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WO2025188160A1 - 생체모사 칩, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포 외 기질 코팅방법 - Google Patents

생체모사 칩, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포 외 기질 코팅방법

Info

Publication number
WO2025188160A1
WO2025188160A1 PCT/KR2025/099584 KR2025099584W WO2025188160A1 WO 2025188160 A1 WO2025188160 A1 WO 2025188160A1 KR 2025099584 W KR2025099584 W KR 2025099584W WO 2025188160 A1 WO2025188160 A1 WO 2025188160A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
groove
substrate
extracellular matrix
paragraph
inlet
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2025/099584
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2025188160A8 (ko
Inventor
강주헌
최주해
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UNIST Academy Industry Research Corp
Original Assignee
UNIST Academy Industry Research Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020250016232A external-priority patent/KR20250135699A/ko
Application filed by UNIST Academy Industry Research Corp filed Critical UNIST Academy Industry Research Corp
Publication of WO2025188160A1 publication Critical patent/WO2025188160A1/ko
Publication of WO2025188160A8 publication Critical patent/WO2025188160A8/ko
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/06—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with filtration, ultrafiltration, inverse osmosis or dialysis means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a biomimetic chip, a method for manufacturing the same, and a method for coating an extracellular matrix using the same.
  • Micro Physiological System is a biomimetic chip that reproduces the structure and microenvironment of human organs in vitro by combining human-derived 3D cell culture technology and blood flow-simulating microfluidic technology. It is a technology that fixes cells in a microfluidic channel for a certain period of time and a certain space and observes cell growth, etc.
  • MPS is utilized in various fields such as disease mechanisms, new drug screening, and patient-tailored medical technology, and depending on the purpose of use, the microfluidic channels inside the chip are applied in various designs such as single, double, and multi-channel.
  • the structure of conventional microfluidic channel has a curved structure.
  • the flow of fluid is given to the microfluidic channel of this curved structure in order to simulate circulating cells, the flow of fluid is concentrated on the inside of the curve, which may cause a difference in the velocity of the fluid. Due to this difference in the velocity of the fluid in the curved area, the coating agent used when modifying the surface of the microfluidic channel accumulates in the curved area, making it difficult to uniformly treat the surface of the microfluidic channel, and there is a problem that it causes non-uniform adhesion of cells cultured on the surface of the microfluidic channel during cell culture in the future.
  • an extracellular matrix can be coated on the microfluidic channel to fix cells in a certain space for a certain period of time and observe cell growth, etc.
  • the biomimetic chip can easily apply cell culture and cell circulation models by introducing a linear microfluidic channel.
  • one embodiment of the present invention relates to a biomimetic chip including a substrate having a first groove formed on one surface, a cover part arranged to face the substrate and having a second groove formed on a surface facing the substrate, a porous membrane arranged between the substrate and the cover part to have an area overlapping at least the first groove and the second groove, and a plurality of openings having a first inlet, a first outlet, a second inlet, and a second outlet that penetrate the cover part in a thickness direction of the cover part or in a direction perpendicular to the thickness direction.
  • a biomimetic chip maintains a constant circulation speed of fluid inside a microfluidic channel to induce attachment at a uniform density on the surface of the microchannel during cell culture and circulation, and can be immediately and strongly attached through chemical bonding by combining using oxygen plasma and a silane coupling agent.
  • the extracellular matrix coating method according to an embodiment of the present invention can effectively implement the function of the basement membrane in the body by optimizing cell-matrix interaction by introducing an aligned fiber structure into a porous membrane, thereby strengthening the function of the cell barrier.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view schematically illustrating an example of a biomimetic chip according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a cross-sectional view schematically illustrating an example of the biomimetic chip of Figure 1.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating an example of a method for manufacturing a biomimetic chip according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a process diagram schematically illustrating an example of a method for manufacturing a biomimetic chip of Figure 3.
  • Figure 5 is a graph showing the bonding strength of a silane coupling agent according to a solvent.
  • Figure 6 is a photograph showing the cell culture results of a biomimetic chip manufactured using the biomimetic chip manufacturing method of Figure 3.
  • Figure 7 is a photograph showing the experimental results of a biomimetic chip manufactured using the biomimetic chip manufacturing method of Figure 3.
  • Figure 8 is a flowchart illustrating an example of an extracellular matrix coating method according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 9 is a schematic diagram schematically illustrating an example of the extracellular matrix coating method of Figure 8.
  • Figure 10 is a photograph showing the alignment of the extracellular matrix coated with the extracellular matrix coating method of Figure 8.
  • Figure 11 is a photograph of cells cultured on an extracellular matrix coated with the extracellular matrix coating method of Figure 8, obtained by fluorescence analysis.
  • Figure 12 is a graph evaluating the function of cells cultured on an extracellular matrix coated under various conditions.
  • Figure 13a is a photograph of a fluorescent analysis of cells cultured on an extracellular matrix coated under various conditions and co-cultured with a cancer cell line.
  • Figure 13b is a graph showing the relative quantification of the fluorescently labeled tight junction proteins in Figure 13a.
  • Figure 14a is a photograph of the metastasis of cancer cells analyzed by fluorescence when cells and cancer cell lines were co-cultured on an extracellular matrix coated under various conditions.
  • Figure 14b is a graph showing the number of fluorescently labeled cancer cells per volume in Figure 14a.
  • Figure 14c is a graph showing the permeability coefficient due to metastasis of cancer cells when co-cultured with cancer cell lines on an extracellular matrix coated with various conditions.
  • one embodiment of the present invention relates to a biomimetic chip including a substrate having a first groove formed on one surface, a cover part arranged to face the substrate and having a second groove formed on a surface facing the substrate, a porous membrane arranged between the substrate and the cover part to have an area overlapping at least the first groove and the second groove, and a plurality of openings having a first inlet, a first outlet, a second inlet, and a second outlet that penetrate the cover part in a thickness direction of the cover part or in a direction perpendicular to the thickness direction.
  • the first groove may be formed to be longer than the second groove, the first inlet and the first outlet may correspond to an end of the first groove, and the second inlet and the second outlet may correspond to an end of the second groove.
  • the first groove has a length extending in one direction and a width intersecting the length, and the width may include a plurality of convex regions formed spaced apart from each other and having the same or greater width along the length.
  • the above convex regions may overlap the first inlet, the first outlet, the second inlet, and the second outlet.
  • Biofluid can be injected into the first groove and the second groove.
  • the biofluid may include a material selected from circulating cells, adherent cells, scaffolds, chemicals, and biomolecules.
  • the biofluid can be selectively exchanged through the porous membrane in an area where the first groove and the second groove overlap.
  • the above circulating and adherent cells can be cultured in a single layer or multilayer structure or can be cultured by circulating along the channels of the chip.
  • the scaffold may comprise a protein or hydrogel protein comprising an extracellular matrix.
  • the above chemicals may include cell culture media and additives.
  • the biomolecule may comprise a signaling molecule or a neurotransmitter.
  • Another embodiment of the present invention for achieving the above-described purpose discloses a method for manufacturing a biomimetic chip, including the steps of preparing a substrate, a cover part, and a porous membrane, the step of surface-treating the substrate and the cover part with plasma gas, the step of surface-treating the porous membrane with a silane coupling agent, and the step of bonding the surface-treated substrate, the cover part, and the porous membrane.
  • the plasma gas contains oxygen or air, and the oxygen or the air can modify the surface of the substrate and the cover part with hydroxyl groups.
  • the above silane coupling agent may contain water or ethanol as a solvent.
  • Another embodiment of the present invention for achieving the above-described purpose provides an extracellular matrix coating method, comprising the steps of introducing a solution containing an extracellular matrix protein onto a substrate, forming a constant flow in the solution, coating the extracellular matrix protein so that it is directionally aligned in the direction of the flow, and introducing cells onto the extracellular matrix coating having the directionality.
  • plasma and calcium chloride (CaCl 2 ) can be further injected while forming the above constant flow.
  • first, second, etc. are used not in a limiting sense but for the purpose of distinguishing one component from another.
  • a part such as a film, region, component, etc. is said to be on or above another part, it includes not only the case where it is directly on top of the other part, but also the case where another film, region, component, etc. is interposed between them.
  • each step is for convenience of explanation and do not indicate the order of the steps.
  • the steps may be performed in a different order than stated, unless the context clearly dictates otherwise. In other words, the steps may be performed in the same order as stated, substantially simultaneously, or in the opposite order.
  • the present invention relates to a biomimetic chip, a method for manufacturing the same, and a method for coating an extracellular matrix using the same.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view schematically illustrating an example of a biomimetic chip according to one embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically illustrating an example of the biomimetic chip of FIG. 1.
  • a biomimetic chip (1) may include a substrate (10) having a first groove (11) formed on one surface, a cover portion (20) having a second groove (21) formed thereon and including a plurality of openings (12, 13, 22, 23) formed in a thickness direction intersecting the second groove (21), and a porous membrane (30) disposed between the substrate (10) and the cover portion (20) and covering at least a portion of the first groove (11) and the second groove (21).
  • the substrate (10) may have a first groove (11) formed in the center of one surface.
  • the first groove (11) may be formed in the center of the substrate (10) with a length in one direction and a width in a direction crossing the length.
  • the first groove (11) may function as a microfluid channel or chamber, and may be connected to a first inlet (12) and a first outlet (13) described below to induce a flow of the first biofluid so that the first biofluid may circulate inside the first groove (11).
  • the first groove (11) may be formed with a region having a width that is not constant and intersecting with the length, and having a larger width.
  • a plurality of regions having a larger width may be formed, and may correspond to the first inlet (12) and the first outlet (13) described below.
  • the substrate (10) may be a transparent substrate whose inside can be observed from the outside.
  • the substrate (10) may be made of any material that can be formed transparently, and as a specific example, the substrate (10) may include at least one selected from among polydimethylsiloxane (PDMS), polyethersulfone (PES), poly(3,4-ethylenedioxythiophene), poly(styrenesulfonate), polyimide, polyurethane, polyester, perfluoropolyether (PFPE), and polycarbonate.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PES polyethersulfone
  • PFPE perfluoropolyether
  • the cover portion (20) can be positioned to face the substrate (10).
  • the cover portion (20) includes a second groove (21).
  • the second groove (21) can be formed to have at least an area overlapping the first groove (11).
  • the cover portion (20) may be a transparent substrate whose inside can be observed from the outside.
  • the cover portion (20) may be formed of any material that can be formed transparently, and as a specific example, the cover portion (20) may include at least one selected from among polydimethylsiloxane (PDMS), polyethersulfone (PES), poly(3,4-ethylenedioxythiophene), poly(styrenesulfonate), polyimide, polyurethane, polyester, perfluoropolyether (PFPE), and polycarbonate.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PES polyethersulfone
  • PFPE perfluoropolyether
  • the cover portion (20) may have a second groove (21) formed on one surface of the cover portion (20) facing the substrate (10).
  • the second groove (21) may be formed in the center or an area adjacent to one surface of the cover portion (20).
  • first groove (11) and the second groove (21) may overlap at least in one area to form a tube shape.
  • the second groove (21) may be formed to have a shorter length than the first groove (11) and may overlap in one area of the first groove (11).
  • the second groove (21) may overlap in the longitudinal direction of the first groove (11) on both sides along the center of the first groove (11), and both end portions of the second groove (21) may be located inside the both end portions of the first groove (11).
  • a plurality of openings (12, 13, 22, 23) may be formed in a direction intersecting the second groove (21), for example, in a vertical thickness direction (Z) or a direction perpendicular to the thickness direction (Z), that is, in a direction horizontal to the second groove.
  • the second groove (21) faces the first groove (11) and overlaps to form a tube shape, and is separated by a porous membrane (30) described later, so that each of the first groove (11) and the second groove (21) can function as a microfluidic channel or chamber.
  • the depth of the microfluidic channel formed by the first groove (11) and the porous membrane (30) can be 150 ⁇ m to 250 ⁇ m
  • the depth of the microfluidic channel formed by the second groove (11) and the porous membrane (30) can be 800 ⁇ m to 1200 ⁇ m.
  • the plurality of openings (12, 13, 22, 23) may each include a first inlet (12), a first outlet (13), a second inlet (22) and a second outlet (23).
  • first inlet (12) and the first outlet (13) may be arranged to be spaced apart from each other, and may be arranged at least spaced apart from the second groove (21) and on the outside of the second groove (21).
  • first inlet (12) and the first outlet (13) may be formed to correspond to the first groove (11), for example, the first inlet (12) and the first outlet (13) may be formed to correspond to one end and the other end of the first groove (11), respectively.
  • the second inlet (22) and the second outlet (23) can be arranged to be spaced apart from each other, and can be arranged at least spaced apart from the first inlet (12) and the first outlet (13) and on the inside of the first inlet (12) and the first outlet (13).
  • the second inlet (22) and the second outlet (23) may be formed to correspond to the second groove (21) of the cover part (20), and for example, the second inlet (22) and the second outlet (23) may be formed to correspond to one end and the other end of the second groove (21), respectively.
  • the length of the first groove (11) and the length of the second groove (21) may be formed to be equal to or different from each other, so that the first inlet (12) and the second inlet (22) and the first outlet (13) and the second outlet (23) may be formed to be spaced apart from each other.
  • the first inlet (12) and the first outlet (13) are formed to overlap with the first groove (11), for example, to correspond to both ends of the first groove (11), so as to be connected to the first groove (11) and form a flow path through which the fluid flows.
  • the first inlet (12) and the first outlet (13) can be attached or detached to a tube connected to an external pump, so that the flow of the fluid circulating in the first groove (11) can be controlled at a desired speed through the pump.
  • the second inlet (22) and the second outlet (23) may be formed to overlap with the second groove (21), for example, to correspond to both ends of the second groove (21), and may be connected to the second groove (21) to form a flow path through which the fluid flows.
  • the second inlet (22) and the second outlet (23) may be detachably connected to a tube connected to an external pump, so that the flow of the fluid circulating in the second groove (21) may be controlled at a desired speed through the pump.
  • first inlet (12), the first outlet (13), the second inlet (22) and the second outlet (23) can all be attached to and detached from the tube, and the tube is connected to an external pump, so that the flow of the fluid injected into the first groove (11) and the second groove (21) by the pump and then discharged can be controlled.
  • the first groove (11) may include regions with different widths.
  • regions with different widths of the first groove (11) specifically, four regions convex on both sides (hereinafter defined as "convex regions") with a large width, may be formed, and these four convex regions of the first groove (11) may correspond to and overlap multiple openings (12, 13, 22, 23), respectively.
  • first groove (11) and the openings (12, 13, 22, 23) can be formed perpendicular to each other, and the fluid flowing into the openings (12, 13, 22, 23) and the first groove (11) and the second groove (21) by the joint formed perpendicularly at a right angle can rapidly change in velocity and pressure.
  • the fluid flowing into the first groove (11) and the second groove (21) may include a biofluid.
  • the biofluid may be circulated within the first groove (11) by being injected into the interior of the first groove (11) through the first inlet (12) and discharged to the outside through the first outlet (13), and may be circulated within the second groove (21) by being injected into the interior of the second groove (21) through the second inlet (22) and discharged to the outside through the second outlet (23).
  • the biofluid may be injected into the first groove (11) through the first inlet (12) and remain statically inside the first groove (11) without being discharged, and may be injected into the second groove (21) through the second inlet (22) and discharged to the outside through the second outlet (23) to circulate inside the second groove (21).
  • the biofluid may be circulated inside the first groove (11) by being injected into the interior of the first groove (11) through the first inlet (12) and discharged to the outside through the first discharge port (13), and may be injected into the interior of the second groove (21) through the second inlet (22) and remain statically inside the second groove (21) without being discharged.
  • the biofluid may be injected into the first groove (11) through the first inlet (12) and may exist in a static state inside the first groove (11) without being discharged, and may be injected into the second groove (21) through the second inlet (22) and may exist in a static state inside the second groove (21) without being discharged.
  • the biofluid may include, for example, substances selected from circulating and adherent cells, scaffolds, chemicals, and biomolecules, and specifically, the circulating and adherent cells may include all types of cells, such as endothelial cells, epithelial cells, stromal cells, and immune cells derived from animals including humans, the scaffold may include proteins or hydrogels containing constituent molecules of cells including extracellular matrix, the chemicals may include cell culture media and additives and drugs added to the cell culture media, and the biomolecules may include, but are not limited to, all molecules produced by organisms, such as signaling substances or neurotransmitters, and may include all types of substances that are generally available in the past, depending on the purpose of the experiment.
  • the circulating and adherent cells may include all types of cells, such as endothelial cells, epithelial cells, stromal cells, and immune cells derived from animals including humans
  • the scaffold may include proteins or hydrogels containing constituent molecules of cells including extracellular matrix
  • the chemicals may include cell culture media and additives and
  • the porous membrane (30) is placed between the substrate (10) and the cover portion (20), and may be placed, for example, between the first groove (11) and the second groove (21).
  • the porous membrane (30) may be arranged to overlap the first groove (11) and the second groove (21), and may be arranged to cover at least one area of the space between the first groove (11) and the second groove (21).
  • the porous membrane (30) may include, but is not limited to, a PET porous membrane, and may include various materials, and may include any material that can be conventionally used as a membrane (30).
  • the porous membrane (30) is arranged between the first groove (11) and the second groove (21) in the area where the first groove (11) and the second groove (21) overlap, so that the biofluid injected into the first groove (11) can be selectively moved to the second groove (21), or conversely, the biofluid injected into the second groove (21) can be selectively moved to the first groove (11).
  • the intercellular bonds of the endothelial cells can be weakened, inducing condensation of the endothelial cells. This weakens the intercellular bonds of the endothelial cells, which can easily cause the collapse of the endothelial cell barrier cultured on the porous membrane (30). This collapse of the endothelial cell barrier causes disordered transendothelial migration (TEM) of cancer cells through the endothelial cells, making it difficult to maintain the membrane permeability of the porous membrane (30) on which the endothelial cells are cultured in an environment similar to that in vivo.
  • TEM transendothelial migration
  • the present invention provides, as an optional embodiment, a porous membrane (30) that can be coated with an extracellular matrix oriented in one direction.
  • a constant flow can be applied to a biofluid containing the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix can be aligned and oriented in one direction, and a fiber-shaped extracellular matrix coating layer can be formed.
  • a biofluid containing an extracellular matrix may first be injected into the second groove (21) so that the extracellular matrix may be coated on the surface of the second groove (21) and the porous membrane (30) facing the second groove direction.
  • a constant flow may be applied to the biofluid so that the extracellular matrix may be oriented and aligned in one direction, and a fiber-shaped extracellular matrix coating layer may be formed on the surface of the second groove (21) and the porous membrane (30) facing the second groove direction.
  • endothelial cells can be introduced and aligned on a fiber coating layer in which the extracellular matrix is aligned.
  • Endothelial cells cultured in these aligned fiber structures can exhibit enhanced cell proliferation rates and increased expression of genes related to cell-to-cell adhesion, enabling them to function as excellent barriers without collapsing even when co-cultured with cancer cells.
  • the barrier of endothelial cells cultured on the aligned fiber coating layer can maintain structural stability even in a co-culture environment with cancer cells, which can provide a physiological advantage of restricting the disordered transendothelial migration (TEM) of cancer cells and maintaining membrane permeability.
  • TEM disordered transendothelial migration
  • first groove (11) and the second groove (21) of the biomimetic chip (1) can be separated by a porous membrane (30) to form a straight-line microfluidic channel or chamber, that is, a straight-line microfluidic channel or chamber including a separate inlet and outlet can be formed in each of the first groove (11) and the second groove (21), so that various treatments such as cells, scaffolds, and drugs can be performed in the microfluidic channels of each of the first groove (11) and the second groove (21) depending on the model to be applied.
  • an extracellular matrix when applying a circulation model to a biomimetic chip (1), first, an extracellular matrix can be injected into the second groove (21) through the second inlet (22) of the biomimetic chip (1).
  • the PLL (Poly-L-Lysine) coating agent and extracellular matrix protein which are easy for cell attachment and are injected through the second inlet (22), can be discharged through the second outlet (23), thereby coating the second groove (21).
  • human pulmonary vascular endothelial cells and a culture medium are injected and discharged again through the second inlet (22) and the second outlet (23), thereby forming a monolayer of human pulmonary vascular endothelial cells on the surface of the second groove (21), so that an in vivo blood vessel can be simulated in the second groove (21).
  • cancer cells can be circulated in the second groove (21) through the second inlet (22) and the second outlet (23), and cancer cells (circulating tumor cells) circulating in the second groove (21) can attach onto the simulated endothelial cells.
  • some cancer cells can move to the first groove (11) through the porous membrane (30) and infiltrate into the extracellular matrix formed in the first groove (11).
  • pulmonary vascular endothelial cells can be labeled with Green CMFDA Dye and circulating cancer cells can be labeled with Red CMFPX Dye using CellTracker TM .
  • the extracellular matrix and coating agent can be uniformly coated throughout the microfluid channel or chamber, human pulmonary vascular cells can be uniformly cultured as a monolayer, and circulating cancer cells can be uniformly attached to endothelial cells.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating an example of a method for manufacturing a biomimetic chip according to another embodiment of the present invention.
  • a method for manufacturing a biomimetic chip may include a step of preparing a substrate, a cover part, and a porous membrane (S100), a step of surface-treating the substrate and the cover part with plasma gas (S200), a step of surface-treating the porous membrane with a silane coupling agent (S300), and a step of bonding the surface-treated substrate, cover part, and porous membrane (S400).
  • the substrate (10) and the cover portion (20) can be manufactured using a mold having a shape of a first groove (11) and a second groove (21) by milling with a CNC machine, and can be prepared by a molding method in which liquid polydimethylsiloxane (PDMS) is poured into the mold to imitate the shape of the mold, and the cover portion (20) can be prepared by additionally forming a plurality of openings with a desired diameter using a puncher in the PDMS imitated in the mold.
  • PDMS liquid polydimethylsiloxane
  • a porous membrane can be prepared by manufacturing a PET thin film to correspond to the length of the second groove (21).
  • Figure 4 is a process diagram schematically illustrating an example of a method for manufacturing a biomimetic chip of Figure 3.
  • the substrate (10) and the cover portion (20) may be surface-treated with oxygen plasma (O 2 plasma).
  • oxygen plasma O 2 plasma
  • PDMS forming the substrate (10) and the cover portion (20) has a surface composed of CH 3 - and thus has hydrophobicity.
  • the surface of PDMS may be substituted from CH 3 - to OH - and may become hydrophilic.
  • the oxygen plasma (O 2 plasma) may be treated under conditions of 400 mTorr to 500 mTorr and 80 W to 120 W for 1 to 3 minutes.
  • the porous membrane (30) may be surface-treated with a silane coupling agent, and the silane coupling agent may specifically include a (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) coupling agent.
  • the APTES coupling agent may be prepared by adding 5 molar% of APTES to a solvent containing ethanol (Et-OH) or distilled water, and may be treated on the surface of the porous membrane (30) by heating to 70°C to 90°C.
  • porous membrane (30) surface-treated with APTES in this way can have its surface modified with amino groups.
  • the substrate (10) and cover part (20) surface-treated with oxygen plasma (O2 plasma) have hydroxyl groups (OH - ) on their surfaces, and the porous membrane (30) surface-treated with an APTES coupling agent has amino groups on its surface, so that the substrate (10) and cover part (20) can form a strong covalent bond with the porous membrane (30). Therefore, by arranging the porous membrane (30) between the substrate (10) and the cover part (20), the substrate (10), the cover part (20), and the porous membrane (30) can be firmly attached to each other.
  • oxygen plasma O2 plasma
  • the bonding strength between the substrate (10), the cover portion (20), and the porous membrane (30) may vary depending on the solvent used in the APTES coupling agent.
  • Figure 5 is a graph showing the bonding strength of a silane coupling agent according to a solvent.
  • the fluid pressure that the biomimetic chip can withstand without fluid leakage is approximately 23 psi
  • ethanol (Et-OH) is used as a solvent
  • the fluid pressure that the biomimetic chip can withstand without fluid leakage is approximately 35 psi. It can be confirmed that the bonding strength is approximately 1.5 times stronger when ethanol is used than when distilled water is used as a solvent.
  • Figure 6 is a photograph showing the cell culture results of a biomimetic chip manufactured using the biomimetic chip manufacturing method of Figure 3.
  • human pulmonary vascular endothelial cells cultured in a microfluidic channel were stained with VE-cadherin (endothelial specific adhesion molecule, White) and DAPI (nuclear DNA, Blue) markers, and then fluorescence analysis was performed to confirm that the human pulmonary vascular endothelial cells injected into the microfluidic channel formed a monolayer on the surface of the microfluidic channel, and that blood vessels in vivo were mimicked in the microfluidic channel.
  • VE-cadherin endothelial specific adhesion molecule, White
  • DAPI nuclear DNA, Blue
  • Figure 7 is a photograph showing the experimental results of a biomimetic chip manufactured using the biomimetic chip manufacturing method of Figure 3.
  • FIG. 7 shows human pulmonary vascular endothelial cells cultured in the second groove, (b) shows circulating cancer cells circulating in the second groove, and (C) shows cancer cells attached to human pulmonary vascular endothelial cells formed in the second groove.
  • pulmonary vascular endothelial cells are cultured in a monolayer at a uniform density in a microchannel having a straight structure, and it can be confirmed that cancer cells are uniformly attached to the top of the endothelial cells without fluid leakage even when circulating cancer cells using tubing.
  • the biomimetic chip maintains a constant circulation rate of fluid within the microfluidic channel, thereby inducing attachment at a uniform density on the microchannel surface during cell culture and circulation, and can be immediately and strongly attached through chemical bonding by combining using oxygen plasma and a silane coupling agent.
  • Figure 8 is a flowchart illustrating an example of an extracellular matrix coating method according to another embodiment of the present invention.
  • the extracellular matrix coating method may include a step of introducing a solution containing an extracellular matrix protein onto a substrate (S1000), a step of forming a constant flow in the solution (S2000), a step of coating the extracellular matrix protein so that it is directionally aligned in the direction of the flow (S3000), and a step of introducing cells onto the extracellular matrix coating having the directionality (S4000).
  • the substrate may be a transparent substrate whose inside can be observed from the outside, and may include, for example, silicon, and as a specific example, may include polydimethylsiloxane (PDMS), and as a more specific example, may include a biomimetic chip according to an embodiment of the present invention.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • a first groove and a second groove may be positioned on the first groove and overlapping the first groove within the substrate, and a porous membrane may be positioned between the first groove and the second groove, such that a space may be defined by one side of the first groove and the porous membrane facing the first groove direction, and a space may be defined by the other side of the second groove and the porous membrane facing the second groove direction.
  • a solution containing the extracellular matrix can be injected into the space defined by the second groove and the other side of the porous membrane.
  • a constant shear stress can be applied to the solution injected into the space defined by the second groove and the other surface of the porous membrane by a pump located outside the substrate, so that a constant flow can be formed in the solution.
  • the extracellular matrix contained in the solution in which a constant flow is formed in the space defined by the second groove and the other side of the porous membrane can be aligned in one direction in the space defined by the second groove and the other side of the porous membrane.
  • the extracellular matrix contained in the solution can be coated in the form of fibers on the second groove and the other side of the porous membrane.
  • Figure 9 is a schematic diagram schematically illustrating an example of the extracellular matrix coating method of Figure 8.
  • the other side (310) of the porous membrane (300) can be coated with extracellular matrix proteins aligned in one direction.
  • a solution having a constant flow in the space (S) defined by the second groove (211) and the other side (310) of the porous membrane (300) may include, for example, fibronectin, which is an extracellular matrix, and when a solution containing fibronectin is injected with a constant flow into the space (S) defined by the second groove (211) and the other side (310) of the porous membrane (300), fibronectin may be arranged on the other side (310) of the membrane (300).
  • Figure 10 is a photograph showing the alignment of the extracellular matrix coated with the extracellular matrix coating method of Figure 8.
  • cells can be cultured onto the extracellular matrix coating having the directionality, and at this time, the cells can be cultured while being oriented along the extracellular matrix having the directionality.
  • cells are not limited to a single type of cell, but various types of cells can be introduced and cultured on an extracellular matrix depending on the experimental purpose.
  • Figure 11 is a photograph of cells cultured on an extracellular matrix coated with the extracellular matrix coating method of Figure 8, obtained by fluorescence analysis.
  • human umbilical vein endothelial cells cultured under coating conditions of static and flow conditions can be confirmed, which can be stained with markers of fibronectin (gray), fibrin (green), VE-cadherin (red), and DAPI (blue).
  • vascular endothelial cells As a result of culturing vascular endothelial cells (HUVECs) on a substrate coated with fibrin fibers, it was confirmed that vascular endothelial cells (HUVECs) cultured on the coated substrate under no-flow conditions (Static) showed irregular cell arrangement, whereas vascular endothelial cells (HUVECs) cultured along the coated aligned fibers under flow conditions (Flow) were arranged in a directionally ordered manner.
  • Static no-flow conditions
  • Flow vascular endothelial cells
  • vascular endothelial cells After flowing a solution containing fibronectin with a constant flow into the microfluidic channel of a biomimetic chip, plasma and calcium chloride with a constant flow were sequentially flowed, thereby culturing vascular endothelial cells (HUVECs) on a membrane coated with fibrin fibers aligned with an orientation in the direction of flow.
  • VECs vascular endothelial cells
  • vascular endothelial cells By statically positioning a solution containing fibronectin, plasma, and calcium chloride in the microfluidic channels of a biomimetic chip, vascular endothelial cells (HUVECs) were cultured on a membrane coated with fibrin fibers.
  • vascular endothelial cells By flowing a solution containing fibronectin through the microfluidic channels of the biomimetic chip, vascular endothelial cells (HUVECs) were cultured on the fibronectin-coated membrane.
  • Vascular endothelial cells were cultured on fibronectin-coated experimental well plates.
  • Endothelial cells (HUVECs) were cultured in uncoated experimental well plates.
  • Figure 12 is a graph evaluating the function of cells cultured on an extracellular matrix coated under various conditions.
  • vascular endothelial cells (HUVECs) cultured in Example 1 exhibited an excellent barrier function by showing the lowest permeability along with a high proliferation rate compared to Example 2 and Comparative Examples 1 to 3.
  • vascular endothelial cells (HUVECs) cultured in Example 1 was improved through analysis of gene expression related to cell-to-cell binding and adhesion.
  • MDA-MB-231 a highly metastatic breast cancer cell line, was co-cultured with vascular endothelial cells (HUVECs) cultured in Example 1.
  • VAVECs vascular endothelial cells
  • Example 2 MDA-MB-231, a highly metastatic breast cancer cell line, was co-cultured with cultured vascular endothelial cells (HUVECs).
  • HAVECs vascular endothelial cells
  • MDA-MB-231 a highly metastatic breast cancer cell line, was co-cultured with cultured vascular endothelial cells (HUVECs).
  • MCF-7 a low-metastatic breast cancer cell line
  • HAVECs vascular endothelial cells
  • MCF-7 a low-metastatic breast cancer cell line
  • HAVECs cultured vascular endothelial cells
  • MCF-7 a low-metastatic breast cancer cell line, was co-cultured with cultured vascular endothelial cells (HUVECs).
  • Figure 13a is a photograph of a fluorescent analysis of cells cultured on an extracellular matrix coated under various conditions and co-cultured with a cancer cell line
  • Figure 13b is a graph showing the relative quantification of the fluorescently labeled tight junction protein in Figure 13a.
  • the barrier function of the endothelial cell layer can be evaluated using two breast cancer cell lines with different metastatic properties.
  • Experimental Examples 1 to 3 are co-cultures of highly metastatic MDA-MB-231, which has the property of migrating by destroying the tight junctions of endothelial cells, with the vascular endothelial cells (HUVECs) of Examples 1, 2, and Comparative Example 1, and Experimental Examples 4 to 6 are co-cultures of low-metastatic MCF-7, which has a superior binding force between cancer cells, with the vascular endothelial cells (HUVECs) of Examples 1, 2, and Comparative Example 1.
  • Intercellular adhesion of endothelial cells was quantified by fluorescence using the tight junction protein (VE-Cadherin) as a marker.
  • VE-Cadherin tight junction protein
  • the vascular endothelial cells (HUVECs) cultured in Experimental Example 1 maintained the same amount of tight junction protein (VE-Cadherin) as in Example 1, which was not co-cultured with highly migratory MDA-MB-231, thereby maintaining the barrier.
  • the vascular endothelial cells (HUVECs) cultured in Experimental Examples 2 and 3 had a reduced amount of tight junction protein (VE-Cadherin) compared to Example 2 and Comparative Example 1, which were not co-cultured with MDA-MB-231, respectively, thereby destroying the barrier.
  • Experimental Examples 4 to 6 maintain the same tight junction protein quantification as Examples 1, 2, and Comparative Example 3, which were not co-cultured with low-metastatic MCF-7, respectively, thereby maintaining the barrier.
  • vascular endothelial cells (HUVECs) coated on the extracellular matrix aligned with anti-metastatic properties maintained the barrier without collapse when co-cultured with highly metastatic MDA-MB-231 or low-metastatic MCF-7.
  • Figure 14a is a photograph of a fluorescent analysis of cancer cell metastasis during co-culture of cells cultured on an extracellular matrix coated under various conditions and a cancer cell line
  • Figure 14b is a graph showing the number of cancer cells per volume indicated by fluorescent light in Figure 14a
  • Figure 14c is a graph showing the permeability coefficient due to cancer cell metastasis during co-culture of cells cultured on an extracellular matrix coated under various conditions and a cancer cell line.
  • vascular endothelial cells can be stained with Red CMFDA Dye and cancer cells can be stained with Green CMFPX Dye, and when co-cultured with highly metastatic MDA-MB-231, it can be confirmed that fewer metastatic cancer cells (green marker) are observed in Experimental Example 1 compared to Experimental Examples 2 and 3.
  • MDA-MB-231 which has strong tight junction destruction characteristics, showed metastatic behavior in all of Experimental Examples 1 to 3, but it can be confirmed that the number of metastatic cancer cells confirmed in Experimental Example 1 was the lowest, and through this, it can be seen that the vascular endothelial cells of Experimental Example 1 showed the lowest cancer cell invasion rate compared to Experimental Examples 2 and 3. In other words, it can be seen that the barrier function of the vascular endothelial cells of Experimental Example 1 was improved compared to Experimental Examples 2 and 3.
  • Experimental Example 1 maintains 1, while Experimental Examples 2 and 3 exceed 1, indicating that the barrier function of the vascular endothelial cells of Experimental Example 1 is improved compared to Experimental Examples 2 and 3.
  • vascular endothelial cells (HUVECs) coated on the extracellular matrix aligned with anti-metastatic properties maintained the barrier without collapse when co-cultured with highly metastatic MDA-MB-231 or low-metastatic MCF-7.
  • the extracellular matrix coating method according to the embodiment of the present invention can implement a robust cell barrier similar to an in vivo environment by coating an extracellular matrix aligned with anti-radiation properties in the form of fibers on a biomimetic chip.

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Abstract

본 발명은, 일 면에 제1 홈이 형성된 기판, 상기 기판과 대향하도록 배치되고, 상기 기판을 바라보는 면에 제2 홈이 형성된 커버부, 상기 기판과 상기 커버부 사이에, 적어도 상기 제1 홈 및 상기 제2 홈과 중첩된 영역을 갖도록 배치된 다공성 멤브레인 및 상기 커버부에 상기 커버부의 두께 방향 또는 두께 방향에 수직한 방향으로 관통된 제1 주입구, 제1 배출구, 제2 주입구 및 제2 배출구를 구비하는 복수의 개구를 포함하는 생체모사 칩에 관한 것으로, 본 발명의 실시예에 따른 생체모사 칩은 미세 유체 채널 내부에서 유체의 순환 속도를 일정하게 유지시켜 세포의 배양 및 순환 시 미세 채널 표면에 균일한 밀도로 부착을 유도하고, 산소 플라즈마와 실란 커플링제의 활용으로 결합됨으로써, 화학결합을 통하여 즉각적이고, 강하게 부착될 수 있다.

Description

생체모사 칩, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포 외 기질 코팅방법
본 발명은 생체모사 칩, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포 외 기질 코팅방법에 관한 것이다.
인체 유래 3차원 세포 배양 기술과 혈류 모사 미세 유체역학 기술을 융합하여 인체 장기의 구조와 미세환경을 체외(in vitro)에서 재현하는 생체모사 칩(Micro Physiological System, MPS)은 미세 유체 채널 내에서 세포를 일정 시간, 일정 공간에 고정시키고 세포의 성장 등을 관찰하는 기술이다.
MPS는 질환 메커니즘, 신약 스크리닝, 환자 맞춤형 의료 기술 등 다양한 분야에서 활용되며 사용 목적에 따라 칩 내부의 미세 유체 채널이 single, double, multi 채널 등의 디자인으로 다양하게 적용된다.
세포의 순환 모델을 적용하기 위한 MPS에서, 종래의 미세 유체 채널의 구조는 curve 구조를 가지는데, 순환하는 세포를 모사하기 위하여 이 curve 구조의 미세 유체 채널에 유체의 흐름(flow)을 줄 경우, curve 안쪽으로 유체의 흐름이 집중되면서 유체의 속도차이가 발생될 수 있다. 이러한 curve 구역에서의 유체의 속도 차이로 인하여 미세 유체 채널의 표면 수정(modification)시 사용되는 코팅제가 curve 구역에 쌓이게 되어 미세 유체 채널의 균일한 표면 처리를 어렵게 하고, 추후 세포배양 시에, 미세 유체 채널 표면에 배양되는 세포의 불균일한 접합을 초래하는 문제가 있다.
한편, 미세 유체 채널 내에서 세포를 일정 시간, 일정 공간에 고정시키고 세포의 성장 등을 관찰하기 위해 미세 유체 채널에 세포 외 기질이 코팅될 수 있다.
현재 상용화된 세포 외 기질 코팅 방식은 주로 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌과 같은 단일 단백질을 이용한 단순 코팅이나, 매트리젤 (Matrigel)과 같은 복합 기저막 단백질을 이용한 코팅이 대표적이다. 이러한 기존 코팅 방식들은 단순 침지나 흡착 방식으로 형성된 코팅은 대부분 무작위적 배향을 가진 2차원적 구조를 형성하여 생체 내 기저막의 정교한 구조적 특성을 효과적으로 반영하지 못하고, 생체 내 복잡한 세포 외 기질 환경을 모사하기 어렵다는 문제가 있다.
본 발명에서 생체모사 칩은 직선 구조의 미세 유체 채널 도입을 통하여 세포 배양 및 세포 순환 모델이 용이하게 적용될 수 있다.
또한, 생체 내(in vivo) 환경과 유사한 견고한 세포장벽을 구현할 수 있다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예는, 일 면에 제1 홈이 형성된 기판, 상기 기판과 대향하도록 배치되고, 상기 기판을 바라보는 면에 제2 홈이 형성된 커버부, 상기 기판과 상기 커버부 사이에, 적어도 상기 제1 홈 및 상기 제2 홈과 중첩된 영역을 갖도록 배치된 다공성 멤브레인 및 상기 커버부에 상기 커버부의 두께 방향 또는 두께 방향에 수직한 방향으로 관통된 제1 주입구, 제1 배출구, 제2 주입구 및 제2 배출구를 구비하는 복수의 개구를 포함하는 생체모사 칩에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 생체모사 칩은 미세 유체 채널 내부에서 유체의 순환 속도를 일정하게 유지시켜 세포의 배양 및 순환 시 미세 채널 표면에 균일한 밀도로 부착을 유도하고, 산소 플라즈마와 실란 커플링제의 활용으로 결합됨으로써, 화학결합을 통하여 즉각적이고, 강하게 부착될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 세포 외 기질 코팅방법은 다공성 멤브레인에 정렬된 섬유 구조를 도입하여 세포-기질 상호작용을 최적화함으로써, 체내 기저막의 기능을 효과적으로 구현하여 세포 장벽의 기능을 강화시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체모사 칩의 일 예를 개략적으로 도시한 분해 사시도이다.
도 2는 도 1의 생체모사 칩의 일 예를 개략적으로 도시한 단면도이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체모사 칩 제조 방법의 일 예를 도시한 순서도이다.
도 4는 도 3의 생체모사 칩 제조 방법의 일 예를 개략적으로 도시한 공정도이다.
도 5는 용매에 따른 실란 커플링제의 결합력을 도시한 그래프이다.
도 6은 도 3의 생체모사 칩 제조 방법으로 만들어진 생체모사 칩의 세포배양 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 도 3의 생체모사 칩 제조 방법으로 만들어진 생체모사 칩의 실험결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 외 기질 코팅방법의 일 예를 도시한 순서도이다.
도 9는 도 8의 세포 외 기질 코팅방법의 일 예를 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 10은 도 8의 세포 외 기질 코팅방법으로 코팅된 세포 외 기질의 정렬도를 나타내는 사진이다.
도 11은 도 8의 세포 외 기질 코팅방법으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포를 형광분석한 사진이다.
도 12는 다양한 조건으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포의 기능을 평가한 그래프이다.
도 13a는 다양한 조건으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포와 암세포주를 공배양한 것을 형광분석한 사진이다.
도 13b는 도 13a에서 형광표시된 밀착연결 단백질의 상대 정량을 나태는 그래프이다.
도 14a는 다양한 조건으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포와 암세포주의 공배양시 암세포의 전이를 형광분석한 사진이다.
도 14b는 도 14a에서 형광표시된 암세포의 부피당 개수를 나태는 그래프이다.
도 14c는 다양한 조건으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포와 암세포주의 공배양시 암세포의 전이에 의한 투과계수를 나타낸 그래프이다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예는, 일 면에 제1 홈이 형성된 기판, 상기 기판과 대향하도록 배치되고, 상기 기판을 바라보는 면에 제2 홈이 형성된 커버부, 상기 기판과 상기 커버부 사이에, 적어도 상기 제1 홈 및 상기 제2 홈과 중첩된 영역을 갖도록 배치된 다공성 멤브레인 및 상기 커버부에 상기 커버부의 두께 방향 또는 두께 방향에 수직한 방향으로 관통된 제1 주입구, 제1 배출구, 제2 주입구 및 제2 배출구를 구비하는 복수의 개구를 포함하는 생체모사 칩에 관한 것이다.
상기 제1 홈은 상기 제2 홈의 길이보다 길게 형성되고, 상기 제1 주입구 및 상기 제1 배출구는 상기 제1 홈의 끝 단부에 대응되고, 상기 제2 주입구 및 상기 제2 배출구는 상기 제2 홈의 끝 단부에 대응될 수 있다.
상기 제1 홈은 일 방향으로 연장된 길이와 상기 길이와 교차하는 폭을 가지며, 상기 폭은 상기 길이를 따라 같거나 큰 폭을 가지고 서로 이격되어 형성되는 복수 개의 볼록 영역을 포함할 수 있다.
상기 볼록 영역들은 상기 제1 주입구, 상기 제1 배출구, 상기 제2 주입구 및 상기 제2 배출구와 중첩될 수 있다.
상기 제1 홈 및 상기 제2 홈에는 바이오 유체가 주입될 수 있다.
상기 바이오 유체는 순환세포, 부착세포, 스캐폴드, 화학물질 및 생체분자 중 선택되는 물질을 포함할 수 있다.
상기 바이오 유체는 상기 제1 홈과 상기 제2 홈이 중첩되는 영역에서 상기 다공성 멤브레인을 통해 선택적으로 교환될 수 있다.
상기 순환 및 부착세포는 단일층이나 다층구조로 배양되거나 칩의 채널을 따라 순환하며 배양될 수 있다.
상기 스캐폴드는 세포외 기질(extracellular matrix)을 포함하는 단백질 또는 하이드로겔 단백질을 포함할 수 있다.
상기 화학물질은 세포 배양배지 및 첨가물을 포함할 수 있다.
상기 생체분자는 신호전달물질 또는 신경전달물질을 포함할 수 있다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예는, 기판, 커버부 및 다공성 멤브레인을 준비하는 단계, 상기 기판 및 상기 커버부를 플라즈마 기체로 표면 처리하는 단계, 상기 다공성 멤브레인을 실란(silane) 커플링제로 표면 처리하는 단계 및 표면 처리된 상기 기판, 상기 커버부 및 상기 다공성 멤브레인을 접합하는 단계를 포함하는 생체모사 칩 제조 방법을 개시한다.
상기 플라즈마 기체는 산소 또는 공기를 포함하고, 상기 산소 또는 상기 공기는 상기 기판 및 상기 커버부의 표면을 하이드록실기로 수정(modification)할 수 있다.
상기 실란 커플링제는 물 또는 에탄올을 용매로 포함할 수 있다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예는, 세포 외 기질 단백질을 포함하는 용액을 기판 상에 도입하는 단계, 상기 용액에 일정한 유동을 형성하는 단계, 상기 세포 외 기질 단백질이 상기 유동 방향으로 방향성을 갖고 정렬되도록 코팅되는 단계 및 상기 방향성을 가지는 상기 세포 외 기질 코팅 상에 세포를 도입하는 단계를 포함하는 세포 외 기질 코팅방법을 제공한다.
상기 코팅되는 단계에서 혈장 및 염화칼슘(CaCl2)이 상기 일정한 유동을 형성하며 더 주입될 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명의 효과 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
본 명세서 전체에서, 제1, 제2 등의 용어는 한정적인 의미가 아니라 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하는 목적으로 사용되었다.
본 명세서 전체에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서 전체에서, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다.
본 명세서 전체에서, 막, 영역, 구성 요소 등의 부분이 다른 부분 위에 또는 상에 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우 뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.
각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.
도면에서는 설명의 편의를 위하여 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다. 예컨대, 도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 임의로 나타내었으므로, 본 발명이 반드시 도시된 바에 한정되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명하기로 하며, 도면을 참조하여 설명할 때 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 도면부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 생체모사 칩, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포 외 기질 코팅방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체모사 칩의 일 예를 개략적으로 도시한 분해 사시도이고, 도 2는 도 1의 생체모사 칩의 일 예를 개략적으로 도시한 단면도이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 생체모사 칩(1)은 일 면에 제1 홈(11)이 형성된 기판(10), 제2 홈(21)이 형성되며, 제2 홈(21)과 교차하게 두께 방향으로 형성된 복수 개의 개구(12,13,22,23)를 포함하는 커버부(20) 및 기판(10)과 커버부(20) 사이에 배치되며, 상기 제1 홈(11) 및 상기 제2 홈(21)의 적어도 일 영역을 덮는 다공성 멤브레인(30)을 포함할 수 있다.
기판(10)은 일 면의 중앙부에 제1 홈(11)이 형성될 수 있다. 일 예로, 제1 홈(11)은 기판(10)의 중앙부에 일 방향으로 길이를 가지고 형성되며, 길이와 교차하는 방향의 폭을 가질 수 있다. 제1 홈(11)이 길이와 폭을 가지고 형성됨으로써, 제1 홈(11)에는 유체가 흐르는 공간이 정의될 수 있으며, 따라서, 제1 홈(11)은 미세 유체 채널 또는 챔버의 역할을 할 수 있으며, 후술하는 제1 주입구(12) 및 제1 배출구(13)와 연결되어 제1 바이오 유체의 흐름이 유도되어 제1 바이오 유체가 제1 홈(11) 내부를 순환할 수 있다.
선택적 실시예로서 제1 홈(11)은 길이와 교차하는 폭이 일정하지 않고 더 큰 폭을 가지는 영역이 형성될 수 있다. 이때, 더 큰 폭을 가지는 영역은 복수 개 형성될 수 있으며, 후술하는 제1 주입구(12) 및 제1 배출구(13)와 대응할 수 있다.
한편, 기판(10)은 외부에서 내부가 관측가능한 투명 기판일 수 있다. 일 예로 기판(10)은 투명하게 형성될 수 있는 재료라면 무엇이든 사용 가능하고, 구체적 예로, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리에테르설폰(polyethersulfone, PES), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리(스티렌설포네이트)(poly(styrenesulfonate)), 폴리이미드(polyimide), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리에스테르(polyester), 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether, PFPE), 폴리카보네이트(polycarbonate) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
커버부(20)는 기판(10)에 대향하도록 배치될 수 있다. 커버부(20)는 제2 홈(21)을 포함한다. 예를들면 제2 홈(21)은 적어도 제1 홈(11)과 중첩된 영역을 갖도록 형성될 수 있다.
한편, 커버부(20)는 외부에서 내부가 관측가능한 투명 기판일 수 있다. 일 예로 커버부(20)는 투명하게 형성될 수 있는 재료라면 무엇이든 사용 가능하고, 구체적 예로, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리에테르설폰(polyethersulfone, PES), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리(스티렌설포네이트)(poly(styrenesulfonate)), 폴리이미드(polyimide), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리에스테르(polyester), 퍼플루오로폴리에테르(Perfluoropolyether, PFPE), 폴리카보네이트(polycarbonate) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
구체적 예로서 커버부(20)는 커버부(20)의 면 중 기판(10)을 향하는 일 면에 제2 홈(21)이 형성될 수 있다.
선택적 실시예로서 제2 홈(21)은 커버부(20)의 일면에 중앙 또는 이와 인접한 영역에 형성될 수 있다.
또한, 제1 홈(11)과 제2 홈(21)은 적어도 일 영역에서 중첩되어 관 형태를 형성할 수 있다. 이때, 제2 홈(21)은 제1 홈(11)보다 길이가 작게 형성되어, 제1 홈(11)의 일 영역에서 중첩될 수 있다. 구체적으로, 제2 홈(21)은 제1 홈(11)의 중심을 따라 양측으로 제1 홈(11)의 길이 방향으로 중첩될 수 있으며, 제2 홈(21)의 양측단부는 제1 홈(11)의 양측단부보다 내측에 위치할 수 있다.
한편, 제2 홈(21)과 교차하는 방향, 예를 들면 수직한 두께방향(Z) 또는 두께방향(Z)에 수직한 방향 즉, 제2 홈과 수평한 방향으로 복수 개의 개구(12,13,22,23)가 형성될 수 있다.
일 예로, 제2 홈(21)은 제1 홈(11)과 마주보며 중첩되어 관 형태를 형성하고, 후술하는 다공성 멤브레인(30)에 의해 분리되어 제1 홈(11) 및 제2 홈(21) 각각은 미세 유체 채널 또는 챔버의 역할을 할 수 있다. 이때, 제1 홈(11)과 다공성 멤브레인(30)에 의해 형성된 미세 유체 채널의 깊이(depth)는 150㎛ 내지 250㎛일 수 있고, 제2 홈(11)과 다공성 멤브레인(30)에 의해 형성된 미세 유체 채널의 깊이(depth)는 800㎛ 내지 1200㎛일 수 있다.
복수 개의 개구(12,13,22,23)는 각각 제1 주입구(12), 제1 배출구(13), 제2 주입구(22) 및 제2 배출구(23)를 포함할 수 있다.
일 예로, 제1 주입구(12) 및 제1 배출구(13)는 서로 이격되도록 배치될 수 있고, 적어도 제2 홈(21)과 이격되고 제2 홈(21)의 외측에 각각 배치될 수 있다.
또한, 제1 주입구(12) 및 제1 배출구(13)는 제1 홈(11)에 대응되도록 형성될 수 있고, 예를들면 제1 주입구(12) 및 제1 배출구(13)는 각각 제1 홈(11)의 일측 단부 및 타측 단부에 대응되도록 형성될 수 있다.
기판(10)에 형성된 제1 홈(11)의 끝단부에 대응되도록 형성될 수 있고,
제2 주입구(22) 및 제2 배출구(23)는 서로 이격되도록 배치될 수 있고, 적어도 제1 주입구(12) 및 제1 배출구(13)과 이격되고 제1 주입구(12) 및 제1 배출구(13)의 내측에 배치될 수 있다.
또한, 제2 주입구(22) 및 제2 배출구(23)는 커버부(20)의 제2 홈(21)에 대응되도록 형성될 수 있고, 예를들면 제2 주입구(22) 및 제2 배출구(23)는 각각 제2 홈(21)의 일측 단부 및 타측 단부에 대응되도록 형성될 수 있다.
이때, 제1 홈(11)의 길이와 제2 홈(21)의 길이가 서로 같거나 다르게 형성되어, 제1 주입구(12)와 제2 주입구(22) 및 제1 배출구(13)와 제2 배출구(23)는 각각 서로 이격되어 형성될 수 있다.
제1 주입구(12)와 제1 배출구(13)는 제1 홈(11)과 중첩, 예를들면 제1 홈(11)의 양측단부에 각각 대응되도록 형성되어 제1 홈(11)과 연결되어 유체가 흐르는 유로를 형성할 수 있다. 이때, 제1 주입구(12) 및 제1 배출구(13)는 외부 펌프와 연결된 튜브와 탈부착이 가능할 수 있어, 제1 홈(11)을 순환하는 유체의 흐름(flow)은 펌프를 통하여 원하는 속도로 조절될 수 있다.
제2 주입구(22)와 제2 배출구(23)는 제2 홈(21)과 중첩, 예를들면 제2 홈(21)의 양측단부에 각각 대응되도록 형성되어 제2 홈(21)과 연결되어 유체가 흐르는 유로를 형성할 수 있다. 이때, 제2 주입구(22) 및 제2 배출구(23)는 외부 펌프와 연결된 튜브와 탈부착이 가능할 수 있어, 제2 홈(21)을 순환하는 유체의 흐름(flow)은 펌프를 통하여 원하는 속도로 조절될 수 있다.
즉, 제1 주입구(12), 제1 배출구(13), 제2 주입구(22) 및 제2 배출구(23)는 모두 튜브와 탈부착이 가능할 수 있고, 튜브는 외부의 펌프와 연결되어, 펌프에 의해 제1 홈(11)과 제2 홈(21)으로 주입된 후 배출되는 유체의 흐름이 조절될 수 있다.
선택적 실시예로서 제1 홈(11)은 폭이 상이한 영역을 포함할 수 있다. 예를들면 도 1에는 제1 홈(11)의 폭이 상이한 영역, 구체적 예로서 폭이 크도록 양측으로 볼록한 영역(이하, '볼록 영역'이라고 정의한다)이 4개 형성될 수 있고, 이러한 제1 홈(11)의 4개의 볼록 영역은, 복수의 개구(12, 13, 22, 23)에 각각 대응되어 중첩될 수 있다.
한편, 제1 홈(11)과 개구들(12, 13, 22, 23)은 서로 수직하게 형성될 수 있는데 이렇게 직각을 가지고 수직하게 형성된 결합부에 의해 개구들(12,13, 22, 23)과 제1 홈(11)과 제2 홈(21)으로 유입되는 유체는 유속과 압력이 급격하게 변할 수 있다. 이때, 제1 홈(11)에 복수의 개구(12, 13, 22, 23)와 중첩된 볼록 영역이 형성됨으로써, 볼록 영역에 공간을 형성하고, 직각으로 수직하게 연결되는 제1 홈(11)과 복수의 개구(12, 13, 22, 23)의 결합부가 유선형을 갖도록 하여, 유체의 유동방향이 급격하게 변하는 것을 방지하여, 제1 홈(11)과 제2 홈(21)을 흐르는 유체의 유속과 유압이 변하는 것을 방지할 수 있고, 제1 홈(11) 및 제2 홈(21)에 유체가 흐르며 생기는 유체에 의한 전단응력을 일정하게 유지시켜 줄 수 있다.
한편, 제1 홈(11) 및 제2 홈(21)으로 유입되는 유체는 바이오 유체를 포함할 수 있다. 예를 들어 바이오 유체는 제1 주입구(12)를 통해 제1 홈(11)의 내부로 주입되어 제1 배출구(13)를 통해 외부로 배출되는 방법으로 제1 홈(11) 내부를 순환할 수 있고, 제2 주입구(22)를 통해 제2 홈(21)의 내부로 주입되어 제2 배출구(23)를 통해 외부로 배출되는 방법으로 제2 홈(21) 내부를 순환할 수 있다.
선택적 실시예로서, 바이오 유체는 제1 주입구(12)를 통해 제1홈(11) 내부로 주입되어 배출되지 않고 제1 홈(11) 내부에 정적인 상태로 존재할 수 있고, 제2 주입구(22)를 통해 제2 홈(21)의 내부로 주입되어 제2 배출구(23)를 통해 외부로 배출되는 방법으로 제2 홈(21) 내부를 순환할 수 있다.
선택적 실시예로서, 바이오 유체는 제1 주입구(12)를 통해 제1 홈(11)의 내부로 주입되어 제1 배출구(13)를 통해 외부로 배출되는 방법으로 제1 홈(11) 내부를 순환할 수 있고, 제2 주입구(22)를 통해 제2홈(21) 내부로 주입되어 배출되지 않고 제2홈(21) 내부에 정적인 상태로 존재할 수 있다.
선택적 실시예로서, 바이오 유체는 제1 주입구(12)를 통해 제1홈(11) 내부로 주입되어 배출되지 않고 제1홈(11) 내부에 정적인 상태로 존재할 수 있고, 제2 주입구(22)를 통해 제2홈(21) 내부로 주입되어 배출되지 않고 제2홈(21) 내부에 정적인 상태로 존재할 수 있다.
바이오 유체는 예를 들어 순환 및 부착세포, 스캐폴드, 화학물질 및 생체분자 중 선택되는 물질을 포함할 수 있고, 구체적으로, 순환 및 부착세포는 인간을 포함하는 동물 유래의 내피세포, 상피세포, 기질세포, 면역세포 등 모든 종류의 세포를 포함할 수 있고, 스캐폴드는 세포외 기질(extracellular matrix)을 포함하는 세포의 구성 분자들을 포함하는 단백질 또는 하이드로겔을 포함할 수 있으며, 화학물질은 세포 배양배지 및 세포 배양배지에 첨가되는 첨가물 및 약물 등을 포함할 수 있고, 생체분자는 신호전달물질 또는 신경전달 물질 등 유기체에 의해 생산되는 모든 분자들을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 실험의 목적에 따라 종래에 일반적으로 사용 가능한 모든 종류의 물질을 포함할 수 있다.
다공성 멤브레인(30)은 기판(10)과 커버부(20)사이에 배치되고, 예를들면 제1 홈(11)과 제2 홈(21)의 사이에 배치될 수 있다.
구체적 예로서 다공성 멤브레인(30)은 제1 홈(11) 및 제2 홈(21)과 중첩되도록배치될 수 있고, 제1 홈(11)과 제2 홈(21)의 사이의 공간의 적어도 일 영역을 덮도록 배치될 수 있다.
일 예로, 다공성 멤브레인(30)은 PET 다공성 멤브레인을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 다양한 소재가 포함될 수 있고, 종래에 멤브레인(30)으로 사용 가능한 소재라면 무엇이든 포함할 수 있다.
한편, 다공성 멤브레인(30)은 제1 홈(11)과 제2 홈(21)이 중첩되는 영역에서 제1 홈(11)과 제2 홈(21) 사이에 배치되어 제1 홈(11)에 주입되는 바이오 유체를 선택적으로 제2 홈(21)으로 이동시키거나, 반대로 제2 홈(21)에 주입되는 바이오 유체를 제1 홈(11)으로 선택적으로 이동시킬 수 있다.
선택적 실시예로 다공성 멤브레인(30)은 제2홈(21)에 주입되는 순환 암세포를 포함하는 바이오 유체를 제1 홈(11)으로 선택적으로 이동시킬 수 있다. 이때 다공성 멤브레인(30)의 제2 홈(21) 방향을 향하는 면에 배양된 내피세포의 경우 제2 홈(21)에 주입되어 이동되는 순환 암세포에 의해 침윤될 수 있다.
암세포의 경우 내피세포와 공배양할 시 내피세포의 세포 간 결합을 약화시켜 내피세포의 응축을 유도할 수 있으며 이로인해 내피세포의 세포간 결합이 약화되어 다공성 멤브레인(30)에 배양된 내피세포 장벽의 붕괴가 쉽게 일어날 수 있다. 이러한 내피세포 장벽의 붕괴는 내피세포를 통한 암세포의 무질서한 내피세포층 투과 이동(Transendothelial migration, TEM)을 야기함으로써, 내피세포가 배양된 다공성 멤브레인(30)의 막 투과도를 생체 내(in vivo)와 유사한 환경으로 유지하기 어려운 문제가 있다.
이를 해결하기 위해 본 발명은 선택적 실시예로서 다공성 멤브레인(30)에 일 방향으로 배향된 세포 외 기질이 코팅될 수 있다. 예들 들어 일 방향으로 배향된 세포 외 기질을 코팅하기 위해 세포 외 기질을 포함하는 바이오 유체에 일정한 유동을 가할 수 있다. 이렇게 일정한 유동을 가하면 세포 외 기질은 한 방향으로 배향되어 정렬될 수 있으며, 섬유(fiber) 형태의 세포 외 기질 코팅층이 형성될 수 있다.
선택적 실시예로 제2 홈(21)에 내피세포와 암세포가 공배양될 경우, 제2 홈(21)에는 세포 외 기질을 포함하는 바이오 유체체가 먼저 투입되어 제2 홈(21)과 다공성 멤브레인(30)의 제2 홈 방향을 향하는 면에 세포 외 기질이 코팅될 수 있다. 이때 상기 바이오 유체에 일정한 유동을 가할 수 있어, 세포 외 기질은 한 방향으로 배향되어 정렬될 수 있으며, 제2 홈(21) 및 다공성 멤브레인(30)의 제2 홈 방향을 향하는 면에 섬유(fiber) 형태의 세포 외 기질 코팅층을 형성할 수 있다.
위와 같이 세포 외 기질이 배향되어 정렬된 섬유 코팅층 상에 내피세포를 도입하여 배향 시킬 수 있다.
이러한 정렬된 섬유 구조에서 배양된 내피세포는 세포 증식률이 향상될 수 있고, 세포 간 결합 관련 유전자 발현이 증가할 수 있어 암세포와 공배양시에도 붕괴되지 않고 우수한 장벽 기능을 할 수 있다.
결과적으로 정렬된 섬유 코팅층 상에 배양된 내피세포의 장벽은 암세포와의 공배양 환경에서도 구조적 안정성을 유지할 수 있으며, 이는 암세포의 무질서한 내피세포층 투과 이동 (Transendothelial migration, TEM)을 제한하고 막 투과도를 유지하는 생리학적 장점을 제공할 수 있다.
한편, 생체모사 칩(1)의 제1 홈(11)과 제2 홈(21)은 다공성 멤브레인(30)에 의해 분리되어 일직선 구조의 미세 유체 채널 또는 챔버를 형성할 수 있고, 즉, 제1 홈(11)과 제2 홈(21) 각각에 별도의 주입구와 배출구를 포함하는 직선 구조의 미세 유체 채널 또는 챔버가 형성될 수 있어, 적용하고자 하는 모델에 따라 제1 홈(11)과 제2 홈(21) 각각의 미세 유체 채널에 세포, 스캐폴드(scaffold), 약물 등 다양한 처리가 가능할 수 있다.
선택적 실시예로서, 생체모사 칩(1)에 순환 모델을 적용할 경우, 먼저, 생체모사 칩(1)의 제2 주입구(22)를 통해 제2 홈(21)에 세포 외 기질을 주입할 수 있다. 제2 주입구(22)를 통해 주입된 세포 부착에 용이한 PLL(Poly-L-Lysine) 코팅제 및 세포 외 기질 단백질은 제2 배출구(23)를 통해 배출됨으로써, 제2 홈(21)을 코팅 시킬 수 있다. 제2 홈(21)이 코팅된 뒤, 또 다시 제2 주입구(22)와 제2 배출구(23)를 통해 인간 폐혈관 내피세포와 배양액을 주입 및 배출시킴으로써, 제2 홈(21)의 표면에 인간 폐혈관 내피세포를 단층(monolayer)으로 형성하여 제2 홈(21)에 체내(in vivo)의 혈관이 모사될 수 있다.
제2 홈(21)에 혈관이 모사되면, 제2 주입구(22)와 제2배출구(23)를 통해 제2 홈(21)에 암세포를 순환시킬 수 있고, 제2 홈(21)을 순환하는 암세포(Circulating Tumor Cell)는 모사된 내피세포 위로 부착될 수 있다. 이때, 몇몇의 암세포는 다공성 멤브레인(30)을 통해 제1 홈(11)으로 이동되어 제1 홈(11)에 형성된 세포 외 기질로 침윤될 수 있다. 이때, 내피세포와 암세포의 구별이 용이하도록 하기 위하여 CellTrackerTM을 사용하여 폐혈관 내피세포는 Green CMFDA Dye로 표지 될 수 있고, 순환 암세포는 Red CMFPX Dye로 표지 될 수 있다.
한편, 제1 홈(11)과 제2 홈(21)은 일직선 구조를 가지므로, 제1 바이오 유체와 제2 바이오 유체의 유량을 조절하여 미세 유체 채널에 주입하여 순환시킬 경우, 미세 유체 채널 또는 챔버 전체에 균일하게 세포외 기질 및 코팅제가 코팅될 수 있고, 인간 폐혈관 세포가 단층으로 균일하게 배양될 수 있으며, 순환 암세포를 내피세포에 균일하게 부착시킬 수 있다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체모사 칩 제조 방법의 일 예를 도시한 순서도이다.
도 3을 참조하면, 생체모사 칩 제조 방법은 기판, 커버부 및 다공성 멤브레인을 준비하는 단계(S100), 기판 및 커버부를 플라즈마 기체로 표면 처리하는 단계(S200), 다공성 멤브레인을 실란(silane) 커플링제로 표면 처리하는 단계(S300) 및 표면 처리된 기판, 커버부 및 다공성 멤브레인을 접합하는 단계(S400)를 포함할 수 있다.
기판, 커버부 및 다공성 멤브레인을 준비하는 단계(S100)에서 기판(10) 및 커버부(20)는 CNC machine으로 밀링(milling)하여 제1 홈(11)과 제2 홈(21)의 형태가 포함된 몰드를 사용하여 제작될 수 있으며, 이 몰드에 액체 상태의 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)을 부어 몰드의 모양을 본뜨는 몰딩방식으로 준비될 수 있고, 커버부(20)는 몰드에 본뜬 PDMS에 추가로 펀치 기구(puncher)를 통해 원하는 크기의 직경을 가진 복수 개의 개구를 더 형성함으로써 준비될 수 있다.
다공성 멤브레인은 PET 박막을 제2 홈(21)의 길이에 대응하도록 제작하여 준비될 수 있다.
도 4는 도 3의 생체모사 칩 제조 방법의 일 예를 개략적으로 도시한 공정도이다.
도 4를 참조하면, 기판 및 커버부를 플라즈마 기체로 표면 처리하는 단계(S200)에서 기판(10) 및 커버부(20)은 산소 플라즈마(O2 plasma)로 표면 처리될 수 있다. 일 예로, 기판(10)과 커버부(20)을 형성하고 있는 PDMS는 표면이 CH3 - 이루어져 있어 소수성을 지니는데 산소 플라즈마(O2 plasma)로 표면 처리될 경우 PDMS의 표면은 CH3 -에서 OH-로 치환되어 친수성을 띄게 될 수 있다. 이때, 산소 플라즈마(O2 plasma)는 400mTorr 내지 500m Torr, 80W 내지 120W의 조건에서 1분 내지 3분 동안 처리될 수 있다.
다공성 멤브레인을 실란(silane) 커플링제로 표면 처리하는 단계(S300)에서 다공성 멤브레인(30)은 실란 커플링제로 표면 처리될 수 있는데, 실란 커플링제는 구체적으로 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) 커플링제를 포함할 수 있다. 이때, APTES 커플링제는 에탄올(Et-OH) 또는 증류수(Distilled Water)를 포함하는 용매에 APTES를 5%몰 첨가하여 제조될 수 있고, 70℃ 내지 90℃로 가열되어 다공성 멤브레인(30)의 표면에 처리될 수 있다.
이렇게 APTES로 표면 처리된 다공성 멤브레인(30)은 표면이 아미노기로 수정될 수 있다.
표면 처리된 기판, 커버부 및 다공성 멤브레인을 접합하는 단계(S400)에서 산소 플라즈마(O2 plasma)로 표면 처리된 기판(10) 및 커버부(20)은 표면이 하이드록실기(OH-)를 띄게 되고, APTES 커플링제로 표면 처리된 다공성 멤브레인(30)은 표면이 아미노기를 띄게 됨으로써, 기판(10) 및 커버부(20)은 다공성 멤브레인(30)과 강한 공유결합을 형성할 수 있다. 따라서, 기판(10)과 커버부(20) 사이에 다공성 멤브레인(30)이 배치됨으로써, 기판(10), 커버부(20) 및 다공성 멤브레인(30)은 서로 견고하게 부착될 수 있다.
한편, APTES 커플링제에 사용되는 용매에 따라 기판(10), 커버부(20) 및 다공성 멤브레인(30)간의 결합력이 달라질 수 있다.
도 5는 용매에 따른 실란 커플링제의 결합력을 도시한 그래프이다.
도 5를 참조하면, APTES 커플링제는 용매로 증류수(DW)를 사용할 경우, 생체모사 칩이 유체의 누출 없이 견딜 수 있는 유체의 압력은 약 23psi이고, 용매로 에탄올(Et-OH)을 사용할 경우 경우, 생체모사 칩이 유체의 누출 없이 견딜 수 있는 유체의 압력은 약 35psi로, 용매로 증류수를 사용할 경우보다 에탄올을 사용할 경우 약 1.5배 이상 강한 결합력을 보이는 것을 확인할 수 있다.
도 6은 도 3의 생체모사 칩 제조 방법으로 만들어진 생체모사 칩의 세포배양 결과를 나타내는 사진이다.
도 6을 참조하면, 미세 유체 채널에 배양된 인간 폐혈관 내피세포를 VE-cadherin (endothelial specific adhesion molecule, White), DAPI (nuclear DNA, Blue)마커로 염색한 후, 형광분석을 통하여 미세 유체 채널로 주입된 인간 폐혈관 내피세포가 미세 유체 채널 표면에 단층(monolayer)을 형성하며 체내의(in vivo) 혈관이 미세 유체 채널에 모사된 것을 확인할 수 있다.
도 7은 도 3의 생체모사 칩 제조 방법으로 만들어진 생체모사 칩의 실험결과를 나타내는 사진이다.
도 7을 참조하면, (a)는 제2 홈에 배양된 인간 폐혈관 내피세포를 나타내고, (b)는 제2 홈을 순환하는 순환 암세포를 나타내며, (C)는 제2 홈에 형성된 인간 폐혈관 내피세포에 부착된 암세포를 나타낸다.
(a), (b), (c)를 참조하면, 본 발명의 생체모사 칩을 활용하여 폐 혈관 내피세포를 배양한 결과, 직선 구조를 가지는 미세 채널에 폐 혈관 내피세포가 균일한 밀도로 단층 배양됨을 확인할 수 있고, 튜빙을 활용한 암세포의 순환에도 유체의 누출없이 암세포가 내피세포 상단에 균일한 부착을 보이는 것을 확인할 수 있다.
결과적으로, 생체모사 칩은 미세 유체 채널 내부에서 유체의 순환 속도를 일정하게 유지시켜 세포의 배양 및 순환 시 미세 채널 표면에 균일한 밀도로 부착을 유도하고, 산소 플라즈마와 실란 커플링제를 활용하여 결합됨으로써, 화학결합을 통하여 즉각적이고, 강하게 부착될 수 있다.
이하에서는 본 발명의 실시예에 따른 생체모사 칩을 이용한 세포 외 기질 코팅방법에 대하여 설명한다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 외 기질 코팅방법의 일 예를 도시한 순서도이다.
도 8을 참조하면, 세포 외 기질 코팅방법은 세포 외 기질 단백질을 포함하는 용액을 기판 상에 도입하는 단계(S1000), 상기 용액에 일정한 유동을 형성하는 단계(S2000), 상기 세포 외 기질 단백질이 상기 유동 방향으로 방향성을 갖고 정렬되도록 코팅되는 단계(S3000) 및 상기 방향성을 가지는 상기 세포 외 기질 코팅 상에 세포를 도입하는 단계(S4000)를 포함할 수 있다.
세포 외 기질 단백질을 포함하는 용액을 기판 상에 도입하는 단계(S1000)에서 기판은 외부에서 내부가 관측가능한 투명 기판일 수 있고, 예를 들어 실리콘을 포함할 수 있으며, 구체적 예로 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)을 포함할 수 있으며, 더욱 구체적 예로는 본 발명의 실시예에 따른 생체모사 칩을 포함할 수 있다.
선택적 실시예로 기판내부에는 제1 홈과 상기 제1 홈 상에 상기 제1 홈과 중첩되어 배치되는 제2 홈이 위치할 수 있으며, 이때 제1 홈과 제2 홈 사이에는 다공성 멤브레인이 배치될 수 있어, 제1 홈과 다공성 멤브레인의 제1 홈 방향을 향하는 일 면에 의해 공간이 정의될 수 있고, 제2 홈과 다공성 멤브레인의 제2 홈 방향을 향하는 타 면에 의해 공간이 정의될 수 있다.
세포 외 기질을 포함하는 용액은 제2 홈과 다공성 멤브레인의 타 면에 의해 정의된 공간으로 주입될 수 있다.
상기 용액에 일정한 유동을 형성하는 단계(S2000)에서 제2 홈과 다공성 멤브레인의 타 면에 의해 정의된 공간으로 주입된 용액에는 기판 외부에 위치하는 펌프에 의해 일정한 전단응력이 가해질 수 있어, 상기 용액에 일정한 유동이 형성될 수 있다.
상기 세포 외 기질 단백질이 상기 유동 방향으로 방향성을 갖고 정렬되도록 코팅되는 단계(S3000)에서 제2 홈과 다공성 멤브레인의 타 면에 의해 정의된 공간에 일정한 유동이 형성된 용액에 포함된 세포 외 기질은 제2 홈과 다공성 멤브레인의 타 면에 의해 정의된 공간에 일 방향으로 배향되어 정렬될 수 있다.
이렇게 배향된 세포 외 기질 상에 혈장과 염화칼슘(CaCl2)을 순차적으로 유동을 주어 주입함으로써, 용액에 포함된 세포 외 기질이 제2 홈과 다공성 멤브레인의 타 면에 섬유 형태로 코팅될 수 있다.
도 9는 도 8의 세포 외 기질 코팅방법의 일 예를 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 9를 참조하면, 다공성 멤브레인(300)의 타 면(310)에는 세포 외 기질 단백질이 일 방향으로 정렬되어 코팅될 수 있다.
제2 홈(211)과 다공성 멤브레인(300)의 타 면(310)에 의해 정의된 공간(S)에서 일정한 유동을 가지는 용액은 일 예로 세포 외 기질인 피브로넥틴(fibronectin)을 포함할 수 있고, 이 피브로넥틴(fibronectin)을 포함하는 용액을 일정한 유동을 가지고 제2 홈(211)과 다공성 멤브레인(300)의 타 면(310)에 의해 정의된 공간(S)에 주입하면, 멤브레인(300)의 타 면(310)에는 피브로넥틴(fibronectin)이 배치될 수 있다.
멤브레인(300)의 타 면(310)에 피브로넥틴(fibronectin)이 배치되면, 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 혈장이 일정한 유동을 가지고 제2 홈(211)과 다공성 멤브레인(300)의 타 면(310)에 의해 정의된 공간(S)에 주입되어, 피브로넥틴(fibronectin) 상에 피브리노겐(fibrinogen)이 배치될 수 있다.
그 다음으로 피브로넥틴(fibronectin)과 피브리노겐(fibrinogen)상에 염화칼슘(CaCl2)을 일정한 유동을 주어 주입하면, factor XIIIa가 활성화되어 피브로넥틴(fibronectin)과 피브린(fibrin)은 가교결합하여 정렬됨으로써, 섬유소 섬유(fibrin fiber) 형태로 멤브레인(300)의 타 면(310)에 세포 외 기질이 코팅될 수 있다.
도 10은 도 8의 세포 외 기질 코팅방법으로 코팅된 세포 외 기질의 정렬도를 나타내는 사진이다.
도 10을 참조하면, 무유동 조건 (a)과 유동 조건 (b) 에서의 세포 외 기질의 배향도를 확인할 수 있다.
다공성 멤브레인(300)의 타 면(310)에 plasma를 1시간, 3시간 및 6시간 간격으로 처리한 결과, (a)에서는 무작위적 배향을 보였으나, (b)에서는 fibrin fiber가 유체의 흐름 방향을 따라 정렬되는 것을 관찰할 수 있다.
상기 방향성을 가지는 상기 세포 외 기질 코팅 상에 세포를 도입하는 단계(S4000)에서는 방향성을 가지는 세포 외 기질 코팅 상으로 세포가 배양될 수 있으며, 이때 세포는 방향성을 가지는 세포 외 기질을 따라 배향되어 배양될 수 있다.
한편, 세포는 어느 한 종류의 세포로 한정되는 것이 아니라 실험목적에 따라 다양한 종류의 세포가 도입되어 세포 외 기질 상에 배양될 수 있다.
도 11은 도 8의 세포 외 기질 코팅방법으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포를 형광분석한 사진이다.
도 11을 참조하면, 피브로넥틴(Fibronectin) (Gray), 피브린(Fibrin) (Green), 밀착연결 단백질(VE-cadherin) (Red), DAPI (Blue) 마커로 염색될 수 있으며, 무유동 조건(Static)과 유동 조건(Flow)의 코팅 조건에서 배양된 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)를 확인할 수 있다.
섬유소 섬유(Fibrin fiber)가 코팅된 기질 위에서 혈관내피세포(HUVECs)를 배양한 결과, 무유동 조건(Static)에서 코팅된 기질 위에서 배양된 혈관내피세포(HUVEC)는 불규칙한 세포 배열을 보인 반면, 유동 조건(Flow)에서 코팅된 정렬된 fiber를 따라 배양된 혈관내피세포(HUVECs)는 방향성을 가지고 배열된 것을 확인할 수 있다.
실시예 1
일정한 유동을 가지는 피브로넥틴을 포함하는 용액을 생체모사 칩의 미세 유체 채널에 유동시킨 후, 일정한 유동을 가지는 혈장 및 염화칼슘을 순차적으로 유동시킴으로써, 유동 방향으로 배향성을 가지고 정렬된 섬유소 섬유(fibrin fiber)가 코팅된 멤브레인에 혈관 내피세포(HUVECs)를 배양하였다.
실시예 2
피브로넥틴을 포함하는 용액, 혈장 및 염화칼슘을 생체모사 칩의 미세 유체 채널에 정적으로 위치시킴으로써, 섬유소 섬유(fibrin fiber)가 코팅된 멤브레인에 혈관 내피세포(HUVECs)를 배양하였다.
비교예 1
피브로넥틴을 포함하는 용액을 생체모사 칩의 미세 유체 채널에 유동시킴으로써, 피브로넥틴이 코팅된 멤브레인에 혈관 내피세포(HUVECs)를 배양하였다.
비교예 2
피브로넥틴이 코팅된 실험용 홈판(well plate)에 혈관 내피세포(HUVECs)를 배양하였다.
비교예 3
아무것도 코팅되지 않은 실험용 홈판(well plate)에 혈관 내피세포(HUVECs)를 배양하였다.
도 12는 다양한 조건으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포의 기능을 평가한 그래프이다.
도 12를 참조하면, 실시예 1 및 실시예 2, 비교예 1 내지 비교예 3의 세포 증식률(a), 투과도(b) 및 내피세포 접합 마커 (PECAM-1) 및 tight junction 마커(CLDN-5, OCLN, ZO-1) 분석(c) 그래프를 확인할 수 있다.
그래프(a) 및 그래프(b)를 참조하면, 실시예 1에서 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)는 실시예 2 및 비교예 1 내지 비교예 3에 비해 높은 증식률과 함께 가장 낮은 투과도를 나타내어 우수한 장벽 기능을 보이는 것을 확인할 수 있다.
그래프(c)를 참조하면, 세포 간 결합 및 부착 관련 유전자 발현 분석을 통해 실시예 1에서 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)의 기능이 개선된 것을 확인할 수 있다.
실험예 1
실시예 1로 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)와 함께 고전이성 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 공배양 하였다.
실험예 2
실시예 2로 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)와 함께 고전이성 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 공배양 하였다.
실험예 3
비교예 1로 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)와 함께 고전이성 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 공배양 하였다.
실험예 4
실시예 1로 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)와 함께 저전이성 유방암 세포주인 MCF-7을 공배양 하였다.
실험예 5
실시예 2로 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)와 함께 저전이성 유방암 세포주인 MCF-7을 공배양 하였다.
실험예 6
비교예 1로 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)와 함께 저전이성 유방암 세포주인 MCF-7을 공배양 하였다.
도 13a는 다양한 조건으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포와 암세포주를 공배양한 것을 형광분석한 사진이고, 도 13b는 도 13a에서 형광표시된 밀착연결 단백질의 상대 정량을 나태는 그래프이다.
도 13a 및 도13b를 참조하면, 서로 다른 전이 특성을 가진 두 유방암 세포주를 이용하여 내피세포층의 장벽 기능(barrier function)을 평가할 수 있다.
실험예 1 내지 실험예 3은 내피세포의 tight junction을 파괴하며 이동하는 특성을 가진 고전이성 MDA-MB-231을 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 혈관 내피세포(HUVECs)와 공배양한 것이고, 실험예 4 내지 실험예 6은 암세포 간 결합력이 우세한 저전이성 MCF-7을 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 혈관 내피세포(HUVECs)와 공배양한 것이다.
내피세포의 세포간 결합은 밀착연결 단백질(VE-Cadherin)을 마커로 하여 형광 정량 하였다.
분석 결과 실험예 1에서 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)는 고전이성 MDA-MB-231과 공배양 되지 않은 실시예 1과 동일한 밀착연결 단백질(VE-Cadherin) 정량을 유지하는 것으로 보아 barrier를 유지하는 것을 확인할 수 있으며, 반면에 실험예 2 및 실험예 3에서 배양된 혈관 내피세포(HUVECs)는 각각 MDA-MB-231과 공배양 되지 않은 실시예 2 및 비교예 1보다 밀착연결 단백질(VE-Cadherin)의 정량이 감소된 것으로 보아 barrier가 붕괴된 것을 확인할 수 있다.
또한, 실험예 4 내지 실험예 6은 각각 저전이성 MCF-7과 공배양 되지 않은 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 3과 동일한 밀착연결 단백질 정량을 유지하는 것을 보아 barrier를 유지하는 것을 확인할 수 있다.
즉, 방항성을 가지고 정렬된 세포 외 기질 상에 코팅된 혈관 내피세포(HUVECs)는 고전이성 MDA-MB-231 또는 저전이성 MCF-7과 공배양시에 모두 barrier가 붕괴되지 않고 유지되는 것을 확인할 수 있다.
도 14a는 다양한 조건으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포와 암세포주의 공배양시 암세포의 전이를 형광분석한 사진이고, 도 14b는 도 14a에서 형광표시된 암세포의 부피당 개수를 나태는 그래프이며, 도 14c는 다양한 조건으로 코팅된 세포 외 기질 상에 배양된 세포와 암세포주의 공배양시 암세포의 전이에 의한 투과계수를 나타낸 그래프이다.
도 14a를 참조하면, 세포의 구별을 용이하게 하기 위하여 혈관 내피세포(HUVECs)는 Red CMFDA Dye로 암세포는 Green CMFPX Dye로 염색될 수 있으며, 고전이성 MDA-MB-231와 공배양시에 실험예 1에서는 실험예 2 및 실험예 3에 비해 전이되는 암세포(초록 마커)가 더 적게 관찰되는 것을 확인할 수 있다.
또한 저전이성 MCF-7과 공배양시에 실험예 4 내지 실험예 6에서는 전이되는 암세포(초록 마커)가 거의 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있다.
도 14b를 참조하면, tight junction 파괴 특성이 강한 MDA-MB-231은 실험예 1 내지 실험예 3에서 모두 전이 양상을 보였으나, 실험예 1에서 확인된 전이된 암세포의 수가 가장 적은 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 실험예 1의 혈관 내피세포는 실험예 2 및 실험예 3과 비교하여 가장 낮은 암세포 침윤도를 보이는 것을 알 수 있다. 즉 실험예 1의 혈관 내피세포의 장벽 기능이 실험예 2 및 실험예 3에 비해 향상된 것을 알 수 있다.
위와 같은 결과는 혈관 내피세포의 투과계수 비교를 통해서도 확인할 수 있다.
도 14c를 참조하면, 실험예 1은 1을 유지하는 반면, 실험예 2 및 실험예 3은 1을 초과하는 것으로 보아 실험예 1의 혈관 내피세포의 장벽 기능이 실험예 2 및 실험예 3에 비해 향상된 것을 알 수 있다.
즉, 방항성을 가지고 정렬된 세포 외 기질 상에 코팅된 혈관 내피세포(HUVECs)는 고전이성 MDA-MB-231 또는 저전이성 MCF-7과 공배양시에 모두 barrier가 붕괴되지 않고 유지되는 것을 확인할 수 있다.
결과적으로 본 발명의 실시예에 따른 세포 외 기질 코팅 방법은 방항성을 가지고 정렬된 세포 외 기질을 섬유 형태로 생체모사 칩에 코팅함으로써, 생체 내(in vivo) 환경과 유사한 견고한 세포장벽을 구현할 수 있다.
또한, 생체 외에서 생체 내 기저막의 생리학적 환경을 보완하여, 내피세포의 증식 및 유전자 발현 향상, 투과도 조절, 암세포 공배양 환경에서의 내피세포 장벽 유지 등의 다양한 생물학적 기능을 제공함으로써, 생체모사 칩 개발 및 이를 이용한 실험연구에 유용하게 활용될 수 있다.
이와 같이 본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
실시예에서 설명하는 특정 실행들은 일 실시 예들로서, 어떠한 방법으로도 실시 예의 범위를 한정하는 것은 아니다. 명세서의 간결함을 위하여, 종래 전자적인 구성들, 제어 제공 방법들, 소프트웨어, 상기 제공 방법들의 다른 기능적인 측면들의 기재는 생략될 수 있다. 또한, 도면에 도시된 구성 요소들 간의 선들의 연결 또는 연결 부재들은 기능적인 연결 및/또는 물리적 또는 회로적 연결들을 예시적으로 나타낸 것으로서, 실제 장치에서는 대체 가능하거나 추가의 다양한 기능적인 연결, 물리적인 연결, 또는 회로 연결들로서 나타내어질 수 있다. 또한, "필수적인", "중요하게" 등과 같이 구체적인 언급이 없다면 본 발명의 적용을 위하여 반드시 필요한 구성 요소가 아닐 수 있다.
실시예의 명세서(특히 특허청구범위에서)에서 "상기"의 용어 및 이와 유사한 지시 용어의 사용은 단수 및 복수 모두에 해당하는 것일 수 있다. 또한, 실시 예에서 범위(range)를 기재한 경우 상기 범위에 속하는 개별적인 값을 적용한 발명을 포함하는 것으로서(이에 반하는 기재가 없다면), 상세한 설명에 상기 범위를 구성하는 각 개별적인 값을 기재한 것과 같다. 마지막으로, 실시 예에 따른 방법을 구성하는 단계들에 대하여 명백하게 순서를 기재하거나 반하는 기재가 없다면, 상기 단계들은 적당한 순서로 행해질 수 있다. 반드시 상기 단계들의 기재 순서에 따라 실시 예들이 한정되는 것은 아니다. 실시 예에서 모든 예들 또는 예시적인 용어(예들 들어, 등등)의 사용은 단순히 실시 예를 상세히 설명하기 위한 것으로서 특허청구범위에 의해 한정되지 않는 이상 상기 예들 또는 예시적인 용어로 인해 실시 예의 범위가 한정되는 것은 아니다. 또한, 당업자는 다양한 수정, 조합 및 변경이 부가된 특허청구범위 또는 그 균등물의 범주 내에서 설계 조건 및 팩터에 따라 구성될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (16)

  1. 일 면에 제1 홈이 형성된 기판;
    상기 기판과 대향하도록 배치되고, 상기 기판을 바라보는 면에 제2 홈이 형성된 커버부;
    상기 기판과 상기 커버부 사이에, 적어도 상기 제1 홈 및 상기 제2 홈과 중첩된 영역을 갖도록 배치된 다공성 멤브레인; 및
    상기 커버부에 두께 방향 또는 두께 방향에 수직한 방향으로 관통된 제1 주입구, 제1 배출구, 제2 주입구 및 제2 배출구를 구비하는 복수의 개구를 포함하는,
    생체모사 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 홈은 상기 제2 홈의 길이보다 같거나 길게 형성되고,
    상기 제1 주입구 및 상기 제1 배출구는 상기 제1 홈의 끝 단부에 대응되고, 상기 제2 주입구 및 상기 제2 배출구는 상기 제2 홈의 끝 단부에 대응되는, 생체모사 칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 홈은 일 방향으로 연장된 길이와 상기 길이와 교차하는 폭을 가지며, 상기 폭은 상기 길이를 따라 더 큰 폭을 가지고 서로 이격되어 형성되는 복수 개의 볼록 영역을 포함하는, 생체모사 칩.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 볼록 영역들은 상기 제1 주입구, 상기 제1 배출구, 상기 제2 주입구 및 상기 제2 배출구와 중첩되는, 생체모사 칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 홈에 및 상기 제2 홈에는 바이오 유체가 주입되는, 생체모사 칩.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 바이오 유체는 순환세포, 부착세포, 스캐폴드, 화학물질 및 생체분자 중 선택되는 물질을 포함하는, 생체모사 칩.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 바이오 유체는 상기 제1 홈과 상기 제2 홈이 중첩되는 영역에서 상기 다공성 멤브레인을 통해 선택적으로 교환되는, 생체모사 칩.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 순환 및 부착세포는 단일층이나 다층구조로 배양되거나 칩의 채널을 따라 순환하며 배양되는, 생체모사 칩.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 세포 외 기질(extracellular matrix) 단백질 또는 하이드로겔 단백질을 포함하는, 생체모사 칩.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 화학물질은 세포 배양배지 및 첨가물을 포함하는, 생체모사 칩.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 생체분자는 신호전달물질 또는 신경전달물질을 포함하는, 생체모사 칩.
  12. 기판, 커버부 및 다공성 멤브레인을 준비하는 단계;
    상기 기판 및 상기 커버부를 플라즈마 기체로 표면 처리하는 단계;상기 다공성 멤브레인을 실란(silane) 커플링제로 표면 처리하는 단계; 및
    표면 처리된 상기 기판, 상기 커버부 및 상기 다공성 멤브레인을 접합하는 단계;를 포함하는, 생체모사 칩 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 플라즈마 기체는 산소 또는 공기 를 포함하고, 상기 산소 또는 상기 공기는 상기 기판 및 상기 커버부의 표면을 하이드록실기로 수정(modification)하는, 생체모사 칩 제조 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 실란 커플링제는 물 또는 에탄올을 용매로 포함하는, 생체모사 칩 제조 방법.
  15. 세포 외 기질 단백질을 포함하는 용액을 기판 상에 도입하는 단계;
    상기 용액에 일정한 유동을 형성하는 단계;
    상기 세포 외 기질 단백질이 상기 유동 방향으로 방향성을 갖고 정렬되도록 코팅되는 단계; 및
    상기 방향성을 가지는 상기 세포 외 기질 코팅 상에 세포를 도입하는 단계;를 포함하는 세포 외 기질 코팅방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 코팅되는 단계에서 혈장 및 염화칼슘(CaCl2)이 상기 일정한 유동을 형성하며 더 주입되는 것을 포함하는 세포 외 기질 코팅방법.
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