MD4161929T2 - 1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril în calitate de inhibitor al USP30 pentru utilizare în tratamentul disfuncției mitocondriale al cancerului și al fibrozei - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la activitatea hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitrililor ca inhibitori ai enzimei deubiquitilante USP30, având utilizare în domenii terapeutice, incluzând afecţiuni care implică disfuncţii mitocondriale, cancer şi fibroze.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă la hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitrili cu activitate de un inhibitor al enzimei de deubiquitinilare a hidrolazei ubiquitină 30 de capăt C-terminal, cunoscută, de asemenea, cu denumirea de peptidază specifică ubiquitinei 30 (USP30), utilizări ale acestora, procedee de preparare a acestora şi compoziţii care conţin inhibitorul menţionat. Acest inhibitor are utilitate într-o varietate de domenii terapeutice, incluzând afecţiuni care implică disfuncţie mitocondrială, cancer şi fibroză.

STADIUL TEHNICII AL INVENŢIEI

Ubiquitina este o proteină mică, alcătuită din 76 de aminoacizi, care este importantă pentru reglarea funcţiei proteinelor în celulă. Ubiquitinilarea şi deubiquitinilarea sunt procese mediate enzimatic prin care ubiquitina este legată covalent sau este scindată de la o proteină ţintă cu enzimele de deubiquitinilare (DUB-uri), dintre care există aproximativ 100 de DUB-uri în celulele umane, împărţite în subfamilii pe baza omologiei de secvenţă. Familia USP este caracterizată prin casetele sale comune Cys şi His, care conţin reziduuri Cys şi His critice pentru activităţile lor de DUB. Procesele de ubiquitinilare şi deubiquitinilare au fost implicate în reglarea multor funcţii celulare, incluzând progresia ciclului celular, apoptoza, modificarea receptorilor de suprafaţă celulară, reglarea transcripţiei ADN-ului şi repararea ADN-ului. Astfel, sistemul de ubiquitină a fost implicat în patogeneza numeroaselor stări de boală, incluzând inflamaţie, infecţie virală, disfuncţie metabolică, tulburări ale CNS, şi oncogeneză.

Ubiquitina este un regulator principal al dinamicii mitocondriale. Mitocondriile sunt organite dinamice a căror biogeneză, fuziune şi fisiune sunt reglate prin reglarea post-translaţională prin ubiquitinilarea multor factori cheie, cum ar fi mitofuzinele. La om, USP30 este o proteină cu 517 aminoacizi care se găseşte în membrana externă a mitocondriilor (Nakamura şi colab., 2008, Mol Biol 19:1903-11). Ea este singura enzimă de deubiquitinilare care poartă un semnal de adresare mitocondrială şi a fost arătat că deubiquitilează o serie de proteine mitocondriale. A fost demonstrat că USP30 se opune mitofagiei mediate de parkină, şi că reducerea activităţii USP30 poate remedia defectele mediate de parkină în mitofagie (Bingol şi colab., 2015, Nature 510:370-5; Gersch şi colab., 2017, Nat Struct Mol Biol 24(11): 920-930; Cunningham şi colab., 2015, Nat Cell Biol 17(2): 160-169). Inactivarea USP30 poate, de asemenea, să crească importul de proteine mitocondriale, posibil, prin ubiquitinilarea proteinelor TOM (Jacoupy şi colab., 2019, Sci Rep 9(1): 11829). O mică proporţie de USP30 a fost localizată la nivelul peroxizomilor, care sunt generaţi prin fuziunea veziculelor mitocondriale şi ER, USP30 putând antagoniza calea Pex2/pexofagie (Riccio şi colab., 2019, J Cell Biol 218(3): 798-807). March5 ligaza Ub E3 şi deubiquitinaza USP30 se asociază cu translocaza şi reglează importul mitocondrial, şi, în timp ce March5 se opune importului mitocondrial şi direcţionează degradarea substraturilor, USP30 deubiquitinilează substraturile pentru a promova importul acestora (Phu şi colab., 2020, Molecular Cell 77, 1107-1123).

Disfuncţia mitocondrială poate fi definită ca un conţinut mitocondrial diminuat (mitofagie sau biogeneză mitocondrială), ca o scădere a activităţii mitocondriale şi a fosforilării oxidative, dar şi ca o modulare a generării de specii reactive la oxigen (ROS). De aici, disfuncţiile mitocondriale joacă un rol într-un număr foarte mare de procese şi patologii de îmbătrânire.

De exemplu, boala Parkinson afectează aproximativ 10 milioane de oameni din întreaga lume (Parkinson's Disease Foundation) şi este caracterizată prin pierderea neuronilor dopaminergici din substantia nigra. Mecanismele exacte care stau la baza PD sunt neclare; cu toate acestea, disfuncţia mitocondrială este din ce în ce mai apreciată ca un factor cheie determinant al susceptibilităţii neuronale dopaminergice în PD, şi este o caracteristică, atât a bolilor familiale, cât şi a celor sporadice, precum şi a parkinsonismului indus de toxine. Parkina este una dintre numeroasele proteine care au fost implicate în PD cu debut precoce. În timp ce majoritatea cazurilor de PD sunt legate de defecte ale alfa-sinucleinei, 10% din cazurile de Parkinson sunt legate de defecte genetice specifice, unul dintre acestea fiind în parkin ligaza ubiquitin E3. Parkina şi kinaza 1 induse de protein kinaza PTEN (PINK1) colaborează pentru a ubiquitila proteinele membranei mitocondriale a mitocondriilor deteriorate, rezultând mitofagie. Dereglarea mitofagiei are ca rezultat creşterea stresului oxidativ, care a fost descris ca o caracteristică a PD. Prin urmare, inhibarea USP30 ar putea fi o strategie posibilă pentru tratamentul PD (BP). De exemplu, pacienţi cu BP cu mutaţii ale genei parkină care conduc la o activitate redusă ar putea fi compensaţi terapeutic prin inhibarea USP30.

A fost raportat că epuizarea USP30 sporeşte eliminarea mitofagică a mitocondriilor şi, de asemenea, sporeşte moartea celulară indusă de parkină. De asemenea, a fost arătat că USP30 reglează apoptoza dependentă de BAX/BAK în mod independent de supraexprimarea parkinei. Epuizarea USP30 sensibilizează celulele canceroase la mimetice BH-3, cum ar fi ABT-737, fără a fi nevoie de supraexprimarea parkinei. Astfel, a fost demonstrat un rol anti-apoptotic pentru USP30 şi, prin urmare, USP30 este o ţintă posibilă pentru terapia împotriva cancerului.

Sistemul ubiquitină-proteazom a câştigat interes ca ţintă pentru tratamentul cancerului în urma aprobării inhibitorului de proteazom, bortezomib (Velcade®), pentru tratamentul mielomului multiplu. Tratamentul extins cu bortezomib este limitat de toxicitatea asociată şi de rezistenţa la medicamente. Cu toate acestea, se preconizează că strategiile terapeutice care ţintesc aspecte specifice ale căii ubiquitină-proteazom în amonte de proteazom, cum ar fi DUB-urile, vor fi mai bine tolerate (Bedford şi colab., 2011, Nature Rev 10:29-46).

Bolile fibrotice, incluzând fibroză renală, hepatică şi pulmonară, reprezintă o cauză principală de morbiditate şi mortalitate şi pot afecta toate ţesuturile şi sistemele de organ. Fibroza este considerată a fi rezultatul stresului acut sau cronic asupra ţesutului sau organului, caracterizat prin depunerea de matrice extracelulară, reducerea permeabilităţii vasculare/a tubulilor/a canalelor/a căilor respiratorii şi afectarea funcţiei, rezultând în cele din urmă insuficienţă de organ. Multe afecţiuni fibrotice sunt promovate de stilul de viaţă sau de factori de mediu; cu toate acestea, o proporţie din afecţiunile fibrotice poate fi iniţiată prin factori declanşatori genetici sau, de fapt, este considerată idiopatică (adică fără o cauză cunoscută). Anumite boli fibrotice, cum ar fi fibroza pulmonară idiopatică (IPF), pot fi tratate cu inhibitori nespecifici de kinază (nintedanib) sau cu medicamente fără un mecanism de acţiune bine caracterizat (pirfenidonă). Alte tratamente pentru fibroză de organ, cum ar fi fibroză renală sau hepatică, atenuează presiunea asupra organului în sine (de ex., beta-blocante pentru ciroză, blocante ale receptorilor de angiotensină pentru boala renală cronică). Atenţia la factorii de stil de viaţă, cum ar fi controlul glucozei şi al alimentaţiei, poate influenţa, de asemenea, evoluţia şi severitatea bolii.

Disfuncţia mitocondrială a fost implicată într-o serie de boli fibrotice, stresul oxidativ din avalul disfuncţiei fiind principalul mediator patogen, alături de scăderea producţiei de ATP. În modele preclinice, perturbarea căii mitofagice (prin mutaţie sau inactivarea, fie a parkinei, fie a PINK1) exacerbează fibroza pulmonară şi fibroza renală, cu dovezi ale unui stres oxidativ crescut.

Kurita şi colab., 2017, Respiratory Research 18:114, dezvăluie că acumularea de miofibroblaste profibrotice este un proces crucial pentru remodelarea fibrotică în IPF. Se spune că descoperirile recente arată participarea autofagiei/mitofagiei, parte a mecanismului de degradare lizozomală, în patogeneza IPF, şi că mitofagia a fost implicată în diferenţierea miofibroblastelor prin reglarea activării receptorului factorului de creştere derivat din trombocite (PDGFR) mediată de speciile reactive la oxigen (ROS) mitocondrial. Rezultatele lui Kurita au sugerat că pirfenidona induce mitofagia mediată de PARK2 şi inhibă, de asemenea, dezvoltarea fibrozei pulmonare în contextul unei mitofagii insuficiente, ceea ce poate explica cel puţin parţial mecanismele antifibrotice pentru tratamentul IPF.

Williams şi colab., 2015, Pharmacol Res. Decembrie; 102: 264-269, discută rolul autofagiei mediate de PINK1-Parkin în protejarea împotriva leziunilor hepatice induse de alcool şi acetaminofen, prin îndepărtarea mitocondriilor deteriorate prin mitofagie. Se sugerează că stabilizarea farmacologică a USP8 sau inactivarea USP15 şi USP30 pot fi ţinte terapeutice posibile pentru suprareglarea mitofagiei induse de parkină şi, la rândul lor, protejează împotriva leziunilor hepatice induse de medicamente. Cu toate acestea, se observă că DUB-urile sunt reglate atât transcripţional, cât şi post-translaţional, ceea ce poate face dificilă dezvoltarea de medicamente pentru ţintirea acestor enzime specifice şi, în plus, a fost arătat că ubiquitina fosforilată este rezistentă la DUB-uri. Autorii concluzionează că suprareglarea stabilizării PINK1 sau a activităţii kinazei poate fi o ţintă mai eficientă decât inhibarea DUB-urilor.

Williams şi colab., 2015, Biomolecules 5, 2619-2642, şi Williams şi colab., 2015, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 309: G324-G340, analizează mecanismele implicate în reglarea homeostaziei mitocondriale în ficat şi modul în care aceste mecanisme pot proteja împotriva bolilor hepatice induse de alcool.

Luciani şi colab., 2020, Nat. comun. 11, 970, raportează că dereglarea reţelei mitocondriale în celulele diferenţiate terminal contribuie la un spectru larg de tulburări, incluzând acidemia metilmalonică (MMA). MMA este una dintre cele mai frecvente tulburări metabolice ereditare, din cauza deficitului de mutază mitocondrială metilmalonil-coenzimă A (MMUT). Deficitul de MMUT induce modificări metabolice şi mitocondriale care sunt exacerbate de anomalii ale mitofagiei mediate de PINK1/Parkină, care provoacă acumularea de mitocondrii disfuncţionale care declanşează stres epitelial şi, în cele din urmă, deteriorarea celulară. Se sugerează o legătură între deficitul primară de MMUT, mitocondriile bolnave, disfuncţia mitofagiei şi stresul epitelial, şi sunt furnizate perspective terapeutice posibile pentru MMA.

Kluge şi colab., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2018, 28 2655-2659, raportează că inhibitorii selectivi de USP30 accelerează mitofagia.

Serii de derivaţi ai heterociclurilor N-ciano-substituite sunt descrise ca inhibitori de enzime de deubiquitinilare, în cererile PCT WO 2016/046530 (US 15/513125,

US 15/894025, US 16/448066), WO 2016/156816 (US 15/558632, US 16/297937,

US16/419558, US16/419747, US16/788446), WO 2017/009650 (US 15/738900),

WO2017/093718 (US15/776149), WO2017/103614 (US15/781615),

WO2017/149313 (US16/078518), WO2017/109488 (US16/060299),

WO2017/141036 (US16/070936), WO2017/163078 (US16/087515),

WO2017/158381 (US16/080229), WO2017/158388 (US16/080506),

WO2018/065768 (US16/336685), WO2018/060742 (US16/336202),

WO2018/060689 (US16/334836), WO2018/060691 (US16/336363),

WO2018/220355 (US16/615040), WO2018/234755 (US16/615709),

WO2020/212350, WO2020/212351, WO2021/043870, PCT/EP2021/059032 şi

PCT/EP2021/064166. Cererea PCT WO 2019/171042 (US 16/977019) dezvăluie utilizarea N-cianopirolidinelor ca inhibitori de USP30 pentru tratamentul bolilor fibrotice.

Falgueyret şi colab., 2001, J.Med.Chem. 44, 94-104 şi cererea PCT WO 01/77073 se referă la cianopirolidine ca inhibitori de catepsine K şi L, cu utilitate posibilă în tratarea osteoporozei şi a altor afecţiuni legate de resorbţia osoasă. Cererea PCT WO 2015/179190 se referă la inhibitori de amidază acidă hidrolizantă a N-aciletanolamină, cu utilitate posibilă în tratarea colitei ulcerative şi a bolii Crohn. Cererea PCT WO 2013/030218 se referă la compuşi de chinazolin-4-onă ca inhibitori de proteaze specifice ubiquitinei, cum ar fi USP7, cu utilitate posibilă în tratarea cancerului, bolilor neurodegenerative, tulburărilor inflamatorii şi infecţiilor virale. Cererile PCT WO 2015/017502 şi WO 2016/019237 se referă la inhibitori de tirozin kinază Bruton cu utilitate posibilă în tratarea bolilor, cum ar fi boli autoimune, boli inflamatorii şi cancer. Cererileea PCT WO 2009/026197, WO 2009/129365, WO 2009/129370 şi WO 2009/129371, se referă la cianopirolidine ca inhibitori de catepsină C cu utilitate posibilă în tratarea COPD. Cerere de brevet din Statele Unite US 2008/0300268 se referă la compuşi poliaromatici ca inhibitori ai receptorului tirozin kinazei PDGFR. Cererile PCT WO 2019/222468, WO 2019/071073, WO 2020/036940 şi WO 2020/072964, Rusilowicz-Jones şi colab., 2020, bioRxiv 2020.04.16.044206 (20 aprilie 2020), şi Tsefou şi colab., bioRxiv 2021.02.02.429344 (2 februarie 2021), se referă la compuşi care conţin cianamidă ca inhibitori de USP30. Yue şi colab., 2014, Cell Research, 24, 482-496, se referă la un derivat diterpenoid de 15-oxospiramilactonă ca inhibitor de USP30 care a indus fuziunea mitocondrială.

Cererea PCT WO 2015/183987 se referă la compoziţii farmaceutice care cuprind inhibitori de deubiquitinază şi albumină serică umană pentru metode de tratare a cancerului, fibrozei, unei boli sau afecţiuni autoimune, unei boli sau afecţiuni inflamatorii, unei boli sau afecţiuni neurodegenerative sau a unei infecţii. Este de remarcat că se spune că deubiquitinazele, incluzând UCHL5/UCH37, USP4, USP9X, USP11 şi USP15, au fost implicate în reglarea căii de semnalizare TGF-beta, a cărei perturbare dă naştere la boli neurodegenerative şi fibrotice, la disfuncţii autoimune şi la cancer.

Cererea PCT WO 2006/067165 se referă la o metodă de tratare a bolilor fibrotice utilizând inhibitori de indolinon kinazei. Cererea PCT WO 2007/119214 se referă la o metodă de tratare a fibrozei pulmonare în stadiu incipient utilizând un antagonist al receptorilor de endotelină. Cererea PCT WO 2012/170290 se referă la o metodă de tratare a bolilor fibrotice utilizând acizi THC. Cererea PCT WO 2018/213150 se referă la inhibitori de sulfonamidă USP30 cu utilitate posibilă în tratamentul afecţiunilor care implică defecte mitocondriale. Larson-Casey şi colab., 2016, Immunity 44, 582-596, se referă la mitofagia mediată de kinaza macrofagică Akt1, rezistenţa la apoptoză şi fibroza pulmonară. Tang şi colab., 2015, Kidney Diseases 1, 71-79, revizuiesc rolul posibil al mitofagiei în fiziopatologia renală.

Există o nevoie de metode şi compoziţii sigure, alternative şi/sau îmbunătăţite pentru tratamentul sau prevenirea afecţiunilor care implică disfuncţie mitocondrială, cancer şi fibroză, precum şi al diferitelor simptome şi afecţiuni asociate acestora. Deşi nu se doreşte a fi legat de vreo teorie sau mecanism particular, se consideră că compuşii din prezenta invenţie acţionează pentru a inhiba enzima USP30, care, la rândul său, suprareglează mitofagia indusă de parkină.

Leziunea renală acută (AKI) este definită ca o scădere bruscă a funcţiei renale, care apare pe parcursul a 7 zile sau mai puţine, severitate a leziunii care este stabilită în funcţie de creşterea creatininei serice (CSr) şi scăderea cantităţii de urină evacuată, aşa cum este descris în ghidurile Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO). AKI apare la aproximativ 13,3 milioane de persoane pe an, dintre care 85% trăiesc în ţările în curs de dezvoltare, şi se consideră că contribuie la aproximativ 1,7 milioane de decese în fiecare an (Mehta şi colab., 2015, Lancet 385(9987): 2616-2643). AKI are ca rezultat, cel mai probabil, leziuni renale permanente (adică boală renală cronică; CKD) şi poate avea ca rezultat, de asemenea, leziuni ale organelor non-renale. AKI reprezintă o problemă semnificativă de sănătate publică, în special, dacă se ia în considerare numărul absolut de pacienţi care dezvoltă CKD incidentă, CKD progresivă, boală renală în stadiu terminal şi evenimente cardiovasculare. S-a constatat că AKI este prevalentă la pacienţi spitalizaţi din cauza COVID-19 şi este puternic asociată cu mortalitate spitalicească, leziuni şi disfuncţie mitocondrială fiind raportate ca un posibil mecanism fiziopatologic şi ţintă terapeutică (Kellum şi colab., Nephrol Dial Transplant (2020) 35: 1652-1662).

AKI şi CKD sunt considerate un şir neîntrerupt pe acelaşi spectru de boli (Chawla şi colab., 2017, Nat Rev Nephrol 13(4): 241-257). Pacienţii care sunt supuşi bypass-ului coronarian (CABG) prezintă un risc crescut de leziuni renale. Există o nevoie medicală evidentă neacoperită în dezvoltarea de medicamente pentru tratamentul şi/sau prevenirea AKI.

Rinichiul este un situs cu cerere metabolică crescută, cu rate crescute de mitofagie demonstrat in vivo (McWilliams şi colab., 2018, Cell Metab 27(2): 439-449 e435). Celulele epiteliale ale tubulului renal proximal (RPTEC), un tip de celulă cu o nevoie semnificativă de ATP pentru schimbul de solut/ioni, sunt bogate în mitocondrii şi sunt principalele celule efectoare ale leziunii renale acute (AKI) în rinichi. Disfuncţia mitocondrială a fost implicată în mecanismele AKI/CKD, atât prin multiple dovezi din modelele preclinice de AKI şi CKD, cât şi prin date care demonstrează fenotipuri mitocondriale anormale în biopsii de la pacienţi (Emma şi colab., 2016, Nat Rev Nephrol 12(5): 267-280; Eirin şi colab., 2017, Handb Exp Pharmacol 240: 229-250). Mai mult, boala mitocondrială primară se manifestă adesea prin simptome renale, cum ar fi glomeruloscleroza focală segmentară (Kawakami şi colab., 2015, J Am Soc Nephrol 26(5): 1040-1052) la pacienţi cu MELAS/MIDD, precum şi prin patologii tubulare primare la pacienţi cu deficienţe de coenzimă Q. Mutaţiile din ADNmt pot provoca boli tubulointerstiţiale ereditare pe cale maternă (Connor şi colab., 2017, PLoS Genet 13(3): e1006620).

În ceea ce priveşte controlul calităţii mitocondriale în leziuni renale (Tang şi colab., 2018, Autophagy 14(5): 880-897), a fost demonstrat că leziunile renale au fost exacerbate în urma leziunii renale acute ischemice (AKI), atât la şoarecii cu PINK1 KO, cât şi la cei cu PARK2 KO, sugerând că mitofagia mediată de PINK1/PARKIN joacă un rol protector în urma IRI în rinichi. În plus, mitofagia parkin/PINK1 protejează faţă de leziuni renale induse de cisplatină (Wang şi colab., 2018, Cell Death Dis 9(11): 1113). Sunt disponibile modele limitate de CKD pentru investigarea mitofagiei, dovezile care susţin controlul calităţii mitocondriale în fibroză provin din studii privind afecţiuni pulmonare fibrotice, cum ar fi COPD şi IPF. Animalele cu parkină inactivată prezintă o fibroză pulmonară exacerbată ca răspuns la bleomicină (Kobayashi şi colab., 2016, J Immunol, 197:504-516). În mod similar, celulele epiteliale ale căilor respiratorii de la animale cu sindrom de parkină inactivată (KO) prezintă răspunsuri fibrotice şi senescente exacerbate la fumul de ţigară (Araya şi colab., 2019, Autophagy 15(3): 510-526).

Sunt disponibile modele preclinice pentru studierea posibilelor noi terapii, prin capacitatea lor de a modela patologia fibrozei (de ex., depunerea de colagen) în concordanţă cu condiţia umană. Modelele preclinice pot fi mediate de toxine (de ex., bleomicină, pentru fibroză pulmonară şi cutanată), chirurgical (de ex., modelul de leziune de ischemie/reperfuzie şi modelul de obstrucţie ureterală unilaterală, pentru fibroză tubulointerstiţială acută) şi genetic (de ex., şoareci diabetici (db/db), pentru nefropatie diabetică). De exemplu, ambele exemple date anterior de tratamente indicate pentru fibroză pulmonară idiopatică (nintedanib şi pirfenidonă) prezintă eficacitate în modelul de fibroză pulmonară de la bleomicină.

Prin urmare, există o nevoie de compuşi, care să fie inhibitori de USP30, pentru tratamentul sau prevenirea afecţiunilor în care este indicată inhibarea USP30. În particular, există o nevoie de inhibitori de USP30 care să aibă proprietăţi adecvate şi/sau îmbunătăţite pentru a maximiza eficacitatea faţă de boala ţintă.

EXPUNERE PE SCURT A INVENŢIEI

Prezenta invenţie furnizează un compus cu formula (I):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la compusul cu formula (I) pentru utilizare ca medicament, în special, în tratamentul afecţiunilor care implică disfuncţie mitocondrială, cancer şi fibroză, precum şi la procedee de preparare a acestuia şi la compoziţii farmaceutice care conţin compuşii menţionaţi.

DESCRIERE DETALIATĂ A INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă la inhibitori de USP30 care au proprietăţi adecvate şi/sau îmbunătăţite pentru a maximiza eficacitatea faţă de boala ţintă. Astfel de proprietăţi includ, de exemplu, potenţă, selectivitate, proprietăţi fizico-chimice, proprietăţi ADME (absorbţie, distribuţie, metabolism şi excreţie), incluzând profil PK (farmacocinetic) şi profil de siguranţă.

În general, este de dorit să se maximizeze potenţa unei molecule medicamentoase faţă de enzima ţintă în teste relevante pentru a reduce doza eficientă/eficace care trebuie administrată pacienţilor. Compuşii din invenţie pot fi testaţi pentru afinitatea USP30 utilizând testul biochimic de polarizare a fluorescenţei (FP) in vitro descris aici.

USP30 este o proteină transmembranară situată în membrana externă a mitocondriilor, care sunt organite producătoare de energie prezente în interiorul celulelor. Prin urmare, posibilitatea de a demonstra activitatea celulară in vitro este avantajoasă, deoarece aceasta este una dintre numeroasele componente care pot indica o capacitate mai mare de a angaja ţinta în cadrul său fiziologic, adică acolo unde compusul inhibitor de USP30 este capabil să pătrundă în celule. Testul Western blot (WB) pentru USP30 celular îşi propune să testeze activitatea compuşilor împotriva USP30 în celule utilizând o sondă de activitate ireversibilă pentru a monitoriza activitatea USP30. În mod analog testului Western blot celular, evaluarea angajării ţintei (ex vivo) poate fi efectuată, fie în probe de ţesut cerebral, fie în probe de ţesut renal de la animale tratate cu compus.

Pentru a extinde cunoştinţele despre legarea ţintei la farmacodinamica din aval, se poate face evaluarea ubiquitinilării TOM20 (o proteină a membranei mitocondriale externe).

În general, este important ca un medicament să fie cât mai selectiv posibil pentru enzima ţintă dorită; activităţile suplimentare dau naştere la posibilitatea apariţiei de efecte secundare. Rolul fiziologic exact al multor DUB-uri nu a fost încă pe deplin determinat, însă, indiferent de rolul pe care aceste DUB-uri îl pot juca sau nu, este un principiu solid al chimiei medicale să se asigure că orice medicament are selectivitate faţă de ţintele mecaniciste înrudite cu funcţie fiziologică necunoscută. Exemple reprezentative de enzime DUB pentru care compuşii din prezenta invenţie pot fi analizaţi sunt UCHL1, UCHL3, UCHL5, YOD1, SENP2, SENP6, TRABID, BAP1, Cezanne, MINDY2/FAM63B, OTU1, OTUD3, OTUD5, OTUD6A, OTUD6B, OTUB1/UBCH5B, OTUB2, CYLD, VCPIP, AMSH-LP, JOSD1, JOSD2, USP1/UAF1, USP2, USP4, USP5, USP6, USP7, USP8, USP9x, USP10, USP11, USP12/UAF1, USP13, USP14, USP15, USP16, USP19, USP20, USP21, USP22, USP24, USP25, USP28, USP32, USP34, USP35, USP36, USP45, USP46/UAF1, USP47 şi USP48. De preferinţă, compuşii din invenţie au o bună selectivitate pentru USP30 faţă de una sau mai multe dintre aceste enzime DUB.

Pe lângă selectivitatea faţă de alte enzime DUB, este important ca un medicament să aibă o afinitate scăzută pentru alte ţinte, şi profilarea farmacologică poate fi efectuată împotriva unor grupuri de ţinte pentru a evalua posibilitatea de, şi pentru a minimiza, posibilele efecte în afara ţintei. Exemple de ţinte pentru care pot fi analizaţi compuşii din prezenta invenţie sunt cele din grupul standard Eurofins-Cerep SafetyScreen44, care include 44 de ţinte ca o selecţie reprezentativă de receptori GPCR, transportori, canale ionice, receptori nucleari şi enzime kinazice şi non-kinazice. De preferinţă, compuşii din invenţie au o afinitate nesemnificativă faţă de ţintele acestui grup de analiză. Alte exemple de ţinte pentru care pot fi testaţi compuşii din prezenta invenţie sunt kinazele din grupul de profilare a kinazelor Thermo Fisher SelectScreen, care include 39 de ţinte ca o selecţie reprezentativă de enzime kinazice. De preferinţă, compuşii din invenţie au o afinitate nesemnificativă faţă de ţintele acestui grup de analiză. În plus, exemple de clase particulare de enzime pentru care pot fi analizaţi compuşii din prezenta invenţie sunt catepsinele (de ex., catepsina A, B, C, H, K, L, L2, S, V şi Z). De preferinţă, compuşii din invenţie au o selectivitate bună pentru USP30 faţă de una sau mai multe dintre aceste enzime.

De asemenea, este nevoie de compuşi care au proprietăţi farmacocinetice favorabile, astfel încât să fie adecvaţi pentru administrare orală. Un medicament administrat oral ar trebui să aibă o biodisponibilitate bună; adică capacitatea de a traversa uşor tractul gastrointestinal (GI) şi de a nu fi supus unui metabolism extins pe măsură ce trece din tractul GI în circulaţia sistemică. Odată ce un medicament se află în circulaţia sistemică, viteza de metabolizare este, de asemenea, importantă pentru determinarea timpului de rezidenţă a medicamentului în organism.

Prin urmare, în mod evident, este favorabil ca moleculele medicamentoase să aibă proprietăţile de a traversa cu uşurinţă tractul gastrointestinal şi doar de a fi metabolizate lent în organism. Testul Caco-2 este un model larg acceptat pentru prezicerea capacităţii unei anumite molecule de a traversa tractul gastrointestinal. Majoritatea moleculelor medicamentoase sunt metabolizate, în general, în ficat, şi testele in vitro care utilizează hepatocite cu celule întregi (animale sau umane) sunt metode larg acceptate pentru măsurarea susceptibilităţii unei anumite molecule de a fi metabolizată în ficat. Astfel de teste îşi propun să preconizeze eliminarea in vivo, din valoarea calculată a eliminării, de către hepatocite.

Se preconizează că compuşii, care au un flux bun de Caco-2 şi sunt stabili faţă de hepatocite, au o biodisponibilitate orală bună (absorbţie bună în tractul gastrointestinal şi extracţie minimă a compusului pe măsură ce acesta trece prin ficat), şi un timp lung de rezidenţă în organism, suficient pentru ca medicamentul să fie eficient.

Solubilitatea unui compus este un factor important în atingerea unei concentraţii dorite de medicament în circulaţia sistemică pentru răspunsul farmacologic anticipat. Solubilitatea apoasă scăzută este o problemă întâlnită la dezvoltarea formulărilor de noi entităţi chimice, iar pentru a fi absorbit, un medicament trebuie să fie prezent sub formă de soluţie la situsul de absorbţiei. Solubilitatea cinetică a unui compus poate fi măsurată utilizând un test de solubilitate turbidimetrică, ale cărui date pot fi utilizate, de asemenea, împreună cu datele de permeabilitate la Caco-2 pentru a prezice absorbţia intestinală la om dependentă de doză.

Alţi parametri care pot fi măsuraţi utilizând teste standard şi care indică profilul de expunere al unui compus includ, de exemplu, stabilitatea plasmatică (măsurarea timpului de înjumătăţire), valorile sanguite AUC, Cmax, Cmin şi Tmax.

Tratamentul afecţiunilor CNS, incluzând boala Alzheimer, boala Parkinson şi alte tulburări descrise aici, necesită ca moleculele medicamentoase să ţintească creierul, ceea ce necesită o penetrare adecvată a barierei hematoencefalice. Prin urmare, există o nevoie de inhibitori de USP30 care să aibă proprietăţi eficiente de penetrare hematoencefalică şi să asigure un timp de rezidenţă adecvat în creier pentru a fi eficace. Probabilitatea ca un compus să poată traversa bariera hematoencefalică poate fi măsurată printr-un test de flux in vitro utilizând un monostrat de celule MDR1-MDCK (celule renale canine Madin-Darby transfectate cu MDR-1, rezultând supraexprimarea glicoproteinei P a transportorului de eflux uman). În plus, expunerea poate fi măsurată, de asemenea, direct în creier şi plasmă utilizând modele animale in vivo.

De asemenea, este nevoie de compuşi care au un profil de siguranţă favorabil, care poate fi măsurat printr-o varietate de metode standard in vitro şi in vivo. O analiză ulterioară sau în paralel a toxicităţii celulare poate fi utilizată pentru a testa efectul antiproliferativ/citotoxic într-o anumită linie celulară (de ex., HCT116), prin detectarea fluorometrică a rezasurin (alamarBlue™) redus la resofurină ca răspuns la activitatea mitocondrială.

Studii de toxicologie şi siguranţă pot fi, de asemenea, efectuate pentru a identifica organe ţintă posibile pentru efecte adverse şi pentru a defini indicele terapeutic pentru a stabili dozele iniţiale în studii clinice. Cerinţele de reglementare impun, în general, ca studiile să fie efectuate pe cel puţin două specii de animale de laborator, un rozător (şobolan sau şoarece) şi un nerozător (iepure, câine, primat neuman, sau alte specii adecvate).

Testul de mutaţie inversă bacteriană (testul Ames) poate fi utilizat pentru a evalua proprietăţile mutagene ale compuşilor din invenţie, în mod obişnuit, prin utilizarea tulpinii bacteriene Salmonella typhimurium, care este mutant pentru biosinteza aminoacidului histidină.

Testul micronucleului poate fi utilizat pentru a determina dacă un compus este genotoxic, prin evaluarea prezenţei micronucleilor. Micronucleii pot conţine fragmente de cromozomi produse prin ruperea ADN-ului (clastogeni), sau cromozomi întregi produşi prin perturbarea aparatului mitotic (aneugeni).

Testul predictor hERG furnizează informaţii valoroase despre posibila legare a compuşilor testaţi la canalul de potasiu, şi despre posibila prelungire a intervalului QT pe ecocardiogramă. Inhibarea curentului hERG provoacă prelungirea intervalului QT, rezultând o tahiaritmie ventriculară posibil fatală (torsada vârfurilor). De obicei, datele testului pot fi generate de pe o platformă automată de testare de tip patch-clamp.

Prin urmare, prezenta invenţie se referă la inhibitori de USP30 care au proprietăţi adecvate şi/sau îmbunătăţite pentru a maximiza eficacitatea faţă de boala ţintă. Astfel de proprietăţi includ, de exemplu, potenţa, selectivitatea, proprietăţile fizico-chimice, proprietăţile ADME (absorbţie, distribuţie, metabolism şi excreţie), incluzând profilul PK (farmacocinetic), şi profilul de siguranţă.

Compusul cel mai preferat din prezenta invenţie este foarte potent pentru USP30, aşa cum a fost măsurat în testul biochimic descris aici, şi este semnificativ mai selectiv pentru USP30 faţă de alte DUB-uri şi catepsine. Proprietăţile semnificative şi neaşteptate ale compuşilor din prezenta invenţie îi fac deosebit de adecvaţi pentru utilizare în tratamentul şi/sau prevenirea bolilor legate de activitatea USP30.

Conform unui prim aspect, prezenta invenţie furnizează un compus cu formula (I):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Într-un prim aspect preferat, prezenta invenţie furnizează un compus cu formula (IA):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Într-un al doilea aspect preferat, prezenta invenţie furnizează un compus cu formula (IB):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Într-un al treilea aspect preferat, prezenta invenţie furnizează un compus cu formula (IC):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Într-un al patrulea aspect preferat, prezenta invenţie furnizează un compus cu formula (ID):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Compuşi preferaţi cu formula (I) sunt selectaţi dintre:

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

(3aS,4S,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

(3aS,4R,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

(3aR,4R,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

(3aS,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

(3aR,4S,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril; şi

(3aS,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora .

Compuşi mai preferaţi cu formula (I) sunt selectaţi dintre:

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

(3aS,4S,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril; şi

(3aS,4R,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora .

Cel mai preferat compus cu formula (I) este:

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril;

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Exemplul 1 este compusul cel mai preferat al invenţiei.

Acest compus preferat cu formula (I) există sub forma unui singur stereoizomer dextrogir, care a fost identificat ca având următoarea structură, cu configuraţia absolută arătată:

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril.

Compusul cu formula (I) posedă trei centre chirale şi, prin urmare, poate exista în opt configuraţii stereochimice. Se consideră că sinteza inelului biciclic, conform experimentelor de mai jos, produce sistemul inelar cis-condensat, dând naştere la patru stereoizomeri posibili. Configuraţia stereochimică a compusului cu formula (I) cel mai preferat este cea din Exemplul 1, care este compusul cel mai activ împotriva USP30 în testul biochimic.

Patru stereoizomeri au fost preparaţi prin experimentele descrise mai jos; Exemplele de la 1 la 4. Exemplele 1 şi 3 sunt dextrorotatorii, şi Exemplele 2 şi 4 sunt levororotatorii, atunci când se măsoară în condiţii experimentale; (c = 0,05 g/100 cm3, MeOH). Exemplul 1, atunci când a fost preparat prin două metode diferite, a produs măsurători ale rotaţiei optice [α]D 25 = +208° şi +204°. Variaţia mică se poate datora diferenţelor experimentale sau diferenţelor de puritate optică. Exemplul 3 a produs o măsurătoare a rotaţiei optice [α]D 25 = +166°.

Prezenta invenţie se referă, în plus, la stereoizomerul cis-condensat care este dextrogir, atunci când este măsurat aşa cum este descris, şi are o rotaţie optică aproximativă în regiunea de +204° până la +208°. În funcţie de puritatea optică, acest stereoizomer, atunci când este substanţial pur, poate produce o rotaţie optică în regiunea de +190° până la +220°. O astfel de figură distinge clar acest compus din invenţie de celălalt stereoizomer cis-condensat care este, de asemenea, dextrogir.

Prezenta invenţie se referă, în plus, la:

(+)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril (I);

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta invenţie se referă, în plus, la stereoizomerul principal produs prin procedura experimentală din Exemplul 1.

Sărurile acceptabile farmaceutic ale compuşilor cu formula (I) includ sărurile de adiţie acidă şi bazică (incluzând di-săruri) ale acestora.

Săruri de adiţie acidă adecvate sunt formate din acizi care formează săruri netoxice. Exemple includ sărurile acetat, aspartat, benzoat, besilat, bicarbonat/carbonat, bisulfat, camsilat, citrat, edisilat, esilat, fumarat, gluceptat, gluconat, glucuronat, hibenzat, clorhidrat/clorură, bromhidrat/bromură, iodhidrat/iodură, hidrogenfosfat, isetionat, D- şi L-lactat, malat, maleat, malonat, mesilat, metilsulfat, 2-napsilat, nicotinat, nitrat, orotat, palmat, fosfat, zaharat, stearat, succinat sulfat, D- şi L-tartrat, şi tosilat.

Săruri bazice adecvate sunt formate din baze care formează săruri netoxice. Exemple includ sărurile de aluminiu, amoniu, arginină, benzatină, calciu, colină, dietilamină, diolamină, glicină, lizină, magneziu, meglumină, olamină, potasiu, sodiu, trometamină, şi zinc.

Pentru o analiză a sărurilor adecvate, vezi Stahl şi Wermuth, Manual de săruri farmaceutice: Proprietăţi, selecţie şi utilizare, Wiley-VCH, Weinheim, Germania (2002).

O sare acceptabilă farmaceutic a unui compus cu formula (I) poate fi preparată cu uşurinţă prin amestecare împreună a soluţiilor de compus cu formula (I) cu acidul sau baza dorită, după caz. Sarea poate precipita din soluţie şi poate fi colectată prin filtrare sau poate fi recuperată prin evaporarea solventului.

Solvaţi acceptabili farmaceutic, conform invenţiei, includ hidraţi şi solvaţi în care solventul de cristalizare poate fi substituit izotopic, de exemplu, D2O, acetonă-d6, DMSO-d6.

De asemenea, în sfera de întindere a invenţiei se află clatraţi, complexe de incluziune medicament-gazdă în care, spre deosebire de solvaţii menţionaţi anterior, medicamentul şi gazda sunt prezente în cantităţi nestoichiometrice. Pentru o revedere a unor astfel de complexe, vezi J. Pharm Sci, 64 (8), 1269-1288 de Haleblian (august 1975).

În continuare, toate referirile la compuşi cu formula (I) includ referiri la săruri ale acestora, şi la solvaţi şi clatraţi ai compuşilor cu formula (I) şi săruri ale acestora.

Invenţia include toţi polimorfii compuşilor cu formula (I), aşa cum au fost definiţi anterior.

În sfera de întindere a prezentei invenţiei sunt incluse toate formele tautomerice ale compuşilor cu formula (I).

Tehnicile convenţionale de preparare/izolare a enantiomerilor individuali includ sinteza chirală de la un precursor optic pur adecvat, sau rezoluţia racematului (sau a racematului unei sări sau derivat) utilizând, de exemplu, cromatografie de lichid chirală de înaltă performanţă (HPLC). Ca alternativă, racematul (sau un precursor racemic) poate reacţiona cu un compus optic activ adecvat, de exemplu, un alcool sau, în cazul în care compusul cu formula (I) conţine o grupare acidă sau bazică, o bază sau un acid, cum ar fi 1-feniletilamina sau acidul tartric. Amestecul diastereomeric rezultat poate fi separat prin cromatografie şi/sau cristalizare fracţionată, şi unu sau ambii diastereoizomeri pot fi transformaţi în enantiomerul (enantiomerii) pur corespondent prin mijloace bine-cunoscute unei persoane de specialitate. Compuşii chirali din invenţie (şi precursorii chirali ai acestora) pot fi obţinuţi în formă îmbogăţită enantiomeric utilizând cromatografie, de obicei HPLC, pe o răşină asimetrică, cu o fază mobilă alcătuită dintr-o hidrocarbură, de obicei, heptan sau hexan, care conţine de la 0 la 50% în volum propan-2-ol, de obicei, de la 2% la 20% şi de la 0 la 5% în volum o alchilamină, de obicei 0,1% dietilamină. Concentrarea eluatului produce amestecul îmbogăţit. Prezenta invenţie include toate formele cristaline ale compuşilor cu formula (I), incluzând racemaţii şi amestecurile racemice (conglomeratele) ale acestora. Conglomeratele stereoizomerice pot fi separate prin tehnici convenţionale cunoscute de persoanele de specialitate în domeniu - vezi, de exemplu, "Stereochimia compuşilor organici» a lui E. L. Eliel şi S. H. Wilen (Wiley, New York, 1994).

Compusul cel mai preferat cu formula (I) din prezenta invenţie poate exista în combinaţie cu unu sau mai mulţi alţi stereoizomeri ai compuşilor cu formula (I) preferaţi. De exemplu, compusul poate exista cu enantiomerul său, adică sub formă de racemat, sau poate exista cu un diastereomer.

Compuşii preferaţi cu formula (I) din prezenta invenţie există, de preferinţă, sub forma unui stereoizomer unic. Compuşii preferaţi cu formula (I) sunt izolaţi sub formă de stereoizomeri unici şi pot exista cu un exces stereoizomeric de cel puţin 60%, de preferinţă, cel puţin 80%, mai preferat, cel puţin 90%, mai preferat, cel puţin 95%, de exemplu, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100%. Excesul stereoizomeric poate fi o măsură a unui exces enantiomeric sau poate fi o măsură a unui raport diastereomeric.

Prezenta invenţie include, de asemenea, toate variaţiile izotopice acceptabile farmaceutic ale unui compus cu formula (I). O variaţie izotopică este definită ca fiind una în care cel puţin un atom este înlocuit cu un atom care are acelaşi număr atomic, dar o masă atomică diferită de masa atomică întâlnită în mod obişnuit în natură.

Exemple de izotopi adecvaţi pentru includerea în compuşii din invenţie includ izotopi de hidrogen, cum ar fi 2H şi 3H, carbon, cum ar fi 13C şi 14C, azot, cum ar fi 15N, oxigen, cum ar fi 17O şi 18O, fosfor, cum ar fi 32P, sulf, cum ar fi 35S, fluor, cum ar fi 18F şi clor, cum ar fi 36Cl.

Substituirea compuşilor din invenţie cu izotopi, cum ar fi deuteriu, poate asigura anumite avantaje terapeutice rezultate dintr-o stabilitate metabolică mai mare, de exemplu, un timp de înjumătăţire in vivo crescut, sau doze reduse şi, prin urmare, poate fi preferată în anumite circumstanţe.

Anumite variaţii izotopice ale compuşilor cu formula (I), de exemplu, cele care încorporează un izotop radioactiv, sunt utile în studiile privind distribuţia medicamentului şi/sau a substratului în ţesuturi. Izotopii radioactivi tritiu şi 14C, sunt deosebit de utili în acest scop, având în vedere uşurinţa încorporării lor şi mijloacele rapide de detectare.

Variaţiile izotopice ale compuşilor cu formula (I) pot fi, în general, preparate prin tehnici convenţionale cunoscute de persoanele de specialitate în domeniu, sau prin procedee analoage cu cele descrise în Exemplele şi Preparările însoţitoare, utilizând variaţii izotopice adecvate ale reactivilor adecvaţi.

Compuşii cu formula (I) sunt inhibitori de enzimă de deubiquitinilare USP30.

Conform unui alt aspect, prezenta invenţie furnizează un compus cu formula (I) aşa cum este definit aici, un tautomer al acestuia sau o sare acceptabilă farmaceutic a compusului sau a tautomerului menţionat, pentru utilizare ca medicament.

Conform unui alt aspect, prezenta invenţie furnizează un compus cu formula (I) pentru utilizare într-o metodă de tratament sau de prevenire a unei tulburări sau afecţiuni în care se ştie sau se poate demonstra că inhibarea USP30 produce un efect benefic la un mamifer, care cuprinde administrarea la mamiferul menţionat a unei cantităţi eficiente terapeutic de un compus cu formula (I), aşa cum este definit aici, un tautomer al acestuia sau o sare acceptabilă farmaceutic a compusului sau a tautomerului menţionat.

Tulburarea sau afecţiunea care beneficiază de activitatea USP30 este selectată dintre o afecţiune care implică disfuncţie mitocondrială, cancer şi fibroză.

Într-o variantă de realizare preferată în toate aspectele invenţiei, tulburarea sau afecţiunea care beneficiază de activitatea USP30 este o afecţiune care implică disfuncţie mitocondrială.

Disfuncţiile mitocondriale rezultă din defecte ale mitocondriilor, care sunt compartimente specializate prezente în fiecare celulă a corpului, cu excepţia globulelor roşii. Atunci când mitocondriile cedează, se generează din ce în ce mai puţină energie în interiorul celulei, iar celulele se lezează sau chiar mor. Dacă acest proces se repetă în tot corpul, viaţa subiectului la care se întâmplă acest lucru este grav compromisă. Bolile mitocondriilor apar cel mai adesea în organele care necesită multă energie, cum ar fi creier, inimă, ficat, muşchi scheletici, rinichi şi sistemul endocrin şi respirator.

Afecţiunea care implică disfuncţie mitocondrială poate fi selectată dintre o afecţiune care implică un defect de mitofagie, o afecţiune care implică o mutaţie a ADN-ului mitocondrial, o afecţiune care implică stres oxidativ mitocondrial, o afecţiune care implică un defect posibil al membranei mitocondriale, biogeneza mitocondrială, o afecţiune care implică un defect al formei sau morfologiei mitocondriale, şi o afecţiune care implică un defect de stocare lizozomală.

În special, afecţiunea care implică disfuncţie mitocondrială poate fi selectată dintre o boală neurodegenerativă; scleroză multiplă (MS); encefalopatie mitocondrială, acidoză lactică, şi sindroame de tip accident vascular cerebral (MELAS); diabet zaharat şi surditate ereditare pe cale maternă (MIDD); neuropatie optică ereditară Leber (LHON); cancer (incluzând, de exemplu, cancer de sân, ovarian, de prostată, pulmonar, renal, gastric, de colon, testicular, de cap şi gât, de pancreas, cerebral, melanom, osos, sau alte tipuri de cancer ale ţesuturilor şi organelor, şi cancere ale celulelor sanguine, cum ar fi limfom şi leucemie, mielom multiplu, carcinom metastatic, osteosarcom, condosarcom, sarcom Ewing, carcinom nazofaringian, cancer colorectal şi carcinom pulmonar fără celule mici); neuropatie, ataxie, retinită pigmentară, sindromul Leigh ereditar pe cale maternă (NARP-MILS); boala Danon; diabet; nefropatie diabetică; tulburări metabolice; insuficienţă cardiacă; cardiopatie ischemică care conduce la infarct miocardic; boli psihiatrice, de exemplu, schizofrenie; deficit multiplu de sulfatază (MSD); mucolipidoză II (ML II); mucolipidoză III (ML III); mucolipidoză IV (ML IV); GMl-gangliozidoză (GM1); ceroid-lipofuscinoze neuronale (NCL1); boala Alpers; sindromul Barth; defecte de beta-oxidare; deficit de carnitină-acilcarnitină; deficit de carnitină; sindroame de deficit de creatină; deficit de coenzimă Q10; deficit de complex I; deficit de complex II; deficit de complex III; deficit de complex IV; deficit de complex V; deficit de COX; sindrom de oftalmoplegie externă progresivă cronică (CPEO); deficit de CPT I; deficit de CPT II; acidurie glutarică de tip II; sindromul Kearns-Sayre; acidoză lactică; deficit de acil-CoA dehidrogenază cu lanţ lung (LCHAD); boala sau sindromul Leigh; varianta franco-canadiană a sindromului Leigh (LSFC); cardiomiopatie infantilă letală (LIC); boala Luft; deficit de acil-CoA dehidrogenază cu lanţ mediu (MCAD); epilepsie mioclonică şi sindromul fibrelor roşii zdrenţuite (MERRF); citopatie mitocondrială; sindrom de ataxie recesivă mitocondrială; sindrom de depleţie a ADN-ului mitocondrial; tulburare mioneurogastointestinală şi encefalopatie; sindrom Pearson; deficit de piruvat dehidrogenază; deficit de piruvat carboxilază; mutaţii POLG; deficit de 3-hidroxiacil-CoA dehidrogenază cu lanţ mediu/scurt (M/SCHAD); deficit de acil-CoA dehidrogenază cu lanţ foarte lung (VLCAD); tulburări peroxizomale; acidemie metilmalonică; deficit de mevalonat kinază; declin dependent de vârstă al funcţiei cognitive şi al forţei musculare; şi deteriorare cognitivă asociată cu tulburări neurodegenerative şi neuropsihiatrice.

Afecţiunea care implică disfuncţie mitocondrială poate fi o tulburare a CNS, de exemplu, o boală neurodegenerativă.

Boli neurodegenerative includ, dar nu se limitează la, boala Parkinson, boala Alzheimer, scleroză laterală amiotrofică (SLA), boala Huntington, ischemie, accident vascular cerebral, demenţă cu corpi Lewy, atrofie sistemică multiplă (MSA), paralizie supranucleară progresivă (PSP), degenerare corticobazală (CBD), şi demenţă frontotemporală.

În particular, compuşii din invenţie pot fi utili în tratamentul sau prevenirea bolii Parkinson, incluzând, dar fără limitare la, PD legată de mutaţii în α-sinucleină, parkină, PINK1, GBA şi LRRK2, şi boala Parkinson juvenilă autosomal recesivă (AR-JP) sau boala Parkinson cu debut precoce (EOPD), în care parkina sau PINK1 este mutată, trunchiată sau eliminată.

În particular, compuşii din invenţie pot fi utili în tratamentul deficienţei cognitive asociate cu tulburări neurodegenerative şi neuropsihiatrice, incluzând, de exemplu, deficienţă cognitivă asociată cu boala Alzheimer şi boala Parkinson, forme preclinice sau prodromale de AD şi PD, boala Huntington, demenţa cu corpi Lewy, deficienţa cognitivă asociată cu schizofrenie, tulburările de dispoziţie, tulburările bipolare şi depresive majore.

Compuşii din invenţie sau compoziţiile farmaceutice ale acestora, aşa cum este descris aici, pot fi combinate cu unu sau mai mulţi agenţi suplimentari, atunci când sunt utilizate pentru tratamentul sau prevenirea afecţiunilor care implică disfuncţie mitocondrială. Compuşii pot fi combinaţi cu unu sau mai mulţi agenţi suplimentari selectaţi dintre levodopa, un agonist al dopaminei, un inhibitor de monoaminooxigenază (MAO) B, un catecol, un inhibitor de O-metiltransferază (COMT), un anticolinergic, riluzol, amantadină, un inhibitor de colinesterază, memantină, tetrabenazină, un antipsihotic, diazepam, clonazepam, un antidepresiv, şi un anticonvulsivant. Compuşii pot fi combinaţi cu agenţi care reduc/elimină agregatele proteice patogene în boli neurodegenerative, cum ar fi agenţi care reduc/elimină alfa-sinucleina în boala Parkinson, în atrofia multisistemică sau demenţa cu corpi Lewy; agenţi care reduc/elimină Tau în boala Alzheimer sau în paralizia supranucleară progresivă; agenţi care reduc/elimină TDP-43 în SLA sau în demenţă frontotemporală.

Într-o altă variantă de realizare preferată pentru toate aspectele invenţiei, tulburarea sau afecţiunea care beneficiază de activitatea USP30 este cancer. Cancerul poate fi legat de disfuncţia mitocondrială. Cancere preferate includ, de exemplu, cancere de sân, ovarian, de prostată, pulmonar, renal, gastric, de colon, testicular, de cap şi gât, de pancreas, cerebral, melanom, osos, sau alte cancere ale ţesuturilor şi organelor, şi cancere ale celulelor sanguine, cum ar fi limfom şi leucemie, mielom multiplu, carcinom metastatic, osteosarcom, condosarcom, sarcom Ewing, carcinom nazofaringian, cancer colorectal, cancer colorectal, şi carcinom pulmonar fără celule mici.

În particular, compuşii din invenţie pot fi utili în tratamentul sau prevenirea cancerului în cazurile în care căile apoptotice sunt dereglate şi, mai precis, în cazurile în care proteinele din familia BCL-2 sunt mutate sau sunt supra- sau sub-exprimate.

Fibroza se referă la acumularea de constituenţi ai matricei extracelulare care apare în urma traumelor, inflamaţiei, reparării ţesuturilor, reacţiilor imunologice, hiperplaziei celulare, şi neoplaziei. Tulburări fibrotice care pot fi tratate cu compuşii şi compoziţiile din prezenta invenţie includ, printre altele, fibroză/tulburări fibrotice asociate cu boli majore ale organelor, de exemplu, boală pulmonară interstiţială (ILD), ciroză hepatică, boala ficatului gras non-alcoolică (NAFDL) şi steatohepatită non-alcoolică (NASH) (fibroză hepatică), boală renală (fibroză renală), leziune renală acută (AKI), boală renală acută (AKD), boală renală cronică (CKD), funcţie întârziată a grefei renale, boală cardiacă sau vasculară (fibroză cardiacă) şi boli ale ochiului; tulburări fibroproliferative, de exemplu, sclerodermie sistemică şi locală, cicatrici cheloide şi hipertrofice, ateroscleroză, restenoză şi contractură Dupuytren; cicatrici asociate cu traumatism, de exemplu, complicaţii chirurgicale, fibroză indusă de medicamente chimioterapeutice (de ex., fibroză indusă de bleomicină), fibroză indusă de radiaţii, leziuni şi arsuri accidentale); fibroză retroperitoneală (boala Ormond); şi fibroză peritoneală / cicatrici peritoneale la pacienţii care primesc dializă peritoneală, de obicei, după transplant renal. Vezi, de exemplu, Wynn şi colab., 2004, Nat Rev Immunol. August; 4(8): 583-594. Prin urmare, prezenta invenţie se referă la compuşi şi compoziţii utilizate în metode de tratament sau prevenire a fibrozei/tulburărilor fibrotice ale şi/sau asociate cu organele majore, incluzând, de exemplu, plămân, ficat, rinichi, inimă, piele, ochi, tract gastrointestinal, peritoneu, şi măduvă osoasă, precum şi a altori boli/tulburări descrise aici.

Compuşii pot fi combinaţi cu agenţi care sunt utilizaţi ca tratamente pentru bolile renale, incluzând agenţi antidiabetici, agenţi pentru bolile cardiovasculare şi agenţi noi care ţintesc căile relevante pentru boli, cum ar fi stresul oxidativ (incluzând, dar fără limitare la, calea nrf2/keap-1) şi căile antiapoptotice (incluzând, dar fără limitare la, agenţi anti-p53).

Boala pulmonară interstiţială (ILD) include afecţiuni în care inflamaţia pulmonară şi fibroza sunt căile comune finale de patologie, de exemplu, sarcoidoză, silicoză, reacţii la medicamente, infecţii şi boli vasculare legate de colagen, cum ar fi artrită reumatoidă şi scleroză sistemică (sclerodermie). Afecţiunea fibrotică a plămânului include, de exemplu, fibroză pulmonară, fibroză pulmonară idiopatică (IPF), pneumonită interstiţială obişnuită (UIP), boală pulmonară interstiţială, alveolită fibrozantă criptogenă (AGC), bronşiolită obliterantă, şi bronşiectazie.

Fibroza pulmonară idiopatică (IPF) este cel mai frecvent tip de ILD, şi nu are o cauză cunoscută.

Compuşii pot fi combinaţi cu agenţi care sunt tratamente pentru IPF şi, posibil, pentru boli interstiţiale (ILD), incluzând nintedanib şi pirfenidonă.

Ciroza hepatică are cauze similare cu bolile interstiţiale (ILD) şi include, de exemplu, ciroza asociată cu hepatita virală, schistosomiază şi alcoolism cronic.

Boala renală poate fi asociată cu diabet, care poate deteriora şi cicatriza rinichii, ceea ce conduce la o pierdere progresivă a funcţiei, precum şi cu boli de hipertensiune. Fibroza renală poate să apară în orice stadiu al bolii renale, de la boală renală acută (AKD) după leziune şi boală renală cronică (CKD), cum ar fi CKD incidentă şi CKD progresivă, până la boală renală în stadiu terminal (ESRD). Fibroza renală se poate dezvolta ca urmare a unor boli cardiovasculare, cum ar fi hipertensiune arterială sau diabet, ambele punând o presiune imensă asupra funcţiei renale, ceea ce promovează un răspuns fibrotic. Cu toate acestea, fibroza renală poate fi şi idiopatică (fără o cauză cunoscută), şi anumite boli mitocondriale genetice prezintă, de asemenea, manifestări de fibroză renală şi simptome asociate.

Bolile de inimă pot avea ca rezultat formarea de ţesut cicatricial care poate afecta capacitatea inimii de a pompa.

Bolile oculare includ, de exemplu, degenerescenţă maculară şi retinopatie retiniană şi vitroasă, care pot afecta vederea.

Într-o variantă de realizare preferată, prezenta invenţie se referă la tratamentul sau prevenirea fibrozei pulmonare idiopatice (IPF).

Într-o altă variantă de realizare preferată, prezenta invenţie se referă la tratamentul sau prevenirea fibrozei renale.

Într-o altă variantă de realizare preferată, prezenta invenţie se referă la tratamentul sau prevenirea leziunii renale acute (AKI), în special, la pacienţi cu risc crescut. Exemplele includ AKI după intervenţie chirurgicală, de exemplu, transplant de organe, cum ar fi cea cauzată de ischemie-reperfuzie, funcţie întârziată a grefei; oncologice, cum ar fi AKI cauzată de chimioterapie; de la nefropatie indusă de mediu de contrast, cum ar fi citotoxicitate tubulară directă, ischemie hemodinamică şi efecte osmotice; de la nefrită interstiţială acută, cum ar fi cea cauzată de medicamente sau infecţii; AKI cauzată de obstrucţii, cum ar fi pietre la rinichi; şi AKI indusă de COVID-19. Un subgrup particular de pacienţi cu risc crescut sunt cei supuşi unei intervenţii chirurgicale cardiace, de exemplu, bypass coronarian şi/sau intervenţii chirurgicale valvulare. Există factori de risc statici stabiliţi pentru AKI, cum ar fi vârsta de 65 de ani sau peste, diabet dependent de insulină, CKD (adulţi cu o rată estimată de filtrare glomerulară [eGFR] mai mică decât 60 ml/min/1,73 m2 prezintă un risc deosebit), insuficienţă cardiacă, boală hepatică, antecedente de AKI.

Într-o altă variantă de realizare preferată, prezenta invenţie se referă la tratamentul sau prevenirea bolii renale acute (AKD) sau a bolii renale cronice (CKD) care decurge dintr-o astfel de AKI, incluzând, de exemplu, fibroza tubulointerstiţială şi nefropatia diabetică.

Într-o altă variantă de realizare preferată, prezenta invenţie se referă la tratamentul sau prevenirea bolilor hepatice, incluzând, dar fără limitare la, NAFLD, NASH, ciroză hepatică, hipertensiune portală, insuficienţă hepatică acută, şi carcinom hepatocelular. Bolile hepatice, cum ar fi NAFLD şi NASH, pot fi asociate cu diverse afecţiuni metabolice, cum ar fi sindrom metabolic şi diabet de tip II, care ar creşte, de asemenea, riscul pentru diverse patologii asociate diabetului, incluzând retinopatie diabetică şi neuropatii periferice.

Compuşii din invenţie sau compoziţiile farmaceutice ale acestora, aşa cum este descris aici, pot fi combinate cu unu sau mai mulţi agenţi suplimentari atunci când sunt utilizate pentru tratamentul sau prevenirea afecţiunilor care implică boli hepatice şi disfuncţie metabolică, incluzând metformin, sulfoniluree, inhibitori de DPP-4, agonişti de GLP-1, agonişti de PPAR, inhibitori de SGLT2, inhibitori de enzimă de transfoemare a angiotensinei (ACE) şi blocante ale receptorilor de angiotensină II (ARB-uri).

Sindromul Leigh este o tulburare neurometabolică ereditară rară care afectează sistemul nervos central. Această tulburare progresivă începe la sugari cu vârste cuprinse între trei luni şi doi ani. Rareori, apare la adolescenţi şi adulţi. Sindromul Leigh poate fi cauzat de mutaţii în ADN-ul nuclear care codifică proteinele mitocondriale, mutaţii în ADN-ul mitocondrial (sindromul Leigh ereditar pe cale maternă - MILS), sau de deficit de o enzimă denumită piruvat dehidrogenază situată pe braţul scurt al cromozomului X (sindromul Leigh legat de X). Simptomele sindromului Leigh progresează de obicei rapid. Cele mai timpurii semne pot fi o capacitate redusă de supt şi pierderea controlului capului şi a abilităţilor motorii. Aceste simptome pot fi însoţite de pierderea poftei de mâncare, vărsături, iritabilitate, plâns continuu şi convulsii. Pe măsură ce tulburarea progresează, simptomele pot include, de asemenea, slăbiciune generalizată, lipsa tonusului muscular şi episoade de acidoză lactică, care pot duce la afectarea funcţiei respiratorii şi renale.

În sindromul Leigh (MILS), ereditar pe cale maternă, mutaţiile genetice din ADN-ul mitocondrial (într-o proporţie mare, >90%) interferează cu sursele de energie care alimentează celulele dintr-o zonă a creierului care joacă un rol în mişcările motorii. Mutaţiile genetice din ADN-ul mitocondrial au ca rezultat o lipsă cronică de energie în aceste celule, ceea ce, la rândul său, afectează sistemul nervos central şi provoacă degenerarea progresivă a funcţiilor motorii. Atunci când mutaţiile genetice din ADN-ul mitocondrial care cauzează MILS sunt mai puţin abundente (mai puţin de 90%), afecţiunea este cunoscută cu denumirea de neuropatie ataxie şi retinită pigmentară (NARP). Există, de asemenea, o formă a bolii Leigh (denumită boala Leigh legată de cromozomul X), care este rezultatul mutaţiilor într-o genă care produce un alt grup de substanţe importante pentru metabolismul celular. Există o altă variantă a sindromului Leigh, denumită varianta franco-canadiană, caracterizată prin mutaţii într-o genă denumită LRPPRC. Simptome neurologice similare sunt exprimate ca cele din sindromul Leigh, deşi steatoza hepatică este frecvent observată, de asemenea, în varianta franco-canadiană.

Într-o variantă de realizare preferată, prezenta invenţie se referă la tratamentul sau prevenirea sindromului sau bolii Leigh, incluzând, de exemplu, boala Leigh legată de cromozomul X, varianta franco-canadiană a sindromului Leigh şi/sau simptomele asociate cu boala Leigh.

Compuşii pot fi combinaţi cu agenţi noi care pot fi utilizaţi ca tratamente pentru bolile mitocondriale, incluzând, dar fără limitare la, nicotinamidă ribozidă.

Referirile la „tratament» includ mijloace de ameliorare, atenuare a simptomelor, de eliminare a cauzei simptomelor, fie temporar, fie permanent. Compuşii din invenţie sunt utili în tratamentul bolilor descrise aici la oameni şi alte mamifere.

Într-o altă variantă de realizare, invenţia cuprinde terapia profilactică a bolilor descrise aici şi include mijloace pentru a preveni sau încetini apariţia simptomelor tulburării sau afecţiunii menţionate. Compuşii din invenţie sunt utili în prevenirea bolilor descrise aici la oameni şi la alte mamifere.

Un pacient care necesită tratament sau prevenţie poate fi, de exemplu, o fiinţă umană sau alt mamifer care suferă de afecţiunea respectivă sau prezintă riscul de a suferi de afecţiune.

Conform unui alt aspect, prezenta invenţie furnizează o compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus cu formula (I), aşa cum este definit aici, sau o sare acceptabilă farmaceutic a compusului sau a tautomerului menţionat, împreună cu un diluant sau purtător acceptabil farmaceutic.

Compoziţiile farmaceutice din invenţie cuprind oricare dintre compuşii din invenţie combinat cu orice purtător, adjuvant sau vehicul acceptabil farmaceutic. Exemple de purtători acceptabili farmaceutic sunt cunoscute de persoanele de specialitate în domeniu şi includ, dar fără limitare la, agenţi de conservare, agenţi de umplutură, agenţi de dezintegrare, agenţi de umectare, agenţi de emulsionare, agenţi de suspendare, agenţi de îndulcire, agenţi de aromatizare, agenţi de parfumare, agenţi antibacterieni, agenţi antifungici, agenţi de lubrifiere şi agenţi de dispersare, în funcţie de natura modului de administrare şi de formele de dozare. Compoziţiile pot fi sub formă de, de exemplu, tablete, capsule, pulberi, granule, elixire, pastile, supozitoare, siropuri şi preparate lichide, incluzând suspensii şi soluţii. Termenul „compoziţie farmaceutică», în contextul acestei invenţii, înseamnă o compoziţie care cuprinde un agent activ şi care cuprinde în plus unu sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic. Compoziţia poate conţine suplimentar ingrediente selectate, de exemplu, dintre diluanţi, adjuvanţi, excipienţi, vehicule, agenţi de conservare, agenţi de umplutură, agenţi de dezintegrare, agenţi de umectare, agenţi de emulsionare, agenţi de suspendare, agenţi de îndulcire, agenţi de aromatizare, agenţi de parfumare, agenţi antibacterieni, agenţi antifungici, agenţi de lubrifiere şi agenţi de dispersare, în funcţie de natura modului de administrare şi de formele de dozare.

Compuşii din invenţie sau compoziţiile farmaceutice ale acestora, aşa cum este descris aici, pot fi utilizate singure sau în combinaţie cu unu sau mai mulţi agenţi farmaceutici suplimentari. Compuşii pot fi combinaţi cu un agent terapeutic antitumoral suplimentar, de exemplu, medicamente chimioterapeutice sau inhibitori de alte proteine de reglare. Într-o variantă de realizare, agentul terapeutic antitumoral suplimentar este un mimetic BH-3. Într-o altă variantă de realizare, mimeticele BH-3 pot fi selectate dintre, dar fără limitare la, unu sau mai mulţi dintre ABT-737, ABT-199, ABT-263 şi Obatoclax. Într-o altă variantă de realizare, agentul antitumoral suplimentar este un agent chimioterapeutic. Agenţii chimioterapeutici pot fi selectaţi dintre, dar fără limitare la, olaparib, mitomicină C, cisplatină, carboplatină, oxaliplatină, radiaţii ionizante (IR), camptotecină, irinotecan, topotecan, temozolomidă, taxani, 5-fluoropirimidine, gemcitabină şi doxorubicină.

Pentru tratamentul sau prevenirea tulburărilor fibrotice, de exemplu, compuşii din invenţie sau compoziţiile farmaceutice ale acestora, aşa cum este descris aici, pot fi utilizate singure sau în combinaţie cu unu sau mai mulţi agenţi farmaceutici suplimentari selectaţi din grupul alcătuită din agenţi anticolinergici, mimetice beta-2, steroizi, inhibitori de PDE-IV, inhibitori de kinază p38 MAP, antagonişti de NK1, antagonişti de LTD4, inhibitori de EGFR, şi antagonişti ai endotelinei.

În particular, compuşii din invenţie sau compoziţiile farmaceutice ale acestora, aşa cum este descris aici, pot fi utilizate singure sau în combinaţie cu unu sau mai mulţi agenţi farmaceutici suplimentari selectaţi din grupul alcătuită din medicamente imunosupresoare generale, cum ar fi un corticosteroid, agenţi imunosupresori sau citotoxici sau antifibrotice, cum ar fi pirfenidonă sau un inhibitor nespecific al kinazei (de ex., nintedanib).

Compoziţiile farmaceutice din invenţie pot fi administrate în orice mod eficient, cum ar fi oral, parenteral, topic, prin inhalare, intranazal, rectal, intravaginal, ocular şi prin ureche. Compoziţii farmaceutice adecvate pentru administrarea compuşilor din prezenta invenţie, şi metode de preparare a acestora vor fi evidente cu uşurinţă pentru persoane de specialitate în domeniu. Astfel de compoziţii şi metode de preparare a acestora pot fi găsite, de exemplu, în "Remington's Pharmaceutical Sciences", ediţia a 19-a (Mack Publishing Company, 1995).

Administrare orală

Compuşii din invenţie pot fi administraţi oral. Administrarea orală poate implica înghiţirea, astfel încât compusul să intre în tractul gastrointestinal, sau se poate utiliza administrare bucală sau sublinguală, prin care compusul să intre în fluxul sanguin direct din gură.

Formulări adecvate pentru administrare orală includ formulări solide, cum ar fi tablete, capsule care conţin particule, lichide sau pulberi, pastile (care le includ pe cele umplute cu lichid), capsule masticabile, multiparticule şi nanoparticule, geluri, pelicule (incluzând mucoadezive), ovule, spray-uri, şi formulări lichide.

Formulările lichide includ suspensii, soluţii, siropuri şi elixire. Astfel de formulări pot fi utilizate ca materiale de umplutură în capsule moi sau tari şi cuprind, de obicei, un purtător, de exemplu, apă, etanol, propilenglicol, metilceluloză sau un ulei adecvat, şi unu sau mai mulţi agenţi de emulsionare şi/sau agenţi de suspendare. Formulările lichide pot fi preparate, de asemenea, prin reconstituire dintr-un solid, de exemplu, dintr-un pliculeţ.

Compuşii din invenţie pot fi utilizaţi, de asemenea, în forme farmaceutice cu dizolvare şi dezintegrare rapidă, cum ar fi cele descrise în Expert Opinion in Therapeutic Patents, 11 (6), 981-986 de Liang şi Chen (2001)).

O tabletă tipică poate fi preparată utilizând procedee standard cunoscute de un chimist specializat în formulări, de exemplu, prin comprimare directă, granulare (uscată, umedă sau prin topitură), întărire din topitură, sau prin extrudare. Formularea de tabletă poate cuprinde unu sau mai multe straturi şi poate fi acoperită sau neacoperită.

Exemple de excipienţi adecvaţi pentru administrare orală includ purtători, de exemplu, celuloză, carbonat de calciu, fosfat dicalciu dibazic, manitol şi citrat de sodiu, lianţi de granulare, de exemplu, polivinilpirolidină, hidroxipropilceluloză, hidroxipropilmetilceluloză şi gelatină, agenţi de dezintegrare, de exemplu, glicolat de amidon sodic şi silicaţi, agenţi de lubrifiere, de exemplu, stearat de magneziu şi acid stearic, agenţi de umectare, de exemplu, laurilsulfat de sodiu, conservanţi, antioxidanţi, arome şi coloranţi.

Formulările solide pentru administrare orală pot fi formulate cu eliberare imediată şi/sau modificată. Formulările cu eliberare modificată includ eliberare întârziată, susţinută, pulsată, dublu controlată, ţintită şi programată. Detalii despre tehnologiile adecvate de eliberare modificată, cum ar fi dispersiile de înaltă energie, particulele osmotice şi cele acoperite, se găsesc în Verma şi colab., Pharmaceutical Technology On-line, 25 (2), 1-14 (2001). Alte formulări cu eliberare modificată sunt descrise în brevetul US Nr. 6,106,864.

Administrare parenterală

Compuşii din invenţie pot fi administraţi, de asemenea, direct în fluxul sanguin, în muşchi sau într-un organ intern. Mijloacele adecvate pentru administrare parenterală includ administrare intravenoasă, intraarterială, intraperitoneală, intratecală, intraventriculară, intrauretrală, intrasternală, intracraniană, intramusculară şi subcutanată. Dispozitive adecvate pentru administrare parenterală includ injectoare cu ac (incluzând microac), injectoare fără ac, şi tehnici de perfuzie.

Formulările parenterale sunt, de obicei, soluţii apoase care pot conţine excipienţi, cum ar fi săruri, carbohidraţi şi agenţi de tamponare (de preferinţă, la un pH de la 3 la 9), dar, pentru unele aplicaţii, acestea pot fi formulate mai adecvat sub forma unei soluţii sterile neapoase, sau sub o formă uscată pentru a fi utilizată împreună cu un vehicul adecvat, cum ar fi apă sterilă, apirogenă.

Prepararea formulărilor parenterale în condiţii sterile, de exemplu, prin liofilizare, poate fi realizată cu uşurinţă utilizând tehnici farmaceutice standard bine-cunoscute de persoanele de specialitate în domeniu.

Solubilitatea compuşilor cu formula (I) utilizaţi în prepararea soluţiilor parenterale poate fi crescută printr-o prelucrare adecvată, de exemplu, utilizarea dispersiilor uscate prin pulverizare cu energie crescută şi/sau prin utilizarea unor tehnici de formulare adecvate, cum ar fi utilizarea agenţilor de creştere a solubilităţii.

Formulările pentru administrare parenterală pot fi formulate cu eliberare imediată şi/sau modificată. Formulările cu eliberare modificată includ eliberare întârziată, susţinută, pulsată, dublu controlată, ţintită şi programată.

Compoziţiile farmaceutice din prezenta invenţie includ, de asemenea, compoziţii şi metode cunoscute în domeniu pentru ocolirea barierei hematoencefalice, sau pot fi injectate direct în creier. Zonele adecvate pentru injectare includ cortexul cerebral, cerebelul, mezencefalul, trunchiul cerebral, hipotalamusul, măduva spinării şi ţesutul ventricular, precum şi zone ale SNP, incluzând corpul carotidian şi medulara suprarenală.

Administrare

Mărimea unei doze eficiente de un compus va varia, desigur, în funcţie de natura severităţii afecţiunii care trebuie tratată şi de calea de administrare. Selectarea dozelor adecvate este de competenţa medicului. Intervalul de doză zilnică este de aproximativ 10 µg până la aproximativ 100 mg pe kg de greutate corporală la un om şi un animal non-uman şi, în general, poate fi de aproximativ 10 µg până la 30 mg pe kg de greutate corporală la fiecare doză. Doza de mai sus poate fi administrată de la o dată la de trei ori pe zi.

De exemplu, administrarea orală poate necesita o doză zilnică totală de la 5 mg la 1000 mg, cum ar fi de la 5 la 500 mg, în timp ce o doză intravenoasă poate necesita doar de la 0,01 la 30 mg/kg de greutate corporală, cum ar fi de la 0,1 la 10 mg/kg, mai preferat, de la 0,1 la 1 mg/kg de greutate corporală. Doza zilnică totală poate fi administrată în doze unice sau divizate.

Persoana de specialitate va aprecia, de asemenea, că, în tratamentul sau prevenirea anumitor afecţiuni, compuşii din invenţie pot fi administraţi într-o singură doză, „la nevoie» (adică, după cum este necesar sau dorit).

Metodologii de sinteză

Compuşii cu formula (I) pot fi preparaţi utilizând metode descrise mai jos în schemele generale de reacţie şi în exemplele reprezentative. Acolo unde este cazul, transformările individuale din cadrul unei scheme pot fi efectuate într-o ordine diferită. Invenţia este ilustrată prin următoarele exemple nelimitative în care se utilizează următoarele abrevieri şi definiţii. Compuşii au fost caracterizaţi prin cromatografie de lichid - spectroscopie de masă (LCMS) sau 1RMN 1H, sau prin ambele.

Conform unui alt aspect, prezenta invenţie furnizează un procedeu de preparare a unui compus cu formula (I), care cuprinde deprotejarea compusului cu formula (III) utilizând metode standard pentru a obţine amina (II) care poate apoi să reacţioneze cu bromură de cianogen pentru a obţine compusul corespunzător cu formula (I):

în care PG este o grupare protectoare.

Într-un alt aspect, prezenta invenţie furnizează un compus, care este selectat dintre formulele (II) şi (III), în care PG este o grupare protectoare sau o sare a compusului menţionat.

Într-o variantă de realizare preferată, prezenta invenţie furnizează un compus, care este selectat dintre formulele (IIA) şi (IIIA):

în care PG este o grupare protectoare sau o sare a compusului menţionat.

Conform unui alt aspect, prezenta invenţie furnizează un procedeu de preparare a unui compus cu formula (III), care cuprinde oxidarea compusului cu formula (IV) utilizând metode standard, cum ar fi cu acid m-cloroperbenzoic, pentru a obţine N-oxid (V) care poate reacţiona apoi cu cianură de trimetilsilil şi clorură de dimetilcarbamoil pentru a obţine compusul corespunzător cu formula (III):

în care PG este o grupare protectoare.

Într-un alt aspect, prezenta invenţie furnizează un compus, care este selectat dintre formulele (IV) şi (V), în care PG este o grupare protectoare sau o sare a compusului menţionat.

Într-o variantă de realizare preferată, prezenta invenţie furnizează un compus, care este selectat dintre formulele (IVA) şi (VA):

în care PG este o grupare protectoare sau o sare a compusului menţionat.

Grupările protectoare sunt selectate, de preferinţă, dintre terţ-butiloxicarbonil (BOC), benziloxicarbonil (Cbz), p-metoxibenzil carbonil (MeOZ), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), acetil (Ac), benzoil (Bz), benzil (Bn), carbamat, p-metoxibenzil (PMB), 3,4-dimetoxibenzil (DMPM), p-metoxifenil (PMP), tosil (Ts), tricloroetoxicarbonil (Troc), 4-nitrobenzensulfonil (Nosyl) şi 2-nitrofenilsulfenil (Nps). Cele mai preferate sunt BOC şi Cbz.

Abrevieri

br s singlet larg (semnal RMN) MeOH metanol CO monoxid de carbon min minut (minute) d dublet (semnal RMN) MsCl clorură de metansulfonil dba dibenzilacetonă N2 azot (L)-DBTA acid dibenzoil-L-tartric monohidrat NMP N-metilpirolidonă DCM diclormetan p-TSA acid 4-toluensulfonic DMF N,N-dimetilformamidă rac racemic DMSO dimetilsulfoxid rt temperatura camerei d.r. raport diastereomeric Rf. factor de retenţie e.e. exces enantiomeric s singlet (semnal RMN) ES electropulverizare SFC cromatografie de fluid supercritic EtOAc acetat de etil SOCl2 clorură de tionil h oră (ore) TBD 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-enă H2 hidrogen TEA trietilamină HPLC cromatografie de lichid de înaltă performanţă TFA acid trifluoroacetic IPA propan-2-ol THF tetrahidrofuran LCMS Cromatografie de lichid - spectrometrie de masă TMSCN cianură de trimetilsilil m multiplet (semnal RMN) volum volume MeCN acetonitril

Metode LCMS / HPLC / SFC

Metoda C

Fază mobilă (A) 2 mM acetat de amoniu şi 0,1% acid formic în apă (B) 0,1% acid formic în acetonitril Instrument Waters ACQUITY H Class cu detector PDA şi SQ Coloană BEH C18 (50 mm x 2,1 mm) 1,7 µm Debit 0,550 mL/min Temperatura cuptorului cu coloană Ambiantă Timp de prelucrare 3,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 0,55 98 2 0,30 0,55 98 2 0,60 0,55 50 50 1,10 0,55 25 75 2,00 0,60 0 100 2,70 0,60 0 100 2,71 0,55 98 2 3,00 0,55 98 2

Metoda C1

Fază mobilă (A) 2 mM acetat de amoniu şi 0,1% acid formic în apă (B) 0,1% Acid formic în acetonitril Instrument Waters ACQUITY UPLC clasa H cu detector PDA şi SQ Coloană BEH C18 (50 mm x 2,1 mm) 1,7 µm Debit 0,550 mL/min Temperatura cuptorului cu coloană Ambiantă Timp de prelucrare 2,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,00 0,55 95 5 0,60 0,60 30 70 0,80 0,65 10 90 1,10 0,65 0 100 1,70 0,65 0 100 1,71 0,55 95 5 2,00 0,55 95 5

Metoda E

Fază mobilă (A) 0,1% v/v (30% v/v amoniac apos) în apă (B) 100% MeOH Instrument HPLC Waters e2695 cu detector PDA Coloană X-bridge C8 (250 x 4,6 mm), 5µm Temperatura cuptorului cu coloană 45 °C Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 45 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A %B 0,0 1,0 10 90 5,00 1,0 20 80 10,00 1,0 30 70 30,00 1,0 30 70 35,00 1,0 60 40 35,01 1,0 90 10 40,00 1,0 90 10 40,01 1,0 10 90 45,00 1,0 10 90

Metoda F

Fază mobilă (A) 10 mM acetat de amoniu în apă (B) 100 % Acetonitril Instrument Sistem RRLC Agilent 1290 Infinity ataşat cu detector de masă Agilent 6120 şi detector PDA Coloană YMC TRIART, C18 (150 mm x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Temperatura cuptorului cu coloană Ambiantă Timp de prelucrare 12,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 1,0 90 10 5,00 1,0 10 90 7,00 1,0 0 100 11,00 1,0 0 100 11,01 1,0 90 10 12,00 1,0 90 10

Metoda H

Fază mobilă (A) 5 mM bicarbonat de amoniu în apă (B) 100% Acetonitril Instrument Shimadzu Nexera UFLC cu detector de masă cu un singur cvadripol 2020 Coloană Waters X-Bridge C18 (50 x 4,6 mm) 3,5 µm Temperatura cuptorului cu coloană Ambiantă Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 8,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 1,0 95 5 3,50 1,0 10 90 4,50 1,0 5 95 6,00 1,0 5 95 6,01 1,0 95 5 8,00 1,0 95 5

Metoda H1

Fază mobilă (A) 5 mM bicarbonat de amoniu în apă (B) 100% Acetonitril Instrument Shimadzu Nexera UFLC cu detector de masă cu un singur cvadripol 2020 Coloană Waters X-Bridge C18 (50 x 4,6 mm) 3,5 µm Temperatura cuptorului cu coloană Ambiantă Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 6,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 1,0 95 5 2,80 1,0 15 85 3,50 1,0 5 95 5,00 1,0 5 95 5,01 1,0 95 5 6,00 1,0 95 5

Metoda H3

Fază mobilă (A) 5 mM bicarbonat de amoniu în apă (B) 100% Acetonitril Instrument Shimadzu Nexera UHPLC şi LCMS-2020 de înaltă presiune Coloană Waters X-Bridge C18 (50 x 4,6 mm), 3,5 µm Temperatura cuptorului cu coloană Ambiantă Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 6,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 1,0 95 5 2,80 1,0 15 85 3,50 1,0 5 95 5,00 1,0 5 95 5,01 1,0 95 5 6,00 1,0 95 5

Metoda X

Fază mobilă (A) 10 mM acetat de amoniu şi 0,1% acid formic în apă (B) 0,1% Acid formic în acetonitril Instrument Sistem RRLC Agilent 1290 Infinity ataşat cu detector de masă Agilent 6120 şi detector PDA Coloană YMC-Pack ODS-AQ (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Temperatura cuptorului cu coloană Ambiantă Timp de prelucrare 30,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 1,0 90 10 10,00 1,0 60 40 20,00 1,0 20 80 25,00 1,0 0 100 28,00 1,0 0 100 28,01 1,0 90 10 30,00 1,0 90 10

Metoda X2

Fază mobilă (A) 0,1% v/v (30% v/v amoniac apos) în apă (B) 0,1% v/v (30% v/v amoniac apos) în acetonitril Instrument HPLC Waters e2695 cu detector PDA Coloană X-bridge C8 (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 40,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,0 1,0 95 5 5,00 1,0 95 5 10,00 1,0 70 30 15,00 1,0 70 30 25,00 1,0 40 60 30,00 1,0 10 90 35,00 1,0 10 90 35,01 1,0 95 5

Metoda Y4

Fază mobilă (A) Dioxid de carbon lichid (B) 0,1% Dietilamină în propan-2-ol: acetonitril (50:50) Instrument Waters SFC Investigator şi detector PDA Coloană Chiralpak IH (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 4,0 mL/min Timp de prelucrare 10,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % B la început % B la final 0 până la 5 4,0 5 50 5 până la 10 4,0 50 50

Metoda Y11

Fază mobilă (A) 0,1% Dietilamină în n-hexan (B) 0,1% Dietilamină în propan-2-ol: acetonitril (70-30) Instrument HPLC Agilent seria 1260 şi detector PDA Coloană Chiralpak IC (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 25,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 1,0 80 20 5,00 1,0 50 50 10,00 1,0 30 70 20,00 1,0 30 70 20,01 1,0 80 20 25,00 1,0 80 20

Metoda Y13

Fază mobilă (A) Dioxid de carbon lichid (B) 0,1% Dietilamină în propan-2-ol: acetonitril (50:50) Instrument Waters SFC Investigator şi detector PDA Coloană Chiralpak IC (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 4,0 mL/min Timp de prelucrare 8,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % B la început % B la final 0 până la 5 4,0 5 50 5 până la 8 4,0 50 50

Metoda Y15

Fază mobilă (A) 0,1% Dietilamină în n-hexan (B) 0,1% Dietilamină în propan-2-ol: acetonitril (70:30) Instrument HPLC Agilent seria 1260 şi detector PDA Coloană Chiralpak IC (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 25,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 1,0 80 20 5,00 1,0 45 55 10,00 1,0 30 70 15,00 1,0 30 70 20,00 1,0 80 20 25,00 1,0 80 20

Metoda Y17

Fază mobilă (A) 0,1% Dietilamină în metanol (B) 0,1% Dietilamină în acetonitril Instrument HPLC Agilent seria 1260 şi detector PDA Coloană Chiralpak IG (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 20,0 min Izocratic Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 20,00 50 50

Metoda Y20

Fază mobilă (A) Dioxid de carbon lichid (B) 0,1% Dietilamină în propan-2-ol: acetonitril (50:50) Instrument Waters SFC Investigator şi detector PDA Coloană Chiralpak IH (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 4,0 mL/min Timp de prelucrare 9,0 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % B la început % B la final 0 până la 5 4,0 5 50 5 până la 9 4,0 50 50

Metoda Y22

Fază mobilă (A) Dioxid de carbon lichid (B) 0,2% NH4OH în metanol Instrument Waters SFC Investigator cu detector PDA Coloană Chiralpak IC (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 4,0 mL/min Timp de prelucrare 10 min. Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % B la început % B la final 0 până la 5 4,0 5 50 5 până la 10 4,0 50 50

Metoda Y23

Fază mobilă (A) 0,1% Dietilamină în metanol (B) Dioxid de carbon lichid Instrument HPLC Agilent seria 1100 cu detector PDA Coloană Chiralpak IG (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 8 min. Izocratic Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0 până la 8 1,0 100 0

Metoda Y24

Fază mobilă (A) Dioxid de carbon lichid (B) 0,1% Dietilamină în metanol: acetonitril (50:50) Instrument Waters SFC Investigator cu detector PDA Coloană Chiralpak AD-H (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 4,0 mL/min Timp de prelucrare 14 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % B la început % B la final 0 până la 5 4,0 5 50 5 până la 9 4,0 50 50

Metoda Y25

Fază mobilă (A) Dioxid de carbon lichid (B) 0,1% Dietilamină în propan-2-ol: acetonitril (50:50) Instrument Waters SFC Investigator cu detector PDA Coloană Chiralpak AD-H (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 4,0 mL/min Timp de prelucrare 15 min Gradient Timp (min) Debit (mL/min) % B la început % B la final 0 până la 5 4,0 5 50 5 până la 10 4,0 50 50

Metoda Y26

Fază mobilă (A) 0,1% Dietilamină în metanol (B) Dioxid de carbon lichid Instrument HPLC Agilent seria 1100 cu detector PDA Coloană Chiralpak IG (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 9 min. Izocratic Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0 până la 9 1,0 100 0

Metoda Y28

Fază mobilă (A) 0,1% Dietilamină în n-hexan (B) 0,1% Dietilamină în propan-2-ol: acetonitril (70:30) Instrument HPLC seria Agilent 1260 Infinity cu detector PDA Coloană Chiralpak IC (250 x 4,6 mm), 5 µm Debit 1,0 mL/min Timp de prelucrare 40,0 min Izocratic Timp (min) Debit (mL/min) % A % B 0,01 până la 40 1,0 60 40

Intermediar A

5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilat de etil

(i) i-PrMgCl, THF, rt; (ii) TFA, DCM, 0 °C până la rt; (iii) TEA, DCM, 0 °C până la rt.

Etapa (i)

(2-oxo-2-(piridin-4-il)etil)carbamat de terţ-butil

Clorhidrat de 4-bromopiridină (CAS 19524-06-2, de la CombiBlocks, 8,0 g, 41,2 mmoli) a fost tratat cu soluţie apoasă de 5% Na2CO3 (300 mL) şi a fost extras cu DCM (2 x 100 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 şi a fost concentrat la presiune redusă. Reziduul a fost dizolvat imediat în THF anhidru (50 mL) şi a fost adăugată prin picurare clorură de izopropilmagneziu (2 M în THF, 20,57 mL, 41,2 mmoli) la rt în N2. Soluţia închisă la culoare rezultată a fost agitată la rt timp de 1,5 ore, timp în care s-a format un precipitat. Între timp, la o suspensie agitată de (2-(metoxi(metil)amino)-2-oxoetil)carbamat de terţ-butil (7,1 g, 32,9 mmoli) în THF (50 mL) a fost adăugată prin picurare clorură de izopropilmagneziu (2 M în THF, 16,4 mL, 32,9 mmoli) la 0 °C. Soluţia a fost agitată timp de 10 minute înainte de a fi adăugată prin picurare la rt la soluţia de piridil Grignard. Amestecul a fost agitat la rt timp de 16 ore, apoi a fost turnat în apă (200 mL) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 200 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 şi au fost concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană (30% EtOAc în n-hexani) pentru a obţine (2-oxo-2-(piridin-4-il)etil)carbamat de terţ-butil (4,8 g, 20,3 mmoli, randament 49%).

LCMS: Metoda C, 1,40 min, MS: ES+ 237,1; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 8,88 - 8,89 (d, J= 5,6 Hz, 2H), 7,77 - 7,79 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 5,49 (br s, 1H), 4,69 - 4,71 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 1,52 (s, 9H).

Etapa (ii)

Sare TFA de 2-amino-1-(piridin-4-il)etan-1-onă

La o soluţie agitată de (2-oxo-2-(piridin-4-il)etil)carbamat de terţ-butil (4,8 g, 20,34 mmoli) în DCM (50 mL) a fost adăugat prin picurare TFA (2,4 mL, 5 vol.) la 0 °C. Amestecul a fost încălzit lent la rt şi a fost agitat timp de 2 ore, apoi a fost concentrat la presiune redusă cu DCM (3 x 100 mL) pentru a obţine sarea TFA de 2-amino-1-(piridin-4-il)etan-1-onă (7,0 g, randament cantitativ).

LCMS: Metoda C, 0,29 min, MS: ES+ 136,96; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,91 - 8,93 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 8,36 (br s, 3H), 7,92 - 7,94 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 4,68 (t, J = 5,2 Hz, 2H).

Etapa (iii)

5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilat de etil

Această reacţie a fost efectuată în duplicat. La o soluţie agitată de sare TFA de 2-amino-1-(piridin-4-il)etan-1-onă (3,0 g, 12 mmoli) în DCM (80 mL) a fost adăugat prin picurare TEA (3,75 g, 5,17 mL, 37,2 mmoli) la rt. Clorooxalat de etil (1,63 g, 1,33 mL, 12 mmoli) a fost adăugat prin picurare la 0 °C. Amestecul a fost încălzit lent la rt şi a fost agitat timp de 24 de ore. Cele două loturi au fost combinate şi turnate în apă (200 mL) şi au fost extrase cu DCM (2 x 200 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 şi au fost concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană (40% EtOAc în n-hexani) pentru a obţine 5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilat de etil (0,45 g, 2,06 mmoli, randament 10% în 2 etape).

LCMS: Metoda C, 1,29 min, MS: ES+ 219,25; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,74 - 8,75 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 8,29 (s, 1H), 7,79 - 7,80 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 4,40-4,45 (q, J = 7,2, Hz, 2H), 1,37 (t, J = 6,8 Hz, 3H).

Intermediar B

Rac (3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

(i) EtOC(A)Cl, NaOH, DCM, 0 °C până la rt; (ii) NaH, DMF, 3-clorobut-1-enă, 0 °C până la rt; (iii) HCO2H, 0 °C apoi 100 °C; (iv) N-benzilglicină, toluen, 110 °C; (v) HCl concentrat, 110 °C; (vi) (BOC)2O, TEA, 4-dimetilaminopiridină, DCM, 0 °C până la rt; (vii) separare cromatografică;

(viii) Pd(OH)2, MeOH, H2, art.

Etapa (i)

(2,2-dimetoxietil)carbamat de etil

La o soluţie agitată de 2,2-dimetoxietan-1-amină (CAS 22483-09-6, de la Combi-blocks, 12,5 g, 118,9 mmoli) în DCM (100 mL) a fost adăugată prin picurare la 0 °C o soluţie apoasă de hidroxid de sodiu (5,2 g, 130,8 mmoli) în apă (31 mL). A fost adăugat cloroformiat de etil (14,2 g, 130,8 mmoli), şi amestecul a fost agitat la rt timp de 16 ore. Acest amestec şi un amestec de reacţie în duplicat au fost turnate în apă (500 mL) şi au fost extrase cu DCM (3 x 500 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă pentru a obţine (2,2-dimetoxietil)carbamat de etil (36,5 g, randament cantitativ).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,15 (s, 1H), 4,34 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 3,98 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 3,24 (s, 6H), 3,05 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 1,15 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

Etapa (ii)

But-3-en-2-il-(2,2-dimetoxietil)carbamat de etil

La o soluţie agitată de (2,2-dimetoxietil)carbamat de etil (12,1 g, 68,3 mmoli) în DMF (50 mL) a fost adăugat în porţii NaH (60% în ulei mineral, 6,84 g, 170,9 mmoli), timp de 2 ore, la 0 °C. Amestecul a fost agitat la 0 °C timp de 2 ore, apoi a fost adăugată 3-clorobut-1-enă (7,6 mL, 75,2 mmoli), şi amestecul a fost agitat la rt timp de 20 de ore. Acest amestec şi două amestecuri de reacţie în duplicat au fost stinse în apă răcită cu gheaţă (300 mL) şi au fost extrase cu EtOAc (3 x 500 mL). Fazele organice combinate au fost spălate cu apă rece (3 x 150 mL) şi saramură (2 x 150 mL). Faza organică a fost uscată peste Na2SO4 anhidru şi a fost concentrată la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană (oxid de aluminiu bazic, 5% EtOAc în n-hexani) pentru a obţine but-3-en-2-il-(2,2-dimetoxietil)carbamat de etil (15,5 g, 67,0 mmoli, randament 28%, în două etape).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 5,88 - 5,94 (m, 1 H), 5,08 - 5,11 (m, 2H), 4,41 - 4,48 (m, 2H), 4,05 - 4,06 (m, 2H), 3,18 - 3,35 (m, 8H), 1,18 - 1,24 (m, 6H).

Etapa (iii)

But-3-en-2-il(2-oxoetil)carbamat de etil

La o soluţie agitată de but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamat de etil (15,5 g, 67,0 mmoli) a fost adăugat prin picurare acid formic (36 mL) la 0 °C. Amestecul a fost încălzit la 100 °C timp de 2 ore, apoi a fost răcit la rt, a fost turnat în apă răcită cu gheaţă (200 mL) şi a fost extras cu EtOAc (3 x 300 mL). Fazele organice combinate au fost spălate cu soluţie saturată de NaHCO3 (3 x 100 mL). Faza organică a fost uscată peste Na2SO4 anhidru şi a fost concentrată la presiune redusă pentru a obţine but-3-en-2-il-(2-oxoetil)carbamat de etil (11,3 g, 61,1 mmoli, randament 91%).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 9,47 (s, 1H), 5,75 - 5,85 (m, 1H), 5,10 - 5,15 (m, 2H), 4,65 - 4,77 (m, 1H), 3,80 - 4,07 (m, 4H), 1,10 - 1,18 (m, 6H).

Etapa (iv)

rac (3aR,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de etil

La o soluţie agitată de but-3-en-2-il-(2-oxoetil)carbamat de etil (4,7 g, 25,4 mmoli) în toluen (100 mL) a fost adăugată N-benzilglicină (CAS 17136-36-6, de la Combi-blocks, 4,2 g, 25,4 mmoli) la rt. Amestecul a fost încălzit la 110 °C timp de 16 ore, apoi a fost concentrat la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană (oxid de aluminiu bazic, 7% EtOAc în n-hexani) pentru a produce rac (3aR,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de etil (3,2 g, 11,1 mmoli, randament 43%).

LCMS: Metoda C, 1,33 min, două vârfuri largi fuzionate, fără separare la nivelul liniei de referinţă a celor doi diastereomeri, MS: ES+ 289,3.

Etapa (v)

Sare de clorhidrat de rac (3aR, 6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol

O soluţie agitată de rac (3aR,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de etil (3,2 g, 11,1 mmoli) în HCl concentrat (40 mL, 12,5 vol.) a fost încălzită la 100 °C timp de 16 ore. Amestecul a fost răcit la rt şi a fost concentrat la presiune redusă pentru a obţine sare de rac-(3aR, 6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol HCl (3,72 g, randament cantitativ).

LCMS: Metoda F, 4,45 min şi 4,92 min, doi diastereomeri, MS: ES+ 217,3.

Etapa (vi)

rac (3aR,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La o soluţie agitată de sare HCl rac-(3aR,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidro-

pirolo[3,4-b]pirol (3,7 g, 14,65 mmoli) în DCM (40 mL) au fost adăugate trietilamină (10,3 mL, 73,5 mmoli), 4-dimetilaminopiridină (0,09 g, 0,73 mmoli) şi dicarbonat de di-terţ-butil (3,83 g, 17,58 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 5 ore, apoi a fost turnat în apă (100 ml) şi a fost extras cu DCM (2 x 150 ml). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru şi au fost concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost dus prin separare cromatografică la Etapa (vii).

Etapa (vii)

rac-(3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (izomer majotitar) şi

rac-(3aR,4S,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (izomer minoritar)

Reziduul din Etapa (vi) a fost purificat prin cromatografie pe coloană (oxid de aluminiu bazic, 2% EtOAc în n-hexani) pentru a obţine două fracţiuni separate într-un raport de 4,2:1.

Prima fracţiune care a eluat, Fracţiunea 1, rac-(3aR,4S,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (izomer minoritar, 0,50 g) a fost izolat sub forma unui ulei incolor. TLC: Rf 0,5 (30% EtOAc/n-hexani).

LCMS: Metoda C, 1,46 min, MS: ES+ 317,4 şi Metoda X, 13,70 min, MS: ES+ 317,3.

Cea de-a doua fracţiune care a eluat, Fracţiunea 2, rac-(3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (izomer majoritar, 2,10 g, 6,63 mmoli, randament 45%) a fost izolat sub forma unui ulei incolor. TLC: Rf 0,4 (30% EtOAc/n-hexani).

LCMS: Metoda C, 1,46 min, MS: ES+ 317,4 şi Metoda X, 13,37 min, MS: ES+ 317,3; d.r. 99:1 prin Metoda X.

Fracţiunea 2 a fost reportată în Etapa (viii).

Etapa (viii)

rac-(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La o soluţie agitată de rac-(3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]-pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (Fracţiunea 2, izomer majoritar, 0,50 g, 1,58 mmoli) în MeOH (10 mL) a fost adăugat 20% Pd(OH)2 (50% umiditate, 250 mg, 50% g/g), şi a fost purjată cu H2 gazos timp de 4 ore la rt. Amestecul a fost filtrat printr-un pat de Celite, a fost spălat cu MeOH (50 mL) şi a fost concentrat la presiune redusă pentru a obţine rac-(3aS.,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (0,33 g, 1,46 mmoli, randament 92%).

LCMS: Metoda C, 1,29 min, MS: ES+ 227,32.

Intermediar C

(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

Etapa (i)

(2,2-dimetoxietil)-D-alaninat de metil

La un amestec agitat de 2,2-dimetoxiacetaldehidă (97,01 g, 931,89 mmoli) în MeOH (100 mL) a fost adăugat D-alaninat de metil HCl (100,0 g, 716,84 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost agitat la rt timp de 2 ore. A fost adăugată în porţii cianoborohidrură de sodiu (58,52 g, 931,89 mmoli) în atmosferă de N2 la 0 °C şi a fost agitat la rt timp de 18 ore. Amestecul a fost filtrat peste Celite şi a fost spălat cu MeOH (2 x 200 mL). Filtratul a fost concentrat la presiune redusă, iar reziduul a fost turnat în apă (1000 mL) şi a fost extras cu DCM (2 x 1000 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste sulfat de sodiu şi au fost concentrate la presiune redusă la 40 °C pentru a obţine (2,2-dimetoxietil)-D-alaninat de metil sub forma unui ulei galben pal (135,0 g, 705,95 mmoli, randament 98%).

1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 4,41 - 4,54 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,47 - 3,50 (m, 1H), 3,38 - 3,46 (m, 6H), 2,76 - 2,81 (m, 1H), 2,64 - 2,68 (m, 1H), 1,31 - 1,35 (d, J = 7,2 Hz, 3H).

Metoda a fost repetată de trei ori în mod identic, utilizând D-alaninat de metil HCl (la o scară de 500 g, 1200 g şi 1200 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (680 g, 1625 g şi, respectiv, 1625 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 4065 g, 21,25 moli.

Etapa (ii)

N-(2,2-dimetoxietil)-N-(etoxicarbonil)-D-alaninat de metil

La un amestec agitat de bicarbonat de sodiu (88,95 g, 1058 mmoli) în apă (810 mL) a fost adăugată o soluţie de (2,2-dimetoxietil)-D-alaninat de metil (135 g, 705,95 mmoli) în THF (810 mL) la rt. La soluţia bifazică răcită (-5 până la 5 °C) a fost adăugat cloroformiat de etil (91,93 g, 847,14 mmoli), şi amestecul a fost agitat la rt timp de 2 ore. Amestecul a fost turnat în apă (1,35 L) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 675 mL). Fazele organice combinate au fost spălate cu soluţie saturată de KHSO4 (675 mL), au fost uscate peste sulfat de sodiu şi au fost concentrate la presiune redusă, la 40 °C pentru a obţine N-(2,2-dimetoxietil)-N-(etoxicarbonil)-D-alaninat de metil sub forma unui ulei (150,0 g, 569,71 mmoli, randament 80%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 4,52 (m, 2H), 4,15 - 4,27 (m, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,40 - 3,63 (m, 9H), 1,50 - 1,52 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 1,23 - 1,39 (m, 3H).

Metoda a fost repetată de patru ori în mod identic, utilizând (2,2-dimetoxietil)-D-alaninat de metil (la o scară de 680 g, 1000 g, 1000 g şi 1250 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (775 g, 1360 g, 1365 g şi, respectiv, 1375 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 5025 g, 19,09 moli.

Etapa (iii)

(R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamat de etil

La un amestec agitat N-(2,2-dimetoxietil)-N-(etoxicarbonil)-D-alaninat de metil (100 g, 379,8 mmoli) în etanol (1,8 L) şi THF (200 mL) a fost adăugat prin picurare LiBH4 (2M în THF, 949,5 mL, 1899,04 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost agitat la rt timp de 18 ore, apoi a fost stins prin adăugare de două ori a unei soluţii reci de clorură de amoniu (50 g) în apă (500 mL), şi a fost concentrat la presiune redusă pentru a îndepărta solventul organic mai volatil. Reziduul a fost preluat în EtOAc (500 mL). Faza organică a fost separată, a fost uscată peste sulfat de sodiu şi a fost concentrată la presiune redusă la 40 °C pentru a obţine (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamat de etil sub forma unui ulei (72,0 g, 306,01 mmoli, randament 81%).

1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 4,85 - 4,86 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,15 - 4,24 (m, 3H), 3,71 - 3,72 (m, 2H), 3,41 - 3,56 (m, 6H), 3,14 -3,19 (m, 1H), 2,99 - 3,05 (m, 2H), 1,28 - 1,34 (m, 3H), 1,13 - 1,15 (m, 1H), 1,03 - 1,05 (m, 1H).

Metoda a fost repetată de cinci ori în mod identic, utilizând N-(2,2-dimetoxietil)-N-(etoxicarbonil)-D-alaninat de metil (la o scară de 500 g, 500 g, 1200 g, 1200 g şi 1200 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (336 g, 336 g, 929 g, 930 g şi, respectiv, 930 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 3533 g, 15,01 moli.

Etapa (iv)

(R)-(2,2-dimetoxietil)(1-oxopropan-2-il)carbamat de etil

La un amestec agitat de (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamat de etil (400,0 g, 1700,1 mmoli) în DCM:apă (1,04 L, 1:1) au fost adăugate NaHCO3 (428 g, 5100 mmoli) şi TEMPO (2,6 g, 17,0 mmoli) la rt. O soluţie de hipoclorit de sodiu (soluţie 1M NaOCl a fost proaspăt preparată din NaOCl solid: 5H2O, 391,1 g, 2210,13 mmoli, diluat cu 4,98 L apă) a fost adăugată la soluţia bifazică la 0 °C. Amestecul a fost încălzit la rt şi a fost agitat timp de 18 ore, apoi a fost stins cu grijă cu o soluţie apoasă de tiosulfat de sodiu 10% (g/v) (2,8 L) şi a fost extras cu DCM (2 x 4,0 L). Faza organică a fost uscată peste sulfat de sodiu şi a fost concentrată la presiune redusă la 40 °C pentru a obţine (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamat de etil sub forma unui ulei (360 g, 1543,3 mmoli, randament 90,78%).

1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 9,59 (s, 1H), 4,46 - 4,48 (m, 1H), 4,16 - 4,24 (m, 2H), 3,84 - 3,89 (m, 1H), 3,52 - 3,56 (m, 1H), 3,42 - 3,47 (m, 6H), 3,30 - 3,40 (m, 1H), 1,38 - 1,41 (m, 3H), 1,22 - 1,34 (m, 3H).

Metoda a fost repetată de trei ori în mod identic utilizând (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamat de etil (1100 g, 840 g şi 1200 g) pentru a furniza compusul din subtitlu (1026 g, 820 g şi, respectiv, 1020 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 3226 g, 13,83 moli.

Etapa (v)

(R)-but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamat de etil

La un amestec agitat de bromură de metiltrifenilfosfoniu (137,7 g, 385,8 mmoli) în THF (1,8 L) a fost adăugat prin picurare KHMDS (1M în THF, 401,26 ml, 401,2 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost agitat la rt timp de 1 oră, apoi a fost adăugată prin picurare o soluţie de (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamat de etil (72,0 g, 308,6 mmoli) în THF (576 mL) la -78 °C în N2. Amestecul a fost agitat la rt timp de 18 ore, apoi a fost stins cu MeOH (2,2 ml) şi a fost agitat timp de 30 de minute la rt. Amestecul a fost concentrat, a fost distilat concomitent cu hexan (3 x 1500 ml), a fost răcit la 0 °C şi filtrat pentru a îndepărta MePPh2O şi PPh3O precipitate. Faza organică a fost concentrată, a fost răcită şi a fost filtrată din nou. Filtratul rezultat a fost concentrat la presiune redusă la 40 °C pentru a obţine (R)-but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamat de etil (65 g, 1543,3 mmoli, randament 91%) sub forma unui ulei maro deschis.

1H RMN (400 MHz, CDCl3) ppm: δ 5,92 - 6,03 (m, 1H), 5,11 - 5,16 (m, 1H), 4,52 (s, 2H), 4,17 - 4,23 (m, 2H), 3,45 (s, 6H), 3,27 (m, 2H), 2,67 - 2,72 (m, 1H), 1,26 - 1,33 (m, 6H).

Metoda a fost repetată de trei ori în mod identic, utilizând (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamat de etil (735 g, 1417 g şi 1020 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (644 g, 1262 g şi, respectiv, 860 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 2831 g, 12,24 moli.

Etapa (vi)

(R)-but-3-en-2-il(2-oxoetil)carbamat de etil

La un amestec agitat de (R)-but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamat de etil (300,0 g, 1297,07 mmoli) în acetonă (6,0 L) şi apă (600 mL) a fost adăugat acid p-toluen sulfonic monohidrat (78,9 g, 415,06 mmoli) la rt. Amestecul a fost încălzit la 60 °C timp de 18 ore, a fost lăsat să se răcească la rt şi a fost concentrat la presiune redusă. Amestecul a fost concentrat, iar reziduul a fost turnat în soluţie saturată de NaHCO3 (1500 mL) şi a fost extrasă cu EtOAc (2 x 1000 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă pentru a obţine (R)-but-3-en-2-il(2-oxoetil)carbamat de etil sub forma unui ulei galben pal (230 g, 1242,5 mmoli, randament 96%).

1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 9,55 (s, 1H), 5,79 - 5,86 (m, 1H), 5,05 - 5,25 (m, 2H), 5,00 - 5,05 (m, 1H), 4,12 - 4,22 (m, 2H), 3,70 - 3,92 (m, 2H), 1,24 - 1,31 (m, 6H).

Metoda a fost repetată de trei ori în mod identic, utilizând (R)-but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamat de etil (1020 g, 670 g şi 860 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (795 g, 480 g, respectiv, 605 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 2110 g, 11,39 moli.

Etapa (vii)

(3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de etil, amestec cu (3aS,4R,6aS)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de etil (amestec de diastereomeri ~70 : 30)

Într-un balon cu fund rotund de 10 L, echipat cu un aparat Dean-Stark, un amestec de (R)-but-3-en-2-il-(2-oxoetil)carbamat de etil (200,0 g, 1079,7 mmoli) în toluen (7,2 L, 36 vol.) a fost agitat la rt. La amestec a fost adăugată benzilglicină (214,02 g, 1295,7 mmoli), care a fost apoi încălzit la 120 °C timp de 18 ore, a fost lăsat să se răcească la rt şi a fost concentrat la presiune redusă. Reziduul a fost turnat în soluţie saturată de NaHCO3 (2000 mL) şi a fost extrasă cu DCM (2 x 1000 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă pentru a obţine compuşii din subtitlu (amestec de diastereomeri ~70 : 30) sub forma unui ulei maro (306,0 g, 1061,06 mmoli, randament 98%).

LCMS: Metoda H3, 3,46 min, amestec de diastereomeri, MS: ES+ 289,2; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 7,16 - 7,40 (m, 5H), 4,16 (m, 2H), 3,91 (m, 2H), 3,65 (m, 1H), 3,49 (m, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,18 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,64 - 2,72 (m, 1H), 2,40 (s, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,30 (t, 3H), 1,20 (d, J = 5,2 Hz, 3H); HPLC chirală: Metoda Y26, 5,23 min - vârf majoritar; 5,61 min - vârf minoritar.

Metoda a fost repetată de trei ori în mod identic, utilizând (R)-but-3-en-2-il-(2-oxoetil)carbamat de etil (515 g, 600 g şi 760 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (751 g, 880 g şi, respectiv, 970 g). Greutatea combinată a tuturor celor patru loturi: 2907 g, 10,09 moli.

Etapa (viii)

(3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol, amestec cu (3aS,4R,6aS)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol

Un amestec agitat de produs din Etapa (vii) (amestec de diastereomeri ~70 : 30, 300,0 g, 1040,25 mmoli) în HBr apos (48% greutate, 1988 mL, 16644,12 mmoli) a fost încălzit la reflux timp de 6 ore. Amestecul a fost turnat în apă (1,5 L, 5 vol) şi a fost spălat cu toluen (3 x 600 mL, 2 vol). Stratul apos a fost alcalinizat cu K2CO3 (~2,0 kg, 14563,5 mmoli) până la pH ~10 şi a fost extras cu DCM (3 x 1,5 L). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost dizolvat în DCM (500 mL) şi a fost spălat bine cu soluţie 1N de NaOH (150 mL). Stratul apos a fost extras cu DCM (200 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă pentru a obţine compuşii din subtitlu (amestec de diastereomeri ~70 : 30) sub forma unui ulei maro (155,0 g, 716,49 mmoli, randament 69%). LCMS: Metoda F, 3,05 min, amestec de diastereomeri, MS: ES+ 217,2; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 7,21 - 7,40 (m, 5H), 3,63 - 3,87 (m, 1H), 3,42 - 3,59 (m, 1H), 3,08 - 3,23 (m, 1H), 2,83 - 3,09 (m, 3H), 2,77 (m, 1H), 2,65 (s, 1H), 2,20 - 2,36 (m, 2H), 1,99 (m, 1H), 1,49 (m, 1H), 1,02 - 1,21 (m, 3H); HPLC chirală: Metoda Y26, 4,98 min şi 5,55 min, au fost observate doar două vârfuri distincte.

Metoda a fost repetată de două ori în mod identic utilizând (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de etil (amestec de diastereomeri în raport de ~70 : 30, 1100 g şi 1700 g) pentru a obţine compuşii din subtitlu (575 g şi, respectiv, 838 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 1568 g, 7,24 moli.

Etapa (ix)

(3aR,4R,6aR)-1-Benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol. Sare 0,5 (L)-DBTA

La produsul din Etapa (viii) (amestec de diastereomeri ~70 : 30, 2,5 g, 11,56 mmoli) a fost adăugată 2,5% apă în THF (19,2 mL). A fost adăugată o soluţie de acid (2R,3R)-2,3-bis(benzoiloxi)succinic hidrat (1,28 g, 3,57 mmoli, de la Angene) în 2,5% apă în THF (6,8 mL, 2,75 vol.) la rt, şi soluţia a fost agitată la rt timp de 2,5 ore. Solidul precipitat a fost colectat prin filtrare la presiune redusă, iar turta de filtrare a fost spălată cu 2,5% apă în THF (2 x 10 mL) pentru a obţine un solid alb (3,0 g).

O suspensie de solid alb (3,0 g) în 2,5% apă în THF (36 mL) a fost încălzită la reflux timp de 1 oră pentru a obţine o soluţie limpede. Amestecul a fost apoi lăsat să se răcească la rt timp de 1 oră, apoi a fost menţinut fără agitare timp de 1 oră la rt. Solidul cristalizat a fost colectat prin filtrare la presiune redusă, iar turta de filtrare a fost spălată cu 2,5% apă în THF (2 x 10 mL) şi a fost uscată la presiune redusă la 40 °C pentru a produce (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol. 0,5 L-DBTA sub forma unui solid alb (2,4 g, 3,03 mmoli, randament 26%).

HPLC chirală: Metoda Y22, 5,35 min.

Etapa (ix): alternativă

La produsul din Etapa (viii) (amestec de diastereomeri ~70 : 30, 150,0 g, 693,38 mmoli) a fost adăugată 2,5% apă în THF (1,2 L). Soluţia a fost însămânţată cu (3aR, 4R, 6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol. sarea 0,5 (L)-DBTA din lotul sintetizat anterior (700 mg). O soluţie de acid (2R,3R)-2,3-bis(benzoiloxi)succinic hidrat (79,50 g, 221,88 mmoli, de la Angene) în 2,5% apă în THF (412 mL, 2,75 vol) a fost adăugat la rt, şi soluţia a fost agitată la rt timp de 3 ore. Amestecul de reacţie a fost menţinut la rt timp de 3 ore. Solidul precipitat a fost colectat prin filtrare la presiune redusă, iar turta de filtrare a fost spălată cu 2,5% apă în THF (2 x 1500 mL) pentru a obţine un solid galben (178,0 g).

Prima cristalizare: O suspensie de solid galben (178,0 g) în 2,5% apă în THF (2670 mL) a fost încălzită la reflux timp de 1 oră pentru a obţine o soluţie limpede. Amestecul a fost apoi lăsat să se răcească la rt timp de 1 oră, apoi a fost menţinut ca atare fără agitare timp de 1 oră la rt. Solidul cristalizat a fost colectat prin filtrare la presiune redusă, iar turta de filtrare a fost spălată cu 2,5% apă în THF (2 x 1780 mL) şi a fost uscată la presiune redusă la 40 °C pentru a obţine (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol,0,5 L-DBTA sub forma unui solid alb (113,0 g, 142,0 mmoli).

A doua cristalizare: Solidul din prima cristalizare (113,0 g) a fost resuspendat în 2,5% apă în THF (1695 mL) şi a fost încălzit la reflux timp de 1 oră pentru a forma o soluţie. Amestecul a fost apoi lăsat să se răcească la rt şi a fost menţinut ca atare fără agitare timp de 1 oră la rt. Solidul cristalizat a fost colectat prin filtrare la presiune redusă, iar turta de filtrare a fost spălată cu 2,5% apă în THF (2 x 1130 mL) şi a fost uscată la presiune redusă la 40 °C pentru a obţine (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol. sare 0,5 L-DBTA sub forma unui solid alb (103,0 g, 130,22 mmoli, randament 18%).

HPLC chirală: Metoda Y22, 5,31 min.

Metoda a fost repetată de două ori în mod identic utilizând (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidro-pirolo[3,4-b]pirol (un amestec de diastereomeri în raport de ~70 : 30, 570 g şi 838 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (478 g şi, respectiv, 778 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 1359 g, 1,72 moli.

Etapa (x)

(3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

Un amestec agitat de (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo-[3,4-b]pirol. sare 0,5 L-DBTA (100,0 g, 126,42 mmoli) în THF: apă (1800 mL, 1:1,25) a fost încălzită la 50 °C. NaHCO3 (31,86 g, 379,28 mmoli) a fost adăugat în porţii la 50 °C. Amestecul a fost răcit la 25 °C, a fost adăugat dicarbonat de di-terţ-butil (66,14 g, 303,42 mmoli) şi amestecul bifazic a fost agitat energic la rt timp de 16 ore. Amestecul a fost turnat în apă (500 mL) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 1 L). Fazele organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă saturată de NaHCO3 (2 x 300 mL), au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat utilizând cromatografie pe coloană (100-200 silicagel, 20% EtOAc în n-hexani) pentru a obţine (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil sub forma unui ulei vâscos, gri (45,0 g, 142,20 mmoli, randament 61%).

LCMS: Metoda H3, 3,96 min, MS: ES+ 317,2; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 7,23 - 7,36 (m, 5H), 3,79 (s, 1H), 3,62 (s, 1H), 3,42 (s, 2H), 3,09 - 3,14 (m, 1H), 3,02 - 3,05 (m, 1H), 2,81 (s, 1H), 2,34 (s, 1H), 2,18 - 2,25 (m, 1H), 1,96 - 2,04 (m, 1H), 1,46 - 1,55 (m, 1H), 1,40 (s, 9H), 1,08 - 1,10 (d, J = 6,0 Hz, 3H); HPLC chirală: Metoda Y23, 4,31 min, 99,6% e.e., 99,5 : 0,5 d.r.

Metoda a fost repetată de două ori în mod identic utilizând (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo-[3,4-b]pirol,0,5 sare L-DBTA (200 g şi 1000 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (134 g şi, respectiv, 685 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 864 g, 2,73 moli.

Etapa (xi)

(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La un amestec agitat de (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (200,0 g, 632,01 mmoli) în etanol (1,6 L) a fost adăugat 10% Pd/C (50% umiditate, 100,0 g, 0,5% g/g), apoi a fost purjat cu H2 gazos timp de 4 ore la rt. Amestecul a fost filtrat printr-un pat Celite Hyflow®, a fost spălat cu MeOH (2 x 500 mL) şi a fost concentrat la presiune redusă pentru a obţine (3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil sub forma unui ulei incolor (134,0 g, 592,08 mmoli, randament 96%).

LCMS: Metoda H3, 2,22 min, MS: ES+ 227,2; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 3,75 - 3,82 (m, 1H), 3,48 - 3,49 (m, 2H), 3,04 - 3,08 (m, 1H), 2,85 - 2,91 (m, 1H), 2,32 - 2,38 (m, 1H), 2,22 (s, 2H), 2,00 - 2,05 (m, 1H), 1,64 - 1,70 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,15 - 1,19 (d, J = 6,4 Hz, 3H); HPLC chirală: Metoda Y13, 4,55 min.

Metoda a fost repetată în mod identic utilizând (3aR,4R,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (570 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (400 g). Greutatea combinată a două loturi: 534 g, 2,36 moli.

Exemplul 1

(+)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril şi

Exemplul 2

(-)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

(i) TBD, THF, 0 °C până la rt; (ii) m-CPBA, 0 °C până la rt; (iii) TMSCN, clorură de dimetilcarbamoil, MeCN, 0 °C până la rt; (iv) TFA, DCM, 0 °C până la rt; (v) K2CO3, BrCN, THF, 0 °C până la rt; (vi) purificare HPLC preparativă chirală.

Etapa (i)

rac-(3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirolo[3,4-b] pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La o soluţie agitată de 5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilat de etil (5,0 g, 22,93 mmoli) şi rac-(3aS.,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (4,15 g, 18,35 mmoli) în THF (50 mL) a fost adăugat, în porţii, TBD (4,78 g, 34,39 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 1 oră, apoi a fost turnat în apă (50 mL) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 200 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă pe coloană (silicagel, 2% MeOH în DCM) pentru a obţine rac-(3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (5,5 g, 13,82 mmoli, randament 60%). LCMS: Metoda C1, 1,14 min, MS: ES+ 399,4.

Etapa (ii)

Rac 1-oxid de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină

La o soluţie agitată de rac-(3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (5,5 g, 13,82 mmoli) în DCM (60 mL) a fost adăugat în porţii acid m-cloroperbenzoic (4,77 g, 27,64 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 24 de ore. Amestecul de reacţie a fost turnat în soluţie saturată de NaHCO3 (200 mL) şi a fost extrasă cu EtOAc (2 x 300 mL). Fazele organice combinate au fost spălate cu soluţie saturată de NaHCO3 (3 x 100 mL), tiosulfat de sodiu 10% (200 mL), au fost uscate peste Na2SO4 şi au fost concentrate la presiune redusă pentru a produce rac 1-oxid de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină (4,80 g, 11,58 mmoli, randament 83%).

LCMS: Metoda C1, 1,15 min, MS: ES+ 415,6.

Etapa (iii)

rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La o soluţie agitată de rac 1-oxid de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină (4,80 g, 11,58 mmoli) în acetonitril (50 mL), au fost adăugate prin picurare clorură de dimetilcarbamoil (3,11 g, 2,68 mL, 28,97 mmoli) şi TMSCN (3,45 g, 34,74 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 16 ore, apoi a fost turnat în apă (200 mL) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 300 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă pe coloană (silicagel, 2% MeOH în DCM) pentru a obţine rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (5,1 g, 12,05 mmoli, randament cantitativ).

LCMS: Metoda C1, 1,28 min, MS: ES+ [M+18] 441,4.

Etapa (iv)

rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitril

La o soluţie agitată de rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (5,1 g, 2,16 mmoli) în DCM (50 mL) a fost adăugat prin picurare TFA (10 mL, 2 vol) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 2 ore, apoi a fost concentrat la presiune redusă pentru a obţine sare TFA de rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitril (5,0 g, 11,44 mmoli, randament 98%, în două etape).

LCMS: Metoda C1, 0,91 min, MS: ES+ 324,3.

Etapa (v)

rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

La o soluţie agitată de sarea TFA de rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitril (0,14 g, 0,33 mmoli) în THF (6 mL) a fost adăugat K2CO3 (0,14 g, 1,00 mmoli) la rt, şi a fost agitată timp de 10 minute. A fost adăugată bromură de cianogen (0,03 g, 0,27 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost agitat la 0 °C timp de 15 minute, apoi a fost turnat în apă (10 ml) şi a fost extras cu EtOAc (3 x 10 ml). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 şi au fost concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin triturare utilizând n-pentan (2 x 10 mL) pentru a obţine rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]-pirol-5(1H)-carbonitril (0,08 g, 0,23 mmoli, randament 88%, în două etape).

LCMS: Metoda H, 2,49 min, MS: ES+ 349,1; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,89 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,36 (s, 0,7H), 8,34 (s, 0,3H), 8,05 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,11 - 5,19 (m, 0,4H), 4,57 - 4,63 (m, 0,7H), 4,24 - 4,29 (m, 0,8H), 3,89 - 4,01 (m, 2H), 3,42 - 3,57 (m, 2,6H), 2,51 - 2,61 (m, 0,5H, ascuns), 1,85 - 2,05 (m, 2H), 1,30 (d, J = 6,4 Hz, 3H), amestec de rotameri.

Compusul din subtitlu (1,9 g, 5,45 mmoli, randament 47%) a fost preparat, de asemenea, în mod analog din Ssare TFA de rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)-oxazol-5-il)picolinonitril (5,0 g).

Etapa (vi)

Exemplul 1: (+)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril şi

Exemplul 2: (-)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

Separarea racematului în enantiomerii din Exemplul 1 şi Exemplul 2

Fiecare dintre cei doi enantiomeri a fost izolat din compusul racemic rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril (1,5 g) prin separare cromatografică HPLC utilizând un instrument Shimadzu LC-20AP cuplat la un detector UV, cu o coloană Chiralpak IC 250 mm x 21,0 mm, 5 microni. Debitul a fost stabilit la 20,0 mL/min. Fază mobilă a fost (A) 0,1% DEA în n-hexani şi (B) 0,1% DEA în 70:30 IPA/MeCN. Spectrele UV au fost înregistrate la 295 nm lambda max. Cromatografia a fost efectuată pe parcursul unei perioade de 70 de minute cu fază mobilă izocratică 40:60 B/A pentru a furniza cei doi enantiomeri descrişi mai jos, cu timpi de eluare de 40,0 min şi, respectiv, 55,6 min.

Fracţiunea cu eluare mai rapidă (Exemplul 2)

(-)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

Randament (0,44 g, 1,26 mmoli), solid alb.

LCMS: Metoda H, 2,56 min, MS: ES+ 349,2.

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,89 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,35 - 8,37 (m, 1H), 8,06 - 8,07 (m, 1H), 5,12 - 5,17 (m, 0,4H), 4,59 - 4,62 (m, 0,7H), 4,25 - 4,29 (m, 0,7H), 3,91 - 4,02 (m, 2H), 3,42 - 3,59 (m, 2,7H), 2,57 - 2,61 (m, 0,5H, ascuns), 1,85 - 2,05 (m, 2H), 1,31 (d, J = 6,4 Hz, 3H), amestec de rotameri.

HPLC chirală: Metoda Y11, 12,89 min; >99% ee.

Punct de topire = 142 °C până la 146 °C.

[α]D 25 = -208° (c = 0,05 g/100 cm3, MeOH).

Fracţiune cu eluare mai lentă (Exemplul 1)

(+)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

Randament (0,48 g, 1,38 mmoli), solid alb.

LCMS: Metoda H, 2,56 min, MS: ES+ 349,2.

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,89 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,36 - 8,38 (m, 1H), 8,06 - 8,07 (m, 1H), 5,12 - 5,16 (m, 0,4H), 4,57 - 4,65 (m, 0,7H), 4,22 - 4,30 (m, 0,7H), 3,91 - 4,02 (m, 2H), 3,41 - 3,58 (m, 2,7H), 2,61 - 2,63 (m, 0,5H, ascuns), 1,82 - 2,07 (m, 2H), 1,31 (d, J = 6,0 Hz, 3H), amestec de rotameri.

HPLC chirală: Metoda Y11, 15,09 min; >99% ee.

[α]D 25 = +208° (c = 0,05 g/100 cm3, MeOH).

Lot de material preparat printr-o metodă analogă: Punct de topire = 144 °C până la 146 °C.

Exemplul 1 Sinteză alternativă.

(+)-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

Etapa (i)

(3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirolo[3,4-b] pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La un amestec agitat de 5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilat de etil (37,0 g, 169,72 mmoli) şi (3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (30,70 g, 135,64 mmoli) în THF (370 mL) la 0 °C a fost adăugat în porţii TBD (28,32 g, 203,47 mmoli). Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 2 ore, apoi a fost turnat în apă (370 mL) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 370 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă pe coloană (silicagel, 5% MeOH în DCM) pentru a obţine (3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil sub forma unui solid galben pal (29,0 g, 72,78 mmoli, randament 43%).

LCMS: Metoda H3, 2,79 min, MS: ES+ 399,2; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 8,72 - 8,82 (m, 2H), 8,20 - 8,24 (m, 1H), 7,76 - 7,77 (m, 2H), 5,10 - 5,11 (m, 1H), 4,56 (s, 1H), 4,03 (s, 1H), 3,57 - 3,85 (m, 4H), 2,09 - 2,14 (m, 1H), 1,73 - 1,86 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,21 - 1,10 (m, 3H); HPLC chirală: Metoda Y24, 5,35 min.

Metoda a fost repetată de două ori în mod identic, utilizând (3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (165 g şi 457 g) pentru a furniza compusul din subtitlu (255 g şi, respectiv, 620 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 904 g, 2,27 moli.

Etapa (ii)

1-oxid de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină

La un amestec agitat de (3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil) hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (29,0 g, 72,82 mmoli) în DCM (435 mL) a fost adăugat în porţii acid m-cloroperbenzoic (37,69 g, 218,46 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 20 de ore, apoi a fost turnat în soluţie saturată de NaOH (725 mL, 25 vol) şi a fost extras cu DCM (2 x 290 mL). Fazele organice combinate au fost spălate cu tiosulfat de sodiu 10% (290 mL), au fost uscate pe Na2SO4 şi au fost concentrate la presiune redusă pentru a obţine 1-oxid de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină sub forma unui solid galben (28,30 g, 68,32 mmoli, randament 94%).

LCMS: Metoda H3, 2,41 min, MS: ES+ 259,0 (M-56); 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 8,25 - 8,26 (m, 2H), 8,08 - 8,11 (m, 1H), 7,78 -7,79 (m, 2H), 5,08 - 5,09 (m, 0,4 H), 4,54 (m, 0,6 H), 4,02 - 4,09 (m, 1H), 3,66 - 3,82 (m, 4H), 2,07 - 2,12 (m, 2H), 1,64-1,84 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,15 -1,19 (m, 3H); HPLC chirală: Metoda Y25, 6,13 min.

Metoda a fost repetată de două ori în mod identic, utilizând (3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (255 g şi 620 g) pentru a furniza compusul din subtitlu (235 g şi, respectiv, 550 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 813,3 g, 1,96 moli.

Etapa (iii)

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo-[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La un amestec agitat de 1-oxid de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]-pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină (28,30 g, 68,32 mmoli) în acetonitril (1132 mL), au fost adăugate prin picurare clorură de dimetilcarbamoil (22,04 g, 18,87 mL, 204,96 mmoli) şi TMSCN (20,33 g, 204,96 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost încălzit la 80 °C timp de 2 ore, a fost lăsat să se răcească la rt şi apoi a fost turnat în apă (280 mL) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 280 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă pentru a obţine (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo-[3,4-b]-pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil sub forma unui ulei maro (28,0 g, 66,16 mmoli, randament 97%).

LCMS: Metoda H3, 3,06 min, MS: ES+ 368,0 (M-56); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,87 - 8,88 (m, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,34 - 8,36 (m, 1H), 8,03 - 8,05 (m, 1H), 4,55 (s, 1H), 4,02 (s, 1H), 3,55 - 3,84 (m, 3H), 2,74 (s, 2H), 2,08 - 2,13 (m, 1H), 1,75 - 1,83 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,16 - 1,20 (m, 3H); HPLC chirală: Metoda Y4, 4,67 min.

Metoda a fost repetată de două ori în mod identic utilizând 1-oxid de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină (235 g şi 550 g) pentru a obţine compusul din subtitlu (180 g şi, respectiv, 470 g). Greutatea combinată a tuturor celor trei loturi: 678 g, 1,60 moli.

Etapa (iv)

Sare p-TSA de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitril

La un amestec agitat de (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (28,0 g, 66,16 mmoli) în acetonitril (560 mL) a fost adăugat în porţii p-TSA (66,07 g, 383,72 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 5 ore, apoi a fost concentrat la presiune redusă pentru a obţine sare p-TSA de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitril sub forma unui ulei galben (115,0 g, randament cantitativ).

LCMS: Metoda H3, 1,97 min, MS: ES+ 324,0; HPLC chirală: Metoda Y20, 5,17 min.

Metoda a fost repetată în mod identic utilizând (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (650 g) pentru a furniza compusul din subtitlu (1000 g). Greutatea combinată a două loturi: 1115 g, 3,44 moli.

Etapa (v)

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

La o soluţie agitată de sare de p-TSA de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)-oxazol-5-il)picolinonitril (180,0 g, 363,22 mmoli) în THF: apă (5,4 L, 2:1) a fost adăugat K2CO3 (145,26 g, 1052,63 mmoli), la rt şi a fost agitată timp de 5 minute. A fost adăugată bromură de cianogen (26,0 g, 245,61 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 1 oră, apoi amestecul a fost concentrat la presiune redusă, iar reziduul a fost turnat în apă răcită cu gheaţă (2 L) pentru a forma un precipitat. Solidul a fost colectat prin filtrare la presiune redusă. Solidul a fost resuspendat în apă (2 L) şi a fost agitat timp de 2 ore la rt, apoi a fost filtrat la presiune redusă. Materialul solid a fost spălat cu apă rece (1 L), urmată de n-hexani (500 mL), eter dietilic (100 mL) şi IPA (100 mL) pentru a obţine (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidro-

pirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril, (40,0 g, 114,83 mmoli, randament 32%).

LCMS: Metoda H3, 2,50 min, MS: ES+ 349,0; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,89 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,35 - 8,37 (m, 1H), 8,05 - 8,06 (m, 1H), 5,12 - 5,13 (m, 0,4H), 4,57 - 4,61 (m, 0,6H), 4,23 - 4,28 (m, 0,7H), 3,89 - 4,00 (m, 2H), 3,41 - 3,58 (m, 2,4H), 2,54 - 2,67 (m, 1H, ascuns), 1,89 - 2,06 (m, 2H), 1,27 - 1,30 (m, 3H), amestec de rotameri; HPLC: Metoda X2, 19,78 min, 99,96%; HPLC chirală: Metoda Y15, 15,29 min; > 99% ee.; Punct de topire = 147 °C până la 149 °C; [α]D 25 = +202° (c. = 0,05 g/100 cm3, MeOH).

Etapa (v) (sinteză alternativă)

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

La o soluţie agitată de sare de p-TSA de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)-oxazol-5-il)picolinonitril (115,0 g, 232,06 mmoli) în THF: apă (804 mL, 9:5) a fost adăugat K2CO3 (98,22 g, 711,76 mmoli) la rt, şi a fost agitată timp de 10 minute. A fost adăugată bromură de cianogen (18,86 g, 177,94 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 2 ore, apoi a fost turnat în apă (1150 ml) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 1150 ml). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 şi au fost concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost suspendat în IPA (575 mL) şi a fost încălzit la 80 °C timp de 2 ore pentru a forma o soluţie limpede. Amestecul a fost lăsat să se răcească lent la rt pentru a forma un solid cristalin, care a fost colectat prin filtrare la presiune redusă, a fost spălat cu IPA rece (115 mL) şi a fost uscat la presiune redusă pentru a obţine (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidro-

pirolo[3,4-b]-pirol-5(1H)-carbonitril (15,0 g, 43,08 mmoli, randament 19%).

Metoda a fost repetată în mod identic utilizând sare de p-TSA de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metil-octahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)-oxazol-5-il)picolinonitril (1000 g) pentru a obţine compusul din titlu (288 g). O soluţie de 288 g şi 15 g de (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]-pirol-5(1H)-carbonitril în THF (909 mL, 3 vol) a fost agitată la rt timp de 2 ore pentru a forma o soluţie limpede. Solvenţii au fost îndepărtaţi la presiune redusă pentru a obţine un solid alb, care a fost spălat suplimentar cu pentan (300 mL, 1 vol) şi a fost uscat la presiune redusă timp de 4 ore la o temperatură sub 45 °C, pentru a produce (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]-pirol-5(1H)-carbonitril (303,0 g).

LCMS: Metoda H3, 2,52 min, MS: ES+ 349,0; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,87 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,30 - 8,38 (m, 1H), 8,04 - 8,05 (m, 1H), 5,12 - 5,13 (m, 0,4H), 4,59 - 4,60 (m, 0,6H), 4,23 - 4,27 (m, 0,6H), 3,91 - 4,02 (m, 2H), 3,41 - 3,56 (m, 2,4H), 2,54 - 2,61 (m, 1H, ascuns), 1,84 - 2,04 (m, 2H), 1,30 (d, J = 6,4 Hz, 3H), amestec de rotameri; HPLC chirală: Metoda Y15, 15,11 min; HPLC: Metoda E, 27,87 min; > 99% e.e., 99,5 : 0,5 d.r.; Punct de topire = 161°C până la 162°C; [α]D 25 = +204° (c = 0,05 g/100 cm3, MeOH).

Exemplul 3 şi Exemplul 4

(+)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril, şi

(-)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

Etapa (i)

(rac-3aR,4S,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (izomer minoritar) şi rac-(3aR,4R,aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (izomer majoritar)

La o soluţie agitată de sare HCl de rac-(3aR,6aR)-1-benzil-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol ((Etapa (v) produs către Intermediarul B, 68,0 g, 269,31 mmoli) în DCM (700 mL) au fost adăugate trietilamină (136,0 g, 187,3 mL, 1346,55 mmoli), 4-dimetilpiridină (1,64 g, 13,46 mmoli) şi dicarbonat de di-terţ-butil (70,51 g, 323,17 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 6 ore, apoi a fost turnat în apă (1000 mL) şi a fost extras cu DCM (2 x 1000 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru şi au fost concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană (silicagel, dimensiune 100-200 #, 7 până la 9% EtOAc în n-hexani) pentru a obţine compuşii din subtitlu sub forma a două fracţiuni separate, Fracţiunea 1 (izomer minoritar, 0,8 g, 2,53 mmoli, randament 0,94%) şi Fracţiunea 2 (izomer majoritar, 38,0 g, 120,25 mmoli, randament 45%).

Fracţiunea 1 LCMS: Metoda H1, 4,19 min, MS: ES+ 317,2. Fracţiunea 2 LCMS: Metoda H1, 3,87 min, MS: ES+ 317,0. Izomerul minoritar, Fracţiunea 1, a fost reportat în Etapa (ii).

Etapa (ii)

rac-(3aS,4S,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La o soluţie agitată de rac-(3aR,4S,6aR)-1-benzil-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]-pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (Fracţiunea 1, izomer minoritar, 0,8 g, 2,53 mmoli) în etanol (10 mL) a fost adăugat 10% Pd/C (50% umiditate, 0,8 g) şi a fost purjată cu hidrogen gazos timp de 16 ore la rt. Amestecul a fost filtrat prin Celite®, a fost spălat cu etanol (50 mL) şi a fost concentrat la presiune redusă pentru a obţine rac-(3aS.,4S,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (0,42 g, 1,85 mmoli, randament 73%).

LCMS: Metoda H1, 2,25 min, MS: ES+ 227,2.

Etapa (iii)

rac-(3aR,4S,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirolo[3,4-b] pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

O soluţie agitată de 5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilat de etil (0,49 g, 2,25 mmoli) şi rac-(3aS.,4S,6aR)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (0,41 g, 1,79 mmoli) în toluen (7 mL) a fost încălzită la 40 °C timp de 10 minute pentru a dizolva ambele materii prime, apoi a fost răcită la 0 °C, urmată de adăugare prin picurare a unei soluţii de TBD (0,15 g, 1,12 mmoli) în toluen (2 mL) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 3 ore, apoi a fost turnat în apă (50 mL) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 50 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru, au fost filtrate şi concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă pe coloană (silicagel, 80 până la 90% EtOAc în n-hexani) pentru a produce rac-(3aR,4S,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (0,43 g, 1,09 mmoli, randament 48%).

LCMS: Metoda H1, 2,88 min, MS: ES+ 399,2.

Etapa (iv)

rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină 1-oxid

La o soluţie agitată de rac-(3aR,4S,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil) hexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (0,43 g, 1,08 mmoli) în DCM (7 mL) a fost adăugat în porţii acid m-cloroperbenzoic (0,37 g, 2,16 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 16 ore. Amestecul a fost turnat în apă (100 mL) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 100 mL). Fazele organice combinate au fost spălate cu soluţie saturată de NaHCO3 (2 x 100 mL), tiosulfat de sodiu 10% (2 x 100 mL), au fost uscate peste Na2SO4 şi au fost concentrate la presiune redusă pentru a produce 1-oxid de rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină (0,39 g, 0,95 mmoli, randament 87%).

LCMS: Metoda H1, 2,50 min, MS: ES+ [M-56] 359,0.

Etapa (v)

rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo [3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil

La o soluţie agitată de rac 1-oxid de 4-(2-((3aR,4S,6aR)-5-(terţ-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridină (0,39 g, 0,94 mmoli) în MeCN (7 mL), au fost adăugate prin picurare clorură de dimetilcarbamoil (0,30 g, 0,26 mL, 2,83 mmoli) şi cianură de trimetilsilil (0,28 g, 0,36 mL, 2,83 mmoli) la rt. Amestecul a fost încălzit la 80 °C timp de 2 ore, apoi a fost turnat în soluţie de 10% Na2CO3 în apă (50 mL) şi a fost extrasă cu EtOAc (2 x 50 mL). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 anhidru şi au fost concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă pe coloană (silicagel, 80 - 90% EtOAc în n-hexani) pentru a produce rac-(3aR, 4S, 6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]-pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (0,38 g, 0,89 mmoli, randament 95%).

LCMS: Metoda H1, 3,15 min, MS: ES+ [M-56] 368,0.

Etapa (vi)

rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitril

La o soluţie agitată de rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carboxilat de terţ-butil (0,38 g, 0,89 mmoli) în DCM (10 mL) a fost adăugat în porţii acid p-toluensulfonic monohidrat (0,84 g, 4,45 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 6 ore, apoi a fost concentrat la presiune redusă pentru a obţine sare p-TSA de rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il) picolinonitril (0,52 g, randament cantitativ).

LCMS: Metoda H1, 1,93 min, MS: ES+ 324,0.

Etapa (vii)

rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

La o soluţie agitată de sare de p-TSA de rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-4-metiloctahidropirolo[3,4-b]pirol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitril (0,52 g, 1,01 mmoli) în THF (10 mL) şi apă (5 mL) a fost adăugat K2CO3 (0,70 g, 5,05 mmoli) la rt, şi a fost agitată timp de 5 minute. A fost adăugată bromură de cianogen (0,13 g, 1,21 mmoli) la 0 °C. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la rt şi a fost agitat timp de 1 oră, apoi a fost turnat în apă (50 ml) şi a fost extras cu EtOAc (2 x 50 ml). Fazele organice combinate au fost uscate peste Na2SO4 şi au fost concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă pe coloană (silicagel, 90 până la 95% EtOAc în n-hexani) pentru a obţine rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril (0,18 g, 0,52 mmoli, randament 57%, în două etape).

LCMS: Metoda H1, 2,48 min, MS: ES+ 349,0; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,88 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,35 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,05 (dd, J = 5,2, 1,2 Hz, 1H), 5,06 - 5,10 (m, 0,6H), 4,56 - 4,60 (m, 0,7H), 4,16 - 4,21 (m, 0,7H), 3,44 - 3,95 (m, 4H), 2,81 - 2,93 (m, 1H), 1,77 - 1,99 (m, 2H), 1,25 (d, J = 6,4 Hz, 3H), amestec de rotameri; HPLC: Metoda E, 28,58 min; 98,8 : 1,2 d.r.

Etapa (viii)

Exemplul 3: (+)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril, şi

Exemplul 4: (-)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

Fiecare dintre cei doi enantiomeri a fost izolat din compusul racemic rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril (0,10 g, 0,29 mmoli) prin separare cromatografică utilizând un instrument Shimadzu LC-20AP cuplat la un detector UV, cu o coloană Chiralpak IG 250 mm x 21,0 mm, 5 microni. Debitul a fost stabilit la 20,0 mL/min. Fază mobilă a fost (A) 0,1% DEA în MeOH şi (B) 0,1% DEA în MeCN. Spectrele UV au fost înregistrate la 292 nm lambda max. Cromatografia a fost efectuată pe parcursul unei perioade de 35 de minute cu fază mobilă izocratică 50 : 50 B/A, pentru a furniza cei doi enantiomeri descrişi mai jos, cu timpi de eluare de 8,03 min şi, respectiv, 12,95 min.

Fracţiune cu eluare mai rapidă (Exemplul 3)

(+)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

Randament (23 mg, 0,07 mmoli). LCMS: Metoda H1, 2,49 min, MS: ES+ 349,0; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,88 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,35 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,05 (dd, J = 5,2, 1,2 Hz, 1H), 5,06 - 5,11 (m, 0,6H), 4,56 - 4,61 (m, 0,7H), 4,16 - 4,22 (m, 0,7H), 3,43 - 3,95 (m, 4H), 2,81 - 2,95 (m, 1H), 1,77 - 1,98 (m, 2H), 1,25 (d, J = 6,4 Hz, 3H), amestec de rotameri; HPLC chirală: Metoda Y17, 8,11 min.

Fracţiune cu eluare mai lentă (Exemplul 4)

(-)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril

Randament (19 mg, 0,05 mmoli). LCMS: Metoda H1, 2,49 min, MS: ES+ 349,0; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,88 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,35 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 4,8, 1,2 Hz, 1H), 5,06 - 5,11 (m, 0,6H), 4,56 - 4,60 (m, 0,7H), 4,16 - 4,21 (m, 0,7H), 3,43 - 3,95 (m, 4H), 2,81 - 2,95 (m, 1H), 1,77 - 1,99 (m, 2H), 1,25 (d, J = 6,4 Hz, 3H), amestec de rotameri; HPLC chirală: Metoda Y17, 13,17 min.

Exemplul 3: Solid alb; HPLC chirală: Metoda Y17, 8,11 min; > 99% ee; 99,5 : 0,5 d.r.; punct de topire = 206 °C până la 207 °C; [α]D 25 = +166° (c. = 0,05 g/100 cm3, MeOH).

Exemplul 4: Solid alb; HPLC chirală: Metoda Y17, 13,17 min; > 99% ee.; 99,5 : 0,5 d.r.; punct de topire = 206 °C până la 207 °C; [α]D 25 = -156° (c = 0,05 g/100 cm3, MeOH).

HPLC chiralăă conform Exemplelor de la 1 la 4.

Exemplele 1-4 au fost analizate utilizând metode HPLC şi HPLC chirală. Separarea la nivel de bază pentru aceşti patru izomeri nu a fost observată într-un singur sistem, aşadar HPLC chirală (Metoda Y28) a fost utilizată pentru a determina puritatea enantiomerică, în timp ce HPLC achirală (Metoda E) a fost utilizată pentru a determina raportul diastereomeric.

Activitatea biologică a compuşilor din invenţie

Abrevieri:

TAMRA Carboxitetrametilrodamină PCR Reacţia în lanţ a polimerazei PBS Soluţie salină tamponată cu fosfat EDTA Acid etilendiaminotetraacetic Tris 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propandiol NP-40 Nonidet P-40, octilfenoxipolietoxietanol BSA Albumină serică bovină PNS Sistem nervos periferic BH3 Domeniul 3 de omologie Bcl-2 PTEN Omolog de fosfatază şi tensină SDS-PAGE Electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu DMSO Dimetil sulfoxid YFP Proteină fluorescentă galbenă VME Ester metilic de vinil HA Hemaglutinină Ahx Acid aminohexanoic

Test biochimic pentri IC50 USP

Plăci de diluţie au fost preparate la o concentraţie de 21 de ori mai mare decât concentraţia finală (2100 µM pentru o concentraţie finală de 100 µM) în 50% DMSO pe o placă din polipropilenă cu 96 de godeuri cu fund în formă de V (Greiner #651201). O serie tipică de diluţie la 8 concentraţii ar fi 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 µM final. Reacţiile au fost efectuate în duplicat pe plăci negre cu 384 de godeuri (volum mic, Greiner 784076) într-un volum final de reacţie de 21 µl. Pe placă a fost adăugat 1 µl, fie de 50% DMSO, fie de compus diluat. USP30 (Boston Biochem #E582) a fost diluat în tampon de reacţie (40 mM Tris, pH 7,5, 0,005% Tween 20, 0,5 mg/ml BSA, 5 mM beta-mercaptoetanol) pentru a obţine o concentraţie finală de analiză de 4 nM, şi la compus au fost adăugaţi 10 µl de USP30 diluat. Enzima şi compusul au fost incubate timp de 30 de minute la rt. Reacţiile au fost iniţiate prin adăugarea a 50 nM de peptidă marcată cu TAMRA, legată de ubiquitină printr-o legătură izo-peptidică ca substrat de polarizare a fluorescenţei. Reacţiile au fost citite imediat după adăugarea substratului şi după o incubare de 2 ore la rt. Citirile au fost efectuate pe un Pherastar Plus (BMG Labtech). λ de excitaţie 540 nm; λ de emisie 590 nm.

Activitatea compuşilor exemplificativi în test biochimic pentru IC50 USP30:

Exemplul IC50 (nM) 1 11 2 1078 3 338 4 > 3000

Exemple de referinţă

Activitatea compuşilor exemplificativi în test biochimic pentru IC50 USP30:

Exemplu de referinţă Structură Origine IC50 USP30 (nM) A WO 2016/156816 Exemplul 270 270 B WO 2016/156816 Exemplul 56 70 C WO 2016/156816 Exemplul 241 72 D. WO 2016/046530 Exemplul 1 310 E. WO 2016/046530 Exemplul 88 4400

Farmacologie în afara ţintei

Exemplul 1 a fost supus profilării farmacologice în panelul Eurofins CEREP SafetyScreen44. La o singură concentraţie de 10 µM, a fost observată o inhibare mai mică decât 50% a legării sau a activităţii enzimatice împotriva tuturor ţintelor din panel. Exemplul 1 are o probabilitate scăzută de interacţiuni în afara ţintei din cauza afinităţii scăzute pentru ţinte în acest test.

Farmacologie de siguranţă

Exemplul 1 a fost evaluat pentru efectele asupra canalului de potasiu hERG, în celule CHO exprimate stabil, la concentraţii între 0,01 şi 30 µM. Exemplul 1 a produs o valoare maximă de inhibare de 27% din amplitudinea curentului hERG la 30 µM, indicând o mică predispoziţie de a afecta intervalul QT.

Toxicologie genetică

Exemplul 1 a fost evaluat în testul de mutaţie inversă bacteriană (Ames) şi, in vitro, în testul micronucleului. Toate testele in vitro au fost efectuate cu şi fără activare metabolică exogenă, utilizând concentraţii până la cele limitate de citotoxicitate sau insolubilitate. Exemplul 1 nu a indus mutaţii atunci când a fost testat până la 5000 µg/placă cu şi fără activare metabolică în testul de mutaţie inversă pe tulpinile de Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 şi TA97a şi pe tulpina de Escherichia Coli WP2 uvrA pKM101.

Inducerea deteriorării cromozomilor a fost evaluată utilizând testul in vitro al micronucleilor în celule TK6. Exemplul 1 a fost negativ pentru inducerea micronucleilor atunci când a fost incubat timp de 3 ore în prezenţa activării metabolice exogene, urmată de 27 de ore de recuperare, precum şi atunci când a fost incubat timp de 27 de ore în absenţa activării metabolice exogene, urmată de 27 de ore de recuperare.

Testul de ubiquitinilare TOM20

Liniile celulare umane pot fi provocate cu agenţi depolarizanţi mitocondriali (ionofori (de ex., CCCP, valinomicină), inhibitori de complex mitocondrial (oligomicină, antimicină A)) pentru a induce ubiquitinilarea TOM20, care este apoi promovată în continuare în prezenţa inhibitorilor de USP30. Ubiquitinilarea TOM20 este ulterior evaluată prin Western blot al lizatelor celulare, detectarea aductului de ubiquitinilare TOM20 fiind posibilă datorită unei creşteri de 8 kDa a greutăţii moleculare pentru fiecare moleculă de ubiquitină adăugată, rezultând formarea unei benzi imunoreactive TOM20. Nivelurile de ubiquitinilare TOM20 pot fi cuantificate utilizând densitometrie prin chemiluminescenţă a benzilor imunoreactive deşirate.

Testul de implicare a ţintei celulare endogene USP30

Celule Hela care supraexprimă stabil YFP-Parkină au fost însămânţate în vase cu 6 godeuri. Odată ce au aderat, celulele au fost tratate cu concentraţii adecvate de compuşi testaţi sau cu vehicul de control, timp de 1 oră, la 37°C, 5% CO2. Lizatele de celule întregi au fost preparate prin răzuirea celulelor în PBS rece, centrifugare şi lizare în tampon de liză (50 mM Tris-bază, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1% NP-40/Igepal CA-630, 2 mM MgCl32, 10% glicerol, 5 mM beta-mercaptoetanol, mini-tablete fără EDTA cOmplete™ (Roche), tablete PhosStop (Roche)) timp de 10 minute. Echivalentul a 20 µg de proteină din lizatul celular purificat au fost incubate cu o concentraţie finală de sondă 2,5 µM HA-Ahx-Ahx-Ub-VME la rt. Reacţia a fost oprită prin adăugare de tampon de încărcare a probei 5x SDS, iar proteinele au fost separate prin SDS PAGE şi western blotting. USP30 a fost detectată utilizând un anticorp anti-USP30 Sheep S746D (MRC PPU Reagents and Services) şi un conjugat de IgG secundar de iepure anti-oaie cu peroxidază de hrean (H+L) (Thermo #31480), şi a fost vizualizată utilizând reactiv ECL (GE #RPN2109) pe un aparat de imagistică GE LAS4000. Implicarea ţintei a fost măsurată prin cuantificarea benzilor corespunzătoare USP30 şi USP30 legată de sonda Ub-VME şi exprimarea acestei proporţii în comparaţie cu controlul tratat cu vehicul.

Citotoxicitate in vitro (Cell Tox): Măsurată în celule de carcinom colorectal uman HCT116 utilizând alamarBlue™ ca punct final al testului. Citotoxicitatea compusului a fost măsurată pe parcursul unei perioade de expunere continuă la compus timp de 96 de ore.

Studii suplimentare

log P: coeficient de partiţie; măsurarea lipofilicităţii.

log D: coeficient de distribuţie; măsurarea lipofilicităţii.

TPSA: aria suprafeţei polare topologice.

Solubilitate turbidimetrică: Soluţie de compus testat preparată în DMSO diluat în tampon apos.

Turbidimetria este utilizată ca punct final prin măsurarea absorbanţei la 620 nm.

FaSSIF: fluid intestinal simulat în stare de repaus alimentar, măsurat la pH 6,5.

Hep Cl de şoarece: eliminarea hepatocitelor in vitro, în celule de şoarece.

Hep Cl uman: eliminarea hepatocitelor in vitro, în celule umane.

fu,p în plasmă: Fracţiunea liberă a unui compus din preparatul de plasmă determinată prin dializă la echilibru in vitro. Se înţelege că numai compusul nelegat (liber) este capabil să implice ţinta. fu,br în creier: Fracţiunea liberă a unui compus din preparatul de omogenat cerebral determinată prin dializă la echilibru in vitro. Se înţelege că numai compusul nelegat (liber) este capabil implice ţinta.

Clu: eliminarea in vitro. Clu, aşa cum este definit aici, este eliminarea scalată, calculată la rândul său din eliminarea intrinsecă. Eliminarea intrinsecă este eliminarea preconizată datorată reacţiilor metabolice hepatice, determinată prin incubarea unui compus într-un preparat de hepatocite. Cu cât valoarea în mL/min/kg este mai mică, cu atât compusul este mai stabil.

Eliminarea Cl in vivo: Măsurarea farmacocinetică a volumului de plasmă (sau orice matrice) din care o substanţă este îndepărtată complet pe unitatea de timp. Cu cât valoarea în mL/min/kg este mai mică, cu atât compusul este mai stabil.

F oral: Biodisponibilitate orală.

Test de flux MDR1-MDCK (monostrat de celule renale canine Madin-Darby) (in vitro).

Flux in vitro WT-MDCK (tip sălbatic).

Kpuu este raportul dintre medicamentul nelegat în creier şi medicamentul nelegat în plasmă, şi poate indica posibilitatea de tratare a indicaţiilor periferice şi/sau ale CNS.

Studii Exemplul 1 Celulă TE WB EC50 USP30 endogenă (µM) 0,026 Toxicitate celulară EC50 HCT116 (µM) > 30 Fizico-chimice Log D măsurat la pH 7,4 1,4 TPSA 110 Solubilitate turbidimetrică (µM) 65 FaSSIF (µM) măsurat la pH 6,5 488 CI-ul Hepatocitelor de şoarece Clu scalată (ml/min/kg) 40 Cl-ul hepatocitelor umane Clu scalată (ml/min/kg) 18 Stabilitate t1⁄2 în plasmă de şoarece (minute) > 120 MDR1-MDCK Raport de eflux efectiv 3,2 WT-MDCK Raport de eflux, flux A-B Papp (10-6 cm/s) 0,8, 16 Studii Exemplul 1 Legarea la şoarece fu,p în plasmă / fu,br în creier 0,14 / 0,30 PK şoarece 2 mg/kg IV Cl plasmatic (mL/min/kg) 19 PK şoarece 10 mg/kg F oral (%) 87 TOM20-Ub crescut de 1,5 ori Declanşator de mitofagie cu antimicină A/oligomicină EC1,5x (µM) 0,010 Cmax plasmatic nelegat/potenţa celulelor TOM20-Ub (doză PO 10 mg/kg - şoarece) 292 PK de microdializă la şoareci şi şobolani 30 mg/kg po Kpuu la şoarece (PFCu/plasmău) 0,90 PFCu la şoarece /celulă TOM20-Ub de 125 de ori Kpuu la şobolan (PFCu/plasmău) 0,43 PFCu la şoarece >9x celule TOM20-Ub 0,5 h până la > 6 h PFCu la şobolan >9x celule TOM20-Ub 0,75 h până la 2,25 h PK la câini 30 mg/kg po Kpuu (CSF/plasmău) 0,41

Exemplul 1 posedă proprietăţi benefice care demonstrează o posibilă superioritate faţă de alţi compuşi. De exemplu, eliminarea plasmatică IV observată de 19 ml/min/kg, aşa cum a fost măsurat la şoarece, este scăzută, ceea ce demonstrează o stabilitate plasmatică valoroasă, iar compusul are o biodisponibilitate orală excepţională de 87%.

Exemplul 1 prezintă o distribuţie crescută la nivelul CNS in vivo după o doză orală, aşa cum este determinat prin prelevarea de probe prin microdializă a regiunilor creierului după o doză de 30 mg/kg la şoareci şi şobolani. Concentraţii mari de substanţă nelegată din Exemplul 1 au fost observate timp de mai multe ore după administrare, ceea ce a dus la o durată estimată adecvată a acoperirii ţintei în CNS. În plus, Exemplul 1, atunci când este administrat oral la câini în doză de 30 mg/kg, a prezentat o repartizare crescută în lichidul cefalorahidian (CSF).

Compus Ex. 1 Ref. Ex. A Ref. Ex. B Ref. Ex. C IC50 DUB (µM) USP30 0,011 0,27 0,070 0,072 IC50 DUB (µM) USP2, USP6, USP10, USP16, USP21, USP25, USP28 24,9 - 107,2 0,90 - 59,4 0,54 - 38,8 4,0 - 92,4 Preferinţa de selectivitate DUB pentru DUB-uri USP30 v 7 > 2260 3,3 - 220 7,7 - 554 56 - 1283 IC50 de catepsină (µM) Catepsină B 205,1 4,1 1,4 1,2 Catepsină K 109,9 0,54 16,2 0,44 Catepsină L 42,1 2,1 1,8 1,3 Catepsină S 259,6 20,2 9,2 22,8 Catepsină V 247,5 9,1 2,3 18,5 B, K, L, S, V ≥ 42,1 0,54 - 20,2 1,8 - 16,2 0,44 - 22,8 Preferinţa de selectivitate pentru USP30 v catepsină > 3800 2-75 20 - 231 6,1 - 317 Cl-ul hepatocitelor de şoarece Clu scalată (ml/min/kg) 40 92 > 121 108 Stabilitate t1⁄2 în plasmă de şoarece (minute) > 120 63 21 16 Compus Ex. 1 Ref. Ex. D Ref. Ex. E IC50 DUB (µM) USP30 0,011 0,31 4,4 UCHL1 > 300 0,25 6,8 Preferinţa de selectivitate DUB pentru USP30 v UCHL1 > 27000 0,8 1,5

Date comparative

Exemplele de referinţă A, B, C, D şi E sunt inhibitori de DUB cunoscuţi, identificaţi ca inhibitori activi ai USP30 şi prezintă o anumită similaritate structurală cu compuşii din prezenta invenţie, având caracteristica structurală de cianamidă. Exemplele de referinţă D şi E sunt descrise în WO 2016/046530 ca având activitate de inhibare a UCHL1.

Exemplul 1 prezintă o stabilitate metabolică a hepatocitelor semnificativ îmbunătăţită (măsurată în hepatocite de şoarece), în comparaţie cu exemplele de referinţă A, B şi C. Exemplul 1 prezintă o stabilitate plasmatică semnificativ îmbunătăţită (de cel puţin 2 până la 8 ori, aşa cum este măsurat în plasma de şoarece), în comparaţie cu exemplele de referinţă A, B şi C.

Puterea faţă de USP30

Exemplul 1 din prezenta invenţie este semnificativ mai puternic împotriva USP30 decât Exemplele de Referinţă A, B, C, D şi E, aşa cum a fost măsurat în testul biochimic. Exemplul 1 este de peste 6 ori mai puternic decât Exemplele de Referinţă B şi C, de peste 24 de ori mai puternic decât Exemplele de Referinţă A şi D şi de 400 de ori mai puternic decât Exemplul de Referinţă E.

Selectivitate pentru USP30 faţă de alte DUB-uri

Datele furnizate demonstrează că Exemplul 1 este semnificativ mai selectiv pentru USP30 faţă de şapte DUB-uri (USP2, USP6, USP10, USP16, USP21, USP25 şi USP28), în comparaţie cu Exemplele de Referinţă A, B şi C. Exemplul 1 este de peste 2260 de ori mai puternic împotriva USP30 decât împotriva fiecăruia dintre cele şapte DUB-uri. Acesta reprezintă un avantaj semnificativ al selectivităţii faţă de Exemplele de Referinţă A şi B, care sunt de doar 3,3 ori, respectiv, 7,7 ori mai puternice. Exemplul de Referinţă C este mai selectiv decât A şi B, dar, fiind de 56 de ori mai puternic împotriva USP30 decât împotriva unui alt DUB, este totuşi semnificativ inferior Exemplului 1.

Selectivitate pentru USP30 faţă de UCHL1

Datele furnizate demonstrează că Exemplul 1 este semnificativ mai selectiv pentru USP30 faţă de UCHL1, în comparaţie cu Exemplele de Referinţă D şi E. Exemplul 1 este de peste 27000 de ori mai puternic împotriva USP30 decât UCHL1, în timp ce Exemplele de Referinţă D şi E sunt doar de 0,8 şi, respectiv, de 1,5 ori mai puternice.

Selectivitate pentru USP30 faţă de catepsinele B, K, L, S şi V

Datele furnizate demonstrează că Exemplul 1 este semnificativ mai selectiv pentru USP30 faţă de catepsine (B, K, L, S şi V), în comparaţie cu Exemplele de Referinţă A, B şi C. Exemplul 1 este de peste 3800 de ori mai puternic împotriva USP30 decât împotriva fiecăreia dintre catepsine. Acesta reprezintă un avantaj semnificativ de selectivitate faţă de Exemplele de Referinţă A, B şi C.

Mai exact, Exemplul 1 este de peste 18000 de ori mai puternic împotriva USP30 decât împotriva catepsinei B, comparativ cu Exemplele de Referinţă B şi C, care sunt doar de 20 şi, respectiv, de 16,7 ori mai puternice. Exemplul 1 este de peste 9900 de ori mai puternic împotriva USP30 decât împotriva catepsinei K, în comparaţie cu Exemplele de Referinţă A şi C, care sunt doar de 2 şi, respectiv, de 6,1 ori mai puternice.

Avantajele identificate mai sus ale Exemplului 1 din invenţie faţă de exemplele de referinţă din stadiul anterior al tehnicii sunt, atât semnificative, cât şi neaşteptate. Individual şi, în particular, în combinaţie, această superioritate face ca compusul să fie deosebit de adecvat pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea bolilor legate de activitatea USP30.

Modele preclinice in vivo

Compuşii din invenţie pot fi testaţi in vivo pentru eficacitate în modele reprezentative de boli, utilizând proceduri standard de studiu din literatura publicată, incluzând, de exemplu:

(a) Modelul de fibroză pulmonară indusă de bleomicină, care este un model preclinic in vivo dominant al fibrozei pulmonare idiopatice. [Kobayashi şi colab., 2016, J Immunol, 197(2):504-516].

(b) Model de NAFLD şi homeostazie a glucozei indus de alimentaţie. [Nishida şi colab., 2013, Lab Invest; Feb;93(2):230-41].

(c) Model MPTP de boală Parkinson, o paradigmă frecvent utilizată pentru studierea neurodegenerarii în sistemul dopaminergic al creierului, declanşată de disfuncţia mitocondrială indusă chimic. [Karuppagouner şi colab., 2014, Sci Rep. 2014 mai 2;4:4874].

(d) Model de sindrom Leigh Ndufs4KO. [Kruse şi colab., 2008, Cell Metab. Apr;7(4):312-20]].

(e) Model de rozătoare în vârstă: efecte asupra funcţiei hipocampice, cognitive şi motorii. [Kobilo şi colab., 2014, Learn Mem. 17 ian.;21(2):119-26]; Creed şi colab., 2019, Neuroscience. 15 iunie; 409:169-179; Van Skike şi colab., 2020, Aging Cell. 19; e13057].

Rozătoarele în vârstă dezvoltă neurodegenerarea hipocampului în mod natural, ceea ce stă la baza modificărilor biochimice şi funcţionale ale capacităţii cognitive. Axa glutamină/glutamat poate fi considerată un surogat pentru sănătatea hipocampului, având în vedere relaţia strânsă dintre utilizarea glutaminei în neuroni ca parte a producţiei de energie mitocondrială.

(f) Modelul de boală renală obstructivă ureterală unilaterală (UUO). [Chevalier şi colab., 2009, Kidney Int 75(11): 1145-1152].

UUO provoacă leziuni renale caracterizate prin leziuni ale celulelor tubulare, inflamaţie interstiţială şi fibroză. Aceasta serveşte ca model de după leziune renală acută (AKI) ireversibilă. UUO experimentală a ilustrat mecanismele moleculare ale apoptozei, inflamaţiei şi fibrozei, toate acestea fiind procese cheie în leziunea renală, indiferent de afecţiunea primară. În consecinţă, modelul de UUO furnizează cercetătorilor informaţii dincolo de obstrucţie (Chevalier şi colab., 2009, Kidney Int 75(11): 1145-1152).

Exemplul 1 a fost evaluat în modelul UUO pentru a determina capacitatea compusului de a atenua fibroza tubulointerstiţială progresivă şi boala renală cronică (CKD).

În ziua 1 a studiului, şoarecilor adulţi C57BL/6 li s-a administrat prin gavaj oral, conform uneia dintre următoarele scheme de dozare: Vehicul, 1,5 sau 5 mg/kg Exemplul 1 (p.o.) de două ori pe zi. La două ore după administrarea dozei în ziua 1 a studiului, şoarecii au fost supuşi unei intervenţii chirurgicale pentru ligaturarea ureterului stâng în două puncte. Operaţia UUO reuşită a fost confirmată ulterior prin observarea dilatării pelvisului renal din cauza hidronefrozei. Administrarea la animale a fost făcută conform schemei prescrise, timp de 10 zile, moment în care rinichii au fost recoltaţi pentru evaluare histopatologică şi pentru evaluarea proteinelor/ARN. Coloraţia cu roşu Picrosirius a fost efectuată pentru a evalua gradul de depunere de colagen, iar IHC a fost folosit pentru a evalua expresia relativă a α-Actinei musculare netede (α-SMA).

Rezultatele au demonstrat că, atât dozele de 1,5, cât şi cele de 5 mg/kg din Exemplul 1 (p.o.), administrate de două ori pe zi, au redus statistic depunerea de colagen, evidenţiată prin reducerea colorării cu roşu picrosirius în rinichii ligaturaţi. Evaluarea colorării cu α-SMA a relevat că administrarea orală BID a 1,5 mg/kg din Exemplul 1 a avut ca rezultat o reducere statistică a nivelurilor de α-SMA în rinichii cu leziuni UUO, în comparaţie cu grupul de control tratat cu substanţă placebo.

(g) AKI poate fi indusă prin prinderea pediculului renal bilateral, rezultând leziuni de ischemie-reperfuzie (IRI) care au ca rezultat pierderea severă a funcţiei renale, leziuni tubulare şi inflamaţie [Lu şi colab. 2012. J Nephrol. 25 (5): 738-45].

Claims (14)

1. Un compus cu formula (I):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

2. Compusul conform revendicării 1, care are formula (IA):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

3. Compusul conform revendicării 1, care are formula (IB):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

4. Compusul conform revendicării 1, care este: (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-carbonitril; sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

5. Un compus conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 4, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare ca medicament.

6. Un compus conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 4, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea unei afecţiuni care implică disfuncţie mitocondrială, cancer sau fibroză.

7. Un compus pentru utilizare conform revendicării 6, în care afecţiunea care implică disfuncţie mitocondrială este selectată dintre o tulburare a CNS; boală neurodegenerativă; boala Parkinson; boala Alzheimer; scleroză laterală amiotrofică; boala Huntington; ischemie; accident vascular cerebral; demenţă cu corpi Lewy; demenţă frontotemporală; scleroză multiplă; encefalopatie mitocondrială, acidoză lactică şi acidoză lactică, şi sindroame de tip accident vascular cerebral; diabet zaharat şi surditate ereditare pe cale maternă; neuropatie optică ereditară Leber; neuropatie, ataxie, retinită pigmentară - sindrom Leigh ereditar pe cale maternă; boala Danon; diabet; nefropatie diabetică; tulburări metabolice; insuficienţă cardiacă; cardiopatie ischemică care conduce la infarct miocardic; boli psihiatrice, schizofrenie; deficit multiplu de sulfatază; mucolipidoză II; mucolipidoză III; mucolipidoză IV; GMl-gangliozidoză; ceroid-lipofuscinoze neuronale; boala Alpers; sindrom Barth; defecte de beta-oxidare; deficit de carnitină-acil-carnitină; deficit de carnitină; sindroame de deficit de creatină; deficit de coenzimă Q10; deficit de complex I; deficit de complex II; deficit de complex III; deficit de complex IV; deficit de complex V; deficit de COX; sindrom de oftalmoplegie externă progresivă cronică; deficit de CPT I; deficit de CPT II; acidurie glutarică de tip II; sindrom Kearns-Sayre; acidoză lactică; deficit de acil-CoA dehidrogenază cu lanţ lung; boala sau sindromul Leigh; varianta franco-canadiană a sindromului Leigh; cardiomiopatie infantilă letală; boala Luft; deficit de acil-CoA dehidrogenază cu lanţ mediu; epilepsie mioclonică şi sindromul fibrelor roşii zdrenţuite; citopatie mitocondrială; sindrom de ataxie recesivă mitocondrială; sindrom de depleţie a ADN-ului mitocondrial; tulburare mioneurogastrointestinală şi encefalopatie; sindrom Pearson; deficit de piruvat dehidrogenază; deficit de piruvat carboxilază; mutaţii POLG; deficit de 3-hidroxiacil-CoA dehidrogenază cu lanţ mediu/scurt; deficit de acil-CoA dehidrogenază cu lanţ foarte lung; tulburări peroxizomale; acidemie metilmalonică; deficit de mevalonat kinază; declin dependent de vârstă al funcţiei cognitive şi al forţei musculare şi deteriorare cognitivă asociată cu toate tulburările neurodegenerative şi neuropsihiatrice.

8. Un compus pentru utilizare conform revendicării 7, în care boala neurodegenerativă este selectată dintre boala Parkinson, boala Alzheimer, scleroză laterală amiotrofică, boala Huntington, ischemie, accident vascular cerebral, demenţă cu corpi Lewy, atrofie sistemică multiplă, paralizie supranucleară progresivă, degenerare corticobazală, demenţă frontotemporală; şi boala Parkinson legată de mutaţii în α-sinucleină, parkină, PINK1, GBA şi LRRK2, şi boala Parkinson juvenilă autosomal recesivă sau boala Parkinson cu debut precoce (EOPD), în care parkina sau PINK1 este mutată, trunchiată sau eliminată.

9. Un compus pentru utilizare conform revendicării 7, în care boala neurodegenerativă este sindromul sau boala Leigh, boala Leigh legată de cromozomul X, varianta franco-canadiană a sindromului Leigh şi/sau simptomele asociate cu boala Leigh.

10. Un compus pentru utilizare conform revendicării 6, în care cancerul este selectat dintre cancer de sân, ovarian, de prostată, pulmonar, renal, gastric, de colon, testicular, de cap şi gât, de pancreas, cerebral, melanom, osos, hepatic, de ţesut moale, cancere ale organelor şi ţesuturilor, cancere ale celulelor sanguine, LMC, LAM, limfom cu celule de mantă, neuroblastom, sarcom de ţesut moale, liposarcom, sarcom fibroblastic, leiomiosarcom, carcinom hepatocelular, osteosarcom, cancer esofagian, leucemie, limfom, mielom multiplu, carcinom metastatic, condosarcom, sarcom Ewing, carcinom nazofaringian, cancer colorectal, carcinom pulmonar fără celule mici, cancer în care căile apoptotice sunt dereglate, şi cancer în care proteinele din familia BCL-2 sunt mutate sau sunt supra- sau sub-exprimate.

11. Un compus pentru utilizare conform revendicării 6, în care fibroza este selectată dintre: fibroză sau o tulburare fibrotică asociată cu acumularea de constituenţi ai matricei extracelulare care apare în urma traumelor, inflamaţiei, reparării ţesuturilor, reacţiilor imunologice, hiperplaziei celulare, sau neoplazie; fibroză sau o tulburare fibrotică asociată cu boli majore ale organelor, tulburări fibroproliferative sau cicatrici asociate cu traume; fibroză sau o tulburare fibrotică asociată cu boală pulmonară interstiţială, ciroză hepatică, boala ficatului gras non-alcoolică şi steatohepatită non-alcoolică, boală renală, boală renală acută, leziune renală acută, boală renală cronică, funcţie întârziată a grefei renale, boală cardiacă sau vasculară, boli ale ochiului, sclerodermie sistemică şi locală, cicatrici cheloide şi hipertrofice, ateroscleroză, restenoză, contractură Dupuytren, complicaţii chirurgicale, fibroză indusă de medicamente chimioterapeutice, fibroză indusă de radiaţii, leziuni şi arsuri accidentale, fibroză retroperitoneală, şi fibroză peritoneală/cicatrici peritoneale; şi fibroză asociată cu boli pulmonare interstiţiale selectate dintre sarcoidoză, silicoză, reacţii la medicamente, infecţii, boli vasculare legate de colagen, artrită reumatoidă, scleroză sistemică, sclerodermie, fibroză pulmonară, fibroză pulmonară idiopatică, pneumonită interstiţială obişnuită, boală pulmonară interstiţială, alveolită fibrozantă criptogenă, bronşiolită obliterantă, şi bronşiectazie.

12. O compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 4, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, împreună cu unu sau mai mulţi excipienţi acceptabili farmaceutic.

13. Un compus, care este selectat dintre formulele (II), (III), (IV) şi (V):

sau o sare a compusului menţionat; şi în care PG este o grupare protectoare, care este selectată dintre terţ-butiloxicarbonil, benziloxicarbonil, p-metoxibenzil carbonil, 9-fluorenilmetiloxicarbonil, acetil, benzoil, benzil, carbamat, p-metoxibenzil, 3,4-dimetoxibenzil, p-metoxifenil, tosil, tricloretoxicarbonil, 4-nitrobenzensulfonil şi 2-nitrofenilsulfenil.

14. Un compus conform revendicării 13, care este selectat dintre formulele (IIA), (IIIA), (IVA) şi (VA):

sau o sare a compusului menţionat.