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WO2025206046A1 - 所望のヌクレオチド配列をノックインする方法、ノックイン細胞の製造方法、及びキット - Google Patents

所望のヌクレオチド配列をノックインする方法、ノックイン細胞の製造方法、及びキット

Info

Publication number
WO2025206046A1
WO2025206046A1 PCT/JP2025/012229 JP2025012229W WO2025206046A1 WO 2025206046 A1 WO2025206046 A1 WO 2025206046A1 JP 2025012229 W JP2025012229 W JP 2025012229W WO 2025206046 A1 WO2025206046 A1 WO 2025206046A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
dna
domain
acid sequence
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/012229
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
忠彦 吉間
哲史 佐久間
卓 山本
奈穂子 西堀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hiroshima University NUC
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Hiroshima University NUC
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hiroshima University NUC, Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Hiroshima University NUC
Publication of WO2025206046A1 publication Critical patent/WO2025206046A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Definitions

  • the technique of inserting or substituting a desired nucleotide sequence into a specific region of target DNA, such as genomic DNA, is called “knock-in.”
  • One known method involves using the CRISPR-Cas system to cut double-stranded DNA, then utilizing a repair mechanism called homology-directed repair (HDR) at the break to insert or replace donor DNA containing the desired nucleotide sequence at or near the break.
  • HDR homology-directed repair
  • the donor DNA used is single-strand DNA (ssDNA) that has sequences (homology arms) at the 5' and 3' ends of the nucleotide sequence to be inserted that are homologous to the surrounding sequences of the target region to which it is to be inserted, or, if the sequence to be inserted is long, a donor plasmid containing the nucleotide sequence of such single-strand DNA is used.
  • ssDNA single-strand DNA
  • a donor plasmid containing the nucleotide sequence of such single-strand DNA is used.
  • Non-Patent Document 2 reports that efficient knock-in using the CRISPR-Cas9 system is possible even in cultured cells by using lssDNA (long single strand DNA: lssDNA) as donor DNA, which has homology arms of approximately 500 bases or more at both ends. Furthermore, while lssDNA is difficult to prepare and its use has been limited, for example, Inoue et al., Cells, 2021, 10, 1076. https://doi.org/10.3390/cells10051076 (Non-Patent Document 3) reports a simpler and less expensive method for preparing lssDNA.
  • lssDNA long single strand DNA: lssDNA
  • knock-in techniques using double-stranded DNA cleavage as described above have the problem of causing unintended insertions or deletions of nucleotide sequences.
  • Techniques that do not use double-stranded DNA cleavage include, for example, a technique described by Nakajima et al., Genome Research, 28, 2018, pp.
  • Non-Patent Document 4 in which a donor plasmid is combined with a nickase-type Cas9 (nCas9, Cas9D10A) that partially lacks the double-stranded DNA cleavage activity of Cas9, and the nucleotide sequence of the donor plasmid is inserted at the site of single-stranded DNA cleavage (nicking) caused by nCas9 (combination of single nicks in the target gene and donor plasmid: SNGD).
  • nickase-type Cas9 nickase-type Cas9
  • TALEN Transcription activator-like effector nuclease
  • FokI FrokI nuclease domain
  • TALE Transcription activator-like effector nuclease
  • the TALEs of a pair of TALENs bind to opposite strands of the target DNA, and the FokI nuclease domains form a dimer with each other, thereby achieving site-specific double-stranded DNA cleavage activity (nuclease activity).
  • FokI nuclease domain there have been reports of linking two FokI nuclease domains and binding them to a zinc finger array (ZF) or TALE to induce double-stranded DNA breaks (Minczuk et al., Nucleic Acids Research, 36(12), 2008, pp. 3926-3938 (Non-Patent Document 5)), and of inducing single-stranded DNA breaks (nicks) using a construct with a mutation in one of the FokI nuclease domains (Yan Luo et al., Scientific Reports, 6:20657, 2016, doi: 10.1038/srep20657 (Non-Patent Document 6)).
  • ND1 domain nuclease domain 1
  • ND1 domain nuclease domain 1
  • an artificial nucleic acid cleaving enzyme that includes this ND1 domain and a DNA-binding domain such as a ZF or TALE (WO 2020/045281 (Patent Document 1)).
  • ND1 domain nuclease domain 1 (ND1 domain) described in Patent Document 1, which is a substitute for the FokI nuclease domain, into a dND1 domain with a nuclease activity-deficient mutation and by combining ND1 and dND1 to form a dimer
  • a nicking enzyme nickase active form
  • nCas9 nickase-type Cas9
  • Non-Patent Document 6 in which the FokI nuclease domain was modified, it would be expected that a nick would be introduced into the strand recognized and bound by a domain that has not been mutated to eliminate nuclease activity.
  • ssDNA single-stranded DNA
  • a method for inserting a donor sequence into a target region on a target DNA comprising: a donor DNA that is a single-stranded DNA containing a nucleotide sequence arranged in the following order from the 5' side: a 5' side homology arm sequence, a donor sequence, and a 3' side homology arm sequence; a site-specific nicking system comprising a first fusion protein comprising a first DNA-binding domain and an ND1 domain, and a second fusion protein comprising a second DNA-binding domain and a dND1 domain, wherein the ND1 domain and the dND1 domain form a dimer to introduce a nick within or near the target region; contacting the target DNA with The ND1 domain comprises the following (a) to (c): (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40; (b) a polypeptide comprising an amino acid sequence
  • the present invention makes it possible to provide a method for specifically and highly efficiently inserting (knock-in) a desired nucleotide sequence into a target region using only a protein, a method for producing cells in which a desired nucleotide sequence has been inserted into a target region (knock-in cells), and kits for use in these methods.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing the positional relationship between the PAM sequences on the target genes APC (a) and Rosa26 (b), the cleavage points by nCas9 (D10A), and each TALE and guide RNA used in Test Example 1.
  • This graph shows the EGFP fluorescence intensity (RFI) when the SSA assay reporter plasmid EGxRosa26xFP, which is equipped with Rosa26 as the target gene, is treated with a combination of TALE47(Rosa26-L)-ND1 and TALE47(Rosa26-R)-ND1, a combination of TALE47(Rosa26-L)-dND1 and TALE47(Rosa26-R)-ND1, or a combination of TALE47(Rosa26-L)-ND1 and TALE47(Rosa26-R)-dND1, or a combination of TALE47(Rosa26-L)-ND1 and TALE47(Rosa26-R)-dND1, or these, further treated with nCas9(D10A) and guide RNA (Rosa26_gRNA-C or Rosa26_gRNA-B).
  • RPI EGFP fluorescence intensity
  • Fluorescence images of each EGFP in the combinations shown in Table 9 ((a): Mock, (b) SNGD, (c) dND1+ND1+PD, (d) dND1+ND1+lssDNA). This is a graph showing the average number of EGFP-positive cells/total number of cells (%) for each of four wells obtained from the fluorescent images of each EGFP in the combinations shown in Table 9 ((a): Mock, (b) SNGD, (c) dND1+ND1+PD, (d) dND1+ND1+lssDNA).
  • FIG. 10 is a graph showing the relative value (relative activity) and standard deviation of the average value of the number of EGFP-positive cells/total number of cells (%) for four wells obtained from the fluorescence images of each EGFP for the combinations shown in Table 10 ((a): PD-0 (base), (b): 20 ng lssDNA, (c): 40 ng lssDNA, (d): 60 ng lssDNA), where (a) the base value is set to 1.
  • the nicking enzyme of the present invention is an artificial nicking enzyme comprising two domains, ND1 and dND1, and has single-stranded DNA cleavage activity (nickase activity) that cleaves only one strand of double-stranded DNA.
  • ND1 domain The "ND1 domain” according to the present invention is nuclease domain 1, which is one of the nuclease domains discovered by the present inventors through screening for homologous sequences with 35 to 70% identity to the FokI nuclease domain (Patent Document 1).
  • a typical nucleotide sequence of the ND1 domain is (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40, more preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 has 70% identity with the amino acid sequence of the FokI nuclease domain.
  • ND1 domain of the present invention includes polypeptides containing an amino acid sequence highly homologous to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40, as long as they have double-stranded DNA cleavage activity (nuclease activity) when two molecules of the ND1 domain are used.
  • nuclease domains include, for example, ND1 domains derived from other bacteria and modified ND1 domains (natural mutants and artificial mutants).
  • embodiments of the "ND1 domain" of the present invention also include (b) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40, and more preferably a polypeptide consisting of said amino acid sequence.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40, and more preferably a polypeptide consisting of said amino acid sequence.
  • at least the amino acids corresponding to positions 66 and 83 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 must be aspartic acid.
  • substituted, deleted, inserted, and/or added amino acid sequence refers to an amino acid sequence in which amino acids (amino acid residues) in the amino acid sequence have been substituted, deleted, inserted, or added, or an amino acid sequence in which two or more of these have been combined.
  • “multiple” refers to an integer of 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2.
  • “one or multiple” preferably refers to 1 to 30, 1 to 25, or 1 to 20 amino acid residues (e.g., 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, or 2 or less).
  • embodiments of the "ND1 domain” according to the present invention include (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40, and more preferably a polypeptide consisting of said amino acid sequence.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40, and more preferably a polypeptide consisting of said amino acid sequence.
  • the sequence is not a nuclease activity-deficient mutant sequence described below, and therefore at least the amino acids corresponding to positions 66 and 83 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 must be aspartic acid.
  • amino acid sequence homology when referring to amino acid sequence homology, it means that when a control amino acid sequence (e.g., the amino acid sequence of the polypeptide (a)) and a target amino acid sequence (e.g., the amino acid sequence of the polypeptide (c)) are aligned using amino acid sequence analysis software, etc., the amino acid in the target amino acid sequence (target amino acid) that is at the same position as an amino acid in the control amino acid sequence (control amino acid) may be the same amino acid as the control amino acid, or an amino acid with the same properties as the control amino acid.
  • the target amino acid is the same amino acid as the control amino acid.
  • Groups of amino acids with similar properties are well known in the art to which this invention pertains, and can be classified into, for example, acidic amino acids (aspartic acid and glutamic acid); basic amino acids (lysine, arginine, histidine); and neutral amino acids can be classified into amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), amino acids with hydroxy groups (serine, threonine), amino acids containing sulfur (cysteine, methionine), amino acids with amide groups (asparagine, glutamine), amino acids with imino groups (proline), and amino acids with aromatic groups (phenylalanine, tyrosine, tryptophan).
  • acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid
  • basic amino acids lysine, arginine, histidine
  • neutral amino acids can be classified into amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, iso
  • sequence homology and identity are determined by comparing two sequences aligned to maximize sequence identity. Methods for determining sequence homology or identity (%) are known to those of skill in the art. Algorithms for achieving optimal alignment and sequence identity can be any algorithm known to those of skill in the art (e.g., the BLAST algorithm, the FASTA algorithm, etc.), and sequence homology or identity of amino acid sequences can be determined using sequence analysis software such as BLASTP or FASTA.
  • the one or more amino acid residues are preferably 1 to 30, 1 to 25, or 1 to 20 (e.g., 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, or 2 or less).
  • the homology with the amino acid sequence of polypeptide (da) may be 90% or more, but is preferably 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 97.5% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 99.8% or more).
  • a fusion product in which "TALE-L ⁇ domain to be confirmed” is linked in this order from the N-terminus, and a fusion product in which "TALE-R ⁇ amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 (ND1 domain)" is linked in this order from the N-terminus can be expressed in cells, and confirmation can be made by determining whether double-stranded DNA cleavage occurs in the target DNA corresponding to the TALE.
  • an SSA assay system targeting a reporter gene on a plasmid e.g., an EGFP gene with a TALE recognition sequence inserted
  • nickase activity a molecule containing two ND1 domains and two dND1 domains has the activity of cleaving single-stranded DNA (nickase activity) can be appropriately confirmed using methods known to those skilled in the art or methods similar thereto.
  • TALE Transcription activator-like effector nuclease
  • TALE Transcription activator-like effector nuclease
  • the "TALE” according to the present invention contains at least an N-terminal domain and a TALE repeat domain, and may further contain a C-terminal domain.
  • a TALE repeat domain is composed of multiple, for example, 10 to 30, preferably 13 to 25, and more preferably 15 to 20 tandem repeats (TALE repeats) of TALE sequences that form a right-handed superhelical coil.
  • a typical TALE repeat unit (one TALE sequence) consists of 33 to 35 amino acids, and recognizes specific bases in DNA via repeat variable residues (RVD) consisting of two amino acid residues at the 12th and 13th positions.
  • RVDs repeat variable residues
  • Examples of RVDs that specifically recognize bases include HD, which recognizes C; NG, which recognizes T; NI, which recognizes A; NN, which recognizes G or A; and NS, which recognizes A, C, G, or T.
  • the TALE sequences of the TALEs of the present invention may each be appropriately modified from their native amino acid sequences, so long as the TALE repeat domain can recognize and bind to the TALE recognition sequence.
  • the TALE sequences may each independently have a different RVD position, or one or more amino acid residues other than the RVD (e.g., 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, preferably 5 or less or 4 or less, more preferably 3 or less or 2 or less) may be substituted, deleted, inserted, and/or added, and the two amino acid residues at positions 12 and 13 of the RVD may be substituted with other amino acid residues to enhance specificity for A, T, C, and G.
  • one or more amino acid residues other than the RVD e.g., 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, preferably 5 or less or 4 or less, more preferably 3 or less or 2 or less
  • the N-terminal domain of the TALE of the present invention can be a naturally occurring amino acid sequence (e.g., the amino acid sequence of the N-terminal domain contained in Addgene's pTALETF_v2 (ID: 32185-32188)). However, as long as the N-terminal domain does not have a significant negative effect on the function of each fusion protein of the present invention (e.g., binding ability to the TALE recognition sequence, nickase activity, etc.), it may be modified as appropriate from the naturally occurring amino acid sequence.
  • the chain length of such an N-terminal domain is preferably 49 to 287 amino acid residues, more preferably 80 to 200 amino acid residues, and even more preferably 120 to 180 amino acid residues.
  • one or more amino acid residues may be substituted, deleted, inserted, and/or added.
  • the C-terminal domain of the TALE may be a naturally occurring amino acid sequence with a portion of the C-terminal amino acid sequence removed.
  • the chain length of such a C-terminal domain is preferably 1 to 200 amino acid residues, more preferably 5 to 150 amino acid residues, even more preferably 10 to 125 amino acid residues, and even more preferably 10 to 100 amino acid residues.
  • a preferred embodiment of the TALE of the present invention is the Platinum TALEN (JP 2015-33365 A), in which amino acids at two specific positions in one TALE repeat unit are changed every four TALE repeat units.
  • the zinc finger array of the present invention represents the DNA-binding domain of a zinc finger nuclease (ZFN) that contains a DNA-binding domain and a nuclease domain.
  • ZFN zinc finger nuclease
  • a zinc finger array typically comprises 2 to 15, preferably 3 to 8, and more preferably 4 to 6, zinc finger proteins, which are linked directly or via linkers.
  • Each zinc finger protein contains one or more zinc atoms and a helix structure that recognizes specific bases, and each zinc finger protein recognizes three specific bases in DNA.
  • the zinc finger array of the present invention is not particularly limited as long as it can recognize and bind to a DNA-binding domain recognition sequence, and may be modified as appropriate. For example, it may be modified by substitution, deletion, insertion, and/or addition of one or more amino acid residues (e.g., 50 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, preferably 5 or less or 4 or less, and more preferably 3 or less or 2 or less).
  • one or more amino acid residues e.g., 50 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, preferably 5 or less or 4 or less, and more preferably 3 or less or 2 or less.
  • the zinc finger array of the present invention is designed to recognize a nucleotide sequence or its complementary sequence located on the 5' or 3' side of a target site in a target DNA, preferably via a spacer of 1 to 10 bases, respectively.
  • the zinc finger array recognition sequence or its complementary sequence recognized by the zinc finger array is a nucleotide sequence located on the 5' or 3' side of the target site, respectively, via a spacer of 1 to 10 bases.
  • each DNA-binding domain and the ND1 domain or dND1 domain may be linked directly or via a linker.
  • linker There are no particular limitations on the length or type of the linker, as long as it does not significantly negatively affect the function of each fusion protein of the present invention (e.g., binding ability to the DNA-binding domain recognition sequence, nickase activity, etc.).
  • the length of the linker is typically 2 to 180 amino acid residues, preferably 2 to 120 amino acid residues.
  • the chain length of the linker can be adjusted so that the distance between the TALE repeat domain and the ND1 domain or dND1 domain is 1 to 200 amino acid residues, preferably 5 to 150 amino acid residues, more preferably 10 to 125 amino acid residues, and even more preferably 10 to 100 amino acid residues, including the chain length of the N-terminal domain of the TALE (when the order is ND1 domain or dND1 domain ⁇ DNA-binding domain from the N-terminus) or C-terminal domain (when the order is DNA-binding domain ⁇ ND1 domain or dND1 domain from the N-terminus), more preferably the latter.
  • the distance between the TALE repeat domain and the ND1 domain or dND1 domain is the number of amino acid residues from the N-terminus to the residue adjacent to the N-terminus of the ND1 domain or dND1 domain, starting from the amino acid residue adjacent to the C-terminus of the TALE repeat domain as the first residue, if the order is DNA-binding domain ⁇ ND1 domain or dND1 domain; and from the N-terminus to the residue adjacent to the C-terminus of the ND1 domain or dND1 domain, starting from the amino acid residue adjacent to the N-terminus of the TALE repeat domain as the first residue, if the order is ND1 domain or dND1 domain ⁇ DNA-binding domain, it is the number of amino acid residues from the amino acid residue adjacent to the N-terminus of the TALE repeat domain as the first residue, starting from the amino acid residue adjacent to the N-terminus of the TALE repeat domain as the first residue,
  • linker is not particularly limited, and examples include the HTS95 linker consisting of the HTS95 amino acid sequence described in Sun, N., & Zhao, H. (2014) Molecular BioSystems, 10(3), pp. 446-453, GSS linker, SAGG linker, GGGGS linker, XTEN linker, etc.
  • the DNA-binding domain and the ND1 domain or dND1 domain may be located on either the N-terminal or C-terminal side, with the linker interposed as needed.
  • the fusion protein of the present invention is preferably linked in the following order from the N-terminal side: DNA-binding domain ⁇ (the linker as needed) ⁇ ND1 domain or dND1 domain, from the viewpoint of exhibiting excellent nickase activity that is particularly specific to DNA strands, i.e., specific to strands having a DNA-binding domain recognition sequence to which the second fusion protein binds.
  • the DNA-binding domain and the ND1 domain or dND1 domain can be linked at the nucleic acid level and the amino acid level. That is, polynucleotides encoding each of the fusion proteins of the present invention can be prepared by ligating the respective polynucleotides in the order of "polynucleotide encoding the ND1 domain or dND1 domain ⁇ polynucleotide encoding the DNA-binding domain" or "polynucleotide encoding the DNA-binding domain ⁇ polynucleotide encoding the ND1 domain or dND1 domain.” The polynucleotides obtained in this manner can be inserted into an expression vector and expressed in an appropriate host cell, thereby obtaining each of the fusion proteins of the present invention in which the domains are linked at the amino acid level in the order of "ND1 domain or dND1 domain ⁇ DNA-binding domain" or "DNA-binding domain
  • the expression vector can be appropriately selected from vectors used in the relevant field, and examples thereof include plasmid vectors, viral vectors, phage vectors, phagemid vectors, BAC vectors, YAC vectors, MAC vectors, and HAC vectors.
  • Host cells into which the expression vector is introduced can be appropriately selected taking into consideration compatibility with the expression vector, and examples include prokaryotic cells such as Escherichia coli, actinomycetes, and archaea, and eukaryotic cells such as yeast, sea urchin, silkworm, zebrafish, mouse, rat, frog, tobacco, Arabidopsis, and rice.
  • polynucleotide encompasses both DNA and RNA (mRNA), and each polynucleotide may have its codons optimized for purposes such as increasing expression efficiency within cells.
  • Fusion proteins according to the present invention can also be prepared by artificial synthesis based on amino acid sequence information. Furthermore, fusion proteins according to the present invention may be added with epitope tags (e.g., flag tags, HA tags, etc.) for purification or detection, labeled proteins (e.g., fluorescent proteins, etc.), or various transport signals (e.g., nuclear transport signals, plastid transport signals, mitochondrial transport signals, etc.).
  • epitope tags e.g., flag tags, HA tags, etc.
  • labeled proteins e.g., fluorescent proteins, etc.
  • transport signals e.g., nuclear transport signals, plastid transport signals, mitochondrial transport signals, etc.
  • target DNA DNA containing this target region
  • the target DNA according to the present invention is double-stranded DNA, and for the sake of convenience, in order to show its correspondence with the above-described nicking system of the present invention, at least one strand is defined as having a structure containing, from the 5' side, a 5' DNA-binding domain recognition sequence or its complementary sequence, optionally the spacer, the target region, optionally the spacer, and a 3' DNA-binding domain recognition sequence or its complementary sequence.
  • the 5' DNA-binding domain recognition sequence and the 3' DNA-binding domain recognition sequence may be located on the same strand or on opposite strands, but are preferably located on opposite strands.
  • the target DNA of the present invention includes, adjacent to the 5' side of the target region, a 5' side sequence that is identical to the 5' side homology arm sequence (5'HA) of the donor DNA described below, and also includes, adjacent to the 3' side, a 3' side sequence that is identical to the 3' side homology arm sequence (3'HA) of the donor DNA described below.
  • the 5' side sequence and 3' side sequence may overlap with the 5' DNA-binding domain recognition sequence or its complementary sequence, or the 3' DNA-binding domain recognition sequence or its complementary sequence, respectively.
  • target region in the present invention refers to a region into which a donor sequence of the donor DNA described below is inserted or replaced with the donor sequence.
  • the target region is a region containing the cleavage site cleaved by the nicking enzyme or a region adjacent to the cleavage site. Its length may be a single location between two adjacent bases at the cleavage site or two bases adjacent to the cleavage site, a single base adjacent to the cleavage site or adjacent to the cleavage site, or two or more bases including the cleavage site or adjacent to the cleavage site.
  • "inserting a donor sequence into a target region” includes not only an embodiment in which the donor sequence is inserted between two bases on either side of the cleavage site or adjacent to it, but also an embodiment in which one or more bases of the target region are replaced with the donor sequence.
  • the length of a target region of one or more bases is, for example, preferably 1 to 500 bases, more preferably 2 to 300 bases, and even more preferably 2 to 100 bases.
  • the "5' DNA-binding domain recognition sequence” and "3' DNA-binding domain recognition sequence” of the present invention are sequences recognized by either the first DNA-binding domain or the second DNA-binding domain, respectively.
  • the first DNA-binding domain and the second DNA-binding domain may bind to each other's DNA-binding domain recognition sequence, and either may bind to the 5' DNA-binding domain recognition sequence or the 3' DNA-binding domain recognition sequence.
  • the distance between DNA-binding domain recognition sequences according to the present invention is preferably 1 to 50 bases, more preferably 2 to 40 bases, and more preferably 3 to 30 bases, from the viewpoint of enabling the nicking enzyme of the present invention to form a dimer and specifically and efficiently introduce nicks within or near the target region.
  • the nucleotide sequence of such target DNA is not particularly limited, and can be used as a target for the knock-in method of the present invention by designing the donor DNA described below and each DNA-binding domain in the first fusion protein and second fusion protein so that the 5' DNA-binding domain recognition sequence or its complementary sequence, the 3' DNA-binding domain recognition sequence or its complementary sequence, the distance between the DNA-binding domain recognition sequences, the 5' side sequence, and the 3' side sequence satisfy the above conditions.
  • the target DNA of the present invention can be DNA present within a cell (endogenous DNA) or DNA present outside a cell, depending on the purpose.
  • DNA present within a cell may be endogenous DNA or exogenous DNA.
  • Examples of endogenous DNA include genomic DNA, chloroplast DNA, and mitochondrial DNA within the nucleus, while examples of exogenous DNA include DNA introduced into a cell.
  • the target DNA of the present invention is DNA present within a cell (endogenous DNA)
  • it is more preferable that the DNA is genomic DNA within a nucleus or exogenous DNA.
  • DNA present outside a cell may be DNA derived from a cell, or DNA amplified and synthesized outside the cell.
  • the knock-in method of the present invention is characterized by using single-stranded DNA (ssDNA) containing a donor sequence as the donor DNA.
  • a "donor sequence” refers to a desired nucleotide sequence intended to be inserted into the target region of the target DNA, and is not particularly limited, and any nucleotide sequence can be used.
  • the knock-in method of the present invention replaces the target region with this donor sequence.
  • the donor sequence may be a sequence in which a mutation (e.g., base substitution, deletion, addition, or insertion) has been introduced into the target region.
  • the donor sequence may be a sequence containing a foreign DNA sequence (e.g., a recombinase recognition sequence, a recombinase expression cassette, a drug resistance gene expression cassette, a negative selection marker expression cassette, a fluorescent protein expression cassette, etc.).
  • the donor sequence may also be a sequence in which the foreign DNA sequence has been introduced into the target region (or a mutated sequence thereof).
  • the length of such a donor sequence is not particularly limited and can be, for example, 1 to 10,000 bases, preferably 10 to 10,000 bases, more preferably 30 to 5,000 bases, and even more preferably 50 to 3,000 bases.
  • the donor DNA of the present invention also includes, on the 5' side of the donor sequence, a 5' homology arm sequence (sometimes referred to herein as "5' HA”) that is identical to the nucleotide sequence adjacent to the 5' side of the target region (5' side sequence), and, on the 3' side, a 3' homology arm sequence (sometimes referred to herein as "3' HA”) that is identical to the nucleotide sequence adjacent to the 3' side of the target region (3' side sequence).
  • a 5' homology arm sequence (sometimes referred to herein as "5' HA”) that is identical to the nucleotide sequence adjacent to the 5' side of the target region (5' side sequence)
  • 3' homology arm sequence sometimes referred to herein as "3' HA”
  • 5'HA is the same as the nucleotide sequence adjacent to the 5' side of the target region on the sense strand
  • 3'HA is the same as the nucleotide sequence adjacent to the 3' side of the target region on the sense strand.
  • 5'HA is the same as the nucleotide sequence adjacent to the 5' side of the target region on the antisense strand
  • 3'HA is the same as the nucleotide sequence adjacent to the 3' side of the target region on the antisense strand.
  • the length of each of the homology arms is preferably 10 to 800 bases, more preferably 20 to 750 bases, and even more preferably 30 to 700 bases.
  • the donor DNA of the present invention is preferably a long single-stranded DNA (lssDNA) in which the length of each of the homology arms is independently 100 bases or more, and the length of each of the homology arms is more preferably 100 to 700 bases, and even more preferably 100 to 600 bases.
  • the donor DNA of the present invention is preferably a single-stranded DNA consisting only of a nucleotide sequence arranged in the following order from the 5' end: 5' HA, donor sequence, 3' HA. However, it is not limited to this as long as it does not significantly impair the effects of the present invention (knock-in efficiency, etc.).
  • a nucleotide sequence consisting of any number of bases preferably 100 bases or less may be added to the 5' end and/or 3' end.
  • the length (total length) of such donor DNA is not particularly limited, but can be, for example, 21 to 11,600 bases, preferably 40 to 10,000 bases, more preferably 60 to 6,000 bases, and even more preferably 100 to 4,000 bases.
  • the donor DNA of the present invention can be prepared by known methods for preparing single-stranded DNA or methods similar thereto. For example, it can be prepared using PCR, restriction enzyme digestion, DNA ligation techniques, etc. Furthermore, according to the method described in Inoue et al., Cells, 2021, 10, 1076.
  • the sequence of single-stranded DNA can be amplified by PCR using a primer set in which one of the primers is phosphorylated at the 5' end, and the strand of the resulting double-stranded DNA with the phosphorylated 5' end is digested from the phosphorylated end, thereby preparing the desired single-stranded DNA even in the case of long single-stranded DNA.
  • the donor DNA and a nicking system are brought into contact with the target DNA, and the nicking system cleaves within or near the target region, thereby inserting the donor sequence into the target region.
  • in the vicinity preferably refers to a position within 100 bases, and more preferably within 50 bases, counting the base adjacent to the target region as the first base.
  • the knock-in method of the present invention may be performed within a cell or in a cell-free system.
  • the "inside the cell” where the knock-in method of the present invention is performed may be a eukaryotic cell or a prokaryotic cell, preferably a eukaryotic cell.
  • eukaryotic cells include animal cells (such as cells of mammals, fish, birds, reptiles, amphibians, and insects), plant cells, algae cells, and yeast.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli, Salmonella, Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, and extreme thermophiles.
  • the donor DNA and nicking system are brought into contact with the target DNA by introducing the donor DNA and nicking system into the cell, or by introducing the donor DNA into the cell and expressing the nicking system within the cell.
  • the nicking system of the present invention may be such that each of the fusion proteins constituting the system is introduced into the cell in the form of a protein, or in the form of RNA or DNA (polynucleotide) encoding the protein and expressed within the cell, or in the form of a vector (expression vector) containing the polynucleotide and expressing the protein and expressed within the cell.
  • mammals When producing a model animal, mammals are preferably rodents such as mice, rats, guinea pigs, and hamsters, with mice being particularly preferred.
  • Examples of the plant include grains, oilseed crops, forage crops, fruits, and vegetables.
  • Specific examples of crops include rice, corn, banana, peanut, sunflower, tomato, rapeseed, tobacco, wheat, barley, potato, soybean, cotton, and carnation.
  • the present invention also relates to a kit for use in the above-mentioned knock-in method of the present invention, the method for producing a knock-in cell of the present invention, or the method for producing a non-human individual of the present invention, At least one selected from the group consisting of a first fusion protein, a first fusion protein expression vector that expresses the first fusion protein, and a polynucleotide that encodes the first fusion protein; at least one selected from the group consisting of a second fusion protein, a second fusion protein expression vector that expresses the second fusion protein, and a polynucleotide that encodes the second fusion protein;
  • a kit comprising:
  • the first fusion protein and the second fusion protein are each as described above in the nicking system of the present invention, including their preferred embodiments. These may each independently be in the form of a protein, a polynucleotide encoding the protein, or a vector (expression vector) that expresses the protein.
  • the expression vectors for the first fusion protein and the second fusion protein, and the polynucleotides encoding them, are also as described above, including their preferred embodiments.
  • the kit of the present invention may further include the donor DNA, as described above in the knock-in method of the present invention, including its preferred embodiments. However, the donor DNA to be used in each method may be designed and synthesized by the user as appropriate depending on the target region of the target DNA.
  • TALE Vector Set Confirmation of nickase activity by single-strand annealing (SSA) assay [Method]
  • SSA single-strand annealing
  • module sequences were then inserted into pEX-A2J2 (Eurofins Genomics, Tokyo, Japan) to prepare a module plasmid set (16 types in total: pEX1HD to pEX4HD, pEX1NG to pEX4NG, pEX1NI to pEX4NI, and pEX1NN to pEX4NN).
  • a destination vector (TALE47 vector) was created by inserting one of the module sequences and a sequence encoding the TALE C-terminal domain following the 3' end of the N-terminal domain of the TALE, created by artificial DNA synthesis, into pcDNA3.1s, which was prepared by removing the drug resistance gene expression unit from pcDNA3.1(+) (Thermo Fisher Scientific).
  • the C-terminal domain of the TALE used was one with 47 amino acids (47), and the sequence encoding "47” was synthesized using artificial DNA based on the C-terminal domain sequence contained in Addgene's ptCMV-153/47-VR-NG (Addgene ID: 50704).
  • TALE-ND1 Expression Plasmid and TALE-dND1 Expression Plasmid Using DNA encoding an artificially synthesized ND1 domain (nucleotide sequence number: 39, amino acid sequence number: 40) as a template, a fragment (ND1) was amplified by PCR using the primer set shown in Table 1 below, and using the TALE47 vector prepared in (1) above as a template, a fragment (TALE47) was amplified by PCR using the primer set shown in Table 1 below. These fragments were then ligated by the in-fusion method to prepare a TALE47-ND1 expression plasmid that expresses a fusion protein in which the ND1 domain is fused to the C-terminus of TALE47.
  • TALE47-ND1 expression plasmid As a template, fragments amplified by PCR using the two primer sets shown in Table 1 below were ligated by the in-fusion method to create a site-directed mutagenesis method to prepare a TALE47-dND1 expression plasmid that expresses a fusion protein in which a dND1 domain (nucleotide sequence number: 41, amino acid sequence number: 42) in which the D66N mutation was introduced into the ND1 domain was fused to the C-terminus of TALE47.
  • a dND1 domain nucleotide sequence number: 41, amino acid sequence number: 42
  • TALE47 in the TALE47-ND1 expression plasmid and TALE47-dND1 expression plasmid prepared above contained TALE repeat domains (APC-L, APC-R, Rosa26-L, Rosa26-R) corresponding to the TALE recognition sequences listed in Table 2 below, respectively, and was subjected to the SSA assay described below.
  • TALE repeat domains APC-L, APC-R, Rosa26-L, Rosa26-R
  • a nickase-type nCas9(D10A) expression plasmid (pX330(D10A)_BS) and a guide RNA expression plasmid (pX330_BS- ⁇ Cas9) were prepared in a manner similar to that described in WO 2023-038023.
  • Each guide RNA was designed to correspond to the guide RNA target sequence on each target gene shown in Table 3 below (Table 3 shows the complementary sequence (sequences other than those underlined) and the PAM sequence (underlined sequence) of the guide RNA target sequence (on the antisense strand)).
  • Figure 1 shows a conceptual diagram of the positional relationship between the PAM sequences on the target genes APC and Rosa26 (the positions corresponding to the PAM sequences on the guide RNA are shown in Figure 1), the cleavage point by nCas9(D10A), and each TALE and guide RNA.
  • HEK293T cells grown in DMEM medium containing 10% FBS were seeded at 1 x 10 cells per well of a 96-well plate the day before transfection.
  • 33 ng of TALE-L (APC-L, Rosa26-L) expression plasmid, 33 ng of TALE-R (APC-R, Rosa26-R) expression plasmid, and 33 ng of SSA assay reporter plasmids were transfected into the HEK293T cells using Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific).
  • pBluescript II SK+
  • Stratagene was used to supplement the amount of the introduced plasmid, making the total amount of the introduced plasmid 100 ng.
  • the cells were cultured for 48 hours, and the amount of fluorescence from the EGFP protein per unit area in each well was measured using a plate reader.
  • the above combination was also transfected in combination with an nCas9 (D10A) expression plasmid and a guide RNA expression plasmid, and measurements were performed in the same manner as above.
  • measurements were taken at 16 points per well, and the average value was used as the EGFP fluorescence intensity (RFI). The average and standard deviation of the values from three independent wells were graphed.
  • Figure 2 shows the results when the SSA assay reporter plasmid EGxAPCxFP, which carries APC as the target gene, was treated with a combination of TALE47(APC-L)-ND1 and TALE47(APC-R)-ND1, or a combination of TALE47(APC-L)-dND1 and TALE47(APC-R)-ND1 (where one ND1 is dND1), or a combination of TALE47(APC-L)-ND1 and TALE47(APC-R)-dND1, or these were further treated with nCas9(D10A) and guide RNA (APC_gRNA-C or APC_gRNA-B).
  • Figure 3 shows the results when the SSA assay reporter plasmid EGxRosa26xFP, which carries Rosa26 as the target gene, was treated with a combination of TALE47(Rosa26-L)-ND1 and TALE47(Rosa26-R)-ND1, or a combination of TALE47(Rosa26-L)-dND1 and TALE47(Rosa26-R)-ND1, where one ND1 is a dND1, or a combination of TALE47(Rosa26-L)-ND1 and TALE47(Rosa26-R)-dND1, or these were further treated with nCas9(D10A) and guide RNA (Rosa26_gRNA-C or Rosa26_gRNA-B).
  • nCas9 and a guide RNA corresponding to the guide RNA target sequence on the same strand as the TALE recognition sequence of TALE47-dND1 (APC_gRNA-C for TALE47(APC-L)-dND1, and APC_gRNA-B for TALE47(APC-R)-dND1), double-nicking double-stranded DNA cleavage activity was confirmed, confirming that the combination of the ND1 domain and the dND1 domain has nickase activity.
  • mCherry-P2a-EGFP(C321G)/pcDNA3.1Zeo+ was prepared to establish a reporter cell line inserted into the genome.
  • the mCherry expression plasmid pmCherry-C1 was purchased from Takara Bio Inc., and the DNA encoding EGFP was fully synthesized.
  • PCR was performed using the primer sets listed in Table 4 below for these DNAs and the expression vector pcDNA3.1Zeo+ (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and the resulting fragments were ligated by the in-fusion method to produce the plasmid mCherry-P2A-EGFP/pcDNA3.1Zeo+ (nucleotide sequence number: 43, amino acid sequence number: 44 for mCherry-P2A-EGFP).
  • mCherry-P2A-EGFP(C321G)/pcDNA3.1Zeo+ was created by substituting the 321st base, C, in the nucleotide sequence encoding EGFP on the plasmid mCherry-P2a-EGFP/pcDNA3.1Zeo+ with G to create a mutant called mCherry-P2A-EGFP(C321G)/pcDNA3.1Zeo+.
  • PCR was performed with the two primer sets listed in Table 4 below, and the resulting fragments were ligated using the in-fusion method to create the plasmid mCherry-P2A-EGFP(C321G)/pcDNA3.1Zeo+ by site-directed mutagenesis.
  • PCR was performed using the two primer sets listed in Table 5 below using EGFP / pBS as a template, and the resulting fragments were ligated by the In-Fusion method to produce the donor plasmid PD-0 / pBS.
  • Guide RNA expression plasmids were prepared by inserting sgEGFP_332s and sgUC57N2 into the guide RNA expression plasmid (pX330_BS- ⁇ Cas9) in the same manner as in Test Example 1 (3) above.
  • TALE repeat domains corresponding to each TALE recognition sequence on the EGFP gene listed in Table 7 below were inserted into TALE47 of the TALE47-dND1 expression plasmid and TALE47-ND1 expression plasmid prepared in Test Example 1 (2) above, in order to generate similar nicking near the site of nicking by nCas9 and guide RNA (sgEGFP_332s), to create the TALE47(EGFP-3)-dND1 expression plasmid and TALE47(EGFP-3R)-ND1 expression plasmid.
  • sgEGFP_332s guide RNA
  • mCherry-P2A-EGFP(C321G)/pcDNA3.1Zeo+ linear fragment was introduced into HEK293T cells using Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific). Two days after transfection, the cells were detached, appropriately diluted with 125 ⁇ g/mL Zeocin-containing medium (hereafter, cell lines were established in this medium), and seeded onto 10 cm dishes. Approximately two weeks later, single colonies were collected and seeded onto 96-well plates. The 24 strains in which mCherry fluorescence was observed were expanded and cultured. Knock-in efficiency was evaluated according to the SNGD method described below in (5).
  • #7, #8, #22 Three strains (#7, #8, #22) with high knock-in efficiency were selected, and single clones were obtained again from these three strains by limiting dilution.
  • the resulting clones #7-1, #7-2, #7-3, #8-1, #8-2, #8-3, #22-1, #22-2, and #22-3 were compared in terms of knock-in efficiency, cell proliferation, etc., and #7-2, #8-1, and #22-3 were selected as strains with equivalent activity and proliferation capacity.
  • the #22-3 cell line was used as a reporter cell line (a line expressing a fluorescent activity-loss mutant) in which the mCherry-P2A-EGFP (C321G) expression unit was inserted into the genome.
  • one of the primers used was a primer with a phosphorylated 5' end.
  • the resulting PCR product was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL), and then approximately 5 ⁇ g was digested from the 5′ phosphorylated end with Lambda exonuclease (New England BioLab). The remaining double-stranded DNA was then digested with Exonuclease III (Takara Bio) and further purified using the above-mentioned NucleoSpin Gel and PCR Clean-up to obtain each lssDNA (PD-0, PD-3).
  • Donor plasmids (PD-0, PD-3), lssDNA (PD-0, PD-3), guide RNA (sgEGFP_332s) expression plasmid, guide RNA (sgUC57N2) expression plasmid, nCas9 expression plasmid, TALE47(EGFP-3)-dND1 expression plasmid, and TALE47(EGFP-3R)-ND1 expression plasmid were introduced into HEK293T cells (#22-3 strain) in the combinations and amounts shown in Table 9 below, with a total of 100 ng of plasmid and DNA using Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific). When the type or amount of introduced plasmid was reduced, pBluescript II (SK+) (Stratagene) was used to supplement the amount, so that the total amount of introduced plasmid and DNA was 100 ng.
  • pBluescript II (SK+) (Stratagene) was used to supplement the amount, so that the total amount of
  • the cells were cultured for 72 hours and then stained with Hoechst 33342 (10 ⁇ L of a 50 ⁇ g/mL solution was added to each well for 10 minutes at room temperature). Furthermore, 100 ⁇ L of 4% paraformaldehyde solution was added and treated at room temperature for 1 hour to fix the cells. After washing with PBS(-), 100 ⁇ L of PBS(-) was added to each well, and two types of fluorescence image data (fluorescence from Hoechst 33342 staining and EGFP fluorescence) were acquired from four locations in each well using an In Cell Analyzer 6000 (Cytiva).
  • Hoechst 33342 10 ⁇ L of a 50 ⁇ g/mL solution was added to each well for 10 minutes at room temperature. Furthermore, 100 ⁇ L of 4% paraformaldehyde solution was added and treated at room temperature for 1 hour to fix the cells. After washing with PBS(-), 100 ⁇ L of PBS(-) was added to each well, and two types of flu
  • the number of fluorescent cells was quantified using image analysis software ImageJ, and the average and standard deviation of the number of EGFP-positive cells/total cell count (%) for the four locations were graphed. The higher the average value of the number of EGFP-positive cells/total cell count (%) obtained, the higher the knock-in efficiency.
  • Figure 4 shows the EGFP fluorescence images for each of the combinations shown in Table 9 ((a): Mock, (b) SNGD, (c) dND1 + ND1 + PD, (d) dND1 + ND1 + lssDNA), and Figure 5 shows the number of EGFP-positive cells/total number of cells (%).
  • the average number of EGFP-positive cells/total number of cells (%) was calculated in the same manner as above, except that the combinations and amounts of each donor DNA and expression plasmid were as shown in Table 10 below.
  • the value (a) when the donor plasmid was used was set to 1, and the relative activity and standard deviation were graphed. The results are shown in Figure 6.
  • Figures 4 to 5 show the results of confirming the knock-in efficiency by nicking the target genome and donor plasmid using an EGFP fluorescence activity loss mutant expression strain (#22-3 strain) using nCas9 by the SNGD method (SNGD: combination of single nicks in the target gene and donor plasmid) described in Non-Patent Document 4.
  • FIGS 4 to 5 show the results of confirming the knock-in efficiency when nicking using a combination of the ND1 domain and dND1 domain was performed using lssDNA instead of a donor plasmid as the donor DNA.
  • lssDNA PD-3
  • TALE47 EGFP-3-dND1 expression plasmid
  • EGFP-3R TALE47
  • the nicking system of the present invention is a site-specific nicking system that comprises a first fusion protein comprising a first DNA-binding domain and an ND1 domain, and a second fusion protein comprising a second DNA-binding domain and a dND1 domain, and thereby exhibits nickase activity that can replace the nickase activity of nickase-type Cas9 (nCas9) using only the proteins.
  • nickase-type Cas9 nickase-type Cas9
  • the present invention makes it possible to provide a method for specifically and highly efficiently inserting (knock-in) a desired nucleotide sequence into a target region using only proteins, a method for producing cells in which a desired nucleotide sequence has been inserted into a target region (knock-in cells), and kits for use in these methods. Therefore, the present invention is expected to be used as an excellent genome editing tool in a wide range of industrial fields, including medicine, agriculture, and manufacturing.

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Abstract

５'側から、５'側ホモロジーアーム配列、ドナー配列、３'側ホモロジーアーム配列の順で配置されたヌクレオチド配列を含む一本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡと、第１のＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメインとを含む第１の融合タンパク質、及び第２のＤＮＡ結合ドメインとｄＮＤ１ドメインとを含む第２の融合タンパク質を含み、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとが２量体を形成して標的領域内又は標的領域の近傍にニックを導入する部位特異的ニッキングシステムと、を標的ＤＮＡに接触させる工程を含む、標的ＤＮＡ上の標的領域にドナー配列を挿入する方法。

Description

所望のヌクレオチド配列をノックインする方法、ノックイン細胞の製造方法、及びキット
　本発明は、所望のヌクレオチド配列をノックインする方法、ノックイン細胞の製造方法に関し、より詳しくは、標的ＤＮＡ上の標的領域に所望のヌクレオチド配列を挿入（ノックイン）する方法、標的ＤＮＡ上の標的領域に所望のヌクレオチド配列が挿入された細胞（ノックイン細胞）を製造する方法、及びこれらの方法に用いるためのキットに関する。
　ゲノムＤＮＡ等の標的ＤＮＡ上の特定の領域に所望のヌクレオチド配列を挿入又は置換する技術は「ノックイン」と称され、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって二本鎖ＤＮＡを切断し、その切断箇所の相同性依存的修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）と呼ばれる修復機構を利用して、当該切断箇所又はその近傍に挿入したいヌクレオチド配列を含むドナーＤＮＡを挿入又は置換する方法が知られている。例えば、Ｙ　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　１３，Ｄｅｃ　５，２０１３，ｐ．６５９－６６２（非特許文献１）には、マウス受精卵において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムで二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋ；ＤＳＢ）を切断し、その切断箇所の近傍に、ＨＤＲによって変異を導入したことが報告されている。
　このようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによるノックイン技術においては、ドナーＤＮＡとして、挿入したいヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に、これを挿入したい標的領域の周辺配列と相同な配列（ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｒｍ）を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ）を用いるか、挿入したい配列が長い場合等には、かかる一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を含むドナープラスミドを用いることが知られている。例えば、Ｌｉ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２１　Ａｕｇ　２０１７，ｄｏｉ：　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１７８９０５（非特許文献２）には、ドナーＤＮＡを、両末端に約５００塩基以上のホモロジーアームを有するｌｓｓＤＮＡ（ｌｏｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡ：ｌｓｓＤＮＡ）とすることにより、培養細胞においてもＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムで効率的にノックインが可能となることが報告されている。また、ｌｓｓＤＮＡは作製が難しくその使用が制限されていたが、例えば、Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ，２０２１，１０，１０７６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ１００５１０７６（非特許文献３）には、より簡便で安価なｌｓｓＤＮＡの調製方法が報告されている。
　しかしながら、上記のような二本鎖ＤＮＡ切断を用いたノックイン技術では、意図しないヌクレオチド配列の挿入や欠失を引き起こすことが問題となっていた。二本鎖ＤＮＡ切断を用いない技術としては、例えば、Ｃａｓ９の二本鎖ＤＮＡ切断活性を一部欠失させたニッカーゼ型のＣａｓ９（ｎＣａｓ９、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）にドナープラスミドを組み合わせて、ｎＣａｓ９で一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）を生じさせた箇所にドナープラスミドのヌクレオチド配列を挿入する技術（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｉｃｋｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｄｏｎｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ：ＳＮＧＤ）が、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８，２０１８，ｐ．２２３－２３０（非特許文献４））が記載されている。
　しかしながらこれらの従来技術はいずれもＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに依存するものであって、これらを用いてゲノム編集をするためにはガイドＲＮＡも細胞に導入する必要があるため、タンパク質のみでゲノム編集が可能な、より安全性の高い技術が望まれている。
　タンパク質のみでゲノム編集が可能な技術として、２０１０年に第二世代ゲノム編集技術として開発された人工制限酵素である、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）が知られている。ＴＡＬＥＮは、タイプＩＩＳ制限酵素であるＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン）をヌクレアーゼドメイン、ＴＡＬＥをＤＮＡ結合ドメインとした融合タンパク質であり、一対のＴＡＬＥＮのＴＡＬＥがそれぞれ標的ＤＮＡの反対鎖に結合し、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが互いに２量体を形成することで部位特異的な二本鎖ＤＮＡ切断活性（ヌクレアーゼ活性）を奏する。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに関しては、これまでに、２個のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを連結し、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）やＴＡＬＥに結合させて二本鎖ＤＮＡ切断を誘導した報告（Ｍｉｎｃｚｕｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６（１２），２００８，ｐ．３９２６－３９３８（非特許文献５））や、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの片方に変異を入れた構造体を用いて一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を誘導した報告（Ｙａｎ　Ｌｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，６：２０６５７，２０１６，ｄｏｉ：　１０．１０３８／ｓｒｅｐ２０６５７（非特許文献６））がある。
　また、本発明者らは、従来のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとは異なる、新規なヌクレアーゼドメイン１（ＮＤ１ドメイン）を開発し、かかるＮＤ１ドメインとＺＦやＴＡＬＥ等のＤＮＡ結合ドメインとを含む人工核酸切断酵素により、標的ＤＮＡ上の標的部位を編集することに成功している（国際公開第２０２０／０４５２８１号明細書（特許文献１））。
国際公開第２０２０／０４５２８１号明細書
Ｙ　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　１３，Ｄｅｃ　５，２０１３，ｐ．６５９－６６２ Ｌｉ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，２１　Ａｕｇ　２０１７，ｄｏｉ：　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１７８９０５ Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ，２０２１，１０，１０７６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ１００５１０７６ Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８，２０１８，ｐ．２２３－２３０ Ｍｉｎｃｚｕｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６（１２），２００８，ｐ．３９２６－３９３８ Ｙａｎ　Ｌｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，６：２０６５７，２０１６，ｄｏｉ：　１０．１０３８／ｓｒｅｐ２０６５７
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、一本鎖ＤＮＡ切断をタンパク質のみで行い、特異的かつ高効率に、標的領域に所望のヌクレオチド配列の挿入（ノックイン）ができる方法、及び標的領域に所望のヌクレオチド配列が挿入された細胞（ノックイン細胞）を製造できる方法、並びに、これらの方法に用いるためのキットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの代替因子である特許文献１に記載のヌクレアーゼドメイン１（ＮＤ１ドメイン）を、ヌクレアーゼ活性欠損変異を導入したｄＮＤ１ドメインとし、ＮＤ１とｄＮＤ１とを組み合わせた２量体型とすることにより、タンパク質のみで、ニッカーゼ型のＣａｓ９（ｎＣａｓ９）のニッカーゼ活性に代替可能なニッカーゼ活性を奏するニッキング酵素（ニッカーゼ活性体）とできることを見出した。さらに、このニッキング酵素を標的ＤＮＡ上の標的領域へ誘導するために、各ドメインにそれぞれＤＮＡ結合ドメインを結合させた融合タンパク質とすることで、部位特異的なニッキングシステムを開発することに成功した。
　なお、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを改変した非特許文献６の記載に基づけば、ヌクレアーゼ活性欠損変異を導入していないドメインが認識して結合する鎖にニックが導入されることが想定されるが、これに反して、ＮＤ１ドメインを改変した上記ニッキング酵素では、驚くべきことに、ヌクレアーゼ活性欠損変異を導入したｄＮＤ１ドメインが認識する鎖の方にニックが導入されることも本発明者らは見出した。
　さらに、本発明者らは、この新たなニッキングシステムにおいては、ドナーＤＮＡとして、ドナープラスミドではなく一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を用いることで、ノックイン効率を顕著に増大させることが可能となることも見出した。これは、ニッカーゼ型のＣａｓ９では確認されない、当該ニッキングシステムに特異的な現象であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　かかる知見により提供される本発明の態様は以下のとおりである。
［１］
　標的ＤＮＡ上の標的領域にドナー配列を挿入する方法であり、
　５’側から、５’側ホモロジーアーム配列、ドナー配列、３’側ホモロジーアーム配列の順で配置されたヌクレオチド配列を含む一本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡと、
　第１のＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメインとを含む第１の融合タンパク質、及び第２のＤＮＡ結合ドメインとｄＮＤ１ドメインとを含む第２の融合タンパク質を含み、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとが２量体を形成して前記標的領域内又は前記標的領域の近傍にニックを導入する部位特異的ニッキングシステムと、
を前記標的ＤＮＡに接触させる工程を含み、
　ＮＤ１ドメインが、下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第８３番目に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドであり、かつ、
　ｄＮＤ１ドメインが、下記（ｄａ）～（ｄｃ）：
（ｄａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドである、
方法。
［２］
　前記ドナーＤＮＡが、５’側ホモロジーアーム配列及び３’側ホモロジーアーム配列の長さがそれぞれ独立に１００塩基以上の長鎖一本鎖ＤＮＡである、［１］に記載の方法。
［３］
　標的ＤＮＡ上の標的領域にドナー配列が挿入された細胞を製造する方法であり、
　５’側から、５’側ホモロジーアーム配列、ドナー配列、３’側ホモロジーアーム配列の順で配置されたヌクレオチド配列を含む一本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡと、
　第１のＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメインとを含む第１の融合タンパク質、及び第２のＤＮＡ結合ドメインとｄＮＤ１ドメインとを含む第２の融合タンパク質を含み、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとが２量体を形成して前記標的領域内又は前記標的領域の近傍にニックを導入する部位特異的ニッキングシステムと、
を細胞内に導入又は細胞内で発現させ、前記標的ＤＮＡに接触させる工程を含み、
　ＮＤ１ドメインが、下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第８３番目に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを含むドメインであり、かつ、
　ｄＮＤ１ドメインが、下記（ｄａ）～（ｄｃ）：
（ｄａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドである、
方法。
［４］
　前記ドナーＤＮＡが、５’側ホモロジーアーム配列及び３’側ホモロジーアーム配列の長さがそれぞれ独立に１００塩基以上の長鎖一本鎖ＤＮＡである、［３］に記載の方法。
［５］
　［１］～［４］のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであり、
　第１の融合タンパク質、第１の融合タンパク質を発現する第１の融合タンパク質発現ベクター、及び第１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種と、
　第２の融合タンパク質、第２の融合タンパク質を発現する第２の融合タンパク質発現ベクター、及び第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種と、
を含み、
　第１の融合タンパク質発現ベクターが、（ｉ）ＮＤ１ドメイン及び第１のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、（ｉｉ）ＮＤ１ドメインをコードするポリヌクレオチドと、第１のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と、を含むベクターからなる群から選択される少なくとも１種であり、
　第２の融合タンパク質発現ベクターが、（ｉｉｉ）ｄＮＤ１ドメイン及び第２のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、（ｉｖ）ｄＮＤ１ドメインをコードするポリヌクレオチドと、第２のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と、を含むベクターからなる群から選択される少なくとも１種である、
キット。
　本発明によれば、タンパク質のみで、特異的かつ高効率に、標的領域に所望のヌクレオチド配列の挿入（ノックイン）ができる方法、及び標的領域に所望のヌクレオチド配列が挿入された細胞（ノックイン細胞）を製造できる方法、並びに、これらの方法に用いるためのキットを提供することが可能となる。
試験例１において用いた、標的遺伝子ＡＰＣ（ａ）及びＲｏｓａ２６（ｂ）上のＰＡＭ配列、及びｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）による切断点と、各ＴＡＬＥ及びガイドＲＮＡとの位置関係を示す概念図である。 標的遺伝子としてＡＰＣを搭載したＳＳＡアッセイ用レポータープラスミドＥＧｘＡＰＣｘＦＰに対して、ＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせ、又は、ＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｌ）－ｄＮＤ１とＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせ、若しくはＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｒ）－ｄＮＤ１との組み合わせ、これらにさらにｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）及びガイドＲＮＡ（ＡＰＣ＿ｇＲＮＡ－Ｃ又はＡＰＣ＿ｇＲＮＡ－Ｂ）を作用させたときのＥＧＦＰ蛍光強度（ＲＦＩ）を示すグラフである。 標的遺伝子としてＲｏｓａ２６を搭載したＳＳＡアッセイ用レポータープラスミドＥＧｘＲｏｓａ２６ｘＦＰに対して、ＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせ、又は、ＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）－ｄＮＤ１とＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせ、若しくはＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）－ｄＮＤ１との組み合わせ、これらにさらにｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）及びガイドＲＮＡ（Ｒｏｓａ２６＿ｇＲＮＡ－Ｃ又はＲｏｓａ２６＿ｇＲＮＡ－Ｂ）を作用させたときのＥＧＦＰ蛍光強度（ＲＦＩ）を示すグラフである。 表９に示す組み合わせ（（ａ）：Ｍｏｃｋ、（ｂ）ＳＮＧＤ、（ｃ）ｄＮＤ１＋ＮＤ１＋ＰＤ、（ｄ）ｄＮＤ１＋ＮＤ１＋ｌｓｓＤＮＡ）における各ＥＧＦＰの蛍光画像である。 表９に示す組み合わせ（（ａ）：Ｍｏｃｋ、（ｂ）ＳＮＧＤ、（ｃ）ｄＮＤ１＋ＮＤ１＋ＰＤ、（ｄ）ｄＮＤ１＋ＮＤ１＋ｌｓｓＤＮＡ）における各ＥＧＦＰの蛍光画像から得られた、ＥＧＦＰ陽性細胞数／全細胞数（％）の各ウェル４か所の平均値及び標準偏差を示すグラフである。 表１０に示す組み合わせ（（ａ）：ＰＤ－０（ｂａｓｅ）、（ｂ）：ｌｓｓＤＮＡ　２０ｎｇ、（ｃ）：ｌｓｓＤＮＡ　４０ｎｇ、（ｄ）：ｌｓｓＤＮＡ　６０ｎｇ）における各ＥＧＦＰの蛍光画像から得られた、ＥＧＦＰ陽性細胞数／全細胞数（％）の各ウェル４か所の平均値の、（ａ）ｂａｓｅの値を１としたときの相対値（相対活性）及び標準偏差を示すグラフである。
　以下、本発明の好ましい実施形態を例に挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　＜ニッキング酵素＞
　本発明のニッキング酵素は、２つのドメインＮＤ１及びｄＮＤ１を含む人工ニッキング酵素である。本発明のニッキング酵素は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断する一本鎖ＤＮＡ切断活性（ニッカーゼ活性）を有する。
　（ＮＤ１ドメイン）
　本発明に係る「ＮＤ１ドメイン」は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとの同一性が３５～７０％の範囲に存在する相同配列のスクリーニングによって、本発明者らが見出したヌクレアーゼドメインの一つであるヌクレアーゼドメイン１である（特許文献１）。ＮＤ１ドメインの典型的ヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、より好ましくは配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。なお、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列と７０％の同一性を有する。
　本発明に係る「ＮＤ１ドメイン」には、ＮＤ１ドメインを２分子用いた場合に、ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ切断活性（ヌクレアーゼ活性）を有する限り、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。このようなヌクレアーゼドメインには、例えば、他の細菌由来のＮＤ１ドメインやＮＤ１ドメインの改変体（天然の変異体及び人工的な変異体）が含まれる。
　したがって、本発明に係る「ＮＤ１ドメイン」の態様には、（ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、より好ましくは前記アミノ酸配列からなるポリペプチドも含まれる。ただし、下記のヌクレアーゼ活性欠損変異配列ではないことが必要であるため、（ｂ）において、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の少なくとも第６６番目及び第８３番目に対応するアミノ酸はアスパラギン酸であることが必要である。
　ここで、アミノ酸配列において、「置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸（アミノ酸残基）が、置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、これらのうちの２種以上の組み合わせがなされたアミノ酸配列であることを示す。また、「複数個」とは、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個の整数であることを示す。（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数個として好ましくは、アミノ酸残基が１～３０個、１～２５個、１～２０個（例えば、１～１０個、１～５個、１～３個、２個以下）である。
　また、本発明に係る「ＮＤ１ドメイン」の態様には、（ｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、より好ましくは前記アミノ酸配列からなるポリペプチドも含まれる。ただし、（ｃ）においても、下記のヌクレアーゼ活性欠損変異配列ではないことが必要であるため、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の少なくとも第６６番目及び第８３番目に対応するアミノ酸はアスパラギン酸であることが必要である。
　ここで、アミノ酸配列の相同性という場合には、対照のアミノ酸配列（例えば、（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列）と対象のアミノ酸配列（例えば、（ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列）とをアミノ酸配列解析ソフトウェア等を用いて整列させた際に、対照のアミノ酸配列上のアミノ酸（対照アミノ酸）と同位置になる対象のアミノ酸配列上のアミノ酸（対象アミノ酸）が、前記対照アミノ酸と同じアミノ酸であっても、前記対照アミノ酸と同じ性質を持つアミノ酸であってもよい。アミノ酸配列の同一性という場合には、前記対象アミノ酸は、前記対照アミノ酸と同じアミノ酸である。同じ性質を持つアミノ酸のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られており、例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）；中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
　このようなアミノ酸配列の相同性及び同一性は、配列の一致が最大となる状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列相同性又は同一性の数値（％）を求める方法は、当業者に公知である。最適なアラインメント及び配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者に既知のいずれかのアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム等）を利用することができ、アミノ酸配列の配列相同性又は同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ等の配列解析ソフトウェアを用いて決定することができる。また、（ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列との相同性は、９０％以上であればよいが、好ましくは、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上）である。より好ましくは、同一性で、９０％以上、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上）である。
　また、アミノ酸配列において、特定のアミノ酸に「対応する」アミノ酸とは、アミノ酸配列解析ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒやＣｌｕｓｔａｌＷ等）を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））アミノ酸配列を整列させた際に、前記特定のアミノ酸（前記対照アミノ酸（対照アミノ酸残基）、例えば、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目又は第８３番目のアスパラギン酸）と同位置になるアミノ酸を示す。
　（ｄＮＤ１ドメイン）
　本発明に係る「ｄＮＤ１ドメイン」は、ＮＤ１ドメインのアミノ酸配列を、ヌクレアーゼ活性が欠損するような変異配列（ヌクレアーゼ活性欠損変異配列）に改変した改変ドメインである。このようなｄＮＤ１ドメインのヌクレアーゼ活性欠損変異配列としては、ＮＤ１ドメインと２分子で用いた場合に、二本鎖ＤＮＡ切断活性が欠損され、かつ、一本鎖ＤＮＡ切断活性を有すればよく、典型的には、（ｄａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、より好ましくは前記置換アミノ酸を含む前記アミノ酸配列からなるポリペプチドである。前記置換アミノ酸に置換されるアスパラギン酸としては、第６６番目のアスパラギン酸及び第８３番目のアスパラギン酸のうちのいずれかであっても両方であってもよいが、少なくとも第６６番目のアスパラギン酸を含むことが好ましい。
　また、本発明に係る「ｄＮＤ１ドメイン」には、このような（ｄａ）と高い相同性を有するアミノ酸配列からなる改変体も含まれる。したがって、本発明に係る「ｄＮＤ１ドメイン」の態様には、（ｄｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；並びに、（ｄｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。
　（ｄｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数個として好ましくは、アミノ酸残基が１～３０個、１～２５個、１～２０個（例えば、１～１０個、１～５個、１～３個、２個以下）である。また、（ｄｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、（ｄａ）のアミノ酸配列との相同性は、９０％以上であればよいが、好ましくは、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上）である。より好ましくは、同一性で、９０％以上、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上）である。
　（ｄｂ）及び（ｄｃ）において、前記置換アミノ酸に置換されるアスパラギン酸としては、第６６番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸及び第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸のうちのいずれかであっても両方であってもよいが、少なくとも第６６番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を含むことが好ましい。また、（ｄａ）、（ｄｂ）、（ｄｃ）において、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換されるときの置換アミノ酸としては、前記酸性アミノ酸以外のアミノ酸が好ましく、アラニン又はアスパラギンがより好ましい。
　第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸、又はかかるアスパラギン酸に対応するアミノ酸を前記置換アミノ酸に置換する方法としては、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２，ｐ．４８８－４９２）、重複伸長ＰＣＲ等の公知の方法を適宜採用することができる。また、前記アミノ酸の改変に用いるプライマー等は、目的のアミノ酸配列（配列番号：４０に記載のアミノ酸配列等）及び目的の改変に基づいて、従来公知の方法又はそれに準じた方法により適宜設計することができる。
　なお、本発明において、ＮＤ１ドメイン及びｄＮＤ１ドメインが、ＮＤ１ドメインと２分子で用いた場合にＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ切断活性（ヌクレアーゼ活性）を有するか欠損しているかは、当業者に公知の方法又はそれに準じた方法で適宜確認することができる。例えば、下記の試験例に記載のように、「ＴＡＬＥ－Ｌ→確認対象のドメイン」をＮ末側からこの順で結合した融合体と、「ＴＡＬＥ－Ｒ→配列番号：４０に記載のアミノ酸配列（ＮＤ１ドメイン）」をＮ末側からこの順で結合した融合体とを細胞内で発現させ、ＴＡＬＥに対応する標的ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ切断されるか否かにより確認することができる。この方法においては、プラスミド上のレポーター遺伝子（例えば、ＴＡＬＥ認識配列が挿入されたＥＧＦＰ遺伝子）を標的としたＳＳＡアッセイ系を用い、レポーター活性を指標に評価してもよい。例えば、前記融合体の組み合わせを用いた場合のヌクレアーゼ活性が、「ＴＡＬＥ－Ｌ→配列番号：４０に記載のアミノ酸配列（ＮＤ１ドメイン）」をＮ末側からこの順で結合した融合体と、「ＴＡＬＥ－Ｒ→配列番号：４０に記載のアミノ酸配列（ＮＤ１ドメイン）」をＮ末側からこの順で結合した融合体とを細胞内で発現させたときのヌクレアーゼ活性の２０％以上であれば、ヌクレアーゼ活性を有すると判断することができ、２０％未満であれば、ヌクレアーゼ活性を欠損していると判断することができる。
　また、本発明において、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとを２分子で用いた場合にＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ切断活性（ニッカーゼ活性）を有するか否かも、当業者に公知の方法又はそれに準じた方法で適宜確認することができる。例えば、下記の試験例に記載のように、上記によりヌクレアーゼ活性を有することが確認された「ＴＡＬＥ－Ｌ→確認対象のドメイン１」をＮ末側からこの順で結合した融合体（又は「ＴＡＬＥ－Ｌ→配列番号：４０に記載のアミノ酸配列（ＮＤ１ドメイン）」をＮ末側からこの順で結合した融合体）と、上記によりヌクレアーゼ活性の欠損が確認された「ＴＡＬＥ－Ｒ→確認対象のドメイン２」をＮ末側からこの順で結合した融合体とを組み合わせて、ヌクレアーゼ活性が欠損されることを確認した上で、これに、ヌクレアーゼ活性の欠損が確認された融合体のＴＡＬＥ認識配列の近傍かつ反対鎖を一本鎖ＤＮＡ切断するｎＣａｓ９とガイドＲＮＡとの組み合わせを作用させ、ＴＡＬＥに対応する標的ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ切断活性が復活するか否かにより確認することができる。この方法においても、上記ＳＳＡアッセイ系を用い、レポーター活性を指標に評価してよい。
　＜ニッキングシステム＞
　本発明のニッキングシステムは、
　第１のＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメインとを含む第１の融合タンパク質、及び
　第２のＤＮＡ結合ドメインとｄＮＤ１ドメインとを含む第２の融合タンパク質
を含み、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとが２量体を形成して前記標的領域内又は前記標的領域の近傍にニックを導入する部位特異的ニッキングシステムである。
　（融合タンパク質）
　本発明に係る第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質（本明細書中、場合により単に「融合タンパク質」と総称する）は、ＤＮＡ結合ドメインと上記のＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインとを含む融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを介して標的ＤＮＡ上の標的領域の近傍（ＤＮＡ結合ドメイン認識配列）にそれぞれ結合し、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとが互いに２量体を形成して、当該標的領域内又は当該標的領域の近傍で二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断する（ニックを導入する）、部位特異的ニッキングシステムとして機能する。前記ＮＤ１ドメイン及びｄＮＤ１ドメインとしては、その好ましい態様も含めて、それぞれ上述のとおりである。
　（ＤＮＡ結合ドメイン）
　本発明において、ＮＤ１ドメインと共に第１の融合タンパク質を構成するＤＮＡ結合ドメインを第１のＤＮＡ結合ドメインと称し、ｄＮＤ１ドメインと共に第２の融合タンパク質を構成するＤＮＡ結合ドメインを第２のＤＮＡ結合ドメインと称し、第１のＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＤＮＡ結合ドメインを総称して場合により単に「ＤＮＡ結合ドメイン」と称する。
　本発明に係る「ＤＮＡ結合ドメイン」としては、任意のＤＮＡ配列（ＤＮＡ結合ドメイン認識配列）に特異的に結合させることが可能なタンパク質ドメインであれば特に制限はない。ＤＮＡ結合ドメインとしては、例えば、ＴＡＬＥ、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）、ＰＰＲタンパク質（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｐｅａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられ、ＴＡＬＥ及びジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）からなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、ＴＡＬＥがより好ましい。本発明に係る第１のＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＤＮＡ結合ドメインとしては、互いに同種であっても異種であってもよいが、同種（例えば、いずれもＴＡＬＥ）であることが好ましい。
　〔ＴＡＬＥ〕
　ＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）は、典型的には、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属プロテオバクテリアが分泌し宿主植物の遺伝子転写を活性化するタンパク質であり、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌が有するＴＡＬＥ様タンパク質を含む総称である。本発明に係る「ＴＡＬＥ」は、少なくとも、Ｎ末ドメイン及びＴＡＬＥリピートドメインを含み、Ｃ末ドメインをさらに含んでいてもよい。
　ＴＡＬＥリピートドメインは、右巻き超らせん（ｓｕｐｅｒｈｅｌｉｃａｌ）を形成するＴＡＬＥ配列の、複数、例えば１０～３０、好ましくは１３～２５、より好ましくは１５～２０のタンデムリピート（ＴＡＬＥリピート）で構成される。典型的なＴＡＬＥリピート１単位（１つのＴＡＬＥ配列）は、３３～３５アミノ酸からなり、その１２番目と１３番目の２アミノ酸残基からなる可変残基（ｒｅｐｅａｔ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ：ＲＶＤ）によって、ＤＮＡの特定の塩基を認識する。塩基を特異的に認識するＲＶＤの例としては、Ｃを認識するＨＤ、Ｔを認識するＮＧ、Ａを認識するＮＩ、Ｇ又はＡを認識するＮＮ、及びＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを認識するＮＳ等が挙げられる。かかるＴＡＬＥリピートドメインのＤＮＡ認識機構に基づき、特定の塩基を認識するＴＡＬＥ配列を人工的に連結することにより、ＤＮＡ上の特定のヌクレオチド配列（ＴＡＬＥ認識配列）を認識して結合できるＴＡＬＥを作製することができる。
　本発明に係るＴＡＬＥの前記ＴＡＬＥ配列は、それぞれ、ＴＡＬＥリピートドメインがＴＡＬＥ認識配列を認識して結合できるものである限り、天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、前記ＴＡＬＥ配列においては、それぞれ独立に、ＲＶＤの位置が変更されていても、ＲＶＤ以外のアミノ酸残基が１個又は複数個（例えば、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）置換、欠失、挿入及び／又は付加されたものでもよく、また、ＲＶＤの１２番目と１３番目の２アミノ酸残基は、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧに対する特異性を増強するために他のアミノ酸残基に置換されてもよい。
　本発明に係るＴＡＬＥのＴＡＬＥリピートドメインは、標的ＤＮＡの標的領域の５’側又は３’側に、それぞれ好ましくは０～３０塩基のスペーサーを介して存在するヌクレオチド配列又はその相補配列を認識するように、すなわち、ＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列が、前記標的領域の５’側又は３’側にそれぞれ好ましくは０～３０塩基のスペーサーを介して存在するヌクレオチド配列となるように、より好ましくは、両ＴＡＬＥ認識配列の間の距離が１～５０塩基となるように、設計される。このような所望のＴＡＬＥを設計、作製する技術は公知であり、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２９，２０１１，ｐ．１４３－１４８；Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ　Ｒｅｐ　３，３３７９（２０１３）や、前記Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１３）に記載のＰｌａｔｉｎｕｍ　Ｇａｔｅシステムによって、前記ヌクレオチド配列に対する高い結合活性を有するＴＡＬＥを作製することができる。
　本発明に係るＴＡＬＥのＮ末ドメインとしては、天然型のアミノ酸配列（例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列）を用いることができるが、本発明に係る各融合タンパク質の機能（ＴＡＬＥ認識配列への結合能、ニッカーゼ活性等）に著しく負の影響を与えない限り、前記天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたものでもよい。また、精製や検出のためのフラグタグ、ＴＡＬＥ－ＮＤ１ドメイン及びＴＡＬＥ－ｄＮＤ１ドメインを細胞核へ移行するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）等を含んでいてもよい。
　このようなＮ末ドメインの鎖長としては、４９～２８７アミノ酸残基であることが好ましく、８０～２００アミノ酸残基であることがより好ましく、１２０～１８０アミノ酸残基であることがさらに好ましい。
　本発明に係るＴＡＬＥのＮ末ドメインの具体例としては、上記の他、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０６９９）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列や、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０７０３）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明に係るＴＡＬＥがＣ末ドメインをさらに含む場合、かかるＴＡＬＥのＣ末ドメインとしても、天然型のアミノ酸配列（例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（ＷＴ：アミノ酸残基数＝１８０））を用いることができるが、本発明に係る第２の融合タンパク質の機能（ＴＡＬＥ認識配列への結合能、ニッカーゼ活性等）に著しく負の影響を与えない限り、前記天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたものでもよい。
　本発明に係るＴＡＬＥがＣ末ドメインをさらに含む場合、前記ＴＡＬＥのＣ末ドメインとしては、天然型のアミノ酸配列においてＣ末側の一部のアミノ酸配列が除去されたものであってもよい。このようなＣ末ドメインとしては、Ｃ末ドメインの鎖長が、１～２００アミノ酸残基であることが好ましく、５～１５０アミノ酸残基であることがより好ましく、１０～１２５アミノ酸残基であることがさらに好ましく、１０～１００アミノ酸残基であることがさらにより好ましい。
　前記Ｃ末ドメインの具体例としては、上記の他、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＮ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８９～３２１９２）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝６３）、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＮＧ（ＩＤ：５０７０４）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝４７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　本発明に係るＴＡＬＥの好ましい態様としては、ＴＡＬＥリピート１単位の２つの特定の位置のアミノ酸がＴＡＬＥリピート４単位ごとに変化している、Ｐｌａｔｉｎｕｍ　ＴＡＬＥＮ（特開２０１５－３３３６５号公報）のＴＡＬＥの態様が好ましいものとして挙げられる。
　〔ジンクフィンガーアレイ〕
　本発明に係るジンクフィンガーアレイは、ＤＮＡ結合領域及びヌクレアーゼドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のうちのＤＮＡ結合領域を示す。ジンクフィンガーアレイは、通常、２～１５、好ましくは３～８、より好ましくは４～６個のジンクフィンガータンパク質からなり、各ジンクフィンガータンパク質の間は直接、又はリンカーを介して結合される。各ジンクフィンガータンパク質は、１つ以上の亜鉛と特定の塩基を認識するヘリックス構造とを含み、１つのジンクフィンガータンパク質でＤＮＡの特定の３塩基を認識する。
　本発明に係るジンクフィンガーアレイは、それぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列を認識して結合できるものである限り、特に制限されず、適宜改変されたものであってもよい。例えば、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又は２個以下）のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたものでもよい。
　本発明に係るジンクフィンガーアレイは、標的ＤＮＡの標的部位の５’側又は３’側に、それぞれ好ましくは１～１０塩基のスペーサーを介して存在するヌクレオチド配列又はその相補配列を認識するように、すなわち、ジンクフィンガーアレイが認識するジンクフィンガーアレイ認識配列又はその相補配列が、前記標的部位の５’側又は３’側にそれぞれ１～１０塩基のスペーサーを介して存在するヌクレオチド配列となるように、設計される。このようなジンクフィンガーアレイを設計、作製する技術は公知であり、例えば、Ｂｅｅｒｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２０，１３５－１４１（２００２）、Ｓａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８，６７－６９（２０１１）等に記載の方法を参照して適宜設計、作製することができる。
　（リンカー）
　本発明の融合タンパク質において、各ＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインとは、それぞれ、直接結合されていても、リンカーを介して結合されていてもよい。前記リンカーとしては、本発明に係る各融合タンパク質の機能（ＤＮＡ結合ドメイン認識配列への結合能、ニッカーゼ活性等）に著しく負の影響を与えない限り、その鎖長や種類において、特に制限はない。前記リンカーの鎖長としては、通常、２～１８０アミノ酸残基であり、好ましくは２～１２０アミノ酸残基である。例えば、前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥである場合、ＴＡＬＥリピートドメインと前記ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインとの間の距離が、ＴＡＬＥのＮ末ドメイン（Ｎ末側から、ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメイン→ＤＮＡ結合ドメインの順の場合）又はＣ末ドメイン（Ｎ末側から、ＤＮＡ結合ドメイン→ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインの順の場合）、より好ましくは後者の場合であってＣ末ドメインの鎖長も含めた距離で、１～２００アミノ酸残基、好ましくは５～１５０アミノ酸残基、より好ましくは１０～１２５アミノ酸残基、さらに好ましくは１０～１００アミノ酸残基となるように前記リンカーの鎖長を調整することができる。この場合、ＴＡＬＥリピートドメインと前記ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインとの間の距離は、Ｎ末側から、ＤＮＡ結合ドメイン→ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインの順の場合には、ＴＡＬＥリピートドメインのＣ末端のＣ末側に隣接するアミノ酸残基を１残基目として、ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインのＮ末端のＮ末側に隣接する残基までのアミノ酸残基の数であり、Ｎ末側から、ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメイン→ＤＮＡ結合ドメインの順の場合には、ＴＡＬＥリピートドメインのＮ末端のＮ末側に隣接するアミノ酸残基を１残基目として、ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインのＣ末端のＣ末側に隣接する残基までのアミノ酸残基の数である。
　前記リンカーの種類としては特に制限されず、例えば、Ｓｕｎ，Ｎ．，＆Ｚｈａｏ，Ｈ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，１０（３），ｐ．４４６－４５３に記載のＨＴＳ９５アミノ酸配列からなるＨＴＳ９５リンカー、ＧＳＳリンカー、ＳＡＧＧリンカー、ＧＧＧＧＳリンカー、ＸＴＥＮリンカー等が挙げられる。
　本発明に係る融合タンパク質において、ＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインとは、必要に応じて前記リンカーを介して、どちらがＮ末側にあってもＣ末側にあってもよい。これらの中でも、本発明に係る融合タンパク質としては、特にＤＮＡ鎖に特異的、つまり、第２の融合タンパク質が結合するＤＮＡ結合ドメイン認識配列のある鎖に特異的に優れたニッカーゼ活性を示す観点からは、Ｎ末側から、ＤＮＡ結合ドメイン→（必要に応じて前記リンカー）→ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインの順に結合されていることが好ましい。
　本発明に係る融合タンパク質において、ＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインとの結合は、核酸レベル及びアミノ酸レベルで行うことができる。すなわち、「ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインをコードするポリヌクレオチド→ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド」又は「ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド→ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメインをコードするポリヌクレオチド」の順となるように、それぞれのポリヌクレオチドをライゲーション反応により連結することにより、本発明に係る各融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製することができる。こうして得られたポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞内で発現させることにより、「ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメイン→ＤＮＡ結合ドメイン」又は「ＤＮＡ結合ドメイン→ＮＤ１ドメイン又はｄＮＤ１ドメイン」の順にアミノ酸レベルで結合された本発明に係る各融合タンパク質を得ることができる。
　前記発現ベクターとしては、当該分野で使用されるベクターから適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、ＢＡＣベクター、ＹＡＣベクター、ＭＡＣベクター、ＨＡＣベクターが挙げられる。前記発現ベクターを導入する宿主細胞としては、発現ベクターとの適合性を考慮して適宜選択することができ、例えば、大腸菌、放線菌、古細菌などの原核生物や酵母、ウニ、カイコ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、カエル、タバコ、シロイヌナズナ、イネ等の真核生物の細胞が挙げられる。なお、「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいずれも包含し、各ポリヌクレオチドにおいては、細胞内での発現効率を高める等の目的で、コドンの最適化を行っていてもよい。
　また、本発明に係る融合タンパク質は、アミノ酸配列情報を基に人工合成して調製することも可能である。さらに、本発明に係る融合タンパク質としては、精製や検出のためのエピトープタグ（例えば、フラグタグ、ＨＡタグなど）や標識タンパク質（例えば、蛍光タンパク質など）、各種移行シグナル（例えば、核移行シグナル、色素体移行シグナル、ミトコンドリア移行シグナルなど）が付加されていてもよい。
　＜所望のヌクレオチド配列をノックインする方法＞
　本発明は、標的ＤＮＡ上の標的領域にドナー配列を挿入する方法であり、
　５’側から、５’側ホモロジーアーム配列、ドナー配列、３’側ホモロジーアーム配列の順で配置されたヌクレオチド配列を含む一本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡと、
　上記本発明のニッキングシステムと、
を標的ＤＮＡに接触させる工程を含む、
方法（本明細書中、場合により単に「本発明のノックイン方法」ともいう）を提供する。
　（標的ＤＮＡ）
　本発明においては、所望のヌクレオチド配列、すなわち、下記のドナーＤＮＡのドナー配列を挿入する領域を標的領域として、該標的領域を含むＤＮＡを「標的ＤＮＡ」という。本発明に係る標的ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡであり、上記の本発明のニッキングシステムとの対応を示すために、便宜的に、少なくとも一方の鎖が、５’側から順に、５’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列、必要に応じて前記スペーサー、前記標的領域、必要に応じて前記スペーサー、３’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列を含む構造であるものとする。５’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列及び３’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列は、互いに同じ鎖上に設定しても、互いに反対鎖上に設定してもよいが、互いに反対鎖上に設定することが好ましい。
　また、本発明に係る標的ＤＮＡには、前記標的領域の５’側に隣接して、下記のドナーＤＮＡの５’側ホモロジーアーム配列（５’ＨＡ）と同一配列である５’側配列を含み、また、３’側に隣接して、下記のドナーＤＮＡの３’側ホモロジーアーム配列（３’ＨＡ）と同一配列である３’側配列を含むものとする。かかる５’側配列及び３’側配列は、それぞれ、５’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列若しくはその相補配列、又は、３’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列若しくはその相補配列と重複していてもよい。
　本発明に係る「標的領域」は、下記のドナーＤＮＡのドナー配列が挿入される、又は前記ドナー配列で置換される領域を示す。前記標的領域は、前記ニッキング酵素によって切断される切断部位を含む領域又はその近傍の領域であり、その長さとしては、隣接する２塩基の間の前記切断部位又はその近傍に存在する２塩基の間の１箇所であってもよく、当該切断部位に隣接する、又は当該切断部位の近傍に存在する１塩基であってもよく、当該切断部位を含む、又は当該切断部位の近傍に存在する２塩基以上であってもよい。本発明において、「標的領域にドナー配列を挿入」には、前記切断部位を挟む又はその近傍に存在する２塩基の間に前記ドナー配列が挿入される態様の他、１塩基以上の前記標的領域が前記ドナー配列で置換される態様を含むものとする。１塩基以上の標的領域の長さとしては、例えば、１～５００塩基であることが好ましく、２～３００塩基であることがより好ましく、２～１００塩基であることがさらに好ましい。
　なお、本発明において、「切断部位の近傍」という場合の「近傍」とは、好ましくは、前記切断部位との間の塩基数が１００塩基以内であることを示し、５０塩基以内であることがより好ましい。
　本発明に係る「５’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列」及び「３’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列」は、それぞれ、第１のＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＤＮＡ結合ドメインのうちのいずれかが認識する配列である。第１のＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＤＮＡ結合ドメインは、互いに他方のＤＮＡ結合ドメイン認識配列に結合すればよく、どちらが５’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列に結合しても３’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列に結合してもよい。
　本発明に係る「５’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列」及び「３’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列」（本明細書中、場合により単に「ＤＮＡ結合ドメイン認識配列」と総称する）の長さとしては、ＤＮＡ結合ドメインの種類に応じて設定されるが、例えば、前記各ＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥである場合には、それぞれ独立に、１０～３０塩基であることが好ましく、１３～２５塩基であることが好ましく、１５～２２塩基であることがさらに好ましい。また例えば、前記各ＤＮＡ結合ドメインがジンクフィンガーアレイである場合には、それぞれ独立に、６～４５塩基であることが好ましく、９～２４塩基であることが好ましく、１２～１８塩基であることがさらに好ましい。
　本発明に係るＤＮＡ結合ドメイン認識配列の間の距離（５’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列の５’側又は３’側に隣接する塩基を１塩基目として、３’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列の３’側又は５’側に隣接する塩基までの長さ、標的領域を含む）としては、上記本発明のニッキング酵素が２量体を形成でき、特異的かつ高効率で前記標的領域内又は前記標的領域の近傍にニックを導入できる観点から、１～５０塩基であることが好ましく、２～４０塩基であることが好ましく、３～３０塩基であることがより好ましい。
　このような標的ＤＮＡのヌクレオチド配列としては、特に制限されず、５’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列、３’ＤＮＡ結合ドメイン認識配列又はその相補配列、ＤＮＡ結合ドメイン認識配列の間の距離、５’側配列、及び３’側配列が上記条件を満たすように、下記のドナーＤＮＡ、並びに、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質における各ＤＮＡ結合ドメインを設計することにより、本発明のノックイン方法の標的とすることができる。
　本発明に係る標的ＤＮＡとしては、目的に応じて、細胞内に存在するＤＮＡ（内在性ＤＮＡ）又は細胞外に存在するＤＮＡとすることができる。細胞内に存在するＤＮＡとしては、内因性ＤＮＡであっても、外因性ＤＮＡであってもよい。内因性ＤＮＡとしては核内のゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡが挙げられ、外因性ＤＮＡとしては、例えば、細胞内に導入したＤＮＡが挙げられる。本発明に係る標的ＤＮＡが細胞内に存在するＤＮＡ（内因性ＤＮＡ）である場合、当該ＤＮＡとしては、核内のゲノムＤＮＡ又は外因性ＤＮＡであることがより好ましい。細胞外に存在するＤＮＡとしては、細胞に由来するＤＮＡであっても、細胞外で増幅、合成したＤＮＡであってもよい。
　（ｓｓＤＮＡ）
　本発明のノックイン方法は、ドナーＤＮＡとして、ドナー配列を含む一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を用いることを特徴とする。
　本発明において、「ドナー配列」とは、前記標的ＤＮＡの標的領域に挿入することを目的とする所望のヌクレオチド配列であり、特に制限されず、任意のヌクレオチド配列を採用することができる。本発明のノックイン方法により、前記標的領域がこのドナー配列に置き換えられる。一例として、前記ドナー配列としては、前記標的領域に変異（例えば、塩基の置換、欠失、付加、又は挿入）が導入されてなる配列が挙げられる。また、別の一例として、前記ドナー配列としては、外来ＤＮＡ配列（例えば、組換え酵素認識配列、組換え酵素発現カセット、薬剤耐性遺伝子発現カセット、ネガティブセレクションマーカー発現カセット、蛍光タンパク質発現カセット等）を含む配列が挙げられる。また、前記ドナー配列としては、前記標的領域（又はその変異配列）に前記外来ＤＮＡ配列が導入された配列とすることもできる。
　このようなドナー配列の長さとしては、特に制限されず、例えば、１～１００００塩基とすることができ、１０～１００００塩基であることが好ましく、３０～５０００塩基であることがより好ましく、５０～３０００塩基であることがさらに好ましい。
　本発明に係るドナーＤＮＡは、また、前記ドナー配列の５’側に、前記標的領域の５’側に隣接するヌクレオチド配列（５’側配列）と同一配列である５’側ホモロジーアーム配列（本明細書中、場合により「５’ＨＡ」とも称する）を含み、３’側に、前記標的領域の３’側に隣接するヌクレオチド配列（３’側配列）と同一配列である３’側ホモロジーアーム配列（本明細書中、場合により「３’ＨＡ」と称する）を含む。
　本発明に係る一本鎖ＤＮＡを、センス鎖上にある標的領域を基に設計する場合、５’ＨＡは、前記センス鎖上の標的領域の５’側に隣接するヌクレオチド配列の同一配列とし、３’ＨＡは、前記センス鎖上の標的領域の３’側に隣接するヌクレオチド配列の同一配列とする。また、アンチセンス鎖上にある標的領域を基に設計する場合、５’ＨＡは、前記アンチセンス鎖上の標的領域の５’側に隣接するヌクレオチド配列の同一配列とし、３’ＨＡは、前記アンチセンス鎖上の標的領域の３’側に隣接するヌクレオチド配列の同一配列とする。
　本発明に係る５’ＨＡ及び３’ＨＡ（本明細書中、場合により単に「ホモロジーアーム」と総称する）の、前記標的ＤＮＡ上の５’側配列又は３’側配列との同一配列としては完全に同一（すなわち、同一性が１００％）でなくとも、実質的に同一であればよく、例えば、それぞれ独立して、同一性が８０％以上であればよく、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９７％以上、９８％以上、９９％以上であることがさらにより好ましい。
　前記ホモロジーアームの長さとしては、それぞれ独立に、１０～８００塩基であることが好ましく、２０～７５０塩基であることがより好ましく、３０～７００塩基であることがさらに好ましい。これらの中でも、本発明に係るドナーＤＮＡとしては、前記ホモロジーアームの長さが、それぞれ独立に、１００塩基以上である長鎖一本鎖ＤＮＡ（ｌｓｓＤＮＡ）であることが好ましく、前記ホモロジーアームの長さが、それぞれ独立に、１００～７００塩基であることがより好ましく、１００～６００塩基であることがさらに好ましい。
　本発明のドナーＤＮＡとしては、好ましくは、５’側から、５’ＨＡ、ドナー配列、３’ＨＡの順で配置されてなるヌクレオチド配列のみからなる一本鎖ＤＮＡであるが、本発明の効果（ノックイン効率等）を著しく阻害しない限りこれに限定されず、例えば、５’末端及び／又は３’末端に、任意の複数塩基（好ましくは１００塩基以下）からなるヌクレオチド配列が付加されていてもよい。
　このようなドナーＤＮＡの長さ（全長）としては、特に制限されないが、例えば、２１～１１６００塩基とすることができ、４０～１００００塩基であることが好ましく、６０～６０００塩基であることがより好ましく、１００～４０００塩基であることがさらに好ましい。
　本発明のドナーＤＮＡとしては、公知の一本鎖ＤＮＡを作製する方法又はそれに準じた方法によって作製することができる。例えば、ＰＣＲ、制限酵素切断、ＤＮＡ連結技術等を利用して作製することができる。また、Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ，２０２１，１０，１０７６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ１００５１０７６（非特許文献３）に記載の方法にしたがって、一方のプライマーの５’末端をリン酸化したプライマーセットを用いてＰＣＲにより一本鎖ＤＮＡの配列を増幅し、得られた二本鎖ＤＮＡのうち、５’末端がリン酸化された方の鎖を同リン酸化末端から消化することにより、長鎖一本鎖ＤＮＡの場合にも目的の一本鎖ＤＮＡを作製することができる。
　（ノックイン）
　本発明のノックイン方法では、前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムを前記標的ＤＮＡに接触させ、前記ニッキングシステムによって前記標的領域内又は前記標的領域の近傍を切断することで当該標的領域に前記ドナー配列を挿入する。
　なお、本発明において、ニックを導入する位置について「標的領域の近傍」という場合の「近傍」とは、好ましくは、前記標的領域に隣接する塩基を１塩基目として、１００塩基以内であることを示し、５０塩基以内であることがより好ましい。
　前記ドナーＤＮＡと、前記ニッキングシステム、すなわち、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を標的ＤＮＡに接触させると、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の各ＤＮＡ結合ドメインが標的ＤＮＡ上の対応するＤＮＡ結合ドメイン認識配列を認識して結合し、第１のＤＮＡ結合ドメインに連結されたＮＤ１ドメイン、及び、第２のＤＮＡ結合ドメインに連結されたｄＮＤ１ドメインを当該標的ＤＮＡ上の標的領域付近に誘導する。これにより、当該標的領域内又は前記標的領域の近傍において、ＮＤ１ドメイン及びｄＮＤ１ドメインの２量体を含むニッキング酵素が二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断してニックを導入する。このとき、例えば、第１の融合タンパク質の構成が、Ｎ末側から「ＴＡＬＥ→ＮＤ１」の順に結合された構成であり、第２の融合タンパク質の構成が、Ｎ末側から「ＴＡＬＥ→ｄＮＤ１」の順に結合された構成である場合、第２の融合タンパク質が結合するＤＮＡ結合ドメイン認識配列がある鎖に選択的にニックを導入することができる。ニックが導入された結果、前記ドナーＤＮＡと前記標的ＤＮＡとの間におけるホモロジーアームとその同一配列（５’側配列、３’側配列）との相関により、前記ドナー配列が当該標的領域に挿入される。
　本発明のノックイン方法は、細胞内において行っても、無細胞系において行ってもよい。本発明のノックイン方法の場となる「細胞内」としては、真核細胞内であっても原核細胞内であってもよく、好ましくは真核細胞内である。前記真核細胞としては、例えば、動物細胞（哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞等）、植物細胞、藻細胞、酵母が挙げられ、前記原核細胞としては、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、枯草菌、乳酸菌、高度好熱菌が挙げられる。
　「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞等が含まれる。具体的には、例えば、卵母細胞や精子などの生殖細胞；各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ノックイン動物の作製に用いられる卵母細胞としては、受精前及び受精後の卵母細胞を利用することができるが、好ましくは受精後の卵母細胞、すなわち受精卵である。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。卵母細胞は、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
　「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞等が含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、カルスなどが挙げられる。
　また、本発明のノックイン方法の場となる「無細胞系」とは、生きた細胞（前記真核細胞、原核細胞）のない系を示す。本発明に係る無細胞系としては、前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムと、前記標的ＤＮＡとが接触可能な系であれば特に制限されず、例えば、緩衝液内；前記真核細胞又は原核細胞の細胞破砕液内、細胞抽出液内等が挙げられる。
　前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムと前記標的ＤＮＡとを接触させる方法としては特に制限されない。細胞内においては、例えば、下記のノックイン細胞の製造方法のように、前記標的ＤＮＡを含む細胞に対して前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムを導入又は発現させる方法が挙げられる。無細胞系においては、例えば、標的ＤＮＡの溶液と前記前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムの溶液とを混合すればよい。これらの溶液の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が好ましい。
　＜ノックイン細胞の製造方法＞
　本発明は、標的ＤＮＡ上の標的領域にドナー配列が挿入された細胞を製造する方法であり、
　前記ドナーＤＮＡと、
　上記本発明のニッキングシステムと、
を細胞内に導入又は細胞内で発現させ、標的ＤＮＡに接触させる工程を含む、
方法（本明細書中、場合により「本発明のノックイン細胞の製造方法」ともいう）も提供する。
　本発明のノックイン細胞の製造方法において、前記標的ＤＮＡ、ドナーＤＮＡ、及びニッキングシステムは、それぞれ、その好ましい態様も含めて、上述したとおりである。本発明のノックイン細胞の製造方法における標的ＤＮＡとしては、細胞内のゲノムＤＮＡであり、より好ましくは、核内のゲノムＤＮＡであり、当該ゲノムＤＮＡの編集目的に応じて、ドナーＤＮＡ、第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質を設計することができる。前記細胞としては、上記の本発明のノックイン方法の場として挙げた各細胞が挙げられる。
　また、本発明のノックイン細胞の製造方法において、前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムと前記標的ＤＮＡとの接触は、前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムの細胞内への導入、又は、前記ドナーＤＮＡの細胞内への導入及び前記ニッキングシステムの細胞内での発現により行う。したがって、本発明に係るニッキングシステムとしては、これを構成する各融合タンパク質を、それぞれタンパク質の形態で細胞に導入しても、当該タンパク質をコードするＲＮＡやＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させても、前記ポリヌクレオチドを含み、当該タンパク質を発現するベクター（発現ベクター）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させてもよい。
　前記各融合タンパク質を発現ベクターの形態で細胞に導入して細胞内で発現させる場合には、例えば、前記各融合タンパク質を発現するベクターをそれぞれ細胞内に導入してもよく、また、これらを組み合わせて発現するベクターを細胞内に導入してもよい。
　また、前記各融合タンパク質を発現ベクターの形態やポリヌクレオチドの形態で細胞に導入して細胞内で発現させる場合、前記各融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、それぞれ独立して、導入する細胞に応じて適宜コドン最適化されたものであってもよい。また、当該発現ベクターとしては、発現させるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結しているプロモーター及び／又はその他の制御配列を含むことが好ましい。ここで、「作動可能に結合している」とは、調節エレメントに上記ポリヌクレオチドが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナルなど）が挙げられる。プロモーターとしては、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、ｐｏｌＩＩプロモーター、ｐｏｌＩプロモーター、及びこれらの組み合わせが挙げられ、当業者であれば、導入する細胞の種類などに応じて、適切な発現ベクターを選択することができる。さらに、当該発現ベクターとしては、宿主ゲノムに組み込まれることなく、コードするタンパク質を安定して発現することができるものであることが好ましい。このような融合タンパク質発現ベクターは、適宜従来公知の方法に準じて作製することができる。
　前記ドナーＤＮＡ、前記各融合タンパク質、各融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、各融合タンパク質を発現するベクターを細胞に導入する方法としては、タンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡ断片を細胞に導入するための公知の方法を細胞の種類に応じて適宜採用することができ、このような方法としては、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法、リポソーム法（リポフェクション法）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、ウイルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウィルス等）、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法、熱ショック法（塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）等が挙げられる。このような方法は、「Ｄａｖｉｓｅｔ　ａｌ．，Ｂａｓｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６」等、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
　前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムが細胞内に導入される又は細胞内で発現すると、前記ドナーＤＮＡと各融合タンパク質と細胞内の標的ＤＮＡとが接触し、上記の本発明のノックイン方法で述べた標的領域へのドナー配列の挿入が起こり、かかる標的領域にドナー配列が挿入された細胞を得ることが可能となる。
　本発明はまた、標的ＤＮＡ上の標的領域にドナー配列が挿入された細胞（ノックイン細胞）を含む非ヒト個体の作製方法を提供する。この方法は、上記本発明のノックイン細胞の製造方法により得られた細胞から非ヒト個体を作製する工程を含む。前記非ヒト個体としては、例えば、非ヒト動物及び植物が挙げられる。前記非ヒト動物としては、哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類が挙げられる。モデル動物を作製する場合、哺乳動物は、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類であり、特に好ましくはマウスである。前記植物としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類が挙げられる。具体的な作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションを例示することができる。
　前記ノックイン細胞から非ヒト個体を作製する方法としては、公知の方法を利用することができる。動物において細胞から非ヒト個体を作製する場合、通常、生殖細胞又は多能性幹細胞が利用される。例えば、前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムを卵母細胞にマイクロインジェクションし、得られた卵母細胞を偽妊娠状態にした雌非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、その後産仔を得ることができる。また、植物においては、古くから、その体細胞が分化全能性を有していることが知られており、例えば、前記ドナーＤＮＡ及びニッキングシステムを植物細胞にマイクロインジェクションし、得られた植物細胞から植物体を再生することにより、所望のヌクレオチド配列がゲノムに挿入された植物体を得ることができる。また、得られた非ヒト個体からは、所望のヌクレオチド配列がゲノムに挿入された子孫やクロ－ンを得ることもできる。
　標的ＤＮＡ上の標的領域へのドナー配列のノックインの有無の確認、及び遺伝子型の決定は、従来公知の方法に基づいて行うことができ、例えばＰＣＲ法、配列決定法、サザンブロッティング法等を利用することができる。
　＜キット＞
　本発明は、また、上記本発明のノックイン方法、本発明のノックイン細胞の製造方法、又は上記本発明の非ヒト個体の作製方法に用いるためのキットであり、
　第１の融合タンパク質、第１の融合タンパク質を発現する第１の融合タンパク質発現ベクター、及び第１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種と、
　第２の融合タンパク質、第２の融合タンパク質を発現する第２の融合タンパク質発現ベクター、及び第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種と、
を含むキットを提供する。
　第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は、それぞれ、その好ましい態様も含めて、上記の本発明のニッキングシステムで述べたとおりである。これらはそれぞれ独立して、タンパク質の形態であっても、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの形態であっても、当該タンパク質を発現するベクター（発現ベクター）の形態であってもよい。第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の各発現ベクター、並びに、これらをコードする各ポリヌクレオチドも、それぞれ、その好ましい態様も含めて上述のとおりである。また、本発明のキットとしては、前記ドナーＤＮＡをさらに含んでいてもよく、これは、その好ましい態様も含めて、上記の本発明のノックイン方法で述べたとおりであるが、各方法に用いるためのドナーＤＮＡは、標的ＤＮＡの標的領域に応じて、ユ－ザ－が適宜設計、合成してよい。
　本発明に係る融合タンパク質が発現ベクターの形態である場合、標的ＤＮＡの標的領域に応じて、ユ－ザ－が前記各融合タンパク質を設計することができる形態であってもよく、第１の融合タンパク質発現ベクターは、
　（ｉ）ＮＤ１ドメイン及び第１のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、
　（ｉｉ）ＮＤ１ドメインをコードするポリヌクレオチドと、第１のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と、を含むベクター
からなる群から選択される少なくとも１種とすることができ、第２の融合タンパク質発現ベクターは、
　（ｉｉｉ）ｄＮＤ１ドメイン及び第２のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、
　（ｉｖ）ｄＮＤ１ドメインをコードするポリヌクレオチドと、第２のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と、を含むベクター
からなる群から選択される少なくとも１種とすることができる。
　上記（ｉ）～（ｉｖ）のベクターにおいて、各構成（ドメイン、必要に応じてリンカー、挿入部位等）の順は、発現させる目的の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に応じて適宜調整することができる。また、例えば、第１のＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬＥである場合、（ｉｉ）、（ｉｖ）における挿入部位に挿入されるポリヌクレオチドはそのＴＡＬＥリピート配列のみであってもよく、この場合、（ｉｉ）、（ｉｖ）のベクターには、ＴＡＬＥのＮ末ドメインをコードするポリヌクレオチド及び必要に応じてＣ末ドメインをコードするポリヌクレオチドを含んでいてよい。さらに、第１の融合タンパク質発現ベクター及び第２の融合タンパク質発現ベクターは、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現する１つのベクターであってもよい。なお、（ｉ）～（ｉｖ）の各ベクターとしては、それぞれ、各ポリヌクレオチドを発現可能にする発現ユニットを含むものであることが好ましい。
　本発明のキットとしては、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含んでいてもよい。このような追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、当該キットは、本発明の各方法を実施するための使用説明書をさらに含んでいてもよい。
　本発明のキットに含まれる各要素は、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、同一の容器に収容されていてもよい。各要素は、一回の使用量ごとに容器に収容されていてもよいし、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい。各要素は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒（緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等を含む溶媒）中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
　以下、試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の試験例に限定されるものではない。
　（試験例１）シングルストランドアニーリング（ＳＳＡ）アッセイによるニッカーゼ活性確認
　〔方法〕
　（１）ＴＡＬＥベクターセット及びＴＡＬＥ発現プラスミドの作製
　ＴＡＬＥベクターセットの配列及び構成は、各ＴＡＬＥ認識配列に対応するように、Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，３：３３７９（２０１３）にしたがって構築した。先ず、１２番目と１３番目の２アミノ酸で構成される可変残基の４種（ＲＶＤ：ＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、ＮＮ）をコードする配列以外のモジュ－ル配列（ｎｏｎ－ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ（ｎｏｎ－ＲＶＤ））に改変（特に、４番目と３２番目）を加え、さらにその両端に制限酵素ＢｓＡＩ認識サイトを付加した配列（モジュ－ル配列）を人工ＤＮＡ合成した（計１６種：１ＨＤ～４ＨＤ、１ＮＧ～４ＮＧ、１ＮＩ～４ＮＩ、１ＮＮ～４ＮＮ）。次いで、これらモジュ－ル配列をｐＥＸ－Ａ２Ｊ２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に挿入して、モジュ－ルプラスミドセット（計１６種：ｐＥＸ１ＨＤ～ｐＥＸ４ＨＤ、ｐＥＸ１ＮＧ～ｐＥＸ４ＮＧ、ｐＥＸ１ＮＩ～ｐＥＸ４ＮＩ、及びｐＥＸ１ＮＮ～ｐＥＸ４ＮＮ）を作製した。
　また、アレイプラスミドを構成するＤＮＡ配列ＦＵＳ２＿ａＸＸ（計７種：ＸＸ＝１ａ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ）及びＦＵＳ２＿ｂ（１－４）（計４種）を人工ＤＮＡ合成により作製した。これらをｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に挿入して、ｐＣＲ８＿ＦＵＳ２＿ａＸＸ及びｐＣＲ８＿ＦＵＳ＿ｂ（１－４）を作製した。次いで、これを上記Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１３）に記載のＰｌａｔｉｎｕｍ　Ｇａｔｅシステムにおける最初のアセンブルステップ（ステップ１）の捕捉ベクターとして使用し、同文献に記載の方法にしたがって、ＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドを作製した。
　次いで、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）から薬剤耐性遺伝子発現ユニットを除去したｐｃＤＮＡ３．１ｓに、人工ＤＮＡ合成により作製した、ＴＡＬＥのＮ末ドメインをコードする配列に加え、前記モジュ－ル配列を１つと、この３’末に続くＴＡＬＥのＣ末ドメインをコードする配列と、を挿入したデスティネーションベクター（ＴＡＬＥ４７ベクター）を作製した。ＴＡＬＥのＣ末ドメインとしては、Ｃ末ドメインのアミノ酸数が４７のもの（４７）を用い、「４７」をコードする配列はＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＮＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ　ＩＤ：５０７０４）に含まれるＣ末ドメインの配列を参照して人工ＤＮＡ合成した。また、ＴＡＬＥのＮ末ドメインとしては、Ｃ末ドメインに対応させて、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０７０３）に含まれるＮ末ドメインの配列を参照して人工ＤＮＡ合成した。上記で作製したアレイプラスミド及びデスティネーションベクターを用いて、上記Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１３）に記載の方法にしたがい、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法によってＴＡＬＥ発現プラスミドを作製した。
　（２）ＴＡＬＥ－ＮＤ１発現プラスミド及びＴＡＬＥ－ｄＮＤ１発現プラスミドの作製
　人工合成したＮＤ１ドメイン（ヌクレオチド配列番号：３９、アミノ酸配列番号：４０）をコードしているＤＮＡを鋳型として、下記の表１に示すプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した断片（ＮＤ１）と、上記（１）で調製したＴＡＬＥ４７ベクターを鋳型として、下記の表１に示すプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した断片（ＴＡＬＥ４７）とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結することにより、ＴＡＬＥ４７のＣ末側にＮＤ１ドメインが融合した融合タンパク質を発現するＴＡＬＥ４７－ＮＤ１発現プラスミドを作製した。次いで、ＴＡＬＥ４７－ＮＤ１発現プラスミドを鋳型として、下記の表１に示す２種のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結する部位特異的変異導入法により、ＴＡＬＥ４７のＣ末側にＮＤ１ドメインにＤ６６Ｎ変異を導入したｄＮＤ１ドメイン（ヌクレオチド配列番号：４１、アミノ酸配列番号：４２）が融合した融合タンパク質を発現するＴＡＬＥ４７－ｄＮＤ１発現プラスミドを作製した。
　上記で調製したＴＡＬＥ４７－ＮＤ１発現プラスミド及びＴＡＬＥ４７－ｄＮＤ１発現プラスミドのＴＡＬＥ４７には、それぞれ、下記の表２に記載のＴＡＬＥ認識配列に対応するＴＡＬＥリピートドメイン（ＡＰＣ－Ｌ、ＡＰＣ－Ｒ、Ｒｏｓａ２６－Ｌ、Ｒｏｓａ２６－Ｒ）を挿入し、下記のＳＳＡアッセイに供した。
　（３）ＳＳＡアッセイによる二本鎖ＤＮＡ切断活性の定量
　ＳＳＡアッセイ用レポータープラスミドの作製には、特開２０２３－３８０２３号公報において作製したｐｃＥＧｘｘＦＰを用いた。ＳＳＡアッセイに用いる各標的遺伝子として、ＡＰＣ（ｈｕｍａｎ　ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ　ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ　ｃｏｌｉ）をヒトゲノムから、Ｒｏｓａ２６及びＨＰＲＴ１をハムスターゲノムから、それぞれＰＣＲにより単離し、それらをｐｃＥＧｘｘＦＰ内のＥＧＦＰのＮ末側とＣ末側の間に挿入したリンカー内の制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識配列にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入することにより、各ＳＳＡアッセイ用レポータープラスミド（ｐｃＥＧｘＡＰＣｘＦＰ、ｐｃＥＧｘＲｏｓａ２６ｘＦＰ）とした。
　また、国際公開第２０２３－０３８０２３号と同様にしてニッカーゼタイプのｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）発現プラスミド（ｐＸ３３０（Ｄ１０Ａ）＿ＢＳ）、及びガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９）を作製し、各ガイドＲＮＡは、下記の表３に示した各標的遺伝子上のガイドＲＮＡ標的配列（表３には、ガイドＲＮＡ標的配列（アンチセンス鎖上）の相補配列（下線以外の配列）及びＰＡＭ配列（下線配列）を示す）に対応するように設計した。標的遺伝子ＡＰＣ及びＲｏｓａ２６上のＰＡＭ配列（図１ではガイドＲＮＡ上のＰＡＭ配列に対応する位置を示す）、及びｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）による切断点と、各ＴＡＬＥ及びガイドＲＮＡとの位置関係の概念図を図１に示す。
　１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で生育させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１×１０４細胞ずつ、９６ウェルプレートの各ウェルにトランスフェクション前日に播種した。ＴＡＬＥ－Ｌ（ＡＰＣ－Ｌ、Ｒｏｓａ２６－Ｌ）発現プラスミド３３ｎｇ、ＴＡＬＥ－Ｒ（ＡＰＣ－Ｒ、Ｒｏｓａ２６－Ｒ）発現プラスミド３３ｎｇ、及びＳＳＡアッセイ用レポータープラスミド（ｐｃＥＧｘＡＰＣｘＦＰ、ｐｃＥＧｘＲｏｓａ２６ｘＦＰ）３３ｎｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。導入プラスミドの種類又は導入量を減らす場合においては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で補い、導入プラスミド全量を１００ｎｇとした。
　トランスフェクション後４８時間培養し、各ウェルの単位面積当たりのＥＧＦＰタンパク質による蛍光量をプレートリーダーで測定した。また、上記組み合わせに、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）発現プラスミド及びガイドＲＮＡ発現プラスミドもさらに組み合わせてトランスフェクションし、上記と同様に測定した。ウェル内の細胞の局在によるばらつきを低減させるために、各ウェルにつき１６ポイントで測定を行い、その平均値をＥＧＦＰ蛍光強度（ＲＦＩ）とした。独立した３ウェルの値の平均値及び標準偏差をグラフ化した。
　標的遺伝子としてＡＰＣを搭載したＳＳＡアッセイ用レポータープラスミドＥＧｘＡＰＣｘＦＰに対して、ＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせ、又は、一方のＮＤ１をｄＮＤ１としたＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｌ）－ｄＮＤ１とＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせ、若しくはＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｒ）－ｄＮＤ１との組み合わせ、これらにさらにｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）及びガイドＲＮＡ（ＡＰＣ＿ｇＲＮＡ－Ｃ又はＡＰＣ＿ｇＲＮＡ－Ｂ）を作用させたときの結果を図２に示す。
　また、標的遺伝子としてＲｏｓａ２６を搭載したＳＳＡアッセイ用レポータープラスミドＥＧｘＲｏｓａ２６ｘＦＰに対して、ＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせ、又は、一方のＮＤ１をｄＮＤ１としたＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）－ｄＮＤ１とＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせ、若しくはＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）－ｄＮＤ１との組み合わせ、これらにさらにｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）及びガイドＲＮＡ（Ｒｏｓａ２６＿ｇＲＮＡ－Ｃ又はＲｏｓａ２６＿ｇＲＮＡ－Ｂ）を作用させたときの結果を図３に示す。
　〔結果〕
　図２に示したように、標的遺伝子としてＡＰＣを搭載したレポータープラスミドＥＧｘＡＰＣｘＦＰに対して、ＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせを作用させることにより、二本鎖ＤＮＡ切断活性が確認され、ＮＤ１ドメインがダイマー型のヌクレアーゼとして機能することを再確認した。他方、一方のＮＤ１ドメインをｄＮＤ１ドメインとした場合には、二本鎖ＤＮＡ切断活性が消失することが確認された。さらに、ｎＣａｓ９と、ＴＡＬＥ４７－ｄＮＤ１のＴＡＬＥ認識配列と同じ鎖上のガイドＲＮＡ標的配列に対応するガイドＲＮＡとを同時に発現させること（ＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｌ）－ｄＮＤ１に対してＡＰＣ＿ｇＲＮＡ－Ｃ、ＴＡＬＥ４７（ＡＰＣ－Ｒ）－ｄＮＤ１に対してＡＰＣ＿ｇＲＮＡ－Ｂ）によって、ダブルニッキングによる二本鎖ＤＮＡ切断活性が確認され、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとの組み合わせがニッカーゼ活性を有することが確認された。
　また、図３に示したように、標的遺伝子としてＲｏｓａ２６を搭載したレポータープラスミドＥＧｘＲｏｓａ２６ｘＦＰに対して、ＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）－ＮＤ１とＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）－ＮＤ１との組み合わせを作用させた場合にも同様に、二本鎖ＤＮＡ切断活性が確認され、ＮＤ１ドメインがダイマー型のヌクレアーゼとして機能することを再確認した。また、この場合でも、一方のＮＤ１ドメインをｄＮＤ１ドメインとした場合には、二本鎖ＤＮＡ切断活性が消失することが確認された。さらにこの場合でも同様に、ｎＣａｓ９と、ＴＡＬＥ４７－ｄＮＤ１のＴＡＬＥ認識配列と同じ鎖上のガイドＲＮＡ標的配列に対応するガイドＲＮＡとを同時に発現させること（ＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｌ）－ｄＮＤ１に対してＲｏｓａ２６＿ｇＲＮＡ－Ｃ、ＴＡＬＥ４７（Ｒｏｓａ２６－Ｒ）－ｄＮＤ１に対してＲｏｓａ２６＿ｇＲＮＡ－Ｂ）によって、ダブルニッキングによる二本鎖ＤＮＡ切断活性が確認され、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとの組み合わせがニッカーゼ活性を有することが確認された。
　また、これらの結果より、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとの組み合わせでは、驚くべきことに、ｄＮＤ１ドメインに結合するＴＡＬＥが認識する鎖の方にニックが導入されることが確認された。
　（試験例２）ＮＤ１－ｄＮＤ１及びドナーｌｓｓＤＮＡによるノックイン効率の評価
　〔方法〕
　（１）レポーター細胞株樹立用プラスミドの作製
　先ず、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８，２０１８，ｐ．２２３－２３０（非特許文献４）の記載にならって、ＥＧＦＰ遺伝子の３２１番目の塩基ＣをＧに置換して終止コドンに置換し、ＥＧＦＰタンパク質が蛍光を発することのできない変異体としたｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（Ｃ３２１Ｇ）（ヌクレオチド配列番号：４５、アミノ酸配列番号：４６）発現ユニットをゲノムに挿入したレポーター細胞株を樹立するための、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２ａ－ＥＧＦＰ（Ｃ３２１Ｇ）／ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋を作製した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１は、タカラバイオ社から購入し、ＥＧＦＰをコードするＤＮＡは全合成した。これらＤＮＡ、及び発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）について、それぞれ、下記の表４に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結することにより、プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋を作製した（ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰのヌクレオチド配列番号：４３、アミノ酸配列番号：４４）。
　次いで、プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２ａ－ＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋上のＥＧＦＰをコードするヌクレオチド配列の３２１番目の塩基ＣをＧに置換した変異体としたｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（Ｃ３２１Ｇ）／ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋を作製した。プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２ａ－ＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋を鋳型として、下記の表４に記載の２種のプライマーセットによりＰＣＲを実施し、得られた断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結する部位特異的変異導入法により、プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（Ｃ３２１Ｇ）／ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋を作製した。
　（２）ドナープラスミド及び各発現プラスミドの作製
　上記非特許文献４に記載のＳＮＧＤ法にならって、ｎＣａｓ９によるニッキングによってドナープラスミドのノックインが誘発されてＥＧＦＰが野生型に戻された後の、ｎＣａｓ９による再度のアタックを回避するため、ＥＧＦＰに、標的遺伝子ＥＧＦＰ上にニックを入れるためのガイドＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ＿３３２ｓ（下記の表６に、ガイドＲＮＡ標的配列（アンチセンス鎖上）の相補配列（下線以外の配列）及びＰＡＭ配列（下線配列）を示す））の、標的配列への再結合を抑制する、アミノ酸置換を伴わない変異を導入したドナーＰＤ－０（ヌクレオチド配列番号：４７）を発現するプラスミド（ドナープラスミド）を作製した。すなわち、野生型のＥＧＦＰ翻訳領域配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＳＫ＋）にクローニングするために、ＥＧＦＰをコードするヌクレオチドの全合成配列を鋳型として、下記の表５に記載のプライマーセットでＰＣＲを実施し、制限酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩとで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＳＫ＋）と共にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結し、プラスミドＥＧＦＰ／ｐＢＳを作製した。さらに、ＥＧＦＰ／ｐＢＳを鋳型として、下記の表５に記載の２種のプライマーセットを用いてＰＣＲを実施し、得られた断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により連結し、ドナープラスミドＰＤ－０／ｐＢＳを作製した。
　また、上記ＳＮＧＤ法で使用するｎＣａｓ９発現プラスミドとしては、上記の試験例１の（３）で作製した、ニッカーゼタイプのｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）発現プラスミド（ｐＸ３３０（Ｄ１０Ａ）＿ＢＳ）を用いた。さらに、上記ＳＮＧＤ法で使用するガイドＲＮＡ発現プラスミドとしては、上記のｓｇＥＧＦＰ＿３３２ｓ、及び、ドナープラスミド（ｐＢＳ）上でニッキングを生じさせるためのガイドＲＮＡ（ｓｇＵＣ５７Ｎ２（下記の表６に、ガイドＲＮＡ標的配列（アンチセンス鎖上）の相補配列（下線以外の配列）及びＰＡＭ配列（下線配列）を示す）について、上記の試験例１の（３）と同様にして、ガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９）にｓｇＥＧＦＰ＿３３２ｓ、ｓｇＵＣ５７Ｎ２を挿入したガイドＲＮＡ発現プラスミドをそれぞれ作製した。
　また、ｎＣａｓ９に代えて、ＴＡＬＥ４７－ｄＮＤ１とＴＡＬＥ４７－ＮＤ１との組み合わせを用いたときのノックイン効率評価のために、ｎＣａｓ９及びガイドＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ＿３３２ｓ）によるニッキング箇所付近に同様のニッキングを発生させる目的で、上記試験例１（２）で作製したＴＡＬＥ４７－ｄＮＤ１発現プラスミド及びＴＡＬＥ４７－ＮＤ１発現プラスミドのＴＡＬＥ４７に、ＥＧＦＰ遺伝子上にある下記の表７に記載の各ＴＡＬＥ認識配列に対応するＴＡＬＥリピートドメイン（ＥＧＦＰ－３、ＥＧＦＰ－３Ｒ）を挿入し、ＴＡＬＥ４７（ＥＧＦＰ－３）－ｄＮＤ１発現プラスミド、及びＴＡＬＥ４７（ＥＧＦＰ－３Ｒ）－ＮＤ１発現プラスミドとした。
　さらに、ＴＡＬＥ４７－ｄＮＤ１とＴＡＬＥ４７－ＮＤ１との組み合わせに対するドナープラスミドとして、ＥＧＦＰに、前記ＴＡＬＥ認識配列への再結合を抑制する、アミノ酸置換を伴わない変異を導入したドナーＰＤ－３（ヌクレオチド配列番号：４８）を発現するプラスミド（ドナープラスミド：ＰＤ－３／ｐＢＳ）を、下記の表５に記載の２種のプライマーセットを用い、上記ＰＤ－０／ｐＢＳと同様にして作製した。
　（３）レポーター細胞株の樹立
　上記（１）で作製したプラスミドｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（Ｃ３２１Ｇ）／ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋を制限酵素ＳｃａＩ切断部位（プラスミド上に１か所のみ、アンピシリン耐性遺伝子上に存在）で切断し、直鎖状断片をアガロースゲル電気泳動により単離精製した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で生育させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞２．５×１０５細胞を、６ウェルプレートにトランスフェクション前日に播種した。上記のｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（Ｃ３２１Ｇ）／ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ＋直鎖状断片２．５μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。導入２日後に細胞を剥がし、１２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ含有培地（以後、この培地で細胞株を樹立）で適宜希釈し、１０ｃｍディッシュに播種した。約２週間後に単一コロニーを回収し、９６ウェルプレートに播種した。ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が観察された２４株を拡大培養し、下記（５）のＳＮＧＤ法にしたがったノックイン効率評価を実施して、ノックイン効率の高かった３株（＃７、＃８、＃２２）を選択し、これら３株について限界希釈法により再度単一クローンを取得した。得られたクローン＃７－１、＃７－２、＃７－３、＃８－１、＃８－２、＃８－３、＃２２－１、＃２２－２、＃２２－３について、ノックイン効率、細胞増殖等を比較検討し、同等の活性及び増殖能を有する株として、＃７－２、＃８－１、＃２２－３株を選択した。以後の実験には、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（Ｃ３２１Ｇ）発現ユニットをゲノムに挿入したレポーター細胞株（蛍光活性消失変異体発現株）として、＃２２－３株を使用した。
　（４）ｌｓｓ（ｌｏｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ）ＤＮＡの作製
　ドナーｌｓｓＤＮＡとしては、Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ，２０２１，１０，１０７６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ１００５１０７６（非特許文献３）に記載の方法にしたがってｌｓｓＤＮＡ（全長：７２０ｎｔ、５’ＨＡ：３２０ｎｔ、３’ＨＡ：３９９ｎｔ、ＰＤ－０又はＰＤ－３と同じヌクレオチド配列）をそれぞれ調製した。先ず、ドナープラスミドＰＤ－０／ｐＢＳ又はＰＤ－３／ｐＢＳを鋳型として、下記の表８に記載のプライマーセットによりＰＣＲを実施した。このとき、使用するプライマーの一方を５’末端をリン酸化したプライマーとした。得られたＰＣＲ産物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ―ｕｐ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を用いて精製した後、約５μｇをＬａｍｂｄａ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂ社製）により５’リン酸化末端側から消化し、次いで、残存する二本鎖ＤＮＡをＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製）により消化し、さらに上記ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ―ｕｐを用いて精製することにより、各ｌｓｓＤＮＡ（ＰＤ－０、ＰＤ－３）を得た。
　（５）ノックイン効率評価
　１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で生育させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１×１０４細胞ずつ、ポリ－Ｌ－リジンコート又はコラーゲンコートの９６ウェルプレートの各ウェルにトランスフェクション前日に播種した。ドナープラスミド（ＰＤ－０、ＰＤ－３）、ｌｓｓＤＮＡ（ＰＤ－０、ＰＤ－３）、ガイドＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ＿３３２ｓ）発現プラスミド、ガイドＲＮＡ（ｓｇＵＣ５７Ｎ２）発現プラスミド、ｎＣａｓ９発現プラスミド、ＴＡＬＥ４７（ＥＧＦＰ－３）－ｄＮＤ１発現プラスミド、及びＴＡＬＥ４７（ＥＧＦＰ－３Ｒ）－ＮＤ１発現プラスミドを、下記の表９に示す組み合わせ及び量で、総計１００ｎｇのプラスミド及びＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（＃２２－３株）に導入した。導入プラスミドの種類又は導入量を減らす場合においては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で補い、導入プラスミド及びＤＮＡの全量が１００ｎｇとなるようにした。
　トランスフェクション後７２時間培養し、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２染色（各ウェルに５０μｇ／ｍＬ溶液を１０μＬ添加、１０分、室温）し、さらに、４％パラホルムアルデヒド溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間処理して細胞を固定した。ＰＢＳ（－）で洗浄後、各ウェルにＰＢＳ（－）１００μＬを添加し、Ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　６０００（Ｃｙｔｉｖａ社製）により２種類の蛍光画像データ（Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２染色による蛍光、ＥＧＦＰ蛍光）を各ウェル４か所ずつ取得した。蛍光を発した細胞数を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪにより数値化して、ＥＧＦＰ陽性細胞数／全細胞数（％）について前記４か所の平均値及び標準偏差をグラフ化した。得られたＥＧＦＰ陽性細胞数／全細胞数（％）の平均値が高いほど、ノックイン効率が高いといえる。
　表９に示す組み合わせ（（ａ）：Ｍｏｃｋ、（ｂ）ＳＮＧＤ、（ｃ）ｄＮＤ１＋ＮＤ１＋ＰＤ、（ｄ）ｄＮＤ１＋ＮＤ１＋ｌｓｓＤＮＡ）における各ＥＧＦＰの蛍光画像を図４に、ＥＧＦＰ陽性細胞数／全細胞数（％）を図５に、それぞれ示す。
　また、ｎＣａｓ９に、ドナーＤＮＡとして、ドナープラスミドに代えてｌｓｓＤＮＡを組み合わせた場合についても比較検証するために、各ドナーＤＮＡ及び発現プラスミドの組み合わせを、下記の表１０に示す組み合わせ及び量としたこと以外は上記と同様にして、ＥＧＦＰ陽性細胞数／全細胞数（％）の平均値を求め、ドナープラスミドを用いたとき（ａ）の値を１として、各相対活性及び標準偏差をグラフ化した。結果を図６に示す。
　〔結果〕
　図４～図５の（ｂ）は、非特許文献４に記載にならったＳＮＧＤ法（ＳＮＧＤ：ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｉｃｋｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｄｏｎｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ）により、ＥＧＦＰ蛍光活性消失変異体発現株（＃２２－３株）を用い、ｎＣａｓ９によってターゲットゲノム上及びドナープラスミド上にニッキングを入れることによるノックイン効率を確認した結果である。図４～図５に示したように、非特許文献４に記載のＳＮＧＤ法と同様に、ドナープラスミドＰＤ－０／ｐＢＳ、ガイドＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ＿３３２ｓ）発現プラスミド、及びガイドＲＮＡ（ｓｇＵＣ５７Ｎ２）発現プラスミド、及びｎＣａｓ９発現プラスミドを導入した場合（ｂ）には、全細胞のうちの約６％でノックインが観察された。
　図４～図５の（ｃ）は、ターゲットゲノムに対するニッキングを、ｎＣａｓ９に代えてＴＡＬＥ４７－ｄＮＤ１とＴＡＬＥ４７－ＮＤ１との組み合わせに担わせたときのノックイン効率を確認した結果である。図４～図５に示したように、ドナープラスミドＰＤ－３／ｐＢＳ、ガイドＲＮＡ（ｓｇＥＧＦＰ＿３３２ｓ）発現プラスミド、ｎＣａｓ９発現プラスミド、ＴＡＬＥ４７（ＥＧＦＰ－３）－ｄＮＤ１発現プラスミド、及びＴＡＬＥ４７（ＥＧＦＰ－３Ｒ）－ＮＤ１発現プラスミドを導入した場合（ｃ）にも、（ｂ）と同様に全細胞のうちの約６％でノックインが観察され、本発明のＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとの組み合わせによるニッカーゼ活性はｎＣａｓ９のニッカーゼ活性に代替できることが確認された。
　図４～図５の（ｄ）は、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとの組み合わせによるニッキングに対し、ドナーＤＮＡとして、ドナープラスミドに代えてｌｓｓＤＮＡを組み合わせたときのノックイン効率を確認した結果である。図４～図５に示したように、ｌｓｓＤＮＡ（ＰＤ－３）、ＴＡＬＥ４７（ＥＧＦＰ－３）－ｄＮＤ１発現プラスミド、及びＴＡＬＥ４７（ＥＧＦＰ－３Ｒ）－ＮＤ１発現プラスミドを導入した場合（（ｄ）：実施例）には、全細胞のうちの約１８％でノックインが観察され、ドナープラスミドを使用した場合（ｃ）に対して約３倍の顕著に高いノックイン効率を示すことが確認された。
　他方、図６に示したように、ｎＣａｓ９によるニッキングに対しても、ドナープラスミドに代えてｌｓｓＤＮＡを組み合わせた場合（比較例）について比較検証したが、ｎＣａｓ９によるニッキングにおいては、ドナーＤＮＡをｌｓｓＤＮＡとしても（ｂ）、また、ｌｓｓＤＮＡの量をさらに増やしても（（ｃ）～（ｄ））、ドナープラスミドを用いた場合（ａ）に比べてノックイン効率（ＥＧＦＰ陽性細胞数／全細胞数（％））の向上は観察されず、本発明のＴＡＬＥ－ＮＤ１とＴＡＬＥ－ｄＮＤ１とｌｓｓＤＮＡとの組み合わせとしたときのような顕著なノックイン効率の増強作用は確認されなかった。
　以上説明したように、本発明のニッキングシステムは、第１のＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメインとを含む第１の融合タンパク質、及び第２のＤＮＡ結合ドメインとｄＮＤ１ドメインとを含む第２の融合タンパク質を含むことにより、タンパク質のみで、ニッカーゼ型のＣａｓ９（ｎＣａｓ９）のニッカーゼ活性に代替可能なニッカーゼ活性を奏する部位特異的ニッキングシステムである。そればかりか、かかるニッキングシステムをノックイン技術に用いる際には、ノックインするドナーＤＮＡとして特に一本鎖ＤＮＡを組み合わせることにより、顕著にノックイン効率を向上させることができる。
　このように、本発明によれば、タンパク質のみで、特異的かつ高効率に、標的領域に所望のヌクレオチド配列の挿入（ノックイン）ができる方法、及び標的領域に所望のヌクレオチド配列が挿入された細胞（ノックイン細胞）を製造できる方法、並びに、これらの方法に用いるためのキットを提供することが可能となる。よって本発明は、優れたゲノム編集ツールとして、医療、農業、工業などの幅広い産業分野での活用が期待される。

Claims (5)

  1. 　標的ＤＮＡ上の標的領域にドナー配列を挿入する方法であり、
    　５’側から、５’側ホモロジーアーム配列、ドナー配列、３’側ホモロジーアーム配列の順で配置されたヌクレオチド配列を含む一本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡと、
    　第１のＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメインとを含む第１の融合タンパク質、及び第２のＤＮＡ結合ドメインとｄＮＤ１ドメインとを含む第２の融合タンパク質を含み、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとが２量体を形成して前記標的領域内又は前記標的領域の近傍にニックを導入する部位特異的ニッキングシステムと、
    を前記標的ＤＮＡに接触させる工程を含み、
    　ＮＤ１ドメインが、下記（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第８３番目に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドであり、かつ、
    　ｄＮＤ１ドメインが、下記（ｄａ）～（ｄｃ）：
    （ｄａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｄｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｄｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドである、
    方法。
  2. 　前記ドナーＤＮＡが、５’側ホモロジーアーム配列及び３’側ホモロジーアーム配列の長さがそれぞれ独立に１００塩基以上の長鎖一本鎖ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
  3. 　標的ＤＮＡ上の標的領域にドナー配列が挿入された細胞を製造する方法であり、
    　５’側から、５’側ホモロジーアーム配列、ドナー配列、３’側ホモロジーアーム配列の順で配置されたヌクレオチド配列を含む一本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡと、
    　第１のＤＮＡ結合ドメインとＮＤ１ドメインとを含む第１の融合タンパク質、及び第２のＤＮＡ結合ドメインとｄＮＤ１ドメインとを含む第２の融合タンパク質を含み、ＮＤ１ドメインとｄＮＤ１ドメインとが２量体を形成して前記標的領域内又は前記標的領域の近傍にニックを導入する部位特異的ニッキングシステムと、
    を細胞内に導入又は細胞内で発現させ、前記標的ＤＮＡに接触させる工程を含み、
    　ＮＤ１ドメインが、下記（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第８３番目に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目及び第８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを含むドメインであり、かつ、
    　ｄＮＤ１ドメインが、下記（ｄａ）～（ｄｃ）：
    （ｄａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸が他の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｄｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｄｃ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の第６６番目のアスパラギン酸及び／又は第８３番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸に置換された置換アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドである、
    方法。
  4. 　前記ドナーＤＮＡが、５’側ホモロジーアーム配列及び３’側ホモロジーアーム配列の長さがそれぞれ独立に１００塩基以上の長鎖一本鎖ＤＮＡである、請求項３に記載の方法。
  5. 　請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであり、
    　第１の融合タンパク質、第１の融合タンパク質を発現する第１の融合タンパク質発現ベクター、及び第１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種と、
    　第２の融合タンパク質、第２の融合タンパク質を発現する第２の融合タンパク質発現ベクター、及び第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種と、
    を含み、
    　第１の融合タンパク質発現ベクターが、（ｉ）ＮＤ１ドメイン及び第１のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、（ｉｉ）ＮＤ１ドメインをコードするポリヌクレオチドと、第１のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と、を含むベクターからなる群から選択される少なくとも１種であり、
    　第２の融合タンパク質発現ベクターが、（ｉｉｉ）ｄＮＤ１ドメイン及び第２のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、（ｉｖ）ｄＮＤ１ドメインをコードするポリヌクレオチドと、第２のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と、を含むベクターからなる群から選択される少なくとも１種である、
    キット。
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WO (1) WO2025206046A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018097257A1 (ja) * 2016-11-28 2018-05-31 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集方法
WO2019189147A1 (ja) * 2018-03-26 2019-10-03 国立大学法人神戸大学 細胞の有する二本鎖ｄｎａの標的部位を改変する方法
WO2020045281A1 (ja) * 2018-08-27 2020-03-05 国立大学法人広島大学 新規ヌクレアーゼドメインおよびその利用
WO2020075399A1 (ja) * 2018-10-12 2020-04-16 国立研究開発法人産業技術総合研究所 植物細胞の核内へのタンパク質導入法
JP2023038023A (ja) * 2021-09-06 2023-03-16 国立大学法人広島大学 Ｄｎａを二本鎖切断するヌクレアーゼドメイン
WO2024181446A1 (ja) * 2023-02-28 2024-09-06 住友化学株式会社 ニッキング酵素、ｄｎａ編集システム、標的ｄｎａの編集方法、及び標的ｄｎａが編集された細胞の製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018097257A1 (ja) * 2016-11-28 2018-05-31 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集方法
WO2019189147A1 (ja) * 2018-03-26 2019-10-03 国立大学法人神戸大学 細胞の有する二本鎖ｄｎａの標的部位を改変する方法
WO2020045281A1 (ja) * 2018-08-27 2020-03-05 国立大学法人広島大学 新規ヌクレアーゼドメインおよびその利用
WO2020075399A1 (ja) * 2018-10-12 2020-04-16 国立研究開発法人産業技術総合研究所 植物細胞の核内へのタンパク質導入法
JP2023038023A (ja) * 2021-09-06 2023-03-16 国立大学法人広島大学 Ｄｎａを二本鎖切断するヌクレアーゼドメイン
WO2024181446A1 (ja) * 2023-02-28 2024-09-06 住友化学株式会社 ニッキング酵素、ｄｎａ編集システム、標的ｄｎａの編集方法、及び標的ｄｎａが編集された細胞の製造方法

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