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WO2025206265A1 - Ｉｐｔ発現核酸構築物 - Google Patents

Ｉｐｔ発現核酸構築物

Info

Publication number
WO2025206265A1
WO2025206265A1 PCT/JP2025/012676 JP2025012676W WO2025206265A1 WO 2025206265 A1 WO2025206265 A1 WO 2025206265A1 JP 2025012676 W JP2025012676 W JP 2025012676W WO 2025206265 A1 WO2025206265 A1 WO 2025206265A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plant
ipt
regenerated
genome editing
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/012676
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
創 山田
祐二 石田
晴康 濱田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corp filed Critical Kaneka Corp
Publication of WO2025206265A1 publication Critical patent/WO2025206265A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding isopentenyltransferase (IPT) and a promoter operably linked to the polynucleotide.
  • the present invention also relates to an agent for promoting the production of regenerated plants derived from plant tissue explants, comprising the nucleic acid construct; a method for promoting the production of regenerated plants derived from plant tissue explants; and a method for producing regenerated plants derived from plant tissue explants.
  • the present invention further relates to an agent for improving the efficiency of plant genome editing, comprising the nucleic acid construct; a method for improving genome editing efficiency in plants; and a method for producing genome-edited plants.
  • Non-Patent Document 2 describes co-introducing a target gene and an IPT gene into a plant and selecting genetically modified organisms using morphological abnormalities as an indicator. Furthermore, Patent Document 1 describes obtaining genome-edited individuals in which the foreign gene has not been integrated into the genome by removing individuals in which the foreign gene has been integrated into the genome using morphological abnormalities as an indicator when regenerating individuals derived from plant cells into which the IPT gene and a genome editing enzyme gene have been introduced.
  • the objective of the present invention is to provide a means for shortening the time required to regenerate a plant from a plant tissue fragment, or a means for improving the efficiency of genome editing in plants.
  • FIG. 1 Figures showing the T-DNA structures of the vectors prepared in Production Examples 1 to 5.
  • A Genome-editing vector for non-IPT expression.
  • B Genome-editing vector for PNative-IPT expression, genome-editing vector for PPcUbi-IPT expression, genome-editing vector for P35S-IPT expression, and genome-editing vector for P2x35S-IPT expression.
  • A Agrobacterium carrying a non-IPT expression genome editing vector or
  • a PPcUbi-IPT expression genome editing vector was inoculated into potato leaf pieces, and the leaf pieces were cultured on coculture medium PCM for 3 days, then on callus formation medium PCM for 3 days, and then on regeneration medium PSM.
  • the present invention relates to a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding isopentenyltransferase (IPT) and a promoter operably linked to the polynucleotide (hereinafter referred to as the "IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention").
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention can be used to promote the generation of regenerated plants from plant tissue explants and/or improve the efficiency of plant genome editing.
  • plasmids include, but are not limited to, pUC series (pUC57, pUC18, pUC19, pUC9, etc.), pLC series (pLC41, etc.), pAL series (pAL51, pAL156, etc.), pBI series (pBI121, pBI101, pBI221, pBI2113, pBI101.2, etc.), pPZP series, pSMA series, and intermediate vector series (pLGV23Neo, pNCAT, etc.).
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention comprises, as essential components, a polynucleotide encoding isopentenyltransferase (IPT) and a promoter operably linked to the polynucleotide.
  • IPT isopentenyltransferase
  • IPT isopentenyl transferase
  • IPT is an enzyme involved in the biosynthesis of cytokinin.
  • Isopentenyl transferase may be derived from plants or bacteria such as Agrobacterium.
  • Agrobacterium refers to bacteria of the genus Agrobacterium.
  • the isopentenyl transferase may be, for example, an isopentenyl transferase derived from Agrobacterium tumefaciens.
  • the isopentenyl transferase may be, for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the isopentenyl transferase may also be a protein having isopentenyl transferase activity and consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid has been added, deleted, and/or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid substitution preferably refers to substitutions within conservative amino acid groups that have similar properties, such as charge, side chain, polarity, and aromaticity, among the 20 types of amino acids that make up naturally occurring proteins. Examples include substitutions within uncharged polar amino acids with low-polarity side chains (Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr), branched-chain amino acids (Leu, Val, Ile), neutral amino acids (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), neutral amino acids with hydrophilic side chains (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), and aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp). Amino acid substitutions within these groups are preferred because they are known to be less likely to cause changes in the properties of polypeptides.
  • amino acid sequence identity refers to a numerical value indicating the percentage of sites containing the same type of amino acid residue within the comparison range of two amino acid sequences. Even when the lengths of the two amino acid sequences are different, amino acid sequence identity can be calculated by aligning the sequences to maximize the degree of amino acid identity within the comparison range.
  • a representative algorithm for such analysis is BLAST, although this is not limited to it. BLAST is available in a variety of software and web services.
  • amino acid sequence identity can be easily calculated using the genetic information processing software GENETYX (https://www.genetyx.co.jp/) or the NCBI BLAST server (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  • GENETYX https://www.genetyx.co.jp/
  • NCBI BLAST server https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
  • FASTA FASTA
  • the polynucleotide encoding isopentenyl transferase may be, for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide encoding isopentenyl transferase may also be a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 nucleotide has been added, deleted, and/or substituted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and which encodes a protein having isopentenyl transferase activity.
  • the polynucleotide encoding isopentenyl transferase may also be a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and which encodes a protein having isopentenyl transferase activity.
  • nucleotide sequence identity is a numerical value that indicates the percentage of sites with the same type of base within the comparison range of two nucleotide sequences, similar to the amino acid sequence identity described above. Even if the lengths of the two nucleotide sequences are different, nucleotide sequence identity can be calculated by aligning them so that the degree of base identity within the comparison range is highest. While not limited to the aforementioned BLAST and FASTA, analysis algorithms such as MUMmer can also be used to analyze nucleotide sequence identity.
  • polynucleotide refers not only to double-stranded nucleic acids, but also to single-stranded nucleic acids such as the positive strand (sense strand) or complementary strand (antisense strand) that constitute them, and unless otherwise specified, includes both DNA and RNA.
  • the promoter operably linked to the polynucleotide encoding isopentenyl transferase may be of plant or non-plant origin, as long as it is capable of inducing transcription in plant cells.
  • the promoter may be the native promoter of the isopentenyl transferase gene or a promoter of another gene.
  • the promoter may also be a naturally occurring promoter or a modified promoter.
  • the promoter may be, for example, a constitutive promoter.
  • constitutive promoter refers to a promoter that can induce transcription in the entire plant (e.g., all tissues or all cells of the plant) regardless of the developmental stage.
  • the promoter may also be, for example, a high-expression promoter.
  • a "high-expression promoter” refers to a promoter having activity greater than that of the promoter shown in SEQ ID NO: 16 (the native promoter of the Agrobacterium tumefaciens IPT gene), for example, a promoter having activity 1.5 times or more (e.g., 2 times or more, 4 times or more, 6 times or more, 8 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 40 times or more, 60 times or more, 80 times or more, 100 times or more, 200 times or more, 400 times or more, 600 times or more, 800 times or more, or 1000 times or more) that of the promoter shown in SEQ ID NO: 16.
  • Promoter activity can be confirmed by constructing a vector in which various reporter genes, such as ⁇ -glucuronidase (GUS) or luciferase (LUC) genes, are linked downstream of the promoter, transforming a plant with the vector using the Agrobacterium method or the like, and then measuring the expression of the reporter gene.
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • LOC luciferase
  • promoters include the isopentenyl transferase (IPT) gene promoter (e.g., the Agrobacterium tumefaciens IPT gene promoter), ubiquitin promoters (e.g., the parsley ubiquitin promoter, the maize ubiquitin promoter), the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, modified CaMV 35S promoter promoters (e.g., the 2x35S promoter, the El2-35S omega promoter), actin promoters (e.g., the rice actin promoter), the nopaline synthase (NOS) gene promoter, the alcohol dehydrogenase (ADH) gene promoter, the tobacco-derived infection-specific protein (PR protein) promoter, the RuBisco promoter, and the U6 promoter (e.g., the Arabidopsis thaliana U6 promoter).
  • IPT isopentenyl transferase
  • ubiquitin promoters e.g., the
  • the promoter may be, for example, a polynucleotide consisting of the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 16 to 19 and 44.
  • the promoter may also be a polynucleotide having promoter activity and consisting of a base sequence in which one to two or one base has been added, deleted, and/or substituted in the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 16 to 19 and 44.
  • the promoter may also be a polynucleotide having promoter activity and consisting of a base sequence having 90% or more, 95% or more, or 100% sequence identity with the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 16 to 19 and 44.
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention may include an expression control region for isopentenyltransferase other than a promoter (e.g., an enhancer, an insulator, a terminator, a poly(A) addition signal, etc.).
  • a promoter e.g., an enhancer, an insulator, a terminator, a poly(A) addition signal, etc.
  • terminals include, but are not limited to, the Pea3A terminator, a heat shock protein (HSP) gene terminator, a nopaline synthase (NOS) gene terminator, an octopine synthase (OCS) gene terminator, and a CaMV 35S terminator.
  • HSP heat shock protein
  • NOS nopaline synthase
  • OCS octopine synthase
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention may or may not contain a drug resistance gene.
  • drug resistance gene refers to a gene that confers resistance to a specific drug (a selective drug as described later in this specification) to a target plant.
  • drug resistance genes include, but are not limited to, the bar gene for phosphinothricin (PPT) (glufosinate), the hygromycin B resistance gene (hpt gene) for hygromycin B, the chloramphenicol resistance gene for chloramphenicol, the neomycin resistance gene for neomycin, and the kanamycin resistance gene for kanamycin.
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention can be prepared by those skilled in the art using known techniques. For example, as shown in the Examples below, it can be prepared by cleaving the gene cassette with an appropriate restriction enzyme and ligating it to a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate backbone vector.
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention can also be prepared using techniques such as In-Fusion cloning, TA cloning, and double crossover recombination.
  • the base sequence of the gene encoded in the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention may be optimized to use codons appropriate for the plant cell into which it is introduced, in order to efficiently express its translation product in the cell.
  • the IPT expression nucleic acid construct of the present invention can promote the generation of regenerated plants from plant tissue explants and can also improve genome editing efficiency in plants.
  • the present invention provides an agent for promoting the production of regenerated plants derived from plant tissue fragments (hereinafter, sometimes referred to as the "agent for promoting the production of regenerated plants of the present invention"), which comprises the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention.
  • tissue explant refers to a section cut out from a part of a plant.
  • the plant tissue explant may be any tissue explant capable of regenerating a plant, and includes, for example, sections of leaves, stems, roots, or seeds.
  • the plant tissue explant may be, for example, a tissue explant containing a dividing cell or a cell capable of regeneration, such as, but not limited to, a tissue explant containing the hypocotyl, cotyledonary node, shoot apex, or terminal bud of a young plant.
  • Regenerated plants include plants from which adventitious buds, stems, and leaves have been regenerated or regenerated, plants from which roots have been regenerated or regenerated, and plants from which leaves, stems, and roots have been regenerated or regenerated.
  • regenerated plants whose generation is promoted by the present invention are preferably plants from which leaves and stems have been regenerated or regenerated, for example, plants from which morphologically normal leaves and stems have been regenerated or regenerated.
  • a polynucleotide encoding IPT may or may not be integrated into the genome of a regenerated plant.
  • the term "agent for promoting the production of regenerated plants” refers to an agent that, when introduced into a plant tissue fragment or cultured cells derived therefrom, promotes the production of regenerated plants derived from the plant tissue fragment.
  • Promotion of regenerated plant production can be, for example, promotion of the production of regenerated plants from a plant tissue fragment, or promotion of the production of regenerated plants from callus formed from a plant tissue fragment.
  • "promoting the production of regenerated plants” means increasing the amount of regenerated plants produced compared to the amount of regenerated plants produced when regenerated plants are produced from a plant tissue fragment without introducing a polynucleotide encoding isopentenyl transferase (IPT).
  • promotion of the production of regenerated plants can be, for example, promotion of the growth of regenerated plants. Therefore, the agent for promoting the production of regenerated plants of the present invention can be, for example, a growth promoter for regenerated plants.
  • the term "agent for promoting the growth of regenerated plants” refers to an agent that, when introduced into a plant tissue fragment or cultured cells derived therefrom, promotes the growth of regenerated plants derived from plant tissue fragments.
  • "promoting the growth of regenerated plants” includes promoting the growth rate of leaves and/or stems.
  • promoting the growth of a regenerated plant means increasing the growth rate of a regenerated plant compared to the growth rate of a plant regenerated from a plant tissue explant without introducing a polynucleotide encoding isopentenyl transferase (IPT).
  • IPT isopentenyl transferase
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention has the effect of promoting the production of regenerated plants derived from plant tissue explants can be evaluated, for example, as described below.
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention is introduced into plant tissue explants or cultured cells derived therefrom, and these are cultured for a predetermined period of time to regenerate plants.
  • the number of tissue explants that form shoots (number of shoot-forming tissue explants) is counted, and the ratio of the number of shoot-forming tissue explants to the total number of tissue explants is calculated.
  • the same procedure is performed using an identical nucleic acid construct except that it does not contain the IPT gene.
  • the ratio of the number of shoot-forming tissue explants to the total number of tissue explants when the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention is introduced is 1.5 times or more (e.g., 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, or 5 times or more) higher than the ratio of the number of shoot-forming tissue explants to the total number of tissue explants when a nucleic acid construct not containing the IPT gene is introduced, it can be determined that the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention has the effect of promoting the production of regenerated plants.
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention can be introduced into plant tissue explants or cultured cells derived therefrom, which are then cultured to form callus, and the callus can then be cultured to regenerate a plant. Then, for example, the number of tissue explants that have grown to the point where the regenerated plant has formed morphologically normal leaves and stems (sometimes referred to as "stems and leaves" in this specification) after a specified period of time can be counted as the number of shoot-forming tissue explants, and the ratio of the number of shoot-forming tissue explants to the total number of tissue explants can be calculated.
  • the promoter for regenerated plant production of the present invention comprises the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention.
  • the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention is as described in "1. IPT-expressing nucleic acid construct.”
  • the regenerated plant production promoter of the present invention can be introduced into plant cells, for example, plant tissue explants (e.g., leaf, stem, root, or seed segments, tissue explants containing dividing cells or cells capable of regeneration, etc.), or cultured cells derived therefrom (e.g., callus or protoplasts).
  • plant tissue explants e.g., leaf, stem, root, or seed segments, tissue explants containing dividing cells or cells capable of regeneration, etc.
  • cultured cells derived therefrom e.g., callus or protoplasts.
  • callus can be formed from plant tissue explants into which the regenerated plant production promoter of the present invention has been introduced, and plants can be regenerated and grown from the callus, thereby promoting the generation of regenerated plants derived from plant tissue explants.
  • the regenerated plant production promoter of the present invention can be introduced into callus derived from plant tissue explants, and plants can be regenerated and grown from the callus, thereby promoting the generation of regenerated plants derived from plant tissue explants.
  • the regenerated plant production promoter of the present invention can be used in the regenerated plant production promoting method and regenerated plant production method of the present invention described below. Details of how to use the regenerated plant production promoting agent of the present invention are as described in "4. Regenerated plant production promoting method” and “5. Regenerated plant production method.”
  • the plant to which the agent for promoting the production of regenerated plants of the present invention is introduced may be either a herbaceous plant or a woody plant.
  • the plant may also be, for example, an agriculturally important plant, such as a crop plant such as a grain, vegetable, or fruit, or an ornamental plant.
  • the plant may be any of mosses, ferns, gymnosperms, or angiosperms, but is preferably an angiosperm, such as a monocotyledonous or dicotyledonous plant.
  • monocotyledonous plants include plants of the Poaceae family (e.g., rice, wheat, barley, corn, sugarcane, sorghum, sorghum, and turfgrass), plants of the Musaceae family (e.g., bananas), plants of the Amaryllidaceae family (e.g., leeks, onions, garlic, and chives), and plants of the Liliaceae family (e.g., lilies and tulips).
  • dicotyledonous plants examples include Brassicaceae plants (e.g., cabbage, radish, Chinese cabbage, rapeseed), Asteraceae plants (e.g., lettuce, burdock, chrysanthemum), Fabaceae plants (e.g., soybean, peanut, pea, kidney bean, lentil, chickpea, broad bean, licorice), Solanaceae plants (e.g., tomato, eggplant, potato, tobacco, bell pepper, chili pepper, petunia), and Rosaceae plants (e.g., strawberry, apple, pear, peach, loquat, almond, plum, rose, plum).
  • Brassicaceae plants e.g., cabbage, radish, Chinese cabbage, rapeseed
  • Asteraceae plants e.g., lettuce, burdock, chrysanthemum
  • Fabaceae plants e.g., soybean, peanut, pea, kidney bean, lentil, chickpea, broad bean, lic
  • Cucurbitaceae plants e.g., cucumber, gourd, pumpkin, melon, watermelon
  • Anacardiaceae plants e.g., mango, pistachio, cashew nut
  • Lauraceae plants e.g., avocado
  • Rutaceae plants e.g., mandarin orange, grapefruit, lemon, yuzu
  • Convolvulaceae plants e.g., sweet potato
  • Theaceae plants e.g., tea plant
  • Vitaceae plants e.g., grape).
  • the plant is preferably an angiosperm, more preferably a dicotyledon, even more preferably a solanaceae plant (e.g., tomato, eggplant, potato, tobacco, bell pepper, chili pepper, or petunia) or a legume (e.g., soybean, peanut, pea, kidney bean, lentil, chickpea, broad bean, or licorice), and most preferably potato (Solanum tuberosum) and soybean (Glycine max).
  • solanaceae plant e.g., tomato, eggplant, potato, tobacco, bell pepper, chili pepper, or petunia
  • a legume e.g., soybean, peanut, pea, kidney bean, lentil, chickpea, broad bean, or licorice
  • potato Solanum tuberosum
  • soybean Glycine max
  • Potato varieties include, but are not limited to, varieties such as “Sassy,” “Danshakuimo,” “Kitaakari,” “May Queen,” “Haruka,” “Cynthia,” and “Northern Ruby.”
  • Soybean varieties include, but are not limited to, varieties such as “Maple Arrow,” “Fukuyutaka,” “Enrei,” “Tachinagaha,” and “Yukihomare.”
  • the promoter for regenerated plant production of the present invention can promote the generation of regenerated plants from plant tissue fragments, thereby shortening the time required to regenerate plants from plant tissue fragments.
  • the promoter for regenerated plant production of the present invention can promote the generation of regenerated plants from plant tissue fragments, thereby shortening the time required to regenerate plants from plant tissue fragments.
  • it takes 2 to 3 months to form callus from plant tissue fragments, regenerate a plant from the callus, and grow the plant until leaves unfold.
  • the promoter for regenerated plant production of the present invention it takes only 1 to 2 months to form callus from plant tissue fragments, regenerate a plant from the callus, and grow the plant until leaves unfold.
  • composition for Promoting the Production of Regenerated Plants 3-1 provides a composition for promoting the production of regenerated plants derived from plant tissue fragments (hereinafter, sometimes referred to as the "composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention"), which comprises the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention.
  • the regenerated plants whose production is promoted by the present invention may preferably be plants whose leaves and stems have been regenerated or redifferentiated.
  • composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention contains the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention as an essential active ingredient.
  • the composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention may further contain a polynucleotide encoding a genome editing system as an optional component. Each component is described below.
  • the IPT-expressing nucleic acid construct used in the composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention may be a promoter for promoting the production of regenerated plants of the present invention.
  • the IPT-expressing nucleic acid construct or the promoter for promoting the production of regenerated plants of the present invention is as described in "1. IPT-Expressing Nucleic Acid Construct" and "2. Promoters for Promoting the Production of Regenerated Plants.”
  • the composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention is preferably introduced into plant cells directly or via bacteria such as Agrobacterium so that the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention is in an amount effective for plant cells.
  • the term "genome editing system” is not particularly limited as long as it is an artificial restriction enzyme system that can cause modifications at specific sites in genomic DNA.
  • artificial restriction enzyme systems include the CRISPR/Cas system, the TALEN system, the ZFN system, and the PPR system.
  • the CRISPR/Cas system uses the Cas protein, a nuclease (RGN; RNA-guided nuclease), and guide RNA (gRNA, single-guide RNA (SgRNA)).
  • RGN RNA-guided nuclease
  • gRNA single-guide RNA
  • the guide RNA binds to the target site, and the Cas protein, guided to the binding site, can cleave the DNA (e.g., CRISPR-Cas9 (U.S. Patent No. 8,697,359, WO 2013/176772), CRISPR-Cpf1 (Zetsche B. et al., Cell, 163(3):759-71, (2015)).
  • the ZFN system uses artificial nucleases (ZFNs) that contain a nucleic acid cleavage domain conjugated to a DNA-binding domain containing a zinc finger array (e.g., U.S. Patents Nos. 6,265,196, 8,524,500, and 7,888,121; European Patent No. 1,720,995).
  • ZFNs artificial nucleases
  • a DNA-binding domain containing a zinc finger array e.g., U.S. Patents Nos. 6,265,196, 8,524,500, and 7,888,121; European Patent No. 1,720,995
  • the DNA-binding domain that binds to the target site can be designed according to known schemes.
  • PPR pentatricopeptiderepeat fused with a nuclease domain
  • PPR pentatricopeptiderepeat
  • the CRISPR/Cas system is preferred because it uses nucleic acids (guide RNAs) to recognize target sites, allowing for more flexible selection of target sites and simplifying its preparation.
  • the length of the guide RNA used in the CRISPR/Cas system is at least 15, 16, 17, 18, 19, or 20 bases.
  • the preferred upper limit of the base length is 30 or less, more preferably 25 or less, even more preferably 22 or less, and most preferably 20 or less.
  • the CRISPR/Cas system may use two or more guide RNAs (e.g., 2, 3, 4, or 5).
  • the Cas protein may contain one or more nuclear localization signals (NLS).
  • the Cas protein is preferably a type II CRISPR enzyme, such as the Cas9 protein.
  • the Cas9 protein may be Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes Cas9, Streptococcus thermophilus Cas9, or a mutant thereof.
  • the Cas9 protein may be, for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the Cas9 protein may also be a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid has been added, deleted, and/or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and which binds to DNA in a guide RNA-dependent manner.
  • the Cas9 protein may also be a protein consisting of an amino acid sequence that has 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and which binds to DNA in a guide RNA-dependent manner.
  • genes that can be targeted by genome editing there are no particular restrictions on the genes that can be targeted by genome editing, as long as the gene is one for which disruption, insertion, or replacement is desired.
  • the polynucleotide encoding the genome editing system may be contained in the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention.
  • the composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention may contain the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention, which includes a polynucleotide encoding the genome editing system (hereinafter, sometimes referred to as the "IPT and genome editing system-expressing nucleic acid construct").
  • the polynucleotide encoding the genome editing system may be contained in a nucleic acid construct different from the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention.
  • the composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention may contain, in addition to the IPT-expressing nucleic acid construct of the present invention, a nucleic acid construct containing a polynucleotide encoding the genome editing system (hereinafter sometimes referred to as a "genome editing system-expressing nucleic acid construct").
  • the IPT and genome editing system expression nucleic acid construct, and the genome editing system expression nucleic acid construct may further include expression control regions (promoter, enhancer, insulator, terminator, poly A addition signal, etc.) for the nuclease and/or guide RNA that constitute the genome editing system.
  • expression control regions promoter, enhancer, insulator, terminator, poly A addition signal, etc.
  • the promoters and terminators described in "1. IPT Expression Nucleic Acid Construct" can be used as the promoters and terminators for the nuclease and/or guide RNA.
  • composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention may be in the form of a mixture in which two or more components (e.g., an IPT-expressing nucleic acid construct and a genome editing system-expressing nucleic acid construct) are present together, or in the form of a kit in which two or more components (e.g., an IPT-expressing nucleic acid construct and a genome editing system-expressing nucleic acid construct) are present separately.
  • two or more components e.g., an IPT-expressing nucleic acid construct and a genome editing system-expressing nucleic acid construct
  • composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention may further contain a solvent such as water, a surfactant, a buffer, a pH adjuster, a solubilizing agent, a preservative, or the like.
  • a solvent such as water, a surfactant, a buffer, a pH adjuster, a solubilizing agent, a preservative, or the like.
  • composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention can be introduced into plant cells, such as plant tissue explants (e.g., leaf, stem, root, or seed segments, tissue explants containing dividing cells or cells capable of regeneration, etc.), or cultured cells derived therefrom (e.g., callus or protoplasts).
  • plant tissue explants e.g., leaf, stem, root, or seed segments, tissue explants containing dividing cells or cells capable of regeneration, etc.
  • cultured cells derived therefrom e.g., callus or protoplasts
  • composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention can be used in the method for promoting the production of regenerated plants and the method for producing regenerated plants of the present invention described below. Methods for using the composition for promoting the production of regenerated plants of the present invention are as described in "4. Method for promoting the production of regenerated plants” and “5. Method for producing regenerated plants.”
  • Method for promoting the production of regenerated plants of the present invention essentially comprises a construct introduction step and a regeneration step.
  • the plant cells may be plant tissue fragments (e.g., leaf, stem, root, or seed segments, tissue fragments containing dividing cells or cells capable of regeneration, etc.), or cultured cells derived therefrom (callus or protoplasts).
  • the plant cells may also be callus obtained in the callus formation step.
  • the regeneration process may involve culturing plant cells in a medium containing plant hormones, particularly auxin and/or cytokinin.
  • the medium used in the regeneration process may further contain gibberellin, a plant hormone that promotes elongation growth.
  • gibberellin a plant hormone that promotes elongation growth.
  • the type and concentration of plant hormones added to the medium can be adjusted appropriately depending on the type of plant and the type of tissue being cultured.
  • the medium used in the regeneration process may also further contain a selective agent.
  • the callus formation step is a step of culturing plant cells to form callus.
  • the plant cells may be plant tissue fragments (e.g., sections of leaves, stems, roots, or seeds, tissue fragments containing dividing cells or cells capable of regeneration, etc.), or cultured cells derived therefrom (e.g., protoplasts).
  • the plant cells may also be plant cells (e.g., plant tissue fragments or cultured cells derived therefrom) into which the composition for improving genome editing efficiency of the present invention has been introduced in the construct introduction step.
  • the callus formation process may involve culturing plant cells in a medium containing plant hormones, particularly auxins and cytokinins.
  • the amounts of auxin and cytokinin in the medium may be adjusted appropriately depending on the type of plant and the type of tissue to be cultured.
  • the auxin concentration may be 1 mg/L to 10 mg/L, 1 mg/L to 5 mg/L, or 1 mg/L to 3 mg/L
  • the cytokinin concentration may be 0.1 mg/L to 5 mg/L, 0.1 mg/L to 1 mg/L, or 0.3 mg/L to 0.7 mg/L.
  • the medium used in the callus formation step may also further contain a selective agent.
  • Culture conditions in the callus formation step may be static or shaking culture in the presence or absence of light, at 15 to 35°C, for example 25°C.
  • callus can be formed in either a medium containing or not containing plant hormones, but it is preferable to form callus in a medium containing plant hormones. By forming callus in a medium containing plant hormones, more callus can be obtained than when forming callus in a medium not containing plant hormones.
  • the regeneration step is a step of culturing the callus to induce regeneration and regenerate a plant body.
  • the callus may be the callus obtained in the callus formation step, or it may be callus into which the genome editing efficiency improving composition of the present invention has been introduced in the construct introduction step.
  • regeneration can be induced in either a medium containing or not containing plant hormones, but regeneration in a medium containing plant hormones is preferable.
  • regeneration in a medium containing plant hormones By regenerating in a medium containing plant hormones, more regenerated individuals can be obtained than when regenerating in a medium not containing plant hormones.
  • the shoot induction step is a step of culturing plant cells to induce shoot formation.
  • the plant cells may be plant tissue explants (e.g., leaf, stem, root, or seed segments, tissue explants containing dividing cells or cells capable of regeneration, etc.), or cultured cells derived therefrom (e.g., protoplasts).
  • the plant cells may be plant cells (e.g., plant tissue explants or cultured cells derived therefrom) into which the composition for improving genome editing efficiency of the present invention has been introduced in the construct introduction step.
  • the shoot induction step may involve culturing plant tissue explants in a medium containing a plant hormone, particularly cytokinin.
  • the amount of cytokinin in the medium may be adjusted appropriately depending on the type of plant and the type of tissue being cultured, but may be, for example, 0.1 mg/L to 10 mg/L, 0.5 mg/L to 5 mg/L, or 1 mg/L to 3 mg/L.
  • the medium used in the shoot induction step may further contain gibberellin, for example, in an amount of 0.1 mg/L to 0.9 mg/L, 0.1 mg/L to 0.7 mg/L, or 0.1 mg/L to 0.5 mg/L.
  • the medium used in the shoot induction step may also further contain a selective agent.
  • the culture in the shoot induction step can be carried out in the presence of light at 15 to 35°C, for example, 25°C.
  • the shoot elongation step is a step of elongating the shoot formed in the shoot induction step.
  • the shoot elongation step may include culturing the shoot in a medium containing a plant hormone, particularly cytokinin.
  • the amount of cytokinin in the medium may be appropriately adjusted depending on the type of plant and the type of tissue to be cultured, and may be, for example, 0.1 mg/L to 0.9 mg/L or 0.3 mg/L to 0.7 mg/L.
  • the medium used in the shoot elongation step may further contain gibberellin in an amount of, for example, 0.1 mg/L to 10 mg/L, 0.5 mg/L to 5 mg/L, or 1 mg/L to 3 mg/L.
  • the medium used in the shoot elongation step may also further contain a selective drug.
  • the culture in the shoot elongation step may be carried out in the presence of light at 15 to 35°C, for example, 25°C.
  • the present invention provides a method for producing a genome-edited plant (hereinafter, sometimes referred to as the "genome-edited plant production method of the present invention").
  • the genome-edited plant production method of the present invention includes a construct introduction step as an essential step.
  • the genome-edited plant production method of the present invention may include, as optional steps, a callus formation step and a regeneration step.
  • the genome-edited plant production method of the present invention may include, for example, (i) a construct introduction step, and (ii) a regeneration step consisting of a callus formation step and a regeneration step, in the order described.
  • the genome-edited plant production method of the present invention may also include, for example, a regeneration step consisting of (i) a callus formation step, (ii) a construct introduction step, and (iii) a regeneration step, in the order described.
  • the genome-edited plant production method of the present invention may also include, as optional steps, a shoot induction step and a shoot elongation step.
  • the genome-edited plant production method of the present invention may include, for example, (i) a construct introduction step, and (ii) a regeneration step consisting of a shoot induction step and a shoot elongation step, in the order described.
  • the genome-edited plant production method of the present invention may include a selection step as an optional step.
  • construct introduction process, regeneration process, callus formation process, redifferentiation process, shoot induction process, and shoot elongation process are as described for the method for improving genome editing efficiency of the present invention.
  • the “selection process” is a process in which genomic DNA is extracted from the regenerated plants obtained in the regeneration process, and genome-edited plants into which the desired modification has been introduced are selected.
  • “Desired modification” refers to the modification that the genome editing system introduced into the plant cells in the construct introduction process is intended to introduce into the genomic DNA. Whether the desired modification has been introduced into the genomic DNA can be evaluated by any known means. For example, using the extracted genomic DNA as a template, a nucleic acid amplification reaction is performed on the region of the genomic DNA containing the desired modification. The presence or absence of the desired modification can be determined by sequencing the base sequence of the obtained amplified product, or by treating the amplified product with a restriction enzyme, or by other methods.
  • regenerated plants with morphological abnormalities may be excluded from the targets for evaluation of the presence or absence of the desired modification.
  • Regenerated plants with morphological abnormalities are likely to have the IPT gene introduced into their genomic DNA.
  • ⁇ Production Example 1 Construction of IPT non-expressing genome editing vector> A pUC19 vector containing an expression cassette (PPcUbi-Cas9-Pea3A) linking the parsley ubiquitin promoter (PPcUbi) (SEQ ID NO: 17), the Streptococcus pyogenes-derived Cas9 gene (SEQ ID NO: 4), and the pea (Pisum sativum; P. sativum)-derived Pea3A terminator (SEQ ID NO: 20) was prepared by chemical synthesis at GenScrIPT.
  • PPcUbi-Cas9-Pea3A an expression cassette linking the parsley ubiquitin promoter (PPcUbi) (SEQ ID NO: 17), the Streptococcus pyogenes-derived Cas9 gene (SEQ ID NO: 4), and the pea (Pisum sativum; P. sativum)-derived Pea3A terminator (SEQ ID
  • This pUC19 vector and the pLC41 vector were treated with restriction enzymes BamHI-HF (New England Biolad), and then ligated using a Ligation Long kit (Takara). This resulted in a vector (pLC41-PPcUbi-Cas9 vector) in which PPcUbi-Cas9-Pea3A was inserted on the T-DNA between the left border (LB) and right border (RB) of the pLC41 vector.
  • This pZD-dxCas9 plasmid was digested with restriction enzymes PmeI and SbfI-HF (New England Biolad) to excise the gRNA expression cassette (SEQ ID NO: 6).
  • This gRNA expression cassette was ligated to the pLC41-PPcUbi-Cas9 vector, which had been opened by restriction enzyme digestion with PmeI and SbfI-HF, using a Ligation Long kit (Takara) to obtain the pLC41-gRNA-PPcUbi-Cas9 vector (hereinafter sometimes referred to as the "IPT non-expressing genome editing vector").
  • the structure of the T-DNA (SEQ ID NO: 21) of this vector is shown in Figure 1A.
  • the PPcUbi, Cas9, and Pea3A sequences were designed with reference to the pZH-FFCas9 vector described in Mikami et al., 2015, Plant Mol Biol, 88(6):561-572.
  • PNative-IPT expression genome editing vector Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens) derived IPT gene native promoter (PNative) (SEQ ID NO: 16), Agrobacterium tumefaciens derived IPT gene (SEQ ID NO: 2), Pea3A terminator (SEQ ID NO: 20) was linked to the expression cassette (PNative-IPT-Pea3A) pUC19 containing was prepared by chemical synthesis by GenScrIPT Co.
  • PNative is derived from the promoter sequence upstream of the IPT gene sequence (NCBI accession numbers: X14410 X17432) present in the DNA of the Agrobacterium tumefaciens A281 strain (patent number 3905607), which is registered with the DDBJ.
  • the sequence of PNative-IPT-Pea3A is a 1,408 bp sequence amplified by PCR using the forward primer: CCCGTTACAAGTATTGCACGTTTTGT (SEQ ID NO: 28) and the reverse primer: CTAATACATTCCGAACGGAT (SEQ ID NO: 29), with the Pea3A sequence linked downstream of the PNative-IPT sequence.
  • PPcUbi-IPT expression genome editing vector Construction of PPcUbi-IPT expression genome editing vector> PPcUbi (SEQ ID NO: 17), IPT gene (SEQ ID NO: 2), Pea3A (SEQ ID NO: 20) were amplified by PCR and introduced into the pLC41-gRNA-PPcUbi-Cas9 vector in the form of PPcUbi-IPT-Pea3A, which was treated with the restriction enzyme SpeI-HF using NEBuilder (New England Biolad).
  • pLC41-gRNA-PPcUbi-Cas9-PPcUbi-IPT vector hereinafter sometimes referred to as "PPcUbi-IPT expression genome editing vector").
  • the structure of the T-DNA (SEQ ID NO: 23) of this vector is shown in Figure 1B.
  • P35S-IPT expression genome editing vector The cauliflower mosaic virus-derived 35S promoter (P35S) (SEQ ID NO: 18), IPT gene (SEQ ID NO: 2), and Pea3A (SEQ ID NO: 20) were amplified by PCR and introduced into the pLC41-gRNA-PPcUbi-Cas9 vector in the form of P35S-IPT-Pea3A, which had been treated with the restriction enzyme SpeI-HF using NEBuilder, to obtain the pLC41-gRNA-PPcUbi-Cas9-P35S-IPT vector (hereinafter sometimes referred to as the "P35S-IPT expression genome editing vector").
  • the structure of the T-DNA (SEQ ID NO: 24) of this vector is shown in Figure 1B.
  • P35S was amplified (845 bp) using the forward primer: GCCTCGAGTCTAGAGATTAGCCT (SEQ ID NO: 32) and the reverse primer: TAGAGTCCCCCCGTGTTCTCT (SEQ ID NO: 33).
  • P2x35S-IPT expression genome editing vector Construction of P2x35S-IPT expression genome editing vector>
  • the 2x35S promoter (P2x35S) (SEQ ID NO: 19), a modified promoter with enhanced expression of P35S, the IPT gene (SEQ ID NO: 2), and Pea3A (SEQ ID NO: 20) were amplified by PCR and introduced into the pLC41-gRNA-PPcUbi-Cas9 vector in the form of P2x35S-IPT-Pea3A, which was treated with the restriction enzyme SpeI-HF using NEBuilder, to obtain the pLC41-gRNA-PPcUbi-Cas9-P2x35S-IPT vector (hereinafter sometimes referred to as the "P2x35S-IPT expression genome editing vector").
  • the structure of the T-DNA (SEQ ID NO: 25) of this vector is shown in Figure 1B.
  • P2x35S was amplified (759 bp) using pZD-dxCas9 (Kusano et al., 2018, Scientific Reports, 8, 13753) as a template with the forward primer: TTGCCAACATGGTGGAGCAC (SEQ ID NO: 34) and the reverse primer: ACTAGTCCGGCCTCTCCAAA (SEQ ID NO: 35).
  • Example 1 Effect of IPT on promoting the production of regenerated plants (1) To verify the effect of IPT in tissue culture, the following experiment was carried out.
  • Potatoes were transformed using Agrobacterium carrying the non-IPT expression genome-editing vector prepared in Production Example 1 or the PPcUbi-IPT expression genome-editing vector prepared in Production Example 3.
  • Potato transformation was carried out according to the Agrobacterium method described by Craze et al., Current Protocols in Plant Biology, 2018, Volume 3, Issue 1, pp. 33-41, with some modifications.
  • leaf pieces (area 0.3-0.5 cm 2 ) were aseptically excised from leaves of cultured potato (Solanum tuberosum) seedlings cultured from shoot tips in a culture room (25°C, 16 hours light/8 hours dark).
  • the Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain into which the non-IPT-expressing genome-editing vector prepared in Production Example 1 or the PPcUbi-IPT-expressing genome-editing vector prepared in Production Example 3 had been introduced by electroporation, was spread on YP medium (Yeast Extract 5 g/L, Bacto Peptone 10 g/L, NaCl 5 g/L) containing 50 mg/L kanamycin and cultured at 28°C for 1 day. After that, the strain was transferred to liquid medium PCM (Craze et al., Current Protocols in Plant Biology, 2018, Volume 3, Issue 1, pp.
  • YP medium Yeast Extract 5 g/L, Bacto Peptone 10 g/L, NaCl 5 g/L
  • the PCM medium contains 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) (synthetic auxin) 2 mg/L, zeatin (cytokinin) 0.5 mg/L, MS medium containing vitamins (Duchefa Biochemie) 4.4 g/L, MES 500 mg/L, sucrose 20 g/L, and agar 5 g/L, and is adjusted to pH 5.7 with NaOH.
  • 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
  • zeatin cytokinin
  • MES 500 mg/L sucrose 20 g/L
  • agar 5 g/L agar 5 g/L
  • the leaf pieces were immersed in the Agrobacterium suspension and left to stand for 10 minutes. The leaf pieces were then transferred onto filter paper to remove excess suspension, and the leaf pieces were then placed with their surface facing upwards on co-cultivation medium PCM (Craze et al., Current Protocols in Plant Biology, 2018, Volume 3, Issue 1, pp. 33-41) containing 140 ⁇ M acetosyringone, and cultured at 25°C under illumination for 3 days.
  • PCM co-cultivation medium
  • PSM medium contains 0.5 mg/L zeatin (cytokinin), 2 mg/L gibberellic acid, 4.4 g/L MS medium containing vitamins (Duchefa Biochemie), 500 mg/L MES, 20 g/L sucrose, and 5 g/L agar, and is adjusted to pH 5.7 with NaOH.
  • the cultures were observed under a microscope and the number of leaf segments that were confirmed to have redifferentiated into plants (number of redifferentiated leaf segments) was counted, and the ratio of the number of redifferentiated leaf segments to the number of inoculated leaf segments was calculated as an index of regeneration efficiency.
  • the number of leaf segments that had grown until the redifferentiated individuals formed morphologically normal leaves (excluding multiple shoots) was counted as the number of shoot-forming leaf segments, and the ratio of the number of shoot-forming leaf segments to the number of inoculated leaf segments was calculated.
  • the ratio of the number of shoot-forming leaf segments to the number of inoculated leaf segments can be used as an index of the rate at which redifferentiated individuals are generated.
  • Figure 2 shows an example of cultured tissue four weeks after Agrobacterium inoculation.
  • Table 1 also shows the number of regenerated leaf segments, the number of leaf segments that formed shoots, and their ratio to the number of inoculated leaf segments.
  • the ratio of the number of regenerated leaf disks to the number of inoculated leaf disks was approximately 8% higher than in the test area where the non-IPT expression genome-editing vector was introduced. This indicates that regeneration is induced by expressing IPT.
  • the ratio of the number of leaf discs that formed shoots to the number of inoculated leaf discs was approximately eight times higher than in the test area where the non-IPT expression genome-editing vector was introduced. This indicates that expressing IPT can promote the generation of regenerated individuals (regenerated plants).
  • a vector containing T-DNA that includes a polynucleotide encoding a genome editing system is introduced into a plant, the following will occur: individuals in which the desired mutation has been introduced and the T-DNA has been integrated into the genome; individuals in which the desired mutation has been introduced and the T-DNA has not been integrated into the genome; individuals in which the desired mutation has not been introduced and the T-DNA has been integrated into the genome; and individuals in which the desired mutation has not been introduced and the T-DNA has not been integrated into the genome.
  • Plants with the IPT gene integrated into their genome typically exhibit morphological abnormalities such as multiple shoots. Therefore, in test plots where the PPcUbi-IPT expression genome editing vector (a vector containing a genome editing system and T-DNA containing a polynucleotide encoding IPT) was introduced, it is highly likely that individuals that formed normal leaves did not have T-DNA integrated into their genome. Therefore, it can be said that the above-mentioned effect of IPT in promoting the production of regenerated individuals also occurs in individuals that do not have the IPT gene integrated into their genome.
  • the PPcUbi-IPT expression genome editing vector a vector containing a genome editing system and T-DNA containing a polynucleotide encoding IPT
  • Example 2 Effect of IPT on promoting the production of regenerated plants (2) The following experiment was carried out to compare the promoting effect of IPT expression under different promoters on the production of regenerated plants.
  • Agrobacterium carrying the non-IPT expression genome editing vector, PNative-IPT expression genome editing vector, PPcUbi-IPT expression genome editing vector, P35S-IPT expression genome editing vector, or P2x35S-IPT expression genome editing vector prepared in Production Examples 1 to 5 was inoculated into potato leaf pieces, and the leaf pieces were cultured on coculture medium PCM for 3 days, then on callus formation medium PCM for 3 days, and then on regeneration medium PSM.
  • the number of leaf segments in which regeneration was confirmed was counted, and the ratio of the number of redifferentiated leaf segments to the number of inoculated leaf segments was calculated as an index of regeneration efficiency.
  • the number of leaf segments that had grown until the redifferentiated individuals had formed morphologically normal leaves (excluding multiple shoots) was counted as the number of shoot-forming leaf segments, and the ratio of the number of shoot-forming leaf segments to the number of inoculated leaf segments was calculated as an index of the growth rate of the redifferentiated individuals.
  • the ratio of the number of leaf segments that formed shoots to the number of inoculated leaf segments was 2.2%
  • the ratios of the number of leaf segments that formed shoots to the number of inoculated leaf segments were 46.2%, 57.7%, 70.8%, and 55.1%, respectively.
  • IPT can promote the generation of regenerated individuals (regenerated plants), and that the growth of regenerated individuals can be significantly promoted when IPT is expressed using high-expression promoters such as PPcUbi, P35S, and P2x35S.
  • Example 3 Effect of IPT on promoting the production of regenerated plants (3) An experiment similar to that of Example 2 was carried out, except that transformation was carried out using a potato variety, "Sassy,” different from that used in Example 2. The results are shown in Table 3.
  • the ratio of the number of regenerated leaf pieces to the number of inoculated leaf pieces was 32.0%
  • the ratio of the number of regenerated leaf pieces to the number of inoculated leaf pieces was 64.0%, 80.0%, 72.0%, and 76.0%, respectively. Therefore, the regeneration-inducing effect of the IPT gene was confirmed in the potato cultivar "Sassy.”
  • the ratio of the number of leaf segments that formed shoots to the number of inoculated leaf segments was 16.0%
  • the ratios of the number of leaf segments that formed shoots to the number of inoculated leaf segments were 48.0%, 56.0%, 48.0%, and 52.0%, respectively. Therefore, the effect of the IPT gene in promoting the production of regenerated plants was confirmed in the potato cultivar "Sassy.”
  • Example 4 Effect of IPT on promoting the production of regenerated plants (4) The following experiment was carried out to confirm whether the promotion of regenerated plant production by IPT observed in the potato tissue culture method in Examples 1 to 3 can also be observed in the soybean tissue culture method.
  • GUS-bar expression vector A vector (hereinafter referred to as "GUS-bar expression vector") having a GUS gene expression cassette and a bar gene expression cassette on the T-DNA of binary vector pLC41 (Genbank accession No. LC215698) was prepared.
  • the GUS gene expression cassette contained in the GUS-bar expression vector contains a cauliflower mosaic virus-derived 35S promoter (P35S) (SEQ ID NO: 38), a GUS gene mediated by a catalase intron from castor bean (Ricinus communis) (SEQ ID NO: 39) (Ohta et al., 1990, Plant Cell Physiol., 31(6); 805-813), and a Nos terminator (Tnos) (SEQ ID NO: 40).
  • the bar gene expression cassette contained in the GUS-bar expression vector contains a cauliflower mosaic virus-derived 35S promoter (P35S) (SEQ ID NO: 41), a bar gene (SEQ ID NO: 42), and a 35S terminator (T35S) (SEQ ID NO: 43).
  • the bar gene is a drug resistance gene that confers resistance to phosphinothricin to plants.
  • bar-IPT expression vector A vector (hereinafter referred to as "bar-IPT expression vector") having a bar gene expression cassette and an IPT gene expression cassette on the T-DNA of binary vector pLC41 (Genbank accession No. LC215698) was prepared.
  • the bar gene expression cassette contained in the bar-IPT expression vector is identical to the bar gene expression cassette contained in the GUS-bar expression vector.
  • the IPT gene expression cassette contained in the bar-IPT expression vector contains a maize ubiquitin promoter (PZmUbi) (SEQ ID NO: 44), an IPT gene (SEQ ID NO: 2), and a Nos terminator (Tnos) (SEQ ID NO: 45).
  • Agrobacterium tumefaciens EHA105 strains carrying the GUS-bar expression vector or bar-IPT expression vector were precultured on YP agar medium (Ishida et al., 2007, Nature Protocols, 2:1614-1621) for one day. The cultured Agrobacterium was then suspended in Agrobacterium suspension medium (Paz et al., 2006, Plant Cell Reports, 25(3):206-213) and used as the inoculum source.
  • the cotyledons were immersed in the inoculum and stored at room temperature for 15 minutes.
  • the Agrobacterium-inoculated cotyledons were then placed on a coculture medium (Paz et al., 2006, Plant Cell Reports, 25(3):206-213) (1/10 B5 salts, B5 vitamins, 7.5 ⁇ M 6-benzylaminopurine (BAP), 0.7 ⁇ M gibberellic acid ( GA ), 20 mM MES, 3% sucrose, 200 ⁇ M acetosyringone, 100-400 mg/L cysteine, 154 mg/L dithiothreitol, pH 5.4) and cultured at 25°C for 3 days under illumination.
  • the cotyledons were then placed on SI medium (shoot induction medium) (Paz et al., 2006, Plant Cell Reports, 25(3):206-213) (B5 salts, B5 vitamins, MSIII iron stock, 3% sucrose, 3 mM MES, 5.0 ⁇ M BAP, 50 mg/L timentin, 200 mg/L cefotaxime, 50 mg/L vancomycin, pH 5.7) so that the cotyledonary nodes were buried in the medium, and cultured at 25°C under illumination for 2 weeks.
  • the grown stems and leaves were removed, and the cotyledons were placed on SI medium containing 5 mg/L phosphinothricin and cultured at 25°C under illumination for 2 weeks.
  • Table 4 shows the number of cotyledonary nodes inoculated with Agrobacterium, the number of cotyledonary nodes that formed shoots after two weeks of culture on shoot elongation medium, and the total number of shoots formed.
  • Agrobacterium carrying either the non-IPT expression genome-editing vector prepared in Production Example 1 or the PPcUbi-IPT expression genome-editing vector prepared in Production Example 3 was inoculated onto potato leaf pieces, which were then cultured on coculture medium PCM for three days, then on callus formation medium PCM for three days, and then on regeneration medium PSM.
  • PRM rooting medium
  • DNA extraction was performed as follows: 300 ⁇ l of DNA extraction buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 mM EDTA (pH 8.0), 25 mM Back, 0.05% SDS), 2-5 mm2 leaf segments of the plant to be analyzed, and two 5 mm stainless steel beads were added to each well of a 96-well plate, and the mixture was crushed at 1000 rpm for 1 minute and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. 50 ⁇ l of the supernatant was then saved as the DNA extract.
  • DNA extraction buffer 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 mM EDTA (pH 8.0), 25 mM Back, 0.05% SDS
  • 2-5 mm2 leaf segments of the plant to be analyzed 2-5 mm2 leaf segments of the plant to be analyzed
  • two 5 mm stainless steel beads were added to each well of a 96-well plate, and the mixture was crushed at 1000 rpm for 1 minute and centrifuged at
  • CLEAVED AMPLIFIED POLYMORPHIC SEQUENCE (CAPS) analysis was used to evaluate whether mutations in the target genomic sequence due to genome editing had occurred in the regenerated individuals.
  • the target genomic sequence within the GBSS1 gene was amplified by PCR using primers GBSS1-Fw: CACTTTGTGTCAAGAAGCCAAAC (SEQ ID NO: 36) and GBSS1-Rv: TTTGACCTGCAGATAAAGTAGCG (SEQ ID NO: 37).
  • the PCR reaction mixture was prepared by adding sterile distilled water to a total volume of 10 ⁇ l, containing 0.8 ⁇ l of DNA extract, 2.5 pmol of each primer, 0.2 U of KOD FX NEO, 5 ⁇ l of 2x PCR Buffer for KOD FX Neo, and 2 ⁇ l of 2 mM dNTPs.
  • the PCR reaction was performed at 94°C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98°C for 15 seconds and 68°C for 1 minute.
  • the IPT gene was integrated into approximately 20% of the analyzed individuals.
  • the PPcUbi-IPT expression genome editing vector in the experimental group where the PPcUbi-IPT expression genome editing vector was introduced, there were 4 edited individuals in which the IPT gene was not integrated into their genome, accounting for 4.9% (4/102) of the analyzed individuals.
  • the PPcUbi-IPT expression genome editing vector in the experimental group where the PPcUbi-IPT expression genome editing vector was introduced, there were 11 edited individuals in which the IPT gene was not integrated into their genome, accounting for 4.0% (11/274) of the analyzed individuals. Therefore, improved genome editing efficiency was observed even in individuals in which IPT was not integrated into their genome.
  • Example 7 Genome editing efficiency improvement effect of IPT (2)> An experiment similar to that of Example 6 was carried out, except that a different potato variety, "Sassy,” was used. The results are shown in Table 8.

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Abstract

植物組織片から植物体を再生させるのに要する期間を短縮する手段、又は植物におけるゲノム編集効率を向上させる手段の提供。　本発明は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物からなる、植物組織片由来の再生植物体の生成促進剤を提供する。本発明はまた、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物からなる、植物ゲノム編集効率向上剤を提供する。

Description

ＩＰＴ発現核酸構築物
　本発明は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物に関する。本発明はまた、前記核酸構築物からなる植物組織片由来の再生植物体の生成促進剤、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進する方法、及び植物組織片由来の再生植物体を作出する方法に関する。本発明はさらに、前記核酸構築物からなる植物ゲノム編集効率向上剤、植物におけるゲノム編集効率を向上させる方法、及びゲノム編集植物を作出する方法に関する。
　植物のゲノム編集個体の作出は、例えば、ゲノム編集系をコードする遺伝子をアグロバクテリウム法等により植物組織片に導入し、植物組織片からカルスを形成させ、カルスから植物体を再生することによって行われる（非特許文献１）。しかしながら、このような組織培養法を用いたゲノム編集個体の作出方法には多大な時間と労力が必要となる他、ゲノム編集効率が低いという問題がある。したがって、当該方法にはさらなる改良が必要とされている。
　一方、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）は、植物ホルモンであるサイトカイニンの生合成に関与する酵素であり、アグロバクテリウム由来のＩＰＴ遺伝子が植物のゲノムに組み込まれると葉や茎などにおいて形態異常が生じることが知られている。
　ＩＰＴは、外来ＤＮＡの組込みマーカーとして使用できることが報告されている。例えば、非特許文献２には、目的遺伝子とＩＰＴ遺伝子を植物に共導入し、形態異常を指標として遺伝子組換え体を選抜することが記載されている。また、特許文献１には、ＩＰＴ遺伝子とゲノム編集酵素遺伝子を導入した植物細胞に由来する再分化個体において、形態異常などを指標として、ゲノムに外来遺伝子が組み込まれた個体を除去することにより、外来遺伝子がゲノムに組み込まれていないゲノム編集個体を取得することが記載されている。
国際公開第２０１９／１０３０３４号
Ｍｅｌａｎｉｅ　Ｃｒａｚｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：３３－４１ 海老沼宏安ら、１９９７、化学と生物、３５：７２－７４
　本発明は、植物組織片から植物体を再生させるのに要する期間を短縮する手段、又は植物におけるゲノム編集効率を向上させる手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＩＰＴ遺伝子が導入された植物組織片から植物体を再生した場合、ＩＰＴ遺伝子が導入されていない植物組織片から植物体を再生した場合に比べ、再生植物体の生成が促進されることを見い出した。本発明者らはまた、ＩＰＴ遺伝子及びゲノム編集系をコードする遺伝子を植物細胞に導入した場合、ゲノム編集系をコードする遺伝子単独を植物細胞に導入した場合に比べ、ゲノム編集効率が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］　イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物からなる、植物ゲノム編集効率向上剤。
［２］　プロモーターが高発現プロモーターである、［１］に記載の植物ゲノム編集効率向上剤。
［３］　前記核酸構築物がベクターである、［１］に記載の植物ゲノム編集効率向上剤。
［４］　［１］～［３］のいずれか１つに記載の植物ゲノム編集効率向上剤を含む、植物ゲノム編集効率向上用組成物。
［５］　ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、［４］に記載の植物ゲノム編集効率向上用組成物。
［６］　植物におけるゲノム編集効率を向上させる方法であって、［４］又は［５］に記載の組成物を植物細胞に導入する構築物導入工程を含む、方法。
［７］　ゲノム編集植物を作出する方法であって、［４］又は［５］に記載の組成物を植物細胞に導入する構築物導入工程を含む、方法。
［８］　［４］又は［５］に記載の組成物を植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入する構築物導入工程、及び
　前記組成物を導入した植物組織片又はそれに由来する培養細胞を培養して植物体を再生させる再生工程
を含む、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］　前記再生工程が、植物組織片又はそれに由来する培養細胞を植物ホルモン含有培地で培養することを含む、［８］に記載の方法。
［１０］　前記再生工程で得られた再生植物体からゲノムＤＮＡを抽出し、目的の改変が導入されたゲノム編集植物を選抜する工程をさらに含む、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］　イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物からなる、植物組織片由来の再生植物体の生成促進剤。
［１２］　プロモーターが高発現プロモーターである、［１１］に記載の再生植物体の生成促進剤。
［１３］　前記核酸構築物がベクターである、［１１］又は［１２］に記載の再生植物体の生成促進剤。
［１４］　［１１］～［１３］のいずれか１つに記載の再生植物体の生成促進剤を含む、植物組織片由来の再生植物体の生成促進用組成物。
［１５］　植物組織片由来の再生植物体の生成を促進する方法であって、
　［１１］～［１３］のいずれか１つに記載の再生植物体の生成促進剤、又は［１４］に記載の組成物を植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入する構築物導入工程、及び
　再生植物体の生成促進剤又は前記組成物を導入した植物組織片又はそれに由来する培養細胞を培養して植物体を再生させる再生工程を含む、
方法。
［１６］　植物組織片由来の再生植物体を作出する方法であって、
　［１１］～［１３］のいずれか１つに記載の再生植物体の生成促進剤、又は［１４］に記載の組成物を植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入する構築物導入工程、及び
　再生植物体の生成促進剤又は前記組成物を導入した植物組織片又はそれに由来する培養細胞を培養して植物体を再生させる再生工程を含む、
方法。
［１７］　前記再生工程が、植物組織片又はそれに由来する培養細胞を植物ホルモン含有培地で培養することを含む、［１５］又は［１６］に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2024-055527号及び日本国特許出願番号2024-056233の開示内容を包含する。
　本発明の再生植物体の生成促進剤によれば、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進することができ、これにより植物組織片から植物体を再生させるのに要する期間を短縮することができる。本発明のゲノム編集効率向上剤によれば、植物におけるゲノム編集効率を向上させることができる。
製造例１～５で作製したベクターのＴ－ＤＮＡの構造を示す図である。（Ａ）ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクター。（Ｂ）ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、及びＰ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター。 （Ａ）ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクター、又は（Ｂ）ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入したアグロバクテリウムをジャガイモの葉片に接種し、当該葉片を共存培地ＰＣＭで３日間培養し、カルス化培地ＰＣＭで３日間培養した後、再分化培地ＰＳＭで培養したときの培養組織の例を示す写真である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＩＰＴ発現核酸構築物
１－１．概要
　本発明は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物（以下、「本発明のＩＰＴ発現核酸構築物」と称する。）に関する。本発明のＩＰＴ発現核酸構築物は、植物組織片由来の再生植物体の生成促進、及び／又は植物ゲノム編集効率向上に使用することができる。
１－２．定義
　本明細書において、「核酸構築物」は、タンパク質又はＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ等）を発現させることができるポリヌクレオチドを意味する。核酸構築物は、例えばベクターであってもよい。本明細書において、「ベクター」は、プラスミド、ウイルスベクター、人工染色体等を包含するが、好ましくはプラスミドである。プラスミドとしては、限定されないが、例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等）、ｐＬＣ系（ｐＬＣ４１等）、ｐＡＬ系（ｐＡＬ５１、ｐＡＬ１５６等）、ｐＢＩ系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２等）、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ等）が挙げられる。
１－３．構成
　本発明のＩＰＴ発現核酸構築物は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを必須の構成要素として含む。各構成要素について以下に説明する。
（１）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド
　イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）は、サイトカイニンの生合成に関与する酵素である。イソペンテニルトランスフェラーゼは、植物由来であってもよく、アグロバクテリウム等の細菌由来であってもよい。本明細書において、「アグロバクテリウム」はアグロバクテリウム属細菌を意味する。イソペンテニルトランスフェラーゼは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のイソペンテニルトランスフェラーゼであり得る。
　イソペンテニルトランスフェラーゼは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。イソペンテニルトランスフェラーゼはまた、配列番号１に示すアミノ酸配列において１～１０個、１～７個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、又は１個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列からなり、イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。イソペンテニルトランスフェラーゼはまた、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
　本明細書において、「（アミノ酸の）置換」は、好ましくは、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸間において、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似する保存的アミノ酸群内での置換である。例えば、低極性側鎖を有する無電荷極性アミノ酸群（Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ）、分枝鎖アミノ酸群（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ）、中性アミノ酸群（Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸群（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸群（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸群（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸群（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）内での置換が挙げられる。これらの群内でのアミノ酸置換であれば、ポリペプチドの性質に変化を生じにくいことが知られているため好ましい。
　本明細書において、「アミノ酸（の）配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列の比較範囲内におけるアミノ酸残基の種類が同一な部位の割合を示す数値である。アミノ酸配列同一性は、二つのアミノ酸配列の長さが異なる場合であっても、比較範囲内のアミノ酸一致度が最も高くなるように整列（アラインメント）することで算出可能である。限定はしないが、このような解析を行う代表的なアルゴリズムがＢＬＡＳＴである。ＢＬＡＳＴは、様々なソフトやＷｅｂサービスで利用可能である。例えば、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｙｘ．ｃｏ．ｊｐ／）、ＮＣＢＩ提供ＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）等を利用して、アミノ酸配列同一性を容易に算出することができる。また、ＢＬＡＳＴ以外にもＦＡＳＴＡと呼ばれるアルゴリズム等もあり、妥当な同一性が算出できれば利用可能である。
　イソペンテニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。イソペンテニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドはまた、配列番号２に示す塩基配列において１～１０個、１～７個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、又は１個の塩基が付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列からなり、かつイソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。イソペンテニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドはまた、配列番号２に示す塩基配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
　本明細書において「塩基（の）配列同一性」とは、前記アミノ酸配列同一性と同様に、二つの塩基配列の比較範囲内における塩基の種類が同一な部位の割合を示す数値である。塩基配列同一性は、二つの塩基配列の長さが異なる場合であっても、比較範囲内の塩基一致度が最も高くなるように整列（アラインメント）することで算出可能である。限定はしないが、前述のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡの他、ＭＵＭｍｅｒ等の解析アルゴリズムを塩基配列同一性の解析を行うことも可能である。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、二本鎖の核酸だけでなく、それを構成する正鎖（センス鎖）又は相補鎖（アンチセンス鎖）等の一本鎖を包含し、特に言及しない限り、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
（２）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター
　本明細書において、「作動可能に連結された」とは、プロモーターの下流にポリヌクレオチドが発現可能に結合していることを意味する。
　イソペンテニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターは、植物細胞において転写を誘導できるものであればよく、植物由来であっても、非植物由来であってもよい。プロモーターは、イソペンテニルトランスフェラーゼ遺伝子の天然のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然に存在するプロモーターであってもよく、改変プロモーターであってもよい。
　プロモーターは、例えば、構成的プロモーターであってもよい。本明細書において、「構成的プロモーター」とは、植物体全体（例えば、植物体の全組織又は全細胞）において生育時期に関わらず転写を誘導することができるプロモーターを意味する。
　プロモーターはまた、例えば、高発現プロモーターであってもよい。本明細書において、「高発現プロモーター」とは、配列番号１６に示すプロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシェンスＩＰＴ遺伝子の天然のプロモーター）の活性を超える活性を有するプロモーター、例えば、配列番号１６に示すプロモーターの活性の１．５倍以上（例えば、２倍以上、４倍以上、６倍以上、８倍以上、１０倍以上、２０倍以上、４０倍以上、６０倍以上、８０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、４００倍以上、６００倍以上、８００倍以上、又は１０００倍以上）の活性を有するプロモーターを意味する。プロモーター活性は、種々のレポーター遺伝子、例えばβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）等の遺伝子をプロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを用いてアグロバクテリウム法等により植物を形質転換した後、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。
　例えば、レポーター遺伝子がＧＵＳの場合には、宿主細胞内でのプロモーター活性は、蛍光基質を用いるＣａｓｔｌｅ＆Ｍｏｒｒｉｓの方法（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｂ５，１－１６（１９９４）；Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ＆Ｒ．Ａ．Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に従ってＧＵＳ活性を測定し、さらにＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８－２５４（１９７６））に従ってタンパク質量を測定して、ＧＵＳ活性をタンパク量当たりに換算する（ｎｍｏｌｅ　４－ＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎとして算出する）ことにより、確認することができる。
　プロモーターとしては、例えば、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）遺伝子プロモーター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシェンス由来ＩＰＴ遺伝子プロモーター）、ユビキチンプロモーター（例えば、パセリユビキチンプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの改変プロモーター（例えば、２ｘ３５Ｓプロモーター、Ｅｌ２－３５Ｓオメガプロモーター）、アクチンプロモーター（例えば、イネアクチンプロモーター）、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子プロモーター、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子プロモーター、タバコ由来感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）プロモーター、ＲｕＢｉｓｃｏプロモーター、Ｕ６プロモーター（例えば、シロイヌナズナＵ６プロモーター）等が挙げられる。プロモーターは、好ましくは高発現プロモーターであり得る。高発現プロモーターとしては、例えば、ユビキチンプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、及びＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの改変プロモーターが挙げられるが、好ましくは、パセリユビキチンプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、又は２ｘ３５Ｓプロモーターであり得る。
　プロモーターは、例えば、配列番号１６～１９及び４４のいずれか１つに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。プロモーターはまた、配列番号１６～１９及び４４のいずれか１つに示す塩基配列において１～２個又は１個の塩基が付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。プロモーターはまた、配列番号１６～１９及び４４のいずれか１つに示す塩基配列と９０％以上、９５％以上又は１００％の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
（３）その他の構成要素
　本発明のＩＰＴ発現核酸構築物は、プロモーター以外のイソペンテニルトランスフェラーゼの発現制御領域（エンハンサー、インシュレーター、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル等）を含んでもよい。「ターミネーター」としては、限定されないが、例えば、Ｐｅａ３Ａターミネーター、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）遺伝子ターミネーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子ターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子ターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーターが挙げられる。
　本発明のＩＰＴ発現核酸構築物は、薬剤耐性遺伝子を含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書において「薬剤耐性遺伝子」とは、特定の薬剤（本明細書では後述する選抜薬剤）に対する耐性を対象植物に付与する遺伝子をいう。限定はしないが、薬剤耐性遺伝子の具体例として、フォスフィノスライシン（ＰＰＴ：ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）（グルホシネート：Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）に対するｂａｒ遺伝子、ハイグロマイシンＢに対するハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ｈｐｔ遺伝子）、クロラムフェニコールに対するクロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシンに対するネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシンに対するカナマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
　本発明の核酸構築物は、アグロバクテリウム法により植物細胞に導入する場合、アグロバクテリウムＴ－ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）を更に含んでいることが望ましい。
１－４．製造方法
　本発明のＩＰＴ発現核酸構築物は、当業者であれば適宜公知の手法を用いて作製することができる。例えば、後述の実施例に示すように、遺伝子カセットを適当な制限酵素で切断し、骨格となる適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイト等に連結することにより作製することができる。また、Iｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング、ＴＡクローニング、二重交叉組換え（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）等の手法を用いても、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物は作製できる。さらに、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物においてコードされる遺伝子の塩基配列は、導入される植物細胞においてそれらの翻訳産物を効率良く発現させるため、当該細胞に合わせたコドンに最適化されていてもよい。
１－５．効果
　本発明のＩＰＴ発現核酸構築物は、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進することができ、また、植物においてゲノム編集効率を向上させることができる。
２．再生植物体の生成促進剤
２－１．概要
　本発明は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物からなる、植物組織片由来の再生植物体の生成促進剤（以下、「本発明の再生植物体の生成促進剤」と称する場合がある。）を提供する。
２－２．定義
　本明細書において、「植物組織片」は、植物体の一部を切り出した切片を意味する。植物組織片は、植物体再生能力を有する組織片であればよく、例えば、葉、茎、根、又は種子の切片を包含する。植物組織片は、例えば、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片、例えば、幼植物の胚軸、子葉節、茎頂、又は頂芽を含む組織片であり得るが、それに限定されるものではない。
　本明細書において、「再生植物体」は、植物組織片から再生した植物体を意味する。再生植物体は、例えば、植物組織片又はそれに由来する培養細胞（例えば、カルス）をオーキシン及び／又はサイトカイニンを含有する培地で培養することにより生成することができる。一般に、例えば、オーキシン及びサイトカイニンを含む培地でカルスを培養した場合、オーキシン及びサイトカイニンの濃度比に応じてカルスから茎葉又は根が再分化する。培地中のオーキシン比が高い場合根が再分化し、サイトカイニン比が高いと茎葉が再分化する。再生植物体は、不定芽、茎及び葉が再生又は再分化した植物体、根が再生又は再分化した植物体、葉、茎、及び根が再生又は再分化した植物体を包含するが、本発明により生成を促進する再生植物体は、好ましくは、葉及び茎が再生又は再分化した植物体、例えば形態正常な葉及び茎が再生又は再分化した植物体である。再生植物体は、ＩＰＴをコードするポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていてもよく、組み込まれていなくてもよい。
　本明細書において、「再生植物体の生成促進剤」とは、植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入することにより、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進する作用を有する剤を意味する。再生植物体の生成促進は、例えば、植物組織片からの再生植物体の生成の促進、又は植物組織片から形成したカルスからの再生植物体の生成の促進であり得る。本明細書において、「再生植物体の生成を促進する」とは、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチドを導入せずに植物組織片から再生植物体を生成した場合の再生植物体の生成量に比べ、再生植物体の生成量を増大させることを意味する。本明細書において、再生植物体の生成促進は、例えば、再生植物体の成長促進であり得る。したがって、本発明の再生植物体の生成促進剤は、例えば、再生植物体の成長促進剤であり得る。本明細書において、「再生植物体の成長促進剤」とは、植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入することにより、植物組織片由来の再生植物体の成長を促進する作用を有する剤を意味する。本明細書において、「再生植物体の成長促進」には、葉及び／又は茎の成長速度の促進が包含される。本明細書において、「再生植物体の成長を促進する」とは、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチドを導入せずに植物組織片から植物体を再生した場合の再生植物体の成長速度に比べ、再生植物体の成長速度を増大させることを意味する。
　本発明のＩＰＴ発現核酸構築物が植物組織片由来の再生植物体の生成促進作用を有するか否かは、例えば以下に述べるように評価できる。本発明のＩＰＴ発現核酸構築物を植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入し、これを所定期間培養して植物体を再生させる。シュートを形成した組織片数（シュート形成組織片数）を計数し、総組織片数に対するシュート形成組織片数の割合を算出する。コントロールとして、ＩＰＴ遺伝子を含まない点を除き同一の核酸構築物を用いて同様の操作を行う。本発明のＩＰＴ発現核酸構築物を導入したときの総組織片数に対するシュート形成組織片数の割合が、ＩＰＴ遺伝子を含まない核酸構築物を導入したときの総組織片数に対するシュート形成組織片数の割合に比べ、１．５倍以上（例えば、２倍以上、３倍以上、４倍以上、又は５倍以上）高い場合、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物は再生植物体の生成促進作用を有すると判定できる。カルスを経由して植物体を再生させる場合には、例えば、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物を植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入し、これを培養してカルスを形成させ、カルスを培養して植物体を再生することができる。そして、例えば、所定期間後に再生植物体が形態正常な葉及び茎（本明細書において「茎葉」と称すこともある。）を形成するまで成長した組織片数をシュート形成組織片数として計数し、総組織片数に対するシュート形成組織片数の割合を算出することができる。
２－３．構成
　本発明の再生植物体の生成促進剤は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物からなる。本発明のＩＰＴ発現核酸構築物については、「１．ＩＰＴ発現核酸構築物」に記載の通りである。
２－４．使用方法
　本発明の再生植物体の生成促進剤は、植物細胞、例えば植物組織片（例えば葉、茎、根、又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）、又はそれに由来する培養細胞（例えば、カルス又はプロトプラスト）に導入することができる。本発明の再生植物体の生成促進剤を導入した植物組織又はそれに由来する培養細胞から植物体を再生させることにより、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進させることができる。一実施形態では、本発明の再生植物体の生成促進剤を導入した植物組織片からカルスを形成させ、当該カルスから植物体を再生させ生育させることにより、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進させることができる。別の実施形態では、植物組織片由来のカルスに本発明の再生植物体の生成促進剤を導入し、当該カルスから植物体を再生させ生育させることにより、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進することができる。
　本発明の再生植物体の生成促進剤は、後述の本発明の再生植物体生成促進方法及び再生植物体作出方法に使用することができる。本発明の再生植物体の生成促進剤の使用方法の詳細については、「４．再生植物体生成促進方法」及び「５．再生植物体作出方法」に記載の通りである。
２－５．使用対象
　本発明の再生植物体の生成促進剤を導入する植物は、草本植物又は木本植物のいずれであってもよい。植物はまた、例えば、農業上重要な植物、例えば、穀類、野菜、果物等の作物植物や花卉植物であってもよい。
　植物は、コケ植物、シダ植物、裸子植物又は被子植物のいずれであってもよいが、好ましくは被子植物、例えば単子葉植物又は双子葉植物である。単子葉植物としては、例えば、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）植物（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム、コウリャン、芝草）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）植物（例えば、バナナ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）植物（例えば、ネギ、タマネギ、ニンニク、ニラ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）植物（例えば、ユリ、チューリップ）が挙げられる。また、双子葉植物としては、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物（例えば、キャベツ、ダイコン、ハクサイ、アブラナ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）植物（例えば、レタス、ゴボウ、キク）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）植物（例えば、ダイズ、落花生、エンドウ、インゲンマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ、ソラマメ、甘草）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）植物（例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ、ペチュニア）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）植物（例えば、イチゴ、リンゴ、ナシ、モモ、ビワ、アーモンド、スモモ、バラ、ウメ、サクラ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）植物（例えば、キュウリ、ウリ、カボチャ、メロン、スイカ）、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）植物（例えば、マンゴー、ピスタチオ、カシューナッツ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）植物（例えば、アボカド）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）植物（例えば、ミカン、グレープフルーツ、レモン、ユズ）、ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ）植物（例えば、サツマイモ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）植物（例えばチャノキ）、及びブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）植物（例えば、ブドウ）が挙げられる。本明細書において、植物は、好ましくは被子植物、より好ましくは双子葉植物、さらにより好ましくはナス科植物（例えばトマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ、又はペチュニア）、又はマメ科植物（例えば、ダイズ、落花生、エンドウ、インゲンマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ、ソラマメ、甘草）、最も好ましくはジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）及びダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）である。ジャガイモの品種としては、限定されないが、例えば、品種「サッシー」、「男爵薯」、「キタアカリ」、「メークイン」、「はるか」、「シンシア」、「ノーザンルビー」等が挙げられる。ダイズの品種としては、限定されないが、例えば、「Ｍａｐｌｅ　Ａｒｒｏｗ」、「フクユタカ」、「エンレイ」、「タチナガハ」、「ユキホマレ」等が挙げられる。
２－６．効果
　本発明の再生植物体の生成促進剤によれば、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進することができ、また、それにより植物組織片から植物体を再生させるのに要する期間を短縮することができる。例えば、ジャガイモの場合、本発明の再生植物体の生成促進剤を使用しない場合には、植物組織片からカルスを形成させ、カルスから植物体を再生させ、葉が展開するまで生育させるのに２～３ヶ月必要である。これに対し、本発明の再生植物体の生成促進剤を使用する場合、僅か１～２ヶ月で植物組織片からカルスを形成させ、カルスから植物体を再生させ、葉が展開するまで生育させることができる。
　このような効果は、ＩＰＴをコードするポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていない再生植物体でも生じる。
３．再生植物体生成促進用組成物
３－１．概要
　本発明は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物を含む、植物組織片由来の再生植物体の生成促進用組成物（以下、「本発明の再生植物体生成促進用組成物」と称する場合がある。）を提供する。本発明により生成を促進する再生植物体は、好ましくは、葉及び茎が再生又は再分化した植物体であり得る。
３－２．構成成分
　本発明の再生植物体生成促進用組成物は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物を必須の有効成分として含む。本発明の再生植物体生成促進用組成物は、任意の構成成分として、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。各構成成分について以下に説明する。
（１）ＩＰＴ発現核酸構築物
　本発明の再生植物体生成促進用組成物に用いるＩＰＴ発現核酸構築物は、本発明の再生植物体の生成促進剤であってもよい。本発明のＩＰＴ発現核酸構築物又は再生植物体の生成促進剤については、「１．ＩＰＴ発現核酸構築物」、「２．再生植物体の生成促進剤」に記載の通りである。本発明の再生植物体生成促進用組成物は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物が植物細胞に有効な量となるよう、植物細胞に直接導入するか、またはアグロバクテリウムなどの細菌を介して植物細胞に導入することが望ましい。
（２）ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチド
　本発明の再生植物体生成促進用組成物をゲノム編集植物の作出に用いる場合、本発明再生植物体生成促進用組成物は、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
　本明細書において、「ゲノム編集系」は、ゲノムＤＮＡ上の特定の部位に改変を生じさせ得る人工制限酵素システムである限り特に制限されない。人工制限酵素システムとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、ＰＰＲシステムが挙げられる。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ヌクレアーゼ（ＲＧＮ；ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、Ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ（ＳｇＲＮＡ））を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ガイドＲＮＡが標的部位に結合し、該結合部位に誘導されたＣａｓタンパク質によってＤＮＡを切断することができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９－７１，（２０１５））。
　また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに、脱アミノ化酵素であるデアミナーゼを付加した人工酵素複合体も、本発明に係るゲノム編集系として用いることができる（Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６）））。
　ＴＡＬＥＮシステムは、ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）に加えて転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用する（例えば、米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）。該システムを細胞内に導入することにより、ＴＡＬＥＮがＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキーム（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９（２）に従って設計することができる。
　ＺＦＮシステムは、ジンクフィンガーアレイを含むＤＮＡ結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用する（例えば、米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）。該システムを細胞内に導入することにより、ＺＦＮがＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。
　ＰＰＲシステムとしては、例えば、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）を使用することができる（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　５３：１１７１－１１７９（２０１２））。
　これらゲノム編集系の中でもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的部位の認識に核酸（ガイドＲＮＡ）を用いるため標的部位をより自由に選択でき、その調製も簡便であることから好ましい。なお、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いられるガイドＲＮＡの長さは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０塩基である。好ましい塩基長の上限としては、３０以下、より好ましくは２５以下、さらに好ましくは２２以下、最も好ましくは２０以下である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは２個以上（例えば、２個、３個、４個、又は５個）のガイドＲＮＡを使用してもよい。Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。また、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素が好ましく、例えば、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９、又はこれらの突然変異体であってもよい。
　Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。Ｃａｓ９タンパク質はまた、配列番号３に示すアミノ酸配列において１～１０個、１～７個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、又は１個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列からなり、ガイドＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合するタンパク質であってもよい。Ｃａｓ９タンパク質はまた、配列番号３に示すアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ガイドＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合するタンパク質であってもよい。
　ゲノム編集のターゲットとなる遺伝子は特に限定されず、その遺伝子の破壊又は挿入・置換が望まれるものであればよい。
　本発明の再生植物体生成促進用組成物において、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドは、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物に含まれていてもよい。すなわち、本発明の再生植物体生成促進用組成物は、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含む本発明のＩＰＴ発現核酸構築物（以下、「ＩＰＴ及びゲノム編集系発現核酸構築物」と称する場合がある。）を含んでもよい。
　或いは、本発明の再生植物体生成促進用組成物において、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドは、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物とは異なる核酸構築物に含まれていてもよい。すなわち、本発明の再生植物体生成促進用組成物は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物に加え、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物（以下、「ゲノム編集系発現核酸構築物」と称する場合がある。）を含んでもよい。
　ＩＰＴ及びゲノム編集系発現核酸構築物、並びにゲノム編集系発現核酸構築物は、ゲノム編集系を構成するヌクレアーゼ及び／又はガイドＲＮＡの発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル等）をさらに含んでもよい。ヌクレアーゼ及び／又はガイドＲＮＡのプロモーター及びターミネーターとしては、「１．ＩＰＴ発現核酸構築物」において述べたプロモーター及びターミネーターを使用することができる。
　本発明の再生植物体生成促進用組成物は、２種以上の構成成分（例えば、ＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物）が共に存在する混合物の形態であってもよく、２種以上の構成成分（例えば、ＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物）が分離して存在するキットの形態であってもよい。
（３）その他の構成成分
　本発明の再生植物体生成促進用組成物は、水等の溶媒、界面活性剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、溶解補助剤、又は保存剤等をさらに含んでもよい。
３－３．使用方法
　本発明の再生植物体生成促進用組成物は、植物細胞、例えば植物組織片（例えば葉、茎、根、又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）、又はそれに由来する培養細胞（例えば、カルス又はプロトプラスト）に導入することができる。本発明の再生植物体の生成促進用組成物を導入した植物組織又はそれに由来する培養細胞から植物体を再生させることにより、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進させることができる。一実施形態では、本発明の再生植物体生成促進用組成物を導入した植物組織片からカルスを形成させ、当該カルスから植物体を再生させ生育させることにより、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進させることができる。別の実施形態では、植物組織片由来のカルスに本発明の再生植物体生成促進用組成物を導入し、当該カルスから植物体を再生させ生育させることにより、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進することができる。
　本発明の再生植物体生成促進用組成物は、後述の本発明の再生植物体生成促進方法及び再生植物体作出方法に使用することができる。本発明の再生植物体生成促進用組成物の使用方法については、「４．再生植物体生成促進方法」及び「５．再生植物体作出方法」に記載の通りである。
３－４．使用対象
　本発明の再生植物体生成促進用組成物を導入する植物は、「２－５．使用対象」に記載の通りであり、例えば、コケ植物、シダ植物、裸子植物又は被子植物である。本発明の再生植物体生成促進用組成物を導入する植物は、好ましくは被子植物、より好ましくは双子葉植物、さらにより好ましくはナス科植物（例えばトマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ、又はペチュニア）、又はマメ科植物（例えば、ダイズ、落花生、エンドウ、インゲンマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ、ソラマメ、甘草）である。
３－５．効果
　本発明の再生植物体生成促進用組成物によれば、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進することができ、また、それにより植物組織片から植物体を再生させるのに要する期間を短縮することができる。このような効果は、ＩＰＴをコードするポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていない再生植物体でも生じる。
４．再生植物体生成促進方法
４－１．概要
　本発明は、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進する方法（以下、「本発明の再生植物体生成促進方法」と称する場合がある。）を提供する。本発明により生成を促進する再生植物体は、好ましくは、葉及び茎が再生又は再分化した植物体であり得る。
４－２．方法
　本発明の再生植物体生成促進方法は、構築物導入工程及び再生工程を必須の工程として含む。
　本発明の再生植物体生成促進方法は、任意選択の工程としてカルス形成工程及び再分化工程を含んでもよい。本発明の再生植物体生成促進方法は、例えば、（ｉ）構築物導入工程、並びに（ｉｉ）カルス形成工程及び再分化工程からなる再生工程を、記載された順番の通りに含み得る。本発明の再生植物体生成促進方法はまた、例えば、（ｉ）カルス形成工程、（ｉｉ）構築物導入工程、及び（ｉｉｉ）再分化工程からなる再生工程を、記載された順番通りに含み得る。
　本発明の再生植物体生成促進方法はまた、任意選択の工程としてシュート誘導工程及びシュート伸長工程を含んでもよい。本発明の再生植物体生成促進方法は、例えば、（ｉ）構築物導入工程、並びに（ｉｉ）シュート誘導工程及びシュート伸長工程からなる再生工程を、記載された順番通りに含み得る。
　各工程について以下に説明する。
（１）構築物導入工程
　構築物導入工程は、本発明の再生植物体の生成促進剤又は再生植物体生成促進用組成物を植物細胞に導入する工程である。
　本工程において、植物細胞は、植物組織片（例えば、葉、茎、根、又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）、又はそれに由来する培養細胞（カルス又はプロトプラスト）であってもよい。植物細胞はまた、カルス形成工程で得られたカルスであってもよい。
　本発明の再生植物体の生成促進剤又は再生植物体生成促進用組成物の植物細胞への導入は、例えば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法等の公知の方法を用いて行うことができる。アグロバクテリウム法による構築物導入は、例えば、構築物を導入したアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシェンス）の懸濁液に植物細胞を浸漬することにより行うことができる。
（２）再生工程
　再生工程は、本発明の再生植物体の生成促進剤又は再生植物体生成促進用組成物を導入した植物細胞（特に、植物組織片又はそれに由来する培養細胞）を培養して植物体を再生させる工程である。
　再生工程は、植物ホルモン、特にオーキシン及び／又はサイトカイニンを含有する培地で植物細胞を培養することを含んでもよい。
　本明細書において、「培地」は植物組織培養に通常用いられている培地であればよく、例えば、糖類、ビタミン、緩衝剤等を含む培地、例えば、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、ガンボルグＢ５培地、ホワイト培地、ニッチ培地、ＫＮＵＤＳＯＮ　Ｃ培地、ＳＢ培地、Ｒ２培地、Ｎ６培地、Ｔｕｌｅｅｋｅ培地等の基本培地が挙げられる。培地は固体培地又は液体培地であってもよい。
　本明細書において、「オーキシン」としては、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、及び２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）等が挙げられる。本明細書において、「サイトカイニン」としては、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、ゼアチン、ベンジルアデニン及びチジアズロン等が挙げられる。
　再生工程に用いる培地は、伸長成長を促進する植物ホルモンであるジベレリンを含んでもよい。本明細書において、「ジベレリン」としては、ＧＡ１～ＧＡ１３６が挙げられる。
　培地に添加する植物ホルモンの種類及び濃度は、植物の種類や培養する組織の種類に応じて適宜調整することができる。
　再生工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。本明細書において「選抜薬剤」とは、特定の薬剤遺伝子と組み合わせて、形質転換体の選抜に用いられる薬剤をいう。例えば、低分子化合物やポリペプチド等が該当する。一般的には、対象植物の発生や生育に負の影響を及ぼし得る薬剤が該当する。選抜薬剤の具体例として、ハイグロマイシンＢ、クロラムフェニコール、又はネオマイシンやカナマイシン等の抗生物質やフォスフィノスライシンのような除草剤有効成分が挙げられる。
（３）カルス形成工程
　カルス形成工程は、植物細胞を培養してカルスを形成する工程である。本明細書において、「カルス」は、特に、植物組織片（例えば葉、茎、根、又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）又はそれに由来する培養細胞（例えば、プロトプラスト）を培養することにより形成される細胞塊を意味する。カルスは例えば植物ホルモンであるオーキシン及びサイトカイニンを含有する培地で植物組織片又はそれに由来する培養細胞を培養することにより形成することができる。
　カルス形成工程に供する植物細胞は、植物組織片（例えば、葉、茎、根、又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）、又はそれに由来する培養細胞（例えば、プロトプラスト）であってもよい。植物細胞は、構築物導入工程で本発明の再生植物体の生成促進剤又は本発明の再生植物体生成促進用組成物を導入した植物細胞（例えば、植物組織片又はそれに由来する培養細胞）であってもよい。
　カルス形成工程は、植物ホルモン、特にオーキシン及びサイトカイニンを含有する培地で植物細胞を培養することを含んでもよい。
　カルス形成工程において、培地中のオーキシン及びサイトカイニンの量は、植物の種類や培養する組織の種類に応じて適切に調整すればよいが、例えば、オーキシンの濃度は１ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、又は１ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌとすることができ、サイトカイニンの濃度は、例えば、０．１ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、又は０．３ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌとすることができる。カルス形成工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。カルス形成工程における培養条件は、光存在下又は非存在下、１５～３５℃、例えば２５℃で静置又は振とう培養とすればよい。
　カルス形成工程では、カルスを未分化のまま維持し増殖させるため、形成されたカルスを継代培養してもよい。カルスの継代は、１～４週間毎に行うことが好ましい。
　なお、構築物導入工程後に本工程を行う場合、本工程に用いる植物細胞には、サイトカイニン合成酵素であるＩＰＴが導入されているため、植物ホルモンを含有しない培地、植物ホルモンを含有する培地のいずれにおいてもカルスを形成させることができるが、植物ホルモンを含有する培地でカルスを形成させることが好ましい。植物ホルモンを含有する培地でカルスを形成させることにより、植物ホルモンを含有しない培地でカルスを形成させる場合に比べ多くのカルスを取得し得る。
（４）再分化工程
　再分化工程は、カルスを培養して再分化を誘導し植物体を再生させる工程である。
　本工程において、カルスは、カルス形成工程で得られたカルスであってもよく、構築物導入工程で本発明の再生植物体の生成促進剤又は再生植物体生成促進用組成物が導入されたカルスであってもよい。
　再分化工程は、植物ホルモン、特にオーキシン及び／又はサイトカイニンを含有する培地でカルスを培養することを含んでもよい。培地中のオーキシン及び／又はサイトカイニンの濃度は、再分化させる組織、植物の種類、培養する組織の種類等によって適切に決定すればよい。
　例えば、カルスから茎葉を分化させる場合、オーキシンを含まず、サイトカイニンを含む培地を用いることができる。このとき、培地中のサイトカイニンの濃度は、例えば、０．１ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、又は０．３ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌとすることができる。再分化工程に用いる培地は、ジベレリンを、例えば０．１ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ又は１ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌの量で、さらに含んでもよい。再分化工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。
　本工程において、培地は、成長段階に応じて適切に変更してもよい。例えば、植物ホルモン（特にオーキシン及び／又はサイトカイニン）を含有する培地でカルスを培養し、植物体を再生させた後、植物ホルモンを含有しない培地に再生植物体を移してもよい。
　なお、本工程に用いるカルスは、サイトカイニン合成酵素であるＩＰＴが導入されているため、植物ホルモンを含有しない培地、植物ホルモンを含有する培地のいずれにおいても再分化を引き起こすことができるが、植物ホルモンを含有する培地で再分化させることが好ましい。植物ホルモンを含有する培地で再分化させることにより、植物ホルモンを含有しない培地で再分化させる場合に比べ多くの再分化個体を取得し得る。
（５）シュート誘導工程
　シュート誘導工程は、植物細胞を培養してシュート形成を誘導する工程である。本工程において、植物細胞は、植物組織片（例えば、葉、茎、根、又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）、又はそれに由来する培養細胞（例えば、プロトプラスト）であってもよい。本工程において、植物細胞は、構築物導入工程で本発明の再生植物体の生成促進剤又は本発明の再生植物体生成促進用組成物を導入した植物細胞（例えば、植物組織片又はそれに由来する培養細胞）であってもよい。
　シュート誘導工程は、植物ホルモン、特にサイトカイニンを含有する培地で植物組織片を培養することを含んでもよい。シュート誘導工程において、培地中のサイトカイニンの量は、植物の種類や培養する組織の種類に応じて適切に調整すればよいが、例えば、０．１ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、又は１ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌとすることができる。シュート誘導工程に用いる培地は、ジベレリンを、例えば０．１ｍｇ／Ｌ～０．９ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌ、又は０．１ｍｇ／Ｌ～０．５ｍｇ／Ｌの量で、さらに含んでもよい。シュート誘導工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。シュート誘導工程における培養は、光存在下、１５～３５℃、例えば２５℃で行うことができる。
（６）シュート伸長工程
　シュート伸長工程は、シュート誘導工程において形成されたシュートを伸長させる工程である。シュート伸長工程は、植物ホルモン、特にサイトカイニンを含有する培地でシュートを培養することを含んでもよい。シュート伸長工程において、培地中のサイトカイニンの量は、植物の種類や培養する組織の種類に応じて適切に調整すればよいが、例えば、０．１ｍｇ／Ｌ～０．９ｍｇ／Ｌ又は０．３ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌとすることができる。シュート伸長工程に用いる培地は、ジベレリンを、例えば０．１ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ又は１ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌの量で、さらに含んでもよい。シュート伸長工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。シュート伸長工程における培養は、光存在下、１５～３５℃、例えば２５℃で行うことができる。
４－３．効果
　本発明の再生植物体生成促進方法によれば、植物組織片由来の再生植物体の生成を促進することができ、また、それにより植物組織片から植物体を再生させるのに要する期間を短縮することができる。このような効果は、ＩＰＴをコードするポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていない再生植物体でも生じる。
５．再生植物体作出方法
５－１．概要
　本発明は、植物組織片由来の再生植物体を作出する方法（以下、「本発明の再生植物体作出方法」と称する場合がある。）を提供する。本発明により作出する再生植物体は、好ましくは、葉及び茎が再生又は再分化した植物体であり得る。
５－２．方法
　本発明の再生植物体作出方法は、構築物導入工程及び再生工程を必須の工程として含む。
　本発明の再生植物体作出方法は、任意選択の工程としてカルス形成工程及び再分化工程を含んでもよい。本発明の再生植物体作出方法は、例えば、（ｉ）構築物導入工程、並びに（ｉｉ）カルス形成工程及び再分化工程からなる再生工程を、記載された順番の通りに含み得る。本発明の再生植物体作出方法はまた、例えば、（ｉ）カルス形成工程、（ｉｉ）構築物導入工程、及び（ｉｉｉ）再分化工程からなる再生工程を、記載された順番通りに含み得る。
　本発明の再生植物体作出方法はまた、任意選択の工程としてシュート誘導工程及びシュート伸長工程を含んでもよい。本発明の再生植物体作出方法は、例えば、（ｉ）構築物導入工程、並びに（ｉｉ）シュート誘導工程及びシュート伸長工程からなる再生工程を、記載された順番通りに含み得る。
　各工程については、本発明の再生植物体生成促進方法について説明した通りである。
５－３．効果
　本発明の再生植物体作出方法によれば、再生植物体の生成が促進されるため、短期間で再生植物体を作出することができる。
６．ゲノム編集効率向上剤
６－１．概要
　本発明は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物からなる、植物ゲノム編集効率向上剤（以下、「本発明のゲノム編集効率向上剤」と称する場合がある。）を提供する。
６－２．定義
　本明細書において、「植物ゲノム編集効率向上剤」は、植物に導入することにより植物におけるゲノム編集効率を向上させる作用を有する剤を意味する。
　本明細書において、「ゲノム編集」は、ゲノムＤＮＡ上の特定の塩基配列に改変を導入する技術を意味する。本明細書において、「改変」は、塩基配列の挿入、欠失、置換、付加等の変異を包含する。ゲノム編集は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、又はＰＰＲシステム等のゲノム編集系を用いて行うことができる。
　本明細書において、「ゲノム編集効率」とは、ゲノム編集系発現核酸構築物の導入を行った植物細胞由来の植物体のうち、ゲノムＤＮＡに目的の改変が導入されている植物体の割合を意味する。
　本明細書において、「ゲノム編集効率を向上させる」とは、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチドを導入せず、ゲノム編集系発現核酸構築物を導入した植物細胞由来の植物体のゲノム編集効率に比べ、ゲノム編集効率を１．１倍以上（例えば１．２倍以上、１．５倍以上）向上させることを意味する。
　本発明のＩＰＴ発現核酸構築物が、ゲノム編集効率を向上させる作用を有するか否かは、例えば以下に述べるように評価できる。本発明のＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物、或いはＩＰＴ及びゲノム編集系発現核酸構築物を植物細胞（例えば、植物組織片又はそれに由来する培養細胞）に導入し、これを所定期間培養して植物体を再生させる。カルスを経由して植物体を再生させる場合には、例えば、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物、或いはＩＰＴ及びゲノム編集系発現核酸構築物を植物細胞（例えば、植物組織片又はそれに由来する培養細胞）に導入し、これを培養してカルスを形成させ、カルスを培養して植物体を再生させる。得られた再生植物体のゲノムＤＮＡに目的の改変が生じているか否かを評価する。コントロールとして、ゲノム編集系発現核酸構築物単独を植物細胞に導入し、同様の操作を行う。ＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物、或いはＩＰＴ及びゲノム編集系発現核酸構築物を導入した植物細胞由来の再生植物体のゲノム編集効率が、ゲノム編集系発現核酸構築物単独を導入した植物細胞由来の再生植物体のゲノム編集効率に比べ、上述のように向上している場合、ＩＰＴ発現核酸構築物が、ゲノム編集効率を向上させる作用を有すると判定できる。
６－３．構成
　本発明のゲノム編集効率向上剤は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物からなる。本発明のＩＰＴ発現核酸構築物については、「１．ＩＰＴ発現核酸構築物」に記載の通りである。本発明のゲノム編集効率向上剤において、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターとしては、「１．ＩＰＴ発現核酸構築物」に記載の通り、例えば、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの改変プロモーター、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子プロモーター、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子プロモーター、タバコ由来感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）プロモーター、ＲｕＢｉｓｃｏプロモーター、Ｕ６プロモーター等が挙げられる。ＩＰＴをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターは、好ましくは高発現プロモーターであり得る。高発現プロモーターとしては、例えば、ユビキチンプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、及びＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの改変プロモーターが挙げられるが、好ましくはユビキチンプロモーター、より好ましくはパセリユビキチンプロモーターであり得る。
６－４．使用方法
　本発明のゲノム編集効率向上剤は、後述の本発明のゲノム編集効率向上方法及び本発明のゲノム編集植物作出方法に使用することができる。本発明のゲノム編集効率向上剤の使用方法については、「８．ゲノム編集効率向上方法」、「９．ゲノム編集植物の作出方法」に記載の通りである。
６－５．使用対象
　本発明のゲノム編集効率向上剤を導入する植物は、「２－５．使用対象」に記載の通りであり、例えば、コケ植物、シダ植物、裸子植物又は被子植物、好ましくは被子植物、より好ましくは双子葉植物、さらにより好ましくはナス科植物、例えばトマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ、又はペチュニア、又はマメ科植物（例えば、ダイズ、落花生、エンドウ、インゲンマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ、ソラマメ、甘草）である。
６－６．効果
　本発明のゲノム編集効率向上剤によれば、植物におけるゲノム編集効率が向上する。特に、ＩＰＴのプロモーターとして高発現プロモーターを用いた場合、顕著にゲノム編集効率が向上する。この効果は、ＩＰＴをコードするポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていない個体でも生じる。
７．ゲノム編集効率向上用組成物
７－１．概要
　本発明は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物を含む、植物ゲノム編集効率向上用組成物（以下、「本発明のゲノム編集効率向上用組成物」と称する場合がある。）を提供する。
７－２．構成成分
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物を必須の有効成分として含む。本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、任意の構成成分として、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。各構成成分について以下に説明する。
（１）ＩＰＴ発現核酸構築物
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物に用いるＩＰＴ発現核酸構築物は、本発明のゲノム編集効率向上剤であってもよい。本発明のＩＰＴ発現核酸構築物又はゲノム編集効率向上剤については、「１．ＩＰＴ発現核酸構築物」、「６．ゲノム編集効率向上剤」に記載の通りである。本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物が植物細胞に有効な量となるよう、植物細胞に直接導入するか、またはアグロバクテリウムなどの細菌を介して植物細胞に導入することが望ましい。
（２）ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチド
　ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドについては、「３－２．（２）ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチド」で述べた通りである。
　ゲノム編集系は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ＺＦＮシステム、又はＰＰＲシステム、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、より好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムであり得る。
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物において、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドは、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物に含まれていてもよい。すなわち、本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含む本発明のＩＰＴ発現核酸構築物（ＩＰＴ及びゲノム編集系発現核酸構築物）を含んでもよい。
　或いは、本発明のゲノム編集効率向上用組成物において、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドは、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物とは異なる核酸構築物に含まれていてもよい。すなわち、本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物に加え、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物（ゲノム編集系発現核酸構築物）を含んでもよい。
　ＩＰＴ及びゲノム編集系発現核酸構築物、並びにゲノム編集系発現核酸構築物は、ゲノム編集系を構成するヌクレアーゼ及び／又はガイドＲＮＡの発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル等）をさらに含んでもよい。
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、２種以上の構成成分（例えば、ＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物）が共に存在する混合物の形態であってもよく、２種以上の構成成分（例えば、ＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物）が分離して存在するキットの形態であってもよい。
（３）その他の構成成分
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、水等の溶媒、界面活性剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、溶解補助剤、又は保存剤等をさらに含んでもよい。
７－３．使用方法
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、後述の本発明のゲノム編集効率向上方法及び本発明のゲノム編集植物作出方法に使用することができる。本発明のゲノム編集効率向上用組成物の使用方法については、「８．ゲノム編集効率向上方法」、「９．ゲノム編集植物の作出方法」に記載の通りである。
７－４．対象植物
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物を導入する植物は、「２－５．使用対象」に記載の通りであり、例えば、コケ植物、シダ植物、裸子植物又は被子植物である。本発明のゲノム編集効率向上用組成物を導入する植物は、好ましくは被子植物、より好ましくは双子葉植物、さらにより好ましくはナス科植物、例えばトマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ、又はペチュニア、又はマメ科植物（例えば、ダイズ、落花生、エンドウ、インゲンマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ、ソラマメ、甘草）である。
７－５．効果
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物によれば、植物におけるゲノム編集効率を向上させることができる。特に、ＩＰＴのプロモーターとして高発現プロモーターを用いた場合、顕著にゲノム編集効率を向上させることができる。この効果は、ＩＰＴをコードするポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていない個体でも生じる。
８．ゲノム編集効率向上方法
８－１．概要
　本発明は、植物におけるゲノム編集効率を向上させる方法（以下、「本発明のゲノム編集効率向上方法」と称する場合がある。）を提供する。
８－２．方法
　本発明のゲノム編集効率向上方法は、構築物導入工程を必須の工程として含む。
　本発明のゲノム編集効率向上方法は、任意選択の工程として再生工程を含んでもよい。
　本発明のゲノム編集効率向上方法は、任意選択の工程として、カルス形成工程及び再分化工程を含んでもよい。本発明のゲノム編集効率向上方法は、例えば、（ｉ）構築物導入工程、並びに（ｉｉ）カルス形成工程及び再分化工程からなる再生工程を、記載された順番の通りに含み得る。本発明のゲノム編集効率向上方法はまた、例えば、（ｉ）カルス形成工程、（ｉｉ）構築物導入工程、及び（ｉｉｉ）再分化工程からなる再生工程を、記載された順番通りに含み得る。
　本発明のゲノム編集効率向上方法はまた、任意選択の工程として、シュート誘導工程及びシュート伸長工程を含んでもよい。本発明のゲノム編集効率向上方法は、例えば、（ｉ）構築物導入工程、並びに（ｉｉ）シュート誘導工程及びシュート伸長工程からなる再生工程を、記載された順番通りに含み得る。
　各工程について以下に説明する。
（１）構築物導入工程
　構築物導入工程は、本発明のゲノム編集効率向上用組成物を植物細胞に導入する工程である。
　本工程に用いる本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物に加え、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
　本工程に用いる本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、例えば、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含む本発明のＩＰＴ発現核酸構築物（ＩＰＴ及びゲノム編集系発現核酸構築物）を含んでもよい。或いは、本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、本発明のＩＰＴ発現核酸構築物に加え、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物（ゲノム編集系発現核酸構築物）を含んでもよい。
　本工程に用いる本発明のゲノム編集効率向上用組成物は、２種以上の構成成分（例えば、ＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物）が共に存在する混合物の形態であってもよく、２種以上の構成成分（例えば、ＩＰＴ発現核酸構築物及びゲノム編集系発現核酸構築物）が分離して存在するキットの形態であってもよい。
　本工程において、植物細胞は、植物組織片（例えば葉、茎、根、又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）、又はそれに由来する培養細胞（カルス又はプロトプラスト等）であってもよい。植物細胞はまた、カルス形成工程で得られたカルスであってもよい。
　本発明のゲノム編集効率向上用組成物の植物細胞への導入は、例えば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法等の公知の方法を用いて行うことができる。アグロバクテリウム法による構築物導入は、例えば、構築物を導入したアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシェンス）の懸濁液に植物細胞を浸漬することにより行うことができる。
（２）再生工程
　再生工程は、本発明のゲノム編集効率向上用組成物を導入した植物細胞（特に、植物組織片又はそれに由来する培養細胞）を培養して植物体を再生させる工程である。
　再生工程は、植物ホルモン、特にオーキシン及び／又はサイトカイニンを含有する培地で植物細胞を培養することを含んでもよい。再生工程に用いる培地は、伸長成長を促進する植物ホルモンであるジベレリンをさらに含んでもよい。培地に添加する植物ホルモンの種類及び濃度は、植物の種類や培養する組織の種類に応じて適宜調整することができる。再生工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。
（３）カルス形成工程
　カルス形成工程は、植物細胞を培養してカルスを形成する工程である。
　本工程において、植物細胞は、植物組織片（例えば葉、茎、根又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）、又はそれに由来する培養細胞（例えば、プロトプラスト）であってもよい。植物細胞は、構築物導入工程で本発明のゲノム編集効率向上用組成物を導入した植物細胞（例えば、植物組織片又はそれに由来する培養細胞）であってもよい。
　カルス形成工程は、植物ホルモン、特にオーキシン及びサイトカイニンを含有する培地で植物細胞を培養することを含んでもよい。
　カルス形成工程において、培地中のオーキシン及びサイトカイニンの量は、植物の種類や培養する組織の種類に応じて適切に調整すればよいが、例えば、オーキシンの濃度は１ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、又は１ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌとすることができ、サイトカイニンの濃度は、例えば、０．１ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、又は０．３ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌとすることができる。カルス形成工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。カルス形成工程における培養条件は、光存在下又は非存在下、１５～３５℃、例えば２５℃で静置又は振とう培養すればよい。
　カルス形成工程では、カルスを未分化のまま維持し増殖させるため、形成されたカルスを継代培養してもよい。カルスの継代は、１～４週間毎に行うことが好ましい。
　なお、構築物導入工程後に本工程を行う場合、本工程に用いる植物細胞には、サイトカイニン合成酵素であるＩＰＴが導入されているため、植物ホルモンを含有しない培地、植物ホルモンを含有する培地のいずれにおいてもカルスを形成させることができるが、植物ホルモンを含有する培地でカルスを形成させることが好ましい。植物ホルモンを含有する培地でカルスを形成させることにより、植物ホルモンを含有しない培地でカルスを形成させる場合に比べ多くのカルスを取得し得る。
（４）再分化工程
　再分化工程は、カルスを培養して再分化を誘導し植物体を再生させる工程である。
　本工程において、カルスは、カルス形成工程で得られたカルスであってもよく、構築物導入工程で本発明のゲノム編集効率向上用組成物が導入されたカルスであってもよい。
　再分化工程は、植物ホルモン、特にオーキシン及び／又はサイトカイニンを含有する培地でカルスを培養することを含んでもよい。培地中のオーキシン及び／又はサイトカイニンの濃度は、再分化させる組織、植物の種類、培養する組織の種類等によって適切に決定すればよい。
　例えば、カルスから茎葉を分化させる場合、オーキシンを含まず、サイトカイニンを含む培地を用いることができる。このとき、培地中のサイトカイニンの濃度は、例えば、０．１ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、又は０．３ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌとすることができる。再分化工程に用いる培地は、ジベレリンを、例えば０．１ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、又は１ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌの量で、さらに含んでもよい。再分化工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。
　本工程において、培地は、成長段階に応じて適切に変更してもよい。例えば、植物ホルモン（特にオーキシン及び／又はサイトカイニン）を含有する培地でカルスを培養し、植物体を再生させた後、植物ホルモンを含有しない培地に再生植物体を移してもよい。
　なお、本工程に用いるカルスには、サイトカイニン合成酵素であるＩＰＴが導入されているため、植物ホルモンを含有しない培地、植物ホルモンを含有する培地のいずれにおいても再分化を引き起こすことができるが、植物ホルモンを含有する培地で再分化させることが好ましい。植物ホルモンを含有する培地で再分化させることにより、植物ホルモンを含有しない培地で再分化させる場合に比べ多くの再分化個体を取得し得る。
（５）シュート誘導工程
　シュート誘導工程は、植物細胞を培養してシュート形成を誘導する工程である。本工程において、植物細胞は、植物組織片（例えば、葉、茎、根、又は種子の切片、分裂細胞又は再分化能を有する細胞を含む組織片等）、又はそれに由来する培養細胞（例えば、プロトプラスト）であってもよい。本工程において、植物細胞は、構築物導入工程で本発明のゲノム編集効率向上用組成物を導入した植物細胞（例えば、植物組織片又はそれに由来する培養細胞）であってもよい。
　シュート誘導工程は、植物ホルモン、特にサイトカイニンを含有する培地で植物組織片を培養することを含んでもよい。シュート誘導工程において、培地中のサイトカイニンの量は、植物の種類や培養する組織の種類に応じて適切に調整すればよいが、例えば、０．１ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ、又は１ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌとすることができる。シュート誘導工程に用いる培地は、ジベレリンを、例えば０．１ｍｇ／Ｌ～０．９ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌ、又は０．１ｍｇ／Ｌ～０．５ｍｇ／Ｌの量で、さらに含んでもよい。シュート誘導工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。シュート誘導工程における培養は、光存在下、１５～３５℃、例えば２５℃で行うことができる。
（６）シュート伸長工程
　シュート伸長工程は、シュート誘導工程において形成されたシュートを伸長させる工程である。シュート伸長工程は、植物ホルモン、特にサイトカイニンを含有する培地でシュートを培養することを含んでもよい。シュート伸長工程において、培地中のサイトカイニンの量は、植物の種類や培養する組織の種類に応じて適切に調整すればよいが、例えば、０．１ｍｇ／Ｌ～０．９ｍｇ／Ｌ又は０．３ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌとすることができる。シュート伸長工程に用いる培地は、ジベレリンを、例えば０．１ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ又は１ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌの量で、さらに含んでもよい。シュート伸長工程に用いる培地はまた、選抜薬剤をさらに含んでもよい。シュート伸長工程における培養は、光存在下、１５～３５℃、例えば２５℃で行うことができる。
８－３．効果
　本発明のゲノム編集効率向上方法によれば、植物におけるゲノム編集効率を向上させることができる。特に、ＩＰＴのプロモーターとして高発現プロモーターを用いた場合、顕著にゲノム編集効率を向上させることができる。この効果は、ＩＰＴをコードするポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれていない個体でも生じる。
９．ゲノム編集植物の作出方法
９－１．概要
　本発明は、ゲノム編集植物を作出する方法（以下、「本発明のゲノム編集植物作出方法」と称する場合がある。）を提供する。
９－２．方法
　本発明のゲノム編集植物作出方法は、構築物導入工程を必須の工程として含む。
　本発明のゲノム編集植物作出方法は、任意選択の工程として再生工程を含んでもよい。
　本発明のゲノム編集植物作出方法は、任意選択の工程として、カルス形成工程及び再分化工程を含んでもよい。本発明のゲノム編集植物作出方法は、例えば、（ｉ）構築物導入工程、並びに（ｉｉ）カルス形成工程及び再分化工程からなる再生工程を、記載された順番の通りに含み得る。本発明のゲノム編集植物作出方法はまた、例えば、（ｉ）カルス形成工程、（ｉｉ）構築物導入工程、及び（ｉｉｉ）再分化工程からなる再生工程を、記載された順番通りに含み得る。
　本発明ゲノム編集植物作出方法はまた、任意選択の工程として、シュート誘導工程及びシュート伸長工程を含んでもよい。本発明のゲノム編集植物作出方法は、例えば、（ｉ）構築物導入工程、並びに（ｉｉ）シュート誘導工程及びシュート伸長工程からなる再生工程を、記載された順番通りに含み得る。
　本発明のゲノム編集植物作出方法は、任意選択の工程として、選抜工程を含んでもよい。
　本明細書において、「ゲノム編集植物」は、ゲノム編集系によりゲノムＤＮＡが改変された植物を意味する。ゲノム編集植物は、カルス、不定胚、不定芽、茎及び葉が再生又は再分化した植物体、根が再生又は再分化した植物体、葉、茎、及び根が再生又は再分化した植物体を包含する。
　構築物導入工程、再生工程、カルス形成工程、再分化工程、シュート誘導工程及びシュート伸長工程については、本発明のゲノム編集効率向上方法について説明した通りである。
　「選抜工程」は、再生工程で得られた再生植物体からゲノムＤＮＡを抽出し、目的の改変が導入されたゲノム編集植物を選抜する工程である。「目的の改変」は、構築物導入工程で植物細胞に導入したゲノム編集系がゲノムＤＮＡに導入することが意図される改変を意味する。ゲノムＤＮＡに目的の改変が導入されているか否かは、任意の公知の手段により評価することができる。例えば、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、目的の改変を含むゲノムＤＮＡの領域について核酸増幅反応を行う。得られた増幅産物の塩基配列をシークエンシングにより決定するか、増幅産物を制限酵素処理するなどの方法により目的の改変の有無を判断することができる。
　選抜工程では、目的の改変の有無を評価する対象から、多芽体等の形態異常を有する再生植物体を排除してもよい。形態異常を有する再生植物体は、ＩＰＴ遺伝子がゲノムＤＮＡに導入されている可能性が高い。形態異常を有する再生植物体を評価対象から排除することにより、ＩＰＴ発現核酸構築物がゲノムＤＮＡに導入されていないが目的の改変がゲノムＤＮＡに導入されているゲノム編集植物が得られる可能性が高くなる。
９－３．効果
　本発明のゲノム編集植物の作出方法によれば、効率的にゲノム編集植物を作出することができる。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
＜製造例１：ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターの構築＞
　パセリユビキチンプロモーター（ＰＰｃＵｂｉ）（配列番号１７）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９遺伝子（配列番号４）、及びエンドウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ；　Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ）由来Ｐｅａ３Ａターミネーター（配列番号２０）を連結させた発現カセット（ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９－Ｐｅａ３Ａ）を含むｐＵＣ１９ベクターをＧｅｎＳｃｒＩＰＴ社の化学合成により作製した。このｐＵＣ１９ベクターとｐＬＣ４１ベクター（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＬＣ２１５６９８）とをＢａｍＨＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｄ社）で制限酵素処理した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｌｏｎｇ　ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてライゲーションを行った。これにより、ｐＬＣ４１ベクターのＬｅｆｔ　Ｂｏｒｄｅｒ（ＬＢ）とＲｉｇｈｔ　Ｂｏｒｄｅｒ（ＲＢ）間のＴ－ＤＮＡ上に、ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９－Ｐｅａ３Ａが挿入されたベクター（ｐＬＣ４１－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９ベクター）を得た。
　Ｋｕｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，８，１３７５３に記載のｐＺＤ－ｄｘＣａｓ９プラスミドは、ジャガイモＧＢＳＳＩ（顆粒結合型デンプン合成酵素Ｉ）遺伝子を標的とする複数のｇＲＮＡを含む。このｐＺＤ－ｄｘＣａｓ９プラスミドをＰｍｅＩ及びＳｂｆＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｄ社）で制限酵素処理してｇＲＮＡの発現カセット（配列番号６）を切り出した。このｇＲＮＡの発現カセットと、ＰｍｅＩ及びＳｂｆＩ－ＨＦによる制限酵素処理で開環させたｐＬＣ４１－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９ベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｌｏｎｇ　ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて結合させ、ｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９ベクター（以下、「ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクター」と称する場合がある。）を得た。当該ベクターのＴ－ＤＮＡ（配列番号２１）の構造を図１Ａに示す。
　なお、ＰＰｃＵｂｉ、Ｃａｓ９、及びＰｅａ３Ａ配列はＭｉｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，８８（６）：５６１－５７２に記載のｐＺＨ－ＦＦＣａｓ９ベクターを参考に設計した。
＜製造例２：ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターの構築＞
　アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来ＩＰＴ遺伝子の天然のプロモーター（ＰＮａｔｉｖｅ）（配列番号１６）、アグロバクテリウム・ツメファシェンス由来ＩＰＴ遺伝子（配列番号２）、Ｐｅａ３Ａターミネーター（配列番号２０）を連結させた発現カセット（ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ－Ｐｅａ３Ａ）を含むｐＵＣ１９をＧｅｎＳｃｒＩＰＴ社の化学合成により作製した。このｐＵＣ１９と、ｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９ベクターをＳｐｅＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｄ社）で制限酵素処理した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｌｏｎｇ　ｋｉｔでライゲーションを行った。これにより、ｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９－ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴベクター（以下、「ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター」と称する場合がある。）を得た。当該ベクターのＴ－ＤＮＡ（配列番号２２）の構造を図１Ｂに示す。
　なお、ＩＰＴ遺伝子の塩基配列は、アグロバクテリウム・ツメファシェンスのＴｉプラスミド（ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｘ００４９３)を鋳型としてフォワードプライマー：ＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＴＣＧＧ（配列番号２６）及びリバースプライマー：ＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣＧＧＡＴ（配列番号２７）でＰＣＲにより増幅される７２３ｂｐの塩基配列である。
　ＰＮａｔｉｖｅは、ＤＤＢＪに登録されているアグロバクテリウム・ツメファシェンスＡ２８１株のＤＮＡ(特許３９０５６０７)に存在するＩＰＴ遺伝子の配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｘ１４４１０　Ｘ１７４３２）の上流のプロモーター配列に由来する。
　ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ－Ｐｅａ３Ａの配列は、フォワードプライマー：ＣＣＣＧＴＴＡＣＡＡＧＴＡＴＴＧＣＡＣＧＴＴＴＴＧＴ（配列番号２８）及びリバースプライマー：ＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣＧＧＡＴ（配列番号２９）でＰＣＲにより増幅される１４０８ｂｐの配列ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴの下流にＰｅａ３Ａの配列を連結した配列である。
＜製造例３：ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターの構築＞
　ＰＰｃＵｂｉ（配列番号１７）、ＩＰＴ遺伝子（配列番号２）、Ｐｅａ３Ａ（配列番号２０）をＰＣＲで増幅し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｄ社）により、ＳｐｅＩ－ＨＦで制限酵素処理したｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９ベクターにＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ－Ｐｅａ３Ａの形で導入し、ｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９－ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴベクター（以下、「ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター」と称する場合がある。）を得た。当該ベクターのＴ－ＤＮＡ（配列番号２３）の構造を図１Ｂに示す。
　なお、ＰＰｃＵｂｉは、ｐＺＨ＿ＦＦＣａｓ９（Ｍｉｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，８８（６）：５６１－５７２）を鋳型としてフォワードプライマー：ＡＧＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＴＡＧＣＡＡＣＧ（配列番号３０及びリバースプライマー：　ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＡＣＡＴＡＣＡＴ（配列番号３１）でＰＣＲにより増幅した（９３９ｂｐ）。
＜製造例４：Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターの構築＞
　カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）（配列番号１８）、ＩＰＴ遺伝子（配列番号２）、及びＰｅａ３Ａ（配列番号２０）をＰＣＲで増幅し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒにより、ＳｐｅＩ－ＨＦで制限酵素処理したｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９ベクターにＰ３５Ｓ－ＩＰＴ－Ｐｅａ３Ａの形で導入し、ｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９－Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴベクター（以下、「Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター」と称する場合がある。）を得た。当該ベクターのＴ－ＤＮＡ（配列番号２４）の構造を図１Ｂに示す。
　なお、Ｐ３５Ｓは、フォワードプライマー：ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＴＡＧＣＣＴ（配列番号３２）及びリバースプライマー：ＴＡＧＡＧＴＣＣＣＣＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴ（配列番号３３）で増幅した（８４５ｂｐ）。
＜製造例５：Ｐ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターの構築＞
　Ｐ３５Ｓの発現力が増強された改変プロモーターである２ｘ３５Ｓプロモーター（Ｐ２ｘ３５Ｓ）（配列番号１９）、ＩＰＴ遺伝子（配列番号２）、およびＰｅａ３Ａ（配列番号２０）をＰＣＲで増幅し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒにより、ＳｐｅＩ－ＨＦで制限酵素処理したｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９ベクターにＰ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ－Ｐｅａ３Ａの形で導入し、ｐＬＣ４１－ｇＲＮＡ－ＰＰｃＵｂｉ－Ｃａｓ９－Ｐ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴベクター（以下、「Ｐ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター」と称する場合がある。）を得た。当該ベクターのＴ－ＤＮＡ（配列番号２５）の構造を図１Ｂに示す。
　なお、Ｐ２ｘ３５Ｓは、ｐＺＤ－ｄｘＣａｓ９（Ｋｕｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，８，１３７５３）を鋳型としてフォワードプライマー：ＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＣ（配列番号３４）及びリバースプライマー：ＡＣＴＡＧＴＣＣＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡ（配列番号３５）で増幅した（７５９ｂｐ）。
＜実施例１：ＩＰＴの再生植物体生成促進作用（１）＞
　組織培養法におけるＩＰＴの効果を検証するため、以下の実験を行った。
　製造例１で作製したＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクター、又は製造例３で作製したＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入したアグロバクテリウムを用いてジャガイモの形質転換を行った。
　ジャガイモへの形質転換は、Ｃｒａｚｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，Ｖｏｌｕｍｅ　３，Ｉｓｓｕｅ　１，ｐ．３３－４１に記載のアグロバクテリウム法に従い、一部改変して実施した。
　具体的には、培養室（２５℃、１６時間明期／８時間暗期)で茎頂培養したジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の培養苗の葉から葉片（面積０．３～０．５ｃｍ2）を無菌的に切り出した。
　製造例１で作製したＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクター、又は製造例３で作製したＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターをエレクトロポレーション法により導入したアグロバクテリウム・ツメファシェンスＥＨＡ１０５株を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン含有ＹＰ培地（Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ　Ｐｅｐｔｏｎｅ　１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ　５ｇ／L)に塗布し、２８℃で１日間培養後、１００μＭアセトシリンゴン含有液体培地ＰＣＭ（Ｃｒａｚｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，Ｖｏｌｕｍｅ　３，Ｉｓｓｕｅ　１，ｐ．３３－４１）に移し、６００ｎｍにおける吸光度が１．９になるようアグロバクテリウム懸濁液を調整した。なお、ＰＣＭ培地は、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）（合成オーキシン）２ｍｇ／Ｌ、ゼアチン（サイトカイニン）０．５　ｍｇ／Ｌ、ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｖｉｔａｍｉｎｓ（Ｄｕｃｈｅｆａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）４．４ｇ／Ｌ、ＭＥＳ　５００ｍｇ／Ｌ、スクロース２０ｇ／Ｌ、Ａｇａｒ　５ｇ／Ｌを含み、ＮａＯＨでｐＨ５．７に調製されている。
　上記の葉片を上記のアグロバクテリウム懸濁液に浸漬し、１０分間静置した。この葉片をろ紙の上に移して余分な懸濁液を除去し、１４０μＭアセトシリンゴン含有共存培地ＰＣＭ（Ｃｒａｚｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，Ｖｏｌｕｍｅ　３，Ｉｓｓｕｅ　１，ｐ．３３－４１）に葉片の表面を上向きにして置床し、２５℃照明下で３日間培養した。
　その後、カルス化培地ＰＣＭ（Ｃｒａｚｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，Ｖｏｌｕｍｅ　３，Ｉｓｓｕｅ　１，ｐ．３３－４１）に葉片を置床し、さらに２５℃照明下で３日間培養した。
　次に、各葉片に由来する培養物を再分化培地ＰＳＭ（Ｃｒａｚｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，　Ｖｏｌｕｍｅ　３，Ｉｓｓｕｅ　１，ｐ．３３－４１）に置床して２５℃照明下で培養し、１４日間ごとに新しいＰＳＭ培地に交換した。なお、ＰＳＭ培地は、ゼアチン（サイトカイニン）０．５　ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ　ジベレリン酸、ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｖｉｔａｍｉｎｓ（Ｄｕｃｈｅｆａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）４．４ｇ／Ｌ、ＭＥＳ　５００ｍｇ／Ｌ、スクロース２０ｇ／Ｌ、Ａｇａｒ　５ｇ／Ｌを含み、ＮａＯＨでｐＨ５．７に調製されている。
　アグロバクテリウムの接種から４週間後に、顕微鏡下で培養物を観察し、植物体への再分化の様態が確認できた葉片数（再分化葉片数）を計数し、接種葉片数に対する再分化葉片数の割合を再分化効率の指標として算出した。また、同時に、再分化個体が形態正常な葉(多芽体は除く)を形成するまで成長した葉片数をシュート形成葉片数として計数し、接種葉片数に対するシュート形成葉片数の割合を算出した。ジャガイモの組織培養では多くの場合、カルスの再分化が始まると茎状組織の形成が起こり、次いで葉の形成が進む。そのため、上記の接種葉片数に対するシュート形成葉片数の割合は、再分化個体の生成速度の指標とできる。
　アグロバクテリウムの接種から４週間後の培養組織の例を図２に示す。また、再分化葉片数、シュート形成葉片数とそれらの接種葉片数に対する割合を表１に示す。
　ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区に比べ、接種葉片数に対する再分化葉片数の割合が約８％上昇していた。このことは、ＩＰＴを発現させることにより再分化が誘導されることを示す。
　また、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区に比べ、接種葉片数に対するシュート形成葉片数の割合が約８倍も高かった。このことは、ＩＰＴを発現させることにより、再分化個体（再生植物体）の生成を促進できることを示す。
　通常、ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドを含むＴ－ＤＮＡを含むベクターを植物に導入した場合、目的の変異が導入され、かつＴ－ＤＮＡがゲノムに組み込まれている個体、目的の変異が導入され、かつＴ－ＤＮＡがゲノムに組み込まれていない個体、目的の変異が導入されておらず、かつＴ－ＤＮＡがゲノムに組み込まれている個体、目的の変異が導入されておらず、かつＴ－ＤＮＡがゲノムに組み込まれていない個体が生じる。
　ＩＰＴ遺伝子がゲノムに組み込まれた植物は通常多芽体等の形態異常を示すことから、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター（ゲノム編集系及びＩＰＴをコードするポリヌクレオチドを含むＴ－ＤＮＡを含むベクター）を導入した試験区では、正常葉を形成している個体はＴ－ＤＮＡがゲノムに組み込まれていない可能性が高い。したがって、上記のＩＰＴによる再分化個体の生成促進効果は、ＩＰＴ遺伝子がゲノムに組み込まれていない個体でも生じるといえる。
　このようにＩＰＴ遺伝子がゲノムに組み込まれていない再分化個体の生成が促進されるのは、アグロバクテリウムを接種した葉片では、ＩＰＴ遺伝子がゲノムに組み込まれた細胞と組み込まれていない細胞が混在した状態になっており、ＩＰＴ遺伝子がゲノムに組み込まれた細胞でサイトカイニンが過剰合成・分泌されると、隣接する非組み込み細胞にサイトカイニンが伝播するためであると考えられる。
＜実施例２：ＩＰＴの再生植物体生成促進作用（２）＞
　異なるプロモーター下でＩＰＴを発現させた場合の再生植物体生成促進作用を比較するため、以下の実験を行った。
　実施例１と同様の方法により、製造例１～５で作製したＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクター、ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、又はＰ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入したアグロバクテリウムをジャガイモの葉片に接種し、当該葉片を共存培地ＰＣＭで３日間培養し、カルス化培地ＰＣＭで３日間培養した後、再分化培地ＰＳＭで培養した。
　アグロバクテリウムの接種から１か月経過時に、再分化が確認できた葉片数（再分化葉片数）を計数し、接種葉片数に対する再分化葉片数の割合を再分化効率の指標として算出した。また、同時に、再分化個体が形態正常な葉(多芽体は除く)を形成するまで成長した葉片数をシュート形成葉片数としてを計数し、接種葉片数に対するシュート形成葉片数の割合を再分化個体の生育速度の指標として算出した。
　結果を表２に示す。
　ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、接種葉片数に対する再分化葉片数の割合が４１．１％であったのに対し、ＩＰＴ遺伝子を含むＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、又はＰ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、全ての葉片が再分化しており、接種葉片数に対する再分化葉片数の割合は１００％であった。このことから、ＩＰＴ遺伝子を導入することにより再分化が誘導されることが確認された。
　また、ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、接種葉片数に対するシュート形成葉片数の割合が２．２％であったのに対し、ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、接種葉片数に対するシュート形成葉片数の割合がそれぞれ４６．２％、５７．７％、７０．８％、５５．１％であった。このことから、ＩＰＴを発現させることにより再分化個体（再生植物体）の生成を促進できること、特にＰＰｃＵｂｉ、Ｐ３５Ｓ、Ｐ２ｘ３５Ｓ等の高発現プロモーターでＩＰＴを発現させる場合顕著に再分化個体の生育を促進できることが示された。
＜実施例３：ＩＰＴの再生植物体生成促進作用（３）＞
　実施例２とは異なるジャガイモ品種「サッシー」を用いて形質転換を行った点を除き、実施例２と同様の実験を行った。結果を表３に示す。
　ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、接種葉片数に対する再分化葉片数の割合が３２．０％であったのに対し、ＩＰＴ遺伝子を含むＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、又はＰ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、接種葉片数に対する再分化葉片数の割合はそれぞれ６４．０％、８０．０％、７２．０％、７６．０％であった。したがって、ＩＰＴ遺伝子による再分化誘導効果がジャガイモ品種「サッシー」においても確認された。
　また、ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、接種葉片数に対するシュート形成葉片数の割合が１６．０％であったのに対し、ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、接種葉片数に対するシュート形成葉片数の割合がそれぞれ４８．０％、５６．０％、４８．０％、５２．０％であった。したがって、ＩＰＴ遺伝子による再生植物体の生成促進効果がジャガイモ品種「サッシー」においても確認された。
＜実施例４：ＩＰＴの再生植物体生成促進作用（４）＞
　実施例１～３においてジャガイモの組織培養法で見られたＩＰＴの再生植物体生成促進が、ダイズの組織培養法でも見られるかを確認するため、以下の実験を行った。
（１）ＧＵＳ－ｂａｒ発現ベクターの作製
　バイナリーベクターｐＬＣ４１（Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＬＣ２１５６９８）のＴ－ＤＮＡ上にＧＵＳ遺伝子発現カセットとｂａｒ遺伝子発現カセットとを有するベクター（以下、「ＧＵＳ－ｂａｒ発現ベクター」と称する。）を作製した。
　ＧＵＳ－ｂａｒ発現ベクターに含まれるＧＵＳ遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）（配列番号３８）、ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）のカタラーゼイントロンが介在したＧＵＳ遺伝子（配列番号３９）（Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３１（６）；８０５－８１３）、及びＮｏｓターミネーター（Ｔｎｏｓ）（配列番号４０）を含む。ＧＵＳ－ｂａｒ発現ベクターに含まれるｂａｒ遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）（配列番号４１）、ｂａｒ遺伝子（配列番号４２）、及び３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）（配列番号４３）を含む。ｂａｒ遺伝子は、フォスフィノスライシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）への耐性を植物に付与する薬剤耐性遺伝子である。
（２）ｂａｒ－ＩＰＴ発現ベクターの作製
　バイナリーベクターｐＬＣ４１（Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＬＣ２１５６９８）のＴ－ＤＮＡ上にｂａｒ遺伝子発現カセットとＩＰＴ遺伝子発現カセットとを有するベクター（以下、「ｂａｒ－ＩＰＴ発現ベクター」と称する。）を作製した。
　ｂａｒ－ＩＰＴ発現ベクターに含まれるｂａｒ遺伝子発現カセットは、ＧＵＳ－ｂａｒ発現ベクターに含まれるｂａｒ遺伝子発現カセットと同一である。ｂａｒ－ＩＰＴ発現ベクターに含まれるＩＰＴ遺伝子発現カセットは、トウモロコシユビキチンプロモーター（ＰＺｍＵｂｉ）（配列番号４４）、ＩＰＴ遺伝子（配列番号２）、及びＮｏｓターミネーター（Ｔｎｏｓ）（配列番号４５）を含む。
（３）アグロバクテリウム法によるダイズの形質転換
　エタノール、及びアンチホルミンで滅菌したダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）完熟種子（品種：Ｍａｐｌｅ　Ａｒｒｏｗ）を滅菌蒸留水に１晩浸漬した。種皮を除いた種子から胚軸を基部１～２ｍｍを残して取り除いた後、種子を縦半分に切り分けた。続いて、子葉節にある初生葉を取り除き、子葉を滅菌蒸留水で洗浄した。
　上記のＧＵＳ－ｂａｒ発現ベクター又はｂａｒ－ＩＰＴ発現ベクターを導入したアグロバクテリウム・ツメファシェンスＥＨＡ１０５菌株を、ＹＰ寒天培地（Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２：１６１４－１６２１）で１日前培養した。その後、培養したアグロバクテリウム菌をアグロバクテリウム懸濁液体培地（Ｐａｚ　ｅｔ　ａｌ．，２００６，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２５（３）：２０６－２１３）に懸濁し、接種源とした。
　上記の子葉を上記の接種源に浸漬し、室温で１５分間保存した。アグロバクテリウムを接種した子葉を、濾紙を敷いた共存培地（Ｐａｚ　ｅｔ　ａｌ．，２００６，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２５（３）：２０６－２１３）（１／１０　Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン、７．５μＭ　６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．７μＭ　ジベレリン酸(ＧＡ３)、２０ｍＭ　ＭＥＳ、３％スクロース、２００μＭ　アセトシリンゴン、１００～４００ｍｇ／Ｌ　システイン、１５４ｍｇ／Ｌ　ジチオスレイトール、ｐＨ５．４）に置床し、照明下２５℃で３日間培養した。その後、子葉節が培地に埋まるようにＳＩ培地（シュート誘導培地）（Ｐａｚ　ｅｔ　ａｌ．，２００６，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２５（３）：２０６－２１３）（Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン、ＭＳＩＩＩ　ｉｒｏｎ　ｓｔｏｃｋ、３％スクロース、３ｍＭ　ＭＥＳ、５．０μＭ　ＢＡＰ、５０ｍｇ／Ｌ　チメンチン、２００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌ　バンコマイシン、ｐＨ５．７）に子葉を置床し、照明下２５℃で２週間培養した。生長した茎葉を取り除き、５ｍｇ／Ｌのフォスフィノスライシンを含むＳＩ培地に子葉を置床し照明下２５℃で２週間培養した。同様の操作を２回繰り返した（計６週間培養）後、増殖した組織をフォスフィノスライシン５ｍｇ／Ｌを含むシュート伸長培地（ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、２０ｇ／Ｌ　スクロース、０．５ｇ／Ｌ　ＭＥＳ、０．５ｍｇ／Ｌ　ゼアチン、２ｍｇ／Ｌ　ジベレリン酸、１５０ｍｇ／Ｌ　チメンチン、５ｍｇ／Ｌ　フォスフィノスライシン、５ｇ／Ｌ　アガロース、ｐＨ　５．７）に置床した。照明下２５℃で２週間培養した後、形成されたフォスフィノスライシン抵抗性シュートの数を計数した。
　アグロバクテリウムを接種した子葉節数と、シュート伸長培地での２週間の培養後におけるシュートを形成した子葉節数及び形成されたシュートの総数を下記表４に示す。
　ＧＵＳ－ｂａｒ発現ベクターを導入した試験区では、アグロバクテリウムを接種した２３個の子葉節のうち２個の子葉節からシュートが形成され、合計２本のシュートが得られた。これに対し、ｂａｒ－ＩＰＴ発現ベクターを導入した試験区では、アグロバクテリウムを接種した２３個の子葉節のうち５つの子葉節からシュートが形成され、合計８本のシュートが得られた。ｂａｒ－ＩＰＴ発現ベクターを導入した試験区では、ＧＵＳ－ｂａｒ発現ベクターを導入した試験区に比べ、約２．５倍もシュート形成率が高かった。したがって、ＩＰＴ遺伝子による再生植物体の生成促進効果がダイズにおいても確認された。
＜実施例５：ＩＰＴのゲノム編集効率向上作用（１）＞
　ゲノム編集効率に対するＩＰＴの効果を検証するため、以下の実験を行った。
　実施例１と同様の方法により、製造例１で作製したＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクター又は製造例３で作製したＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入したアグロバクテリウムをジャガイモの葉片に接種し、この葉片を共存培地ＰＣＭで３日間培養し、カルス化培地ＰＣＭで３日間培養した後、再分化培地ＰＳＭで培養した。
　接種葉片から再分化が起こり、シュート及び葉が形成された再分化個体を、発根培地ＰＲＭ（Ｃｒａｚｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１８，Ｖｏｌｕｍｅ　３，Ｉｓｓｕｅ　１，ｐ．３３－４１）に移植して、２５℃照明下で培養した。
　発根培地に移植した再分化個体のうち、シュート及び葉の形成と発根が確認された個体を選抜し、ＤＮＡを抽出した。この時、多芽体など形態や生育に異常を有する個体は排除した。
　ＤＮＡ抽出は以下の方法により行った。９６ウェルプレートの各ウェルに３００μｌのＤＮＡ抽出バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ　８．０）、２５ｍＭ　Ｂａｃｋ、０．０５％　ＳＤＳ）、解析する植物の２～５ｍｍ２の葉切片、５ｍｍのステンレスビーズ２個を加え、１０００ｒｐｍで１分の粉砕処理と３０００ｒｐｍで１０分の遠心処理を行った後、５０μｌの上清をＤＮＡ抽出液として保存した。
　再分化個体においてゲノム編集による標的ゲノム配列の変異が生じているか否かを、ＣＬＥＡＶＥＤ　ＡＭＰＬＩＦＩＥＤ　ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＣ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ（ＣＡＰＳ）解析を用いて評価した。ＧＢＳＳ１遺伝子内の標的ゲノム配列は、プライマーＧＢＳＳ１－Ｆｗ：ＣＡＣＴＴＴＧＴＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣ（配列番号３６）、及びＧＢＳＳ１－Ｒｖ：ＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＣＧ（配列番号３７）を用いて、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応液は、ＤＮＡ抽出液０．８μｌ、プライマー各２．５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ　ＦＸ　ＮＥＯ　０．２Ｕ、２ｘＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ　５μｌ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　２μｌに、滅菌蒸留水を添加して合計１０μｌとすることにより調製した。ＰＣＲの反応は、９４℃で２分処理後、９８℃　１５秒及び６８℃１分の反応を１サイクルとして３５サイクル行った。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片２μｌ、ＣｕｔＳｍａｒｔＢｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）２μｌ、及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）０．２μｌに滅菌水を添加して２０μｌとし、３７℃で３時間制限酵素処理を行った。得られた制限酵素処理物を、マイクロチップ電気泳動装置Ｍｕｌｔｉｎａ（島津製作所）を用いて解析した。解析により編集が確認できた個体数（編集個体数）を解析個体数で割った値をゲノム編集効率として算出した。本実験は２回行った（それぞれ、実験１、実験２）。
　結果を表５及び６に示す。
　実験１及び実験２では、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区において、ＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区に比べ、ゲノム編集効率がそれぞれ約２倍、約６倍も高かった。このことは、ＩＰＴを発現させることによりゲノム編集効率が向上することを示す。
　実験１及び実験２では、ＩＰＴ遺伝子がゲノムに組み込まれていた個体は解析個体全体の２割程度であった。実験１のＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区において、編集個体のうちＩＰＴ遺伝子がゲノムに組み込まれていない個体は４個であり、解析個体数に対する割合は４．９％（４／１０２）であった。また、実験２のＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区において、編集個体のうちＩＰＴ遺伝子がゲノムに組み込まれていない個体は１１個であり、解析個体数に対する割合は４．０％（１１／２７４）であった。したがって、ＩＰＴがゲノムに組み込まれていない個体でもゲノム編集効率の向上が見られた。
＜実施例６：ＩＰＴのゲノム編集効率向上作用（２）＞
　異なるプロモーター下でＩＰＴを発現させた場合のゲノム編集効率を比較するため、以下の実験を行った。
　製造例１～５で作製したＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクター、ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクター、又はＰ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入したアグロバクテリウムをジャガイモの葉片に接種した点を除き実施例５と同様の操作を行った。
　結果を表７に示す。
　ＩＰＴ遺伝子を含まないＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区、ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、ゲノム編集効率がそれぞれ僅か１．８％、１．３％であった。これに対し、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区、Ｐ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区ではゲノム編集効率が高く、それぞれ２．２％、３．８％であった。また、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターではゲノム編集効率がさらに高く、６．５％、であった。このことから、ＰＰｃＵｂｉ、Ｐ３５Ｓ、Ｐ２ｘ３５Ｓ等の高発現プロモーターでＩＰＴを発現させる場合、ＩＰＴを発現させない場合やＩＰＴの天然のプロモーターでＩＰＴを発現させる場合に比べ、ゲノム編集効率を向上させることができることが示された。
＜実施例７：ＩＰＴのゲノム編集効率向上作用（２）＞
　実施例６とは異なるジャガイモ品種「サッシー」を用いた点を除き、実施例６と同様の実験を行った。結果を表８に示す。
　ＩＰＴ遺伝子を含まないＩＰＴ非発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、ゲノム編集効率が０．０％であるのに対し、ＰＮａｔｉｖｅ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区では、ゲノム編集効率が６．８％まで向上した。さらに、Ｐ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区、Ｐ２ｘ３５Ｓ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区ではゲノム編集効率が高く、それぞれ１７．７％、１５．６％であった。さらに、ＰＰｃＵｂｉ－ＩＰＴ発現ゲノム編集ベクターを導入した試験区ではゲノム編集効率がさらに高く、２２．６％であった。このことから、ＩＰＴを発現させない場合に比べてＩＰＴの天然のプロモーターでＩＰＴを発現させる場合にはゲノム編集効率を向上させることができることが示され、さらにＰＰｃＵｂｉ、Ｐ３５Ｓ、Ｐ２ｘ３５Ｓ等の高発現プロモーターでＩＰＴを発現させる場合、ＩＰＴを発現させない場合やＩＰＴの天然のプロモーターでＩＰＴを発現させる場合に比べ、ゲノム編集効率をさらに向上させることができることが示された。したがって、ＩＰＴ遺伝子によるゲノム編集効率向上効果がジャガイモ品種「サッシー」においても確認された。
配列番号１　アグロバクテリウム・ツメファシェンス由来ＩＰＴタンパク質のアミノ酸配列（２４０アミノ酸）
MDLHLIFGPTCTGKTTTAIALAQQTGLPVLSLDRVQCCPQLSTGSGRPTVEELKGTTRLYLDDRPLVEGIIAAKQAHHRLIEEVYNHEANGGLILEGGSTSLLNCMARNSYWSADFRWHIIRHKLPDQETFMKAAKARVKQMLHPAAGHSIIQELVYLWNEPRLRPILKEIDGYRYAMLFASQNQITADMLLQLDANMEGKLINGIAQEYFIHARQQEQKFPQVNAAAFDGFEGHPFGMY
配列番号２　アグロバクテリウム・ツメファシェンス由来ＩＰＴタンパク質をコードする塩基配列（７２３アミノ酸）
ATGGACCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCACAGGAAAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTTCCAGTCCTTTCGCTTGATCGGGTCCAATGCTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACCAACAGTGGAAGAACTGAAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCTGGTGGAGGGTATCATCGCAGCCAAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGTGTATAATCATGAGGCCAACGGCGGGCTTATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTGCTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGTGCAGATTTTCGTTGGCATATTATTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAAGCGGCCAAGGCCAGAGTTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAAGAGTTGGTTTATCTTTGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGATATCGATATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAGCTTGACGCAAATATGGAAGGTAAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCATCCATGCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGACGGATTCGAAGGTCATCCGTTCGGAATGTATTAG
配列番号３　ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（１３７２アミノ酸）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSRAD
配列番号４　ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質をコードする塩基配列（４１１６ｂｐ）
ATGGATAAGAAGTACTCTATCGGACTCGATATCGGAACTAACTCTGTGGGATGGGCTGTGATCACCGATGAGTACAAGGTGCCATCTAAGAAGTTCAAGGTTCTCGGAAACACCGATAGGCACTCTATCAAGAAAAACCTTATCGGTGCTCTCCTCTTCGATTCTGGTGAAACTGCTGAGGCTACCAGACTCAAGAGAACCGCTAGAAGAAGGTACACCAGAAGAAAGAACAGGATCTGCTACCTCCAAGAGATCTTCTCTAACGAGATGGCTAAAGTGGATGATTCATTCTTCCACAGGCTCGAAGAGTCATTCCTCGTGGAAGAAGATAAGAAGCACGAGAGGCACCCTATCTTCGGAAACATCGTTGATGAGGTGGCATACCACGAGAAGTACCCTACTATCTACCACCTCAGAAAGAAGCTCGTTGATTCTACTGATAAGGCTGATCTCAGGCTCATCTACCTCGCTCTCGCTCACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTCATCGAGGGTGATCTCAACCCTGATAACTCTGATGTGGATAAGTTGTTCATCCAGCTCGTGCAGACCTACAACCAGCTTTTCGAAGAGAACCCTATCAACGCTTCAGGTGTGGATGCTAAGGCTATCCTCTCTGCTAGGCTCTCTAAGTCAAGAAGGCTTGAGAACCTCATTGCTCAGCTCCCTGGTGAGAAGAAGAACGGACTTTTCGGAAACTTGATCGCTCTCTCTCTCGGACTCACCCCTAACTTCAAGTCTAACTTCGATCTCGCTGAGGATGCAAAGCTCCAGCTCTCAAAGGATACCTACGATGATGATCTCGATAACCTCCTCGCTCAGATCGGAGATCAGTACGCTGATTTGTTCCTCGCTGCTAAGAACCTCTCTGATGCTATCCTCCTCAGTGATATCCTCAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCTCCACTCTCAGCTTCTATGATCAAGAGATACGATGAGCACCACCAGGATCTCACACTTCTCAAGGCTCTTGTTAGACAGCAGCTCCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGATCAGTCTAAGAACGGATACGCTGGTTACATCGATGGTGGTGCATCTCAAGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCTATCCTCGAGAAGATGGATGGAACCGAGGAACTCCTCGTGAAGCTCAATAGAGAGGATCTTCTCAGAAAGCAGAGGACCTTCGATAACGGATCTATCCCTCATCAGATCCACCTCGGAGAGTTGCACGCTATCCTTAGAAGGCAAGAGGATTTCTACCCATTCCTCAAGGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAGATTCTCACCTTCAGAATCCCTTACTACGTGGGACCTCTCGCTAGAGGAAACTCAAGATTCGCTTGGATGACCAGAAAGTCTGAGGAAACCATCACCCCTTGGAACTTCGAAGAGGTGGTGGATAAGGGTGCTAGTGCTCAGTCTTTCATCGAGAGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTTCCAAACGAGAAGGTGCTCCCTAAGCACTCTTTGCTCTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGTTGACCAAGGTTAAGTACGTGACCGAGGGAATGAGGAAGCCTGCTTTTTTGTCAGGTGAGCAAAAGAAGGCTATCGTTGATCTCTTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTGACCGTGAAGCAGCTCAAAGAGGATTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGATTCAGTTGAGATTTCTGGTGTTGAGGATAGGTTCAACGCATCTCTCGGAACCTACCACGATCTCCTCAAGATCATTAAGGATAAGGATTTCTTGGATAACGAGGAAAACGAGGATATCTTGGAGGATATCGTTCTTACCCTCACCCTCTTTGAAGATAGAGAGATGATTGAAGAAAGGCTCAAGACCTACGCTCATCTCTTCGATGATAAGGTGATGAAGCAGTTGAAGAGAAGAAGATACACTGGTTGGGGAAGGCTCTCAAGAAAGCTCATTAACGGAATCAGGGATAAGCAGTCTGGAAAGACAATCCTTGATTTCCTCAAGTCTGATGGATTCGCTAACAGAAACTTCATGCAGCTCATCCACGATGATTCTCTCACCTTTAAAGAGGATATCCAGAAGGCTCAGGTTTCAGGACAGGGTGATAGTCTCCATGAGCATATCGCTAACCTCGCTGGATCTCCTGCAATCAAGAAGGGAATCCTCCAGACTGTGAAGGTTGTGGATGAGTTGGTGAAGGTGATGGGAAGGCATAAGCCTGAGAACATCGTGATCGAAATGGCTAGAGAGAACCAGACCACTCAGAAGGGACAGAAGAACTCTAGGGAAAGGATGAAGAGGATCGAGGAAGGTATCAAAGAGCTTGGATCTCAGATCCTCAAAGAGCACCCTGTTGAGAACACTCAGCTCCAGAATGAGAAGCTCTACCTCTACTACCTCCAGAACGGAAGGGATATGTATGTGGATCAAGAGTTGGATATCAACAGGCTCTCTGATTACGATGTTGATCATATCGTGCCACAGTCATTCTTGAAGGATGATTCTATCGATAACAAGGTGCTCACCAGGTCTGATAAGAACAGGGGTAAGAGTGATAACGTGCCAAGTGAAGAGGTTGTGAAGAAAATGAAGAACTATTGGAGGCAGCTCCTCAACGCTAAGCTCATCACTCAGAGAAAGTTCGATAACTTGACTAAGGCTGAGAGGGGAGGACTCTCTGAATTGGATAAGGCAGGATTCATCAAGAGGCAGCTTGTGGAAACCAGGCAGATCACTAAGCACGTTGCACAGATCCTCGATTCTAGGATGAACACCAAGTACGATGAGAACGATAAGTTGATCAGGGAAGTGAAGGTTATCACCCTCAAGTCAAAGCTCGTGTCTGATTTCAGAAAGGATTTCCAATTCTACAAGGTGAGGGAAATCAACAACTACCACCACGCTCACGATGCTTACCTTAACGCTGTTGTTGGAACCGCTCTCATCAAGAAGTATCCTAAGCTCGAGTCAGAGTTCGTGTACGGTGATTACAAGGTGTACGATGTGAGGAAGATGATCGCTAAGTCTGAGCAAGAGATCGGAAAGGCTACCGCTAAGTATTTCTTCTACTCTAACATCATGAATTTCTTCAAGACCGAGATTACCCTCGCTAACGGTGAGATCAGAAAGAGGCCACTCATCGAGACAAACGGTGAAACAGGTGAGATCGTGTGGGATAAGGGAAGGGATTTCGCTACCGTTAGAAAGGTGCTCTCTATGCCACAGGTGAACATCGTTAAGAAAACCGAGGTGCAGACCGGTGGATTCTCTAAAGAGTCTATCCTCCCTAAGAGGAACTCTGATAAGCTCATTGCTAGGAAGAAGGATTGGGACCCTAAGAAATACGGTGGTTTCGATTCTCCTACCGTGGCTTACTCTGTTCTCGTTGTGGCTAAGGTTGAGAAGGGAAAGAGTAAGAAGCTCAAGTCTGTTAAGGAACTTCTCGGAATCACTATCATGGAAAGGTCATCTTTCGAGAAGAACCCAATCGATTTCCTCGAGGCTAAGGGATACAAAGAGGTTAAGAAGGATCTCATCATCAAGCTCCCAAAGTACTCACTCTTCGAACTCGAGAACGGTAGAAAGAGGATGCTCGCTTCTGCTGGTGAGCTTCAAAAGGGAAACGAGCTTGCTCTCCCATCTAAGTACGTTAACTTTCTTTACCTCGCTTCTCACTACGAGAAGTTGAAGGGATCTCCAGAAGATAACGAGCAGAAGCAACTTTTCGTTGAGCAGCACAAGCACTACTTGGATGAGATCATCGAGCAGATCTCTGAGTTCTCTAAAAGGGTGATCCTCGCTGATGCAAACCTCGATAAGGTGTTGTCTGCTTACAACAAGCACAGAGATAAGCCTATCAGGGAACAGGCAGAGAACATCATCCATCTCTTCACCCTTACCAACCTCGGTGCTCCTGCTGCTTTCAAGTACTTCGATACAACCATCGATAGGAAGAGATACACCTCTACCAAAGAAGTGCTCGATGCTACCCTCATCCATCAGTCTATCACTGGACTCTACGAGACTAGGATCGATCTCTCACAGCTCGGTGGTGATTCAAGGGCTGAT
配列番号５　ＳＶ４０　ＮＬＳ
CCTAAGAAGAAGAGGAAGGTT
配列番号６　ｇＲＮＡの発現カセット（１５５２ｂｐ）
CTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGAGGGCTGTTAACAAGCTTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGCACCCAACTTTTCTATACAAAGTTGTACTTTTTTCTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCYTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTAACTTTCCATCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACYTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGGGCTGTTAACAAGCTTGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTACTTTTTTCTCTTCTTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGTACTAAGGTAACACCCAAGATACTAAGGTAACACCCAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGAACC
配列番号７　ＡｔＵ６プロモーター１
CTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTG
配列番号８　ＧＢＳＳ　ｇＲＮＡ１
AGGGCTGTTAACAAGCTTGA
配列番号９　ｓｃａｆｆｏｌｄ　１
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGCACCCAACTTTTCTATACAAAGTTG
配列番号１０　ＡｔＵ６プロモーター２
CTTTTTTCTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCYTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTAACTTTCCATCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACYTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTG
配列番号１１　ＧＢＳＳ　ｇＲＮＡ２
GGGCTGTTAACAAGCTTGAT
配列番号１２　ｓｃａｆｆｏｌｄ　２
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACAACTTTGTATAATAAAGTTG
配列番号１３　ＡｔＵ６プロモーター３
CTTTTTTCTCTTCTTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTG
配列番号１４　ＧＢＳＳ　ｇＲＮＡ３
TACTAAGGTAACACCCAAGA
配列番号１５　ｓｃａｆｆｏｌｄ　３
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGAACC
配列番号１６　ＰＮａｔｉｖｅ（６９１ｂｐ）
ACTAGTCCCGTTACAAGTATTGCACGTTTTGTAAATTGCATATTAATGCAATCTGGATGTTTAATAACGAATGTAATGGCGTAGAAATATGTATTTTATTGTATTTATCTTTCACTATGTTGAAGTTTGCAATAATATGCTAATGTAAAATTAAAAAATTATGTACTGCCGCATTTGTTCAAATGGCGCCGTTATTTCAAAAATATCTTTGATTTTGTTACGAGGACAACGACTGCAGGAAGTAAATAAAAGACGCTGTTGTTAAGAAATTGCTATCATATGTGCCCAGCTATAGGGCCATTTAAGTTCAATTGTGAAATAGCCGCCCTTATTTTGACGTCTCATCAAATCAAATATTAAAAAATATCTCACTCTGTCGCCAGCAATGATGTAATAACCGCAGAAAAGTGAGAGTAAATCGCGGAAAAACGTCGCCGAGTGGCATGAATAGCGGCCTCCGTATTGCTGATTTAGTCAGCTTTATTTGACTTAAGGGTGCCCTCGTTAGTGACAAATTGCTTTCAAGGAGACAGCCATGCCCCACACTTTGTTGAAAAACAAGTTGCCTTTTGGGAAGAACCTAAAGCCACTTGCTCTTCAAGGAGGAATATCGAGGAAGAGAATATAACAGCCTCTGGTACAGACTTCTCTTGTGCAAAAATCAATTTGTATTCAACATATCGCAAGACCG 
配列番号１７　ＰＰｃＵｂｉ（９１７ｂｐ）
CTAGCAACGATTGTACAATTGCTTCTTTAAAAAAGGAAGAAAGAAAGAAAGAAAAGAATCAACATCAGCGTTAACAAACGGCCCCGTTACGGCCCAAACGGTCATATAGAGTAACGGCGTTAAGCGTTGAAAGACTCCTATCGAAATACGTAACCGCAAACGTGTCATAGTCAGATCCCCTCTTCCTTCACCGCCTCAAACACAAAAATAATCTTCTACAGCCTATATATACAACCCCCCCTTCTATCTCTCCTTTCTCACAATTCATCATCTTTCTTTCTCTACCCCCAATTTTAAGAAATCCTCTCTTCTCCTCTTCATTTTCAAGGTAAATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTTATTCCTTGTTTTAATTAGGTATGTATTATTGCTAGTTTGTTAATCTGCTTATCTTATGTATGCCTTATGTGAATATCTTTATCTTGTTCATCTCATCCGTTTAGAAGCTATAAATTTGTTGATTTGACTGTGTATCTACACGTGGTTATGTTTATATCTAATCAGATATGAATTTCTTCATATTGTTGCGTTTGTGTGTACCAATCCGAAATCGTTGATTTTTTTCATTTAATCGTGTAGCTAATTGTACGTATACATATGGATCTACGTATCAATTGTTCATCTGTTTGTGTTTGTATGTATACAGATCTGAAAACATCACTTCTCTCATCTGATTGTGTTGTTACATACATAGATATAGATCTGTTATATCATTTTTTTTATTAATTGTGTATATATATATGTGCATAGATCTGGATTACATGATTGTGATTATTTACATGATTTTGTTATTTACGTATGTATATATGTAGATCTGGACTTTTTGGAGTTGTTGACTTGATTGTATTTGTGTGTGTATATGTGTGTTCTGATCTTGATATGTTATGTATGTGCAGC
配列番号１８　Ｐ３５Ｓ（８４３ｂｐ）
GCCTCGAGTCTAGAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCATCAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGA
配列番号１９　Ｐ２ｘ３５Ｓ（７４８ｂｐ）
AACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGCCGG
配列番号２０　Ｐｅａ３Ａターミネーター（４６９ｂｐ）
CAGGCCTCCCAGCTTTCGTCCGTATCATCGGTTTCGACAACGTTCGTCAAGTTCAATGCATCAGTTTCATTGCCCACACACCAGAATCCTACTAAGTTTGAGTATTATGGCATTGGAAAAGCTGTTTTCTTCTATCATTTGTTCTGCTTGTAATTTACTGTGTTCTTTCAGTTTTTGTTTTCGGACATCAAAATGCAAATGGATGGATAAGAGTTAATAAATGATATGGTCCTTTTGTTCATTCTCAAATTATTATTATCTGTTGTTTTTACTTTAATGGGTTGAATTTAAGTAAGAAAGGAACTAACAGTGTGATATTAAGGTGCAATGTTAGACATATAAAACAGTCTTTCACCTCTCTTTGGTTATGTCTTGAATTGGTTTGTTTCTTCACTTATCTGTGTAATCAAGTTTACTATGAGTCTATGATCAAGTAATTATGCAATCAAGTTAAGTACAGTATAGGCTT
配列番号４４　トウモロコシユビキチンプロモーター（８９４ｂｐ）
TGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCT
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物からなる、植物ゲノム編集効率向上剤。
  2. 　前記核酸構築物がベクターである、請求項１に記載の植物ゲノム編集効率向上剤。
  3. 　請求項１に記載の植物ゲノム編集効率向上剤を含む、植物ゲノム編集効率向上用組成物。
  4. 　ゲノム編集系をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３に記載の植物ゲノム編集効率向上用組成物。
  5. 　植物におけるゲノム編集効率を向上させる方法であって、請求項４に記載の組成物を植物細胞に導入する構築物導入工程を含む、方法。
  6. 　ゲノム編集植物を作出する方法であって、請求項４に記載の組成物を植物細胞に導入する構築物導入工程を含む、方法。
  7. 　請求項４に記載の組成物を植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入する構築物導入工程、及び
    　前記組成物を導入した植物組織片又はそれに由来する培養細胞を培養して植物体を再生させる再生工程
    を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記再生工程が、植物組織片又はそれに由来する培養細胞を植物ホルモン含有培地で培養することを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記再生工程で得られた再生植物体からゲノムＤＮＡを抽出し、目的の改変が導入されたゲノム編集植物を選抜する工程をさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸構築物からなる、植物組織片由来の再生植物体の生成促進剤。
  11. 　前記核酸構築物がベクターである、請求項１０に記載の再生植物体の生成促進剤。
  12. 　請求項１０に記載の再生植物体の生成促進剤を含む、植物組織片由来の再生植物体の生成促進用組成物。
  13. 　植物組織片由来の再生植物体の生成を促進する方法であって、
    　請求項１０に記載の再生植物体の生成促進剤を植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入する構築物導入工程、及び
    　再生植物体の生成促進剤を導入した植物組織片又はそれに由来する培養細胞を培養して植物体を再生させる再生工程を含む、
    方法。
  14. 　植物組織片由来の再生植物体を作出する方法であって、
    　請求項１０に記載の再生植物体の生成促進剤を植物組織片又はそれに由来する培養細胞に導入する構築物導入工程、及び
    　再生植物体の生成促進剤を導入した植物組織片又はそれに由来する培養細胞を培養して植物体を再生させる再生工程を含む、
    方法。
  15. 　前記再生工程が、植物組織片又はそれに由来する培養細胞を植物ホルモン含有培地で培養することを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2019103034A1 (ja) * 2017-11-27 2019-05-31 国立研究開発法人理化学研究所 ゲノム編集植物の生産方法
WO2021022043A2 (en) * 2019-07-30 2021-02-04 Pairwise Plants Services, Inc. Morphogenic regulators and methods of using the same

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