MD3262046T2

MD3262046T2 - Săruri de inhibitori ai PI3K și procedee pentru prepararea lor

Info

Publication number: MD3262046T2
Application number: MDE20180031T
Authority: MD
Inventors: Lei Qiao; Lingkai Weng; Chongsheng Eric Shi; David Meloni; Qiyan Lin; Michael Xia; Vaqar Sharief; William Frietze; Zhongjiang Jia; Yongchun Pan; Pingli Liu; Tai-Yuen Yue; Jiacheng Zhou
Original assignee: Incyte Corp
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2021-03-31
Also published as: SG10201912302VA; EP3262046A1; SG11201706917WA; EA201791923A1; JP2021006532A; CL2017002179A1; CN117777139A; TW201636351A; SI3262046T1; KR20170132185A; SG10201907576SA; BR122021004509A2; CN107580597A; MA41607B1; WO2016138363A1; NZ773226A; US12024522B2; BR122021004509B1; US20220024934A1; US20250129079A1

Abstract

Prezenta cerere de brevet furnizează procedee pentru prepararea (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onei, care este utilă ca inhibitor al fosfoinozitidei 3-kinază-delta (PI3Kδ), precum şi a unei forme de sare şi a intermediarilor asociaţi cu aceasta.

Description

DOMENIUL TEHNIC

Prezenta cerere de brevet furnizează un procedeu pentru prepararea (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onei, care este utilă ca un inhibitor de fosfoinozitidă 3-kinază-delta (PI3Kδ), precum şi o formă de sare şi intermediari asociaţi acesteia.

FUNDAL

Fosfoinozitida 3-kinază (PI3K) aparţine unei familii largi de kinaze de semnalizare lipide care fosforilează fosfoinozitida la poziţia D3 a inelului inozitol (Cantley, Science, 2002, 296(5573): 1655-7). PI3K sunt divizate în trei clase (clasa I, II, şi III) în conformitate cu structura lor, reglarea şi specificitatea substratului. PI3K de clasă I, care includ PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ, şi PI3Kδ, sunt o familie de lipide şi protein kinaze cu specificitate duală care catalizează fosforilarea fosfatidilinozito-4,5-bisfosfatului (PIP2) dând naştere la fosfatidilinozito-3,4,5-trisfosfat (PIP3). PIP3 funcţionează ca al doilea mesager care controlează un număr de procese celulare, incluzând creşterea, supravieţuirea, adeziunea şi migraţia. Toate cele patru izoforme PI3K de clasă I există ca heterodimeri compuşi dintr-o subunitate catalitică (p110) şi o subunitate regulatoare strâns asociată care controlează expresia lor, activarea, şi localizarea subcelulară. PI3Kα, PI3Kβ, şi PI3Kδ sunt asociate cu o subunitate regulatoare cunoscută ca p85 şi sunt activate de factori de creştere şi citokine printr-un mecanism dependent de tirozin kinază (Jimenez, şi colab., J Biol Chem., 2002, 277(44):41556-62) în timp ce PI3Kγ este asociată cu două subunităţi regulatoare (p101 şi p84) şi activarea ei este condusă de activarea receptorilor cuplaţi cu proteina G (Brock, şi colab., J Cell Biol., 2003, 160(1):89-99). PI3Kα şi PI3Kβ sunt exprimate ubicuitar. În contrast, PI3Kγ şi PI3Kδ sunt exprimate predominant în leucocite (Vanhaesebroeck, şi colab., Trends Biochem Sci., 2005, 30(4):194-204).

Distribuţia diferită de ţesut a factorilor izoformi PI3K în funcţiile lor biologice distincte. Ablaţia genetică a PI3Kα sau PI3Kβ conduce la letalitate embrionică, care arată că PI3Kα şi PI3Kβ au funcţii esenţiale şi neredundante, cel puţin în timpul dezvoltării (Vanhaesebroeck, şi colab., 2005). În schimb, şoarecii care nu au PI3Kγ şi PI3Kδ sunt viabili, fertili şi au o perioadă de viaţă normală deşi prezintă un sistem imunitar alterat. Deficienţa de PI3Kγ conduce la recrutarea alterată a macrofagelor şi neutrofilelor la situsurile de inflamaţie precum şi activarea alterată a celulei T (Sasaki, şi colab., Science, 2000, 287(5455):1040-6). Şoarecii mutanţi PI3Kδ au defecte specifice în semnalizarea celulei B care conduce la dezvoltarea alterată a celulelor B şi la răspunsuri reduse ale anticorpilor după stimularea cu antigen (Clayton, şi colab., J Exp Med. 2002, 196(6):753-63; Jou, şi colab., Mol Cell Biol. 2002, 22(24):8580-91; Okkenhaug, şi colab., Science, 2002, 297(5583):1031-4).

Fenotipurile şoarecilor mutanţi PI3Kγ şi PI3Kδ sugerează că aceste enzime pot juca un rol în inflamaţie şi alte boli pe bază imună şi acest lucru este confirmat în modelele preclinice. Şoarecii mutanţi PI3Kγ sunt protejaţi pe larg de boală în modelele pe şoarece de artrită reumatoidă (RA) şi astm (Camps, şi colab., Nat Med. 2005, 11(9):936-43; Thomas, şi colab., Eur. J. Immunol. 2005, 35(4):1283-91). În plus, s-a arătat că tratamentul şoarecilor de tip sălbatic cu un inhibitor selectiv de PI3Kγ reduce glomerulonefritele şi supravieţuirea prelungită în modelul MRL-lpr de nefrite de lupus sistemic (SLE) şi suprimă inflamaţia şi deteriorarea articulaţiilor în modelele de RA (Barber, şi colab., Nat Med. 2005, 11(9):933-5; Camps, şi colab., 2005). Similar, s-a arătat că atȃt şoarecii mutanţi PI3Kδ cȃt şi şoarecii de tip sălbatic trataţi cu un inhibitor selectiv de PI3Kδ au inflamaţie alergică atenuată a căilor aeriene şi hiper-responsivitate într-un model pe şoarece de astm (Ali, şi colab., Nature. 2004, 431(7011):1007-11; Lee, şi colab., FASEB J. 2006, 20(3):455-65) şi au o boală atenuată într-un model de RA (Randis, şi colab., Eur. J. Immunol., 2008, 38(5): 1215-24).

S-a arătat că proliferarea celulei B joacă un rol major în dezvoltarea bolilor inflamatorii autoimune (Puri, Frontiers în Immunology (2012), 3(256), 1-16; Walsh, Kidney International (2007) 72, 676-682). De exemplu, celulele B susţin autoreactivitatea celulei T, o componentă importantă a bolilor inflamatorii autoimune. Odată activate şi maturate, celulele B pot trafica la situsurile de inflamaţie şi recruta celule inflamatorii sau diferenţia la plasmablaste. Astfel, activitatea celulelor B poate fi afectată de ţintirea citokinelor stimulatoare ale celulei B, receptorilor de suprafaţă ai celulei B, sau prin depleţia celulei B. S-a arătat că Rituximab, un anticorp monoclonal himeric de şoarece/uman IgG1 κ direcţionat împotriva receptorului de suprafaţă al celulei B, CD20, depletează celulele B CD20+. S-a arătat că utilizarea de rituximab are eficacitate în tratarea purpurei trombocitopenice idiopatice, anemiei hemolitice autoimune, sau vasculitei. De exemplu, tratamentul cu rituximab a condus la remisia bolii la pacienţii care suferă de vasculită sistemică (AASV) asociată anticorpului citoplasmatic anti-neutrofil (ANCA) cu depleţia demonstrată a celulei B periferice (Walsh, 2007; Lovric, Nephrol Dial Transplant (2009) 24: 179-185). Similar, un răspuns complet a fost raportat la o treime pȃnă la două treimi din pacienţii care au vasculită crioglobulinemică amestecată după tratamentul cu rituximab, incluzând pacienţii care au prezentat forme severe de vasculită care a fost rezistentă sau intolerantă la alte tratamente (Cacoub, Ann Rheum Dis 2008;67:283-287). S-a arătat similar că, rituximabul are eficacitate în tratarea pacienţilor cu purpură trombocitopenică idiopatică (sau purpură trombocitopenică imunitară) (Garvey, British Journal of Haematology, (2008) 141, 149-169; Godeau, Blood (2008), 112(4), 999-1004; Medeo, Europaan Journal of Haematology, (2008) 81, 165-169) şi anemie hemolitică autoimună (Garvey, British Journal of Haematology, (2008) 141, 149-169).

Semnalizarea PI3Kδ a fost legată de supravieţuirea, migraţia, şi activarea celulei B (Puri, Frontiers în Immunology, 2012, 3(256), 1-16, la paginile 1-5; şi Clayton, J Exp Med, 2002, 196(6):753-63). De exemplu, PI3Kδ este necesar pentru activarea celulei B dependentă de antigen, condusă de receptorul celulei B. Prin blocarea adeziunii, supravieţuirii, activării, şi proliferării celulei B, inhibarea PI3Kδ poate afecta abilitatea celulei B de a activa celulele T, prevenind activarea acestora şi reducerea secreţiei de autoanticorpi şi citokine proinflamatorii. Prin urmare, prin abilitatea lor de a inhiba activarea celulelor B, ar fi de aşteptat ca inhibitorii PI3Kδ să trateze bolile mediate de celula B care au fost tratabile prin metode similare cum ar fi depleţia celulei B cu rituximab. Într-adevăr, s-a arătat că inhibitorii PI3Kδ sunt utili pe modelele pe şoarece ale diferitelor boli autoimune care sunt de asemenea tratabile cu rituximab cum ar fi artrita (Puri (2012)). În plus, celulele native cum ar fi celulele B, care sunt legate de autoimunitate sunt sensibile la activitatea PI3Kδ, ca celulele MZ şi B-1 care sunt aproape absente la şoarecii care nu au gena p110δ (Puri (2012). Inhibitorii PI3Kδ pot reduce traficul de, şi activarea de celule MZ şi B-1, care sunt implicate în bolile autoimune.

În plus faţă de rolul lor potenţial în bolile inflamatorii, toate cele patru clase I de izoforme PI3K pot juca un rol în cancer. Gena care codifică p110α este mutată frecvent în cancerele obişnuite, incluzând la sân, la prostată, la colon şi endometrial (Samuels, şi colab., Science, 2004, 304(5670):554; Samuels, şi colab., Curr Opin Oncol. 2006, 18(1):77-82). Opt procente din aceste mutaţii sunt reprezentate de una din trei substituţii de aminoacizi în domeniile helicale sau kinază ale enzimei şi conduc la o reglare pozitivă semnificativă a activităţii kinazei conducând la transformarea oncogenică în cultura celulară şi în modele pe animale (Kang, şi colab., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005, 102(3):802-7; Bader, şi colab., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(5):1475-9). Nici o astfel de mutaţie nu a fost identificată la alte izoforme PI3K deşi există dovezi că ele pot contribui la dezvoltarea şi progresul malignităţilor. Supraexprimarea consistentă a PI3Kδ este observată în leucemia mieloblastică acută (Sujobert, şi colab., Blood, 2005, 106(3):1063-6) şi inhibitorii de PI3Kδ pot preveni creşterea celulelor leucemice (Billottet, şi colab., Oncogene. 2006, 25(50):6648-59). Expresia ridicată de PI3Kγ este văzută în leucemia mieloidă cronică (Hickey, şi colab., J Biol. Chem. 2006, 281(5):2441-50). Alterări în expresia PI3Kβ, PI3Kγ şi PI3Kδ au fost de asemenea observate în cancerele de creier, colon şi vezică (Benistant, şi colab., Oncogene, 2000, 19(44):5083-90; Mizoguchi, şi colab., Brain Pathol. 2004, 14(4):372-7; Knobbe, şi colab., Neuropathol Appl Neurobiol. 2005, 31(5):486-90). În plus, aceste izoforme au arătat că toate sunt oncogenice în cultura celulară (Kang, şi colab., 2006).

US 2014/249132 descrie derivaţi pirazolopirimidină pentru tratamentul tulburărilor înrudite cu PI3Kδ.

Din aceste motive, există o necesitate pentru dezvoltarea de noi inhibitori ai PI3K care să poată fi utilizaţi în tulburările inflamatorii, bolile autoimune şi cancer. Această invenţie este direcţionată spre această necesitate şi altele.

REZUMAT

Prezenta invenţie furnizează o sare care este sare a acidului clorhidric de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă, care este cristalină.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea o compoziţie farmaceutică cuprinzând sarea acidului clorhidric a invenţiei şi un purtător acceptabil farmaceutic.

Prezenta invenţie mai furnizează o metodă de inhibare a activităţii unei kinaze PI3Kδ, in vitro, cuprinzând punerea în contact a kinazei cu sarea acidului clorhidric a invenţiei.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea o sare a acidului clorhidric a invenţiei pentru utilizare în tratarea unei boli la un pacient, în care respectiva boală este definită în revendicări.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea un procedeu de preparare a sării acidului clorhidric a invenţiei, cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula I:

cu acidul clorhidric pentru a forma respectiva sare.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar utilizarea sării acidului clorhidric a compusului cu Formula I pentru fabricarea unui medicament pentru utilizare în oricare din metodele descrise aici.

Prezenta cerere de brevet furnizează de asemenea un procedeu de preparare a sării acidului clorhidric a compusului cu Formula I, cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula I:

cu acidul clorhidric pentru a forma respectiva sare.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un procedeu de preparare a unui compus cu Formula I, cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula XVI:

cu acetatul de formamidină pentru a forma compusul menţionat cu Formula I:

Prezenta cerere de brevet mai furnizează un compus cu Formula XIV:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează de asemenea un compus cu Formula XV:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un compus cu Formula XVI:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un compus cu Formula XIX:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează de asemenea un compus cu Formula XX:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un compus cu Formula XXI:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

DESCRIEREA DESENELOR

FIG. 1 prezintă o termogramă DSC reprezentativă a sării din exemplul 3.

FIG. 2 prezintă datele TGA reprezentative ale sării din exemplul 3.

FIG. 3 prezintă un tipar XRPD reprezentativ al sării din exemplul 3.

DESCRIERE DETALIATĂ

Compuşi şi Săruri

Sunt de asemenea descrise aici procedee care pot fi utilizate pentru prepararea unui compus cu Formula I:

sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia, care este utilă ca un inhibitor al PI3Kδ, în care Et este etil. De asemenea sunt descrişi intermediari asociaţi acestuia care pot fi utilizaţi pentru prepararea unui compus cu Formula I şi săruri ale acestuia.

. În unele realizări, sarea este un raport stoichiometric 1:1 de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă şi acid clorhidric.

Diferite forme ale aceleiaşi substanţe au diferite proprietăţi vrac referitoare la, de exemplu, higroscopicitate, solubilitate, stabilitate, şi altele asemenea. Formele cu puncte de topire ridicate au adesea o bună stabilitate termodinamică care este avantajoasă în prelungirea perioadei de viaţă a formulărilor medicamentoase care conţin forma solidă. Formele cu puncte de topire mai scăzute, sunt adesea mai puţin stabile termodinamic, dar sunt avantajoase prin aceea că ele au o solubilitate crescută în apă, translatȃnd la forme medicamentoase cu biodisponibilitate crescută care sunt slab higroscopice şi sunt dorite pentru stabilitatea lor la căldură şi umiditate şi sunt rezistente la degradare în timpul depozitării pe termen lung.

Sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I furnizat aici este cristalină. Aşa cum s-a utilizat în acest document, prin „cristalină« sau „formă cristalină« se înţelege că se referă la o anumită configuraţie structurală a unei substanţe cristaline. Diferitele forme cristaline ale aceleiaşi substanţe au de obicei diferite structuri cristaline (de exemplu, celule unitare) care sunt atribuite diferitelor proprietăţi fizice care sunt caracteristice fiecăreia din formele cristaline. În unele cazuri, diferite configuraţii structurale au conţinut diferit de apă sau solvent.

Diferitele forme de sare pot fi identificate prin metode de caracterizare a stării solide cum ar fi prin difracţie cu raze X pe pulbere (XRPD). Alte metode de caracterizare cum ar fi calorimetrie cu scanare diferenţială (DSC), analiză termogravimetrică (TGA), absorbţia dinamică a vaporilor (DVS), şi altele asemenea ajută suplimentar la identificarea formei precum şi ajută la determinarea stabilităţii şi a conţinutului solvent/apă.

Un tipar XRPD de reflexii (maxime) este de obicei considerat o amprentă a unei anumite forme cristaline. Este bine cunoscut că intensităţile relative ale maximelor XRPD pot varia pe larg depinzând de, inter alia, prepararea tehnică a mostrei, distribuţia dimensiunii cristalului, diferitele filtre utilizate, procedura de montare a mostrei, şi instrumentele particulare utilizate. În unele cazuri, pot fi observate noi maxime sau maximele existente pot dispare, depinzând de tipul instrumentului sau de setări. Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul „maxim« se referă la o reflexie având o înălţime/intensitate relativă de cel puţin aproximativ 4% din înălţimea/intensitatea maximă a maximului. Mai mult, variaţiile instrumentului şi alţi factori pot afecta valorile 2-teta. Astfel, asignarea maximelor, cum ar fi cele raportate aici, poate varia cu plus sau minus aproximativ 0,2° (2-teta), şi termenii „substanţial« şi „aproximativ« aşa cum s-au utilizat în contextul XRPD de aici se înţelege că cuprind variaţiile mai sus menţionate.

În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are cel puţin un maxim XRPD, în termeni de 2-teta, selectat dintre aproximativ 11,3°, aproximativ 16,4°, aproximativ 21,0°, aproximativ 23,0°, aproximativ 28,1°, aproximativ 31,2°, şi aproximativ 32,8°. În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are cel puţin dpuă maxime XRPD, în termeni de 2-teta, selectate dintre aproximativ 11,3°, aproximativ 16,4°, aproximativ 21,0°, aproximativ 23,0°, aproximativ 28,1°, aproximativ 31,2°, şi aproximativ 32,8°. În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are cel puţin trei maxime XRPD, în termeni de 2-teta, selectate dintre aproximativ 11,3°, aproximativ 16,4°, aproximativ 21,0°, aproximativ 23,0°, aproximativ 28,1°, aproximativ 31,2°, şi aproximativ 32,8°. În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are cel puţin patru maxime XRPD, în termeni de 2-teta, selectate dintre aproximativ 11,3°, aproximativ 16,4°, aproximativ 21,0°, aproximativ 23,0°, aproximativ 28,1°, aproximativ 31,2°, şi aproximativ 32,8°. În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are cel puţin cinci maxime XRPD, în termeni de 2-teta, selectate dintre aproximativ 11,3°, aproximativ 16,4°, aproximativ 21,0°, aproximativ 23,0°, aproximativ 28,1°, aproximativ 31,2°, şi aproximativ 32,8°. În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are un profil XRPD substanţial aşa cum se arată în Figura 3.

În acelaşi mod, citirile de temperatură în legătură cu DSC, TGA, sau alte experimente termice pot varia cu aproximativ ±3°C depinzând de instrument, setările particulare, prepararea mostrei, etc. Corespunzător, o formă cristalină raportată aici având o termogramă DSC „substanţial« aşa cum se arată în oricare din figuri, sau termenul „aproximativ« este înţeles să acomodeze o astfel de variaţie. În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are o termogramă DSC având un maxim endotermic la aproximativ 207°C. În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are o termogramă DSC substanţial aşa cum se arată în Figura 1. În unele realizări, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I are o termogramă TGA substanţial aşa cum se arată în Figura 2.

În unele realizări, sărurile şi compuşii descrişi aici (de exemplu, compusul cu Formula I sau sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I) sunt substanţial izolaţi. Prin „substanţial izolat« se înţelege că sarea sau compusul este cel puţin parţial sau substanţial separată din mediul în care a fost formată sau detectată. Separarea parţială poate include, de exemplu, o compoziţie îmbogăţită în sărurile descrise aici. Separarea substanţială poate include compoziţii conţinând cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 60%, cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% din masa sărurilor descrise aici, sau o sare a acestora. Metodele pentru izolarea compuşilor şi sărurilor lor sunt de rutină în domeniu.

Intermediari

Prezenta cerere de brevet mai furnizează intermediari care sunt utili în prepararea compusului cu Formula I.

Corespunzător, prezenta cerere de brevet furnizează un compus cu Formula XIV:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un compus cu Formula XV:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un compus cu Formula XVI:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un compus cu Formula XIX:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un compus cu Formula XX:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Prezenta cerere de brevet furnizează suplimentar un compus cu Formula XXI:

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Procedee

Prezenta invenţie furnizează suplimentar un procedeu de preparare a unei săruri de acid clorhidric cu Formula I:

cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula I:

cu acidul clorhidric pentru a forma respectiva sare.

În unele realizări, respectivul acid clorhidric este acidul clorhidric apos 1 M.

În unele realizări, de la aproximativ 3,3 până la aproximativ 3,7 echivalenţi de acid clorhidric sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula I.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie este efectuată la o temperatură de la aproximativ 45°C până la aproximativ 55°C.

În unele realizări, procedeul cuprinde:

• adăugarea de acid clorhidric la compusul cu Formula I la temperatura camerei pentru a forma o suspensie; • încălzirea respectivei suspensii până la o temperatură de la aproximativ 45°C până la aproximativ 55°C pentru a forma o soluţie; şi • răcirea soluţiei până la o temperatură de la aproximativ 0°C până la aproximativ 5°C la respectiva sare cristalizată. În unele realizări, procedeul cuprinde punerea în reacţie a unui compus cu Formula XVI:

cu acetat de formamidină pentru a forma un compus cu Formula I:

În unele realizări, respectiva punere în reacţie a unui compus cu Formula XVI cu acetat de formamidină este efectuată într-o componentă solvent cuprinzând 1,2-etandiol.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a unui compus cu Formula XVI cu acetat de formamidină este efectuată la o temperatură de la aproximativ 100°C până la aproximativ 105°C.

În unele realizări, aproximativ de la 8 până la aproximativ 10 echivalenţi de acetat de formamidină sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent de compus cu Formula XVI.

În unele realizări, procedeul cuprinde în plus prepararea compusului cu Formula XVI printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula XV:

cu (1-etoxietiliden)malononitril în prezenţa unei amine terţiare.

În unele realizări, respectiva amină terţiară este N-metilpirolidinonă.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie a unui compus cu Formula XV cu cu (1-etoxietiliden)malononitril este efectuată la aproximativ temperatura camerei.

În unele realizări, procedeul cuprinde în plus prepararea compusului cu Formula XV printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula XIV-a:

cu hidrazină în prezenţa unei amine terţiare, în care P1 este alchilsulfonil C1-6.

În unele realizări, respectiva amină terţiară este N-metilpirolidinonă.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a unui compus cu Formula XIV-a cu hidrazină este efectuată la o temperatură de la aproximativ 35°C până la aproximativ 60°C.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a unui compus cu Formula XIV-a cu hidrazină este efectuată într-o componentă solvent cuprinzând diclorometan.

În unele realizări, P1 este o grupare metansulfonil.

În unele realizări, procedeul cuprinde în plus prepararea compusului cu Formula XIV printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula XIII:

cu halogenură de alchilsulfonil C1-6 în prezenţa unei amine terţiare.

În unele realizări, respectiva halogenură de alchilsulfonil C1-6 este clorură de metansulfonil.

În unele realizări, respectiva amină terţiară este N,N-diizopropiletilamină.

În unele realizări, de la aproximativ 1,1 până la aproximativ 1,5 echivalenţi de halogenură de alchilsulfonil sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent de compus cu Formula XIII.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a compusului menţionat cu Formula XIII cu halogenură de alchilsulfonil C1-6 este efectuată la o temperatură de la aproximativ -10°C până la aproximativ 5°C.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a compusului menţionat cu Formula XIII cu halogenură de alchilsulfonil C1-6 este efectuată într-o componentă solvent cuprinzând diclorometan.

În unele realizări, etapele de: (i) punere în reacţie a compusului menţionat cu Formula XIII cu halogenură de alchilsulfonil C1-6; (ii) punerea în reacţie a unui compus menţionat cu Formula XIV-a cu hidrazină în prezenţa unei amine terţiare pentru a forma un compus cu Formula XV; şi (iii) punerea în reacţie a unui compus menţionat cu Formula XV cu acetat de formamidină pentru a forma un compus cu Formula XVI sunt efectuate în acelaşi recipient fără izolarea compusului cu Formula XIV-a sau a compusului cu Formula XV.

În unele realizări, procedeul cuprinde în plus prepararea compusului cu Formula XVI printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unei săruri cu Formula XV-a:

cu (1-etoxietiliden)malononitril în prezenţa unei amine terţiare, în care TsOH este acid p-toluensulfonic.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie a unei săruri cu Formula XV-a cu cu (1-etoxietiliden)malononitril este efectuată la aproximativ temperatura camerei.

În unele realizări, de la aproximativ 1,3 până la aproximativ 1,6 echivalenţi de (1-etoxietiliden)malononitril sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent de sare cu Formula XV-a.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a sării cu formula XV-a cu (1-etoxietiliden)malononitril este efectuată într-o componentă solvent cuprinzând etanol.

În unele realizări, procedeul cuprinzând în plus prepararea sării cu Formula XV-a printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu formula XXI:

cu acid p-toluensulfonic, în care Boc este terţ-butoxicarbonil.

În unele realizări, respectivul acid p-toluensulfonic este acid p-toluensulfonic monohidrat.

În unele realizări, de la aproximativ 1,3 până la aproximativ 1,6 echivalenţi de acid p-toluensulfonic sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula XXI.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie a compusului menţionat cu Formula XXI cu acid p-toluensulfonic este efectuată la o temperatură de la aproximativ 45°C până la aproximativ 65°C.

În unele realizări, punerea în reacţie a respectivului compus cu Formula XXI cu acid p-toluensulfonic este efectuată într-o componentă solvent cuprinzând etanol.

În unele realizări, etapele de: (i) punere în reacţie a unui compus menţionat cu Formula XXI cu acid p-toluensulfonic pentru a forma o sare cu Formula XV-a; şi (ii) punere în reacţie a respectivei sări cu Formula XV-a cu (1-etoxietiliden)malononitril sunt efectuate în acelaşi recipient fără izolarea sării cu Formula XV-a.

În unele realizări, procedeul cuprinde în plus prepararea compusului cu Formula XXI printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula XX:

cu gaz de hidrogen în prezenţa unuia sau mai multor catalizatori de hidrogenare selectaţi independent, în care Boc este terţ-butoxicarbonil.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a unui compus cu Formula XX cu gaz de hidrogen este efectuată în prezenţa a doi catalizatori de hidrogenare selectaţi independent.

În unele realizări, un catalizator de hidrogenare este bis(1,5-ciclooctadien)rodiu(I)tetrafluoroborat şi celălalt este (R)-(-)-1-{(S)-2-[bis(4-trifluorometilfenil)fosfină]ferocenil}etil-di-t-butilfosfină.

În unele realizări, de la aproximativ 13,5 până la aproximativ 14,5 echivalenţi de bis(1,5-ciclooctadien)rodiu(I)tetrafluoroborat sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula XX.

În unele realizări, de la aproximativ 12 până la aproximativ 13 echivalenţi de (R)-(-)-1-{(S)-2-[bis(4-trifluorometilfenil)fosfină]ferocenil}etil-di-t-butilfosfină sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula XX.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a unui compus cu Formula XX cu gaz de hidrogen este efectuată la aproximativ temperatura camerei.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a unui compus cu Formula XX cu gaz de hidrogen este efectuată într-o componentă solvent cuprinzând metanol.

În unele realizări, procedeul cuprinde în plus prepararea compusului cu Formula XX printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula XIX:

cu t-butil carbazat.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie a unui compus cu Formula XIX cu t-butil carbazat este efectuată la o temperatură de la aproximativ 60°C până la aproximativ 70°C.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie a unui compus cu Formula XIX cu t-butil carbazat este efectuată într-o componentă solvent cuprinzând metanol.

În unele realizări, procedeul cuprinde în plus prepararea compusului cu Formula XIX printr-un procedeu cuprinzând oxidarea unui compus cu Formula XIII-a:

în prezenţa unui agent oxidant.

În unele realizări, respectivul agent oxidant este periodinan Dess-Martin.

În unele realizări, de la aproximativ 1,2 până la aproximativ 1,7 echivalenţi din respectivul agent oxidant este utilizat pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula XIII-a.

În unele realizări, respectiva oxidare a compusului cu Formula XIII-a este efectuată la aproximativ temperatura camerei.

În unele realizări, repectiva oxidare a compusului cu Formula XIII-a este efectuată într-o componentă solvent cuprinzând diclorometan.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula XIII este preparat printr-un procedeu cuprinzând încălzirea unui compus cu Formula XII:

în prezenţa unui solvent component.

În unele realizări, respectiva încălzire este efectuată la o temperatură de la aproximativ 95°C până la aproximativ 105°C.

În unele realizări, respectiva componentă solvent cuprinde 1,4-dioxan.

În unele realizări, respectiva componentă solvent cuprinde toluen.

În unele realizări, respectiva componentă solvent cuprinde 1,4-dioxan şi toluen.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula XII este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula XI:

în prezenţa unei baze puternice.

În unele realizări, respectiva bază puternică este hidroxidul de sodiu.

În unele realizări, respectiva bază puternică este hidroxidul de sodiu apos 1 M.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie este efectuată la aproximativ temperatura camerei.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula XI este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula X:

cu gaz de hidrogen în prezenţa nichelului Raney.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie este efectuată la o temperatură de la aproximativ 50°C până la aproximativ 70°C.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula X este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula IX:

în prezenţa eteratului trifluorură de bor, a catalizatorului (3aS)-1-metil-3,3-difeniltetrahidro-3H-pirolo[1,2-c][1,3,2]oxazaborol ((S)-MeCBS), şi a complexului boran.

În unele realizări, de la aproximativ 0,03 până la aproximativ 0,07 echivalenţi de eterat trifluorură de bor sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula IX.

În unele realizări, de la aproximativ 0,05 până la aproximativ 0,15 echivalenţi de catalizator (3aS)-1-metil-3,3-difeniltetrahidro-3H-pirolo[1,2-c][1,3,2]oxazaborol ((S)-MeCBS) sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula IX.

În unele realizări, respectivul complex boran este complexul boran-THF 1,0 M în THF.

În unele realizări, de la aproximativ 0,9 până la aproximativ 1,1 echivalenţi de complex boran sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula IX.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie este efectuată la aproximativ temperatura camerei.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula IX este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula VIII:

cu iod în prezenţa unei componente solvent.

În unele realizări, respectiva componentă solvent cuprinde acetonă.

În unele realizări, de la aproximativ 0,75 până la aproximativ 1,25 echivalenţi de iod sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula VIII.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula VIII este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula VII:

cu dimetil malonat în prezenţa unui catalizator.

În unele realizări, respectivul catalizator este (1S,2S)-N,N'-dibenzilciclohexan-1,2-diamină-dibromonichel (catalizator Evans).

În unele realizări, de la aproximativ 1,1 până la aproximativ 1,3 echivalenţi de dimetil malonat sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula VII.

În unele realizări, de la aproximativ 0,02 până la aproximativ 0,03 echivalenţi de catalizator de metal de tranziţie sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula VII.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula VII este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula VI:

cu nitrometan în prezenţa unui acid organic pentru a forma un prim amestec.

În unele realizări, respectivul acid organic este acidul acetic glacial.

În unele realizări, de la aproximativ 9,5 până la aproximativ 10,5 echivalenţi de nitrometan sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula VI.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie cuprinde în plus adăugarea unei baze amine la respectivul prim amestec pentru a forma un al doilea amestec.

În unele realizări, respectiva bază amină este benzilamina.

În unele realizări, de la aproximativ 0,2 până la aproximativ 0,3 echivalenţi de bază amină sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula VI.

În unele realizări, respectivul al doilea amestec este încălzit de la aproximativ 55°C până la aproximativ 65°C.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula VI este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula V:

cu un complex halogenură (alchil C1-4)magneziu pentru a forma un prim amestec.

În unele realizări, respectivul complex halogenură (alchil C1-4)magneziu este complexul clorură de litiu de clorură de izopropilmagneziu 1,3 M.

În unele realizări, de la aproximativ 1,1 până la aproximativ 1,3 echivalenţi din respectivul complex halogenură (alchil C1-4)magneziu sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula V.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie cuprinde în plus adăugarea de N-formilmorfolină la respectivul prim amestec pentru a forma un al doilea amestec.

În unele realizări, de la aproximativ 1,8 până la aproximativ 2,2 echivalenţi de N-formilmorfolină sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula V.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie este efectuată la o temperatură de la aproximativ - 5°C până la aproximativ 10°C.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula V este preparat în conformitate cu procedurile descrise în cererea de brevet S.U.A. nr. 2013-0059835A1.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula VI este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula V-a:

cu N,N-dimetilformamidă în prezenţa diizopropilamidei de litiu.

În unele realizări, respectiva diizopropilamidă de litiu este preparată prin punerea în reacţie a N,N-diizopropilaminei în prezenţa n-butillitiului.

În unele realizări, respectiva diizopropilamidă de litiu este preparată la o temperatură de la aproximativ -75°C până la aproximativ 5°C.

În unele realizări:

(i) respectivul compus cu formula V-a este reacţionat cu diizopropilamidă de litiu \tabpentru a forma un prim amestec; şi (ii) se adaugă N,N-dimetilformamidă la respectivul prim amestec pentru a forma \tabun al doilea amestec. În unele realizări, de la aproximativ 1,2 până la aproximativ 1,3 echivalenţi de bază amină sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula V-a. În unele realizări, de la aproximativ 1,4 până la aproximativ 1,6 echivalenţi de N,N-dimetilformamidă sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula V-a. În unele realizări, respectivul compus cu Formula V-a este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula IV-a:

cu 1,2-etandiol în prezenţa acidului p-toluensulfonic.

În unele realizări, respectivul acid p-toluensulfonic este acidul p-toluensulfonic monohidrat.

În unele realizări, de la aproximativ 2,2 până la aproximativ 2,7 echivalenţi de 1,2-etandiol sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula IV-a.

În unele realizări, de la aproximativ 0,05 până la aproximativ 0,1 echivalenţi de acid p-toluensulfonic sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula IV-a.

În unele realizări, respectiva punerea în reacţie este efectuată aproape de reflux.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula IV-a este preparat printr-un procedeu cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu Formula II:

cu CH2CH2-X1 în prezenţa unei baze carbonat de metal alcalin, în care: X1 este halogenură.

În unele realizări, X1 este iodură.

În unele realizări, respectiva bază carbonat de metal alcalin este carbonatul de potasiu.

În unele realizări, de la aproximativ 1,1 până la aproximativ 1,3 echivalenţi de CH2CH2-X1 sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu formula II.

În unele realizări, de la aproximativ 1,8 până la aproximativ 2,2 echivalenţi de bază carbonat de metal alcalin sunt utilizaţi pe baza a 1 echivalent al compusului cu Formula II.

În unele realizări, respectiva punere în reacţie este efectuată de la aproximativ 55°C până la aproximativ 65°C.

În unele realizări, respectivul compus cu Formula II este preparat în conformitate cu procedurile descrise în cererea de brevet S.U.A. nr. 2013-0059835A1.

Se apreciază că anumite caracteristici ale invenţiei, care sunt, pentru claritate, descrise în contextul unor realizări separate, pot fi de asemenea furnizate în combinaţie într-o singură realizare (în timp ce realizările sunt intenţionate a fi combinate dacă sunt scrise în forme de dependenţă multiplă). Invers, diferite caracteristici ale invenţiei care sunt, pentru concizie, descrise în contextul unei singure realizări, pot fi de asemenea furnizate separat sau în orice subcombinaţie adecvată.

Sărurile şi compuşii descrişi aici pot fi asimetrice (de exemplu, având unul sau mai mulţi stereocentri). Dacă nu se indică nici o stereochimie, atunci toţi stereoizomerii, cum ar fi enantiomerii şi diastereomerii, sunt intenţionaţi, dacă nu se indică altfel, prin structură sau nume. Sărurile şi compuşii prezentei cereri de brevet care conţin atomi de carbon substituiţi asimetric, pot fi izolaţi în forme optic active sau racemice. Metodele despre cum se prepară forme optic active din materii prime inactive optic sunt cunoscute în domeniu, cum ar fi prin rezoluţia amestecurilor racemice sau prin sinteză stereoselectivă. Mulţi izomeri geometrici de olefine, legături duble C=N, şi altele asemenea, pot fi de asemenea prezenţi în sărurile şi compuşii descrişi aici, şi toţi astfel de izomeri stabili sunt avuţi în vedere în prezenta cerere de brevet. Izomerii geometrici cis şi trans ai sărurilor şi compuşilor din prezenta cerere de brevet sunt descrişi şi pot fi izolaţi ca un amestec de izomeri sau ca forme izomerice separate.

Rezoluţia amestecurilor racemice de săruri şi compuşi poate fi efectuată prin oricare din numeroasele metode cunoscute în domeniu. Un exemplu de metodă include recristalizarea fracţională utilizând un acid de rezolvare chirală care este un acid organic activ optic, care formează sare. Agenţi de rezolvare adecvaţi pentru metodele de recristalizare fracţională sunt, de exemplu, acizii activi optic, cum ar fi formele D şi L de acid tartric, acid diacetiltartric, acid dibenzoiltartric, acid mandelic, acid malic, acid lactic sau diferiţi acizi camforsulfonici activi optic cum ar fi acidul β-camforsulfonic. Alţi agenţi de rezolvare adecvaţi pentru metodele de cristalizare fracţională includ forme stereoizomerice pure de α-metilbenzilamină (de exemplu, forme S şi R, sau forme diastereomerice pure), 2-fenilglicinol, norefedrină, efedrină, N-metilefedrină, ciclohexiletilamină, 1,2-diaminociclohexan, şi altele asemenea.

Rezoluţia de amestecuri racemice poate fi de asemenea efectuată prin eluare pe o coloană ambalată cu un agent de rezolvare activ optic (de exemplu, dinitrobenzoilfenilglicină). Compoziţia de solvent de eluare adecvată poate fi determinată de către o persoană calificată în domeniu.

Sărurile şi compuşii invenţiei pot include de asemenea toţi izotopii atomilor care apar în intermediari sau sărurile finale sau compuşi. Izotopii includ acei atomi având acelaşi număr atomic dar numere de masă diferite. De exemplu, izotopii de hidrogen includ tritiu şi deuteriu.

În unele realizări, compuşii sau sărurile pot fi găsite împreună cu alte substanţe cum ar fi apă şi solvenţi (de exemplu hidraţi şi solvaţi) sau pot fi izolaţi.

În unele realizări, compuşii descrişi aici, sau sărurile acestora (de exemplu, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I), sunt substanţial izolaţi. Prin „substanţial izolat« se înţelege că compusul este cel puţin parţial sau substanţial separat de mediul în care el a fost format sau detectat. Separarea parţială poate include, de exemplu, o compoziţie îmbogăţită în compuşi. Separarea substanţială poate include compoziţii conţinând cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 60%, cel puţin aproximativ 70%, cel puţin aproximativ 80%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% din masa compuşilor, sau sării acestora. Metodele pentru izolarea compuşilor şi sărurilor lor sunt de rutină în domeniu.

Exprimarea „acceptabil farmaceutic« este utilizată aici pentru a se referi la acei compuşi, materiale, compoziţii, şi/sau forme de dozare care sunt, în domeniul raţionamentului medical, adecvate pentru utilizare în contact cu ţesuturile fiinţelor umane şi animale fără toxicitate excesivă, iritare, răspuns alergic, sau alte probleme sau complicaţii, proporţional cu un raport rezonabil beneficiu/risc.

Aşa cum se va aprecia, compuşii furnizaţi aici, incluzând sărurile acestora, pot fi preparaţi utilizând tehnici cunoscute de sinteză organică şi pot fi sintetizaţi în conformitate cu oricare din numeroasele căi sintetice posibile. Procedeele descrise aici pot fi monitorizate în conformitate cu orice metodă adecvată cunoscută în domeniu. De exemplu, formarea produsului poate fi monitorizată prin mijloace spectroscopice, cum ar fi spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară (de exemplu, 1H sau 13C), spectroscopia cu infraroşii, sau spectrofotometria (de exemplu, UV-vizibil); sau prin cromatografie cum ar fi cromatografie cu lichide de înaltă performanţă (HPLC) sau cromatografia în strat subţire (TLC) sau alte tehnici înrudite.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul „punere în reacţie« este utilizat aşa cum se cunoaşte în domeniu, şi se referă în general la aducerea împreună a reactivilor chimici într-o astfel de manieră încât să permită interacţiunea lor la nivel molecular pentru a obţine o transformare chimică sau fizică. În unele realizări, punerea în reacţie implică doi reactivi, în care unul sau mai mulţi echivalenţi ai celui de al doilea reactiv sunt utilizaţi faţă de primul reactiv. Etapele de punere în reacţie a procedeelor descrise aici pot fi efectuate pentru un timp şi în condiţii adecvate pentru prepararea produsului identificat.

Reacţiile proceselor descrise aici pot fi efectuate în solvenţi adecvaţi care pot fi cu uşurinţă selectaţi de către o persoană calificată în domeniul sintezei organice. Solvenţii adecvaţi pot fi substanţial nereactivi cu materiile prime (reactanţi), intermediarii, sau produsele la temperaturile la care sunt efectuate reacţiile, de exemplu, temperaturi care pot varia de la temperatura de îngheţare a solventului pȃnă la temperatura de fierbere a solventului. O reacţie dată poate fi efectuată într-un solvent sau într-un amestec de mai mult de un solvent. Depinzând de etapa particulară de reacţie, pot fi selectaţi solvenţii adecvaţi pentru o anumită etapă de reacţie.

Solvenţii adecvaţi pot include solvenţi halogenaţi cum ar fi tetraclorură de carbon, bromodiclorometan, dibromoclorometan, bromoform, cloroform, bromoclorometan, dibromometan, clorură de butil, diclorometan, tetracloroetilen, tricloroetilen, 1,1,1-tricloroetan, 1,1,2-tricloroetan, 1,1-dicloroetan, 2-cloropropan, 1,2-dicloroetan, 1,2-dibromoetan, hexafluorobenzen, 1,2,4-triclorobenzen, 1,2-diclorobenzen, clorobenzen, fluorobenzen, amestecuri ale acestora şi altele asemenea.

Solvenţi eter adecvaţi includ: dimetoximetan, tetrahidrofuran, 1,3-dioxan, 1,4-dioxan, furan, dietil eter, etilen glicol dimetil eter, etilen glicol dietil eter, dietilen glicol dimetil eter, dietilen glicol dietil eter, trietilen glicol dimetil eter, anisol, t-butil metil eter, amestecuri ale acestora şi altele asemenea.

Solvenţi protici adecvaţi pot include, cu titlu de exemplu şi fără limitare, apă, metanol, etanol, 2-nitroetanol, 2-fluoroetanol, 2,2,2-trifluoroetanol, etilen glicol, 1-propanol, 2-propanol, 2-metoxietanol, 1-butanol, 2-butanol, i-butil alcool, t-butil alcool, 2-etoxietanol, dietilen glicol, 1-, 2-, sau 3-pentanol, neo-pentil alcool, t-pentil alcool, dietilen glicol monometil eter, dietilen glicol monoetil eter, ciclohexanol, alcool benzilic, fenol, sau glicerol.

Solvenţi aprotici adecvaţi pot include, cu titlu de exemplu şi fără limitare, tetrahidrofuran (THF), N,N-dimetilformamidă (DMF), N,N-dimetilacetamidă (DMA), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinonă (DMPU), 1,3-dimetil-2-imidazolidinonă (DMI), N metilpirolidinonă (NMP), formamidă, N-metilacetamidă, N-metilformamidă, acetonitril, dimetil sulfoxid, propionitril, etil format, macetat de etil, hexacloroacetonă, acetonă, etil metil cetonă, acetat de etil, sulfolan, N,N-dimetilpropionamidă, tetrametiluree, nitrometan, nitrobenzen, sau hexametilfosforamidă.

Solvenţi hidrocarbură adecvaţi includ benzen, ciclohexan, pentan, hexan, toluen, cicloheptan, metilciclohexan, heptan, etilbenzen, m-, o-, sau p-xilen, octan, indan, nonan, sau naftalenă.

Reacţiile proceselor descrise aici pot fi efectuate la temperaturi adecvate care pot fi cu uşurinţă determinate de specialistul calificat. Temperaturile de reacţie vor depinde de, de exemplu, punctele de topire şi de fierbere ale reactivilor şi solvenţilor, dacă sunt prezenţi; termodinamica reacţiei (de exemplu, reacţiile exotermice viguroase pot necesita să fie efectuate la temperaturi reduse); şi cineticile reacţiei (de exemplu, o barieră de activare energetică ridicată poate necesitate temperaturi ridicate).

Expresiile, „temperatura ambiantă« şi „temperatura camerei« sau „rt« aşa cum s-au utilizat în acest document, sunt înţelese în domeniu, şi se referă în general la o temperatură, de exemplu o temperatură de reacţie, care este aproximativ temperatura camerei în care este efectuată reacţia, de exemplu, o temperatură de la aproximativ 20°C până la aproximativ 30°C.

Reacţiile proceselor descrise aici pot fi efectuate în aer sau sub o atmosferă inertă. De obicei, reacţiile conţinând reactivi sau produse care sunt substanţial reactive cu aerul pot fi efectuate utilizând tehnici sintetice sensibile la aer care sunt bine cunoscute specialistului calificat.

Metode de utilizare

Sărurile invenţiei şi compuşii pot modula activitatea unuia sau mai multor kinaze diferite incluzând, de exemplu, fosfoinozitida 3-kinază (PI3K). Termenul „modulează« se înţelege că se referă la abilitatea de a creşte sau scade activitatea unuia sau mai multor membri ai familiei PI3K. Corespunzător, sărurile invenţiei pot fi utilizate în metode de modulare a PI3K prin punerea în contact a PI3K cu oricare dintre una sau mai multe săruri, compuşi sau compoziţii descrise aici. În unele realizări, sărurile invenţiei şi compuşii din prezenta cerere de brevet pot acţiona ca inhibitori ai unuia sau mai multor PI3K. În alte realizări, sărurile invenţiei pot fi utilizate pentru a modula activitatea unui PI3K la un individ care are nevoie de modularea receptorului prin administrarea unei cantităţi modulare dintr-un compus, sau dintr-o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În unele realizări, modularea este inhibare.

Dat fiind că creşterea şi supravieţuirea celulei canceroase sunt impactate de multiple căi de semnalizare, prezenta cerere de brevet este utilă pentru tratarea stărilor de boală caracterizate prin mutanţi kinază rezistenţi la medicamente. În plus, diferiţi inhibitori ai kinazei, care prezintă diferite preferinţe în kinazele cărora ei le modulează activităţile, pot fi utilizaţi în combinaţie. Această abordare ar putea furniza o eficienţă ridicată în tratarea stărilor de boală prin ţintirea multiplelor căi de semnalizare, reducerea probabilităţii de rezistenţă la medicamente care apare într-o celulă, şi reducerea toxicităţii tratamentelor pentru boală.

Kinazele la care se leagă şi/sau modulează prezentele săruri şi compuşi (de exemplu, inhibă) includ orice membru al familiei PI3K. În unele realizări, PI3K este PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ, sau PI3Kγ. În unele realizări, PI3K este PI3Kδ sau PI3Kγ. În unele realizări, PI3K este PI3Kδ. În unele realizări, PI3K este PI3Kγ. În unele realizări, PI3K include o mutaţie. O mutaţie poate fi un înlocuitor al unui aminoacid cu altul, sau o deleţie dintr-unul sau mai mulţi aminoacizi. În astfel de realizări, mutaţia poate fi prezentă în domeniul kinazic al PI3K.

În unele realizări, mai mult de o sare sau compus este utilizat pentru a inhiba activitatea unei kinaze (de exemplu, PI3Kδ sau PI3Kγ).

În unele realizări, mai mult de o sare sau compus este utilizat pentru a inhiba mai mult de o kinază, cum ar fi cel puţin două kinaze (de exemplu, PI3Kδ şi PI3Kγ).

În unele realizări, una sau mai multe săruri sau compuşi sunt utilizate în combinaţie cu un alt inhibitor al kinazei pentru a inhiba activitatea unei kinaze (de exemplu, PI3Kδ sau PI3Kγ).

În unele realizări, una sau mai multe săruri sau compuşi sunt utilizate în combinaţie cu un alt inhibitor al kinazei pentru a inhiba activităţile a mai mult de o kinază (de exemplu, PI3Kδ sau PI3Kγ), cum ar fi cel puţin două kinaze.

Sărurile şi compuşii invenţiei pot fi selectivi. Prin „selectiv« se înţelege că compusul se leagă la, sau inhibă o kinază cu afinitate sau respectiv potenţă mai mare, în comparaţie cu cel puţin o altă kinază. În unele realizări, sărurile şi compuşii invenţiei sunt inhibitori selectivi de PI3Kδ sau PI3Kγ faţă de PI3Kα şi/sau PI3Kβ. În unele realizări, sărurile şi compuşii invenţiei sunt inhibitori selectivi de PI3Kδ (de exemplu, faţă de PI3Kα, PI3Kβ şi PI3Kγ). În unele realizări, sărurile şi compuşii invenţiei sunt inhibitori selectivi de PI3Kδ (de exemplu, faţă de PI3Kα, PI3Kβ şi PI3Kγ). În unele realizări, selectivitatea poate fi cel puţin aproximativ de 2 ori, de 5 ori, de 10 ori, cel puţin de aproximativ 20 ori, cel puţin de aproximativ 50 ori, cel puţin de aproximativ 100 ori, cel puţin de aproximativ 200 ori, cel puţin de aproximativ 500 ori sau cel puţin de aproximativ 1000 ori. Selectivitatea poate fi măsurată prin metode de rutină în domeniu. În unele realizări, selectivitatea poate fi testată la concentraţia Km ATP a fiecărei enzime. În unele realizări, selectivitatea sărurilor şi compuşilor invenţiei poate fi determinată prin teste celulare asociate cu activitatea particulară a kinazei PI3K.

Un alt aspect al prezentei cereri de brevet se referă la o sare a invenţiei pentru utilizare în metodele de tratare a unei boli sau tulburări asociate kinazei (cum ar fi PI3K) la un individ (de exemplu, pacient) prin administrarea individului care are nevoie de un astfel de tratament a unei cantităţi sau doze eficiente terapeutic dintr-unul sau mai multe săruri sau compuşi ai prezentei cereri de brevet sau a unei compoziţii farmaceutice a acestora. O boală asociată cu PI3K poate include orice boală, tulburare sau afecţiune care este direct sau indirect legată de expresia sau activitatea PI3K, incluzând supraexprimarea şi/sau niveluri de activitate normală. În unele realizări, boala poate fi legată de Akt (protein kinază B), de ţinta de rapamicină la mamifere (mTOR), sau de kinaza 1 dependentă de fosfoinozitidă (PDK1). În unele realizări, boala asociată cu mTOR poate fi inflamaţie, ateroscleroză, psoriazis, restenoză, hipertrofie benignă a prostatei, tulburări osoase, pancreatită, angiogeneză, retinopatie diabetică, ateroscleroză, artrită, tulburări imunologice, boală renală, sau cancer. O boală asociată cu PI3K poate include de asemenea orice boală, tulburare sau afecţiune care poate fi prevenită, ameliorată, sau vindecată prin modularea activităţii PI3K. În unele realizări, boala este caracterizată prin activitatea normală a PI3K. În unele realizări, boala este caracterizată prin PI3K mutantă. În astfel de realizări, mutaţia poate fi prezentă în domeniul kinazic al PI3K.

Exemple de boli asociate cu PI3K includ boli pe bază imunitară care implică sistemul incluzând, de exemplu, artrită reumatoidă, alergie, astm, glomerulonefrită, lupus, sau inflamaţie asociată cu oricare din cele de mai sus.

Alte exemple de boli asociate cu PI3K includ cancere cum ar fi de sân, de prostată, de colon, endometrial, de creier, de vezică, de piele, de uter, de ovar, de plămâni, pancreatic, renal, gastric, sau cancer hematologic.

Alte exemple de boli asociate cu PI3K includ bolile de plămâni cum ar fi leziunea pulmonară acută (ALI) şi sindromul de detresă respiratorie la adult (ARDS).

Alte exemple de boli asociate cu PI3K includ osteoartrită, restenoză, ateroscleroză, tulburări osoase, artrită, retinopatie diabetică, psoriazis, hipertrofie benignă a prostatei, inflamaţie, angiogeneză, pancreatită, boală renală, boală inflamatorie intestinală, miastenia gravis, scleroză multiplă, sau sindrom Sjgren, şi altele asemenea.

Alte exemple de boli asociate cu PI3K includ purpură trombocitopenică idiopatică (ITP), anemie hemolitică autoimună (AIHA), vasculită, lupus eritematos sistemic, nefrită lupică, pemfigus, nefropatie membranoasă, leucemie limfocitară cronică (CLL), limfom non-Hodgkin (NHL), leucemie cu celule păroase, limfom cu celule de manta, limfom Burkitt, limfom limfocitic mic, limfom folicular, limfom limfoplasmacitic, limfom al zonei marginale extranodale, limfom difuz cu celule B mari cum ar fi celulele B activate (ABC), sau limfom difuz cu celule B mari cu celule B ale centrului germinal (GCB).

În unele realizări, boala este selectată dintre purpură trombocitopenică idiopatică (ITP), anemie hemolitică autoimună, vasculită, lupus eritematos sistemic, nefrită lupică, pemfigus, anemie hemolitică autoimună (AIHA), nefropatie membranoasă, leucemie limfocitară cronică (CLL), limfom non-Hodgkin (NHL), leucemie cu celule păroase, limfom cu celule de manta, limfom Burkitt, limfom limfocitic mic, limfom folicular, limfom limfoplasmacitic, limfom al zonei marginale extranodale, limfom Hodgkin, macroglobulinemie Waldenstrom, leucemie prolimfocitară, leucemie limfoblastică acută, mielofibroză, limfom al ţesutului limfatic asociat mucoasei (MALT), limfom cu celule B, limfom cu celule B mari mediastinal (timic), granulomatoză limfomatoidă, limfom al zonei marginale splenic, limfom primar cu efuziune, limfom intravascular cu celule B mari, leucemia celulei plasmatice, plasmacitom extramedular, mielom înăbuşit (mielom asimptomatic aka), gamopatie monoclonală de semnificaţie nedeterminată (MGUS) şi limfom cu celule B.

În unele realizări, metoda este o metodă de tratare a purpurei trombocitopenice idiopatice (ITP) selectată dintre ITP recidivată şi ITP refractară.

În unele realizări, metoda este o metodă de tratare a vasculitei selectată dintre boală Behet, sindrom Cogan, arterită celulară gigantică, polimialgie reumatică (PMR), arterită Takayasu, boală Buerger (tromboangită obliterantă), vasculită a sistemului nervos central, boală Kawasaki, poliarterită nodoasă, sindrom Churg-Strauss, vasculită crioglobulinemică amestecată (virus esenţial sau al hepatitei C indus de (HCV)), purpură Henoch-Schnlein (HSP), vasculită de hipersensibilitate, poliangeită microscopică, granulomatoză Wegener, şi vasculită sistemică (AASV) asociată anticorpului citoplasmatic anti-neutrofil (ANCA).

În unele realizări, metoda este o metodă de tratare a limfomului non-Hodgkin (NHL) selectat dintre NHL recidivat, NHL refractar, şi NHL folicular recurent.

În unele realizări, metoda este o metodă de tratare a limfomului cu celule B, în care respectivul limfom cu celule B este limfom difuz cu celule B mari (DLBCL).

În unele realizări, metoda este o metodă de tratare a limfomului cu celule B, în care respectivul limfom cu celule B este limfomul difuz cu celule B mari cum ar fi celulele B activate (ABC), sau limfomul difuz cu celule B mari cu celule B ale centrului germinal (GCB).

În unele realizări, respectiva boală este osteoartrită, restenoză, ateroscleroză, tulburări osoase, artrită, retinopatie diabetică, psoriazis, hipertrofie benignă a prostatei, inflamaţie, angiogeneză, pancreatită, boală renală, boală inflamatorie intestinală, miastenia gravis, scleroză multiplă, sau sindrom Sjgren.

În unele realizări, respectiva boală este artrită reumatoidă, alergie, astm, glomerulonefrită, lupus, sau inflamaţie asociată cu oricare din cele anterior menţionate.

În unele realizări, respectivul lupus este lupus eritematos sistemic sau nefrită lupică.

În unele realizări, respectiva boală este cancer la sân, cancer la prostată, cancer la colon, cancer endometrial, cancer la creier, cancer la vezică, cancer la piele, cancer la uter, cancer la ovar, cancer pulmonar, cancer pancreatic, cancer renal, cancer gastric, sau un cancer hematologic.

În unele realizări, respectivul cancer hematologic este leucemie mieloblastică acută sau leucemie mieloidă cronică.

În unele realizări, respectivul cancer hematologic reprezintă malignităţi limfoide ale originii celulei B incluzând, limfomul non-Hodgkin al celulei B indolent/agresiv (NHL), şi limfomul Hodgkin (HL).

În unele realizări, respectiva boală este leziune pulmonară acută (ALI) sau sindrom de detresă respiratorie la adult (ARDS).

Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul „punere în contact« se referă la aducerea împreună a radicalilor indicaţi într-un sistem in vitro sau într-un sistem in vivo. De exemplu, „punerea în contact« a PI3K cu un compus include administrarea unui compus din prezenta cerere de brevet unui individ sau pacient, cum ar fi un om, având PI3K, precum şi, de exemplu, introducerea unui compus într-o mostră conţinând o preparare celulară sau purificată care conţine PI3K.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul „individ« sau „pacient«, utilizat interschimbabil, se referă la orice animal, incluzând mamifere, preferabil şoareci, şobolani, alte rozătoare, iepuri, câini, pisici, porcine, vite, oi, cai, sau primate, şi cel mai preferabil oameni.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, exprimarea „cantitate eficientă terapeutic« se referă la cantitatea de compus activ sau agent farmaceutic care declanşează răspuns biologic sau medicinal care este căutat într-un ţesut, sistem, animal, individ sau om de către un cercetător, veterinar, medic sau alt clinician. În unele realizări, dozajul compusului, sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia, administrat unui pacient sau individ este de la aproximativ 1 mg până la aproximativ 2 g, de la aproximativ 1 mg până la aproximativ 1000 mg, de la aproximativ 1 mg până la aproximativ 500 mg, de la aproximativ 1 mg până la aproximativ 100 mg, de la aproximativ 1 mg până la 50 mg, sau de la aproximativ 50 mg până la aproximativ 500 mg.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul „tratare« sau „tratament« se referă la una sau mai multe dintre (1) prevenirea bolii; de exemplu, prevenirea unei boli, afecţiuni sau tulburări la un individ care poate fi predispus la boală, afecţiune sau tulburare dar încă nu experimentează sau afişează patologia sau simptomatologia bolii; (2) inhibarea bolii; de exemplu, inhibarea unei boli, afecţiuni sau tulburări la un individ care experimentează sau afişează patologia sau simptomatologia bolii, afecţiunii sau tulburării (adică, oprirea dezvoltării suplimentare a patologiei şi/sau simptomatologiei); şi (3) ameliorarea bolii; de exemplu, ameliorarea unei boli, afecţiuni sau tulburări la un individ care experimentează sau afişează patologia sau simptomatologia bolii, afecţiunii sau tulburării (adică, inversarea patologiei şi/sau simptomatologiei) cum ar fi scăderea severităţii bolii.

Terapii combinate

Unul sau mai mulţi agenţi farmaceutici suplimentari cum ar fi, de exemplu, agenţi chimioterapeutici, agenţi antiinflamatori, steroizi, imunosupresive, precum şi Bcr-Abl, Flt-3, EGFR, HER2, JAK (de exemplu, JAK1 sau JAK2), c-MET, VEGFR, PDGFR, cKit, IGF-1R, RAF, FAK, Akt mTOR, PIM, şi AKT (de exemplu, AKT1, AKT2, sau AKT3) inhibitori ai kinazei cum ar fi, de exemplu, cei descrişi în WO 2006/056399, sau alţi agenţi cum ar fi, anticorpi terapeutici, pot fi utilizaţi în combinaţie cu sărurile sau compuşii prezentei cereri de brevet pentru tratamentul bolilor, tulburărilor sau afecţiunilor asociate cu PI3K. Unul sau mai mulţi agenţi farmaceutici suplimentari pot fi administraţi unui pacient simultan sau secvenţial.

În unele realizări, agentul farmaceutic suplimentar este un inhibitor JAK1 şi/sau JAK2. În unele realizări, prezenta cerere de brevet furnizează un compus descris aici, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia pentru utilizare într-o metodă de tratare a unei boli descrise aici (de exemplu, o malignitate a celulei B, cum ar fi limfomul difuz cu celule B) la un pacient, cuprinzând administrarea la pacient a compusului descris aici, sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia, şi a unui inhibitor JAK1 şi/sau JAK2. Malignităţile celulei B le pot include pe cele descrise aici şi în U.S. Ser. nr. 61/976.815, depusă pe 8 aprilie 2014.

În unele realizări, inhibitorul de JAK1 şi/sau JAK2 este un compus din Tabelul 1, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. Compuşii din Tabelul 1 sunt inhibitori selectivi ai JAK1 (selectivi faţă de JAK2, JAK3, şi TYK2). Valorile IC50 obţinute prin metoda de Test A la 1 mM ATP sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabelul 1

# Prep. Nume Structură IC50 JAK1 (nM) JAK2/ JAK1 1 US 2014/0121 198, (Exemplul 20) ((2R,SS)-5-{2-[(1R)-1-hidroxietil]-1H-imidazo [4,5-d]thieno[3,2-b] piridin-1-il}tetrahidro-2H-piran-2-il)acetonitril ++ >10 2 US 2014/0343 030, (Exemplul 7) 4-[3-(cianometil)-3-(3',5'-dimetil-1H,1'H-4,4'-bipirazol-1-il) azetidin-1-il]-2,5-difluoro-N-[(1S)-2,2,2-trifluoro-1-metiletil] benzamidă +++ >10 3 US 2010/ 0298334 (Exemplul 2)a 3-[1-(6-cloropiridin-2-il)pirolidin-3-il]-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propannitril + >10 4 US 2010/ 0298334 (Exemplul 13c) 3-(1-[1,3]oxazolo[5,4-b]piridin-2-ilpirolidin-3-il)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propannitril + >10 5 US 2011/ 0059951 (Exemplul 12) 4-[(4-{3-ciano-2-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] propil}piperazin-1-il) carbonil]-3-fluorobenzonitril + >10 6 US 2011/ 0059951 (Exemplul 13) 4-[(4-{3-ciano-2-[3-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirol-1-il]propil} piperazin-1-il)carbonil]-3-fluorobenzonitril + >10 7 US 2011/ 0224190 (Exemplul 1) {1-{1-[3-Fluoro-2-(trifluorometil)isonicotin oil]piperidin-4-il}-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-3-il} acetonitril + >10 8 US 2011/ 0224190 (Exemplul 154) 4-{3-(Cianometil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-1-il}-N-[4-fluoro-2-(trifluorometil)fenil] piperidin-1-carboxamidă + >10 9 US 2011/ 0224190 (Exemplul 85) [3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]-1-(1-{[2-(trifluorometil)pirimidin-4-il]carbonil}piperidin-4-il)azetidin-3-il] acetonitril + >10 10 US 2012/ 0149681 (Exemplul 7b) [trans-1-[4-(7H-pirolo [2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]-3-(4-{[2-(trifluorometil) pirimidin-4-il] carbonil}piperazin-1-il) ciclobutil]acetonitril + >10 11 US 2012/ 0149681 (Exemplul 157) {trans-3-(4-{[4-[(3-hidroxiazetidin-1-il) metil]-6-(trifluorometil) piridin-2-il]oxi}piperidin-1-il)-1-[4-(7H-pirolo [2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]ciclobutil}acetonitril + >10 12 US 2012/ 0149681 (Exemplul 161) {trans-3-(4-{[4-{[(2S)-2-(hidroximetil)pirolidin-1-il]metil}-6-(trifluorometil)piridin-2-il]oxi}pipendin-1-il)-1-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]ciclobutil} acetonitril + >10 13 US 2012/ 0149681 (Exemplul 162) {trans-3-(4-{[4-{[(2R)-2-(hidroximetil)pirolidin-1-il]metil}-6-(trifluorometil)piridin-2-il]oxi}piperidin-1-il)-1-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]ciclobutil} acetonitril + >10 14 US 2012/ 0149682 (Exemplul 20)b 4-(4-{3-[(dimetilamino) metil]-5-fluorofenoxi} piperidin-1-il)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] butanenitril + >10 15 US 2013/ 0018034 (Exemplul 18) 5-{3-(cianometil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-1-il} -N-izopropilpirazin-2-carboxamidă + >10 16 US 2013/ 0018034 (Exemplul 28) 4-{3-(cianometil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-1-il}-2,5-difluoro-N-[(1S)-2,2,2-trifluoro-1-metiletil]benzamidă + >10 17 US 2013/ 0018034 (Exemplul 34) 5-{3-(cianometil)-3-[4-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-1-il}-N-izopropilpirazin-2-carboxamidă + >10 18 US 2013/ 0045963 (Exemplul 45) {1-(cis-4-{[6-(2-hidroxietil)-2-(trifluorometil)pirimidin-4-il]oxi}ciclohexil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-3-il}acetonitril + >10 19 US 2013/ 0045963 (Exemplul 65) {1-(cis-4-{[4-[(etilamino)metil]-6-(trifluorometil)piridin-2-il]oxi}ciclohexil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-3-il}acetonitril + >10 20 US 2013/ 0045963 (Exemplul 69) {1-(cis-4-{[4-(1-hidroxi-1-metiletil)-6-(trifluorometil)piridin-2-il]oxi}ciclohexil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-3-il}acetonitril + >10 21 US 2013/ 0045963 (Exemplul 95) {1-(cis-4-{[4-{[(3R)-3-hidroxipirolidin-1-il] metil}-6-(trifluorometil) piridin-2-il]oxi} ciclohexil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] azetidin-3-il}acetonitril + >10 22 US 2013/ 0045963 (Exemplul 95) {1-(cis-4-{[4-{[(3S)-3-hidroxipirolidin-1-il] metil}-6-(trifluorometil) piridin-2-il]oxi} ciclohexil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] azetidin-3-il}acetonitril + >10 23 US 2014/ 0005166 (Exemplul 1) {trans-3-(4-{ [4-({ [ (1S)-2-hidroxi-1-metiletil] amino}metil)-6-(trifluorometil)piridin-2-il]oxi}piperidin-1-il)-1-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]ciclobutil} acetonitril + >10 24 US 2014/ 0005166 (Exemplul 14) {trans-3-(4-{[4-({[(2R)-2-hidroxipropil]amino} metil)-6-(trifluorometil) piridin-2-il]oxi}piperidin-1-il)-1-[4-(7H-pirolo [2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] ciclobutil}acetonitril + >10 25 US 2014/ 0005166 (Exemplul 15) {trans-3-(4-{[4-({[(2S)-2-hidroxipropil] amino}metil)-6-(trifluorometil)piridin-2-il]oxi}pipendin-1-il)-1-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]ciclobutil} acetonitril + >10 26 US 2014/ 0005166 (Exemplul 20) {trans-3-(4-{[4-(2-hidroxietil)-6-(trifluorometil)piridin-2-il]oxi}piperidin-1-il)-1-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]ciclobutil} acetonitril + >10 + înseamnă <10 nM ++ înseamnă ≤ 100 nM +++ înseamnă ≤ 300 nM aDate pentru enantiomer 1 bDate pentru enantiomer 2

În unele realizări, inhibitorul de JAK1 şi/sau JAK2 este {1-{1-[3-fluoro-2-(trifluorometil)izonicotinoil]piperidin-4-il}-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-3-il}acetonitril, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

În unele realizări, inhibitorul de JAK1 şi/sau JAK2 este sare a acidului adipic de {1-{1-[3-fluoro-2-(trifluorometil)izonicotinoil]piperidin-4-il}-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-3-il}acetonitril.

În unele realizări, inhibitorul de JAK1 şi/sau JAK2 este 4-{3-(cianometil)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-1-il}-2,5-difluoro-N-[(1S)-2,2,2-trifluoro-1-metiletil]benzamidă, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

În unele realizări, inhibitorul de JAK1 şi/sau JAK2 este selectat dintre (R)-3-[1-(6-cloropiridin-2-il)pirolidin-3-il]-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propannitril,(R)-3-(1-[1,3]oxazolo[5,4-b]piridin-2-ilpirolidin-3-il)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propannitril, (R)-4-[(4-{3-ciano-2-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propil}piperazin-1-il)carbonil]-3-fluorobenzonitril, (R)-4-[(4-{3-ciano-2-[3-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirol-1-il]propil}piperazin-1-il) carbonil]-3-fluorobenzonitril, sau (R)-4-(4-{3-[(dimetilamino)metil]-5-fluorofenoxi}piperidin-1-il)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] butanenitril, (S)-3-[1-(6-cloropiridin-2-il)pirolidin-3-il]-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propannitril, (S)-3-(1-[1,3]oxazolo[5,4-b]piridin-2-ilpirolidin-3-il)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propannitril, (S)-4-[(4-{3-ciano-2-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propil}piperazin-1-il)carbonil]-3-fluorobenzonitril, (S)-4-[(4-{3-ciano-2-[3-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirol-1-il]propil}piperazin-1-il)carbonil]-3-fluorobenzonitril, (S)-4-(4-{3-[(dimetilamino)metil]-5-fluorofenoxi}piperidin-1-il)-3-[4-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il] butanenitril; şi săruri acceptabile farmaceutic ale oricărora din cei anterior menţionaţi.

În unele realizări, inhibitorul de JAK1 şi/sau JAK2 este selectat dintre compuşii din cererea de brevet SUA nr. 2010/0298334, depusă pe 5 mai 2010, cererea de brevet SUA nr. 2011/0059951, depusă pe 31 august 2010, cererea de brevet SUA nr. 2011/0224190, depusă pe 9 martie 2011, cererea de brevet SUA nr. 2012/0149681, depusă pe 18 noiembrie 2011, cererea de brevet SUA nr. 2012/0149682, depusă pe 18 noiembrie 2011, cererea de brevet SUA nr. 2013/0018034, depusă pe 19 iunie 2012, cererea de brevet SUA nr. 2013/0045963, depusă pe 17 august 2012, şi cererea de brevet SUA nr. 2014/0005166, depusă pe 17 mai 2013.

Exemple de anticorpi pentru utilizare în terapia de combinaţie includ dar nu se limitează la, trastuzumab (de exemplu anti-HER2), ranibizumab (de exemplu anti-VEGF-A), bevacizumab (Avastin™, de exemplu anti-VEGF), panitumumab (de exemplu anti-EGFR), cetuximab (de exemplu anti-EGFR), rituximab (Rituxan™, anti-CD20) şi anticorpi direcţionaţi spre c-MET.

Unul sau mai mulţi din următorii agenţi pot fi utilizaţi în combinaţie cu sărurile sau compuşii din prezenta cerere de brevet şi sunt prezentaţi ca listă nelimitativă: un agent citostatic, cisplatin, doxorubicină, taxoter, taxol, etoposidă, irinotecan, camptostar, topotecan, paclitaxel, docetaxel, epotilonă, tamoxifen, 5-fluorouracil, metoxtrexat, temozolomidă, ciclofosfamidă, SCH 66336, R115777, L778,123, BMS 214662, Iressa, Tarceva, anticorpi la EGFR, Gleevec™, intron, ara-C, adriamicină, citoxan, gemcitabină, muştar de uracil, clormetină, ifosfamidă, melfalan, clorambucil, pipobroman, trietilenmelamină, trietilentiofosforamină, busulfan, carmustină, lomustină, streptozocin, dacarbazină, floxuridină, citarabină, 6-mercaptopurină, 6-tioguanină, fosfat de fludarabină, oxaliplatin, leucovirin, ELOXATIN™, pentostatină, vinblastină, vincristină, vindezină, bleomicină, dactinomicină, daunorubicină, doxorubicină, epirubicină, idarubicină, mitramicină, deoxicoformicină, mitomicină-C, L-asparaginază, tenipozidă 17.alfa.-etinilestradiol, dietilstilbestrol, testosteron, prednison, fluoximesteron, propionat de dromostanolonă, testolactonă, megestrolacetat, metilprednisolon, metiltestosteron, prednisolon, triamcinolonă, clorotrianisenă, hidroxiprogesteron, aminoglutetimidă, estramustină, medroxiprogesteronacetat, leuprolid, flutamidă, toremifenă, goserelin, cisplatin, carboplatin, hidroxiuree, amsacrină, procarbazină, mitotan, mitoxantronă, levamisol, navelbenă, anastrazol, letrazol, capecitabină, reloxafină, droloxafină, hexametilmelamină, avastin, herceptin, bexar, velcade, zevalin, trisenox, xeloda, vinorelbină, porfimer, erbitux, lipozomal, tiotepa, altretamină, melfalan, trastuzumab, lerozol, fulvestrant, exemestan, fulvestrant, ifosfomidă, rituximab, C225, campat, clofarabină, cladribină, afidicolon, rituxan, sunitinib, dasatinib, tezacitabină, Sml1, fludarabină, pentostatin, triapină, didox, trimidox, amidox, 3-AP, MDL-101,731, bendamustină (Treanda), ofatumumab, şi GS-1101 (cunoscut de asemenea ca CAL-101).

Exemple de chimioterapeutice includ inhibitori de proteozom (de exemplu, bortezomib), talidomidă, revlimid, şi agenţi care deteriorează ADN-ul cum ar fi melfalan, doxorubicină, ciclofosfamidă, vincristină, etoposidă, carmustină, şi altele asemenea.

Exemple de steroizi includ coriticosteroizi cum ar fi dexametazonă sau prednison.

Exemple de inhibitori Bcr-Abli includ compuşii, şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, ale genurilor şi speciilor divulgate în Brevetul S.U.A. nr. 5.521.184, WO 04/005281, şi U.S. Ser. nr. 60/578.491.

Exemple de inhibitori adecvaţi ai Flt-3i includ compuşii, şi sărurile lor acceptabile farmaceutic, cum s-au divulgat în WO 03/037347, WO 03/099771, şi WO 04/046120.

Exemple de inhibitori adecvaţi ai RAFi includ compuşii, şi sărurile lor acceptabile farmaceutic, cum s-au divulgat în WO 00/09495 şi WO 05/028444.

Exemple de inhibitori adecvaţi ai FAKi includ compuşii, şi sărurile lor acceptabile farmaceutic, cum s-au divulgat în WO 04/080980, WO 04/056786, WO 03/024967, WO 01/064655, WO 00/053595, şi WO 01/014402.

Exemple de inhibitori adecvaţi ai mTOR includ compuşii, şi sărurile lor acceptabile farmaceutic, cum s-au divulgat în WO 2011/025889.

În unele realizări, sărurile invenţiei pot fi utilizate în combinaţie cu unul sau mai mulţi alţi inhibitori ai kinazei incluzând imatinib, în special pentru tratarea pacienţilor rezistenţi la imatinib sau la alţi inhibitori ai kinazei.

În unele realizări, sărurile invenţiei pot fi utilizate în combinaţie cu un agent chimioterapeutic în tratamentul cancerului, cum ar fi mielomul multiplu, şi pot îmbunătăţi răspunsul la tratament în comparaţie cu răspunsul la agentul chimioterapic singur, fără exacerbarea efectelor sale toxice. Exemple de agenţi farmaceutici suplimentari utilizaţi în tratamentul mielomului multiplu, de exemplu, pot include, fără limitare, melfalan, melfalan plus prednison [MP], doxorubicină, dexametazonă, şi velcade (bortezomib). Alţi agenţi suplimentari utilizaţi în tratamentul mielomului multiplu includ Bcr-Abl, Flt-3, RAF şi inhibitori ai kinazei FAK. Efectele aditive sau sinergice sunt rezultate dorite ale combinării unui inhibitor al PI3K din prezenta cerere de brevet cu un agent suplimentar. Mai mult, rezistenţa celulelor de mielom multiplu la agenţi cum ar fi dexametazona poate fi reversibilă după tratamentul cu un inhibitor al PI3K din prezenta cerere de brevet. Agenţii pot fi combinaţi cu prezentul compus într-o singură sau continuă formă de dozare, sau agenţii pot fi administraţi simultan sau secvenţial ca forme de dozare separate.

În unele realizări, un corticosteroid cum ar fi dexametazona este administrat unui pacient în combinaţie cu sărurile invenţiei unde dexametazona este administrată intermitent spre deosebire de în mod continuu.

În unele alte realizări, combinaţii ale sărurilor invenţiei cu alţi agenţi terapeutici pot fi administrate unui pacient înainte de, în timpul, şi/sau după un transplant de măduvă osoasă sau transplant de celulă stem.

Formulări farmaceutice şi forme de dozare

Când sunt utilizate ca agenţi farmaceutici, sărurile invenţiei pot fi administrate sub formă de compoziţii farmaceutice. Aceste compoziţii pot fi preparate într-o manieră bine cunoscută în domeniul farmaceutic, şi pot fi administrate pe o varietate de căi, depinzând dacă este dorit tratamentul local sau sistemic şi de zona care urmează să fie tratată. Administrarea poate fi topică (incluzând transdermală, epidermală, oftalmică şi la membrana mucozală incluzând livrarea intranazală, vaginală şi rectală), pulmonară (de exemplu, prin inhalare sau insuflare de pulberi sau aerosoli, inclusiv cu un nebulizator; intratraheală sau intranazală), orală sau parenterală. Administrarea parenterală include intravenoasă, intraarterială, subcutanată, intraperitoneală intramusculară sau injecţie sau perfuzie; sau intracranială, de exemplu, administrare intratecală sau intraventriculară. Administrarea parenterală poate fi sub forma unei singure doze bolus, sau poate fi, de exemplu, printr-o pompă de perfuzie continuă. Compoziţiile farmaceutice şi formulările pentru administrare topică pot include plasturi transdermali, unguente, loţiuni, creme, geluri, picături, supozitoare, pulverizatoare, lichide şi pulberi. Purtătorii farmaceutici convenţionali pe bază apoasă, de pulbere sau uleioasă, agenţii de îngroşare şi altele asemenea poate fi necesari sau de dorit.

Această invenţie include de asemenea compoziţiile farmaceutice care conţin, ca ingredient activ, sarea invenţiei (adică, sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I), în combinaţie cu unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic (excipienţi). În unele realizări, compoziţia este adecvată pentru administrare topică. În prepararea compoziţiilor invenţiei, ingredientul activ este de obicei amestecat cu un excipient, diluat cu un excipient sau încapsulat într-un astfel de purtător în formă de, de exemplu, o capsulă, pliculeţ, hârtie, sau alt recipient. Când excipientul serveşte ca diluant, el poate fi un material solid, semi-solid, sau lichid, care acţionează ca vehicul, purtător sau mediu pentru ingredientul activ. Astfel, compoziţiile pot fi sub formă de tablete, pilule, pulberi, pastile, pliculeţe, caşete, elixire, suspensii, emulsii, soluţii, siropuri, aerosoli (ca un solid sau într-un mediu lichid), unguente conţinând, de exemplu, până la 10% din masa compusului activ, capsule de gelatină moi şi tari, supozitoare, soluţii sterile injectabile, şi pulberi sterile ambalate.

În prepararea formulării, compusul activ sau sarea pot fi măcinate pentru a furniza dimensiunea adecvată a particulei înainte de combinarea cu celelalte ingrediente. Dacă compusul activ sau sarea sunt substanţial insolubile, ele pot fi măcinate la o dimensiune a particulei mai mică de 200 mesh. Dacă compusul activ sau sarea sunt substanţial solubile în apă, dimensiunea particulei poate fi ajustată prin măcinare pentru a furniza o distribuţie substanţial uniformă în formulare, de exemplu de aproximativ 40 mesh.

Sărurile invenţiei şi compuşii pot fi măcinaţi utilizând procedee de măcinare cunoscute cum ar fi măcinarea umedă pentru a obţine o dimensiune a particulei adecvată pentru formarea tabletei şi pentru alte tipuri de formulări. Preparările finale divizate (nanoparticulare) ale sărurilor invenţiei pot fi preparate prin procedee cunoscute în domeniu, de exemplu, vezi cererea de brevet internaţional nr. WO 2002/000196.

Unele exemple de excipienţi adecvaţi includ lactoză, dextroză, zaharoză, sorbitol, manitol, amidonuri, gumă de salcâm, fosfat de calciu, alginaţi, tragacant, gelatină, silicat de calciu, celuloză microcristalină, polivinilpirolidonă, celuloză, apă, sirop, şi metil celuloză. Formulările pot include suplimentar: agenţi de lubrifiere cum ar fi talc, stearat de magneziu, şi ulei mineral; agenţi de umectare; de emulsionare şi agenţi de punere în suspensie; agenţi de conservare cum ar fi metil şi propilhidroxi-benzoaţi; agenţi de îndulcire; şi agenţi de aromatizare. Compoziţiile invenţiei pot fi formulate astfel încât să asigure eliberarea rapidă, susţinută sau întârziată a ingredientului activ după administrare la pacient prin utilizarea procedurilor cunoscute în domeniu.

Compoziţiile pot fi formulate într-o formă de dozare unitară, fiecare dozaj conţinând de la aproximativ 5 până la aproximativ 1000 mg (1 g), mai uzual de la aproximativ 100 până la aproximativ 500 mg, din ingredientul activ. Termenul „forme de dozare unitare« se referă la unităţi fizice discrete adecvate ca dozaje unitare pentru subiecţii umani şi alte mamifere, fiecare unitate conţinând o cantitate predeterminată de material activ calculată pentru a produce efectul terapeutic dorit, în asociere cu un excipient farmaceutic adecvat.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei conţin de la aproximativ 5 până la aproximativ 50 mg de ingredient activ. O persoană având calificare obişnuită în domeniu va aprecia că aceste compoziţii încorporează un conţinut de la aproximativ 5 până la aproximativ 10, de la aproximativ 10 până la aproximativ 15, de la aproximativ 15 până la aproximativ 20, de la aproximativ 20 până la aproximativ 25, de la aproximativ 25 până la aproximativ 30, de la aproximativ 30 până la aproximativ 35, de la aproximativ 35 până la aproximativ 40, de la aproximativ 40 până la aproximativ 45, sau dela aproximativ 45 până la aproximativ 50 mg de ingredient activ.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei conţin aproximativ 2,5, aproximativ 5, aproximativ 7,5, aproximativ 10, aproximativ 12,5, aproximativ 15, aproximativ 17,5, aproximativ 20, aproximativ 22,5, sau aproximativ 25mg din ingredientul activ. În unele realizări, compoziţiile invenţiei conţin aproximativ 5mg din ingredientul activ. În unele realizări, compoziţiile invenţiei conţin aproximativ 10mg din ingredientul activ.

Dozaje similare ale compuşilor şi sărurilor descrise aici pot fi utilizate în metodele şi utilizările invenţiei.

Compusul activ sau sarea pot fi eficiente într-un interval de dozare larg şi sunt administrate în general într-o cantitate eficientă farmaceutic. Se va înţelege totuşi că, cantitatea compusului sau sării administrate de fapt vor fi uzual determinate de către un medic, în conformitate cu circumstanţe relevante, incluzând afecţiunea care trebuie tratată, calea de administrare aleasă, compusul sau sarea actual administrate, vârsta, greutatea, şi răspunsul pacientului individual, severitatea simptoamelor pacientului, şi altele asemenea.

Pentru prepararea compoziţiilor solide cum ar fi tabletele, ingredientul activ principal este amestecat cu un excipient farmaceutic pentru a forma o compoziţie preformulată solidă conţinând un amestec omogen dintr-un compus sau sare a prezentei cereri de brevet. Când se face referire la aceste compoziţii preformulate ca omogene, ingredientul activ este de obicei dispersat uniform prin compoziţie astfel încât compoziţia să poată fi cu uşurinţă subdivizată în forme de dozare unitare eficiente egale cum ar fi tabletele, pilulele şi capsulele. Această preformulare solidă este apoi subdivizată în forme de dozare unitare de tipul descris mai sus conţinând de la, de exemplu, aproximativ 0,1 până la aproximativ 1000 mg de ingredient activ din prezenta cerere de brevet.

Tabletele sau pilulele din prezenta cerere de brevet pot fi acoperite sau altfel compuse pentru a furniza o formă de dozare care să ofere avantajul unei acţiuni prelungite. De exemplu, tableta sau pilula poate cuprinde o componentă de dozaj interior şi una de dozaj exterior, cea din urmă fiind în forma unei anvelope peste prima. Cele două componente pot fi separate de un strat enteric care serveşte să reziste la dezintegrarea din stomac şi să permită componentei interioare să treacă intactă în duoden sau să fie întârziată în eliberare. Poate fi utilizată o varietate de materiale pentru astfel de straturi sau acoperiri enterice, astfel de materiale incluzând un număr de acizi polimerici şi amestecuri de acizi polimerici cu astfel de materiale ca şelac, alcool cetilic, şi acetat de celuloză.

Formele lichide în care sărurile, şi compoziţiile prezentei cereri de brevet pot fi încorporate pentru administrare orală sau prin injecţie includ soluţii apoase, siropuri aromate adecvate, suspensii apoase sau uleioase, şi emulsii aromate cu uleiuri comestibile cum ar fi ulei din seminţe de bumbac, ulei de susan, ulei din nucă de cocos, sau ulei de arahide, precum şi elixire şi vehicule farmaceutice similare.

Compoziţiile pentru inhalare sau insuflare includ soluţii şi suspensii în solvenţi acceptabili farmaceutic, apoşi sau organici, sau amestecuri ale acestora, şi pulberi. Compoziţiile lichide sau solide pot conţine excipienţi adecvaţi acceptabili farmaceutic cum s-a descris mai sus. În unele realizări, compoziţiile sunt administrate pe cale orală sau respiratorie nazală pentru efect local sau sistemic. Compoziţiile pot fi nebulizate prin utilizarea de gaz inert. Soluţiile nebulizate pot fi înspirate direct dintr-un dispozitiv de nebulizare sau dispozitivul de nebulizare poate fi ataşat la o mască facială, cagulă, sau maşină de respirat intermitentă cu presiune pozitivă. Compoziţiile soluţii, suspensii, sau pulberi pot fi administrate oral sau nazal din dispozitive care livrează formularea într-o manieră adecvată.

Formulările topice pot conţine unul sau mai mulţi purtători convenţionali. În unele realizări, unguentele pot conţine apă şi unul sau mai mulţi purtători hidrofobi selectaţi dintre, de exemplu, parafină lichidă, polioxietilen alchil eter, propilen glicol, vaselină albă, şi altele asemenea. Compoziţiile purtătorilor de creme pot fi pe baza apei în combinaţie cu glicerol şi unul sau mai multe alte componente, de exemplu monostearat de glicerină, monostearat de glicerină PEG şi alcool cetistearilic. Gelurile pot fi formulate utilizând alcool izopropilic şi apă, adecvată în combinaţie cu alte componente cum ar fi, de exemplu, glicerol, hidroxietil celuloză, şi altele asemenea. În unele realizări, formulările topice conţin cel puţin aproximativ 0,1, cel puţin aproximativ 0,25, cel puţin aproximativ 0,5, cel puţin aproximativ 1, cel puţin aproximativ 2, sau cel puţin aproximativ 5 % din masa compusului sau a sării invenţiei. Formulările topice pot fi ambalate adecvat în tuburi de, de exemplu, 100 g care sunt opţional asociate cu instrucţiuni pentru tratamentul afecţiunii selectate, de exemplu, psoriazis sau alte afecţiuni ale pielii.

Cantitatea compusului, sării, sau compoziţiei administrate unui pacient va varia depinzând de ce este administrat, scopul administrării, cum ar fi profilaxie sau terapie, starea pacientului, maniera administrării, şi altele asemenea. În aplicaţiile terapeutice, compoziţiile pot fi administrate unui pacient care deja suferă de o boală, într-o cantitate suficientă pentru a vindeca sau cel puţin a opri parţial simptoamele bolii şi complicaţiile sale. Dozele eficiente vor depinde de afecţiunea bolii care este tratată precum şi de raţionamentul clinicianului curant depinzând de factori cum ar fi severitatea bolii, vârsta, greutatea şi afecţiunea generală a pacientului, şi altele asemenea.

Compoziţiile administrate unui pacient pot fi sub forma compoziţiilor farmaceutice descrise mai sus. Aceste compoziţii pot fi sterilizate prin tehnicile de sterilizare convenţionale, sau pot fi filtrate steril. Soluţiile apoase pot fi ambalate pentru utilizare aşa cum sunt, sau liofilizate, prepararea liofilizată fiind combinată cu un purtător apos steril înainte de administrare. PH-ul preparărilor compusului vor fi de obicei între 3 şi 11, mai preferabil de la 5 până la 9 şi cel mai preferabil de la 7 până la 8. Se va înţelege că utilizarea anumitor excipienţi, purtători, sau stabilizatori anteriori va conduce la formarea de săruri farmaceutice.

Dozajul terapeutic al unui compus sau săruri ale prezentei cereri de brevet poate varia în conformitate cu, de exemplu, utilizarea particulară pentru care este făcut tratamentul, maniera administrării compusului sau sării, sănătatea şi afecţiunea pacientului, şi raţionamentul medicului curant. Proporţia sau concentraţia unui compus sau săruri a invenţiei într-o compoziţie farmaceutică poate varia depinzând de un număr de factori incluzând dozajul, caracteristicile chimice (de exemplu, hidrofobicitatea), şi calea de administrare. De exemplu, compuşii şi sărurile invenţiei pot fi furnizaţi într-o soluţie apoasă de tampon fiziologic conţinând aproximativ 0,1 până la aproximativ 10% m/v a compusului pentru administrare parenterală. Unele intervale tipice de dozare sunt de la aproximativ 1 µg/kg până la aproximativ 1 g/kg de greutate corporală pe zi. În unele realizări, intervalul de dozare este de la aproximativ 0,01 mg/kg până la aproximativ 100 mg/kg de greutate corporală pe zi. Dozajul este probabil dependent de astfel de variabile ca tipul şi extensia progresului bolii sau tulburării, starea generală de sănătate a pacientului particular, eficacitatea biologică relativă a compusului selectat, formularea excipientului, şi calea sa de administrare. Dozele eficiente pot fi extrapolate din curbele de răspuns la doză derivate din sistemele de testare in vitro sau pe modele pe animale.

Compoziţiile invenţiei pot include în plus unul sau mai mulţi agenţi farmaceutici suplimentari cum ar fi agenţi chimioterapeutici, steroizi, compuşi antiinflamatori, sau imunosupresive, exemple ale cărora sunt furnizate aici.

Truse

Prezenta cerere de brevet include de asemenea truse farmaceutice utile, de exemplu, în tratamentul sau prevenirea bolilor sau tulburărilor asociate cu PI3K, cum ar fi cancerul, care include unul sau mai multe recipiente conţinând o compoziţie farmaceutică cuprinzând o cantitate eficientă terapeutic dintr-un compus. Astfel de truse pot include în plus, dacă se doreşte, una sau mai multe componente diferite ale unei truse farmaceutice convenţionale, cum ar fi, de exemplu, recipiente cu unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic, recipiente suplimentare, etc., după cum va fi cu uşurinţă evident celor calificaţi în domeniu. Instrucţiunile, fie ca inserturi sau fie ca etichete, care indică cantităţile componentelor care urmează să fie administrate, înstrucţiuni de administrare, şi/sau instrucţiuni pentru amestecarea componentelor, pot fi de asemenea incluse în trusă.

Invenţia va fi descrisă în mai multe detalii pe calea exemplelor specifice. Următoarele exemple sunt oferite în scopuri ilustrative, şi nu intenţionează să limiteze invenţia în nici o manieră. Cei calificaţi în domeniu vor recunoaşte cu uşurinţă o varietate de parametri necritici care pot fi schimbaţi sau modificaţi pentru a da esenţial aceleaşi rezultate. Sarea acidului clorhidric a compusului cu Formula I şi compusul cu Formula I au fost găsite ca fiind inhibitori ai PI3K în conformitate cu cel puţin un test descris aici.

EXEMPLE

Invenţia va fi descrisă în mai multe detalii pe calea exemplelor specifice. Următoarele exemple sunt oferite în scopuri ilustrative, şi nu intenţionează să limiteze invenţia în nici o manieră. Exemplele de compuşi, sau săruri ale acestora, conţinând unul sau mai mulţi centri chirali au fost obţinute în forme racemate sau ca amestecuri izomerice, în afară de cazul când se specifică altfel.

Metode generale

Purificările preparatoare LC-MS ale unor compuşi preparaţi au fost efectuate pe sisteme fracţionare direcţionate spre masă Waters. Setarea echipamentului de bază, protocoalele, şi software-ul de control pentru operarea acestor sisteme au fost descrise în detaliu în literatură. Vezi de exemplu „Two-Pump At Column Dilution Configuration for Preparative LC-MS«, K. Blom, J. Combi. Chem., 4, 295 (2002); „Optimizing Preparative LC-MS Configurations and Methods for Parallel Synthesis Purification«, K. Blom, R. Scântei, J. Doughty, G. Everlof, T. Haque, A. Combs, J. Combi. Chem., 5, 670 (2003); şi „Preparative LC-MS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization«, K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Combi. Chem., 6, 874-883 (2004). Compuşii separaţi au fost de obicei supuşi la spectrometrie de masă cu cromatografie analitică cu lichide (LCMS) pentru analiza de puritate în următoarele condiţii: Instrument; seria Agilent 1100, LC/MSD, Coloană: Waters Sunfire™ C18 5 µm, 2,1 x 50 mm, Tampoane: fază mobilă A: 0,025% TFA în apă şi fază mobilă B: acetonitril; gradient 2% până la 80% de B în 3 minute cu debit 2,0 mL/minut.

Unii din compuşii preparaţi au fost de asemenea separaţi pe o scală preparativă prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă cu fază inversă (RP-HPLC) cu detector MS sau cromatografie rapidă (gel de siliciu) cum s-a indicat în exemple. Condiţiile tipice de coloană ale cromatografiei preparative cu lichide de înaltă performanţă cu fază inversă (RP-HPLC) sunt după cum urmează:

pH = 2 purificări: Waters Sunfire™ C18 5 µm, coloană 19 x 100 mm, eluând cu fază mobilă A: 0,1% TFA (acid trifluoroacetic) în apă şi fază mobilă B: acetonitril; debitul a fost de 30 mL/minut, gradientul de separare a fost optimizat pentru fiecare compus utilizând protocolul de optimizare a metodei specifice compusului cum s-a descris în literatură [vezi „Preparative LCMS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization«, K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Comb. Chem., 6, 874-883 (2004)]. De obicei, debitul utilizat cu coloana 30 x 100 mm a fost de 60 mL/minut.

pH = 10 purificări: Waters XBridge C18 5 µm, coloană 19 x 100 mm, eluând cu fază mobilă A: 0,15% NH4OH în apă şi fază mobilă B: acetonitril; debitul a fost de 30 mL/minut, gradientul de separare a fost optimizat pentru fiecare compus utilizând protocolul de optimizare a metodei specifice compusului cum s-a descris în literatură [Vezi „Preparative LCMS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization«, K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Comb. Chem., 6, 874-883 (2004)]. De obicei, debitul utilizat cu coloana 30 x 100 mm a fost de 60 mL/minut.

Unii din compuşii preparaţi au fost de asemenea analizaţi prin calorimetrie cu scanare diferenţială (DSC). Condiţiile tipice instrumentului DSC sunt după cum urmează: Instrument TA pentru calorimetrie cu scanare diferenţială, Model Q200 cu autoeşantiator: 30 - 350°C la 10°C/min; tas şi capac mostră de aluminiu T-zero; flux gazos de azot la 50 mL/min.

Instrument de calorimetrie cu scanare diferenţială Mettler Toledo (DSC) 822: 40 - 340°C la o rată de încălzire de 10 °C/min.

Unii din compuşii preparaţi au fost de asemenea analizaţi prin analiză termogravimetrică (TGA). Condiţiile tipice pentru instrumentul TGA după cum urmează: Analizor instrument termogravimetric TA, Model Piris: Pantă de temperatură de la 25°C până la 300°C la 10°C/min; flux de gaz de azot de purjare la 60 mL/min; Suport pentru mostră din creuzet ceramic TGA.

Instrument TA Q500: pantă de temperatură de la 20°C până la 300°C la 10°C/min.

Unii din compuşii preparaţi au fost de asemenea analizaţi prin difracţie cu raze X pe pulbere (XRPD). Condiţiile tipice ale instrumentului XRPD sunt după cum urmează: Instrument difractometru cu raze X pe pulbere Bruker D2 PHASER: lungimea de undă a radiaţiei cu raze X: 1,05406 Å CuKAI; putere raze X: 30 KV, 10 mA; pulbere mostră: dispersată pe un suport pentru mostră cu fundal zero; condiţii generale de măsurare: unghi de început - 5 grade, unghi de stop - 60 grade, luarea unei mostre - 0,015 grade, viteză de scanare - 2 grade/min.

Difractometru cu pulbere Rigaku Miniflex: Cu la 1,054056 Е cu filtru Kβ; condiţii generale de măsurare: unghi de început - 3 grade, unghi de stop - 45 grade, luarea unei mostre-0,02 grade, viteză de scanare - 2 grade/min.

Exemplul 1. Sinteză de (R)-4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil) pirolidin-2-onă

Etapa 1. 1-(5-cloro-4-fluoro-2-hidroxifenil)etanonă (ii)

4-cloro-3-fluorofenol (i, 166 g, 1,11 mol) şi clorura de acetil (107 mL, 1,50 mol) au fost încărcate într-un flacon de 5 L la temperatura camerei. Amestecul de reacţie a fost agitat şi turnat la o soluţie clară în timp ce temperatura lotului a fost înregistrată scăzȃnd până la 6°C. Amestecul de reacţie a fost apoi încălzit la 60°C timp de 2 ore. Amestecul de reacţie a fost încărcat cu nitrobenzen (187,5 mL, 1,82 mol) şi ulterior răcit la temperatura camerei. S-a adăugat apoi triclorură de aluminiu (160 g, 1,2 mmol) la amestec în trei porţii (50 g, 50g, şi 60 g la intervale de 5 min). Temperatura lotului a crescut până la 78°C după terminarea adăugării. Amestecul de reacţie a fost apoi încălzit la 100-120°C timp de 3 ore, moment în care, analiza HPLC a arătat că reacţia a fost completă. Amestecul de reacţie a fost apoi răcit la 0°C şi încărcat cu hexani (0,45 L), acetat de etil (0,55 L), şi apoi încărcat încet cu 1,0 N acid clorhidric apos (1,0 L) la temperatura camerei. Adăugarea de acid clorhidric apos a fost exotermică şi temperatura lotului a crescut de la 26°C până la 60°C. Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura camerei timp de 20 min. Straturile au fost separate şi stratul organic a fost spălat secvenţial cu 1,0 N acid clorhidric apos (2 x 600 mL) şi apă (400 mL). Stratul organic a fost apoi extras cu 1,0 N soluţie apoasă de hidroxid de sodiu (2 x 1,4 L). Soluţiile bazice combinate au fost acidulate la pH 2 prin adăugarea de 12 N acid clorhidric apos până când nici un precipitat suplimentar nu a mai fost separat. Solidul rezultat a fost colectat prin filtrare, spălat cu apă şi uscat în pâlnie de filtrare sub sucţiune pentru a da compusul ii ca solid galben (187,4 g, 89,5%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12,44 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 2,61 (s, 3H).

Etapa 2. 1-(5-cloro-4-fluoro-2-hidroxi-3-iodofenil)etanonă (iii)

1-(5-cloro-4-fluoro-2-hidroxifenil)etanona (ii, 100,0 g, 530,3 mmol) a fost dizolvată în acid acetic (302 mL) şi la soluţie s-a adăugat N-iodosuccinimidă (179,2 g, 796,5 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat de la aproximativ 61°C până la aproximativ 71°C timp de 2 ore, moment în care analiza HPLC a indicat că reacţia a fost completă. Amestecul de reacţie a fost apoi răcit la temperatura camerei, s-a adăugat apă (613 mL), şi suspensia rezultată a fost agitată la temperatura camerei timp de 30 min. Produsul a fost colectat prin filtrare şi clătit cu apă pentru a da un solid maro. Produsul umed a fost dizolvat în acid acetic (400 mL) la 60°C. La soluţie s-a adăugat apă (800 mL) (peste 15 min) pentru a precipita produsul pur. Produsul a fost colectat prin filtrare şi spălat cu apă (100 mL). Produsul a fost uscat pe pȃlnia de filtrare sub sucţiune timp de 18 ore pentru a da compusul iii ca solid maro (164,8 g, randament 95,0%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 813,34 (s, 1H), 8,26 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 2,68 (s, 3H).

Etapa 3. 1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-iodofenil)etanonă (iv)

Într-un balon de 5 L cu trei gȃturi, cu fund rotund, echipat cu un condensator şi un termometru, 1-(5-cloro-4-fluoro-2-hidroxi-3-iodofenil)etanonă (iii, 280 g, 840 mmol) a fost dizolvată în N,N-dimetilformamidă (600 mL). În timpul dizolvării, temperatura internă a scăzut de la 19,3°C până la 17,0°C. S-a adăugat iodoetan (81,2 mL, 1020 mmol) la amestecul rezultat. S-a adăugat apoi carbonat de potasiu (234 g, 1690 mmol) peste 2 min la amestecul de reacţie şi nu s-a observat nici o modificare în temperatura lotului. Amestecul de reacţie a fost încălzit la 60°C timp de 3 ore, moment în care analiza HPLC a indicat că reacţia a fost completă. Amestecul de reacţie a fost lăsat să se răcească la temperatura camerei şi produsul a fost colectat prin filtrare. Solidele au fost dizolvate într-un amestec de DCM (1,0 L), hexan (500 ml), şi apă (2,1 L). Sistemul bifazic a fost agitat la 20°C timp de 20 min. Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu DCM (1,0 L). Stratul organic combinat a fost spălat cu apă (2 x 250 mL) şi saramură (60 mL). Faza organică a fost separată, uscată pe Na2SO4 anhidru, filtrată, şi concentrată în vid la sec pentru a da compusul iv ca solid galben (292 g, randament 94%). 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ7,69 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,95 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 2,62 (s, 3H), 1,49 (t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS pentru C10H10ClFIO2 (M + H)+: m/z = 342,9.

Etapa 4. 2-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-iodofenil)-2-metil-1,3-dioxolan (v)

O soluţie de 1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-iodofenil)etanonă (iv, 250,0 g, 693,4 mmol) şi 1,2-etandiol (58,0 mL, 1040 mmol) în toluen (1,5 L) a fost tratată cu acid p-toluensulfonic monohidrat (10,6 g, 55,5 mmol). Flaconul de reacţie a fost prevăzut cu un aparat Dean-Stark şi amestecul a fost încălzit la reflux timp de 7 ore. Analiza LCMS a indicat că amestecul de reacţie a conţinut 8,3% materie primă şi 91,7% produs. Amestecul de reacţie a fost răcit la 106°C, şi o cantitate suplimentară de 1,2-etandiol (11,6 mL, 208 mmol) a fost introdusă prin seringă. Amestecul de reacţie a fost apoi încălzit la reflux pentru încă 8 ore suplimentare. Analiza LCMS a indicat că amestecul de reacţie a conţinut 3,6% materie primă şi 96,4% produs. Amestecul de reacţie a fost răcit la 106°C, şi s-a introdus suplimentar prin seringă 1,2-etandiol (7,73 mL, 139 mmol). Amestecul de reacţie a fost încălzit la reflux pentru încă 15,5 ore suplimentare. Analiza LCMS a indicat că amestecul de reacţie a conţinut 2,2% materie primă şi 97,8% produs.

Amestecul de reacţie a fost apoi răcit la 0°C şi s-au adăugat apă (200 ml) şi NaHCO3 saturat apos (300 ml) pentru a ajusta amestecul la un pH de 9. S-a adăugat DCM (200 ml) şi lotul a fost agitat timp de 10 min. Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu toluen (300 mL). Stratul organic combinat a fost spălat secvenţial cu un amestec de apă (200 ml) şi NaHCO3 saturat apos (200 ml), apă (300 ml), saramură (300 ml), uscat pe Na2SO4 anhidru, filtrat, şi concentrat în vid la sec pentru a furniza compusul brut v ca solid maro deschis (268 g, randament 100%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,59 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,26-3,96 (m, 4H), 3,92-3,72 (m, 2H), 1,74 (s, 3H), 1,50 (t, J = 7,0 Hz, 3 H). LCMS pentru C12H14ClFIO3 (M + H)+: m/z = 387,0.

Etapa 5. 3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)benzaldehidă (vi)

La o soluţie agitată de 2-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-iodofenil)-2-metil-1,3-dioxolan (v, 135,0 g, 349,2 mmol) (86,8% puritate prin HPLC cu 5,5% cetonă) în tetrahidrofuran anhidru (300 mL), de la aproximativ 0°C până la aproximativ 3°C s-a adăugat încet complex de clorură de litiu de clorură de izopropilmagneziu 1,3 M în THF (322,3 mL, 419,0 mmol) peste 1 oră. Amestecul de reacţie a fost agitat de la aproximativ 0°C până la aproximativ 5°C timp de 30 min, moment în care analiza LCMS a indicat că reacţia de modificare iod-magneziu a fost completă. S-a adăugat apoi la amestecul de reacţie N-formilmorfolină (71,1 mL, 700 mmol) peste 1 oră de la aproximativ 0°C până la aproximativ 8°C. Amestecul de reacţie a fost agitat de la aproximativ 0°C până la aproximativ 8°C pentru încă o oră suplimentară, moment în care analizele LCMS şi HPLC au arătat că materia primă a fost consumată şi s-a observat o cantitate semnificativă de produs secundar de de-iodinare, 2-(5-cloro-2-etoxi-4-fluorofenil)-2-metil-1,3-dioxolan. Reacţia a fost stinsă cu o soluţie apoasă de acid citric (120,8 g, 628,6 mmol) în apă (1,20 L) la 0°C. Amestecul stins de reacţie a fost apoi extras cu EtOAc (2 x 600 mL). Fazele au fost cu uşurinţă separate. Stratul organic combinat a fost spălat secvenţial cu apă (300 ml) şi saramură (500 mL), uscat pe Na2SO4 anhidru, filtrat, şi concentrat în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă pe coloană cu gel de siliciu cu 0 - 10% EtOAc/hexan pentru a da compusul produs brut vi ca solid galben pal, care a fost un amestec de produs dorit, 3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)benzaldehidă(vi, 80 g, 80%) conţinând 36 mol % de produs secundar de de-iodinare, 2-(5-cloro-2-etoxi-4-fluorofenil)-2-metil-1,3-dioxolan cum s-a indicat prin analiza NMR. Compusul produs brut vi a fost purificat suplimentar prin formarea aductului corespunzător de bisulfit de sodiu.

Bisulfitul de sodiu (36,91 g, 354,7 mmol) a fost dizolvat în apă (74,3 mL, 4121 mmol). La o soluţie agitată de 3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)benzaldehidă brută (vi, 80,00g, 177,3 mmol) în acetat de etil (256,0 mL), soluţia proaspăt preparată de bisulfit de sodiu a fost adăugată într-o porţie. Soluţia a fost agitată timp de aproximativ 10 min şi s-a observat precipitatul. Suspensia a fost apoi agitată pentru încă o oră suplimentară. Aductul de aldehidă-bisulfit a fost colectat prin filtrare, spălat cu EtOAc şi uscat sub vid şi atmosferă de azot timp de 20 ore pentru a da un solid alb (58,2 g, randament 83,6%). La aductul de aldehidă-bisulfit (58,2 g, 148 mmol) amestecat în hidroxid de sodiu apos 1,0 M (296 mL, 296 mmol) s-a adăugat metil t-butil eter (600 mL) (MTBE). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 6 min pentru a da un amestec bifazic clar, şi agitarea a continuat pentru încă 5 min suplimentare. Faza organică a fost colectată şi stratul apos a fost extras cu MTBE (2 x 300 mL). Straturile organice combinate au fost spălate cu saramură (300 mL), uscate pe Na2SO4 anhidru, filtrate, şi concentrate în vid pentru a da compusul pur vi ca solid cristalin alb (31,4 g, randament 73,4%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,27 (s, 1H), 7,78 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 4,10-3,96 (m, 4H), 3,87-3,76 (m, 2H), 1,72 (s, 3H), 1,44 (t, J = 7,0 Hz, 3 H). LCMS pentru C13H15ClFO4 (M + H)+: m/z = 289,0.

Etapa 6. (E)-2-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-(2-nitrovinil)fenil)-2-metil-1,3-dioxolan (vii)

Într-un balon de 5 L cu 4 gâturi, cu fund rotund, echipat cu agitator la partea superioară, perete despărţitor, termocuplu, admisie de azot şi condensator s-a încărcat 3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)benzaldehidă (vi, 566,2 g, 1961 mmol), nitrometan (1060 mL, 19600 mmol), şi acid acetic glacial (1120 mL). În continuare, amestecul de reacţie a fost încărcat cu benzilamină (53,6 mL, 490 mmol) şi amestecul rezultat a fost încălzit la 60°C şi reacţia a fost monitorizată prin LCMS timp de 5,5 ore. O analiză iniţială a liniei de bază a fost luată la t = 0. Reacţia a fost verificată după 2 ore şi 5 ore. După 2 ore, a existat aproximativ 20% din materia primă aldehidă nereacţionată. După 5 ore profilul de reacţie a fost după cum urmează: compusul din materia primă vi (< 2%), imină intermediară (< 4%), compusul produs vii (> 93%) şi aduct de benzilamină Michael (nedetectat). La momentul de reacţie de 5,5 ore, reacţia a fost considerată completă. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura camerei şi diluat cu acetat de etil (3,0 L). Amestecul a fost separat în jumătate pentru prelucrare din cauza volumului mare implicat.

Fiecare jumătate a fost tratată în conformitate cu următoarea procedură: Amestecul de reacţie a fost mai întȃi spălat cu 1,5 M NaCl în apă (2 x 1500 mL; după fiecare spălare volumul apos de ieşire a crescut în comparaţie cu cel de intrare sugerând că acidul acetic şi/sau nitrometanul au fost îndepărtaţi). Amestecul a fost apoi răcit la aproximativ 15°C şi spălat cu 4 M soluţie apoasă de NaOH (4 x 300 mL) până când extractul apos a atins pH-ul de 8-9. În timpul spălării iniţiale stratul apos a rămas acidic, dar deoarece soluţia apoasă a devenit puţin bazică în timpul spălărilor ulterioare, amestecul a fost încălzit şi extractul a fost închis la culoare. Straturile au fost separate. Stratul organic după ajustarea pH-ului a fost apoi spălat cu clorură de sodiu 1,5 M în apă (1000 mL) şi apă (500 mL). În timpul acestei spălări finale, s-au observat o emulsie şi o partiţie lentă. Faza organică a fost uscată pe MgSO4 anhidru, agitată, şi concentrată sub presiune redusă. Siropul chihlimbariu rezultat a fost plasat sub vid înaintat peste noapte. S-au obţinut sirop solidificat şi 740 g de produs brut.

La produsul brut s-a adăugat heptan (1,3 L), formȃnd o suspensie, care a fost încălzită într-o baie cu apă la 60°C până când toate solidele s-au dizolvat. Soluţia rezultată a fost filtrată prin polişare într-un balon curat de 3 L cu 4 gâturi, cu fund rotund, echipat cu un agitator la partea superioară şi o admisie de azot. Filtrul a fost clătit cu heptan (40 mL). Soluţia filtrată a fost răcită la temperatura camerei şi agitată timp de 5 ore. S-a observat precipitatul solid şi suspensia a fost răcită la 0°C într-o baie cu gheaţă timp de 1 oră. Produsul a fost colectat prin filtrare şi turta umedă rezultată a fost spălată cu 500 mL de heptan rece cu gheaţă. Produsul a fost parţial uscat pe filtru sub sucţiune în vid şi uscat mai departe sub vid înaintat peste noapte. Filtratul şi soluţia de spălare au fost concentrate sub presiune redusă şi reziduul rezultat a fost păstrat pentru purificare pe coloană.

Solidele din cristalizarea heptanului au fost dizolvate într-un mic volum de DCM şi 20% EtOAc/hexan şi încărcate pe o coloană conţinând aproximativ 1 kg de gel de siliciu. Coloana a fost eluată cu 20% EtOAc/hexan. Fracţiunile dorite au fost combinate şi concentrate sub presiune redusă pentru a da un solid galben. Solidul a fost uscat sub vid înaintat peste noapte pentru a da 497 g de compus al produsului vii ca solid cristalin galben pal.

Filtratele concentrate şi spălate din cristalizarea heptanului au fost încărcate pe aceeaşi coloană ca mai sus utilizând 20% EtOAc/hexan. Coloana a fost eluată utilizând acelaşi sistem de solvent ca mai sus pentru a îndepărta impurităţile liniei de bază şi acidul acetic rezidual. Fracţiunile dorite au fost combinate şi concentrate sub presiune redusă pentru a da un ulei chihlimbariu roşcat. Uleiul a fost plasat sub vid înaintat şi s-a obţinut aproximativ 220 g de produs brut. Acest produs brut a fost dizolvat în heptan (500 mL) şi însămânţat cu o cantitate mică din prima recoltă de produs solid. Suspensia a fost agitată la temperatura camerei timp de 16 ore şi apoi răcită într-o baie cu gheaţă timp de 3 ore. A doua recoltă de produs a fost colectată prin filtrare. Produsul a fost uscat sub vid înaintat şi s-au obţinut 110 g de produs ca solid galben. Cantitatea totală de compus de produs vii obţinută a fost de 607 g (randament 93,3%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,94 (s, 2H), 7,68 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 4,07-3,95 (m, 4H), 3,82-3,73 (m, 2H), 1,65 (s, 3H), 1,39 (t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS pentru C14H16ClFNO5 (M + H)+: m/z = 332,0.

Etapa 7. (R)-dimetil-2-(1-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)fenil)-2-nitroetil)malonat (viii)

Într-un balon de 2 L cu fund rotund cu o bară de agitare magnetică şi admisie de azot conţinând (E)-2-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-(2-nitrovinil)fenil)-2-metil-1,3-dioxolan (vii, 352,8 g, 1064 mmol), s-au adăugat tetrahidrofuran anhidru (1,06 L) şi dimetil malonat (146 mL, 1280 mmol). (1S,2S)-NN'-dibenzilciclohexan-1,2-diamină-dibromonichel (catalizator Evans, 21,4 g, 26,6 mmol), a fost încărcat la amestecul de reacţie. Amestecul de reacţie a fost de culoare maro şi s-a observat o soluţie omogenă. Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 18,5 ore. Reacţia a fost analizată după 18,5 ore prin HPLC. Materia primă nereacţionată, compusul vii, a fost prezent la 2%. Amestecul de reacţie a fost concentrat sub presiune redusă pentru a îndepărta THF şi reziduul rezultat a fost purificat prin cromatografie rapidă (DCM/hexani utilizaţi pentru încărcare, 1422 g de gel de siliciu au fost utilizate pentru această coloană, şi coloana a fost eluată cu 10% până la 20% EtOAc/hexan; fracţiunile coloanei au fost monitorizate prin TLC utilizând 30% EtOAc/hexan ca eluent şi au fost vizualizate prin UV). Fracţiunile dorite au fost combinate şi concentrate sub presiune redusă. Reziduul a fost uscat sub vid înaintat. În timp, siropul s-a solidificat la un solid galben deschis (503,3 g) şi o mostră a fost luată pentru analiza chirală HPLC. Puritatea chirală a fost de 95,7 % a (R)-enantiomerului dorit şi de 4,3% a (S)-enantiomerului nedorit. Etanolul (1,0 L) a fost adăugat la solide şi amestecul a fost încălzit într-o baie cu apă la 60°C până când solidele s-au dizolvat. Soluţia a fost filtrată prin polişare într-un balon curat de 3 L cu 4 gâturi printr-o hȃrtie de filtrare #1 Whatman. Soluţia filtrată a fost răcită la temperatura camerei în timp ce a fost agitată. Cristalizarea s-a observat după 30 min de agitare şi suspensia a fost agitată la temperatura camerei timp de 16 ore. Suspensia a fost răcită într-o baie cu gheaţă timp de 1 oră. Produsul a fost colectat prin filtrare şi turta filtrată rezultată a fost spălată cu etanol rece în gheaţă (500 mL) şi a fost uscată parţial pe filtru. Solidele au fost uscate sub vid înaintat pentru a da produsul dorit viii (377,5 g) ca solid cristalin alb. Puritatea chirală a fost determinată prin HPLC chirală ca fiind de 100% a (R)-enantiomerului dorit şi de 0% a (S)-enantiomerului nedorit.

Filtratul şi spălatul au fost combinate şi concentrate sub presiune redusă la un ulei (118,9g). Uleiul a fost dizolvat în etanol (475,0 mL) (4 mL/g) şi a fost însămânţat cu prima recoltă de cristale. Suspensia rezultantă a fost agitată timp de 16 ore la temperatura camerei şi apoi răcită într-o baie cu gheaţă timp de 5,5 ore. Al doilea produs recoltat a fost izolat prin filtrare şi a fost uscat parţial pe filtru. El a fost uscat sub vid înaintat pentru a da al doilea produs recoltat (31,0 g). Puritatea chirală a fost determinată prin HPLC chirală a fi de 98,3% a (R)-enantiomerului dorit şi de 1,7 % a (S)-enantiomerului nedorit. S-au obţinut combinat din prima şi cea de a doua recoltă ale produsului 408,5 g în randament de 82,8%. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,51 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 5,20-4,81 (m, 2H), 4,62 (m, 1H), 4,14-4,03 (m, 2H), 4,03-3,97 (m, 2H), 3,95-3,88 (m, 1H), 3,84-3,72 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,38 (s, 3H), 1,61 (s, 3H), 1,39 (t, J = 6,9 Hz, 3H). LCMS pentru C19H24ClFO9 (M + H)+ m/z = 463,9.

Etapa 8. (R)-dimetil 2-(1-(3-acetil-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)-2-nitroetil)malonat (ix)

La o soluţie agitată de (R)-dimetil-2-(1-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)fenil)-2-nitroetil)malonat (viii, 244,0 g, 526,0 mmol) în acetonă (1,2 L) într-un balon de 5 L cu trei gȃturi, cu fund rotund, echipat cu un agitator mecanic, s-a adăugat iod (13,4 g, 52,6 mmol) la temperatura camerei. Soluţia maro rezultată a fost încălzită la 50°C într-o baie cu apă timp de 30 min, în care moment analiza LCMS a arătat că reacţia a fost completă. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura camerei, şi apoi stins cu o soluţie de tiosulfat de sodiu (17,0 g, 108 mmol) în apă (160 mL) pentru a da o soluţie galben pal clară. În acest moment, o cantitate suplimentară de apă (1,2 L) a fost încărcată la soluţia stinsă şi suspensia albă rezultată a fost agitată la temperatura camerei timp de 1 oră. Solidul a fost apoi colectat prin filtrare şi re-dizolvat în acetonă (1,4 L) la 40°C. Soluţia a fost răcită la temperatura camerei, şi apoi s-a adăugat apă suplimentară (1,4 L). Suspensia albă rezultată a fost agitată la temperatura camerei timp de 1 oră. Solidul a fost colectat prin filtrare şi spălat cu apă (3 x 100 ml). Solidul produs a fost uscat într-o pȃlnie de filtrare sub sucţiune cu un flux de azot timp de 46 ore pentru a da compusul ix ca solid alb (212 g, randament 96%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,54 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,09-4,67 (m, 3H), 4,10-3,83 (m, 3H), 3,90 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 1,46 (t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS pentru C17H20ClFNO8 (M + H)+: m/z = 420,1.

Etapa 9. dimetil 2-((R)-1-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil)-2-nitroetil)malonat (x)

La o soluţie agitată de (3aS)-1-metil-3,3-difeniltetrahidro-3H-pirolo[1,2-c][1,3,2]oxazaborol, ((S)-MeCBS, 16,39 g, 59,12 mmol, 0,1 echiv.) în THF anhidru (100 mL) într-un balon de 5 L cu fund rotund la temperatura camerei, s-au adăugat o soluţie de 1,0 M boran-THF complex în THF (591 mL, 591 mmol, 1 echiv.) urmată de eterat trifluorură de bor (3,75 mL, 29,6 mmol, 0,05 echiv). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura camerei timp de 30 min. S-a adăugat apoi în picătură o soluţie de dimetil [(1R)-1-(3-acetil-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)-2-nitroetil]malonat (ix, 253,0 g, 591,2 mmol) în THF anhidru (1,7 L) printr-o pâlnie de adăugare peste 60 min. Flaconul care a conţinut cetona ix a fost clătit cu THF anhidru (135 mL) şi soluţia a fost adăugată în picătură prin pâlnia de adăugare la amestecul de reacţie. Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura camerei timp de încă 10 min suplimentare, moment în care analiza LCMS a arătat conversia completă a cetonei la alcool. Reacţia a fost stinsă prin adăugarea de metanol în picătură (71,8 mL, 1770 mmol) la 0°C. Amestecul stins de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 15 min înainte de a fi concentrat în vid pentru a da produsul brut. Produsul brut al acestui lot şi al loturilor similare (utilizând 200 g de materie primă) au fost combinate şi au fost purificate prin cromatografie pe coloană cu gel de siliciu utilizând 0 până la 5 % MeOH/DCM ca eluent pentru a da compusul x ca solid alb (437g, randament 97,9%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,50 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 5,13 (q, J= 6,3 Hz, 1H), 5,01-4,65 (m, 3H), 4,14-3,89 (m, 3H), 3,79 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 1,57-1,42 (m, 6H). LCMS pentru C17H21ClFNNaO8 (M + Na)+: m/z = 444,0.

Etapa 10. (4R)-metil 4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil)-2-oxopirolidin-3-carboxilat (xi)

Un balon Morton cu 3 gȃturi, cu fund rotund, conţinând dimetil ((1R)-1-{3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-[(1R)-1-hidroxietil]fenil}-2-nitroetil)malonat (x, 100,0 g, 237,1 mmol) în tetrahidrofuran (800,0 mL) şi nichel Raney (120 g după îndepărtarea apei cu o pipetă) a fost dotat cu un condensator, un agitator mecanic (tijă de agitare de sticlă şi acoperire de teflon), şi două baloane de gaz de hidrogen (după purjare în vid). Balonul a fost plasat într-o baie cu ulei la 65°C. Lotul a fost agitat viguros timp de 16 ore şi baloanele au fost periodic îndepărtate şi reumplute cu hidrogen. A fost luată o mostră şi analizată prin HPLC. Produsul, compusul xi, a fost prezent la 83%. În amestecul de reacţie au fost 7,8% dintr-o amină neciclizată şi 5,5% dintr-un produs secundar de hidroxilamină. Catalizatorul a fost separat prin filtrare (trebuie avută grijă ca nichelul Raney să nu fie lăsat să se usuce prin expunere la aer). Filtratul a fost evaporat la sec pentru a da 91 g de produs brut ca spumă albă. Produsul brut (91 g, puritatea zonei de 82,6 %) a fost combinat cu un alt lot similar de produs brut (93 g, puritate 72,8 %) pentru purificare. Produsul brut combinat (184 g) a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu gel de siliciu (EtOAc/hexan ca eluent) pentru a da compusul xi (101,1 g, puritate HPLC 93%, randament brut 59,3%). Materialul brut a fost utilizat pentru etapa următoare fără purificare suplimentară. LCMS pentru C16H20ClFNO5 (M + H)+: m/z = 360,0.

Etapa 11. acid (4R)-4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil)-2-oxopirolidin-3-carboxilic (xii)

Într-un balon de 5 L, cu 4 gâturi, cu fund rotund, echipat cu un agitator la partea superioară şi o admisie de azot, a fost încărcată o soluţie de (4R)-metil 4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil)-2-oxopirolidin-3-carboxilat (xi, 268 g, 581 mmol) în tetrahidrofuran (2150 mL, 26500 mmol). La soluţie, s-a încărcat hidroxid de sodiu 1,0 M în apă (1420 mL, 1420 mmol). Soluţia tulbure rezultată a devenit clară într-un min. Amestecul de reacţie a fost agitat peste noapte la temperatura camerei. Reacţia a fost analizată prin LCMS după 15 ore şi a părut să fie completă deoarece nu s-a mai observat materie primă. Amestecul de reacţie a fost răcit într-o baie cu gheaţă la o temperatură internă de 9,5°C şi amestecul a fost acidulat la pH 1-2 prin adăugarea de 6,0 M acid clorhidric apos (237,0 mL, 1422 mmol) printr-o pȃlnie de picurare în 30 min. Amestecul de reacţie a fost divizat în jumătate şi fiecare jumătate a fost extrasă cu acetat de etil (2 x 1 L). Straturile apoase combinate au fost extrase suplimentar cu acetat de etil (500 mL). Cele două straturi organice au fost spălate cu saramură (20 % g/g NaCl/ apă, 2 x 1000 mL), uscate pe MgSO4 anhidru, filtrate, şi concentrate pentru a da acidul intermediar brut xii ca spumă gălbuie care a fost utilizat direct în următoarea reacţie. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12,68 (br s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,52 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,27 (br s, 1H), 4,90 (q, J = 6,3 Hz, 1H), 4,28 (q, J = 8,8 Hz, 1H), 3,92-3,81 (m, 1H), 3,76-3,65 (m, 1H), 3,57 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,46 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,23 (q, J = 9,5 Hz, 1H), 1,33 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,28 (d, J = 6,4 Hz, 3H). LCMS pentru C15H17ClFNNaO5 (M + Na)+: m/z = 368,0.

Etapa 12. (R)-4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil)pirolidin-2-onă (xiii)

Compusul brut xii a fost dizolvat în 1,4-dioxan (976 mL) şi toluen (976 mL) şi soluţia galbenă rezultată a fost încălzită la 100°C. Culoarea soluţiei a devenit maro pe măsură ce reacţia a progresat. Mostrele au fost extrase la momentele de timp de 1 oră, 2 ore şi 2,5 ore. La 2,5 ore, analiza HPLC a arătat că acidul, compusul 12, a fost la 0,38% şi produsul dorit, compusul xiii, la 78,8%. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura camerei şi a fost filtrat prin polişare într-un balon curat de 3 L, cu fund rotund. Soluţia a fost apoi concentrată sub presiune redusă şi reziduul rezultat a fost plasat sub vid înaintat pentru a da o spumă maro (254 g).

Acetonitrilul (350 mL) a fost încărcat la siropul maro şi încălzit la 65°C într-o baie cu apă până când s-a observat dizolvarea. Soluţia a fost răcită la temperatura camerei şi a fost agitată timp de 16 ore. Solidele au fost separate de soluţie. Suspensia rezultată a fost răcită într-o baie cu gheaţă timp de 1 oră. Produsul a fost colectat prin filtrare şi turta filtrată a fost clătită cu 400 mL de acetonitril rece cu gheaţă. Solidele par să fie higroscopice. Solidul a fost dizolvat în DCM (2,0 L) şi concentrat la un sirop care a fost plasat sub vid înaintat pentru a da compusul xiii ca spumă albă (106,4 g).

Filtratul a fost concentrat la un sirop închis (aproximativ 120 g) care a fost purificat prin cromatografie rapidă (coloană cu gel de siliciu de 4 x 330g, încărcată cu DCM, eluată cu 50% până la 100% EtOAc/hexan, şi monitorizată prin TLC utilizând 100% EtOAc ca eluent). Fracţiunile din cromatografie au fost concentrate sub presiune redusă şi plasate sub vid înaintat pentru a da o spumă maro deschis (54,4g). Spuma a fost încărcată cu MTBE (400 mL) şi MeOH (10 mL) şi încălzită într-o baie cu apă la 56°C timp de 15 minute şi unele solide au rămas. Suspensia a fost răcită la temperatura camerei cu agitare. Suspensia a fost filtrată pentru a îndepărta substanţele insolubile. Filtratul a fost concentrat la un sirop şi plasat sub vid înaintat pentru a da o spumă. Spuma a fost încărcată cu acetonitril (72 mL, 1,5 mL/g) şi încălzită într-o baie cu apă la 60°C până când soluţia devine omogenă. Soluţia a fost răcită la temperatura camerei cu agitare şi solidele precipitate din soluţie şi a devenit foarte groasă. S-a încărcat acetonitril suplimentar (24 mL) pentru a ajusta diluţia până la 2 mL/g. Suspensia a fost agitată la temperatura camerei timp de 16 ore şi apoi răcită într-o baie cu gheaţă timp de 1 oră. Produsul a fost colectat prin filtrare şi clătit cu acetonitril. Compusul xiii (25 g) a fost obţinut ca a doua recoltă. Un total de 131,4 g de compus xiii au fost obţinute în randament de 74,9 % din compusul xi. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,83 (s, 1H), 7,47 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 4,96-4,85 (m, 1H), 4,08-3,92 (m, 1H), 3,80 (qt, J = 6,9, 3,5 Hz, 2H), 3,61-3,51 (m, 1H), 3,25 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 2,61-2,50 (m, 1H), 2,35-2,26 (m, 1H), 1,33 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,27 (d, J = 6,4 Hz, 3H). LCMS pentru C14H18ClFNO3 (M + H)+: m/z = 302,0.

Exemplul 2. Sinteză alternativă a (R)-4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil)pirolidin-2-onei

Etapa 1. 1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluorofenil)etanonă (iv-a)

1-(5-cloro-4-fluoro-2-hidroxifenil)etanonă (Compusul ii din Exemplul 1, Etapa 1, 1350 g, 7160 mmol), N,N-dimetilformamidă (3,32 L), iodoetan (1340 g, 8590 mmol), şi carbonat de potasiu (1980 g, 14300 mmol) au fost amestecate împreună şi agitate la temperatura camerei timp de 45 min. Temperatura lotului a ajuns până la 55°C de la 22°C. Amestecul de reacţie a fost încălzit la 60°C timp de 1 oră (temperatura lotului a atins 67°C în 30 min şi apoi a scăzut până la 60°C). Analiza HPLC a indicat că toată materia primă a fost consumată. S-a adăugat apă (10 L) într-o porţie (agitarea va înceta dacă apa se adaugă în porţii). Suspensia rezultată a fost agitată la temperatura camerei timp de 30 min. Produsul a fost colectat prin filtrare şi a fost clătit cu apă (3 L). Produsul a fost uscat pe filtru sub vid timp de 5 zile pentru a da compusul iv-a ca solid arămiu (1418 g). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 7,69 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,30 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,15 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 2,51 (s, 3H), 1,37 (t, J = 7,0 Hz, 3H).

Etapa 2. 2-(5-cloro-2-etoxi-4-fluorofenil)-2-metil-1, 3-dioxolan (v-a)

O soluţie de 1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluorofenil)etanonă (iv-a, 1481,0 g, 6836,3 mmol) a fost dizolvată în toluen (6 L). S-au adăugat 1,2-etandiol (953 mL, 17100 mmol) şi acid p-toluensulfonic monohidrat (104 g, 547 mmol) la soluţie. Amestecul de reacţie a fost încălzit la reflux la 104-110°C cu utilizarea unui aparat Dean-Stark pentru a îndepărta apa timp de 17,4 ore. Analiza HPLC a indicat că 37% din materia primă a rămas nereacţionată. Aproximativ 600 mL de distilate au fost îndepărtate şi amestecul de reacţie a fost încălzit sub reflux timp de încă 5 ore suplimentare (în total 22 ore). Analiza HPLC nu a indicat nici o reacţie suplimentară.

S-a speculat că K2CO3 rezidual în compusul de materie primă iv-a poate a oprit reacţia. Prin urmare, amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura camerei şi spălat cu acid clorhidric apos 1 N (3 x 6,66 L). După spălarea cu acid apos, stratul organic a fost transferat înapoi în vasul de reacţie. S-au adăugat 1,2-etandiol (381 mL, 6840 mmol) şi acid p-toluensulfonic monohidrat (104 g, 547 mmol) şi amestecul de reacţie a fost încălzit sub reflux timp de 16 ore. Analiza HPLC a indicat că aproximativ 20% din materia primă a rămas nereacţionată. Aproximativ 100 mL de distilate au fost îndepărtate. S-a adăugat 1,2-etandiol (380 mL, 6800 mmol) şi s-a refluxat timp de 6 ore (în total 22 ore). HPLC a indicat că 7% din materia primă a rămas nereacţionată. Aproximativ 125 mL de distilate au fost îndepărtate. Amestecul de reacţie a fost încălzit la reflux timp de 6 ore (în total 28 ore). HPLC a indicat că 5,4% din materia primă a rămas nereacţionată. Aproximativ 125 mL de distilate au fost îndepărtate. Amestecul de reacţie a fost încălzit la reflux timp de încă 7 ore suplimentare. Analiza HPLC a indicat că 3,5% din materia primă a rămas nereacţionată. Aproximativ 80 mL de distilate au fost îndepărtate. Reacţia a fost considerată completă în acest punct.

Amestecul de reacţie a fost spălat cu soluţie apoasă de hidroxid de sodiu 1 N (2 x 5,5 L). Prima spălare bazică a fost extrasă cu toluen (2,1 L). Soluţia de toluen combinată a fost spălată cu apă (7 L) şi concentrată pentru a da 2153 g de ulei de culoare închisă. Analiza HPLC a indicat puritatea produsului la 93,8% cu 1,90 % materie primă şi 0,79% de produs de-iod. Analiza 1H NMR a indicat că aproximativ 0,5 echivalent de toluen (aproximativ 256 g) au rămas în produs. Randamentul corectat al compusului v-a a fost 88,0%. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,51 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,70 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 4,17-3,92 (m, 4H), 3,91-3,80 (m, 2H), 1,75 (s, 3H), 1,46 (t, J= 7,0 Hz, 3H).

Etapa 3. 3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)benzaldehidă (vi)

Într-un cuptor-uscat, un balon de 3 L cu 4 gâturi, cu fund rotund, echipat cu un agitator la partea superioară, o pâlnie de adăugare de 500 mL, admisie de azot, perete separator, şi termocuplu a fost încărcat cu N,N-diizopropilamină (87,8 mL, 626 mmol) şi tetrahidrofuran anhidru (1090 mL, 13500 mmol). Această soluţie a fost răcită la -72°C şi încărcată cu 2,5 M n-butillitiu în hexani (261 mL, 652 mmol). Soluţia de n-butillitiu a fost adăugată peste 18 min. Temperatura maximă internă în timpul adăugării a fost -65°C. Baia de acetonă cu gheaţă uscată a fost înlocuită cu o baie de apă cu gheaţă şi amestecul de reacţie a fost încălzit de la aproximativ -5°C până la aproximativ 0°C şi menţinut timp de 15 min. Amestecul de reacţie a fost apoi răcit la -74,5°C.

Într-un balon separat de 1 L, cu fund rotund, conţinând 2-(5-cloro-2-etoxi-4-fluorofenil)-2-metil-1,3-dioxolan (v-a, 136,1 g, 522,1 mmol) s-a adăugat tetrahidrofuran anhidru (456 mL) pentru a dizolva solidele. Soluţia rezultată a fost răcită într-o baie cu gheaţă până la aproximativ 0°C. Soluţia conţinând compusul v-a a fost transferată la o soluţie LDA peste 40 minute printr-o canulă în timp ce se menţine temperatura reacţiei între -70°C şi -72,5°C. Amestecul de reacţie a devenit o suspensie galbenă şi a fost agitat timp de 37 min la -74°C. S-a încărcat N,N-dimetilformamidă (60,6 mL, 783 mmol) într-o porţie printr-o seringă şi această adăugare a produs o exotermă de la -74,5°C la -66,5°C. Reacţia a fost monitorizată prin HPLC la 90 min după adăugare. Materia primă a fost prezentă la 2,9%. Baia rece a fost îndepărtată şi amestecul de reacţie a fost încălzit la temperatura ambiantă. Amestecul de reacţie a fost eşantionat şi analizat după 3 ore şi materia primă nereacţionată a fost prezentă la 1,5%. Reacţia a fost considerată completă şi a fost stinsă prin adăugarea de apă îngheţată la soluţia de reacţie (1,4 L) şi diluată cu acetat de etil (1,5 L). Stratul apos a fost extras cu acetat de etil (1,5 L) şi straturile organice au fost combinate şi spălate cu saramură (20% g/g NaCl apos, 2 x 600 mL) şi uscate pe MgSO4 anhidru. MgSO4 a fost îndepărtat prin filtrare şi filtratul a fost concentrat la un ulei cu unele solide prezente. Acest reziduu a fost dizolvat în clorură de metilen şi încărcat pe un strat de gel de siliciu (586 g). Tamponul de siliciu a fost eluat cu 2% EtOAc/DCM (monitorizat prin TLC utilizând 100% DCM ca eluent). Fracţiunile dorite au fost colectate şi concentrate sub presiune redusă pentru a da un ulei chihlimbariu deschis. Uleiul a fost plasat sub vid înaintat pentru a da compusul vi ca solid galben (146,5g, randament 95,1%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,27 (s, 1H), 7,78 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 4,10-3,96 (m, 4H), 3,87-3,76 (m, 2H), 1,72 (s, 3H), 1,44 (t, J= 7,0 Hz, 3 H). LCMS pentru C13H15ClFO4 (M + H)+: m/z = 289,1.

Etapele 4-10. (R)-4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil)pirolidin-2-onă (xiii)

Compusul din titlu a fost preparat utilizând proceduri analoage cu cele descrise în Exemplul 1, Etapele 6-12.

Exemplul 3. clorhidrat de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d] pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă

Etapa 1. (R)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil metansulfonat (xiv)

(R)-4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((R)-1-hidroxietil)fenil)pirolidin-2-onă (xiii, 172,0 g, 570,0 mmol) (constȃnd din 147 g la 99,83%: puritate chirală 0,09%, puritate chimică 99,33%; şi 25g, 87,46%: puritate chirală 12,54%, puritate chimică 86,74%) a fost dizolvată în clorură de metilen (860 mL). S-a adăugat N,N-diizopropiletilamină (149 mL, 855 mmol) la soluţie de la aproximativ -7°C până la aproximativ 2°C. S-a adăugat clorură de metansulfonil (57,4 mL, 741 mmol) în picătură la amestecul de reacţie peste 25 min. Suspensia s-a transformat într-o soluţie clară. În momentul de reacţie de 30 min, HPLC a indicat că reacţia a fost completă. Acest amestec de reacţie conţinând compusul xiv a fost utilizat direct în reacţia următoare.

Etapa 2. (R)-4-(3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-((S)-1-hidraziniletil)fenil)pirolidin-2-onă (xv)

La 0°C, la amestecul de reacţie conţinând compusul xiv din etapa 1, s-a adăugat hidrazină (178,9 mL, 5,7 mol) într-o porţie urmată de N-metilpirolidinonă (860 mL). Amestecul de reacţie a devenit tulbure şi s-au format unele precipitate. Amestecul a fost încălzit la 40-57°C sub azot timp de 90 min. HPLC a indicat că tot mesilatul a fost consumat.

Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura camerei şi s-a adăugat o soluţie saturată de bicarbonat de sodiu (28,3 g) în apă (300 mL). Amestecul a fost agitat timp de 20 min, moment în care s-a adăugat diclorometan (300 mL). Stratul organic a fost separat şi agitat cu o soluţie de bicarbonat de sodiu (14,2 g) în apă (150 mL). Stratul apos a fost extras cu diclorometan (200 mL x 2). Straturile organice combinate au fost spălate cu saramură (80 mL), uscate pe Na2SO4 anhidru (311 g), concentrate, şi azeotropate cu toluen (250 mL) pentru a da o soluţie incoloră de N-metilpirolidinonă conţinând compusul xv care a fost utilizat direct în reacţia următoare. O mostră a fost purificată pentru analiza NMR. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ 7,88 (s, 1H), 7,66 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,42 (q, J = 6,7 Hz, 1H), 4,06-3,88 (m, 2H), 3,79-3,66 (m, 1H), 3,65-3,51 (m, 1H), 3,24 (t, J = 8,8 Hz, 1H), 2,60-2,46 (m, 1H), 2,36-2,25 (m, 1H), 1,37 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,26 (d, J = 6,8 Hz, 3H). LCMS pentru C14H19ClFN3O2 (M + H)+: m/z = 316,1.

Etapa 3. 5-amino-1-((S)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil)-3-metil-1H-pirazol-4-carbonitril (xvi)

Cu agitare, s-a adăugat (1-etoxietiliden)malononitril (101 g, 741 mmol) la soluţia N-metilpirolidinonă a compusului xv din etapa 2, în porţii şi amestecul a fost agitat la temperatura camerei sub azot. După 15 min, analiza HPLC a indicat 11% din materia primă hidrazină, compusul xv, faţă de produsul compusului xvi. S-a adăugat N,N-diizopropiletilamină (15 mL, 86 mmol) şi amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 15 ore. Analiza HPLC a indicat că 5,6% din materia primă a rămas. S-a adăugat N,N-diizopropiletilamină (5 mL, 30 mmol) şi amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 5 ore. HPLC a indicat că 5,6% din materia primă a rămas. Amestecul de reacţie a fost agitat timp de 2,5 zile şi combinat cu două loturi similare şi au fost prelucrate împreună.

Amestecrile de reacţie ale celor trei loturi ale compusului xvi au fost combinate. O soluţie de hidroxid de sodiu apoasă 0,5 M (3,8 L) a fost adăugată la 10-20°C şi agitată timp de 5 min. HPLC a indicat că toată materia primă (1-etoxietiliden)malononitril a fost consumată. S-a adăugat acetat de etil (4,0 L) şi amestecul a fost agitat timp de 15 min. Straturile au fost separate. Stratul organic a fost spălat cu hidroxid de sodiu 0,5 M în apă (2,38 L). Straturile au fost separate. Stratul apos combinat a fost extras cu acetat de etil (2 x 2 L). Straturile organice combinate au fost spălate cu 1,0 M acid clorhidric apos (3,56 L) şi pH-ul stratului apos rezultat a fost 2-3. Stratul organic a fost spălat cu saramură (5 L), uscat pe Na2SO4 anhidru, concentrat, şi uscat sub vid înaintat timp de 40 ore pentru a da compusul xvi ca solid spumos maro deschis (702,7 g). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,78 (s, 1H), 7,44 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,53 (s, 2H), 5,64 (q, J = 6,7 Hz, 1H), 3,96 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 3,34 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,59-2,50 (m, 1H), 2,29 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 1,57 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,37 (t, J = 6,9 Hz, 3H). LCMS pentru C19H22ClFN5O2 (M + H)+: m/z = 406,1.

Randamentul global al compusului xvi în trei etape (mezilare, hidrazinoliză şi formare de pirazol) a fost calculat a fi 72,8% din intrarea totală a compusului xiii. Puritatea a fost determinată prin HPLC ca fiind de aproximativ 80%. Analiza HPLC a indicat unele produse existente în stratul apos bazic, care au fost ulterior extrase cu EtOAc (2 L), spălate cu acid clorhidric apos 1,0 M şi saramură, uscate cu sulfat de sodiu anhidru, concentrate, şi uscate cu pompă de vid înaintat timp de 40 ore pentru a da compusul xvi ca ulei maro (134 g, 13,9%).

Etapa 4. (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă (xvii)

5-amino-1-((S)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil)-3-metil-1H-pirazol-4-carbonitril (xvi, 702,7 g, 1731 mmol) a fost adăugat într-un vas de reacţie cu acetat de formamidină (1802 g, 17,31 mol) şi 1,2-etandiol (3,51 L). Amestecul de reacţie a fost încălzit la 102-103°C cu agitare timp de 18 ore. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura camerei şi s-au adăugat acetat de etil (7 L) şi apă (6 L) şi amestecul bifazic a fost agitat timp de 15 min. Stratul organic a fost separat şi stratul apos a fost diluat cu apă suplimentară (4,5 L) şi acetat de etil (3 L) şi agitat timp de 10 min. Stratul organic a fost separat. Stratul apos a fost extras suplimentar cu acetat de etil (2 L). Straturile organice au fost combinate şi agitate cu apă (4,5 L). Stratul apos a fost separat şi stratul organic a fost filtrat printr-un strat de celite (aproximativ 1 kg). Stratul organic a fost extras cu acid clorhidric apos 1,0 M (7 L) prin agitarea amestecului timp de 10 min. Stratul apos a fost separat. Stratul organic maro clar a fost agitat cu acid clorhidric apos 1,0 M suplimentar (3 L) timp de 10 min. Stratul apos a fost separat. Straturile acidice apoase au fost combinate şi spălate cu toluen (500 mL). Soluţia acidică apoasă a fost răcită cu o baie de apă cu gheaţă şi s-a adăugat clorură de metilen (4 L). La 5-15°C, s-a adăugat încet o soluţie de hidroxid de sodiu (530 g) în apă (530 mL) (50% soluţie de NaOH) până la un pH al soluţiei de 11-12. S-a observat precipitatul solid. S-au adăugat suplimentar clorură de metilen (3,5 L) şi metanol (300 mL) şi amestecul a fost agitat timp de 10-15 min. Produsul solid a fost colectat prin filtrare şi uscat pe filtru sub sucţiune timp de 16 ore pentru a da compusul xvii (289,7 g) ca solid maro. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,11 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,52 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,30 (br s, 2H), 6,23 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 3,97 (p, J = 9,2 Hz, 1H), 3,90-3,73 (m, 2H), 3,57 (t, J = 9,9 Hz, 1H), 3,25 (dd, J= 9,2, 8,7 Hz, 1H), 2,48 (s, 3H), 2,60-2,50 (m, 1H), 2,36-2,20 (m, 1H), 1,69 (d, J = 7,1 Hz, 3 H), 1,39 (t, J = 6,9 Hz, 3H). LCMS pentru C20H23ClFN6O2 (M + H)+: m/z = 433,3.

Filtratul a fost transferat într-o pâlnie separatoare şi stratul organic a fost separat. Stratul apos a fost agitat cu clorură de metilen (5 L) şi metanol (200 mL). Stratul organic combinat a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru, concentrat, uscat cu pompă de vid înaintat timp de 16 ore pentru a da o cantitate suplimentară de 259,3 g ca solid maro. S-au obţinut în total 548,3 g de xvii în randament de 73,2%.

Etapa 5. (R)-4-(3-((S)-1-(4-Amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă sare clorhidrat (xviii)

O soluţie de acid clorhidric apos 1,0 M (HCl, 5,0 L, 5,0 mol) a fost adăugată la (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă (xvii, 609,8 g, 1,409 mol) la temperatura camerei. Suspensia groasă rezultată a fost apoi încălzită la 50°C pentru a da o soluţie clară. O soluţie suplimentară de 1,82 L de acid clorhidric apos 1,0 M (HCl, 1,82 L, 1,82 mol; total 6,82 L, 6,82 mol, 4,84 echiv) a fost adăugată la soluţia clară la 50°C şi soluţia a fost apoi filtrată printr-un filtru cu polişare la aproximativ 50°C. Amestecul de reacţie filtrat şi polişat a fost răcit gradual la temperatura camerei peste 2 ore înainte să fie răcit în continuare la 0-5°C. Amestecul de reacţie a fost agitat la 0-5°C timp de cel puţin 20 min pentru a iniţia precipitarea. Solidele rezultate au fost colectate prin filtrare, clătite cu o porţiune de soluţie mamă rece, urmată de acid clorhidric apos 1,0 M (HCl, 200 mL), şi uscate pe pȃlnia de filtrare la temperatura camerei sub sucţiune la greutate constantă (în aproximativ 39 ore) pentru a da sarea acidului clorhidric a compusului cu formula I: clorhidrat de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă (xviii, 348,7 g, teoretic 661,2 g, 52,7%) ca pulbere albă cristalină. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,39 (br s, 1H), 9,05 (br s, 1H), 8,50 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,59 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,28 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 3,95 (m, 1H), 3,79 (m, 2H), 3,55 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 2,59 (s, 3H), 2,55 (ddd, J = 16,8, 10,3, 2,3 Hz, 1H), 2,28 (ddd, J = 16,8, 8,6, 1,5 Hz, 1H), 1,73 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,38 (t, J = 6,9 Hz, 3H) ppm. 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 175,3, 156,4 (JCF = 249,8 Hz), 153,8 (JCF = 7,0 Hz), 152,4, 150,8, 147,3, 144,3, 131,4 (JCF = 3,5 Hz), 127,3, 126,4 (JCF = 12,6 Hz), 116,1 (JCF = 18,4 Hz), 98,0, 72,1, 49,1, 46,6, 36,0, 29,4, 21,0, 15,4, 14,6 ppm. 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ - 113,6 (d, JFH = 7,7 Hz) ppm. C20H23Cl2FN6O2 (MW 469,34); LCMS (EI) m/e 433,2 (M+ + H; exact masă of xvii: 432,15). Conţinut de apă prin KF: 3,63% din masă; Conţinut de clorură (Cl-) prin titrare: 7,56% din masă (7,56% prin teorie).

Intervalul de topire/descompunere al formei cristaline de clorhidrat de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă a fost determinat prin DSC, de la o temperatură iniţială de 30°C la o temperatură finală de 350°C utilizând o rată de încălzire de 10°C/min. Termograma DSC a dezvăluit un eveniment endotermic cu un debut la 194,37°C şi maxim la 206,55°C, aşa cum se arată în FIG 1.

Termograma TGA a prezentat o pierdere totală în greutate de 4,3% până la 210°C. Peste 210°C sarea începe să se descompună, aşa cum se arată în FIG. 2.

Un tipar reprezentativ de difracţie a energiei razelor X (XRPD) este prezentat în Fig. 3 şi Tabelul 2 prezintă maximele şi intensităţile corespunzătoare.

Tabelul 2.

2-teta Intensitate relativă 2-teta Intensitate relativă 2-teta Intensitate relativă 5,739 2,20% 25,098 2,20% 42,916 2,40% 7,133 1,20% 25,66 7,00% 43,373 0,50% 7,736 0,10% 25,895 4,00% 44,148 0,40% 10,225 2,30% 27,168 3,10% 45,29 0,30% 11,283 99,00% 27,792 8,50% 46,089 1,40% 11,303 94,10% 28,1 10,00% 47,572 0,40% 13,666 2,90% 28,464 5,50% 48,897 0,70% 14,166 0,90% 30,134 3,20% 49,647 0,50% 14,833 0,10% 31,239 13,70% 50,589 0,30% 15,364 3,80% 31,918 1,30% 51,042 0,10% 16,354 9,70% 32,827 9,50% 51,687 0,40% 17,136 0,50% 33,818 0,70% 52,624 0,40% 16,866 2,70% 34,198 2,80% 53,287 0,50% 17,435 5,50% 35,033 2,10% 54,104 0,20% 17,635 3,30% 35,423 2,10% 54,127 0,10% 18,811 5,10% 36,226 0,30% 54,159 0,20% 18,898 6,60% 36,676 0,90% 55,42 0,30% 19,603 1,50% 37,47 0,90% 56,821 0,10% 20,157 1,80% 37,951 0,50% 20,593 0,50% 38,457 1,70% 21,039 11,10% 39,055 0,20% 21,308 3,80% 39,968 0,20% 22,169 7,50% 40,184 0,30% 23,002 11,50% 40,962 0,20% 24,628 6,60% 42 1,30%

Exemplul 4. Sinteză alternativă a clorhidratului de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă

Etapa 1. (R)-4-(3-acetil-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă (xix)

(4R)-4-[3-cloro-6-etoxi-2-fluoro-5-(1-hidroxietil)fenil]pirolidin-2-onă (ca un amestec de doi diastereomeri cu configuraţie R la pirolidinonă şi configuraţii R sau S la alcool secundar) (xiii, 16,7 g, 55,3 mmol) a fost dizolvată în diclorometan (167 mL). Soluţia a fost răcită într-o baie de apă cu gheaţă şi s-a adăugat periodinană Dess-Martin (35,2 g, 83,0 mmol) în porţii mici. Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 2 ore, în care moment analiza HPLC a arătat terminarea reacţiei. O soluţie de sulfit de sodiu (28 g, 220 mmol) în apă (70 mL) a fost adăugată la amestecul de reacţie şi amestecul a fost agitat timp de 20 min. O soluţie de hidroxid de sodiu 1,0 M a fost adăugată la amestec şi agitată timp de 10 min. Straturile au fost lăsate să se decanteze şi stratul organic a fost separat şi spălat secvenţial cu soluţie apoasă de hidroxid de sodiu 1 M (66 mL) şi apă (60 mL). Stratul organic a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru. Agentul de uscare a fost îndepărtat prin filtrare şi filtratul a fost concentrat pentru a da (R)-4-[3-acetil-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil]pirolidin-2-onă ca un ulei care a fost utilizat în reacţia următoare fără purificare suplimentară.

Etapa 2. (R,E)-terţ-butil 2-(1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-(5-oxopirolidin-3-il)fenil) etiliden)hidrazincarboxilat (xx)

(R)-4-[3-acetil-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil]pirolidin-2-onă brută (compusul xix din etapa 1) a fost dizolvată în metanol (60 mL) şi la soluţie s-a adăugat t-butil carbazat (8,04 g, 60,8 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la 65°C timp de 3,5 zile, moment în care analiza HPLC a arătat terminarea reacţiei. Amestecul a fost concentrat sub presiune redusă şi reziduul a fost purificat prin cromatografie pe gel de siliciu eluând cu un amestec de 0-5% de metanol în acetat de etil pentru a da (R,E)-terţ-butil 2-(1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-(5-oxopirolidin-3-il)fenil)etilidene) hidrazincarboxilat (xx, 19,5 g, 85%). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9,83 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,36 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,07 (p, J = 9,1 Hz, 1H), 3,84-3,69 (m, 2H), 3,59 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 3,28 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,14 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,25 (t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS pentru C19H25ClFN3NaO4 (M + Na)+: m/z = 436,1.

Etapa 3. terţ-butil 2-((S)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil)hidrazincarboxilat (xxi)

(R,E)-terţ-butil 2-(1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-(5-oxopirolidin-3-il)fenil)etiliden) hidrazincarboxilat (xx, 0,5 g, 1,2 mmol) a fost dizolvat în metanol (25 mL) şi soluţia a fost barbotată cu azot gazos timp de 5 min. La soluţie s-au adăugat bis(1,5-ciclooctadien)rodiu(I)tetrafluoroborat (35 mg, 0,086 mmol) şi (R)-(-)-1-{(S)-2-[bis(4-trifluorometilfenil)fosfină]ferocenil}etil-di-t-butilfosfină (64 mg, 0,094 mmol) şi amestecul de reacţie rezultat a fost barbotat cu azot gazos timp de 30 min. Amestecul de reacţie a fost apoi agitat sub gaz de hidrogen la presiune (56 psi) timp de 2,5 zile. Amestecul de reacţie a fost concentrat sub presiune redusă şi reziduul rezultat a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu gel de siliciu eluând cu un amestec de metanol (0-10%) în acetat de etil. Fracţiunile dorite au fost concentrate pentru a da terţ-butil 2-((S)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil) hidrazincarboxilat (xxi, 428 mg, randament 85%). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,18 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,53 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,73 (s, 1H), 4,41 (br s, 1H), 3,98 (m, 1H), 3,75 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,26 (m, 1H), 2,53 (m, 1H), 2,29 (dd, J = 17,6, 8,6 Hz, 1H), 1,32 (s, 12H), 1,10 (d, J = 6,5 Hz, 1H). LCMS pentru C19H27ClFN3NaO4 (M + Na)+: m/z = 437,9. Analiza chirală HPLC a indicat că produsul a conţinut diastereomerul dorit terţ-butil-2-((S)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil)hidrazină carboxilat (xxi) la 85,6% şi diastereomerul nedorit terţ-butil-2-((R)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil)hidrazincarboxilat la 14,3%.

Etapa 4. 5-amino-1-((S)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil)-3-metil-1H-pirazol-4-carbonitril (xvi)

Se adaugă terţ-butil 2-((S)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil)hidrazincarboxilat (xxi, 130 mg, 0,31 mmol) şi acid p-toluensulfonic monohidrat (86 mg, 0,45 mmol) la etanol (3 mL) şi amestecul de reacţie a fost încălzit la 50°C timp de 20 ore. Analiza HPLC a arătat că a existat aproximativ 88 % din materia primă nereacţionată. S-a încărcat o cantitate suplimentară de acid p-toluensulfonic (86 mg, 0,45 mmol) şi amestecul de reacţie a fost încălzit la 60°C timp de 24 ore. Analiza HPLC a prezentat o deprotejare Boc completă. La acest amestec de reacţie s-a adăugat (1-etoxietilidene)malononitril (61 mg, 0,45 mmol) şi N,N-diizopropiletilamină (260 µL, 1,5 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 2 ore. HPLC a prezentat terminarea formării inelului pirazol. Soluţia apoasă de hidroxid de sodiu 1,0 M a fost adăugată la amestecul de reacţie şi s-a agitat timp de 20 min. La amestec s-a adăugat acetat de etil (20 mL) şi s-a agitat. Amestecul bifazic a fost lăsat să se decanteze. Stratul de acetat de etil a fost colectat şi stratul apos a fost extras cu acetat de etil (10 mL). S-a adăugat soluţia combinată de acetat de etil cu acid clorhidric apos 1M (5 mL) şi s-a agitat timp de 15 min. Amestecul bifazic a fost lăsat să se decanteze şi stratul organic a fost colectat şi uscat pe sulfat de sodiu anhidru. Sulfatul de sodiu a fost îndepărtat prin filtrare şi filtratul a fost concentrat pentru a da 5-amino-1-((S)-1-(5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirolidin-3-il)fenil)etil)-3-metil-1H-pirazol-4-carbonitril (xvi, 126 mg, cantitate de produs brut) şi a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.

Etapa 5. (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă (xvii)

5-Amino-1-{(1S)-1-[5-cloro-2-etoxi-4-fluoro-3-(5-oxopirolidin-3-il)fenil]etil}-3-metil-1Hpirazole-4-carbonitril (xvi, 126 mg, 0,31 mmol) a fost adăugat la acetat de formamidină (323 mg, 3,1 mmol) şi 1,2-etandiol (2 mL). Amestecul de reacţie a fost încălzit la 104-105°C cu agitare. După 18 ore, analiza HPLC a arătat că aproximativ 44% din materia primă a compusului xvi a rămas. Amestecul de reacţie a fost încălzit la 115°C timp de 24 ore. Analiza HPLC a arătat că reacţia a fost completă. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura camerei şi s-au adăugat acetat de etil (10 mL) şi apă (5 ml). Amestecul bifazic a fost agitat. Straturile au fost lăsate să se separe. Stratul organic a fost colectat şi stratul apos a fost extras cu acetat de etil (5 mL). Soluţia combinată de acetat de etil a fost spălată cu apă (5 mL), uscată pe sulfat de sodiu anhidru. Sulfatul de sodiu a fost îndepărtat prin filtrare şi filtratul a fost concentrat la un reziduu. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe gel de siliciu. Coloana a fost eluată cu un amestec de metanol (0-5%) în clorură de metilen. Fracţiunile dorite au fost combinate şi evaporate pentru a da (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă (xvii, 94 mg, randament 69,9%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,11 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,52 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,30 (br s, 2H), 6,23 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 3,97 (p, J = 9,2 Hz, 1H), 3,90-3,73 (m, 2H), 3,57 (t, J = 9,9 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 9,2, 8,7 Hz, 1H), 2,48 (s, 3H), 2,60-2,50 (m, 1H), 2,36-2,20 (m, 1H), 1,69 (d, J = 7,1 Hz, 3 H), 1,39 (t, J = 6,9 Hz, 3H). LCMS pentru C20H23ClFN6O2 (M + H)+: m/z = 433,3.

Analiza chirală HPLC a produsului a indicat că a conţinut diastereomerul dorit, (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă (xvii), la 87% şi diastereomerul nedorit (R)-4-(3-((R)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin -2-onă la 13%.

Etapa 6. clorhidrat de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d] pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă

Produsul din titlu a fost preparat în conformitate cu procedura descrisă în Exemplul 3, Etapa 5. Sarea clorhidrat rezultată se potriveşte bine cu materialul realizat prin procedeul sintetic descris în Exemplul 3, în fiecare aspect comparabil incluzând puritatea chimică, puritatea chirală, şi caracteristicile stării solide.

Exemplu A1: Test al enzimei PI3K

Trusa de testare luminiscentă a PI3-Kinazei incluzând substratul kinazei lipide, proteine detectoare I(1,3,4,5)P4, PI(3,4,5)P3 biotinilate, legate la D-mio-fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat (PtdIns(4,5)P2)D (+)-sn-1,2-di-O-octanoilgliceril, 3-O-fosfo (PIP2), este cumpărată de la Echelon Biosciences (Salt Lake City, UT). Trusa de detecţie AlfaScreen™ GST incluzând perle donator şi acceptor a fost cumpărată de la PerkinElmer Life Sciences (Waltham, MA). PI3Kδ (p110δ /p85α) este cumpărată de la Millipore (Bedford, MA). ATP, MgCl2, DTT, EDTA, HEPES şi CHAPS sunt cumpărate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Test AlfaScreen™ pentru PI3Kδ

Racţia kinazei este efectuată într-o placă REMP cu 384 de godeuri de la Thermo Fisher Scientific într-un volum final de 40 µL. Inhibitorii sunt mai întâi diluaţi serial în DMSO şi adăugaţi la godeurile plăcii înainte de adăugarea altor componente de reacţie. Concentraţia finală de DMSO în test este de 2%. Testele PI3K sunt efectuate la temperatura camerei în 50 mM HEPES, pH 7,4, 5mM MgCl2, 50 mM NaCl, 5mM DTT şi CHAPS 0,04%. Reacţiile sunt iniţiate prin adăugarea de ATP, amestecul final de reacţie constȃnd din 20 µM PIP2, 20 µM ATP. 1,2nM PI3Kδ sunt incubate timp de 20 minute. 10 µL de amestec de reacţie sunt apoi transferaţi la 5 µL 50nM I(1,3,4,5)P4 biotinilat în tampon de stingere: 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1% Tween-20, urmat de adăugarea a 10 µL perle donator şi acceptor AlfaScreen™ suspendate în tampon de stingere conţinând 25nM proteină detectoare PI(3,4,5)P3. Concentraţia finală a perlelor atȃt donator cȃt şi acceptor este de 20 mg/ml. După etanşarea plăcii, placa este incubată într-o locaţie întunecoasă la temperatura camerei timp de 2 ore. Activitatea produsului este determinată pe un cititor de microplacă Fusion-alfa (Perkin-Elmer). Determinarea IC50 este efectuată prin ajustarea curbei activităţii de control procentuale versus log din concentraţia inhibitoare utilizând software-ul GraphPad Prism 3.0.

Exemplu A2: Test al enzimei PI3K

Materiale: Substrat kinază lipidă, fosfoinozitol-4,5-bisfosfat (PIP2), sunt cumpărate de la Echelon Biosciences (Sare Lake City, UT). Izoformele PI3K α, β, δ şi γ sunt cumpărate de la Millipore (Bedford, MA). ATP, MgCl2, DTT, EDTA, MOPS şi CHAPS sunt cumpărate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Reacţiile kinază sunt efectuate într-o placă clară cu 96 de godeuri de la Thermo Fisher Scientific la un volum final de 24 µL. Inhibitorii sunt mai întâi diluaţi serial în DMSO şi adăugaţi la godeurile plăcii înainte de adăugarea altor componente de reacţie. Concentraţia finală de DMSO în test este de 0,5%. Testele PI3K sunt efectuate la temperatura camerei în 20 mM MOPS, pH 6,7, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT şi 0,03% CHAPS. Amestecul de reacţie este preparat conţinând 50 µM PIP2, kinază şi variind concentraţia de inhibitori. Reacţiile sunt iniţiate prin adăugarea de ATP conţinând 2,2 µCi [γ-33P]ATP la o concentraţie finală de 1000 µM. Concentraţia finală de izoforme PI3K α, β, δ şi γ în test a fost de 1,3, 9,4, 2,9 şi respectiv 10,8 nM. Reacţiile sunt incubate timp de 180 minute şi oprite prin adăugarea de 100 µL de fosfat de potasiu 1 M, pH 8,0, 30 mM EDTA tampon de stingere. O alicotă de 100 µL a soluţiei de reacţie este apoi transferată la o placă de fltrare PVDF de 0,45 µm Millipore MultiScreen IP cu 96 de godeuri (placa de filtrare este preudată cu 200 µL 100% etanol, apă distilată, şi fosfat de potasiu 1 M, respectiv pH 8,0). Placa de filtrare este aspirată pe un colector Millipore sub vid şi spălată cu 18 × 200 µL tampon de spălare conţinând fosfat de potasiu 1 M, pH 8,0 şi 1 mM ATP. După uscare prin aspirare şi ştergere, placa este uscată în aer într-un incubator la 37°C peste noapte. Adaptorul Packard TopCount (Millipore) este apoi ataşat la placă după adăugarea a 120 µL cocktail de scintilaţie Microscint 20 (Perkin Elmer) în fiecare godeu. După etanşarea plăcii, radioactivitatea produsului este determinată prin contorizarea scintilaţiei pe Topcount (Perkin-Elmer). Determinarea IC50 este efectuată prin ajustarea curbei activităţii de control procentuale versus log din concentraţia inhibitoare utilizând software-ul GraphPad Prism 3.0.

Sarea acidului clorhidric de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă a fost testată în testul din exemplul A2 şi s-a determinate a fi un inhibitor selectiv pentru PI3Kδ.

Sarea acidului clorhidric de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă a fost testată în testul din exemplul A2 şi s-a determinat a fi un inhibitor >100 ori mai selectiv pentru PI3Kδ faţă de fiecare din PI3Kα, PI3Kβ, şi PI3Kγ.

Exemplu A3: Test de proximitate a scintilaţiei PI3Kδ

Materiale

[γ-33P]ATP (10mCi/mL) a fost cumpărat de la Perkin-Elmer (Waltham, MA). Substraul de linază lipidă, D-mio-fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat (PtdIns(4,5)P2)D (+)-sn-1,2-di-O-octanoilgliceril, 3-O-fosfo legat (PIP2), CAS 204858-53-7, au fost cumpărate de la Echelon Biosciences (Salt Lake City, UT). PI3Kδ (p110δ /p85α) a fost cumpărat de la Millipore (Bedford, MA). ATP, MgCl2, DTT, EDTA, MOPS şi CHAPS au fost cumpărate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Perlele de scintilaţie YSi SPA din aglutinină din germeni de grȃu (WGA) au fost cumpărate de la GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ).

Reacţia kinază a fost efectuată într-o placă albă matriceală din polistiren cu 384 de godeuri de la Thermo Fisher Scientific într-un volum final de 25 µL. Inhibitorii au fost mai întȃi diluaţi serial în DMSO şi adăugaţi la godeurile plăcii înainte de adăugarea altor componente de reacţie. Concentraţia finală de DMSO în test a fost de 0,5%. Testele PI3K au fost efectuate la temperatura camerei în 20 mM MOPS, pH 6,7, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT şi CHAPS 0,03%. Reacţiile au fost iniţiate prin adăugarea de ATP, amestecul final de reacţie constȃnd din 20 µM PIP2, 20 µM ATP, 0,2 µCi [γ-33P] ATP, 4 nM PI3Kδ. Reacţiile au fost incubate timp de 210 min şi oprite prin adăugarea de 40 µL de perle SPA suspendate în tampon de stingere: 150mM fosfat de potasiu pH 8,0, 20% glicerol. 25 mM EDTA, 400 µM ATP. Concentraţia finală de perle SPA a fost de 1,0 mg/mL. După etanşarea plăcii, placa a fost agitată peste noapte la temperatura camerei şi centrifugată la 1800 rpm timp de 10 minute, radioactivitatea produsului a fost determinată prin contorizarea scintilaţiei pe Topcount (Perkin-Elmer). Determinarea IC50 a fost efectuată prin ajustarea curbei activităţii de control procentuale versus log din concentraţia inhibitoare utilizând software-ul GraphPad Prism 3.0. Compusul cu Formula I a fost găsită cu o IC50 ≤ 10 nM în testul din exemplul A3.

Exemplu B1: Test de proliferare a celulei B

Pentru a obţine celule B, PBMC uman este izolat din sângele periferic al donatorilor normali, care nu iau medicamente prin centrifugarea standard a gradientului de densitate pe Ficoll-Hypague (GE Healthcare, Piscataway, NJ) şi incubarea cu microperle anti-CD 19 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Celulele B sunt apoi purificate prin imunosortare pozitivă utilizând un autoMacs (Miltenyi Biotech) în conformitate cu instrucţiunile fabricantului.

Celulele B purificate (2Ч105/godeu/200 µL) sunt cultivate în plăci de legare ultra-scăzute cu 96 de godeuri (Corning, Corning, NY) în RPMI1640, 10% FBS şi lgM anti-uman F(ab')2 de capră (10 µg/ml) (Invitrogen, Carlsbad, CA) în prezenţa a diferite cantităţi de compuşi testaţi timp de trei zile. Se adaugă apoi [3H]-timidină (1 µCi/godeu) (PerkinElmer, Boston, MA) în PBS la culturile de celule B pentru încă 12 ore suplimentare înainte ca radioactivitatea încorporată să fie separată prin filtrare cu apă prin filtre GF/B (Packard Bioscience, Meriden, CT) şi măsurată prin contorizarea scintilaţiilor lichide cu un TopCount (Packard Biosciences).

Exemplu B2: Test de proliferare celulară Pfeiffer

Linia celulară Pfeiffer (limfom difuz cu celule B mari) este cumpărată de la ATCC (Manassas, VA) şi menţinută în mediul de cultură recomandat (RPMI şi 10% FBS). Pentru a măsura activitatea antiproliferatoare a compuşilor, celulele Pfeiffer sunt placate cu mediu de cultură (2x103 celule/godeu/pe 200 µl) în plăci cu legare ultra-scăzută cu 96 de godeuri (Corning, Corning, NY), în prezenţa sau absenţa unui interval de concentraţie al compuşilor testaţi. După 3-4 zile, se adaugă [3H]-timidină (1 µCi/godeu) (PerkinElmer, Boston, MA) în PBS la cultura celulară timp de încă 12 ore suplimentare înainte ca radioactivitatea încorporată să fie separată prin filtrare cu apă prin filtre GF/B (Packard Biosciences, Meridenj, CT) şi măsurată prin contorizarea scintilaţiilor lichide cu un TopCount (Packard Biosciences).

Exemplu B3: Test de proliferare celulară SUDHL-6

Linia celulară SUDHL-6 (limfom difuz cu celule B mari) a fost cumpărată de la ATCC (Manassas, VA) şi menţinută în mediul de cultură recomandat (RPMI şi 10% FBS). Pentru a măsura activitatea antiproliferatoare a compuşilor prin cuantificare ATP, celulele SUDHL-6 au fost placate cu mediu de cultură (5000 celule/godeu/pe 200 µl) în plăci negre clare de polistiren de cultură tisulară cu 96 de godeuri (Greiner-bio-one prin VWR, NJ) în prezenţa sau absenţa unui interval de concentraţii al compuşilor testaţi. După 3 zile, s-a adăugat agentul de cultură celulară Cell Titer-GLO Luminescent (Promega, Madison, WI) în fiecare godeu timp de 10 minute la temperatura camerei pentru a stabiliza semnalul luminiscent. Acest lucru determină numărul de celule viabile din cultură pe baza cuantificării prezenţei ATP, care semnalizează prezenţa celulelor active metabolic. Luminiscenţa a fost măsurată cu TopCount 384 (Packard Biosciences prin Perkin Elmer, Boston, MA).

Exemplu C: Test de fosforilare akt Celulele Ramos (limfocite B de la limfomul Burkitt) sunt obţinute de la ATCC (Manassas, VA) şi menţinute în RPMI1640 şi 10% FBS. Celulele (3Ч107 celule/tub/3 mL în RPMI) sunt incubate cu diferite cantităţi ale compuşilor testaţi timp de 2 ore la 37°C şi apoi stimulate cu lgM anti-uman F(ab')2 de capră (5 µg/mL) (Invitrogen) timp de 17 minute într-o baie cu apă la 37°C. Celulele stimulate sunt centrifugate la 4°C cu centrifugare şi întregile extracte celulare sunt preparate utilizând 300 µL tampon de lizare (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Lizatele rezultate sunt sonicate şi supernatanţii sunt colectaţi. Nivelul de fosforilare al akt în supernatanţi este analizat prin utilizarea truselor ELISA de sandwich-uri PathScan fosfo-Aktl (Ser473) (Cell Signaling Technology) în conformitate cu instrucţiunile fabricantului.

Claims

1. O sare care este sare a acidului clorhidric de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil)pirolidin-2-onă, care este cristalină.

2. Sarea conform revendicării 1 care este un raport stoichiometric 1:1 de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etoxi-6-fluorofenil) pirolidin-2-onă şi acid clorhidric.

3. Sarea conform revendicării 1 sau 2, caracterizată printr-o termogramă DSC având un maxim endotermic la 207 ± 3 °C.

4. Sarea conform oricăreia dintre revendicările 1-3 având o termogramă DSC aşa cum se arată mai jos :

5. Sarea conform oricăreia dintre revendicările 1-4 având o termogramă TGA aşa cum se arată mai jos:

6. Sarea conform oricăreia dintre revendicările 1-5 având:

(a) cel puţin un maxim XRPD, în termeni de 2-teta, selectat dintre 11,3° ± 0,2°, \tab16,4° ± 0,2°, 21,0° ± 0,2°, 23,0° ± 0,2°, 28,1° ± 0,2°, 31,2° ± 0,2°, şi 32,8° ± 0,2°; (b) cel puţin două maxime XRPD, în termeni de 2-teta, selectate dintre 11,3° ± \tab0,2°, 16,4° ± 0,2°, 21,0° ± 0,2°, 23,0° ± 0,2°, 28,1° ± 0,2°, 31,2° ± 0,2°, şi 32,8° \tab± 0,2°; (c) cel puţin trei maxime XRPD, în termeni de 2-teta, selectate dintre 11,3° ± \tab0,2°, 16,4° ± 0,2°, 21,0° ± 0,2°, 23,0° ± 0,2°, 28,1° ± 0,2°, 31,2° ± 0,2°, şi 32,8° \tab± 0,2°; (d) cel puţin patru maxime XRPD, în termeni de 2-teta, selectate dintre 11,3° ± \tab0,2°, 16,4° ± 0,2°, 21,0° ± 0,2°, 23,0° ± 0,2°, 28,1° ± 0,2°, 31,2° ± 0,2°, şi 32,8° \tab± 0,2°; (e) cel puţin cinci maxime XRPD, în termeni de 2-teta, selectate dintre 11,3° ± \tab0,2°, 16,4° ± 0,2°, 21,0° ± 0,2°, 23,0° ± 0,2°, 28,1° ± 0,2°, 31,2° ± 0,2°, şi 32,8° \tab± 0,2°. 7. Sarea conform oricăreia dintre revendicările 1-5 având un profil XRPD aşa cum se arată mai jos:

8. O compoziţie farmaceutică cuprinzând o sare conform oricăreia dintre revendicările 1-7 şi un purtător acceptabil farmaceutic.

9. O metodă de inhibare a activităţii unei kinaze PI3Kδ, in vitro, cuprinzând punerea în contact a kinazei cu o sare conform oricăreia dintre revendicările 1-7.

10. O sare conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 7, pentru utilizare în tratarea unei boli la un pacient, în care boala menţionată este selectată dintre purpură trombocitopenică idiopatică (ITP), anemie hemolitică autoimună, vasculită, lupus eritematos sistemic, nefrită lupică, pemfigus, anemie hemolitică autoimună (AIHA), nefropatie membranoasă, leucemie limfocitară cronică (CLL), limfom non-Hodgkin (NHL), leucemie cu celule păroase, limfom cu celule de manta, limfom Burkitt, limfom limfocitic mic, limfom folicular, limfom limfoplasmacitic, limfom al zonei marginale extranodal, limfom Hodgkin, macroglobulinemie Waldenstrom, leucemie prolimfocitară, leucemie limfoblastică acută, mielofibroză, limfom al ţesutului limfatic asociat cu mucoasa (MALT), limfom cu celule B, limfom mediastinal (timic) cu celule B mari, limfomatoidă granulomatoză, limfom al zonei marginale splenic, limfom primar cu efuziune, limfom intravascular cu celule B mari, leucemia celulei plasmatice, plasmacitom extramedular, mielom înăbuşit (mielom asimptomatic aka), gamopatie monoclonală de smenificaţie nedeterminată (MGUS) şi limfom cu celule B; sau boala este purpură trombocitopenică idiopatică (ITP) selectată dintre ITP recidivată şi ITP refractară; sau boala este vasculită selectată dintre boala Behçet, sindrom Cogan, arterită cu celule gigant, polimialgie reumatică (PMR), arterită Takayasu, boală Buerger (tromboangită obliterantă), vasculită a sistemului nervos central, boală Kawasaki, poliarterită nodoasă, sindrom Churg-Strauss, vasculită crioglobulinemică amestecată (virus esenţial sau al hepatitei C indus de (HCV)), purpură Henoch-Schonlein (HSP), vasculită de hipersensibilitate, poliangeită microscopică, granulomatoză Wegener, şi vasculită sistemică asociată cu anticorpul citoplasmatic anti-neutrofil (ANCA) (AASV); sau boala este limfom non-Hodgkin (NHL) selectat dintre NHL recidivat , NHL refractar, şi NHL folicular recurent; sau boala este limfom cu celule B, în care respectivul limfom cu celule B este limfom difuz cu celule B mari (DLBCL); sau boala este limfom cu celule B, în care respectivul limfom cu celule B este limfom difuz cu celule B mari cum ar fi celulele B activate (ABC), sau limfom difuz cu celule B mari cu celule B ale centrului germinal (GCB); sau boala este osteoartrită, restenoză, ateroscleroză, tulburări osoase, artrită, retinopatie diabetică, psoriazis, hipertrofie benignă a prostatei, inflamaţie, angiogeneză, pancreatită, boală renală, boală inflamatorie intestinală, miastenia gravis, scleroză multiplă, sau sindrom Sjögren; sau boala este artrită reumatoidă, alergie, astm, glomerulonefrită, lupus, sau inflamaţie asociată cu oricare din cele anterior menţionate; sau boala este lupus care este lupus eritematos sistemic sau nefrită lupică; sau boala este cancer la sân, cancer la prostată, cancer la colon, cancer endometrial, cancer la creier, cancer la vezică, cancer la piele, cancer la uter, cancer la ovar, cancer pulmonar, cancer pancreatic, cancer renal, cancer gastric, sau un cancer hematologic; sau boala este un cancer hematologic care este este leucemie mieloblastică acută sau leucemie mieloidă cronică; sau boala este leziune pulmonară acută (ALI) sau sindrom de detresă respiratorie la adult (ARDS).

11. Un procedeu de preparare a sării conform oricăreia dintre revendicările 1-7, cuprinzând punerea în reacţie a unui compus cu formula I:

cu acidul clorhidric pentru a forma respectiva sare.

12. Procedeul conform revendicării 11, în care respectivul acid clorhidric este acidul clorhidric apos 1 M.

13. Procedeul conform revendicării 11 sau 12, în care respectiva punere în reacţie este efectuată la o temperatură de de la 45°C până la 55°C.

14. Procedeul conform oricăreia dintre revendicările 11-13, în care procedeul cuprinde:

• adăugarea de acid clorhidric la compusul cu Formula I la temperatura camerei pentru a forma o suspensie; • încălzirea respectivei suspensii până la o temperatură de la 45°C până la 55°C pentru a forma o soluţie; şi • răcirea soluţiei până la o temperatură de la 0°C până la 5°C pentru a cristaliza respectiva sare. • 999. SDODR • • • Fig. 1 • • • • • Fig. 2 • • • • • Fig. 3