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WO2025100980A1 - Ube3a를 표적으로 하여 발현증강을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 - Google Patents

Ube3a를 표적으로 하여 발현증강을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 Download PDF

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WO2025100980A1
WO2025100980A1 PCT/KR2024/017580 KR2024017580W WO2025100980A1 WO 2025100980 A1 WO2025100980 A1 WO 2025100980A1 KR 2024017580 W KR2024017580 W KR 2024017580W WO 2025100980 A1 WO2025100980 A1 WO 2025100980A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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ube3a
antisense oligonucleotide
mrna
translation
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2024/017580
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김진국
김시온
게비 제시카하나리
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Original Assignee
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST filed Critical Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
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    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy

Definitions

  • an antisense oligonucleotide targeting the pre-mRNA of the human UBE3A gene which induces increased expression of UBE3A (Ubiquitin protein ligase E3A), and its use in treating a disease associated with a lack of functional UBE3A.
  • UBE3A Ubiquitin protein ligase E3A
  • the antisense oligonucleotide induces splicing to increase the production of an mRNA of a productive isoform that does not contain a site that inhibits translation of UBE3A, thereby increasing the expression level of UBE3A, thereby treating or ameliorating a disease or symptom caused by a lack of functional UBE3A in a subject.
  • Oligonucleotides are actively being used for the diagnosis or treatment of diseases. Unlike most biopharmaceuticals that target proteins, oligonucleotides target genes that are the cause of diseases, and can be developed as therapeutics that act on rare genetic diseases that were previously untreatable or protein targets that could not be effectively treated with small molecule or protein therapeutics. In particular, oligonucleotide-based therapeutics have the advantage of being much simpler in design and development compared to small molecule drugs and large molecule biopharmaceuticals.
  • Antisense oligonucleotides can bind to pre-mRNA or mRNA with a complementary sequence, and regulate splicing of pre-mRNA to create new proteins, or induce degradation of mRNA to block protein production. Splicing regulation can result in increasing the expression of desired proteins while suppressing the expression of unwanted proteins, or inducing the expression of new proteins.
  • Therapeutics are being developed using these properties of RNA, and Exondys51, which induces exon skipping, has been approved by the US FDA as a treatment for Duchenne muscular dystrophy (DMD).
  • mRNA can theoretically code for and produce any type of protein, and ASOs have the advantage of enabling the development of therapeutics for proteins that were previously unavailable because the site to be inhibited was not exposed, since they target RNA.
  • UBE3A is a ubiquitin protein ligase E3A, an enzyme that targets proteins to be degraded within cells. This enzyme attaches ubiquitin to proteins to be degraded, and the proteasome recognizes and degrades the ubiquitin-attached proteins. This protein degradation is a process that removes damaged or unnecessary proteins and maintains the normal function of the cell.
  • UBE3A plays an important role in the development and function of the nervous system, and it is known that loss of UBE3A gene function in the brain causes symptoms of Angelman syndrome, a genetic disease that primarily affects the nervous system.
  • Antisense oligonucleotides targeting UBE3A are being developed in various ways as treatments for Angelman syndrome (e.g., US Patent 11,320,421, US Patent 11,261,446).
  • Angelman syndrome e.g., US Patent 11,320,421, US Patent 11,261,446
  • the present inventors identified a target region in the pre-mRNA of UBE3A that can induce enhanced expression of UBE3A, and developed an antisense oligonucleotide therefor.
  • the purpose is to provide an antisense oligonucleotide targeting the pre-mRNA of the UBE3A gene, which induces increased expression of UBE3A.
  • One aspect of the present invention is an antisense oligonucleotide targeting pre-mRNA of the human UBE3A gene,
  • the above antisense oligonucleotide comprises 13 to 40 consecutive nucleotides and binds to the target site of UBE3A pre-mRNA through hybridization by at least 13 consecutive Watson-Crick base pairing A:T or G:C or wobble base pairing G:U, I:A, I:C or I:U, thereby increasing the expression of UBE3A.
  • the above target region provides an antisense oligonucleotide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 11, and 47 to 66.
  • the target site of the antisense oligonucleotide that induces increased expression of the UBE3A gene was discovered by exploring the site of UBE3A pre-mRNA that affects the translational activity of UBE3A mRNA. Specifically, through polysome profiling of cells, it was confirmed that the number of ribosomes bound per mRNA and, consequently, the translational activity of UBE3A differ depending on whether two exons (e1, e2) in the 5'-UTR or the intron region connecting these two exons are included in the mature mRNA.
  • Exons e1 and e2 in the 5'-UTR correspond to the minus strand sequences of chr15:25,408,620-25,408,684 and chr15:25,407,067-25,407,262, respectively, based on hg38.
  • the presence of each exon e1 and e2 is interdependently associated, such that mRNA is spliced to include both e1 and e2 or to exclude both of them, and mRNA isoforms that include both e1 and e2, or e1, e2, and the intronic region connecting e1 and e2, have significantly lower translational activity than mRNA isoforms that do not include them, confirming that they act as translational repression sites.
  • the target site which includes all of the exons e1, e2, and the intronic region connecting e1 and e2, which were identified as translational repression sites, was the 5'-UTR region of the pre-mRNA of UBE3A, the minus strand of chr15:25,407,067-25,408,684 (hg38) (SEQ ID NO: 97), exon e1 was the minus strand of chr15:25,408,620-25,408,684 (hg38) (SEQ ID NO: 98), and exon e2 was the minus strand of chr15:25,407,067-25,407,262 (hg38) (SEQ ID NO: 99).
  • Antisense oligonucleotides targeting a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 21 within the 5'-UTR target region were designed, and it was confirmed that they induce splicing so that a translational repression site in pre-mRNA is not included in a mature mRNA, thereby increasing the mRNA of a productive isoform, and thereby increasing the expression of UBE3A.
  • Antisense oligonucleotides targeting a sequence of SEQ ID NOs: 47 to 66 within the target region were additionally designed, centering on the target region of the antisense oligonucleotides confirmed to have high activity in increasing the production of mRNA of a productive isoform and increasing the expression of UBE3A, and these were screened for increasing the expression of UBE3A.
  • the antisense oligonucleotide comprises a contiguous sequence that is at least 80%, for example, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or 100% complementary to a target region of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11, 51, 62, and 63.
  • the antisense oligonucleotide may have a length of, but is not limited to, 14 to 30, 15 to 25, 17 to 24, or 18 to 20 nucleotides.
  • the antisense oligonucleotide is completely complementary (100% complementary) to a target region of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 11, and 47 to 66, or may contain a mismatch, for example, 1, 2, 3 or more consecutive mismatches, sufficient to hybridize to the target region by at least 13 consecutive Watson-Crick base pairs or floating base pairs to increase the expression of UBE3A.
  • the target portion may comprise a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11, 51, 62, and 63.
  • the target portion may comprise a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11 and 63.
  • One aspect of the present invention is an antisense oligonucleotide targeting pre-mRNA of the human UBE3A gene,
  • the above antisense oligonucleotide comprises 13 to 40 consecutive nucleotides and binds to more than 80% of the nucleobases of the target sequence of UBE3A pre-mRNA through hybridization by Watson-Crick base pairing A:T or G:C or floating base pairing G:U, I:A, I:C or I:U, thereby increasing the expression of UBE3A.
  • the above target sequence provides an antisense oligonucleotide, wherein the target sequence is a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 11, and 47 to 66.
  • the antisense oligonucleotide may be a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11, 51, 62, and 63.
  • the antisense oligonucleotide may be a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11 and 63.
  • the antisense oligonucleotide can increase the expression of UBE3A by binding to at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the nucleobases of the target sequence of UBE3A pre-mRNA through hybridization via Watson-Crick base pairing A:T or G:C or floating base pairing G:U, I:A, I:C or I:U.
  • antisense oligonucleotide refers to a nucleic acid sequence that is complementary to a target DNA or mRNA sequence, and is used interchangeably herein with “antisense oligomer” or "ASO".
  • Antisense oligonucleotides are generally designed to bind to a target and increase the expression of the RNA target by modulating the expression, or activity, of the target at the transcription, translation, or splicing level.
  • Antisense oligonucleotides are designed to hybridize to a gene, such as UBE3A or a transcript thereof, under cellular conditions. Thus, the oligonucleotide is designed to be sufficiently complementary to its target, i.e., to hybridize sufficiently with sufficient specificity to produce the desired effect in a cellular environment.
  • 5'-untranslated region refers to a region of an mRNA that is important in the regulation of translation of the transcript.
  • the 5'-UTR begins at the transcription initiation site and ends at the nucleotide preceding the initiation sequence of the coding region (typically, AUG).
  • target site of pre-mRNA of UBE3A gene or "target site of UBE3A pre-mRNA” as used herein means a site present in UBE3A pre-mRNA that is targeted by an oligonucleotide to induce enhanced expression of UBE3A. It may be exon e1, or e2, a part thereof, or a surrounding region comprising the same, which acts as a translational repression site, and an antisense oligonucleotide designed thereto can act to induce splicing so that e1 and e2 are not included in the mRNA.
  • UBE3A refers to Ubiquitin protein ligase E3A.
  • Ubiquitin protein ligase is an enzyme that attaches ubiquitin to proteins to be degraded, and the proteasome recognizes and degrades ubiquitin-tagged proteins. Protein degradation is a process that removes damaged or unnecessary proteins to maintain normal cell function.
  • UBE3A plays an important role in the development and function of the nervous system, and helps regulate the balance of protein synthesis and degradation at the synapses between nerve cells where cell-to-cell communication occurs. Loss of UBE3A gene function in the brain causes many of the unique features of Angelman syndrome, a complex genetic disorder that primarily affects the nervous system. Angelman syndrome can result from genetic mutations or abnormalities that result in the inactivation or deletion of the UBE3A gene, resulting in a deficiency or lack of functional UBE3A.
  • splicing refers to the process by which pre-mRNA transcribed from DNA is converted into mature mRNA, in which introns are removed from the pre-mRNA and exons are joined.
  • splicing refers to the generation of mRNA with different structures or compositions, i.e., mRNA isoforms, depending on which introns or exons are removed or maintained from a single pre-mRNA.
  • exon means a portion of a gene that encodes a portion of the final mature RNA from which introns have been removed by RNA splicing, and refers to the corresponding sequence in the DNA sequence of the gene and the RNA transcript.
  • intron refers to a nucleotide sequence within a gene that is removed by RNA splicing during the maturation of the final RNA product, and refers to the corresponding sequence in the DNA sequence of the gene and the RNA transcript.
  • exon skipping or “exon skipping” as used herein means that splicing of pre-mRNA results in the generation of mRNA without that exon, for example, when an antisense oligonucleotide targeting that exon binds, thereby inhibiting the formation of the splicesome complex that mediates splicing, resulting in the generation of mRNA that does not include that exon.
  • the term "productive isoform” refers to an isoform of the final mRNA obtained by splicing of pre-mRNA that does not contain an exon that acts as a translational repression site, and which can be translated with a high translational activity compared to the presence of the translational repression site.
  • the term “unproductive isoform” refers to an isoform of mRNA obtained by splicing of pre-mRNA that contains a translational repression site, and which cannot be translated into a final product, or which can be translated with a low yield due to the translational repression, or which can be translated into a final product with impaired or compromised function.
  • translational inhibition site refers to a site or region consisting of one or more bases on a pre-mRNA, which, when included in a final mature mRNA, results in lower translational activity compared to when not included.
  • the translational inhibition site may be an exon.
  • translational inhibition site as used herein is used interchangeably with “translational inhibition element” and “translational inhibition factor.”
  • translation activity refers to the activity of translating mRNA into protein, and can be measured by the amount or level of protein, or the number of ribosomes bound per mRNA. The more ribosomes bound per mRNA for translation, the higher the translation activity, and the fewer ribosomes bound per mRNA, the lower the translation activity. Translation activity can be analyzed by polysome profiling.
  • complementarity refers to the ability of a nucleoside/nucleotide to form Watson-Crick base pairs.
  • Watson-Crick base pairs are guanine (G)-cytosine (C) and adenine (A)-thymine (T)/uracil (U).
  • Oligonucleotides may include nucleosides having modified nucleobases, for example, 5-methyl cytosine is often used in place of cytosine, and thus complementarity includes Watson-Crick base-pairing between an unmodified nucleobase and a modified nucleobase.
  • Watson-Crick base pair refers to base pairing between A and T (A:T) or between C and G (G:C)
  • floating base pair refers to base pairing between G and U (G:U), I and A (I:A), I and C (I:C), or I and U (I:U).
  • % complementarity refers to the percentage of complementary nucleotides capable of forming base pairs between nucleic acid molecules. % complementarity is calculated by counting the number of aligned bases that form pairs between two sequences, dividing by the total number of nucleotides in the oligonucleotide, and multiplying by 100. Nucleobases/nucleotides that do not align, i.e. do not form base pairs, in a comparison of two sequences are referred to as mismatches.
  • An antisense oligonucleotide can be greater than 80% complementary to a target region, for example, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementary.
  • Antisense oligonucleotides may contain one, two, or three base mismatches relative to the target site, or may contain more than one base mismatch, as long as they have sufficient complementarity to effectively bind to the target site.
  • homology means the percentage of amino acid or, in the case of bases, bases that match at a particular position between polymers such as polypeptides or polynucleotides being compared, and may be used interchangeably with “identity” for sequences. Two sequences may be considered to be “homologous” to each other if they are at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% identical.
  • the percent homology of two polynucleotide sequences can be calculated by aligning the two sequences for optimal comparison purposes, comparing the nucleotides at corresponding nucleotide positions, and determining that if a position in the first sequence has the same nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the two sequences are identical at that position.
  • Sequence homology can be determined using software such as BLASTP, BLASTN, and FASTA.
  • the antisense oligonucleotide may bind to the target site of UBE3A pre-mRNA to induce splicing to generate a productive isoform of UBE3A mRNA that does not contain a site that inhibits translation of UBE3A, thereby increasing the expression of UBE3A.
  • an antisense oligonucleotide does not necessarily require 100% sequence complementarity to bind (hybridize) to the target site and exert its intended effect. Since binding of the antisense oligonucleotide to the target site can result in the production of mRNA of a productive isoform when the antisense oligonucleotide binds to the target site and forms a complex that prevents splicing of the target site into mRNA, the antisense oligonucleotide and the target site need only be complementary enough to induce mRNA of a productive isoform.
  • the antisense oligonucleotide and the target site can be at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100% complementarity.
  • the antisense oligonucleotide may comprise a mismatch to a target site nucleic acid of the UBE3A 5'-UTR. Despite the mismatches, hybridization of the antisense oligonucleotide to the target site may still be sufficient to induce alternative splicing to result in increased UBE3A expression.
  • the decreased binding affinity resulting from the mismatches may advantageously be compensated for by an increased number of nucleotides in the oligonucleotide and/or an increased number of modified nucleosides, e.g., 2' modified nucleosides, including LNAs, present in the oligonucleotide sequence that can increase binding affinity for the target.
  • the antisense oligonucleotide may comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 29, 31, 33 to 35, 37, and 39 to 44, or a sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% homology thereto.
  • the above antisense oligonucleotides are designed to have complementarity to the target site and to be able to induce splicing to increase the production of productive isoform mRNA, and are selected by confirming their activity. Since the intended effect is achieved when the antisense oligonucleotide can bind to the target site or an adjacent site including the target site and induce splicing such that the target site, i.e., the site having translational repression activity, is not included in the mRNA, the antisense oligonucleotide or an antisense oligonucleotide having 80% or more, for example, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% homology thereto can be effectively effective.
  • an antisense oligonucleotide of a specific sequence and an antisense oligonucleotide having at least 80% sequence identity thereto have the same or similar effects.
  • the antisense oligonucleotide may comprise or consist of SEQ ID NO: 33 or 34, or a sequence having at least 80% homology thereto.
  • the antisense oligonucleotide may target a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 47 to 66.
  • Antisense oligonucleotides comprising the sequence of SEQ ID NO: 33 or 34, for example, antisense oligonucleotides a405 and a406, showed excellent activity in increasing the expression of UBE3A by acting on the target site, and antisense oligonucleotide sequences targeting the target site and its surroundings were designed.
  • SEQ ID NOs: 47 to 66 correspond to sequences of adjacent regions centered on the target site of SEQ ID NO: 33 or 34.
  • antisense oligonucleotides demonstrates that not only antisense oligonucleotides having 100% homology to the target site, but also antisense oligonucleotides having sufficient complementarity to be able to have the intended antisense oligonucleotide activity, for example, greater than 80% complementarity, or sequences having greater than 80% homology to antisense oligonucleotides having activity, function effectively as antisense oligonucleotides.
  • the antisense oligonucleotide may comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 67 to 86, or a sequence having at least 80% homology thereto.
  • the antisense oligonucleotide may comprise or consist of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 71, 75, 82, and 83, or a sequence having at least 80% homology thereto.
  • the antisense oligonucleotide may comprise one or more modifications of a chemically modified sugar moiety, a chemically modified base, and a chemically modified internucleoside linkage.
  • the chemically modified sugar moiety can be selected from sugar moieties modified with 2'-O-methyl, 2'-methoxyethoxy, 2'-O-Amethoxyethyl (2'-MOE), 2'-dimethylaminoethoxy, 2'-dimethylaminoethoxyethoxy, 2'-fluoro, 2'-acetamide, morpholino, locked nucleic acid (LNA), and S-contrained-ethyl (c-ET).
  • LNA locked nucleic acid
  • the above modified base may be selected from the group consisting of isocytosine, pseudoisocytosine, 5-methyl-cytosine, 5-fluorocytosine, 5-thiozolo-cytosine, 5-propynyl-cytosine, 5-propynyl-uracil, 5-bromouracil 5-thiazolo-uracil, 2-thio-uracil, 2'thio-thymine, inosine, diaminopurine, 6-aminopurine, 2-aminopurine, 2,6-diaminopurine and 2-chloro-6-aminopurine, and/or
  • the chemically modified internucleoside linkage may be a phosphorothioate linkage or a phosphorodiamidate linkage.
  • the antisense oligonucleotide comprises one or more modifications of a chemically modified sugar moiety, a chemically modified base, and a chemically modified internucleoside linkage,
  • the chemically modified sugar moiety comprises at least one of a sugar moiety modified with 2'-O-methyl, 2'-methoxyethoxy, 2'-O-Amethoxyethyl (2'-MOE), 2'-dimethylaminoethoxy, 2'-dimethylaminoethoxyethoxy, 2'-fluoro, 2'-acetamide, morpholino, locked nucleic acid (LNA), or S-contrained-ethyl (c-ET),
  • the modified base comprises at least one of 5-methyl-cytosine, 5-fluorocytosine, and 2-aminopurine bases,
  • the chemically modified internucleoside linkage may include a phosphorothioate linkage.
  • the antisense oligonucleotide may be composed of a nucleoside having a 2'-MOE modification, wherein the internucleoside linkages are phosphorothioate, and all cytosine (C) bases are 5'-methyl-cytosine.
  • the antisense oligonucleotide is composed of a nucleoside having a 2'-MOE modification, wherein the internucleoside linkages are phosphorothioate, and all cytosine (C) bases can be 5'-methyl-cytosine.
  • the antisense oligonucleotide comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 33, 34, 70, 82 or 83, wherein all nucleotides are nucleosides having a 2'-MOE modification, the internucleoside linkages are phosphorothioate, and all cytosine (C) bases can be 5'-methyl-cytosine.
  • the antisense oligonucleotide has one of the structures represented by the following formulae (I) to (IV):
  • A can be 2'MOE-A
  • C can be 2'MOE-5'-methyl-C
  • G can be 2'MOE-G
  • T can be 2'MOE-T
  • * can be PS (phosphorothioate)
  • 2'MOE can be 2'-O-methoxyethyl.
  • the antisense oligonucleotide has one of the structures of the following formulae (I) and (IV):
  • A can be 2'MOE-A
  • C can be 2'MOE-5'-methyl-C
  • G can be 2'MOE-G
  • T can be 2'MOE-T
  • * can be PS (phosphorothioate)
  • 2'MOE can be 2'-O-methoxyethyl.
  • modified oligonucleotide as used herein means an oligonucleotide comprising one or more sugar-modified nucleosides and/or modified internucleoside linkages.
  • chemical modification means introducing chemically modified nucleosides or internucleoside linkages into an antisense oligonucleotide to increase the nucleobase sequence of the antisense oligonucleotide, such as the nuclease resistance and/or binding affinity for a target nucleic acid.
  • modified nucleoside means a nucleoside which is modified compared to an equivalent DNA or RNA nucleoside by introduction of one or more modifications of the sugar moiety or the (nucleo)base moiety.
  • internucleoside linkage or "internucleoside linkage” as used herein means a bond or linkage that covalently links two nucleosides to each other, including but not limited to a phosphodiester (PO) linkage.
  • the internucleoside linkage comprises phosphate groups that form a phosphodiester linkage between adjacent nucleosides.
  • Modified internucleoside linkages increase the nuclease resistance of the oligonucleotide compared to phosphodiester linkages.
  • Modified internucleoside linkages are particularly useful for stabilizing oligonucleotides for in vivo use.
  • Modified internucleoside linkages or linkages include but are not limited to a phosphorothioate linkage, a phosphorodiamidate linkage.
  • nucleobase includes purine (e.g., adenine and guanine) and pyrimidine (e.g., uracil, thymine, and cytosine) residues present in nucleosides and nucleotides that form hydrogen bonds when hybridized with nucleic acids.
  • pyrimidine e.g., uracil, thymine, and cytosine residues present in nucleosides and nucleotides that form hydrogen bonds when hybridized with nucleic acids.
  • nucleobase also includes modified nucleobases that may be different from the naturally occurring nucleobases but are functional when hybridized with nucleic acids.
  • nucleobase includes both naturally occurring nucleobases such as adenine, guanine, cytosine, thymidine, uracil, xanthine, and hypoxanthine, as well as non-naturally occurring variants.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of a disease associated with abnormal levels and/or activity of UBE3A, comprising the antisense oligonucleotide described above.
  • the disease may be Angelman syndrome.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating a disease in which a therapeutic effect is confirmed through enhanced expression of UBE3A, comprising a virus that expresses the above-described antisense oligonucleotide in a cell.
  • the disease may be Angelman syndrome.
  • the antisense oligonucleotide has one of the structures represented by the following formulae (I) to (IV):
  • A can be 2'MOE-A
  • C can be 2'MOE-5'-methyl-C
  • G can be 2'MOE-G
  • T can be 2'MOE-T
  • * can be PS (phosphorothioate)
  • 2'MOE can be 2'-O-methoxyethyl.
  • the antisense oligonucleotide may comprise a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 29, 31, 33 to 35, 37, and 39 to 44, or a sequence having at least 80% homology thereto.
  • the antisense oligonucleotide comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 33, 34, 70, 82 or 83, wherein all nucleotides are nucleosides having a 2'-MOE modification, the internucleoside linkages are phosphorothioate, and all cytosine (C) bases can be 5'-methyl-C.
  • the antisense oligonucleotide may be a combination of antisense oligonucleotides having different sequences.
  • the pharmaceutical composition may further include pharmaceutically acceptable excipients, additives, etc.
  • the pharmaceutical composition may further comprise another therapeutic agent for the treatment of a disease associated with abnormal levels and/or activity of UBE3A.
  • the antisense oligonucleotide and the other therapeutic agent may be administered simultaneously or separately.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a therapeutically effective amount, i.e., an amount capable of producing the desired therapeutic effect.
  • the therapeutically effective amount is preferably an appropriate dose capable of treating a disease associated with an abnormal level and/or activity of UBE3A, and may be determined in consideration of certain factors, including the body weight, sex, age of the subject to be treated, the specific composition being administered, the active ingredient(s) in the composition, the time and route of administration, the general health, and other drugs being administered simultaneously.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered, for example, by oral administration or parenteral administration, for example, by subcutaneous injection, intravenous injection or infusion, intraarterial injection or infusion, intramuscular injection, topical administration, or administration to a target organ.
  • the antisense oligonucleotide according to the present invention can be administered intravenously or subcutaneously, and can be administered in a dosage of, but not limited to, 0.1 mg/kg to 50 mg/kg, 0.1 mg/kg to 30 mg/kg, 0.1 mg/kg to 20 mg/kg, 0.1 mg/kg to 5 mg/kg, or 0.5 mg/kg to 5 mg/kg.
  • Angelman syndrome refers to a genetic disease that primarily affects the nervous system, which occurs when there is an abnormality in the 15th chromosome derived from the maternal line, and is usually caused by a problem in the UBE3A gene, resulting in insufficient or low levels or activity of functional UBE3A. Therefore, symptoms can be treated or improved by increasing the expression of UBE3A to raise the level and/or activity of UBE3A to a normal level.
  • disease associated with abnormal levels or activity of UBE3A means a disease caused by lower than normal or insufficient levels or activity of functional UBE3A, for example, Angelman syndrome.
  • Another aspect of the present invention provides a method of treating a disease associated with an abnormal level or activity of UBE3A, comprising administering a therapeutically effective amount of the antisense oligonucleotide described above.
  • terapéuticaally effective amount means the amount of an active ingredient necessary to achieve the desired therapeutic effect, for example, the amount of an antisense oligonucleotide that can alleviate, relieve, improve or cure Angelman syndrome or its symptoms.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention can be administered by parenteral routes, including intravenous, intraarterial, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection or infusion, intrathecal or intracranial, for example, intracerebral or intracerebroventricular administration.
  • Another aspect of the present invention is a method for screening a gene having a translation repressor or translation promoter regulated through alternative splicing
  • a step of obtaining polysome profile data for human or animal cells
  • the above selection step selects a region that increases the number of ribosomes bound to mRNA when present as a translation promoting factor
  • a method in which a region that reduces the number of ribosomes bound to an mRNA when present is selected as a translation repressor.
  • the number of ribosomes bound per mRNA can be analyzed through profiling of polysomes in samples obtained from cells, and the greater the number of ribosomes bound per mRNA, the more active translation is and therefore, it can be determined that the translation activity is high.
  • profiling of polysomes mRNA is separated according to the number of ribosomes bound per mRNA, the mRNA of each separated fraction is analyzed by RNA-seq to confirm the sequence, and the sequences of each fraction are compared to discover the region affecting translation activity.
  • mRNA containing exons e1 and/or e2 present in the 5'-UTR of UBE3A pre-mRNA had low translation activity, whereas mRNA not containing exons e1 and e2 had high translation activity, and through this, exons e1 and e2 were identified as translation repressors.
  • the step of obtaining polysome profile data for the human or animal cell comprises:
  • RNA-seq comprising a step of performing RNA-seq on each fraction of the isolated mRNA to generate polysome profile data identifying the mRNA present in each fraction
  • a step of obtaining polysome profile data for a previously performed human or animal cell may be included.
  • translation accelerator refers to a region in mRNA that increases translation activity when present, and may be composed of one or more bases. If the translation activity of the mRNA is increased when a specific region, i.e., a base or base sequence, is present, and the translation activity is decreased when the region is removed, it can be determined that the mRNA acts as a translation accelerator.
  • An isoform of mRNA that includes a translation accelerator is a productive isoform that brings about the production of a desired end product, whereas an isoform of mRNA that does not include a translation accelerator and thus reduces the production of the end product by translation is an unproductive isoform.
  • a translation accelerator may not be part of the end product.
  • translation repressor refers to a site that lowers translation activity when present in mRNA, and may be composed of one or more bases. If the translation activity of the mRNA is lowered when a specific site, i.e., a base or base sequence, is present, and the translation activity is increased when the site is removed, it can be determined to act as a translation repressor.
  • An isoform of mRNA that does not contain a translation repressor is a productive isoform that brings about the production of a desired end product, whereas an isoform of mRNA that contains a translation repressor and reduces the production of an end product by translation is a non-productive isoform.
  • polysome refers to a structure in which multiple ribosomes are bound to mRNA for translation, and the number of ribosomes bound per mRNA indicates translation activity. The greater the number of ribosomes, the higher the translation activity. In order to determine translation activity from a sample of a cell or organism, a polysome profile is examined, and from this, the degree of translation activity and the sites or factors affecting translation activity can be determined.
  • the selected translation repressor or translation stimulator can be used as a target of an antisense oligonucleotide that induces splicing to regulate the expression level of a target gene.
  • an antisense oligonucleotide can be designed to induce splicing to remove the translation repressor to increase the expression of the target gene.
  • an antisense oligonucleotide that induces splicing can be designed to include the translational repressor to reduce the expression of the target gene.
  • an antisense oligonucleotide that induces splicing can be designed to include the translation promoting factor to increase the expression of the target gene.
  • an antisense oligonucleotide can be designed to induce splicing to exclude the translation promoting factor in order to reduce the expression of the target gene.
  • An antisense oligonucleotide according to one embodiment of the present invention can increase the expression of UBE3A by increasing the productive isoform of UBE3A, and thereby can be effectively used in the treatment of diseases associated with abnormal levels and/or activity of UBE3A, such as Angelman syndrome.
  • a method for screening translation repressors and/or translation stimulators based on a polysome profile according to one embodiment of the present invention can be usefully used in the design of target sites and oligonucleotides for the same to regulate the expression of target genes.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a strategy for increasing gene expression through ASO-mediated exon skipping of a 5'-untranslated region (5'-UTR) including translation inhibitory elements according to one specific example of the present invention.
  • A represents the position of the 5'-UTR present in messenger RNA (mRNA)
  • B represents a strategy for reducing the production of unproductive isoforms having exons including translation inhibitory elements by selectively controlling splicing using an antisense oligonucleotide (ASO), while simultaneously increasing the production of productive isoforms that do not include the exons, thereby ultimately increasing the amount of protein expression.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • Figure 2 shows HEK293T polysome profile data analysis for discovering a target region in the UBE3A 5'untranslated region according to one specific example of the present invention.
  • mRNAs present in HEK293T cells were separated according to the number of bound ribosomes (translation efficiency), and RNA-seq was performed on each separated fraction to obtain polysome profile data (GEO accession number: GSE69352). From this, it was confirmed that translation efficiency decreases when splicing is performed in the direction that includes two exons (e1, e2) present in the UBE3A 5'untranslated region, thereby elucidating that there is a translation repressor in the corresponding region.
  • Figure 3 shows the analysis of human neuronal polysome profile data (GEO accession number: GSE100007) for the discovery of a target region within the UBE3A 5'untranslated region according to one embodiment of the present invention. It was also confirmed in cultured human neural cells that the translation efficiency of the UBE3A gene was reduced when two exons (e1, e2) present within the UBE3A 5'untranslated region were included and spliced.
  • GSE100007 human neuronal polysome profile data
  • Figure 4 shows the results of measuring the ratio of productive and unproductive isoforms classified according to translation efficiency for verification of a target region in the 5'untranslated region of UBE3A according to one specific example of the present invention.
  • the unproductive isoform refers to an isoform of mRNA that includes two exons having translation repression factors, resulting in low translation efficiency
  • the productive isoform refers to an isoform of mRNA that is spliced so that two exons having translation repression activity are excluded.
  • Figure 5 shows the expression level of the target region within the UBE3A 5'untranslated region in each human tissue according to one specific example of the present invention.
  • Figure 6 shows a schematic diagram of an ASO strategy for a target region within the 5'untranslated region of UBE3A according to one specific example of the present invention.
  • Figure 7 shows the positions of 21 antisense oligonucleotides designed around exon e2, which is one of the target regions in the 5'untranslated region of UBE3A according to one specific example of the present invention.
  • the sequence presented in Figure 7 corresponds to chr15:25,407,025-25,407,296 based on hg38, and is indicated in the direction of the minus strand.
  • the region demarcated by a rectangular box corresponds to exon e2, and the designed antisense oligonucleotides are indicated by arrow-shaped boxes.
  • Figures 8a and 8b show the results of screening ASOs designed in and around exon e2, one of the target regions in the 5'untranslated region of UBE3A , according to one specific example of the present invention.
  • Figure 8a shows the results of RT-PCR
  • Figure 8b shows the ratio of non-productive isoforms to total isoforms from the RT-PCR results compared to Mock.
  • Mock is a condition in which only lipofectamine LTX was treated without injecting ASO.
  • Figure 9 shows the positions and sequences of primers for RT-PCR to confirm the relative expression levels of isoforms constituting the target region within the UBE3A 5'untranslated region according to one specific example of the present invention.
  • Figure 10 shows the optimized design of ASO for the target region in the 5'untranslated region of UBE3A according to one specific example of the present invention.
  • 20 ASOs (shaded arrow-shaped boxes) were additionally designed around a405 and a406 (arrow-shaped boxes) that showed the best efficacy in the first screening.
  • the sequence presented in Figure 10 corresponds to chr15:25,407,064-25,407,284 based on hg38, and is indicated in the direction of the minus strand.
  • the e2 exon region (chr15:25,407,067-25,407,262, hg38 , minus strand, 196 nt), which is the target exon of the designed ASO, is indicated by a rectangular box.
  • Figures 11a and 11b show the results of screening of ASOs designed to optimize the target region within the 5'untranslated region of UBE3A according to one specific example of the present invention.
  • Figure 11a shows the results of RT-PCR
  • Figure 11b shows the ratio of non-productive isoforms to total isoforms from the RT-PCR results compared to Mock.
  • Mock is a condition in which only lipofectamine LTX was treated without injecting ASO.
  • Figures 12a and 12b show changes in UBE3A protein expression in K562 cells by ASO for the target region in the UBE3A 5'untranslated region according to one specific example of the present invention.
  • Figure 12a shows the results of Western blot analysis
  • Figure 12b shows the fold change relative to the condition (Mock) where the UBE3A expression values in the results of Figure 12a are normalized to the b-actin and GAPDH expression values, respectively, and no ASO was treated.
  • Figure 13 shows the results of analyzing the change in UBE3A mRNA isoform expression in K562 cell line by RNA-seq of a406, an ASO according to one specific example of the present invention.
  • Figure 14 shows the results of RT-PCR evaluation of the similarity of UBE3A isoform expression between brain-like models (D160 cerebral organoids, K562 cell line, D40 human neuronal cells) and human brain tissues (human whole brain tissue, human cerebral cortex tissue) used for ASO screening evaluation according to one specific example of the present invention.
  • brain-like models D160 cerebral organoids, K562 cell line, D40 human neuronal cells
  • human brain tissues human whole brain tissue, human cerebral cortex tissue
  • Figure 15 shows the positions and sequences of primers and probes used in UBE3A isoform-specific RT-qPCR performed to evaluate the effect of ASO according to one embodiment of the present invention on changes in UBE3A isoform expression patterns.
  • Figures 16a and 16b show the dose-dependent UBE3A splicing alteration effect (1 week) of a406 according to one embodiment of the present invention in human cerebral organoids.
  • Figure 16a shows the RT-PCR results
  • Figure 16b shows the UBE3A isoform-specific RT-qPCR results, in which the expression levels of each UBE3A isoform relative to GAPDH mRNA are expressed as fold change relative to the condition without ASO treatment (Mock).
  • Figures 17a and 17b show the dose-dependent UBE3A splicing alteration effect (2 weeks) of a406 according to one embodiment of the present invention in human cerebral organoids.
  • Figure 17a shows the results of RT-PCR and qRT-PCR
  • Figure 17b shows the results of UBE3A isoform-specific RT-qPCR, in which the expression levels of each UBE3A isoform relative to GAPDH mRNA are expressed as fold change relative to the condition without ASO treatment (Mock).
  • Figures 18a and 18b show dose-dependent increase in UBE3A protein expression (2 weeks) of a406 according to one embodiment of the present invention in human cerebral organoids.
  • Figure 18a shows the results of measuring UBE3A protein and GAPDH protein expression by Western blotting
  • Figure 18b shows the fold change value of UBE3A protein expression compared to GAPDH in the data of Figure 18a compared to the group not treated with ASO (0 ⁇ M).
  • Figures 19a and 19b show the dose-dependent UBE3A splicing alteration effect (2 weeks) of a748 according to one embodiment of the present invention in human cerebral organoids.
  • Figure 19a shows the RT-PCR results
  • Figure 19b shows the UBE3A isoform-specific RT-qPCR results, in which the expression levels of each UBE3A isoform relative to GAPDH mRNA are expressed as fold change relative to the condition without ASO treatment (Mock).
  • Figure 20 shows the results of analyzing the change in UBE3A mRNA isoform expression in cerebral organoids by RNA-seq of a748, an ASO according to one specific example of the present invention.
  • Figures 21a, 21b, and 21c show the dose-dependent increasing effect (2 weeks) of a748 according to one embodiment of the present invention on UBE3A protein expression in human cerebral organoids.
  • Figure 21a shows the results of measuring UBE3A protein and GAPDH protein expression by Western blotting
  • Figure 21b shows the fold change in the expression level of UBE3A protein relative to GAPDH according to a748 treatment in the data compared to the condition without ASO treatment (0 ⁇ M).
  • Figure 21c visually shows the change in UBE3A protein expression relative to GAPDH in the a748 treatment group as a bar graph based on the data of Figure 21b.
  • Figure 22 shows the results of the toxicity evaluation of ASO according to one specific example of the present invention.
  • Figure 22 shows the ASO and the dosage of the control group and the experimental group, and the survival rate 7 days after ASO administration ([number of surviving mice]/[total number of mice used in the ASO toxicity test]).
  • Figures 23a and 23b show the effect of ASO (a406, a748) according to one specific example of the present invention on UBE3A protein expression in cerebral organoids derived from Angelman syndrome patients.
  • Figure 23a shows the results of measuring UBE3A protein and GAPDH protein expression by Western blotting
  • Figure 23b shows the change in UBE3A protein expression compared to GAPDH in the ASO (a406, a748) treated group as a bar graph and represents it as the fold change compared to the group not treated with ASO (0 ⁇ M).
  • Figure 24 shows the results of analyzing the change in UBE3A mRNA isoform expression in cerebral organoids derived from Angelman syndrome patients by RNA-seq of a748, an ASO according to one specific example of the present invention.
  • RNA-seq was performed on each fraction to analyze the polysome profile data (GEO accession number: GSE69352).
  • isoforms with high translation efficiency were detected in many fractions bound to a large number of ribosomes (high polysomes), whereas isoforms with low translation efficiency were mainly found in fractions bound to a small number of ribosomes (low polysomes).
  • polysome profile data From the polysome profile data, we identified a target region within the 5'untranslated region of the UBE3A gene that significantly affects the translation activity of the UBE3A gene (gene ID: 7337, RefSeq accession number: NM_130839.5).
  • the polysome profile data are shown in Figure 2. Polysome profiling data showed that when splicing was performed in the direction that included two exons (e1, e2) within the UBE3A 5'untranslated region, translation efficiency was reduced, suggesting the presence of a translation repressor in that region.
  • the data showed a pattern of simultaneous inclusion and simultaneous exclusion of two exons (e1, e2) in the UBE3A target region, confirming that the presence of the two exons in mRNA can be mutually coupled.
  • target regions that could induce increased expression of UBE3A were identified using human neuronal polysome data.
  • Polysome profile data obtained by performing RNA-seq on each fraction separated according to the number of ribosome binding (translation efficiency) of mRNAs in cultured human neuron cells for 50 days were analyzed.
  • isoforms with high translation efficiency were mainly distributed in the fraction with many ribosomes bound (high polysome), whereas isoforms with low translation efficiency were found more in the fraction with few ribosomes bound (low polysome).
  • the polysome profile data are shown in Fig. 3.
  • FIG. 7 shows the locations of ASOs designed to target the e2 exon and its surroundings.
  • the hg38, chr15:25,407,025-25,407,296 region, which includes the e2 exon and its surroundings, is indicated in the minus strand direction.
  • the target sequence of the designed ASO and the sequence information of the ASO sequence are shown in Table 1 below.
  • nucleosides of the designed ASO used the 2'MOE modification, all internucleoside linkages were PS (phosphorothioate), and 5'-methyl-C bases were used instead of all C bases.
  • the target site and primer sequences are shown in Figure 9.
  • the relative expression levels of isoforms constituting the target region within the 5'untranslated region of UBE3A were determined by RT-PCR.
  • the designed 21 candidate ASOs and 2 control ASOs were each injected into K562 cells using lipofectamine LTX at a final concentration of 200 nM.
  • RT-PCR was performed with RNA extracted 24 hours after ASO injection to confirm the change in the relative expression levels of productive and non-productive isoforms of UBE3A caused by each candidate ASO.
  • the results are shown in Fig. 8a and 8b.
  • Fig. 8a shows the result of RT-PCR
  • Fig. 8b shows the ratio of non-productive isoforms compared to Mock from the RT-PCR result.
  • the ASOs that reduced the non-productive isoforms in the control ASO treatment and mock comparison were a401, a403, a404, a405, a406, a407, a409, a411, a413, a414, a415, and a416, and among them, the ASOs that reduced the non-productive isoforms the most were a405 (SEQ ID NO: 33) and a406 (SEQ ID NO: 34).
  • Table 2 below shows the target sequences and ASO sequences of ASOs designed around the target sites of ASOs selected for their ability to reduce the nonproductive isoform of UBE3A.
  • Candidate ASOs (a406, a736, a747, and a748) and control ASO (a29) were injected into K562 cells at a final concentration of 200 nM using the electroporation method, and the expression of UBE3A, b-actin, and GAPDH proteins was measured by Western Blot analysis 48 hours after ASO injection.
  • Antibodies against UBE3A, b-actin, and GAPDH were 10344-1-AP (Proteintech; 1:1000 dilution), A5316 (Sigma-Aldrich; 1:5000 dilution), and ab8245 (abcam; 1:5000 dilution), respectively. The results are shown in Fig. 12a and 12b.
  • Figure 12a shows the results of Western blot analysis
  • Figure 12b shows the fold change relative to the condition (Mock) without ASO treatment after normalizing the UBE3A expression values to the b-actin and GAPDH expression values for each condition in the data of Figure 12a.
  • Candidate ASOs designed and screened against the target region of UBE3A increased the expression of UBE3A compared to the mock in K562 cell line, with a406 resulting in the greatest increase.
  • cerebral organoids were selected as a brain-like model.
  • D195 cerebral organoids were injected with a406 at the indicated doses (0, 10 ⁇ M, and 20 ⁇ M) based on the final concentration once every 3 days for 1 week by natural absorption method (gymnosis), and then RT-PCR and RT-qPCR were performed.
  • RT-PCR RNA extracted from each sample was reverse transcribed into cDNA, and the expression levels of isoforms in the target region were measured.
  • RT-qPCR Taqman-probe-based isoform-specific real-time quantitative PCR was performed using the same cDNA sample. Through this, the expression of each isoform was quantitatively analyzed.
  • Figures 16a and 16b show the results of RT-PCR and RT-qPCR, respectively.
  • Figure 16b shows the values of UBE3A mRNA versus GAPDH mRNA in each condition and the fold change for the non-ASO treatment condition. Error bars represent the 95% confidence intervals of the geometric means for the results of three biological replicates.
  • RT-PCR we confirmed that the expression of nonproductive isoforms of UBE3A decreased and the expression of productive isoforms increased in a dose-dependent manner with a406 treatment.
  • isoform-specific RT-qPCR that nonproductive isoforms (including e1 and e2 exons) decreased in an a406 dose-dependent manner and productive isoforms increased in an a406 dose-dependent manner, while the total amount of UBE3A mRNA did not change.
  • a406 or control ASO (Control ASO, AATGTTAGTGCTTGTTGAGGGC) was injected at the indicated doses (0, 10 ⁇ M, and 20 ⁇ M) based on the final concentration once every 3 days for 2 weeks by natural uptake method into D195 cerebral organoids, and then RT-PCR and RT-qPCR were performed. The results are shown in Figs. 17a and 17b.
  • RT-PCR confirmed that the expression of nonproductive isoforms of UBE3A decreased in a dose-dependent manner and the expression of productive isoforms increased with a406 treatment
  • isoform-specific RT-qPCR confirmed that nonproductive isoforms (including e1, e2 exons) decreased in an a406 dose-dependent manner and productive isoforms increased in an a406 dose-dependent manner, while the total mRNA amount of UBE3A did not change.
  • a406 treatment on UBE3A protein expression was confirmed in human cerebral organoids.
  • a406 was injected into D156 cerebral organoids once every 3 days for 2 weeks by natural absorption at the indicated doses (0, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, 40 ⁇ M, 80 ⁇ M) based on the final concentration.
  • protein expression levels were measured by capillary Western blotting (Jess Simple Western System) using antibodies against UBE3A and GAPDH, 10344-1-AP (Proteintech; 1:50 dilution) and ab8245 (abcam; 1:1500 dilution). The results are shown in Figs. 18a and 18b. It was confirmed that UBE3A protein expression increased in a dose-dependent manner following 2-week treatment with a406.
  • RT-PCR and RT-qPCR were performed. The results are shown in Figs. 19a and 19b.
  • RT-PCR confirmed that the expression of nonproductive isoforms of UBE3A decreased in a dose-dependent manner with a748 treatment
  • isoform-specific RT-qPCR confirmed that nonproductive isoforms (including e1, e2 exons) decreased in an a748 dose-dependent manner
  • productive isoforms increased in an a748 dose-dependent manner were shown in Figs. 19a and 19b.
  • RNA-seq The results are shown in Fig. 20. It was found that in human cerebral organoids, among the exons (e1, e2) of the target region, the form including the e2 region was abundantly expressed, and the isoform including the e1 region was hardly expressed. Compared to the condition where ASO was not injected (Mock), it was confirmed that the expression of the isoform including the e2 region was significantly reduced under the condition treated with a748.
  • a748 treatment on UBE3A protein expression was confirmed in human cerebral organoids.
  • a748 was injected into D170 cerebral organoids once every 3 days for 2 weeks by natural absorption at the indicated doses (0, 20 ⁇ M, 40 ⁇ M, 80 ⁇ M) based on the final concentration.
  • the protein expression levels were measured by capillary Western blotting (Jess Simple Western System) using antibodies against UBE3A and GAPDH, 10344-1-AP (Proteintech; 1:50 dilution) and ab8245 (abcam; 1:1500 dilution).
  • the results are shown in Figs. 21a, 21b, and 21c. It was confirmed that UBE3A protein expression increased in a dose-dependent manner following 2 weeks of a748 treatment.
  • Table 3 below shows the ASOs used for toxicity assessment.
  • Fig. 22 shows the information on ASO administered to P2 mice and the survival rate 7 days after ASO administration calculated as [number of surviving mice]/[total number of mice used in ASO toxicity test].
  • induced pluripotent stem cells derived from Angelman syndrome patients (NM_130839.5 (UBE3A): c.2289G>A) were differentiated into cerebral organoids and cultured for 120 days. Then, a406 or a748 was injected at a final concentration of 40 ⁇ M once every 3 days for 3 or 4 weeks by the natural uptake method.
  • Figs. 23a and 23b protein expression levels were measured by capillary Western blotting (Jess Simple Western System) using antibodies against UBE3A and GAPDH, 10344-1-AP (Proteintech; 1:50 dilution) and ab8245 (abcam; 1:1500 dilution). The results are shown in Figs. 23a and 23b.
  • Fig. 23a each lane of the Western blot represents an independent biological repeat experiment.
  • Fig. 23b is a bar graph quantifying the change in UBE3A protein expression compared to GAPDH in the leading ASO treatment group using the data from Fig. 23a, and confirming that UBE3A protein expression in the leading ASO treatment group increased by approximately 1.2-fold compared to the ASO-untreated group (Mock).

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Abstract

UBE3A의 발현 증강을 유도하는, UBE3A의 5'-UTR을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 UBE3A 결핍과 관련된 질환의 치료 용도가 개시된다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 UBE3A의 번역을 억제하는 부위를 포함하지 않는 생산적 이소형의 mRNA의 생성을 증가시키도록 스플라이싱을 유도하여, UBE3A의 발현 수준을 증가시켜, 개체에서 UBE3A의 결핍에 의한 질환이나 증상을 치료 또는 개선할 수 있다.

Description

UBE3A를 표적으로 하여 발현증강을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도
UBE3A(Ubiquitin protein ligase E3A)의 발현 증강을 유도하는, 인간 UBE3A 유전자의 프리-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 기능성 UBE3A 부족과 관련된 질환의 치료 용도가 개시된다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 UBE3A의 번역을 억제하는 부위를 포함하지 않는 생산적 이소폼의 mRNA의 생성을 증가시키도록 스플라이싱을 유도하여, UBE3A의 발현 수준을 증가시켜, 개체에서 기능성 UBE3A의 부족에 의한 질환이나 증상을 치료 또는 개선할 수 있다.
본 연구는 삼성미래기술육성사업의 지원을 받아 수행되었다(과제번호: SRFC-MA2102-04).
올리고뉴클레오티드가 질환의 진단 또는 치료를 위해 활발하게 이용되고 있다. 단백질을 표적으로 하는 대부분의 바이오 약품과 달리, 올리고뉴클레오티드는 질병의 근원인 유전자를 표적으로 하여, 이전에는 치료할 수 없었던 희귀 유전질환이나, 저분자 또는 단백질 치료제로 효과적으로 치료할 수 없었던 단백질 표적에 작용하는 치료제로 개발될 수 있다. 특히, 올리고뉴클레오티드 기반 치료제는 설계나 개발이 저분자 약물 및 고분자 바이오의약품과 비교할 때 휠씬 간편하다는 장점을 갖는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide: ASO)는 상보적 서열을 갖는 프리-mRNA(pre-mRNA)나 mRNA에 결합하여, 프리-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절하여 새로운 단백질을 만들거나, mRNA의 분해를 유도하여 단백질 생산을 막을 수 있다. 스플라이싱 조절은 원치 않은 단백질 발현을 억제하면서, 원하는 단백질의 발현을 증가시키거나, 새로운 단백질을 발현시키는 결과를 가져올 수 있다. 이러한 RNA의 특성을 이용하여 치료제가 개발되고 있으며, 엑손 스키핑을 유도하는 엑손디스51(Exondys51)이 DMD(Duchenne muscular dystrophy) 치료제로 미국 FDA의 허가를 받았다. mRNA는 이론적으로 모든 종류의 단백질을 코딩하여 생산할 수 있고, ASO는 RNA를 표적으로 하기 때문에 저해하고자 하는 부위가 노출되지 않아 치료제를 만들 수 없었던 단백질에 대한 치료제의 개발이 가능하다는 장점을 갖는다.
UBE3A는 유비퀴틴 단백질 리가아제 E3A로, 세포 내에서 분해시킬 단백질을 표적으로 하는 효소이다. 이 효소는 분해되어야할 단백질에 유비퀴틴을 부착시키고, 프로테아솜이 유비퀴틴이 부착된 단백질을 인식하고 분해한다. 이러한 단백질 분해는 손상되거나 불필요한 단백질을 제거하여 세포의 정상적인 기능을 유지시키는 과정이다. UBE3A는 신경계의 발달 및 기능에 중요한 역할을 하고, 뇌에서 UBE3A 유전자 기능의 상실이 주로 신경계에 영향을 미치는 유전 질환인 안젤만 증후군의 증상들을 유발하는 것으로 알려져 있다. UBE3A를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 안젤만 증후군의 치료제로 다양하게 개발되고 있으나(미국특허 11320421, 미국특허 11261446 등), 보다 안전하고 효과적으로 사용될 수 있거나, 다른 약물과 독립된 기작으로 작동하여 병용투여를 통해 치료 효과를 극대화할 수 있는, UBE3A의 발현을 증강시키는 치료제에 대한 요구가 존재한다.
본 발명자들은 UBE3A의 발현 증강을 유도할 수 있는, UBE3A의 프리-mRNA 중 표적 부위를 확인하고, 그에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 개발하였다.
UBE3A의 발현 증강을 유도하는, UBE3A 유전자의 프리-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, UBE3A 프리-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 UBE3A의 비정상적 수준 및/또는 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 선택적 스플라이싱(splicing)을 통해 조절되는 번역 억제 인자 또는 번역 촉진 인자를 가진 유전자를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 인간 UBE3A 유전자의 프리-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서,
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 13개 내지 40개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하고, UBE3A 프리-mRNA의 표적 부위에 적어도 13개의 연속된 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble base pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U에 의한 혼성화를 통하여 결합하여 UBE3A의 발현을 증가시키고,
상기 표적 부위는 서열번호 9 내지 11, 및 47 내지 66으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
UBE3A 유전자의 발현 증강을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적 부위는 UBE3A mRNA의 번역 활성에 영향을 미치는 UBE3A 프리-mRNA의 부위를 탐색하여 발굴하였다. 구체적으로, 세포의 폴리솜(polysome) 프로파일링을 통해 5'-UTR 내의 2개의 엑손(e1, e2), 또는 이 두 엑손과 이들을 연결하는 인트론 부위가 성숙한 mRNA(mature mRNA)에 포함되는지 여부에 따라, mRNA당 결합된 리보솜의 개수가 달라지고, 결과적으로, UBE3A의 번역 활성이 달라진다는 것을 확인하였다. 5'-UTR 내의 엑손 e1 및 e2는 hg38 기준으로 각각 chr15:25,408,620-25,408,684와 chr15:25,407,067-25,407,262의 마이너스 가닥 방향의 서열에 해당한다. 각 엑손 e1 및 e2의 존재는 상호 의존적으로 연관되어서, mRNA에 e1과 e2가 모두 포함되거나 또는 이들이 모두 제외되도록 스플라이싱되고, e1 및 e2, 또는 e1, e2, 및 e1과 e2를 연결하는 인트론 부위를 모두 포함하는 mRNA 이소폼은 이들을 포함하지 않는 mRNA 이소폼에 비해 번역 활성이 유의하게 낮아지므로, 이들이 번역 억제 부위로 작용하는 것으로 확인하였다. 번역 억제 부위로 확인된 엑손 e1, e2 및 e1과 e2를 연결하는 인트론 부위를 모두 포함하는 표적 부위는 UBE3A의 프리-mRNA의 5'-UTR 영역으로, chr15:25,407,067-25,408,684 (hg38)의 마이너스 가닥 (서열번호 97)이고, 엑손 e1은 chr15:25,408,620-25,408,684 (hg38)의 마이너스 가닥 (서열번호 98), 엑손 e2는 chr15:25,407,067-25,407,262 (hg38)의 마이너스 가닥 (서열번호 99)이었다. 이 5'-UTR 표적 부위 내의 서열번호 1 내지 21로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하고 이들이 프리-mRNA 중 번역 억제 부위를 성숙한 mRNA에 포함시키지 않도록 스플라이싱을 유도하여, 생산적 이소폼의 mRNA를 증가시키고, 그에 의해 UBE3A의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 생산적 이소폼의 mRNA의 생성을 증가시키고, UBE3A의 발현을 증가시키는 활성이 높은 것으로 확인된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적 부위를 중심으로 표적 부위 내의 서열번호 47 내지 66의 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가로 설계하고 이들을 UBE3A 발현 증가에 대해 스크리닝하였다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11, 51, 62, 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 표적 부위와 80% 이상, 예를 들면, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 100% 상보적인 연속 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 14개 내지 30개, 15개 내지 25개, 17개 내지 24개, 또는 18개 내지 20개의 뉴클레오티드로 구성된 길이일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 9 내지 11, 및 47 내지 66으로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 표적 부위에 완전히 상보적(100% 상보적)이거나, 표적 부위에 적어도 13개의 연속된 왓슨-크릭 염기쌍 또는 유동 염기쌍에 의해 혼성화를 통하여 결합하여 UBE3A의 발현을 증가시킬 수 있을 정도의 미스매치(mismatch), 예를 들면, 연속된 1개, 2개, 또는 3개 이상의 미스매치를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 부위는 서열번호 11, 51, 62, 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 부위는 서열번호 11 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 인간 UBE3A 유전자의 프리-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서,
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 13개 내지 40개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하고, UBE3A 프리-mRNA의 표적 서열의 핵염기들 중 80% 이상과 왓슨-크릭 염기쌍 A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍 G:U, I:A, I:C 또는 I:U에 의한 혼성화를 통하여 결합하여, UBE3A의 발현을 증가시키고,
상기 표적 서열은 서열번호 9 내지 11, 및 47 내지 66으로 구성된 군으로부터 선택된 서열인 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11, 51, 62, 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 UBE3A 프리-mRNA의 표적 서열의 핵염기들 중 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상과 왓슨-크릭 염기쌍 A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍 G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화를 통하여 결합하여, UBE3A의 발현을 증가시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 DNA 또는 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 의미하며, 본원에서 "안티센스 올리고머" 또는 "ASO"와 호환적으로 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 표적에 결합하고, 전사, 번역 또는 스플라이싱 수준에서 표적의 발현, 또는 활성을 조절하여 RNA 표적의 발현을 증가시키도록 설계된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 조건 하에서 유전자, 예를 들면, UBE3A 또는 그의 전사체에 혼성화하도록 설계된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 그의 표적에 충분히 상보적이도록, 즉, 세포 환경에서 원하는 효과를 생성할 수 있도록 충분한 특이성으로 충분히 혼성화되도록 설계된다.
본원에서 사용되는 용어 "5-비번역 영역(5'-untranslated region: 5'-UTR)"은 전사체의 번역의 조절에서 중요한 mRNA의 영역을 의미한다. 5'-UTR은 전사 개시 부위에서 시작되어 코딩 영역의 개시 서열(일반적으로, AUG) 전의 뉴클레오티드에서 끝난다.
본원에서 사용되는 용어 "UBE3A 유전자의 프리-mRNA의 표적 부위" 또는 "UBE3A 프리-mRNA의 표적 부위"는 UBE3A의 발현 증강을 유도하기 위해 올리고뉴클레오티드가 표적으로 하는 UBE3A 프리-mRNA에 존재하는 부위를 의미한다. 번역 억제 부위로 작용하는 엑손 e1, 또는 e2, 그의 일부, 또는 그를 포함하는 주변 영역일 수 있고, 그에 대해 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 작용하여, e1 및 e2가 mRNA에 포함되지 않도록 스플라이싱을 유도할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "UBE3A"는 유비퀴틴 단백질 리가아제 E3A(Ubiquitin protein ligase 3A)를 의미한다. 유비퀴틴 단백질 리가아제는 분해시킬 단백질에 유비퀴틴을 결합시키는 효소이고, 프로테아솜이 유비퀴틴-태깅된 단백질을 인식하고 분해한다. 단백질 분해는 손상되거나 불필요한 단백질을 제거하여 세포의 정상적인 기능을 유지시키는 과정이다. UBE3A는 신경계의 발달 및 기능에서 중요한 역할을 수행하고, 세포간 소통이 일어나는 신경 세포 간의 연접부(시냅스)에서 단백질 합성과 분해의 균형을 조절하는데 기여한다. 뇌에서 UBE3A 유전자 기능의 상실은 신경계에 주로 영향을 미치는 복합적 유전 질환인 안젤만 증후군의 독특한 특징 중 다수를 유발한다. UBE3A 유전자의 불활성화 또는 결실로 이어지는 유전적 변이나 이상에 의해 기능성 UBE3A의 결핍이나 부족이 초래되면 안젤만 증후군이 초래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "스플라이싱"은 DNA로부터 전사된 프리-mRNA가 성숙한 mRNA로 변환되는 과정으로서, 프리-mRNA로부터 인트론은 제거되고, 엑손이 연결되는 것을 의미한다. "선택적 스플라이싱"은 하나의 프리-mRNA로부터 제거되거나 유지되는 인트론이나 엑손에 따라, 상이한 구조나 구성의 mRNA, 즉, mRNA 이소폼을 생성하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "엑손"은 RNA 스플라이싱에 의해 인트론이 제거된, 최종 성숙한 RNA의 일부를 코딩하는 유전자의 부분을 의미하며, 유전자의 DNA 서열및 RNA 전사체 중 상응하는 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "인트론"은 최종 RNA 산물의 성숙 동안 RNA 스플라이싱에 의해 제거되는 유전자 내의 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 유전자의 DNA 서열 및 RNA 전사체 중 상응하는 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "엑손 스키핑(exon skipping)" 또는 "엑손 스킵"은 프리-mRNA의 스플라이싱에서 해당 엑손이 빠진 mRNA가 생성되는 것을 의미하며, 예를 들면, 해당 엑손을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 결합하여, 스플라이싱을 매개하는 스플라이세오솜 복합체(splicesome complex) 생성이 저해되고, 결과적으로 그 엑손을 포함하지 않는 mRNA가 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생산적 이소폼"은 프리-mRNA의 스플라이싱에 의해 수득된, 번역 억제 부위로 작용하는 엑손을 포함하지 않는 최종 mRNA의 이소폼으로서, 번역 억제 부위의 존재 시 대비 높은 번역 활성으로 번역될 수 있는 mRNA를 의미한다. "비생산적 이소폼"은 프리-mRNA의 스플라이싱에 의해 수득된, 번역 억제 부위를 포함하는 mRNA의 이소폼으로서, 최종 산물로 번역될 수 없거나, 또는 번역 활성이 억제되어 낮은 수율로 번역되거나 또는 기능이 약화되거나 손상된 최종 산물로 번역될 수 있는 mRNA를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "번역 억제 부위"는 프리-mRNA 상의 하나 이상의 염기로 구성된 부위 또는 영역을 의미하며, 최종 성숙한 mRNA에 포함되는 경우, 불포함시 대비 낮은 번역 활성을 초래하는 부위 또는 영역을 의미한다. 번역 억제 부위는 엑손일 수 있다. 본원에서 "번역 억제 부위"는 "번역 억제 요소", "번역 억제 인자"와 호환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "번역 활성"은 mRNA가 단백질로 번역되는 활성을 의미하며, 단백질의 양이나 수준, 또는 mRNA당 결합된 리보솜의 개수 등으로 측정될 수 있다. 번역을 위해 mRNA당 결합된 리보솜의 개수가 많을수록, 번역 활성은 높고, mRNA당 결합된 리보솜의 개수가 적을수록, 번역 활성은 낮은 것일 수 있다. 폴리솜 프로파일링에 의해 번역 활성을 분석할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 능력을 의미한다. 왓슨-크릭 염기쌍은 구아닌(G)-사이토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있고, 예를 들면, 5-메틸 시토신이 시토신 대신에 종종 사용되고, 따라서, 상보성은 비-변형 핵염기와 변형 핵염기 사이에 왓슨 크릭 염기-쌍형성을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "왓슨-크릭 염기쌍"은 A와 T간의 염기쌍(A:T) 또는 C와 G 간의 염기쌍(G:C)을 의미하고, "유동 염기쌍"은 G와 U(G:U), I와 A(I:A), I와 C(I:C), 또는 I와 U(I:U) 간의 염기쌍을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "% 상보성"은 핵산 분자들 사이에서, 염기쌍을 형성할 수 있는 상보적인 뉴클레오티드의 비율을 의미한다. % 상보성은 2개의 서열 간에 쌍을 형성하는 정렬된 염기들의 수를 계수하고, 올리고뉴클레오티드 중 뉴클레오티드의 총수로 나누고, 100을 곱함으로써 산출된다. 2개의 서열의 비교에서 정렬되지 않는, 즉 염기쌍을 형성하지 않는 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치(mismatch)로 지칭된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 부위에 대해 80% 이상, 예를 들면, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보성일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 부위에 대해 1개, 2개, 또는 3개의 염기 미스매치를 포함하거나, 또는 표적 부위에 유효하게 결합하기에 충분한 정도의 상보성을 갖는 한, 1개 이상의 염기 미스매치를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "상동성"은 비교되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 중합체 사이에서 특정 위치의 아미노산의 종류 또는 염기의 경우, 염기의 종류가 일치하는 비율을 의미하며, 서열에 대해 "동일성"과 호환적으로 사용될 수 있다. 두 서열이 80% 이상, 85% 이상, 90%, 95%, 또는 99% 이상 동일하면 서로 "상동성"인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들면, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 상동성(%)의 계산은 최적의 비교 목적으로 두 서열을 정렬하고, 상응하는 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드를 비교하여, 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드가 존재하면 해당 위치에서 두 서열은 동일한 것으로 판단된다. 서열 상동성은 BLASTP, BLASTN, 및 FASTA와 같은 소프트웨어를 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 UBE3A 프리-mRNA의 표적 부위에 결합하여, UBE3A의 번역을 억제하는 부위를 포함하지 않는 생산적 이소폼의 UBE3A mRNA를 생성하도록 스플라이싱을 유도하여, UBE3A의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
폴리솜 프로파일링에 의해 낮은 번역 활성을 초래하는 것으로 확인된 2개의 엑손(e1, e2)이 mRNA에 포함되지 않도록 스플라이싱을 유도하면 생산적 이소폼의 mRNA의 생성이 증가되고, 그에 의해 UBE3A 단백질의 발현이 증가하는 것으로 확인하였다. 존재 시에 낮은 번역 활성을 초래하는 엑손은 번역 억제 부위로 작용하고, 그 부위가 포함되지 않도록 스플라이싱을 유도하기 위해 그 부위에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 생산적 이소폼의 생성을 증가시켰다.
안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 부위에 결합(혼성화)하여 의도된 효과를 발휘하기 위해 반드시 100% 서열 상보성이 요구되는 것은 아니다. 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 부위의 결합은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 부위에 결합하여 표적 부위가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 막을 수 있는 복합체를 형성하면 생산적 이소폼의 mRNA가 생성될 수 있으므로, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 부위는 생산적 이소폼의 mRNA를 유도할 수 있을 정도로 상보성을 가지면 된다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 부위는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 상보성을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 UBE3A 5'-UTR의 표적 부위 핵산에 대해 미스매치를 포함할 수 있다. 미스매치들에도 불구하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적 부위에 대한 혼성화는 여전히 UBE3A 발현 증가를 가져오도록 선택적 스플라이싱을 유도하기에 충분할 수 있다. 미스매치로부터 비롯되는 감소된 결합 친화도는 유리하게, 올리고뉴클레오티드내 뉴클레오티드들의 증가된 수 및/또는 표적에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있는 변형 뉴클레오시드, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 서열내에 존재하는, LNA를 포함한 2' 변형된 뉴클레오시드의 증가된 수에 의해 보완될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 29, 31, 33 내지 35, 37, 및 39 내지 44로 구성된 군으로부터 선택된 서열, 또는 그에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 그로 구성될 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 부위에 대한 상보성을 갖고, 생산적 이소형 mRNA의 생성을 증가시키도록 스플라이싱을 유도할 수 있도록 설계되었고, 그 활성을 확인하여 선별되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 부위 또는 표적 부위를 포함한, 그의 인접 부위에 결합하여, 표적 부위, 즉, 번역 억제 활성을 갖는 부위가 mRNA에 포함되지 않도록 스플라이싱을 유도할 수 있으면 의도된 효과가 달성되므로, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그에 대해 80% 이상, 예를 들면, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 상동성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 유효하게 작용할 수 있다.
동일한 표적 부위 및 그에 인접한 부위에 결합하는 복수 개의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 그들의 표적 부위에 대한 결합 및 그에 따른 스플라이싱에 대한 효과를 확인하여, 특정한 서열의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그에 대해 80% 이상 서열 동일성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 동일하거나 유사한 효과를 갖는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 33 또는 34, 또는 그에 대해 80% 이상 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 그로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 47 내지 66으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 표적으로 하는 것일 수 있다.
서열번호 33 또는 34의 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드 a405 및 a406은 표적 부위에 작용하여 UBE3A의 발현을 증가시키는 우수한 활성을 보였고, 그의 표적 부위 및 그 주위를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 설계하였다. 서열번호 47 내지 66은 서열번호 33 또는 34의 표적 부위를 중심으로 한 그 인접 부위의 서열에 해당한다. 생산적 이소폼의 생성을 증가시키는 효과가 높은 것으로 확인된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적 부위에 대해 추가로 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모두 비생산적 이소폼의 생성을 감소시키고, 생산적 이소폼의 생성을 증가시켜, 효과적으로 UBE3A의 발현 증강을 유도한다는 것을 확인했다. 이러한 추가로 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 활성은 표적 부위에 대한 100% 상동성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 뿐 아니라, 의도된 안티센스 올리고뉴클레오티드 활성을 가질 수 있을 정도의 상보성, 예를 들면, 80% 이상의 상보성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 활성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 80% 이상의 상동성을 갖는 서열도 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 효과적으로 작용한다는 것을 보여준다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 67 내지 86으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열, 또는 그에 대해 80% 이상 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 그로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 71, 75, 82, 및 83으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열, 또는 그에 대해 80% 이상 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 그로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 당 모이어티, 화학적으로 변형된 염기, 및 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합 중 하나 이상의 변형을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 화학적으로 변형된 당 모이어티는 2'-O-메틸, 2'-메톡시에톡시, 2'-O-A메톡시에틸(2'-MOE), 2'-디메틸아미노에톡시, 2'-디메틸아미노에톡시에톡시, 2'-플루오로, 2'-아세트아미드, 모르폴리노(morpholino), LNA (locked nucleic acid), 및 c-ET(S-contrained-ethyl)로 변형된 당 모이어티 로부터 선택될 수 있고,
상기 변형된 염기는 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-메틸-시토신, 5-플루오로시토신, 5-티오졸로-시토신, 5-프로피닐-시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-브로모우라실 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'티오-티민, 이노신, 디아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 및/또는
화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 결합 또는 포스포로디아미데이트 결합일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 당 모이어티, 화학적으로 변형된 염기, 및 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합 중 하나 이상의 변형을 포함하고,
상기 화학적으로 변형된 당 모이어티는 2'-O-메틸, 2'-메톡시에톡시, 2'-O-A메톡시에틸(2'-MOE), 2'-디메틸아미노에톡시, 2'-디메틸아미노에톡시에톡시, 2'-플루오로, 2'-아세트아미드, 모르폴리노(morpholino), LNA (locked nucleic acid), 또는 c-ET(S-contrained-ethyl)로 변형된 당 모이어티 중 하나 이상을 포함하고,
상기 변형된 염기는 5-메틸-시토신, 5-플루오로시토신, 및 2-아미노퓨린 염기 중 하나 이상을 포함하며,
화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-MOE 변형을 갖는 뉴클레오시드로 구성되고, 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트이며, 모든 시토신(C) 염기는 5'-메틸-시토신인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-MOE 변형을 갖는 뉴클레오시드로 구성되고, 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트이며, 모든 시토신(C) 염기는 5'-메틸-시토신일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 33, 34, 70, 82 또는 83의 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성되고, 모든 뉴클레오티시드가 2'-MOE 변형을 갖는 뉴클레오시드이고, 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트이며, 모든 시토신(C) 염기는 5'-메틸-시토신일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 (I) 내지 (IV)의 구조 중 하나이고:
A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C*T*T*G*T 화학식 (I);
A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C*T*T*G*T*A*T*C*T 화학식 (II);
C*C*C*C*A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C 화학식 (III); 및
G*T*A*C*C*C*C*A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C 화학식 (IV);
식 중에서, A는 2'MOE-A, C는 2'MOE-5'-메틸-C, G는 2'MOE-G, T는 2'MOE-T, *는PS(phosphorothioate), 2'MOE는 2'-O-메톡시에틸일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 (I) 및 (IV)의 구조 중 하나이고:
A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C*T*T*G*T 화학식 (I); 및
G*T*A*C*C*C*C*A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C 화학식 (IV);
식 중에서, A는 2'MOE-A, C는 2'MOE-5'-메틸-C, G는 2'MOE-G, T는 2'MOE-T, *는PS(phosphorothioate), 2'MOE는 2'-O-메톡시에틸일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는 1개 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "화학적 변형"은 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 핵염기 서열을 뉴클레아제 내성 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화도를 증가시키도록 안티센스 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드간 결합(internucleoside linkage)을 도입하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형의 도입에 의해 등가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오시드간 결합" 또는 "뉴클레오시드간 연결기"는 2개의 뉴클레오시드를 서로 공유 결합에 의해 연결시키는 결합 또는 연결기를 의미하며, 예를 들면, 포스포디에스테르(PO) 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 천연 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결기는 인접 뉴클레오시드들 사이에 포스포디에스레르 연결기를 생성하는 포스페이트 기들을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포디에스테르 연결기에 비해 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 생체내 사용을 위해 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는데 특히 유용하다. 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 연결기는 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디아미데이트 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "핵염기"는 핵산의 혼성화시 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린(예, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘(예, 우라실, 티민 및 시토신) 잔기를 포함한다. 본원에서, 용어 핵염기는 천연 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화시 기능성인 변형된 핵염기를 또한 포함한다. 이와 관련하여, "핵염기"는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴과 같은 천연 핵염기뿐 아니라 비천연 변이체 모두를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 전술된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, UBE3A의 비정상적 수준 및/또는 활성과 관련된 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 질환은 안젤만 증후군일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 전술된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포 내에서 발현시키는 바이러스를 포함하는, UBE3A의 발현 증강을 통한 치료 효과가 확인된 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 질환은 안젤만 증후군일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 (I) 내지 (IV)의 구조 중 하나이고:
A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C*T*T*G*T 화학식 (I);
A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C*T*T*G*T*A*T*C*T 화학식 (II);
C*C*C*C*A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C 화학식 (III); 및
G*T*A*C*C*C*C*A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C 화학식 (IV);
식 중에서, A는 2'MOE-A, C는 2'MOE-5'-메틸-C, G는 2'MOE-G, T는 2'MOE-T, *는PS(phosphorothioate), 2'MOE는 2'-O-메톡시에틸일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 29, 31, 33 내지 35, 37, 및 39 내지 44로 구성된 군으로부터 선택된 서열, 또는 그에 대해 80% 이상 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 33, 34, 70, 82 또는 83의 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성되고, 모든 뉴클레오티시드가 2'-MOE 변형을 갖는 뉴클레오시드이고, 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트이며, 모든 시토신(C) 염기는 5'-메틸-C일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상이한 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 첨가제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 UBE3A의 비정상적 수준 및/또는 활성과 관련된 질환의 치료를 위한 다른 치료제를 더 포함할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드와 상기 다른 치료제는 동시에 투여되거나 또는 별개로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 치료 유효량, 즉, 원하는 치료 효과를 생성할 수 있는 양으로 투여된다. 치료 유효량은 UBE3A의 비정상적 수준 및/또는 활성과 관련된 질환을 치료할 수 있는 적절한 용량인 것이 바람직하며, 이는 치료 대상 개체의 체중, 성별, 연령, 투여되는 특정한 조성물, 조성물 중의 활성 성분(들), 투여 시간 및 경로, 전반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯하여 특정 인자를 고려하여 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 예를 들어, 경구 투여 또는 비경구 투여, 예를 들어, 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입, 동맥내 주사 또는 주입, 근육내 주사, 국소 투여 또는 표적 기관으로의 투여에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 정맥내로 또는 피하로 투여할 수 있으며, 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 5 mg/kg 범위, 또는 0.5 mg/kg 내지 5 mg/kg 범위의 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "안젤만 증후군"은 주로 신경계에 영향을 미치는 유전 질환으로, 모계로부터 유래된 15번 염색체에 이상이 있을 때 발생하는 질환을 의미하며, 대개는 UBE3A 유전자의 문제 때문에 기능성 UBE3A의 수준이나 활성이 불충분하거나 낮을 때 발생한다. 따라서, UBE3A의 발현을 증가시켜서 UBE3A의 수준 및/또는 활성을 정상적인 수준으로 높이는 것에 의해 증상을 치료하거나 개선할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "UBE3A의 비정상적인 수준 또는 활성과 관련된 질환"은 기능성 UBE3A의 수준이나 활성이 정상 수준이나 활성보다 낮거나 부족하여 발생하는 질환을 의미하며, 예를 들면, 안젤만 증후군일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 전술된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, UBE3A의 비정상적인 수준 또는 활성과 관련된 질환과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"는 활성 성분이 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 양을 의미하며, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 안젤만 증후군 또는 그의 증상의 경감, 완화, 개선 또는 치료를 가져올 수 있는 양을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입, 척추강내 또는 두개내, 예를 들면, 대뇌내 또는 뇌실내 투여를 포함한 비경구적 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 선택적 스플라이싱(splicing)을 통해 조절되는 번역 억제 인자 또는 번역 촉진 인자를 가진 유전자를 스크리닝하는 방법으로서,
인간 또는 동물 세포에 대한 폴리솜 프로필 데이터를 수득하는 단계,
상기 폴리솜 프로필 데이터를 분석하여, 선택적 스플라이싱을 통해 조절되는 번역 촉진 인자 및/또는 번역 억제 인자를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 선별하는 단계는 존재 시에 mRNA에 결합된 리보솜의 개수를 증가시키는 부위는 번역 촉진 인자로 선별하고,
존재 시에 mRNA에 결합된 리보솜의 개수를 감소시키는 부위는 번역 억제 인자로 선별하는 것인 방법을 제공한다.
세포로부터 수득된 시료에서 폴리솜의 프로파일링을 통해 mRNA당 결합된 리보솜의 개수를 분석할 수 있고, mRNA당 결합된 리보솜의 개수가 많을수록 번역이 활발하게 이루어지고 따라서, 번역 활성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 폴리솜의 프로파일링에 의해, mRNA당 결합된 리보솜의 개수에 따라 mRNA를 분리하고, 분리된 각 분획의 mRNA를 RNA-seq에 의해 분석하여 서열을 확인하고, 각 분획의 서열을 비교하여, 번역 활성에 영향을 미치는 부위를 발굴할 수 있다. 예를 들면, UBE3A 프리-mRNA의 5'-UTR에 존재하는 엑손 e1 및/또는 e2를 포함하는 mRNA는 번역 활성이 낮았고, 엑손 e1 및 e2를 포함하지 않는 mRNA는 번역 활성이 높았고, 이를 통해 엑손 e1 및 e2는 번역 억제 인자로 확인되었다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 인간 또는 동물 세포에 대한 폴리솜 프로필 데이터를 수득하는 단계는
인간 또는 동물 세포로부터 용해물을 수득하고, 수크로오스 구배를 통해, mRNA에 결합된 리보솜 개수에 따라 mRNA를 분획으로 분리하는 단계, 및
분리된 mRNA의 각 분획에 대해 RNA-seq을 수행하여 각 분획에 존재하는 mRNA를 파악하는 폴리솜 프로필 데이터를 생성하는 단계를 포함하거나,
기 수행된 인간 또는 동물 세포에 대한 폴리솜 프로필 데이터를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "번역 촉진 인자"는 mRNA에 존재시 번역 활성을 높이는 부위를 의미하고, 하나 이상의 염기로 구성될 수 있다. 특정 부위, 즉, 염기 또는 염기 서열의 존재시 해당 mRNA의 번역 활성이 높아지고, 그 부위의 제거 시 번역 활성이 낮아지는 경우, 번역 촉진 인자로 작용하는 것으로 확인할 수 있다. 번역 촉진 인자를 포함하는 mRNA의 이소폼이 원하는 최종 산물의 생성을 가져오는 생산적 이소폼이고, 반면에, 번역 촉진 인자를 포함하지 않아, 번역에 의한 최종 산물의 생성을 감소시키는 mRNA의 이소폼은 비생산적 이소폼이다. 번역 촉진 인자는 최종 산물의 일부는 아닐 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "번역 억제 인자"는 mRNA에 존재시 번역 활성을 낮추는 부위를 의미하고, 하나 이상의 염기로 구성될 수 있다. 특정 부위, 즉, 염기 또는 염기 서열의 존재시 해당 mRNA의 번역 활성이 낮아지고, 그 부위의 제거 시 번역 활성이 높아지는 경우, 번역 억제 인자로 작용하는 것으로 확인할 수 있다. 번역 억제 인자를 포함하지 않는 mRNA의 이소폼이 원하는 최종 산물의 생성을 가져오는 생산적 이소폼이고, 반면에, 번역 억제 인자를 포함하여, 번역에 의한 최종 산물의 생성을 감소시키는 mRNA의 이소폼은 비생산적 이소폼이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리솜"은 번역을 위해 mRNA에 복수 개의 리보솜이 결합된 구조를 의미하며, mRNA 당 결합된 리보솜의 개수는 번역 활성을 나타낸다. 리보솜의 개수가 많을 수록 번역 활성이 높다는 것을 의미한다. 세포나 개체의 시료로부터 번역 활성을 파악하기 위해 폴리솜 프로파일을 조사하고, 그로부터 번역 활성의 정도 및 번역 활성에 영향을 미치는 부위나 인자 등을 파악할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 선별된 번역 억제 인자 또는 번역 촉진 인자는 표적 유전자의 발현량을 조절하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 유전자의 발현을 증가시키기 위해서, 상기 번역 억제 인자를 제거하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 설계될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해서, 상기 번역 억제 인자를 포함하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 설계될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 유전자의 발현을 증가시키기 위해서, 상기 번역 촉진 인자를 포함하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 설계될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해서, 상기 번역 촉진 인자를 제외하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 설계될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 UBE3A의 생산적 이소폼을 증가시켜 UBE3A의 발현을 증가시킬 수 있고, 그에 의해 UBE3A의 비정상적 수준 및/또는 활성과 관련된 질환, 예를 들면, 안젤만 증후군의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리솜 프로필에 근거한 번역 억제 인자 및/또는 번역 촉진 인자를 스크리닝하는 방법은 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 표적 부위 및 그에 대한 올리고뉴클레오티드의 설계에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 번역 억제 인자를 포함한 5'-비번역 부위(5'-untranslated region: 5'-UTR)의 ASO-매개 엑손 스킵을 통해 유전자 발현을 증대시키는 전략을 보여주는 개략도이다. A는 메신저 RNA(mRNA)에 존재하는 5'비번역 부위(5'-UTR)의 위치를 나타내고, B는 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense Oligonucleotide: ASO)를 사용하여 선택적으로 스플라이싱을 조절함으로써 번역 억제 인자(translation inhibitory elements)를 포함하는 엑손을 갖는 비생산적 이소폼(unproductive isoform)의 생성을 감소시키고, 동시에 해당 엑손을 포함하지 않는 생산적 이소폼(productive isoform)의 생성을 증가시켜, 궁극적으로 단백질 발현양을 증가시키는 전략을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역 발굴을 위한 HEK293T 폴리솜 프로필 데이터 분석을 보여준다. HEK293T 세포내에 존재하는 mRNA들을 결합된 리보솜 개수(번역 효율)에 따라 분리하고, 분리된 각 프랙션(fraction)에 대해서 RNA-seq을 수행함으로 얻어진 폴리솜 프로필 데이터(GEO accession number: GSE69352)로부터, UBE3A 5'비번역 부위 내에 존재하는 엑손 2개(e1, e2)가 포함되는 방향으로 스플라이싱되면, 번역 효율이 감소된다는 것을 확인함으로써 해당 부위에 번역 억제 인자가 있다는 것을 규명하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역 발굴을 위한 인간 뉴런 폴리솜 프로필 데이터(GEO accession number: GSE100007) 분석을 보여준다. UBE3A 5'비번역 부위 내에 존재하는 엑손 2개(e1, e2)가 포함되어 스플라이싱되면 UBE3A 유전자의 번역 효율이 감소된다는 것이 배양된 인간 신경 세포에서도 확인되었다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역의 검증을 위해 번역 효율에 따라 분류된 생산적 이소폼과 비생산적 이소폼의 비율을 측정한 결과를 보여준다. 비생산적 이소폼은 번역 억제 인자를 가진 엑손 2개가 포함되어, 낮은 번역 효율을 초래하는 mRNA의 이소폼을 의미하고, 생산적 이소폼은 번역 억제 활성을 갖는 엑손 2개가 제외되도록 스플라이싱되는 mRNA의 이소폼을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역의 인간의 각 조직에서의 발현 정도를 보여준다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역에 대한 ASO 전략의 모식도를 보여준다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역 중 하나인 엑손 e2와 그 주변에 설계된 21개의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 위치를 보여준다. 도 7에 제시된 서열은 hg38 기준으로 chr15:25,407,025-25,407,296에 해당하며, 마이너스 가닥의 방향으로 표시되어 있다. 직사각형 박스로 구획된 영역은 엑손 e2에 해당하며, 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화살표 모양의 박스로로 표시된다.
도 8a 및 8b은 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역 중 하나인 엑손 e2와 그 주변에 설계된 ASO들의 스크리닝 결과를 보여준다. 도 8a는 RT-PCR의 결과를 보여주고, 도 8b는 RT-PCR 결과로부터 전체 이소폼에 대한 비생산적 이소폼 비율을 Mock에 대비하여 표시한다. Mock은 ASO를 주입하지 않고 리포펙타민(lipofectamine) LTX만 처리한 조건이다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역을 구성하는 이소폼들의 상대적 발현 정도를 확인하기 위한 RT-PCR용 프라이머의 위치 및 서열을 보여준다.
도 10은 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역에 대한 ASO의 최적화 설계를 보여준다. 1차 스크리닝에서 가장 효능이 좋았던 a405, a406(화살표 모양의 박스) 주변으로 20개의 ASO들(음영이 있는 화살표 모양의 박스)을 추가로 설계하였다. 도 10에 제시된 서열은 hg38 기준으로 chr15:25,407,064-25,407,284에 해당하며, 마이너스 가닥의 방향으로 표시되어 있다. 설계된 ASO의 표적 엑손인 e2 엑손 영역(chr15:25,407,067-25,407,262, hg38, 마이너스 가닥, 196 nt)은 직사각형 박스로 표시되어 있다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역에 대한 최적화 설계된 ASO의 스크리닝 결과를 보여준다. 도 11a는 RT-PCR의 결과를 보여주고, 도 11b는 RT-PCR 결과로부터 전체 이소폼에 대한 비생산적 이소폼 비율을 Mock에 대비하여 표시한다. Mock은 ASO를 주입하지 않고 리포펙타민(lipofectamine) LTX만 처리한 조건이다.
도 12a 및 12b는 본 발명의 일 구체예에 따른 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역에 대한 ASO에 의한 K562 세포주에서 UBE3A 단백질 발현 변화를 보여준다. 도 12a는 웨스턴 블랏 분석의 결과이고, 도 12b는 도 12a의 결과에서 UBE3A 발현 값을 b-actin과 GAPDH 발현 값으로 각각 정규화한 후, ASO를 처리하지 않은 조건(Mock)에 대한 배수 변화를 표시한다.
도 13은 본 발명의 일 구체예에 따른 ASO인 a406이 K562 세포주에서 UBE3A mRNA 이소폼 발현에 미치는 변화를 RNA-seq으로 분석한 결과를 보여준다.
도 14는 본 발명의 일 구체예에 따른 ASO 스크리닝 평가에 활용된 뇌-유사모델들(D160 대뇌 오가노이드, K562 세포주, D40 인간 뉴런 세포)과 인간 뇌 조직(인간 전체 뇌 조직, 인간 대뇌피질 조직) 간의 UBE3A 이소폼 발현 유사성을 RT-PCR로 평가한 결과를 보여준다.
도 15는 본 발명의 일 구체예에 따른 ASO가 UBE3A 이소폼 발현 패턴 변화에 미치는 효과를 평가하기 위해 수행된 UBE3A 이소폼 특이적 RT-qPCR에서 사용된 프라이머 및 프로브의 위치 및 서열을 보여준다.
도 16a 및 16b는 인간 대뇌 오가노이드에서 본 발명의 일 구체예에 따른 a406의 용량 의존적 UBE3A 스플라이싱 변화 효과(1주)를 보여준다. 도 16a는 RT-PCR 결과를 보여주고, 도 16b는 UBE3A 이소폼 특이적 RT-qPCR 결과에 대해, GAPDH mRNA 대비 UBE3A 각 이소폼들의 발현량을 ASO를 처리하지 않은 조건(Mock)에 대한 배수 변화값으로 표시한다.
도 17a 및 17b는 인간 대뇌 오가노이드에서 본 발명의 일 구체예에 따른 a406의 용량 의존적 UBE3A 스플라이싱 변화 효과(2주)를 보여준다. 도 17a는 RT-PCR 및 qRT-PCR의 결과를 보여주고, 도 17b는 UBE3A 이소폼 특이적 RT-qPCR 결과에 대해, GAPDH mRNA 대비 UBE3A 각 이소폼들의 발현량을 ASO를 처리하지 않은 조건(Mock)에 대한 배수 변화값으로 표시한다.
도 18a 및 18b는 인간 대뇌 오가노이드에서 본 발명의 일 구체예에 따른 a406의 용량 의존적 UBE3A 단백질 발현 증가(2주)를 보여준다. 도 18a는 UBE3A 단백질 및 GAPDH 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 측정한 결과이고, 도 18b는 도 18a의 데이터에서 GAPDH 대비 UBE3A 단백질 발현양을 ASO를 처리하지 않은 그룹(0 μM)에 대한 배수 변화 값으로 표시한다.
도 19a 및 19b는 인간 대뇌 오가노이드에서 본 발명의 일 구체예에 따른 a748의 용량 의존적 UBE3A 스플라이싱 변화 효과(2주)를 보여준다. 도 19a는 RT-PCR 결과를 보여주고, 도 19b는 UBE3A 이소폼 특이적 RT-qPCR 결과에 대해, GAPDH mRNA 대비 UBE3A 각 이소폼들의 발현량을 ASO를 처리하지 않은 조건(Mock)에 대한 배수 변화값으로 표시한다.
도 20은 본 발명의 일 구체예에 따른 ASO인 a748이 대뇌 오가노이드에서 UBE3A mRNA 이소폼 발현에 미치는 변화를 RNA-seq으로 분석한 결과를 보여준다.
도 21a, 21b, 및 21c는 인간 대뇌 오가노이드에서 본 발명의 일 구체예에 따른 a748이 UBE3A 단백질 발현에 미치는 용량 의존적 증가 효과(2주)를 보여준다. 도 21a는 UBE3A 단백질 및 GAPDH 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 측정한 결과이며, 도 21b는 해당 데이터에서 a748 처리에 따른 GAPDH 대비 UBE3A 단백질 발현량을 ASO를 처리하지 않은 조건(0 μM)에 대한 배수 변화로 나타낸다. 도 21c는 도 21b의 데이터를 바탕으로, a748 처리 그룹의 GAPDH 대비 UBE3A 단백질 발현 변화를 막대 그래프로 통합하여 시각적으로 보여준다.
도 22는 본 발명의 일 구체예에 따른 ASO의 독성 평가 결과를 보여준다. 도 22는 대조군과 실험군의 ASO 및 투여량과 ASO 투여 7일 후 생존율([생존 마리 수]/[ASO 독성 시험에 사용된 총 마리 수])을 나타낸다.
도 23a 및 23b는 안젤만 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 본 발명의 일 구체예에 따른 ASO(a406, a748)가 UBE3A 단백질 발현에 미치는 효과를 보여준다. 도 23a는 UBE3A 단백질 및 GAPDH 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 측정한 결과이며, 도 23b는 ASO(a406, a748) 처리군의 GAPDH 대비 UBE3A 단백질 발현 변화를 막대 그래프로 통합하여 ASO를 처리하지 않은 그룹(0 μM)에 대한 배수 변화로 나타낸다.
도 24는 본 발명의 일 구체예에 따른 ASO인 a748이 안젤만 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 UBE3A mRNA 이소폼 발현에 미치는 변화를 RNA-seq으로 분석한 결과를 보여준다.
본 발명은 첨부되는 도면과 함께 하기에 상세하게 기재되는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 실시예에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 것이며, 본 실시예는 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구범위에 의해 정의된다.
실시예 1. UBE3A 5'-비번역 부위내 표적 영역의 발굴
1.1. HEK293T 폴리솜 프로필 데이터 분석(polysome profiling data re-analysis)을 통한 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역(target region) 발굴
HEK293T 세포 내에 존재하는 mRNA들을 결합된 리보솜 개수(번역 효율)에 따라 분리하고, 각 분획(fraction)에 대해 RNA-seq을 수행하여 얻은 폴리솜 프로필 데이터(GEO accession number: GSE69352)를 분석했다. 분석 결과, 번역 효율이 높은 이소폼은 다수의 리보솜에 결합된 분획(high polysome)에서 많이 검출된 반면, 번역 효율이 낮은 이소폼은 적은 수의 리보솜(low polysome)에 결합된 분획에서 주로 발견되었다. 폴리솜 프로필 데이터로부터 UBE3A 유전자(gene ID: 7337, RefSeq accession number: NM_130839.5)의 번역 활성에 유의하게 영향을 미치는 UBE3A 유전자의 5'비번역 부위 내 표적 영역을 확인했다. 도 2에 폴리솜 프로필 데이터가 도시된다. 폴리솜 프로필 데이터는 UBE3A 5'비번역 부위 내에 존재하는 엑손 2개(e1,e2)가 포함되는 방향으로 스플라이싱이 되면, 번역 효율이 감소되는 것을 보여주어, 해당 부위에 번역 억제 인자가 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 이 데이터는 UBE3A 표적 영역의 두 엑손(e1, e2)이 동시에 포함되고 동시에 불포함되는 패턴을 보여주었고, 이로부터 mRNA에서 두 엑손의 존재가 상호 연동될 수 있다는 것을 확인하였다.
1.2. 인간 뉴런 폴리솜 데이터 분석을 통한 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역 발굴
HEK293T 세포에서 확인된 데이터를 검증하기 위해 인간 뉴런 폴리솜 데이터를 이용하여 UBE3A의 발현 증강을 유도할 수 있는 표적 영역을 확인하였다.
50일 동안 배양된 인간 뉴런 세포에서 mRNA들을 리보솜 결합 수(번역 효율)에 따라 분리한 각 분획에 대해서 RNA-seq을 수행하여 얻어진 폴리솜 프로필 데이터(GEO accession number: GSE100007)를 분석하였다. 분석 결과, 번역 효율이 높은 이소폼들은 다수의 리보솜이 결합된 분획(high polysome)에서 주로 분포하였으며, 반면에 번역 효율이 낮은 이소폼들은 리보솜이 적게 결합된 분획(low polysome)에서 더 많이 발견되었다. 도 3에 폴리솜 프로필 데이터가 도시된다. HEK293T 세포에서와 같이, UBE3A 유전자의 5' 비번역 부위 내에 존재하는 엑손 2개(e1, e2)가 포함되어 스플라이싱 되면 번역 효율이 감소되는 것이 확인되어, 이들이 UBE3A의 번역에서 번역 억제 인자로 작용한다는 것을 보여주었다.
또한, 50일 동안 배양된 인간 뉴런 세포의 폴리솜 프로필 데이터로부터 Low 폴리솜(polysome)과 High 폴리솜(polysome)에서 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역을 포함하거나 포함하지 않은 이소폼들의 상대적 발현 수준을 정량화하였다. 이를 위해 IGV(Integrative Genomics Viewer) browser의 Sashimi plot을 사용하여 Low 폴리솜과 High 폴리솜 데이터를 시각화하고, 표적 영역의 접합부(junction) 수를 확인하였다. 이를 바탕으로 해당 영역에서 발생한 스플라이싱 이벤트의 수를 계산한 후, 표적 영역을 포함하는 이소폼과 포함하지 않는 이소폼 간의 상대적 발현 비율을 산출하였다. 도 4에 그 결과가 도시된다. mRNA당 리보솜의 개수가 2 내지 4개인 경우, 낮은 번역 효율을 갖는 것으로 분류하고, 리보솜 개수가 5개 이상인 경우 높은 번역 효율을 갖는 것으로 분류하였다. 낮은 번역 효율을 갖는 Low 폴리솜의 경우, 비생산적 이소폼, 즉, 번역 억제 인자로 확인된 엑손 e1 및/또는 e2가 포함된 이소폼이 엑손 e1 및 e2를 포함하지 않는 생산적 이소폼보다 1.8배 많았고, 높은 번역 효율을 갖는 High 폴리솜의 경우, 생산적 이소폼이 비생산적 이소폼보다 1.9배 많은 것으로 확인하였다. 결과적으로 ASO의 표적 영역을 포함하지 않는 UBE3A 이소폼 형태가 High 폴리솜 분획에서 많이 존재하고 Low 폴리솜 분획에서는 상대적으로 적게 존재하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 엑손 e1 및/또는 e2가 스플라이싱에 의해 mRNA에 포함되면 번역 억제 인자로 작용한다는 것을 보여준다.
1.3. 뇌 조직에서 표적 영역의 발현 정도
GTEx RNA-seq 데이터 세트를 활용하여, 인간의 각 조직에서 스플라이싱 후 UBE3A 5'비번역 부위의 표적 영역이 포함되는 정도를 확인했다. 도 5에 그 결과가 도시된다. 다른 조직에 비해 뇌 조직에서 UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역이 포함된 mRNA가 많은 것을 확인하였다.
폴리솜 프로필 데이터로부터 UBE3A의 5' 비번역 부위 내에 번역 억제 인자가 포함되고, 그에 의해 UBE3A의 번역 활성에 영향을 미친다는 것을 확인하고, UBE3A의 번역 활성을 높이기 위해 번역 억제 인자를 표적으로 하는 ASO를 이용하여 UBE3A의 해당 부위를 선택적으로 불포함시키는 전략을 수립했다. 도 6에 그 전략의 개략도가 도시된다.
실시예 2. 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 설계
실시예 1에서 확인된 UBE3A 유전자의 발현 증강을 유도하기 위한, UBE3A 프리-mRNA의 5'-UTR에 존재하는 번역 억제 부위를 표적화하는 ASO를 설계하였다.
2.1. 안티센스 올리고뉴클레오티드 설계
표적 엑손 중 하나인 e2 엑손(196 nt, 직사각형 박스로 표시: 서열번호 99) 주변으로 21개의 ASO들을 설계하였다. 도 7은 e2 엑손과 그 주변을 표적 영역으로 설계된 ASO의 위치를 보여준다. e2 엑손과 주변을 포함하는 타겟 영역으로 hg38, chr15:25,407,025-25,407,296 부위가 마이너스 가닥 방향으로 표시되어 있다.
하기 표 1에 설계된 ASO의 표적 서열 및 ASO 서열의 서열 정보가 표시된다.
Figure PCTKR2024017580-appb-img-000001
설계된 ASO의 모든 뉴클레오시드들에는 2'MOE 변형이 사용되었고, 모든 뉴클레오시드간 결합은 PS(phosphorothioate)였고, 모든 C 염기 대신 5'-메틸-C 염기가 사용되었다.
설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 UBE3A 프리-mRNA의 스플라이싱에 대한 효과를 확인하기 위해 RT-PCR용 프라이머를 설계하였다.
정방향 (F) 프라이머 5' - ACCCTGATGTCACCGAATGG (서열번호 100)
역방향 (R) 프라이머 5' - CGCTTCATTCGGCTAGCT (서열번호 101)
도 9에 표적 부위 및 프라이머 서열이 도시된다.
UBE3A 5'비번역 부위 내 표적 영역을 구성하는 이소폼들의 상대적 발현의 정도를 RT-PCR로 확인하였다.
2.2. RT-PCR에 의한 ASO 스크리닝
설계된 21개의 후보 ASO와 2개의 대조 ASO(control ASO, AATGTTAGTGCTTGTTGAGGGC; NTC, TTAGTTTAATCACGCTCG)를 K562 세포주에 각각 리포펙타민 LTX를 사용하여 최종농도 기준 200 nM로 주입하였다. ASO 주입 24시간 후 추출한 RNA로 RT-PCR을 수행하여 각 후보 ASO에 의한 UBE3A의 생산적 이소폼과 비생산적 이소폼의 상대적 발현양의 변화를 확인하였다. 도 8a 및 8b에 그 결과가 도시된다. 도 8a는 RT-PCR의 결과를 도시하고, 도 8b는 RT-PCR 결과로부터 Mock 대비 비생산적 이소폼 비율을 보여준다. Mock은 ASO를 주입하지 않고 리포펙타민 LTX만 처리한 것이다. 대조 ASO 처리 및 Mock 대비, 21개의 후보 ASO들 중 비생산적 이소폼을 감소시키는 ASO는 a401, a403, a404, a405, a406, a407, a409, a411, a413, a414, a415, 및 a416이었고, 이들 중 가장 많이 감소시키는 ASO는 a405(서열번호 33) 및 a406(서열번호 34)이었다.
실시예 3. ASO 최적화
3.1. 최적화 설계
실시예 2의 ASO 스크리닝에서 UBE3A의 비생산적 이소폼을 감소시키는 효능이 가장 우수했던 a405(서열번호 33) 및 a406(서열번호 34)의 표적 영역 주변으로 20개의 ASO를 추가로 설계했다. 도 10에 직사각형 박스로 표시된 표적 엑손 e2에 대해 배열된 a405와 a406(음영이 없는 화살표 모양의 박스) 및 추가로 설계된 20개의 ASO들(음영이 있는 화살표 모양의 박스)이 도시된다.
하기 표 2에 UBE3A의 비생산적 이소폼을 감소시키는 효능에 의해 선별된 ASO의 표적 부위를 중심으로 설계된 ASO의 표적 서열 및 ASO 서열이 표시된다.
Figure PCTKR2024017580-appb-img-000002
설계된 ASO의 모든 뉴클레오시드들에는 2'MOE 변형이 사용되었고, 모든 뉴클레오시드간 결합은 PS였고, 모든 C 염기 대신 5'-메틸-C 염기가 사용되었다.
3.2. RT-PCR에 사용한 ASO 최적화 스크리닝
최적화 설계를 통해 도출한 20개의 후보 ASO들과 1개의 대조 ASO(Control ASO, AATGTTAGTGCTTGTTGAGGGC)를 K562 세포주에 각각 리포펙타민 LTX를 사용하여 최종농도 기준 200 nM로 주입하고, ASO 주입 24시간 후 추출한 RNA로 RT-PCR을 수행하여 각 후보 ASO에 의한 UBE3A의 생산적 이소폼과 비생산적 이소폼의 상대적 발현양의 변화를 확인하였다. 도 11a 및 11b에 그 결과가 도시된다. 도 11a는 RT-PCR의 결과를 도시하고, 도 11b는 RT-PCR 결과로부터 Mock 대비 비생산적 이소폼 비율을 보여준다. Mock은 ASO를 주입하지 않고 리포펙타민 LTX만 처리한 것이다. UBE3A의 비생산적 이소폼을 감소시키는 효능을 갖는 것으로 선별된 ASO의 표적 영역 주변을 표적으로 최적화 설계된 ASO는 대조 ASO 및 Mock 대비 모두 유의하게 비생산적 이소폼을 감소시켰고, a736, a740, a747, a748은 a405와 유사하거나, a406보다 우수한 효능을 보였다.
3.3. ASO에 의한 UBE3A 단백질 발현 변화
UBE3A 5'-UTR 내 표적 영역에 대해 설계된 ASO에 의한 UBE3A 단백질 발현에 대한 효과를 K562 세포주에서 확인하였다.
(1) K562 세포주에서 ASO에 의한 UBSE3A 단백질 발현량 변화
K562 세포주에 후보 ASO(a406, a736, a747, 및 a748) 및 대조 ASO(a29)를 전기천공 방법을 이용하여 최종 농도 기준 200nM씩 주입하고, ASO 주입 48시간 후에 웨스턴 블랏(Western Blot analysis)을 통해 UBE3A, b-actin, GAPDH 단백질 발현을 측정하였다. UBE3A에 대한 항체, b-액틴(b-actin)에 대한 항체, 및 GAPDH에 대한 항체는 각각 10344-1-AP(Proteintech; 1:1000 희석), A5316(Sigma-Aldrich; 1:5000 희석), 및 ab8245(abcam; 1:5000 희석)이었다. 그 결과가 도 12a 및 12b에 도시된다. 도 12a는 웨스턴 블랏 분석의 결과이고, 도 12b는 도 12a의 데이터에서 각 조건에 대해서 UBE3A 발현 값을 b-액틴과 GAPDH 발현 값으로 각각 정규화한 후, ASO를 처리하지 않은 조건(Mock)에 대한 배수 변화를 표시한다.
UBE3A의 표적 영역에 대해 설계되고 선별된 후보 ASO는 K562 세포주에서 모무 Mock 대비 UBE3A의 발현을 증가시켰고, a406이 가장 큰 증가를 가져왔다.
(2) K562 세포주에서 a406에 의한 UBE3A 이소폼 변화
RNA-seq을 통해 K562 세포주에서 a406에 의한 UBE3A 이소폼의 변화를 확인하였다. 구체적으로, a406(선도 ASO)을 K562 세포주에 전기천공 방법을 이용하여 최종 농도 기준 200 nM로 주입한 후, 주입 24시간 후에 RNA를 추출하여 RNA-seq을 수행하였다. 도 13에 그 결과가 도시된다. ASO를 주입하지 않은 조건(Mock)에 비하여 a406을 주입했을 때 표적 영역의 엑손들(e1, e2)이 포함된 이소폼 발현이 크게 감소한다는 것을 확인했다.
실시예 4. 인간 대뇌 오가노이드에서 ASO에 의한 UBE3A 발현에 대한 효과
- 뇌-유사 모델의 평가
ASO의 효능을 평가하기 위해 사용할 뇌-유사 모델을 선택하기 위해, D160 대뇌 오가노이드(H9 Human Embryonic Stem Cell(hESC) 유래, Next&Bio), K562 세포주, D40 인간 뉴런 세포와 인간 뇌 조직(전체 뇌 조직, 인간 대뇌 피질 조직)의 UBE3A 이소폼 발현 패턴을 RT-PCR로 비교하였다. 그 결과가 도 14에 도시된다. K562 세포주나 D40 인간 뉴런 세포의 경우 비생산적 이소폼의 비중이 뇌 조직에 비해 크게 낮아서 뇌 조직에서의 ASO의 효능을 평가하는데 적절하지 않은 것으로 확인하였다. 결과적으로 대뇌 오가노이드 모델이 인간 뇌 조직에서의 UBE3A 이소폼의 발현 패턴을 가장 잘 모사하는 것으로 확인하였다.
ASO의 효능을 평가하기 위해 대뇌 오가노이드를 뇌-유사 모델로 선정하였다.
- RT-qPCR에 사용된 프라이머 및 프로브 정보
UBE3A 프리-mRNA 내 5'-UTR을 표적으로 하는 ASO의 UBE3A 스플라이싱 효과를 RT-qPCR 분석으로 확인하기 위해 각 이소폼에 대한 프라이머 및 프로브를 설계하였다. UBE3A 비생산적 이소폼, UBE3A 생산적 이소폼, UBE3A 모든 이소폼, 및 GAPDH를 검출하기 위해 설계된 표적 부위 및 그에 대한 프라이머 세트와 프로브가 도 15에 도시된다.
4.1. 인간 대뇌 오가노이드에서 a406의 용량 의존적 UBE3A 스플라이싱 변화 효과
인간 대뇌 오가노이드에서 a406의 용량 의존적 UBE3A 스플라이싱 변화 효과 (1주)
D195 대뇌 오가노이드에 자연적 흡수 방법(gymnosis)으로 1주일간 3일에 1번씩 최종 농도 기준 표시된 용량(0, 10 μM 및 20 μM)으로 a406을 주입한 후 RT-PCR 및 RT-qPCR을 수행하였다. RT-PCR에서는 각 샘플에서 추출한 RNA를 cDNA로 역전사한 뒤, 표적 영역 내 이소폼들의 발현 정도를 측정하였다. RT-qPCR에서는 동일한 cDNA 샘플을 사용하여 Taqman-probe 기반의 이소폼 특이적 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 이를 통해 각 이소폼의 발현을 정량적으로 분석하였다. 도 16a 및 16b는 각각 RT-PCR 및 RT-qPCR의 결과를 보여준다. 도 16b는 각 조건에서 GAPDH mRNA 대비 UBE3A mRNA의 값을 구하고, ASO 비처리 조건에 대한 배수 변화값을 도시한다. 에러바는 3번의 생물학적 반복 실험 결과에 대한 기하 평균의 95% 신뢰구간을 의미한다. RT-PCR을 통하여 a406을 처리함에 따라 용량 의존적으로 UBE3A 비생산적 이소폼들의 발현이 감소하고 생산적 이소폼의 발현이 증가했다는 것을 확인했다. 또한, 이소폼-특이적 RT-qPCR을 통하여 비생산적 이소폼(e1, e2 엑손을 포함)이 a406 용량 의존적으로 감소하고, 생산적 이소폼이 a406 용량 의존적으로 증가하는 반면 UBE3A 총 mRNA 양은 변하지 않는다는 것을 확인했다. 이러한 결과는 ASO에 의해 생산적 이소폼의 생성을 증가시키도록 스플라이싱이 유도되었다는 것을 보여준다.
인간 대뇌 오가노이드에서 a406의 용량 의존적 UBE3A 스플라이싱 변화 효과 (2주)
전술된 바와 동일하게 D195 대뇌 오가노이드에 자연적 흡수 방법으로 2주일간 3일에 1번씩 최종 농도 기준 표시된 용량(0, 10 μM 및 20 μM)으로 a406 또는 대조군 ASO(Control ASO, AATGTTAGTGCTTGTTGAGGGC)를 주입한 후 RT-PCR 및 RT-qPCR을 수행하였다. 그 결과가 도 17a 및 17b에 도시된다. 1주 처리 시의 결과와 동일하게, RT-PCR을 통하여 a406을 처리함에 따라 용량 의존적으로 UBE3A 비생산적 이소폼들의 발현이 감소하고 생산적 이소폼의 발현이 증가한다는 것을 확인하였고, 이소폼-특이적 RT-qPCR을 통하여 비생산적 이소폼(e1, e2 엑손을 포함)이 a406 용량 의존적으로 감소하고, 생산적 이소폼이 a406 용량 의존적으로 증가하는 반면 UBE3A 총 mRNA 양은 변하지 않는다는 것을 확인하였다.
4.2. 인간 대뇌 오가노이드에서 a406의 용량 의존적 UBE3A 단백질 발현 증가 효과 (2주)
인간 대뇌 오가노이드에서 a406의 처리에 따른 UBE3A 단백질 발현에 대한 효과를 확인하였다. D156 대뇌 오가노이드에 자연적 흡수 방법으로 2주일간 3일에 1번씩, 최종 농도 기준 표시된 용량(0, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM)으로 a406을 주입하였다. 그 후, UBE3A 및 GAPDH에 대한 항체, 10344-1-AP(Proteintech; 1:50 희석) 및 ab8245(abcam; 1:1500 희석)를 이용하여 모세관 웨스턴 블랏(Jess Simple Western System)으로 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과가 도 18a 및 18b에 도시된다. a406의 2주 처리에 따라 용량 의존적으로 UBE3A 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
4.3. 인간 대뇌 오가노이드에서 a748의 용량 의존적 UBE3A 스플라이싱 변화 효과 (2주)
D170 대뇌 오가노이드에 자연적 흡수 방법으로 2주일간 3일에 1번씩 최종 농도 기준 표시된 용량(0, 20 μM, 40 μM 및 80 μM)으로 a748을 주입한 후 RT-PCR 및 RT-qPCR을 수행하였다. 그 결과가 도 19a 및 19b에 도시된다. RT-PCR을 통하여 a748을 처리함에 따라 용량 의존적으로 UBE3A 비생산적 이소폼들의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 이소폼-특이적 RT-qPCR을 통하여 비생산적 이소폼(e1, e2 엑손을 포함)이 a748 용량 의존적으로 감소하고, 생산적 이소폼이 a748 용량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
4.4. 인간 대뇌 오가노이드에서 a748에 의한 UBE3A 이소폼 변화
RNA-seq을 통해 인간 대뇌 오가노이드에서 a748에 의한 UBE3A 이소폼의 변화를 확인하였다. 구체적으로, D170 대뇌 오가노이드에 a748을 자연 흡수 방식으로 2주간 3일에 1번씩 최종 농도 기준 40 μM으로 주입한 후 RNA를 추출하여 RNA-seq을 수행하였다. 도 20에 그 결과가 도시된다. 인간 대뇌 오가노이드에서 표적 영역의 엑손들(e1, e2) 중 e2 영역이 포함된 형태가 풍부하게 발현되고 있으며, e1 영역이 포함된 이소폼은 거의 발현되지 않는 것으로 나타났다. ASO를 주입하지 않은 조건(Mock)과 비교했을 때, a748을 처리한 조건에서 e2 영역을 포함하는 이소폼 발현이 크게 감소하는 것을 확인하였다.
4.5. 인간 대뇌 오가노이드에서 a748의 용량 의존적 UBE3A 단백질 발현 증가 효과 (2주)
인간 대뇌 오가노이드에서 a748의 처리에 따른 UBE3A 단백질 발현에 대한 효과를 확인하였다. D170 대뇌 오가노이드에 자연적 흡수 방법으로 2주일간 3일에 1번씩 최종 농도 기준 표시된 용량(0, 20 μM, 40 μM, 80 μM)으로 a748을 주입하였다. 그 후, UBE3A 및 GAPDH에 대한 항체, 10344-1-AP(Proteintech; 1:50 희석) 및 ab8245(abcam; 1:1500 희석)를 이용하여 모세관 웨스턴 블랏(Jess Simple Western System)을 수행하여 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과가 도 21a, 21b 및 21c에 도시된다. a748의 2주의 처리에 따라 용량 의존적으로 UBE3A 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5. ASO 독성 평가
마우스에서 UBE3A 프리-mRNA의 5'-UTR을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하여 생체내 독성을 평가하였다.
하기 표 3에 독성 평가를 위해 사용된 ASO가 표시된다.
Figure PCTKR2024017580-appb-img-000003
a28 및 a30의 모든 뉴클레오시드에는 2'MOE 변형이 사용되었고, 모든 뉴클레오시드간 결합은 PS였고, 모든 C 염기 대신 5'-메틸-C 염기가 사용되었다. a386, T*GCAG*5*8*7*8*5*7*7*7*8*8*TCTC*G; a639, A*GTAA*7*7*8*6*8*7*8*8*5*8*TCTCC (A=2'MOE-A, C=2'MOE-5'-methyl-C, G=2'MOE-G, T=2'MOE-T, 5=DNA-A, 6=DNA-5'-methyl-C, 7=DNA-G, 8=DNA-T, *=PS). a640, A*G*A*5*8*7*7*6*5*6*5*8*6*8*C*T*T*G (A=LNA-A, C=LNA-5'-methyl-C, G=LNA-G, T=LNA-T, 5=DNA-A, 6=DNA-C, 7=DNA-G, 8=DNA-T, *=PS).
생후 2일령(P2) 쥐에서 UBE3A 후보 ASO 독성 평가
생후 2일령 쥐(종명:C57BL/6N)의 좌측 뇌에 PBS(0 ㎍) 또는 ASO(30 ㎍ 또는 40 ㎍)를 각각 2 ㎕씩 뇌실내 주사(Introcerebroventricular(ICV) injection)로 투여한 후, 7일간 생존 여부를 매일 관찰하여 투여한 ASO의 독성을 평가하였다. 도 22에 그 결과가 도시된다. 도 22는 P2 마우스에 투여한 ASO의 정보 및 [생존 마리 수]/[ASO 독성 시험에 사용된 총 마리 수]로 계산된 ASO 투여 7일 후 생존율을 보여준다.
UBE3A 프리-mRNA의 5'-UTR 중 번역 억제 부위를 표적으로 설계되고 선별된 ASO, a406, a736, 및 a748은 독성 대조군으로 포함된 a386 및 a28에 비해 낮은 세포 독성을 갖는 것으로 확인하였다.
실시예 6. 안젤만 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 ASO에 의한 UBE3A 발현에 대한 효과
6.1. 안젤만 증후군 환자 유래 오가노이드에서 선도 ASO를 통한 UBE3A 단백질 발현 증가 효과(3주 및 4주)
안젤만 증후군 환자 유래 오가노이드에서 선도 ASO(a406, a748) 처리에 따른 UBE3A 단백질 발현에 대한 효과를 확인하였다. 구체적으로, 안젤만 증후군 환자(NM_130839.5(UBE3A):c.2289G>A) 유래 역분화 줄기세포를 대뇌 오가노이드로 분화하여 120일간 배양한 후, 자연적 흡수 방법으로 3주 또는 4주 동안 3일에 1번씩 최종 농도 기준 40 μM으로 a406 또는 a748을 주입하였다. 그 후, UBE3A 및 GAPDH에 대한 항체, 10344-1-AP(Proteintech; 1:50 dilution) 및 ab8245(abcam; 1:1500 dilution)를 이용하여 모세관 웨스턴 블랏(Jess Simple Western System)을 수행하여 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과가 도 23a 및 23b에 도시된다. 도 23a에서 웨스턴 블랏의 각 래인은 독립된 생물학적 반복 실험을 의미한다. 도 23b는 23a의 데이터를 선도 ASO 처리군의 GAPDH 대비 UBE3A 단백질 발현 변화를 막대 그래프로 정량화하여 나타낸 것으로, 선도 ASO 처리군에서 ASO 미처리군(Mock) 대비 UBE3A 단백질 발현이 약 1.2배 증가하는 것을 확인하였다.
6.2. 안젤만 증후군 환자 유래 오가노이드에서 a748에 의한 UBE3A 이소폼 변화
RNA-seq을 통해 안젤만 증후군 환자 유래 오가노이드에서 a748에 의한 UBE3A 이소폼의 변화를 확인하였다. 구체적으로, 안젤만 증후군 환자(NM_130839.5(UBE3A):c.2289G>A) 유래 역분화 줄기세포를 대뇌 오가노이드로 분화하여 157일간 배양한 후, a748을 자연 흡수 방식으로 2주간 3일에 한 번씩 최종 농도 기준 60 μM으로 주입한 후 RNA를 추출하여 RNA-seq을 수행하였다. 도 24에 그 결과가 도시된다. ASO를 주입하지 않은 조건(Mock)과 비교했을 때, a748을 처리한 조건에서 표적 영역의 엑손들(e1, e2)을 포함하는 이소폼의 발현이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.

Claims (19)

  1. 인간 UBE3A 유전자의 프리-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 13개 내지 40개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하고, UBE3A 프리-mRNA의 표적 부위에 적어도 13개의 연속된 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble base pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화를 통하여 결합하여 UBE3A의 발현을 증가시키고,
    상기 표적 부위는 서열번호 9 내지 11, 및 47 내지 66으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 부위는 서열번호 11, 51, 62, 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 부위는 서열번호 11 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 인간 UBE3A 유전자의 프리-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 13개 내지 40개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하고, UBE3A 프리-mRNA의 표적 서열의 핵염기들 중 80% 이상과 왓슨-크릭 염기쌍 A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍 G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화를 통하여 결합하여, UBE3A의 발현을 증가시키고,
    상기 표적 서열은 서열번호 9 내지 11, 및 47 내지 66으로 구성된 군으로부터 선택된 서열인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11, 51, 62, 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열인 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 서열인 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 당 모이어티, 화학적으로 변형된 염기, 및 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합 중 하나 이상의 변형을 포함하고,
    상기 화학적으로 변형된 당 모이어티는 2'-O-메틸, 2'-메톡시에톡시, 2'-O-A메톡시에틸(2'-MOE), 2'-디메틸아미노에톡시, 2'-디메틸아미노에톡시에톡시, 2'-플루오로, 2'-아세트아미드, 모르폴리노(morpholino), LNA (locked nucleic acid), 또는 c-ET(S-contrained-ethyl)로 변형된 당 모이어티 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 변형된 염기는 5-메틸-시토신, 5-플루오로시토신, 및 2-아미노퓨린 염기 중 하나 이상을 포함하며,
    화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합을 포함하는 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-MOE 변형을 갖는 뉴클레오시드로 구성되고, 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트이며, 모든 시토신(C) 염기는 5'-메틸-시토신인 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 (I) 내지 (IV)의 구조 중 하나이고:
    A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C*T*T*G*T 화학식 (I);
    A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C*T*T*G*T*A*T*C*T 화학식 (II);
    C*C*C*C*A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C 화학식 (III); 및
    G*T*A*C*C*C*C*A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C 화학식 (IV);
    식 중에서, A는 2'MOE-A, C는 2'MOE-5'-메틸-C, G는 2'MOE-G, T는 2'MOE-T, *는 PS(phosphorothioate), 2'MOE는 2'-O-메톡시에틸인 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 (I) 및 (IV)의 구조 중 하나이고:
    A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C*A*A*A*C*T*T*G*T 화학식 (I); 및
    G*T*A*C*C*C*C*A*A*G*A*T*T*G*C*T*T*C*C 화학식 (IV);
    식 중에서, A는 2'MOE-A, C는 2'MOE-5'-메틸-C, G는 2'MOE-G, T는 2'MOE-T, *는 PS(phosphorothioate), 2'MOE는 2'-O-메톡시에틸인 것인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, UBE3A의 비정상적인 수준 또는 활성과 관련된 질환의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 질환은 안젤만 증후군인 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포 내에서 발현시키는 바이러스를 포함하는, UBE3A의 발현 증강을 통한 치료 효과가 확인된 질환의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 질환은 안젤만 증후군인 것인 약학적 조성물.
  13. 선택적 스플라이싱(splicing)을 통해 조절되는 번역 억제 인자 또는 번역 촉진 인자를 가진 유전자를 스크리닝하는 방법으로서,
    인간 또는 동물 세포에 대한 폴리솜 프로필 데이터를 수득하는 단계,
    상기 폴리솜 프로필 데이터를 분석하여, 선택적 스플라이싱을 통해 조절되는 번역 촉진 인자 및/또는 번역 억제 인자를 선별하는 단계를 포함하고,
    상기 선별하는 단계는 존재 시에 mRNA에 결합된 리보솜의 개수를 증가시키는 부위는 번역 촉진 인자로 선별하고,
    존재 시에 mRNA에 결합된 리보솜의 개수를 감소시키는 부위는 번역 억제 인자로 선별하는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 인간 또는 동물 세포에 대한 폴리솜 프로필 데이터를 수득하는 단계는
    인간 또는 동물 세포로부터 용해물을 수득하고, 수크로오스 구배를 통해, mRNA에 결합된 리보솜 개수에 따라 mRNA를 분획으로 분리하는 단계, 및
    분리된 mRNA의 각 분획에 대해 RNA-seq을 수행하여 각 분획에 존재하는 mRNA를 파악하는 폴리솜 프로필 데이터를 생성하는 단계를 포함하거나,
    기 수행된 인간 또는 동물 세포에 대한 폴리솜 프로필 데이터를 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 선별된 번역 억제 인자 또는 번역 촉진 인자는 표적 유전자의 발현량을 조절하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적으로 이용되는 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 표적 유전자의 발현을 증가시키기 위해서, 상기 번역 억제 인자를 제거하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 설계되는 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해서, 상기 번역 억제 인자를 포함하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 설계되는 것인 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 표적 유전자의 발현을 증가시키기 위해서, 상기 번역 촉진 인자를 포함하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 설계되는 것인 방법.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해서, 상기 번역 촉진 인자를 제외하도록 스플라이싱을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 설계되는 것인 방법.
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