WO2025205122A1 - Method for preparing novel competent cell - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for preparing competent cells using Thermus thermophilus.
- the present invention also relates to a method for amplifying a plasmid using the competent cells.
- Thermus thermophilus a model microorganism for thermophiles, is known for its high ability to take up foreign DNA, and this property has led to the establishment of a genetic manipulation system for it since ancient times.
- a variety of genetic manipulation methods are applicable, such as the development of a shuttle vector for use with E. coli based on the commonly used plasmid pTT8 present in the Thermus thermophilus HB8 strain, and gene insertion and deletion manipulation of chromosomal genes that takes advantage of the high recombination efficiency with homologous sequences.
- Non-Patent Document 1 In the transformation of Thermus thermophilus bacteria in these genetic engineering experiments, experiments have always been conducted by preparing fresh cells (Non-Patent Document 1).
- this type of conventional competent cell technology using Thermus thermophilus requires significantly more time and effort than the frozen competent cell method currently used for E. coli and other bacteria, which allows for long-term storage.
- conventional competent cell technology using Thermus thermophilus requires the preparation of competent cells for each transformation experiment, which not only requires a great deal of effort, but also means that the cells cannot be used immediately when desired, making it extremely inefficient.
- Patent Document 1 discloses a highly active P450scc enzyme protein, and describes Thermus bacteria as an example of a host into which a vector containing DNA encoding the protein can be introduced. However, it does not disclose any specific experimental examples of transformation using Thermus bacteria as competent cells.
- Patent Document 2 discloses a method for causing a thermophilic bacterium with an optimal growth temperature of 50°C or higher to produce an enzyme derived from a psychrophilic bacterium or mesophilic bacterium with an optimal growth temperature of 50°C or lower that is at least 10°C lower than the optimal growth temperature of the thermophilic bacterium.
- the examples in Patent Document 2 describe an example of transformation using a thermophilic bacterium of the genus Geobacillus. However, no examples of transformation using bacteria of the genus Thermus are disclosed.
- the present inventors have made the following discovery for the first time, and have completed the present invention based on this discovery.
- - We succeeded in producing competent cells of Thermus thermophilus HB27 strain that can be stored for a long period of time using simple procedures while maintaining the transformability of the strain.
- - We succeeded in producing competent cells that are stable for storage in a -20°C freezer, without using liquid nitrogen or an ultra-low temperature storage facility at -80°C, which are commonly used to store competent cells.
- conventional competent cells have generally been produced through the steps of pre-culture, main culture, cell collection, resuspension, aliquoting, and cryopreservation, the present invention has succeeded in simplifying the process. Specifically, competent cells were successfully produced by simply cryopreserving Thermus thermophilus after culture. The obtained competent cells had the same transformation efficiency as those prepared just before use and were stable for long-term storage.
- the culture time is not particularly limited as long as it allows the desired amount of Thermus thermophilus to be obtained, but it is, for example, 2 to 8 hours, preferably 3 to 6 hours, and more preferably 4 to 5 hours.
- the container used for culturing is not particularly limited, and any container commonly used in the relevant technical field can be used.
- culturing can be carried out using a flask (e.g., an Erlenmeyer flask), a culture tube, etc.
- the present invention from the standpoint of transformation efficiency, it is preferable to proceed to the next step using a culture medium in which Thermus thermophilus growth is in the logarithmic growth phase to the stationary phase.
- the method for preparing competent cells of the present invention includes a step of cryopreserving Thermus thermophilus after culture. Since cryopreservation at a relatively high temperature is possible in the present invention, no large-scale equipment is required and the thawing time can be significantly reduced when the cells are used. Therefore, transformation can be carried out efficiently according to the present invention.
- the cryopreservation temperature is not particularly limited, as long as it can maintain the frozen state.
- concentration of the cryopreservative e.g., glycerol
- the cryopreservation temperature can be, for example, -20°C.
- the cryopreservation temperature may be higher than the -80°C commonly used in conventional technology. From the perspective of shortening the thawing time and allowing for immediate use, the cryopreservation temperature is, for example, -40 to -20°C, and -30 to -20°C is preferable.
- the freezing method can be natural freezing or flash freezing, but natural freezing is preferred from the perspective of convenience, as it does not require the preparation of liquid nitrogen. Natural freezing is performed, for example, by placing the container containing the culture medium in a storage freezer. Flash freezing is performed, for example, by immersing the container containing the culture medium in liquid nitrogen.
- the method for preparing competent cells preferably further comprises a step of adding a cryopreservation agent before the cryopreservation step, which is used to prevent the stored competent cells from being damaged by freezing at low temperatures or warming to room temperature.
- Cryopreservatives include, but are not limited to, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), polyvinylpyrrolidine, polyethylene glycol, etc. Glycerol is preferably used, as it is the most common and inexpensive.
- the amount (concentration) of cryopreservative to be added is not particularly limited, but for example, the final concentration is 10-20% v/v, preferably 12% v/v-18% v/v.
- the cryopreservation agent may be added at any stage before the cryopreservation step, for example, after the culture step. Furthermore, if a dispensing step, as described below, is performed, the cryopreservation agent may be added before or after the dispensing step. Furthermore, if a resuspension step, as described below, is performed, the cryopreservation agent may be added before or after the resuspension step, or simultaneously with the resuspension step.
- the method for adding the cryopreservative is not particularly limited, as long as it involves mixing the cryopreservative with the culture medium and making the cryopreservative present in the culture medium. It is also possible to add the cryopreservative to the culture medium, or to add the culture medium to a solution containing the cryopreservative or to the cryopreservative alone. From the standpoint of simplicity, it is preferable to add the cryopreservative to the culture medium.
- the method for preparing competent cells preferably includes a dispensing step in which a medium containing Thermus thermophilus grown by culture is dispensed into amounts suitable for storage and use.
- the amount dispensed is not particularly limited, but is, for example, 50 ⁇ L to 500 ⁇ L, preferably 100 ⁇ L to 450 ⁇ L, and more preferably 150 ⁇ L to 400 ⁇ L.
- the container used for dispensing is not particularly limited; for example, a microtube (e.g., 1.5 mL tube) can be used.
- the method for preparing competent cells may further include a pre-culture step prior to the culture (main culture) step, in which Thermus thermophilus is grown to a certain amount in a relatively small amount of medium.
- the pre-culture time is not particularly limited as long as it allows the desired amount of Thermus thermophilus to be obtained, but it is, for example, 6 to 24 hours, preferably 8 to 20 hours, and more preferably 12 to 16 hours.
- the container used for pre-culture is not particularly limited, and any container commonly used in the relevant technical field can be used.
- pre-culture can be carried out using a culture tube, etc.
- the "ingredients of the medium” and “culture temperature” in the pre-culture step are the same as those described in the ⁇ Culturing (main culturing) step>.
- the method may include a step of recovering Thermus thermophilus after the culturing step.
- Thermus thermophilus can be concentrated by the cell collection step, and other components can be removed.
- the method for collecting the bacteria is not particularly limited, but examples include centrifugation and filtration.
- the bacteria are collected by centrifugation.
- the method may include a step of resuspending the Thermus thermophilus collected in the cell collection step, in which the collected Thermus thermophilus is suspended in a fresh medium.
- the dilution ratio when resuspending is not particularly limited, but is, for example, 0.5 to 15 times, preferably 0.7 to 12 times.
- reaction mixture was cooled to room temperature, and 0.5 ⁇ l (equivalent to 10 U) of NEB Dpn I was added, followed by a reaction at 37°C for 2 hours.
- the reagent was prepared with the above composition and incubated at 50°C for 1 hour.
- the vector and Ori fragment were separated and purified by agarose gel electrophoresis, and a portion of the 30 ⁇ l eluted solution was subjected to Gibson Assembly as described above. After incubation at 50°C for 1 hour, a portion of the reaction mixture (0.5 ⁇ l) was added to 100 ⁇ l of JM109 competent cells for transformation. Plasmids were prepared from colonies that appeared on LB/Hg medium, and the sequences were confirmed by the Sanger method.
- CFU/ ⁇ g The transformation efficiency (CFU/ ⁇ g) was calculated by the following method. 1. Add 10 ng of DNA (plasmid) to competent cells and transform them. 2. Count the number of colonies and calculate the number of colonies per ⁇ g of DNA (CFU/ ⁇ g).
- ⁇ Transformation> 1. Remove the competent cells from the freezer. 2. Add the DNA solution to the competent cells. 3. Incubate at 70°C for 2-3 hours.
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Abstract
Description
本発明は、サーマス・サーモフィルスを用いた、コンピテントセルの調製方法に関する。本発明はまた、前記コンピテントセルを用いた、プラスミドの増幅方法に関する。 The present invention relates to a method for preparing competent cells using Thermus thermophilus. The present invention also relates to a method for amplifying a plasmid using the competent cells.
好熱菌のモデル微生物であるサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）は、外来からのDNAの取り込み能が高いことで知られ、この性質から古くから遺伝子操作系が確立されていた。例えば、一般的に用いられてきたサーマス・サーモフィルスHB8株に存在するプラスミドpTT8を基とした大腸菌とのシャトルベクターの開発、また相同配列との高い組み換え効率を利用した染色体の遺伝子挿入・欠失操作など、多様な遺伝子操作方法が適用可能である。 Thermus thermophilus, a model microorganism for thermophiles, is known for its high ability to take up foreign DNA, and this property has led to the establishment of a genetic manipulation system for it since ancient times. For example, a variety of genetic manipulation methods are applicable, such as the development of a shuttle vector for use with E. coli based on the commonly used plasmid pTT8 present in the Thermus thermophilus HB8 strain, and gene insertion and deletion manipulation of chromosomal genes that takes advantage of the high recombination efficiency with homologous sequences.
こうした遺伝子工学実験で行う形質転換において、サーマス・サーモフィルスでは常にフレッシュな菌体を調製して実験が行われてきた（非特許文献１）。しかし、このような従来のサーマス・サーモフィルスを用いたコンピテントセルの技術は、現在大腸菌等で主流の長期保存可能な凍結型コンピテントセル法と比較して、著しく時間と労力を要する。具体的には、従来のサーマス・サーモフィルスを用いたコンピテントセルの技術では、形質転換実験のたびに毎回コンピテントセルを調製する必要があり、調製に多大な労力がかかる上に、使用したいときに即時には使用することができず、極めて非効率であるという問題があった。 In the transformation of Thermus thermophilus bacteria in these genetic engineering experiments, experiments have always been conducted by preparing fresh cells (Non-Patent Document 1). However, this type of conventional competent cell technology using Thermus thermophilus requires significantly more time and effort than the frozen competent cell method currently used for E. coli and other bacteria, which allows for long-term storage. Specifically, conventional competent cell technology using Thermus thermophilus requires the preparation of competent cells for each transformation experiment, which not only requires a great deal of effort, but also means that the cells cannot be used immediately when desired, making it extremely inefficient.
また、特許文献１には、高活性なP450scc酵素蛋白質が開示されており、該蛋白質をコードするDNAを含むベクターを導入する宿主の一例として、サーマス属細菌が記載されている。しかし、サーマス属細菌をコンピテントセルとして用いて形質転換を行った具体的な実験例は、一切開示されていない。 Furthermore, Patent Document 1 discloses a highly active P450scc enzyme protein, and describes Thermus bacteria as an example of a host into which a vector containing DNA encoding the protein can be introduced. However, it does not disclose any specific experimental examples of transformation using Thermus bacteria as competent cells.
さらに、特許文献２には、至適増殖温度が50℃以上の好熱菌に、至適増殖温度が50℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも10℃以上低い温度の低温菌または中温菌由来の酵素を製造させる方法が開示されている。また、特許文献２の実施例では、ゲオバシルス属の好熱菌を用いて形質転換を行った例が記載されている。しかし、サーマス属細菌を用いて形質転換を行った例は一切開示されていない。 Furthermore, Patent Document 2 discloses a method for causing a thermophilic bacterium with an optimal growth temperature of 50°C or higher to produce an enzyme derived from a psychrophilic bacterium or mesophilic bacterium with an optimal growth temperature of 50°C or lower that is at least 10°C lower than the optimal growth temperature of the thermophilic bacterium. Furthermore, the examples in Patent Document 2 describe an example of transformation using a thermophilic bacterium of the genus Geobacillus. However, no examples of transformation using bacteria of the genus Thermus are disclosed.
上記に鑑み、本発明の目的は、長期保存が可能なサーマス・サーモフィルス由来のコンピテントセルの調製方法を提供することである。 In light of the above, an object of the present invention is to provide a method for preparing competent cells derived from Thermus thermophilus that can be stored for a long period of time.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、以下の知見を初めて見出し、当該知見に基づき、本発明を完成させた。
・サーマス・サーモフィルスのHB27株の形質転換能を維持したまま、簡便な操作で長期保存可能なコンピテントセルの作製に成功した。
・一般にコンピテントセルの保存に用いられる液体窒素や-80℃の超低温保存庫を使用することなく、-20℃の冷凍庫（フリーザー）で保存安定性を有するコンピテントセルの作製に成功した。
・従来、コンピテントセルの作製は、一般に、前培養、本培養、集菌、再懸濁、分注、および凍結保存の工程を経て作製されていたところ、本発明では、工程を簡素化することに成功した。具体的には、培養後のサーマス・サーモフィルスを凍結保存するのみで、コンピテントセルの作製に成功した。
・得られたコンピテントセルは、従来の用時調整の方法と同等の形質転換効率を有し、長期保存安定であった。
As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventors have made the following discovery for the first time, and have completed the present invention based on this discovery.
- We succeeded in producing competent cells of Thermus thermophilus HB27 strain that can be stored for a long period of time using simple procedures while maintaining the transformability of the strain.
- We succeeded in producing competent cells that are stable for storage in a -20°C freezer, without using liquid nitrogen or an ultra-low temperature storage facility at -80°C, which are commonly used to store competent cells.
While conventional competent cells have generally been produced through the steps of pre-culture, main culture, cell collection, resuspension, aliquoting, and cryopreservation, the present invention has succeeded in simplifying the process. Specifically, competent cells were successfully produced by simply cryopreserving Thermus thermophilus after culture.
The obtained competent cells had the same transformation efficiency as those prepared just before use and were stable for long-term storage.
すなわち、本発明の一態様は、以下に関する。
〔１〕培養後のサーマス・サーモフィルスを凍結保存する工程を含む、コンピテントセルの調製方法。
〔２〕サーマス・サーモフィルスを培養する工程、および
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
を含む、コンピテントセルの調製方法。
〔３〕サーマス・サーモフィルスを培養する工程、
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を分注する工程、および
前記工程で分注されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
を含む、コンピテントセルの調製方法。
〔４〕さらに、前記凍結保存工程の前に、凍結保存剤を添加する工程を含む、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記凍結保存が-80℃より高い温度で行われる、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記サーマス・サーモフィルスが、HB27株またはHB8株である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記凍結保存剤が、グリセロール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリビニルピロリジン、およびポリエチレングリコールからなる群より少なくとも一つである、〔４〕に記載の方法。
〔８〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法で調製したコンピテントセルを用いる、プラスミドの増幅方法。
〔９〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法で調製したコンピテントセルを解凍し、解凍後のコンピテントセルを形質転換する工程を含む、〔８〕に記載の方法。
That is, one aspect of the present invention relates to the following.
[1] A method for preparing competent cells, comprising a step of cryopreserving Thermus thermophilus after culture.
[2] A method for preparing competent cells, comprising the steps of culturing Thermus thermophilus, and freezing and storing the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the step.
[3] a step of culturing Thermus thermophilus;
A method for preparing competent cells, comprising the steps of: dispensing the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the step; and freezing and storing the culture solution containing Thermus thermophilus dispensed in the step.
[4] The method according to any one of [1] to [3], further comprising the step of adding a cryopreservation agent before the cryopreservation step.
[5] The method according to any one of [1] to [3], wherein the cryopreservation is carried out at a temperature higher than -80°C.
[6] The method according to any one of [1] to [3], wherein the Thermus thermophilus is the HB27 strain or the HB8 strain.
[7] The method according to [4], wherein the cryopreservation agent is at least one selected from the group consisting of glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), polyvinylpyrrolidine, and polyethylene glycol.
[8] A method for amplifying a plasmid, using competent cells prepared by the method according to any one of [1] to [3].
[9] The method according to [8], comprising the steps of thawing competent cells prepared by the method according to any one of [1] to [3], and transforming the thawed competent cells.
本発明によれば、サーマス・サーモフィルス由来のコンピテントセルを長期保存できる。それ故、形質転換実験のたびに毎回調製する必要はなく、労力を省くことができ、効率的に実験が行える。また、本発明のコンピテントセルは、比較的高い温度での保存が可能であり、使用したいときに即時に使用できるという利点を有する。 According to the present invention, competent cells derived from Thermus thermophilus can be stored for long periods of time. This eliminates the need to prepare them every time a transformation experiment is performed, saving labor and allowing experiments to be performed efficiently. Furthermore, the competent cells of the present invention have the advantage that they can be stored at relatively high temperatures and can be used immediately when desired.
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。 The following describes in detail an example of an embodiment of the present invention, but the present invention is not limited to this.
（１．定義） 本明細書において、「サーマス・サーモフィルス」とは、サーマス属に分類される、グラム陰性の好気性細菌の一種である。至適増殖温度が75℃であり、好熱菌に分類される。また、本明細書において、「好熱菌」とは、至適増殖温度が50℃以上である微生物である。 (1. Definition) As used herein, "Thermus thermophilus" refers to a type of Gram-negative aerobic bacterium classified in the genus Thermus. Its optimum growth temperature is 75°C, and it is classified as a thermophile. Furthermore, as used herein, "thermophiles" refer to microorganisms whose optimum growth temperature is 50°C or higher.
本明細書において、「コンピテントセル」とは、形質転換用の細胞、微生物を意味する。コンピテントセルは、膜の透過性が増大しており、外来DNA等をその内部に取り込むことができる。 In this specification, the term "competent cells" refers to cells or microorganisms for transformation. Competent cells have increased membrane permeability and are able to incorporate foreign DNA, etc.
本明細書において、「凍結保存」とは、培養液を凍結させて、低温で保存することを意味する。とりわけ、凍結保存は、特定の微生物（例えば、サーマス・サーモフィルス）を含む培養液を凍結させて、低温（例えば、-20℃）で保存することを意図する。 As used herein, "cryopreservation" refers to freezing a culture medium and storing it at a low temperature. In particular, cryopreservation refers to freezing a culture medium containing a specific microorganism (e.g., Thermus thermophilus) and storing it at a low temperature (e.g., -20°C).
本明細書において、「形質転換」とは、外来DNA等を細胞等の内部に導入し、その遺伝的性質を変えることを意味する。 As used herein, "transformation" means introducing foreign DNA or other substances into cells or other organisms to change their genetic properties.
（２．コンピテントセルの調製方法）
本発明の一実施形態において、培養後のサーマス・サーモフィルスを凍結保存する工程を含む、コンピテントセルの調製方法を提供する。
(2. Method for preparing competent cells)
In one embodiment of the present invention, there is provided a method for preparing competent cells, which comprises a step of cryopreserving Thermus thermophilus after culturing.
また、本発明の一実施形態において、サーマス・サーモフィルスを培養する工程、および前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程を含む、コンピテントセルの調製方法を提供する。 In one embodiment of the present invention, a method for preparing competent cells is provided, which includes the steps of culturing Thermus thermophilus and cryopreserving the culture medium containing Thermus thermophilus obtained in the above step.
さらに、本発明の一実施形態において、サーマス・サーモフィルスを培養する工程、前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を分注する工程、および前記工程で分注されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程を含む、コンピテントセルの調製方法を提供する。 Furthermore, in one embodiment of the present invention, there is provided a method for preparing competent cells, comprising the steps of culturing Thermus thermophilus, dispensing the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the above step, and freezing and storing the culture solution containing Thermus thermophilus dispensed in the above step.
本発明者らは、サーマス・サーモフィルスを用いた遺伝子工学実験を飛躍的に効率化することを目的として、コンピテントセル法に着目し、検討を行った。具体的には、一般的に用いられるサーマス・サーモフィルスのHB27株の形質転換能を維持したまま、簡便な操作で長期保存可能なコンピテントセルの作製を試みた。また、保存に関して、一般にコンピテントセルの保存に用いられる液体窒素や-80℃の超低温保存庫を使用することなく、より一般的な-20℃の冷凍庫で保存安定性を有するコンピテントセルの作製が可能であるか、検討した。このような着想に基づき作製したコンピテントセルを使用し、別途開発した種々のベクターを用いて形質転換能の確認と保存安定性について検討したところ、少なくとも3ヶ月間、顕著な形質転換効率を低下することなく使用可能なコンピテントセルの開発に成功した。また、形質転換効率についても、従来の用時調整の方法と同等であることが判明した。このような高機能なコンピテントセルを簡便な方法で得られたことは驚くべきことである。 The inventors focused on the competent cell method and conducted research with the aim of dramatically improving the efficiency of genetic engineering experiments using Thermus thermophilus. Specifically, they attempted to produce competent cells that could be stored for long periods of time using simple procedures while maintaining the transformability of the commonly used Thermus thermophilus strain HB27. Furthermore, regarding storage, they investigated whether it was possible to produce competent cells that would be stable in the more common -20°C freezer, rather than using liquid nitrogen or an ultra-low temperature storage cabinet at -80°C, which are commonly used for storing competent cells. Using competent cells produced based on this concept, they confirmed their transformation ability and storage stability using various separately developed vectors. They successfully developed competent cells that could be used for at least three months without a significant decrease in transformation efficiency. Furthermore, they found that the transformation efficiency was equivalent to that of conventional methods that require preparation just before use. It is surprising that such highly functional competent cells could be obtained using such a simple method.
本発明により、サーマス・サーモフィルスを用いた遺伝子組み換え実験操作が大幅に効率化されるため、サーマス・サーモフィルスを用いる研究分野において、極めて有用である。 The present invention significantly improves the efficiency of genetic recombination experiments using Thermus thermophilus, making it extremely useful in research fields that use Thermus thermophilus.
＜培養（本培養）工程＞
本発明の一実施形態において、コンピテントセルの調製方法は、サーマス・サーモフィルスの培養工程を含むことが好ましい。培養工程では、サーマス・サーモフィルスを培養することにより、サーマス・サーモフィルスを大量に増やす。
<Culture (main culture) process>
In one embodiment of the present invention, the method for preparing competent cells preferably includes a culturing step of Thermus thermophilus. In the culturing step, Thermus thermophilus is cultured to increase the number of Thermus thermophilus.
培養されるサーマス・サーモフィルスは、特に限定されないが、汎用的に使用される観点から、HB27株またはHB8株が好ましい。 Thermus thermophilus to be cultured is not particularly limited, but from the perspective of general use, HB27 or HB8 strains are preferred.
培養で使用される培地は、微生物の培養に通常使用されるものであれば特に限定されない。そのような培地としては、例えば、LB培地（例えば、Lennox（ナカライ製））、M9培地、TB培地、SOB培地、SOC培地、2X YT培地、NZCYM液体培地等が挙げられる。 The medium used for cultivation is not particularly limited, as long as it is one that is commonly used for culturing microorganisms. Examples of such media include LB medium (e.g., Lennox (manufactured by Nakarai)), M9 medium, TB medium, SOB medium, SOC medium, 2X YT medium, and NZCYM liquid medium.
本発明の一実施形態において、前記培地は、MgSO4、CaCl2等の成分を含んでいることが好ましい。これらの成分を含むことにより、本発明のコンピテントセルの形質転換能が上昇する。 In one embodiment of the present invention, the medium preferably contains components such as MgSO 4 and CaCl 2. By including these components, the transformability of the competent cells of the present invention is increased.
培養の温度は、サーマス・サーモフィラスが増殖できる温度であれば特に限定されないが、例えば、50～90℃であり、60～85℃であることが好ましく、65～80℃であることがより好ましく、70～75℃であることがさらに好ましい。サーマス・サーモフィラスの至適増殖温度は75℃であるため、この近辺の温度であれば、培養温度としてより適している。 The culture temperature is not particularly limited as long as it allows Thermus thermophilus to grow, but is, for example, 50-90°C, preferably 60-85°C, more preferably 65-80°C, and even more preferably 70-75°C. The optimal growth temperature for Thermus thermophilus is 75°C, so temperatures around this range are more suitable as culture temperatures.
培養時間は、サーマス・サーモフィラスが所望量得られる時間であれば特に限定されないが、例えば、2～8時間であり、3～6時間であることが好ましく、4～5時間であることがより好ましい。 The culture time is not particularly limited as long as it allows the desired amount of Thermus thermophilus to be obtained, but it is, for example, 2 to 8 hours, preferably 3 to 6 hours, and more preferably 4 to 5 hours.
培養に使用される容器は、特に限定されることなく、当該技術分野で通常使用される任意の容器が使用され得る。例えば、フラスコ（例えば、三角フラスコ）、培養用チューブ等を用いて培養が行われる。 The container used for culturing is not particularly limited, and any container commonly used in the relevant technical field can be used. For example, culturing can be carried out using a flask (e.g., an Erlenmeyer flask), a culture tube, etc.
本発明の一実施形態において、形質転換効率の観点からは、サーマス・サーモフィラスの増殖段階が対数増殖期から定常期にある培養液を用いて、次工程へ移ることが好ましい。 In one embodiment of the present invention, from the standpoint of transformation efficiency, it is preferable to proceed to the next step using a culture medium in which Thermus thermophilus growth is in the logarithmic growth phase to the stationary phase.
＜凍結保存工程＞
本発明のコンピテントセルの調製方法は、培養後のサーマス・サーモフィルスを凍結保存する工程を含む。本発明では、比較的高い温度で凍結保存が可能であるため、大掛かりな設備を必要とすることなく、また、使用の際に解凍時間を大幅に短縮することができる。よって、本発明によれば、効率的に形質転換を行うことができる。
<Freezing preservation process>
The method for preparing competent cells of the present invention includes a step of cryopreserving Thermus thermophilus after culture. Since cryopreservation at a relatively high temperature is possible in the present invention, no large-scale equipment is required and the thawing time can be significantly reduced when the cells are used. Therefore, transformation can be carried out efficiently according to the present invention.
凍結保存の温度は、凍結状態が維持できる温度であればよく、特に限定されない。凍結保存剤（例えば、グリセロール）の濃度が一般に使用される濃度である場合、凍結保存の温度は、例えば、-20℃であり得る。凍結保存の温度は、従来技術で一般に使用される-80℃よりも高い温度であってもよい。解凍時間を短くし、即時の使用に供する観点からは、例えば、-40～-20℃であり、-30～-20℃であることが好ましい。 The cryopreservation temperature is not particularly limited, as long as it can maintain the frozen state. When the concentration of the cryopreservative (e.g., glycerol) is a commonly used concentration, the cryopreservation temperature can be, for example, -20°C. The cryopreservation temperature may be higher than the -80°C commonly used in conventional technology. From the perspective of shortening the thawing time and allowing for immediate use, the cryopreservation temperature is, for example, -40 to -20°C, and -30 to -20°C is preferable.
凍結方法としては、自然凍結であっても、瞬間凍結であってもよいが、液体窒素の準備がなくてもよいとの利便性の観点からは、好ましくは、自然凍結である。自然凍結は、例えば、培養液の入った容器を、保存する冷凍庫に入れることにより行われる。また、瞬間凍結は、例えば、培養液の入った容器を、液体窒素に浸すことにより行われる。 The freezing method can be natural freezing or flash freezing, but natural freezing is preferred from the perspective of convenience, as it does not require the preparation of liquid nitrogen. Natural freezing is performed, for example, by placing the container containing the culture medium in a storage freezer. Flash freezing is performed, for example, by immersing the container containing the culture medium in liquid nitrogen.
＜凍結保存剤の添加工程＞
本発明の一実施形態において、コンピテントセルの調製方法は、さらに、前記凍結保存工程の前に、凍結保存剤を添加する工程を含むことが好ましい。凍結保存剤は、保存されるコンピテントセルが低温での凍結または室温への加温により損傷するのを阻止するために使用される。
<Step of adding cryopreservative>
In one embodiment of the present invention, the method for preparing competent cells preferably further comprises a step of adding a cryopreservation agent before the cryopreservation step, which is used to prevent the stored competent cells from being damaged by freezing at low temperatures or warming to room temperature.
凍結保存剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリビニルピロリジン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。最も一般的であり、かつ安価であるとの観点からは、好ましくは、グリセロールが使用される。 Cryopreservatives include, but are not limited to, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), polyvinylpyrrolidine, polyethylene glycol, etc. Glycerol is preferably used, as it is the most common and inexpensive.
凍結保存剤の添加量（濃度）は、特に限定されないが、例えば、終濃度が10～20% v/vであり、好ましくは、12% v/v～18% v/vである。 The amount (concentration) of cryopreservative to be added is not particularly limited, but for example, the final concentration is 10-20% v/v, preferably 12% v/v-18% v/v.
凍結保存剤の添加は、前記凍結保存工程の前のいずれかの段階で行われればよく、例えば、前記培養工程の後に行われ得る。また、後述する分注工程を行う場合は、分注工程の前もしくは後に行われ得る。さらに、後述する再懸濁工程を行う場合は、再懸濁工程の前もしくは後、または再懸濁と同時に行ってもよい。 The cryopreservation agent may be added at any stage before the cryopreservation step, for example, after the culture step. Furthermore, if a dispensing step, as described below, is performed, the cryopreservation agent may be added before or after the dispensing step. Furthermore, if a resuspension step, as described below, is performed, the cryopreservation agent may be added before or after the resuspension step, or simultaneously with the resuspension step.
凍結保存剤の添加は、凍結保存剤と培養液とが混合され、培養液中に凍結保存剤が存在するようにする方法であれば特に限定されず、培養液に凍結保存剤を添加する態様のみならず、凍結保存剤を含む溶液または凍結保存剤単体に前記培養液を投入してもよい。簡便さの観点から、凍結保存剤の添加は、培養液に凍結保存剤を添加する方法で行われることが好ましい。 The method for adding the cryopreservative is not particularly limited, as long as it involves mixing the cryopreservative with the culture medium and making the cryopreservative present in the culture medium. It is also possible to add the cryopreservative to the culture medium, or to add the culture medium to a solution containing the cryopreservative or to the cryopreservative alone. From the standpoint of simplicity, it is preferable to add the cryopreservative to the culture medium.
＜分注工程＞
本発明の一実施形態において、コンピテントセルの調製方法は、分注工程を含むことが好ましい。分注工程では、培養で増やしたサーマス・サーモフィルスを含む培地を、保管および使用に適した量に分注する。
<Dispensing process>
In one embodiment of the present invention, the method for preparing competent cells preferably includes a dispensing step in which a medium containing Thermus thermophilus grown by culture is dispensed into amounts suitable for storage and use.
分注の量は、特に限定されないが、例えば、50 μL～500 μLであり、好ましくは、100 μL～450 μLであり、より好ましくは、150 μL～400 μLである。 The amount dispensed is not particularly limited, but is, for example, 50 μL to 500 μL, preferably 100 μL to 450 μL, and more preferably 150 μL to 400 μL.
分注する容器も特に限定されず、例えば、マイクロチューブ（例えば、1.5 mLチューブ）が使用される。 The container used for dispensing is not particularly limited; for example, a microtube (e.g., 1.5 mL tube) can be used.
＜前培養工程＞
本発明の一実施形態において、コンピテントセルの調製方法は、培養（本培養）工程の前に、さらに、前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程では、比較的少量の培地で、サーマス・サーモフィルスを一定量まで増やす。
<Pre-culture step>
In one embodiment of the present invention, the method for preparing competent cells may further include a pre-culture step prior to the culture (main culture) step, in which Thermus thermophilus is grown to a certain amount in a relatively small amount of medium.
前培養の時間は、サーマス・サーモフィラスが所望量得られる時間であれば特に限定されないが、例えば、6～24時間であり、8～20時間であることが好ましく、12～16時間であることがより好ましい。 The pre-culture time is not particularly limited as long as it allows the desired amount of Thermus thermophilus to be obtained, but it is, for example, 6 to 24 hours, preferably 8 to 20 hours, and more preferably 12 to 16 hours.
前培養に使用される容器は、特に限定されることなく、当該技術分野で通常使用される任意の容器が使用され得る。例えば、培養用チューブ等を用いて前培養が行われる。 The container used for pre-culture is not particularly limited, and any container commonly used in the relevant technical field can be used. For example, pre-culture can be carried out using a culture tube, etc.
前培養工程における、「培地の成分」、「培養の温度」は、＜培養（本培養）工程＞の記載が援用される。 The "ingredients of the medium" and "culture temperature" in the pre-culture step are the same as those described in the <Culturing (main culturing) step>.
＜集菌工程＞
本発明の一実施形態において、培養工程後に、サーマス・サーモフィルスを回収する工程を含んでいてもよい。集菌工程により、サーマス・サーモフィルスを濃縮し、それ以外の成分を除去することができる。
<Bacteria collection process>
In one embodiment of the present invention, the method may include a step of recovering Thermus thermophilus after the culturing step. Thermus thermophilus can be concentrated by the cell collection step, and other components can be removed.
集菌の方法は、特に限定されないが、遠心分離、ろ過等が挙げられる。好ましくは、遠心分離により集菌される。 The method for collecting the bacteria is not particularly limited, but examples include centrifugation and filtration. Preferably, the bacteria are collected by centrifugation.
＜再懸濁工程＞
本発明の一実施形態において、前記集菌工程で回収されたサーマス・サーモフィルスを再懸濁する工程を含んでいてもよい。再懸濁工程では、集菌したサーマス・サーモフィルスを新鮮な培地に懸濁する。
<Resuspension process>
In one embodiment of the present invention, the method may include a step of resuspending the Thermus thermophilus collected in the cell collection step, in which the collected Thermus thermophilus is suspended in a fresh medium.
再懸濁時の希釈倍率は、特に限定されないが、例えば、0.5～15倍であり、0.7～12倍であることが好ましい。 The dilution ratio when resuspending is not particularly limited, but is, for example, 0.5 to 15 times, preferably 0.7 to 12 times.
再懸濁の方法は、特に限定されることなく、例えば、＜培養（本培養）工程＞の項に記載の培地を添加し、ピペッティング、タッピング等で混合することにより行われる。 The resuspension method is not particularly limited, and can be carried out, for example, by adding the medium described in the section <Culturing (Main Culture) Step> and mixing by pipetting, tapping, etc.
本発明のコンピテントセルの調製方法では、前記培養工程の後に、集菌工程、再懸濁工程を含まなくても、コンピテントセルが調製できる。しかし、本発明の一実施形態では、前記培養工程の後に、集菌工程、再懸濁工程を含んでもよい。 In the competent cell preparation method of the present invention, competent cells can be prepared without including a bacterial collection step and a resuspension step after the culturing step. However, in one embodiment of the present invention, a bacterial collection step and a resuspension step may be included after the culturing step.
（３．プラスミドの増幅方法）
本発明の一実施形態において、前記で調製したコンピテントセルを用いる、プラスミドの増幅方法を提供する。前述の通り、本発明のコンピテントセルは、長期保存が可能であるため、コンピテントセルの調製に時間を要さず、効率的にプラスミドの増幅を行うことができる。
(3. Plasmid Amplification Method)
In one embodiment of the present invention, a method for amplifying a plasmid is provided, which uses the competent cells prepared as described above. As described above, the competent cells of the present invention can be stored for a long period of time, so that preparation of the competent cells does not require much time and the plasmid can be efficiently amplified.
また、本発明の一実施形態において、前記で調製したコンピテントセルを解凍し、解凍後のコンピテントセルを形質転換する工程を含む、プラスミドの増幅方法を提供する。 In one embodiment of the present invention, a method for amplifying a plasmid is provided, which includes the steps of thawing the competent cells prepared as described above and transforming the thawed competent cells.
増幅させるプラスミドは、本発明のサーマス・サーモフィルス由来コンピテントセルに導入され、その中で増幅可能なものであれば、特に限定されない。そのようなプラスミドは、従来知られているものの他に、今後新たに発見されるプラスミドも含まれ得る。従来知られたプラスミドとしては、例えば、pTT8型のプラスミド、pTMY型のプラスミド等が挙げられる。pTT8型のプラスミドとしては、例えば、pTT8、pHB5002d、pHB5008c、pHB5018e、pAA2-2d等が挙げられる。pTMY型のプラスミドとしては、例えば、pTMY、pTthSNM1-1c、pTthSNM1-7d、pTthSNM4-1c、pTthSNM6-6d、pTthSNM7-6d、pAA1-1c、pAA3-7d等が挙げられる。 The plasmid to be amplified is not particularly limited, as long as it can be introduced into the Thermus thermophilus-derived competent cells of the present invention and can be amplified therein. Such plasmids may include previously known plasmids as well as newly discovered plasmids. Previously known plasmids include, for example, pTT8-type plasmids and pTMY-type plasmids. Examples of pTT8-type plasmids include pTT8, pHB5002d, pHB5008c, pHB5018e, and pAA2-2d. Examples of pTMY-type plasmids include pTMY, pTthSNM1-1c, pTthSNM1-7d, pTthSNM4-1c, pTthSNM6-6d, pTthSNM7-6d, pAA1-1c, and pAA3-7d.
コンピテントセルの解凍方法は、コンピテントセルの機能を減弱もしくは喪失させない方法であれば特に限定されない。コンピテントセルの解凍は、例えば、保存されている冷凍庫から取り出して、室温で融解したり、あるいは、氷上で一定時間静置することにより行われる。 The method for thawing competent cells is not particularly limited, as long as it does not weaken or destroy the function of the competent cells. Competent cells can be thawed, for example, by removing them from the freezer in which they are stored and thawing them at room temperature, or by leaving them to stand on ice for a certain period of time.
形質転換の方法は、当該技術分野において通常使用される方法であれば、特に限定されない。形質転換の方法としては、例えば、上述の非特許文献１等が挙げられる。また、本発明の一実施形態において、形質転換は、実施例に記載された方法で行われる。 The transformation method is not particularly limited, as long as it is a method commonly used in the relevant technical field. Examples of transformation methods include those described in Non-Patent Document 1 above. In one embodiment of the present invention, transformation is performed using the method described in the Examples.
形質転換の温度は、特に限定されないが、例えば、50～90℃であり、好ましくは、60～80℃である。 The transformation temperature is not particularly limited, but is, for example, 50 to 90°C, preferably 60 to 80°C.
形質転換の時間は、特に限定されないが、例えば、1～4時間であり、好ましくは、1.5～3.5時間である。 The transformation time is not particularly limited, but is, for example, 1 to 4 hours, preferably 1.5 to 3.5 hours.
前記解凍から形質転換の完了までの時間は、例えば、10時間以内であり、8時間以内であることが好ましく、6時間以内であることがより好ましく、4時間以内であることがさらに好ましく、3時間以内であることが特に好ましい。前述の通り、従来の方法では、形質転換実験を行うことを意図したときから形質転換が完了するまでに多大な時間がかかっていたところ（例えば、前培養12～16時間、本培養4時間、および形質転換2時間の合計18～22時間）、本発明では、形質転換実験を行うことを意図したとき（本発明の解凍開始時に相当）から形質転換が完了するまでの時間を大幅に短縮することができる。 The time from thawing to completion of transformation is, for example, within 10 hours, preferably within 8 hours, more preferably within 6 hours, even more preferably within 4 hours, and particularly preferably within 3 hours. As mentioned above, with conventional methods, it took a significant amount of time from the time it was intended to perform a transformation experiment to the completion of transformation (for example, a total of 18 to 22 hours, consisting of 12 to 16 hours of pre-culture, 4 hours of main culture, and 2 hours of transformation). However, with the present invention, the time from the time it was intended to perform a transformation experiment (corresponding to the start of thawing in the present invention) to the completion of transformation can be significantly reduced.
（４．その他）
また、本発明の一実施形態において、以下を提供する。
〔１－１〕培養後のサーマス・サーモフィルスを凍結保存する工程からなる、コンピテントセルの調製方法。
〔１－２〕サーマス・サーモフィルスを培養する工程、および
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
からなる、コンピテントセルの調製方法。
〔１－３〕サーマス・サーモフィルスを培養する工程、
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を分注する工程、および
前記工程で分注されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
からなる、コンピテントセルの調製方法。
〔１－２’〕サーマス・サーモフィルスを培養する工程、
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液に凍結保存剤を添加する工程、および
前記工程で凍結保存剤を添加されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
からなる、コンピテントセルの調製方法。
〔１－３’〕サーマス・サーモフィルスを培養する工程、
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液に凍結保存剤を添加する工程、
前記工程で凍結保存剤を添加されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を分注する工程、および
前記工程で分注されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
からなる、コンピテントセルの調製方法。
〔１－３’’〕サーマス・サーモフィルスを培養する工程、
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を分注する工程、
前記工程で分注されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液に凍結保存剤を添加する工程、および
前記工程で凍結保存剤を添加されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
からなる、コンピテントセルの調製方法。
〔１－４〕前記凍結保存が-80℃より高い温度で行われる、〔１－１〕～〔１－３〕、〔１－２’〕、〔１－３’〕および〔１－３’’〕のいずれかに記載の方法。
〔１－５〕前記サーマス・サーモフィルスが、HB27株またはHB8株である、〔１－１〕～〔１－３〕、〔１－２’〕、〔１－３’〕および〔１－３’’〕のいずれかに記載の方法。
〔１－６〕前記凍結保存剤が、グリセロール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリビニルピロリジン、およびポリエチレングリコールからなる群より少なくとも一つである、〔１－４〕に記載の方法。
〔１－７〕〔１－１〕～〔１－３〕、〔１－２’〕、〔１－３’〕および〔１－３’’〕のいずれかに記載の方法で調製したコンピテントセルを用いる、プラスミドの増幅方法。
〔１－８〕〔１－１〕～〔１－３〕、〔１－２’〕、〔１－３’〕および〔１－３’’〕のいずれかに記載の方法で調製したコンピテントセルを解凍し、解凍後のコンピテントセルを形質転換する工程を含む、〔１－７〕に記載の方法。
(4. Other)
In one embodiment of the present invention, the following is provided:
[1-1] A method for preparing competent cells, comprising a step of freezing and storing Thermus thermophilus after culture.
[1-2] A method for preparing competent cells, comprising the steps of: culturing Thermus thermophilus; and freezing and storing the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the above step.
[1-3] culturing Thermus thermophilus;
A method for preparing competent cells, comprising the steps of: dispensing the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the above step; and freezing and storing the culture solution containing Thermus thermophilus dispensed in the above step.
[1-2'] culturing Thermus thermophilus;
A method for preparing competent cells, comprising the steps of: adding a cryopreservation agent to the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the above step; and freezing and preserving the culture solution containing Thermus thermophilus to which the cryopreservation agent has been added in the above step.
[1-3'] culturing Thermus thermophilus;
adding a cryopreservative to the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the above step;
a step of dispensing the culture solution containing Thermus thermophilus to which a cryopreservative has been added in the step above; and a step of freezing and preserving the culture solution containing Thermus thermophilus dispensed in the step above.
[1-3″] Culturing Thermus thermophilus;
Dispensing the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the above step;
a step of adding a cryopreservation agent to the culture solution containing Thermus thermophilus dispensed in the step above; and a step of freezing and preserving the culture solution containing Thermus thermophilus to which the cryopreservation agent has been added in the step above.
[1-4] The method according to any one of [1-1] to [1-3], [1-2'], [1-3'] and [1-3''], wherein the cryopreservation is carried out at a temperature higher than -80°C.
[1-5] The method according to any one of [1-1] to [1-3], [1-2'], [1-3'] and [1-3''], wherein the Thermus thermophilus is the HB27 strain or the HB8 strain.
[1-6] The method according to [1-4], wherein the cryopreservation agent is at least one selected from the group consisting of glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), polyvinylpyrrolidine, and polyethylene glycol.
[1-7] A method for amplifying a plasmid using competent cells prepared by the method described in any one of [1-1] to [1-3], [1-2'], [1-3'] and [1-3''].
[1-8] The method according to [1-7], which comprises the steps of thawing competent cells prepared by the method according to any one of [1-1] to [1-3], [1-2'], [1-3'] and [1-3''], and transforming the thawed competent cells.
以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本願明細書全体を通じて引用する文献は、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。 The present invention will be described in more detail below using examples, but these are not intended to limit the scope of the present invention. All references cited throughout this specification are hereby incorporated by reference in their entirety.
（１．コンピテントセルの作製）
以下の菌株、培地、および方法により、コンピテントセルの作製を行った。
(1. Preparation of competent cells)
Competent cells were prepared using the following strains, media, and methods.
＜菌株＞
Thermus thermophilus HB27株（ATCC BAA-163）
<Strain>
Thermus thermophilus HB27 strain (ATCC BAA-163)
＜培地＞ <Culture medium>
＜添加剤＞
MgSO4（和光純薬製）
CaCl2（和光純薬製）
グリセロール（和光純薬製）
<Additives>
MgSO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
CaCl 2 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Glycerol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
＜方法＞
コンピテントセルは、以下の手順により作製した。
１．Thermus thermophilus HB27株を70℃にて16時間前培養する。
２．前培養後のThermus thermophilus HB27株を70℃にて8時間本培養する。
３．Thermus thermophilus HB27株を遠心分離により集菌する。
４．集菌したThermus thermophilus HB27株を、グリセロールを含む培地（終濃度16% v/v）に再懸濁する。
５．再懸濁液を、1.5 mLチューブに200 μLずつ分注する。
６．冷凍庫（-20℃）で保存する。
<Method>
Competent cells were prepared by the following procedure.
1. Pre-culture Thermus thermophilus HB27 strain at 70°C for 16 hours.
2. After pre-cultivation, the Thermus thermophilus HB27 strain is cultured at 70°C for 8 hours.
3. Thermus thermophilus strain HB27 is collected by centrifugation.
4. The collected Thermus thermophilus strain HB27 is resuspended in a medium containing glycerol (final concentration 16% v/v).
5. Dispense 200 μL of the resuspended solution into 1.5 mL tubes.
6. Store in the freezer (-20°C).
（２．形質転換）
上記で作製したコンピテントセルを冷凍庫から取り出し、プラスミドを含むDNA溶液を添加した。次いで、70℃で2～3時間、インキュベートした。なお、プラスミドとしては、以下の方法で作製したpIOK9Hgを使用した。
2. Transformation
The competent cells prepared above were removed from the freezer, and a DNA solution containing the plasmid was added. The cells were then incubated at 70°C for 2-3 hours. The plasmid used was pIOK9Hg, prepared as follows:
（pIOK9Hgの構築）
まず、各T. thermophilusプラスミドであるpTthSNM3-3d（GenBank ID: AP025612）の推定複製遺伝子とその前後ORF間の配列、ならびに下流の2つの機能未知タンパク質遺伝子をPCRで増幅した。次に、PCRにより増幅したDNA断片を、大腸菌ベクターであるpHSG298Hg（配列番号1）に、Gibson Assemblyにて、＋の向きで挿入し、pIOK9Hgを構築した。なお、pHSG298Hgは、pUC型のプラスミドであり、ColE1型の複製機構をとり、選択マーカーとして耐熱性ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。
(Construction of pIOK9Hg)
First, the putative replication gene and the sequence between the preceding and following ORFs of each T. thermophilus plasmid, pTthSNM3-3d (GenBank ID: AP025612), as well as two downstream protein genes of unknown function, were amplified by PCR. The PCR-amplified DNA fragments were then inserted into the E. coli vector pHSG298Hg (SEQ ID NO: 1) in the + orientation using Gibson Assembly to construct pIOK9Hg. pHSG298Hg is a pUC-type plasmid with a ColE1-type replication mechanism and a thermostable hygromycin resistance gene as a selectable marker.
pHSG298Hgの塩基配列（配列番号１）を以下に示す。 The base sequence of pHSG298Hg (SEQ ID NO: 1) is shown below.
＜ベクターの調製＞
市販（タカラバイオ製）のベクターpHSG298のカナマイシン耐性遺伝子を耐熱性ハイグロマイシン耐性遺伝子に置換したベクターpHSG298Hgを用い、Hg耐性遺伝子の下流にoriを挿入した。pHSG298Hgは配列番号2および3のプライマーを用いてインバースPCRにより直鎖状の全長プラスミドを調製した。ベクターのPCRにはKOD one（タカラバイオ製）を使用した。
<Vector preparation>
The kanamycin resistance gene of the commercially available (Takara Bio) vector pHSG298 was replaced with a heat-stable hygromycin resistance gene to create the vector pHSG298Hg, which was then inserted downstream of the hygromycin resistance gene. A linear full-length plasmid was prepared from pHSG298Hg by inverse PCR using primers SEQ ID NOs: 2 and 3. KOD one (Takara Bio) was used for vector PCR.
反応後は一旦室温に反応液を冷まし、NEB社製Dpn Iを0.5 μl（10 U相当）添加し、37℃で2時間反応させた。 After the reaction, the reaction mixture was cooled to room temperature, and 0.5 μl (equivalent to 10 U) of NEB Dpn I was added, followed by a reaction at 37°C for 2 hours.
＜PCR材料＞
DNAテンプレート 0.2 μl
Fwプライマー 0.5 μl
Rvプライマー 0.5 μl
KOD One 8 μl
dH2O 10.3 μl
20 μl
<PCR materials>
DNA template 0.2 μl
Fw primer 0.5 μl
Rv primer 0.5 μl
KOD One 8 μl
dH2O 10.3 μl
20 μl
＜PCR条件＞
98℃ 2分
98℃ 10秒
57℃ 5秒
68℃ 20秒 ※30サイクル
68℃ 10秒
<PCR conditions>
98℃ 2 minutes
98℃ 10 seconds
57℃ 5 seconds
68℃ 20 seconds *30 cycles
68℃ 10 seconds
＜プライマー＞ <Primer>
（Ori断片の調製）
Ori断片の調製は、以下の条件で行った。
(Preparation of Ori fragment)
The Ori fragment was prepared under the following conditions.
＜PCR材料＞
DNAテンプレート 0.2 μl
Fwプライマー 0.5 μl
Rvプライマー 0.5 μl
KOD FENeo 0.4 μl
S*Buffer for FXNeo 10 μl
2 mM dNTPS 4 μl
dH2O 4.4 μl
20 μl
<PCR materials>
DNA template 0.2 μl
Fw primer 0.5 μl
Rv primer 0.5 μl
KOD FENeo 0.4 μl
S*Buffer for FXNeo 10 μl
2 mM dNTPS 4 μl
4.4 μl dH2O
20 μl
＜PCR条件＞
98℃ 2分
98℃ 10秒
57℃ 30秒
68℃ 90秒 ※30サイクル
68℃ 10秒
<PCR conditions>
98℃ 2 minutes
98℃ 10 seconds
57℃ 30 seconds
68℃ 90 seconds *30 cycles
68℃ 10 seconds
＜プライマー＞
＜Gibson Assembly＞ <Gibson Assembly>
上記の組成で試薬を調製し、50℃で1時間インキュベートした。 The reagent was prepared with the above composition and incubated at 50°C for 1 hour.
ベクターおよびOri断片をアガロースゲル電気泳動により分離・精製し、30 μlに溶出した溶液の一部を上述の通りGibson Assemblyに供した。50℃、1時間保温後、JM109コンピテントセル100 μlに対し反応液の一部（0.5 μl）を加え形質転換した。LB/Hg培地に現れたコロニーよりプラスミドを調製し、サンガー法によりシーケンスを確認した。 The vector and Ori fragment were separated and purified by agarose gel electrophoresis, and a portion of the 30 μl eluted solution was subjected to Gibson Assembly as described above. After incubation at 50°C for 1 hour, a portion of the reaction mixture (0.5 μl) was added to 100 μl of JM109 competent cells for transformation. Plasmids were prepared from colonies that appeared on LB/Hg medium, and the sequences were confirmed by the Sanger method.
また、形質転換効率（CFU/μg)は、以下の方法で算出した。
１．コンピテントセルにDNA（プラスミド）を10 ng添加し、形質転換する。
２．コロニー数をカウントし、DNA 1 μgあたりのコロニー数（CFU/μg）を算出する。
The transformation efficiency (CFU/μg) was calculated by the following method.
1. Add 10 ng of DNA (plasmid) to competent cells and transform them.
2. Count the number of colonies and calculate the number of colonies per μg of DNA (CFU/μg).
（３．条件についての検討）
次いで、コンピテントセルの作製および形質転換の条件についての検討を行った。条件の検討には、以下を指標とした。
・増殖時期
対数増殖期（log phase、OD600＝0.3～0.5）と定常期（stationary phase、OD600＝1.4～1.6）
・再懸濁時の希釈倍率（Dilution ratio）
対数増殖期：1x、5x、10x
定常期：1/10、1x、10x
・Mg2+、Ca2+の添加の有無
添加する場合の濃度としては、Mg2+ 0.4 mM、Ca2+ 0.35 mMとなるように培地に添加
・培地の交換の有無（再懸濁の有無）
再懸濁時する場合、新鮮な培地と交換
(3. Consideration of conditions)
Next, we investigated the conditions for preparing competent cells and for transformation, using the following criteria as indicators:
Growth phase: Log phase (OD600 = 0.3-0.5) and stationary phase (OD600 = 1.4-1.6)
・Dilution ratio when resuspended
Logarithmic growth phase: 1x, 5x, 10x
Stationary phase: 1/10, 1x, 10x
- Whether or not Mg 2+ and Ca 2+ were added. If added, the concentrations should be 0.4 mM Mg 2+ and 0.35 mM Ca 2+. - Whether or not the medium was replaced (whether or not it was resuspended).
When resuspending, replace with fresh medium.
比較実験の結果から、以下のプロトコルが、最適化されたコンピテントセル作製プロトコルであると推定される。なお、本発明が、以下のプロトコルに限定されないことは言うまでもない。 Based on the results of the comparative experiments, the following protocol is presumed to be an optimized protocol for producing competent cells. It goes without saying that the present invention is not limited to the following protocol.
＜コンピテントセルの作製＞
１．Thermus thermophilus HB27株を前培養する。
２．前培養後のThermus thermophilus HB27株を、Mg2+、Ca2+を添加したLB培地45 mLで本培養する。
３．本培養中の培養液に、80%グリセロールを10 mL添加する（培養中に一部蒸発するので培地量は約40 mLに減少）。
４．1.5 mLチューブに200 μLずつ分注する（瞬間凍結なし）。
５．冷凍庫（-20℃）で保存する。
<Preparation of competent cells>
1. Pre-culture Thermus thermophilus HB27 strain.
2. After pre-culture, Thermus thermophilus HB27 strain is cultured in 45 mL of LB medium supplemented with Mg 2+ and Ca 2+ .
3. Add 10 mL of 80% glycerol to the culture medium during the main culture (this will evaporate during the culture, reducing the medium volume to approximately 40 mL).
4. Dispense 200 μL into 1.5 mL tubes (do not flash freeze).
5. Store in the freezer (-20°C).
＜形質転換＞
１．冷凍庫からコンピテントセルを取り出す。
２．コンピテントセルにDNA溶液を添加する。
３．70℃で2～3時間インキュベートする。
<Transformation>
1. Remove the competent cells from the freezer.
2. Add the DNA solution to the competent cells.
3. Incubate at 70°C for 2-3 hours.
本発明は、サーマス・サーモフィルス由来のコンピテントセルを長期保存できるため、形質転換実験において、極めて有用である。本出願は、日本で出願された特願2024－048785（出願日：2024年3月25日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。 This invention allows for the long-term storage of competent cells derived from Thermus thermophilus, making it extremely useful in transformation experiments. This application is based on patent application No. 2024-048785 filed in Japan (filing date: March 25, 2024), the contents of which are incorporated in their entirety herein.
Claims (9)
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
を含む、コンピテントセルの調製方法。 A method for preparing competent cells, comprising the steps of: culturing Thermus thermophilus; and freezing and storing the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the step.
前記工程で得られたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を分注する工程、および
前記工程で分注されたサーマス・サーモフィルスを含む培養液を凍結保存する工程
を含む、コンピテントセルの調製方法。 Cultivating Thermus thermophilus;
A method for preparing competent cells, comprising the steps of: dispensing the culture solution containing Thermus thermophilus obtained in the step; and freezing and storing the culture solution containing Thermus thermophilus dispensed in the step.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2024-048785 | 2024-03-25 | ||
| JP2024048785 | 2024-03-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2025205122A1 true WO2025205122A1 (en) | 2025-10-02 |
Family
ID=97218792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2025/010066 Pending WO2025205122A1 (en) | 2024-03-25 | 2025-03-17 | Method for preparing novel competent cell |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2025205122A1 (en) |
-
2025
- 2025-03-17 WO PCT/JP2025/010066 patent/WO2025205122A1/en active Pending
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