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WO2025163166A1 - Procédé de prédiction de la réponse d'un patient atteint de cancer à un traitement d'immunothérapie - Google Patents

Procédé de prédiction de la réponse d'un patient atteint de cancer à un traitement d'immunothérapie

Info

Publication number
WO2025163166A1
WO2025163166A1 PCT/EP2025/052572 EP2025052572W WO2025163166A1 WO 2025163166 A1 WO2025163166 A1 WO 2025163166A1 EP 2025052572 W EP2025052572 W EP 2025052572W WO 2025163166 A1 WO2025163166 A1 WO 2025163166A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
concentration
progressor
early
base pairs
size
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/EP2025/052572
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric Ginot
Audrey BOUTONNET
Sébastien SALAS
Frédéric Fina
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adelis
Aix Marseille Universite
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Original Assignee
Adelis
Aix Marseille Universite
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adelis, Aix Marseille Universite, Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM filed Critical Adelis
Publication of WO2025163166A1 publication Critical patent/WO2025163166A1/fr
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/165—Mathematical modelling, e.g. logarithm, ratio
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention falls within the general field of oncology.
  • the present invention relates to an in vitro method for predicting the early progressor character and/or the early non-progressor character of a subject suffering from cancer during the administration of an immunotherapy treatment.
  • Cancer treatment has been the focus of much research for decades. In recent years, a particular effort has been made to develop more individualized therapeutic strategies.
  • immunotherapy The approach aimed not at directly attacking the tumor, but at stimulating the immune system, known as immunotherapy, is today recognized as one of the most effective therapeutic strategies for the treatment of a large number of types of cancer.
  • immunotherapy is used routinely, with spectacular results, particularly for small cell lung cancer.
  • a meta-analysis revealed that 25% of patients treated with immunotherapy showed a response to treatment, prolonging survival.
  • durable responses were more frequent in patients treated with immunotherapy, i.e., their overall survival was improved (Pons-Tostivint et al., 2019, JCO Precision Oncology, 3(3): 1-10).
  • immunotherapy treatments are not effective in all patients. Furthermore, they can cause side effects in some. For these patients, conventional chemotherapy would have been a better option. These patients are referred to as non-responders to immunotherapy treatment. This information is often obtained late, several weeks after the start of immunotherapy treatment, weeks that can lead to a deterioration in the patient's health and significantly reduce their life expectancy. Identifying patients in whom immunotherapy will be effective is a necessity recognized today by the entire immunotherapy community. No method currently allows, before starting immunotherapy treatment, to identify/classify cancer patients who will respond or not to this treatment, more precisely to identify patients for whom this treatment will, or will not, prevent tumor progression.
  • CPS Combined Positive Score
  • TPS Tumor Proportion Score
  • the present invention aims to provide a method for predicting, with high accuracy, how a cancer patient will respond, more precisely whether his tumor will progress early or not, when he is subjected to immunotherapy treatment, before the start of such treatment. Additional objectives of the invention are that this method is easy to implement, using equipment commonly available in analysis laboratories, and that it can be applied to the greatest possible number, on the one hand, of types of cancer, and on the other hand, of types of immunotherapy treatments.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • This free DNA circulating in blood plasma is currently the subject of intense clinical research in oncology, because mutations of the genomic DNA present in tumor cells can be found there, which guide the therapy to be administered to the patient.
  • this circulating free deoxyribonucleic acid will be referred to in the present description as “circulating free DNA” or cfDNA.
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • the term “early non-progressor subject”, or subject with early non-progressor characteristics, conventionally in itself in the medical field, is understood to mean a subject suffering from cancer for whom there is observed, on the first image of the tumor acquired by medical imaging, in particular by X-ray scanner, after the start of the immunotherapy treatment, compared to the image acquired by the same medical imaging technique before the start of this treatment, an increase of less than 20% of the tumor lesions identified on the imaging, that is to say that the tumor lesions have decreased, have remained stable or have increased by less than 20% (in surface area).
  • the time of acquisition of the first medical imaging image after the The start of immunotherapy treatment is determined according to the conventional cancer management protocol in force in the field, and depends on the particular type of cancer concerned. Typically, this time is 6 weeks after the start of immunotherapy treatment for lung cancers, and 12 weeks for other cancers.
  • an early progressor or a subject with early progressor characteristics, also conventionally in itself in the medical field, is understood to mean a subject suffering from cancer for whom, on the first image of the tumor acquired by medical imaging, in particular by X-ray scanner, after the start of immunotherapy treatment, compared to the image acquired by the same medical imaging technique before the start of this treatment, an increase of more than 20% of the tumor lesions identified on the imaging, that is to say that the tumor lesions have increased by 20% or more (in surface area).
  • circulating cell-free DNA also means extracellular DNA present in the patient's blood plasma.
  • This circulating cell-free DNA includes circulating tumor cell-free DNA and circulating non-tumor cell-free DNA.
  • the concentration, in particular the relative concentration, of circulating free DNA fragments of a patient suffering from cancer, the size of which is greater than 500 base pairs, constitutes a parameter which can be used in a method for determining whether this patient will be an early progressor or an early non-progressor during the administration of an immunotherapy treatment.
  • an in vitro method for predicting the early progressor character and/or the early non-progressor character of a subject suffering from cancer during an immunotherapy treatment i.e. when an immunotherapy treatment will be administered to him.
  • This method falls under statistical analysis methods. It comprises steps of: a/ determining, in an isolated blood sample which has been obtained from said subject, preferably before said immunotherapy treatment:
  • total cfDNA concentration the total concentration of free deoxyribonucleic acid circulating in said blood sample
  • steps c/ and d/ may consist of either steps d/ and d1/ and/or c2/ and d2/: c1/ comparison of this score with a first predetermined reference value, and d1/ conclusion that the subject presents an early progressor character during the immunotherapy treatment when this score is less than or equal to this first reference value, and/or c2/ comparison of this score with a second predetermined reference value, and d2/ conclusion that the subject presents an early non-progressor character during the immunotherapy treatment when the score is higher than this second reference value, either in steps c3/ and d3/ and/or c4/ and d4/: c3/ comparison of this score with a first predetermined reference value, and d3/ conclusion that the subject presents an early non-progressor character during the immunotherapy treatment when this score is lower than or equal to this first reference value, and/or c4/ comparison of this score with a second predetermined reference value, and d4/ conclusion that the subject presents an early progressor character during the immunotherapy
  • the method is an in vitro method for predicting the early progressor character of a subject suffering from cancer during an immunotherapy treatment, which comprises steps of: a/ determining, in an isolated blood sample which has been obtained from said subject, preferably before said immunotherapy treatment:
  • total cfDNA concentration the total concentration of free deoxyribonucleic acid circulating in said blood sample
  • the method is an in vitro method for predicting the early non-progressor character of a subject suffering from cancer during an immunotherapy treatment, which comprises steps of: a/ determining, in an isolated blood sample which has been obtained from said subject, preferably before said immunotherapy treatment:
  • total cfDNA concentration the total concentration of free deoxyribonucleic acid circulating in said blood sample
  • the method according to the invention may otherwise be an in vitro method for predicting the early progressor character and the early non-progressor character of a subject suffering from cancer during immunotherapy treatment. It then comprises, after the step of obtaining the score:
  • step d / of comparing this score with the first predetermined reference value a step d1 / of concluding that the subject presents an early progressor character during the immunotherapy treatment when this score is less than or equal to this first reference value
  • step c4 / of comparing this score with a second predetermined reference value a step d4 / of concluding that the subject presents an early progressor character during the immunotherapy treatment when the score is greater than this second reference value
  • step c2/ of comparing this score to the second predetermined reference value a step d2/ of concluding that the subject presents an early non-progressor character during the immunotherapy treatment when the score is higher than this second reference value or a step c3/ of comparing this score to a first predetermined reference value, and a step d3/ of concluding that the subject presents an early non-progressor character during the immunotherapy treatment when this score is lower than or equal to this first reference value.
  • the method according to the invention which takes into consideration the content of large cfDNA contained in the blood sample from the subject, makes it possible to predict, with high precision, the character of early non-progressor and/or the character of early progressor with respect to an immunotherapy treatment of a patient suffering from cancer, even before the start of such treatment.
  • the result of the method according to the invention constitutes thus a particularly advantageous aid for decision-making, by the clinician, who will take it into account within the overall clinical picture, to administer or not an immunotherapy treatment for each given patient.
  • Such a method proves to be particularly advantageous in that it makes it possible, for example, to avoid administering the immunotherapy treatment to patients who have been predicted as early progressors, for whom this treatment will not have the desired efficacy, and/or on the contrary to administer with confidence an immunotherapy treatment to patients who have been predicted as early non-progressors.
  • the precision (or accuracy) of prediction of the method according to the invention has in particular been verified in prospective observational studies carried out on cohorts of, respectively, 51 patients and 155 patients suffering from different types of cancer, and having been subjected to different types of immunotherapy treatments (the method according to the invention having been implemented on blood samples taken from the patients before the start of these treatments).
  • the performance of statistical prediction methods is generally evaluated by plotting a receiver operating characteristic curve (ROC curve) and measuring the area under the curve (AUC).
  • ROC curve receiver operating characteristic curve
  • AUC area under the curve
  • the ROC curve is established by plotting the sensitivity versus (1 -specificity) after classification of patients, based on the results obtained by the prediction method. The closer the AUC value is to 1, the higher the sensitivity and specificity of the method, and the more efficient the method is.
  • a method according to an embodiment of the invention made it possible to predict an early progressor character of patients with an AUC as high as 0.833, which clearly demonstrates its good performance.
  • “Sensitivity” here means, in a classical manner, the probability of the process of identifying as positive the early progressors (or, as the case may be, early non-progressors), that is to say of identifying the true positives. "Specificity” means the probability for the process of not identifying as positive early non-progressors (or, as the case may be, early progressors), that is, not to identify true negatives.
  • the term “positive predictive value” means the probability for a subject to be an early progressor (or, as the case may be, an early non-progressor) when the result of the method predicts it as such.
  • the term “negative predictive value” means the probability for a subject to be an early non-progressor (or, as the case may be, an early progressor) when the result of the method predicts it as such.
  • Each of the reference values used in the method according to the invention is preferably a threshold value, also commonly referred to as a “cut-off value”. It is within the skill of a person skilled in the art to know how to establish such reference values, in particular such threshold values, for the prediction method according to the invention, depending on the level of sensitivity and the level of specificity required for each prediction. Such a determination can be carried out either empirically or theoretically.
  • said first reference value and said second reference value are identical, and designated by the expression “common reference value”. Then, the method comprises a step of concluding that:
  • the subject presents an early progressor character or, according to the mathematical formula chosen, an early non-progressor character, during immunotherapy treatment, and/or
  • the subject presents an early non-progressor character or, depending on the mathematical formula chosen, an early progressor character, during immunotherapy treatment.
  • the first reference value and the second reference value are different, the first reference value being less than the second reference value.
  • the method may then comprise a step of concluding that: - if the score is less than or equal to the first reference value, the subject presents an early progressor character, or, according to the mathematical formula chosen, an early non-progressor character, during immunotherapy treatment,
  • the subject presents an early non-progressor character or, according to the chosen mathematical formula, an early non-progressor character, during immunotherapy treatment,
  • the method does not allow the subject's response to immunotherapy treatment to be satisfactorily predicted.
  • the blood sample used in the method according to the invention has preferably been isolated from the subject by a blood sample taken before the start of the immunotherapy treatment.
  • the invention does not, however, exclude the possibility that this blood sample has been taken at the time of administration of this treatment, or after, preferably just after, within a few hours or a few days following the start of administration of the treatment.
  • the method according to the invention does not in itself involve any step applied to the patient's body.
  • the analysis steps it involves are carried out from whole blood samples that have been taken from the patient beforehand, in a conventional manner in itself.
  • the subject to which the method according to the invention is applied is preferably a mammal. It is preferably a human.
  • the method according to the invention may also meet one or more of the characteristics described below, implemented in isolation or in each of their technically effective combinations.
  • the mathematical function implemented in the method according to the invention can be any type of multivariate function.
  • variables of large cfDNA concentration and total cfDNA concentration it may use other variables.
  • it may use, as variables, several different large cfDNA concentrations, each corresponding to a predetermined analytical size range different from the others.
  • analytical size range designates any size range included in sizes greater than 500 base pairs. It may also or otherwise use, as variables, other clinical or biological information relating to the patient.
  • Each of the variables contained in the mathematical function according to the invention can be weighted by a coefficient specific to it and which can be equal to 1, or different from 1.
  • the mathematical function comprises, as a variable, the ratio between at least said large cfDNA concentration and said total cfDNA concentration.
  • the ratio between at least said large cfDNA concentration and said total cfDNA concentration For example, it consists of the ratio between at least said large cfDNA concentration and said total cfDNA concentration.
  • This is in particular the ratio between a concentration of large cfDNA and the concentration of total cfDNA.
  • This function can then be described as the relative concentration of cfDNA fragments whose size is included in the predetermined analytical size range, present in the blood sample of the subject studied. As indicated above, it has been discovered by the present inventors that such a relative concentration constitutes an indicator / biomarker making it possible to effectively predict the response (in terms of early or non-early tumor progression) of a cancer patient when undergoing immunotherapy treatment.
  • the mathematical function implemented according to the invention may otherwise be equal to the sum of different concentrations of large cfDNA, each being associated with a predetermined analytical size range, this sum being divided by the total cfDNA concentration.
  • the method comprises steps d/ and d1/, and/or c2/ and d2/ described above, i.e. it concludes that the subject exhibits early progressor character during immunotherapy treatment when the score is less than or equal to the first reference value, and/or the subject exhibits early non-progressor character during immunotherapy treatment when the score is greater than the second reference value.
  • the mathematical function implemented according to the invention can otherwise combine the above variables in any other way, and in particular be part of the framework of linear regression.
  • each predetermined size range, or analytical size range is defined solely by its minimum value, i.e., it is a range defined as including sizes greater than, or greater than or equal to, a given minimum value.
  • At least one predetermined size range/analytical size range is the range of sizes greater than 500 base pairs, preferably the size range greater than or equal to 580 base pairs, more preferably the size range greater than or equal to 600 base pairs, and even more preferably the size range greater than or equal to 1500 base pairs. Preferably, this is the size range greater than or equal to 1600 base pairs, or even greater than or equal to 1650 base pairs, or even greater than or equal to 1700 base pairs.
  • each predetermined size range, or analytical size range is defined by its minimum value and its maximum value, i.e., it is a range defined as including sizes greater than, or greater than or equal to, a given minimum value, and less than, or less than or equal to, a given maximum value.
  • the larger and/or larger size ranges are more particularly preferred within the scope of the invention, compared to the smaller and/or smaller size ranges.
  • At least one predetermined size range/analytical size range is the size range between 580 and 1649 base pairs.
  • At least one predetermined size range/analytical size range is the size range between 1650 and 4000 base pairs.
  • the mathematical function used according to the invention can combine all combinations of the variables each associated with a range of analytical size specific to it, which are mentioned above.
  • predetermined size ranges particularly preferred in the context of the invention, in the context in which the mathematical function implemented is the ratio between a concentration of large cfDNA (i.e. cfDNA fragments in the predetermined size range) and the total cfDNA concentration
  • analytical size ranges are the size range greater than or equal to 1650 base pairs, in particular between 1650 and 4000 base pairs, and the size range from 580 to 1649 base pairs.
  • the method comprises establishing a curve representing the concentration, as a function of size, of the free deoxyribonucleic acid fragments circulating in said blood sample, and determining the size, expressed in base pairs, corresponding to the second peak on said curve, this size being designated herein by the expression "Position peak2".
  • the mathematical function then preferably includes, as a variable, said Position peak2.
  • the method comprises determining the concentration of circulating free deoxyribonucleic acid in said blood sample for each size between 160 and 220 base pairs, and calculating the sum of each of said concentrations to the power of 0.1, said sum being called Sumi6o-22o.
  • the mathematical function implemented then preferably comprises, as a variable, said Sumi6o-22o.
  • This parameter Sumi6o-22o can be defined by the following equation:
  • the mathematical function comprises, as variables:
  • relative concentration of large cfDNA for example the relative concentration of cfDNA of size greater than or equal to 1650 base pairs, in particular between 1650 and 4000 base pairs, and/or the relative concentration of cfDNA of size between 580 at 1649 base pairs,
  • equation (1 a) the mathematical function can be expressed by equation (1 a) or by equation (1 b):
  • variable P1 is the relative concentration of cfDNA of size greater than or equal to 1650 base pairs in the blood sample
  • variable Sommei6o-22o is as defined above, and expressed in pg/pl to the power of 0.1,
  • Position pic2 is as defined above, and expressed in base pairs.
  • coefficients a1, b1, c1 and d1 are preferably such that:
  • - -40.0 ⁇ a1 ⁇ -30.0, preferably -38.0 ⁇ a1 ⁇ -37.0, for example -37.2 ⁇ a1 ⁇ -37.1,
  • the first reference value and the second reference value are identical, and equal to 0.5.
  • Steps c/ and d/ of the method according to the invention thus consist of steps d / and d1 /, and c2/ and d2/ described above.
  • Steps c/ and d/ of the method according to the invention thus consist of steps d / and d1 /, and c2/ and d2/ described above.
  • Steps c/ and d/ of the method according to the invention thus consist of steps c3/ and d3/, and c4/ and d4/ described above.
  • the method comprises determining the number of neutrophils and the number of lymphocytes in said blood sample.
  • the mathematical function then preferably comprises, as a variable, the ratio between said number of neutrophils and said number of lymphocytes.
  • the number of neutrophils and the number of lymphocytes in the blood sample can be determined by any method known to those skilled in the art, for example by blood count.
  • the mathematical function comprises, as variables:
  • relative concentration of large cfDNA for example the relative concentration of cfDNA of size greater than or equal to 1650 base pairs, in particular between 1650 and 4000 base pairs, and/or the relative concentration of cfDNA of size between 580 and 1649 base pairs,
  • variable P1 is the relative concentration of cfDNA of size greater than or equal to 1650 base pairs in the blood sample
  • variable Sommei6o-22o is as defined above, and expressed in pg/pl to the power of 0.1,
  • Position pic2 is as defined above, and expressed in base pairs
  • the coefficients a2, b2, c2, d2 and e2 in equations (2a) and (2b) are preferably such that:
  • 0.0 ⁇ d2 ⁇ 1.0 preferably 0.0 ⁇ d2 ⁇ 0.1, for example 0.04 ⁇ d2 ⁇ 0.05,
  • the coefficients a2, b2, c2, d2 and e2 in equations (2a) and (2b) are preferably such that:
  • - and/or 0.0 ⁇ d2 ⁇ 1.0 preferably 0.0 ⁇ d2 ⁇ 0.2, for example 0.1 ⁇ d2 ⁇ 0.2, - and/or -1.0 ⁇ e2 ⁇ 0.0, preferably -0.1 ⁇ e2 ⁇ 0.0.
  • the coefficients a2, b2, c2, d2 and e2 in equations (2a) and (2b) are preferably such that:
  • a2 ⁇ -10.0 preferably -17.0 ⁇ a2 ⁇ -16.0, for example -16.2 ⁇ a2 ⁇ -16.1,
  • 0.0 ⁇ d2 ⁇ 1.0 preferably 0.0 ⁇ d2 ⁇ 0.2, for example 0.0 ⁇ d2 ⁇ 0.1,
  • the first reference value and the second reference value are identical, and equal to 0.5.
  • equation (2a) it is concluded according to the invention that the subject has an early progressor character during the immunotherapy treatment when the score is less than or equal to this reference value, and that the subject has an early non-progressor character during the immunotherapy treatment when the score is greater than this reference value.
  • Steps c/ and d/ of the method according to the invention thus consist of steps d/ and d1/, and c2/ and d2/ described above.
  • Steps c/ and d/ of the method according to the invention thus consist of steps c3/ and d3/, and c4/ and d4/ described above.
  • the score obtained by the method according to the invention which is the result of the mathematical function, advantageously constitutes a generic indicator of the early progressor character and/or the early non-progressor character of a subject studied, independent of both the type of cancer from which the subject is suffering, and the type of immunotherapy treatment which could be given to him. administered.
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to predict the early progressor character and/or the early non-progressor character of a subject suffering from any type of cancer, and in particular, but not limited to, a metastatic tumor pathology, a melanoma, a kidney cancer, in particular clear cell, a urothelial carcinoma of the bladder, a squamous cell carcinoma of the head and neck, or even a small cell or non-small cell bronchial cancer (or lung cancer), or a plurality of such cancers.
  • a metastatic tumor pathology e.g., a metastatic tumor pathology, a melanoma, a kidney cancer, in particular clear cell, a urothelial carcinoma of the bladder, a squamous cell carcinoma of the head and neck, or even a small cell or non-small cell bronchial cancer (or lung cancer), or a plurality of such cancers.
  • the immunotherapy treatment for which the aim is to determine the early progressor and/or early non-progressor status of the subject can be of any type. It can notably involve nivolumab, lipilimumab, pembrolizumab and/or one or more anti-PD-L1 antibodies such as atezolizumab, avelumab and/or durvalumab.
  • the prediction by the method according to the invention is furthermore also effective with regard to configurations in which the immunotherapy treatment is carried out in conjunction with other therapeutic treatment methods, such as chemotherapy treatment and/or targeted therapy when possible.
  • Obtaining the blood sample from the subject, from which the method according to the invention is applied may have been carried out in any conventional manner. It may, for example, have been carried out by taking a blood sample from the subject in tubes containing an ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer or in specific tubes for obtaining circulating DNA, such as the tubes marketed by Streck under the name Cell-Free DNA BCT® (Streck) or by Roche Diagnostic under the name “Cell-free DNA collection tube”, according to the supplier’s recommendations.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the determination of said total cfDNA concentration and the determination of said at least one large cfDNA concentration, and where appropriate the establishment of the curve representing the concentration, as a function of the size, of the circulating free deoxyribonucleic acid fragments and/or the determination of the concentration of circulating free deoxyribonucleic acid for each size between 160 and 220 base pairs are carried out by direct analysis of the blood sample isolated from the subject, i.e. a whole blood sample.
  • the method comprises a prior step of obtaining a plasma sample from this whole blood sample.
  • the step of selectively obtaining the plasma sample from the whole blood sample isolated from the patient by blood collection is preferably carried out within a few days following the blood draw, for example within 6 hours after the blood draw if EDTA buffer tubes are used, and within 7 days after the blood draw if specific tubes for obtaining circulating free DNA are used, such as the tubes mentioned above.
  • This step can be carried out in any conventional way, for example by centrifugation.
  • the step of obtaining the plasma sample, from a whole blood sample obtained from the patient, of the method according to the invention thus comprises:
  • a first gentle centrifugation for example at a speed between 1200 and 1600 g, preferably at room temperature, i.e. at 20°C +/- 5°C;
  • a second centrifugation at a faster speed for example between 3000 and 16000 g, preferably also at room temperature;
  • the plasma sample thus obtained can typically be stored at -20°C for a period of less than or equal to 1 month, or at -80°C for periods of more than 1 month, before its analysis for the determination of the different concentrations of cfDNA necessary for the implementation of the method. implementation of the method according to the invention.
  • the determination of the total cfDNA concentration and the determination of the concentration(s) of large cfDNA in the blood sample, and where appropriate the establishment of the curve representing the concentration, as a function of the size, of the circulating free deoxyribonucleic acid fragments and/or the determination of the circulating free deoxyribonucleic acid concentration for each size between 160 and 220 base pairs, can be carried out by any method conventional in itself for those skilled in the art. Depending on the particular technique used, they can be carried out directly on the whole blood sample or on the plasma sample obtained from this blood sample, or after a step of extracting the cfDNA from one or other of these samples.
  • the determination of said total cfDNA concentration and the determination of said at least one large cfDNA concentration, and where appropriate the establishment of the curve representing the concentration, as a function of the size, of the circulating free deoxyribonucleic acid fragments and/or the determination of the circulating free deoxyribonucleic acid concentration for each size between 160 and 220 base pairs are carried out by direct analysis of the plasma sample obtained from the whole blood sample isolated from the subject, that is to say they are carried out directly on this sample itself, without a prior DNA extraction step.
  • the method comprises a step of extracting the circulating free deoxyribonucleic acid from the blood sample, or where appropriate from the plasma sample obtained from this blood sample, so as to obtain an extract containing the circulating free deoxyribonucleic acid contained therein. Determining the total cfDNA concentration and determining said at least one large cfDNA concentration, and where appropriate establishing the curve representing the concentration, as a function of the size, of the circulating free deoxyribonucleic acid fragments and/or determining the concentration of circulating free deoxyribonucleic acid for each size between 160 and 220 base pairs, are then carried out by analysis of the circulating free deoxyribonucleic acid extract thus obtained.
  • the step of extracting cfDNA from the blood sample, or where appropriate from the plasma sample can be carried out in any conventional manner, for example by a technology using magnetic beads, or by means of a kit marketed for this purpose, by the companies IDSolutions (IDXtract Kit), Promega (Maxwell® RSC ccfDNA plasma Kit) or Qiagen (QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit) for example.
  • IDXtract Kit IDXtract Kit
  • Promega Maxwell® RSC ccfDNA plasma Kit
  • Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit
  • the analysis of the blood sample, the plasma sample, or the cfDNA extract obtained according to the invention, to determine the total cfDNA concentration and one or more large cfDNA concentrations (each associated with a different analytical size range), and where appropriate the curve representing the concentration, as a function of the size, of the circulating free deoxyribonucleic acid fragments and/or the circulating free deoxyribonucleic acid concentration for each size between 160 and 220 base pairs, can be carried out by any technique known to those skilled in the art for this purpose.
  • PCR polymerase chain reaction
  • gel electrophoresis gel electrophoresis
  • capillary electrophoresis technology using a commercially available device, such as the Fragment Analyzer and System 7100 CE from Agilent Technologies, the QIAxcel offered by Qiagen, or the GenomeLab system from Sciex.
  • Fragment Analyzer and System 7100 CE from Agilent Technologies
  • QIAxcel offered by Qiagen
  • GenomeLab system from Sciex.
  • the determination of the different concentrations of cfDNA is carried out by a technique based on the so-called pLas technology, as described in particular in documents WO 2016/016470, WO 2014/020271, or the publication of Collinson et al., Lab Chip, 2016, 16(7): 1243-53.
  • the pLas technology operates in two stages respectively of concentration and separation carried out online.
  • the DNA is concentrated via a capillary system formed by the junction of a small capillary and another capillary of larger section.
  • the solution containing the DNA is brought to flow laminarly in the large capillary, and an electric field is used to slow the migration.
  • this counter-electrophoresis causes a transverse force, dependent on the size of the DNA, which pushes the DNA towards the walls.
  • the change in flow speed and electric field at the constriction allows the DNA to be stopped and concentrated like a ring. Indeed, upstream of the constriction, the flow and counter-electrophoresis are slow, causing a weak transverse force. The DNA is therefore in the mass of the flow, and advances towards the constriction.
  • downstream of the constriction the flow and counter-electrophoresis are fast, strongly pressing the DNA to the wall where the laminar flow is very weak, and where counter-electrophoresis dominates.
  • the DNA then moves back towards the constriction, by counter-electrophoresis, along the wall. This ring is then released by the progressive decrease in the electric field, which also allows the separation operation to be carried out according to the size of the fragments.
  • the analysis of the blood sample, the plasma sample, or the cfDNA extract obtained according to the invention, to determine the total cfDNA concentration and one or more large cfDNA concentrations (each associated with a different analytical size range), and where appropriate the curve representing the concentration, as a function of the size, of the circulating free deoxyribonucleic acid fragments and/or the circulating free deoxyribonucleic acid concentration for each size between 160 and 220 base pairs, may in particular be carried out by the method, based on the pLas technology above, as described in document FR 3128231 or the publication by Boutonnet et al., Analytical Chemistry, 2023, 95(24): 9263-70.
  • This method has the advantage of being able to be implemented directly on a plasma sample, without prior extraction of the circulating DNA contained therein, and it advantageously makes it possible to easily and economically determine the characterization of the size profile of cfDNA with increased sensitivity compared to other analysis techniques.
  • This method can in particular be implemented using the device described in documents WO 2017/009566 and Andriamanampisoa et al., Analytical Chemistry, 2018, 90(6): 3766-74, and marketed under the name Biabooster by Adelis Technologies.
  • this method involves at least one iteration of an alternation:
  • a step of laminar flow of the sample to be analyzed in a capillary in a first direction of flow the capillary being provided with at least one local restriction of its section and comprising an analysis buffer, during which the sample is subjected to a first difference in electrical potential whose action on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes the retention of nucleic acid molecules in the capillary,
  • a step of laminar flow of the sample in a second direction of flow opposite to the first direction of flow, and, after the last iteration of the alternation, a step of separation by laminar flow of the sample in the capillary in the first direction of flow, during which the sample is subjected to an electrical potential difference less than or equal to the first potential difference, the action of which on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes partial retention of nucleic acid molecules in the capillary.
  • This method further comprises, during or after the separation step, a step of measuring a fluorescence time profile of the fluorescent nucleic acid molecules and a step of converting the fluorescence time profile into a concentration profile of nucleic acid molecules of different lengths, by implementing a fluorescence profile of a standard sample, the concentration of which is known for each length of fluorescent nucleic acid molecule present in the sample.
  • the nucleic acid molecules were made fluorescent by one of the techniques known to those skilled in the art, for example by adding to the analysis buffer an intercalating fluorophore, that is to say a molecule which fluoresces little in the free state, and which fluoresces a lot when it is intercalated between the bases of the DNA.
  • the guaranteed technical uncertainty of such a method is advantageously 5 to 10%.
  • the size repeatability is better than 1%.
  • this method advantageously allows to determine the total cfDNA concentration and the large cfDNA concentration(s) in the plasma sample with a very good degree of approximation.
  • the score obtained within the framework of the prediction method according to the invention also constitutes a good statistical indicator of the prognosis of overall survival without progression of the subject suffering from cancer treated by immunotherapy, as well as of his survival at 3 years.
  • another aspect of the invention relates to an in vitro method for predicting the early progressor character and/or the early non-progressor character during an immunotherapy treatment of a subject suffering from cancer, in particular lung cancer, this method comprising steps of: 1/ establishing a curve representing the concentration, as a function of the size, of the free deoxyribonucleic acid fragments circulating in an isolated blood sample obtained from said subject before said immunotherapy treatment,
  • This process may meet one or more of the characteristics described above. before in this description, not relating to one or more variables of the mathematical function with the exception of the variable Position pic2.
  • Figure 1 shows a curve representing the fluorescence intensity profile as a function of time, obtained by analysis, by a method based on pLas technology, of a plasma sample from a cancer patient containing cfDNA.
  • Figure 2 shows a curve representing the fluorescence intensity profile as a function of time, obtained by analysis, by a method based on pLas technology, of a standard sample containing DNA fragments of known size and concentration.
  • Figure 3 shows a curve representing the circulating free DNA concentration profile, expressed in picograms per pl per base pair (bp), as a function of size, obtained from the curve in Figure 1.
  • Figure 4 shows a histogram representing the distribution of circulating free DNA concentration for different size ranges, obtained from the curve in Figure 3.
  • Figure 5 represents ROC curves relating to the prediction of the early progressor character of a patient suffering from cancer during an immunotherapy treatment, obtained for an indicator according to the invention, the relative concentration of cfDNA fragments of size greater than or equal to 1650 bp in a plasma sample of said patient, in a/ for a training batch, in b/ for a test batch, and in c/ for the total cohort; for each curve, the area under the curve (“AUC”) is indicated in the figure.
  • AUC area under the curve
  • Figure 6 represents ROC curves relating to the prediction of the early progressor character of a patient suffering from cancer during an immunotherapy treatment, obtained for an indicator according to the invention, the relative concentration of cfDNA fragments of size between 580 and 1649 bp in a plasma sample of said patient, in a/ for a learning batch, in b/ for a test batch, and in c/ for the total cohort; for each curve, the area under the curve (“AUC”) is indicated in the figure.
  • AUC area under the curve
  • Figure 7 represents the box plots obtained for a cohort of 51 patients for two indicators according to the invention, in a/ the relative concentration of cfDNA fragments of size greater than or equal to 1650 bp in a plasma sample of said patient, in b/ the relative concentration of cfDNA fragments of size between 580 and 1649 bp in this plasma sample.
  • Figure 8 shows a graph representing, as a function of time, the progression-free survival curve of patients with cancer who have undergone immunotherapy treatment, determined by the Kaplan-Meier method, according to whether they have a score higher (light curve) or lower (dark curve) than the threshold value of 0.034, this score being predicted by a method according to the invention taking into account the relative concentration of cfDNA fragments of size greater than or equal to 1650 bp in the plasma samples of the patients; the number of patients (“individuals at risk”) from the initial cohort included in the study at each evaluation time, respectively with a score lower than 0.034 (top line) and a score higher than 0.034 (bottom line) is indicated in the table below the graph.
  • Figure 9 represents, in a/ the box plots obtained for a cohort of 68 patients suffering from lung cancer (54 patients with the status of non-early progressor NEP and 14 patients with the status of early progressor EP), for an indicator according to the invention (relative concentration of cfDNA fragments of size greater than or equal to 1650 bp in a plasma sample of said patient), and in b/ a ROC curve relating to the prediction of the early progressor character of a patient suffering from lung cancer during immunotherapy treatment, obtained for the same indicator.
  • an indicator according to the invention relative concentration of cfDNA fragments of size greater than or equal to 1650 bp in a plasma sample of said patient
  • a ROC curve relating to the prediction of the early progressor character of a patient suffering from lung cancer during immunotherapy treatment
  • Figure 10 shows a graph representing the negative predictive value (NPV) as a function of specificity for a cohort of 68 patients with lung cancer and the indicator according to the invention “relative concentration of cfDNA fragments of size greater than or equal to 1650 bp in a plasma sample of said patient”.
  • NPV negative predictive value
  • Figure 1 1 shows graphs representing, as a function of time, the progression-free survival curve of patients with cancer (in a/, all cancers, in b/, lung cancer) and having undergone immunotherapy treatment, determined by the Kaplan-Meier method, depending on whether they have a score higher (dark curve) or lower (light curve) than the threshold value (in a/ 0.039, in b/ 0.037), this score being predicted by a method according to the invention taking into account the relative concentration of cfDNA fragments of size greater than or equal to 1650 bp in the plasma samples of the patients; the numbers of patients (“individuals at risk”) of the initial cohort included in the study at each evaluation time, respectively with a score lower than the threshold value (top line) and a score lower than the threshold value (bottom line) are indicated in the tables below the graphs.
  • Figure 12 shows graphs representing, as a function of time, the progression-free survival curve of patients with cancer (in a/, all cancers, in b/, lung cancer) and having undergone immunotherapy treatment, determined by the Kaplan-Meier method, according to whether they have a score higher (dark curve) or lower (light curve) than the threshold value (in a/ 307.2, in b/ 304.8), this score being predicted by a method according to the invention taking into account the position of peak 2 on the curve representing the concentration, as a function of the size, of the cfDNA fragments in the plasma samples of the patients; the numbers of patients (“individuals at risk”) of the initial cohort included in the study at each evaluation time, respectively with a score lower than the threshold value (top line) and a score lower than the threshold value (bottom line) are indicated in the tables below the graphs.
  • Figure 13 shows a graph representing, as a function of time, the progression-free survival curve of patients with cancer who have been subjected to immunotherapy treatment, determined by the Kaplan-Meier method, according to whether they have a score higher (dark curve) or lower (light curve) than the threshold value (0.086), this score being predicted by a method according to the invention taking into account the relative concentration of cfDNA fragments of size between 580 and 1649 bp in the plasma samples of the patients; the number of patients (“individuals at risk”) from the initial cohort included in the study at each evaluation time, respectively with a score lower than the threshold value (top line) and a score lower than the threshold value (bottom line) is indicated in the table below the graph.
  • Figure 14 shows a graph representing, as a function of time, the progression-free survival curve of patients with lung cancer who have been subjected to immunotherapy treatment, determined by the Kaplan-Meier method, according to whether they have a score higher (dark curve) or lower (light curve) than the threshold value (0.5), this score being predicted by a method according to the invention taking into account several parameters of cfDNA size in the plasma samples of the patients; the number of patients (“individuals at risk”) of the initial cohort included in the study at each evaluation time, respectively with a score lower than the threshold value (top line) and a score lower than the threshold value (bottom line) is indicated in the table below the graph.
  • Figure 15 shows a graph representing, as a function of time, the progression-free survival curve of patients with lung cancer who have been subjected to immunotherapy treatment, determined by the Kaplan-Meier method, according to whether they have a score higher (dark curve) or lower (light curve) than the threshold value (0.5), this score being predicted by a method according to the invention taking into account several parameters of cfDNA size in the patients' plasma samples and a clinical marker; the number of patients ("individuals at risk") from the initial cohort included in the study at each evaluation time, respectively with a score lower than the threshold value (top line) and a score lower than the threshold value (bottom line) is indicated in the table below the graph.
  • Figure 16 shows a graph representing, as a function of time, the progression-free survival curve of patients with HNSCC cancer who have been subjected to immunotherapy treatment, determined by the Kaplan-Meier method, according to whether they have a score higher (dark curve) or lower (light curve) than the threshold value (0.5), this score being predicted by a method according to the invention taking into account several parameters of cfDNA size in the patients' plasma samples and a clinical marker; the number of patients ("individuals at risk") from the initial cohort included in the study at each evaluation time, respectively with a score lower than the threshold value (top line) and a score lower than the threshold value (bottom line) is indicated in the table below the graph.
  • A/ Study 1 A/ Study 1
  • Response to immunotherapy treatment of patients refers to the response to the treatments used, which are: nivolumab, lipilimumab and/or pembrolizumab, these treatments can be combined with targeted therapy, administration of anti-PD-L1 antibodies or chemotherapy treatment.
  • the characteristics of the patients in the cohort at the start of the study are summarized in Table 1.
  • iRECIST guidelines for response criteria for use in trials testing immunotherapeutics”, Seymour et al., LANCET Oncology, vol 18, issue 3, e143-e152, 2017
  • the clinical data monitored are: serum lactate dehydrogenase (LDH) level, level of metastases, age, sex, smoker or non-smoker, tumor proportion score (TPS).
  • LDH serum lactate dehydrogenase
  • TPS tumor proportion score
  • the samples used according to the invention are prepared from whole blood taken from the individual.
  • whole blood is collected on Cell-Free DNA Collection Tubes according to the recommendations of the supplier Roche Diagnostics.
  • the plasma thus recovered can be used immediately, or it can be stored at -20°C for a period of less than or equal to 1 month, or -80°C for periods of more than 1 month, before its analysis.
  • the total circulating free DNA concentration in plasma samples, and the concentration profiles as a function of size, are determined by a method based on pLas microfluidic technology. More specifically, the protocol implemented is as described in the publication by Boutonnet et al., Analytical Chemistry, 2023, 95(24): 9263-70.
  • the material used is as follows:
  • the protocol implemented is schematically as follows.
  • Plasma samples are first subjected to pretreatment with proteinase K in the presence of detergent, so as to release the nucleic acids from the vesicles and nucleoprotein complexes in which they are most often trapped. To this end, they are placed in the presence of an aqueous solution of proteinase K (2 mg/ml) and non-ionic surfactant NP-40 (1%) at 56°C for 2 h with vigorous stirring (900 rpm), then recovered by centrifugation.
  • TAE buffer Tris-Acetate-EDTA (TAE) 0.5X + bovine serum albumin (BSA) 0.5 mg/mL, pH 8, polyvinylpyrrolidone (PVP) 360kDa 5% (w/v), water,
  • BSA bovine serum albumin
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • PIPES buffer 30 mM Bis-tris, piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) (Pipes) 10 mM, pH 6.5, EDTA 1 mM, PVP 360KDa 5% (w/v), water,
  • the fluorescence profile is then converted into a concentration profile using the fluorescence intensity profile of a standard sample comprising DNA fragments whose respective sizes, ranging from 100 base pairs (“bp”) to 1500 base pairs, are known and for which, for each size of DNA fragment, the migration time, the fluorescence intensity and the concentration are known (making it possible to know the fluorescence to concentration conversion factor for each migration time of the peaks of the standard sample).
  • the area of each peak of the standard sample is measured (in RFU.min), then divided by the concentration of the corresponding fragment.
  • the result is divided by the unit of time (1 min), and thus, for each of the peaks in Figure 2, a fluorescence value per pg.pL is obtained for each migration time of the standard sample.
  • Virtual points can be added outside the curve expressing the conversion factor (RFU/pg/pL.min) as a function of the migration time thus obtained, for short and long migration times.
  • a linear interpolation is carried out between the points of this curve, in a conventional manner, to determine the fluorescence conversion factor into concentration for all migration times located between the first and last peak of the standard sample.
  • the fragments of the standard sample give “migration time / DNA size” pairs.
  • a linear interpolation is made, in a conventional manner, between each point to obtain a conversion of migration times into DNA size. Additional points can be added to the curve representing DNA size as a function of migration time thus obtained, the migration times of these additional points being calculated relative to the closest experimental DNA fragments in the standard sample, in order to gain precision in the calibration of DNA size, without having to increase the number of DNA fragments in the standard sample.
  • a curve representing DNA size as a function of migration time is obtained.
  • concentrations are only quantitatively determined between 75 and 1650 base pairs.
  • a relative concentration value in arbitrary units, is calculated. This relative value, however, is highly representative of the actual value.
  • the minimum and maximum sizes of the interval are converted to minimum and maximum times according to the time/size calibration, and then the integral of the time/concentration curve is calculated between these minimum and maximum times. This gives the absolute concentration of cfDNA in each desired size range, expressed in pg/pL.
  • a histogram of the percentages of the following different size ranges is constructed: size less than 75 bp, from 75 to 239 bp, from 240 to 369 bp, from 370 to 579 bp, from 580 to 1649 bp, greater than or equal to 1650 bp.
  • An example of such a histogram is shown in Figure 4.
  • the total concentration of cfDNA is also calculated. In this example, this total concentration is approximated to the concentration of DNA between the sizes 75 bp and 1650 bp, the value thus approximated being very close to the real value.
  • Preliminary statistical tests including classification by univariate logistic regression, univariate and multivariate COX regression and Kaplan-Meier estimation to classify early progressors and early non-progressors on a first set of 25 patients with a distribution of pathologies equivalent to that of the entire cohort of 51 patients were first carried out, for the following panels of potential indicators: relative concentrations of cfDNA fragments in plasma, for the following respective size ranges: size less than 75 bp, 75 to 239 bp, 240 to 369 bp, 370 to 579 bp, 580 to 1649 bp, greater than or equal to 1650 bp.
  • the two indicators that characterize the patient's response are the relative concentrations of cDNA fragments in the plasma for the following size ranges: size greater than or equal to 1650 base pairs, and size between 580 and 1649 base pairs.
  • the cohort of 51 patients is divided into two data sets: a training set (70% - 35 patients) and a test set (30% - 16 patients). This distribution between training set and test set is classic and corresponds to the standard methodology for this type of statistical analysis.
  • the two sets (training and test) present a balanced distribution between patients in progression, pathology and sex.
  • a ROC curve is performed on the training batch to determine the threshold that minimizes the distance from the optimal point (0.1).
  • the method used to set the optimal threshold value is the BOOTSTRAP method. For 100 experiments, patients are randomly sampled with replacement between the training batch (“in bag”) and the test batch (“out of bag”).
  • the threshold is optimized and defined as the median of the 100 thresholds obtained by the BOOTSTRAP method.
  • PSV positive predictive value
  • NVM negative predictive value
  • the thresholds determined by the BOOTSTRAP method are further used to calculate a 95% confidence interval of the threshold values by extracting the 2.5% and 97.5% quantiles.
  • the ROC curves obtained for each indicator, respectively for the training batch of 35 patients, the test batch of 16 patients and the total cohort, are shown in Figure 5 for indicator P1 and in Figure 6 for indicator P2.
  • the values of the area under the curve (AUC) are indicated in the figures for each of the curves. We observe that this value is high for both indicators, and is higher for indicator P1 ( Figure 5) than for indicator P2 ( Figure 6).
  • AUC area under the curve
  • Figure 7 shows the box plots obtained for each of the P1 and P2 indicators for the entire cohort. We observe that the results are statistically different between early progressors and early non-progressors.
  • the P2 indicator has an excellent specificity of 1 considering a threshold (below which the patient is considered an early progressor) of 0.072 (confidence interval of 0.062 to 0.122). This indicator thus has a good predictive power of progression or not of the tumor at the first examination: if it is low, then there will very probably be (better than 90%) progression of the disease at the first examination. On the other hand, if it is high, its predictive power of an absence of early progression is moderate, lower than that of the P1 marker, which presents the best compromise between sensitivity and specificity.
  • the progression-free survival curves and survival probabilities were estimated by the Kaplan-Meier method, and compared to the prediction results by the P1 indicator according to the invention, with the threshold value of 0.034.
  • the results are shown in Figure 8. It is observed that the curves are well correlated and characteristic of a long response, and therefore of a good prognosis of progression-free survival.
  • the P1 indicator constitutes a marker allowing the prognosis of progression-free survival.
  • This study is based on a cohort of 155 patients (including the 51 patients from Study 1) with 5 types of cancer pathologies: melanoma, ENT (head and neck squamous cell carcinoma, hereinafter referred to as HNSCC), lung (non-small cell), kidney and bladder.
  • the response to immunotherapy treatment of patients refers to the response to the treatments used which are: nivolumab, lipilimumab and/or pembrolizumab, these treatments can be combined with targeted therapy, the administration of anti-PD-L1 antibodies or chemotherapy treatment.
  • the curve representing the concentration of cfDNA as a function of size is established as described in the description of Study 1, and as illustrated in Figure 3.
  • the position of peak 2 (expressed in base pairs), for example 308 base pairs for the example in Figure 3, is determined, as are the different concentrations of cfDNA in the desired value ranges.
  • ROC curves are established, and the values of the area under the curve (AUC) as well as the p values, established respectively by the methods of the t test and the Wilcoxon test in a classical manner, in relation to the known EP or NEP statuses, are determined.
  • the threshold that minimizes the distance from the optimal point (0.1) (reference value), established from the ROC curve, is indicated in Table 10. Scores above these threshold values indicate early non-progressor status.
  • the threshold values may be chosen differently, in particular higher values if the objective is to prioritize the specificity of prediction of an early progressor status rather than the sensitivity of prediction.
  • the box plots and ROC curve for the P1 indicator are shown in Figure 9, respectively in a/ and b/.
  • the obtained AUC is equal to 0.79.
  • the graph representing NPV as a function of specificity is shown in Figure 10. It is observed that the P1 indicator allows predicting approximately 3/4 of early non-progressors with an NPV of 90%.
  • the “Position peak2” indicator shows similar performance to the P1 indicator in lung cancer.
  • a logistic regression was performed, specifically to predict early progressor (EP) patients, by dividing the data into a training set (75% of the data) and a test set (25% of the data, 16 patients), for a total of 64 lung cancer patients. The logistic regression was adjusted on the training set by cross-validation, then tested on the test set.
  • EP early progressor
  • the threshold value (above which the patient is considered an early progressor) is equal to 0.5.
  • a logistic regression was performed, specifically to predict early progressor (EP) patients, by dividing the data into a training set (25 patients) and a test set (7 patients), for a total of 32 patients with HNSCC. The logistic regression was adjusted on the training set by cross-validation and then tested on the test set.
  • the threshold value (above which the patient is considered an early progressor) is equal to 0.5.
  • a logistic regression was performed, aiming to predict more specifically early progressor (EP) patients, by dividing the data into a set training set (42 patients) and a test set (13 patients), for a total of 55 lung cancer patients. Logistic regression was fitted on the training set by cross-validation, then tested on the test set.
  • a logistic regression was performed, specifically to predict early progressor (EP) patients, by dividing the data into a training set (83 patients) and a test set (27 patients), for a total of 110 patients with non-melanoma cancer. The logistic regression was fitted to the training set by cross-validation and then tested on the test set.
  • the NPV is high: the conclusion of the prediction process allows immunotherapy treatment to be administered to the patient with good confidence that he will not be an early progressor.
  • the threshold value (above which the patient is considered an early progressor) is equal to 0.5. It emerges from the above results that the combination of the size markers chosen in accordance with the invention and the ratio "number of neutrophils / number of lymphocytes" further increases the performance of predicting an early progressor characteristic, compared to what can be predicted by the combination of these size markers alone.
  • Progression-free survival curves and survival probabilities were estimated by the Kaplan-Meier method, and compared with the prediction results by different of the above indicators, with the corresponding cut-off value, for different types of cancer. Confidence intervals were obtained by the BOOTSTRAP method.
  • the indicators chosen in accordance with the invention constitute a tool allowing the prognosis of progression-free survival.

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Abstract

L'invention concerne un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce d'un sujet atteint d'un cancer lors d'un traitement d'immunothérapie. Ce procédé comprend la détermination, dans un échantillon de sang isolé du sujet, de la concentration totale d'ADN libre circulant et d'une concentration des fragments d'ADN libre circulant de grande taille, la combinaison de ces données dans une fonction mathématique de sorte à obtenir un score, et la comparaison de ce score à un valeur de référence prédéterminée. Il conclut que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d'immunothérapie lorsque le score obtenu est inférieur ou égal à la valeur de référence.

Description

PROCÉDÉ DE PRÉDICTION DE LA RÉPONSE D’UN PATIENT ATTEINT DE CANCER À UN TRAITEMENT D’IMMUNOTHÉRAPIE
La présente invention s’inscrit dans le domaine général de l’oncologie.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non- progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors de l’administration d’un traitement d’immunothérapie.
Le traitement des cancers constitue depuis des décennies l’objectif de nombreux travaux de recherche. Dans les dernières années, un effort particulier a été réalisé pour développer des stratégies thérapeutiques plus individualisées.
L’approche visant non pas à s’attaquer directement à la tumeur, mais à stimuler le système immunitaire, dite immunothérapie, est aujourd’hui reconnue comme l’une des stratégies thérapeutiques les plus efficaces pour le traitement d’un grand nombre de types de cancers. Sur certains types de cancers, l’immunothérapie est utilisée en routine, avec des résultats spectaculaires, notamment pour ce qui concerne le cancer du poumon à petites cellules. Ainsi, une méta-analyse a révélé que 25 % des patients traités par immunothérapie présentaient une réponse au traitement prolongeant la survie. En analyse multivariée, il a également été montré que des réponses durables étaient plus fréquentes chez les patients traités par immunothérapie, c’est-à-dire que leur survie globale était améliorée (Pons-Tostivint et al., 2019, JCO Precision Oncology, 3(3): 1 -10).
Cependant, les traitements d’immunothérapie ne montrent pas une efficacité chez tous les patients. En outre, ils peuvent provoquer des effets indésirables sur certains. Pour ces patients, une chimiothérapie classique aurait été une meilleure option. On parle alors de patients non-répondeurs au traitement d’immunothérapie. Cette information est souvent obtenue tard, plusieurs semaines après le démarrage du traitement d’immunothérapie, semaines qui peuvent entrainer la dégradation de l’état de santé du patient et réduire notablement son espérance de vie. Identifier les patients chez lesquels une immunothérapie sera efficace est une nécessité aujourd’hui actée par l’ensemble de la communauté en immunothérapie. Aucune méthode ne permet actuellement, avant le démarrage d’un traitement d’immunothérapie, d’identifier / classifier les patients atteints de cancer qui seront répondeurs ou non-répondeurs à ce traitement, plus précisément d’identifier les patients pour lesquels ce traitement permettra, ou ne permettra pas, d’empêcher la progression de la tumeur. Un biomarqueur fiable, standardisé, pouvant être utilisé dans la pratique clinique pour prédire la réponse au traitement et en évaluer l'efficacité future n’a pas encore été identifié. Or, l’existence d’un tel marqueur prédictif améliorerait l’efficacité de la prise en charge des patients et son éthique sous-tendue, en évitant aux patients des pertes de chance de guérison et des effets indésirables inutiles. En outre, les nouveaux traitements d’immunothérapie sont vendus à des prix très élevés. Le coût d’un traitement par cellules CAR-T est d’environ 350 000 euros par patient, et celui d’un traitement par immunomodulateurs d’environ 75 000 euros par an. Ces coûts posent évidemment des problèmes d’accès et de prise en charge, d’autant plus que ces traitements ne sont efficaces que chez une fraction des patients et qu’ils n’apportent pas toujours un bénéfice majeur.
A ce jour, deux marqueurs sont utilisés pour prédire le caractère répondeur des patients aux traitements d’immunothérapie, à titre indicatif seulement car le caractère prédictif de ces marqueurs est limité :
- le score positif combiné (CPS, pour l’anglais Combined Positive Score), qui évalue l'expression de PD-L1 (« programmed death ligand-1 ») dans les cellules tumorales et les cellules immunitaires - ce score est égal au nombre total de cellules marquant PD-L1 x 100, divisé par le nombre de cellules tumorales viables ;
- et le score de proportion tumorale (TPS, pour l’anglais Tumor Proportion Score), qui ne prend en compte que l’expression de PD-L1 par les cellules tumorales - ce score est égal au nombre de cellules tumorales marquant PD- L1 ) x 100, divisé par le nombre de cellules tumorales viables.
Ces marqueurs CPS et TPS nécessitent néanmoins la mise en place de protocoles souvent particuliers à chaque centre de soin, et aucune normalisation n’est à ce jour réalisée, ce qui entraine des différences dans les valeurs des scores et seuils appliqués dans les différents centres de soin. La présente invention vise à proposer un procédé permettant de prédire, avec une haute précision, comment un patient atteint de cancer répondra, plus précisément si sa tumeur progressera précocement ou non, lorsqu’il sera soumis à d’un traitement d’immunothérapie, ceci avant le démarrage d’un tel traitement. Des objectifs supplémentaires de l’invention sont que ce procédé soit facile à mettre en oeuvre, au moyen d’appareillages couramment disponibles dans les laboratoires d’analyse, et qu’il puisse s’appliquer au plus grand nombre possible, d’une part, de types de cancers, et d’autre part, de types de traitements d’immunothérapie.
Visant à développer un tel procédé, les présents inventeurs se sont intéressés à l’acide désoxyribonucléique (ADN) libre circulant présent dans le sang des patients. Cet ADN libre circulant dans le plasma sanguin est actuellement l’enjeu d’une intense recherche clinique en oncologie, car on peut y retrouver des mutations de l’ADN génomique présentes dans les cellules tumorales, qui orientent la thérapie à administrer au patient. Par commodité, on désignera cet acide désoxyribonucléique libre circulant, dans la présente description, par « ADN libre circulant » ou encore ADNcf.
Il est clairement établi que le sang véhicule une petite quantité d’ADN libre circulant provenant de la libération de matériel génétique par les tissus. Cet ADN libre circulant sans cellule est sous la forme d’ADN double-brin d’une taille moyenne de 150-180 paires de bases (pb), correspondant à l’enroulement de l’ADN dans un nucléosome. Sa durée de vie est de moins de deux heures, avant qu'il ne soit filtré et éliminé de la circulation sanguine par la rate, le foie et les reins. Toutes les études s’accordent en une détection quantitative moindre de l’ADN libre circulant chez les individus sains et en son augmentation liée à différentes situations cliniques telles que les accidents vasculaires cérébraux et infarctus myocardiques, les exercices musculaires intensifs, l’insuffisance rénale aiguë, la cytolyse hépatique, les traumatismes, la chirurgie, le cancer, la présence d’un foetus lors de la gestation...
Dans le cas du cancer, les progrès récents de la biologie moléculaire et du séquençage de l’ADN ont permis d’identifier de nombreuses mutations de gènes impliqués dans l’oncogénèse à partir d’un type particulier d’ADN circulant, l’ADN circulant tumoral (ADNct). Il a notamment été montré que le taux d’ADNct serait corrélé à la charge tumorale et au stade du cancer. D’une manière générale, les études réalisées portent sur l’utilisation de l’ADNct comme biomarqueur tumoral permettant de suivre l’évolution positive ou négative du patient lors de son traitement thérapeutique (immunothérapie ou autres).
Des études corrélant l’ADN circulant avec l’évolution du patient au cours d’un traitement d’immunothérapie ont été décrites dans la littérature. La plupart de ces études portent sur le suivi post-traitement, en suivant le niveau de charge tumorale soit par mesure de l’ADNct par des techniques usuelles telles que la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou le séquençage, ou soit par un examen direct de la tumeur par imagerie.
D’un point de vue plus général, les études réalisées sur l’ADN circulant portent sur les fragments d’ADN de petite taille, inférieure à 250 paires de bases, qui sont considérés comme portant la principale information, et plus précisément sur les tailles entre 70 et 150 paires de bases, qui sont enrichies en ADNct. L’ADNct est ainsi souvent proposé comme indicateur de l'évolution de la maladie.
Il a maintenant été découvert par les présents inventeurs que l’analyse du profil de taille de l’ADN libre circulant total des sujets atteints d’un cancer permet de prédire leur réponse future aux traitements d’immunothérapie, plus précisément de déterminer si le sujet sera ou non progresseur précoce lorsqu’un tel traitement lui sera administré, ceci en amont de cette administration.
On entend dans la présente description, par sujet non-progresseur précoce, ou sujet à caractère de non-progresseur précoce, de manière conventionnelle en elle-même dans le domaine médical, un sujet atteint de cancer pour lequel on observe, sur la première image de la tumeur acquise par imagerie médicale, en particulier par scanner aux rayons X, après le début du traitement d’immunothérapie, par rapport à l’image acquise par la même technique d’imagerie médicale avant le début de ce traitement, une augmentation de moins de 20 % des lésions tumorales repérées à l’imagerie, c’est-à-dire que les lésions tumorales ont diminué, sont restées stables ou ont augmenté de moins de 20 % (en surface). On parle alors plus couramment de progression de moins de 20 % de la tumeur cancéreuse à la première évaluation par imagerie après le début du traitement d’immunothérapie.
Le moment de l’acquisition de la première image d’imagerie médicale après le début du traitement d’immunothérapie est déterminé selon le protocole conventionnel de prise en charge des malades atteints de cancer en vigueur dans le domaine, et dépend du type particulier de cancer concerné. Typiquement, ce moment est de 6 semaines après le début du traitement d’immunothérapie pour les cancers du poumon, et de 12 semaines pour les autres cancers.
Par opposition, on entend, par sujet progresseur précoce, ou sujet à caractère de progresseur précoce, également de manière conventionnelle en elle-même dans le domaine médical, un sujet atteint de cancer pour lequel on observe, sur la première image de la tumeur acquise par imagerie médicale, en particulier par scanner aux rayons X, après le début du traitement d’immunothérapie, par rapport à l’image acquise par la même technique d’imagerie médicale avant le début de ce traitement, une augmentation de plus de 20 % des lésions tumorales repérées à l’imagerie, c’est-à-dire que les lésions tumorales ont augmenté de 20 % ou plus (en surface). On parle alors plus couramment de progression de plus de 20 % de la tumeur cancéreuse à la première évaluation par imagerie après le début du traitement d’immunothérapie.
Comme indiqué ci-avant, on entend en outre, par ADN libre circulant, l’ADN extracellulaire présent dans le plasma sanguin du patient. Cet ADN libre circulant comprend l’ADN libre circulant tumoral et l’ADN libre circulant non-tumoral.
Plus particulièrement, il a été découvert par les présents inventeurs que les patients à caractère de non-progresseur précoce, pour lesquels la tumeur ne progresse pas ou peu, ou même régresse, dans la période initiale d’un traitement d’immunothérapie, dans les premières semaines de ce traitement, présentent un plus fort taux de fragments d’ADN libre circulant de grande taille que les patients à caractère de progresseur précoce. Ainsi, la concentration, notamment la concentration relative, en fragments d’ADN libre circulant d’un patient atteint d’un cancer, dont la taille est supérieure à 500 paires de bases, constitue un paramètre qui peut être utilisé dans un procédé permettant de déterminer si ce patient sera progresseur précoce ou non-progresseur précoce lors de l’administration d’un traitement d’immunothérapie. Rien dans l’art antérieur, qui ne s’intéresse qu’aux fragments d’ADN libre circulant de petite taille, bien inférieure à 500 paires de bases, ne laissait présager un tel résultat. Ainsi, il est proposé selon la présente invention un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, c’est-à-dire lorsqu’un traitement d’immunothérapie lui sera administré. Ce procédé relève des procédés d’analyse statistique. Il comprend des étapes de : a/ détermination, dans un échantillon de sang isolé qui a été obtenu à partir dudit sujet, de préférence avant ledit traitement d’immunothérapie :
- de la concentration totale d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, dite concentration d’ADNcf totale,
- d’au moins une concentration, dans ledit échantillon de sang, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dont la taille est incluse dans une plage de taille prédéterminée, ladite plage de taille prédéterminée, qui sera désignée dans la présente description par l’expression « plage de taille analytique », étant comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases, la concentration ainsi déterminée étant appelée dans la présente description « concentration d’ADNcf de grande taille >>, b/ combinaison dans une fonction mathématique d’au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et de ladite concentration d’ADNcf totale, de sorte à obtenir un score, résultat de la fonction mathématique, ce score reflétant la probabilité que le sujet présente ou non un caractère de progresseur précoce et/ou un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, c/ comparaison de ce score à une première valeur de référence prédéterminée et/ou une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d/ détermination du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non- progresseur précoce du sujet lors du traitement d’immunothérapie sur la base du résultat de cette comparaison.
En particulier, en fonction de la fonction mathématique, les étapes c/ et d/ peuvent consister, soit en des étapes d / et d1 / et/ou c2/ et d2/ : c1 / comparaison de ce score à une première valeur de référence prédéterminée, et d1 / conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence, et/ou c2/ comparaison de ce score à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d2/ conclusion que le sujet présente un caractère de non- progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence, soit en des étapes c3/ et d3/ et/ou c4/ et d4/ : c3/ comparaison de ce score à une première valeur de référence prédéterminée, et d3/ conclusion que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence, et/ou c4/ comparaison de ce score à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d4/ conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, le procédé est un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, qui comprend des étapes de : a/ détermination, dans un échantillon de sang isolé qui a été obtenu à partir dudit sujet, de préférence avant ledit traitement d’immunothérapie :
- de la concentration totale d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, dite concentration d’ADNcf totale,
- d’au moins une concentration, dans ledit échantillon de sang, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dont la taille est incluse dans une plage de taille prédéterminée, ladite plage de taille prédéterminée, qui sera désignée dans la présente description par l’expression « plage de taille analytique », étant comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases, la concentration ainsi déterminée étant appelée dans la présente description « concentration d’ADNcf de grande taille >>, b/ combinaison dans une fonction mathématique d’au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et de ladite concentration d’ADNcf totale, de sorte à obtenir un score, ce score reflétant la probabilité que le sujet présente ou non un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, c1 / comparaison de ce score à une première valeur de référence prédéterminée, et d1 / conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence, ou c4/ comparaison de ce score à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d4/ conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, le procédé est un procédé in vitro de prédiction du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, qui comprend des étapes de : a/ détermination, dans un échantillon de sang isolé qui a été obtenu à partir dudit sujet, de préférence avant ledit traitement d’immunothérapie :
- de la concentration totale d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, dite concentration d’ADNcf totale,
- d’au moins une concentration, dans ledit échantillon de sang, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dont la taille est incluse dans une plage de taille prédéterminée, ladite plage de taille prédéterminée, qui sera désignée dans la présente description par l’expression « plage de taille analytique », étant comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases, la concentration ainsi déterminée étant appelée dans la présente description « concentration d’ADNcf de grande taille >>, b/ combinaison dans une fonction mathématique d’au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et de ladite concentration d’ADNcf totale, de sorte à obtenir un score, ce score reflétant la probabilité que le sujet présente ou non un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie, c2/ comparaison de ce score à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d2/ conclusion que le sujet présente un caractère de non- progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence, ou c3/ comparaison de ce score à une première valeur de référence prédéterminée, et d3/ conclusion que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence.
Le procédé selon l’invention peut autrement être un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint d’un cancer lors d’un traitement d’immunothérapie. Il comprend alors, après l’étape d’obtention du score :
- une étape d / de comparaison de ce score à la première valeur de référence prédéterminée, et une étape d1 / de conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence, ou une étape c4/ de comparaison de ce score à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et une étape d4/ de conclusion que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence, et
- une étape c2/ de comparaison de ce score à la deuxième valeur de référence prédéterminée, et une étape d2/ de conclusion que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette deuxième valeur de référence ou une étape c3/ de comparaison de ce score à une première valeur de référence prédéterminée, et une étape d3/ de conclusion que le sujet présente un caractère de non- progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque ce score est inférieur ou égal à cette première valeur de référence.
Comme indiqué ci-avant, le procédé selon l’invention, qui prend en considération la teneur en ADNcf de grande taille contenu dans l’échantillon de sang issu du sujet, permet de prédire, avec une haute précision, le caractère de non- progresseur précoce et/ou le caractère de progresseur précoce vis-à-vis d’un traitement d’immunothérapie d’un patient atteint de cancer, ceci avant-même le démarrage d’un tel traitement. Le résultat du procédé selon l’invention constitue ainsi une aide particulièrement avantageuse pour la prise de décision, par le clinicien, qui le prendra en compte au sein du tableau clinique global, d’administrer ou non un traitement d’immunothérapie pour chaque patient donné. Un tel procédé s’avère particulièrement avantageux en ce qu’il permet par exemple d’éviter une administration du traitement d’immunothérapie aux patients qui ont été prédits comme progresseurs précoces, pour lesquels ce traitement ne présentera pas l’efficacité recherchée, et/ou au contraire de d’administrer avec confiance un traitement d’immunothérapie aux patients qui ont été prédits comme non-progresseurs précoces.
La précision (ou justesse, pour l’anglais « accuracy ») de prédiction du procédé selon l’invention a notamment été vérifiée dans des études observationnelles prospectives menées sur des cohortes de, respectivement, 51 patients et 155 patients souffrant de différents types de cancers, et ayant été soumis à différents types de traitements d’immunothérapie (le procédé selon l’invention ayant été mis en oeuvre sur des échantillons de sang prélevés des patients avant le début de ces traitements).
De manière classique en elle-même, le terme précision désigne ici la proportion de patients ayant été correctement classés par le procédé selon l’invention.
La performance des procédés de prédiction statistique est généralement évaluée en traçant une courbe de caractéristique de fonctionnement du récepteur (courbe ROC) et en mesurant l'aire sous la courbe (AUC). La courbe ROC est établie en traçant la sensibilité versus (1 -spécificité) après classification des patients, en fonction des résultats obtenus par le procédé de prédiction. Plus la valeur de l'AUC est proche de 1 , plus la sensibilité et la spécificité du procédé sont élevées, et plus le procédé est performant. Dans l'étude sur la cohorte de 51 patients précitée, un procédé selon un mode de mise en oeuvre de l'invention a permis de prédire un caractère de progresseur précoce des patients avec une AUC aussi élevée que 0,833, ce qui en démontre clairement la bonne performance.
« Sensibilité » signifie ici, de manière classique, la probabilité du procédé d'identifier comme positifs les sujets progresseurs précoces (ou, selon les cas, non-progresseurs précoces), c'est-à-dire d'identifier les vrais positifs. « Spécificité » désigne la probabilité pour le procédé de ne pas identifier comme positifs les sujets non-progresseurs précoces (ou, selon les cas, progresseurs précoces), c'est-à-dire de ne pas identifier les vrais négatifs.
De plus, on entend dans la présente description, par « valeur prédictive positive » (PPV), la probabilité pour un sujet d’être progresseur précoce (ou, selon les cas, non-progresseur précoce) lorsque le résultat du procédé le prédit comme tel. On entend, par « valeur prédictive négative » (NPV), la probabilité pour un sujet d’être non-progresseur précoce (ou, selon les cas, progresseur précoce) lorsque le résultat du procédé le prédit comme tel.
Chacune des valeurs de référence utilisées dans le procédé selon l'invention est de préférence une valeur seuil, également couramment désignée par l’expression « valeur cut-off ». Il entre dans les compétences de l'homme du métier de savoir établir de telles valeurs de références, notamment de telles valeurs seuils, pour le procédé de prédiction selon l'invention, en fonction du niveau de sensibilité et du niveau de spécificité requis pour chaque prédiction. Une telle détermination peut être effectuée de manière soit empirique, soit théorique.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, ladite première valeur de référence et ladite deuxième valeur de référence sont identiques, et désignées par l’expression « valeur de référence commune >>. Alors, le procédé comprend une étape de conclusion que :
- si le score est inférieur ou égal à la valeur de référence commune, le sujet présente un caractère de progresseur précoce ou, selon la formule mathématique choisie, un caractère de non-progresseur précoce, lors du traitement d’immunothérapie, et/ou
- si le score est supérieur à la valeur de référence commune, le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce ou, selon la formule mathématique choisie, un caractère de progresseur précoce, lors du traitement d’immunothérapie.
Dans des modes de mise en oeuvre alternatifs de l’invention, la première valeur de référence et la deuxième valeur de référence sont différentes, la première valeur de référence étant inférieure à la deuxième valeur de référence. Le procédé peut alors comprendre une étape de conclusion que : - si le score est inférieur ou égal à la première valeur de référence, le sujet présente un caractère de progresseur précoce, ou, selon la formule mathématique choisie, un caractère de non-progresseur précoce, lors du traitement d’immunothérapie,
- si le score est supérieur à la deuxième valeur de référence, le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce ou, selon la formule mathématique choisie, un caractère de non-progresseur précoce, lors du traitement d’immunothérapie,
- si le score est supérieur à la première valeur de référence et inférieur ou égal à la deuxième valeur de référence, le procédé ne permet pas de prédire de manière satisfaisante la réponse du sujet au traitement d’immunothérapie.
Le procédé de prédiction selon l’invention, dont les résultats sont basés sur une analyse statistique, permet notamment avantageusement :
- une prédiction-stratification avant thérapie des patients non-progresseurs précoces et/ou des patients progresseurs précoces lors du traitement d’immunothérapie, permettant ainsi une prise en charge personnalisée ;
- une stratification des patients permettant de réaliser des études cliniques plus efficaces,
- pour le patient, un gain de temps augmentant les chances de succès de sa thérapie, en évitant les effets secondaires ou induits ;
- une simplicité et rapidité de mise en oeuvre par analyse réalisée à partir d’un échantillon sanguin déjà prélevé du patient pour d’autres objectifs ;
- une réduction des coûts très importants des traitements d’immunothérapie, qui peuvent être ciblés sur les seuls patients prédits comme non-progresseurs précoces par le procédé selon l’invention.
L’échantillon de sang utilisé dans le procédé selon l’invention a de préférence été isolé du sujet par un prélèvement sanguin réalisé avant le début du traitement d’immunothérapie. L’invention n’exclut pas pour autant que ce prélèvement sanguin ait été réalisé au moment de l’administration de ce traitement, ou après, de préférence juste après, dans les quelques heures ou quelques jours suivants le début de l’administration du traitement.
Le procédé selon l’invention est dépourvu en lui-même d’étape appliquée au corps du patient. Les étapes d’analyse qu’il implique sont réalisées à partir d’échantillons de sang total qui ont été prélevés du patient au préalable, de manière classique en elle-même.
Le sujet auquel s'applique le procédé selon l'invention est de préférence un mammifère. Il s’agit de préférence d’un humain.
Le procédé selon l’invention peut en outre répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-après, mises en oeuvre isolément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes.
La fonction mathématique mise en oeuvre dans le procédé selon l’invention peut être tout type de fonction multivariée.
Outre les variables que sont la concentration d’ADNcf de grande taille et la concentration d’ADNcf totale, elle peut utiliser d’autres variables. Elle peut notamment utiliser, en tant que variables, plusieurs concentrations d’ADNcf de grande taille différentes, chacune correspondant à une plage de taille analytique prédéterminée et différente des autres. On rappelle qu’au sens de la présente invention, l’expression « plage de taille analytique » désigne toute plage de taille comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases. Elle peut également ou autrement utiliser, en tant que variables, d’autres informations cliniques ou biologiques relatives au patient.
Chacune des variables contenues dans la fonction mathématique selon l’invention peut y être pondérée par un coefficient qui lui est propre et qui peut être égal à 1 , ou différent de 1 .
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, la fonction mathématique comprend, en tant que variable, le rapport entre au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et ladite concentration d’ADNcf totale. Par exemple, elle consiste en le rapport entre au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et ladite concentration d’ADNcf totale.
Il s’agit notamment du rapport entre une concentration d’ADNcf de grande taille et la concentration d’ADNcf totale. On peut alors qualifier cette fonction de concentration relative des fragments d’ADNcf dont la taille est comprise dans la plage de taille analytique prédéterminée, présente dans l’échantillon de sang du sujet étudié. Comme indiqué ci-avant, il a été découvert par les présents inventeurs qu’une telle concentration relative constitue un indicateur / biomarqueur permettant de prédire de manière performante la réponse (en termes de progression précoce ou non de la tumeur) d’un patient atteint de cancer lorsqu’il est soumis à un traitement d’immunothérapie.
La fonction mathématique mise en oeuvre selon l’invention peut autrement être égale à la somme de différentes concentrations d’ADNcf de grande taille, chacune étant associée à une plage de taille analytique prédéterminée, cette somme étant divisée par la concentration d’ADNcf totale.
Lorsque la fonction mathématique est le rapport entre une concentration d’ADNcf de grande taille et la concentration d’ADNcf totale, ou une somme de tels rapports, le procédé comprend les étapes d / et d1 /, et/ou c2/ et d2/ décrites ci-avant, c’est-à-dire qu’il conclut que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est inférieur ou égal à la première valeur de référence, et/ou le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à la deuxième valeur de référence.
La fonction mathématique mise en oeuvre selon l’invention peut autrement combiner les variables ci-dessus de toute autre façon, et notamment s’inscrire dans le cadre de la régression linéaire.
En particulier, elle peut avoir été obtenue par les étapes suivantes :
- évaluation du caractère de progresseur précoce ou non-progresseur précoce, lors d’un traitement d’immunothérapie, dans une cohorte de patients atteints de cancer, pour lesquels les valeurs des marqueurs décrits ci-avant et ci-après sont connues,
- et réalisation d’une analyse de régression logistique pour évaluer et pondérer la valeur discriminative indépendante de chacun de ces marqueurs pour la prédiction du caractère de progresseur précoce ou non-progresseur précoce lors d’un traitement d’immunothérapie,
- de sorte à obtenir la fonction mathématique visée.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, chaque plage de taille prédéterminée, ou plage de taille analytique, est définie uniquement par sa valeur minimale, c’est-à-dire qu’il s’agit d’une plage définie comme incluant les tailles supérieures, ou supérieures ou égales, à une valeur minimale donnée.
Ainsi, dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, au moins une plage de taille prédéterminée / plage de taille analytique est la plage de tailles supérieures à 500 paires de bases, de préférence la plage de tailles supérieures ou égales à 580 paires de bases, de préférence encore la plage de tailles supérieures ou égales à 600 paires de bases, et encore plus préférentiellement la plage de tailles supérieures ou égales à 1500 paires de bases. Préférentiellement, il s’agit de la plage de tailles supérieures ou égales à 1600 paires de bases, ou encore supérieures ou égales à 1650 paires de bases, ou même supérieures ou égales à 1700 paires de bases.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers alternatifs de l’invention, chaque plage de taille prédéterminée, ou plage de taille analytique, est définie par sa valeur minimale et sa valeur maximale, c’est-à-dire qu’il s’agit d’une plage définie comme incluant les tailles supérieures, ou supérieures ou égales, à une valeur minimale donnée, et inférieures, ou inférieures ou égales, à une valeur maximale donnée. Dans une telle configuration, les plages de taille plus élevées et/ou plus étendues sont plus particulièrement préférées dans le cadre de l’invention, par rapport aux plages de taille moins élevées et/ou moins étendues.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, au moins une plage de taille prédéterminée / plage de taille analytique est la plage de tailles comprises entre 580 et 1649 paires de bases.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, au moins une plage de taille prédéterminée / plage de taille analytique est la plage de tailles comprises entre 1650 et 4000 paires de bases.
La fonction mathématique utilisée selon l’invention peut combiner toutes combinaisons des variables associées chacune à une plage de taille analytique qui lui est propre, qui sont mentionnées ci-avant.
Parmi les plages de taille prédéterminées particulièrement préférées dans le cadre de l’invention, dans le contexte dans lequel la fonction mathématique mise en oeuvre est le rapport entre une concentration d’ADNcf de grande taille (c’est- à-dire des fragments d’ADNcf dans la plage de taille prédéterminée) et la concentration d’ADNcf totale, on peut citer à titre d’exemples de plages de taille analytique la plage de tailles supérieures ou égales à 1650 paires de bases, notamment comprise entre 1650 et 4000 paires de bases, et la plage de tailles de 580 à 1649 paires de bases.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, le procédé comprend l’établissement d’une courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, et la détermination de la taille, exprimée en paires de bases, correspondant au deuxième pic sur ladite courbe, cette taille étant désignée dans la présente par l’expression « Position pic2 ». La fonction mathématique comprend alors de préférence, en tant que variable, ladite Position pic2.
Un exemple de méthode permettant d’établir la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans l’échantillon de sang, est décrite de manière détaillée ci-après dans la présente description. Le deuxième pic observé sur cette courbe, c’est-à-dire le deuxième en partant de la valeur 0 et en allant vers les tailles les plus hautes, correspond au dinucléosome. Il a été découvert par les présents inventeurs que l’intégration de cette valeur dans la fonction mathématique mise en oeuvre, améliore la performance de prédiction du procédé selon l’invention.
Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l’invention, le procédé comprend la détermination de la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, et le calcul de la somme de chacune desdites concentrations à la puissance 0,1 , ladite somme étant dite Sommei6o-22o. La fonction mathématique mise en oeuvre comprend alors de préférence, en tant que variable, ladite Sommei6o-22o. Ce paramètre Sommei6o-22o peut être défini par l’équation suivante :
Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l’invention, la fonction mathématique comprend, en tant que variables :
- au moins un rapport entre une concentration d’ADNcf de grande taille et la concentration d’ADNcf totale, dite concentration relative en ADNcf de grande taille, par exemple la concentration relative en ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 paires de bases, notamment comprise entre 1650 et 4000 paires de bases, et/ou la concentration relative en ADNcf de taille comprise entre 580 à 1649 paires de bases,
- et au moins Position pic2 et/ou Sommei6o-22o.
A titre d’exemple, la fonction mathématique peut être exprimée par l’équation (1 a) ou par l’équation (1 b) :
Score = 1 / (1 + Exp(-(a1 + b1 x P1 + c1 x Sommei6o-22o + d1 x Position pic2))) Equation (1 a)
Score = 1 - 1 / (1 + Exp(-(a1 + b1 x P1 + c1 x Sommei6o-22o + d1 x Position pic2))) Equation (1 b) dans lesquelles :
- a1 , b1 , c1 et d1 sont des coefficients constants,
- la variable P1 est la concentration relative en ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 paires de bases dans l’échantillon de sang,
- la variable Sommei6o-22o est telle que défini ci-avant, et exprimée en pg/pl à la puissance 0,1 ,
- la variable Position pic2 est telle que défini ci-avant, et exprimée en paires de bases.
Les coefficients a1 , b1 , c1 et d1 sont de préférence tels que :
- -40,0 < a1 < -30,0, de préférence -38,0 < a1 < -37,0, par exemple -37,2 < a1 < -37,1 ,
- et/ou 30,0 < b1 < 40,0, de préférence 32,0 < b1 < 33,0, par exemple 32,0 < b1 < 32,1 ,
- et/ou -1 ,0 < c1 < 0,0, de préférence -0,1 < c1 < 0,0,
- et/ou 0,0 < d1 < 1 ,0, de préférence 0,0 < d1 < 0,2, par exemple 0,1 < d1 < 0,2. Dans de tels modes de mise en oeuvre, notamment particulièrement adaptés aux patients atteints de cancer du poumon, la première valeur de référence et la deuxième valeur de référence sont identiques, et égales à 0,5.
Pour ce qui concerne l’équation (1 a), il est conclu selon l’invention que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est inférieur ou égal à cette valeur de référence, et que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette valeur de référence. Les étapes c/ et d/ du procédé selon l’invention consistent ainsi en les étapes d / et d1 /, et c2/ et d2/ décrites ci-avant. Pour ce qui concerne l’équation (1 b), il est conclu selon l’invention que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est inférieur ou égal à cette valeur de référence, et que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette valeur de référence. Les étapes c/ et d/ du procédé selon l’invention consistent ainsi en les étapes c3/ et d3/, et c4/ et d4/ décrites ci-avant.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, le procédé comprend la détermination du nombre de neutrophiles et du nombre de lymphocytes dans ledit échantillon de sang. La fonction mathématique comprend alors de préférence, en tant que variable, le rapport entre ledit nombre de neutrophiles et ledit nombre de lymphocytes.
Le nombre de neutrophiles et le nombre de lymphocytes dans l’échantillon de sang peuvent être déterminés par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple par numération sanguine.
Il a été découvert par les présents inventeurs que l’intégration de ce marqueur clinique dans la fonction mathématique selon l’invention peut améliorer la performance de la prédiction.
Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l’invention, la fonction mathématique comprend, en tant que variables :
- au moins un rapport entre une concentration d’ADNcf de grande taille et la concentration d’ADNcf totale, dite concentration relative en ADNcf de grande taille, par exemple la concentration relative en ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 paires de bases, notamment comprise entre 1650 et 4000 paires de bases, et/ou la concentration relative en ADNcf de taille comprise entre 580 à 1649 paires de bases,
- au moins Position pic2 et/ou Sommei6o-22o.
- et au moins le rapport entre le nombre de neutrophiles et le nombre de lymphocytes dans l’échantillon de sang, ce rapport étant nommé Rn/L
La fonction mathématique peut alors notamment être exprimée par l’équation (2a) ou par l’équation (2b) :
Score = 1 / (1 + Exp(-(a2 + b2 x P1 + c2 x Sommei6o-22o + d2 x Position pic2 + e2 x Rn/I)))
Equation (2a) Score = 1 - 1 1 (1 + Exp(-(a2 + b2 x P1 + c2 x Sommei6o-22o + d2 x Position pic2 + e2 x
Rn/I))) Equation (2b) dans lesquelles :
- a2, b2, c2, d2 et e2 sont des coefficients constants,
- la variable P1 est la concentration relative en ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 paires de bases dans l’échantillon de sang,
- la variable Sommei6o-22o est telle que défini ci-avant, et exprimée en pg/pl à la puissance 0,1 ,
- la variable Position pic2 est telle que défini ci-avant, et exprimée en paires de bases,
- Rn/I le rapport entre le nombre de neutrophiles et le nombre de lymphocytes dans l’échantillon de sang.
A titre de premier exemple, particulièrement adapté aux patients atteints de carcinome à cellules squameuses de la tête et du cou (HNSCC), les coefficients a2, b2, c2, d2 et e2 dans les équations (2a) et (2b) sont de préférence tels que :
- 2,0 < a2 < 3,0, de préférence 2,2 < a2 < 2,3,
- et/ou 10,0 < b2 < 20,0, de préférence 19,0 < b2 < 20,0, par exemple 19,4 < b2 < 19,5,
- et/ou -1 ,0 < c2 < 0,0, de préférence -0,1 < c2 < 0,0,
- et/ou 0,0 < d2 < 1 ,0, de préférence 0,0 < d2 < 0,1 , par exemple 0,04 < d2 < 0,05,
- et/ou -3,0 < e2 < -2,0, de préférence -2,5 < e2 < -2,0, par exemple -2,3 < e2 < -2,2.
A titre de deuxième exemple, particulièrement adapté aux patients atteints de cancer du poumon, les coefficients a2, b2, c2, d2 et e2 dans les équations (2a) et (2b) sont de préférence tels que :
- 30,0 < a2 < -20,0, de préférence -28,0 < a2 < -27,0, par exemple -27,4 < a2 < -27,3,
- et/ou -7,0 < b2 < -6,0, de préférence -6,4 < b2 < -6,2, par exemple -6,4 < b2 < - 6,3,
- et/ou -1 ,0 < c2 < 0,0, de préférence -0,2 < c2 < 0,0, par exemple -0,2 < c2 < -01 ,
- et/ou 0,0 < d2 < 1 ,0, de préférence 0,0 < d2 < 0,2, par exemple 0,1 < d2 < 0,2, - et/ou -1 ,0 < e2 < 0,0, de préférence -0,1 < e2 < 0,0.
A titre de troisième exemple, particulièrement adapté aux patients atteints de tous types de cancers hors mélanomes, les coefficients a2, b2, c2, d2 et e2 dans les équations (2a) et (2b) sont de préférence tels que :
- -20,0 < a2 < -10,0, de préférence -17,0 < a2 < -16,0, par exemple -16,2 < a2 < -16,1 ,
- et/ou 20,0 < b2 < 30,0, de préférence 27,0 < b2 < 28,0, par exemple 27,2 < b2 < 27,3,
- et/ou -1 ,0 < c2 < 0,0, de préférence -0,1 < c2 < 0,0,
- et/ou 0,0 < d2 < 1 ,0, de préférence 0,0 < d2 < 0,2, par exemple 0,0 < d2 < 0,1 ,
- et/ou -1 ,0 < e2 < 0,0, de préférence -0,2 < e2 < 0,0, par exemple -0,2 < e2 < -0,1.
Dans de tels modes de mise en oeuvre, la première valeur de référence et la deuxième valeur de référence sont identiques, et égales à 0,5. Pour ce qui concerne l’équation (2a), il est conclu selon l’invention que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est inférieur ou égal à cette valeur de référence, et que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette valeur de référence. Les étapes c/ et d/ du procédé selon l’invention consistent ainsi en les étapes d / et d1/, et c2/ et d2/ décrites ci-avant.
Pour ce qui concerne l’équation (2b), il est conclu selon l’invention que le sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est inférieur ou égal à cette valeur de référence, et que le sujet présente un caractère de progresseur précoce lors du traitement d’immunothérapie lorsque le score est supérieur à cette valeur de référence. Les étapes c/ et d/ du procédé selon l’invention consistent ainsi en les étapes c3/ et d3/, et c4/ et d4/ décrites ci-avant.
Le score obtenu par le procédé selon l’invention, qui est le résultat de la fonction mathématique, constitue avantageusement un indicateur générique du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non-progresseur précoce d’un sujet étudié, indépendant tant du type de cancer dont le sujet est atteint, que du type de traitement d’immunothérapie qui pourrait lui être administré.
En particulier, le procédé selon l’invention permet avantageusement de prédire le caractère de progresseur précoce et/ou le caractère de non-progresseur précoce d’un sujet atteint de tout type de cancer, et notamment, mais non limitativement, d’une pathologie tumorale métastatique, d’un mélanome, d’un cancer du rein, en particulier à cellules claires, d’un carcinome urothélial de la vessie, d’un carcinome épidermoïde de la tête et du cou, ou encore d’un cancer bronchique à petites cellules ou non (ou cancer du poumon), ou d’une pluralité de tels cancers.
Le traitement d’immunothérapie pour lequel on vise à connaître le caractère de progresseur précoce et/ou le caractère de non-progresseur précoce du sujet peut quant à lui être de tout type. Il peut notamment mettre en oeuvre le nivolumab, lïpilimumab, le pembrolizumab et/ou un ou plusieurs anticorps anti- PD-L1 tels que l’atézolizumab, l’avélumab et/ou le durvalumab.
La prédiction par le procédé selon l’invention est en outre également performante pour ce qui concerne les configurations dans lesquelles le traitement d’immunothérapie est réalisé conjointement à d’autres méthodes de traitement thérapeutique, telles qu’un traitement de chimiothérapie et/ou une thérapie ciblée lorsqu’elle est possible.
L’obtention de l’échantillon de sang du sujet, à partir duquel est appliqué le procédé selon l’invention, peut avoir été réalisée de toute manière classique en elle-même. Elle peut par exemple avoir été réalisée par prélèvement d’un échantillon sanguin du sujet dans des tubes contenant un tampon à base d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou dans des tubes spécifiques pour l’obtention d’ADN circulant, tels que les tubes commercialisés par Streck sous la dénomination Cell-Free DNA BCT® (Streck) ou par Roche Diagnostic sous la dénomination « Cell-free DNA collection tube », selon les recommandations du fournisseur.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l’invention, la détermination de ladite concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille, et le cas échéant l’établissement de la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant et/ou la détermination de la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, sont réalisées par analyse directe de l’échantillon de sang isolé du sujet, c’est-à-dire un échantillon de sang total. Dans des modes de réalisation préférentiels de l’invention, le procédé comprend une étape préalable d’obtention d’un échantillon de plasma à partir de cet échantillon de sang total.
L’étape d’obtention sélective de l’échantillon de plasma à partir de l’échantillon de sang total isolé du patient par prélèvement sanguin est préférentiellement réalisée dans les quelques jours suivant la prise de sang, par exemple dans les 6 heures après la prise de sang si l’on utilise des tubes à tampon EDTA, et dans les 7 jours après la prise de sang si l’on utilise des tubes spécifiques pour l’obtention d’ADN libre circulant, tels que les tubes mentionnés ci-avant.
Cette étape peut être réalisée de toute manière classique en elle-même, par exemple par centrifugation.
Afin de limiter la libération d’ADN cellulaire contenu dans les cellules circulantes présentes dans l’échantillon de sang total, ce qui provoquerait la dilution de l’ADN libre circulant, un protocole incluant deux centrifugations est de préférence privilégié selon l’invention. Préférentiellement, l’étape d’obtention de l’échantillon de plasma, à partir d’un échantillon de sang complet obtenu du patient, du procédé selon l’invention comprend ainsi :
- une première centrifugation douce, par exemple à une vitesse comprise entre 1200 et 1600 g, de préférence à température ambiante, c’est-à-dire à 20°C +/- 5°C ;
- la récupération du plasma (surnageant), sans prélever la galette de cellules séparant le plasma et les hématies ;
- une deuxième centrifugation à vitesse plus rapide, par exemple comprise entre 3000 et 16000 g, de préférence également à température ambiante ;
- et la récupération du plasma (surnageant), par exemple par aspiration, sans prélever le culot formé.
Quels que soient les tubes précités, l’échantillon de plasma ainsi obtenu peut typiquement être conservé à -20°C pour une durée inférieure ou égale à 1 mois, ou à -80°C pour des durées supérieures à 1 mois, avant son analyse pour la détermination des différentes concentrations en ADNcf nécessaires à la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
La détermination de la concentration d’ADNcf totale et la détermination de la ou des concentration(s) d’ADNcf de grande taille dans l’échantillon de sang, et le cas échéant l’établissement de la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant et/ou la détermination de la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, peuvent être réalisées par toute méthode classique en elle-même pour l’homme du métier. En fonction de la technique particulière mise en œuvre, elles peuvent être réalisées directement sur l’échantillon de sang total ou sur l’échantillon de plasma obtenu à partir de cet échantillon de sang, ou après une étape d’extraction de l’ADNcf de l’un ou l’autre de ces échantillons.
Ainsi, dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, particulièrement avantageux sur le plan de la rapidité et simplicité de mise en œuvre du procédé selon l’invention, la détermination de ladite concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille, et le cas échéant l’établissement de la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant et/ou la détermination de la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, sont réalisées par analyse directe de l’échantillon de plasma obtenu à partir de l’échantillon de sang total isolé du sujet, c’est-à-dire qu’elle sont réalisées directement sur cet échantillon lui-même, sans étape d’extraction de l’ADN préalable.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers alternatifs de l’invention, le procédé comprend une étape d’extraction de l’acide désoxyribonucléique libre circulant de l’échantillon de sang, ou le cas échéant de l’échantillon de plasma obtenu à partir de cet échantillon de sang, de sorte à obtenir un extrait contenant l’acide désoxyribonucléique libre circulant qui y était contenu. La détermination de la concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille, et le cas échéant l’établissement de la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant et/ou la détermination de la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, sont alors réalisées par analyse de l’extrait d’acide désoxyribonucléique libre circulant ainsi obtenu.
L’étape d’extraction de l’ADNcf de l’échantillon de sang, le cas échéant de l’échantillon de plasma, peut être réalisée de toute manière classique en elle- même, par exemple par une technologie mettant en oeuvre des billes magnétiques, ou encore au moyen d’un kit commercialisé à cet effet, par les sociétés IDSolutions (Kit IDXtract), Promega (Kit Maxwell® RSC ccfDNA plasma) ou Qiagen (Kit QIAamp Circulating Nucleic Acid) par exemple.
L’analyse de l’échantillon de sang, de l’échantillon de plasma, ou de l’extrait d’ADNcf obtenu selon l’invention, pour déterminer la concentration d’ADNcf totale et une ou plusieurs concentration(s) d’ADNcf de grande taille (chacune associée à une plage de taille analytique différente), et le cas échéant la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant et/ou la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier à cet effet.
Elle peut par exemple être réalisée par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), par électrophorèse en gel, ou par la technologie d’électrophorèse capillaire, au moyen d’un dispositif disponible commercialement, tel que le Fragment Analyseur et système 7100 CE d’Agilent Technologies, le QIAxcel proposé par la société Qiagen, ou encore du système GenomeLab de la société Sciex. Ces techniques nécessitent une extraction préalable de l’ADN libre circulant de l’échantillon de sang ou de l’échantillon de plasma.
Préférentiellement, la détermination des différentes concentrations d’ADNcf est réalisée par une technique basée sur la technologie dite pLas, telle que décrite notamment dans les documents WO 2016/016470, WO 2014/020271 , ou la publication de Ranchon et al., Lab Chip, 2016, 16(7): 1243-53. Schématiquement, la technologie pLas opère en deux étapes respectivement de concentration et de séparation réalisées en ligne. D'abord, l'ADN est concentré via un système de capillaires formé de la jonction d'un petit capillaire et d'un autre capillaire de plus grande section. La solution contenant l'ADN est amenée à s’écouler de façon laminaire dans le grand capillaire, et un champ électrique est utilisé pour ralentir la migration. À cause du cisaillement apporté par l’écoulement laminaire, cette contre-électrophorèse fait apparaître une force transverse, dépendante de la taille de l’ADN, qui pousse l’ADN vers les parois. Le changement de vitesse d'écoulement et de champ électrique au niveau de la constriction permet d'arrêter l'ADN et de le concentrer comme un anneau. En effet, en amont de la constriction, l’écoulement et la contre-électrophorèse sont lents, provoquant une faible force transverse. L’ADN se trouve donc dans la masse de l’écoulement, et avance vers la constriction. En revanche, en aval de la constriction, l’écoulement et la contre-électrophorèse sont rapides, plaquant fortement l’ADN à la paroi où l’écoulement laminaire est très faible, et où la contre- électrophorèse domine. L’ADN recule alors vers la constriction, par contre-électrophorèse, le long de la paroi. Cet anneau est ensuite libéré par la baisse progressive du champ électrique, ce qui permet également d'effectuer l'opération de séparation en fonction de la taille des fragments.
L’analyse de l’échantillon de sang, de l’échantillon de plasma, ou de l’extrait d’ADNcf obtenu selon l’invention, pour déterminer la concentration d’ADNcf totale et une ou plusieurs concentration(s) d’ADNcf de grande taille (chacune associée à une plage de taille analytique différente), et le cas échéant la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant et/ou la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, peut en particulier être réalisée par la méthode, basée sur la technologie pLas ci-dessus, telle que décrite dans le document FR 3128231 ou encore la publication de Boutonnet et al., Analytical Chemistry, 2023, 95(24): 9263-70. Cette méthode présente l’avantage de pouvoir être mise en oeuvre directement sur un échantillon de plasma, sans extraction au préalable de l’ADN circulant qui y est contenu, et elle permet avantageusement de déterminer facilement et de façon économique la caractérisation du profil de taille de l’ADNcf avec une sensibilité accrue par rapport aux autres techniques d’analyse. Cette méthode peut notamment être mise en oeuvre au moyen du dispositif décrit dans les documents WO 2017/009566 et Andriamanampisoa et al., Analytical Chemistry, 2018, 90(6): 3766-74, et commercialisé sous la dénomination Biabooster par Adelis Technologies.
En substance, cette méthode comporte au moins une itération d’une alternance :
- d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon à analyser dans un capillaire dans un premier sens d’écoulement, le capillaire étant muni d’au moins une restriction locale de sa section et comportant un tampon d’analyse, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire,
- d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement, et, après la dernière itération de l’alternance, une étape de séparation par écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une différence de potentiel électrique inférieure ou égale à la première différence de potentiel, dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque une retenue partielle de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire.
Cette méthode comprend en outre, pendant ou après l’étape de séparation, une étape de mesure d’un profil temporel de fluorescence des molécules fluorescentes d’acides nucléiques et une étape de conversion du profil temporel de fluorescence en un profil de concentration en molécules d’acides nucléiques de différentes longueurs, par la mise en oeuvre d’un profil de fluorescence d’un échantillon étalon, dont on connaît la concentration pour chaque longueur de molécule fluorescente d’acides nucléiques présente dans l’échantillon. Les molécules d’acides nucléiques ont été rendues fluorescentes par une des techniques connues de l’homme du métier, par exemple par ajout dans le tampon d’analyse d’un fluorophore intercalant, c’est-à-dire d’une molécule qui fluoresce peu à l’état libre, et qui fluoresce beaucoup quand elle est intercalée entre les bases de l’ADN.
L’incertitude technique garantie d’une telle méthode, basée sur technologie pLas, est avantageusement de 5 à 10%. La répétabilité en taille est meilleure que 1 %. En particulier, cette méthode permet avantageusement de déterminer la concentration d’ADNcf totale et la ou les concentration(s) d’ADNcf de grande taille dans l’échantillon de plasma avec un très bon degré d’approximation.
Il a en outre été découvert par les présents inventeurs que le score obtenu dans le cadre du procédé de prédiction selon l’invention constitue également un bon indicateur statistique du pronostic de survie globale sans progression du sujet atteint de cancer traité par immunothérapie, ainsi que de sa survie à 3 ans.
Il a été en outre été observé par les présents inventeurs que le paramètre qu’est Position pic2, tel que défini ci-avant, permet à lui seul de prédire avec une bonne performance le caractère de progresseur précoce et/ou le caractère de non- progresseur précoce lors d’un traitement d’immunothérapie d’un sujet atteint d’un cancer, et en particulier d’un cancer du poumon.
Ainsi, un autre aspect de l’invention concerne un procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non-progresseur précoce lors d’un traitement d’immunothérapie d’un sujet atteint d’un cancer, en particulier un cancer du poumon, ce procédé comprenant des étapes de : 1/ établissement d’une courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans un échantillon de sang isolé obtenu à partir dudit sujet avant ledit traitement d’immunothérapie,
2/ détermination de la taille, exprimée en paires de bases, correspondant au deuxième pic sur ladite courbe, cette taille étant désignée dans la présente par l’expression « Position pic2 », et
3a/ comparaison de ladite taille « Position pic2 >> à une première valeur de référence prédéterminée, et 4a/ conclusion que ledit sujet présente un caractère de progresseur précoce lors dudit traitement d’immunothérapie lorsque ledit score est inférieur ou égal à ladite première valeur de référence, et/ou
3b/ comparaison de ladite taille « Position pic2 >> à une deuxième valeur de référence prédéterminée, et 4b/ conclusion que ledit sujet présente un caractère de non-progresseur précoce lors dudit traitement d’immunothérapie lorsque ledit score est supérieur à ladite deuxième valeur de référence.
Ce procédé peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci- avant dans la présente description, ne portant pas sur une ou des variables de la fonction mathématique à l’exception de la variable Position pic2.
Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en oeuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention, avec l’appui des figures 1 à 16, dans lesquelles :
La figure 1 montre une courbe représentant le profil d’intensité de fluorescence en fonction du temps, obtenu par analyse, par une méthode basée sur la technologie pLas, d’un échantillon de plasma d’un patient atteint de cancer contenant de l’ADNcf.
La figure 2 montre une courbe représentant le profil d’intensité de fluorescence en fonction du temps, obtenu par analyse, par une méthode basée sur la technologie pLas, d’un échantillon étalon contenant des fragments d’ADN de taille et concentration connues.
La figure 3 montre une courbe représentant le profil de concentration d’ADN libre circulant, exprimé en picogrammes par pl par paire de bases (pb), en fonction de la taille, obtenu à partir de la courbe de la figure 1 .
La figure 4 montre un histogramme représentant la répartition de la concentration d’ADN libre circulant pour différentes plages de taille, obtenu à partir de la courbe de la figure 3.
La figure 5 représente des courbes ROC relatives à la prédiction du caractère de progresseur précoce d’un patient atteint de cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, obtenues pour un indicateur selon l'invention, la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans un échantillon de plasma dudit patient, en a/ pour un lot d’apprentissage, en b/ pour un lot de test, et en c/ pour la cohorte totale ; pour chaque courbe, l’aire sous la courbe (« AUC ») est indiquée sur la figure.
La figure 6 représente des courbes ROC relatives à la prédiction du caractère de progresseur précoce d’un patient atteint de cancer lors d’un traitement d’immunothérapie, obtenues pour un indicateur selon l'invention, la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille entre 580 et 1649 pb dans un échantillon de plasma dudit patient, en a/ pour un lot d’apprentissage, en b/ pour un lot de test, et en c/ pour la cohorte totale ; pour chaque courbe, l’aire sous la courbe (« AUC ») est indiquée sur la figure.
La figure 7 représente les boites à moustaches obtenues pour une cohorte de 51 patients pour deux indicateurs selon l'invention, en a/ la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans un échantillon de plasma dudit patient, en b/ la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille entre 580 et 1649 pb dans cet échantillon de plasma.
La figure 8 montre un graphe représentant, en fonction du temps, la courbe de survie sans progression de patients atteints de cancer et ayant été soumis à un traitement d’immunothérapie, déterminée par la méthode de Kaplan-Meier, selon qu’ils aient un score supérieur (courbe claire) ou inférieur (courbe foncée) à la valeur seuil de 0,034, ce score étant prédit par un procédé selon l’invention prenant en compte la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans les échantillons de plasma des patients ; le nombre de patients (« individus à risque ») de la cohorte initiale inclus dans l’étude à chaque temps d’évaluation, respectivement à score inférieur à 0,034 (ligne du haut) et score supérieur à 0,034 (ligne du bas) est indiqué dans le tableau sous le graphe.
La figure 9 représente, en a/ les boites à moustaches obtenues pour une cohorte de 68 patients atteints de cancer du poumon (54 patients ayant le statut de non- progresseur précoce NEP et 14 patients ayant le statut de progresseur précoce EP), pour un indicateur selon l'invention (concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans un échantillon de plasma dudit patient), et en b/ une courbe ROC relative à la prédiction du caractère de progresseur précoce d’un patient atteint de cancer du poumon lors d’un traitement d’immunothérapie, obtenue pour le même indicateur.
La figure 10 montre un graphe représentant la valeur prédictive négative (NPV) en fonction de la spécificité pour une cohorte de 68 patients atteints de cancer du poumon et l’indicateur selon l'invention « concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans un échantillon de plasma dudit patient ».
La figure 1 1 montre des graphes représentant, en fonction du temps, la courbe de survie sans progression de patients atteints de cancer (en a/, tous cancers, en b/, cancer du poumon) et ayant été soumis à un traitement d’immunothérapie, déterminée par la méthode de Kaplan-Meier, selon qu’ils aient un score supérieur (courbe foncée) ou inférieur (courbe claire) à la valeur seuil (en a/ 0,039, en b/ 0,037), ce score étant prédit par un procédé selon l’invention prenant en compte la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb dans les échantillons de plasma des patients ; les nombres de patients (« individus à risque ») de la cohorte initiale inclus dans l’étude à chaque temps d’évaluation, respectivement à score inférieur à la valeur seuil (ligne du haut) et score inférieur à la valeur seuil (ligne du bas) sont indiqués dans les tableaux sous les graphes.
La figure 12 montre des graphes représentant, en fonction du temps, la courbe de survie sans progression de patients atteints de cancer (en a/, tous cancers, en b/, cancer du poumon) et ayant été soumis à un traitement d’immunothérapie, déterminée par la méthode de Kaplan-Meier, selon qu’ils aient un score supérieur (courbe foncée) ou inférieur (courbe claire) à la valeur seuil (en a/ 307,2, en b/ 304,8), ce score étant prédit par un procédé selon l’invention prenant en compte la position du pic 2 sur la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’ADNcf dans les échantillons de plasma des patients ; les nombres de patients (« individus à risque ») de la cohorte initiale inclus dans l’étude à chaque temps d’évaluation, respectivement à score inférieur à la valeur seuil (ligne du haut) et score inférieur à la valeur seuil (ligne du bas) sont indiqués dans les tableaux sous les graphes.
La figure 13 montre un graphe représentant, en fonction du temps, la courbe de survie sans progression de patients atteints de cancer et ayant été soumis à un traitement d’immunothérapie, déterminée par la méthode de Kaplan-Meier, selon qu’ils aient un score supérieur (courbe foncée) ou inférieur (courbe claire) à la valeur seuil (0,086), ce score étant prédit par un procédé selon l’invention prenant en compte la concentration relative en fragments d’ADNcf de taille comprise entre 580 et 1649 pb dans les échantillons de plasma des patients ; le nombre de patients (« individus à risque ») de la cohorte initiale inclus dans l’étude à chaque temps d’évaluation, respectivement à score inférieur à la valeur seuil (ligne du haut) et score inférieur à la valeur seuil (ligne du bas) est indiqué dans le tableau sous le graphe. La figure 14 montre un graphe représentant, en fonction du temps, la courbe de survie sans progression de patients atteints de cancer du poumon et ayant été soumis à un traitement d’immunothérapie, déterminée par la méthode de Kaplan-Meier, selon qu’ils aient un score supérieur (courbe foncée) ou inférieur (courbe claire) à la valeur seuil (0,5), ce score étant prédit par un procédé selon l’invention prenant en compte plusieurs paramètres de taille d’ADNcf dans les échantillons de plasma des patients ; le nombre de patients (« individus à risque ») de la cohorte initiale inclus dans l’étude à chaque temps d’évaluation, respectivement à score inférieur à la valeur seuil (ligne du haut) et score inférieur à la valeur seuil (ligne du bas) est indiqué dans le tableau sous le graphe.
La figure 15 montre un graphe représentant, en fonction du temps, la courbe de survie sans progression de patients atteints de cancer du poumon et ayant été soumis à un traitement d’immunothérapie, déterminée par la méthode de Kaplan-Meier, selon qu’ils aient un score supérieur (courbe foncée) ou inférieur (courbe claire) à la valeur seuil (0,5), ce score étant prédit par un procédé selon l’invention prenant en compte plusieurs paramètres de taille d’ADNcf dans les échantillons de plasma des patients et un marqueur clinique ; le nombre de patients (« individus à risque ») de la cohorte initiale inclus dans l’étude à chaque temps d’évaluation, respectivement à score inférieur à la valeur seuil (ligne du haut) et score inférieur à la valeur seuil (ligne du bas) est indiqué dans le tableau sous le graphe.
La figure 16 montre un graphe représentant, en fonction du temps, la courbe de survie sans progression de patients atteints de cancer HNSCC et ayant été soumis à un traitement d’immunothérapie, déterminée par la méthode de Kaplan-Meier, selon qu’ils aient un score supérieur (courbe foncée) ou inférieur (courbe claire) à la valeur seuil (0,5), ce score étant prédit par un procédé selon l’invention prenant en compte plusieurs paramètres de taille d’ADNcf dans les échantillons de plasma des patients et un marqueur clinique ; le nombre de patients (« individus à risque ») de la cohorte initiale inclus dans l’étude à chaque temps d’évaluation, respectivement à score inférieur à la valeur seuil (ligne du haut) et score inférieur à la valeur seuil (ligne du bas) est indiqué dans le tableau sous le graphe. A/ Etude 1
Cette étude est basée sur une cohorte de 51 patients présentant 5 types de pathologies cancéreuses : mélanome (20%), ORL (carcinome à cellules squameuses de la tête et du cou) (20%), poumon (non à petites cellules) (21 %), rein (18%), vessie (21%).
La réponse au traitement d’immunothérapie des patients se réfère à la réponse aux traitements utilisés qui sont : le nivolumab, lïpilimumab et/ou le pembrolizumab, ces traitements pouvant être combinés à une thérapie ciblée, l’administration d’anticorps anti-PD-L1 ou à un traitement de chimiothérapie. Les caractéristiques des patients de la cohorte au début de l’étude sont résumées dans le tableau 1 .
Tableau 1 - Caractéristiques des patients de la cohorte
L’évaluation de la progression ou non des patients au cours du traitement d’immunothérapie est réalisée par analyse des images de la tumeur acquises par scanner en appliquant la méthodologie standard iRECIST (« iRECIST: guidelines for response criteria for use in trials testing immunotherapeutics », Seymour et al., LANCET Oncology, vol 18, issue 3, e143-e152, 2017), 6 à 12 semaines après le début du traitement, en fonction du type de cancer (6 semaines pour le cancer du poumon, 12 semaines pour les autres cancers). Les données cliniques suivies sont : taux de lactate déshydrogénase (LDH) sérique, niveau de métastases, âge, sexe, fumeur ou non-fumeur, score de proportion tumorale (TPS).
A.1/ Préparation des échantillons de plasma
Les échantillons utilisés selon l’invention sont préparés à partir de sang complet prélevé de l’individu. A cet effet, le sang total est collecté sur des tubes Cell-Free DNA Collection Tube selon les recommandations du fournisseur Roche Diagnostics.
Chaque échantillon ainsi collecté est soumis à deux centrifugations successives :
- une 1 ère centrifugation douce à 1600 g, à température ambiante (20°C +/- 5°C), pendant 10 min, cette 1 ère centrifugation étant réalisée dans une période de 7 jours maximum après le prélèvement ; le plasma (surnageant) est récupéré sans prélever la galette de cellules,
- et une 2ème centrifugation à vitesse plus rapide, à 4500 g, également à température ambiante (20°C +/- 5°C) et pendant 10 minutes ; le plasma est aspiré sans prélever le culot formé. Le plasma ainsi récupéré peut être utilisé immédiatement, ou il peut être conservé à -20°C pour une durée inférieure ou égale à 1 mois, ou -80°C pour des durées supérieures à 1 mois, avant son analyse.
A.2/ Analyse des échantillons de plasma pour les concentrations en ADN libre circulant dans différentes plages de taille
La concentration totale en ADN libre circulant dans les échantillons de plasma, et les profils de concentration en fonction de la taille, sont déterminés par une méthode basée sur la technologie microfluidique pLas. Plus particulièrement, le protocole mis en oeuvre est tel que décrit dans la publication de Boutonnet et al., Analytical Chemistry, 2023, 95(24): 9263-70.
Le matériel utilisé est le suivant :
- système d’électrophorèse Agilent G7100A CE équipé d’un capillaire intégrant la technologie pLAS, dont le diamètre est muni d’une restriction locale,
- détecteur de fluorescence Picometrics, Zetalif® LED 480.
Le protocole mis en oeuvre est schématiquement le suivant.
Les échantillons de plasma sont tout d’abord soumis à un prétraitement par protéinase K en présence de détergent, de sorte à libérer les acides nucléiques des vésicules et des complexes nucléoprotéiques dans lesquels ils sont le plus souvent emprisonnés. A cet effet, ils sont mis en présence d’une solution aqueuse de protéinase K (2 mg/ml) et de tensioactif non-ionique NP-40 (1 %) à 56°C pendant 2 h sous agitation vigoureuse (900 tr/min), puis récupérés par centrifugation.
Chaque échantillon de plasma est injecté dans le système d’électrophorèse, dont la température est maintenue à 25 °C. Les différents ingrédients et solutions mis en oeuvre pour l’analyse sont les suivantes :
- RNASE : RNase Away (Biolab),
- Eau BSA : solution de BSA à 50 mg/ml dans l’eau purifiée,
- HCl 0,1 M : solution d’acide chlorhydrique à 0,1 M dans l’eau,
- PVA 2% : solution d’alcool polyvinylique dans l’eau (800 mg dans 40 ml d’eau),
- Tampon TAE : Tris-Acétate-EDTA (TAE) 0,5X + albumine de sérum bovine (BSA) 0,5 mg/mL, pH 8, polyvinylpyrrolidone (PVP) 360kDa 5% (p/v), eau,
- Tampon TAE + dye : Tampon TAE + SybrGreen 2X (Sigma),
- Tampon PIPES : Bis-tris 30 mM, acide pipérazine-N,N'-bis(2-éthanesulfonique) (Pipes) 10 mM, pH 6,5, EDTA 1 mM, PVP 360KDa 5% (p/v), eau,
- Tampon PIPES + dye : Tampon PIPES + SYBR Green 2X.
Le programme exact mis en oeuvre dans le système d’électrophorèse est détaillé dans les tableaux 2 à 4. Tableau 2 - programme du système d’électrophorèse - pré-conditionnement, injection et transfert
Tableau 3 - programme du système d’électrophorèse - Concentration avec retours
Tableau 4 - programme du système d’électrophorèse - changement de tampon et fin de concentration, séparation A Tissue de l’analyse, on obtient, pour chaque échantillon de plasma analysé, un profil d’intensité de fluorescence en fonction du temps. Un exemple de tel profil est montré sur la figure 1 .
Le profil de fluorescence est ensuite converti en profil de concentration grâce au profil d’intensité de fluorescence d’un échantillon étalon comprenant des fragments d’ADN dont les tailles respectives, allant de 100 paires de bases (« pb ») à 1500 paires de bases, sont connues et dont on connaît, pour chaque taille de fragment d’ADN, le temps de migration, l’intensité de fluorescence et la concentration (permettant de connaître le facteur de conversion de fluorescence en concentration pour chaque temps de migration des pics de l’échantillon étalon).
Cet échantillon étalon présente la composition indiquée dans le tableau 5 :
Tableau 5 - composition de l’échantillon étalon (Conc. désigne la concentration) Le profil de migration de cet échantillon étalon dans le dispositif utilisé est montré sur la figure 2.
Ces données sont utilisées pour réaliser, d’une part, un étalonnage de la fluorescence, et, d’autre part, un étalonnage des temps de migration.
Pour l’étalonnage de la fluorescence, l’aire de chaque pic de l’échantillon étalon est mesurée (en RFU.min), puis divisée par la concentration du fragment correspondant. Pour obtenir un facteur de conversion instantané, le résultat est divisé par l’unité de temps (1 min), et on obtient donc, pour chacun des pics de la figure 2, une valeur de fluorescence par pg.pL pour chaque temps de migration de l’échantillon étalon. Des points virtuels peuvent être ajoutés en dehors de la courbe exprimant le facteur de conversion (RFU/pg/pL.min) en fonction du temps de migration ainsi obtenue, pour les courts et les longs temps de migration. Une interpolation linéaire est réalisée entre les points de cette courbe, de manière classique en elle-même, pour déterminer le facteur de conversion de fluorescence en concentration pour tous les temps de migration situés entre le premier et le dernier pic de l’échantillon étalon. Une légère extrapolation linéaire est faite de part et d’autre pour élargir légèrement la gamme de temps de migration dans laquelle le facteur de conversion est connu. Ici, l’extrapolation est faite entre 75 et 100 pb et entre 1500 et 1650 pb. On obtient alors une courbe composée de morceaux de droites, qui est lissée à l’aide de splines de degré 2, de manière classique en elle-même. Cette courbe lissée est utilisée pour convertir la valeur de fluorescence en valeur de concentration tout au long de l’analyse. Ainsi, la courbe de fluorescence en fonction du temps de chaque échantillon donné est convertie en courbe de concentration en fonction du temps.
Pour l’étalonnage des temps de migration, les fragments de l’échantillon étalon donnent des couples « temps de migration / taille d’ADN ». Une interpolation linéaire est faite, de manière classique en elle-même, entre chaque point pour obtenir une conversion des temps de migration en taille d’ADN. Des points supplémentaires peuvent être ajoutés à la courbe représentant la taille de l’ADN en fonction du temps de migration ainsi obtenue, les temps de migration de ces points supplémentaires étant calculés par rapport aux fragments d’ADN expérimentaux les plus proches dans l’échantillon étalon, afin de gagner en précision sur l’étalonnage de la taille de l’ADN, sans avoir eu à augmenter le nombre de fragments d’ADN dans l’échantillon étalon. Après une nouvelle interpolation linéaire, on obtient une courbe représentant la taille de l’ADN en fonction du temps de migration.
A l’aide de ces deux étalonnages, celui de la fluorescence versus la concentration, et celui du temps de migration versus taille d’ADN, on convertit, pour chaque échantillon de plasma analysé, la courbe de fluorescence en fonction du temps en une courbe de concentration en fonction de la taille.
On obtient ainsi, pour chaque échantillon de plasma analysé, un profil d’intensité de concentration de l’ADNcf en fonction de la taille. Un exemple de tel profil est montré sur la figure 3.
Par cette méthode, les concentrations ne sont déterminées quantitativement qu’entre 75 et 1650 paires de bases. Ainsi, pour les fragments de taille inférieure à 75 paires de bases et les fragments de taille supérieure à 1650 paires de bases, une valeur relative de la concentration, en unités arbitraires, est calculée. Cette valeur relative est toutefois hautement représentative de la valeur réelle. Pour déterminer la concentration d’ADNcf dans chaque plage de taille souhaitée, les tailles minimale et maximale de l’intervalle sont converties en temps minimal et maximal selon l’étalonnage temps/taille, puis l’intégrale de la courbe temps/concentration est calculée entre ces temps minimal et maximal. Ceci donne la concentration absolue d’ADNcf dans chaque plage de taille souhaitée, exprimée en pg/pL.
Pour chaque échantillon de plasma analysé, à partir des concentrations individuelles de chaque taille, on construit ainsi un histogramme des pourcentages des différentes plages de taille suivantes : taille inférieure à 75 pb, de 75 à 239 pb, de 240 à 369 pb, de 370 à 579 pb, de 580 à 1649 pb, supérieure ou égale à 1650 pb. Un exemple de tel histogramme est montré sur la figure 4. Pour chaque échantillon de plasma analysé, on calcule en outre la concentration totale d’ADNcf. Dans cet exemple, cette concentration totale est approximée à la concentration d’ADN comprise entre les tailles 75 pb et 1650 pb, la valeur ainsi approximée étant très proche de la valeur réelle.
Enfin, pour chaque échantillon de plasma analysé, on calcule la concentration relative d’ADN dans chacune des plages de taille ci-dessus, cette concentration relative étant égale à la concentration absolue d’ADN dans cette plage de taille, déterminée comme indiqué ci-avant, divisée par la concentration totale d’ADN.
A.3/ Analyse statistique
Des tests statistiques préliminaires incluant une classification par régression logistique univariant, régression COX univariant et multivariant et une estimation Kaplan-Meier pour classifier les progresseurs précoces et non-progresseurs précoces sur un premier set de 25 patients ayant une répartition des pathologies équivalente à celle de l’ensemble de la cohorte des 51 patients ont tout d’abord été réalisés, pour les panels d’indicateurs potentiels suivants : concentrations relatives des fragments d’ADNcf dans le plasma, pour les plages de taille respectives suivantes : taille inférieure à 75 pb, de 75 à 239 pb, de 240 à 369 pb, de 370 à 579 pb, de 580 à 1649 pb, supérieure ou égale à 1650 pb.
Les deux indicateurs qui caractérisent la réponse du patient (progresseurs précoces ou non-progresseurs précoces sous traitement d’immunothérapie) sont les concentrations relatives de fragments d’ADNc dans le plasma pour les plages de taille suivantes : taille supérieure ou égale à 1650 paires de bases, et taille entre 580 et 1649 paires de bases.
Les fonctions mathématiques (indicateurs) utilisées pour l’analyse statistique, nommées P1 et P2, sont donc les suivantes : Concentration en fragments d'ADNcf de taille supérieure ou égale à 1650 pb Concentration totale en ADNcf
Concentration en fragments d'ADNcf de taille entre 580 et 1649 pb Concentration totale en ADNcf
La cohorte de 51 patients est divisée en deux lots de données : un lot d’apprentissage (70% - 35 patients) et un lot de test (30% - 16 patients). Cette répartition entre lot d’apprentissage et lot de test est classique et correspond à la méthodologie standard de ce type d’analyse statistique. Les deux lots (apprentissage et test) présentent une répartition équilibrée entre les patients en progression, pathologie et sexe.
Les données statistiques sont établies par rapport aux données cliniques obtenues par la méthodologie iRECIST 6 à 12 semaines après le début du traitement d’immunothérapie, selon le type de cancer.
Pour chaque indicateur, une courbe ROC est réalisée sur le lot d’apprentissage pour déterminer le seuil qui minimise la distance avec le point optimal (0,1 ). La méthode utilisée pour fixer la valeur seuil optimale est la méthode BOOTSTRAP. Pour 100 expériences les patients sont échantillonnés aléatoirement avec remise entre lot d’apprentissage (« in bag ») et lot de test (« out of bag »).
Pour chaque indicateur, le seuil est optimisé et défini comme la médiane des 100 seuils obtenus par la méthode BOOTSTRAP.
Ces seuils sont ensuite utilisés sur le lot de d’apprentissage et puis le lot de test, et les métriques suivantes sont déterminées :
- aire sous la courbe (AUC, pour l’anglais « Area Under Curve »),
- justesse de classement (en anglais, « accuracy »),
- sensibilité,
- spécificité,
- valeur prédictive positive (PPV, pour l’anglais « Positive Predictive Value ») : probabilité que le patient prédit comme progresseur précoce soit progresseur précoce,
- valeur prédictive négative (NPV, pour l’anglais « Negative Predictive Value ») : probabilité que le patient prédit comme non-progresseur précoce soit non- progresseur précoce.
Les seuils déterminés par la méthode BOOTSTRAP sont en outre utilisés pour calculer un intervalle à 95% de confiance des valeurs seuil en extrayant les quantiles à 2,5% et 97,5%.
Les courbes ROC obtenues pour chaque indicateur, respectivement pour le lot d’apprentissage de 35 patients, le lot de test de 16 patients et la cohorte totale, sont montrées sur la figure 5 pour l’indicateur P1 et sur la figure 6 pour l’indicateur P2. Les valeurs de l’aire sous la courbe (AUC) sont indiquées sur les figures pour chacune des courbes. On observe que cette valeur est élevée pour les 2 indicateurs, et est supérieure pour l’indicateur P1 (figure 5) que pour l’indicateur P2 (figure 6). A titre comparatif, par exemple, pour l’indicateur qu’est la concentration relative de fragments d’ADNcf dans la plage de tailles supérieures ou égales à 240 pb, on obtient pour la cohorte totale une AUC de 0,65 seulement.
La figure 7 montre les boites à moustaches obtenues, pour chacun des indicateurs P1 et P2, pour l’ensemble de la cohorte. On observe que les résultats sont statistiquement différents entre les progresseurs précoces et les non- progresseurs précoces.
L’ensemble des résultats obtenus, pour le lot d’apprentissage (« A ») et pour le lot test (« T ») sont résumés dans le tableau 6, pour chacun des indicateurs P1 et P2.
Tableau 6 - Valeurs statistiques caractéristiques pour les indicateurs P1 et P2 Pour l’indicateur P1 , on obtient une sensibilité de 0,833 et une spécificité de 0,900, pour un seuil (score au-dessous duquel le patient est considéré comme progresseur précoce) de 0,034 (intervalle de confiance de 0,028 à 0,043).
L’indicateur P2 présente quant à lui une excellente spécificité de 1 en considérant un seuil (au-dessous duquel le patient est considéré comme progresseur précoce) de 0,072 (intervalle de confiance de 0,062 à 0,122). Cet indicateur a ainsi un bon pouvoir prédictif d’une progression ou non de la tumeur au premier examen : s’il est faible, alors il y aura très probablement (à mieux que 90 %) progression de la maladie au premier examen. En revanche, s’il est élevé, son pouvoir prédictif d’une absence de progression précoce est modéré, inférieur à celui du marqueur P1 , qui présente le meilleur compromis entre sensibilité et spécificité.
Pour le lot test, les courbes de survie sans progression et les probabilités de survie ont été estimées par la méthode de Kaplan-Meier, et comparées aux résultats de prédiction par l’indicateur P1 selon l’invention, avec la valeur seuil de 0,034. Les résultats sont montrés sur la figure 8. On observe que les courbes sont bien corrélées et caractéristiques d’une réponse longue, et donc d’un bon pronostic de la survie sans progression. Ainsi, l’indicateur P1 constitue un marqueur permettant le pronostic de la survie sans progression.
B/ Etude 2
Cette étude est basée sur une cohorte de 155 patients (incluant les 51 patients de l’Etude 1 ) présentant 5 types de pathologies cancéreuses : mélanome, ORL (carcinome à cellules squameuses de la tête et du cou, ci-après dénommé HNSCC), poumon (non à petites cellules), rein et vessie.
La réponse au traitement d’immunothérapie des patients se réfère à la réponse aux traitements utilisés qui sont : le nivolumab, lïpilimumab et/ou le pembrolizumab, ces traitements pouvant être combinés à une thérapie ciblée, l’administration d’anticorps anti-PD-L1 ou à un traitement de chimiothérapie.
Les caractéristiques des patients de la cohorte au début de l’étude sont résumées dans le tableau 7 et le tableau 8. précoce, NEP = non-progresseur précoce
Tableau 8 - Caractéristiques complètes des patients de la cohorte
Pour chaque patient, il est établi la courbe représentant la concentration de l’ADNcf en fonction de la taille comme décrit dans le descriptif de l’Etude 1 , et telle qu’illustrée que la figure 3. La position du pic 2 (exprimée en paires de bases), par exemple 308 paires de base pour l’exemple de la figure 3, est déterminée, de même que les différentes concentrations d’ADNcf dans les plages de valeurs souhaitées.
L’analyse statistique est réalisée comme décrit en référence à l’Etude 1 .
B.1/ Analyses statistiques préliminaires Les fonctions mathématiques (indicateurs) utilisées pour l’analyse statistique sont P1 et P2 décrites en référence à l’Etude 1 , ainsi que le paramètre Position pic2.
Pour chaque fonction mathématique, les courbes ROC sont établies, et les valeurs de l’aire sous la courbe (AUC) ainsi que les valeurs p, établies respectivement par les méthodes du test t et du test de Wilcoxon de manière classique, par rapport aux statuts EP ou NEP connus, sont déterminées.
Les résultats obtenus sont montrés dans le tableau 9, pour les cancers du poumon et de la vessie, ainsi que pour l’ensemble des cancers affectant les patients de la cohorte.
Tableau 9 - Résultats statistiques caractéristiques pour les indicateurs P1 , P2 et Position pic2 - n= nombre de patients, t = test t, Wile. = Wilcoxon
On observe que du point de vue de la valeur p, c’est-à-dire de la certitude d’avoir une distribution différente entre les groupes progresseur précoce (EP) et non- progresseur précoce (NEP), les indicateurs P1 et P2, ainsi que l’indicateur Position pic2, sont discriminants pour le cancer du poumon et le cancer de la vessie.
Les valeurs p les plus faibles sont obtenues lorsque l’on considère l’ensemble des pathologies. Ceci montre que ces indicateurs possèdent bien une distribution différente entre EP et NEP dans les autres pathologies également. Quand on combine la valeur p avec l’AUC, on observe que l’indicateur P1 est le plus performant.
Pour chaque indicateur et chaque type de cancer, le seuil qui minimise la distance avec le point optimal (0,1 ) (valeur de référence), établi à partir de la courbe ROC, est indiqué dans le tableau 10. Les scores supérieurs à ces valeurs seuils témoignent d’un statut de non-progresseur précoce.
NEP
Selon l’information souhaitée pour le patient, les valeurs seuil pourront être choisies différemment, notamment choisies à des valeurs plus hautes si l’objectif est de privilégier la spécificité de prédiction d’un statut progresseur précoce plutôt que la sensibilité de prédiction.
B.2/ Performance de l’indicateur P1 sur le cancer du poumon
Pour le groupe de patients atteints de cancer du poumon, les boites à moustache et la courbe ROC pour l’indicateur P1 sont montrées sur la figure 9, respectivement en a/ et b/. L’AUC obtenu est égal à 0,79. Le graphe représentant la NPV en fonction de la spécificité est montré sur la figure 10. On observe que l’indicateur P1 permet de prédire environ les 3/4 des non-progresseurs précoces avec une NPV de 90%.
L’indicateur « Position pic2 » montre des performances similaires à celles de l’indicateur P1 dans le cancer du poumon.
B.3/ Analyse multivariée - paramètres de taille d’ADNcf
Cette analyse prend en compte les paramètres de taille suivants :
- P1 ,
- Position pic2, exprimée en paires de bases,
- Sommei6o-22o, exprimée en pg/pl à la puissance 0,1 , qui est définie par la formule suivante :
Une régression logistique a été faite, visant à prédire plus particulièrement les patients progresseurs précoces (EP), en divisant les données en un jeu d’apprentissage (75% des données) et un jeu de test (25% des données, 16 patients), pour un total de 64 patients atteints de cancer du poumon. La régression logistique a été réglée sur le jeu d’apprentissage par cross-validation, puis testée sur le jeu de test.
Les résultats sur le jeu de test sont montrés dans le tableau 1 1 .
Tableau 1 1 - Performance d’une régression ogistique sur les marqueurs P1 ,
Position pic2 et Sommei6o-22o pour le jeu de test n’ayant pas participé à l’apprentissage, pour des patients souffrant de cancer du poumon (n=16) La performance est bonne ; selon ces données, il serait possible d’éviter de donner de l’immunothérapie aux 2/3 des patients EP, tout en omettant de donner de l’immunothérapie à 8% des patients NEP.
La formule mathématique complète, nommée S1 , est la suivante :
51 = 1 - 1 / (1 + Exp(-(-37,13 + 32,04xP1 - 0,08x(Sommei6o-22o) + 0,13x(Position pic2))))
La valeur seuil (au-dessus de laquelle le patient est considéré comme progresseur précoce) est égale à 0,5.
B.4/ Analyse multivariée - paramètres de taille d’ADNcf et marqueur clinique
Cette analyse prend en compte les paramètres de taille suivants :
- P1 ,
- Position pic2, exprimée en paires de bases,
- Sommei6o-22o, exprimée en pg/pl à la puissance 0,1 ,
- rapport entre le nombre de neutrophiles et le nombre de lymphocytes (« Rn/I »), ces nombres étant déterminés par numération sanguine. a/ Cancer HNSCC
Une régression logistique a été faite, visant à prédire plus particulièrement les patients progresseurs précoces (EP), en divisant les données en un jeu d’apprentissage (25 patients) et un jeu de test (7 patients), pour un total de 32 patients atteints de HNSCC. La régression logistique a été réglée sur le jeu d’apprentissage par cross-validation, puis testée sur le jeu de test.
Sur l’ensemble des données, on obtient de très bonnes performances :
- Sensibilité = 83%
- Spécificité = 86%
- PPV : 88%
- NPV : 80%.
La formule mathématique complète, nommée S2, est la suivante :
52 = 1 - 1 / (1 + Exp(-(2,29 + 19,46xP1 - 0,07x(Sommei6o-22o) + 0,047x(Position pic2) - 2,27xRn/l)))
La valeur seuil (au-dessus de laquelle le patient est considéré comme progresseur précoce) est égale à 0,5. b/ Cancer du poumon
Une régression logistique a été faite, visant à prédire plus particulièrement les patients progresseurs précoces (EP), en divisant les données en un jeu d’apprentissage (42 patients) et un jeu de test (13 patients), pour un total de 55 patients atteints de cancer du poumon. La régression logistique a été réglée sur le jeu d’apprentissage par cross-validation, puis testée sur le jeu de test.
Sur l’ensemble des données, on obtient de très bonnes performances :
- Sensibilité = 44%
- Spécificité = 96%
- PPV : 67%
- NPV : 90%.
La formule mathématique complète, nommée S3, est la suivante :
53 = 1 - 1 / (1 + Exp(-(-27,35 - 6,30xP1 - 0,2x(Sommei60-22o) +0,12x(Position pic2) - 0,04xRn/l))) La valeur seuil (au-dessus de laquelle le patient est considéré comme progresseur précoce) est égale à 0,5. c/ Tous cancers hors mélanome
Une régression logistique a été faite, visant à prédire plus particulièrement les patients progresseurs précoces (EP), en divisant les données en un jeu d’apprentissage (83 patients) et un jeu de test (27 patients), pour un total de 1 10 patients atteints de cancer autre qu’un mélanome. La régression logistique a été réglée sur le jeu d’apprentissage par cross-validation, puis testée sur le jeu de test.
Sur l’ensemble des données, on obtient là encore de très bonnes performances :
- Sensibilité = 81 %
- Spécificité = 81 %
- PPV : 68%
- NPV : 89%.
On observe en particulier que la NPV est élevée : la conclusion du procédé de prédiction permet d’administrer un traitement d’immunothérapie au patient avec une bonne confiance qu’il ne sera pas un progresseur précoce.
La formule mathématique complète, nommée S4, est la suivante :
54 = 1 - 1/(1 + Exp(-(-16,18 + 27,26xP1 - 0,075x(Sommei6o-22o) + 0,056x(Position pic2) - 0,19xRn/l)))
La valeur seuil (au-dessus de laquelle le patient est considéré comme progresseur précoce) est égale à 0,5. Il ressort des résultats ci-avant que la combinaison des marqueurs de taille choisis conformément à l’invention et du rapport « nombre de neutrophiles / nombre de lymphocytes », augmente plus encore les performances de prédiction d’un caractère de progresseur précoce, par rapport à ce qui peut être prédit par la combinaison de ces marqueurs de taille seuls.
B.5/ Courbes de survie sans progression
Les courbes de survie sans progression et les probabilités de survie ont été estimées par la méthode de Kaplan-Meier, et comparées aux résultats de prédiction par différents des indicateurs ci-dessus, avec la valeur seuil correspondante, pour différents types de cancer. Les intervalles de confiance ont été obtenus par la méthode BOOTSTRAP.
Les résultats sont montrés :
- sur la figure 1 1 pour l’indicateur P1 , en a/ pour l’ensemble des cancers et en b/ pour le cancer du poumon seul ;
- sur la figure 12 pour l’indicateur Position pic2, en a/ pour l’ensemble des cancers et en b/ pour le cancer du poumon seul ;
- sur la figure 13 pour l’indicateur P2, pour l’ensemble des cancers ;
- sur la figure 14 pour l’indicateur S1 , pour le cancer du poumon ;
- sur la figure 15 pour l’indicateur S3, pour le cancer du poumon ;
- et sur la figure 16 pour l’indicateur S2, pour le cancer HNSCC.
On observe que les courbes sont bien corrélées et caractéristiques d’une réponse longue, et donc d’un bon pronostic de la survie sans progression, à l’exception de celle de la figure 16, pour laquelle l’indicateur identifie toutefois correctement les patients à faible espérance de vie, inférieure ou égale à 4 mois. Ainsi, les indicateurs choisis conformément à l’invention constituent un outil permettant le pronostic de la survie sans progression.
Cette étude menée sur 155 patients confirme le pouvoir prédicteur associé à la présence de grands fragments dans l’ADN libre circulant.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro de prédiction du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non-progresseur précoce lors d’un traitement d’immunothérapie d’un sujet atteint d’un cancer, comprenant des étapes de : a/ détermination, dans un échantillon de sang isolé obtenu à partir dudit sujet avant ledit traitement d’immunothérapie :
- de la concentration totale d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, dite concentration d’ADNcf totale,
- d’au moins une concentration, dans ledit échantillon de sang, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dont la taille est incluse dans une plage de taille prédéterminée, ladite plage de taille prédéterminée étant comprise dans les tailles supérieures à 500 paires de bases, dite concentration d’ADNcf de grande taille, b/ combinaison dans une fonction mathématique d’au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et de ladite concentration d’ADNcf totale, de sorte à obtenir un score, c/ comparaison dudit score à une première valeur de référence prédéterminée et/ou une deuxième valeur de référence prédéterminée, et d/ détermination du caractère de progresseur précoce et/ou du caractère de non- progresseur précoce dudit sujet lors dudit traitement d’immunothérapie sur la base du résultat de ladite comparaison.
2. Procédé selon la revendication 1 , selon lequel ladite première valeur de référence et ladite deuxième valeur de référence sont identiques.
3. Procédé selon la revendication 1 , selon lequel ladite première valeur de référence est inférieure à ladite deuxième valeur de référence.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel ladite fonction mathématique comprend, en tant que variable, le rapport entre au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et ladite concentration d’ADNcf totale
5. Procédé selon la revendication 4, selon lequel ladite fonction mathématique est le rapport entre au moins ladite concentration d’ADNcf de grande taille, et ladite concentration d’ADNcf totale.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, selon lequel ladite plage de taille prédéterminée est la plage de tailles supérieures à 500 paires de bases, de préférence supérieures ou égales à 600 paires de bases, et de préférence encore supérieures ou égales à 1500 paires de bases.
7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, selon lequel ladite plage de taille prédéterminée est la plage de tailles supérieures ou égales à 1650 paires de bases.
8. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, selon lequel ladite plage de taille prédéterminée est la plage de tailles comprises entre 1650 et 4000 paires de bases.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, selon lequel ladite plage de taille prédéterminée est la plage de tailles comprises entre 580 et 1649 paires de bases.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant l’établissement d’une courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang, et la détermination de la taille, exprimée en paires de bases, correspondant au deuxième pic sur ladite courbe, dite Position pic2, et selon lequel ladite fonction mathématique comprend, en tant que variable, ladite Position pic2.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant la détermination de la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant dans ledit échantillon de sang pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, et le calcul de la somme de chacune desdites concentrations à la puissance 0,1 , ladite somme étant dite Sommei6o-22o, et selon lequel ladite fonction mathématique comprend, en tant que variable, ladite Sommei6o-22o.
12. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 1 1 , comprenant la détermination du nombre de neutrophiles et du nombre de lymphocytes dans ledit échantillon de sang, et selon lequel ladite fonction mathématique comprend, en tant que variable, le rapport entre ledit nombre de neutrophiles et ledit nombre de lymphocytes.
13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant une étape d’obtention d’un échantillon de plasma à partir dudit échantillon de sang.
14. Procédé selon la revendication 13, selon lequel la détermination de ladite concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille, et le cas échéant l’établissement de la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant et/ou la détermination de la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, sont réalisées par analyse directe dudit échantillon de plasma.
15. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, comprenant une étape d’extraction de l’acide désoxyribonucléique libre circulant dudit échantillon de sang, ou le cas échéant dudit échantillon de plasma, et selon lequel la détermination de ladite concentration d’ADNcf totale et la détermination de ladite au moins une concentration d’ADNcf de grande taille, et le cas échéant rétablissement de la courbe représentant la concentration, en fonction de la taille, des fragments d’acide désoxyribonucléique libre circulant et/ou la détermination de la concentration d’acide désoxyribonucléique libre circulant pour chaque taille comprise entre 160 et 220 paires de bases, sont réalisées par analyse de l’extrait d’acide désoxyribonucléique libre circulant ainsi obtenu.
16. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 15, selon lequel ledit sujet est un humain.
17. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 16, selon lequel ledit cancer est une pathologie tumorale métastatique, un mélanome, un cancer du rein, un carcinome urothélial de la vessie, un carcinome épidermoïde de la tête et du cou, ou un cancer bronchique non à petites cellules.
18. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 17, selon lequel ledit traitement d’immunothérapie met en oeuvre le nivolumab, lïpilimumab, le pembrolizumab, l’atézolizumab, l’avélumab et/ou le durvalumab.
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