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WO2025100747A1 - 줄기세포 유래 엑토-리포좀 융합 나노입자 및 그의 용도 - Google Patents

줄기세포 유래 엑토-리포좀 융합 나노입자 및 그의 용도 Download PDF

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Publication number
WO2025100747A1
WO2025100747A1 PCT/KR2024/015123 KR2024015123W WO2025100747A1 WO 2025100747 A1 WO2025100747 A1 WO 2025100747A1 KR 2024015123 W KR2024015123 W KR 2024015123W WO 2025100747 A1 WO2025100747 A1 WO 2025100747A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
stem cells
derived
fusion
liposome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2024/015123
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
강동우
박준영
임수현
김근혜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ectosome Co ltd
Industry Academic Cooperation Foundation of Gachon University
Original Assignee
Ectosome Co ltd
Industry Academic Cooperation Foundation of Gachon University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ectosome Co ltd, Industry Academic Cooperation Foundation of Gachon University filed Critical Ectosome Co ltd
Publication of WO2025100747A1 publication Critical patent/WO2025100747A1/ko
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to novel ecto-liposome fusion nanoparticles, and more particularly, to stem cell-derived ecto-liposome fusion nanoparticles with enhanced targeting ability to tumor sites.
  • Ectosomes are vesicles of various sizes (diameter 0.1–1 mm) that bud off directly from the plasma membrane and are secreted into the extracellular space. Unlike living cells, ectosomes have phosphatidylserine, a phospholipid, on their surface. Although ectosomes are produced and secreted by direct budding of the cell membrane, the cargo components contained inside them are not identical to those of the parent cell and are known to differ depending on the state of the cell (Cocucci and Meldolesi, Curr. Biol . 21(23): R940-R940, 2011).
  • Ectosomes differ from exosomes, which are secreted outside the cell through the multivesicular body (MVB) pathway from endosomes, in terms of their production method and the substances contained inside, but their interaction in the extracellular space and with target cells is known to be similar to that of exosomes.
  • MVB multivesicular body
  • liposomes are spherical vesicle structures made of a lipid bilayer, composed of phospholipids, which can be manufactured artificially or found in cells, and since they have both hydrophobic and hydrophilic properties, they can selectively absorb substances from the surrounding environment through the membrane and increase in size.
  • Most liposomes are spherical or oval in shape, and since there is space inside the liposome, they are used as drug delivery vehicles to deliver drugs such as anticancer agents into the body.
  • Korean U.S. Patent Publication No. 2021-0063254 discloses a composition for adjuvant anticancer treatment containing a liposome composition and a drug delivery method using the same.
  • the present invention is intended to solve various problems including the above-mentioned problems, and aims to provide a novel stem cell-derived ecto-liposome fusion that exhibits superior targeting ability to a tumor site than conventional drug delivery vehicles having targeting ability.
  • these tasks are exemplary and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a fusion nanoparticle formed by fusing stem cell-derived ectosomes and liposomes is provided.
  • a drug delivery vehicle comprising the fusion nanoparticle as an active ingredient is provided.
  • a pharmaceutical composition comprising the drug delivery vehicle and an effective drug is provided.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer which comprises, as an active ingredient, a fused nanoparticle formed by fusing a stem cell-derived ectosome with a liposome loaded with an anticancer agent therein.
  • a method for producing a fusion nanoparticle having a targeting ability for tumor tissue comprises a step of mixing the above ectosome and liposome nanoparticles and fusing the ectosome and liposome through ultrasonic treatment.
  • a use for manufacturing a medicament for preventing and treating cancer wherein a fusion nanoparticle formed by fusing a stem cell-derived ectosome with a liposome loaded with an anticancer agent therein is used.
  • a method for treating cancer in a subject comprising administering to the subject a fused nanoparticle formed by fusing a therapeutically effective amount of stem cell-derived ectosome with a liposome having an anticancer agent loaded therein.
  • the stem cell-derived ecto-liposome fusion of the present invention exhibits enhanced targeting ability to a tumor site, which is a target disease, and thus can be utilized as a drug delivery vehicle that loads drugs such as anticancer agents and releases the drugs systemically or locally, and can be used as a therapeutic agent for treating intractable cancer or metastatic tumors.
  • a tumor site which is a target disease
  • drugs such as anticancer agents and releases the drugs systemically or locally
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • Figure 1 is a schematic diagram schematically illustrating a process for manufacturing ecto-liposome fusion nanoparticles in which ectosomes and liposomes derived from adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSCs) of the present invention are fused.
  • AD-MSCs adipose-derived mesenchymal stem cells
  • Figure 2 is a microscopic photograph showing the results of observing the fusion of ectosomes and liposomes using a transmission electron microscope (TEM) after the production of AD-MSC-derived ecto-liposome fusion nanoparticles of the present invention, and a graph showing the results of analyzing the same.
  • TEM transmission electron microscope
  • Figure 3 is a graph showing the results of analyzing the hydrodynamic sizes and electrical potentials of liposomes, AD-MSC-derived ectosomes, and ecto-liposome fusion nanoparticles.
  • Figure 4 is a graph showing the results of analyzing the size distribution of the ecto-liposome fusion nanoparticles of the present invention using nanoparticle tracking (NTA).
  • NTA nanoparticle tracking
  • Figure 5 is a gel photograph showing the results of confirming the fusion of liposomes, ectosomes, and ecto-liposomes using polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • Figure 6a is a schematic diagram schematically illustrating the principle of confirming the fusion of the ecto-liposome fusion nanoparticles of the present invention through FRET (fluorescence resonance energy transfer) analysis.
  • Figure 6b is a graph showing the results of analyzing the fluorescence intensity of the ecto-liposome fusion nanoparticle of the present invention.
  • DiI and DiD fluorescence were attached to the ectosome, and the analysis was performed using the FRET experimental method using a Victor 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) at an excitation wavelength of 549 nm and an excitation wavelength and emission wavelength of 665 nm for DiI fluorescence.
  • Figure 7 is a fluorescence microscope photograph showing the targeting ability of the ecto-liposome fusion nanoparticle of the present invention toward lung cancer cells (A549).
  • the uptake of liposomes dyed with a DiO fluorescent substance, ectosomes extracted from adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSCs) dyed with a DiI fluorescent substance, liposomes dyed with a DiO fluorescent substance, and ecto-liposome fusion nanoparticles dyed with a DiI fluorescent substance was visualized by fluorescence.
  • FIG. 8a is a fluorescence photograph confirming the targeting ability of the ecto-liposome fusion nanoparticle of the present invention.
  • the upper part is a fluorescence photograph observed using a brain tumor animal model. After brain cancer cells (U87MG) were injected into the brain of an experimental mouse, a xenograft tumor experimental animal model was prepared, and the tumor size of the animal was photographed using in vivo fluorescence imaging.
  • the lower part is a fluorescence photograph observing the distribution of the ecto-liposome fusion nanoparticle of the present invention in tumor tissue extracted from a brain tumor animal model. The distribution of the tumor signal (upper part) and the drug signal (lower part) of the ecto-liposome fusion nanoparticle for the brain tumor extracted from the experimental animal model were photographed using in vivo fluorescence imaging.
  • FIG. 8b is a fluorescence photograph confirming the targeting ability of the ecto-liposome fusion nanoparticle of the present invention.
  • the upper part is a fluorescence photograph observed using a lung tumor animal model. After lung cancer cells (A549) were injected into the lungs of an experimental mouse, a xenograft tumor experimental animal model was prepared, and the tumor size of the animal was photographed using in vivo fluorescence imaging.
  • the lower part is a fluorescence photograph observing the distribution of the ecto-liposome fusion nanoparticle of the present invention in tumor tissue extracted from a lung tumor animal model. The distribution of the tumor signal (upper part) and the drug signal (lower part) of the ecto-liposome fusion nanoparticle for the lung tumor extracted from the experimental animal model were photographed using in vivo fluorescence imaging.
  • ectosome refers to a nano-vesicle with a phospholipid membrane structure with a diameter of 100 to 500 nm that is produced by budding from the cell membrane (plasmamembrane), unlike 'exosomes' among extracellular vesicles.
  • liposome used in this document is a spherical or oval vesicle structure made of lipids. As a structure, molecules such as phospholipids have a hydrophobic part that dislikes water and a hydrophilic part that likes water. Liposomes can encapsulate drugs such as anticancer drugs inside, or reconstruct membrane proteins within the membrane like a biological membrane to reproduce various functions, so they are being developed as drug delivery vehicles for body delivery in the form of microcapsules.
  • drug delivery carrier used in this document refers to a material used to deliver a drug to a required lesion and maintain it for an appropriate period of time, and a method of effectively delivering a drug to a lesion using a drug delivery carrier is called a drug delivery system.
  • a fusion nanoparticle formed by fusing stem cell-derived ectosomes and liposomes is provided.
  • the stem cells may be embryonic stem cells, mesenchymal stem cells or induced pluripotent stem cells, and the mesenchymal stem cells may be bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, adipose-derived stem cells, dental pulp-derived stem cells or peripheral blood-derived stem cells.
  • the stem cell may be a stem cell educated as a lesion-derived cell, the lesion may be a tumor tissue, and the tumor tissue may be primary or metastatic.
  • the educated stem cell may be a stem cell cultured by contacting the culture medium in which the lesion-derived cell is cultured, and may have a size of 100 to 350 nm in diameter, and the ectosome and liposome may be prepared by mixing at a mass ratio of 1:20. Also, preferably, the ectosome and liposome may be prepared by mixing at a mass ratio of 1:10.
  • a drug delivery vehicle comprising the fusion nanoparticle as an active ingredient is provided.
  • a pharmaceutical composition comprising the drug delivery vehicle and an effective drug is provided.
  • the effective drug may be an anticancer agent.
  • the anticancer drugs include mechloethamine, chlorambucil, phenylalanine, mustard, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), streptozotocin, busulfan, thiotepa, cisplatin, carboplatin, doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone, plicamycin, mitomycin, C bleomycin, vincristine, vinblastine, It can be selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, etoposide, teniposide, topotecan, and iridotecan.
  • Anthracyclines doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone, and actinomycin D;
  • a pharmaceutical composition for treating cancer which comprises, as an active ingredient, a fused nanoparticle formed by fusing the stem cell-derived ectosome with a liposome loaded with an anticancer agent therein.
  • the stem cells may be educated stem cells that have been educated as target cancer cells, and the anticancer agent may be loaded by being bound to the surface or interior of the fusion nanoparticle by covalent bonding or non-covalent bonding, or by being encapsulated inside the nanoparticle having a core-shell structure.
  • the way in which the anticancer agent is loaded into the liposome nanoparticle may be by being bound to the surface or interior of the nanoparticle by covalent bonding or non-covalent bonding, or by being encapsulated inside the nanoparticle having a core-shell structure, and when loaded by covalent bonding, the anticancer agent may be covalently bound to a terminal or side chain of a biodegradable polymer.
  • the anticancer agent may be loaded by being covalently bound to the surface of the ectosome membrane by covalent bonding or non-covalent bonding and presented on the surface.
  • the cancer may be selected from the group consisting of brain tumor, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, colon cancer, colon cancer, breast cancer, uterine sarcoma, esophageal cancer, laryngeal cancer, small intestine cancer, and thyroid cancer, but is not limited thereto.
  • a method for treating cancer in a subject comprising the step of administering to the subject a fusion nanoparticle formed by fusing stem cell-derived ectosomes and liposomes.
  • a method for producing a fusion nanoparticle having a targeting ability for tumor tissue comprises a step of mixing the above ectosome and liposome nanoparticles and fusing the ectosome and liposome through ultrasonic treatment.
  • the ectosome and liposome nanoparticles can be mixed at a mass ratio of 1:20.
  • a use for manufacturing a medicament for preventing and treating cancer wherein a fusion nanoparticle formed by fusing a stem cell-derived ectosome with a liposome loaded with an anticancer agent therein is used.
  • a method for treating cancer in a subject comprising administering to the subject a fused nanoparticle formed by fusing a therapeutically effective amount of stem cell-derived ectosome with a liposome having an anticancer agent loaded therein.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the type of the patient's affected area, application site, number of treatments, treatment time, formulation, patient's condition, type of excipient, etc.
  • the amount of use is not particularly limited, but may be 0.01 ⁇ g/kg/day to 10 mg/kg/day.
  • the above daily amount may be administered once a day, or divided into 2 to 3 times a day at appropriate intervals, or intermittently at intervals of several days.
  • the compound in the pharmaceutical composition of the present invention, can be administered orally or parenterally, and is preferably administered parenterally by intravenous injection, subcutaneous injection, intracerebroventricular injection, intracerebrospinal fluid injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • solid or liquid formulation additives may be used in the manufacture of the pharmaceutical composition.
  • the formulation additives may be either organic or inorganic. Examples of the excipients include lactose, sucrose, sucrose, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbitol, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate and silicon dioxide.
  • binder examples include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, dextrin and pectin.
  • lubricants include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, and hydrogenated vegetable oil. Any colorant that is generally permitted to be added to pharmaceuticals can be used. Their tablets and granules can be appropriately coated with sugar, gelatin, or other agents as needed. In addition, preservatives, antioxidants, and the like can be added as needed.
  • the pharmaceutical composition when it is a drug, it can additionally contain at least one selected from a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifier, or a preservative.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be in a desirable form depending on the method of use, and in particular, it is preferable to formulate by adopting a method known in the art so as to provide rapid, sustained, or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • Examples of specific dosage forms include PLASTERS, GRANULES, LOTIONS, LINIMENTS, LEMONADES, POWDERS, SYRUPS, LIQUIDS AND SOLUTIONS, AEROSOLS, EXTRACTS, ELIXIRS, FLUIDEXTRACTS, EMULSIONS, SUSPENSIONS, DECOCTIONS, INFUSIONS, TABLETS, SUPPOSITORIES, INJECTIONS, SPIRITS, CATAPLSMA, CAPSULES, TROCHES, TINCURES, PASTES, PILLS, SOFTWARE or any one of hard gelatin capsules.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may additionally contain components commonly used in the composition, and may include, for example, common auxiliary agents such as stabilizers, solubilizers, and flavoring agents, and carriers.
  • common auxiliary agents such as stabilizers, solubilizers, and flavoring agents, and carriers.
  • the pharmaceutical composition or joint injection may contain various carriers suitable for direct injection into the affected area.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in formulation, and include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., a talc, a glycerol, a glycerol, a glycerol, a glycerol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a glycerol, a glycerol, a glycerol, a glycerol, a glycerol, a glycerol, sorbitol, sorbitol
  • the inventors of the present invention have previously discovered that stem cells educated with cancer cell or inflammatory cell culture medium have enhanced targeting ability for tumor tissue or inflammatory tissue without using unnecessary processes such as genetic manipulation through research (Korean Patent Publication No. 2022-0117474). Thereafter, the inventors hypothesized that ectosomes secreted from the above-mentioned educated stem cells would also have targeting ability for lesions such as tumor tissue, and to verify the above hypothesis, ectosomes were separated from the educated stem cells and then mixed with PLGA nanoparticles, which are biodegradable polymers, to prepare ectosome-biodegradable fusion nanoparticles coated with ectosome membranes.
  • PLGA nanoparticles which are biodegradable polymers
  • the fusion nanoparticles were investigated to determine whether they were well targeted to tumor tissue. As a result, it was confirmed that the fusion nanoparticles exhibited significantly higher tumor cell targeting ability compared to non-educated stem cell-derived ectosome-biodegradable polymer fusion nanoparticles, and that the fusion nanoparticles exhibited further enhanced targeting ability to tumor tissue.
  • the inventors of the present invention isolated ectosomes from educated stem cells and fused them with liposomes, which are spherical vesicle structures made of an artificially manufactured lipid bilayer, to produce novel fusion nanoparticles (see Fig. 1). Thereafter, the tumor tissue targeting ability of the ecto-liposome fusion nanoparticles of the present invention was analyzed using lung cancer and brain tumor animal models. As a result, it was confirmed that the ecto-liposome fusion nanoparticles derived from educated stem cells exhibited excellent targeting ability to brain tumor and lung cancer cell tissues by treating the culture medium of cancer cells.
  • Example 1 Extraction of ectosome derived from adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC)
  • the present inventors isolated ectosomes (nanoevesicles) to produce fusion nanoparticles in which ectosomes (nanoevesicles) and liposomes are fused from adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSCs) that have enhanced targeting ability by being trained as cancer cells.
  • AD-MSCs adipose-derived mesenchymal stem cells
  • adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) and lung cancer cells (A549) were dispensed at 5x105 per well in a 100 ⁇ culture plate and cultured at 37°C for 24 hours.
  • adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) and brain cancer cells (U87MG) were dispensed at 5x105 per well in a 100 ⁇ culture plate and cultured at 37°C for 24 hours. Thereafter, culture medium (medium) was obtained from the plate in which the lung cancer cells were being cultured, 10 ml of medium was dispensed to the stem cells, and then cultured for additional 24 hours (education).
  • cytochalasin B 10 ⁇ g/ ⁇ l of cytochalasin B (5 ⁇ l) was added to the plate cultured with adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) cultured with the above lung cancer cell or brain cancer cell culture medium, the cells were separated, and then vortexed for 3 minutes. Then, centrifugation was performed at 1,000 rpm for 10 minutes using a centrifuge, the supernatant was collected, and centrifugation was performed at 4,000 rpm for 15 minutes to remove the supernatant, thereby obtaining an ectosome pellet, which was resuspended in 10 ⁇ l of DW and quantified using a nanodrop.
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • Liposomes are drug delivery vehicles that are biocompatible because they are composed of phospholipids.
  • the inventors of the present invention synthesized liposomes using microfluidic technology. Specifically, 18:1 ( ⁇ 9-Cis) PC (DOPC) [CAS#: 850375P, Avanti], cholesterol [CAS#: C8667, Sigma], and 18:0 PEG2000 PE [CAS#: 880120, Avanti] were added to ethanol at a molar ratio of 60:35:5, and then vortexed and sonicated for 10 minutes.
  • Example 2 The ectosome extracted through the above Example 1 and the liposome nanoparticle manufactured through Example 2-1 were mixed at a mass ratio of 1:10 and sonicated for 10 minutes in a bath sonicator. Thereafter, 10 minutes in liquid nitrogen and 10 minutes at 37°C were incubated as one cycle, resulting in 3 cycles. Subsequently, centrifugation was performed at 4°C and 3000 ⁇ g for 20 minutes using a 100KD filter (Merk, Amicon UFC910024 Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, 100K) to remove the remaining ecto-liposome fused nanoparticles that were not nanoparticleized. Transmission electron microscopy (TEM) and FRET Assay were used to confirm whether the liposomes and ectosomes were properly fused (Fig. 2).
  • TEM Transmission electron microscopy
  • FRET Assay were used to confirm whether the liposomes and ectosomes were properly fused (Fig. 2).
  • the present inventors treated DiI at 5 ⁇ l/1 ml before Example 1-2 and incubated for 15 minutes. Thereafter, in order to attach fluorescent dye DiD or DiO to liposomes, liposomes were synthesized as in Example 2-1, and then treated with fluorescent dye DiD or DiO at 5 ⁇ l/1 ml, followed by vortexing and sonication for 10 minutes.
  • centrifugation was performed at 4°C and 3000 ⁇ g for 20 minutes using a centrifuge through a 100KD filter (Merk, Amicon UFC910024 Amicon ® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, 100K) to remove residual liposomes. Thereafter, the fusion was confirmed using FRET Assay and Uptake (Figs. 6a and 6b).
  • the present inventors performed SDS-PAGE to confirm the fusion of the ectosome-liposome fusion nanoparticles manufactured above. Specifically, proteins in the ectosome-liposome fusion were separated and purified from SDS-PAGE, and each liposome, ectosome, and ecto-liposome were mixed with a lysis buffer and incubated on ice for 30 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 4°C and 3000xg for 20 minutes to obtain a supernatant, and proteins were quantified through Coomassie quantification.
  • the size distribution and potential of the ecto-liposome fusion nanoparticle of the present invention were analyzed using a nanoparticle size analyzer (Anton Paar LiteSizer 500), and NTA analysis was performed using Nanosight NS300 (Nanosight, UK).
  • a nanoparticle size analyzer Anton Paar LiteSizer 500
  • NTA analysis was performed using Nanosight NS300 (Nanosight, UK).
  • FIGS. 3 and 4 liposomes exhibited a size distribution of an average of 50 nm
  • ectosomes exhibited an average of 184 nm
  • ectosome-liposome fusion nanoparticles exhibited an average of 90 nm.
  • liposomes exhibited a charge of -1 mV
  • ectosomes exhibited a charge of -7.3 mV
  • ectosome-liposome fusion nanoparticles exhibited a charge of -2.38 mV.
  • the above NTA analysis confirmed that the ectosome-liposome fusion nanoparticles were a substance with a size of 121.9 ⁇ 2.7 nm and a particle count of 3.21e+08 ⁇ 1.88e+07 per ml.
  • the present inventors investigated the uptake ability of the ectosome-liposome fusion nanoparticles of the present invention toward tumor cells. Specifically, lung cancer cells (A549) were seeded (5 x 10 4 cells) on poly-d-lysine-coated cover slips and cultured overnight. Then, DiO-labeled liposome nanoparticles, DiI-labeled ectosomes isolated from lung cancer cells, and DiI-labeled ectosome-liposome fusion nanoparticles (Ecto-Liposomes) isolated from lung cancer cells were added to the cultured cells, and then cultured at 37°C for 6 hours.
  • Example 3 Analysis of tumor tissue targeting ability in a brain tumor model
  • the present inventors analyzed the tumor tissue targeting ability of the ecto-liposome fusion nanoparticles of the present invention using a brain tumor animal model.
  • the brain tumor animal model was prepared by directly injecting brain tumor cells (U87MG-luciferase-GFP, 3x10 5 cells) genetically engineered to express fluorescent protein and bioluminescent enzyme (luciferase) into the brain of BALB/c nude mice through surgery.
  • brain tumor cells U87MG-luciferase-GFP, 3x10 5 cells
  • luciferase bioluminescent enzyme
  • the size of the brain tumor was observed using an IVIS imaging system, and after confirming that the brain tumor had been formed, ecto-liposomes extracted from the educated AD-MSCs (1x10 6 cells), the educated AD-MSCs (1x10 6 cells), and liposomes were intravenously injected into the tail vein of the brain tumor model mouse once a day for a total of 3 days (Fig. 8a). Thereafter, on the 4th day, whole-body bioimaging was performed on the experimental animals, and after the experimental animals were sacrificed, the brains where tumors were formed were extracted and the targeting ability of the ecto-liposomes to tumor tissues was analyzed through ex vivo imaging.
  • Example 4 Analysis of tumor tissue targeting ability in a lung cancer model
  • the present inventors also analyzed the tumor tissue targeting ability of the ecto-liposome fusion nanoparticles of the present invention using a lung cancer animal model.
  • the lung cancer animal model was prepared by injecting lung cancer cells (A549-luciferase-RFP, 1x10 6 ) genetically engineered to express fluorescent protein and bioluminescent enzyme (luciferase) via the tail vein of BALB/c nude mice. Thereafter, the size of the lung cancer was observed for 4 weeks using an IVIS imaging system (Fig.
  • the ecto-liposomes extracted from the educated AD-MSCs (1x10 6 cells), the educated AD-MSCs (1x10 6 cells), and liposomes were intravenously injected once via the tail vein of the lung cancer model mouse. After 6 hours, whole-body bioimaging was performed on the experimental animals, and after the experimental animals were sacrificed, the lungs where the tumors were formed were removed and the targeting ability of the ecto-liposomes to the tumor tissue was analyzed through ex vivo imaging.

Landscapes

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Abstract

본 발명은 신규 엑토-리포좀 나노입자에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 종래 표적능을 갖는 약물전달체보다 우수한 종양 부위에 대한 표적능을 나타내므로 항암제와 같은 약물을 적재하여 전신적 혹은 국소적으로 약물을 방출시키는 약물전달체로 활용할 수 있고 난치성 암이나 전이성 종양의 치료를 위한 치료제로 사용될 수 있는 신규 엑토-리포좀 나노입자를 제공한다.

Description

줄기세포 유래 엑토-리포좀 융합 나노입자 및 그의 용도
본 발명은 신규 엑토-리포좀 융합 나노입자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종양 부위에 대한 표적능이 강화된 줄기세포 유래 엑토-리포좀 융합 나노입자에 관한 것이다.
엑토좀(ectosome)은 원형질막에서 직접 출아하는 다양한 크기(직경 0.1~1mm)의 소포로서, 세포외 공간으로 분비된다. 살아있는 세포와 달리 엑토좀은 표면에 인지질인 포스파티딜세린을 가지고 있다. 엑토좀은 세포막이 직접 출아함으로써 생성·분비됨에도 불구하고 내부에 포함되는 화물(cargo) 성분이 모세포와 동일하지 않고 세포의 상태에 따라 내부 성분이 상이해진다고 알려져 있다(Cocucci and Meldolesi, Curr. Biol. 21(23): R940-R940, 2011). 엑토좀은 엔도좀(endosome)에서 다포성체(MVB) 경로를 통해 세포 외로 분비되는 엑소좀과는 생성 방식과 내부에 포함된 물질 등에 있어서 차이가 있으나, 세포외 공간에서의 상호작용 그리고 표적 세포와의 상호작용 방식은 엑소좀과 유사한 것으로 알려져 있다. 그러나 엑소좀이 질병 치료 및 진단 등의 기능적 측면에서 집중을 받은데 반하여 엑토좀은 상대적으로 많은 연구가 진행되지 않았다.
한편, 리포좀(liposome)은 지질 2중층(lipid bilayer)으로 되어 있는 구형의 소낭(vesicle) 구조물로 인지질로 구성되어 인공적으로 제조되거나 세포 속에서 찾아볼 수 있으며 소수성과 친수성을 동시에 가지고 있기 때문에 막을 통해 주변 환경으로부터 물질을 선택적으로 흡수해 크기가 커질 수 있다. 리포좀은 대부분 구형이나 타원형이며, 리포좀 안쪽에는 공간이 있기 때문에 여기에 항암제 등의 약물을 넣어 몸속으로 전달하는 약물 전달체로 활용된다. 이와 관련하여 대한미국 공개특허 제2021-0063254호는 리포좀 조성물을 포함하는 항암 치료 보조용 조성물 및 이를 이용한 약물 전달 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 면역세포에 대한 암의 회피 기능을 무력화시켜 암을 치료하는 면역치료법에 관한 것으로 세포 내 전달율이 저조한 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래 표적능을 갖는 약물전달체 보다 우수한 종양 부위에 대한 표적능을 나타내는 신규 줄기세포 유래 엑토-리포좀 융합체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀과 리포좀이 융합되어 형성된, 융합 나노입자가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약물 전달체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약물 전달체 및 유효 약물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 종양 조직의 배양액으로 배양하여 교육된 줄기세포로부터 엑토좀을 분리하는 단계; 및
상기 엑토좀과 리포좀 나노입자를 혼합하여 초음파 처리를 통해 상기 엑토좀과 리포좀을 융합하는 단계를 포함하는, 종양 조직에 대해 표적능을 갖는 융합 나노입자의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자의 암 예방 및 치료를 위한 의약의 제조를 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자를 암에 감염된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 줄기세포 유래 엑토-리포좀 융합체는 표적 질환인 종양 부위에 대한 강화된 표적능을 나타내므로 항암제와 같은 약물을 적재하여 전신적 혹은 국소적으로 약물을 방출시키는 약물전달체로 활용할 수 있고 난치성 암이나 전이성 종양의 치료를 위한 치료제로 사용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC) 유래 엑토좀 및 리포좀이 융합된 엑토-리포좀 융합 나노입자의 제조과정을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 ２는 본 발명의 AD-MSC 유래 엑토-리포좀 융합 나노입자의 제조 후 엑토좀 및 리포좀의 융합 여부를 투과 전자현미경(TEM)을 이용하여 관찰한 결과를 나타내는 현미경 사진이고 이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 리포좀, AD-MSC 유래 엑토좀, 및 엑토-리포좀 융합 나노입자의 유체 역학적 크기(hydrodynamic sizes) 및 전위(electrical potentials)를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 엑토-리포좀 융합 나노입자 입자의 크기 분포도를 나노　입자 추적(NTA)으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다．
도 ５는 리포좀, 엑토좀, 엑토-리포좀의 융합 여부를 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)로 확인한 결과를 나타내는 겔 사진이다.
도 ６a는 FRET(fluorescence resonance energy transfer）분석을 통해 본 발명의 엑토－리포좀 융합 나노입자의 융합을 확인하는 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 ６b는 본 발명의 엑토-리포좀 융합 나노입자의 형광 세기(fluorescence intensity)를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 엑토좀에 DiI 및 DiD 형광을 붙여 DiI 형광의 549 nm 여기 파장 및 665 nm 여기 파장 및 방출 파장에서 Victor 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 FRET　실험 방법을 통해 분석하였다.　
도 ７은 본 발명의 엑토-리포좀 융합 나노입자의 폐암세포(A549)에 대한 표적능을 관찰한 형광현미경 사진이다. 엑토-리포좀 융합 나노입자의 암 표적능을 평가하기 위해 DIO 형광물질로 염색된 리포좀, DiI 형광물질로 염색된 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)에서 추출한 엑토좀, DIO 형광물질로 염색된 리포좀및 DiI 형광물질로 염색된 엑토-리포좀 융합 나노입자의 흡수(uptake)를 형광으로 시각화하였다.
도 8a는 본 발명의 엑토-리포좀 융합 나노입자의 표적능을 확인한 것으로 상단은 뇌종양 동물 모델을 이용하여 관찰한 형광 사진이다. 뇌암세포（U87MG)를 실험동물 마우스의 뇌에 주입한 뒤 이종이식 종양 실험 동물모델을 제조하였고 상기 동물의　종양 크기를 생체 형광 이미징으로 촬영하였다. 하단은　뇌종양 동물 모델로부터 적출한 종양 조직에서 본 발명의 엑토-리포좀 융합 나노입자의 분포를 관찰한 형광 사진이다. 실험 동물모델에서 적출된 뇌종양에 대한 종양 신호(상단) 및 엑토-리포좀 융합 나노입자의 약물 신호(하단)의 분포를 생체 형광 이미징으로 촬영하였다.
도 8b은　본 발명의 엑토-리포좀 융합 나노입자의 표적능을 확인한 것으로 상단은 폐종양 동물 모델을 이용하여 관찰한 형광 사진이다. 폐암세포(A549)를 실험동물 마우스의 폐에 주입한 뒤 이종이식 종양 실험 동물모델을 제조하였고 상기 동물의　종양 크기를 생체 형광 이미징으로 촬영하였다. 하단은　폐종양 동물 모델로부터 적출한 종양 조직에서 본 발명의 엑토-리포좀 융합 나노입자의 분포를 관찰한 형광 사진이다. 실험 동물모델에서 적출된 폐종양에 대한 종양 신호(상단) 및 엑토-리포좀 융합 나노입자의 약물 신호(하단)의 분포를 생체 형광 이미징으로 촬영하였다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "엑토좀(ectosome)"은 세포외 소포 중 '엑소좀'과 달리 세포막(plasmamembrane)의 출아에 의해 생성되는 100 내지 500 nm의 직경을 갖는 인지질막 구조의 나노 소포체를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "리포좀(liposome)"은 지질이 만든 구형이나 타원형의 소낭(vesicle) 구조물이다. 구조체로 인지질 같은 분자는 한 분자 안에 물을 싫어하는 성질인 소수성(hydrophobic)을 띠는 부분과 물을 좋아하는 성질인 친수성(hydrophilic)을 보이는 부분을 동시에 가지고 있다. 리포좀은 내부에 항암제 등 약물을 봉입하거나 또는 생체막처럼 막 내에서 막단백질을 재구성시켜 각종 작용을 재현할 수 있으므로 마이크로 캡슐로 하여 체내 전달용 약물전달체로 개발되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약물 전달체(drug delivery carrier)"는 약물을 필요한 병소에 잘 전달하고 적정 시간 동안 유지되도록 하는데 사용되는 물질을 의미하며, 약물 전달체를 이용하여 약물을 병소에 효과적으로 전달하는 방법을 약물 전달 시스템(drug delivery system)이라고 한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀과 리포좀이 융합되어 형성된, 융합 나노입자가 제공된다.
상기 융합 나노입자에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 유도-만능 줄기세포일 수 있고 상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 치수유래 줄기세포 또는 말초혈액유래 줄기세포일 수 있다.
상기 융합 나노입자에 있어서, 상기 줄기세포는 병소 유래 세포로 교육된 줄기세포일 수 있고 상기 병소는 종양 조직일 수 있으며 상기 종양 조직은 원발성 또는 전이성일 수 있다.
상기 융합 나노입자에 있어서, 상기 교육된 줄기세포는 상기 병소 유래 세포를 배양 중인 배양액과 접촉하여 배양된 줄기세포일 수 있고 직경 100 내지 350 nm의 크기를 가질 수 있으며 상기 엑토좀과 리포좀은 1:20의 질량비로 혼합되어 제조될 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 엑토좀과 리포좀은 1:10의 질량비로 혼합되어 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약물 전달체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약물 전달체 및 유효 약물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 유효 약물은 항암제일 수 있다. 이때 상기 항암제는 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토잔트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신(mitomycin), C 브레오마이신(C Bleomycin), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 항암제를 더 구체적으로 설명하면 하기와 같다:
(i) 아스파라기나제(asparaginase);
(ii) 메토트렉세이트(methotrexate);
(iii) 피리미딘 유사체(pyrimidine analogs)
예: 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine) 및 아라비노실시토신(arabinosylcytosine);
(iv) 히드록시우레아(hydroxy urea);
(v) 퓨린 유사체(purine analogs)
머캅토퓨린(mercaptopurine) 및 티오구아닌(thioguanine);
(vi) 알킬화제(alkylating agents)
니트로겐 머스타드(nitrogen mustad) 및 사이클로스포라미드(cyclosporamide);
(vii) 안트라사이클린 계열 항암제(anthracyclines)
안트라사이클린(anthracycline), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토잔트론(mitoxantrone) 및 악티노마이신 D(actinomycin D);
(viii) 유사분열 억제제(mitotic inhibitors)
빈크리스틴(vincristine) 및 탁솔(taxol);
(ix) 항혈관생성제
VEGF에 특이적인 항체, 콤브레타스타틴 A4(combretastatin A4), 푸마길린(Fumagillin), 허비마이신 A(herbimycin A), 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol), OGT 2115, TNP 470, 트라닐라스트(tranilast), XRP44X, 탈리도마이드(thalidomide), 엔도스타틴(endostatin), 살모신(salmosin), 안지오스타틴(angiostatin) 또는 플라스미노겐(plasminogen) 또는 아포리포단백질(apolipoprotein)의 크링글 도메인(kringle domain);
(x) 삽입성 물질(intercalating agents)
카르보틀라틴(carboplatin) 및 시스플라틴(cisplatin); 및
(xi) 방사성 핵종(radionuclides)
18F, 90Y, 188Re, 32P, 89Sr, 165Dy, 186Re, 198Au, 153Sm, 131I, 169Er, 125I, 99Tc 및 166Ho, 등.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 치료대상 암세포로 교육된 교육 줄기세포일 수 있고 상기 항암제는 상기 융합 나노입자 표면 또는 내부에 공유결합 또는 비공유결합에 의한 결합에 의해 결합되거나 코어-쉘 구조의 나노입자 내부에 봉입이 되는 방식으로 적재가 된것일 수 있다. 아울러 더 구체적으로 상기 항암제가 상기 리포좀 나노입자에 적재되는 방식은 상기 나노입자 표면 또는 내부에 공유결합 또는 비공유결합에 의한 결합에 의해 결합되거나 코어-쉘 구조의 나노입자 내부에 봉입이 되는 방식으로 적재가 될 수 있고 공유결합에 의해 적재되는 경우 생분해성 고분자의 말단 또는 측쇄에 상기 항암제가 공유결합된 것일 수 있다. 선택적으로는 엑토좀 막 표면에 공유결합 또는 비공유결합 방식으로 결합하여 표면에 제시되는 방식으로도 적재가 될 수도 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 식도암, 후두암, 소장암 및 갑상선암으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀과 리포좀이 융합되어 형성된, 융합 나노입자를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 종양 조직의 배양액으로 배양하여 교육된 줄기세포로부터 엑토좀을 분리하는 단계; 및
상기 엑토좀과 리포좀 나노입자를 혼합하여 초음파 처리를 통해 상기 엑토좀과 리포좀을 융합하는 단계를 포함하는, 종양 조직에 대해 표적능을 갖는 융합 나노입자의 제조방법이 제공된다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 엑토좀과 리포좀 나노입자를 1:20의 질량비로 혼합될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자의 암 예방 및 치료를 위한 의약의 제조를 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자를 암에 감염된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
본 발명의 약학적 조성물은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다. 또한 약학적 조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가로 더 포함할 수 있으며, 예컨대 안정화제, 용해화제 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물 또는 관절강 주사제는 환부에 직접 주입에 적합한 다양한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th Ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명자들은 종래 연구를 통해서 유전자 조작과 같은 불필요한 공정을 사용하지 않으면서도 암세포나 염증세포 배양액으로 교육시킨 줄기세포가 종양조직 또는 염증조직에 대한 표적능이 향상됨을 규명한 바 있다(대한민국 공개특허 제2022-0117474호). 그 후, 본 발명자들은 상기와 같이 교육받은 줄기세포로부터 분비되는 엑토좀 역시 종양조직과 같은 병소에 대하여 표적능이 있을 것이라는 가설을 세웠고 상기 가설을 입증하기 위해 교육받은 줄기세포로 부터 엑토좀을 분리한 후 생분해성 고분자인 PLGA 나노입자와 혼합함으로써 엑토좀 막이 코팅된 엑토좀-생분해성 융합 나노입자를 제조하여 융합 나노입자가 종양조직에 잘 표적화되는지 여부를 조사한 결과 비교육된 줄기세포 유래 엑토좀-생분해성 고분자 융합 나노입자와 비교하여 현저하게 높은 종양세포 표적능을 나타냄을 확인하였고 상기 융합 나노입자가 종양조직에 더욱 향상된 표적능을 나타냄을 확인하였다.
더 나아가, 본 발명자들은 교육받은 줄기세포로부터 엑토좀을 분리한 후 이를 인공적으로 제조한 지질 2중층(lipid bilayer)으로 되어 있는 구형의 소낭(vesicle) 구조물인 리포좀과 융합한 신규 융합 나노입자를 제조하였다(도 1 참조). 그 후, 폐암 및 뇌종양 동물 모델을 이용하여 본 발명의 엑토－리포좀 융합 나노입자의 종양조직 표적능력을 분석한 결과 암세포의 배양배지를 처리하여 교육된 줄기세포 유래 엑토-리포좀 융합 나노입자는 뇌종양 및 폐암세포 조직으로 매우 우수한 표적능을 나타냄을 확인하였다. 상기 결과는 본 발명의 엑토－리포좀 융합 나노입자는 종래 혈액-뇌장벽의 존재로 인해 항암제 치료가 제한적이었던 기술적 난제를 해결할 수 있는 근거를 제공하고 폐암 등 난치성 암에 대해 병소에 대한 표적능을 증가시킴으로써 해당 병소에 대한 유효약물의 약물전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC) 유래 엑토좀 추출
본 발명자들은 암세포로 교육시켜 표적능을 강화시킨 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC) 유래 엑토좀(나노소포체) 및 리포좀(Liposome)이 융합된 융합 나노입자 제조를 위해 엑토좀(나노소포체)을 분리하였다.
1-1: 줄기세포에 대한 교육 방법
폐암세포로의 표적능력을 강화시키기 위해 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 폐암세포(A549)를 100π 배양 플레이트에 웰당 5x105개씩 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 또한 뇌암세포로의 표적능력을 강화시키기 위해 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 뇌암세포(U87MG)를 100π 배양 플레이트에 웰당 5x105개씩 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 폐암세포가 배양중인 플레이트에서 배양액(배지)을 수득하여 줄기세포에 배지 10 ml씩 분주한 후 24시간 동안 추가 배양하였다(education).
1-2: 교육된 줄기세포로 부터 엑토좀의 분리
상기 폐암세포 또는 뇌암세포 배양액으로 교육된 지방유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)가 배양된 플레이트에 사이토칼라신 B(cytochalasin B) 10 ㎍/㎕를 5 ㎕ 첨가하였고 세포를 분리한 다음 3분 동안 볼텍싱하였다. 이어서, 원심분리기를 이용하여 1000 rpm조건에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 모았고, 4,000 rpm에서 15분 동안 원심분리를 수행하여 상등액을 제거함으로써 엑토좀 펠렛(pellet)을 수득하였으며 이를 DW 10 ㎕에 재현탁한　후 나노드롭(nanodrop)을 사용하여 정량하였다.
실시예 2: 엑토-리포좀　융합
2-1: 리포좀 나노입자의 제조
리포좀(liposome)은　인지질로　구성되어　있어　생체적합성이　있는　약물　전달체로 본 발명자들은　미세유체(microfluidic)　기술을　사용하여　리포좀을 합성하였다. 구체적으로 lipid phase에 18:1(Δ9-Cis) PC (DOPC) [CAS#: 850375P, Avanti], 콜레스테롤[CAS#: C8667, Sigma] 18:0 PEG2000 PE [CAS#: 880120, Avanti]를　몰비(molar ratio) 60:35:5 비율로　에탄올에　첨가한 후 볼텍싱(vortexing) 및　초음파처리(sonication)를 10분간 수행 후 준비하였다. 이어서,　aqua phase에는 3차 증류수를 준비하였고 5 μm pore size의 미세유체칩을 사용하여 Aqua ８ ml/min, lipid 0.8 ml/min 유속으로 합성하였다. 그 후, 100KD 필터(Merk, Amicon UFC910024 Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, 100K)를　통해　원심분리기를 이용하여 4℃, 3000xg 조건으로 20분 동안 원심분리를 수행하여 나노입자화되지 못한 잔여 리포좀을 제거하였다．　
2-2: 엑토좀 융합 리포좀 나노입자 제조
상기 실시예 1을 통해 추출된 엑토좀 및 실시예 2-1을 통해 제조된 리포좀 나노입자를 1:10의 질량비로 혼합하였고 bath sonicator에서 10분간 초음파 처리하였다. 그 후, 액체질소에 10분, 37℃ 인큐베이션 10분을 1사이클로 해서 3사이클로 수행하였다. 이어서 100KD 필터(Merk, Amicon UFC910024 Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, 100K)를 사용하여 4℃, 3000xg 조건으로 20분 동안 원심분리를 수행하여 나노입자화되지 못한 잔여 엑토-리포좀 융합 나노입자를 제거하였고 투과전자현미경(TEM)과 FRET Assay를 사용하여 리포좀과 엑토좀이 제대로 융합되었는지 확인하였다(도 2).
실시예 ３: DID, DiI, DiO로 표지된 엑토-리포좀의 준비
본 발명자들은 엑토좀에 형광 다이인 DiI가 부착된 융합체의 제조를 위해 실시예 1-2 전에 DiI를 ５μl/1ml로 처리한 후 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 리포좀에 형광 다이인 DiD 또는 DiO를 부착하기 위해 상기 실시예 2-1과 같이 리포좀을 합성한 후, 형광 다이 DiD 또는 DiO를 ５μl/1ml로 처리하여 볼텍싱과 초음파 처리를 10분간 수행하였다. 이어서, 100KD filter(Merk, Amicon UFC910024 Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, 100K)를 통해 원심분리기를 이용하여 4℃, 3000xg 조건으로 20분 동안 원심분리를 수행하여 잔여 리포좀을 제거하였다. 그 후, FRET Assay 및 Uptake에 사용하여 융합을 확인하였다(도 6a 및 6b)．
실시예 ４: 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)
본 발명자들은 상기 제조한 엑토좀－리포좀 융합 나노입자의 융합을 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 구체적으로 SDS-PAGE로부터 엑토좀－리포좀 융합체에 있는 단백질을 분리, 정제하였고 각 리포좀, 엑토좀 및 엑토－리포좀을 용해 버퍼(lysis buffer)와 혼합하여 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 4℃, 3000xg 조건으로 20분 동안 원심분리를 수행하여 상등액을 수득하였고 쿠마시(coomassie) 정량을 통해 단백질을 정량하였다. 이어서, 상기 리포좀, 엑토좀, 및 엑토－리포좀 30 ㎍을 ４X SDS 샘플 버퍼와 혼합하여 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하고 다시 얼음 위에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 4℃, 13,000 rpm 조건으로 5분 동안 원심분리를 수행하여 상등액을 수득하였고 겔에 5 mV로 20분 동안 로딩하여 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 그 후, 쿠마시 블루(coomassie blue)로 1시간 동안 염색하고 남은 염색 시약을 제거하기 위해 30분 동안 탈색(destaining)을 수행하였으며 스캐닝(scanning)을 통해 단백질 밴드를 확인하였다. 그 결과, 단백질 밴드가 리포좀에서는 나타나지 않았고 엑토좀 및 엑토-리포좀에서는 서로 유사한 형태의 단백질 밴드를 확인하여 엑토-리포좀 융합을 확인하였다(도 5).
실험예 1: 물리 화학적 특성
본 발명의 엑토-리포좀 융합체의 크기 분포 및 전위는 나노입도분석기(Anton Paar LiteSizer 500)를 사용하여 분석하였고 NTA 분석은 Nanosight NS300 (Nanosight, UK)을　통해　분석하였다．그 결과, 도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 리포좀은 평균 50 nm, 엑토좀은 평균 184 nm, 엑토좀-리포좀 융합 나노입자(Ecto-Liposome)는 평균 90 nm의 크기 분포를 나타내었다. 또한, 리포좀은 -１mV, 엑토좀은 -7.3 mV, 엑토좀-리포좀 융합 나노입자는 -2.38 mV의 전하를 나타내었다. 상기 NTA 분석을 통해 엑토좀-리포좀 융합 나노입자는 121.9±2.7 nm의 크기로 1 ml에 3.21e+08±1.88e+07 입자 개수가 있는 물질임을 확인하였다.
실험예 2: 엑토-리포좀 융합 나노입자의 흡수능력 분석
본　발명자들은 본 발명의 엑토좀－리포좀　융합 나노입자의 종양세포에 대한 흡수능력을 조사하였다. 구체적으로, 폐암세포(A549)를 폴리－d－리신－코팅된 커버 슬립에 파종(5 x 104 세포)하고 밤새 배양하였다．그　후，DiO로 표지된　리포좀 나노입자，DiI로 표지된 폐암세포에서 분리된 엑토좀 및 DiI로 표지된 폐암세포에서 분리된 엑토좀－리포좀 융합 나노입자(Ecto-Liposome)를 배양중인 세포에 첨가 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 모든 시료들을 4℃의 중간 배지에서 4% 파라포름알데히드로 밤새 고정시켰고, 상기 종양세포 내에서의 DiO와 DiI 형광을 LSM700 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 촬영하였다. 그 결과, 도 ７에 나타난 바와 같이, 단순 리포좀 나노입자를 처리한 종양세포에서는 DiO 형광만 관찰되었고 엑토좀을 처리한 종양세포에서는 DiI 형광만 관찰되었으나 엑토－리포좀 융합 나노입자로 처리한 종양세포 내부에서는 DiO 및 DiI 형광 모두 관찰되었다．
실시예 3: 뇌종양 모델에서 종양조직 표적능력 분석
본 발명자들은 뇌종양 동물 모델을 이용하여 본 발명의 엑토－리포좀 융합 나노입자의 종양조직 표적능력을 분석하였다. 구체적으로, 뇌종양 동물 모델은 BALB/c 누드마우스에 형광단백질 및 생물발광효소(luciferase)를 발현하도록 유전자 조작된 뇌종양세포(U87MG-luciferase-GFP, 3x105세포)를 수술을 통해 뇌에 직접 주사함으로써 제조하였다. 그 후, 생체 형광 이미지 장치(IVIS imaging system)를 이용하여 뇌종양 크기를 관찰하였고 뇌종양이 형성된 것을 확인한 뒤, 교육된 AD-MSC에서 추출한 엑토-리포좀(1x106 세포), 교육된 AD-MSC(1x106 세포), 및 리포좀을 하루에 1회씩 총 3일간 상기 뇌종양 모델 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다(도 8a). 그 후, 4일차에 실험동물에 대한 전신 생체 이미징을 수행하였고 상기 실험동물을 희생시킨 후 종양이 형성된 뇌를 적출하여 생체외(ex vivo) 이미징을 통해 엑토-리포좀의 종양조직에 대한 표적능력을 분석하였다.
그 결과, 8a에 나타난 바와 같이, 뇌암세포의 배양배지를 처리하여 교육된 엑토-리포좀의 경우 뇌종양 조직으로의 표적능이 향상되었음을 확인하였다. 상기 결과는 줄기세포를 정맥주사를 통해 실험동물에 주입하여 달성된 것으로 줄기세포가 뇌혈관 장벽을 통과하여 뇌종양으로 정확하게 이동함을 입증한 것으로 이는 뇌종양 치료에 있어서, 종래 혈액-뇌장벽의 존재로 인해 항암제 치료가 제한적이었던 기술적 난제를 해결할 수 있는 중요한 실마리를 제공함을 시사한다.
실시예 4: 폐암 모델에서 종양조직 표적능력 분석
본 발명자들은 또한, 폐암 동물 모델을 이용하여 본 발명의 엑토－리포좀 융합 나노입자의 종양조직 표적능력을 분석하였다. 구체적으로, 폐암 동물 모델은 BALB/c 누드마우스에 형광단백질 및 생물발광효소(luciferase)를 발현하도록 유전자 조작된 폐암세포(A549-luciferase-RFP, 1x106)를 꼬리정맥을 통해 주사하여 제조하였다. 그 후, 생체 형광 이미지 장치(IVIS imaging system)를 이용하여 4주간 폐암의 크기를 관찰하였고(도 8b) 폐암이 형성된 것을 확인한 뒤, 교육된 AD-MSC에서 추출한 엑토-리포좀(1x106 세포), 교육된 AD-MSC(1x106 세포), 및 리포좀을 1회 상기 폐암 모델 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다. ６시간 후에 실험동물에 대한 전신 생체 이미징을 수행하였고 실험동물을 희생시킨 후 종양이 형성된 폐를 적출하여 생체외(ex vivo) 이미징을 통해 엑토-리포좀의 종양조직으로의 표적능력을 분석하였다.
그 결과, 도 8b에 나타난 바와 같이, 폐암세포의 배양배지를 처리하여 교육된 엑토-리포좀의 경우 종양 조직으로의 표적능이 향상되었음을 확인하였다. 상기 결과는 교육된 줄기세포가 암세포 특이적인 약물 전달, 특히 대표적인 난치성 악성종양인 폐암에 대한 약물전달에 매우 효율적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
(이 발명을 지원한 국가연구개발사업)
(과제고유번호) 2022398018
(과제번호) 2022M3A9G8018189
(부처명) 과학기술정보통신부
(과제관리(전문)기관명) 한국연구재단
(연구사업명) 바이오·의료기술개발사업 (바이오원천융합기술개발)
(연구과제명) 환자 맞춤형 엑토-리포좀을 이용한 복합종양 표적 원천기술 개발
(기여율) 1/1
(과제수행기관명) 가천대학교 산학협력단
(연구기간) 2023.01.01 ~ 2023.12.31

Claims (21)

  1. 줄기세포 유래 엑토좀과 리포좀이 융합되어 형성된, 융합 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 유도-만능 줄기세포인, 융합 나노입자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 골수유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 치수유래 줄기세포 또는 말초혈액유래 줄기세포인, 융합 나노입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 병소 유래 세포로 교육된 줄기세포인, 융합 나노입자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 병소는 종양 조직인, 융합 나노입자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 종양 조직은 원발성 또는 전이성인, 융합 나노입자.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 교육된 줄기세포는 상기 병소 유래 세포를 배양 중인 배양액과 접촉하여 배양된 줄기세포인, 융합 나노입자.
  8. 제1항에 있어서,
    직경 100 내지 350 nm의 크기를 갖는, 융합 나노입자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 엑토좀과 리포좀은 1:20의 질량비로 혼합되어 제조되는, 융합 나노입자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약물 전달체.
  11. 제10항의 약물 전달체 및 유효 약물을 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 유효약물은 항암제인, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 항암제는 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토잔트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신(mitomycin), C 브레오마이신(C Bleomycin), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  14. 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 줄기세포는 치료대상 암세포로 교육된 교육 줄기세포인, 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 항암제는 상기 융합 나노입자 표면 또는 내부에 공유결합 또는 비공유결합에 의한 결합에 의해 결합되거나 코어-쉘 구조의 나노입자 내부에 봉입이 되는 방식으로 적재가 된 것인, 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 암은 뇌종양, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 식도암, 후두암, 소장암 및 갑상선암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  18. 종양 조직의 배양액으로 배양하여 교육된 줄기세포로부터 엑토좀을 분리하는 단계; 및
    상기 엑토좀과 리포좀 나노입자를 혼합하여 초음파 처리를 통해 상기 엑토좀과 리포좀을 융합하는 단계를 포함하는, 종양 조직에 대해 표적능을 갖는 융합 나노입자의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 엑토좀과 리포좀 나노입자를 1:20의 질량비로 혼합되는, 제조방법.
  20. 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자의 암 예방 및 치료를 위한 의약의 제조를 위한 용도.
  21. 치료적으로 유효한 양의 줄기세포 유래 엑토좀이 내부에 항암제가 적재된 리포좀과 융합되어 형성된 융합 나노입자를 암에 감염된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법.
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