MD3191504T2 - Peptide derivate din ezrin și compozițiile farmaceutice ale acestora - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la domeniul medicinii, în special la domeniul industriei chimice şi farmaceutice şi se referă la peptidele derivate din ezrin, în particular, o peptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi cu formula generală (I) X1 EKKRRETVERE X2X3, în care fiecare X reprezintă un rest de aminoacid nepolar. Utilizarea peptidelor ca agenţi imunostimulatori şi, mai specific, pentru utilizarea în tratarea şi prevenirea infecţiilor antivirale, antibacteriene şi antifungice şi tratarea bolilor tractului gastrointestinal GI, în particular a tulburărilor ulcerative ale tractului GI. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la compoziţii farmaceutice cuprinzând peptidele. Mai mult, invenţia se referă la metode de tratare a infecţiilor şi a bolilor ulceroase ale tractului GI cuprinzând administrarea peptidelor la pacienţii care au nevoie de aceasta.

Description

[0001] Prezenta invenţie se referă la domeniul medicinii, în special la domeniul industriei chimice şi farmaceutice şi se referă la peptidele derivate din ezrin, în particular, o peptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi cu formula generală (I)

X1 EKKRRETVERE X2X3, în care fiecare X reprezintă un rest de aminoacid nepolar şi în care secvenţa de aminoacizi are 14 până la 25 de resturi în lungime. Utilizarea peptidelor ca agenţi imunostimulatori şi, mai specific, pentru utilizarea în tratarea şi prevenirea infecţiilor antivirale, antibacteriene şi antifungice şi tratarea bolilor tractului gastrointestinal GI, în particular a tulburărilor ulcerative ale tractului GI. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la compoziţii farmaceutice cuprinzând peptidele. Mai mult, invenţia se referă la metode de tratare a infecţiilor şi a bolilor ulceroase ale tractului GI cuprinzând administrarea peptidelor la pacienţii care au nevoie de aceasta.

[0002] Proteina ezrin, cunoscută şi sub numele de citovilină sau villin-2, este o proteină codificată la om de către gena EZR. Peptidele derivate din proteina ezrin, având activitate biologică, sunt bine cunoscute. Cel mai apropiat analog de peptida conform invenţiei este o tetradecapeptidă farmaceutică NH2_Thr-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-COOH, cuprinzând 14 resturi de aminoacizi, cunoscută ca peptidă HEP-1 sau o peptidă umană de ezrin (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE) şi care a fost dezvoltată pentru tratamentul infecţiei cu HIV [RDHolms, AIDS prophylactics. PCT/GB95/001285, 02.06.95, WO 95/33768] şi, în continuare, pentru tratamentul unei game largi de infecţii bacteriene, fungice şi virale.

[0003] Produsul medicinal liofilizat GEPON® (număr de autorizaţie de introducere pe piaţă: P N000015/01-010911), care cuprinde aproximativ 96% din peptida HEP-1, este utilizat pe scară largă pentru scopuri medicale în Federaţia Rusă (Kladova, O. V., Kharlamova, F.S., Shcherbakova, A. A., Legkova, T. P., Feldfix, L. I., Znamenskaya, A. A., Ovchinnikova, G. S., Uchaikin, V.F. Prima experienţă a aplicării intranazale a Hepon la copiii cu infecţii respiratorii. // Pediatrie, 2002, nr. 2, pp. 86-88), (Polyakova T.O., Magomedov, M.M., Artemyev, M.E., Surikov, E.V., Palchun, V.T. O nouă abordare în tratamentul bolilor cronice ale faringelui // Attending Doctor, 2002, No. 4, pp. 64-65), (Novokshonov, A.A., Uchaikin, V.F., Sokolova, N.V., Tikhonova, O.N., Portnykh, O.Yu. Biocenoza care protejează tratamentul infecţiilor intestinale la copii. // Jurnalul Medical din Rusia, supliment special "bolile sistemului digestiv", 2004, volumul 6, nr. 1), (Parfenov, A.I. Activatorul imunităţii locale Hepon în tratamentul complex al tulburărilor dysbiotice ale intestinului. // Gastroenterologia experimentală şi clinică, 2003, nr. 3, pp. 66-69), (Tishchenko, A.L. O nouă abordare în tratamentul candidozei urogenitale recurente. // Attending Doctor, 2002, No. 3, pp. 46-47), (Telunts, A. V. Tratamentul candidozei la sugari. // Questions of Gynecology, Obstetrics, and Perinatology, 2004, vol. 3, nr. 4, pag. 89-90), (Ataullakhanov, R.I., Holms, R.D., Katlinsky, A.V., Pichugin A.V., Papuashvili, M.N., Shishkova, N.M. Tratamentul cu Hepon imunomodulator sporeşte eficacitatea controlului imun al infecţiilor oportuniste la pacienţii infectaţi cu HIV. // Allergy, Asthma, and Clinical Immunology, 2002, nr. 10, pp. 3-11), (Cherednichenko, T.V., Uchaikin, V.F., Chaplygina, G.V., Kurbanova, G.M. Un nou tratament eficient al hepatitei virale. // Attending Doctor, 2003, nr. 3, pp. 82-83), (Gorbarets, IP, Voronkova, NV, Lopatina, TV, Ivanovskaya, VN, Braginsky, DM, Blokhina, NP, Malyshev, NA Utilizarea combinată a produsului medicamentos Hepon şi a interferonului alfa recombinant la pacienţii cu hepatită cronică C creşte eficienţa tratamentul antiviral şi reduce efectele secundare ale terapiei./Hepatology, 2003, No. 4, pp. 23-28), (Lazevnik, LB, Zvenigorodskaya, LA, Firsakova, V.Yu., Pichugin, AV, Ataullakhanov, RI Aplicarea imunomodulatorului Hepon în tratamentul leziunilor ulceroase erozive ale zonei gastroduodenale // Gastroenterologie experimentală şi clinică, 2003, nr., pp. 17-20), (Malakhova, N.S., Pichugin, A.V., Khalif, I.L., Ataullakhanov, R.I. The application of Hepon immunomodulator for the treatment of nonspecific ulcerative colitis.// Farmateka, 2005, No. 6 [101], pp. 105-108), Dudchenko, M.A., Lysenko, B.F., Chelishvili, A.L., Katlinsky, A.V., Ataullakhanov, R.R. Tratamentul complex al ulcerului trofic. // Attending Doctor 2002, No. 10, pp. 72-75), (Bardychev, M.S. Treatment of local radiation injuries with the activator of local immunity.// Russian Medical Journal, 2003, volume 11, No. 11 (183), pp. 646-647), Salamov G., R.Holms, W. Bessler, R. Ataullakhanov. Treatment of hepatitis C virus infection with human ezrin peptide one (HEP1) in HIV infected patients. // Arzneimittel-Forschung (Drug Research) 2007; 57(7): 497-504].

[0004] HEP-1 prezintă activitate biologică împotriva hepatitei C antivirale şi poate fi utilizat pentru tratamentul pacienţilor cu hepatită C [R.D.Holms, R.I.Ataullakhanov. T HCV combination therapy. PCT/GB2004/000330, 27.01.2004, WO 2004067024 A2].

[0005] HEP-1 prezintă activitate biologică antiulceraţie şi poate fi utilizat pentru tratamentul bolilor ulceroase ale tractului gastrointestinal [R.D.Holms, R.I.Ataullakhanov. Utilizarea peptidelor în terapia anti-ulcer. PCT/GB2006/004390, 23.11.2006, WO/2007/060440].

[0006] Inventatorii prezentei descrieri au dezvoltat o peptidă nouă care a fost preparată sintetic şi care are o activitate imunostimulatoare ridicată. După cum au demonstrat testele biologice, peptida conform invenţiei aşa cum s-a descris şi compoziţiile farmaceutice ale acesteia are o activitate imunostimulatoare ridicată, depăşind activitatea peptidei HEP-1, care este componenta principală a produsului medicamentos GEPON®.

[0007] Într-un prim aspect al invenţiei, este furnizată o peptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi cu formula generală (I) X1EKKRRETVEREX2X3, în care fiecare din X1, X2 şi X3 reprezintă un rest de aminoacid nepolar (SECV ID NR: 5) şi în care secvenţa de aminoacizi are lungimea de 14 până la 25 de resturi.

[0008] Resturile de aminoacid nepolar pot fi selectate independent din grupul constând din glicină, alanină, valină, leucină, metionină, izoleucină, prolină, fenilalanină şi triptofan şi/sau combinaţii ale acestora.

[0009] În unele variante de realizare, X1, X2 şi/sau X3 pot fi selectaţi independent dintre aminoacizi nepolari având grupări R mici, în special glicină, alanină şi/sau valină şi/sau combinaţii ale acestora. Astfel, în unele exemple de realizare ale invenţiei, fiecare din X1, X2 şi X3 sunt selectaţi independent din grupul constând din glicină, alanină şi valină.

[0010] În unele variante de realizare, X1, X2 şi/sau X3 pot fi toate aceeaşi aminoacizi. Într-o variantă preferată, cel puţin unul dintre X1, X2 şi X3 este glicină. Într-o realizare mai preferată, cel puţin 2 din X1, X2 şi X3 este glicină. În cel mai preferat exemplu de realizare, fiecare din X1, X2 şi X3 este glicină. Într-o formă de realizare, peptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cu formula generală (I) X1 EKKRRETVERE X2X3, în care fiecare din X1, X2 şi X3 sunt nepolari şi suplimentar în care cel puţin unul sau cel puţin doi dintre X1, X2 şi X3 reprezintă glicina. Într-o realizare preferată, peptida are secvenţa GEKKRRETVEREGG.

[0011] În prezenta descriere, codurile cu o singură literă au fost utilizate pentru a desemna diferiţii aminoacizi. Folosind codurile de trei litere şi o literă, aminoacizii pot fi menţionaţi după cum urmează: glicină (G sau Gly), alanină (A sau Ala), valină (V sau Val), leucină (L sau Leu), izoleucină (I sau Ile), prolină (P sau Pro), fenilalanină (F sau Phe), tirozină (Y sau Tyr), triptofan (W sau Trp), lizină (K sau Lys), arginină (R sau Arg) histidina (H sau His), acidul aspartic (D sau Asp), acidul glutamic (E sau Glu), asparagina (N sau Asn), glutamina (Q sau Gln), cisteina (C sau Cys), metionina (M sau Met), serina (S sau Ser) şi treonina (T sau Thr). Dacă un reziduu poate fi acid aspartic sau asparagină, pot fi utilizate simbolurile Asx sau B. Atunci când un reziduu poate fi acid glutamic sau glutamină, se pot utiliza simbolurile Glx sau Z. Referinţele la acidul aspartic includ aspartat, iar acidul glutamic include glutamat, dacă contextul nu specifică altceva.

[0012] Termenul peptidă poate include compoziţii cuprinzând secvenţele de aminoacizi descrise în conţinut. De exemplu, peptidele pot fi modificate (de exemplu la terminalele C sau N) pentru a le proteja de degradare sau pentru a creşte biodisponibilitatea şi/sau biocompatibilitatea lor, aşa cum se consideră adecvat sau necesar de către persoana de specialitate. Se observă că caracteristicile referitoare la "peptida conform invenţiei" se aplică în mod egal secvenţei de aminoacizi specificată în formulele generale.

[0013] Peptida conform invenţiei are 14 până la 25 de resturi de aminoacizi în lungime, cu condiţia ca secvenţa de aminoacizi să conţină formula generală (I) X1EKKRRETVEREX2X3, în care fiecare X reprezintă un rest de aminoacid nepolar, aşa cum este descris în conţinut.

[0014] În unele exemple de realizare, peptida are 14 până la 25 de resturi în lungime, de exemplu 14 până la 20 de resturi în lungime sau 14 până la 18 resturi în lungime şi cuprinde secvenţa de aminoacizi cu formula generală I (sau variante de realizare a acesteia definite în continuare). În unele variante de realizare, peptida are 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 sau 25 resturi în lungime şi cuprinde secvenţa de aminoacizi cu formula generală (I) (sau realizări ale acesteia definite suplimentar). În alte variante de realizare, peptida are 14 până la 25 de resturi în lungime, de exemplu 14 până la 20 de resturi în lungime sau 14 până la 18 resturi în lungime şi cuprinde secvenţa din SECV ID NR: 1 (GEKKRRETVEREGG). În unele exemple de realizare, peptida are 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 sau 25 resturi în lungime şi cuprinde secvenţa din SECV ID NR: 1 (GEKKRRETVEREGG). Într-o formă de realizare, peptida are între 14 şi 18 resturi în lungime şi cuprinde o secvenţă de aminoacizi cu formula generală (I) X1 EKKRRETVERE X2X3, în care fiecare din X1, X2 şi X3 sunt nepolari şi în continuare în care cel puţin doi dintre X1, X2 şi X3 sunt glicina. În variantele preferate, peptida conform invenţiei are cel puţin 14 aminoacizi în lungime şi cuprinde SECV ID NR: 1 (GEKKRRETVEREGG).

[0015] De preferinţă, peptida conform invenţiei are 14 reziduuri de aminoacizi în lungime. În cel mai preferat exemplu de realizare a invenţiei, peptida are secvenţa de NH2_Gly-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Gly-Gly-COOH (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG ) (denumită în continuare ca HP-V2).

[0016] Obiectivul prezentei invenţii este extinderea gama de compuşi peptidici care au activitate imunostimulatoare îmbunătăţită. Mai mult, obiectivul prezentei invenţii este prepararea unei compoziţii farmaceutice cu cea mai mare activitate imunostimulatoare şi cu o gamă largă de acţiune pe baza peptidei revendicate şi a peptidelor cunoscute Ezrin. În general, peptidele conform invenţiei au un profil imunostimulator superior şi/sau o activitate antivirală mai mare comparativ cu peptidele cuprinzând sau constând din SECV ID NR: 2. Imunostimularea şi activitatea antivirală pot fi măsurate prin orice metodă cunoscută de o persoană de specialitate. De exemplu, activitatea imunologică a peptidei poate fi evaluată în funcţie de efectul asupra sintezei citokinei mARN în celule J-96 (de exemplu: IFN-α, IL-β şi IL-6). Activitatea antivirală poate fi măsurată în funcţie de efectul citotoxic asupra virusului encefalomiocarditei (ECM) şi/sau în funcţie de IC50 pentru peptidă în inhibarea replicării virusului EMC. Alte metode vor fi evidente pentru persoana de specialitate.

[0017] Obiectivul dorit poate fi realizat cu peptida nouă propusă cuprinzând secvenţa cu formula (I) şi derivaţii acesteia aşa cum s-a discutat în conţinut, şi în mod special secvenţa SECV ID NR: 1: GEKKRRETVEREGG. Aceste peptide conform invenţiei sunt preparate sintetic şi au o activitate imunostimulatoare mare. O căutare a secvenţelor de peptide din baza de date http://research.bioinformatics.udel.edu/peptidematch/index.jsp şi o căutare a secvenţelor de proteine din baza de date http://www.uniprot.org/blast/ au confirmat noutatea peptidei (HP-V2), care conţine 14 resturi de aminoacizi (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG).

[0018] După cum au demonstrat testele biologice, peptida conform invenţiei şi compoziţiile farmaceutice ale acesteia au o activitate imunostimulatoare ridicată, depăşind activitatea peptidei HEP-1, care este componenta principală a produsului medicamentos GEPON®.

[0019] Peptida cunoscută ezrin HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE) şi două peptide mai mici: peptida HP1-5 cu formula NH2 Thr-Glu-Lys-Lys-Arg COOH (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR) definită mai jos ca HP1-5 şi peptida HP6-14 cu formula NH2_Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu COOH (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE) definită mai jos ca HP6-14 au fost utilizate pentru prepararea compoziţiilor farmaceutice cu peptida conform invenţiei. Ultimele două peptide sunt produse de clivaj ale peptidei HEP1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE) şi au secvenţe care sunt identice cu cele descrise anterior [R.D.Holms. Regulatory/unfolding peptide de ezrin. PCT/GB00/03566, 15.09.2000, WO 01/025275]. Peptida HP1-5 şi peptida HP6-14 sunt două peptide satelit, care s-au regăsit în produsul medicamentos GEPON® ca impurităţi.

[0020] În unele variante de realizare, peptida conform invenţiei poate fi combinată cu HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE), sau cu peptida HP1-5 cu formula NH2_Thr-Glu-Lys-Lys-Arg COOH (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR) definită mai jos ca HP1-5 sau cu peptida HP6-14 cu formula NH2 Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu COOH (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE) definită mai jos ca HP6-14.

[0021] Peptidele invenţiei şi combinaţiile de peptide aşa cum sunt descrise în conţinut pot fi utile în medicină, de exemplu pentru utilizare în tratamentul şi prevenirea infecţiilor virale, bacteriene şi fungice, precum şi pentru tratamentul bolilor ulceroase ale membranelor mucoase şi ale ţesuturilor moi.

[0022] Într-un al doilea aspect al invenţiei, este furnizată o peptidă conform invenţiei (cum ar fi o peptidă cu formula generală (I), în particular o peptidă cuprinzând secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1), pentru utilizare în medicină. Utilizările medicale speciale includ tratamentul sau prevenirea infecţiilor. Infecţia poate fi o infecţie virală, bacteriană sau fungică. Alte variante de realizare ale invenţiei includ tratamentul sau prevenirea ulceraţiei membranelor mucoase ale intestinului, cum ar fi ulcerul stomacului, intestinului gros, duodenului sau intestinului subţire şi tratamentul sau prevenirea bolilor inflamatorii intestinale, incluzând boli şi/sau afecţiuni legate de ulcerele stomacului, intestinului gros, duodenului sau intestinului subţire şi sindromul intestinului iritabil (IBS). Peptidele conform invenţiei sunt, de asemenea, furnizate pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea colitei ulcerative şi a bolii Crohn. În realizările preferate, peptidele conform invenţiei sunt furnizate pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea inflamaţiei şi/sau ulceraţiei intestinului inferior.

[0023] De asemenea, este furnizată o peptidă conform invenţiei (cum ar fi o peptidă cu formula generală (I), în particular o peptidă cuprinzând secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1), pentru utilizarea în stimularea unui răspuns imun la un subiect. În unele exemple de realizare a invenţiei, peptidele pot fi utilizate pentru a stimula producţia endogenă de interferon la un subiect. Peptidele pot fi, de asemenea, utilizate pentru a stimula activarea căii de semnalizare MAPK/ERK.

[0024] În unele exemple de realizare ale invenţiei, peptida conform invenţiei poate fi combinată cu HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE), sau cu peptida HP1-5 cu formula NH2 Thr-Glu-Lys-Lys-Arg COOH (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR) definită mai jos ca HP1-5 sau cu peptida HP6-14 cu formula NH2 Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu COOH (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE) definită mai jos ca HP6-14. De exemplu, o peptidă cu formula generală (I), în particular o peptidă cuprinzând secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1, poate fi combinată cu una sau mai multe din SECV ID NR: 2, 3 sau 4. Astfel de combinaţii sunt utile în aspectele medicale ale invenţiei, incluzând tratamentul sau prevenirea infecţiei. Infecţia poate fi o infecţie virală, bacteriană sau fungică. Combinaţiile de peptide sunt, de asemenea, utile în tratamentul sau prevenirea ulceraţiei membranelor mucoase ale intestinului cum ar fi ulcerul stomacului, intestinului gros, duodenului sau intestinului subţire şi tratamentul sau prevenirea bolilor inflamatorii intestinale, incluzând boli şi/sau tulburări legate de ulceraţii ale stomacului, intestinului gros, duodenului sau intestinului subţire şi sindromul intestinului iritabil (IBS). Peptidele conform invenţiei sunt, de asemenea, furnizate pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea colitei ulcerative şi a bolii Crohn. În realizările preferate, combinaţiile peptidice ale invenţiei sunt furnizate pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea inflamaţiei şi/sau ulceraţiei intestinului inferior.

[0025] Exemplele de realizare ale invenţiei se extind în continuare la metode de tratare sau prevenire a infecţiilor, ulceraţii ale stomacului, intestinului gros, duodenului sau intestinului subţire, boli şi/sau tulburări legate de ulceraţii ale stomacului, intestinului gros, duodenului sau intestinului subţire, sindromul intestinului iritabil (IBS), colită ulcerativă şi boala Crohn cuprinzând administrarea peptidei conform invenţiei (cum ar fi o peptidă cu formula generală (I), în particular o peptidă cuprinzând secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1) la un pacient care are nevoie de aceasta. Infecţia poate fi o infecţie virală, bacteriană sau fungică. Peptidele conform invenţiei sunt administrate într-o cantitate eficientă terapeutic şi pot fi administrate cu unul sau mai mulţi compuşi farmaceutic activi. În particular, peptidele conform invenţiei pot fi administrate în combinaţie cu una sau mai multe din peptidele din SECV ID NR: 2, 3 şi/sau 4.

[0026] Astfel, este furnizată de asemenea combinarea unei peptide conform invenţiei (cum ar fi o peptidă cu formula generală (I), în particular o peptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi cu SECV ID NR: 1) şi o peptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi a SECV ID NR: 2, 3 sau 4, pentru utilizare în medicină. Astfel de utilizări medicale includ tratarea sau prevenirea infecţiilor (cum ar fi infecţiile virale, bacteriene sau fungice), ulceraţia membranelor mucoase ale intestinului (cum ar fi ulcerul gastric, ulcerul intestinului gros, ulcerul duodenal şi ulcerul intestinului subţire) sau boală inflamatorie intestinală sau o boală sau tulburare asociată cu boala inflamatorie intestinală (cum ar fi IBS, colita ulcerativă sau boala Crohn). În realizările preferate, peptidele conform invenţiei sunt furnizate pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea inflamaţiei şi/sau ulceraţiei intestinului inferior. Astfel de utilizări medicale includ, de asemenea, stimularea unui răspuns imun la un subiect.

[0027] În variantele preferate, atunci când peptidele conform invenţiei sunt utilizate în combinaţie cu HEP-1, HP1-5 sau HP6-14, peptida suplimentară constă din secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 2, 3 sau 4.

[0028] Este furnizată de asemenea o metodă de stimulare a unui răspuns imun la un subiect, care cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-o peptidă conform invenţiei (cum ar fi o peptidă cu formula generală (I), în particular o peptidă cuprinzând secvenţa de aminoacizi a SECV ID Nr. 1) la un pacient care are nevoie de acesta.

[0029] Într-un al treilea aspect al invenţiei, este furnizată o compoziţie farmaceutică care cuprinde peptida conform invenţiei şi un purtător sau umplutură acceptabile farmaceutic. În unele variante de realizare a invenţiei, compoziţia farmaceutică mai poate cuprinde un compus suplimentar activ farmaceutic. În particular, compoziţia farmaceutică poate cuprinde suplimentar HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE), HP1-5 (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR) sau HP6-14 (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE).

[0030] În consecinţă, într-o realizare, invenţia furnizează o compoziţie farmaceutică cuprinzând o peptidă cu lungime între 14 şi 18 resturi, peptida cuprinzând o secvenţă de aminoacizi având secvenţa X1 EKKRRETVERE X2X3, în care fiecare din X1, X2 şi X3 sunt nepolari şi suplimentar în care cel puţin doi dintre X1, X2 şi X3 sunt glicină şi un purtător sau umplutură acceptabilă farmaceutic.

[0031] Compoziţiile farmaceutice conform invenţiei pot cuprinde alte substanţe active farmaceutic, cum ar fi substanţe antivirale, anti-bacteriene, anti-fungice, analgezice şi/sau antiinflamatoare. Compoziţia farmaceutică poate fi formulată folosind orice adjuvant convenabil şi/sau diluanţi acceptabili fiziologic.

[0032] Materialele de umplutură, purtătorii, conservanţii şi stabilizatorii, utilizaţi în mod obişnuit de către specialiştii în tehnologia de eliberare a medicamentelor, pot fi utilizaţi ca purtător sau umplutură acceptabilă pentru prepararea compoziţiilor farmaceutice furnizate. Pentru injecţii, se utilizează în mod predominant apă distilată sau soluţie salină fiziologică.

[0033] Compoziţia farmaceutică poate fi adaptată pentru administrare prin orice cale adecvată, de exemplu prin administrarea orală (incluzând bucală sau sublinguală), rectală, nazală, topică (inclusiv bucală, sublinguală sau transdermică), vaginală sau parenterală (inclusiv subcutanată, intramusculară, intradermică). Astfel de compoziţii pot fi preparate prin orice metodă cunoscută în domeniul farmaciei, de exemplu prin amestecarea ingredientului activ cu purtătorul sau excipienţii în condiţii sterile. În variante de realizare particulare, compoziţia farmaceutică conform invenţiei cuprinzând peptidele conform invenţiei este sub forma unei tablete pentru administrare orală, cum ar fi o tabletă de glucoză. În unele variante, tableta este dizolvabilă.

[0034] Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrare orală pot fi prezentate ca unităţi discrete cum ar fi capsule sau tablete; sub formă de pulberi sau granule; sub formă de soluţii, siropuri sau suspensii (în lichide apoase sau neapoase sau sub formă de spume sau expandat comestibile sau ca emulsii). În realizările preferate, compoziţia farmaceutică conform invenţiei cuprinzând peptidele conform invenţiei este sub forma unei tablete pentru administrare orală, cum ar fi o tabletă de glucoză. În unele variante de realizare, tableta este dizolvabilă.

[0035] În unele exemple de realizare ale invenţiei, peptidele sunt furnizate sub formă de pulbere sau granule liofilizate.

[0036] Excipienţii adecvaţi pentru tablete sau capsule gelatinoase tari includ lactoză, amidon de porumb sau derivaţi ai acestuia, acid stearic sau sărurile acestuia. Excipienţii adecvaţi pentru utilizare cu capsule gelatinoase moi includ, de exemplu, uleiuri vegetale, ceruri, grăsimi, polioli semi-solizi sau lichizi etc.

[0037] Pentru prepararea soluţiilor şi a siropurilor, excipienţii care pot fi utilizaţi includ, de exemplu, apă, polioli şi zaharuri. Pentru prepararea suspensiilor (de exemplu, uleiuri vegetale) pot fi utilizate uleiuri pentru a furniza suspensii ulei în apă sau apă în ulei.

[0038] Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrarea transdermică pot fi prezentate ca plasturi unităţi discrete destinate să rămână în contact intim cu epiderma receptorului pentru o perioadă prelungită de timp. De exemplu, ingredientul activ poate fi eliberat din plasture prin ionoforeză, aşa cum este descris în general în Pharmaceutical Research, 3 (6), pag. 318 (1986).

[0039] Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrarea topică pot fi formulate ca unguente, creme, suspensii, loţiuni, pulberi, soluţii, paste, geluri, spray-uri, aerosoli sau uleiuri. Pentru infecţiile oculare sau alte ţesuturi externe, de exemplu gura şi pielea, compoziţiile sunt aplicate în mod adecvat ca un unguent sau cremă topică. Când este formulat într-un unguent, ingredientul activ poate fi utilizat fie cu o bază de unguent parafinică, fie bază de unguent miscibilă cu apa. În mod alternativ, ingredientul activ poate fi formulat într-o cremă cu bază cremă ulei-în-apă sau bază de apă-în-ulei. Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrare locală la ochi includ picături pentru ochi în care ingredientul activ este dizolvat sau suspendat într-un purtător adecvat, în special un solvent apos. Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrarea locală în cavitatea bucală includ pilule, pastile şi apă de gură.

[0040] Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrarea rectală pot fi prezentate sub formă de supozitoare sau clisme.

[0041] Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrarea nazală în care purtătorul este un solid includ o pulbere grosieră având o dimensiune a particulei, de exemplu, în intervalul de la 20 până la 500 de microni. Compoziţiile adecvate în care purtătorul este un lichid, pentru administrare sub formă de spray nazal sau ca picături nazale, include soluţii apoase sau uleioase ale ingredientului activ.

[0042] Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrare prin inhalare includ prafuri sau particule fine de particule care pot fi generate prin intermediul diferitelor tipuri de aerosoli de doze sub presiune măsurate, nebulizatoare sau insuflatoare.

[0043] Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrarea vaginală pot fi prezentate ca ovule, tampoane, creme, geluri, paste, spume sau formulări de pulverizare.

[0044] Compoziţiile farmaceutice adaptate pentru administrare parenterală includ soluţie de injectare sterilă apoasă şi neapoasă care poate conţine antioxidanţi, tampoane, agenţi bacteriostatici şi substanţe dizolvate care fac formularea substanţial izotonică cu sângele destinatarului dorit; şi suspensii sterile apoase şi neapoase care pot include agenţi de suspendare şi agenţi de îngroşare. Excipienţii care pot fi utilizaţi pentru soluţii injectabile includ, de exemplu, apă, alcooli, polioli, glicerină şi uleiuri vegetale. Compoziţiile pot fi prezentate în recipiente cu doză unitară sau multidoză, de exemplu fiole şi flacoane etanşate, şi pot fi depozitate într-o stare liofilizată (liofilizată) care necesită numai adăugarea lichidului steril purtat, de exemplu apă pentru preparate injectabile, imediat înainte de utilizare. Soluţiile şi suspensiile de injecţie pentru utilizare pot fi preparate din pulberi, granule şi tablete. sterile

[0045] Compoziţiile farmaceutice pot conţine agenţi de conservare, agenţi de solubilizare, agenţi de stabilizare, agenţi de umectare, emulgatori, îndulcitori, coloranţi, odorizanţi, săruri (substanţele prezentei invenţii pot fi ele însele furnizate sub formă de sare acceptabilă farmaceutic) sau antioxidanţi. Ele pot conţine, de asemenea, agenţi terapeutici activi în plus faţă de substanţa prezentei invenţii.

[0046] Dozările compoziţiilor farmaceutice din prezenta invenţie pot varia între limite largi, în funcţie de boala sau tulburarea de tratat, vârsta şi starea persoanei care urmează să fie tratată etc. şi un medic va determina în cele din urmă dozele adecvate care urmează să fie utilizate.

[0047] Astfel de compoziţii pot fi formulate pentru medicină umană sau veterinară. Prezenta cerere trebuie interpretată ca fiind aplicată în mod egal atât oamenilor, cât şi animalelor, cu excepţia cazului în care contextul implică în mod clar altceva.

[0048] Într-o realizare, invenţia furnizează o compoziţie farmaceutică sub formă de tabletă pentru administrare orală, în particular o tabletă de glucoză, cuprinzând o peptidă cu lungime între 14 şi 18 resturi, peptida cuprinzând o secvenţă de aminoacizi având secvenţa X1 EKKRRETVERE X2X3, în care fiecare din X1, X2 şi X3 sunt nepolari şi suplimentar în care cel puţin doi dintre X1, X2 şi X3 sunt glicină şi un purtător sau umplutură acceptabilă farmaceutic. Într-o realizare mai preferată, peptida are secvenţa GEKKRRETVEREGG.

[0049] Invenţia se extinde la metodele de preparare a compoziţiilor farmaceutice adecvate, precum şi la utilizarea unei peptide conform prezentei invenţii în prepararea unui medicament pentru utilizare în medicină, pentru utilizare în oricare dintre utilizările specificate în conţinut.

[0050] Într-un alt aspect al invenţiei, este furnizată o secvenţă de acid nucleic care codifică o peptidă conform invenţiei, în particular o peptidă cu formula generală I, cum ar fi o peptidă cuprinzând secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR: 5.

[0051] Acidul nucleic poate fi ADN, cADN sau ARN cum ar fi ARNm obţinut prin clonare sau produs prin sinteză chimică. ADN-ul poate fi singur sau dublu catenar. ADN-ul cu o singură catenă poate fi catena care codifică sensul, sau poate fi catena non-codificatoare sau antisens.

[0052] Într-un alt aspect al invenţiei, este furnizat un vector care cuprinde un acid nucleic conform invenţiei. Încă într-un alt aspect al invenţiei este furnizată o celulă gazdă cuprinzând vectorul prezentei invenţii. Metodele de preparare sau de obţinere a unor astfel de acizi nucleici, vectori şi celule gazdă sunt de asemenea incluse în prezenta invenţie şi sunt cunoscute în domeniu.

[0053] Peptida din prezenta invenţie poate fi sintetizată prin chimia sintezei peptidice, de exemplu, peptida conform invenţiei poate fi sintetizată prin sinteză în fază lichidă (Combinatorial Chemistry: A Practical Approach, ed. Hicham Fenniri, Oxford University Press (2000)) folosind procedura standard sau prin sinteza în fază solidă, de exemplu, sinteza "Fmoc" sau "Bmoc" (Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach S.), ed. W. Chan &, Peter White, Oxford University Press (2000)). Când se utilizează sinteza în fază solidă, se foloseşte o fază solidă, cum ar fi răşină polistirenică sau răşină poliamidică sau răşină hibrid polistiren PEG sau răşină pe bază de PEG. În timpul sintezei se folosesc diferite grupări protectoare, de exemplu grupări de protecţie N-terminale, grupări de protecţie t-Boc sau FMOC. Mai mult, pot fi utilizate grupări benziloxicarbonil (Z) sau grupări protectoare aliloxicarbonil (Alloc) sau grupări protectoare (litografice) fotoreportabile sau tehnici de protecţie laterală. Produsele peptice sunt purificate prin separare HPLC sau prin orice altă metodă de purificare. Structura peptidică este confirmată prin analiza aminoacizilor, spectrometrie de masă şi date de cromatografie lichidă de înaltă performanţă.

[0054] În unele cazuri, fragmentele pot fi sintetizate utilizând metode în stare solidă şi apoi cuplate împreună în soluţie. Peptidele pot fi sintetizate din partea grupării carbonil la partea grupării amino a lanţului de aminoacizi în această metodă, deşi peptidele sunt sintetizate în sens invers în celule. În astfel de metode, un aminoacid amino-protejat este legat de o granulaţie a substratului (adică o granulă de răşină), formând o legătură covalentă între gruparea carbonil şi răşină. Gruparea amino este apoi de-protejată şi reacţionează cu gruparea carbonil a următorului aminoacid amino-protejat. Ciclul se repetă de câte ori este necesar pentru a forma lanţul peptidic dorit. Peptida sintetizată este apoi scindată din granulă la sfârşitul procedurii. Grupările protectoare pentru grupele amino utilizate în cea mai mare parte în această sinteză a peptidelor sunt gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil ("Fmoc") şi t-butiloxicarbonil ("Boc"). Gruparea Fmoc este îndepărtată de la capătul amino cu bază în timp ce gruparea Boc este îndepărtată cu acid.

[0055] Peptida HEP-1, peptida HP1-5 şi peptida HP6-14, utilizate în prezenta invenţie pentru prepararea compoziţiilor farmaceutice, au fost preparate prin metoda de sinteză în fază lichidă de către producătorul autorizat "Immapharma", LLC (Moscova).

[0056] Într-un alt aspect al invenţiei, este furnizată o metodă de obţinere a peptidelor conform invenţiei, în particular a peptidelor conform formulei generale 1, cum ar fi peptidele cuprinzând secvenţa de aminoacizi din SECV ID NR: 1 sau SECV ID NR: 5. Metoda poate cuprinde sinteza peptidelor prin sinteză în fază lichidă sau sinteză în fază solidă.

[0057] Într-o formă de realizare a invenţiei, este furnizată o peptidă cu lungimea de 14 aminoacizi, în care secvenţa de aminoacizi este GEKKRRETVEREGG. Peptida este utilă în medicină, în special în tratarea inflamaţiei intestinului inferior şi/sau a ulceraţiei. Peptida poate fi furnizată sub formă de tabletă pentru administrare orală, în particular o tabletă de glucoză.

[0058] Caracteristicile preferate pentru al doilea şi aspectele ulterioare ale invenţiei sunt ca pentru primul aspect mutatis mutandis.

[0059] Prezenta invenţie va fi acum descrisă prin referire la următoarele exemple care sunt prezente numai în scopul de referinţă şi nu trebuie interpretate ca limitând invenţia. În exemple, se face referire la un număr de Figuri în care:

Figura 1. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă a peptidei HEP-1. Coloana Luna C18 (2), 4,6 x 250 mm, particule de 5,0 μm. Faza mobilă: A - apă, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program de 5-25% ACN timp de 20 de minute. Debit: 1 ml/min. Axa X: timpul, axa Y: absorbţia UV (mV, linia superioară, cu vârfuri), presiunea (linia inferioară, orizontală).

Figura 2. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă a amestecului de peptidă HEP-1 şi peptida HP 1-5. Coloana Luna C18 (2), 4,6 x 250 mm, particule de 5,0 μm. Faza mobilă: A - apă, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program de 5-25% ACN timp de 20 de minute. Debit: 1 ml/min. Axa X: timpul, axa Y: absorbţia UV (mV, linia superioară, cu vârfuri), presiunea (linia inferioară, orizontală).

Figura 3. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă a amestecului de peptidă HEP-1 şi peptida HP 6-14. Coloana Luna C18 (2), 4,6 x 250 mm, particule de 5,0 μm. Faza mobilă: A - apă, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program de 5-25% ACN timp de 20 de minute. Debit: 1 ml/min. Axa X: timpul, axa Y: absorbţia UV (mV, linia superioară, cu vârfuri), presiunea (linia inferioară, orizontală).

Figura 4. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă a amestecului de peptidă HEP-1 şi peptida HP-V2. Coloana Luna C18 (2), 4,6 x 250 mm, particule de 5,0 μm. Faza mobilă: A - apă, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program de 5-25% ACN timp de 20 de minute. Debit: 1 ml/min. Axa X: timpul, axa Y: absorbţia UV (mV, linia superioară, cu vârfuri), presiunea (linia inferioară, orizontală).

Figura 5. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă a amestecului de peptidă HP-V2. Coloana Luna C18 (2), 4,6 x 250 mm, particule de 5,0 μm. Faza mobilă: A - apă, 5% ACN, 0,1% TFA; B - 0,1% TFA; program de 5-25% ACN timp de 20 de minute. Debit: 1 ml/min. Axa X: timpul, axa Y: absorbţia UV (mV, linia superioară, cu vârfuri), presiunea (linia inferioară, orizontală).

Figura 6. Spectrul MALDI TOF/TOF al amestecului de peptidă HEP-1 şi peptidă HP-V2.

EXEMPLE

[0060] Metoda de cromatografie lichidă de înaltă performanţă a fost utilizată pentru evaluarea exactă a fiecărei concentraţii de component în timpul preparării compoziţiilor farmaceutice. Rezultatele studiului au demonstrat că este imposibil să se facă distincţia între peptida HP-V2, având un număr similar de aminoacizi cu peptida HEP-1, în condiţiile cromatografiei lichide de înaltă performanţă (HPLC) şi acest fapt nu permite accesul la conţinutul cantitativ al compoziţiile bazate pe HP-V2 şi HEP-1 (Exemplul 4, Figura 1, Figura 4, Figura 5). În acest timp compoziţia cantitativă a peptidei HP-V2 revendicate şi a peptidelor satelit HP1-5 şi HP6-14 poate fi uşor calculată pe baza cromatogramelor ca o consecinţă a separării lor adecvată (Exemplele 2, 3, Fig.2, Figura 3).

[0061] Totuşi, spectrometria de masă MALDI TOF detectează în mod clar fiecare peptidă din amestecul a două peptide, cuprinzând 14 reziduuri de aminoacizi, în special în amestecul de peptidă HP-V2 (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG), care este definită ca HP-V2, şi peptida HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE), care este definită ca HEP-1 (Exemplul 5, Figura 6).

Exemplul 1. Prepararea peptidei HP-V2.

[0062] Sinteza peptidei HP-V2 s-a efectuat prin metoda fazei solide utilizând polimerul alcoxibenzil. Cuplajele au fost realizate folosind metoda bazată pe utilizarea fie: 1) tetrafluoroborat O- (benzotriazol-1-il) -N,N,N',N'-tetrametiluroniu (TBTU); sau 2) 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) şi N,N'-diizopropilcarbodiimidă (DIPC). Ataşarea resturilor secvenţiale de aminoacizi protejate Fmoc s-a realizat singură, cu excepţia cazurilor în care grupările amino nereacţionate s-au aflat pe polimerul peptidil în creştere după reacţia de cuplare. Controlul asupra conţinutului de grupare amino nereacţionată în polimerul peptidil a fost efectuat prin intermediul testului cu ninhidrină. S-a utilizat acid trifluoracetic cu adăugare de tioanisol, fenol, etanditiol, triizopropilsilan şi apă pentru separarea peptidei şi purtătorului polimeric şi pentru deblocarea finală. Structura şi omogenitatea produsului dorit au fost confirmate prin analize de aminoacizi, spectrometrie de masă şi date de cromatografie lichidă de înaltă performanţă.

[0063] Au fost propuse următoarele compoziţii farmaceutice bazate pe peptida HP-V2 furnizată (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG), precum şi pe amestecurile acestora cu următoarele peptide:

HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE);

HP1-5 (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR);

HP6-14 (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE).

Compoziţii farmaceutice:

[0064] Compoziţia farmaceutică cuprinzând o cantitate eficientă de peptidă conform secvenţei ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG şi un purtător sau umplutură acceptabilă farmaceutic - celelalte.

[0065] Compoziţia farmaceutică cuprinzând o cantitate eficientă de peptidă conform secvenţei ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG, peptida conform secvenţei ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE şi un purtător sau umplutură acceptabilă farmaceutic - celelalte.

[0066] Compoziţia farmaceutică cuprinzând o cantitate eficientă de peptidă conform secvenţei ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG, peptida conform secvenţei ID Nr. 3: TEKKR, şi un purtător sau umplutură acceptabilă farmaceutic - celelalte.

[0067] Compoziţia farmaceutică cuprinzând o cantitate eficientă de peptidă conform secvenţei ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG, peptida conform secvenţei ID Nr. 4: RETVEREKE şi un purtător sau umplutură acceptabilă farmaceutic.

[0068] Amestecurile specifice, care conţin peptide HP-V2 şi HEP-1, HP1-5, HP6-14, care au fost utilizate pentru prepararea compoziţiilor farmaceutice, sunt furnizate în Exemplul 6.

[0069] Peptida HP-V2 sau amestecurile acestora cu peptidele menţionate mai sus în cantitate de 0,01 mg până la 1000 mg se dizolvă în volum de 1 ml până la 10 ml de apă sterilă. Formele de dozare pot fi preparate pe baza soluţiei preparate şi pot fi utilizate pe cale orală, anală sau vaginală sau intranazal ca picături sau ca pulverizare pentru inhalare.

[0070] Peptida HP-V2 sau o combinaţie de peptide în cantitate de 0,01 mg până la 1000 mg sunt plasate într-o tabletă sau o capsulă sau supozitoare sau un gel sau o formulare de unguent în combinaţie cu umpluturi, purtători, conservanţi şi stabilizatori adecvaţi, care sunt utilizate de obicei de persoane calificate în tehnologia de eliberare a medicamentelor.

[0071] Peptida HP-V2 sau combinaţia de peptide din compoziţiile farmaceutice menţionate mai sus pot fi utilizate pentru prepararea formelor de dozare care pot fi utilizate oral, anală sau vaginal sau care pot fi aplicate local. Soluţia sterilă care conţine 0,01 mg până la 1000 mg de peptidă HP-V2 sau o combinaţie de peptide dizolvate în volum de 1 ml până la 10 ml de apă pentru injecţie sau orice soluţie salină fiziologică se administrează sub formă injectabilă subcutanată, intramusculară sau intravenoasă.

Exemplul 2. Separarea peptidelor HEP-1 şi HP 1-5 prin HPLC.

[0072] Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC) a fost utilizată pentru separarea peptidelor pe baza timpilor de retenţie ai acestora. Soluţiile stoc de peptide HEP-1 şi HP 1-5 au fost preparate prin solubilizarea lor în apă deionizată la o concentraţie de 1-2 mg/ml urmată de sterilizarea prin filtrare prin filtre Millipore cu dimensiunea porilor 0,2 µm. Compoziţia, conţinând 80% peptidă HEP-1 şi 20% peptidă HP 1-5, a fost preparată prin amestecarea soluţiilor stoc corespunzătoare în volume corespunzătoare.

[0073] HPLC a fost realizat pe coloană Luna C18 (2), de 4,6 x 250 mm în funcţie de mărime, umplută cu particule de 5 µm. Faza mobilă a fost preparată prin amestecarea în program a fazelor A şi B, în care A conţine apă, 5% acetonitril (ACN), 0,1% TFA şi B conţine 0,1% TFA. Gradientul programat 5 până la 25% acetonitril (ACN) a fost format în decurs de 20 de minute. Volumul probei a fost de 20 µl; debitul a fost de 1 ml/min. Picurile au fost înregistrate automat prin absorbţia UV a acestora la diferite durate de retenţie.

[0074] Figura 1 ilustrează vârful HPLC al peptidei HEP-1 cu timpul de retenţie tipic între 9 şi 1 minut. Figura 2 ilustrează separarea clară a două vârfuri, HEP-1 (RT = 9,822 min) şi HP1-5 (RT = 3,666 min), prin HPLC.

Exemplul 3. Separarea peptidelor HEP-1 şi HP6-14 prin HPLC.

[0075] Soluţiile stoc de peptide HEP-1 şi HP6-14 şi amestecuri ale acestora s-au preparat aşa cum s-a descris în Exemplul 2. Analiza peptidelor şi a amestecurilor acestora prin HPLC s-a efectuat pe coloana Luna C18 (2), 4,6 x 250 mm după mărime cu particule de 5 µm aşa cum s-a descris în exemplul 1.

[0076] În condiţiile HPLC, amestecul peptidelor HEP-1 şi HP6-14 a fost clar separat în 2 vârfuri (Fig.3), dintre care unul a avut timpul de retenţie tipic peptidei HP6-14 (RT = 9,495 min), iar cealaltă a avut timpul de retenţie, care era tipic pentru peptida HEP-1 (RT = 9,894 min).

Exemplul 4. Analiza amestecului de peptide HEP-1 şi HP-V2 prin HPLC.

[0077] S-au preparat soluţii stoc de peptide HEP-1 şi HP-V2, precum şi amestecuri ale acestora aşa cum s-a descris în exemplul 2. Analiza HPLC a peptidelor şi a amestecurilor s-a realizat pe coloana Luna C18 (2), 4,6 x 250 mm în funcţie de dimensiune, umplută cu particule de 5 µm aşa cum s-a descris în Exemplul 2.

[0078] În condiţii HPLC, amestecul de peptide HEP-1 şi HP-V2 a fost eluat din coloană ca un vârf (figura 4) cu timpul de retenţie, care a fost tipic pentru peptida HEP-1. Analiza HPLC a soluţiei peptidice HP-V2 a demonstrat (în Fig.5) că timpul de retenţie al acestei peptide a fost într-adevăr acelaşi cu timpul de retenţie al peptidei HEP-1. Aceasta înseamnă că este imposibil să se distingă peptidele HP-V2 şi HEP-1 în aceste condiţii HPLC.

Exemplul 5. Spectrometria de masă a amestecului de peptide HEP-1 şi HP-V2.

[0079] S-au preparat soluţii stoc de peptide HEP-1 şi HP-V2, precum şi amestecuri ale acestora, aşa cum s-a descris în exemplul 2. Spectrele MALDI TOF au fost reordonate pe spectrometrul de masă Bruker Ultraflex TOF/TOF folosind acid 2,5-dihidroxibenzoic ca matrice.

[0080] Spectrul de masă al amestecului de peptide HEP-1 şi HP-V2 (Figura 6) prezintă clar ambele peptide cu ionii lor moleculari 1818,0726 (MW) pentru HEP-1 şi 1630,9385 (MW) pentru HP-V2.

Introducere în Exemplele 6 - 8.

[0081] Următoarele exemple 6-8 demonstrează activitatea biologică a tuturor peptidelor utilizate şi a amestecurilor acestora. Aceste peptide induc producţia de interferon şi protejează diferite tipuri de celule umane de moarte cauzată de infecţia virusului encefalomocarditei citopatice la o doză de 100 TCID50/ml în culturile celulare in vitro.

[0082] Peptida (HP-V2) (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG), cuprinzând 14 resturi de aminoacizi şi compoziţii ale acestora cu peptida HEP-1 (secvenţa ID Nr 2: TEKKRRETVEREKE) sau cu peptida HP1-5 3: TEKKR) sau cu peptida HP6-14 (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE) au fost studiate pentru capacitatea lor de a induce răspunsul antiviral cu producerea de interferon de tip I în culturile diferitelor celule. S-a folosit metodologia convenţională de testare a activităţii antivirale (inducerea interferonului) a compuşilor din cultură in vitro, care este utilizat pe scară largă pentru screening-ul imunostimulator, medicamente antivirale şi inductori ai interferonului.

[0083] În această metodologie in vitro, s-au pretratat diferite tipuri de celule cu peptidele studiate şi apoi celulele au fost infectate cu o doză de 100 LD50 a virusului encefalomocarditei. La 24 de ore după infectare, efectul citopatic al virusului a fost evaluat pentru a evalua activitatea protectoare a compusului testat dacă acesta din urmă are capacitatea de a aduce celulele într-o stare rezistentă la virus, care este mortală pentru celule.

[0084] După cum se ştie, în marea majoritate a cazurilor, o astfel de activitate protectoare a compuşilor se bazează pe inducţia interferonilor (termenul «interferon» înseamnă compusul, care este produs de celulă şi care împiedică replicarea virusului). A fost posibil să se evalueze activitatea antivirală (inducerea interferonului) a acestor compuşi prin utilizarea unor concentraţii diferite ale peptidelor menţionate şi a compoziţiilor acestora in vitro.

[0085] Cu cât este mai mică concentraţia care protejează 50% din celule de moarte din cauza infecţiei la o doză de 100 LD50 a virusului encefalomiocarditei, cu atât este mai mare activitatea antivirală (inducerea interferonului) a compusului testat.

[0086] Peptida (HP-V2) (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG), cuprinzând 14 resturi de aminoacizi şi combinaţii ale acestora cu peptida HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE) sau cu peptida HP1-5 3: TEKKR) sau cu peptida HP6-14 (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE) au fost testate cu privire la activitatea imunostimulatoare (antivirală, inducerea interferonului).

Exemplul 6. Studiul activităţii antivirale (inducerea interferonului) a peptidelor în cultura liniei celulare de hepatom uman.

[0087] Linia celulară de hepatom uman PLC/PRF/5 (Alexander), a fost obţinută de la Research Institute of Virology denumit după Ivanovskiy (Moscova). Mediul complet pentru cultivarea celulelor a fost preparat pe bază de mediu MEM Eagle suplimentat cu 10% ser fetal de viţel (FCS), L-glutamină (300 μg/ml) şi penicilină (100 U/ml).

[0088] Următoarele peptide au fost testate:

HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE);

HP1-5 (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR);

HP6-14 (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE);

HP-V2 (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG);

Amestecuri de peptide:

[0089] MXHP1-5 + HEP-1 - amestecul de peptidă HEP-1 90% (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE) şi 10% din peptida HP1-5 (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR); MXHP6-14 + HEP-1 - amestecul de peptidă HEP-1 90% (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE) şi 10% din peptida HP6-14 (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE); MXHP-V2 + HP1-5 - amestecul de peptidă HP-V2 90% (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG) şi 10% din peptida HP1-5 (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR); MXHP-V2 + HP6-14 - amestecul de peptidă HP-V2 90% (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG) şi 10% din peptida HP6-14 (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE). MXHP-V2 + HEP-1 - amestecul de peptidă HP-V2 95% (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG) şi 5% din peptida HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE).

[0090] Peptidele au fost dizolvate în apă distilată şi apoi sterilizate prin trecerea prin filtre cu dimensiunea porilor 0,2 µm pentru a obţine soluţiile stoc de 1-2 mg/ml. În ziua 0, celulele au fost însămânţate în godeurile plăcii cu 96 de godeuri în mediu de cultură complet cu densitatea celulară de 200 mii de celule în 1 ml. În ziua 1, s-au preparat diluţii seriale ale fiecărei probe testate (24 diluţii seriale în trepte de 2) în tripleţi în godeurile plăcii cu 96 de godeuri. În ziua 3, toate culturile au fost infectate cu o doză de 100 TCID50/ ml de tulpină a virusului encefalomiocarditei "Columbia SK-Col-SK". În final, în ziua 4, efectul citopatic al virusului a fost evaluat prin utilizarea microscopului inversat Leitz în prezenţa diferitelor concentraţii ale peptidei testate sau în culturile fără peptidă (control).

[0091] Efectul antiviral al medicamentului a fost evaluat pe baza concentraţiei minime a acestuia, protejând 50% din celulele de moarte cauzată de virusul encefalomocarditei la o doză de 100 TCID50/ Ml. Titrul de interferon (U/ml) a fost calculat ca o valoare inversă la diluţia maximă a produsului medicamentos, care a protejat 50% din celulele de moarte cauzată de virusul encefalomiocarditei la o doză de 100 TCID50/ Ml.

[0092] Datele obţinute sunt prezentate în Tabelul 1. Este evident că toate peptidele testate şi combinaţiile acestora împiedică replicarea virusului encefalomocarditei în celulele hepatomului uman. Peptidele au protejat celulele hepatomului de efectul citopatic al virusului prin inducerea producţiei de interferon. Eficienţa peptidelor şi a compoziţiilor acestora a fost diferită. Cel mai înalt nivel al activităţii antivirale (inducerea interferonului) a fost înregistrat cu peptida HP-V2 şi compoziţia sa cu peptida HP1-5.

Tabelul 1. Activitate antivirală (inducerea interferonului) a peptidelor în cultura liniei celulare de hepatom uman PLC/PRF/5 (Alexander).

Compus Concentraţia maximă testată (μg/ml) Eficienţa antivirală (μg/ml) † Titrul de interferon indus (U/ml) ‡ HEP-1 100 3.0 320 HP1-5 100 1.6 640 HP6-14 100 0,78 1280 MXHP1-5 + HEP-1 200 62,5 16 MXHP6-14 + HEP-1 200 62,5 16 MXHP-V2 + HP1-5 100 0,1 10240 MXHP-V2 + HP6-14 100 3,0 320 MXHP-V2 + HEP1 100 0,78 1280 HP-V2 100 0,78 1280 Note: † Eficienţa antivirală este prezentată ca fiind concentraţia minimă a compusului, protejând 50% din celule de la moarte ca urmare a infectării cu 100 LD50 virusul encefalomiocarditei ‡ Titrul de interferon indus a fost calculat ca valoare, inversă la diluţia maximă a compusului, care a protejat 50% din celule de la moarte ca urmare a infectării a 100 LD50 virusul encefalomiocarditei.

Exemplul 7. Studiul activităţii antivirale (inducerea interferonului) a peptidelor în cultura liniei celulare de carcinom cervical uman.

[0093] HELA linia celulară de carcinom de col uterin uman a fost obţinută de la I Research Institute of Virology denumit după Ivanovskiy (Moscova). Mediul complet pentru cultivarea celulelor, peptidele şi compoziţiile acestora, precum şi metoda de evaluare a activităţii lor antivirale (inducerea interferonului) au fost aceleaşi ca şi cele descrise în exemplul 5.

[0094] Datele obţinute sunt prezentate în Tabelul 2. Este evident că toate peptidele şi compoziţiile testate împiedică dezvoltarea infecţiei cu virusul encefalomiocarditei în celulele carcinomului cervical de om. Peptidele au protejat celulele carcinomului cervical de efectul citopatic al virusului prin inducerea producţiei de interferon. Peptidele şi compoziţiile acestora au activitate diferită. Activitatea maximă antivirală (inducerea interferonului) a fost detectată când s-a utilizat peptida HP1-5 (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR) şi peptida HP 6-14 (secvenţa ID Nr. 4: RETVEREKE), precum şi combinaţiile acestora cu HP- V2.

Tabelul 2. Activitate antivirală (inducerea interferonului) a peptidelor în cultura liniei celulare de carcinom de col uterin HELA uman.

Compus Concentraţia maximă testată (μg/ml) Eficienţa antivirală (μg/ml) † Titrul de interferon indus (U/ml) ‡ HEP-1 1000 3,9 256 HP1-5 1000 0,49 2048 HP6-14 1000 0,49 2048 MXHP1-5 + HEP-1 2000 7,8 256 MXHP6-14 + HEP-1 2000 1,95 1024 MXHP-V2 + HP1-5 1000 0,97 1024 MXHP-V2 + HP6-14 1000 0,49 2048 HP-V2 1000 7,8 128 Note: † Eficienţa antivirală este prezentată ca fiind concentraţia minimă a compusului, protejând 50% din celule de la moarte ca urmare a infectării a 100 LD50 virusul encefalomiocarditei. ‡ Titrul de interferon indus a fost calculat ca valoare, inversă la diluţia maximă a compusului, care a protejat 50% din celule de la moarte ca rezultat al infectării a 100 LD50 virusul encefalomiocarditei.

Exemplul 8. Studiul activităţii antivirale (inducerea interferonului) a peptidelor în cultura liniei celulare epiteliale umane Girardi Heart.

[0095] Cultura liniei celulare epiteliale umane Girardi Heart a fost obţinută de la Research Institute of Virology denumit după Ivanovskiy (Moscova). Mediul complet pentru cultivarea celulelor, peptidele şi compoziţiile acestora, precum şi metoda de evaluare a activităţii lor antivirale (inducerea interferonului) au fost aceleaşi ca şi cele descrise în Exemplul 5.

[0096] Rezultatele obţinute sunt prezentate în Tabelul 3. Este evident din datele prezentate că toate peptidele şi compoziţiile testate împiedică dezvoltarea infecţiei cu virusul encefalomiocarditei în celulele liniei celulare epiteliale umane Girardi Heart. Peptidele testate şi compoziţiile acestora au fost foarte eficiente în inducerea producţiei de interferoni şi în protejarea liniei celulare epiteliale Girardi Heart de efectul citopatic al virusului. Activitatea maximă antivirală (inducerea interferonului) a fost detectată când s-a utilizat peptida HEP-1 (secvenţa ID Nr. 2: TEKKRRETVEREKE) cu peptida HP1-5 (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR) şi peptida HP6-14 4: RETVEREKE), precum şi combinaţia de peptidă HP-V2 (secvenţa ID Nr. 1: GEKKRRETVEREGG) cu peptida HP1-5 (secvenţa ID Nr. 3: TEKKR) şi cu peptida HEP1 : TEKKRRETVEREKE).

Tabelul 3. Activitatea antivirală (inducerea interferonului) a peptidelor din cultura liniei celulare epiteliale Girardi Heart

Compus Concentraţia maximă testată (μg/ml) Eficienţa antivirală (μg/ml) † Titrul de interferon indus (U/ml) ‡ HEP-1 1000 0,0015 655 360 HP1-5 1000 0,0015 655 360 HP6-14 1000 0,006 163 840 MXHP1-5 + HEP-1 2000 0,0005 4 194 304 MXHP6-14 + HEP-1 2000 0,0005 4 194 304 MXHP-V2 + HP1-5 1000 0,0002 5 242 880 MXHP-V2 + HP6-14 1000 0,006 163 840 MXHP-V2 + HEP1 1000 0,0008 1 310 720 HP-V2 1000 0,0015 655 360 Note: † Eficienţa antivirală este prezentată ca fiind concentraţia minimă a compusului, protejând 50% din celule de la moarte ca urmare a infectării cu 100 LD50 virusul encefalomiocarditei ‡ Titrul de interferon indus a fost calculat ca o valoare, inversă la diluţia maximă a compusului, care a protejat 50% din celule de la moarte ca rezultat al infectării a 100 LD50 virusul encefalomiocarditei

[0097] Aşa cum se arată în exemplele prezentate cu descrierea testelor biologice şi a Tabelelor, peptida HP-V2 propusă prezintă o activitate imunostimulatoare mare, care este aceeaşi (Tabelul 3) sau care este de 4 ori mai mare (Tabelul 1) când se compară cu activitatea peptidei cunoscute HEP-1. Mai mult, compoziţiile farmaceutice cu cea mai mare activitate imunostimulatoare şi cu o gamă largă de acţiune (Tabelele 1-3), care sunt de câteva ori mai mari decât cele cunoscute pentru peptida HEP-1 şi compoziţiile acestora, s-au obţinut pe baza peptidei HP-V2 revendicată şi peptidele cunoscute Ezrin.

Exemplul 9: Studiu pentru a ilustra influenţa peptidei asupra mecanismului molecular în repararea ţesuturilor şi proliferarea celulelor

[0098] Următorul studiu oferă dovezi că peptida conform invenţiei (HP-V2) este implicată în mecanismul molecular de reparare a ţesuturilor şi proliferare celulară. Este cunoscut faptul că, compuşii care influenţează mecanismul molecular al proliferării celulare, de exemplu, reglarea expresiei TGFp este asociată cu repararea intestinului (Monteleone şi colab., "Mongersen, an Oral SMAD7 Antisense Oligonucleotide, and Crohn's Disease", New England Journal of Medicine, 372: 1104-1113). În plus, Akita şi colab., " Basic Fibroblast Growth Factor in Scarless Wound Healing", Adv. Wound Care, 2013, 2 (2): 44-49 discută beneficiul şi rolul factorului de creştere a fibroblastelor de bază (bFGF) în vindecarea rănilor fără cicatrici în aplicarea clinică şi mecanismul de bază. bFGF este o glicoproteină care este utilizată pe scară largă în tratarea rănilor şi ulcerelor. bFGF este uşor de aplicat la orice tip de rană şi conduce la un rezultat mai bun în culoare, textură şi fermitate. Chen şi colab., "NGF Accelerates Cutaneous Wound Healing by Promoting the Migration of Dermal Fibroblasts via the PI3K/Akt-Rac1-JNK and ERK Pathways", BioMed Research International, volumul 2014, ID-ul 547187) a arătat că NGF a accelerat semnificativ vindecarea rănilor cutanate excizionale la şobolani, iar migrarea fibroblastelor indusă de NGF poate contribui la acest proces de vindecare. Acest lucru a arătat, de asemenea, că activarea PI3K/Akt, Rac1, JNK şi ERK au fost toate implicate în reglarea migrării fibroblastelor induse de NGF. Mai departe, Raffetto şi colab., "Mitogen-activated protein kinase pathway regulates cell proliferation in venous ulcer fibroblasts", Vasc. Surg. Endovascular., 2006, 40 (1): 59-66 a arătat că, calea MAPK ERK este importantă pentru proliferarea celulelor în fibroblastele venoase ulceroase.

[0099] Prin urmare, peptidele conform invenţiei sunt utile în prevenirea şi tratamentul inflamaţiei şi ulceraţiei intestinului inferior.

[0100] Se demonstrează că peptida GEKKRRETVEREGG (SECV ID NR: 1) induce activarea fibroblastelor care sunt principalul tip celular responsabil pentru regenerarea tisulară, precum şi vindecarea rănilor şi ulcerelor. Acest exemplu demonstrează influenţa activă directă a peptidei GEKKRRETVEREGG (SECV ID NR: 1) asupra fibroblastelor de şoarece, care dezvăluie semnătura de activare rapidă în celule la nivelul căii de semnalizare MAPK-ERK.

[0101] Peptida GEKKRRETVEREGG (SECV ID NR: 1) a fost obţinută aşa cum s-a descris în Exemplul 1, fibroblastele de şoarece BALB/c au fost achiziţionate de la American Type Culture Collection şi propagate într-un mediu complet constând din DMEM înalt de glucoză suplimentat cu ser 10% fetal de viţel, piruvat de sodiu, aminoacizi ne-esenţiali 1:50 MEM, L-glutamină 2 mM, gentamicină 10 µg/ml şi β-mercaptoetanol 50 µM. Celulele au fost crescute în plăci de cultură de 10 cm la 5% CO2 şi 37°C. Pasajele de celule au fost făcute la confluenţa de 50-60%. Pentru detaşarea celulară s-a utilizat 0,05% tripsină/EDTA urmată de centrifugare (470 x g, 15 min) în 10 ori volum de mediu de spălare conţinând 10% FCS pentru a stinge tripsina. Supernatantul a fost eliminat şi peleta celulară a fost suspendată în 10 ml de mediu complet de cultură, apoi numărul de celule a fost măsurat utilizând hemocitometru înainte ca celulele să fie utilizate pentru experimente.

[0102] Fibroblastele s-au cultivat în plăci de cultură cu 8 godeuri, s-au adăugat peptida examinată sau soluţia de citokină TGF-p1 (control pozitiv) sau un volum echivalent de mediu de cultură (control negativ) în respectivele culturi triplicate. Celulele au fost incubate în prezenţa peptidei GEKKRRETVEREGG SECV ID NR: 1 (10 µg/ml) sau TGF-p1 sau fără niciun compus efector timp de 1 sau 6 ore la 5% CO2 şi 37°C. La momentele de timp indicate, celulele au fost recoltate, spălate de două ori cu PBS şi lizate folosind tamponul de extracţie celulară în prezenţa inhibitorilor de protează timp de 30 de minute la 4°C. Extractele au fost eliminate prin centrifugare (14.000 x g, 10 min, 4°C). Concentraţia de proteină a fost măsurată utilizând reactivul pentru determinarea proteinei (Pierce, 23225). Se diluează în mod corespunzător diluţii ale extractelor (10 µg proteină pe benzi) în SDS-PAGE 8% şi apoi se transferă pe membrană PVDF (Amersham) pentru blotting imunitar. Proteinele vizate au fost detectate utilizând anticorpi specifici pentru fosfo-p44/42 MAPK (Cell Signaling, 4370) şi GAPDH (Abcam ab8245). Benzile de proteine au fost vizualizate şi apoi măsurate intensităţile lor folosind software-ul ImageJ. Datele au fost exprimate ca o valoare (pixeli pe bandă) de ERK1, ERK2 sau fosfo-ERK1 şi fosfo-ERK2 normalizată la o valoare a benzilor GAPDH respective. Valorile medii + SD au fost calculate folosind datele a trei runde independente.

[0103] Rezultatele experimentelor noastre arată că atât peptida GEKKRRETVEREGG (SECV ID NR: 1), cât şi controlul pozitiv TGF-p1 induc o activare rapidă a căii de semnalizare MAPK/ERK în fibroblaste. La o oră după inocularea acestor compuşi efector, o concentraţie de ERK1 (44 kD) şi ERK2 (42 kD) fosforilaţi a fost crescută de aproximativ 3-5 ori. Astfel, 1 oră. după activarea fibroblastelor cu peptidă GEKKRRETVEREGG (10 µg/ml) sau TGF-p1 (5 ng/ml), valorile normalizate pospho-ERK1 au fost 0,4 + 0,02 (p <0,01) şi 0,5 + (p <0,01) comparativ cu 0,1 + 0,002 în martor negativ, iar valorile fosfo-ERK2 au fost 1,3 ± 0,05 (p <0,01) şi 1,9 + 0,1 (p <0,01) în controlul negativ. Mai târziu, la 6 ore după activare, valorile posfo-ERK1 din fibroblastele activate cu peptida GEKKRRETVEREGG (SECV ID NR: 1) sau TGF-P1 au fost 0,1 + 0,006 (p> 0,1) şi respectiv 0,3 +0,02 (p <0,05), în timp ce 0,1 + 0,01 în culturile de control negative. Valorile Posfo-ERK2 la momentul de timp de 6 ore au fost 0,1 + 0,01 (p> 0,1), 0,35 + 0,02 (p <0,01) şi 0,1 + 0,007 în peptidă, TGF-p1 şi, respectiv, culturi neactivate.

[0104] Studiul de mai sus a arătat că activitatea HP-V2 seamănă cu activitatea TGFβ (controlul pozitiv) şi, prin urmare, cu potenţialul de utilizare în prevenirea şi tratamentul inflamaţiei şi ulceraţiei intestinului inferior.

Claims (14)

1. Peptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi cu formula generală (I)

X1EKKRRETVEREX2X3 (SECV ID NR: 5)

în care fiecare dintre X1, X2 şi X3 reprezintă un rest de aminoacid nepolar şi în care secvenţa de aminoacizi are lungimea de 14 până la 25 de resturi.

2. Peptidă conform revendicării 1, în care aminoacidul nepolar este independent selectat din grupul constând din glicină, alanină, valină, leucină, metionină, izoleucină, prolină, fenilalanină, triptofan şi/sau combinaţii ale acestora.

3. Peptidă conform revendicării 1 sau revendicării 2, în care X1 X2 şi/sau X3 este glicină.

4. Peptidă conform revendicării 3, în care secvenţa de aminoacizi este GEKKRRETVEREGG (SECV ID NR: 1).

5. Compoziţie farmaceutică, cuprinzând o cantitate eficientă de peptidă conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 4 şi un purtător sau umplutură acceptabilă farmaceutic.

6. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 5, care mai cuprinde o cantitate eficientă de peptidă conform SECV ID Nr. 2 (TEKKRRETVEREKE).

7. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 5, care cuprinde suplimentar o cantitate eficientă de peptidă conform SECV ID Nr. 3 (TEKKR)

8. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 5, cuprinzând suplimentar o cantitate eficientă de peptidă conform SECV ID Nr. 4 (RETVEREKE).

9. Peptidă conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 4 sau compoziţia farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările de la 5 până la 8, pentru utilizare în stimularea unui răspuns imun la un subiect.

10. Peptidă conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 4 sau compoziţia farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările de la 5 până la 8, pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea unei infecţii virale, bacteriene sau fungice.

11. Peptidă conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 4 sau compoziţia farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările de la 5 până la 8, pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea ulceraţiei membranelor mucoase ale intestinului.

12. Peptidă sau compoziţia farmaceutică pentru utilizare conform revendicării 11, în care ulceraţia membranei mucoase a intestinului este un ulcer gastric, ulcerul intestinului gros, ulcerul duodenal sau un ulcer al intestinului subţire.

13. Peptidă conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 4 sau compoziţia farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările de la 5 la 8, destinată utilizării în tratamentul sau prevenirea unei boli inflamatorii intestinale sau a unei boli sau tulburări asociate bolii inflamatorii intestinale.

14. Peptidă sau compoziţia farmaceutică pentru utilizare conform revendicării 13, în care boala sau tulburarea asociată cu boala inflamatorie intestinală este selectată din grupul constând din sindromul intestinului iritabil (IBS), colita ulcerativă şi boala Crohn.