RU2848457C1

RU2848457C1 - N-Цианопирролидины с активностью ингибиторов USP30

Info

Publication number: RU2848457C1
Application number: RU2022134805A
Authority: RU
Inventors: Кристофер Эндрю Лакхерст; Марк Иэн КЕМП; Пол Уиллиям ТОМПСОН
Original assignee: Мишн Терапьютикс Лимитед
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2025-10-20

Abstract

Изобретение относится к соединению формулы (I), которое выбрано из соединений формулы (I)(i) и формулы (I)(ii), или его фармацевтически приемлемой соли, обладающим активностью ингибиторов деубиквитилирующего фермента USP30. В формулах (I)(i) и (I)(ii) R¹ выбран из (C₁-C₄)алкила, (C₁-C₄)фторалкила и CH₂OCH₃; R² выбран из (C₁-C₄)алкила, CF₃ и циклопропила и R³, R⁴ и R⁵, каждый независимо, выбраны из водорода и галогена. Изобретение относится также к применению указанных соединений для лечения или предупреждения расстройства или состояния, связанного с активностью USP30, или для лечения или предупреждения состояния, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, рака или фиброза, которые связаны с активностью USP30, фармацевтической композиции, обладающей активностью ингибирования активности USP30, содержащей указанные соединения, и к промежуточным соединениям в их синтезе. 5 н. и 26 з.п. ф-лы, 1 табл., 19 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к классу N-цианопирролидинов с активностью ингибиторов деубиквитилирующего фермента убиквитин С-концевая гидролаза 30, которая также известна как убиквитин-специфическая пептидаза 30 (USP30), к их применению, способам их получения и композициям, содержащим указанные ингибиторы. Эти ингибиторы полезны в различных терапевтических областях, включая состояния, в которые вовлечена митохондриальная дисфункция, рак и фиброз.

Все документы, процитированные или упомянутые ниже, в прямой форме включены в данное описание изобретения посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Убиквитин представляет собой небольшой белок, состоящий из 76 аминокислот, который важен для регуляции функции белков в клетке. Убиквитилирование и деубиквитилирование представляют собой энзиматически опосредованные процессы, в результате которых убиквитин ковалентно связывается с белком-мишенью или отщепляется от белка-мишени деубиквитилирующими ферментами (DUB), из которых приблизительно 100 DUB существуют в клетках человека, и которые делятся на подсемейства на основе гомологии последовательностей. Семейство USP характеризуется их общими Cys и His боксами, которые содержат Cys и His остатки, имеющие решающее значение для активности их DUB. Процессы убиквитилирования и деубиквитилирования задействованы в регуляции многих клеточных функций, включающих прохождение клеточного цикла, апоптоз, модификацию рецепторов клеточной поверхности, регуляцию транскрипции ДНК и репарации ДНК. Таким образом, убиквитиновая система участвует в патогенезе многочисленных болезненных состояний, включающих воспаление, вирусную инфекцию, метаболическую дисфункцию, расстройства ЦНС и онкогенез.

Убиквитин является главным регулятором митохондриальной динамики. Митохондрии представляют собой динамичные органеллы, чей биосинтез, слияние и акты деления регулируются посредством пост-трансляционной регуляции через убиквитилирование многих ключевых факторов, таких как митофузины. У людей USP30 представляет собой состоящий из 517 аминокислот белок, который находится в митохондриальной наружной мембране (Nakamura et al, 2008, Mol Biol 19:1903-11). Это единственный деубиквитилирующий фермент, несущий митохондриальный сигнал адресации, и было показано, что он деубиквитилирует целый ряд митохондриальных белков. Было продемонстрировано, что USP30 противодействует паркин-опосредованной митофагии, и что снижение активности USP30 позволяет сохранять паркин-опосредованные дефекты в митофагии (Bingol et al, 2015, Nature 510:370-5; Gersch et al, 2017, Nat Struct Mol Biol 24(11): 920-930; Cunningham et al, 2015, Nat Cell Biol 17(2): 160-169). Инактивация USP30 может также увеличивать импорт митохондриальных белков, потенциально через убиквитилирование ТОМ-белков (Jacoupy et al, 2019, Sci Rep 9(1): 11829). Небольшая часть USP30 локализована в пероксисомах, которые образуются в результате слияния митохондриальных и ER везикул, причем USP30 потенциально антагонизирует путь Рех2/пероксифагии (Riccio et al, 2019, J Cell Biol 218(3): 798-807). ЕЗ убиквитинлигаза March5 и деубиквитиназаШРЗО ассоциируются с транслоказой и регулируют митохондриальный импорт, и хотя March5 противодействует митохондриальному импорту и направляет разрушение субстратов, USP30 деубиквитилирует субстраты, чтобы способствовать их импорту (Phu et al, 2020, Molecular Cell 77, 1107-1123).

Митохондриальная дисфункция может быть определена как уменьшение содержания митохондрий (митофагия или митохондриальный биогенез), как снижение митохондриальной активности и оксидативного фосфорилирования, а также как модулирование образования реактивных форм кислорода (ROS). Следовательно, митохондриальные дисфункции играют роль в очень большом количестве процессов старения и патологий.

Например, болезнь Паркинсона поражает около 10 миллионов людей во всем мире (Фонд борьбы с болезнью Паркинсона) и характеризуется потерей допаминергических нейронов в черном веществе. Точные механизмы, лежащие в основе PD (болезнь Паркинсона), не ясны; тем не менее, митохондриальная дисфункция все чаще оценивается как ключевая детерминанта допаминергической нейрональной чувствительности при PD и является признаком как семейного, так и спорадического заболевания, а также токсин-индуцированного паркинсонизма. Паркин является одним из целого ряда белков, которые связаны с ранним началом PD. Хотя большинство случаев PD связаны с дефектами в альфа-синуклеине, 10% случаев болезни Паркинсона связаны с конкретными генетическими дефектами, один из которых находится в паркине, который является убиквитинлигазой Е3. Паркин и протеинкиназа PTEN-индуцированная предполагаемая киназа 1 (PINK1) совместно участвуют в убиквитилировании митохондриальных мембранных белков поврежденных митохондрий, приводящем к митофагии. Нарушение регуляции митофагии приводит к увеличению оксидативного стресса, который был описан как характеристика PD. Следовательно, ингибирование USP30 может представлять собой потенциальную стратегию для лечения PD. Например, пациенты с PD с мутациями в паркине, приводящими к снижению активности, могут быть терапевтически компенсированы путем ингибирования USP30.

Сообщалось, что истощение USP30 усиливает митофагический клиренс митохондрий, а также усиливает индуцированную паркином гибель клеток. Было показано также, что USP30 регулирует ВАХ/ВАК-зависимый апоптоз независимо от сверхэкспрессии паркина. Истощение USP30 сенситизирует раковые клетки к миметикам ВН-3, таким как АВТ-737, без необходимости в сверхэкспрессии паркина. Таким образом, была продемонстрирована антиапоптическая роль USP30, и USP30, следовательно, является потенциальной мишенью для противораковой терапии.

Система убиквитин-протеасома вызвала интерес в качестве мишени для лечения рака после одобрения ингибитора протеасомы бортезомиба (Velcade®) для лечения множественной миеломы. Длительное лечение бортезомидом ограничено ввиду ассоциированной с ним токсичности и лекарственной устойчивости. Однако терапевтические стратегии, которые нацелены на конкретные аспекты убиквитин-протеасомного пути выше протеасомы, такие как DUB, по прогнозам имеют лучшую переносимость (Bedford et al, 2011, Nature Rev 10:29-46).

Фиброзирующие заболевания, включая фиброз почек, печени и легких, являются лидирующей причиной заболеваемости и смертности и могут поражать все ткани и органы. Считается, что фиброз является результатом острого или хронического стрессового воздействия на ткань или орган, и характеризуется отложением внеклеточного матрикса, снижением проходимости сосудов/канальцев/протоков/дыхательных путей и нарушением функции, что в конечном итоге приводит к органной недостаточности. Многие фиброзирующие состояния обусловлены образом жизни или факторами окружающей среды; однако часть фиброзирующих состояний может быть инициирована генетическими триггерами или действительно считаются идиопатическими (т.е. без известной причины). Некоторые фиброзирующие заболевания, такие как идиопатический фиброз легких (IPF), можно лечить неспецифическим ингибитором киназы (нинтеданиб) или лекарственными средствами без четко охарактеризованного механизма действия (пирфенидон). Другие способы лечения фиброза органа, такого как фиброз почек или печени, ослабляют давление на сам орган (например, бета-блокаторы при циррозе, блокаторы рецепторов ангиотензина при хроническом почечном заболевании). Внимание к факторам образа жизни, таким как контроль глюкозы и диеты, также может влиять на течение и тяжесть заболевания.

Митохондриальная дисфункция вовлечена в ряд фиброзирующих заболеваний, причем оксидативный стресс вслед за дисфункцией является ключевым патогенным медиатором наряду со снижением продуцирования АТР (аденозинтрифосфат). В доклинических моделях прерывание пути митофагии (посредством мутации или нокаута либо паркина, либо PINK1) усугубляет фиброз легких и фиброз почек с признаками повышенного оксидативного стресса.

В Kurita et al, 2017, Respiratory Research 18: 114, раскрыто, что накопление профибротических миофибробластов является решающим процессом для фибротического ремоделирования при IPF. Считается, что последние данные свидетельствуют об участии аутофагии/митофагии, части лизосомального механизма деградации, в патогенезе IPF, и что митофагия вовлечена в дифференцировку миофибробластов путем опосредованной реактивными формами кислорода (ROS) регуляции митохондриальной активации рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFR). Результаты Kurita показали, что пирфенидон индуцирует PARK2-опосред о ванную митофагию, а также ингибирует развитие фиброза легких в условиях недостаточной митофагии, что может по меньшей мере частично объяснить противофиброзные механизмы лечения IPF.

В Williams et al, 2015, Pharmacol Res. December; 102: 264-269, обсуждается роль PINK 1-паркин-опосредованной аутофагии в защите от индуцированного алкоголем и ацетаминофеном повреждения печени путем удаления поврежденных митохондрий посредством митофагии. Предполагается, что фармакологическая стабилизация USP8 или инактивация USP15 и USP30 могут быть потенциальными терапевтическими мишенями для повышающей регуляции паркин-индуцированной митофагии и, в свою очередь, могут защищать от индуцированного лекарственным средством повреждения печени. Тем не менее, отмечается, что DUB регулируются как транскрипционно, так и пост-трансляционно, что может затруднять разработку лекарственных средств для направленного воздействия на эти конкретные ферменты, и, кроме того, было показано, что фосфорилированный убиквитин устойчив к DUB. Авторы приходят к выводу, что повышающая регуляция стабилизации PTNK1 или активности киназы может быть более эффективной мишенью, чем ингибирование DAB.

В Williams et al, 2015, Biomolecules 5, 2619-2642, и Williams et al, 2015, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 309: G324-G340, рассматриваются механизмы, участвующие в регуляции митохондриального гомеостаза в печени, и как эти механизмы могут защитить от индуцированного алкоголем заболевания печени.

В Luciani et al, 2020, Nat. Commun. 11, 970, сообщается, что нарушение регуляции митохондриальной сети в терминально дифференцированных клетках вносит вклад в развитие широкого спектра расстройств, включая метилмалоновую ацидемию (ММА). ММА является одним из наиболее распространенных наследственных метаболических расстройств, обусловленных недостаточностью митохондриальной метилмалонил-кофермент А-мутазы (MMUT). Недостаточность MMUT индуцирует метаболические и митохондриальные изменения, которые усугубляются аномалиями в PINKl/паркин-опосредованной митофагии, вызывая накопление митохондрий с нарушенной функцией, которые запускают эпителиальный стресс и, в конечном счете, повреждение клеток. Высказывается предположение о связи между первичной недостаточностью MMUT, больными митохондриями, дисфункцией митофагии и эпителиальным стрессом, и предлагаются потенциальные терапевтические перспективы для ММА.

В Kluge et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2018, 28 2655-2659, сообщается, что избирательные ингибиторы USP30 ускоряют митофагию.

Серия производных N-циано-замещенных гетероциклов раскрыта в качестве ингибиторов деубиквитилирующих ферментов в заявках РСТ WO 2016/046530 (US 15/513125, US 15/894025, US 16/448066), WO 2016/156816 (US 15/558632, US 16/297937, US 16/419558, US 16/419747, US 16/788446), WO 2017/009650 (US 15/738900), WO 2017/093718 (US 15/776149), WO 2017/103614 (US 15/781615), WO 2017/149313 (US 16/078518), WO 2017/109488 (US 16/060299), WO 2017/141036 (US 16/070936), WO 2017/163078 (US 16/087515), WO 2017/158381 (US 16/080229), WO 2017/158388 (US 16/080506), WO 2018/065768 (US 16/336685), WO 2018/060742 (US 16/336202), WO 2018/060689 (US 16/334836), WO 2018/060691 (US 16/336363), WO 2018/220355 (US 16/615040), WO 2018/234755 (US 16/615709), WO 2020/212350, WO 2020/212351 и WO 2021/043870 и PCT WO 2021/064166, каждая из которых полностью включена в данное описание изобретения посредством ссылки. В заявке PCT WO 2019/171042 (US 16/977019), полное содержание которой включено в данное описание изобретения посредством ссылки, раскрыто применение N-цианопирролидинов в качестве ингибиторов USP30 для лечения фиброзирующих заболеваний.

Falgueyret et al, 2001, J.Med.Chem. 44, 94-104, и заявка PCT WO 01/77073 относятся к цианопирролидинам в качестве ингибиторов катепсинов К и L с потенциальным применением в лечении остеопороза и других состояний, связанных с резорбцией кости. Заявка PCT WO 2015/179190 относится к jV-ацилэтаноламинным ингибиторам гидролизующей кислотной амидазы с потенциальным применением в лечении неспецифического язвенного колита и болезни Крона. Заявка PCT WO 2013/030218 относится к соединениям хиназолин-4-она в качестве ингибиторов убиквитинспецифических протеаз, таких как USP7, с потенциальной полезностью в лечении рака, нейродегенеративных заболеваний, воспалительных расстройств и вирусных инфекций. Заявки PCT WO 2015/017502 и WO 2016/019237 относятся к ингибиторам тирозинкиназы Брутона с потенциальной полезностью в лечении таких заболеваний, как аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание и рак. Заявки PCT WO 2009/026197, WO 2009/129365, WO 2009/129370 и WO 2009/129371 относятся к цианопирролидинам в качестве ингибиторов катепсина С с потенциальной полезностью в лечении COPD (хроническая обструктивная болезнь легких). Заявка на патент США US 2008/0300268 относится к полиароматическим соединениям в качестве ингибиторов тирозинкиназного рецептора PDGFR. Заявки PCT WO 2019/222468, WO 2019/071073, WO 2020/036940 и WO 2020/072964, Rusilowicz-Jones et al, 2020, bioRxiv 2020.04.16.044206 (20 April 2020) и Tsefou et al, bioRxiv 2021.02.02.429344 (2 February 2021) относятся к цианамидсодержащим соединениям в качестве ингибиторов USP30. Yue et al, 2014, Cell Research, 24, 482-496, относится к дитерпеноидному производному 15-оксоспирамилактона в качестве ингибитора USP30, который индуцирует слияние митохондрий.

Заявка PCT WO 2015/183987 относится к фармацевтическим композициям, содержащим ингибиторы деубиквитиназы и человеческий сывороточный альбумин, в способах лечения рака, фиброза, аутоиммунного заболевания или состояния, воспалительного заболевания или состояния, нейродегенеративного заболевания или состояния или инфекции. Отмечено, что деубиквитиназы, включая UCHL5/UCH37, USP4, USP9X, USP11 и USP15, вовлечены в регуляцию сигнального пути TGF-бета, нарушение которого приводит к нейродегенеративным и фиброзирующим заболеваниям, аутоиммунной дисфункции и раку.

Заявка РСТ WO 2006/067165 относится к способу лечения фиброзирующих заболеваний с использованием ингибиторов индолинонкиназы. Заявка РСТ WO 2007/119214 относится к способу лечения фиброза легких на ранней стадии антагонистом рецептора эндотелина. Заявка РСТ WO 2012/170290 относится к способу лечения фиброзирующих заболеваний с использованием ТНС (тетрагидроканнабиноловых) кислот.Заявка РСТ WO 2018/213150 относится к сульфонамидным ингибиторам USP30 с потенциальной полезностью в лечении состояний, в которые вовлечены митохондриальные дефекты. В Larson-Casey et al, 2016, Immunity 44, 582-596, рассматриваются опосредованные макрофагальной киназой Akt1 митофагия, резистентность к апоптозу и фиброз легких. В Tang et al, 2015, Kidney Diseases 1, 71-79, рассматривается потенциальная роль митофагии в почечной патофизиологии.

Существует потребность в безопасных, альтернативных и/или усовершенствованных способах и композициях для лечения или предупреждения состояний, в которые вовлечена митохондриальная дисфункция, рака и фиброза, а также различных симптомов и состояний, связанных с ними. Без какой-либо связи с конкретной теорией или механизмом считается, что соединения по настоящему изобретению оказывают ингибирующее действие на фермент USP30, который, в свою очередь, осуществляет повышающую регуляцию индуцированной паркином митофагии.

Острое почечное повреждение (AKI) определяют как резкое снижение функции почек, происходящее в течение 7 суток или менее, с тяжестью повреждения, стадия которого определена исходя из повышенного сывороточного креатинина (SCr) и пониженного диуреза, как описано в Рекомендациях по улучшению глобальных результатов лечения пациентов с заболеваниями почек (KDIGO). AKI встречается примерно у 13,3 миллиона человек в год, 85% из которых живут в развивающихся странах, и считается, что оно способствует примерно 1,7 миллионам смертей каждый год (Mehta et al, 2015, Lancet 385 (9987): 2616-2643). AKI более чем вероятно приводит к необратимому почечному повреждению (т.е. хроническому почечному заболеванию; CKD) и может также привести к повреждению непочечных органов. AKI является серьезной проблемой общественного здравоохранения, особенно с учетом абсолютного числа пациентов, у которых развивается CKD, прогрессирующее CKD, терминальная стадия почечной недостаточности и сердечно-сосудистые события. Было обнаружено, что AKI распространено у пациентов, госпитализированных с COVID-19, и в значительной степени ассоциируется с больничной смертностью, и сообщается о митохондриальных повреждениях и дисфункции как о потенциальном патофизиологическом механизме и терапевтической мишени (Kellum et al, Nephrol Dial Transplant (2020) 35: 1652-1662).

AKI и CKD рассматриваются как континуум в одном и том же спектре заболеваний (Chawla et al, 2017, Nat Rev Nephrol 13(4): 241-257). Пациенты, перенесшие аортокоронарное шунтирование (CABG), имеют высокий риск почечного повреждения. Существует очевидная неудовлетворенная медицинская потребность в разработке лекарственных продуктов для лечения и/или профилактики AKI.

Почка является местом высокой метаболической потребности с высокими показателями митофагии, продемонстрированными in vivo (McWilliams et al, 2018, Cell Metab 27 (2): 439-449 e435). Эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек (RPTEC), тип клеток со значительной потребностью в АТР для обмена растворенное вещество/ион, богаты митохондриями и являются первичными эффекторными клетками острого почечного повреждения (AKI) в почке. Митохондриальная дисфункция вовлечена в механизмы AKI/CKD, как по данным множества линий доказательств из доклинических моделей AKI и CKD, так и по данным, демонстрирующим аномальные митохондриальные фенотипы в биопсиях пациента (Emma et al, 2016, Nat Rev Nephrol 12(5): 267-280; Eirin et al, 2017, Handb Exp Pharmacol 240: 229-250). Кроме того, первичное митохондриальное заболевание часто проявляется почечными симптомами, такими как очаговый сегментарный гломерулосклероз (Kawakami et al, 2015, J Am Soc Nephrol 26(5): 1040-1052) у пациентов с MELAS/MIDD (митохондриальная энцефалопатия с лактатацидозом/наследуемым по материнской линии синдромом сахарного диабета и глухоты), а также первичные тубулярные патологии у пациентов в недостаточностью кофермента Q. Мутации в мтДНК (митохондриальная ДНК) могут вызывать наследуемое по материнской линии тубулоинтерстициальное заболевание (Connor et al, 2017, PLoS Genet 13(3): e1006620).

В отношении контроля митохондриального качества при почечном повреждении (Tang et al, 2018, Autophagy 14(5): 880-897) продемонстрировано, что почечное повреждение обострялось после ишемического AKI как у мышей PINK1 КО, так и у мышей PARK2 КО, что свидетельствует о том, что PINKl/ПАРКИН-опосредованная митофагия играет защитную роль после IRI (ишемическое реперфузионное повреждение) в почке. Кроме того, паркин/PINK1 митофагия защищает от индуцированного цисплатином почечного повреждения (Wang et al, 2018, Cell Death Dis 9(11): 1113). Ограниченные модели CKD доступны для изучения митофагии, подтверждающие данные по контролю митохондриального качества при фиброзе поступают из исследований фиброзирующих заболеваний легких, таких как COPD и IPF. Животные с нокаутом паркина демонстрируют обострение фиброза легких в ответ на блеомицин (Kobayashi et al, 2016, J Immunol, 197:504-516). Аналогично, эпителиальные клетки дыхательных путей животных с нокаутом паркина (КО) демонстрируют обострение фиброзирующих и стареющих ответных реакций на сигаретный дым (Araya et al, 2019, Autophagy 15(3): 510-526).

Доклинические модели доступны для исследования потенциальных новых терапевтических средств благодаря их способности моделировать фиброзную патологию (например, отложение коллагена), согласующуюся с состоянием у человека. Доклинические модели могут быть опосредованными токсинами (например, блеомицином для фиброза легких и кожи), хирургическими (например, модель ишемического/реперфузионного повреждения и модель односторонней обструкции мочеточника для острого тубулоинтерстициального фиброза) и генетическими (например, диабетические (db/db) мыши для диабетической невропатии). Например, оба примера, ранее приведенные для указанных способов лечения IPF (нинтеданиб и пирфенидон), показывают эффективность в блеомициновой модели фиброза легких.

Соответственно, существует потребность в соединениях, которые являются ингибиторами USP30, для лечения или профилактики состояний, при которых показано ингибирование USP30. В частности, существует потребность в ингибиторах USP30, которые обладают подходящими и/или улучшенными свойствами для максимального увеличения эффективности против целевого заболевания.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I), которое выбрано из соединений формулы (I)(i) и формулы (I)(ii):

его таутомеру или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения или таутомера, где:

R¹ выбран из (С₁-С₄)алкила, (С₁-С₄)фторалкила и СН₂ОСН₃;

R² выбран из (С₁-С₄)алкила, CF₃ и циклопропила; и

R³, R⁴ и R⁵, каждый независимо, выбраны из водорода и галогена.

Настоящее изобретение также относится к применению соединений формулы (I), в частности в лечении состояний, в которые вовлечена митохондриальная дисфункция, рака и фиброза, а также к способам их получения и фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к ингибиторам USP30, которые обладают подходящими и/или улучшенными свойствами для максимального увеличения эффективности против целевого заболевания. Такие свойства включают, например, действенность, избирательность, физико-химические свойства, свойства ADME (абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция), включая PK (фармакокинетический) профиль, и профиль безопасности.

Как правило, желательно максимально увеличить эффективность молекулы лекарственного средства против фермента-мишени в соответствующих анализах, чтобы снизить эффективную/действенную дозировку, которую нужно вводить пациентам. Соединения по изобретению могут быть протестированы на аффинность к USP30 с использованием биохимического флуоресцентного поляризационного анализа (FP) in vitro, описанного в данном документе.

USP30 представляет собой трансмембранный белок, расположенный в наружной мембране митохондрий, которые являются энергопродуцирующими органеллами, присутствующими внутри клеток. Поэтому возможность продемонстрировать клеточную активность in vitro является предпочтительной, так как это один из ряда компонентов, которые могут показывать большую способность взаимодействовать с мишенью в ее физиологических условиях, т.е. где соединение-ингибитор USP30 способно проникать в клетки. Описанный в данном документе клеточный анализ USP30 методом вестерн-блот (WB) предназначен для тестирования активности соединений против USP30 в клетках с использованием зонда необратимой активности для мониторинга активности USP30. Аналогично клеточному вестерн-блот-анализу оценка взаимодействия с мишенью (ex vivo) может быть проведена в образцах ткани головного мозга или почки, взятых у животных, которым вводили соединение.

Для распространения данных по связыванию с мишенью на последующую фармакодинамику может быть произведена оценка убиквитилирования ТОМ20 (белка наружной мембраны митохондрии).

Как правило, важно, чтобы препарат был максимально избирательным по отношению к его желаемому ферменту-мишени; дополнительные активности обуславливают возможность побочных эффектов. Точная физиологическая роль многих DUB еще не полностью определена; однако независимо от того, какую роль эти DUB могут или не могут играть, разумным является основное правило медицинской химии гарантировать, чтобы любой препарат имел избирательность по сравнению с родственными механистическими мишенями неизвестной физиологической функции. Репрезентативными примерами ферментов DUB, в отношении которых соединения по настоящему изобретению могут быть подвергнуты скринингу, являются UCHL1, UCHL3, UCHL5, YOD1, SENP2, SENP6, TRABID, ВАР1, Cezanne, MINDY2/FAM63B, OTU1, OTUD3, OTUD5, OTUD6A, OTUD6B, OTUB1/UBCH5B, OTUB2, CYLD, VCPIP, AMSH-LP, JOSD1, JOSD2, USP1/UAF1, USP2, USP4, USP5, USP6, USP7, USP8, USP9x, USP10, USP11, USP12/UAF1, USP13, USP14, USP15, USP16, USP19, USP20, USP21, USP22, USP24, USP25, USP28, USP32, USP34, USP35, USP36, USP45, USP46/UAF1, USP47 и USP48. Предпочтительно, соединения по изобретению имеют хорошую избирательность к USP30 относительно одного или более чем одного из этих DUB ферментов.

Помимо избирательности относительно других ферментов DUB важно, чтобы препарат имел низкую аффинность к другим мишеням, и фармакологическое профилирование может быть выполнено по отношению к панелям мишеней для оценки потенциала и минимизации потенциальных нецелевых эффектов. Примерами мишеней, по отношению к которым может быть проведен скрининг соединений по настоящему изобретению, являются стандартная промышленная панель Eurofins-Cerep SafetyScreen44, которая включает в себя 44 мишени, в качестве репрезентативного выбора рецепторов GPCR (рецептор, сопряженный с G-белком), транспортеров, ионных каналов, ядерных рецепторов и киназных и некиназных ферментов. Предпочтительно, соединения по изобретению имеют незначительную аффинность к мишеням этой скрининговой панели. Другими примерами мишеней, в отношении которых соединение по настоящему изобретению может быть подвергнуто скринингу, являются киназы панели для профилирования киназ Thermo Fisher SelectScreen, которая включает в себя 39 мишеней в качестве репрезентативного выбора ферментов-киназ. Предпочтительно, соединения по изобретению имеют незначительную аффинность к мишеням этой скрининговой панели. Дополнительно, примерами конкретного класса ферментов, по отношению к которым соединения по настоящему изобретению могут быть подвергнуты скринингу, являются катепсины (например, катепсин А, В, С, Н, K, L, L2, S, V и Z). Предпочтительно, соединения по изобретению обладают хорошей избирательностью к USP30 относительно одного или более чем одного из этих ферментов.

Существует также потребность в соединениях, которые обладают благотворными фармакокинетическими свойствами, чтобы они были пригодны для перорального введения. Перорально вводимое лекарственное средство должно иметь хорошую биодоступность, то есть способность легко проходить сквозь желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) и не подвергаться экстенсивному метаболизму при прохождении из желудочно-кишечного тракта в системный кровоток. Как только лекарственное средство попадает в системный кровоток, скорость метаболизма также важна для определения времени пребывания лекарственного средства в организме.

Таким образом, ясно, что молекулы лекарственных средств должны обладать свойствами легко проходить сквозь желудочно-кишечный тракт и медленно метаболизироваться в организме. Анализ Сасо-2 является общепринятой моделью для прогнозирования способности данной молекулы проходить сквозь желудочно-кишечный тракт. Большая часть метаболизма молекул лекарственных средств обычно происходит в печени, и анализы in vitro с использованием цельноклеточных гепатоцитов (животных или человека) являются широко распространенными методами измерения восприимчивости данной молекулы к метаболизму в печени. Такие анализы предназначены для прогнозирования клиренса in vivo по вычисленному значению клиренса гепатоцитов.

Соединения, которые имеют хорошую проницаемость в модели Сасо-2 и стабильны по отношению к гепатоцитам, прогнозируются как имеющие хорошую пероральную биодоступность (хорошее всасывание по всему желудочно-кишечному тракту и минимальную экстракцию соединения при его прохождении через печень) и длительное время пребывания в организме, которое достаточно для того, чтобы лекарственное средство было эффективным.

Растворимость соединения является важным фактором достижения желаемой концентрации лекарственного средства в системном кровотоке для ожидаемого фармакологического ответа. Низкая растворимость в воде является проблемой при разработке препаратов новых химических соединений, а для всасывания лекарственное средство должно присутствовать в виде раствора в месте всасывания. Кинетическая растворимость соединения может быть измерена с использованием турбидиметрического анализа растворимости, данные которого также могут быть использованы в сочетании с данными о проницаемости в модели Сасо-2 для прогнозирования дозозависимого кишечного всасывания у человека.

Другие параметры, которые могут быть измерены с использованием стандартных анализов, и которые являются показателями профиля экспозиции соединения, включают, например, стабильность в плазме крови (измерение периода полувыведения),

Значения AUC, C_max, C_min И T_max в крови.

Для лечения расстройств ЦНС, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие расстройства, описанные в данном документе, требуется, чтобы молекулы лекарственного средства направленно воздействовали на головной мозг, что требует адекватного проникания через гематоэнцефалический барьер. Поэтому существует потребность в ингибиторах USP30, которые обладают эффективными свойствами проникания в головной мозг из крови и обеспечивают подходящее время пребывания в головном мозге, чтобы быть эффективными. Вероятность того, что соединение может пересечь гематоэнцефалический барьер, может быть измерена в анализе проницаемости in vitro с использованием клеточного монослоя MDR¹-MDCK (клетки почки собак Мадин-Дарби, трансфицированные MDR-1, что приводит к сверхэкспрессии переносчика эффлюкса Р-гликопротеина человека). Дополнительно, воздействие также может быть измерено непосредственно в головном мозге и в плазме крови с использованием животных моделей in vivo.

Существует также потребность в соединениях, которые имеют благоприятный профиль безопасности, который может быть измерен различными стандартными методами in vitro и in vivo. Параллельный скрининг в отношении клеточной токсичности может быть использован для анализа антипролиферативного/цитотоксического эффекта в конкретной клеточной линии (например, НСТ116) путем флуорометрического детектирования превращения резасурина (alamarBlue™) в резофурин в ответ на митохондриальную активность.

Токсикологические исследования и исследования безопасности также могут быть проведены для идентификации потенциальных органов-мишеней в отношении побочных эффектов и определения терапевтического индекса для установления начальных доз в клинических испытаниях. Нормативные требования требуют, как правило, чтобы исследования проводились по меньшей мере на двух видах лабораторных животных, одном грызуне (крыса или мышь) и одном не грызуне (кролик, собака, примат, не являющийся человеком, или другие подходящие виды).

Бактериальный анализ обратной мутации (тест Эймса) может быть использован для оценки мутагенных свойств соединения по изобретению, обычно с использованием бактериального штамма Salmonella typhimurium, который является мутантным для биосинтеза аминокислоты гистидин.

Микроядерный анализ может быть использован для определения, является ли соединение генотоксичным, путем оценки присутствия микроядер. Микроядра могут содержать фрагменты хромосом, образующиеся в результате разрыва ДНК (кластогены) или целые хромосомы, образующиеся в результате нарушения работы митотического аппарата (анеугены).

Прогностический анализ hERG предоставляет ценную информацию о возможном связывании тестируемых соединений с калиевым каналом и о потенциальном удлинении интервала QT на эхокардиограмме. Ингибирование тока hERG вызывает удлинение интервала QT, что приводит к потенциально фатальной желудочковой тахиаритмии (Torsades de Pointes (двунаправленная веретенообразная желудочковая тахикардия)). Обычно данные анализа могут быть получены с использованием автоматизированной платформы для пэтч-клэмп-анализа.

Таким образом, настоящее изобретение относится к ингибиторам USP30, которые обладают подходящими и/или улучшенными свойствами для максимального увеличения эффективности против целевого заболевания. К таким свойствам относятся, например, действенность, избирательность, физико-химические свойства, свойства ADME (абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция), включая PK (фармакокинетический) профиль, и профиль безопасности.

Было обнаружено, что соединения по настоящему изобретению демонстрируют один или более из вышеуказанных идентифицированных свойств, которые являются как существенными, так и неожиданными. Например, соединения Примеров 1-12 по настоящему изобретению оказывают сильное действие на USP30, как измерено в биохимическом анализе, описанном в настоящем документе. Все соединения этих Примеров (1-12) по настоящему изобретению значительно более избирательны к USP30 относительно других DAB и катепсинов.

Существенные и неожиданные свойства соединений по настоящему изобретению делают их особенно подходящими для применения в лечении и/или предупреждении заболеваний, связанных с активностью USP30.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложено соединение формулы (I), которое выбрано из соединений формулы (I)(i) и формулы (I)(ii):

его таутомер или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения или таутомера, где:

R¹ выбран из (С₁-С₄)алкила, (С₁-С₄)фторалкила и CH₂OCH₃;

Соединение формулы (I) существует в виде единственного стереоизомера с показанной абсолютной стереохимией.

Алкильные группы могут быть прямыми или разветвленными и содержат 1-4 атома углерода. Примеры алкила включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил и втор-бутил.

Галоген означает фтор, хлор, бром или йод, в частности фтор или хлор. Фторалкильные группы могут содержать один или более заместителей, представляющих собой фтор. Примерами являются фторметил, дифторметил и трифторметил.

Если не указано иное, термин «замещенный» означает замещенный одной или более определенными группами. В случае если группы могут быть выбраны из более чем одной альтернативы, выбранные группы могут быть одинаковыми или разными. Термин «независимо» означает, что если более чем один заместитель выбран из более чем одного возможного заместителя, то эти заместители могут быть одинаковыми или разными.

Предпочтительные воплощения соединения формулы (I) для применения в настоящем изобретении определены ниже.

Предпочтительно, R¹ выбран из метила, CH₂F, CHF₂, CF₃ и СН₂ОСН₃.

Более предпочтительно, R¹ выбран из метила, CH₂F и СН₂ОСН₃.

Наиболее предпочтительно, R¹ выбран из метила и СН₂ОСН₃.

Предпочтительно, R² выбран из метила, CF₃ и циклопропила.

Наиболее предпочтительно, R² выбран из метила и циклопропила.

Предпочтительно, R³ выбран из водорода, хлора и фтора.

Более предпочтительно, R³ выбран из водорода и фтора.

Наиболее предпочтительно, R³ представляет собой водород.

Предпочтительно, R⁴ и R⁵, каждый независимо, выбраны из водорода и фтора.

Наиболее предпочтительно, каждый из R⁴ и R⁵ представляет собой водород.

Согласно одному аспекту изобретения соединение формулы (I) имеет формулу (I)(i):

Согласно другому аспекту изобретения соединение формулы (I) имеет формулу (I) (ii):

Согласно первому предпочтительному аспекту изобретения предложено соединение формулы (IA)(i):

Предпочтительные воплощения соединения формулы (IA)(i) определены ниже.

Предпочтительные соединения формулы (IA)(i) по настоящему изобретению выбраны из:

5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(фторметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида; и

5-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

или их фармацевтически приемлемых солей.

Наиболее предпочтительные соединения формулы (IA)(i) по настоящему изобретению выбраны из:

5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида; и

или их фармацевтически приемлемых солей.

Согласно второму предпочтительному аспекту изобретения предложено соединение формулы (IB)(i):

Предпочтительные воплощения соединения формулы (IB)(i) определены ниже.

Наиболее предпочтительно, R¹ представляет собой СН₂ОСН₃.

Наиболее предпочтительно, R² представляет собой метил.

Предпочтительные соединения формулы (IB)(i) по настоящему изобретению выбраны из:

4-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида; и

4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

или их фармацевтически приемлемых солей.

Согласно третьему предпочтительному аспекту изобретения предложено соединение формулы (IA)(ii):

Предпочтительные воплощения соединения формулы (IA)(ii) определены ниже.

Предпочтительные соединения формулы (IA)(ii) по настоящему изобретению выбраны из:

5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

5-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид; and

5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(фторметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

или их фармацевтически приемлемых солей.

Согласно четвертому предпочтительному аспекту изобретения предложено соединение формулы (IB)(ii):

Предпочтительные воплощения соединения формулы (IB)(ii) определены ниже.

Предпочтительные соединения формулы (IB)(ii) по настоящему изобретению выбраны из:

4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида; и

4-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида;

или их фармацевтически приемлемых солей.

Фармацевтически приемлемые соли соединений формулы (I) включают их соли присоединения кислоты и соли присоединения основания (в том числе ди-соли).

Подходящие соли присоединения кислоты образуются из кислот, которые образуют нетоксичные соли. Примеры включают соли ацетат, аспартат, бензоат, безилат, бикарбонат/карбонат, бисульфат, камзилат, цитрат, эдисилат, эзилат, фумарат, глуцептат, глюконат, глюкуронат, гибензат, гидрохлорид/хлорид, гидробромид/бромид, гидройодид/йодид, гидрофосфат, изетионат, D- и L-лактат, малат, малеат, малонат, мезилат, метилсульфат, 2-напсилат, никотинат, нитрат, оротат, пальмат, фосфат, сахарат, стеарат, сукцинат сульфат, D- и L-тартрат и тозилат.

Подходящие соли оснований образуются из оснований, которые образуют нетоксичные соли. Примеры включают соли алюминия, аммония, аргинина, бензатина, кальция, холина, диэтил амина, д иол амина, глицина, лизина, магния, меглумина, оламина, калия, натрия, трометамина и цинка.

Обзор по подходящим солям см. в Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH, Weinheim, Germany (2002).

Фармацевтическая приемлемая соль соединения формулы (I) легко может быть получена путем смешивания растворов соединения формулы (I) и желаемой кислоты или желаемого основания, где как подходит. Соль может осаждаться из раствора и может быть собрана фильтрованием или может быть выделена выпариванием растворителя.

Фармацевтические приемлемые сольваты в соответствии с изобретением включают гидраты и сольваты, где кристаллизационный растворитель может быть замещен изотопом, например D₂O, ацетон-d₆, DMSO-d₆.

Также в объем изобретения входят клатраты, комплексы включения лекарственное средство-хозяин, где в отличие от вышеупомянутых сольватов лекарственное средство и хозяин присутствуют в нестехиометрических количествах. Обзор по таким комплексам см. в J. Pharm Sci, 64 (8), 1269-1288 by Haleblian (August 1975).

Далее все ссылки на соединения формулы (I) охватывают ссылки на их соли и на сольваты и клатраты соединений формулы (I) и их солей.

Изобретение охватывает все полиморфы соединений формулы (I), как определено ниже.

Также в объем изобретения входят так называемые "пролекарства" соединений формулы (I). Так, некоторые производные соединений формулы (I), которые сами обладают небольшой активностью или не обладают активностью, когда метаболизируются после введения в или на организм, преобразуются в соединения формулы (I), обладающие желаемой активностью. Такие производные называются "пролекарствами".

Пролекарства в соответствии с изобретением могут быть получены, например, путем замены соответствующих функциональных групп, присутствующих в соединениях формулы (I), некоторыми группировками, известными специалистам в данной области как "прогруппировки", как описано, например, в "Design of Prodrugs" by H Bundgaard (Elsevier, 1985).

Наконец, некоторые соединения формулы (I) сами могут действовать как пролекарства других соединений формулы (I).

Некоторые производные соединений формулы (I), которые содержат атом азота, могут также образовывать соответствующий N-оксид, и такие соединения также входят в объем настоящего изобретения.

В объем настоящего изобретения входят все таутомерные формы соединений формулы (I).

Общепринятые методы получения/выделения индивидуальных энантиомеров включают хиральный синтез из подходящего оптически чистого предшественника или разделение рацемата (или рацемата соли или производного) с использованием, например, хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Альтернативно, рацемат (или рацемический предшественник) может быть подвергнут взаимодействию с подходящим оптически активным соединением, например спиртом, или, в случае если соединение формулы (I) содержит кислотную или основную группировку, с основанием или кислотой, такими как 1-фенилэтиламин или винная кислота. Полученная диастереомерная смесь может быть разделена хроматографией и/или фракционной кристаллизацией, и один или оба диастереоизомера могут быть превращены в соответствующий(ие) чистый(ые) энантиомер(ы) методами, известными специалисту. Хиральные соединения по изобретению (и их хиральные предшественники) могут быть получены в энантиомерно-обогащенной форме с использованием хроматографии, обычно ВЭЖХ, на асимметрической смоле с подвижной фазой, состоящей из углеводорода, обычно гептана или гексан, содержащего 0-50% об. изопропанола, обычно от 2% до 20%, и 0-5% об. алкиламина, обычно 0,1% диэтиламина. Концентрирование элюата дает обогащенную смесь. Настоящее изобретение охватывает кристаллические формы соединений формулы (I), включая их рацематы и рацемические смеси (конгломераты). Стереоизомерные конгломераты могут быть разделены общепринятыми методами, известными специалистам в данной области (см., например, "Stereochemistry of Organic Compounds" by E. L. Eliel and S. H. Wilen (Wiley, New York, 1994)).

Соединения формулы (I) содержат два хиральных центра на атомах углерода пирролидинового кольца, которые замещены R¹ и амидом, и указанные стереоцентры могут существовать либо в (R), либо в (S) конфигурации. Обозначение абсолютной конфигурации (R) и (S) для стереоизомеров в соответствии с номенклатурой IUPAC зависит от природы заместителей и применения правила старшинства. Таким образом, соединения формулы (I) могут существовать в четырех стереоизомерных формах.

Соединения формулы (I) по настоящему изобретению существуют в виде единственного стереоизомера. Атом углерода пирролидинового заместителя амида существует в виде (R)-стереоцентра, тогда как обозначение пирролидинового атома углерода группы R¹ зависит от природы этого заместителя. Соединение формулы (I) выделено в виде единственного стереоизомера и может существовать со стереоизомерным избытком по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, например 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

Дополнительные хиральные центры могут существовать в соединениях формулы (I) в самом заместителе R¹. В объем настоящего изобретения входят все такие стереоизомерные формы соединений формулы (I).

Настоящее изобретение также охватывает все фармацевтически приемлемые изотопные варианты соединения формулы (I). Изотопный вариант определяют как вариант, в котором по меньшей мере один атом заменен атомом, имеющим такое же атомное число, но атомная масса которого отличается от атомной массы, обычно встречающейся в природе.

Примеры изотопов для включения в соединения по изобретению включают изотопы водорода, такие как ²Н и ³Н, углерода, такие как ¹³С и ¹⁴С, азота, такие как ¹⁵N, кислорода, такие как ¹⁷O и ¹⁸O, фосфора, такие как ³²Р, серы, такие как ³⁵S, фтора, такие как ¹⁸F, и хлора, такие как ³⁶CI.

Замещение соединений по изобретению изотопами, такими как дейтерий, может давать некоторые терапевтические преимущества за счет большей метаболической стабильности, например увеличения периода полувыведения in vivo или снижения требований к дозировке, и, следовательно, может быть предпочтительным в некоторых обстоятельствах.

Некоторые изотопные варианты соединений формулы (I), например те, в которые включен радиоактивный изотоп, полезны в исследованиях распределения лекарственных средств или субстратов в тканях. Радиоактивные изотопы тритий и ¹⁴С особенно полезны для этой цели ввиду легкости их включения и готовых средств детектирования.

Изотопные варианты соединений формулы (I) обычно получают стандартными способами, известными специалистам в данной области, или способами, аналогичными способам, описанным в сопровождающих Примерах и Получениях, с использованием соответствующих изотопных вариантов подходящих реагентов.

Соединения формулы (I) являются ингибиторами деубиквитилирующего фермента USP30.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложено соединение формулы (I), как оно определено в данном документе, его таутомер или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения или таутомера для применения в качестве лекарственного средства.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения или предупреждения расстройства или состояния, в отношении которого известно или может быть показано, что ингибирование USP30 оказывает благотворное воздействие у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), как оно определено в данном документе, его таутомера или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения или таутомера.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение соединения формулы (I), как оно определено в данном документе, его таутомера или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения или таутомера в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения расстройства или состояния, в отношении которого известно или может быть показано, что ингибирование USP30 оказывает благотворное воздействие. Изготовление лекарственного средства может включать в себя, среди прочего, химический синтез соединения формулы (I) или его соли, или приготовление композиции или препарата, содержащей(его) соединение или соль, или упаковку любого лекарственного средства, содержащего соединение.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ ингибирования USP30 у пациента, включающий введение пациенту терапевтического количества соединения формулы (I), как оно определено в данном документе, его таутомера или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения или таутомера.

Расстройство или состояние, обусловленное активностью USP30, выбрано из состояния, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, рака и фиброза.

В одном предпочтительном воплощении всех аспектов изобретения расстройство или состояние, обусловленное активностью USP30, представляет собой состояние, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция.

Митохондриальные дисфункции возникают в результате дефектов митохондрий, которые являются специализированными компартментами, присутствующими в каждой клетке организма, кроме эритроцитов. Когда митохондрии выходят из строя, в клетке генерируется все меньше и меньше энергии, и за этим следует повреждение клеток или даже гибель клеток. Если этот процесс повторяется по всему организму, то жизнь субъекта, у которого это происходит, в значительной степени поставлена под угрозу. Заболевания митохондрий появляются чаще всего в органах, которые очень энергоемки, такие как головной мозг, сердце, печень, скелетные мышцы, почки и эндокринная и дыхательная система.

Состояние, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, может быть выбрано из состояния, в которое вовлечен дефект митофагии, состояния, в которое вовлечена мутация в митохондриальной ДНК, состояния, в которое вовлечен митохондриальный оксидативный стресс, состояния, в которое вовлечен дефект митохондриального мембранного потенциала, митохондриального биогенеза, состояния, в которое вовлечен дефект митохондриальной формы или морфологии, и состояния, в которое вовлечен дефект лизосомального накопления.

В частности, состояние, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, может быть выбрано из нейродегенеративного заболевания; рассеянного склероза (MS); митохондриальной энцефалопатии, синдрома лактоацидоза и инсультоподобных эпизодов (MELAS); наследуемых по материнской линии диабета и глухоты (MIDD); наследственной оптической нейропатии Лебера (LHON); рака (в том числе, например, рака молочной железы, яичника, предстательной железы, легкого, почки, желудка, толстой кишки, яичка, в области головы и шеи, поджелудочной железы, головного мозга, меланомы, рака кости или других раковых заболеваний тканевых органов и раковых заболеваний кровяных клеток, таких как лимфома и лейкоз, множественной миеломы, метастатической карциномы, остеосаркомы, хондросаркомы, саркомы Юинга, карциномы носоглотки, колоректального рака и немелкоклеточной карциномы легкого); невропатии, атаксии, пигментного ретинита, унаследованного по материнской линии синдрома Ли (NARP-MILS); болезни Данона; диабета; диабетической невропатии; метаболических расстройств; сердечной недостаточности; ишемической болезни сердца, приводящей к инфаркту миокарда; психиатрических заболеваний, например шизофрении; множественной сульфатазной недостаточности (MSD); муколипидоза II (ML II); муколипидоза III (ML III); муколипидоза IV (ML IV); GM1-ганглиозидоза (GM1); нейронального цероидного липофусциноза (NCL1); болезни Альперса; синдрома Барта; дефектов бета-окисления; карнитин-ацил-карнитиновой недостаточности; недостаточности карнитина; синдромов недостаточности креатинина; недостаточности кофермента Q10; недостаточности комплекса I; недостаточности комплекса II; недостаточности комплекса III; недостаточности комплекса IV; недостаточности комплекса V; недостаточности СОХ (циклоокисгеназа); синдрома хронической прогрессирующей внешней офтальмоплегии (СРЕО); недостаточности CPTI (карнитин-пальмтоилтрансфераза I); недостаточности СРТ II; глутарацидурии типа II; синдрома Кернса-Сейра; лактоацидоза; недостаточности длинноцепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы (LCHAD); болезни или синдрома Ли; франко-канадского варианта синдрома Ли (LSFC); летальной младенческой кардиомиопатии (LIC); болезни Люфта; недостаточности среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы (MCAD); синдрома миоклонической эпилепсии и разорванного красного волокна (MERRF); митохондриальной цитопатии; синдрома митохондриальной рецессивной атаксии; синдрома истощения митохондриальной ДНК; мионейрогастроинтестинального расстройства и энцефалопатии; синдрома Пирсона; недостаточности пируватдегидрогеназы; недостаточности пируваткарбоксилазы; мутаций в POLG (митохондриальная полимераза гамма); недостаточности среднецепочечной 3-гидроксиацил-КоА-дегидродегидрогеназы (M/SCHAD); недостаточности очень длинноцепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы (VLCAD); пероксисомальных расстройств; метилмалоновой ацидемии; и возрастного ухудшения когнитивной функции и мышечной силы.

Состояние, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, может представлять собой расстройство ЦНС, например нейродегенеративное заболевание.

Нейродегенеративные заболевания включают, но без ограничения, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, амиотрофический латеральный склероз (ALS), болезнь Гентингтона, ишемию, инсульт, деменцию с тельцами Леви, множественную системную атрофию (MSA), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), кортикобазальную дегенерацию (CBD) и лобно-височную деменцию.

В частности, соединения по изобретению могут быть полезны в лечении или предупреждении болезни Паркинсона, включая, но без ограничения, PD, связанную с мутациями в α-синуклеине, паркине, PINK1, GBA и LRRK2, и аутосомно-рецессивную ювенильную болезнь Паркинсона (AR-JP), где паркин мутирован, усечен или удален.

В частности, соединения по изобретению могут быть полезны в лечении или предупреждении когнитивного нарушения, ассоциированного с нейродегенеративными и нейропсихиатрическими расстройствами, включая, например, когнитивное нарушение, ассоциированное с болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона, доклиническими или продромальными формами AD и PD, болезнью Гентингтона, деменцией с тельцами Леви, когнитивное нарушение, ассоциированное с шизофренией, расстройствами настроения, биполярным и генерализованным депрессивными расстройствами.

Соединения по изобретению или содержащие их фармацевтические композиции, как описано в настоящем документе, можно комбинировать с одним или более дополнительными агентами при использовании для лечения или предупреждения состояний, в которые вовлечена митохондриальная дисфункция. Соединения можно комбинировать с одним или более дополнительными агентами, выбранными из леводопы, агониста допамина, ингибитора моноаминоксигеназы (МАО) В, ингибитора катехол-О-метилтрансферазы (СОМТ), антихолинергического средства, рилузола, амантадина, ингибитора холинэстеразы, мемантина, тетрабеназина, антипсихотика, диазепама, клоназепама, антидепрессанта и противосудорожного средства. Соединения можно комбинировать с агентами, которые уменьшают/удаляют патогенные белковые агрегаты при нейродегенеративных заболеваниях, такие как агенты, которые уменьшают/удаляют альфа-синуклеин при болезни Паркинсона, множественной системной атрофии или деменции с тельцами Леви; агенты, которые уменьшают/удаляют Таи при болезни Альцгеймера или прогрессирующем надъядерным параличе; агенты, которые уменьшают/удаляют TDP-43 при ALS или лобно-височной деменции.

В другом предпочтительном воплощении всех аспектов изобретения расстройством или состоянием, обусловленным активностью USP30, является рак. Рак может быть связан с митохондриальной дисфункцией. Предпочтительные виды рака включают, например, рак молочной железы, яичника, предстательной железы, легкого, почки, желудка, толстой кишки, яичка, в области головы и шеи, поджелудочной железы, головного мозга, меланому, костный или другие виды рака тканевых органов и виды рака клеток крови, такие как лимфома и лейкоз, множественную миелому, метастатическую карциному, остеосаркому, хондросаркому, саркому Юинга, саркому носоглотки, колоректальный рак, колоректальный рак и немелкоклеточную карциному легкого.

В частности, соединения по изобретению могут быть полезны в лечении или предупреждении рака, при котором нарушена регуляция путей апоптоза, и более конкретно, где белки семейства BCL-2 (В-клеточная лимфома 2) мутированы или сверх-или недо-экспрессированы.

Фиброз относится к накоплению составляющих внеклеточного матрикса, которое возникает вследствие травмы, воспаления, регенерации ткани, иммунологических реакций, клеточной гиперплазии и неоплазии. Фиброзирующие расстройства, которые можно лечить соединениями и композициями по настоящему изобретению, включают, среди прочего, фиброз/фиброзирующие расстройства, ассоциированные с заболеваниями жизненно важных органов, например интерстициальным заболеванием легких (ILD), циррозом печени, неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD) и неалкогольным стеатогепатитом (NASH) (фиброз печени), заболеванием почек (фиброз почек), острым почечным повреждением (AKI), хроническим почечным заболеванием (CKD), замедленной функцией трансплантата почки, сердечным или сосудистым заболеванием (фиброз сердца) и заболеваниями глаза; фибропролиферативные расстройства, например системную и местную склеродермию, келоиды и гипертрофические рубцы, атеросклероз, рестеноз и контрактуру Дюпюитрена; рубцевание, ассоциированное с травмой, например хирургическими осложнениями, фиброзом, вызванным химиотерапевтическими лекарственными средствами (например, индуцированный блеомицином фиброз), фиброзом, вызванным облучением, случайным повреждением и ожогами); ретроперитонеальный фиброз (болезнь Ормонда); и перитонеальный фиброз/перитонеальное рубцевание у пациентов, получающих перитонеальный диализ, обычно после трансплантации почки (см., например, Wynn et al, 2004, Nat Rev Immunol. August; 4(8): 583-594). Таким образом, настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения и соединениям и композициям, используемым в указанных способах, фиброза/фиброзирующих расстройств органов и/или ассоциированных с главными органами, включая, например, легкое, печень, почку, сердце, кожу, глаз, желудочно-кишечный тракт, брюшину и костный мозг, и другими заболеваниями/расстройствами, описанными в данном документе.

Соединения можно комбинировать с агентами, которые применяют в качестве терапевтических средств для лечения заболевания почек, включая противодиабетические агенты, агенты для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и новые агенты, направленно воздействующие на имеющие отношение к заболеванию пути, такие как оксидативный стресс (включая, но без ограничения, путь nrf2/keap-l) и антиапоатические пути (включая, но без ограничения, агенты против р53).

Интерстициальное заболевание легких (ILD) включает расстройства, при которых воспаление легких и фиброз являются финальными общими путями патологии, например саркоидоз, силикоз, реакции на лекарственные средства, инфекции и коллагеновые сосудистые заболевания, такие как ревматоидный артрит и системный склероз (склеродермия). Фиброзирующее расстройство легкого включает, например, фиброз легких, идиопатический фиброз легких (IPF), обычный интерстициальный пневмонит (UIP), интерстициальное заболевание легких, криптогенный фиброзирующий альвеолит (CFA), облитерирующий бронхиолит и бронхоэктаз.

Идиопатический фиброз легких (IPF) является самым распространенным типом ILD, и его причина не известна.

Соединения можно комбинировать с агентами, которые являются средствами для лечения IPF и потенциально ILD, включая нинтеданиб и пирфенидон.

Цирроз печени имеет причины, аналогичные ILD, и включает, например, цирроз, ассоциированный с вирусным гепатитом, шистосомозом и хроническим алкоголизмом.

Заболевание почек может быть ассоциировано с диабетом, который может повреждать и рубцевать почки, приводя к прогрессирующей утрате функции, а также к гипертензивным заболеваниям. Фиброз почек может возникать на любой стадии заболевания почек от острого почечного заболевания (AKD) после повреждения и хронического почечного заболевания (CKD), такого как инцидентное CKD и прогрессирующее CKD, до почечного заболевания в конечной стадии (ESRD). Фиброз почек может развиться в результате сердечно-сосудистого заболевания, такого как гипертензия, или диабета, которые оба накладывают большие ограничения на функцию почек, способствуя фиброзирующему ответу. Однако фиброз почек может быть также идиопатический (в отсутствие известной причины), и при некоторых генетических митохондриальных заболеваниях также присутствуют проявления фиброза почек и ассоциированные симптомы.

Заболевания сердца могут приводить к рубцеванию тканей, что может ухудшать способность сердца качать.

Заболевания глаза включают, например, дегенерацию желтого пятна и ретинальную и витреальную ретинопатию, которые могут ухудшать зрение.

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к лечению или предупреждению идиопатического фиброза легких (IPF).

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к лечению или предупреждению фиброза почек.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к лечению или предупреждению острого почечного повреждения (AKI), особенно у пациентов, имеющих высокий риск. Примеры включают пост-хирургическое AKI, например после трансплантации органа, такое как вследствие ишемического реперфузионного повреждения, замедленной функции трансплантата; онкологическое, такое как AKI вследствие химиотерапии; нефропатии, индуцированной контрастной средой, такой как прямая тубулярная цитотоксичность, гемодинамическая ишемия и осмотические эффекты; острого интерстициального нефрита, такого как вследствие приема лекарственных средств или инфекции; и COVID-19-индуцированную AKI. Особую подгруппу пациентов высокого риска составляют пациенты, подвергшиеся кардиохирургическому вмешательству, например, аортокоронарному шунтированию и/или клапанной хирургии. Установлены статистические факторы риска развития AKI, такие как возраст 65 лет и старше, инсулинозависимый диабет, CKD (группой особого риска являются взрослые с расчетной скоростью клубочковой фильтрации [eGFR] менее 60 мл/мин/1,73 м²), сердечную недостаточность, заболевание печени, AKI в анамнезе.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к лечению или предупреждению хронического почечного заболевания (CKD), проистекающего из такого AKI, включая, например, тубулоинтерстициальный фиброз и диабетическую нефропатию.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к лечению или предупреждению заболеваний печени, включая, но без ограничения, NAFLD, NASH, цирроз печени, портальную гипертензию, острую печеночную недостаточность и печеночноклеточную карциному. Заболевание печени, такое как NAFLD и NASH, может быть связано с различными метаболическими состояниями, такими как метаболический синдром и диабет II типа, который также будет повышать риск возникновения ассоциированных с диабетом патологий, включая диабетическую ретинопатию и периферические невропатии.

Соединения по изобретению или их фармацевтические композиции, как описано в данном документе, можно комбинировать с одним или более дополнительными агентами при использовании для лечения или предупреждения состояний, в которые вовлечены заболевание печени и метаболическая дисфункция, включающими метформин, сульфонилмочевыины, ингибиторы DPP-4, агонисты GLP-1, агонисты PPAR, ингибиторы SGLT2, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) и блокаторы рецептора ангиотензина II (ARB).

Синдром Ли является редким наследственным нейрометаболическим расстройством, которое поражает центральную нервную систему. Это прогрессирующее расстройство начинается у младенцев в возрасте от трех месяцев до двух лет.Редко встречается у подростков и взрослых. Синдром Ли может быть вызван мутациями в ядерной ДНК, кодирующей митохондриальные белки, мутациями в митохондриальной ДНК (наследуемый по материнской линии синдром Ли (MILS)) или дефицитом фермента под названием пируватдегидрогеназа, локализованного на коротком плече X-хромосомы (Х-сцепленный синдром Ли). Симптомы синдрома Ли обычно быстро прогрессируют.Самыми ранними признаками могут быть плохая сосущая способность, а также потеря контроля над головой и двигательных навыков. Эти симптомы могут сопровождаться потерей аппетита, рвотой, раздражительностью, непрерывным плачем и судорогами. По мере прогрессирования расстройства симптомы могут также включать генерализованную слабость, отсутствие мышечного тонуса и эпизоды лактоацидоза, которые могут приводить к нарушению дыхательной и почечной функции.

При унаследованном по материнской линии синдроме Ли (MILS) генетические мутации в митохондриальной ДНК (при высоком проценте >90%) препятствуют источникам энергии обеспечивать функционирование клеток в области головного мозга, которая играет роль в моторике. Генетические мутации в митохондриальной ДНК приводят к хронической нехватке энергии в этих клетках, что в свою очередь влияет на центральную нервную систему и вызывает прогрессирующую дегенерацию двигательных функций. Когда генетические мутации в митохондриальной ДНК, которые вызывают MILS, менее многочисленные (менее 90%), состояние известно как невропатия, атаксия и пигментный ретинит (NARP). Существует также форма болезни Ли (называемая Х-сцепленной болезнью Ли), которая является результатом мутаций в гене, который продуцирует другую группу веществ, важных для клеточного метаболизма. Существует еще один вариант синдрома Ли, который называется франко-канадским вариантом, характеризующимся мутациями в гене под названием LRPPRC. Подобные неврологические симптомы выражены, как и симптомы синдрома Ли, хотя при франко-канадском варианте обычно также наблюдается печеночный стеатоз.

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к лечению или предупреждению синдрома или болезни Ли, включая, например, Х-сцепленную болезнь Ли, франко-канадский вариант синдрома Ли и/или симптомы, ассоциированные с болезнью Ли.

Соединения можно комбинировать с новыми агентами, которые могут быть использованы для лечения митохондриального заболевания, включая, но без ограничения, никотинамид рибозид.

Ссылки на «лечение» включают в себя значения ослаблять, облегчать симптомы, устранять причинно-следственную связь симптомов либо на временной, либо на постоянной основе. Соединения по изобретению полезны в лечении заболеваний, раскрытых в данном документе, у людей и других млекопитающих.

В другом воплощении изобретение охватывает профилактическую терапию заболеваний, раскрытых в данном документе, и включает в себя значения предупреждать или замедлять появление симптомов названного расстройства или состояния. Соединения по изобретению полезны в предупреждении заболеваний, раскрытых в данном документе, у людей и других млекопитающих.

Пациентом, нуждающимся в лечении или предупреждении, может быть, например, человек или другое млекопитающее, страдающий(ее) состоянием или имеющий(ее) риск возникновения этого состояния.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), как оно определено в данном документе, или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения или таутомера вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

Фармацевтические композиции по изобретению содержат любое из соединений по изобретению совместно с любым фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или разбавителем. Примеры фармацевтически приемлемых носителей известны специалистам в данной области и включают, но без ограничения, консерванты, наполнители, разрыхлители, увлажняющие агенты, эмульгаторы, суспендирующие агенты, подсластители, корригенты, отдушки, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты, смазывающие агенты и диспергирующие агенты, в зависимости от природы способа введения и лекарственных форм. Композиции могут быть в форме, например, таблеток, капсул, порошков, гранул, эликсиров, сиропов и жидких препаратов, включающих суспензии и растворы. Термин «фармацевтическая композиция» в контексте данного изобретения означает композицию, содержащую активный агент и содержащую дополнительно один или более фармацевтически приемлемых носителейs. Композиция может дополнительно содержать ингредиенты, выбранные, например, из разбавителей, вспомогательных веществ, эксципиентов, носителей, консервантов, наполнителей, разрыхлителей, увлажняющих агентов, эмульгаторов, суспендирующих агентов, подсластителей, корригентов, отдушек, антибактериальных агентов, противогрибковых агентов, смазывающих агентов и диспергирующих агентов, в зависимости от природы способа введения и лекарственных форм.

Соединения по изобретению или их фармацевтические композиции, как описано в данном документе, можно применять сами по себе или совместно с одним или более дополнительными фармацевтическими агентами. Соединения можно комбинировать с дополнительным противоопухолевым терапевтическим агентом, например с химиотерапевтическими лекарственными средствами или ингибиторами других регуляторных белков. В одном воплощении дополнительный противоопухолевый терапевтический агент представляет собой миметик ВН-3. В другом воплощении миметики ВН-3 могут быть выбраны, но без ограничения, из одного или более АВТ-737, АВТ-199, АВТ-263 и Obatoclax. В еще одном воплощении дополнительный противоопухолевый агент представляет собой химиотерапевтический агент.Химиотерапевтические агенты могут быть выбраны, но без ограничения, из олапариба, митомицина С, цисплатина, карбоплатина, оксаплатина, ионизирующего излучения (IR), камптотецина, иринотекана, топотекана, темозоломида, таксанов, 5-фторпиримидинов, гемцитабина и доксорубицина.

Для лечения или предупреждения фиброзирующих расстройств, например, соединения по изобретению или их фармацевтические композиции, как описано в данном документе, можно применять или комбинировать с одним или более дополнительными фармацевтическими агентами, выбранными из группы, состоящей из антихолинергических агентов, миметиков бета-2, стероидов, ингибиторов PDE-IV, ингибиторов р38 МАР-киназы, антагонистов NK1, антагонистов LTD4, ингибиторов EGFR и антагонистов эндотелина.

В частности, соединения по изобретению или их фармацевтические композиции, как описано в данном документе, можно применять или комбинировать с одним или более дополнительными фармацевтическими агентами, выбранными из группы, состоящей из обычных иммуносуппрессивных лекарственных средств, таких как кортикостероидные, иммуносуппрессивные или цитотоксические агенты, или антибиотиков, таких как пирфенидон, или неспецифического ингибитора киназы (например, нинтеданиб).

Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить любым подходящим эффективным путем, таким как пероральный, парентеральный, местный, ингаляционный, интраназальный, ректальный, интравагинальный и ауральный. Фармацевтические композиции, подходящие для доставки соединений по настоящему изобретению, и способы их получения будут очевидны специалистам в данной области. Такие композиции и способы их получения можно найти, например, в "Remington's Pharmaceutical Sciences", 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995).

Пероральное введение

Соединения по изобретению можно вводить перорально. Пероральное введение может включать в себя проглатывание, так что соединение поступает в желудочно-кишечный тракт, или можно использовать трансбуккальное или сублингвальное введение, при котором соединение поступает в кровоток непосредственно из полости рта.

Препаративные формы, подходящие для перорального введения, включают твердые препаративные формы, такие как таблетки, капсулы, содержащие частицы, жидкости или порошки, пастилки (в том числе с жидким наполнителем), жевательные резинки, мульти- и нано-частицы, гели, пленки (в том числе мукоадгезивные), овули, спреи и жидкие препаративные формы.

Жидкие препаративные формы включают суспензии, растворы, сиропы и эликсиры. Такие препараты могут быть использованы в качестве наполнителей в мягких или твердых капсулах и обычно содержат носитель, например воду, этанол, пропиленгликоль, метилцеллюлозу или подходящее масло, и один или более эмульгаторов и/или суспендирующих агентов. Жидкие препаративные формы могут быть также приготовлены путем разведения твердого вещества, например из саше.

Соединения по изобретению можно также использовать в быстрорастворимых, быстро распадающихся лекарственных формах, таких как те, которые описаны в Expert Opinion in Therapeutic Patents, 11 (6), 981-986 by Liang and Chen (2001).

Типичная таблетка может быть получена стандартными способами, известными химику, работающему с препаративными формами, например путем прямого прессования, гранулирования (сухого, мокрого или из расплава), отверждения расплава или экструзии. Таблетка может содержать один или более слоев и может быть покрыта оболочкой или может не иметь покрытия.

Примеры эксципиентов, подходящих для перорального введения, включают носители, например целлюлозу, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция, маннит и цитрат натрия, связывающие вещества для гранулирования, например поливинилпирролидин, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и желатин, разрыхлители, например натрий-крахмалгликолят и силикаты, смазывающие агенты, например стеарат магния и стеариновую кислоту, увлажняющие агенты, например лаурилсульфат натрия, консерванты, антиоксиданты, корригенты и красители.

Твердые препаративные формы для перорального введения могут быть приготовлены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Препаративные формы с модифицированным высвобождением включают формы с замедленным, длительным, импульсным, двойным контролируемым, направленным и запрограммированным высвобождением. Подробности о подходящих технологиях модифицированного высвобождения, таких как высокоэнергетические дисперсии, осмотические и покрытые оболочкой частицы находятся в Verma et al, Pharmaceutical Technology On-line, 25 (2), 1-14 (2001). Другие препаративные формы с модифицированным высвобождением описаны в патенте США №6,106,864.

Парентеральное введение

Соединения по изобретению можно также вводить прямо в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Подходящие средства для парентерального введения включают внутривенные, внутриартериальные, интраперитонеальные, интратекальные, интравентрикулярные, интрауретральные, интрастернальные, интракраниальные, внутримышечные и подкожные средства. Подходящие устройства для парентерального введения включают игольные (в том числе микроигольные) инъекторы, безыгольные инъекторы и инфузионные технические средства.

Парентеральные препаративные формы обычно представляют собой водные растворы, которые могут содержать эксципиенты, такие как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно до рН от 3 до 9), но для некоторых применений они могут более подходящим образом приготовлены в виде стерильного неводного раствора или в виде высушенной формы для использования в сочетании с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода.

Приготовление парентеральных препаративных форм в стерильных условиях, например лиофилизацией, легко может быть осуществлено с использованием стандартных фармацевтических методов, известных специалистам в данной области.

Растворимость соединений формулы (I), используемых в приготовлении парентеральных растворов, можно увеличивать подходящими способами, например, с использованием высокоэнергетических дисперсий, высушенных распылением, и/или с использованием соответствующих методов приготовления, таких как использование агентов, повышающих растворимость.

Препаративные формы для парентерального введения могут быть приготовлены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Препаративные формы с модифицированным высвобождением включают формы с замедленным, длительным, импульсным, двойным контролируемым, направленным и запрограммированным высвобождением.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также включают композиции и способы, известные в данной области для обхода гематоэнцефалического барьера или которые можно вводить непосредственно в мозг. Подходящие области для инъекции включают кору головного мозга, мозжечок, средний мозг, ствол мозга, гипоталамус, спинной мозг и желудочковую ткань, а также области PNS, включая каротидное тельце и мозговое вещество надпочечников.

Дозировка

Величина эффективной дозы соединения, разумеется, будет варьироваться в зависимости от характера и тяжести состояния, подлежащего лечению, и пути введения. Подбор соответствующих дозировок входит в компетенцию лечащего врача. Суточный диапазон доз составляет от 10 мкг до примерно 100 мг на кг массы тела человека и животного, не являющегося человеком, и, как правило, может составлять от 10 мкг до 30 мг на кг массы тела на дозу. Вышеуказанную дозу можно вводить от одного до трех раз в сутки.

Например, для перорального введения может требоваться суммарная суточная доза от 5 мг до 1000 мг, такая как от 5 до 500 мг, в то время как внутривенная доза может составлять только от 0,01 до 30 мг/кг массы тела, например от 0,1 до 10 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 1 мг/кг массы тела. Суммарную суточную дозу можно вводить в разовых или разделенных дозах. Квалифицированный специалист также оценит, что в лечении или предупреждении определенных состояний соединения по изобретению можно вводить в виде однократной дозы в соответствии с тем, «как требуется» (т.е. как нужно или как желательно).

Методологии синтеза

Соединения формулы (I) могут быть получены с использованием способов, описанных ниже на общих реакционных схемах и в репрезентативных примерах. Если это целесообразно, отдельные превращения на схеме могут быть осуществлены в другом порядке. Изобретение иллюстрируется нижеследующими не ограничивающими примерами, в которых использованы указанные ниже сокращения и определения. Соединения были охарактеризованы методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХМС) или ¹Н ЯМР, или обоими методами.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения соединения формулы (I)(i), включающий взаимодействие соединения формулы (IV), где Y представляет собой ОН, с амином формулы (V)(i), где PG представляет собой защитную группу, такую как ВОС или CBZ, до образования амида формулы (III)(i) (Схема 1). Реакция амидного сочетания может быть осуществлена с использованием стандартной методологии, например путем проведения реакции с использованием реагента сочетания, такого как DCC, HATU, HBTU, EDC, или через смешанный ангидрид. Альтернативно, кислота (IV), где Y представляет собой ОН, может быть превращена в хлорангидрид кислоты (IV), где Y представляет собой С1, используя SOCh, РС1з или РСЬ, который затем может быть подвергнут взаимодействию с амином (V)(i), предпочтительно в подходящем растворителе в присутствии подходящего основания. Альтернативно, соединение (IV), где Y образует сложный эфир, напрямую может быть подвергнуто взаимодействию с амином (V)(i), предпочтительно в подходящем растворителе. Соединение формулы (III)(i) может быть лишено защитной группы стандартными методами с образованием амина (II)(i), который затем может быть подвергнут взаимодействию с бромцианом с получением соответствующего соединения формулы (I)(i).

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение, которое выбрано из соединений формул (II)(i) и (III)(i):

где PG представляет собой защитную группу, предпочтительно ВОС или CBZ, и R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ такие, как определено в данном документе для соединения формулы (I) и его предпочтительных воплощений, его таутомера или соли указанного соединения или таутомера.

Когда соединение формулы (I)(i) имеет формулу (IA)(i), тогда формулы (II)(i), (III)(i) и (IV) представляют собой формулы (IIA)(i), (IIIA)(i) и (IVA) соответственно. Когда соединение формулы (I)(i) имеет формулу (IB)(i), тогда формулы (II)(i), (III)(i) и (IV) представляют собой формулы (IIB)(i), (IIIB)(i) и (IVB)(i) соответственно.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения соединения формулы (I)(ii), включающий взаимодействие соединения формулы (IV), где Y представляет собой ОН, с амином формулы (V)(ii), где PG представляет собой защитную группу, такую как ВОС или CBZ, до образования амида формулы (III)(ii) (Схема 2). Реакция амидного сочетания может быть осуществлена с использованием стандартной методологии, например путем проведения реакции с использованием реагента сочетания, такого как DCC, HATU, HBTU, EDC, или через смешанный ангидрид. Альтернативно, кислота (IV), где Y представляет собой ОН, может быть превращена в хлорангидрид кислоты (IV), где Y представляет собой Cl, используя SOCl₂, PCl₃ или PCl₅, который затем может быть подвергнут взаимодействию с амином (V)(ii), предпочтительно в подходящем растворителе в присутствии подходящего основания. Альтернативно, соединение (IV), где Y образует сложный эфир, напрямую может быть подвергнуто взаимодействию с амином (V)(ii), предпочтительно в подходящем растворителе. Соединение формулы (III)(ii) может быть лишено защитной группы стандартными методами с образованием амина (II)(ii), который затем может быть подвергнут взаимодействию с бромцианом с получением соответствующего соединения формулы (I)(ii).

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено соединение, которое выбрано из соединений формул (II)(ii) and (III)(ii):

Когда соединение формулы (I)(ii) имеет формулу (IA)(ii), тогда формулы (II)(ii), (III)(ii) и (IV) представляют собой формулы (IIA)(ii), (IIIA)(ii) и (IVA) соответственно. Когда соединение формулы (I)(ii) имеет формулу (IB)(ii), тогда формулы (II)(ii), (III)(ii) и (IV) представляют собой формулы (IIB)(ii), (IIIB)(ii) и (IVB)(ii) соответственно.

Защитные группы предпочтительно выбраны из трет-бутилоксикарбонила (ВОС), бензилоксикарбонила (Cbz), пара-метоксибензилкарбонила (MeOZ), 9-флуоренилметилоксикарбонила (Fmoc), ацетила (Ас), бензоила (Bz), бензила (Bn), карбамата, пара-метоксибензиала (РМВ), 3,4-диметоксибензила (DMPM), пара-метоксифенила (РМР), тозила (Ts), трихлорэтоксикарбонила (Troc), 4-нитробензолсульфонила (Nosyl) и 2-нитрофенилсульфенила (Nps). Наиболее предпочтительными являются ВОС аи Cbz.

Сокращения

Методы ЖХМС/ВЭЖХ/СФХ Метод С

Метод C1

Метод С2

Метод Н

Метод H1

Метод J

Метод F

Метод Р3

Метод Y3 Метод, использованный для аналитической хиральной СФХ

Метод Y4 Метод, использованный для аналитической хиральной СФХ

Метод Y5 Метод, использованный для аналитической хиральной СФХ

Метод Y6 Метод, использованный для аналитической хиральной СФХ

Метод Y7 Метод, использованный для аналитической хиральной СФХ

Метод Y8 Метод, использованный для аналитической хиральной СФХ

Метод Y12 Метод, использованный для аналитической хиральной СФХ

Метод Y15 Метод, использованный для аналитической хиральной ВЭЖХ

Метод Y16 Метод, использованный для аналитической хиральной СФХ

Промежуточное соединение А

Этил-5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилат

(i) NaH, THF, 0°C, 2 ч; (ii) фенилтриметиламмония трибромид, THF, от 0°C до к.т., 16 ч; (iii) NaN(CHO)₂, MeCN, 70°C, 1 ч, затем конц. HCl, 70°С, 16 ч; (iv) K₂CO₃, DCM, от 0°С до к.т., 2 ч; (v) POCl₃, 100°С, 7 ч.

Стадия (i)

3-Ацетил-4-циклопропоксибензонитрил

Эту реакцию осуществляли в трех повторах. В перемешиваемый раствор циклопропанола (CAS 16545-68-9, от Synthonix, 0,71 г, 12,27 ммоль) в THF (6 мл) добавляли NaH (60% в масле, 0,49 г, 12,27 ммоль) порциями при 0°С и перемешивали в течение 30 мин. Раствор 3-ацетил-4-фторбензонитрила (CAS 267875-54-7, от Combi-blocks, 1,0 г, 6,13 ммоль) в THF (4 мл) добавляли по каплям при 0°С, и эту смесь перемешивали при 0°С в течение 2 ч. Реакционную смесь объединяли с еще двумя идентичными партиями и затем вливали в ледяную воду (500 мл) и экстрагировали EtOAc (2×500 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 12% EtOAc в н-гексанах) с получением 3-ацетил-4-циклопропоксибензонитрила (3,18 г, 15,82 ммоль, 85%-ный выход).

ЖХМС: m/z нет поддержки; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д. (миллионные доли): 8.05 (dd, J=8.8, 2.4 Гц, 1H), 7.96 (d, J=2.0 Гц, 1H), 7.64 (d, J=8.8 Гц, 1H), 4.13-4.17 (m, 1Н), 2.50 (s, 3Н), 0.81-0.93 (m, 4Н).

Стадия (ii)

3-(2-Бромацетил)-4-циклопропоксибензонитрил

В перемешиваемый раствор 3-ацетил-4-циклопропоксибензонитрила (3,18 г, 15,82 ммоль) в THF (40 мл) добавляли фенилтриметиламмония трибромид (5,94 г, 15,82 ммоль) при 0°С. Эту смесь медленно нагревали до к.т.и перемешивали в течение 16 ч, затем вливали в воду (200 мл) и экстрагировали EtOAc (2×200 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением 3-(2-бромацетил)-4-циклопропоксибензонитрила (4,3 г, 15,41 ммоль, 97%-ный выход). Это неочищенное вещество напрямую использовали на следующей стадии.

ЖХМС: Метод F, 6.61 мин; МС: ЭР+: 297,0, 299,0 (М+18).

Стадия (iii)

4-Циклопропокси-3-глицилбензонитрила гидрохлорид

В перемешиваемый раствор 3-(2-бромацетил)-4-циклопропоксибензонитрила (4,30 г, 15,41 ммоль) в ацетонитриле (43 мл) добавляли диформиламид натрия (1,75 г, 18,49 ммоль) и нагревали при 70°С в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждали до к.т.и концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли МеОН (43 мл) и конц. HCl (4,3 мл). Эту смесь дополнительно нагревали при 70°С в течение 16 ч, затем оставляли охлаждаться до к.т. Эту смесь концентрировали при пониженном давлении, и остаток перемешивали с изопропиловым спиртом (25 мл) до образования осадка. Твердое вещество собирали фильтрованием при пониженном давлении с получением 4-циклопропокси-3-глицилбензонитрила гидрохлорида (5,0 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,30 мин; МС: ЭР+: 217,4.

Стадия (iv)

Этил-2-((2-(5-циано-2-циклопропоксифеиил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетат

В перемешиваемый раствор 4-циклопропокси-3-глицилбензонитрила HCl-соли (5,0 г, 19.80 ммоль) в DCM (50 мл) добавляли K₂CO₃ (10,92 г, 79,2 ммоль) при 0°С. Этилоксалилхлорид (5,4 г, 4,43 мл, 39,60 ммоль) добавляли по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т., перемешивали в течение 2 ч, затем вливали в воду (500 мл) и экстрагировали DCM (2×300 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением этил-2-((2-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетата (5,0 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,52 мин; МС: ЭР+ 316,9.

Стадия (v)

Перемешиваемый раствор этил-2-((2-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетата (5,0 г, 15,81 ммоль) в POCl₃ (50 мл, 10 об.) нагревали при 100°С в течение 7 ч. Эту смесь охлаждали до к.т., вливали в ледяную воду (500 мл) и экстрагировали EtOAc (2×200 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток суспендировали в МеОН (40 мл) и перемешивали при -78°С в течение 15 мин. Твердое вещество собирали фильтрованием при пониженном давлении с получением этил-5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (1,0 г, 3,35 ммоль, 21%-ный выход затри стадии). ЖХМС: Метод С, 1,77 мин; МС: ЭР+: 299,5.

Промежуточное соединение В

Этил-5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилат

(i) Zn(CN)₂, Zn пыль, комплекс PdCl₂(dppf).DCM, DMA, 120°С, 16 ч; (ii) пиридиния трибромид, THF, от 0°С до к.т., 16 ч; (iii) NaN(CHO)₂, MeCN, 80°С, 5 ч, затем конц. HCl, 80°С, 16 ч; (iv) K₂CO₃, DCM, от 0°С до к.т., 4 ч; (v) POCl₃, 100°С, 16 ч.

Стадия (i)

3-Ацетил-4-метоксибензонитрил

В перемешиваемый раствор 1-(5-бром-2-метоксифенил)этан-1-она (CAS 16740-73-1, от Combi-blocks, 60,0 г, 261,89 ммоль) в DMA (600 мл) добавляли цианид цинка (92,25 г, 785,67 ммоль) и цинковую пыль (17,22 г, 261,89 ммоль) при к.т. Эту смесь дегазировали газом N₂ в течение 30 мин, затем добавляли [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(II), комплекс с DCM (10,69 г, 13,09 ммоль). Эту смесь нагревали при 120°С в течение 16 ч. Смесь оставляли охлаждаться до к.т., фильтровали через Celite Hyflow™, фильтрат вливали в ледяную воду (800 мл) и экстрагировали EtOAc (2×1000 мл). Объединенные органические фазы промывали ледяной водой (4×1000 мл), сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (60-120# силикагель, 15% EtOAc в н-гексанах) с получением 3-ацетил-4-метоксибензонитрила (40,0 г, 228,57 ммоль, 87%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,52 мин; МС: ЭР+: 176,08.

Стадия (ii)

3-(2-Бромацетил)-4-метоксибензонитрил

В перемешиваемый раствор 3-ацетил-4-метоксибензонитрила (7,20 г, 41,14 ммоль) в THF (72 мл) добавляли пиридиния трибромид (14,47 г, 45,25 ммоль) при 0°С. Эту смесь медленно нагревали до к.т. и перемешивали в течение 16 ч, затем вливали в воду (400 мл) и экстрагировали EtOAc (2×400 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением 3-(2-бромацетил)-4-метоксибензонитрила (13,0 г, количественный выход). Это неочищенное вещество напрямую использовали на следующей стадии.

Стадия (iii)

3-Глицил-4-метоксибензонитрила гидрохлорид

В перемешиваемый раствор 3-(2-бромацетил)-4-метоксибензонитрила (10,5 г, 41,51 ммоль) в ацетонитриле (105 мл) добавляли диформиламид натрия (5,91 г, 62,26 ммоль), и эту смесь нагревали при 80°С в течение 8 ч. Реакционную смесь охлаждали до к.т., концентрировали при пониженном давлении, и остаток разбавляли МеОН (105 мл) и конц. HCl (10.5 мл). Смесь дополнительно нагревали при 80°С в течение 16 ч, затем оставляли охлаждаться до к.т. Смесь концентрировали при пониженном давлении, и остаток перемешивали с изопропиловым спиртом (40 мл) до образования осадка, который собирали фильтрованием при пониженном давлении с получением 3-глицил-4-метоксибензонитрила гидрохлорида (9,0 г, 39,73 ммоль, 95%-ный выход).

ЖХМС: Метод С2, 0,40 мин; МС: ЭР+: 191,0.

Стадия (iv)

Этил-2-((2-(5-циано-2-метоксифенил)-2-оксоэтил)амиио)-2-оксоацетат

В перемешиваемый раствор 3-глицил-4-метоксибензонитрила гидрохлорида HCl-соли (9,0 г, 39,73 ммоль) в DCM (90 мл) добавляли K₂CO₃ (21,93 г, 158,92 ммоль) при 0°С. Этилоксалилхлорид (10,84 г, 8,89 мл, 79,46 ммоль) добавляли по каплям при 0°С.Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 4 ч. Смесь вливали в воду (900 мл) и экстрагировали DCM (2×500 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением этил-2-((2-(5-циано-2-метоксифенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетата (9,0 г, 31,03 ммоль, 78%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,34 мин; МС: ЭР+ 291,1.

Стадия (v)

Перемешиваемый раствор этил-2-((2-(5-циано-2-метоксифенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетата (1,2 г, 4,14 ммоль) в POCl₃ (12 мл, 10 об.) нагревали при 100°С в течение 2 ч. Смесь охлаждали до к.т., вливали в ледяную воду (200 мл) и экстрагировали EtOAc (3×100 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (3×100 мл), сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 32% EtOAc в н-гексанах) с получением этил-5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,60 г, 2,20 ммоль, 53%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,53 мин; МС: ЭР+: 272,6.

Промежуточное соединение С

Этил-5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксилат

(i) HATU, DIPEA, THF, от 0°С до к.т., 3 ч; (ii) метилмагнийбромид, THF, от -10°С до 0°С, 4 ч; (iii) фенилтриметиламмония трибромид, MeCN, от 0°С до к.т., 9 ч; (iv) NaN(CHO)₂, MeCN, 80°С, 1 ч, затем конц. HCl, 80°С, 3 ч; (v) K₂CO₃, DCM, от 0°С до к.т., 3 ч; (vi) POCl₃, 110°С, 16 ч.

Стадия (i)

5-Бром-N-метокси-N-метил-2-(трифторметокси)бензамид

В перемешиваемый раствор 5-бром-2-(трифторметокси)бензойной кислоты (CAS 403646-47-9, от Combi-blocks, 10,0 г, 35,08 ммоль) в THF (100 мл) добавляли DIPEA (13,57 г, 17,9 мл, 105,25 ммоль) и HATU (20,0 г, 52,62 ммоль) порциями при 0°С. Через 30 минут N,O-диметилгидроксиламин HCl (4,45 г, 45,61 ммоль) добавляли при 0°С. Эту смесь медленно нагревали до к.т. и перемешивали в течение 3 ч, затем вливали в ледяную воду (300 мл) и экстрагировали EtOAc (3×150 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением 5-бром-N-метокси-N-метил-2-(трифторметокси)бензамида (12,2 г, количественный выход). Это неочищенное вещество напрямую использовали на следующей стадии.

ЖХМС: Метод С, 1,69 мин; МС: ЭР+: 327,8, 329,8.

Стадия (ii)

1 -(5-Бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-он

В перемешиваемый раствор 5-бром-N-метокси-N-метил-2-(трифторметокси)-бензамида (12,2 г, 37,31 ммоль) в THF (130 мл) добавляли метилмагнийбромид (3М в диэтиловом эфире, 24,9 мл, 74,62 ммоль) по каплям при -10°С. Эту смесь медленно нагревали до 0°С и перемешивали в течение 4 ч, затем вливали в насыщенный раствор NH₄Cl (300 мл) и экстрагировали EtOAc (3×200 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением 1-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-она (10,0 г, количественный выход). Это неочищенное вещество напрямую использовали на следующей стадии.

ЖХМС: Метод С, m/z нет поддержки; ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ м.д.: 7.92 (s, 1H), 7.67-7.71 (m, 1H), 7.24 (d, J=8.0 Гц, 1H), 2.62 (s, 3Н).

Стадия (iii)

2-Бром-1-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-он

В перемешиваемый раствор 1-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-она (10,0 г, 35,46 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) добавляли фенилтриметиламмония трибромид (13,33 г, 35,46 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь медленно нагревали до к.т. и перемешивали в течение 9 ч, затем вливали в воду (200 мл) и экстрагировали EtOAc (3×100 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель, 5% EtOAc в н-гексанах) с получением 2-бром-1-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-она (11,5 г, 31,95 ммоль, 91%-ный выход затри стадии).

ЖХМС: m/z нет поддержки; ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ м.д.: 7.93 (s, 1Н), 7.73 (dd, J=8.8, 2.4 Гц, 1H), 7.25 (d, J=8.0 Гц, 1H), 4.45 (s, 2Н).

Стадия (iv)

2-Амино-1-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-она гидрохлорид

В перемешиваемый раствор 2-бром-1-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-она (10,0 г, 27,78 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) добавляли диформиламид натрия (5,28 г, 55,58 ммоль), и эту смесь нагревали при 80°С в течение 1 ч. Смесь охлаждали до к.т., концентрировали при пониженном давлении, и остаток разбавляли МеОН (100 мл) и конц. HCl (10,0 мл). Смесь нагревали при 80°С в течение 3 ч, затем оставляли охлаждаться до к.т. Смесь концентрировали при пониженном давлении, остаток перемешивали с диэтиловым эфиром (4×30 мл) до образования осадка, который собирали фильтрованием при пониженном давлении с получением 2-амино-1-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-она гидрохлорида (9,41 г, количественный выход). ЖХМС: Метод С, 1,65 мин; МС: ЭР+: 299,9, 301,9.

Стадия (v)

Этил-2-((2-(5-бром-2-(трифторметокси)фент)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетат

В перемешиваемый раствор 2-амино-1-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)этан-1-она HCl-соли (9,4 г, 28,19 ммоль) в DCM (94 мл) добавляли K₂CO₃ (11,67 г, 84,56 ммоль) при 0°С. Этилоксалилхлорид (5,77 г, 4,73 мл, 42,28 ммоль) добавляли по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т., перемешивали в течение 3 ч, затем вливали в воду (150 мл) и экстрагировали DCM (3×120 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением этил-2-((2-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетата (3,4 г, 8,56 ммоль, 31%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: Метод С, 2,09 мин; МС: ЭР- 396,0, 398,0.

Стадия (vi)

Перемешиваемый раствор этил-2-((2-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетата (3,4 г, 8,56 ммоль) в POCl₃ (17 мл, 5 об.) нагревали при 110°С в течение 16 ч. Смесь охлаждали до к.т., вливали в ледяную воду (250 мл) и экстрагировали EtOAc (3×100 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (3×100 мл), сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 18% EtOAc в н-гексанах) с получением этил-5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксилата (1,3 г, 3,43 ммоль, 40%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 2,39 мин; МС: ЭР+: 379,8, 381,8.

Промежуточное соединение D

Этил-5-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилат

(i) трифторметансульфоновая кислота, NBS, MeCN, от -30°C до к.т., 18 ч; (ii) K₂CO₃, MeI, DMF, от 0°C до к.т., 3 ч; (iii) трибутил(1-этоксивинил)олово, PdCl₂(PPh₃)₂, 1,4-диоксан, 100°С, 3 ч, затем NBS, ТНТ:вода, 0°С, 10 мин; (iv) NaN(CHO)₂, MeCN, 80°С, 2 ч, затем конц. HCl, 80°С, 16 ч; (v) этилхлороксоацетат, K₂CO₃, DCM, от 0°С до к.т., 2 ч; (vi) POCl₃, 100°С, 5 ч.

Стадия (i)

5-Бром-2-фтор-4-гидроксибензонитрил

В перемешиваемый раствор 2-фтор-4-гидроксибензонитрила (CAS 82380-18-5, от Combi-blocks, 8,0 г, 58,39 ммоль) в ацетонитриле (80 мл) добавляли трифторметансульфоновую кислоту (10,51 г, 6,18 мл, 70,07 ммоль) по каплям при -30°С.Через 10 минут N-бромсукцинимид (10,39 г, 58,39 ммоль) постепенно добавляли при -30°С. Эту смесь медленно нагревали до к.т. и перемешивали в течение 18 ч, затем вливали в насыщенный раствор NaHCO₃ (150 мл) и экстрагировали EtOAc (2×150 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением 5-бром-2-фтор-4-гидроксибензонитрила (5,08 г, 23,63 ммоль, 40%-ный выход). Это неочищенное вещество напрямую использовали на следующей стадии.

ЖХМС: Метод С, 1,58 мин; МС: ЭР-: 214,0, 216,0.

Стадия (ii)

5-Бром-2-фтор-4-метоксибензонитрил

В перемешиваемый раствор 5-бром-2-фтор-4-гидроксибензонитрила (5,08 г, 23,63 ммоль) в DMF (30 мл) добавляли K₂CO₃ (6,52 г, 47,26 ммоль) при 0°С. Через 10 минут метилйодид (5,03 г, 2,21 мл, 35,45 ммоль) добавляли по каплям при 0°С. Эту смесь медленно нагревали до к.т. и перемешивали в течение 3 ч, затем вливали в воду (100 мл) и экстрагировали EtOAc (2×100 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель, 2% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-бром-2-фтор-4-метоксибензонитрила (5,70 г, количественный выход).

ЖХМС: m/z нет поддержки; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 8.30 (d, J=7.2 Гц, 1Н), 7.46 (d, J=12.0 Гц, 1H), 4.01 (s, 3Н).

Стадия (iii)

5-(2-Бромацетил)-2-фтор-4-метоксибензонитрил

Перемешиваемый раствор 5-бром-2-фтор-4-метоксибензонитрила (5,70 г, 24,89 ммоль) и трибутил(1-этоксивинил)олова (CAS 97674-02-7, от Combi-blocks, 13,46 г, 37,34 ммоль) в 1,4-диоксане (70 мл) дегазировали N₂ в течение 15 мин, затем добавляли бис(трифенилфосфино)палладия(II) дихлорид (0,87 г, 1,24 ммоль) при к.т. Эту смесь нагревали при 100°С в течение 3 ч. Эту смесь охлаждали до 0°С и добавляли смесь ТНР:вода (2:1, 120 мл). N-Бромсукцинимид (8,85 г, 49,78 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин, затем вливали в воду (100 мл) и экстрагировали EtOAc (2×100 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (силикагель, 2% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-(2-бромацетил)-2-фтор-4-метоксибензонитрила (6,3 г, 23,25 ммоль, 98%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: m/z нет поддержки; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 8.27 (dd, J=7.6, 2.4 Гц, 1Н), 7.54 (dd, J=12.0, 2.4 Гц, 1H), 4.84 (s, 2Н), 4.05 (s, 3Н).

Стадия (iv)

2-Фтор-5-глицил-4-метоксибензонитрила гидрохлорид

В перемешиваемый раствор 5-(2-бромацетил)-2-фтор-4-метоксибензонитрила (6,30 г, 23,25 ммоль) в ацетонитриле (65 мл) добавляли диформиламид натрия (25,85 г, 27,9 ммоль), и эту смесь нагревали при 80°С в течение 2 ч. Смесь охлаждали до к.т., концентрировали при пониженном давлении, и остаток разбавляли МеОН (65 мл) и конц. HCl (6,5 мл). Смесь нагревали при 80°С в течение 16 ч, затем оставляли охлаждаться до к.т. Смесь концентрировали при пониженном давлении, и остаток перемешивали с изопропиловым спиртом (100 мл) до образования осадка, который собирали фильтрованием при пониженном давлении с получением 2-фтор-5-глицил-4-метоксибензонитрила гидрохлорида (5,3 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод Н, 1,96 мин; МС: ЭР+: 209,1.

Стадия (v)

Этил-2-((2-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетат

В перемешиваемый раствор 2-фтор-5-глицил-4-метоксибензонитрила HCl-соли (5,30 г, 21,67 ммоль) в DCM (60 мл) добавляли K₂CO₃ (11,96 г, 86,68 ммоль) при 0°С. Этилоксалилхлорид (5,89 г, 4,83 мл, 43.34 ммоль) добавляли по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т., перемешивали в течение 2 ч, затем вливали в воду (150 мл) и экстрагировали EtOAc (2×150 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением этил-2-((2-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетата (4,20 г, 13,63 ммоль, 58%-ный выход за две стадии). ЖХМС: Метод С, 1,50 мин; МС: ЭР+ 309,4.

Стадия (vi)

Перемешиваемый раствор этил-2-((2-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)-2-оксоэтил)амино)-2-оксоацетата (4,2 г, 13,63 ммоль) в POCl₃ (42 мл, 10 об.) нагревали при 100°С в течение 5 ч. Эту смесь охлаждали до к.т., вливали в ледяную воду (100 мл) и экстрагировали EtOAc (2×150 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (2×100 мл), сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток суспендировали в МеОН (30 мл) и перемешивали при -78°С в течение 15 мин. Твердое вещество собирали фильтрованием при пониженном давлении с получением этил-5-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (1,60 г, 5,51 ммоль, 40%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,63 мин; МС: ЭР+: 291,2.

Пример 1

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

(i) TBD, THF, от 0°C до к.т.; (ii) TFA, DCM, от 0°C до к.т.; (iii) K₂CO₃, CNBr, THF, от 0°C до к.т.

Стадия (i)

трет-Бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилам

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0.60 г, 2.01 ммоль) и трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (CAS 348165-63-9, 0,60 г, 3,02 ммоль) в THF (10 мл) добавляли TBD (0,42 г, 3,02 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь нагревали до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем вливали в воду (70 мл) и экстрагировали EtOAc (2×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 30% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,32 г, 0,71 ммоль, 35%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,86 мин; МС: ЭР- 451,4.

Стадия (ii)

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,31 г, 0,68 ммоль) в DCM (7 мл) добавляли TFA (0,93 мл, 3 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 45 мин, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,3 г, 0,64 ммоль, 94%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,38 мин; МС: ЭР +353,3.

Стадия (iii)

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,3 г, 0,64 ммоль) в THF (8 мл) добавляли K₂CO₃ (0,27 г, 1,93 ммоль) при к.т., и эту смесь перемешивали в течение 10 мин. Бромциан (0,07 г, 0,64 ммоль) добавляли при 0°С, и смесь перемешивали при к.т. в течение 45 мин, затем вливали в воду (70 мл) и экстрагировали EtOAc (2×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 40% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,1 г, 0,27 ммоль, 42%-ный выход).

ЖХМС: Метод Н, 2.96 мин; МС: ЭР+ 378,0; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.36 (d, J=6.4 Гц, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.98 (d, J=8.4 Гц, 1H), 7.68-7.70 (m, 2Н), 4.51-4.53 (m, 1Н), 4.21-4.23 (m, 1Н), 3.89-3.95 (m, 1Н), 3.77-3.81 (m, 1Н), 3.43-3.46 (m, 1H), 2.16-2.18 (m, 1H), 1.76-1.83 (m, 1H), 1.26 (d, J=6.4 Гц, 3Н), 0.92 (s, 4Н). Хиральная СФХ: Метод Y5, 5,18 мин.

Пример 2

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Стадия (i)

трет-Бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилат

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,50 г, 1,67 ммоль) и трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1207853-53-9, 0,46 г, 2,01 ммоль) в THF (8 мл) добавляли TBD (0,35 г, 2,51 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь нагревали до к.т. и перемешивали в течение 3 ч, затем вливали в воду (100 мл) и экстрагировали EtOAc (2×80 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 55% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,32 г, 0,66 ммоль, 39%-ный выход).

ЖХМС: Метод С1, 1,35 мин; МС: ЭР+ 483,4.

Стадия (ii)

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,32 г, 0,66 ммоль) в DCM (8 мл) добавляли TFA (0,96 мл, 3 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,32 г, 0,64 ммоль, 97%-ный выход).

ЖХМС: Метод С1, 1,06 мин; МС: ЭР+ 383,4.

Стадия (iii)

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,32 г, 0,64 ммоль) в THF (8 мл) добавляли K₂CO₃ (0,27 г, 1,93 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 10 мин. Бромциан (0,07 г, 0,64 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при к.т.в течение 1 ч, затем вливали в воду (80 мл) и экстрагировали EtOAc (2×80 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 70% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5Sr)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,10 г, 0,24 ммоль, 38%-ный выход).

ЖХМС: Метод Н, 2,94 мин; МС: ЭР+ 408,2; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.32 (d, J=6.4 Гц, 1H), 8.26 (d, J=1.6 Гц, 1H), 7.98 (d, J=8.8 Гц, 1Н), 7.69-7.70 (m, 2Н), 4.47-4.59 (m, 1Н), 4.19-4.27 (m, 1Н), 4.00-4.10 (m, 1Н), 3.70-3.74 (m, 1H), 3.39-3.51 (m, 3Н), 3.36 (s, 3Н), 2.11-2.18 (m, 1H), 1.98-2.03 (m, 1H), 0.92 (s, 4Н). Хиральная СФХ: Метод Y3, 3,56 мин.

Стадия (iii) альтернативный синтез

В атмосфере N₂ в перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (600,0 г, 1209,67 ммоль) в THF (6 л) добавляли K₂CO₃ (500,80 г, 3629,01 ммоль) при к.т. в атмосфере N₂ и перемешивали в течение 15-20 мин. Раствор бромциана (153,87 г, 1451,60 ммоль) в THF (1,2 л) добавляли по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч при к.т. Протекание реакции контролировали по результатам ТСХ (подвижная фаза: 50% EtOAc в н-гексанах, продукт R_f 0,05; 10% MeOH/DCM продукт R_f 0,4. Эту смесь гасили водой (3 л) и экстрагировали EtOAc (3×6 л). Объединенные органические фазы промывали рассолом (1,5 л), сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метокси-метил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (505 г). Это неочищенное вещество (505 г) суспендировали в IPA (5 л, 10 об.) и нагревали при 80°C с получением прозрачного раствора. Смесь оставляли медленно охлаждаться до к.т. и затем при 0°С до образования кристаллического твердого вещества, которое собирали фильтрованием при пониженном давлении, промывали холодным IPA (505 мл) и сушили в вакууме при 50°C с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)-пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида в виде белого кристаллического твердого вещества (400,0 г, 982,80 ммоль).

Вещество, полученное в результате перекристаллизации из IPA (400 г), суспендировали в IPA (10 л, 25 об.), добавляли активированный уголь (100 г), и эту смесь нагревали при 80°С в течение 1 ч. Горячую смесь фильтровали через Celite Hyflow™ и промывали горячим IPA (800 мл, 2 об.). Фильтрат оставляли медленно охлаждаться до к.т. и затем при 0°С до образования кристаллического твердого вещества, которое собирали фильтрованием под разрежением, промывали холодным IPA (400 л, 1 об.) и сушили в вакууме при 50°C с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида в виде белого кристаллического твердого вещества (320,0 г, 786,24 ммоль, 63%-ный выход).

ЖХМС: Метод H1, 2,81 мин, МС: ЭР+ 408,2; ВЭЖХ: Метод Р3, 24,22 мин; Хиральная ВЭЖХ: Метод Y, 28,97 мин; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.29 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.22 (d, J=2.0 Гц, 1H), 7.95 (dd, J=8.8, 2.4 Гц, 1H), 7.67 (d, J=8.8 Гц, 1H), 7.65 (s, 1H), 4.48-4.58 (m, 1H), 4.18-4.22 (m, 1H), 4.01-4.07 (m, 1H), 3.70-3.74 (m, 1Н), 3.40-3.51 (m, 3Н), 3.35 (s, 3Н), 2.12-2.18 (m, 1Н), 1.97-2.03 (m, 1Н), 0.88-0.96 (m, 4Н); Хиральная ВЭЖХ: Метод Y15, 15,11 мин; 99,8% ее (энантиомерный избыток); ВЭЖХ: Метод Y26, 27,87 мин; DSC максимальная температура (плавления) = 132.7°С; МС с высоким разрешением: ЭР: ЭР- 406,1521 (вычисленная точная масса 407,1594). Данные ДРЛП (дифракция рентгеновских лучей на порошке) в таблице, приведенной ниже, были получены на Bruker AXS D8 Advance: Cu,kα: Kα1(Å): 1,540598; Kα2(Å): 1,544426; Kα2/Kα1=0,50.

Альтернативная перекристаллизация

Неочищенный 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид (134,4 г, 98,9% чистота по результатам ЖХ) суспендировали в этаноле (1340 мл, 10 об.) и нагревали до 55-65°С до образования коричневого раствора. Эту смесь оставляли охлаждаться до 40-45°С и добавляли затравку (135 мг) из аналогичной меньшей партии, и эту смесь перемешивали при 40-45°С в течение 30 мин. Смесь охлаждали до к.т. и перемешивали в течение ночи. Бежевую суспензию фильтровали, и твердое вещество собирали, промывали этанолом (2×260 мл), остаток на фильтре собирали, затем сушили при 60°С в течение ночи с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метокси-метил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида в виде не совсем белого твердого вещества (116,2 г, 86%-ный выход от неочищенного вещества).

МС: ЭР+ 408,2; ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ м.д.: 8.24 (d, J=2.0 Гц, 1Н), 7.66 (dd, J=8.8, 2.0 Гц, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.47 (d, J=8.4 Гц, 1H), 4.68-4.75 (m, 1H), 3.97-4.00 (m, 2Н), 3.83-3.85 (m, 1H), 3.60-3.66 (m, 1H), 3.45-3.53 (m, 2Н), 3.42 (s, 3Н), 2.24-2.32 (m, 1H), 2.09-2.15 (m, 1Н), 0.89-1.02 (m, 4Н); остаточные растворители по результатам ЯМР = EtOH (2260 м.д.); ВЭЖХ чистота 99,6%; ДСК (дифференциальная сканирующая колориметрия): максимальная температура (плавление) = 86,96°С.

Соединение Примера 2 было приготовлено в виде водной суспензии, содержащей 0,1%(масс./об.) Tween-80 и 0,5% (масс./об.) гидроксипропилметилцеллюлозы.

Пример 3

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(фторметил)пирролидип-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

(i) TBD, THF, от 0°С до к.т.; (ii) TFA, DCM, от 0°С до к.т.; (iii) K₂CO₃, CNBr, THF, от 0°С до к.т.

Стадия (i)

трет-Бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(фторметил)пирролидин-1-карбоксилат

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,15 г, 0,50 ммоль) и трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-(фторметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1207853-03-9, от Angene, 0,11 г, 0,50 ммоль) в THF (4 мл) добавляли TBD (0,07 г, 0,50 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь нагревали до к.т. и перемешивали в течение 8 ч, затем вливали в воду (40 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 51% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(фторметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,09 г, 0,19 ммоль, 37%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,76 мин; МС: ЭР- 469,1.

Стадия (ii)

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(фторметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(фторметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,09 г, 0,19 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли TFA (0,9 мл, 10 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(фторметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,16 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,35 мин; МС: ЭР- 368,9.

Стадия (iii)

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(фторметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,15 г, 0,32 ммоль) в THF (5 мл) добавляли K₂CO₃ (0,13 г, 0,96 ммоль) при к.т., и эту смесь перемешивали в течение 10 мин. Бромциан (0,03 г, 0,32 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (40 мл) и экстрагировали EtOAc (2×40 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 69% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-(3R,5S)-1-циано-5-(фторметил)-пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,01 г, 0,03 ммоль, 16%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: Метод Н, 2,96 мин; МС: ЭР+ 396,1; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.39 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.98 (d, J=7.2 Гц, 1Н), 7.68-7.70 (m, 2Н), 4.41-4.69 (m, 3Н), 4.10-4.26 (m, 2Н), 3.61-3.80 (m, 1Н), 3.43-3.53 (m, 1Н), 2.12-2.25 (m, 1H), 1.95-2.07 (m, 1H), 0.92 (s, 4Н). Хиральная СФХ: Метод Y4, 4?96 мин.

Пример 4

5-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Стадия (i)

трет-Бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилам

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,5 г, 1,84 ммоль) и трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (CAS 348165-63-9, 0,37 г, 1,84 ммоль) в THF (10 мл) добавляли TBD (0,38 г, 2,76 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь нагревали до к.т. и перемешивали в течение 2 ч, затем вливали в воду (100 мл) и экстрагировали EtOAc (2×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 30% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,30 г, 0,70 ммоль, 38%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,61 мин; МС: ЭР- 425,1.

Стадия (ii)

5-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин- 1-карбоксилата (0,30 г, 0,70 ммоль) в DCM (6 мл) добавляли TFA (0,9 мл, 3 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,30 г, 0,68 ммоль, 97%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,22 мин; МС: ЭР+ 327,1.

Стадия (iii)

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,30 г, 0,68 ммоль) в THF (7 мл) добавляли K₂CO₃ (0,28 г, 2,04 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 10 мин. Бромциан (0,07 г, 0,68 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 1% МеОН в DCM) с получением 5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,10 г, 0,28 ммоль, 42%-ный выход).

ЖХМС: Метод Н, 2,73 мин; МС: ЭР+ 352,2; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.35 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.95 (d, J=7.2 Гц, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.41 (d, J=8.4 Гц, 1Н), 4.47-4.57 (m, 1Н), 4.08 (s, 3Н), 3.89-3.94 (m, 1Н), 3.76-3.80 (m, 1H), 3.42-3.49 (m, 1H), 2.16-2.20 (m, 1Н), 1.76-1.83 (m, 1H), 1.26 (d, J=6.4 Гц, 3Н). Хиральная СФХ: Метод Y6, 3,76 мин.

Пример 5

5-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Стадия (i)

трет-Бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилат

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,80 г, 2,94 ммоль) и трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1207853-53-9, 0,67 г, 2,94 ммоль) в THF (20 мл) добавляли TBD (0,61 г, 4,41 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь перемешивали при 0°С в течение 6 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 50% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,25 г, 0,55 ммоль, 18%-ный выход).

ЖХМС: Метод С1, 1,29 мин; МС: ЭР+ 457,2.

Стадия (ii)

5-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,25 г, 0,55 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли TFA (2,5 мл, 10 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 2 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,32 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С1, 1,00 мин; МС: ЭР+ 357,3.

Стадия (1H)

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,31 г, 0,66 ммоль) в THF (15 мл) добавляли K₂CO₃ (0,27 г, 1,98 ммоль) при к.т. и после перемешивания в течение 10 минут в эту смесь при 0°С добавляли бромциан (0,07 г, 0,66 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 0,5 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 60% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,11 г, 0,29 ммоль, 52%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: Метод Н, 2,66 мин; МС: ЭР+ 382,2; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.34 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.96 (d, J=8.0 Гц, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.43 (d, J=8.8 Гц, 1Н), 4.47-4.58 (m, 1Н), 4.09 (s, 3Н), 4.00-4.10 (m, 1Н), 3.70-3.74 (m, 1H), 3.41-3.53 (m, 3Н), 3.36 (s, 3Н), 2.08-2.20 (m, 1H), 1.95-2.06 (m, 1Н). Хиральная СФХ: Метод Y7, 5,42 мин.

Пример 6

4-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

(i) AgOTf, EtOAc, 80°C; (ii) LiOH.H₂O, H₂O, THF, от 0°C до к.т.; (iii) POCl₂, пиридин, от 0°C до к.т.; (iv) TFA, DCM, от 0°C до к.т.; (v) K₂CO₃, CNBr, THF, от 0°C до к.т.

Стадия (i)

Этил-4-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилат

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (3,5 г, 13,83 ммоль) и этилоксамата (CAS 617-36-7, от Sigma-Aldrich, 4,86 г, 41,51 ммоль) в EtOAc (35 мл) добавляли трифлат серебра (CAS 2923-28-6, от Combi-blocks, 10,66 г, 41,51 ммоль) при к.т. Эту смесь нагревали при 80°С в течение 24 ч, затем вливали в воду (120 мл), фильтровали через Celite Hyflow™, и фильтрат экстрагировали EtOAc (3×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 16% EtOAc в н-гексанах) с получением этил-4-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,53 г, 1,95 ммоль, 14%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,65 мин; МС: ЭР+ 273,1.

Стадия (ii)

4-(5-Циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоновая кислота

В перемешиваемый раствор этил-4-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,50 г, 1,84 ммоль) в смеси ТНР:вода (1:1, 10 мл) добавляли гидрокида лития моногидрат (0,23 г, 5,51 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь перемешивали при 0°С в течение 2 ч, затем вливали в воду (70 мл), подкисляли 1 н. HCl и экстрагировали DCM (3×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением 4-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоновой кислоты (0,15 г, 0,61 ммоль, 33%-ный выход). ЖХМС: Метод С2, 0,81 мин; МС: ЭР+ 245,1.

Стадия (iii)

трет-Бутил-(2S,4R)-4-(4-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилам

В перемешиваемый раствор 4-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоновой кислоты (0,16 г, 0,65 ммоль) и трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1207853-53-9, 0,15 г, 0,65 ммоль) в пиридине (3 мл) добавляли POCl₃ (0,3 г, 0,18 мл, 1,97 ммоль) по каплям при 0°С. Эту смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×30 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 22% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2S,4R)-4-(4-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,18 г, 0,39 ммоль, 60%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,70 мин; МС: ЭР- 455,1.

Стадия (iv)

4-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2S,4R)-4-(4-(5-циано-2-метоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,17 г, 0,37 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли TFA (0,85 мл, 5 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 4-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,25 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,32 мин; МС: ЭР+ 357,1.

Стадия (v)

В перемешиваемый раствор 4-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,24 г, 0,51 ммоль) в THF (5 мл) добавляли K₂CO₃ (0,21 г, 1,53 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 10 мин. Бромциан (0,04 г, 0,41 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (3×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 71% EtOAc в н-гексанах) с получением 4-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,05 г, 0,14 ммоль, 36%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: Метод Н, 2,80 мин; МС: ЭР- 380,1; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.25 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.44 (d, J=1.6 Гц, 1H), 7.89 (dd, J=8.8, 2.0 Гц, 1H), 7.37 (d, J=8.8 Гц, 1H), 4.47-4.58 (m, 1H), 4.07 (s, 3Н), 4.00-4.18 (m, 1H), 3.69-3.73 (m, 1H), 3.43-3.50 (m, 3Н), 3.34 (s, 3Н), 2.09-2.19 (m, 1H), 1.96-2.02 (m, 1H). Хиральная СФХ: Метод Y3, 3,49 мин.

Пример 7

5-(5-Циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

(i) TBD, THF, от 0°С до к.т.; (ii) Zn(CN)₂, Zn, Pd₂(dba)₃, фосфиновый лиганд, DMA, 140°С; (iii) TFA, DCM, от 0°C до к.т.; (iv) K₂CO₃, CNBr, THF, от 0°C до к.т.

Стадия (i)

трет-Бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилам

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксилата (0,70 г, 1,84 ммоль) и трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1207853-53-9, 0,42 г, 1,84 ммоль) в THF (8 мл) добавляли TBD (0,38 г, 2,77 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь перемешивали при 0°С в течение 2 ч, затем вливали в воду (100 мл) и экстрагировали EtOAc (3×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 25% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,37 г, 0,66 ммоль, 35%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 2,00 мин; МС: ЭР+ 564,4, 566,4.

Стадия (ii)

трет-Бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-(трифторметокси)фепил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилат

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,35 г, 0,62 ммоль) в DMA (3 мл) добавляли цианид цинка (0,18 г, 1,55 ммоль), цинковую пыль (0,02 г, 0,31 ммоль) и 1,1'-ферроцендиил-бис(дифенилфосфин) (0,07 г, 0,12 ммоль) при к.т. Эту смесь дегазировали N₂ в течение 15 мин, затем добавляли трмс(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,11 г, 0,12 ммоль). Смесь нагревали под действием микроволнового излучения при 140°С в течение 1 ч, затем оставляли охлаждаться до к.т., вливали в ледяную воду (70 мл) и экстрагировали EtOAc (3×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 22% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-(трифторметокси)-фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,25 г, 0,5 ммоль, 80%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,83 мин; МС: ЭР+: 511,4.

Стадия (iii)

5-(5-Циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2S,4R)-4-(5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,25 г, 0,49 ммоль) в DCM (3 мл) добавляли TFA (1,25 мл, 5 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 2 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,39 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,38 мин; МС: ЭР+ 411,1.

Стадия (iv)

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,39 г, 0,74 ммоль) в THF (5 мл) добавляли K₂CO₃ (0,31 г, 2,23 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 10 мин. Бромциан (0,06 г, 0,59 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (70 мл) и экстрагировали EtOAc (3×70 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 40% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,14 г, 0,33 ммоль, 66%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: Метод Н, 3,03 мин; МС: ЭР- 434,1; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.40 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.51 (d, J=1.6 Гц, 1H), 8.12 (dd, J=8.8, 2.0 Гц, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.82 (d, J=8.4 Гц, 1H), 4.51-4.55 (m, 1H), 3.99-4.08 (m, 1H), 3.69-3.74 (m, 1H), 3.42-3.51 (m, 3Н), 3.34 (s, 3Н), 2.11-2.17 (m, 1H), 1.97-2.03 (m, 1Н). Хиральная СФХ: Метод Y4, 3,57 мин.

Пример 8

5-(5-Циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

(i) TBD, THF, от 0°C до к.т.; (ii) Zn(CN)₂, Zn, Pd₂(dba)₃, фосфиновый лиганд, DMA, 140°C; (iii) TFA, DCM, от 0°C до к.т.; (iv) K₂CO₃, CNBr, THF, от 0°C до к.т.

Стадия (i)

трет-Бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-бром-2-(трифторметокси)фепил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилам

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксилат (0,40 г, 1,05 ммоль) и трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (CAS 348165-63-9, 0,23 г, 1,16 ммоль) в THF (8 мл) добавляли TBD (0,22 г, 1,57 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 3 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (3×60 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 32% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,14 г, 0,26 ммоль, 24%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 2,01 мин; МС: ЭР+ 534,2, 536,2.

Стадия (ii)

трет-Бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидип-1-карбоксилат

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-бром-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,13 г, 0,24 ммоль) в DMA (1,3 мл) добавляли цианид цинка (0,07 г, 0,61 ммоль), цинковую пыль (0,01 г, 0,12 ммоль) и 1,1'-ферроцендиил-бис(дифенилфосфин) (0,03 г, 0,05 ммоль) при к.т. Эту смесь дегазировали N₂ в течение 10 мин, затем добавляли трмс(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,04 г, 0,05 ммоль). Смесь нагревали под воздействием микроволнового излучения при 140°С в течение 1 ч, затем оставляли охлаждаться до к.т., вливали в воду (20 мл) и экстрагировали EtOAc (3×30 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 38% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,05 г, 0,10 ммоль, 42%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,88 мин; МС: ЭР+ 425,6 (М-56).

Стадия (iii)

5-(5-Циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор тртет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,05 г, 0,1 ммоль) в DCM (2 мл) добавляли TFA (0,15 мл, 3 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,08 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,38 мин; МС: ЭР+ 381,2.

Стадия (iv)

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,08 г, 0,16 ммоль) в THF (4 мл) добавляли K₂CO₃ (0,07 г, 0,48 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 10 мин. Бромциан (0,02 г, 0,16 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (20 мл) и экстрагировали EtOAc (3×25 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 47% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,02 г, 0,05 ммоль, 47%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: Метод Н, 3,02 мин; МС: ЭР- 404,0; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.43 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.11 (d, J=8.4 Гц, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.82 (d, J=8.4 Гц, 1H), 4.48-4.57 (m, 1H), 3.89-3.94 (m, 1H), 3.76-3.80 (m, 1H), 3.42-3.46 (m, 1H), 2.15-2.18 (m, 1H), 1.76-1.83 (m, 1Н), 1.25 (d, J=6.4 Гц, 3Н). Хиральная СФХ: Метод Y8, 5,02 мин.

Пример 9

5-(5-Циано-4-фтор-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидии-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Стадия (i)

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,50 г, 1,72 ммоль) и трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (CAS 348165-63-9, 0,27 г, 1,38 ммоль) в THF (10 мл) добавляли TBD (0,29 г, 2,07 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь нагревали до к.т. и перемешивали в течение 2 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 40% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,3 г, 0,67 ммоль, 38%-ный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,78 мин; МС: ЭР+ 389,3 (М-56).

Стадия (ii)

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (0,3 г, 0,67 ммоль) в DCM (7 мл) добавляли TFA (0,9 мл, 3 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,29 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С, 1,39 мин; МС: ЭР+ 345,3.

Стадия (iii)

5-(5-Циано-4-фтор-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидип-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,29 г, 0,63 ммоль) в THF (7 мл) добавляли K₂CO₃ (0,26 г, 1,89 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 10 мин. Бромциан (0,07 г, 0,63 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (70 мл) до образования осадка, и твердое вещество собирали фильтрованием при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,13 г, 0,35 ммоль, 52%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: Метод Н, 2,75 мин; МС: ЭР+ 370,1; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.31 (d, J=6.4 Гц, 1Н), 8.28-8.31 (m, 1H), 7.79-7.82 (m, 1Н), 7.49-7.52 (m, 1H), 4.47-4.59 (m, 1H), 4.08 (s, 3Н), 3.85-3.99 (m, 1H), 3.76-3.80 (m, 1H), 3.42-3.45 (m, 1H), 2.12-2.23 (m, 1H), 1.73-1.87 (m, 1H), 1.24-1.29 (m, 3Н). Хиральная СФХ: Метод Y5, 4,98 мин.

Пример 10

4-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Стадия (i)

Этил-4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилат

В перемешиваемый раствор 3-(2-бромацетил)-4-циклопропоксибензонитрила (0,70 г, 2,50 ммоль) и этилоксимата (CAS 617-36-7, от Sigma-Aldrich, 0,66 г, 3,75 ммоль) в EtOAc (10 мл) добавляли трифлат серебра (CAS 2923-28-6, от Combi-blocks, 0,96 г, 3,75 ммоль) при к.т. Эту смесь нагревали при 80°С в течение 16 ч, объединяли с еще одной идентичной партией и затем вливали в воду (100 мл), фильтровали через Celite Hyflow™, и фильтрат экстрагировали EtOAc (2×100 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 10% EtOAc в н-гексанах) с получением этил-4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,35 г, 1,17 ммоль, 23%-ный выход).

ЖХМС: Метод H1, 3,40 мин; МС: ЭР+ 299,0.

Стадия (ii)

трет-Бутил-(2S,4R)-4-(4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилам

В перемешиваемый раствор этил-4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,32 г, 1,07 ммоль) и трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1207853-53-9, 0,25 г, 1,07 ммоль) в DMF (7 мл) добавляли TBD (0,18 г, 1,28 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 2 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 30% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2S,4R)-4-(4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,10 г, 0,22 ммоль, 20%-ный выход).

ЖХМС: Метод H1, 3,51 мин; МС: ЭР- 481,3.

Стадия (iii)

4-(5-Циано-2-циклопропоксифеиил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соль

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2S,4R)-4-(4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,1 г, 0,22 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли TFA (1 мл, 10 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,14 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод J, 3,61 мин; МС: ЭР+ 383,0.

Стадия (iv)

В перемешиваемый раствор 4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,14 г, 0,28 ммоль) в THF (5 мл) добавляли K₂CO₃ (0,12 г, 0,84 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 5 мин. Бромциан (0,03 г, 0,28 ммоль) добавляли при 0°С. Смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (30 мл) и экстрагировали EtOAc (2×30 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 45% EtOAc в н-гексанах) с получением 4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,04 г, 0,09 ммоль, 47%-ный выход за две стадии).

ЖХМС: Метод H1, 2,97 мин; МС: ЭР- 406,2; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.24 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.43 (d, J=2.0 Гц, 1H), 7.92 (dd, J=8.8, 2.0 Гц, 1H), 7.64 (d, J=8.4 Гц, 1H), 4.48-4.56 (m, 1H), 4.15-4.23 (m, 1H), 4.0-4.08 (m, 1H), 3.68-3.72 (m, 1H), 3.42-3.50 (m, 3Н), 3.32 (s, 3H), 2.10-2.15 (m, 1H), 1.96-2.01 (m, 1H), 0.86-0.97 (m, 4H).

Хиральная ВЭЖХ: Метод Y15, 10,0 мин.

Пример 11

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Стадия (i)

трет-Бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилам

В перемешиваемый раствор этил-5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,25 г, 0,83 ммоль) и трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1123305-98-5, 0,19 г, 0,83 ммоль) в толуоле (5 мл) добавляли TBD (0,12 г, 0,83 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 35% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,08 г, 0,16 ммоль, 19%-ный выход).

ЖХМС: Метод С1, 1,41 мин; МС: ЭР+ 483.4.

Стадия (ii)

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соль

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2R,4R)-4-(5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилат (0,07 г, 0,15 ммоль) в DCM (1 мл) добавляли TFA (0,22 мл, 3 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,10 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С1, 1,06 мин; МС: ЭР+ 383,2.

Стадия (iii)

В перемешиваемый раствор 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,10 г, 0,20 ммоль) в THF (5 мл) добавляли K₂CO₃ (0,08 г, 0,60 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 5 мин. Бромциан (0,02 г, 0,20 ммоль) добавляли при 0°С. Эту смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 45% EtOAc в н-гексанах) с получением 5-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,02 г, 0,04 ммоль, 29%-ный выход, за две стадии).

ЖХМС: Метод H1, 2,94 мин; МС: ЭР+ 408,2; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.18 (d, J=6.8 Гц, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.96 (d, J=8.4 Гц, 1H), 7.67-7.69 (m, 2Н), 4.50-4.61 (m, 1Н), 4.15-4.25 (m, 1Н), 3.88-3.97 (m, 1Н), 3.63-3.72 (m, 1Н), 3.46-3.60 (m, 2Н), 3.37-3.41 (m, 4Н), 2.27-2.38 (m, 1H), 1.80-1.90 (m, 1H), 0.83-0.98 (m, 4Н). Хиральная СФХ: Метод Y12, 3,53 мин.

Пример 12

4-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Стадия (i)

трет-Бутил-(2R,4R)-4-(4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилам

В перемешиваемый раствор этил-4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксилата (0,40 г, 1,34 ммоль) [Пример 10; Стадия (i)] и трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1123305-98-5, 0,31 г, 1,34 ммоль) в толуоле (5 мл) добавляли TBD (0,19 г, 1,34 ммоль) порциями при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 4 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 40% EtOAc в н-гексанах) с получением трет-бутил-(2R,4R)-4-(4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,22 г, 0,46 ммоль, 34%-ный выход). ЖХМС: Метод С1, 1,42 мин, МС: ЭР+ 483,3.

Стадия (ii)

4-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соль

В перемешиваемый раствор трет-бутил-(2R,4R)-4-(4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)оксазол-2-карбоксамидо)-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (0,22 г, 0,46 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли TFA (0,66 мл, 3 об.) по каплям при 0°С. Эту смесь оставляли нагреваться до к.т. и перемешивали в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,28 г, количественный выход).

ЖХМС: Метод С1, 1,09 мин. МС: ЭР+ 383,2.

Стадия (iii)

В перемешиваемый раствор 4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида TFA-соли (0,28 г, 0,56 ммоль) в THF (5 мл) добавляли K₂CO₃ (0,23 г, 1,69 ммоль) при к.т. и перемешивали в течение 5 мин. Бромциан (0,06 г, 0,56 ммоль) добавляли при 0°С. Эту смесь перемешивали при к.т. в течение 1 ч, затем вливали в воду (50 мл) и экстрагировали EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, 65% EtOAc в н-гексанах) с получением 4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида (0,06 г, 0,14 ммоль, 31%-ный выход, за две стадии).

ЖХМС: Метод HI, 3,01 мин; МС: ЭР+ 408,2; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ м.д.: 9.10 (d, J=7.6 Гц, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.91 (d, J=8.4, 2.0 Гц, 1H), 7.64 (d, J=8.8 Гц, 1H), 4.51-4.56 (m, 1H), 4.16-4.23 (m, 1H), 3.88-3.97 (m, 1H), 3.63-3.67 (m, 1H), 3.46-3.56 (m, 2Н), 3.38-3.41 (m, 4Н), 2.29-2.36 (m, 1H), 1.83-1.90 (m, 1H), 0.92 (br s, 4Н). Хиральная СФХ: Метод Y16, 5,11 мин.

Пример 13

5-(5-Циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Указанное в заголовке соединение может быть получено способом, аналогичным способу Примера 1, с использованием трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (CAS 708274-46-8) на Стадии (i).

Пример 14

5-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Указанное в заголовке соединение может быть получено способом, аналогичным способу Примера 4, с использованием трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (CAS 708274-46-8) на Стадии (i).

Пример 15

5-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидип-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Указанное в заголовке соединение может быть получено способом, аналогичным способу Примера 5, с использованием трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1123305-98-5) на Стадии (i).

Пример 16

4-(5-Циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Указанное в заголовке соединение может быть получено способом, аналогичным способу Примера 6, с использованием трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1123305-98-5) на Стадии (iii).

Пример 17

5-(5-Циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Указанное в заголовке соединение может быть получено способом, аналогичным способу Примера 7, с использованием трет-бутил-(2R,4R)-4-амино-2-(метоксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (CAS 1123305-98-5) на Стадии (i).

Пример 18

5-(5-Циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Указанное в заголовке соединение может быть получено способом, аналогичным способу Примера 8, с использованием трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (CAS 708274-46-8) на Стадии (i).

Пример 19

5-(5-Циано-4-фтор-2-метоксифенил)-Н-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамид

Указанное в заголовке соединение может быть получено способом, аналогичным способу Примера 9, с использованием трет-бутил-(2S,4R)-4-амино-2-метилпирролидин-1-карбоксилата (CAS 708274-46-8) на Стадии (i).

Биологическая активность соединений по изобретению

Сокращения:

TAMRA карбокситетраметилродамин

PCR полимеразная цепная реакция

PBS забуференный фосфатами физиологический раствор

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

Tris 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол

NP-40 Nonidet P-40, октилфеноксиполиэтоксиэтанол

BSA бычий сывороточный альбумин

PNS периферическая нервная система

ВН3 Bcl-2 гомологичный домен 3

PTEN фосфатаза и гомолог тензина

SDS-PAGE электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия

DMSO диметилсульф оксид

YFP желтый флуоресцентный белок

VME винилметиловый эфир

НА гемагглютинин

Ahx аминогексановая кислота

Биохимический анализ IC₅₀ по отношению к USP30

Подготавливали планшеты с разведениями в 21-кратной конечной концентрации (2100 мкМ для конечной концентрации 100 мкМ) в 50% DMSO в 96-луночном полипропиленовом планшете с V-образным дном лунок (Greiner #651201). Типичная 8-точечная серия разведений представляет собой 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 мкМ конечная. Реакции осуществляли в двух повторах в черных 384-лучночных планшетах (небольшого объема, Greiner 784076) в конечном реакционном объеме 21 мкл. Либо 1 мкл 50% DMSO, либо разведенное соединение добавляли в планшет. USP30 (Boston Biochem #Е582) разводили в реакционном буфере (40 мМ Tris, рН 7,5, 0,005% Tween 20, 0,5 мг/мл BSA, 5 мМ бета-меркаптоэтанола) до достижения конечной анализируемой концентрации 4 нМ, и 10 мкл разведенного USP30 добавляли к соединению. Фермент и соединение инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Реакции инициировали добавлением 50 нМ TAMRA-меченого пептида, связанного с убиквитином через изопептидную связь, в качестве субстрата поляризации флуоресценции. Реакции считывали сразу после добавления субстрата и последующего 2-часового инкубирования при комнатной температуре. Считывание показаний проводили на Pherastar Plus (BMG Labtech). λ возбуждения 540 нм; λ эмиссии 590 нм.

Активность проиллюстрированных соединений в биохимическом анализе IC₅₀ по отношению к USP30:

Примеры сравнения

Активность соединений примеров сравнения в биохимическом анализе IC₅₀ по отношению к USP30:

Нецелевая фармакология

Соединение Примера 2 было подвергнуто фармакологическому профилированию в панели Eurofins CEREP SafetyScreen44. При единственной концентрации 10 мкМ менее чем 50%-е ингибирование связывания или активности фермента наблюдали по отношению ко всем мишеням в панели. Соединение Примера 1 имеет низкую вероятность нецелевых взаимодействий вследствие низкой аффинности к мишеням в этом анализе.

Фармакология безопасности

Соединение Примера 2 оценивали в отношении воздействия на hERG калиевый канал в стабильно экспрессированных клетках СНО в концентрациях от 0,01 до 30 мкМ. Соединение Примера 2 дало значение ингибирования 35% амплитуды TOKahERG при 30 мкМ, что указывает на небольшую склонность к воздействию на интервал QT.

Генетическая токсикология

Соединение Примера 2 оценивали в бактериальном анализе обратных мутаций (Ames) и в микроядерном анализе in vitro. Все тесты in vitro проводили с и без экзогенной метаболической активации с использованием концентраций вплоть до концентраций, ограниченных цитотоксичностью или нерастворимостью. Соединение Примера 2 не индуцировало мутации при тестировании вплоть до 1000 мкг на лунку с и без метаболической активации в анализе обратных мутаций в штаммах Salmonella typhimurium ТА98, ТА 100, ТА1535 и ТА97а и в штамме Escherichia Coli WP2 uvrA pKM101.

Индуцирование повреждения хромосомы оценивали с использованием микроядерного анализа in vitro в клетках TK6. Соединение Примера 2 было отрицательным в отношении индуцирования микроядер при инкубировании в течение 3 часов при наличии экзогенной метаболической активации с последующим 27-часовым восстановлением, а также при инкубировании в течение 27 часов и в отсутствие экзогенной метаболической активации с последующим 27-часовым восстановлением.

Клеточный анализ взаимодействия с эндогенной мишенью USP30

Клетки Hela, стабильно экспрессирующие YFP-паркин, высевали в 6-луночные чашки. Сразу после прикрепления клетки обрабатывали соответствующими тестируемыми соединениям в соответствующих концентрациях или контролем-носителем в течение 1 часа при 37°С, 5% СО₂. Цельноклеточные лизаты получали путем соскабливания клеток в холодный PBS, центрифугирования и лизиса в буфере для лизиса (50 мМ Tris-основание, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1% NP-40/Igepal СА-630, 2 мМ MgCl₂, 10% глицерина, 5 мМ бета-меркаптоэтанола, cOmplete минитаблетки без EDTA (Roche), таблетки PhosStop (Roche)) в течение 10 мин. Эквивалент 20 мкг белка из очищенного клеточного лизата инкубировали с конечной концентрацией 2,5 мкМ зонда HA-Ahx-Ahx-Ub-VME при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 5х SDS буфера для загрузки образца, и белки выделяли методом SDS-PAGE и вестерн-блоттингом. USP30 детектировали с использованием овечьего антитела S746D к USP30 (MRC PPU Reagents and Services) и конъюгированного с пероксидазой хрена кроличьего вторичного антитела к овечьему IgG (H+L) (Thermo #31480) и визуализировали с использованием реагента ECL (GE #RPN2109) на визуализаторе GE LAS4000. Взаимодействие с мишенью измеряли путем количественного определения полос, соответствующих USP30 и USP30, связанному с зондом Ub-VME, и выражения этой пропорции по сравнению с обработанным носителем контролем.

Анализ ТОМ20-убиквитилирования

Линии клеток человека могут быть сенсибилизированы митохондриальными деполяризующими агентами (ионофорами (например СССР, валиномицином), ингибиторами митохондриального комплекса (олигомицином, антимицином А)) для индуцирования убиквитилирования ТОМ20, которое затем дополнительно промотируется в присутствии ингибиторов USP30. Убиквитилирование ТОМ20 затем оценивают методом вестерн-блоттинга клеточных лизатов, причем детектирование аддукта убиквитилирования ТОМ20 возможно благодаря увеличению массы молекулы на 8 кДа на каждую молекулу добавленного убиквитина, что приводит к ступенчатости иммунореактивной полосы ТОМ20. Уровни ТОМ20-убиквитилирования могут быть количественного определены с использованием хемилюминесцентной денситометрии ступенчатых иммунореактивных полос.

Цитотоксичность in vitro (Cell Тох): Измеряли в клетках колоректальной карциномы человека НСТ116 с использованием alamarBlue™ в качестве конечной точки анализа. Цитотоксичность соединений измеряли за период времени 96 часов непрерывного воздействия соединения.

Дополнительные исследования

log Р: коэффициент распределения; измерение липофильности.

log D: коэффициент распределения; измерение липофильности.

TPSA: топологическая полярная площадь поверхности.

Турбидиметрическая растворимость: Раствор тестируемого соединения, приготовленный в DMSO, разведенный в водном буфере. Турбидиметрию используют в качестве конечной точки путем измерения поглощения при 620 нм.

FaSSIF: имитированный кишечный сок в состоянии натощак, измеряемый при рН 6,5.

Hep Cl у мыши: in vitro клиренс гепатоцитов в клетках мыши.

Hep Cl у человека: in vitro клиренс гепатоцитов в клетках человека.

f_u,p в плазме: Свободная фракция соединения в препарате плазмы крови, определенная равновесным диализом in vitro.

f_u,br в головном мозге: Свободная фракция соединения в препарате гомогената головного мозга, определенная равновесным диализом in vitro.

Cl_u: клиренс in vitro. Cl_u, как определено в данном документе, представляет собой масштабированный клиренс, рассчитанный в свою очередь из собственного клиренса. Собственный клиренс представляет собой спрогнозированный клиренс вследствие печеночных метаболических реакций, определенный путем инкубирования соединения в препарате гепатоцитов. Чем ниже значение в мл/мин/кг, тем более стабильным является соединение.

Cl: клиренс in vivo: Фармакокинетическое измерение объема плазмы (или любого матрикса), из которого вещество полностью удаляется в единицу времени. Чем ниже значение в мл/мин/кг, тем более стабильным является соединение.

Пероральная F: Пероральная биодоступность.

MDR1-MDCK (монослой клеток почки собак Мадин-Дарби) (in vitro) анализ проницаемости.

WT-MDCK (дикого типа) проницаемость in vitro.

Kp_u,u означает отношение несвязанного лекарственного средства в головном мозге к несвязанному лекарственному средству в плазме крови и может служить показателем потенциала для лечения периферических показаний и/или показаний ЦНС.

Соединения примеров обладают благотворными свойствами, демонстрируя потенциальное превосходство над другими соединениями. Например, для соединений Примеров 1 и 2 наблюдаемый в.в. плазменный клиренс 41 и 20 мл/мин/кг, как измерено у мыши, является низким, что свидетельствует о ценной стабильности в плазме, и что соединения имеют очень хорошую пероральную био доступность 37 и 47% соответственно.

Сравнительные данные

Соединения Примеров сравнения А, В, С, D и Е представляют собой известные ингибиторы DUB, которые были идентифицированы как активные в качестве ингибиторов USP30 и имеют некоторое общее структурное сходство с соединениями по настоящему изобретению, имея цианамидный структурный признак. Соединения Примеров сравнения В, С, D и Е раскрыты в WO 2016/046530 как имеющие активность ингибиторов UCHL1.

Эффективность по отношению к USP30

Соединения Примеров 1-11 по настоящему изобретению значительно более эффективны против USP30, соединения Примеров сравнения А, В, С, D и Е, как измерено в биологическом анализе. Соединение Примера 12 является значительно более эффективным против USP30, чем соединения Примеров сравнения В, С, D и Е. Например, соединения Примеров 1-11 в 6,8-34 раза более эффективны, чем соединение Примера сравнения А, в 16-155 раз более эффективны, чем соединения Примеров сравнения В, С и D, и по меньшей мере в 440 раз более эффективны, чем соединение Примера сравнения Е.

Избирательность к USP30 относительно других DUB

Представленные данные демонстрируют, что соединения Примеров 1, 2, 4, 6, 7, 11 and 12 являются значительно более избирательными к USP30 относительно девяти DUB (USP2, USP6, USP10, USP15, USP16, USP21, USP25, USP28 и USP46) по сравнению с соединением Примера сравнения А. Эти соединения минимум в 110-7820 раз более эффективны против USP30, чем против каждого из этих девяти DUB (соединение Примера 7 не тестировали против USP15). Это является значительным преимуществом в избирательности над соединением Примера сравнения А, которое лишь в 2,2 раза более эффективно.

Избирательность к USP30 относительно UCHL1

Представленные данные демонстрируют, что соединения Примеров 1, 2, 4, 6, 7, 11 и 12 является значительно более избирательными к USP30 относительно UCHL1 по сравнению с соединениями Примеров сравнения В, С, D и Е. Соединения Примеров 1, 2, 4, 6, 7, 11 более чем в 30000 раз более эффективны против USP30, чем против UCHL1, и соединение Примера 12 более чем в 4412 раз более эффективно, тогда как соединения Примеров сравнения В, С, D и Е лишь в 3,0, 1,3, 0,8 и 1,5 раза более эффективны соответственно; 'С' является более избирательным к UCHL1.

Избирательность к USP30 относительно катепсинов В, K, L, S и V

Представленные данные демонстрируют, что соединения Примеров 1, 2, 4, 6, 7, 11 и 12 является значительно более избирательными к USP30 относительно катепсинов (В, K, L, S и V) по сравнению с соединением Примера сравнения А. Соединения этих примеров все более чем в 1540 раз более эффективны против USP30, чем против каждого из катепсинов. Это является значительным преимуществом в избирательности над соединением Примера сравнения А, которое является более эффективным против катепсина К лишь в 11,6 раза.

Идентифицированные выше преимущества соединений по изобретению над соединениями примеров сравнения предшествующего уровня техники являются и значительными, и неожиданными. Это превосходство само по себе и, в частности, в сочетании делает соединения по изобретению особенно подходящим для применения в лечении или предупреждении заболеваний, связанных с активностью USP30.

Доклиническая модель in vitro

(а) Модель повреждения цисплатином клеток почечных проксимальных канальцев человека, модифицированная для тестирования почечных защитных агентов.

Первичные РТС человека изолируют из почек, признанных негодными для трансплантации.

Изолированные клетки высевали на 96-луночные вкладыши Transwell (площадь поверхности = 0,143 см²) при плотности 20000 клеток на вкладыш. Среду обновляли через 24 часа после начального посева, в также в день 3 и день 5 культивирования.

Монослои демонстрировали значения TEER (трансэпителиальное электрическое сопротивление) в диапазоне 80-120 Ω.см² перед использованием в экспериментах.

Монослои РТС человека подвергали предварительному воздействию соединения Примера 2 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0 и 3,0 мкМ) в течение 1 часа как с апикальной, так и базолатеральной стороны клеточного слоя, после чего клетки подвергали воздействию цисплатина (20 мкМ). Затем клетки подвергали воздействию как соединения Примера 2 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0 и 3,0 мкМ), так и цисплатина (20 мкМ) как с апикальной, так и базолатеральной стороны в течение 24 и 48 часов. Кроме того, отрицательные контроли (только соединение Примера 2, 0,5% DMSO для соединения Примера 2, 0,2% диметилформамида (DMF) контроля растворителя цисплатина, положительный контроль (цисплатин 20 мкМ) и цисплатин плюс ингибитор захвата цисплатина (долутегравир 100 мкМ) были включены параллельно. Эксперименты выполняли в трех повторах в монослоях клеток человека (n=3) и от трех разных доноров (N=3).

Анализ жизнеспособности клеток, основанный на продуцировании АТР и высвобождении LDH, выполняли на монослоях, обработанных тестируемым соединением, в 96-луночных вставках Transwell.

Соединение Примера 2 защищало от индуцированной цисплатином утраты АТР зависимым от концентрации образом. Соединение Примера 2 также снижало индуцированное цисплатином повышение LDH. Эти данные демонстрируют, что соединение Примера 2 может защищать от индуцированной цисплатином токсичности по отношению к эпителиальным клеткам проксимальных канальцев.

Доклинические модели in vivo

Соединения по изобретению могут быть протестированы в отношении эффективности в репрезентативных моделях заболеваний in vivo, используя стандартные методики исследований из литературных источников, включая, например:

(a) Модель индуцированного блеомицином фиброза легких, которая является лидирующей доклинической моделью in vivo идиопатического фиброза легких [Kobayashi et al, 2016, J Immunol, 197(2):504-516].

(b) Индуцированная диетой модель NAFLD (неалкогольная жировая болезнь печени) и гомеостаза глюкозы [Nishida et al, 2013, Lab Invest; Feb;93(2):230-41].

(c) Модель индуцированной МРТР (1-метил-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином) болезни Паркинсона, которая является широко используемой парадигмой для изучения нейродегенерации в допаминергической системе головного мозга, которая запускается химически индуцированной митохондриальной дисфункцией [Karuppagouner et al, 2014, Sci Rep. 2014 May 2;4:4874].

(d) Модель синдрома Ли Ndufs4KO [Kruse et al, 2008, Cell Metab. Apr;7(4):312-20].

(e) Модель на старых грызунах: Влияние на гиппокамп, когнитивную и двигательную функцию [Kobilo et al, 2014, Learn Mem. Jan 17;21(2): 119-26; Creed et al, 2019, Neuroscience. Jun 15; 409:169-179; Van Skike et al, 2020, Aging Cell. 19; e13057].

(f) Модель почечного заболевания с односторонней обструкцией мочеточника (UUO) [Chevalier et al, 2009, Kidney Int 75(11): 1145-1152].

UUO вызывает почечное повреждение, характеризующееся повреждением тубулярных клеток, интерстициальным воспалением и фиброзом. Она служит в качестве модели необратимого пост-ренального острого почечного повреждения (AKI). Экспериментальная UUO проиллюстрировала молекулярные механизмы апоптоза, воспаления и фиброза, которые все являются ключевыми процессами в почечном повреждении независимо от первичного инсульта. Следовательно, модель UUO предоставляет исследователям информацию, выходящую за рамки обструкции (Chevalier et al, 2009, Kidney Int 75(11): 1145-1152).

Соединение Примера 2 оценивали в модели UUO для определения способности соединения ослаблять прогрессирующий тубулоинтерстициальный фиброз и хроническое почечное заболевание (CKD).

В День 1 исследования взрослым мышам C57BL/6 посредством перорального зонда вводили дозу согласно одной из следующих схем дозирования: носитель, 1,5 или 5 мг/кг соединения Примера 2 BID (два раза в сутки). Через два часа после введения дозы в День 1 исследования мышей подвергали хирургической операции по наложению лигатуры на левый мочеточник в двух точках. Успешную UUO позднее подтверждали путем определения расширения почечной лоханки вследствие гидронефроза. Животным вводили дозу в соответствии с предписанной им схемой в течение 10 дней, и в этой точке почки собирали для оценки гистопатологии и для оценки белка/РНК. Окрашивание красителем Picrosirius Red выполняли для оценки степени отложения коллагена, и ШС (иммуногистохимическое исследование) использовали для оценки относительной экспрессии гладкомышечного актина α (α-SMA).

Результаты продемонстрировали, что как 1,5, так и 5 мг/кг соединения Примера 2 (п.о.), вводимые BID, статистически снижают отложение коллагена, что доказано снижением окрашивания красителем Picrosirius red в лигированных почках. Оценка окрашивания α-SMA выявила, что пероральное введение 5 и 1,5 мг/кг соединения Примера 2 BID приводит к статистическому снижению уровней α-SMA в UUO-поврежденных почках по сравнению с контролями, которым вводили носитель.

(g) AKI может быть вызвана двусторонним пережатием почечной ножки, приводящим к ишемическому реперфузионному повреждению (IRI), приводящему к тяжелой потере почечной функции, тубулярному повреждению и воспалению [Lu et al. 2012. J Nephrol. 25 (5): 738-45].

Профилактическое введение:

Соединение Примера 2 вводили мышам C57BL/6 в дозе 5 и 1,5 мг/кг BID (р.о.) и сравнивали с лечением носителем с Дня -1 по День +21. В День 0 мышам делали анестезию, и их левую почечную ножку зажимали в течение 45 мин, затем отпускали, чтобы вызвать IRI. В день +21 почки собирали. Оценивали морфологию и фиброз.

Масса тела была сходной в группах и оставалась постоянной на протяжении периода наблюдения. Трихромное окрашивание по Массону выявило значительно меньшую тубулярную атрофию и содержание коллагена во внешнем мозговом слое у животных, которым вводили соединение Примера 2 (оба уровня дозы) в День +21. Экспрессия фибронектина в кортикальном слое и внешнем мозговом слое была значительно снижена у животных, которым вводили соединение Примера 2 (оба уровня дозы) в День +21.

Соединение Примера 2 продемонстрировало эффективность в этой модели IR-индуцированного CKD. Ежесуточное лечение показало значительные преимущества ослабления тубулярной атрофии и снижения фиброза.

Введение после повреждения:

В День 0 (ноль) мышам C57BL/6 делали анестезию, и их левую почечную ножку зажимали в течение 45 мин, затем отпускали, чтобы вызвать IRI. Затем мышам вводили либо носитель, либо соединение Примера 2; 5 мг/кг (р.о.) BID в течение 21 суток, с первым лечением, начавшимся через пять часов после IRI-хирургии (т.е. введение терапевтических средств). Мышей контролировали, и почки собирали в День +21. Почечные срезы количественно оценивали в отношении относительной клеточной морфологии и фиброза с использованием слепых гистологических методов оценки.

Масса тела была сходной в группах и оставалась постоянной на протяжении периода наблюдения. Окрашивание фибронектина в кортикальном слое было значительно снижено у мышей, которым вводили соединение Примера 2, в День +21.

Соединение Примера 2 продемонстрировало частичную эффективность в этой модели IR-индуцированного CKD при введении терапевтической дозы. Начальное лечение после установления ишемического-реперфузионного повреждения показало значительные преимущества для ослабления кортикального фиброза.

Пункты изобретения

Настоящее изобретение относится к следующему:

1. Соединение формулы (I), которое выбрано из соединений формулы (I)(i) и формулы (I)(ii):

2. Соединение по п. 1, где R¹ выбран из метила, CH₂F, CHF₂, CF₃ и СН₂ОСН₃.

3. Соединение по п. 2, где R¹ выбран из метила и СН₂ОСН₃.

4. Соединение по любому из пп. 1-3, где R² выбран из метила, CF₃ и циклопропила.

5. Соединение по п. 4, где R² выбран из метила и циклопропила.

6. Соединение по любому из пп. 1-5, где R³ выбран из водорода и фтора.

7. Соединение по п. 6, где R³ представляет собой водород.

8. Соединение по любому из пп. 1-7, где каждый из R⁴ и R⁵ представляет собой водород.

9. Соединение по любому из пп. 1-8, имеющее формулу (I)(i):

его таутомер или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения или таутомера.

10. Соединение по п. 9, имеющее формулу (IA)(i):

11. Соединение по п. 10, которое выбрано из:

или его фармацевтически приемлемая соль.

12. Соединение по п. 9, имеющее формулу (IB)(i):

13. Соединение по п. 12, которое выбрано из:

4-(5-циано-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида и

или его фармацевтически приемлемая соль.

14. Соединение по любому из пп. 1-8, имеющее формулу (I)(ii):

15. Соединение по п. 14, имеющее формулу (IA)(ii):

16. Соединение по п. 15, которое выбрано из:

5-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида; и

или его фармацевтически приемлемая соль.

17. Соединение по п. 14, имеющее формулу (IB)(ii):

18. Соединение по п. 17, которое выбрано из: 4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида; и

или его фармацевтически приемлемая соль.

19. Соединение по любому из пп. 1-18, его таутомер или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения или таутомера для применения в качестве лекарственного средства.

20. Соединение по любому из пп. 1-18, его таутомер или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения или таутомера для применения в лечении или предупреждении состояния, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, рака или фиброза.

21. Применение соединения по любому из пп. 1-18, его таутомера или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения или таутомера в изготовлении лекарственного средства для применения в лечении или предупреждении состояния, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, рака или фиброза.

22. Способ лечения или предупреждения состояния, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, рака или фиброза, включающий стадию введения эффективного количества соединения по любому из пп. 1-18, его таутомера или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения или таутомера нуждающемуся в этом пациенту.

23. Соединение, применение или способ по пп. 20-22, где состояние, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, выбрано из расстройства ЦНС; нейродегенеративного заболевания; болезни Паркинсона; болезни Альцгеймера; амиотрофического латерального склероза; болезни Гентингтона; ишемии; инсульта; деменции с тельцами Леви; лобно-височной деменции; рассеянного склероза; митохондриальной энцефалопатии, лактоацидоза и синдрома инсультоподобных эпизодов; наследуемых по материнской линии диабета и глухоты; наследственной невропатии зрительного нерва Лебера; невропатии, атаксии, наследуемого по материнской линии синдрома пигментного ретинита Ли; болезни Данона; диабета; диабетической невропатии; метаболических расстройств; сердечной недостаточности; ишемической болезни сердца, приводящей к инфаркту миокарда; психиатрических заболеваний, шизофрении; множественной сульфатазной недостаточности; муколипидоза II; муколипидоза III; муколипидоза IV; GM1-ганглиозидоза; нейронального цероидного липофусциноза; болезни Альперса; синдрома Барта; дефектов бета-окисления; карнитин-ацил-карнитиновой недостаточности; недостаточности карнитина; синдромов недостаточности креатина; недостаточности коэнзима Q10; недостаточности комплекса I; недостаточности комплекса II; недостаточности комплекса III; недостаточности комплекса IV; недостаточности комплекса V; недостаточности СОХ (циклооксигеназа); синдрома хронической прогрессирующей внешней офтальмоплегии; недостаточности СРТ I (карнитин-пальмитоилтрансфераза I); недостаточности СРТ II; глутарацидурии типа II; синдрома Кернса-Сейра; лактоацидоза; недостаточности длинноцепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы; болезни или синдрома Ли; франко-канадского варианта синдрома Ли; летальной младенческой кардиомиопатии; болезни Люфта; недостаточности среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы; синдрома миоклонической эпилепсии и разорванных красных волокон; митохондриальной цитопатии; синдрома митохондриальной рецессивной атаксии; синдрома истощения митохондриальной ДНК; мионейрогастроинтестинального расстройства и энцефалопатии; синдрома Пирсона; недостаточности пируватдегидрогеназы; недостаточности пируваткарбоксилазы; мутаций в POLG (митохондриальная полимераза гамма); недостаточности средне/короткоцепочечной 3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы; и недостаточности очень длинноцепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы; пероксисомальных расстройств; метилмалоновой ацидемии; недостаточности мевалонаткиназы; возрастного ухудшения когнитивной функции и мышечной силы; и когнитивного нарушения, ассоциированного со всеми нейродегенеративными и нейропсихиатрическими расстройствами.

24. Соединение, применение или способ по п. 23, где нейродегенеративное заболевание выбрано из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, амиотрофического латерального склероза, болезни Гентингтона, ишемии, инсульта, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, прогрессирующего надъядерного паралича, кортикобазальной дегенерации, лобно-височной деменции; и болезни Паркинсона, связанной с мутациями в α-синуклеине, паркине, PINK1, GBA и LRRK2, и аутосомальной рецессивной ювенильной болезни Паркинсона или болезни Паркинсона с ранним началом (EOPD), где паркин или PINK1 мутирован, усечен или удален.

25. Соединение, применение или способ по п. 23, где нейродегенеративное заболевание представляет собой синдром или болезнь Ли, Х-сцепленную болезнь Ли, франко-канадский вариант синдрома Ли и/или симптомы, ассоциированные с болезнью Ли.

26. Соединение, применение или способ по пп. 20-22, где рак выбран из рака молочной железы, яичника, предстательной железы, легкого, почки, желудка, ободочной кишки, яичка, в области головы и шеи, поджелудочной железы, головного мозга, меланомы, кости, печени, мягкой ткани, раковых заболеваний тканевых органов, раковых заболеваний кровяных клеток, CML (хронический миелогенный лейкоз), AML (острый миелоидный лейкоз), мантийноклеточной лимфомы, нейробластомы, меланомы, саркомы мягких тканей, липосаркомы, фибробластной саркомы, лейомиосаркомы, печеночноклеточной карциномы, остеосаркомы, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, множественной миеломы, метастатической карциномы, остеосаркомы, хондросаркомы, саркомы Юинга, носоглоточной карциномы, колоректального рака, колоректального рака, немелкоклеточной карциномы легкого, рака, при котором нарушена регуляция путей апоптоза, и рака, при котором белки семейства BCL-2 (В-клеточная лимфома 2) мутированы или сверх- или недо-экспрессированы.

27. Соединение, применение или способ по пп. 20-22, где фиброз выбран из фиброза или фиброзирующего расстройства, ассоциированного с накоплением составляющих внеклеточного матрикса, которое возникает вследствие травмы, воспаления, регенерации тканей, иммунологических реакций, клеточной гиперплазии и неоплазии.

28. Соединение, применение или способ по п. 27, где фиброз выбран из фиброза или фиброзирующего расстройства, ассоциированного с заболеваниями жизненно-важных органов, фибропролиферативными расстройствами и рубцеванием, связанным с травмой.

29. Соединение, применение или способ по п. 28, где фиброз выбран из фиброза или фиброзирующего расстройства, ассоциированного с интерстициальным заболеванием легких, циррозом печени, неалкогольной жировой болезнью печени, неалкогольной жировой болезнью печени и неалкогольным стеатогепатитом, заболеванием почек, острым почечным заболеванием, острым почечным повреждением, хроническим почечным заболеванием, замедленной функцией трансплантата почки, сердечно-сосудистым заболеванием, заболеваниями глаза, системной и местной склеродермией, келоидами, гипертрофическими рубцами, атеросклерозом, рестенозом, контрактурой Дюпюитрена, хирургическими осложнениями, фиброзом, вызванным химиотерапевтическими лекарственными средствами, фиброзом, вызванным облучением, случайным повреждением и ожогами, ретроперитонеальным фиброзом и перитонеальным фиброзом/перитонеальным рубцеванием.

30. Соединение, применение или способ по п. 29, где фиброз, ассоциированный с интерстициальным заболеванием легких, выбран из саркоидоза, силикоза, реакций на лекарственные средства, инфекций, коллагеновых сосудистых заболеваний, ревматоидного артрита, системного склероза, склеродермии, фиброза легких, идиопатического фиброза легких, обычного интерстициального пневмонита, интерстициального заболевания легких, криптогенного фиброзирующего альвеолита, облитерирующего бронхиолита и бронхоэктаза.

31. Соединение, применение или способ по п. 29, где заболевание почек представляет собой острое почечное заболевание, острое почечное повреждение или хроническое почечное заболевание.

32. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), как определено в любом из пп. 1-18, его таутомер или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения или таутомера, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

33. Соединение, которое выбрано из соединений формул (II)(i), (III)(i), (II)(ii) и (III)(ii):

его таутомера или соли указанного соединения или таутомера;

где R¹, R², R³, R⁴ and R⁵ такие, как определено для соединения формулы (I) в любом из пп. 1-18; и PG представляет собой защитную группу, которая предпочтительно выбрана из трет-бутилоксикарбонила, бензилоксикарбонила, пара-метоксибензилкарбонила, 9-флуоренилметилоксикарбонила, ацетила, бензоила, бензила, карбамата, пара-метоксибензила, 3,4-диметоксибензила, пара-метоксифенила, тозила, трихлорэтоксикарбонила, 4-нитробензолсульфонила и 2-нитрофенилсульфенила.

Claims

,

или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения, где

R¹ выбран из (C₁-C₄)алкила, (C₁-C₄)фторалкила и CH₂OCH₃;

R² выбран из (C₁-C₄)алкила, CF₃ и циклопропила; и

2. Соединение по п. 1, где R¹ выбран из метила, CH₂F, CHF₂, CF₃ и CH₂OCH₃.

3. Соединение по п. 2, где R¹ выбран из метила и CH₂OCH₃.

(I)(i),

или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения.

10. Соединение по п. 9, имеющее формулу (IA)(i):

(IA)(i),

11. Соединение по п. 10, которое выбрано из:

5-(5-циано-2-(трифторметокси)фенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида и

или его фармацевтически приемлемая соль.

12. Соединение по п. 9, имеющее формулу (IB)(i):

(IB)(i),

13. Соединение по п. 12, которое выбрано из:

или его фармацевтически приемлемая соль.

(I)(ii),

15. Соединение по п. 14, имеющее формулу (IA)(ii):

(IA)(ii),

16. Соединение по п. 15, которое выбрано из:

5-(5-циано-4-фтор-2-метоксифенил)-N-((3R,5S)-1-циано-5-метилпирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида и

или его фармацевтически приемлемая соль.

17. Соединение по п. 14, имеющее формулу (IB)(ii):

(IB)(ii),

18. Соединение по п. 17, которое выбрано из:

4-(5-циано-2-циклопропоксифенил)-N-((3R,5R)-1-циано-5-(метоксиметил)пирролидин-3-ил)оксазол-2-карбоксамида и

или его фармацевтически приемлемая соль.

19. Применение соединения по любому из пп. 1-18 или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения для лечения или предупреждения расстройства или состояния, связанного с активностью USP30.

20. Применение соединения по любому из пп. 1-18 или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения для лечения или предупреждения состояния, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, рака или фиброза, которые связаны с активностью USP30.

21. Применение по п. 20, где состояние, в которое вовлечена митохондриальная дисфункция, выбрано из расстройства ЦНС; нейродегенеративного заболевания; болезни Паркинсона; болезни Альцгеймера; амиотрофического латерального склероза; болезни Гентингтона; ишемии; инсульта; деменции с тельцами Леви; лобно-височной деменции; рассеянного склероза; митохондриальной энцефалопатии, лактоацидоза и синдрома инсультоподобных эпизодов; наследуемых по материнской линии диабета и глухоты; наследственной невропатии зрительного нерва Лебера; невропатии, атаксии, наследуемого по материнской линии синдрома пигментного ретинита Ли; болезни Данона; диабета; диабетической невропатии; метаболических расстройств; сердечной недостаточности; ишемической болезни сердца, приводящей к инфаркту миокарда; психиатрических заболеваний, шизофрении; множественной сульфатазной недостаточности; муколипидоза II; муколипидоза III; муколипидоза IV; GМ1-ганглиозидоза; нейронального цероидного липофусциноза; болезни Альперса; синдрома Барта; дефектов бета-окисления; карнитин-ацил-карнитиновой недостаточности; недостаточности карнитина; синдромов недостаточности креатина; недостаточности коэнзима Q10; недостаточности комплекса I; недостаточности комплекса II; недостаточности комплекса III; недостаточности комплекса IV; недостаточности комплекса V; недостаточности COX (циклооксигеназа); синдрома хронической прогрессирующей внешней офтальмоплегии; недостаточности CPT I (карнитин-пальмитоилтрансфераза I); недостаточности CPT II; глутарацидурии типа II; синдрома Кернса-Сейра; лактоацидоза; недостаточности длинноцепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы; болезни или синдрома Ли; франко-канадского варианта синдрома Ли; летальной младенческой кардиомиопатии; болезни Люфта; недостаточности среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы; синдрома миоклонической эпилепсии и разорванных красных волокон; митохондриальной цитопатии; синдрома митохондриальной рецессивной атаксии; синдрома истощения митохондриальной ДНК; мионейрогастроинтестинального расстройства и энцефалопатии; синдрома Пирсона; недостаточности пируватдегидрогеназы; недостаточности пируваткарбоксилазы; мутаций в POLG (митохондриальная полимераза гамма); недостаточности средне/короткоцепочечной 3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы; недостаточности очень длинноцепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы; пероксисомальных расстройств; метилмалоновой ацидемии; недостаточности мевалонаткиназы; возрастного ухудшения когнитивной функции и мышечной силы; и когнитивного нарушения, ассоциированного со всеми нейродегенеративными и нейропсихиатрическими расстройствами.

22. Применение по п. 21, где нейродегенеративное заболевание выбрано из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, амиотрофического латерального склероза, болезни Гентингтона, ишемии, инсульта, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, прогрессирующего надъядерного паралича, кортикобазальной дегенерации, лобно-височной деменции; и болезни Паркинсона, связанной с мутациями в α-синуклеине, паркине, PINK1, GBA и LRRK2, и аутосомальной рецессивной ювенильной болезни Паркинсона или болезни Паркинсона с ранним началом (EOPD), где паркин или PINK1 мутирован, усечен или удален.

23. Применение по п. 21, где нейродегенеративное заболевание представляет собой синдром или болезнь Ли, X-сцепленную болезнь Ли, франко-канадский вариант синдрома Ли и/или симптомы, ассоциированные с болезнью Ли.

24. Применение по п. 20, где рак выбран из рака молочной железы, яичника, предстательной железы, легкого, почки, желудка, ободочной кишки, яичка, в области головы и шеи, поджелудочной железы, головного мозга, меланомы, кости, печени, мягкой ткани, раковых заболеваний тканевых органов, раковых заболеваний кровяных клеток, CML (хронический миелогенный лейкоз), AML (острый миелоидный лейкоз), мантийноклеточной лимфомы, нейробластомы, саркомы мягких тканей, липосаркомы, фибробластной саркомы, лейомиосаркомы, печеночноклеточной карциномы, остеосаркомы, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, множественной миеломы, метастатической карциномы, остеосаркомы, хондросаркомы, саркомы Юинга, носоглоточной карциномы, колоректального рака, немелкоклеточной карциномы легкого, рака, при котором нарушена регуляция путей апоптоза, и рака, при котором белки семейства BCL-2 (B-клеточная лимфома 2) мутированы или сверх- или недоэкспрессированы.

25. Применение по п. 20, где фиброз выбран из фиброза или фиброзирующего расстройства, ассоциированного с накоплением составляющих внеклеточного матрикса, которое возникает вследствие травмы, воспаления, регенерации тканей, иммунологических реакций, клеточной гиперплазии и неоплазии.

26. Применение по п. 25, где фиброз выбран из фиброза или фиброзирующего расстройства, ассоциированного с заболеваниями жизненно важных органов, фибропролиферативными расстройствами и рубцеванием, связанным с травмой.

27. Применение по п. 26, где фиброз выбран из фиброза или фиброзирующего расстройства, ассоциированного с интерстициальным заболеванием легких, циррозом печени, неалкогольной жировой болезнью печени и неалкогольным стеатогепатитом, заболеванием почек, острым почечным заболеванием, острым почечным повреждением, хроническим почечным заболеванием, замедленной функцией трансплантата почки, сердечно-сосудистым заболеванием, заболеваниями глаза, системной и местной склеродермией, келоидами, гипертрофическими рубцами, атеросклерозом, рестенозом, контрактурой Дюпюитрена, хирургическими осложнениями, фиброзом, вызванным химиотерапевтическими лекарственными средствами, фиброзом, вызванным облучением, случайным повреждением и ожогами, ретроперитонеальным фиброзом и перитонеальным фиброзом/перитонеальным рубцеванием.

28. Применение по п. 27, где фиброз, ассоциированный с интерстициальным заболеванием легких, выбран из саркоидоза, силикоза, реакций на лекарственные средства, инфекций, коллагеновых сосудистых заболеваний, ревматоидного артрита, системного склероза, склеродермии, фиброза легких, идиопатического фиброза легких, обычного интерстициального пневмонита, интерстициального заболевания легких, криптогенного фиброзирующего альвеолита, облитерирующего бронхиолита и бронхоэктаза.

29. Применение по п. 27, где заболевание почек представляет собой острое почечное заболевание, острое почечное повреждение или хроническое почечное заболевание.

30. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью ингибирования активности USP30, содержащая эффективное количество соединения формулы (I), как определено в любом из пп. 1-18, или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

31. Соединение, которое выбрано из соединений формул (II)(i), (III)(i), (II)(ii) и (III)(ii):

или соли указанного соединения;

где R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ такие, как определено для соединения формулы (I) в любом из пп. 1-18, и PG представляет собой трет-бутилоксикарбонил.