MD3223845T2 - Anticorpi heterodimerici care se leagă de CD3 și CD20 - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la noi anticorpi heterodimeri.

Description

STADIUL TEHNICII AL INVENŢIEI

Agenţii terapeutici pe bază de anticorpi sunt utilizaţi cu succes pentru a trata o varietate de boli, incluzând cancerul şi tulburările autoimune/inflamatorii. Cu toate acestea, sunt încă necesare îmbunătăţiri ale acestei clase de medicamente, în special în ceea ce priveşte creşterea eficacităţii lor clinice. O cale care este cercetată este prelucrarea unor situsuri de legare la antigen suplimentare şi noi în medicamente pe bază de anticorpi, astfel încât o singură moleculă de imunoglobulină să co-cupleze două antigene diferite. Astfel de formate de anticorpi non-nativi sau alternative care cuplează două antigene diferite sunt adesea denumiţi agenţi bispecifici. Deoarece diversitatea considerabilă a regiunii variabile a anticorpului (Fv) face posibilă producerea unui Fv care recunoaşte practic orice moleculă, abordarea uzuală pentru generarea de agenţi bispecifici este introducerea de noi regiuni variabile în anticorp.

Mai multe formate alternative de anticorpi au fost explorate pentru ţintirea bispecifică (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136; Kontermann, mAbs 4(2):182 (2012).

Iniţial, anticorpii bispecifici au fost fabricaţi prin fuzionarea a două linii celulare care produceau fiecare un singur anticorp monoclonal (Milstein şi colab., 1983, Nature 305: 537-540). Cu toate că hibridoma sau cvadroma hibridă rezultată a produs anticorpi bispecifici, aceştia au fost doar o populaţie minoră, şi a fost necesară o purificare extinsă pentru a izola anticorpul dorit. O soluţie de prelucrare pentru acest lucru a fost utilizarea fragmentelor de anticorpi pentru a produce agenţi bispecifici. Deoarece astfel de fragmente nu au structura cuaternară complexă a unui anticorp cu lungime completă, lanţurile uşoare şi grele variabile pot fi legate în constructe genetice unice. Au fost generate fragmente de anticorpi de mai multe forme diferite, incluzând diacorpi, diacorpi cu lanţ unic, scFv-uri în tandem şi agenţi bispecifici Fab2 (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136).

Deşi aceste formate pot fi exprimate la niveluri ridicate în bacterii şi pot avea beneficii de penetrare favorabile datorită mărimii lor mici, ele se elimină rapid in vivo şi pot prezenta obstacole de fabricaţie legate de producerea şi stabilitatea lor. O cauză principală a acestor dezavantaje este că fragmentele de anticorp nu au în mod obişnuit regiunea constantă a anticorpului care este asociată cu proprietăţile sale funcţionale, incluzând mărime mai mare, stabilitate ridicată şi legare la diferiţi receptori şi liganzi de Fc care menţin o perioadă de înjumătăţire lungă în ser (adică receptorul de Fc neonatal FcRn) sau servesc drept situsuri de legare pentru purificare (adică proteina A şi proteina G).

Cercetări mai recente au încercat să soluţioneze deficienţele agenţilor bispecifici bazaţi pe fragmente prin proiectarea de legare duală în formate anticorp-like cu lungime completă (Wu şi colab., 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297; US2009-0311253; Michaelson şi colab., 2009, mAbs 1[2]:128-141; WO2008/032782; Zuo şi colab., 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367; US2002-0103345; Shen şi colab., 2006, J Biol Chem 281[16]:10706-10714; Lu şi colab., 2005, J Biol Chem 280[20]:19665-19672; WO2006/020258).

Aceste formate depăşesc unele dintre problemele agenţilor bispecifici din fragmente de anticorp, în principal deoarece aceştia conţin o regiune Fc. Un dezavantaj semnificativ al acestor formate este că, deoarece ele construiesc noi situsuri de legare la antigen în vârful lanţurilor homodimerice constante, legarea la noul antigen este întotdeauna bivalentă.

Pentru multe antigene care sunt atrăgătoare ca şi co-ţinte într-un format terapeutic bispecific, legarea dorită este mai degrabă monovalentă decât bivalentă. Pentru mulţi receptori imunitari, activarea celulară se realizează prin reticularea (reticularea) a unei interacţiuni de legare monovalentă. Mecanismul reticulării este de obicei mediat de complexe imune anticorp/antigen sau prin intermediul cuplării celulă efectoare la celulă ţintă. De exemplu, receptorii de Fc gamma cu afinitate redusă (FcγRs), cum ar fi FcγRIIa, FcγRIIb şi FcγRIIIa, se leagă monovalent la regiunea Fc a anticorpului. Legarea monovalentă nu activează celulele care exprimă aceşti FcγR; cu toate acestea, după complexarea imună sau contactul celulă la celulă, receptorii sunt reticulaţi şi grupaţi pe suprafaţa celulei, ducând la activare. Pentru receptorii responsabili de medierea omorârii celulare, de exemplu FcγRIIIa pe celulele natural killer (NK), reticularea receptorilor şi activarea celulară au loc atunci când celula efectoare se cuplează cu celula ţintă într-un format foarte avid (Bowles & Weiner, 2005, J Immunol Methods 304:88-99).

În mod similar, pe celulele B, receptorul inhibitor FcγRIIb reglează descendent activarea celulelor B doar atunci când se cuplează într-un complex imun cu receptorul celulei B de pe suprafaţa celulară (BCR), un mecanism care este mediat prin complexarea imună a IgG solubilă cu acelaşi antigen care este recunoscut de BCR (Heyman 2003, Immunol Lett 88[2]:157-161; Smith şi Clatworthy, 2010, Nature Reviews Immunology 10:328-343).

Ca un alt exemplu, activarea cu CD3 a celulelor T are loc numai atunci când receptorul celulelor T asociat al său (TCR) cuplează MHC încărcat de antigen pe celule prezentatoare de antigen într-o sinapsă celulă la celulă foarte avidă (Kuhns şi colab., 2006, Immunity 24:133-139). Într-adevăr, reticularea bivalentă nespecifică a CD3 utilizând un anticorp anti-CD3 provoacă o furtună de citokine şi toxicitate (Perruche şi colab., 2009, J Immunol 183[2]:953-61; Chatenoud & Bluestone, 2007, Nature Reviews Immunology 7:622-632). Astfel, pentru utilizarea clinică practică, modul preferat de co-cuplare a CD3 pentru omorârea redirecţionată a celulelor ţintă este legarea monovalentă care are ca rezultat activarea numai după cuplarea cu ţinta co-cuplată.

CD38, cunoscut şi sub numele de ADP ciclic ribozo hidrolază, este o glicoproteină transmembranară de tip II cu un domeniu extracelular C-terminal lung şi un domeniu citoplasmatic N-terminal scurt. Dintre celulele hematopoietice, o paletă de efecte funcţionale au fost atribuite semnalizării mediate de CD38, incluzând proliferarea limfocitelor, eliberarea citokinelor, reglarea dezvoltării şi supravieţuirii celulelor B şi celulelor mieloide şi inducerea maturării celulelor dendritice. CD38 este nereglat în multe afecţiuni maligne hematopoietice şi în linii celulare derivate din diferite afecţiuni maligne hematopoietice, inclusiv limfom non-Hodgkin (NHL), limfom Burkitt (BL), mielom multiplu (MM), leucemie limfocitară cronică B (B-CLL), leucemie limfocitară acută B şi T (ALL), limfom cu celule T (TCL), leucemie mieloidă acută (AML), leucemie cu celule păroase (HCL), limfom Hodgkin (HL) şi leucemie mieloidă cronică (LMC). Pe de altă parte, cele mai multe celule stem pluripotente primitive ale sistemului hematopoietic sunt CD38-. În ciuda progreselor recente în descoperirea şi dezvoltarea agenţilor anti-cancer, multe forme de cancer care implică tumori care exprimă CD38 au încă un prognostic slab. Astfel, este nevoie de metode îmbunătăţite pentru tratarea unor astfel de forme de cancer.

Antigenul celulei B CD19 (CD19, cunoscut şi sub numele de antigen de suprafaţă al celulelor-B B4, Leu-12) este un marker de suprafaţă al celulelor pan-B umane care se exprimă din stadiile incipiente ale dezvoltării celulelor pre-B prin diferenţiere terminală în celule plasmatice. CD 19 promovează proliferarea şi supravieţuirea celulelor B mature. Acesta se asociază într-un complex cu CD21 pe suprafaţa celulei. De asemenea, el se asociază cu CD81 şi Leu-13 şi potenţează semnalizarea receptorului de celule B (BCR). Împreună cu BCR, CD19 modulează pragurile de semnalizare induse de receptorul de antigen şi intrinseci critice pentru expansiunea clonală a celulelor B şi imunitatea umorală. În colaborare cu CD21, acesta se leagă la sistemul imunitar adaptativ şi înnăscut. După activare, coada citoplasmatică a CD19 devine fosforilată, ceea ce duce la legarea de kinaze din familia Src şi recrutarea kinazei PI-3. Aceasta este o ţintă imunoterapeutică atractivă pentru cancerele de origine limfoidă, deoarece este exprimată şi pe marea majoritate a celulelor NHL, precum şi în unele leucemii.

Un număr de anticorpi sau conjugaţi de anticorpi care ţintesc CD19 au fost evaluaţi în studii preclinice sau în studii clinice pentru tratamentul cancerelor. Aceşti anticorpi sau conjugaţi de anticorpi anti-CD19 includ, dar fără să se limiteze la, MT-103 (un anticorp CD19/CD3 bispecific cu un singur lanţ; Hoffman şi colab., 2005 Int J Cancer 115:98-104; Schlereth şi colab., 2006 Cancer Immunol Immunother 55:503-514), un diacorp CD19/CD16 (Schlenzka şi colab., 2004 Anti-cancer Drugs 15:915-919; Kipriyanov şi colab., 2002 J Immunol 169:137-144), BU12-saporin (Flavell şi colab., 1995 Br J Cancer 72:1373-1379), şi anti-CD19-idarubicină (Rowland şi colab., 1993 Cancer Immunol Immunother 55:503-514).

CD123, cunoscut şi sub numele de receptor alfa al interleukinei-3 (IL-3Rα), este exprimat pe celule dendritice, monocite, eozinofile şi bazofile. CD123 este, de asemenea, exprimat constitutiv de celule stem/progenitoare hematopoietice angajate, de majoritatea liniei mieloide (CD13+, CD14+, CD33+, CD15low) şi de unele celule CD19+. El este absent din celulele CD3+.

Astfel, în timp ce agenţii bispecifici generaţi din fragmente de anticorpi suferă obstacole biofizice şi farmacocinetice, un dezavantaj al celor construiţi cu formate anticorp-like este că aceştia se cuplează cu antigene co-ţintă în mod multivalent în absenţa antigenului ţintă primar, conducând la activare nespecifică şi potenţial la toxicitate. WO 2014/047231 descrie anticorpi bispecifici cuprinzând un braţ de legare la CD3 şi un braţ de legare la CD20.

SCURT REZUMAT AL INVENŢIEI

Într-un prim aspect, invenţia furnizează un anticorp heterodimeric anti-CD3 x anti-CD20 care cuprinde HC1 (Fab-Fc), HC2 (scFv-Fc) şi LC din Figura 74. Prin urmare, într-un caz, descrierea furnizează anticorpi heterodimerici cuprinzând: a) un prim monomer cuprinzând: i) un prim lanţ greu cuprinzând: 1) un prim domeniu greu variabil; 2) un prim lanţ greu constant cuprinzând un prim domeniu Fc; 3) un scFv cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv; în care scFv menţionat este ataşat covalent la capătul C-terminal al domeniului Fc menţionat folosind un domeniu linker; b) un al doilea monomer cuprinzând un al doilea lanţ greu cuprinzând un al doilea domeniu greu variabil şi un al doilea lanţ greu constant cuprinzând un al doilea domeniu Fc; şi c) un lanţ uşor comun care cuprinde un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant.

Într-un alt caz, descrierea furnizează anticorpi heterodimerici cuprinzând: a) un prim monomer cuprinzând: i) un prim lanţ greu cuprinzând: 1) un prim domeniu greu variabil; 2) un prim domeniu greu constant cuprinzând un prim domeniu Fc; şi 3) un prim domeniu uşor variabil, în care primul domeniu uşor variabil menţionat este ataşat covalent la capătul C-terminal al primului domeniu Fc menţionat folosind un domeniu linker; b) un al doilea monomer cuprinzând: i) un al doilea domeniu greu variabil; ii) un al doilea domeniu greu constant cuprinzând un al doilea domeniu Fc; şi iii) un al treilea domeniu greu variabil, în care al doilea domeniu greu variabil menţionat este ataşat covalent la capătul C-terminal al celui de-al doilea domeniu Fc menţionat folosind un domeniu linker; c) un lanţ uşor comun care cuprinde un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant.

Într-un caz suplimentar, descrierea furnizează anticorpi heterodimerici cuprinzând: a) un prim monomer cuprinzând: i) un prim lanţ greu cuprinzând: 1) un prim domeniu greu variabil; 2) un prim lanţ greu constant cuprinzând un prim domeniu CH1 şi un prim domeniu Fc; 3) un scFv cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv; în care scFv menţionat este ataşat covalent între capătul C-terminal al domeniului CH1 menţionat şi capătul N-terminal al primului domeniu Fc menţionat utilizând linkeri de domeniu; b) un al doilea monomer cuprinzând un al doilea lanţ greu cuprinzând un al doilea domeniu greu variabil şi un al doilea lanţ greu constant cuprinzând un al doilea domeniu Fc; şi c) un lanţ uşor comun care cuprinde un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant.

Într-un alt caz, descrierea furnizează anticorpi heterodimerici cuprinzând: a) un prim monomer cuprinzând: i) un prim lanţ greu cuprinzând: 1) un prim domeniu greu variabil; 2) un prim domeniu greu constant cuprinzând un prim domeniu Fc; şi 3) un prim domeniu uşor variabil, în care al doilea domeniu uşor variabil menţionat este ataşat covalent între capătul C al domeniului CH1 al primului domeniu greu constant menţionat şi capătul N-terminal al primului domeniu Fc menţionat folosind linkeri de domeniu; b) un al doilea monomer cuprinzând: i) un al doilea domeniu greu variabil; ii) un al doilea domeniu greu constant cuprinzând un al doilea domeniu Fc; şi iii) un al treilea domeniu greu variabil, în care al doilea domeniu greu variabil menţionat este ataşat covalent la capătul C-terminal al celui de-al doilea domeniu Fc folosind un domeniu linker; c) un lanţ uşor comun care cuprinde un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant.

Într-un caz suplimentar, descrierea furnizează anticorpi heterodimerici cuprinzând: a) un prim monomer cuprinzând: i) un prim lanţ greu cuprinzând: 1) un prim domeniu greu variabil; 2) un prim lanţ greu constant cuprinzând un prim domeniu CH1 şi un prim domeniu Fc; 3) un scFv cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv; în care scFv menţionat este ataşat covalent între capătul C-terminal al domeniului CH1 menţionat şi capătul N-terminal al primului domeniu Fc menţionat utilizând linkeri de domeniu; b) un al doilea monomer cuprinzând un al doilea domeniu Fc; şi c) un lanţ uşor cuprinzând un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant.

În unele cazuri, primul şi al doilea domeniu Fc au un set de substituţii de aminoacizi selectate din grupul format din S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L şi K370S: S364K/E357Q. Mai mult, domeniul(ile) greu variabil şi domeniul(ile) uşor variabil se leagă la un prim antigen tumoral ţintă (TTA), scFv se leagă la un al doilea TTA sau CD3 uman. În unele variante de realizare, TTA este selectat din grupul format din CD19, CD20 şi CD123.

Într-un alt caz, descrierea furnizează domenii de legare la antigen anti-CD3 care au CDR-uri şi/sau domenii variabile şi/sau secvenţele scFv descrise în Figuri pentru H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L.1.47 şi H1.31_L1.47. Invenţia furnizează, în plus, compoziţii de acid nucleic, compoziţii de vectori de expresie şi celule gazdă.

Într-un caz suplimentar, descrierea furnizează anticorpi heterodimerici cuprinzând a) un prim monomer cuprinzând: i) un prim domeniu Fc; ii) un scFv anti-CD3 cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv; în care scFv menţionat este ataşat covalent la capătul N-terminal al domeniului Fc menţionat folosind un domeniu linker; b) un al doilea monomer cuprinzând un lanţ greu cuprinzând: i) un domeniu variabil greu; şi ii) un domeniu constant de lanţ greu care cuprinde un al doilea domeniu Fc; şi c) un lanţ uşor cuprinzând un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant variabil; în care anti-CD3 scFv este selectat din grupul format din anti-CD3 H1.32_L1.47, anti-CD3 H1.89_L1.47, anti-CD3 H1.90_L1.47 şi anti-CD3 H1.33_L1.47 (SEQ ID NO: XX). Domeniul variabil greu şi domeniul variabil uşor se leagă la un TTA (incluzând, dar fără a se limita la acestea, CD19, Cd20, CD38 şi CD123).

Într-un caz suplimentar, descrierea furnizează domenii de legare ale anticorpilor anti-CD20 cuprinzând: a) un domeniu uşor variabil cuprinzând un vlCDR1 având secvenţa RASWSVSYIH (SEQ ID NO: XX), un vlCDR2 având secvenţa ATSNLAS (SEQ ID NO: XX) şi un vlCDR3 având secvenţa QQWTHNPPT (SEQ ID NO: XX); şi b) un domeniu greu variabil care cuprinde un vhCDR1 având secvenţa SYNMH (SEQ ID NO: XX), un vhCDR2 având secvenţa AIYPGNGATSYSQKFQG (SEQ ID NO: XX) şi un vhCDR3 având secvenţa SYYMGGDWYFDV (SEQ ID NO: XX). În unele variante de realizare, domeniile de legare ale anticorpilor anti-CD20 au secvenţele C2B8 H1.202_L1.113.

Într-un caz suplimentar, descrierea furnizează domenii de legare ale anticorpilor anti-CD20 cuprinzând: a) un domeniu uşor variabil cuprinzând un vlCDR1 având secvenţa RASSSVSYIH (SEQ ID NO: XX), un vlCDR2 având secvenţa ATSNLAS (SEQ ID NO: XX) şi un vlCDR3 având secvenţa QQWTSNPPT (SEQ ID NO: XX); şi b) un domeniu greu variabil care cuprinde un vhCDR1 având secvenţa SYNMH (SEQ ID NO: XX), un vhCDR2 având secvenţa AIYPGNGDTSYNQKFQG (SEQ ID NO: XX) şi un vhCDR3 având secvenţa STYYGGDWYFNV (SEQ ID NO: XX).

În unele variante de realizare, domeniile de legare ale anticorpilor anti-CD20 au secvenţele C2B8_H1L1.

Într-un caz suplimentar, descrierea furnizează anticorpi heterodimerici cuprinzând a) un prim monomer cuprinzând: i) un prim domeniu Fc; ii) un scFv anti-CD3 cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv; în care scFv menţionat este ataşat covalent la capătul N-terminal al domeniului Fc menţionat folosind un domeniu linker; b) un al doilea monomer cuprinzând un lanţ greu cuprinzând: i) un domeniu greu variabil; şi ii) un domeniu constant al lanţului greu care cuprinde un al doilea domeniu Fc; şi c) un lanţ uşor cuprinzând un domeniu uşor variabil şi un domeniu constant uşor variabil; în care lanţurile grele şi uşoare variabile formează un domeniu de legare C2B8 H1.202_L1.113 sau C2B8_H1L1.

Într-un caz suplimentar, descrierea furnizează anticorpi heterodimerici cuprinzând a) un prim monomer cuprinzând: i) un prim domeniu Fc; ii) un scFv anti-CD3 cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv; în care scFv menţionat este ataşat covalent la capătul N-terminal al domeniului Fc menţionat folosind un domeniu linker; b) un al doilea monomer cuprinzând un lanţ greu cuprinzând: i) un domeniu greu variabil; şi ii) un domeniu constant de lanţ greu care cuprinde un al doilea domeniu Fc; şi c) un lanţ uşor cuprinzând un domeniu uşor variabil şi un domeniu constant uşor variabil. În această variantă de realizare, domeniile variabile se leagă la CD123 şi pot avea secvenţele 7G3_H1.109_L1.47. Anticorpul XENP13676 este prezentat în Figura 74.

Sunt furnizaţi, de asemenea, acizi nucleici, vectori de expresie şi celule gazdă, pe lângă metode de fabricare a acestor proteine şi de tratare a pacienţilor cu ele.

SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR

Figurile 1A şi 1B descriu mai multe formate ale prezentei invenţii. Sunt prezentate două forme ale formatului „deschizător de sticle», una cu domeniul de legare la antigen din anti-CD3 cuprinzând un scFv şi domeniul de legare la antigen din anti-TTA cuprinzând un Fab, şi una cu acestea inversate. Sunt prezentate toate formatele mAb-Fv, mAb-scFv, ScFv-central şi Fv-central. În plus, sunt prezentate formate „cu un braţ», în care un monomer cuprinde doar un domeniu Fc, atât un ScFv-central cu un braţ, cât şi un Fv-central cu un lanţ. Este ilustrat şi un format scFv dual.

Figura 2 descrie secvenţele constructului anti-CD3_H1.30_L1.47 "High CD3 (Ridicat)", incluzând domeniile variabile grele şi uşoare (CDR-uri subliniate), precum şi vl şi vhCDR-uri individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (dublu subliniat). Aşa cum este adevărat pentru toate secvenţele descrise în Figuri, acest linker încărcat poate fi înlocuit cu un linker neîncărcat sau un linker încărcat diferit, după cum este necesar.

Figura 3 prezintă secvenţele constructului Anti-CD3_H1.32_L1.47 "High-Int #1", incluzând domeniile variabile grele şi uşoare (CDR-uri subliniate), precum şi vl şi vhCDR-uri individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (subliniat dublu). Aşa cum este adevărat pentru toate secvenţele descrise în Figuri, acest linker încărcat poate fi înlocuit cu un linker neîncărcat sau un linker încărcat diferit, după cum este necesar.

Figura 4 descrie secvenţele constructului Anti-CD3_H1.89_L1.47 "High-Int #2", incluzând domeniile variabile grele şi uşoare (CDR-uri subliniate), precum şi vl şi vhCDR-uri individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (subliniat dublu). Aşa cum este adevărat pentru toate secvenţele descrise în Figuri, acest linker încărcat poate fi înlocuit cu un linker neîncărcat sau un linker încărcat diferit, după cum este necesar.

Figura 5 descrie secvenţele constructului Anti-CD3_H1.90_L1.47 "High-Int #3", incluzând domeniile variabile grele şi uşoare (CDR-urile subliniate), precum şi vl şi vhCDR-uri individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (subliniat dublu). Aşa cum este adevărat pentru toate secvenţele descrise în Figuri, acest linker încărcat poate fi înlocuit cu un linker neîncărcat sau un linker încărcat diferit, după cum este necesar.

Figura 6 descrie secvenţele constructului Anti-CD3_H1.90_L1.47 "Int", incluzând domeniile variabile grele şi uşoare (CDR-uri subliniate), precum şi vl şi vhCDR-uri individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (dublu subliniat). Aşa cum este adevărat pentru toate secvenţele descrise în Figuri, acest linker încărcat poate fi înlocuit cu un linker neîncărcat sau un linker încărcat diferit, după cum este necesar.

Figura 7 descrie secvenţele constructului Anti-CD3_H1.31_L1.47 „Low (Scăzut)», incluzând domeniile variabile grele şi uşoare (CDR-uri subliniate), precum şi vl şi vhCDR-uri individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (dublu subliniat). Aşa cum este adevărat pentru toate secvenţele descrise în Figuri, acest linker încărcat poate fi înlocuit cu un linker neîncărcat sau un linker încărcat diferit, după cum este necesar.

Figura 8 descrie secvenţele pentru High CD38: Constructul OKT10_H1.77_L1.24, incluzând domenii variabile grele şi uşoare (CDR-urile subliniate), precum şi vl şi vhCDR-urile individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (subliniat dublu).

Figura 9 descrie secvenţele de CD38 intermediar: Constructul OKT10_H1L1.24, incluzând domeniile variabile grele şi uşoare (CDR-uri subliniate), precum şi vl şi vhCDR-urile individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (subliniat dublu).

Figura 10 descrie secvenţele de Low CD38: Constructul OKT10_H1L1, incluzând domeniile variabile grele şi uşoare (CDR-urile subliniate), precum şi vl şi vhCDR-urile individuale, precum şi un construct scFv cu un linker încărcat (subliniat dublu).

Figura 11 descrie secvenţele de XENP15331.

Figura 12 descrie secvenţele de XENP13243.

Figura 13 descrie secvenţele de XENP14702.

Figura 14 descrie secvenţele de XENP15426.

Figura 15 descrie secvenţele de XENP14701.

Figura 16 descrie secvenţa de XENP14703.

Figura 17 descrie secvenţa de XENP13243.

Figura 18 descrie secvenţele de XENP18967.

Figura 19 descrie secvenţele de XENP18971.

Figura 20 descrie secvenţele de XENP18969.

Figura 21 descrie secvenţele de XENP18970.

Figura 22 descrie secvenţele de XENP18972.

Figura 23 descrie secvenţele de XENP18973.

Figura 24 descrie secvenţele de XENP15055.

Figura 25 descrie secvenţele de XENP13544.

Figura 26 descrie secvenţele de XENP13694.

Figura 27 ilustrează secvenţa de CD3 ε umană.

Figura 28 prezintă lungimea completă (SEQ ID NO: 130) şi domeniul extracelular (ECD; SEQ ID NO: 131) ale proteinei CD38 umane.

Figurile 29A -29E descriu perechi utile de seturi de variante de heterodimerizare (inclusiv asimetrice şi variante de pI).

Figura 30 descrie o listă a regiunilor constante de anticorpi variante izosterice şi substituţiile lor corespondente. pI_(-) indică variante de pI mai mic, în timp ce pI_(+) indică variante de pI mai mare. Acestea pot fi combinate opţional şi independent cu alte variante de heterodimerizare ale invenţiei (şi alte tipuri de variante de realizare, de asemenea, aşa cum este prezentat în lucrarea de faţă).

Figura 31 descrie variante de ablaţie utile care anulează legarea la FcγR (uneori denumite variante "de knock out" sau "KO").

Figura 32 prezintă două variante de realizare deosebit de utile ale invenţiei.

Figura 33 ilustrează un număr de linkeri scFv încărcaţi care îşi găsesc utilizare în creşterea sau reducerea pI al anticorpilor heterodimerici care utilizează unul sau mai mulţi scFv ca şi component. Un singur linker scFv din stadiul tehnicii cu o singură încărcare este menţionat ca "Whitlow", de la Whitlow şi colab., Protein Engineering 6(8):989-995 (1993). Trebuie remarcat faptul că acest linker a fost utilizat pentru reducerea agregării şi creşterea stabilităţii proteolitice în scFv-uri.

Figura 34 prezintă o listă a variantelor Fc cu asimetrie a heterodimerului cu randamente de heterodimeri (determinate prin HPLC-CIEX) şi stabilităţi termice (determinate prin DSC). Stabilitatea termică nedeterminată este notată cu „n.d.».

Figura 35 Randamentele de exprimare ale agenţilor bispecifici după purificarea de afinitate cu proteina A.

Figura 36 Cromatograme de purificare cu schimb cationic.

Figura 37 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, incubare 24 de ore, 10k celule RPMI8226, 400k celule T. Articolele de testare sunt agenţi bispecifici anti-CD38 x anti-CD3. Detectarea a fost efectuată prin LDH

Figura 38 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, incubare de 24 de ore, 10k celule RPMI8226, 500k PBMC umane. Articolele de testare sunt agenţi bispecifici anti-CD38 x anti-CD3. Detectarea a fost efectuată prin LDH.

Figura 39 descrie secvenţele de XENP14419,

Figura 40 descrie secvenţele de XENP14420.

Figura 41 descrie secvenţele de XENP14421.

Figura 42 descrie secvenţele de XENP14422.

Figura 43 descrie secvenţele de XENP14423.

Figura 44 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, 96 ore de incubare, 40k celule RPMI8226, 400k PBMC umane. Articolele de testare sunt anti-CD38 x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. Detectarea s-a făcut prin citometrie în flux, în mod specific dispariţia celulelor CD38+.

Figura 45 Analiza suplimentară a testului de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate descris în Figura 1. Primul rând arată intensitatea medie a fluorescenţei (MFI) a markerului de activare CD69 pe celulele T CD4+ şi CD8+, aşa cum este detectată prin citometrie în flux. Al doilea rând arată procentul de celule T CD4+ şi CD8+ care sunt Ki-67+, o măsură a proliferării celulare. Al treilea rând arată intensitatea medie a fluorescenţei (MFI) intracelulară a inhibitorului PI-9 de grannzimă B pe celulele T CD4+ şi CD8+, aşa cum este detectată prin citometrie în flux.

Figura 46 Proiectarea studiului la şoarece pentru a examina activitatea anti-tumorală a agenţilor bispecifici anti-CD38 x anti-CD3 Fab-scFv-Fc.

Figura 47 Mărimea tumorii măsurată prin IVIS® în funcţie de timp şi tratament

Figura 48 Imagini bioluminescente IVIS® (Ziua 10)

Figura 49 Epuizarea celulelor CD38+ la maimuţele cynomolgus după doze unice din articolele de testare indicate

Figura 50 Activarea celulelor T măsurată prin intensitatea medie a fluorescenţei (MFI) a CD69 la maimuţe cynomolgus, codificarea culorilor ca în Figura 49.

Figura 51 Nivelurile serice de IL-6, după doze unice din articolele de testare indicate.

Figura 52 descrie secvenţele de XENP15427.

Figura 53 descrie secvenţele de XENP15428.

Figura 54 descrie secvenţele de XENP15429.

Figura 55 descrie secvenţele de XENP15430.

Figura 56 descrie secvenţele de XENP15431.

Figura 57 descrie secvenţele de XENP15432.

Figura 58 descrie secvenţele de XENP15433.

Figura 59 descrie secvenţele de XENP15434.

Figura 60 descrie secvenţele de XENP15435.

Figura 61 descrie secvenţele de XENP15436.

Figura 62 descrie secvenţele de XENP15437.

Figura 63 descrie secvenţele de XENP15438.

Figura 64 prezintă afinităţi de legare într-un test Biacore.

Figura 65 prezintă puritatea Heterodimerului în timpul generării de mase stabile utilizând rapoarte de lanţ uşor, Fab-Fc şi scFv-Fc variate.

Figura 66 Depleţia IgM şi IgG2 umane de către agenţi bispecifici anti-CD38 x anti-CD3 într-un model de şoarece huPBMC.

Figura 67 descrie variante de scFv-uri de anti-CD3 umanizate, optimizate în ce priveşte stabilitatea. Substituţiile sunt date în raport cu secvenţa H1_L1.4 scFv. Numerotarea aminoacizilor este numerotarea Kabat.

Figura 68. Secvenţe de aminoacizi ale variantelorde scFv-uri de anti-CD3 umanizate, optimizate pentru stabilitate. CDR-urile sunt subliniate. Pentru fiecare combinaţie de lanţ greu/lanţ uşor, sunt listate patru secvenţe: (i) scFv cu coadă 6xHis C-terminală, (ii) scFv singur, (iii) VH singur, (iv) VL singur.

Figura 69 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, incubare 24 de ore, 10k celule RPMI8226, 500k PBMC. Articolele de testare sunt anti-CD38 (OKT10_H1L1, OKT10_H1.77_L1.24) x anti-CD3 Fab-scFv-Fcs. Detectarea a fost efectuată prin LDH.

Figura 70 Studiul de epuizare a Ig huPBL-SCID. Articolele testate au fost dozate la 8 zile după grefarea de PBMC la 0,03, 0,3 sau 3 mg/kg. Calea de administrare a fost intraperitoneală. Probele de sânge au fost prelevate la 14 zile după grefarea PBMC, prelucrate în ser şi testate pentru IgM şi IgG2 umane.

Figura 71 descrie secvenţele de XENP15049.

Figura 72 descrie secvenţele de XENP15051.

Figura 73 descrie secvenţele de XENP15050.

Figura 74 descrie secvenţele de XENP13676.

Figura 75 descrie secvenţele de XENP14696.

Figura 76 descrie secvenţele de XENP15629.

Figura 77 descrie secvenţele de XENP15053.

Figura 78 descrie secvenţele de XENP15630.

Figura 79 descrie secvenţele de XENP15631.

Figura 80 descrie secvenţele de XENP15632.

Figura 81 descrie secvenţele de XENP15633.

Figura 82 descrie secvenţele de XENP15634.

Figura 83 descrie secvenţele de XENP15635.

Figura 84 descrie secvenţele de XENP15636.

Figura 85 descrie secvenţele de XENP15638.

Figura 86 descrie secvenţele de XENP15639.

Figura 87 descrie secvenţele de XENP13677.

Figura 88 descrie secvenţele de XENP14388.

Figura 89 descrie secvenţele de XENP14389.

Figura 90 descrie secvenţele de XENP14390.

Figura 91 descrie secvenţele de XENP14391.

Figura 92 descrie secvenţele de XENP14392.

Figura 93 descrie secvenţele de XENP14393.

Figura 94 descrie secvenţele de XENP16366.

Figura 95 descrie secvenţele de XENP16367

Figura 96 descrie secvenţele de XENP16368.

Figura 97 descrie secvenţele de XENP16369.

Figura 98 descrie secvenţele de XENP16370.

Figura 99 descrie secvenţele de XENP16371.

Figura 100 descrie secvenţele de XENP16372.

Figura 101 descrie secvenţele de XENP16373.

Figura 102 descrie secvenţele de XENP16374.

Figura 103 descrie secvenţele de XENP16375.

Figura 104 descrie secvenţele de XENP16376.

Figura 105 descrie secvenţele de XENP16377.

Figura 106 descrie secvenţele antigenelor CD20 şi CD123.

Figura 107 Determinarea rezonanţei plasmonului de suprafaţă a afinităţii CD3. Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. CD3δε-Fc uman (Sino Biological) a fost legat covalent de suprafaţa cipului. Articolele testate au fost trecute la 3,125, 12,5, 50 şi 200 nM.

Figura 108 Determinarea rezonanţei plasmonului de suprafaţă a afinităţii CD3. Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. CD3δε-Fc de maimuţă Cynomolgus (Sino Biological) a fost legată covalent de suprafaţa cipului. Articolele testate au fost trecute la 3,125, 12,5, 50 şi 200 nM.

Figura 109 Determinarea rezonanţei plasmonului de suprafaţă a afinităţii CD3. Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. CD3δε-Fc uman (Sino Biological) a fost legat covalent de suprafaţa cipului. Articolele testate au fost trecute la 31,25, 125, 500 şi 2000 nM.

Figura 110 Determinarea rezonanţei plasmonului de suprafaţă a afinităţii CD3. Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. CD3δε-Fc de maimuţă Cynomolgus (Sino Biological) a fost legată covalent de suprafaţa cipului. Articolele testate au fost trecute la 31,25, 125, 500 şi 2000 nM.

Figura 111 Determinarea rezonanţei plasmonului de suprafaţă a afinităţii CD3. Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. CD3δε-Fc de maimuţă Cynomolgus (Sino Biological) a fost legată covalent de suprafaţa cipului. Articolele testate au fost trecute la 31,25, 125, 500 şi 2000 nM.

Figura 112 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, incubare de 24 de ore, 10k celule Ramos, 250k PBMC. Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. Detectarea a fost efectuată prin LDH.

Figura 113 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, incubare de 24 de ore, 20k celule Jeko, 200k PBMC (epuizate de CD19). Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. Detectarea s-a făcut prin citometrie în flux, în mod specific dispariţia celulelor CD19+

Figura 114 Producerea de IL-6 după 24 de ore pentru experimentul descris în Figura 113.

Figura 115 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, 5 ore de incubare, 20k celule Jeko, 500k PBMC (CD19-epuizat). Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1L1) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. Detectarea s-a făcut prin citometrie în flux, în mod specific dispariţia celulelor CD19+

Figura 116 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, incubare de 24 de ore, 20k celule Jeko, 500k PBMC (CD19-epuizat). Articolele de testare sunt anti-CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) x anti-CD3 Fab-scFv-Fc-uri. Detectarea s-a făcut prin citometrie în flux, în mod specific dispariţia celulelor CD19+

Figura 117 Producerea de IL-6 după 24 de ore pentru experimentul descris în Figura 113.

Figura 118 Test de citotoxicitate a celulelor T redirecţionate, incubare 24 de ore, 10k celule RPMI8226, 500k PBMC. Articolele de testare sunt anti-CD38 (OKT10_H1L1, OKT10_H1.77_L1.24) x anti-CD3 Fab-scFv-Fcs. Detectarea a fost efectuată prin LDH.

Figura 119 Studiul de epuizare a Ig huPBL-SCID. Articolele testate au fost dozate la 1 şi 8 zile după grefarea de PBMC la 5 mg/kg. Calea de administrare a fost intraperitoneală. Probele de sânge au fost prelevate la 14 zile după grefarea PBMC, prelucrate în ser şi testate pentru IgM şi IgG2 umane.

Figura 120 Studiul de epuizare a Ig huPBL-SCID. Articolele testate au fost dozate la 8 zile după grefarea de PBMC la 0,03, 0,3 sau 3 mg/kg. Calea de administrare a fost intraperitoneală. Probele de sânge au fost prelevate la 14 zile după grefarea PBMC, prelucrate în ser şi testate pentru IgM şi IgG2 umane.

Figura 121 descrie secvenţele de High CD20 C2B8_H1.202_L1.113.

Figura 122 descrie secvenţele de Low CD20 C2B8_H1L1.

Figura 123 descrie secvenţele de CD123 7G3_H1.109_L1.57.

Figura 124 prezintă o matrice de combinaţii posibile pentru invenţie. Un "A" înseamnă că CDR-urile secvenţelor CD3 la care se face referinţă pot fi combinate cu CDR-urile de TTA din partea dreaptă. Adică, vhCDR-urile din secvenţa variabilă a lanţului greu CD3 H1.30 şi vlCDR-urile din secvenţa variabilă a lanţului uşor CD3 L1.57 pot fi combinate cu vhCDR-urile din secvenţa CD38 OKT10 H1.77 şi vlCDR-urile din secvenţa OKT10L1.24. Un "B" înseamnă că CDR-urile din constructele CD3 pot fi combinate cu domeniile variabile grele şi uşoare din TTA. Adică, vhCDR-urile din secvenţa variabilă a lanţului greu CD3 H1.30 şi vlCDR-urile din secvenţa variabilă a lanţului uşor CD3 L1.57 pot fi combinate cu secvenţa variabilă a domeniului greu CD38 OKT10 H1.77 şi secvenţa OKT10L1.24. Un "C" este inversat, astfel încât domeniul greu variabil şi domeniul uşor variabil din secvenţele CD3 sunt utilizate cu CDR-urile din TTA-uri. Un "D" este situaţia în care sunt combinate atât lanţurile grele variabile cât şi cele uşoare variabile din fiecare. Un "E" este situaţia în care scFv-ul din CD3 este utilizat cu CDR-urile din TTA, iar un "F" este situaţia în care scFv-ul din CD3 este utilizat cu domeniile grele variabile şi uşoare variabile ale domeniului de legare la antigen din TTA.

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

I. Definiţii

Pentru ca cererea să poată fi înţeleasă mai complet, mai jos sunt prezentate mai multe definiţii. Astfel de definiţii sunt menite să cuprindă echivalente gramaticale.

Prin "ablaţie" în lucrarea de faţă se înţelege o reducere sau anulare a activităţii. Astfel, de exemplu, "ablaţia legării FcγR " înseamnă că varianta de aminoacizi a regiunii Fc are mai puţin de 50% din legarea iniţială în comparaţie cu o regiune Fc care nu conţine varianta specifică, iar o pierdere mai mică de 70-80-90-95-98% din activitate este preferată şi, în general, activitatea fiind sub nivelul de legare detectabilă într-un test Biacore. De o utilitare deosebită în ablaţia legării FcyR sunt cele prezentate în Figura 16.

Prin "ADCC" sau "citotoxicitate mediată de celule dependentă de anticorpi", aşa cum se utilizează în lucrarea de faţă, se înţelege reacţia mediată de celule în care celule citotoxice nespecifice care exprimă FcγR recunosc anticorpul legat pe o celulă ţintă şi ulterior determină liza celulei ţintă. ADCC este corelată cu legarea la FcγRIIIa; legarea crescută la FcγRIIIa duce la o creştere a activităţii ADCC.

Prin "ADCP" sau fagocitoză mediată de celule dependentă de anticorpi, aşa cum este utilizată în lucrarea de faţă, se înţelege reacţia mediată de celule în care celule citotoxice nespecifice care exprimă FcγR recunosc anticorpul legat pe o celulă ţintă şi ulterior determină fagocitoza celulei ţintă.

Prin "modificare" în lucrarea de faţă se înţelege o substituţie, inserţie şi/sau deleţie de aminoacizi într-o secvenţă polipeptidică sau o modificare a unui fragment legat chimic de o proteină. De exemplu, o modificare poate fi un carbohidrat modificat sau o structură PEG ataşată la o proteină. Prin "modificare a aminoacizilor" în lucrarea de faţă se înţelege o substituţie, inserţie şi/sau deleţie de aminoacizi într-o secvenţă polipeptidică. Pentru claritate, dacă nu se specifică altfel, modificarea aminoacizilor este întotdeauna la un aminoacid codificat de ADN, de exemplu cei 20 de aminoacizi care au codoni în ADN şi ARN.

Prin "substituţie de aminoacizi" sau "substituţie" în lucrarea de faţă se înţelege înlocuirea unui aminoacid într-o poziţie particulară într-o secvenţă de polipeptidă mamă cu un aminoacid diferit. În special, în unele variante de realizare, substituţia se face la un aminoacid care nu apare în mod natural la o anumită poziţie, fie că nu apare în mod natural în organism sau în niciun organism. De exemplu, substituţia E272Y se referă la o variantă de polipeptidă, în acest caz o variantă de Fc, în care acidul glutamic din poziţia 272 este înlocuit cu tirozină. Pentru claritate, o proteină care a fost proiectată pentru a schimba secvenţa de codificare a acidului nucleic, dar nu pentru a schimba aminoacidul iniţial (de exemplu schimbarea CGG (codificând arginina) în CGA (la fel codificând arginina) pentru a creşte nivelurile de exprimare ale organismului gazdă) nu este o "substituţie de aminoacizi"; adică, în ciuda creării unei noi gene care codifică aceeaşi proteină, dacă proteina are acelaşi aminoacid în poziţia particulară cu care a început, aceasta nu este o substituţie de aminoacizi.

Prin "inserţie de aminoacizi" sau "inserţie" aşa cum se utilizează în lucrarea de faţă se înţelege adăugarea unei secvenţe de aminoacizi la o poziţie particulară într-o secvenţă de polipeptidă mamă. De exemplu, -233E sau 233E desemnează o inserţie de acid glutamic după poziţia 233 şi înainte de poziţia 234. În plus, -233ADE sau A233ADE desemnează o inserţie de AlaAspGlu după poziţia 233 şi înainte de poziţia 234.

Prin "deleţia de aminoacizi" sau "deleţie" aşa cum se utilizează în lucrarea de faţă se înţelege îndepărtarea unei secvenţe de aminoacizi într-o poziţie particulară într-o secvenţă de polipeptidă mamă. De exemplu, E233- sau E233# sau E233() desemnează o deleţie a acidului glutamic în poziţia 233. În plus, EDA233- sau EDA233# desemnează o deleţie a secvenţei GluAspAla care începe la poziţia 233.

Prin "variantă de proteină" sau "proteină variantă", sau "variantă" aşa cum se utilizează în lucrarea de faţă se înţelege o proteină care diferă de cea a unei proteine mamă în virtutea a cel puţin unei modificări de aminoacid. Varianta de proteină se poate referi la proteina însăşi, la o compoziţie cuprinzând proteina sau la secvenţa de aminoacid care o codifică. De preferinţă, varianta de proteină are cel puţin o modificare de aminoacid în comparaţie cu proteina mamă, de exemplu de la aproximativ una până la aproximativ şaptezeci de modificări de aminoacizi şi, de preferinţă, de la aproximativ una până la aproximativ cinci modificări de aminoacizi în comparaţie cu cea mamă. Aşa cum este descris mai jos, în unele variante de realizare, polipeptida mamă, de exemplu o polipeptidă Fc mamă, este o secvenţă umană de tip sălbatic, cum ar fi regiunea Fc de la IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4, deşi secvenţele umane cu variante pot servi şi ele ca "polipeptide mamă", de exemplu IgG1/2 hibrid din Figura 19. Secvenţa variantei de proteină în lucrarea de faţă va avea, de preferinţă, cel puţin aproximativ 80% identitate cu o secvenţă de proteină mamă şi, cel mai preferabil, cel puţin aproximativ 90% identitate, mai preferabil cel puţin aproximativ 95-98-99% identitate. Varianta de proteină se poate referi la varianta de proteină în sine, compoziţii care cuprind varianta de proteină sau secvenţa ADN care o codifică. În consecinţă, prin "variantă de anticorp" sau "anticorp variantă" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege un anticorp care diferă de un anticorp mamă ca urmare a cel puţin unei modificări de aminoacizi, "variantă de IgG" sau "IgG variantă" aşa cum se utilizează în lucrarea de faţă este un anticorp care diferă de o IgG mamă (din nou, în multe cazuri, de o secvenţă IgG umană) în virtutea a cel puţin unei modificări de aminoacizi şi "varianta de imunoglobulină" sau "imunoglobulină variantă» aşa cum este utilizată în lucrarea de faţă înseamnă o secvenţă de imunoglobulină care diferă de cea a unei secvenţe de imunoglobulină mamă ca urmare a cel puţin unei modificări de aminoacizi. "Varianta de Fc" sau "Fc variantă" aşa cum este utilizată în lucrarea de faţă înseamnă o proteină care cuprinde o modificare de aminoacizi într-un domeniu Fc. Variantele de Fc ale prezentei invenţii sunt definite în funcţie de modificările de aminoacizi care le compun. Astfel, de exemplu, N434S sau 434S este o variantă de Fc cu substituţia serinei de la poziţia 434 în raport cu polipeptida Fc mamă, în care numerotarea este conform indexului UE. De asemenea, M428L/N434S defineşte o variantă de Fc cu substituţiile M428L şi N434S faţă de polipeptida Fc mamă. Identitatea aminoacidului WT poate fi nespecificată, caz în care varianta menţionată mai sus este denumită 428L/434S. Se observă că ordinea în care sunt furnizate substituţii este arbitrară, adică, de exemplu, 428L/434S este aceeaşi variantă de Fc ca şi M428L/N434S şi aşa mai departe. Pentru toate poziţiile discutate în prezenta invenţie care se referă la anticorpi, cu excepţia cazului în care se menţionează altfel, numerotarea poziţiei aminoacizilor este conform indexului UE. Indexul UE sau indexul UE al lui Kabat sau schema de numerotare UE se referă la numerotarea anticorpului UE (Edelman şi colab., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85). Modificarea poate fi o adiţie, deleţie sau substituţie. Substituţiile pot include aminoacizi naturali şi, în unele cazuri, aminoacizi sintetici. Exemplele includ Brevetul SUA Nr. 6.586.207; WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin şi colab., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin şi colab., (2002). PICAS United States of America 99:11020-11024; şi L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10.

Aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă, "proteină» în lucrarea de faţă înseamnă cel puţin doi aminoacizi ataşaţi covalent, care include proteine, polipeptide, oligopeptide şi peptide. Gruparea peptidil poate cuprinde aminoacizi şi legături peptidice naturale sau structuri peptidomimetice sintetice, adică "analogi», cum ar fi peptoizi (see Simon şi colab, PNAS USA 89(20):9367 (1992)). Aminoacizii pot fi naturali sau sintetici (de exemplu, nu un aminoacid codificat de ADN); aşa cum va fi cunoscut de cei din domeniu. De exemplu, homo-fenilalanina, citrulina, ornitina şi noreleucina sunt consideraţi aminoacizi sintetici pentru scopul invenţiei şi pot fi utilizaţi aminoacizi cu configuraţia atât D- cât şi L- (R sau S). Variantele conform prezentei invenţii pot cuprinde modificări care includ utilizarea aminoacizilor sintetici încorporaţi utilizând, de exemplu, tehnologiile dezvoltate de Schultz şi colegii săi, incluzând fără să se limiteze la metodele descrise de Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson şi colab., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71, Zhang şi colab., 2003, 303(5656):371-3, and Chin şi colab., 2003, Science 301(5635):964-7.

În plus, polipeptidele pot include derivatizarea sintetică a unuia sau mai multor lanţuri laterale sau terminaţii, glicozilare, PEGilare, permutare circulară, ciclizare, linkeri la alte molecule, fuziune cu proteine sau domenii proteice şi adăugarea de etichete peptidice sau marcaje.

Prin "reziduu", aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă, se înţelege o poziţie într-o proteină şi identitatea sa de aminoacid asociată. De exemplu, Asparagină 297 (denumită şi Asn297 sau N297) este un reziduu la poziţia 297 în anticorpul uman IgG1.

Prin "Fab" sau "regiune Fab", aşa cum este utilizată în lucrarea de faţă, se înţelege polipeptida care cuprinde domeniile de imunoglobulină VH, CH1, VL şi CL. Fab se poate referi la această regiune în mod izolat sau la această regiune în contextul unui anticorp cu lungime completă, fragment de anticorp sau proteină de fuziune Fab. Prin "Fv" sau "fragment Fv" sau "regiune Fv" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege o polipeptidă care cuprinde domeniile VL şi VH ale unui singur anticorp. După cum va fi apreciat de cei din domeniu, acestea sunt în general alcătuite din două lanţuri.

Prin "modificare a subclasei de IgG" sau "modificare a izotipului" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege o modificare a aminoacizilor care transformă un aminoacid dintr-un izotip de IgG în aminoacidul corespunzător dintr-un izotip de IgG diferit, aliniat. De exemplu, deoarece IgG1 cuprinde o tirozină şi IgG2 o fenilalanină la poziţia UE 296, o substituţie F296Y în IgG2 este considerată o modificare a subclasei de IgG.

Prin "modificare non-naturală", aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă, se înţelege o modificare a aminoacizilor care nu este izotipică. De exemplu, deoarece niciuna dintre IgG nu conţine o serină la poziţia 434, substituţia 434S în IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4 (sau hibrizii acestora) este considerată o modificare non-naturală.

Prin "aminoacid" şi "identitate de aminoacizi" aşa cum se utilizează în lucrarea de faţă se înţelege unul dintre cei 20 de aminoacizi naturali care sunt codificaţi de ADN şi ARN.

Prin "funcţie efectoare" aşa cum este utilizată în lucrarea de faţă se înţelege un eveniment biochimic care rezultă din interacţiunea unei regiuni Fc a anticorpului cu un receptor sau ligand de Fc. Funcţiile efectoare includ, dar nu sunt limitate la, ADCC, ADCP şi CDC.

Prin "ligand de Fc de IgG" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege o moleculă, de preferinţă o polipeptidă, de la orice organism care se leagă de regiunea Fc a unui anticorp IgG pentru a forma un complex Fc/ligand de Fc. Liganzii de Fc includ, dar fără să se limiteze la, FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcγRn, C1q, C3, lectină cu legare la manan, receptorul de manoză, proteina stafilococică A, proteina streptococică G şi FcγR viral. Liganzii de Fc includ, de asemenea, omologii receptorilor de Fc (FcRH), care sunt o familie de receptori de Fc care sunt omologi la FcγRs (Davis şi colab., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Liganzii de Fc pot include molecule nedescoperite care se leagă la Fc. Liganzi de Fc de IgC particulari sunt FcRn şi receptori de Fc gamma. Prin "ligand de Fc" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege o moleculă, de preferinţă o polipeptidă, de la orice organism care se leagă de regiunea Fc a unui anticorp pentru a forma un complex Fc/ligand de Fc.

Prin "receptor de Fc gamma", "FcγR" sau "FcqammaR" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege orice membru al familiei de proteine care se leagă la regiunea Fc a anticorpului IgG şi este codificat de o genă FcγR. La om, această familie include, dar fără să se limiteze la, FcγRI (CD64), incluzând izoforme FcγRIa, FcγRIb şi FcγRIc; FcγRII (CD32), incluzând izoforme FcγRIIa (inclusiv alotipurile H131 şi R131), FcγRIIb (inclusiv FcγRIIb-1 şi FcγRIIb-2) şi FcγRIIc; şi FcγRIII (CD16), inclusiv izoformele FcγRIIIa (inclusiv alotipurile V158 şi F158) şi FcγRIIIb (inclusiv alotipurile FcγRIIb-NA1 şi FcγRIIb-NA2) (Jefferis şi colab., 2002, Immunol Lett 82: 57-65), precum şi orice FcγR-uri sau izoforme sau alotipuri deFcγR umane nedescoperite. Un FcγR poate proveni de la orice organism, incluzând dar fără a se limita la acestea, oameni, şoareci, şobolani, iepuri şi maimuţe. FcγR-urile de şoarece includ, dar fără să se limiteze la, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) şi FcγRIII-2 (CD16-2), precum şi orice FcγR-uri sau izoforme sau alotipuri de FcγR de şoarece nediscoperite.

Prin "FcRn" sau "receptor de Fc neonatal" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege o proteină care se leagă la regiunea Fc a anticorpului IgG şi este codificată cel puţin parţial de o genă FcRn. FcRn poate proveni din orice organism, incluzând dar fără a se limita la acestea, oameni, şoareci, şobolani, iepuri şi maimuţe. După cum se ştie în domeniu, proteina funcţională FcRn cuprinde două polipeptide, adesea denumite lanţul greu şi lanţul uşor. Lanţul uşor este beta-2-microglobulină, iar lanţul greu este codificat de gena FcRn. Dacă nu se specifică altfel în lucrarea de faţă, FcRn sau o proteină FcRn se referă la complexul de lanţ greu de FcRn cu beta-2-microglobulină. O varietate de variante de FcRn utilizate pentru a creşte legarea la receptorul FcRn şi, în unele cazuri, pentru a creşte timpul de înjumătăţire plasmatică, sunt prezentate în Legenda Figurii din Figura 83.

Prin "polipeptidă mamă" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege o polipeptidă iniţială care este modificată ulterior pentru a genera o variantă. Polipeptida mamă poate fi o polipeptidă naturală sau o variantă sau o versiune prelucrată a unei polipeptide naturale. Polipeptida mamă se poate referi la polipeptida însăşi, compoziţii care cuprind polipeptida mamă sau secvenţa de aminoacizi care o codifică. În consecinţă, prin "imunoglobulină mamă" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege o polipeptidă imunoglobulină nemodificată care este modificată pentru a genera o variantă, şi prin "anticorp mamă» aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege un anticorp nemodificat care este modificat pentru a genera o variantă de anticorp. Trebuie remarcat faptul că "anticorpul mamă" include anticorpi comerciali cunoscuţi, produşi prin recombinare, aşa cum este prezentat mai jos.

Prin "Fc" sau "regiune Fc" sau "domeniu Fc" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege polipeptida care cuprinde regiunea constantă a unui anticorp, excluzând primul domeniu de imunoglobulină de regiune constantă şi, în unele cazuri, o parte a balamalei. Astfel, Fc se referă la ultimele două domenii de imunoglobulină de regiune constantă de IgA, IgD şi IgG, ultimele trei domenii de imunoglobulină de regiune constantă de IgE şi IgM şi balama flexibilă N-terminală la aceste domenii. Pentru IgA şi IgM, Fc poate include lanţul J. Pentru IgG, domeniul Fc cuprinde domeniile de imunoglobulină Cγ2 şi Cγ3 (Cγ2 şi Cγ3) şi regiunea balama inferioară între Cγ1 (Cγ1) şi Cγ2 (Cγ2). Deşi limitele regiunii Fc pot varia, regiunea Fc a lanţului greu de IgG umană este de obicei definită încât să includă reziduurile C226 sau P230 până la capătul său carboxil-terminal, în care numerotarea este conform indexului UE al lui Kabat. În unele variante de realizare, aşa cum este descris mai complet mai jos, se fac modificări ale aminoacizilor în regiunea Fc, de exemplu pentru a modifica legarea la unul sau mai mulţi receptori FcγR sau la receptorul FcRn.

Prin "regiune constantă grea" în lucrarea de faţă se înţelege porţiunea CH1-balama-CH2-CH3 a unui anticorp.

Prin "proteină de fuziune de Fc" sau "imunoadezină" în lucrarea de faţă se înţelege o proteină care cuprinde o regiune Fc, în general legată (opţional printr-un fragment linker, aşa cum este descris aici) la o proteină diferită, cum ar fi un fragment de legare la o proteină ţintă, aşa cum este descris aici. În unele cazuri, un monomer al anticorpului heterodimeric cuprinde un lanţ greu de anticorp (fie incluzând un scFv sau incluzând în plus un lanţ uşor), iar celălalt monomer este o fuziune de Fc, cuprinzând un domeniu Fc variantă şi un ligand. În unele variante de realizare, aceste entităţi "jumătate anticorp-jumătate proteină de fuziune" sunt denumite "Fuziocorpi".

Prin "poziţie" aşa cum este utilizată în lucrarea de faţă se înţelege o locaţie în secvenţa unei proteine. Poziţiile pot fi numerotate secvenţial sau în conformitate cu un format stabilit, de exemplu, indexul UE pentru numerotarea anticorpilor.

Prin "antigen ţintă" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege molecula care este legată în mod specific de regiunea variabilă a unui anticorp dat. Un antigen ţintă poate fi o proteină, carbohidrat, lipidă sau alt compus chimic. Un număr mare de antigene ţintă adecvate sunt descrise mai jos.

Prin "cateneitate" în contextul monomerilor anticorpilor heterodimerici conform invenţiei în lucrarea de faţă se înţelege că, similar celor două catene de ADN care se "potrivesc", variante de heterodimerizare sunt încorporate în fiecare monomer pentru a păstra capacitatea de "a se potrivi" pentru a forma heterodimeri. De exemplu, dacă unele variante de pI sunt prelucrate în monomer A (de exemplu, determinând creşterea pI), atunci variantele sterice care sunt "perechi de încărcare" care pot fi utilizate, de asemenea, nu interferează cu variantele de pI, de exemplu, variantele de încărcare care determină un pI mai mare sunt puse pe aceeaşi "catenă" sau "monomer" pentru a păstra ambele funcţionalităţi. În mod similar, pentru variantele "asimetrice" care vin în perechi dintr-un set aşa cum este prezentat mai detaliat mai jos, specialistul în domeniu va lua în considerare pI pentru a decide în ce catenă sau monomer care încorporează un set de pereche va merge, astfel încât separarea pI să fie maximizată folosind pI al celor asimetrice, de asemenea.

Prin "celulă ţintă" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege o celulă care exprimă un antigen ţintă.

Prin "regiune variabilă" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se înţelege regiunea unei imunoglobuline care cuprinde unul sau mai multe domenii Ig substanţial codificate de oricare dintre genele V.kappa., V.lamda şi/sau VH care alcătuiesc, respectiv, locusurile genetice ale imunoglobulinei de lanţ kappa, lambda şi greu.

Prin "tip sălbatic sau WT" în lucrarea de faţă se înţelege o secvenţă de aminoacizi sau o secvenţă de nucleotide care se găseşte în natură, incluzând variaţii alelice. O proteină WT are o secvenţă de aminoacizi sau o secvenţă de nucleotide care nu a fost modificată intenţionat.

Anticorpii conform prezentei invenţii sunt în general izolaţi sau recombinaţi. "Izolat", atunci când este utilizat pentru a descrie diferitele polipeptide dezvăluite în lucrarea de faţă, înseamnă o polipeptidă care a fost identificată şi separată şi/sau recuperată dintr-o celulă sau cultură celulară din care ea a fost exprimată. De obicei, o polipeptidă izolată va fi preparată prin cel puţin o etapă de purificare. Un "anticorp izolat" se referă la un anticorp care este substanţial lipsit de alţi anticorpi având specificităţi antigenice diferite. "Recombinat" înseamnă că anticorpii sunt generaţi folosind tehnici de acid nucleic recombinat în celule gazdă exogene.

"Legare specifică" sau "se leagă în mod specific la" sau este "specifică pentru" un anumit antigen sau un epitop înseamnă legare care este diferită măsurabil de o interacţiune nespecifică. Legarea specifică poate fi măsurată, de exemplu, prin determinarea legării unei molecule în comparaţie cu legarea unei molecule martor, care, în general, este o moleculă cu structură similară care nu are activitate de legare. De exemplu, legarea specifică poate fi determinată de competiţia cu o moleculă martor care este similară cu ţinta.

Legarea specifică pentru un anumit antigen sau un epitop poate fi prezentată, de exemplu, de un anticorp care are o KD pentru un antigen sau epitop de cel puţin aproximativ 10-4 M, cel puţin aproximativ 10-5 M, cel puţin aproximativ 10-6 M, cel puţin aproximativ 10-7 M, cel puţin aproximativ 10-8 M, cel puţin aproximativ 10-9 M, în mod alternativ cel puţin aproximativ 10-10 M, cel puţin aproximativ 10-11 M, cel puţin aproximativ 10-12 M sau mai mare, în care KD se referă la o rată de disociere a unei interacţiuni particulare anticorp-antigen. De obicei, un anticorp care se leagă în mod specific la un antigen va avea o KD care este de 20, 50, 100, 500, 1000, 5.000, 10.000 sau de mai multe ori mai mare pentru o moleculă martor în raport cu antigenul sau epitopul.

De asemenea, legarea specifică pentru un anumit antigen sau un epitop poate fi prezentată, de exemplu, de către un anticorp având un KA sau Ka pentru un antigen sau epitop de cel puţin 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5.000 -, 10.000 sau de mai multe ori mai mare pentru epitop în raport cu un martor, unde KA sau Ka se referă la o rată de asociere a unei interacţiuni particulare anticorp-antigen.

II Prezentare generală

Anticorpi bispecifici care co-cuplează CD3 şi un antigen tumoral ţintă au fost proiectaţi şi utilizaţi pentru a redirecţiona celulele T pentru a ataca şi a liza celule tumorale ţintă. Exemplele includ formatele BiTE şi DART, care cuplează în mod monovalent CD3 şi un antigen tumoral. Deşi abordarea ţintirii CD3 a arătat o promisiune considerabilă, un efect secundar comun al acestor terapii este producţia asociată de citokine, care duce adesea la sindromul de eliberare a citokinelor toxice. Deoarece domeniul de legare anti-CD3 al anticorpului bispecific se cuplează cu toate celulele T, este recrutat subsetul de celule T CD4 producătoare de citokine. Mai mult, subsetul de celule T CD4 include celule T reglatoare, a căror recrutare şi înmulţire pot duce potenţial la inhibarea imunităţii şi pot avea un impact negativ asupra inhibării tumorilor pe termen lung. În plus, aceste formate nu conţin domenii Fc şi prezintă perioade de înjumătăţire plasmatică foarte scurte la pacienţi.

Deşi abordarea ţintirii CD3 a arătat o promisiune considerabilă, un efect secundar comun al acestor terapii este producţia asociată de citokine, care duce adesea la sindromul de eliberare a citokinelor toxice. Deoarece domeniul de legare anti-CD3 al anticorpului bispecific se cuplează cu toate celulele T, este recrutat subsetul de celule T CD4 producătoare de citokine. Mai mult, subsetul de celule T CD4 include celule T reglatoare, a căror recrutare şi înmulţire pot duce potenţial la inhibarea imunităţii şi pot avea un impact negativ asupra inhibării tumorilor pe termen lung. O astfel de cale posibilă de a reduce producţia de citokine şi, eventual, de a reduce activarea celulelor T CD4 este prin reducerea afinităţii domeniului anti-CD3 pentru CD3.

În consecinţă, în unele variante de realizare, prezenta invenţie furnizează constructe de anticorpi cuprinzând domenii de legare la antigen anti-CD3 care sunt lianţi "puternici" sau "cu afinitate ridicată" la CD3 (de exemplu, un exemplu sunt domenii variabile grele şi uşoare, reprezentate ca H1.30_L1.47 (opţional incluzând un linker încărcat, după caz)) şi, de asemenea, se leagă la CD38. În alte variante de realizare, prezenta invenţie furnizează constructe de anticorpi cuprinzând domenii de legare la antigen anti-CD3 care sunt lianţi "slabi" sau "cu afinitate inferioară" la CD3. Variante de realizare suplimentare furnizează constructe de anticorpi cuprinzând domenii de legare la antigen anti-CD3 care au afinitate intermediară sau "medie" la CD3 care se leagă şi la CD38.

Ar trebui apreciat faptul că secvenţele de anti-CD3 "ridicată, medie, scăzută" conform prezentei invenţii pot fi utilizate într-o varietate de formate de heterodimerizare. În timp ce majoritatea dezvăluirii din lucrarea de faţă foloseşte formatul "deschizător de sticle" al heterodimerilor, aceste secvenţe variabile grele şi uşoare, precum şi secvenţele scFv (şi secvenţele Fab care cuprind aceste secvenţe variabile grele şi uşoare) pot fi utilizate în alte formate, precum cele descrise în Figura 2 din Publicaţia WO Nr. 2014/145806.

În consecinţă, prezenta descriere furnizează anticorpi heterodimerici care se leagă la două antigene diferite, de exemplu anticorpii sunt "bispecifici", prin aceea că ei se leagă la două antigene ţintă diferite, în general ţintesc antigene tumorale (TTA-uri) aşa cum este descris mai jos. Aceşti anticorpi heterodimerici se pot lega la aceste antigene ţintă fie în mod monovalent (de exemplu, există un singur domeniu de legare la antigen, cum ar fi o pereche de domenii grele variabile şi uşoare variabile), sau în mod bivalent (există două domenii de legare la antigen care se leagă fiecare independent la antigen). Anticorpii heterodimerici conform invenţiei se bazează pe utilizarea de diferiţi monomeri care conţin substituţii de aminoacizi care "asmimetrizează" formarea heterodimerilor peste homodimeri, aşa cum este prezentat mai complet mai jos, cuplat cu "variante de PI" care permit purificarea simplă a heterodimerilor departe de homodimeri, aşa cum este prezentat în mod similar mai jos. Pentru anticorpii bispecifici heterodimerici conform invenţiei, prezenta invenţie se bazează în general pe utilizarea domeniilor Fc prelucrate sau variante care se pot auto-asambla în celulele de producţie pentru a produce proteine heterodimerice, şi pe metode pentru a genera şi purifica astfel de proteine heterodimerice. III. Anticorpi

Prezenta dezvăluire se referă la generarea de anticorpi bispecifici care se leagă la două antigene diferite, de exemplu CD3 şi un antigen tumoral ţintă cum ar fi CD20, CD38 şi CD123, şi sunt în general anticorpi terapeutici. După cum este discutat mai jos, termenul "anticorp" este utilizat în modul general. Anticorpii care se folosesc în prezenta invenţie pot avea mai multe formate aşa cum este descris aici, incluzând anticorpi tradiţionali precum şi derivaţi de anticorpi, fragmente şi mimetice, descrise în lucrarea de faţă.

Unităţile structurale tradiţionale ale anticorpilor cuprind în mod tipic un tetramer. Fiecare tetramer este de obicei compus din două perechi identice de lanţuri polipeptidice, fiecare pereche având un lanţ "uşor" (de obicei având o masă moleculară de aproximativ 25 kDa) şi un lanţ "greu" (de obicei având o masă moleculară de aproximativ 50-70 kDa). Lanţurile uşoare umane sunt clasificate ca lanţuri uşoare kappa şi lambda. Prezenta dezvăluire se referă la clasa IgG, care are mai multe subclase, incluzând, fără să se limiteze la, IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4. Astfel, "izotip" aşa cum este utilizat în lucrarea de faţă se referă la oricare dintre subclasele de imunoglobuline definite prin caracteristicile chimice şi antigenice ale regiunilor lor constante. Ar trebui să se înţeleagă că anticorpii terapeutici pot cuprinde, de asemenea, hibrizi de izotipuri şi/sau subclase. De exemplu, aşa cum se arată în Publicaţia US 2009/0163699, prezenta invenţie înglobează prelucrarea de pI a hibrizilor IgG1/G2.

Porţiunea amino-terminală a fiecărui lanţ include o regiune variabilă de aproximativ 100 până la 110 sau mai mulţi aminoacizi responsabilă în principal de recunoaşterea antigenului, la care se face referire în general în domeniu şi în lucrarea de faţă ca "domeniul Fv" sau "regiunea Fv". În regiunea variabilă, sunt reunite trei bucle pentru fiecare dintre domeniile V ale lanţului greu şi ale lanţului uşor pentru a forma un situs de legare la antigen. Fiecare dintre bucle este denumită ca o regiune de determinare a complementarităţii (denumită în continuare "CDR"), în care variaţia în secvenţa de aminoacizi este cea mai semnificativă. "Variabilă" se referă la faptul că anumite segmente ale regiunii variabile diferă foarte mult ca secvenţă între anticorpi. Variabilitatea în cadrul regiunii variabile nu este distribuită uniform. În schimb, regiunile V constau din întinderi relativ invariabile numite regiuni cadru (FR) de 15-30 de aminoacizi separate de regiuni mai scurte cu variabilitate extremă numite "regiuni hipervariabile", care sunt fiecare de 9-15 aminoacizi în lungime sau mai lungi.

Fiecare VH şi VL este compus din trei regiuni hipervariabile ("regiuni de determinare a complementarităţii", "CDR") şi patru FR-uri, dispuse de la capătul amino-terminal către capătul carboxi-terminal în următoarea ordine: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Regiunea hipervariabilă cuprinde în general reziduuri de aminoacizi de la aproximativ reziduurile de aminoacizi 24-34 (LCDR1; "L" înseamnă lanţ uşor), 50-56 (LCDR2) şi 89-97 (LCDR3) în regiunea variabilă a lanţului uşor şi aproximativ 31 -35B (HCDR1; "H" înseamnă lanţ greu), 50-65 (HCDR2) şi 95-102 (HCDR3) în regiunea variabilă a lanţului greu; Kabat şi colab., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Ediţia a 5-a. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. '\(1991) şi/sau acele reziduuri care formează o buclă hipervariabilă (de exemplu, reziduurile 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) şi 91-96 (LCDR3) în regiunea variabilă a lanţului uşor şi 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) şi 96-101 (HCDR3) din regiunea variabilă a lanţului greu; Chothia şi Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917. CDR-uri specifice conform invenţiei sunt descrise mai jos.

Pe parcursul prezentei descrieri, sistemul de numerotare Kabat este utilizat în general când se face referire la un reziduu din domeniul variabil (aproximativ, reziduurile 1-107 din regiunea variabilă a lanţului uşor şi reziduurile 1-113 din regiunea variabilă a lanţului greu) şi sistemul de numerotare UE pentru regiunile Fc (de exemplu, Kabat şi colab., supra. (1991)).

Este furnizat un număr mare de seturi de CDR diferite. În acest caz, un "set complet de CDR" cuprinde cele trei CDR-uri uşoare variabile şi cele trei CDR-uri grele variabile, de exemplu, un v1CDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 şi vhCDR3. Acestea pot face parte dintr-un domeniu uşor variabil sau greu variabil mai mare, după caz. În plus, aşa cum este prezentat mai complet în lucrarea de faţă, domeniile grele variabile şi uşoare variabile pot fi pe lanţuri polipeptidice separate, atunci când este utilizat un lanţ greu şi uşor (de exemplu, când se utilizează Fab-uri), sau pe un singur lanţ polipeptidic în cazul secvenţelor scFv.

CDR-urile contribuie la formarea situsului de legare la antigen sau, mai precis, a situsului de legare la epitop ale anticorpilor. "Epitop" se referă la un determinant care interacţionează cu un situs specific de legare la antigen din regiunea variabilă a unei molecule de anticorp cunoscută sub numele de paratop. Epitopii sunt grupări de molecule precum aminoacizi sau lanţuri laterale de zahăr şi au de obicei caracteristici structurale specifice, precum şi caracteristici de încărcare specifice. Un singur antigen poate avea mai mult de un epitop.

Epitopul poate cuprinde reziduuri de aminoacizi direct implicaţi în legare (numită şi componentă imunodominantă a epitopului) şi alte reziduuri de aminoacizi, care nu sunt direct implicaţi în legare, cum ar fi reziduuri de aminoacizi care sunt efectiv blocaţi de peptida de legare la antigen în mod specific; cu alte cuvinte, restul de aminoacid se află în amprenta peptidei de legare la antigen în mod specific.

Epitopii pot fi conformaţionali sau liniari. Un epitop conformaţional este produs din aminoacizi juxtapuşi spaţial din diferite segmente ale lanţului polipeptidic liniar. Un epitop liniar este unul produs din reziduuri de aminoacizi adiacente într-un lanţ polipeptidic. Epitopii conformaţionali şi neconformaţionali se pot diferenţia prin faptul că legarea la primul dar nu la cel din urmă se pierde în prezenţa solvenţilor de denaturare.

Un epitop include, în mod obişnuit, cel puţin 3 şi, de obicei, cel puţin 5 sau 8-10 aminoacizi într-o conformaţie spaţială unică. Anticorpii care recunosc acelaşi epitop pot fi verificaţi printr-un imuno-test simplu care arată capacitatea unui anticorp de a bloca legarea unui alt anticorp la un antigen ţintă, de exemplu "acoperire (binning)».

Porţiunea carboxi-terminală a fiecărui lanţ defineşte o regiune constantă responsabilă în primul rând de funcţia efectoare. Kabat şi colab. au colectat numeroase secvenţe primare ale regiunilor variabile ale lanţurilor grele şi ale lanţurilor uşoare. Pe baza gradului de conservare a secvenţelor, aceştia au clasificat secvenţele primare individuale în CDR şi cadru şi au făcut o listă a acestora (vezi SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, ediţia a 5-a, publicaţia NIH, nr. 91-3242, EA Kabat şi colab.).

În subclasa IgG de imunoglobuline, există mai multe domenii de imunoglobulină în lanţul greu. Prin "domeniu de imunoglobulină (Ig)" în lucrarea de faţă se înţelege o regiune a unei imunoglobuline având o structură terţiară distinctă. De interes în prezenta invenţie sunt domeniile lanţului greu, incluzând domeniile grele constante (CH) şi domeniile balama. În contextul anticorpilor IgG, izotipurile de IgG au fiecare trei regiuni CH. În consecinţă, domeniile "CH" în contextul IgG sunt după cum urmează: "CH1"se referă la poziţiile 118-220 în conformitate cu indexul UE al lui Kabat. "CH2" se referă la poziţiile 237-340 conform indexului UE ca în Kabat, iar "CH3" se referă la poziţiile 341-447 conform indexului UE al lui Kabat. Aşa cum este prezentat aici şi descris mai jos, variantele de pI pot fi în una sau mai multe dintre regiunile CH, precum şi în regiunea balama, discutate mai jos.

Trebuie remarcat faptul că secvenţele descrise în lucrarea de faţă încep la regiunea CH1, poziţia 118; regiunile variabile nu sunt incluse, cu excepţia celor menţionate. De exemplu, primul aminoacid din SEQ ID NO: 2, deşi este desemnat ca poziţia "1" în listarea secvenţei, corespunde poziţiei 118 din regiunea CH1, conform numerotării UE.

Un alt tip de domeniu Ig al lanţului greu este regiunea balama. Prin "balama" sau "regiune balama" sau "regiune balama a anticorpului" sau "regiune balama de imunoglobulină" în lucrarea de faţă se înţelege polipeptida flexibilă care cuprinde aminoacizii dintre primul şi al doilea domeniu constant ale unui anticorp. Structural, domeniul CH1 de IgG se termină la poziţia UE 220, iar domeniul CH2 de IgG începe la poziţia reziduu UE 237. Astfel, pentru IgG balamaua anticorpului este definit în lucrarea de faţă că include poziţiile 221 (D221 în IgG1) până la 236 (G236 în IgG1), în care numerotarea este în conformitate cu indexul UE precum în Kabat. În unele variante de realizare, de exemplu în contextul unei regiuni Fc, este inclusă balamaua inferioară, unde "balamaua inferioară" se referă în general la poziţiile 226 sau 230. Aşa cum s-a menţionat în lucrarea de faţă, variantele de pI pot fi făcute şi în regiunea balamalelor.

Lanţul uşor cuprinde în general două domenii, domeniul uşor variabil (care conţine CDR-urile lanţului uşor şi împreună cu domeniile grele variabile formează regiunea Fv) şi o regiune a lanţului uşor constantă (adesea denumită CL sau Cκ).

O altă regiune de interes pentru substituţii suplimentare, evidenţiată mai jos, este regiunea Fc.

Sunt furnizate diferite domenii ale anticorpilor. Aşa cum este descris aici şi este cunoscut în domeniu, anticorpii heterodimerici conform invenţiei cuprind domenii diferite în lanţurile grele şi uşoare, care pot fi suprapuse, de asemenea. Aceste domenii includ, dar nu se limitează la ele, domeniul Fc, domeniul CH1, domeniul CH2, domeniul CH3, domeniul balama, domeniul constant greu (domeniul CH1-balama-Fc sau CH1-balama-CH2-CH3), domeniul greu variabil, domeniul uşor variabil, domeniul constant uşor, domeniile FAb şi domeniile scFv.

Astfel, "domeniul Fc" include domeniul -CH2-CH3 şi, opţional, un domeniu balama. Lanţul greu cuprinde un domeniu greu variabil şi un domeniu constant, care include un domeniu balama-Fc CHI-opţional cuprinzând un CH2-CH3. Lanţul uşor cuprinde un lanţ uşor variabil şi domeniul uşor constant.

Unii anticorpi cuprind cel puţin un domeniu scFv, care, deşi nu apare în mod natural, include în general un domeniu greu variabil şi un domeniu uşor variabil, legate între ele printr-un linker scFv. Aşa cum se arată în lucrarea de faţă, există o serie de linkeri scFv adecvaţi care pot fi utilizaţi, incluzând legături peptidice tradiţionale, generaţi prin tehnici recombinante.

Peptida linker poate include predominant următoarele reziduuri de aminoacizi: Gly, Ser, Ala sau Thr. Peptida linker ar trebui să aibă o lungime care să fie adecvată pentru a lega două molecule în aşa fel încât să preia conformaţia corectă una faţă de alta, astfel încât ele să păstreze activitatea dorită. Într-o variantă de realizare, linkerul are o lungime de la aproximativ 1 până la 50 de aminoacizi, preferabil aproximativ 1 până la 30 de aminoacizi în lungime. Într-o variantă de realizare, pot fi folosiţi linkeri cu lungimea de 1 până la 20 de aminoacizi, cei de la aproximativ 5 la aproximativ 10 aminoacizi găsindu-şi utilizare în unele variante de realizare. Linkeri utili includ polimeri glicină-serină, incluzând de exemplu (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n şi (GGGS)n, unde n este un număr întreg de cel puţin unu (şi în general de la 3 la 4), polimeri glicină-alanină, polimeri alanină-serină şi alţi linkeri flexibili. Alternativ, o varietate de polimeri neproteinici, incluzând, fără să se limiteze la, polietilen glicol (PEG), polipropilen glicol, polioxialchileni sau copolimeri de polietilen glicol şi polipropilen glicol, îşi pot găsi utilizare ca linkeri, adică pot fi folosiţi ca linkeri.

Alte secvenţe linker pot include orice secvenţă cu orice lungime a domeniului CL/CH1, dar nu toate reziduurile domeniului CL/CH1; de exemplu primele 5-12 reziduuri de aminoacizi din domeniile CL/CH1. Linkerii pot fi derivaţi din lanţul uşor de imunoglobulină, de exemplu Cκ sau Cλ. Linkerii pot fi derivaţi din lanţuri grele de imunoglobulină de orice izotip, incluzând, de exemplu, Cγ1, Cy2, Cy3, Cy4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε şi Cµ. Secvenţele linker pot fi, de asemenea, derivate din alte proteine, cum ar fi proteinele Ig-like (de exemplu, TCR, FcR, KIR), secvenţe derivate din regiunea balamala şi alte secvenţe naturale din alte proteine.

Linkerul poate fi un "linker de domeniu", utilizat pentru a lega oricare două domenii aşa cum este prezentat în lucrarea de faţă împreună. Deşi se poate utiliza orice linker adecvat, multe variante de realizare utilizează un polimer glicină-serină, incluzând de exemplu (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n şi (GGGS)n, unde n este un număr întreg care este cel puţin unu (şi în general de la 3 până la 4 până la 5), precum şi orice secvenţă de peptidă care permite ataşarea prin recombinare a celor două domenii cu suficientă lungime şi flexibilitate pentru a permite fiecărui domeniu să-şi păstreze funcţia biologică. În unele cazuri, şi cu atenţie acordată "cateneităţii", aşa cum este subliniat mai jos, pot fi utilizaţi linkeri de domeniu încărcaţi, aşa cum sunt utilizaţi în unele variante de realizare a linkerilor scFv.

Linkerul scFv poate fi un linker scFv încărcat, mai mulţi dintre aceştia fiind prezentaţi în Figura 33. În consecinţă, sunt furnizaţi linkeri scFv încărcaţi, pentru a facilita separarea în pI între un prim şi un al doilea monomer. Adică, prin încorporarea unui linker scFv încărcat, fie pozitiv sau negativ (sau ambele, în cazul scaffold-urilor care utilizează scFv-uri pe monomeri diferiţi), acest lucru permite monomerului care cuprinde linkerul încărcat să modifice pI fără a face alte modificări în domeniile Fc. Aceşti linkeri încărcaţi pot fi înlocuiţi în orice linkeri standard care conţin scFv. Din nou, aşa cum va fi apreciat de persoanele de specialitate în domeniu, linkeri scFv încărcaţi sunt utilizaţi pe "catena" sau monomerul corect, în funcţie de modificările dorite în pI. De exemplu, aşa cum s-a discutat în lucrarea de faţă, pentru a obţine anticorp heterodimeric cu format F triplu, se calculează pI original al regiunii Fv pentru fiecare dintre domeniile de legare la antigen dorite şi se alege unul pentru a fabrica un scFv şi, în funcţie de pI, se aleg linkeri fie pozitiv fie inegativi.

Linkerii de domeniu încărcaţi pot fi utilizaţi şi pentru a creşte separarea de pI a monomerilor conform invenţiei şi, astfel, cei incluşi în Figura 33 pot fi utilizaţi în orice variantă de realizare a prezentei invenţii în care este utilizat un linker.

Anticorpii pot fi cu lungime completă. Prin "anticorp cu lungime completă" în lucrarea de faţă se înţelege structura care constituie forma biologică naturală a unui anticorp, incluzând regiuni variabile şi constante, incluzând una sau mai multe modificări aşa cum este prezentat în lucrarea de faţă, în special în domeniile Fc pentru a permite fie formarea prin heterodimerizare, fie purificarea heterodimerilor separat de homodimeri. Anticorpii cu lungime completă includ în general domenii Fab şi Fc şi pot conţine în plus domenii suplimentare de legare la antigen, cum ar fi scFv-uri, aşa cum este descris în general în Figuri.

Anticorpul poate fi un fragment de anticorp, atâta timp cât acesta conţine cel puţin un domeniu constant care poate fi prelucrat pentru a produce heterodimeri, cum ar fi prelucrarea la pI. Alte fragmente de anticorpi care pot fi utilizate includ fragmente care conţin unul sau mai multe domenii CH1, CH2, CH3, balama şi CL conform invenţiei care au fost prelucrate la pI. De exemplu, fuziunile de Fc sunt fuziuni ale regiunii Fc (CH2 şi CH3, opţional cu regiunea balama) fuzionate la o altă proteină. În domeniu sunt cunoscute mai multe fuziuni de Fc şi pot fi îmbunătăţite prin adăugarea variantelor de heterodimerizare ale invenţiei. În cazul de faţă, pot fi realizate fuziuni de anticorpi cuprinzând CH1; CH1, CH2 şi CH3; CH2; CH3; CH2 şi CH3; CH1 şi CH3, oricare sau toate dintre acestea pot fi realizate opţional cu regiunea balama, utilizând orice combinaţie de variante de heterodimerizare descrise în lucrarea de faţă.

În special, formatele ilustrate în Figura 1 sunt anticorpi, denumiţi de obicei "anticorpi heterodimerici", ceea ce înseamnă că proteina are cel puţin două secvenţe Fc asociate auto-asamblate într-un domeniu Fc heterodimeric.

Anticorpi himerici şi umanizaţi

Anticorpul poate fi un amestec din diferite specii, de exemplu un anticorp himeric şi/sau un anticorp umanizat. În general, atât "anticorpii himerici", cât şi "anticorpii umanizaţi" se referă la anticorpi care combină regiuni de la mai multe specii. De exemplu, "anticorpii himerici" cuprind în mod tradiţional regiune(regiuni) variabile de la un şoarece (sau şobolan, în unele cazuri) şi regiune(regiuni) constante de la un om. "Anticorpii umanizaţi" se referă, în general, la anticorpi non-umani care au avut regiuni cadru de domeniu variabil schimbate cu secvenţe regăsite în anticorpi umani. În general, într-un anticorp umanizat, întregul anticorp, cu excepţia CDR-urilor, este codificat de o polinucleotidă de origine umană sau este identic cu un astfel de anticorp, cu excepţia CDR-urilor sale. CDR-urile, care unele sau toate sunt codificate de acizi nucleici originari dintr-un organism non-uman, sunt grefate în fragmentele cadru foaie-beta ale unei regiuni variabile de anticorp uman pentru a crea un anticorp, a cărui specificitate este determinată de CDR-urile grefate. Crearea unor astfel de anticorpi este descrisă în, de exemplu, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen şi colab., 1988, Science 239: 1534-1536.

"Mutaţia înapoi" a unor reziduuri de cadru acceptor selectate la reziduurile donorului corespunzător este deseori necesară pentru a recâştiga afinitatea care se pierde în constructul grefat iniţial (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213). Anticorpul umanizat va cuprinde, deasemenea, în mod optim cel puţin o porţiune a unei regiuni constante a imunoglobulinei, în mod tipic aceea a unei imunoglobuline umane, şi astfel va cuprinde în mod tipic o regiune Fc umană. Anticorpi umanizaţi pot fi generaţi, de asemenea, folosind şoareci cu un sistem imunitar modificat genetic. Roque şi colab., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654.

O varietate de tehnici şi metode pentru umanizarea şi remodelarea anticorpilor non-umani sunt bine cunoscute în domeniu (vezi Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (SUA), şi referinţele citate în acesta).

Metodele de umanizare includ, dar fără să se limiteze la, metode descrise în Jones şi colab., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann şi colab., 1988; Nature 332: 323-329; Verhoeyen şi colab., 1988, Science, 239: 1534-1536; Queen şi colab., 1989, Proc Natl Acad Sci, SUA 86: 10029-33; He şi colab., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter şi colab., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-9, Presta şi colab., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman şi colab., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181-4185; O'Connor şi colab., 1998, Protein Eng 11:321-8.

Umanizarea sau alte metode de reducere a imunogenităţii regiunilor variabile ale anticorpilor non-umani pot include metode de refaţetare, aşa cum este descris de exemplu în Roguska şi colab., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 91:969-973.

Uneori, anticorpul mamă a fost maturizat pentru afinitate, aşa cum se cunoaşte în domeniu. Metode bazate pe structuri pot fi utilizate pentru umanizarea şi maturizarea pentru afinitate, de exemplu aşa cum este descris în US2006-0008883. Metodele bazate pe selecţie pot fi folosite pentru umanizarea şi/sau maturizarea pentru afinitate a regiunilor variabile ale anticorpului, incluzând, fără să se limiteze la, metode descrise în Wu şi colab., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca şi colab., 1997, J. Biol. Chem. 272(16): 10678-10684; Rosok şi colab., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader şi colab., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 95: 8910-8915; Krauss şi colab., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759. Alte metode de umanizare pot implica grefarea doar a unor părţi ale CDR-urilor, incluzând, dar fără a se limita la acestea, metode descrise în Tan şi colab., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis şi colab., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084.

IV. Anticorpi heterodimerici

Sunt furnizaţi anticorpi heterodimerici care se bazează pe utilizarea a două secvenţe Fc variante ale lanţului greu diferite, care se vor auto-asambla pentru a forma domenii Fc heterodimerice şi anticorpi heterodimerici.

Prezenta invenţie se referă la noi constructe pentru a furniza anticorpi heterodimerici care permit legarea la mai mult de un antigen sau ligand, de exemplu pentru a permite legarea bispecifică. Constructele anticorpilor heterodimerici se bazează pe natura auto-asamblării a celor două domenii Fc ale lanţurilor grele de anticorpi, de exemplu, doi "monomeri" care se asamblează într-un "dimer". Anticorpii heterodimerici sunt produşi prin modificarea secvenţei de aminoacizi a fiecărui monomer aşa cum este discutat mai detaliat mai jos. Astfel, prezenta invenţie este în general orientată către crearea de anticorpi heterodimerici care pot co-cupla antigene în mai multe moduri, bazându-se pe variante de aminoacizi în regiunile constante care sunt diferite pe fiecare lanţ pentru a promova formarea heterodimerică şi/sau pentru a facilita purificarea heterodimerilor faţă de homodimeri.

Sunt furnizaţi anticorpi bispecifici. O problemă încă valabilă în tehnologiile de anticorpi este dorinţa de anticorpi "bispecifici" care se leagă simultan la două antigene diferite, permiţând astfel ca antigenele diferite să fie aduse în apropiere şi determinând noi funcţionalităţi şi noi terapii. În general, aceşti anticorpi sunt produşi prin includerea genelor pentru fiecare lanţ greu şi uşor în celulele gazdă. Acest lucru duce în general la formarea heterodimerului dorit (AB), precum şi a celor doi homodimeri (AA şi BB (fără a include problemele heterodimerice ale lanţului uşor)). Cu toate acestea, un obstacol major în formarea anticorpilor bispecifici este dificultatea în purificarea anticorpilor heterodimerici separat de anticorpii homodimeri şi/sau tendinţa formării heterodimerului faţă de formarea homodimerilor.

Există o serie de mecanisme care pot fi utilizate pentru a genera heterodimeri. În plus, după cum va fi apreciat de persoanele din domeniu, aceste mecanisme pot fi combinate pentru a asigura o heterodimerizare ridicată. Astfel, variantele de aminoacizi care duc la producerea de heterodimeri sunt denumite "variante de heterodimerizare». Aşa cum s-a discutat mai jos, variantele de heterodimerizare pot include variante sterice (de exemplu, variantele "proeminenţe şi găuri" sau "asimetrice" descrise mai jos şi variantele "perechi de încărcare" descrise mai jos), precum şi "variante de pI", care permit purificarea homodimerilor separat de heterodimeri. WO2014/145806 la care se face referire în discuţia de mai jos, descrie "variante de heterodimerizare", mecanismele utile pentru heterodimerizare includ "proeminenţe şi găuri" ("KIH»; uneori în lucrarea de faţă ca variante "asimetrice" (vezi discuţia din WO2014/145806), "direcţionare electrostatică" sau "perechi de încărcare", aşa cum este descris în WO2014/145806, variante de pI descrise în WO2014/145806, şi variante de Fc suplimentare generale aşa cum este subliniat în WO2014/145806 şi mai jos.

Există mai multe mecanisme de bază care pot duce la uşurarea purificării anticorpilor heterodimeri; unul se bazează pe utilizarea variantelor de pI, astfel încât fiecare monomer să aibă un pI diferit, permiţând astfel purificarea izoelectrică a proteinelor dimerice AA, AB şi BB. Alternativ, unele formate de scaffold, cum ar fi formatul "triplu F", permit, de asemenea, separarea pe bază de mărime. Aşa cum este subliniat mai jos, este posibilă, de asemenea, "asimetrizarea" formării heterodimerilor faţă de homodimeri. Astfel, o combinaţie de variante de heterodimerizare sterice şi variante de pI sau de variante de perechi de încărcare îşi găsesc o utilizare specială în invenţie.

Sunt furnizate variante asimetrice, care încurajează formarea heterodimerizării faţă de formarea homodimerizării, împreună cu variante de pI, care cresc diferenţa de pI între cei doi monomeri.

În plus, după cum este prezentat mai complet mai jos, în funcţie de formatul anticorpului heterodimer, variantele de pI pot fi fie conţinute în domeniile constante şi/sau Fc ale unui monomer, fie pot fi utilizaţi linkeri de încărcare, fie linkeri de domeniu, fie linkeri scFv. Adică, scaffold-urile care utilizează scFv(-uri), cum ar fi formatul Triplu F, pot include linkeri scFv încărcaţi (fie pozitivi, fie negativi), care dau un plus suplimentar de pI în scopuri de purificare. Aşa cum va fi apreciat de cei din domeniu, unele formate Triplu F sunt utile doar cu linkeri scFv încărcaţi şi fără ajustări de pI suplimentare, deşi invenţia furnizează variante de pI care sunt pe unul sau ambii monomeri şi/sau linkeri de domeniu încărcaţi, de asemenea. În plus, prelucrarea suplimentară a aminoacizilor pentru funcţionalităţi alternative poate conferi, de asemenea, modificări ale pI, cum ar fi variante Fc, FcRn şi KO.

Dacă pI este utilizat ca mecanism de separare pentru a permite purificarea proteinelor heterodimerice, variante de aminoacizi pot fi introduse într-una sau ambele polipeptide monomerice; adică, pI al unuia dintre monomeri (denumit în lucrarea de faţă pentru simplitate ca "monomer A") poate fi modificat separat de monomerul B, sau ambii monomeri A şi B pot fi modificaţi, cu pI al monomerului A crescând şi pI al monomerului B micşorându-se. După cum este prezentat mai detaliat mai jos, modificările de pI ale unuia sau ale ambilor monomeri se pot face prin îndepărtarea sau adăugarea unui rest încărcat (de exemplu, un aminoacid neutru este înlocuit cu un reziduu de aminoacizi încărcat pozitiv sau negativ, de exemplu glicină în acid glutamic), schimbarea unui rest încărcat din pozitiv sau negativ într-o sarcină opusă (acid aspartic în lizină) sau schimbarea unui rest încărcat într-un rest neutru (de exemplu pierderea unei încărcări; lizină în serină.). Mai multe dintre aceste variante sunt prezentate în Figuri.

O modificare suficientă de pI în cel puţin unul dintre monomeri este creată astfel încât heterodimerii să poată fi separaţi de homodimeri. Aşa cum va fi apreciat de cei din domeniu şi aşa cum este discutat mai jos, acest lucru se poate face folosind o regiune constantă a lanţului greu "de tip sălbatic" şi o regiune variantă care a fost prelucrată fie pentru a creşte, fie pentru a reduce pI (wt A- +B sau wt A- -B), sau prin creşterea unei regiuni şi reducerea celeilalte regiuni (A+ -B- sau A- B+).

Sunt furnizate variante de aminoacizi în regiunile constante ale anticorpilor care sunt direcţionate către modificarea punctului izoelectric (pI) a cel puţin unuia, dacă nu a amândurora, dintre monomerii unei proteine dimerice pentru a forma "anticorpi de pI") prin încorporarea substituţiilor de aminoacizi ("variante de pI" sau "substituţii de pI") într-unul sau ambii monomeri. Aşa cum se arată în lucrarea de faţă, separarea heterodimerilor de cei doi homodimeri poate fi realizată dacă pI-urile celor doi monomeri diferă cu doar 0,1 unităţi de pH, cu 0,2, 0,3, 0,4 şi 0,5 sau mai mult, toate fiind utilizate în prezenta invenţie.

Aşa cum va fi apreciat de cei din domeniu, numărul de variante pI care trebuie incluse pe fiecare monomer sau pe ambii monomeri pentru a obţine o separare bună va depinde în parte de pI de pornire al componentelor, de exemplu în formatul triplu F, pI iniţial al scFv şi Fab de interes. Adică, pentru a determina care monomer să se prelucreze sau în ce „direcţie» (de exemplu, mai pozitiv sau mai negativ), se calculează secvenţele Fv ale celor două antigene ţintă şi se ia o decizie de la aceasta. După cum se cunoaşte în domeniu, Fv-uri diferite vor avea pI de pornire diferite care sunt exploatate în prezenta invenţie. În general, aşa cum este subliniat în lucrarea de faţă, pI sunt proiectate pentru a rezulta o diferenţă totală de pI pentru fiecare monomer de cel puţin aproximativ 0,1 log, cu 0,2 până la 0,5 fiind preferate aşa cum este prezentat în lucrarea de faţă.

Mai mult, aşa cum va fi apreciat de cei din domeniu şi prezentat în lucrarea de faţă, în unele variante de realizare, heterodimerii pot fi separaţi de homodimeri pe baza mărimii. Aşa cum se arată în Figurile 1, de exemplu, mai multe dintre formate permit separarea heterodimerilor şi homodimerilor pe baza mărimii.

În cazul în care variante de pI sunt utilizate pentru a realiza heterodimerizarea, prin utilizarea regiunii(lor) constante ale lanţului(lor) greu(ele), se oferă o abordare mai modulară pentru proiectarea şi purificarea proteinelor bispecifice, inclusiv anticorpi. Astfel, în unele variante de realizare, variantele de heterodimerizare (incluzând variantele de heterodimerizare asimetrice şi de purificare) nu sunt incluse în regiunile variabile, astfel încât fiecare anticorp individual trebuie să fie prelucrat. În plus, posibilitatea imunogenităţii care rezultă din variantele de pI este semnificativ redusă prin importul variantelor de pI din diferite izotipuri de IgG, astfel încât pI este modificat fără a introduce imunogenitate semnificativă. Astfel, o problemă suplimentară care trebuie rezolvată este elucidarea de domenii constante cu pI scăzut cu un conţinut ridicat de secvenţă umană, de exemplu reducerea la minim sau evitarea reziduurilor non-umane în orice poziţie particulară.

Un beneficiu secundar care poate apărea cu această prelucrare de pI este, de asemenea, prelungirea timpului de înjumătăţire plasmatică serică şi creşterea legării la FcRn. Adică, aşa cum este descris în US20120028304, reducerea pI al domeniilor constante de anticorpi (inclusiv cele găsite în anticorpi şi fuziuni de Fc) poate duce la o retenţie mai lungă în ser in vivo. Aceste variante de pI pentru creşterea timpului de înjumătăţire serică facilitează, de asemenea, modificările de pI pentru purificare.

În plus, trebuie remarcat faptul că variantele de pI ale variantelor de heterodimerizare oferă un beneficiu suplimentar pentru metodele analitice şi procesul de control al calităţii la anticorpi bispecifici, deoarece capacitatea de a elimina, minimiza şi diferenţia atunci când sunt prezenţi homodimeri este semnificativă. În mod similar, este importantă capacitatea de a testa în mod fiabil reproductibilitatea producţiei de anticorpi heterodimerici.

Variante de heterodimerizare

Sunt furnizate proteine heterodimerice, incluzând anticorpi heterodimerici într-o varietate de formate, care utilizează variante heterodimerice pentru a permite formarea heterodimerică şi/sau purificarea separată de homodimeri.

Există o serie de perechi adecvate de seturi de variante asimetrice de heterodimerizare. Aceste variante vin în "perechi" de "seturi". Adică, un set al perechii este încorporat în primul monomer şi celălalt set al perechii este încorporat în al doilea monomer. Trebuie remarcat faptul că aceste seturi nu se comportă neapărat ca variante "proeminenţe în găuri", cu o corespondenţă unu-la-unu între un reziduu de pe un monomer şi un reziduu de pe celălalt; adică, aceste perechi de seturi formează o interfaţă între cei doi monomeri care încurajează formarea heterodimerului şi descurajează formarea homodimerului, permiţând ca procentul de heterodimeri care se formează spontan în condiţii biologice să fie de peste 90%, mai degrabă decât 50% aşteptat (25% homodimer A/A: 50% heterodimer A/B: 25% homodimer B/B).

Variante sterice

Formarea heterodimerilor poate fi facilitată prin adăugarea de variante sterice. Adică, prin schimbarea aminoacizilor din fiecare lanţ greu, diferite lanţuri grele sunt mai susceptibile de a se asocia pentru a forma structura heterodimerică decât pentru a forma homodimeri cu aceleaşi secvenţe de aminoacizi Fc. Variantele sterice adecvate sunt incluse în Figura 29.

Un mecanism care este denumit, în general, în domeniu "proeminenţe şi găuri», referindu-se la prelucrarea aminoacizilor care creează influenţe sterice pentru a favoriza formarea heterodimerică şi a defavoriza formarea homodimerică poate fi, de asemenea, opţional utilizat; acest este uneori denumit "proeminenţe şi găuri», aşa cum este descris în Ridgway şi colab., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell şi colab., J. Mol. Biol. 1997 270:26; Brevetul SUA Nr. 8.216.805. Figurile identifică mai multe perechi "monomer A - monomer B" care se bazează pe "proeminenţe şi găuri". În plus, aşa cum este descris în Merchant şi colab., Nature Biotech. 16: 677 (1998), aceste mutaţii "proeminenţe şi găuri" pot fi combinate cu legături disulfidice pentru a asimtriza formarea către heterodimerizare.

Un mecanism suplimentar care se foloseşte în generarea de heterodimeri este uneori denumit "direcţionare electrostatică", aşa cum este descris în Gunasekaran şi colab., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010). Aceasta este uneori denumită în lucrarea de faţă ca "perechi de încărcare". În această variantă de realizare, metodele electrostatice sunt utilizate pentru a asimetriza formarea spre heterodimerizare. După cum vor aprecia specialiştii în domeniu, acestea pot avea, de asemenea, un efect asupra pI şi, prin urmare, asupra purificării şi, prin urmare, ar putea fi, în unele cazuri, considerate şi variante de pI. Cu toate acestea, deoarece acestea au fost generate pentru a forţa heterodimerizarea şi nu au fost utilizate ca instrumente de purificare, ele sunt clasificate ca "variante sterice". Acestea includ, dar nu sunt limitate la ele, D221E/P228E/L368E împerecheat cu D221R/P228R/K409R (de exemplu, acestea sunt "seturi corespunzătoare de monomeri) şi C220E/P228E/368E împerecheat cu C220R/E224R/P228R/K409R.

Variante suplimentare de monomer A şi monomer B care pot fi combinate cu alte variante de realizare, opţional şi independent în orice cantitate, cum ar fi variantele de pI prezentate în lucrarea de faţă sau alte variante sterice care sunt prezentate în Figura 37 din US 2012/0149876.

Variantele sterice descrise în lucrarea de faţă pot fi încorporate opţional şi independent cu orice variantă de pI (sau alte variante cum ar fi variantele de Fc, variantele de FcRn etc.) într-unul sau ambii monomeri şi pot fi incluse sau excluse independent şi opţional din proteinele conform invenţiei.

O listă de variante asimetrice adecvate se găseşte în Figura 29, Figura 34 prezentând câteva perechi de utilitate specială în multe variante de realizare. De o utilitate deosebită în multe variante de realizare sunt perechile de seturi care includ, dar nu se limitează la ele, S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L şi K370S: S364K/E357Q. În ceea ce priveşte nomenclatura, perechea „S364K/E357Q: L368D/K370S" înseamnă că unul dintre monomeri are setul de variante duble S364K/E357Q şi celălalt are setul de variante duble L368D/K370S.

Variante de pI (punct Izoelectric) pentru Heterodimeri

În general, aşa cum va fi apreciat de cei din domeniu, există două categorii generale de variante de pI: cele care cresc pI-ul proteinei (modificări bazice) şi cele care scad pI-ul proteinei (modificări acide). Aşa cum este descris aici, se pot face toate combinaţiile acestor variante: un monomer poate fi de tip sălbatic sau o variantă care nu prezintă un pI semnificativ diferit de tipul sălbatic, iar celălalt poate fi mai bazic sau mai acid. Alternativ, fiecare monomer este schimbat, unul în mai bazic şi unul în mai acid.

Combinaţiile preferate de variante de pI sunt prezentate în Figura 30. Aşa cum este prezentat în lucrarea de faţă şi prezentat în figuri, aceste modificări sunt prezentate în raport cu IgG1, dar toate izotipurile pot fi modificate în acest fel, precum şi hibrizii de izotip. În cazul în care domeniul constant al lanţului greu este de la IgG2-4, R133E şi R133Q pot fi de asemenea utilizate.

Heterodimeri de anticorpi Variante de lanţ uşor

În cazul heterodimerilor pe bază de anticorpi, de exemplu, în care cel puţin unul dintre monomeri cuprinde un lanţ uşor în plus faţă de domeniul lanţului greu, variantele de pI pot fi fabricate şi în lanţul uşor. Substituţiile de aminoacizi pentru scăderea pI al lanţului uşor includ, dar nu sunt limitate la, K126E, K126Q, K145E, K145Q, N152D, S156E, K169E, S202E, K207E şi adăugarea peptidei DEDE la capătul c-terminal al lanţului uşor. Modificările din această categorie bazate pe lanţul uşor lambda constant includ una sau mai multe substituţii la R108Q, Q124E, K126Q, N138D, K145T şi Q199E. În plus, se poate face şi creşterea pI al lanţurilor uşoare.

Variante izotipice

În plus, anticorpii se bazează pe „importul» de aminoacizi de pI la anumite poziţii dintr-un izotip de IgG în altul, reducând sau eliminând astfel posibilitatea introducerii imunogenităţii nedorite în variante. Mai multe dintre acestea sunt prezentate în Figura 21 din Publ. SUA 2014/0370013. Adică, IgG1 este un izotip comun pentru anticorpi terapeutici dintr-o varietate de motive, incluzând funcţia efectoare ridicată. Cu toate acestea, regiunea constantă grea a IgG1 are un pI mai mare decât cel al IgG2 (8,10 faţă de 7,31). Prin introducerea reziduurilor de IgG2 în anumite poziţii în catena principală a IgG1, pI al monomerului rezultat este redus (sau crescut) şi prezintă în plus un timp de înjumătăţire serică mai lung. De exemplu, IgG1 are o glicină (pI 5,97) în poziţia 137, iar IgG2 are un acid glutamic (pI 3,22); importul acidului glutamic va afecta pI al proteinei rezultate. Aşa cum este descris mai jos, sunt necesare, în general, o serie de substituţii de aminoacizi pentru a afecta semnificativ pI al anticorpului variantă. Cu toate acestea, trebuie remarcat, după cum s-a discutat mai jos, că chiar şi modificările moleculelor de IgG2 permit creşterea timpului de înjumătăţire seric.

Alternativ, se fac modificări ale aminoacizilor neizotipici, fie pentru a reduce starea generală de încărcare a proteinei rezultate (de exemplu, prin schimbarea unui aminoacid cu pI mai mare într-un aminoacid cu pI inferior), fie pentru a permite acomodări în structură pentru stabilitate etc. după cum este descris mai mult mai jos.

În plus, prin prelucrarea la pI atât a domeniilor constante grele, cât şi a celor uşoare, se pot observa modificări semnificative în fiecare monomer al heterodimerului. Aşa cum s-a discutat în lucrarea de faţă, având pI-urile celor doi monomeri diferite cu cel puţin 0,5 poate permite separarea prin cromatografie cu schimb de ioni sau focalizare izoelectrică sau alte metode sensibile la punctul izoelectric.

Calcularea pI

pI al fiecărui monomer poate depinde de pI al domeniului constant al lanţului greu variantă şi de pI al monomerului total, incluzând domeniul constant al lanţului greu variantă şi partenerul de fuziune. Astfel, în unele variante de realizare, modificarea pI este calculată pe baza domeniului constant al lanţului greu variantă, utilizând graficul din Figura 19 din Pub. SUA 2014/0370013. Aşa cum s-a discutat în lucrarea de faţă, monomerul care trebuie să fie prelucrat este în general decis în funcţie de pI inerent al Fv şi regiunilor de scaffold. Alternativ, pI al fiecărui monomer poate fi comparat.

Variante de pI care conferă, de asemenea, o legare la FcRn mai bună in vivo

În cazul în care varianta de pI scade pI al monomerului, acestea pot avea avantajul suplimentar de a îmbunătăţi retenţia serică in vivo.

Deşi sunt încă în curs de examinare, se crede că regiunile Fc au perioade de înjumătăţire mai lungi in vivo, deoarece legarea la FcRn la pH 6 într-un endozom sechestrează Fc (Ghetie şi Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598).

compartimentul endozomal reciclează apoi Fc pe suprafaţa celulei. Odată ce compartimentul se deschide către spaţiul extracelular, pH-ul mai mare, ∼7,4, induce eliberarea de Fc înapoi în sânge. La şoareci, Dall 'Acqua şi colab. au arătat că mutante de Fc cu legare crescută la FcRn la pH 6 şi pH 7,4 aveau de fapt concentraţii serice reduse şi acelaşi timp de înjumătăţire ca şi Fc de tip sălbatic (Dall 'Acqua şi colab. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180).

Se crede că afinitatea crescută a Fc pentru FcRn la pH 7,4 interzice eliberarea Fc înapoi în sânge. Prin urmare, mutaţiile de Fc care vor creşte timpul de înjumătăţire al Fc in vivo vor creşte în mod ideal legarea FcRn la pH mai mic, permiţând în acelaşi timp eliberarea de Fc la pH mai mare. Aminoacidul histidină îşi schimbă starea de încărcare în domeniul de pH de 6,0 până la 7,4. Prin urmare, nu este surprinzător să găsim reziduuri His în poziţii importante în complexul Fc/FcRn.

Recent s-a sugerat că anticorpii cu regiuni variabile care au puncte izoelectrice mai scăzute pot avea, de asemenea, timpi de înjumătăţire serică mai lungi (Igawa şi colab., 2010 PEDS. 23(5): 385-392). Cu toate acestea, mecanismul pentru aceasta este încă puţin înţeles. Mai mult, regiunile variabile diferă de la anticorp la anticorp. Variantele de regiune constantă cu pI redus şi timp de înjumătăţire extins ar oferi o abordare mai modulară pentru îmbunătăţirea proprietăţilor farmacocinetice ale anticorpilor, aşa cum este descris aici.

Variante de Fc suplimentare pentru funcţionalitate suplimentară

În plus faţă de variantele de aminoacizi de pI, există o serie de modificări utile ale aminoacizilor din Fc care pot fi făcute din mai multe motive, incluzând, dar fără a se limita la acestea, modificarea legării la unul sau mai mulţi receptori FcγR, legarea modificată la receptorii FcRn, etc.

În consecinţă, proteinele pot include modificări ale aminoacizilor, incluzând variantele de heterodimerizare prezentate în lucrarea de faţă, care includ variantele de pI şi variantele sterice. Fiecare set de variante poate fi inclus sau exclus în mod independent şi opţional din orice proteină heterodimerică particulară.

Variante de FcγR

În consecinţă, există o serie de substituţii de Fc utile care pot fi făcute pentru a modifica legarea la unul sau mai mulţi dintre receptorii FcγR. Pot fi utile substituţiile care au ca rezultat legarea crescută, precum şi cele care au rezultat legarea redusă. De exemplu, se ştie că legarea crescută la Fc RIIIa conduce, în general, la creşterea ADCC (citotoxicitate mediată de celule dependentă de anticorpi; reacţia mediată de celule în care celule citotoxice nespecifice care exprimă FcyR-uri recunosc anticorpul legat pe o celulă ţintă şi ulterior determină liza celulei ţintă). În mod similar, legarea redusă la FcγRIIb (un receptor inhibitor) poate fi benefică şi ea în anumite circumstanţe. Substituţiile de aminoacizi care se folosesc în prezenta invenţie le includ pe cele enumerate în US2006-0024298 (în special Figura 41), US2006-0121032, US2006-0235208, US2007-014817. Variante particulare care se folosesc includ, dar fără să se limiteze la, 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 243A, 243L, 264A, 264V şi 299T.

În plus, există substituţii de Fc suplimentare care îşi găsesc utilizare în legarea crescută la receptorul FcRn şi în creşterea timpului de înjumătăţire serică, aşa cum este dezvăluit în mod specific în US20090163699 incluzând, dar fără a se limita la, 434S, 434A, 428L, 308F, 2591, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 4361 sau V/434S, 436V/428L şi 259I/308F/428L.

Variante de Ablaţie

În mod similar, o altă categorie de variante funcţionale sunt "variantele de ablaţie de FcγR" sau variantele de "Fc knock out (FcKO sau KO) ". În aceste variante de realizare, pentru unele aplicaţii terapeutice, este de dorit să se reducă sau să se îndepărteze legarea normală a domeniului Fc la unul sau mai mulţi sau toţi receptorii Fcγ (de exemplu, FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa etc.) pentru a evita mecanisme de acţiune suplimentare. Aceasta înseamnă că, de exemplu, în multe variante de realizare, în special în utilizarea anticorpilor bispecifici care se leagă la CD3 în mod monovalent, în general este de dorit anularea legării la FcyRIIIa pentru a elimina sau reduce semnificativ activitatea ADCC, în care unul dintre domeniile de Fc cuprind una sau mai multe variante de ablaţie ale receptorului de Fcγ. Aceste variante de ablaţie sunt descrise în Figura 31 şi fiecare poate fi inclusă sau exclusă în mod independent şi opţional, cu aspecte preferate utilizând variante de ablaţie selectate din grupul format din G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G şi E233P/L234V/L235A/G236del. Trebuie remarcat faptul că variantele de ablaţie menţionate în lucrarea de faţă anulează legarea la FcγR, dar în general nu legarea la FcRn.

Combinaţie de Variante Feterodimerice şi de Fc

Aşa cum va fi apreciat de cei din domeniu, toate variantele de heterodimerizare precizate (inclusiv variante asimetrice şi/sau de pI) pot fi combinate opţional şi independent în orice mod, atâta timp cât îşi păstrează "cateneitatea" sau "partiţia de monomer". În plus, toate aceste variante pot fi combinate în oricare dintre formatele de heterodimerizare.

În cazul pI pot fi generate diferite combinaţii, urmând regula de bază a modificării diferenţei de pI între doi monomeri pentru a facilita purificarea.

În plus, oricare dintre variantele de heterodimerizare, asimetrice şi de pI, sunt, de asemenea, combinate independent şi opţional cu variante de ablaţie de Fc, variante de Fc, variante de FcRn, aşa cum este subliniat în general în lucrarea de faţă.

Formate Utile ale Invenţiei

Aşa cum va fi apreciat de specialiştii din domeniu şi discutat mai în detaliu mai jos, proteinele de fuziune heterodimerice pot lua o mare varietate de configuraţii, aşa cum sunt descrise în general în Figurile 1. Unele figuri descriu configuraţii "cu un singur capăt", în care există un tip de specificitate pe un "braţ" al moleculei şi o specificitate diferită pe celălalt "braţ". Alte figuri descriu configuraţii "cu capăt dublu", în care există cel puţin un tip de specificitate la "partea superioară" a moleculei şi una sau mai multe specificităţi diferite la "partea inferioară" a moleculei. Astfel, prezenta invenţie se referă la noi compoziţii de imunoglobulină care se co-cuplează cu un prim şi un al doilea antigen diferiţi.

Aşa cum va fi apreciat de cei din domeniu, anticorpul heterodimeric poate avea valenţe diferite şi poate fi bispecific. Adică, anticorpii heterodimerici conform invenţiei pot fi bivalenţi şi bispecifici, în care un antigen tumoral ţintă (de exemplu, CD3) este legat de un domeniu de legare şi celălalt antigen tumoral ţintă (de exemplu, CD20, CD19, CD38, CD123 etc.) este legat de un al doilea domeniu de legare. Anticorpii heterodimerici pot fi, de asemenea, trivalenţi şi bispecifici, în care primul antigen este legat de două domenii de legare şi al doilea antigen de un al doilea domeniu de legare. După cum este prezentat în lucrarea de faţă, atunci când CD3 este unul dintre antigenele ţintă, este de preferat ca CD3 să fie legat doar în mod monovalent, pentru a reduce potenţialele efecte secundare.

Sunt furnizate domenii de legare la antigen anti-CD3 în combinaţie cu domenii de legare la antigen anti-antigen tumoral ţintă (TTA). După cum va fi apreciat de specialiştii în domeniu, poate fi folosită orice colecţie de CDR-uri anti-CD3, domenii uşoare variabile şi domenii grele variabile anti-CD3, Fab-uri şi scFv-uri aşa cum este descris în oricare dintre Figuri (vezi în special Figurile 2 până la 7 şi Figura 68). În mod similar, poate fi utilizat oricare dintre domeniile de legare la antigen anti-TTA, de exemplu, pot fi utilizate domeniile de legare la antigen anti-CD38, anti-CD20, anti-CD19 şi anti-CD123, indiferent dacă sunt CDR-uri, domenii uşoare variabile şi domenii grele variabile, Fab-uri şi scFv-uri aşa cum este descris în oricare dintre Figuri, combinate opţional şi independent în orice combinaţie.

Formatul de deschizător de sticle

Un scaffold heterodimeric care îşi găseşte o utilizare specială în prezenta invenţie este formatul de scaffold "triplu F" sau "deschizător de sticle" aşa cum se arată în Figura 1A, A şi B. În această variantă de realizare, un lanţ greu al anticorpului conţine Fv cu un singur lanţ ("scFv", aşa cum este definit mai jos) şi celălalt lanţ greu este un format FAb "obişnuit", cuprinzând un lanţ greu variabil şi un lanţ uşor. Această structură este uneori denumită aici ca format "triplu F" (scFv-FAb-Fc) sau formatul "deschizător de sticle", datorită unei asemănări vizuale macroscopice cu un deschizător de sticle (vezi Figurile 1). Cele două lanţuri sunt reunite prin utilizarea variantelor de aminoacizi în regiunile constante (de exemplu, domeniul Fc, domeniul CH1 şi/sau regiunea balama) care promovează formarea anticorpilor heterodimerici aşa cum este descris mai complet mai jos.

Există mai multe avantaje distincte în prezentul format "triplu F". După cum se cunoaşte în domeniu, analogii anticorpilor care se bazează pe două constructe scFv au adesea probleme de stabilitate şi agregare, care pot fi atenuate în prezenta invenţie prin adăugarea unei perechi de lanţuri grele şi uşoare "obişnuite". În plus, spre deosebire de formatele care se bazează pe două lanţuri grele şi două lanţuri uşoare, nu există nicio problemă cu asocierea incorectă a lanţurilor grele şi uşoare (de exemplu, asocierea lanţului greu 1 cu lanţul uşor 2 etc.).

Mulţi anticorpi descrişi în lucrarea de faţă se bazează în general pe formatul de deschizător de sticle care cuprinde un prim monomer care cuprinde un scFv, cuprinzând un domeniu greu variabil şi un domeniu uşor variabil, ataşat covalent folosind un linker scFv (încărcat, în multe situaţii, dar nu în toate cazurile), unde scFv este ataşat covalent la capătul N-terminal al unui prim domeniu Fc, de obicei printr-un linker de domeniu (care, aşa cum este prezentat aici, poate fi neîncărcat sau încărcat). Al doilea monomer al formatului deschizător de sticle este un lanţ greu, iar compoziţia cuprinde în plus un lanţ uşor.

În general, scFv este domeniul care se leagă la CD3, iar Fab-ul lanţurilor grele şi uşoare se leagă la celălalt TTA. În plus, domeniile Fc ale invenţiei cuprind în general variante asimetrice (de exemplu, un set de substituţii de aminoacizi aşa cum se arată în Figura 29 şi Figura 34, variante asimetrice deosebit de utile fiind selectate din grupul format din S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L şi K370S: S364K/E357Q), opţional variante de ablaţie (incluzând pe cele prezentate în Figura 31), opţional linkeri scFv încărcaţi (incluzând pe cei prezentaţi în Figura 33) şi lanţul greu cuprinde variante de pI (incluzând pe cele prezentate în Figura 30).

Sunt furnizate formate de deschizător de sticle în care secvenţele scFv anti-CD3 sunt aşa cum se arată în Figura 2 până la Figura 7 şi Figura 68.

Sunt furnizate formate de deschizător de sticle cu domenii de legare la antigenul CD38 în care secvenţele anti-CD38 sunt aşa cum se arată în Figuri, incluzând Figurile 8 până la 10.

Sunt furnizate formate de deschizător de sticle cu domenii de legare la antigenul CD20 în care secvenţele anti-CD20 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate de deschizător de sticle cu domenii de legare la antigen CD19 în care secvenţele anti-CD19 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate de deschizător de sticle cu domenii de legare la antigenul CD123 în care secvenţele anti-CD123 sunt aşa cum se arată în Figuri. formatul mAb-Fv

Un scaffold heterodimeric este formatul mAb-Fv prezentat în Figura 1. Acest format poate exista prin utilizarea unui ataşament C-terminal al unui domeniu greu variabil "extra" la un monomer şi ataşamentul C-terminal al unui domeniu uşor variabil "suplimentar" la celălalt monomer, formând astfel un al treilea domeniu de legare la antigen, în care porţiunile Fab ale celor doi monomeri se leagă la un TTA şi domeniul scFv "extra" se leagă la CD3.

Într-un exemplu, primul monomer cuprinde un prim lanţ greu, cuprinzând un prim domeniu greu variabil şi un prim domeniu greu constant care cuprinde un prim domeniu Fc, cu un prim domeniu uşor variabil ataşat covalent la capătul C-terminal al primului domeniu Fc folosind un linker de domeniu. Al doilea monomer cuprinde un al doilea domeniu greu variabil al celui de-al doilea domeniu greu constant cuprinzând un al doilea domeniu Fc şi un al treilea domeniu greu variabil ataşat covalent la capătul C-terminal al celui de-al doilea domeniu Fc utilizând un linker de domeniu. Cele două domenii variabile ataşate C-terminal formează un scFv care se leagă la CD3. Acest exemplu utilizează în plus un lanţ uşor comun care cuprinde un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant, care se asociază cu lanţurile grele pentru a forma două Fab-uri identice care se leagă la un TTA. În ceea ce priveşte multe dintre exemplele din lucrarea de faţă, aceste constructe includ variante asimetrice, variante de pI, variante de ablaţie, variante Fc suplimentare, etc. aşa cum se doreşte şi este descris în lucrarea de faţă.

Sunt furnizate formate mAb-Fv în care secvenţele scFv anti-CD3 sunt aşa cum se arată în Figura 2 până la Figura 7 şi Figura 68.

Sunt furnizate formate mAb-Fv în care secvenţele anti-CD38 sunt aşa cum se arată în Figurile 8 până la 10.

Sunt furnizate formate mAb-Fv cu domenii de legare la antigenul CD20 în care secvenţele anti-CD20 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate mAb-Fv cu domenii de legare la antigenul CD19 în care secvenţele anti-CD19 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate mAb-Fv cu domenii de legare la antigenul CD123 în care secvenţele anti-CD123 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate mAb-Fv care cuprind variante de ablaţie aşa cum se arată în Figura 31.

Sunt furnizate formate mAb-Fv care cuprind variante asimetrice aşa cum se arată în Figurile 29 şi 34.

mAb-scFv

Un scaffold heterodimeric care îşi găseşte o utilizare specială este formatul mAb-Fv prezentat în Figura 1. În această variantă de realizare, formatul se bazează pe utilizarea unui ataşament C-terminal al unui scFv la unul dintre monomeri, formând astfel un al treilea domeniu de legare la antigen, în care porţiunile Fab ale celor doi monomeri se leagă la un TTA şi domeniul scFv "suplimenta" se leagă la CD3. Astfel, primul monomer cuprinde un prim lanţ greu (cuprinzând un domeniu greu variabil şi un domeniu constant), cu un scFv ataşat covalent la capătul C-terminal cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv. Acest exemplu utilizează în plus un lanţ uşor comun care cuprinde un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant, care se asociază cu lanţurile grele pentru a forma două Fab-uri identice care se leagă la un TTA. În ceea ce priveşte multe dintre exemplele din lucrarea de faţă, aceste constructe includ variante asimetrice, variante de pI, variante de ablaţie, variante Fc suplimentare, etc. aşa cum se doreşte şi este descris în lucrarea de faţă.

Sunt furnizate formate mAb-Fv în care secvenţele scFv anti-CD3 sunt aşa cum se arată în Figura 2 până la Figura 7 şi Figura 68.

Sunt furnizate formate mAb-Fv în care secvenţele anti-CD38 sunt aşa cum se arată în Figurile 8 până la 10.

Sunt furnizate formate mAb-Fv cu domenii de legare la antigenul CD20 în care secvenţele anti-CD20 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate mAb-Fv cu domenii de legare la antigenul CD19 în care secvenţele anti-CD19 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate mAb-Fv cu domenii de legare la antigenul CD123 în care secvenţele anti-CD123 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate mAb-Fv care cuprind variante de ablaţie aşa cum se arată în Figura 31.

Sunt furnizate formate mAb-Fv care cuprind variante asimetrice aşa cum se arată în Figurile 29 şi 34.

scFv Central

Un scaffold heterodimeric care îşi găseşte o utilizare specială în prezenta invenţie este formatul scFv-Central prezentat în Figura 1. În această variantă de realizare, formatul se bazează pe utilizarea unui domeniu scFv inserat formând astfel un al treilea domeniu de legare la antigen, în care porţiunile Fab ale celor doi monomeri se leagă la un TTA, iar domeniul scFv "suplimentar" se leagă la CD3. Domeniul scFv este inserat între domeniul Fc şi regiunea CH1-Fv a unuia dintre monomeri, furnizând astfel un al treilea domeniu de legare la antigen.

În exemplu, un monomer cuprinde un prim lanţ greu cuprinzând un prim domeniu greu variabil, un domeniu CH1 şi un domeniu Fc, cu un scFv cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv. ScFv este ataşat covalent între capătul C-terminal al domeniului CH1 al domeniului constant greu şi capătul N-terminal al primului domeniu Fc utilizând linkeri de domeniu. Acest exemplu utilizează în plus un lanţ uşor comun care cuprinde un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant, care se asociază cu lanţurile grele pentru a forma două Fab-uri identice care se leagă la un TTA. În ceea ce priveşte multe dintre exemplele din lucrarea de faţă, aceste constructe includ variante asimetrice, variante de pI, variante de ablaţie, variante Fc suplimentare, etc. aşa cum se doreşte şi este descris în lucrarea de faţă.

Sunt furnizate formate scFv-Central în care secvenţele scFv anti-CD3 sunt aşa cum se arată în Figura 2 până la Figura 7 şi Figura 68.

Sunt furnizate formate scFv-Central în care secvenţele anti-CD38 sunt aşa cum se arată în Figurile 8-10.

Sunt furnizate formate scFv-Central cu domenii de legare la antigenul CD20 în care secvenţele anti-CD20 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv-Central cu domenii de legare la antigenul CD19 în care secvenţele anti-CD19 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv-Central cu domenii de legare la antigenul CD123 în care secvenţele anti-CD123 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv-Central care cuprind variante de ablaţie aşa cum se arată în Figura 31.

Sunt furnizate formate scFv-Central care cuprind variante asimetrice aşa cum se arată în Figurile 29 şi 34.

Format Fv-Central

Un scaffold heterodimeric care îşi găseşte o utilizare specială este formatul Fv-Central prezentat în Figura 1. În acest exemplu, formatul se bazează pe utilizarea unui domeniu scFv inserat formând astfel un al treilea domeniu de legare la antigen, în care porţiunile Fab ale celor doi monomeri se leagă la un TTA şi domeniul scFv "suplimentar" se leagă la CD3. Domeniul scFv este inserat între domeniul Fc şi regiunea CH1-Fv a monomerilor, furnizând astfel un al treilea domeniu de legare la antigen, în care fiecare monomer conţine o componentă a scFv (de exemplu, un monomer cuprinde un domeniu greu variabil şi celălalt un domeniu uşor variabil).

În acest exemplu, un monomer cuprinde un prim lanţ greu cuprinzând un prim domeniu greu variabil, un domeniu CH1 şi un domeniu Fc şi un domeniu uşor variabil suplimentar. Domeniul uşor este ataşat covalent între capătul C-terminal al domeniului CH1 al domeniului constant greu şi capătul N-terminal al primului domeniu Fc utilizând linkeri de domeniu. Celălalt monomer cuprinde un prim lanţ greu cuprinzând un prim domeniu greu variabil, un domeniu CH1 şi un domeniu Fc şi un domeniu greu variabil suplimentar. Domeniul uşor este ataşat covalent între capătul C-terminal al domeniului CH1 al domeniului constant greu şi capătul N-terminal al primului domeniu Fc utilizând linkeri de domeniu.

Această variantă de realizare utilizează în plus un lanţ uşor comun care cuprinde un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant, care se asociază cu lanţurile grele pentru a forma două Fab-uri identice care se leagă la un TTA. În ceea ce priveşte multe dintre exemplele din lucrarea de faţă, aceste constructe includ variante asimetrice, variante de pI, variante de ablaţie, variante Fc suplimentare, etc. aşa cum se doreşte şi este descris în lucrarea de faţă.

Sunt furnizate formate Fv-Central în care secvenţele scFv anti-CD3 sunt aşa cum se arată în Figura 2 până la Figura 7 şi Figura 68.

Sunt furnizate formate Fv-Central în care secvenţele anti-CD38 sunt aşa cum se arată în Figurile 8până la 10.

Sunt furnizate formate Fv-Central cu domenii de legare la antigenul CD20 în care secvenţele anti-CD20 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate Fv-Central cu domenii de legare la antigenul CD19 în care secvenţele anti-CD19 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate Fv-Central cu domenii de legare la antigenul CD123 în care secvenţele anti-CD123 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate Fv-Central care cuprind variante de ablaţie aşa cum se arată în Figura 31.

Sunt furnizate formate Fv-Central care cuprind variante asimetrice aşa cum se arată în Figurile 29 şi 34.

Un scFv-Central cu un braţ

Un scaffold heterodimeric care îşi găseşte o utilizare specială este formatul scFv-Central cu un braţ prezentat în Figura 1. În această variantă de realizare, un monomer cuprinde doar un domeniu Fc, în timp ce celălalt monomer utilizează un domeniu scFv inserat formând astfel al doilea domeniu de legare la antigen. În acest format, fie porţiunea Fab se leagă la un TTA, fie scFv se leagă la CD3 sau invers. Domeniul scFv este inserat între domeniul Fc şi regiunea CH1-Fv a unuia dintre monomeri.

În acest exemplu, un monomer cuprinde un prim lanţ greu cuprinzând un prim domeniu greu variabil, un domeniu CH1 şi un domeniu Fc, cu un scFv cuprinzând un domeniu uşor variabil scFv, un linker scFv şi un domeniu greu variabil scFv. ScFv este ataşat covalent între capătul C-terminal al domeniului CH1 al domeniului constant greu şi capătul N-terminal al primului domeniu Fc utilizând linkeri de domeniu. Al doilea monomer cuprinde un domeniu Fc. Acest exemplu utilizează în plus un lanţ uşor cuprinzând un domeniu uşor variabil şi un domeniu uşor constant, care se asociază cu lanţul greu pentru a forma un Fab. În ceea ce priveşte multe dintre exemplele din lucrarea de faţă, aceste constructe includ variante asimetrice, variante de pI, variante de ablaţie, variante Fc suplimentare, etc. aşa cum se doreşte şi este descris în lucrarea de faţă.

Sunt furnizate formate scFv-central cu un braţ în care secvenţele scFv anti-CD3 sunt aşa cum se arată în Figura 2 până la Figura 7 şi Figura 68.

Sunt furnizate formate scFv-central cu un braţ în care secvenţele anti-CD38 sunt aşa cum se arată în Figurile 8 până la 10.

Sunt furnizate formate scFv-central cu un braţ cu domenii de legare la antigenul CD20 în care secvenţele anti-CD20 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv-central cu un braţ cu domenii de legare la antigenul CD19 în care secvenţele anti-CD19 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv-central cu un braţ cu domenii de legare la antigenul CD123 în care secvenţele anti-CD123 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv-central cu un braţ care cuprind variante de ablaţie aşa cum se arată în Figura 31.

Sunt furnizate formate scFv-central cu un braţ care cuprind variante asimetrice aşa cum se arată în Figurile 29 şi 34.

Formate scFv duale

De asemenea, sunt furnizate formate scFv duale aşa cum sunt cunoscute în domeniu şi prezentate în Figura 1.

Sunt furnizate formate scFv duale în care secvenţele scFv anti-CD3 sunt aşa cum se arată în Figura 2 până la Figura 7 şi Figura 68.

Sunt furnizate formate scFv duale în care secvenţele anti-CD38 sunt aşa cum se arată în Figurile 8 până la 10.

Sunt furnizate formate scFv duale cu domenii de legare la antigenul CD20 în care secvenţele anti-CD20 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv duale cu domenii de legare la antigenul CD19 în care secvenţele anti-CD19 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv duale cu domenii de legare la antigenul CD123 în care secvenţele anti-CD123 sunt aşa cum se arată în Figuri.

Sunt furnizate formate scFv duale care cuprind variante de ablaţie aşa cum se arată în Figura 31.

Sunt furnizate formate scFv duale care cuprind variante asimetrice aşa cum se arată în Figurile 29 şi 34.

Antigene ţintă

Anticorpii bispecifici conform invenţiei au două domenii diferite de legare la antigen: unul care se leagă la CD3 (în general monovalent) şi unul care se leagă la un antigen tumoral ţintă (uneori denumit în lucrarea de faţă "TTA"). Antigenele tumorale ţintă adecvate includ, dar nu sunt limitate la, CD20, CD38, CD123; ROR1, ROR2, BCMA; PSMA; SSTR2; SSTR5, CD19, FLT3, CD33, PSCA, ADAM 17, CEA, Her2, EGFR, EGFR-vIII, CD30, FOLR1, GD-2, CA-IX, Trop-2, CD70, CD38, mezotelină, EphA2, CD22, CD79b, GPNMB, CD56, CD138, CD52, CD74, CD30, CD123, RON, ERBB2 şi EGFR.

Formatul "triplu F" este deosebit de benefic pentru ţintirea a două (sau mai multe) antigene distincte. (Aşa cum este prezentat în lucrarea de faţă, această ţintire poate fi orice combinaţie de legare monovalentă şi divalentă, în funcţie de format). Astfel, imunoglobulinele din lucrarea de faţă co-cuplează de preferinţă două antigene ţintă. Specificitatea fiecărui monomer poate fi selectată din listele din lucrarea de faţă. Formate bispecifice utile suplimentare pentru utilizare cu un domeniu de legare anti-CD3 sunt prezentate în Figura 1.

Aplicaţii adecvate particulare ale anticorpilor heterodimerici din lucrarea de faţă sunt perechi co-ţintă pentru care este benefic sau critic să se cupleze fiecare antigen ţintă în mod monovalent. Astfel de antigene pot fi, de exemplu, receptori imunitari care sunt activaţi după complexarea imună. Activarea celulară a multor receptori imunitari se produce numai prin reticulare, realizată în mod obişnuit prin complexe imune anticorp/antigen sau prin intermediul cuplării celulei efectoare la celula ţintă. Pentru unii receptori imunitari, de exemplu, receptorul de semnalizare CD3 pe celulele T, activarea numai după cuplarea cu ţinta co-cuplată este critică, deoarece reticularea nespecifică într-o situaţie clinică poate provoca o furtună de citokine şi toxicitate. Terapeutic, prin cuplarea unor astfel de antigene mai degrabă în mod monovalent, decât multivalent, folosind imunoglobulinele din lucrarea de faţă, o astfel de activare are loc doar ca răspuns la reticulare numai în microambientul antigenului ţintă primar. Capacitatea de a ţinti două antigene diferite cu valenţe diferite este un aspect nou şi util al prezentei invenţii. Antigene exemplificative ţintă pentru care poate fi terapeutic benefic sau necesar să se co-cupleze în mod monovalent includ, dar fără să se limiteze la, receptori activatori imunitari precum CD3, FcγR-uri, receptori toll-like (TLR) precum TLR4 şi TLR9, citokină, chemokină, receptori de citokine şi receptori de chemokine. În multe variante de realizare, unul dintre situsurile de legare la antigen se leagă la CD3, iar în unele variante de realizare este monomerul care conţine scFv.

Practic orice antigen poate fi ţintit de către imunoglobulinele din lucrarea de faţă, incluzând dar fără a se limita la acestea proteine, subunităţi, domenii, motive şi/sau epitopi care aparţin următoarei liste de antigene ţintă, care include atât factori solubili precum citokine, cât şi factori legaţi de membrană, incluzând receptori transmembranari: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGFIa, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, Receptor de adenozină A1, A33, ACE, ACE-2, Activină, Activina A, Activina AB, Activina B, Activina C, Activina RIA, Activina RIA ALK-2, Activina RIB ALK-4, Activina RIIA, Activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Adresine, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsină, antagonist alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artemin, anti-Id, ASPARTIC, factor natriuretic atrial, integrină av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, Stimulator al limfocitelor B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 Osteogenină, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b-NGF, BOK, Bombesină, Factor neurotrofic derivat din os, BPDE, BPDE-ADN, BTC, factor complement 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, Calcitonină, cAMP, antigen carcinoembrionar (CEA), antigen asociat carcinomului, Catepsină A, Catepsină B, Catepsină C/DPPI, Catepsină D, Catepsină E, Catepsină H, Catepsină L, Catepsină O, Catepsină S, Catepsină V, Catepsină X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4 CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteine p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina de Clostridium botulinum, toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antigen asociat tumorii de citokeratină, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Factor accelerator de descompunere, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxină, DNAM-1, Dnază, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelină, Encefalinază, eNOS, Eot, eotaxină 1, EpCAM, Efrină B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectină, ET-1, Factor IIa, Factor VII, Factor VIIIc, Factor IX, proteina de activare a fibroblastelor (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, Feritină, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, Fibrină, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormon foliculostimulant, Fractalkină, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gaz 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (Miostatină), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, Glucagon, Glut 4, glicoproteină IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, factor de eliberare a hormonului de creştere, Haptenă (NP-cap sau NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteină de anvelopă gB de HCMV, HCMV) glicoproteină de anvelopă gH, HCMV UL, Factor de creştere hemopoietic (HGF), Hep B gp120, heparanază, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteină gB de virus herpes simplex (HSV), glicoproteină gD de HSV, HGFA, antigen asociat melanomului cu masă moleculară mare (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miozină cardiacă umană, citomegalovirus uman (HCMV), hormon de creştere uman (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor IgA, IgE, IGF, proteine de legare IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alfa, INF-beta, INF-gamma, Inhibină, iNOS, insulină lanţ-A, insulină lanţ-B, factor 1 de creştere insulină-like, integrină alfa2, integrină alfa3, integrină alfa4, integrină alfa4/beta1, integrină alfa4/beta7, integrină alfa5 (alfaV), integrină alfa5/beta1, integrină alfa5/beta3, integrină alfa6, integrină beta1, integrină beta2, interferon gamma, IP-10, I-TAC, JE, Kalikreină 2, Kalikreină 5, Kalikreină 6, Kalikreină 11, Kalikreină 12, Kalikreină 14, Kalikreină 15, Kalikreină L1, Kalikreină L2, Kalikreină L3, Kalikreină L4, KC, KDR, Factor de Creştere a Keratinocitelor (KGF), laminina 5, LAMP TGF-1), TGF-1 latent, TGF-1 latent bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, antigen Lewis-Y, antigen înrudit cu Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteine, LIX, LKN, Lptn, L-Selectină, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, Surfactant pulmonar, hormon luteinizant, Receptor beta de limfotoxină, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, M ARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEAZE, receptor MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucină (Muc1), MUC18, substanţă Muellerian-inhibitină, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-Cadherină, NCA 90, NCAM, NCAM, Neprilizină, Neurotrofină-3, -4, sau -6, Neurturin, Factor de creştere neuronală (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormon paratiroidian, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Cadherină, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatază alcalină placentară (PLAP), P1GF, PLP, PP14, Proinsulină, Prorelaxină, Proteină C, PS, PSA, PSCA, antigen de membrană specifice prostatei (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, Relaxină lanţ-A, Relaxină lanţ-B, renină, virus sinciţial respirator (RSV) F, RSV Fgp, Ret, factori reumatoizi, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINĂ, albumină serică, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteina asociată tumorii-72), TARC, TCA-3, receptorii celulelor T (de exemplu, receptorul celulelor T alfa/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatază alcalină testiculară PLAP-like, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, TGF-beta RI (ALK-5), TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, Trombină, Ck-1 de timus, hormon stimulator tiroidian, Tie, TIMP, TIQ, Factor tisular, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfa beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40F 50 (CD40 p50), TN Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 Ligand, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK Ligand ODF, OPG Ligand), TNFSF12 (TWAAK Apo-3 Ligand, DR3 Ligand), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM Ligand, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GIT) AITR Ligand, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectin, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 Ligand gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 Ligand CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligand Fas ligand Apo-1, ligand APT1), TNFSF7 (ligand CD27 CD70), TNFSF8 (ligand CD30 CD153), TNFSF9 (ligand 4-1BB ligand CD137), TP -1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transfer, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antigen asociat tumorii CA 125, antigen asociat tumorii care exprimă carbohidrat înrudit cu Lewis Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Urokinază, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherină, VE-cadherină-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antigene virale, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrin, von Willebrands factor, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD şi receptori pentru hormoni şi factori de creştere.

Antigene exemplificative care pot fi ţintite în mod specific de imunoglobulinele conform invenţiei includ, dar fără să se limiteze la: CD20, CD19, Her2, EGFR, EpCAM, CD3, FcγRIIIa (CD16), FcγRIIa (CD32a), FcγRIIb (CD32b), FcγRI (CD64), Receptor Toll-like (TLR) precum TLR4 şi TLR9, citokine precum IL-2, IL-5, IL-13, IL-12, IL-23 şi TNFα, receptori de citokine cum ar fi IL-2R, chemokine, receptori de chemokine, factori de creştere precum VEGF şi HGF, şi altele asemenea. Pentru a forma anticorpii bispecifici conform invenţiei, se pot face anticorpi împotriva oricărei combinaţii a acestor antigene; adică, fiecare dintre aceste antigene poate fi inclus sau exclus opţional şi independent dintr-un anticorp bispecific conform prezentei invenţii.

Combinaţiile preferate în mod special pentru anticorpii bispecifici sunt un domeniu de legare la antigenul CD3 şi un domeniu de legare la antigen selectat dintre un domeniu care se leagă la CD19, CD20, CD38 şi CD123, ale căror secvenţe sunt prezentate în Figuri.

Acizi nucleici conform invenţiei

Invenţia prezintă în plus compoziţii de acid nucleic care codifică anticorpii bispecifici conform invenţiei. Aşa cum va fi apreciat de specialiştii din domeniu, compoziţiile de acid nucleic vor depinde de formatul şi scaffoldul proteinei heterodimerice. Astfel, de exemplu, atunci când formatul necesită trei secvenţe de aminoacizi, cum ar fi pentru formatul triplu F (de exemplu, un prim monomer de aminoacizi cuprinzând un domeniu Fc şi un scFv, un al doilea monomer de aminoacizi cuprinzând un lanţ greu şi un lanţ uşor), trei secvenţe de acid nucleic pot fi încorporate în unul sau mai mulţi vectori de expresie pentru exprimare. În mod similar, unele formate (de exemplu, formate scFv duale aşa cum ar fi dezvăluit în Figura 1) necesită doar doi acizi nucleici; din nou, aceştia pot fi puşi în unul sau doi vectori de expresie.

După cum se ştie în domeniu, acizii nucleici care codifică componentele conform invenţiei pot fi încorporaţi în vectori de expresie aşa cum se cunoaşte în domeniu şi în funcţie de celulele gazdă utilizate pentru a produce anticorpii heterodimerici conform invenţiei. În general, acizii nucleici sunt legaţi în mod operabil la orice număr de elemente reglatoare (promotori, originea replicării, markeri selectabili, situsuri de legare ribozomală, inductori etc.). Vectorii de expresie pot fi vectori extra-cromozomiali sau cu integrare.

Acizii nucleici şi/sau vectorii de expresie sunt apoi transformaţi în orice număr de tipuri diferite de celule gazdă aşa cum este bine cunoscut în domeniu, incluzând celule de mamifere, bacteriene, de drojdii, de insecte şi/sau fungice, iar celulele de mamifere (de exemplu, celule CHO) îşi găsesc utilizare în multe variante de realizare.

În unele exemple, acizii nucleici care codifică fiecare monomer şi acid nucleic opţional care codifică un lanţ uşor, după caz, în funcţie de format, sunt fiecare conţinuţi într-un singur vector de expresie, în general sub aceiaşi agenţi de control promotori diferiţi sau identici. În exemple de utilizare particulară în prezenta invenţie, fiecare dintre aceşti doi sau trei acizi nucleici este conţinut pe un vector de expresie diferit. Aşa cum se arată în lucrarea de faţă şi în US20150307629 pot fi utilizate diferite rapoarte de vectori pentru a conduce la formarea heterodimerului. Adică, în mod surprinzător, deşi proteinele cuprind primul monomer:al doilea monomer:lanţuri uşoare (în cazul multora dintre variantele de realizare din lucrarea de faţă care au trei polipeptide care constituie anticorpul heterodimeric) într-un raport de 1:1:2, acestea nu sunt rapoartele care dau cele mai bune rezultate.

Anticorpii heterodimerici conform invenţiei sunt fabricaţi prin cultivarea celulelor gazdă cuprinzând vectorul(-ii) de expresie aşa cum este bine cunoscut în domeniu. Odată produşi, se efectuează etape uzuale de purificare a anticorpilor, incluzând o etapă de cromotografie cu schimb de ioni. Aşa cum s-a discutat în lucrarea de faţă, având pI-urile celor doi monomeri diferite cu cel puţin 0,5 poate permite separarea prin cromatografie cu schimb de ioni sau focalizare izoelectrică sau alte metode sensibile la punctul izoelectric. Adică, includerea de substituţii de pI care modifică punctul izoelectric (pI) al fiecărui monomer astfel încât fiecare monomer să aibă un pI diferit şi heterodimerul să aibă şi el un pI distinct, facilitând astfel purificarea izoelectrică a heterodimerului "triplu F" (de exemplu, coloane de schimb anionic, coloane de schimb cationic). Aceste substituţii ajută, de asemenea, la determinarea şi monitorizarea oricăror contaminanţi scFv-Fc duali şi homodimeri de mAb post-purificare (de exemplu, geluri IEF, cIEF şi coloane IEX analitice).

Tratamente

Odată fabricate, compoziţiile îşi găsesc utilizarea într-o serie de aplicaţii. CD20, CD38 şi CD123 sunt toate nereglate în multe afecţiuni maligne hematopoietice şi în linii celulare derivate din diferite afecţiuni maligne hematopoietice, în consecinţă, anticorpii heterodimerici conform invenţiei îşi găsesc utilizarea în tratarea cancerului, incluzând, fără să se limiteze la, toate limfoamele şi leucemiile cu celule B, care includ dar fără să se limiteze la, limfom non-Hodgkin (NHL), limfom Burkitt (BL), mielom multiplu (MM), leucemie limfocitară cronică B (B-CLL), leucemie limfocitară acută B şi T (ALL), limfom cu celule T (TCL), leucemie mieloidă acută (AML), leucemie cu celule păroase (HCL), limfom Hodgkin (HL), leucemie limfocitară cronică (CLL), limfom non-Hodgkin şi leucemie mieloidă cronică (CML).

În consecinţă, compoziţiile heterodimerice îşi găsesc utilizarea în tratamentul acestor cancere.

Compoziţii de anticorpi pentru administrare in vivo

Formulările cu anticorpii utilizaţi sunt preparate pentru depozitare prin amestecarea unui anticorp având gradul de puritate dorit cu purtători, excipienţi sau stabilizatori acceptabili farmaceutic (Remington's Pharmaceutical Sciences, ediţia a 16-a, Osol, A. Ed. \tab, sub formă de formulări liofilizate sau soluţii apoase. Purtătorii, excipienţii sau stabilizatorii acceptabili nu sunt toxici pentru primitori la dozele şi concentraţiile utilizate şi includ agenţi de tamponare precum fosfat, citrat şi alţi acizi organici; antioxidanţi, incluzând acid ascorbic şi metionină; conservanţi (cum ar fi clorură de octadecildimetilbenzil amoniu; clorură de hexametoniu; clorură de benzalconiu, clorură de benzetoniu; fenol, alcool butilic sau benzilic; alchil parabeni precum metil sau propil paraben; catecol; rezorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; şi m-crezol); polipeptide cu masă moleculară mică (mai puţin de aproximativ 10 reziduuri); proteine, cum ar fi albumina serică, gelatina sau imunoglobulinele; polimeri hidrofili cum ar fi polivinilpirolidona; aminoacizi precum glicină, glutamină, asparagină, histidină, arginină sau lizină; monozaharide, dizaharide şi alţi carbohidraţi, incluzând glucoză, manoză sau dextrine; agenţi chelatori precum EDTA; zaharuri precum zaharoză, manitol, trehaloză sau sorbitol; contra-ioni care formează sare, cum ar fi sodiu; complexe metalice (de exemplu, complexe Zn-proteină); şi/sau surfactanţi (agenţi tensioactivi) neionici precum TWEEN™, PLURONICS™ sau polietilen glicol (PEG). Formularea din lucrarea de faţă poate conţine, de asemenea, mai mult de un compus activ, după cum este necesar pentru indicaţia particulară care este tratată, de preferinţă, aceia cu activităţi complementare care nu se influenţează negativ reciproc. De exemplu, poate fi de dorit să se furnizeze anticorpi cu alte specificităţi. Alternativ, sau în plus, compoziţia poate cuprinde un agent citotoxic, citokină, agent inhibitor al creşterii şi/sau antagonist cu moleculă mică. Astfel de molecule sunt prezente în mod adecvat în combinaţie în cantităţi care sunt eficiente pentru scopul dorit. Ingredientele active pot fi, de asemenea, prinse în microcapsule preparate, de exemplu, prin tehnici de coacervare sau prin polimerizare interfacială, de exemplu, hidroximetilceluloză sau microcapsule de gelatină şi, respectiv, microcapsule de poli- (metilmetacilat) în sisteme de eliberare de medicament coloidale (de exemplu, lipozomi, microsfere de albumină, microemulsii, nano-particule şi nanocapsule) sau în macroemulsii. Astfel de tehnici sunt dezvăluite în Remington's Pharmaceutical Sciences ediţia a 16-a, Osol, A. Ed. (1980). Formulările care trebuie utilizate pentru administrarea in vivo trebuie să fie sterile, sau aproape. Acest lucru este uşor realizat prin filtrare prin membrane de filtrare sterile. Se pot realiza preparate cu eliberare susţinută. Exemple adecvate de preparate cu eliberare susţinută includ matrici semipermeabile de polimeri solizi hidrofobi care conţin anticorpul, matrici care sunt sub formă de articole modelate, de exemplu filme sau microcapsule. Exemplele de matrici cu eliberare susţinută includ poliesteri, hidrogeluri (de exemplu, poli(2-hidroxietil-metacrilat) sau alcool poli(vinilic)), polilactide (Brevet SUA Nr. 3.773.919), copolimeri ai acidului L-glutamic şi gamma. etil-L-glutamat, etilen-vinil acetat nedegradabil, copolimeri de acid lactic-acid glicolic degradabili precum LUPRON DEPOT™ (microsfere injectabile compuse din copolimer de acid lactic-acid glicolic şi acetat de leuprolidă) şi acid poli-D-(-)-3-hidroxibutiric. Deşi polimeri precum etilen-vinil acetat şi acid lactic-acid glicolic permit eliberarea moleculelor timp de peste 100 de zile, anumite hidrogeluri eliberează proteine pentru perioade mai scurte de timp. Atunci când anticorpii încapsulaţi rămân în organism pentru o lungă perioadă de timp, aceştia se pot denatura sau se pot agrega ca urmare a expunerii la umiditate la 37°C, rezultând o pierdere a activităţii biologice şi posibile modificări ale imunogenităţii. Pot fi concepute strategii raţionale pentru stabilizare în funcţie de mecanismul implicat. De exemplu, dacă se descoperă că mecanismul de agregare este formarea de legături intermoleculare S-S prin inter-schimb tio-disulfură, stabilizarea poate fi realizată prin modificarea reziduurilor de sulfhidril, liofilizarea din soluţii acide, controlul conţinutului de umiditate, utilizarea aditivilor corespunzători şi dezvoltarea de compoziţii cu matrice polimerică specifică.

Modalităţi de administrare

Anticorpii şi agenţii chimioterapeutici sunt administraţi la un subiect, în conformitate cu metode cunoscute, cum ar fi administrarea intravenoasă sub formă de bolus sau prin perfuzie continuă pe o perioadă de timp, pe cale intramusculară, intraperitoneală, intracerebrospinală, subcutanată, intraarticulară, intrasinovială, intratecală, orală, topică sau prin inhalare. Este preferată administrarea intravenoasă sau subcutanată a anticorpului.

Modalităţi de tratament

În metode, terapia este utilizată pentru a furniza un răspuns terapeutic pozitiv cu privire la o boală sau afecţiune. Prin "răspuns terapeutic pozitiv" se intenţionează o îmbunătăţire a bolii sau a afecţiuneşi/sau o ameliorare a simptomelor asociate bolii sau afecţiunii. De exemplu, un răspuns terapeutic pozitiv s-ar referi la una sau mai multe dintre următoarele îmbunătăţiri ale bolii: (1) o reducere a numărului de celule neoplazice; (2) o creştere a morţii celulelor neoplazice; (3) inhibarea supravieţuirii celulelor neoplazice; (5) inhibarea (de exemplu, încetinirea într-o oarecare măsură, preferabil oprirea) creşterii tumorii; (6) o rată crescută de supravieţuire a pacientului; şi (7) o anumită ameliorare pentru unul sau mai multe simptome asociate bolii sau afecţiunii.

Răspunsuri terapeutice pozitive în orice boală sau afecţiune pot fi determinate prin criterii de răspuns standardizate specifice acelei boli sau afecţiuni. Răspunsul tumoral poate fi evaluat pentru modificări ale morfologiei tumorale (adică, încărcătura tumorală globală, mărimea tumorii şi altele asemenea) utilizând tehnici de screening, cum ar fi imagistica prin rezonanţă magnetică (IRM), imagistica radiografică-x, scanarea tomografică computerizată (CT), imagistica prin scanarea osului, endoscopie şi eşantionarea biopsiei tumorale, incluzând aspiraţia măduvei osoase (BMA) şi numărarea celulelor tumorale în circulaţie.

În plus faţă de aceste răspunsuri terapeutice pozitive, subiectul supus terapiei poate manifesta efectul benefic al unei ameliorări a simptomelor asociate bolii.

O îmbunătăţire a bolii poate fi caracterizată ca un răspuns complet. Prin "răspuns complet" se intenţionează absenţa bolii detectabile clinic cu normalizarea oricărui studiu radiografic anormal anterior, măduvei osoase şi lichidului cefalorahidian (LCR) sau proteinei monoclonale anormale în cazul mielomului.

Un astfel de răspuns poate persista cel puţin 4 până la 8 săptămâni, sau uneori 6 până la 8 săptămâni, după tratamentul conform metodelor conform invenţiei. Alternativ, o îmbunătăţire a bolii poate fi clasificată ca fiind un răspuns parţial. Prin "răspuns parţial" se intenţionează să însemne cel puţin o scădere cu aproximativ 50% a oricărei încărcări tumorale măsurabile (adică, numărul de celule maligne prezente la subiect, sau volumul măsurat de mase tumorale sau cantitatea de proteină monoclonală anormală) în absenţa de leziuni noi, care pot persista 4 până la 8 săptămâni sau 6 până la 8 săptămâni.

Tratamentul include o "cantitate eficientă terapeutic" din medicamentele utilizate. O "cantitate eficientă terapeutic" se referă la o cantitate eficientă, la doze şi pentru perioade de timp necesare, pentru a obţine rezultatul terapeutic dorit.

O cantitate eficientă terapeutic poate varia în funcţie de factori precum starea de boală, vârsta, sexul şi greutatea individului şi capacitatea medicamentelor de a provoca un răspuns dorit la individ. O cantitate eficientă terapeutic este, de asemenea, una în care orice efect toxic sau dăunător al anticorpului sau al porţiunii de anticorp este compensat de efectele benefice terapeutic.

O "cantitate eficientă terapeutic" pentru terapia tumorală poate fi măsurată, de asemenea, prin capacitatea sa de a stabiliza progresia bolii. Capacitatea unui compus de a inhiba cancerul poate fi evaluată într-un sistem de model animal de predictie a eficacităţii la tumori umane.

Alternativ, această proprietate a unei compoziţii poate fi evaluată prin examinarea capacităţii compusului de a inhiba creşterea celulelor sau de a induce apoptoza prin teste in vitro cunoscute de către specialistul calificat. O cantitate eficientă terapeutic dintr-un compus terapeutic poate reduce mărimea tumorii sau poate ameliora altfel simptomele la un subiect. O persoană cu calificare obişnuită în domeniu ar putea determina astfel de cantităţi pe baza unor factori precum mărimea subiectului, severitatea simptomelor subiectului şi compoziţia particulară sau calea de administrare selectată.

Regimurile de dozare sunt ajustate pentru a oferi răspunsul dorit optim (de exemplu, un răspuns terapeutic). De exemplu, poate fi administrat un singur bolus, pot fi administrate mai multe doze divizate în timp sau doza poate fi proporţional redusă sau crescută, după cum este indicat de cerinţele situaţiei terapeutice. Compoziţiile parenterale pot fi formulate sub formă de unitate de dozare pentru uşurarea administrării şi uniformitatea dozării. Forma de unitate de dozare, aşa cum este utilizată aici, se referă la unităţi separate fizic adecvate ca doze unitate pentru subiecţii care urmează să fie trataţi; fiecare unitate conţine o cantitate predeterminată de compus activ calculată pentru a produce efectul terapeutic dorit în asociere cu purtătorul farmaceutic necesar.

Specificaţiile pentru formele de unitate de dozare sunt dictate de şi direct dependente de (a) caracteristicile unice ale compusului activ şi efectul terapeutic particular care trebuie atins şi (b) limitările inerente în domeniul producerii compoziţiilor dintr-un astfel de compus activ pentru tratamentul sensibilităţii la indivizi.

Dozele eficiente şi regimurile de dozaj pentru anticorpii bispecifici depind de boala sau afecţiunea de tratat şi pot fi determinate de persoanele de specialitate în domeniu.

Un domeniu exemplificativ, nelimitativ, pentru o cantitate eficientă terapeutic dintr-un anticorp bispecific utilizat în prezenta invenţie este de aproximativ 0,1-100 mg/kg, cum ar fi aproximativ 0,1-50 mg/kg, de exemplu aproximativ 0,1-20 mg/kg, cum ar fi aproximativ 0,1-10 mg/kg, de exemplu aproximativ 0,5, aproximativ cum ar fi 0,3, aproximativ 1, sau aproximativ 3 mg/kg. Într-o altă variantă de realizare, anticorpul este administrat într-o doză de 1 mg/kg sau mai mult, cum ar fi o doză de la 1 până la 20 mg/kg, de exemplu o doză de la 5 până la 20 mg/kg, de exemplu o doză de 8 mg/kg.

Un profesionist din domeniul medical având abilităţi obişnuite în domeniu poate determina şi prescrie cu uşurinţă cantitatea eficientă a compoziţiei farmaceutice necesare. De exemplu, un medic sau un medic veterinar ar putea începe cu doze ale medicamentului utilizate în compoziţia farmaceutică la niveluri mai mici decât cel necesare pentru a obţine efectul terapeutic dorit şi pot creşte treptat doza până la atingerea efectului dorit.

Într-un exemplu, anticorpul bispecific este administrat prin perfuzie într-o doză săptămânală de la 10 până la 500 mg/kg, cum ar fi de la 200 până la 400 mg/kg. O astfel de administrare poate fi repetată, de exemplu, de 1 până la 8 ori, cum ar fi de 3 până la 5 ori. Administrarea poate fi efectuată prin perfuzie continuă pe o perioadă de la 2 până la 24 de ore, cum ar fi de la 2 până la 12 ore.

Într-un exemplu, anticorpul bispecific este administrat prin perfuzie continuă lentă pe o perioadă lungă, cum ar fi mai mare de 24 de ore, dacă este necesar pentru a reduce efectele secundare, incluzând toxicitatea.

Într-un exemplu, anticorpul bispecific este administrat într-o doză săptămânală de la 250 mg până la 2000 mg, cum ar fi de exemplu 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg sau 2000 mg, de până la 8 ori, cum ar fi de la 4 până la de 6 ori. Administrarea poate fi efectuată prin perfuzie continuă pe o perioadă de la 2 până la 24 de ore, cum ar fi de la 2 până la 12 ore. Un astfel de regim poate fi repetat de una sau mai multe ori după cum este necesar, de exemplu, după 6 luni sau 12 luni. Dozajul poate fi determinat sau ajustat prin măsurarea cantităţii de compus din prezenta invenţie în sânge după administrare, de exemplu, prelevând o probă biologică şi folosind anticorpi anti-idiotipici care vizează regiunea de legare la antigen a anticorpului bispecific.

Într-un alt exemplu, anticorpul bispecific este administrat o dată pe săptămână timp de 2 până la 12 săptămâni, cum ar fi timp de 3 până la 10 săptămâni, cum ar fi timp de 4 până la 8 săptămâni.

Într-un exemplu, anticorpul bispecific este administrat prin terapie de întreţinere, cum ar fi, de exemplu, o dată pe săptămână pentru o perioadă de 6 luni sau mai mult.

Într-un exemplu, anticorpul bispecific este administrat printr-un regim care include o perfuzie dintr-un anticorp bispecific urmată de o perfuzie dintr-un anticorp bispecific conjugat cu un radioizotop. Regimul poate fi repetat, de exemplu, 7 până la 9 zile mai târziu.

Ca exemple nelimitative, tratamentul conform prezentei invenţii poate fi furnizat ca o doză zilnică dintr-un anticorp într-o cantitate de aproximativ 0,1-100 mg/kg, cum ar fi 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 sau 100 mg/kg, pe zi, în cel puţin una dintre ziua 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 sau 40 sau, alternativ, cel puţin una din săptămâna 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 sau 20 după iniţierea tratamentului sau orice combinaţie a acestora, utilizând doze unice sau divizate la fiecare 24, 12, 8, 6, 4 sau 2 ore, sau orice combinaţie a acestora.

În unele exemple, molecula de anticorp bispecific a acestuia este utilizată în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari, de exemplu un agent chimioterapeutic. Exemple nelimitative de agenţi chimioterapeutici care degradează ADN-ul includ inhibitori ai topoizomerazei I (de exemplu, irinotecan, topotecan, camptotecină şi analogi sau metaboliţi ai acestora, şi doxorubicină); inhibitori de topoizomerază II (de exemplu, etopozidă, tenipozidă şi daunorubicină); agenţi alchilanţi (de exemplu, melfalan, clorambucil, busulfan, tiotepa, ifosfamidă, carmustină, lomustină, semustină, streptozocină, decarbazină, metotrexat, mitomicină C şi ciclofosfamidă); intercalatori de ADN (de exemplu, cisplatină, oxaliplatină şi carboplatină); intercalatori de ADN şi generatori de radicali liberi, cum ar fi bleomicina; şi mimetice nucleozidice (de exemplu, 5-fluorouracil, capecitibină, gemcitabină, fludarabină, citarabină, mercaptopurină, tioguanină, pentostatină şi hidroxiuree).

Agenţi chimioterapeutici care întrerup replicarea celulară includ: paclitaxel, docetaxel şi analogi înrudiţi; vincristină, vinblastină şi analogi înrudiţi; talidomidă, lenalidomidă şi analogi înrudiţi (de exemplu, CC-5013 şi CC-4047); inhibitori de protein tirozin kinază (de exemplu, imatinib mesilat şi gefitinib); inhibitori de proteazom (de exemplu, bortezomib); Inhibitori de NF-kB, incluzând inhibitori ai kinazei IKB; anticorpi care se leagă de proteine supraexprimate în cancere şi, prin urmare, reglează descendent replicarea celulară (de exemplu, trastuzumab, rituximab, cetuximab şi bevacizumab); şi alţi inhibitori ai proteinelor sau enzimelor cunoscute a fi reglate pozitiv, supra-exprimate sau activate în cancere, a căror inhibare reglează descendent replicarea celulară.

În unele exemple, anticorpii pot fi utilizaţi înainte de, concomitent cu sau după tratamentul cu Velcade® (bortezomib).

EXEMPLE

Exemple sunt furnizate mai jos pentru a ilustra prezenta invenţie. Aceste exemple nu sunt menite să limiteze prezenta invenţie la vreo aplicaţie sau teorie de funcţionare particulară. Pentru toate poziţiile regiunii constante discutate în prezenta invenţie, numerotarea este în conformitate cu indexul UE ca în Kabat (Kabat şi colab., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, ediţia a 5-a, United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). Specialiştii în domeniul anticorpilor vor aprecia că această convenţie constă în numerotarea non-secvenţială în regiuni specifice ale unei secvenţe de imunoglobulină, permiţând o referire normalizată la poziţii conservate în familii de imunoglobuline. În consecinţă, poziţiile oricărei imunoglobuline date, definite prin indexul UE, nu vor corespunde obligatoriu secvenţei sale secvenţiale.

Tehnici ştiinţifice generale şi specifice sunt prezentate în Publicaţiile SUA 2015/0307629, 2014/0288275 şi WO2014/145806.

EXEMPLE

EXEMPLUL 1: FORMATE ALTERNATIVE

Producţia de Agenţi Bispecifici

Scheme desenate ale agenţilor bispecifici anti-CD38 x anti-CD3 sunt prezentate în Figurile 1. Secvenţele de aminoacizi pentru agenţi bispecifici anti-CD38 x anti-CD3 cu format alternativ sunt expuse în Figura 39 până în Figura 43. ADN-ul care codifică cele trei lanţuri necesare pentru exprimarea agenţilor bispecifici a fost generat prin sinteza genelor (Blue Heron Biotechnology, Bothell, Wash.) şi a fost subclonat folosind tehnici standard de biologie moleculară în vectorul de expresie pTT5. Substituţiile au fost introduse folosind fie mutageneză direcţionată pe situs (QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, Tex.), fie sinteză de gene suplimentare şi subclonare. ADN-ul a fost transfectat în celule HEK293E pentru exprimare şi proteinele rezultate au fost purificate din supernatant folosind afinitatea de proteină A (GE Healthcare) şi cromatografia cu schimb de cationi. Randamentele după purificarea prin afinitate de proteină A sunt prezentate în Figura 35. Purificarea prin cromatografie cu schimb de cationi a fost efectuată utilizând o coloană HiTrap SP HP (GE Healthcare) cu un tampon de spălare/echilibrare de 50 mM MES, pH 6,0 şi un tampon de eluare de 50 mM MES, pH 6,0 + 1 M NaCl gradient liniar (vezi Figura 36 pentru cromatograme).

Citotoxicitatea celulelor T redirecţionate

Agenţi bispecifici anti-CD38 x anti-CD3 au fost caracterizaţi in vitro pentru citotoxicitatea celulelor T redirecţionate (RTCC) a liniei de celule de mielom CD38+ RPMI8266. 10k celule RPMI8266 au fost incubate timp de 24 de ore cu 500k PBMC-uri umane. RTCC a fost măsurată prin fluorescenţă de LDH aşa cum s-a indicat (vezi Figura 37).

EXEMPLUL 2

Citotoxicitatea celulelor T redirecţionate

Agenţi bispecifici anti-CD38 x anti-CD3 Fab-scFv-Fc au fost caracterizaţi in vitro pentru citotoxicitatea celulelor T redirecţionate (RTCC) a liniei celulare de mielom CD38+ RPMI8266. 40k celule RPMI8266 au fost incubate timp de 96 de ore cu 400k PBMC-uri umane. RTCC a fost măsurată prin citometrie în flux aşa cum s-a indicat (vezi Figura 44). Exprimarea de către celule T CD4+ şi CD8+ a CD69, Ki-67 şi PI-9 au fost, de asemenea, caracterizate prin citometrie în flux şi sunt prezentate în Figura 45.

Modelul de şoarece al activităţii antitumorale

Patru grupuri de cinci şoareci NOD scid gamma (NSG) au fost grefaţi fiecare cu 5x106 celule tumorale RPMI8226TrS (mielom multiplu, care exprimă luciferază) prin injectarea intravenoasă în vena cozii în ziua -23. În ziua 0, şoarecii au fost grefaţi intraperitoneal cu 10x106 PBMC-uri umane. După grefarea de PBMC în Ziua 0, articolele testate sunt administrate săptămânal (Zilele 0, 7) prin injecţie intraperitoneală la nivelurile de doză indicate în Figura 4. Proiectarea studiului este rezumată suplimentar în Figura 46. Creşterea tumorii a fost monitorizată prin măsurarea fluxului total per şoarece folosind un sistem de imagistică in vivo (IVIS®). Atât XmAb13551, cât şi XmAb15426 au prezentat efecte antitumorale substanţiale (vezi Figura 47 şi Figura 48).

Studii la maimuţa Cynomolgus

La maimuţe Cynomolgus s-a administrat o doză unică de agenţi bispecifici anti-CD38 x anti-CD3. A fost inclus şi un martor bispecific anti-RSV x anti-CD3. Nivelurile de doze au fost: 20 µg/kg XmAb13551 (n=2), 0,5 mg/kg XmAb15426 (n=3), 3 mg/kg XmAb14702 (n=3) sau 3 mg/kg XmAb13245 (martor anti-RSV x anti-CD3, n=3) (în 3 studii independente). Agenţii bispecifici anti-CD38 x anti-CD3 au epuizat rapid celulele CD38+ din sângele periferic (vezi Figura 49). Agenţii bispecifici anti-CD38 x anti-CD3 au dus la activarea celulelor T măsurată prin exprimarea de CD69 (vezi Figura 50). Nivelurile serice de IL-6 au fost, de asemenea, măsurate (vezi Figura 51). De reţinut că, comparativ cu XmAb13551, XmAb15426 a avut o durată crescută de epuizare a celulelor CD38+ şi niveluri mai scăzute de activare a celulelor T şi de producţie de IL-6.

XmAb15426 şi XmAb14702 au fost testaţi la doze unice de 0,5 mg/kg şi respectiv 3 mg/kg. Ambii anticorpi au fost bine toleraţi la aceste doze superioare, în concordanţă cu nivelurile moderate de IL6 observate în serul de la maimuţele tratate. Mai mult, XmAb15426, cu afinitate pentru CD3 intermediară, a epuizat mai eficient celulele CD38+ la 0,5 mg/kg comparativ cu XmAb13551 original cu afinitate mare administrat la nivel de 2, 5 sau 20 µg/kg. Epuizarea de către XmAb15426 a fost mai susţinută comparativ cu cea mai mare doză de XmAb13551 din studiul anterior (respectiv 7 faţă de 2 zile). În mod special, deşi epuizarea celulelor ţintă a fost mai mare pentru XmAb15426, activarea celulelor T (inducerea de CD69, CD25 şi PD1) a fost mult mai mică la maimuţele tratate cu XmAb15426 chiar cu administrare cu o doză de 25 de ori mai mare decât grupul cu administrare de 20 µg/kg XmAb13551. XmAb14702, cu afinitate pentru CD3 foarte scăzută, a avut efect slab asupra celulelor CD38+ şi asupra activării celulelor T.

Aceste rezultate demonstrează că modularea activării celulelor T prin atenuarea afinităţii pentru CD3 este o metodă promiţătoare de îmbunătăţire a ferestrei terapeutice a anticorpilor bispecifici care se cuplează cu celule T. Această strategie are potenţialul de a extinde setul de antigene care pot fi supuse la imunoterapie ţintită cu celule T, îmbunătăţind tolerabilitatea şi permiţând o adminisgrare de doză mai mare pentru a depăşi clearance-ul de scădere a antigenului în cazul ţintelor precum CD38. Am arătat că prin reducerea afinităţii pentru CD3, XmAb 15426 epuizează în mod eficient celulele CD38+, reducând la minim în acelaşi timp efectele CRS aşteptate cu doze comparabile ale omologului său cu afinitate ridicată XmAb13551.

Claims (11)

1. Anticorp heterodimeric anti-CD3 x anti-CD20 care cuprinde fiecare dintre polipeptidele HC1 (Fab-Fc), HC2 (scFv-Fc) şi LC din Figura 74.

2. Anticorpul heterodimeric în conformitate cu revendicarea 1, constând din HC1 (Fab-Fc), HC2 (scFv-Fc) şi LC din Figura 74.

3. Compoziţie de acizi nucleici cuprinzând trei acizi nucleici care codifică anticorpul heterodimeric în conformitate cu revendicarea 1 sau revendicării 2.

4. Compoziţie de vectori de expresie cuprinzând trei vectori de expresie conţinând fiecare un acid nucleic astfel încât cei trei vectori de expresie codifică anticorpul heterodimeric în conformitate cu revendicarea 1 sau revendicării 2.

5. Celulă gazdă cuprinzând compoziţia de acizi nucleici în conformitate cu revendicarea 3.

6. Celulă gazdă cuprinzând compoziţia de vectori de expresie în conformitate cu revendicarea 4.

7. Metodă de fabricare a anticorpului heterodimeric în conformitate cu revendicarea 1 sau revendicării 2 cuprinzând cultivarea celulei gazdă în conformitate cu revendicarea 5 sau revendicării 6 în condiţii în care anticorpul menţionat este exprimat şi recuperarea anticorpului menţionat.

8. Anticorp heterodimeric în conformitate cu revendicarea 1 sau revendicării 2 pentru utilizare în tratarea cancerului.

9. Anticorpul heterodimeric pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 8, în care cancerul menţionat este un cancer hematopoietic.

10. Anticorpul heterodimeric pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 9, în care cancerul hematopoietic menţionat este un limfom sau leucemie cu celule B.

11. Anticorpul heterodimeric pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 10, în care limfomul sau leucemia cu celule B menţionat(ă) este selectat(ă) din grupul constând din limfom non-Hodgkin (NHL), limfom Burkitt (BL), mielom multiplu (MM), leucemie limfocitară cronică B (B-CLL), leucemie limfocitară acută B şi T (ALL), leucemie mieloidă acută (AML), leucemie cu celule păroase (HCL), limfom Hodgkin (HL), leucemie limfocitară cronică (CLL) şi leucemie mieloidă cronică (CML).