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WO2025239337A1 - カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出抑制用医薬組成物 - Google Patents

カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出抑制用医薬組成物

Info

Publication number
WO2025239337A1
WO2025239337A1 PCT/JP2025/017292 JP2025017292W WO2025239337A1 WO 2025239337 A1 WO2025239337 A1 WO 2025239337A1 JP 2025017292 W JP2025017292 W JP 2025017292W WO 2025239337 A1 WO2025239337 A1 WO 2025239337A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pharmaceutical composition
dopamine
subject
inhibitors
release
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/017292
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
宏 一瀬
莉奈 相田
聡一郎 井手
和隆 池田
由紀 森屋
泰之 垣花
怜 原
昭徳 西
幸江 河原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of WO2025239337A1 publication Critical patent/WO2025239337A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting the release of catecholamines from catecholaminergic neurons.
  • Non-Patent Document 1 a description of dopaminergic neurons (dopamine neurons) in the mesolimbic system and the dopamine (DA) they produce are involved in this addiction.
  • D2 blockers generally suppress neuronal activity excessively, causing side effects such as decreased motivation and emotional dullness, making it difficult to select the dosage and drug when using D2 blockers to treat addiction.
  • D2 blockers may have the adverse effect of activating the biosynthesis and release of DA via presynaptic autoreceptors (Non-Patent Document 2).
  • Another method for suppressing dopamine action is to inhibit or attenuate dopamine biosynthesis.
  • Non-Patent Documents 3 to 5 It has been reported that ⁇ -methyltyrosine was administered as a therapeutic drug for chronic schizophrenia to inhibit dopamine biosynthesis.
  • drugs such as topiramate, ondansetron, and naltrexone has been found to be effective in treating alcoholism and drug addiction.
  • these drugs are known to act on opioid receptors, and DA suppression using specific drugs has not yet been available for the treatment of addiction.
  • cognitive behavioral therapy is the main treatment for addiction in Japan (Non-Patent Document 6).
  • the present invention has been made in consideration of the above circumstances, and provides the following pharmaceutical compositions and the like used to inhibit the release of catecholamines from catecholaminergic neurons.
  • a pharmaceutical composition for use in suppressing the release of catecholamines from catecholaminergic neurons in a subject comprising a tyrosine hydroxylase (TH) inhibitor.
  • TH tyrosine hydroxylase
  • the pharmaceutical composition described in [1] above which is capable of suppressing an increase in the amount of catecholamine released from the catecholaminergic neuron.
  • the catecholamine comprises one or more selected from the group consisting of dopamine, noradrenaline, and adrenaline.
  • tyrosine hydroxylase (TH) inhibitor is at least one selected from the group consisting of metyrosine, inhibitors of the synthesis of the coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4), inhibitory nucleotides for the nucleic acid sequence of TH, TH expression inhibitors, compounds that suppress the phosphorylation of TH, inhibitors of enzymes that phosphorylate TH, and inhibitors of signals that promote the phosphorylation of TH.
  • BH4 coenzyme tetrahydrobiopterin
  • the pharmaceutical composition according to [1] above which is used for the treatment of at least one disorder selected from the group consisting of schizophrenia, Tourette's syndrome, bulimia, and addiction.
  • the pharmaceutical composition according to [4] wherein the maximum amount of dopamine released due to the increase is 200% or more of the subject's normal dopamine amount.
  • the pharmaceutical composition described in [4], wherein the pharmaceutical composition is administered to the subject at a dose that does not reduce the extracellular dopamine concentration in the subject's dopaminergic neurons to 50% or less of the subject's normal extracellular dopamine concentration.
  • the pharmaceutical composition according to [1] wherein the subject is a human.
  • a tyrosine hydroxylase inhibitor used to suppress the release of catecholamines from catecholaminergic neurons in a subject comprising administering to the subject a tyrosine hydroxylase inhibitor or the pharmaceutical composition described in [1].
  • a method for treating schizophrenia, bulimia, or addiction comprising administering to a subject a tyrosine hydroxylase inhibitor or the pharmaceutical composition according to [1] above.
  • the present invention can provide pharmaceutical compositions and the like that can suppress the release of catecholamines (dopamine, etc.) from catecholaminergic neurons in a subject. More specifically, it can provide pharmaceutical compositions and the like that suppress the increase in the release of catecholamines (dopamine, etc.) (transient secretion) that occurs when certain drugs are taken, and that have few side effects.
  • the present invention can effectively treat schizophrenia, bulimia, addiction, and the like with few side effects.
  • Figure 1(1) shows the change in methamphetamine (METH)-induced spontaneous locomotor activity in tyrosine hydroxylase (Th) heterozygous mice.
  • Figure 1(2) shows a graph comparing the cumulative locomotor activity after METH administration between wild-type and TH heterozygous mice.
  • FIG. 2 shows changes in METH-induced spontaneous locomotor activity in 6-week-old female Th heterozygous mice.
  • FIG. 3 shows the time course of spontaneous locomotor activity when wild-type mice were administered with metyrosine (AMPT) and then METH.
  • FIG. 4 shows a comparison of the AUC of spontaneous locomotor activity when wild-type mice were administered AMPT followed by METH.
  • FIG. 5 shows the amount of dopamine in tissues at various locations in the brain 4 hours after administration of AMPT to wild-type mice.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of the conditioned place preference test (CPP test).
  • FIG. 7 shows the results of the conditioned place preference test (CPP test) in AMPT-administered mice.
  • FIG. 8 shows a schematic diagram of the principle of the microdialysis method.
  • FIG. 9 shows the changes in extracellular dopamine concentration caused by METH or cocaine after administration of AMPT using microdialysis.
  • the present invention provides pharmaceutical compositions and the like used to inhibit the release of catecholamines from catecholaminergic neurons in a subject.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention contain, as an active ingredient, an inhibitor of tyrosine hydroxylase (TH), an enzyme involved in the biosynthesis of catecholamines.
  • TH tyrosine hydroxylase
  • the present inventors have newly discovered that inhibiting the activity of tyrosine hydroxylase (TH), which is responsible for dopamine (DA) production, can not only suppress DA production but also the amount of DA release (exocytosis) from synaptic vesicles in DA neurons, thereby completing the present invention.
  • catecholamines refer to physiologically active amines with a catechol as the basic structure.
  • physiologically active amines include dopamine (DA), noradrenaline (NOR), and adrenaline.
  • monoamines which are neurotransmitters in the central nervous system of living organisms, include dopamine, noradrenaline, adrenaline, serotonin, and histamine.
  • preferred catecholamines include dopamine and noradrenaline, and more preferably dopamine.
  • Dopamine is involved in physiological functions such as emotion, movement, learning (short-term memory, etc.), motivation, and drug addiction. Furthermore, changes in DA metabolism may be involved in the pathophysiology of neuropsychiatric disorders such as Parkinson's disease.
  • Noradrenaline (NOR) is involved in physiological functions such as maternal behavior, mood regulation, anxiety, stress response, and pain sensation.
  • catecholaminergic neurons Neurons in which catecholamines are biosynthesized, stored, transported, and released are called catecholaminergic neurons.
  • catecholaminergic neurons preferably include dopaminergic neurons (also referred to as “dopamine neurons") and noradrenergic neurons (also referred to as “noradrenergic neurons”), with dopaminergic neurons being more preferred.
  • dopaminergic neurons in the brain include, for example, the midbrain reticular formation, substantia nigra, ventral tegmental area, and hypothalamus. More specifically, these include the nigrostriatal tract, mesencephalon-cortical tract, mesencephalon-limbic tract, and tuberoinfundibular tract. Of these, the nigrostriatal tract is considered important for the body's motor functions, and it is known that degeneration of the nigrostriatal pathway is observed in Parkinson's disease, for example.
  • Noradrenergic neurons are present in the brain and peripheral sympathetic nervous system, and more specifically, in the central nervous system, examples include the locus coeruleus-cortical tract, the reticular-hypothalamic tract, the periventricular system, and the medullo-spinal tract.
  • Dopamine is synthesized in dopaminergic neurons through a two-step enzymatic reaction.
  • Noradrenaline is synthesized in noradrenergic neurons through a three-step enzymatic reaction.
  • the starting material for the biosynthesis of both dopamine and noradrenaline is tyrosine, and in the first step of biosynthesis, the aromatic ring is hydroxylated by tyrosine hydroxylase (TH) (EC 1.14.16.2) to produce L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA).
  • L-DOPA is then decarboxylated by aromatic-L-amino acid decarboxylase (AADC) (EC 4.1.1.28) to produce dopamine.
  • AADC aromatic-L-amino acid decarboxylase
  • the produced dopamine is further converted to noradrenaline by dopamine- ⁇ -monooxygenase (EC 1.14.17.1). An outline of this process is shown below.
  • Tyrosine hydroxylase The amino acid sequences of TH, which acts at the first step of dopamine biosynthesis and noradrenaline biosynthesis, are known to be, for example, GenBank accession numbers KAI4069455.1 (528 aa), KAI4069454.1 (524 aa), KAI4069453.1 (497 aa), and KAI4069452.1 (403 aa) for humans, and GenBank accession numbers EDL18181.1 (498 aa), EDL18182.1 (478 aa) for mice. In primates such as humans, multiple tyrosine hydroxylase mRNAs are generated from a single primary transcript by alternative mRNA splicing.
  • L-DOPA synthesis by TH is normally the rate-limiting step in catecholamine biosynthesis, and inhibition of this enzyme has a significant impact on catecholamine synthesis.
  • Catecholamine biosynthesis by TH is regulated in the short term in the body by activation through phosphorylation of serine residues, followed by inhibition of enzyme activity by the final product (feedback inhibition). Long-term regulation includes regulation of TH protein levels by regulating the transcription and translation of the gene encoding TH.
  • vMAT vesicular monoamine transporter
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises an inhibitor of tyrosine hydroxylase (TH), an enzyme involved in the biosynthesis of catecholamines.
  • TH tyrosine hydroxylase
  • Thorax-specific inhibitors that can be used in the present invention include, but are not limited to, metyrosine ((2S)-2-amino-2-methyl-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid), 3-chlorotyrosine, and 3-iodotyrosine.
  • Metyrosine has the following structure and is commercially available as a medication for pheochromocytoma, a condition characterized by excessive catecholamine secretion (Ono Pharmaceutical Co., Ltd., "Demser Capsules," etc.).
  • Alternative TH inhibitors may be nucleotides (antisense nucleotides, siRNA, etc.) that can specifically inhibit TH expression.
  • nucleotides can be designed and prepared using methods known in the art based on the known nucleotide sequence information of TH; for example, see the known procedures described later in this specification.
  • tyrosine hydroxylation reaction by TH requires tetrahydrobiopterin (BH4) as a coenzyme (cofactor) (Urano et al., Vitamin, 2004, Vol. 78, No. 9, pp. 454-455 (DOI: https://doi.org/10.20632/vso.78.9_454_2)). Therefore, in the present invention, agents that can inhibit the synthesis of BH4 can also be used as TH inhibitors.
  • BH4 tetrahydrobiopterin
  • GTP cyclohydrolase I pyruvoyltetrahydropterin synthase, or sepiapterin reductase
  • sepiapterin reductase can be used to specifically inhibit these enzymes, thereby inhibiting TH and ultimately inhibiting dopamine synthesis.
  • compounds that inhibit TH phosphorylation including small molecules, peptides, and antibodies
  • inhibitors of enzymes involved in intracellular TH phosphorylation and inhibitors of signals that promote phosphorylation may also be used as TH inhibitors.
  • TH inhibitors include small molecules, peptides, and antibodies
  • dominant-negative peptides based on regions containing the TH phosphorylation site may be used as TH inhibitors. The design and production of such peptides are known in the art; for example, see the procedures described later in this specification.
  • an inhibitor specific to aromatic-L-amino acid decarboxylase can also be used together with or instead of a TH inhibitor.
  • AADC inhibitors include carbidopa, benserazide, brocresine, difluoromethyldopa, ⁇ -methyldopa, and monofluoromethyldopa.
  • Some of these AADC inhibitors are commercially available as levodopa metabolic inhibitors for Parkinson's disease (Daiichi Sankyo's "Neodopaston,” Kyowa Hakko Kirin's "EC Dopar,” etc.).
  • antisense nucleotides against nucleotide regions involved in the transcription, splicing, and translation of AADC can also be used as inhibitors of AADC expression (i.e., AADC inhibitors).
  • AADC inhibitors Such antisense nucleotides can be appropriately prepared using methods known in the art, for example, based on the promoter sequence of AADC on the genome and the pre-mRNA sequence of AADC.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a pharmaceutical composition containing only the main drug (active ingredient), or may be a pharmaceutical composition combining the main drug with other ingredients such as pharmaceutically acceptable carriers or additives.
  • the main drug (active ingredient) may be a single type, or multiple types may be combined.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the main drug (active ingredient) in an amount of, for example, 0.1% by weight or more and 99.9% by weight or less, preferably 90% by weight or less, 80% by weight or less, 70% by weight or less, 60% by weight or less, 50% by weight or less, 40% by weight or less, 30% by weight or less, 20% by weight or less, or 10% by weight or less.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited, and examples thereof include oral, parenteral (intravenous), intramuscular, oral mucosal, rectal, vaginal, transdermal, and nasal or inhalation dosage forms, with parenteral (intravenous) dosage forms being preferred.
  • the administration form of the pharmaceutical composition of the present invention is also not limited, and examples thereof include oral, parenteral (intravenous), intramuscular, oral mucosal, rectal, vaginal, transdermal, and nasal or inhalation dosage forms, with parenteral (intravenous) dosage forms being preferred.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited, and can be, for example, within the range of 1 to 5000 mg per day for an adult (e.g., body weight 60 kg), preferably 10 to 1000 mg, 10 to 800 mg, 10 to 600 mg, 10 to 500 mg, 10 to 400 mg, 10 to 300 mg, 10 to 200 mg, 10 to 100 mg, 10 to 75 mg, or 10 to 50 mg.
  • These daily doses may be administered multiple times, for example, two or more times, three or more times, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a polynucleotide encoding a dominant-negative mutant, or a polynucleotide that inhibits the expression or translation of TH or AADC
  • a polynucleotide can be designed to be combined with an appropriate expression cassette including a promoter, etc., so that it can express the desired inhibitor after being delivered into target cells.
  • Such an expression cassette can be delivered to target cells, for example, using a suitable viral vector.
  • viral vectors are suitable for the treatment of diseases because they can introduce genes into target cells with high efficiency.
  • Viral vectors that can be used in the pharmaceutical compositions of the present invention include, but are not limited to, retroviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, and herpes simplex viral vectors (Miller, A.D. et al. (1991) J. Virol. 65, 2220-2224; Miyake, S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8802-8806; Samulski, R. J. et al. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828; JP 2004-528836 A).
  • the dosage is not limited, but can be, for example, 1 to 5,000 mg, preferably 10 to 1,000 mg, and more preferably 10 to 800 mg, 10 to 600 mg, 10 to 500 mg, 10 to 400 mg, 10 to 300 mg, 10 to 200 mg, 10 to 100 mg, 10 to 75 mg, or 10 to 50 mg per day for an adult (e.g., body weight 60 kg).
  • These daily dosages may be administered multiple times, for example, two or more times, three or more times, etc.
  • pharmaceutically acceptable carriers or additives that can be used include, for example, excipients, disintegrants, disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, solubilizers, solubilizers, isotonicity agents, pH adjusters, stabilizers, etc.
  • formulations suitable for oral administration of the pharmaceutical compositions of the present invention include powders, tablets, capsules, fine granules, granules, liquids, and syrups.
  • various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, dipotassium phosphate, and glycine can be used, along with starch, preferably corn, potato, or tapioca starch, and various disintegrants such as alginic acid and certain double silicates, and granulation binders such as polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, and gum arabic.
  • Lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, and talc are often very effective for tableting.
  • Similar solid compositions can also be filled into gelatin capsules. Suitable materials for this purpose include lactose or milk sugar, as well as high-molecular-weight polyethylene glycols.
  • the active ingredients may be combined with various sweeteners, flavorings, colorings or dyes, and, if necessary, emulsifiers and/or suspending agents, and diluents such as water, ethanol, propylene glycol, glycerin, and combinations thereof may be used.
  • examples of formulations suitable for parenteral administration include injections and suppositories.
  • the active ingredient of the present invention can be dissolved in either sesame oil or peanut oil, or in aqueous propylene glycol.
  • the aqueous solution should be appropriately buffered (preferably pH 8 or higher), if necessary, and the liquid diluent should first be rendered isotonic.
  • Such a liquid diluent can be, for example, physiological saline.
  • the resulting aqueous solution is suitable for intravenous injection, while the oily solution is suitable for intraarticular, intramuscular, and subcutaneous injection.
  • the preparation of all these solutions under sterile conditions can be readily achieved using standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art.
  • the active ingredient of the present invention can also be administered topically, such as to the skin.
  • topical administration in the form of a cream, jelly, paste, or ointment is preferred, according to standard pharmaceutical practice.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can suppress the release of catecholamines from catecholaminergic neurons induced, for example, by the ingestion of sleeping pills, anxiolytics, and analgesics, as well as by drinking alcohol, smoking, gambling, gaming, and specific addictions (various behaviors that increase catecholamine levels in the body, etc.), and preferably can suppress increases in the amount of catecholamine release.
  • Each of the above addictions is thought to involve the release of large amounts of neurotransmitters such as dopamine, norepinephrine, and serotonin.
  • neurotransmitters such as dopamine, norepinephrine, and serotonin.
  • nicotine taken into the body binds to nicotinic acetylcholine receptors in the brain, resulting in the release of large amounts of dopamine from the nucleus accumbens, which produces a strong sense of pleasure (from the Ministry of Health, Labor and Welfare's health information site for preventing lifestyle-related diseases, "Nicotine Addiction").
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of, but is not limited to, schizophrenia, Tourette's syndrome, binge eating disorder, or addictions (alcoholism, shopping addiction, drug addiction, gambling addiction, gaming addiction).
  • addictions alcoholism, shopping addiction, drug addiction, gambling addiction, gaming addiction.
  • the dopamine hypothesis has been proposed, which suggests that dopamine is involved in each of the above-mentioned symptoms. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used to treat diseases and symptoms caused by transient massive release of dopamine and other substances.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can suppress the release of catecholamines from catecholaminergic neurons, such as those induced by the ingestion of amphetamine, methamphetamine, opioids, morphine, marijuana, heroin, caffeine, or nicotine, or various low-molecular-weight compounds, and preferably can suppress increases in the release of such catecholamines.
  • inhibition of the release of catecholamines e.g., dopamine and/or noradrenaline
  • catecholamines e.g., dopamine and/or noradrenaline
  • inhibition of catecholamine release in the present invention does not mean inhibition of catecholamine release from the neuron, which may occur due to a decrease in the amount of catecholamine biosynthesis.
  • an increase in the release of catecholamines (e.g., dopamine and/or noradrenaline) from catecholaminergic neurons refers to the maximum release of catecholamines from synaptic vesicles of the neurons during excitation due to the aforementioned drug or addiction, which is, for example, 200% or more, 250% or more, 300% or more, 350% or more, 400% or more, 450% or more, or 500% or more of the normal catecholamine levels in the subject.
  • Quantitative measurement of catecholamine release can be performed using various methods known to those skilled in the art. For example, the method for measuring extracellular catecholamine concentrations (described below) used in the Examples below in this specification can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has the effect of suppressing the maximum amount of transient increase in extracellular catecholamine concentration in a subject to preferably 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, or 5% or less, compared to the maximum amount in a control individual, condition, etc. (control).
  • the duration of this transient rise may range from a momentary rise to a sustained rise for several hours.
  • Preferred examples of the duration of this transient rise are 10 seconds or more, 15 seconds or more, 20 seconds or more, 30 seconds or more, 1 minute or more, 2 minutes or more, 3 minutes or more, 4 minutes or more, 5 minutes or more, 6 minutes or more, 7 minutes or more, 8 minutes or more, 9 minutes or more, 10 minutes or more, 15 minutes or more, and may be 30 minutes or less, 35 minutes or less, 40 minutes or less, 45 minutes or less, 50 minutes or less, 55 minutes or less, 1 hour or less, 2 hours or less, 3 hours or less, 4 hours or less, 5 hours or less, 6 hours or less, 8 hours or less, 10 hours or less, 12 hours or less, 18 hours or less, 24 hours or less, etc., but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered to a subject at a dose that does not reduce the extracellular catecholamine concentration in the subject's catecholaminergic neurons to 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, or 50% or less of the subject's normal extracellular catecholamine concentration.
  • extracellular catecholamine concentration in catecholaminergic neurons refers to the extracellular concentration (preferably in the tissue of the brain region and outside the neurons) measured in the brain region containing catecholaminergic neurons in the subject (e.g., midbrain, striatum, nucleus accumbens, substantia nigra, ventral tegmental area, hypothalamus, cerebral cortex, hippocampus, amygdala, etc.) according to the measurement procedures used in the Examples below. Measurement times can be measured in minutes, seconds, milliseconds, or microseconds.
  • the subject is not limited to, and may include various mammals, with humans being preferred.
  • Dopamine (DA) can be rapidly decomposed in bodily fluids such as blood, cerebrospinal fluid, and lymph, and highly sensitive measurement using minute sample volumes may be required.
  • the amount and concentration of DA can be measured using techniques such as ELISA (such as Funakoshi's "Dopamine ELISA Kit"), HPLC, and mass spectrometry.
  • the means for measuring the amount of dopamine released in measuring the effects of the pharmaceutical composition of the present invention can be a method known to those skilled in the art, such as the microdialysis method described in the Examples below.
  • the microdialysis method allows for continuous, time-dependent changes in biological substances in tissues to be examined while simultaneously observing the behavior of freely moving animals.
  • This microdialysis method can be used to measure diurnal changes in monoamines (NE: norepinephrine, DA: dopamine, 5-HT: serotonin).
  • a similar substance such as DA
  • PET positron emission tomography
  • C-11 raclopride C-11 NMSP
  • C-11 ⁇ -CFT C-11 ⁇ -CFT
  • F-18 FP-DTPZ F-18 FDOPA
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for the treatment of, but is not limited to, schizophrenia, Tourette's syndrome, binge eating disorder, or addictions (alcoholism, shopping addiction, drug addiction, gambling addiction, gaming addiction).
  • addictions can be assessed using methods known to those skilled in the art. Examples include, but are not limited to, the conditioned place preference test (CPP method) using mice, as used in the examples described later in this specification, and the intracerebral self-stimulation test (Gardner EL, Am J Addict, 2000).
  • the present invention is not limited to the inventions relating to the pharmaceutical compositions described above, and may include, for example, a tyrosine hydroxylase inhibitor used to inhibit the release of catecholamines from catecholaminergic neurons in a subject; Use of a tyrosine hydroxylase inhibitor to inhibit the release of catecholamines from catecholaminergic neurons in a subject; Use of a tyrosine hydroxylase inhibitor in the manufacture of a medicament for inhibiting the release of catecholamines from catecholaminergic neurons in a subject; a method for suppressing the release of catecholamines from catecholaminergic neurons in a subject, the method comprising administering to the subject a tyrosine hydroxylase inhibitor or the pharmaceutical composition of the present invention; a method for treating schizophrenia, bulimia, or addiction, which comprises administering to a subject a tyrosine hydroxylase inhibitor or the pharmaceutical composition of the present invention; Other inventions may also be provided, such as a tyrosine hydroxylase inhibitor
  • Th heterozygous mice were used in this experiment. Th heterozygous mice lack one of the two Th genes in their genome. Western blotting of the striatum brain tissue confirmed that this deficiency reduced the amount of Th protein to approximately half that of the wild-type mice (data not shown).
  • Methamphetamine-induced changes in spontaneous locomotion in Th heterozygous mice Methamphetamine (METH) inhibits dopamine storage in the endoplasmic reticulum, increasing the dopamine concentration in the cytoplasm of presynaptic cells. At the same time, it reverses the dopamine transporter, releasing amines such as dopamine, noradrenaline, and serotonin from nerve terminals, ultimately resulting in neuroexcitation.
  • mice In Th heterozygous mice and wild-type mice (9-week-old male mice), changes in METH-induced spontaneous locomotor activity were examined when METH was administered at gradually increasing doses from 0 (saline only), 1.0, 2.0, and 3.0 mg/kg.
  • Mice were individually placed in a cylindrical container with a diameter of 30 cm, and spontaneous locomotor activity was measured every 5 minutes using an infrared sensor (Supermex, Muromachi Kikai). To allow the mice to become accustomed to the container, METH was administered intraperitoneally 120 minutes after the mice were placed in the container, and the METH-induced increase in spontaneous locomotor activity was measured (Figure 1).
  • AMPT was administered intraperitoneally at 10 mg/kg or 20 mg/kg, and methylcellulose used as a vehicle as a control (CNTL).
  • CNTL methylcellulose used as a vehicle as a control
  • 3.0 mg/kg METH was administered intraperitoneally to examine changes in METH-induced spontaneous locomotor activity.
  • the increase in locomotor activity began immediately after METH administration and continued until 40 minutes after administration, but in AMPT-administered mice, the increase in METH-induced locomotor activity was significantly suppressed, with the 20 mg/kg AMPT group experiencing greater suppression than the 10 mg/kg AMPT group ( Figure 3).
  • the dependence-forming potential of METH in AMPT-treated mice was evaluated using the conditioned place preference test (CPP).
  • CPP conditioned place preference test
  • a schematic diagram of the experiment is shown in Figure 6.
  • the evaluation criterion was the CPP score, calculated by subtracting the time spent in the METH-conditioned chamber during the pretest from the time spent in the METH-conditioned chamber during the posttest.
  • Nine-week-old male wild-type mice were used in the experiment.
  • the CPP apparatus was divided into a black room with a metal grid on the floor and a white room with a wire mesh on the floor.
  • mice were able to move between the two rooms via a T-shaped partition with two openings.
  • a rectangular partition with no openings was used to prevent the mice from moving between rooms. The number of times the mice moved between the rooms and the time spent in each room were measured using an infrared detector (Neuroscience).
  • mice are placed in the apparatus from the white room and the number of times they move between rooms and the time spent in each room are measured over a 900-second period. Then, on day 3, as on days 1 and 2, the mice are placed in the apparatus for 15 minutes as a pre-test, and the number of times they move between rooms and the time spent in each room are measured. At this point, the mice are divided into four groups and conditioned. The mice are alternately placed in black and white rooms, with no access to each room, each day.
  • Groups A and B are placed in the black room on days 4 and 6 and the white room on days 5 and 7, while groups C and D are placed in the white room on days 4 and 6 and the black room on days 5 and 7.
  • Groups A and D are administered METH (3 mg/kg) when in the white room, while groups B and C are administered METH when in the black room and are confined to their respective rooms for 45 minutes.
  • the mice were placed in the apparatus for 15 minutes under the same conditions as in the pre-test, and the number of times they moved between the rooms and the time spent in each room were measured to assess which room they had developed a preference for.
  • Microdialysis is a technique for collecting extracellular substances at specific sites in living mice. A probe consisting of a semipermeable membrane is inserted into the head of the mouse, and Ringer's solution is perfused into the probe at a flow rate of 2.0 ⁇ l/min. Brain substances are then collected into the perfusion solution according to their concentration gradient (Figure 8). This technique allows for long-term, continuous monitoring of changes in extracellular substances in unanesthetized, unrestrained mice.
  • the amount of dopamine in the perfusate collected at regular intervals was measured using HPLC electrochemical detection. Specifically, samples collected from the living body were separated using a high-performance liquid chromatography (HPLC) reverse-phase column (150 ⁇ 4.6 mm) and detected using an electrochemical detector (first cell, +180 mV; second cell, -180 mV).
  • the mobile phase consisted of 4.1 g/L sodium acetate adjusted to pH 4.1, 100 mg/L Na 2 EDTA, 100 mg/L octanesulfonic acid, and 20% methanol, perfused at 0.38 mL/min. Sample identification and concentration were calculated from the retention time and peak area of known concentrations of standard compounds. After measurements, mice were euthanized, their brains were removed, fixed in formalin, and brain sections were prepared to confirm the intracerebral fixation of the microdialysis probe.
  • FIG. 9 shows the changes in extracellular dopamine concentration in the striatum measured by microdialysis.
  • AMPT administration inhibits the uptake of dopamine into vesicles via METH-mediated VMAT2 and suppresses dopamine release by reversing the rotation of the dopamine transporter, but that AMPT administration acts independently of METH-mediated release inhibition on the effect of cocaine, which acts on the dopamine transporter (inhibition of dopamine uptake).

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Abstract

本発明は、薬物等の依存症に対する有効な治療手段を提供する。より詳細には、本発明は、対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するために使用される医薬組成物であって、前記医薬組成物が、チロシン水酸化酵素（TH）阻害剤を含む、前記医薬組成物等に係るものである。

Description

カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出抑制用医薬組成物
　本発明は、カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出抑制用医薬組成物等に関する。
　大麻、ヘロイン、コカイン、アンフェタミンなどの薬物の中には、適量であれば有用で医療目的で使用される場合もあるが、一過性の多幸感を得られることから安易に利用されることがあり過度の用量で継続して利用されると薬物乱用を招く。この薬物乱用は、世界の大きな社会問題の１つであり、医療上の大きな課題になっている。薬物に対する感受性、反応性、依存性は個人差があると考えられているが、その分子基盤は詳細には解明されていない。また、依存症に関しては、上記の薬物乱用だけでなく、アルコール、ニコチン、睡眠薬、有機溶剤などに対する依存症、さらには買い物、ゲーム、ギャンブルなどの依存症も社会的に重要な問題である。
　とりわけ、上記の依存症に罹患している患者は、国内だけでも推定で１０万人以上の患者が存在すると考えられる。この依存性には、中脳辺縁系のドーパミン作動性ニューロン（ドーパミンニューロン）および生成されるドーパミン（ＤＡ）が関与していることが報告されている（非特許文献１）。
　そこで、ドーパミンを制御する手段が検討されてきた。ドーパミンの作用を抑制する手段として、例えば、ドーパミン受容体（例えば、Ｄ２受容体）に対する遮断薬が挙げられる。しかしながら、Ｄ２遮断薬は、一般に、ニューロンの活動を抑制し過ぎるため、意欲の減退、感情の鈍磨などの副作用が生じるので、依存症に対してＤ２遮断薬を用いる治療法においては投与量や薬剤の選択を困難なものにしている。さらに、Ｄ２遮断薬は、プレシナプスの自己受容体を介してＤＡの生合成や放出を活性化してしまう逆効果もあり得る（非特許文献２）。
　さらなるドーパミン作用を抑制する手段として、ドーパミン生合成の阻害や減弱手段もある。これまでに、慢性統合失調症に対する治療薬としてα－メチルチロシンを投与してドーパミン生合成を阻害したことが報告されている（非特許文献３～５）。
　また、アルコール中毒および薬物嗜好の処置のための医薬としてトピラメートオンダンセトロン、およびナルトレキソンなどの薬物の併用が見出されている。しかしながら、これらの薬物はオピオイド受容体に作用する薬物として作用を発揮していることが知られており、特定の薬物を用いたＤＡ抑制手段は、依存症の治療には利用可能になっていない。現在の我が国の依存症の治療方法としては、認知行動療法が中心とされている（非特許文献６）。
特表2010-537990号公報
Wise RA and Robble MA, Annual Review of Psychology, 71, 79-106 (2020) Strange PG, Trends Pharmacol Sci, 29, 314-321 (2008) Carlsson, A.ら、Journal of Neural Transmission 34, 125-132(1973) Engelman, K.ら、J Clin Invest. 1968;47(3):577-594 Carlsson, A.ら、Journal of Neural Transmission 34, 125-132(1973) 松本俊彦, 精神神経学雑誌, 113, 999-1006 (2011)
　現在まで、薬物等の依存症に対して有効な治療手段及び治療方法は確立されていない。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するために使用される医薬組成物等を提供するものである。
　[１]対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するために使用される医薬組成物であって、前記医薬組成物が、チロシン水酸化酵素（TH）阻害剤を含む、前記医薬組成物。
　[２]前記カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出量の上昇を抑制し得るものである、前記[１]に記載の医薬組成物。
　[３]前記カテコールアミンが、ドーパミン、ノルアドレナリン、及びアドレナリンからなる群から選択される１つ以上を含む、前記[１]に記載の医薬組成物。
　[４]前記カテコールアミンがドーパミンである、前記[２]に記載の医薬組成物。
　[５]前記チロシン水酸化酵素（TH）阻害剤が、メチロシン、補酵素テトラヒドロビオプテリン（BH4）の合成阻害剤、THの核酸配列に対する阻害ヌクレオチド、TH発現阻害剤、THのリン酸化を抑制する化合物、THをリン酸化する酵素の阻害剤、及びTHのリン酸化を促進するシグナルの阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種である、前記[１]に記載の医薬組成物。
　[６]前記補酵素BH4の合成阻害剤が、セピアプテリンレダクターゼ阻害薬、GTPシクロヒドロラーゼI阻害薬、ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素阻害薬、及びキノノイドジヒドロプテリジン還元酵素からなる群から選択される、前記[５]に記載の医薬組成物。
　[７]前記カテコールアミンの放出量の上昇が、睡眠薬、抗不安薬、及び鎮痛薬の摂取、並びに、飲酒、喫煙、ギャンブル、ゲーム、及び特殊な嗜癖からなる群から選択される少なくとも１種によって誘導されるものである、前記[２]に記載の医薬組成物。
　[８]前記カテコールアミンの放出量の上昇が、アンフェタミン、メタンフェタミン、オピオイド、モルヒネ、マリファナ、ヘロイン、カフェイン、及びニコチンからなる群から選択される少なくとも１種の摂取によって誘導されるものである、前記[２]に記載の医薬組成物。
　[９]統合失調症、Tourette症候群、過食症、及び依存症からなる群から選択される少なくとも１種の治療のために使用されるものである、前記[１]に記載の医薬組成物。
　[１０]前記上昇による前記ドーパミン放出量の最大が、前記対象の平時のドーパミン量に対して２００％以上である、前記[４]に記載の医薬組成物。
　[１１]前記医薬組成物が、前記対象のドーパミン作動性ニューロンに関する細胞外ドーパミン濃度を該対象の平時の細胞外ドーパミン濃度の５０％以下に低減させない用量で前記対象に投与されるものである、前記[４]に記載の医薬組成物。
　[１２]前記対象が、ヒトである、前記[１]に記載の医薬組成物。
　[１３]対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するために使用される、チロシン水酸化酵素阻害剤。
　[１４]対象にチロシン水酸化酵素阻害剤又は前記[１]に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制する方法。
　[１５]対象にチロシン水酸化酵素阻害剤又は前記[１]に記載の医薬組成物を投与することを含む、統合失調症、過食症、又は依存症の治療方法。
　本発明によれば、対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミン（ドーパミン等）の放出を抑制し得る医薬組成物等を提供することができる。詳しくは、特定の薬物服用時などのカテコールアミン（ドーパミン等）の放出量の上昇（一過性分泌量）を抑制し、副作用が低い、医薬組成物等を提供することができる。本発明によれば、統合失調症、過食症、及び依存症などの治療を、効果的にかつ低い副作用で行うことができる。
図１（１）は、チロシン水酸化酵素遺伝子（Th）ヘテロ欠損マウスにおけるメタンフェタミン（METH）誘発自発運動量の変化を示す。図１（２）はMETH投与後の累積運動量を野生型とTHヘテロ欠損マウスで比較したグラフを示す。 図２は、６週齢メスThヘテロ欠損マウスにおけるMETH誘発自発運動量の変化を示す。 図３は、野生型マウスにメチロシン（AMPT）を投与してからMETHを投与した時の自発運動量の継時変化を示す。 図４は、野生型マウスにAMPTを投与してからMETHを投与した時の自発運動量のAUCの比較を示す。 図５は、野生型マウスにAMPTを投与してから4時間後の脳内各部位の組織中ドーパミン量を示す。 図６は、条件付け場所嗜好性試験（CPP試験）の概要図を示す。 図７は、AMPT投与マウスにおける条件付け場所嗜好性試験（CPP試験）の結果を示す。 図８は、マイクロダイアリシス法の原理の模式図を示す。 図９は、マイクロダイアリシス法を用いたAMPT投与によるMETHあるいはコカインによる細胞外ドーパミン濃度の変化を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
　本発明は、対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するために使用される医薬組成物等を提供する。本発明の医薬組成物は、カテコールアミンの生合成に関わる酵素であるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）の阻害剤を有効成分として含むものである。本発明者は、ドーパミン（ＤＡ）生成を担うチロシン水酸化酵素（ＴＨ）の活性を阻害することにより、ＤＡ生成の抑制だけではなく、ＤＡニューロンにおけるシナプス小胞からのＤＡ放出（開口放出）の量を抑制し得るという効果が得られることを新たに見出し、本発明を完成させた。詳しくは、生体組織内ＤＡの量を大きく減少させない程度でＴＨの活性を阻害することにより、上述の新規な効果が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　以下、本発明の医薬組成物等の説明に先立ち、カテコールアミン及びその生合成などについて説明する。
　１．カテコールアミン及びその生合成
　本明細書中、カテコールアミンとは、カテコールを基本構造とする生理活性アミンを指す。このような生理活性アミンとしては、ドーパミン（ＤＡ）、ノルアドレナリン（ＮＯＲ）、アドレナリンの３種が挙げられる。また、生体の中枢神経における神経伝達物質であるモノアミンとしては、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、セロトニン、ヒスタミンなどが挙げられる。本発明において、カテコールアミンとしては、好ましくはドーパミン及びノルアドレナリンが挙げられ、より好ましくはドーパミンである。
　ドーパミン（ＤＡ）は、生理作用として、例えば、情動、運動、学習（短期記憶など）、意欲、薬物中毒との関与が挙げられる。また、ＤＡ代謝の変化はパーキンソン病などの神経精神疾患の病態生理学に関与し得る。ノルアドレナリン（ＮＯＲ）は、生理作用として、例えば、母性行動、気分の調節、不安、ストレス応答、痛覚に関与し得る。
　カテコールアミンの生合成、並びに貯蔵、輸送及び放出等が行われるニューロンは、カテコールアミン作動性ニューロンと称される。本発明において、カテコールアミン作動性ニューロンとしては、好ましくはドーパミン作動性ニューロン（「ドーパミンニューロン」ともいう）、及びノルアドレナリン作動性ニューロン（「ノルアドレナリンニューロン」ともいう）が挙げられ、より好ましくはドーパミン作動性ニューロンである。
　脳におけるドーパミン作動性ニューロンの具体的な所在としては、例えば、中脳網様体、黒質、腹側被蓋野、視床下部などが挙げられる。より詳細には、例えば、黒質－線条体路、中脳－皮質路、中脳－辺縁系路、隆起漏斗路の経路が挙げられる。このうち、黒質－線条体路は生体の運動機能に重要とされており、例えば、パーキンソン病において黒質－線条体経路の変性が観察されることが知られている。
　ノルアドレナリン作動性ニューロンは、脳や末梢交感神経に存在し、より詳細には、例えば、中枢神経系におけるは青斑－皮質路、網様体－視床下部路、脳室周囲系、延髄－脊髄路が挙げられる。
　ドーパミンは、ドーパミン作動性ニューロンにおいて、２段階の酵素反応で合成される。ノルアドレナリンは、ノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて、３段階の酵素反応で合成される。ドーパミン及びノルアドレナリンの生合成の出発物質はいずれもチロシンであり、生合成の第１段階として、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）（ＥＣ１．１４．１６．２）によって芳香族環が水酸化されてＬ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ドーパ）が生成される。次いで、Ｌ－ドーパが芳香族－Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）（ＥＣ４．１．１．２８）によって脱炭酸を受けて、ドーパミンが生成される。生成されたドーパミンは、さらに、ドーパミン－β－モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１７．１）によって、ノルアドレナリンが生成される。以下にその概略を示す。
　（１）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）
　ドーパミン生合成、及びノルアドレナリン生合成の第１段階で作用するＴＨは、アミノ酸配列として、ヒトでは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：KAI4069455.1（528 aa）、KAI4069454.1（524 aa）、KAI4069453.1（497 aa）、KAI4069452.1（403 aa）等の配列が知られており、マウスでは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：EDL18181.1（498 aa）、EDL18182.1（478 aa）等の配列が知られている。ヒト等の霊長類では、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって、単一の一次転写物から多様なチロシンヒドロキシラーゼｍＲＮＡが生成される。
　ＴＨは、細胞質内でＬ－チロシンを特異的な基質としてＬ－ＤＯＰＡを合成する。このＴＨによるＬ－ＤＯＰＡ合成は、通常、カテコールアミノン生合成の律速段階であり、この酵素の阻害は、カテコールアミン合成に大きく影響する。ＴＨによるカテコールアミン生合成は、生体における短時間での調節として、セリン残基のリン酸化による活性化、その後の最終生成物による酵素活性の阻害（フィードバック阻害）を受ける。長期的な調節としては、ＴＨをコードする遺伝子の転写や翻訳の調節によるＴＨタンパク質量の調節が挙げられる。
　（２）Ｌ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）
　ドーパミン生合成及びノルアドレナリン生合成の第２段階で作用するＡＡＤＣは、細胞質でＬ－ＤＯＰＡからドーパミンへの変換を触媒する。但し、このＡＡＤＣは、天然に存在するすべての芳香族Ｌ－アミノ酸を基質とすることができる。
　２．カテコールアミンの小胞への輸送、蓄積及びリサイクル
　カテコールアミンであるドーパミンは、シナプス前ニューロンの細胞質で生成された後、小胞モノアミントランスポーター（ｖＭＡＴ）によって細胞内の小胞に蓄積される。ｖＭＡＴは、１２回膜貫通タンパク質であり、生体では、ｖＭＡＴ１およびｖＭＡＴ２のアイソフォームを有しているが発現されている。神経細胞では主にｖＭＡＴ２が発現され、ｖＭＡＴ１は腸管、肺、膵臓、腎臓などで発現される。
　ｖＭＡＴ２は、細胞質ドメインを介してＴＨ及びＡＡＤＣと相互作用していることが報告されている（Cartier, E.A.ら、J. Biological Chemistry Vol.285, No.3, pp.1957-1966, 2010）。このことから、ドーパミンの合成はシナプス小胞の膜で行われ、合成後に速やかにシナプス小胞に蓄積されることが示唆される。
　神経細胞のシナプス前終末における神経伝達物質を分泌するための小胞は、シナプス小胞とも呼ばれる。ＴＨやＡＡＤＣによって合成されてシナプス小胞に蓄積されたドーパミンは、エキソサイトーシス（開口放出）によって細胞外に（すなわち、ドーパミン作動性ニューロンから）放出される。シナプス小胞から細胞外への放出までの過程は、（１）ドッキング、（２）プライミング、（３）膜融合の３つの過程に分けられる。これらの各過程において、カルシウムイオン（Ｃａ2+）、シナプトタグミン、シナプトブレビンとシンタキシンなどのＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ－２５などが作用していると考えられている。
　放出されたドーパミンなどの神経伝達物質は、シナプス前終末に隣接するシナプス後部表面の受容体（ドーパミン受容体等）に結合して神経シグナル伝達が行われ、その後に代謝される。一方、神経伝達物質を放出したシナプス前終末は、放出した神経伝達物質を取り込んで細胞内に蓄積するという、リサイクル機構も備えている。このリサイクル機構には、形質膜上のドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）などの各伝達物質のトランスポーターを介する取込過程、エンドサイトーシスによる取込過程が含まれる。このうち、ＤＡＴは、コカイン、アンフェタミン、デュロキセチン塩酸塩、GBR 12783、GBR 12909、インダトラリン塩酸塩、リムカゾール塩酸塩などによって、ドーパミンの取り込みが阻害されるか、または細胞内から細胞外へドーパミンが逆輸送されて、結果として細胞外ドーパミン濃度が上昇し得る。
　３．医薬組成物
　前述のとおり、本発明の医薬組成物は、カテコールアミンの生合成に関わる酵素であるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）の阻害剤を含むものである。
　本発明において利用し得るＴＨに特異的な阻害剤としては、例えば、メチロシン（（２Ｓ）－２－アミノ－２－メチル－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパン酸）、３－クロロチロシン、３－ヨードチロシンなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。メチロシンは、以下の構造を有する物質であり、カテコールアミン分泌過剰を認める褐色細胞腫に対する医薬として市販されている（小野薬品工業、「デムサーカプセル」など）。
　代替のＴＨ阻害剤としては、ＴＨの発現を特異的に阻害可能なヌクレオチド（アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなど）を利用し得る。そのようなヌクレオチドの設計や調製は、ＴＨの公知ヌクレオチド配列情報に基づき当該分野で公知の手段を用いることで可能であり、例えば、本明細書中で後述する公知手順を参照できる。
　さらに、ＴＨによるチロシン水酸化反応は、補酵素（補因子）としてテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を必要とする（浦野ら、ビタミン、2004年78巻9号 p.454-455（DOI：https://doi.org/10.20632/vso.78.9_454_2））。そこで、本発明においては、ＢＨ４の合成を阻害し得る剤もＴＨ阻害剤として利用し得る。ＢＨ４の生合成には、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、６－ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素（ＰＴＰＳ）、セピアプテリン還元酵素が関与する（一瀬(鷲見)ら、日本薬理学雑誌、2001年118巻6号 p.371-377など）。そこで、例えば、セピアプテリンレダクターゼ阻害薬、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ阻害薬、ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素阻害薬などを用いることができるが、これら物質に限定されない。代替として、例えば、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素、セピアプテリンレダクターゼの発現や翻訳を阻害可能な上記アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどを利用して、これら酵素を特異的に阻害してＴＨを阻害し、最終的にドーパミン合成を阻害し得る。
　本発明の一実施形態において、例えば、ＴＨのリン酸化を抑制する化合物（低分子やペプチド、抗体を含む）、細胞内でのＴＨのリン酸化に関与する酵素の阻害剤やリン酸化を促進するシグナルの阻害剤も、ＴＨ阻害剤として利用し得る。例えば、ＴＨのリン酸化部位を含む領域などに基づくドミナントネガティブペプチドを、ＴＨの阻害剤として利用し得る。そのようなペプチドの設計や作製は当該分野で公知であり、例えば、本明細書中に後述する手順を参照できる。
　さらにまた、ＴＨの転写、スプライシング、翻訳に係るヌクレオチド領域に対するアンチセンスヌクレオチドを、ＴＨの発現阻害剤として用いることができる。そのようなアンチセンスヌクレオチドは、例えば、ＴＨのゲノム上のプロモーター配列、ＴＨのプレｍＲＮＡ配列に基づいて、当該分野で公知の手段を用いて当業者は適宜調製し得る。
　なお、本発明の医薬組成物においては、ＴＨ阻害剤と共に、又はＴＨ阻害剤に替えて、芳香族－Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）に特異的な阻害剤を使用することもできる。ＡＡＤＣ阻害剤としては、カルビドパ、ベンセラジド、ブロクレシン、ジフルオロメチルドパ、α-メチルドパ、モノフルオロメチルドパなどが公知である。これらＡＡＤＣ阻害剤は、例えば、レボドパの代謝抑制剤としてパーキンソン病に対する医薬として市販されているものもある（第一三共、「ネオドパストン」、協和発酵キリン「イーシー・ドパール」など）。
　ＡＡＤＣ阻害剤としては、ＡＡＤＣの発現を特異的に阻害可能なヌクレオチド（アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなど）も利用し得る。そのようなヌクレオチドの設計や作製は、ＡＡＤＣのヌクレオチド配列情報に基づき当該分野で公知の手段を用いることで可能である。
　ＡＡＤＣは補因子としてビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）を必要とする。そこで、ＡＡＤＣとビタミンＢ６との結合に係る領域に基づくドミナントネガティブペプチドを設計して、それをＡＡＤＣ阻害剤として利用することもできる。そのようなペプチドの設計や作製は当該分野で公知である。
　また、ＡＡＤＣの転写、スプライシング、翻訳に係るヌクレオチド領域に対するアンチセンスヌクレオチドを、ＡＡＤＣの発現阻害剤（すなわちＡＡＤＣ阻害剤）として用いることもできる。そのようなアンチセンスヌクレオチドは、例えば、ＡＡＤＣのゲノム上のプロモーター配列、ＡＡＤＣのプレｍＲＮＡ配列に基づいて、当該分野で公知の手段を用いて適宜調製し得る。
　本発明の医薬組成物は、主薬（有効成分）のみの医薬であってもよいし、主薬と、製薬学的に許容し得る担体又は添加剤等の他の成分とを組み合わせた医薬組成物であってもよい。また、主薬（有効成分）は１種のみでもよいし、複数種が配合されていてもよい。本発明の医薬組成物中、主薬（有効成分）は、例えば0.1重量％以上であって、かつ、99.9重量％以下、好ましくは、90重量％以下、80重量％以下、70重量％以下、60重量％以下、50重量％以下、40重量％以下、30重量％以下、20重量％以下、10重量％以下で、含有することができる。
　本発明の医薬組成物の剤形は、限定はされず、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、及び、鼻腔経由または吸入経由用などの各種剤形が挙げられるが、非経口（静脈内）用の剤形であることが好ましい。本発明の医薬組成物の投与形態も、限定はされず、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、及び、鼻腔経由または吸入経由などの各種投与形態が挙げられるが、非経口（静脈内）の投与形態であることが好ましい。本発明の医薬組成物の投与量は、限定はされず、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日当たり1～5000mg、好ましくは10～1000mg、10～800mg、10～600mg、10～500mg、10～400mg、10～300mg、10～200mg、10～100mg、10～75mg、10～50mgなどの範囲内の用量とすることができる。これらの１日投与量は複数回、例えば、２回以上、３回以上などに分けて投与されても良い。
　本発明の医薬組成物が、ドミナントネガティブ変異体、ＴＨやＡＡＤＣの発現や翻訳を阻害するポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む場合、このようなポリヌクレオチドは、プロモーターなどを含む適当な発現カセットと組み合わせて、標的の細胞内に送達された後、目的の阻害剤を発現することができるように設計され得る。このような発現カセットは、例えば、好適なウイルスベクターを利用して、標的の細胞に送達することができる。一般に、ウイルスベクターは、標的細胞に対して高い効率で遺伝子を導入することができるため、疾患の治療において好適である。本発明の医薬組成物において利用可能なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに制限されない（Miller, A.D. et al. (1991) J. Virol. 65, 2220-2224; Miyake,S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 91, 8802-8806；Samulski, R. J. et al. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828；特表2004-528836号公報）。上述のようなウイルスベクターを含む本発明の医薬組成物を投与する場合、投与量として、限定はされないが、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日当たり1～5000mg、好ましくは10～1000mg、より好ましくは、10～800mg、10～600mg、10～500mg、10～400mg、10～300mg、10～200mg、10～100mg、10～75mg、10～50mgなどとすることができる。これらの１日投与量は複数回、例えば、２回以上、３回以上などに分けて投与されても良い。
　本発明において、製薬学的に許容し得る担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、pH調整剤、安定化剤等を用いることができる。
　本発明の医薬組成物について、経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることができる。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトースまたは乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
　本発明の医薬組成物について、非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることができる。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはpH8以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
　４．医薬組成物の効果及びその評価
　本発明の医薬組成物は、例えば、睡眠薬、抗不安薬、及び鎮痛薬の摂取、並びに、飲酒、喫煙、ギャンブル、ゲーム、及び特殊な嗜癖（種々の生体内カテコールアミン濃度上昇する行動等）によって誘導されるような、カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制し得るものであり、好ましくは当該カテコールアミンの放出量の上昇を抑制し得るものである。
　上記の各嗜好には、ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニンなどの神経伝達物質の大量放出が関与すると考えられている。例えば、喫煙によるニコチン依存症の場合、生体内に取り込まれたニコチンが脳内のニコチン性アセチルコリンレセプターに結合し、その結果、側坐核からドーパミンが大量に放出され、強い快感が得られるとされる（厚生労働省 生活習慣病予防のための健康情報サイト「ニコチン依存症」より）。
　また、一実施形態において、本発明の医薬組成物は、統合失調症、Tourette 症候群、過食症、又は依存症（アルコール依存症、買い物依存症、薬物依存症、ギャンブル依存症、ゲーム依存症）の治療のために使用され得るが、これらに限定されない。
　上記の各症状において、ドーパミンが関与しているとするドーパミン仮説が提唱されている。よって、本発明の医薬組成物は、ドーパミンなどの一過性の大量放出を背景とする疾患、症状の治療に利用することができる。
　代替として、本発明の医薬組成物は、例えば、アンフェタミン、メタンフェタミン、オピオイド、モルヒネ、マリファナ、ヘロイン、カフェイン、又はニコチン、あるいは種々の低分子化合物）の摂取によって誘導されるような、カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制し得るものであり、好ましくは当該カテコールアミンの放出量の上昇を抑制し得るものである。
　本発明において、カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミン（例えばドーパミン及び／又はノルアドレナリン）の放出の抑制とは、具体的には、カテコールアミンを内包するシナプス小胞が上記ニューロンの細胞膜に融合することによる開口放出によってカテコールアミンがニューロンから放出されること、を抑制することを意味する。従って、本発明におけるカテコールアミンの放出の抑制は、カテコールアミンの生合成量が減少することに起因して生じ得る、上記ニューロンからのカテコールアミンの放出の抑制、を意味するものではない。
　本発明において、カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミン（例えばドーパミン及び／又はノルアドレナリン）の放出量の上昇とは、前述の薬物や依存症による興奮時において、上記ニューロンのシナプス小胞からのカテコールアミンの放出量の最大量が、対象の平時のカテコールアミン量に対して、例えば２００％以上、２５０％以上、３００％以上、３５０％以上、４００％以上、４５０％以上、５００％以上となることである。カテコールアミンの放出量の定量的測定は、当業者に公知の種々の測定方法を利用可能である。例えば、本明細書中の下記実施例で用いた細胞外カテコールアミン濃度の測定方法（後述）等を用いることができる。
　本発明の医薬組成物は、対象における細胞外カテコールアミン濃度の一過性の上昇の最大量を、対照の個体、条件等（コントロール）の最大量と比較して、好ましくは、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０%以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下に抑制する作用を提供する。
　この一過性の上昇の持続期間は、瞬間的な上昇から、持続的に数時間上昇し続けることもあり得る。好ましくは、この一過性の上昇の持続時間の例として、１０秒以上、１５秒以上、２０秒以上、３０秒以上、１分以上、２分以上、３分以上、４分以上、５分以上、６分以上、７分以上、８分以上、９分以上、１０分以上、１５分以上またはそれ以上であり、３０分以内、３５分以内、４０分以内、４５分以内、５０分以内、５５分以内、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１８時間以内、２４時間以内などの期間であり得るが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物の対象への投与量に関しては、対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンに関する細胞外カテコールアミン濃度を該対象の平時の細胞外カテコールアミン濃度の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下に低減させないような用量とすることが好ましい。本明細書中、カテコールアミン作動性ニューロンに関する細胞外カテコールアミン濃度とは、下記実施例等で用いた測定手順に従って、測定対象とする、対象個体におけるカテコールアミン作動性ニューロンが含まれる脳内領域（例えば、中脳、線条体、側坐核、黒質、腹側被蓋野、視床下部、大脳皮質、海馬、扁桃体など）において測定した、細胞外（好ましくは、当該脳内領域の組織中かつ上記ニューロン細胞外）の濃度を指す。測定時間としては、分単位、秒単位、ミリ秒単位、マイクロ秒単位の時間が挙げられる。
　本発明において、対象としては、限定はされず、各種哺乳動物が挙げられるが、ヒトが好ましい。
　ドーパミン（ＤＡ）は、血液、脳髄液、リンパ液などの体液中では速やかに分解され得るし、微量なサンプル量での高感度な測定が必要とされ得る。本発明の医薬組成物の効果のミクロレベルでの測定において、ＥＬＩＳＡ（フナコシ「Dopamine ELISA Kit」など）、ＨＰＬＣ、マススペクトルなどの手法によってＤＡの量、濃度等を測定し得る。
　好ましくは、本発明の医薬組成物の効果の測定における、ドーパミンの放出量の測定手段として、例えば、後述の実施例に記載のマイクロダイアライシス法など、当業者に公知の手段を用いることができる。マイクロダイアリシス法は、自由行動下の動物の行動観察と同時に組織の生体内物質の変動を経時的かつ連続的に検討できる方法である。このマイクロダイアリシス法を使用してモノアミン（NE:ノルエピネフリン，DA:ドーパミン，5-HT:セロトニン）の日内変化を測定し得る。
　また、例えば、ＤＡなどの類似物質をトレーサーとして生体に投与し、ボジトロンエミッショントモグラフィー（PET）を用いることで脳内のDA合成から、再取り込み、受容体等の各機能を独立して評価し得る。そのようなトレーサーとして、例えば、C-11 raclopride、C-11 NMSP、C-11 β-CFT、F-18 FP-DTPZ、F-18 FDOPA等の公知物質を利用することができる（Annual Review 神経2013 J. Basic Neuroscience 52-62）。
　一実施形態において、本発明の医薬組成物は、統合失調症、Tourette症候群、過食症、又は依存症（アルコール依存症、買い物依存症、薬物依存症、ギャンブル依存症、ゲーム依存症）の治療のために使用され得るが、これらに限定されない。
　このような依存症などの評価は、当業者に公知の手法を用いて評価できる。例えば、本明細書中で後述する実施例において用いたような、マウスを用いた条件付け場所嗜好性試験（ＣＰＰ法）、脳内自己刺激試験（Gardner EL, Am J Addict, 2000）等の当業者に公知の方法が挙げられるが、これに限定されない。
　５．その他の発明
　本発明においては、前述した医薬組成物に係る発明には限定されず、例えば、
　対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するために使用される、チロシン水酸化酵素阻害剤；
　対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するためのチロシン水酸化酵素阻害剤の使用；
　対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するための薬剤の製造における、チロシン水酸化酵素阻害剤の使用；
　対象にチロシン水酸化酵素阻害剤又は本発明の医薬組成物を投与することを含む、前記対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制する方法；
　対象にチロシン水酸化酵素阻害剤又は本発明の医薬組成物を投与することを含む、統合失調症、過食症、又は依存症の治療方法；
　統合失調症、過食症、又は依存症を治療するために使用される、チロシン水酸化酵素阻害剤；並びに
　統合失調症、過食症、又は依存症を治療するための薬剤の製造における、チロシン水酸化酵素阻害剤の使用
などの発明も提供され得る。これらの発明における、各構成及び技術的用語の説明については、前述した本発明の医薬組成物における説明が適宜適用され得る。
　本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
（１）Thヘテロ欠損マウスにおける脳内ドーパミン代謝物の変化の検証
　本実験には、Thヘテロ欠損マウスを用いた。Thヘテロ欠損マウスはゲノム上に２本あるTh遺伝子の１本が欠損している。この欠損によって、Thのタンパク質量が野生型の約半分に低下していることを、脳組織線条体のウエスタンブロッティングにより確認した（データは示さず）。
　Thヘテロ欠損マウスにおける脳内ドーパミン代謝の変化を調べるため、Thヘテロ欠損マウスと野生型マウスの中脳と線条体、側坐核におけるドーパミンおよびドーパミン代謝物の量を、HPLC-電気化学検出器を用いて測定した。その結果、各部位におけるドーパミン量に有意な差がないことが認められた（データは示さず）。
（２）Thヘテロ欠損マウスにおけるメタンフェタミンによる自発運動量の変化
　メタンフェタミン（METH）は、小胞体のドーパミン貯蓄を阻害して、シナプス前細胞の細胞質におけるドーパミン濃度を上昇させ、同時にドーパミントランスポーターを逆回転させることにより、神経終末からドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニンなどのアミン類を遊離させ、最終的に神経を興奮させる作用を有する。
　Thヘテロ欠損マウスと野生型マウス（9週齢オスマウス）で、METHを0 (生理食塩水(saline)のみ), 1.0, 2.0, 3.0 mg/kgと徐々に投与量を増やした時のMETH誘発自発運動量の変化を調べた。マウスを直径30 cmの円筒形の容器に一匹ずつ入れ、赤外線センサー (スーパーメックス, 室町機械)を用いて5分間ごとの自発運動量を計測した。マウスを容器に慣れさせるため、マウスを容器に入れてから120分間が経過してからMETHを腹腔内投与し、METHによる自発運動量の増加を計測した（図１）。
　METH1.0 mg/kgの投与では両方のマウスとも生理食塩水のみと同程度の反応性しか示さなかったが、2.0 mg/kgのMETH投与により自発運動量は顕著に増加した。この時、野生型マウスは投与直後から30分後にかけて運動量が増加し続けたが、Thヘテロ欠損マウスでは投与直後に運動量が増加した後は、さらに増加することはなく野生型より低い運動量にとどまった。3.0 mg/kgのMETH投与では両方のマウスともにさらに高い運動量を示した。METH投与後の累積運動量を算出したグラフを図１（１）の右側に示す。
　以上の結果より、2.0 mg/kgのMETH投与後の運動量はThヘテロ欠損マウスで有意に野生型マウスより低い値を示した（図１（２））。この結果から、Thヘテロ欠損マウスでMETH反応性が低下していることが示された。
　同様の実験を６週齢メスマウスで行ったところ、2.0 mg/kgのMETH投与でさらに顕著なMETH反応性の違いが観察された（図２）。この違いは６週齢というまだ成獣になる前の発達期ではドーパミン代謝が成獣とは異なっていると考えられた。
（３）Thヘテロ欠損マウスにおけるTH阻害条件下でのMETH投与の作用
　次に、野生型マウスにTH阻害剤を投与してTH活性を抑えた時のMETH応答性の変化を調べた。TH阻害剤としてα-methyl DL-tyrosine (AMPT)(Merck社製, カタログ番号 120693-5g）を用いた。AMPTは生理食塩水に難溶であるため、0.5 w/v%メチルセルロース400溶液(富士フィルム和光純薬株式会社製 カタログ番号133-17815)に懸濁してマウスにMETH投与の4時間前に腹腔内投与した。METHは実験ごとに記載された投与量となるように生理食塩水に溶解して腹腔内投与した。コントロールマウスには生理食塩水のみを投与した。
　AMPTを10 mg/kg、20 mg/kg、コントロール(CNTL)として溶媒に用いたメチルセルロースを腹腔内に投与した。投与４時間後に3.0 mg/kgのMETHを腹腔内投与してMETH誘発自発運動量の変化を調べた。コントロールマウスではMETH投与直後から運動量が増加し始めて投与40分後まで運動量が増加し続けたが、AMPT投与マウスでは顕著にMETH誘発運動量の増加が抑えられ、10mg/kg AMPT投与群より20 mg/kg投与群の方が強く抑制された（図３）。METH投与後65分までの運動量のグラフの曲線下面積AUCを算出すると、AMPT投与マウスでは用量依存的にMETH誘発自発運動量を著明に抑制した（図４）。
（４）AMPT投与による脳内ドーパミン量の変化
　AMPT投与による脳内ドーパミン代謝の変化を調べるために、同様に野生型マウス（週齢確認）にAMPTを投与してから４時間後に解剖して中脳、線条体、側坐核におけるドーパミンとその代謝物を調べた。その結果、10 mg/kg、20 mg/kgと投与量が増えるにつれてドーパミン量の低下が観察されたが、10 mg/kg AMPTでおよそ10%から20%程度、20 mg/kg AMPTでおよそ30%から50%程度の低下にとどまった（図５）。
　脳内ドーパミン量の測定は、マウス脳部位の組織破砕液の上清5μLを1×PBS 45μLで10倍希釈した溶液に0.2 M 過塩素酸/0.1 mM EDTAを50 μL、内部標準物質として1 μM イソプロテレノール (ISO)を10μL加え、ピペッティングしたのち氷上で10分間静置した。その後20,000 x G、4℃、15分間遠心し、上清に強酸を中和するために1 M 酢酸ナトリウムを10 μL加え、再度20,000 x G、4℃、10分間遠心したものをドーパミン測定サンプルとした。ドーパミン測定サンプルは、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)逆相カラムにより分離し、電気化学検出器により検出した。濃度既知の標準物質の保持時間とピーク面積から、サンプルの同定と濃度の算出を行った。
　有意差検定としてはWelch’s t-testを採用し、3群以上の場合はBonferroni法で補正した。p<0.05を有意とした。
（５）AMPT投与によるMETH誘発依存性に対する作用
　AMPTによりMETH誘発自発運動量が抑制されたことから、AMPT投与によりMETHによる依存形成の抑制効果が認められるかを調べるために、条件付け場所嗜好性試験（CPP試験）により、AMPT投与マウスにおけるMETHの依存形成能の変化を評価した。実験の概要を図６に示す。
　条件付け場所嗜好性試験 (CPP法)により、AMPT投与マウスにおけるMETHの依存形成能の変化を評価した。実験の概略図を図６に示す。
　評価の基準としては、CPPスコアとして、[METHにより条件付けした部屋のポストテストでの滞在時間]から[METHにより条件付けした部屋のプレテストでの滞在時間]を引いた時間、を用いた。実験には9週齢のオスの野生型マウスを用いた。
　CPP装置は床面に金属格子が設置された黒い部屋と、床面に金網が設置されている白い部屋に分かれており、馴化、プレテスト、ポストテストの段階では二つの開口部を持つT字の仕切りにより、マウスが両方の部屋を行き来できるようにした。一方で条件付けの段階には、開口部のない長方形の仕切りを用いることでマウスの部屋の移動をできないようにした。マウスの部屋の移動回数および各部屋での滞在時間は、赤外線検出器 (Neuroscience)にて計測した。
　この試験は馴化/プレテスト、条件付け、ポストテストの3段階に分けて行われる。まず1日目と2日目にはマウスを装置に慣れさせるため、白い部屋からマウスを装置に入れて900秒間の部屋の移動回数および各部屋での滞在時間を計測する。そして3日目にはプレテストとして1・2日目と同様にマウスを15分間装置に入れて、部屋の移動回数および各部屋での滞在時間を計測する。ここでそれぞれのマウスを4つに群分けし条件付けを行う。マウスは1日ごとに行き来できなくされた黒い部屋と白い部屋に交互に入れられる。A群とB群は４日目と６日目に黒い部屋で５日目と７日目に白い部屋、C群とD群は４日目と６日目に白い部屋で５日目と７日目に黒い部屋に入れられ、A群とD群は白い部屋の時にMETH（3 mg/kg）を投与され、B群とC群は黒い部屋の時にMETHを投与されて45分間それぞれの部屋に閉じ込められる。8日目にはプレテストと同様の条件でマウスを15分間装置に入れて、それぞれの部屋の移動回数および各部屋での滞在時間を計測することで、どちらの部屋を好むようになったかを評価する。
　この様にして得られた結果より、CPPスコア ([METHにより条件付けした部屋のポストテストでの滞在時間]から[METHにより条件付けした部屋のプレテストでの滞在時間]を引いた時間)を算出することで、マウスにおけるMETHの依存形成能を評価した。
　その結果、50 mg/kgのAMPT投与により有意にMETHによる依存形成を低下させることが示された。
（６）AMPT投与による脳内ドーパミン放出量に対する作用
　AMPT投与による神経終末からのドーパミンの放出量を、マイクロダイアリシス法により評価した。マイクロダイアリシス法は、生きたマウスの特定の部位における細胞外物質を回収する手法である。マウスの頭部に半透膜からなるプローブを挿入し、そのプローブ内に灌流液としてリンガー液を流速2.0μl/minで流すことで脳内物質が濃度勾配に従い灌流液に回収される（図８）。この手法を用いることで、マウスを無麻酔、無拘束の条件下において長時間かつ連続的に細胞外物質の変化をモニタリングすることができる。
　一定時間ごとに回収した灌流液中に含まれるドーパミンの量をHPLC電気化学検出法により測定した。具体的には、生体から回収したサンプルを、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)逆相カラム(150×4.6 mm)により分離し、電気化学検出器(第一セル +180 mV;第2セル, -180 mV)により検出した。移動相として4.1 g/L sodium acetate adjusted to pH 4.1, 100 mg/L Na2EDTA, 100 mg/L octanesulfonic acid, 20% methanolの組成を用いて、0.38 mL/minで還流した。濃度既知の標準物質の保持時間とピーク面積から、サンプルの同定と濃度の算出を行った。測定後のマウスは安楽死により脳を摘出し、ホルマリン固定後、脳切片を作成しマイクロダイアリシスプローブの脳内固定位置を確認した。
　図９にマイクロダイアリシス法により測定した線条体での細胞外ドーパミン濃度の変化を示した。
　AMPTを20 mg/kg、50 mg/kg投与したマウスに1.0 mg/kgのMETHを投与した時に細胞外に放出されたドーパミン量は用量依存的に減少し、50 mg/kgのAMPT投与マウスではほぼMETHによるドーパミンの放出が検出されなかった。
　同様の実験をMETHではなくドーパミントランスポータを阻害することが知られているコカインを投与して調べたところ、50 mg/kgのAMPT投与マウスでも細胞外ドーパミンの顕著な増加が観察された。
　これらの結果は、AMPT投与が、METHによるVMAT2を介してドーパミンの小胞内への取り込みを阻害する作用とドーパミントランスポータを逆回転させることによるドーパミン放出を抑制する作用を持つが、ドーパミントランスポータに作用するコカインによる作用（ドーパミン取込阻害）に対しては、AMPT投与は、METH性放出抑制とは独立して作用することを示した。
（７）考察
　上記の各実験によって、以下の結果が得られた。
(i) 　ヘテロＫＯマウスにおけるＴＨ発現量の低減の結果、組織内ＤＡ量は僅かな低減に留まったが、依存性薬物であるＭＥＴＨに対する反応性・感受性は、ＤＡ量の低減に対して劇的に変化した。
(ii)　ＴＨ阻害剤ＡＭＰＴは、ＭＥＴＨ投与による細胞外ＤＡの増加を用量依存的に抑制した。
(iii) ＡＭＰＴの投与によって、ＶＭＡＴ２作用性であるＭＥＴＨの投与後の細胞外ＤＡの増加を抑えたが、ＤＡＴ阻害剤であるコカインによるＤＡの増加は抑えなかった。
　これらの結果を総合的に検討すると、ＡＭＰＴによるＭＥＴＨ感受性の抑制効果は、組織内ＤＡの減少ばかりでなく、ＤＡ小胞からのＤＡ放出量をＴＨ活性が調節しているという新規生理作用を発見した。このことは、組織内ＤＡを大きく減少させない低用量のＡＭＰＴの投与によりＭＥＴＨによる強い快刺激を抑えて、新しい依存症治療薬を提供するものと考えられる。
 

Claims (15)

  1. 　対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するために使用される医薬組成物であって、前記医薬組成物が、チロシン水酸化酵素（TH）阻害剤を含む、前記医薬組成物。
  2. 　前記カテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出量の上昇を抑制し得るものである、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記カテコールアミンが、ドーパミン、ノルアドレナリン、及びアドレナリンからなる群から選択される１つ以上を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 　前記カテコールアミンがドーパミンである、請求項２に記載の医薬組成物。
  5. 　前記チロシン水酸化酵素（TH）阻害剤が、メチロシン、補酵素テトラヒドロビオプテリン（BH4）の合成阻害剤、THの核酸配列に対する阻害ヌクレオチド、TH発現阻害剤、THのリン酸化を抑制する化合物、THをリン酸化する酵素の阻害剤、及びTHのリン酸化を促進するシグナルの阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 　前記補酵素BH4の合成阻害剤が、セピアプテリンレダクターゼ阻害薬、GTPシクロヒドロラーゼI阻害薬、ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素阻害薬、及びキノノイドジヒドロプテリジン還元酵素からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　前記カテコールアミンの放出量の上昇が、睡眠薬、抗不安薬、及び鎮痛薬の摂取、並びに、飲酒、喫煙、ギャンブル、ゲーム、及び特殊な嗜癖からなる群から選択される少なくとも１種によって誘導されるものである、請求項２に記載の医薬組成物。
  8. 　前記カテコールアミンの放出量の上昇が、アンフェタミン、メタンフェタミン、オピオイド、モルヒネ、マリファナ、ヘロイン、カフェイン、及びニコチンからなる群から選択される少なくとも１種の摂取によって誘導されるものである、請求項２に記載の医薬組成物。
  9. 　統合失調症、Tourette症候群、過食症、及び依存症からなる群から選択される少なくとも１種の治療のために使用されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. 　前記上昇による前記ドーパミン放出量の最大が、前記対象の平時のドーパミン量に対して２００％以上である、請求項４に記載の医薬組成物。
  11. 　前記医薬組成物が、前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンに関する細胞外ドーパミン濃度を該対象の平時の細胞外ドーパミン濃度の５０％以下に低減させない用量で前記対象に投与されるものである、請求項４に記載の医薬組成物。
  12. 　前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の医薬組成物。
  13. 　対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制するために使用される、チロシン水酸化酵素阻害剤。
  14. 　対象にチロシン水酸化酵素阻害剤又は請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記対象におけるカテコールアミン作動性ニューロンからのカテコールアミンの放出を抑制する方法。
  15. 　対象にチロシン水酸化酵素阻害剤又は請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む、統合失調症、過食症、又は依存症の治療方法。
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