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WO2025154995A1 - 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법 - Google Patents

생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법

Info

Publication number
WO2025154995A1
WO2025154995A1 PCT/KR2024/096521 KR2024096521W WO2025154995A1 WO 2025154995 A1 WO2025154995 A1 WO 2025154995A1 KR 2024096521 W KR2024096521 W KR 2024096521W WO 2025154995 A1 WO2025154995 A1 WO 2025154995A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glutamine
alanyl
producing
protein
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2024/096521
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
최원우
이종원
장재우
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cutisbio Co ltd
Original Assignee
Cutisbio Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cutisbio Co ltd filed Critical Cutisbio Co ltd
Publication of WO2025154995A1 publication Critical patent/WO2025154995A1/ko
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)

Definitions

  • Korean Patent Nos. 10-0762730 and 10-2183558 disclose novel enzymes derived from Sphingobacterium strains that efficiently synthesize a dipeptide, i.e., L-alanyl-L-glutamine.
  • a dipeptide i.e., L-alanyl-L-glutamine.
  • the inventors of the present invention in order to discover a novel enzyme other than the previously known L-alanyl-L-glutamine biosynthetic enzyme, searched for a novel enzyme based on homologs of the previously known enzymes, and confirmed that the protein consisting of sequence number 1 has the characteristic of having high L-alanyl-L-glutamine biosynthetic efficiency and maintaining its activity even at high temperatures, thereby completing the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing L-alanyl-L-glutamine, comprising the steps of: (a) culturing a recombinant strain expressing a protein consisting of sequence number 1 in a medium under conditions and for a time suitable for producing the protein; (b) mixing L-alanine methyl ester hydrochloride and glutamine with the culture; and (c) obtaining L-alanyl-L-glutamine.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for producing L-alanyl-L-glutamine, comprising at least one of a protein comprising sequence number 1 or a recombinant strain expressing a protein comprising sequence number 1.
  • the present invention provides a method for producing L-alanyl-L-glutamine, comprising the steps of: (a) culturing a recombinant strain expressing a protein consisting of sequence number 1 in a medium under conditions and for a time suitable for producing the protein; (b) mixing L-alanine methyl ester hydrochloride and glutamine with the culture; and (c) obtaining L-alanyl-L-glutamine.
  • the present invention provides a composition for producing L-alanyl-L-glutamine, comprising at least one of a protein consisting of sequence number 1 or a recombinant strain expressing a protein consisting of sequence number 1.
  • the dppA , pepA , pepB , pepD , pepN , glsA and glsB genes of wild-type BL21 (DE3) are deleted.
  • the time, conditions and medium suitable for producing the protein may vary depending on the type of host strain used as the recombinant strain.
  • the above 'cultivation' means growing the recombinant strain under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culturing process can be carried out according to appropriate media and culturing conditions known in the art. This culturing process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art according to the selected microorganism. Specifically, the culturing can be batch, continuous and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the carbon source may include carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, etc.; sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc., organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, etc.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolysate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugarcane residue, and corn steep liquor may be used, and specifically, carbohydrates such as glucose and sterilized pretreated molasses (i.e., molasses converted into reducing sugar) may be used, and other appropriate amounts of carbon sources may be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • the step (b) according to the present invention refers to a step of substantially synthesizing L-alanyl-L-glutamine by administering a substrate for the biosynthesis of L-alanyl-L-glutamine.
  • the above substrate refers to a substrate containing a carboxyl group component and an amine component.
  • the carboxyl group component can be selected from an amino acid ester or an amino acid amide, and preferably can be L-alanine methyl ester hydrochloride.
  • the amine component can be selected from an amino acid, an amino acid with a C-terminal protected, or an amine, and preferably can be L-glutamine.
  • step (b) according to the present invention it is advantageous for production to set the concentration of the substrate according to the proportional reaction relationship of the reactants, and there is no upper/lower limit restriction on the concentration of the reaction substrate, but the carboxyl group component and the amine component can be administered at a concentration of 50 to 600 mM.
  • the carboxyl group component and the amine component can be dissolved in a buffer solution and administered.
  • the buffer solution is not limited thereto, but a borate buffer solution can be used, and the pH can be adjusted to a range of pH 8 to pH 10, preferably pH 8 to pH 9, and then administered.
  • the protein consisting of sequence number 1 according to the present invention has a constant level of L-alanyl-L-glutamine conversion rate within the range of 25°C to 50°C.
  • the step (b) according to the present invention can be performed at any temperature within 15°C to 55°C, preferably within 25°C to 50°C, and a person skilled in the art can determine an appropriate temperature as needed within the above range to perform the step (b).
  • the above 'recovery' may be collecting the target L-alanyl-L-glutamine using a suitable method known in the art according to the culture method of the above-described recombinant strain, i.e., a culture method such as batch, continuous or fed-batch.
  • various chromatographies such as centrifugation, filtration, treatment with a crystallizing protein precipitant (salting out method), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, HPLC or a combination of these methods may be used, and the target L-alanyl-L-glutamine can be recovered from the medium or the recombinant strain using a suitable method known in the art.
  • Each of the constructed recombinant plasmids pCBT1- ⁇ dppA , pCBT1- ⁇ pepA , pCBT1- ⁇ pepB , pCBT1- ⁇ pepD , pCBT1- ⁇ pepN , pCBT1- ⁇ glsA , and pCBT1- ⁇ glsB vectors was sequentially transformed into E. coli BL21 (DE3) strain by electroporation, and then a second crossing process was performed to produce a strain lacking dppA , pepA , pepB , pepD , pepN , glsA , and glsb , and this was named CE11EC007.
  • the corresponding genetic manipulations were confirmed by PCR using the primers listed in Table 2.
  • a gene encoding ⁇ -amino acid ester acyltransferase derived from Sphingobacterium sp. used in a prior patent and a F0358_12975 gene encoding a novel ⁇ -amino acid ester acyltransferase were synthesized and introduced into the pET28a vector, thereby constructing two plasmids, which were named pSAET and pCutisAET, respectively.
  • Table 3 shows the amino acid sequences of SAET and F0358_12975 used in the prior patent (Korean Patent No. 10-0762730).
  • the vectors pSAET and pCutisAET constructed in the above Example 1-2 were transformed into the CE11EC007 strain produced in the above Example 1-1 to obtain two strains producing L-alanyl-L-glutamine, and these strains were named Ec_SAET and Ec_CutisAET, respectively.
  • the culture was shaken at 200 rpm for 18 h at 25°C, and after the incubation, 1 ml of the culture was centrifuged to recover the cells, which were washed with an equal volume of PBS (Phosphate-buffered saline (pH 7.0)) and used in the enzymatic reaction.
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • the enzymatic reaction was started by adding 100 ⁇ l of the wet cells prepared by the above method to 900 ⁇ l of 0.2 M borate buffer (pH 8.5) containing 50 mM L-alanine methyl ester hydrochloride and 100 mM glutamine. The enzymatic reaction was performed for 1 hour, and after the reaction was completed, the cells were removed using a centrifuge, and the enzyme reaction solution was analyzed by HPLC. The results of the enzymatic reaction are shown in Table 4.

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Abstract

본 발명은 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에 알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride) 및 글루타민(glutamine)을 혼합하는 단계; 및 (c) L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)을 수득하는 단계;를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법
본 출원은 2024년 01월 19일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2024-0008937호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에 알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride) 및 글루타민(glutamine)을 혼합하는 단계; 및 (c) L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)을 수득하는 단계;를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)의 생산 방법에 관한 것이다.
L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine, Ala-Gln, Cas No. 39537-23-0)은 아미노산 알라닌과 글루타민으로 구성된 디펩티드로, C8H15N3O4의 화학식을 갖는다. L-알라닐-L-글루타민은 용해도가 높고, 수용성과 열안정성이 강하며, 독성이 낮고 사람과 동물에서 안정한 화합물이라는 특징이 있어 다양한 분야에서 널리 이용되는데, 식품 산업에서는 유산균 증식 촉진제로 사용되어 식품의 맛, 식감, 유통기한 향상에 도움을 주며, 의료 분야에서는 면역 기능을 향상시키고, 장 기능을 유지하며, 수술이나 질병 후 회복을 개선하기 위한 영양 보충제로 사용된다. 또한 운동 능력을 향상시키고 피로를 줄이기 위해 스포츠 영양 제품에도 사용된다.
L-알라닐-L-글루타민의 합성은 주로 화학적 합성 방법과 효소에 의한 생합성 방법에 의하여 이루어지는데, 화학적 합성 방법은 반응 단계와 부산물이 많고 독성이 높아 산업적으로 용이한 방법이라 할 수 없어 최근에는 효소를 이용한 생합성 방법이 널리 이용되고 있다. 그러나 효소에 의한 생합성 방법 또한 효소 사용량이 많고 펩티드 생산성이 낮다는 단점이 존재한다.
대한민국 등록특허 제10-0762730호 및 제10-2183558호는 스핑고박테리움(Sphingobacterium) 속 균주에서 유래한 것으로서, 디펩티드, 즉 L-알라닐-L-글루타민을 효율적으로 합성하는 신규한 효소를 개시하고 있다. 그러나 이와 같이 알려진 효소와 비교하여 보다 효율이 높고, 특히 고온에서도 L-알라닐-L-글루타민의 생산이 가능한 새로운 효소의 발굴이 필요하다.
이에 본 발명자들은 기존에 알려진 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소 이외에 신규한 효소를 발굴하기 위하여, 종래 알려진 효소의 homologous를 기초로 신규한 효소를 탐색하던 중 서열번호 1로 이루어진 단백질이 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효율이 높으면서도 고온에서도 그 활성을 유지하는 특성을 가지고 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주를 상기 단백질을 생산하는데 적합한 시간 및 조건 하에 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에 알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride) 및 글루타민(glutamine)을 혼합하는 단계; 및 (c) L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)을 수득하는 단계;를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 이루어진 단백질 또는 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주 중 하나 이상을 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주를 상기 단백질을 생산하는데 적합한 시간 및 조건 하에 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에 알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride) 및 글루타민(glutamine)을 혼합하는 단계; 및 (c) L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)을 수득하는 단계;를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 이루어진 단백질 또는 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주 중 하나 이상을 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소에 관한 것으로서, 상기 효소는 다음의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다.
서열번호 1 :
MSGLSFAQDVKADSLYVRQHYDKIEQLIPMRDGTKLFTAIYMPKDKSKNYPVLLNRTPYTVAPYGADAYKKSLGNFPAEMREGFIFVYQDVRGRWMSEGEFEDVRPVNKSKNKKAIDETTDTYDTLEWLSKNMKNYNQKAGIYGISYPGFYSTMSLINSHPTLKAVSPQAPVTNWYLGDDFHHNGVLFLNDSFKFMSSFGVKRPQPITPDKGPKSFEYPIKDNYRFYLEGGSVKELKNTYFQDNIKFYNDLFAHPDYDQFWQDRNPLPHLTHVKPAVMTVGGFFDAEDAYGAFETYKAIEKQNPNATNILVAGPWFHGGWVRAKGDTFGDMQFGSSTGEYYQQQIELPFFNYYLKDKGDFKPTEARIFITGSNEWKQFETWPPKNSSTKKMFLQANGKIAFNQSNTATFDEYVSDPNHPVPYQEGVLETRSREYMVDDQRFASTRPDVMVYQTDVLTEDITVTGPVINHLFVSSTGTDADYVVKLIDVYPEDTPKFNEKLMAGYQNLIRAEIMRAKYRNSFEKPEAMIPNQKTSVMYTMPDVGHTFKKGHRIMIQVQNTWFPLADRNPQQFMNVYEATAKDFLKQTQRIYHDSFIEIPVLNK
상기 서열번호 1로 이루어진 단백질은 Empedobacter brevis에서 유래한 CocE/NonD family hydrolase로 알려진 단백질로서, 상기 단백질이 L-알라닐-L-글루타민 생합성 활성을 갖는 알파-아미노산 에스테르 아실기 전이효소(α-amino acid ester acyltransferase, AET)라는 사실은 본 발명자에 의하여 최초로 확인되었다. 특히 본 발명자가 확인한 결과, 상기 단백질은 상술한 선행 특허문헌에서 개시하는 스핑고박테리움 유래 효소와 비교하여 25℃에서 반응하였을 때 67%, 37℃에서 반응하였을 때 179% 더 높은 L-알라닐-L-글루타민 전환율을 나타냈으며, 특히 50℃에서 선행 특허문헌의 효소는 전혀 활성을 나타내지 아니하였으나, 본 발명에 따른 효소는 25℃ 및 37℃에서와 유사한 정도의 L-알라닐-L-글루타민을 나타냈다.
따라서, 본 발명은 (a) 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주를 상기 단백질을 생산하는데 적합한 시간 및 조건 하에 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양물에 알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride) 및 글루타민(glutamine)을 혼합하는 단계; 및 (c) L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)을 수득하는 단계;를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)의 생산 방법을 제공한다.
이하에서는 본 발명에 따른 방법의 각 단계에 대하여 구체적으로 설명한다.
(a) 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주를 상기 단백질을 생산하는데 적합한 시간 및 조건 하에 배지에서 배양하는 단계;
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 상기 서열번호 1로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터, 바람직하게는 pET28a 벡터를 포함하는 균주를 의미한다. 아울러, 상기 재조합 균주는 상기 서열번호 1로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 균주일 수 있다. 상기 '벡터(vector)'는 본 발명의 서열번호 1로 이루어진 단백질의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 단백질의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그널 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서(enhancers) 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현 벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터(promoter)에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 서열번호 1로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터일 수 있다. 따라서, 상기 재조합 균주는 프로모터(promoter)에 작동 가능하게 연결된 상기 서열번호 1로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 균주일 수 있다.
벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들(adeno-associated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterial vectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈 내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 대장균일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 E. coli BL21(DE3)을 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 있어서 통상의 기술자에게 잘 알려진 바에 따라 형질전환 숙주로 이용될 수 있는 모든 균, 대장균을 포함한다.
상기 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드(본 발명의 단백질 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)가 도입됨에 의한 숙주세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 재조합 균주로 사용된 상기 E. coli BL21(DE3)는 L-알라닐-L-글루타민을 용이하게 생산할 수 있도록 유전적으로 조작된 균주를 의미한다. 즉, 야생형 BL21(DE3)는 디펩티드 트랜스포터(dipeptide transporter, dppA)를 이용하여 디펩티드를 세포 안으로 유입 시키고, 펩티다제(peptidase, pepABDN)를 이용하여 세포 안으로 유입된 디펩티드를 단일 아미노산으로 분해하게 된다. 또한, 야생형 BL21(DE3)는 글루타미나아제(glutaminase, glsAB)를 이용하여 L-글루타민(L-glutamine)을 L-글루탐산(L-glutamate)으로 전환시키게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질에 의하여 생산된 L-알라닐-L-글루타민의 분해를 막고, L-알라닐-L-글루타민의 기질로 사용되는 L-글루타민이 L-글루탐산으로 전환되는 것을 막기위해서 야생형 BL21(DE3)가 갖는 dppA, pepA, pepB, pepD, pepN, glsA 및 glsB 유전자가 결손된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질을 생산하는데 적합한 시간, 조건 및 배지는 상기 재조합 균주로 사용된 숙주균의 종류에 따라 달라질 수 있다.
상기 '배양'은 상기 재조합 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 통상의 기술자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 '배지'는 상기 재조합 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 상기 재조합 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 재조합 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기 화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양에서 배양 온도는 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 E. coli BL21(DE3)를 숙주균으로 하여, LB배지 (Luria-Bertani broth)에서 25℃에서 18시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 통상의 기술자는 당업계에 잘 알려진 바에 따라 적절하게 배양 조건을 변경하여 적용할 수 있고, 본 발명의 서열번호 1로 이루어진 단백질이 발현될 수 있는 숙주균의 배양 조건이라면 상술한 내용 중 어느 것이라도 적용 가능하는 점은 통상의 기술자에게 자명하다.
(b) 상기 배양물에 알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride) 및 글루타민(glutamine)을 혼합하는 단계;
본 발명에 따른 상기 (b) 단계는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성을 위한 기질을 투여하여 실질적으로 L-알라닐-L-글루타민을 합성하는 단계를 의미한다.
상기 기질은 카르복실기 성분과 아민 성분을 포함하는 기질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 카르복실기 성분은 아미노산 에스테르 또는 아미노산 아미드로부터 선택할 수 있으며, 바람직하게는 L-알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride)일 수 있다. 상기 아민 성분은 아미노산, C-말단이 보호된 아미노산 또는 아민으로부터 선택할 수 있으며, 바람직하게는 L-글루타민(L-glutamine)일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 기질의 농도는 반응물의 비례반응관계에 따라 설정하는 것이 생산에 있어 유리하며, 반응 기질의 농도에 있어서 상한/하한의 제한이 없으나, 상기 카르복실기 성분과 아민 성분은 50 내지 600 mM의 농도로 투여할 수 있다.
상기 기질을 투여할 때에는 상기 카르복실기 성분과 상기 아민 성분을 완충 용액에 용해시켜서 투여할 수 있다. 상기 완충 용액은 이에 제한되는 것은 아니나 붕산염 완충 용액(borate buffer)을 사용할 수 있으며, 이를 통해 pH 8 내지 pH 10, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 9 범위로 조절하여 투여할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 기질을 투여할 때 재조합 균주의 밀도는 OD600 = 0.1 내지 4.0 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 본 발명자가 실험한 바에 따르면, 본 발명에 따른 서열번호 1로 이루어진 단백질은 25℃ 내지 50℃ 범위 내에서 일정한 수준의 L-알라닐-L-글루타민 전환율을 갖는다. 이를 고려할 때, 본 발명에 따른 상기 (b) 단계는 15℃ 내지 55℃ 이내, 바람직하게는 25℃ 내지 50℃ 이내의 어떠한 온도에서도 수행될 수 있으며, 통상의 기술자는 상기 범위 내에서 필요에 따라 적절한 온도를 결정하여 상기 (b) 단계를 수행할 수 있다.
(c) L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)을 수득하는 단계;
본 발명에 따른 상기 (c) 단계는 반응을 종료하고 최종 생성된 L-알라닐-L-글루타민을 회수하는 단계를 의미한다.
본 발명에 따른 L-알라닐-L-글루타민 생산 방법에 있어서, 재조합 균주가 생산을 진행하여 필요한 정도로 반응 진행이 완료되면, 재조합 균주를 새로 합성된 L-알라닐-L-글루타민으로부터 물리적으로 분리, 예를 들어 원심분리를 이용하여 분리함으로써 반응을 종료시킬 수 있으며, 이렇게 분리된 재조합 균주는 공정균으로서 새로운 반응 시스템에 투입되어 반복적으로 이용될 수 있다.
상기 '회수'는 상술한 재조합 균주의 배양 방법, 즉, 회분식, 연속식 또는 유가식 등 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-알라닐-L-글루타민을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심 분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 재조합 균주로부터 목적하는 L-알라닐-L-글루타민을 회수할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 이루어진 단백질 또는 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주 중 하나 이상을 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 조성물은 사용목적 내지 양상에 따라 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들면 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 생산용 조성물은 상기 재조합 균주 외에 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 생산용 조성물은 본 발명의 방법으로 제조된 재조합 균주를 포함하고, 담체를 99.9% 내지 0.1 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1로 이루어진 단백질 및 상기 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주는 전술한 바와 같다.
본 발명의 방법은 L-알라닐-L-글루타민을 효율적으로 합성 및/또는 생산할 수 있으며, 특히 본 발명에 따른 단백질은 고온에서도 L-알라닐-L-글루타민을 합성할 수 있다는 특징이 있어, L-알라닐-L-글루타민 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 균주가 L-알라닐-L-글루타민을 생산하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 반응 온도 25℃에서 L-알라닐-L-글루타민 전환율을 선행문헌의 효소와 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 반응 온도 37℃에서 L-알라닐-L-글루타민 전환율을 선행문헌의 효소와 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 반응 온도 50℃에서 L-알라닐-L-글루타민 전환율을 선행문헌의 효소와 비교하여 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. L-알라닐-L-글루타민 생산 균주 제작
1-1. 디펩티드 트랜스포터(dipeptide transporter), 펩티다제(peptidase) 유전자 파쇄
야생형 BL21 (DE3)는 디펩티드 트랜스포터(dipeptide transporter, dppA)를 이용하여 디펩티드를 세포 안으로 유입시키고, 펩티다제(peptidase, pepABDN)를 이용하여 디펩티드를 단일 아미노산으로 분해할 수 있다. 또한, 글루타미나아제(glutaminase, glsAB)를 이용하여 L-글루타민(L-glutamine)을 L-글루탐산(L-glutamate)으로 전환시킬 수 있다.
따라서, 알라닐-글루타민(L-alanyl-L-glutamine, Ala-Gln)의 분해를 막고, 알라닐-글루타민의 기질로 사용되는 L-글루타민이 L-글루탐산으로 전환되는 것을 막기 위하여 야생형 BL21 (DE3)의 dppA, pepA, pepB, pepD, pepN, glsA, glsB의 결손을 진행하였다.
이를 위해서, 표 1에 나열된 프라이머를 이용하여 상기 타겟 유전자들의 업스트림(upstream)과 다운스트림(downstream) 지역을 수득하고, EcoRV 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pCBT1와 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝 함으로써 표 2에 나열된 재조합 플라스미드 pCBT1-ΔdppA, pCBT1-ΔpepA, pCBT1-ΔpepB, pCBT1-ΔpepD, pCBT1-ΔpepN, pCBT1-ΔglsA, pCBT1-ΔglsB 를 구축하였다.
중합효소는 KOD OneTM 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭조건은 98℃에서 1분간 변성 후, 98℃ 10초 변성, 55℃ 5초 어닐링, 68℃ 3초 중합을 29회 반복한 후, 72℃에서 1분간 중합반응을 수행하였다. 깁슨 어셈블리를 이용한 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 정제된 각 유전자 단편들을 혼합한 후 50℃에서 1시간 반응하여 수행하였다.
상기 구축된 각각의 재조합 플라스미드 pCBT1-ΔdppA, pCBT1-ΔpepA, pCBT1-ΔpepB, pCBT1-ΔpepD, pCBT1-ΔpepN, pCBT1-ΔglsA, pCBT1-ΔglsB 벡터를 전기천공법으로 E. coli BL21 (DE3) 균주에 순차적으로 형질전환 후, 2차 교차과정을 거쳐 dppA, pepA, pepB, pepD, pepN, glsA, glsb가 결손된 균주를 제작하였으며, 이를 CE11EC007로 명명하였다. 해당 유전자적 조작은 표 2에 나열된 프라이머를 이용한 PCR 법을 통하여 확인하였다.
타겟 유전자 프라이머 방향 서열 (5' -> 3') 서열
번호
dppA
업스트림		 정방향 CCGGGCTGCAGGAATTCGATCACCAGAAGATAGGCATTGAATAAC 3
역방향 ATTGGAGCAGAATAAGTACTTTAAAAGCCATACAAGACTGATGG 4
dppA
다운스트림		 정방향 TGTATGGCTTTTAAAGTACTTATTCTGCTCCAATTGTGATGTTTG 5
역방향 GCTAGGTCGACTAGCGTGATCACCGACCAAATTCGAAAAG 6
pepA
업스트림		 정방향 CCGGGCTGCAGGAATTCGATGTTGTTTCAGAGAATCTTCATAAGGAAC 7
역방향 CAGGAGCGTAGTGCAGTACTTTGCGTCAGGCAAGGCTG 8
pepA
다운스트림		 정방향 CTTGCCTGACGCAAAGTACTGCACTACGCTCCTGAATC 9
역방향 GCTAGGTCGACTAGCGTGATCATTAGTCGCTTGCTGGAATTG 10
pepB
업스트림		 정방향 CCGGGCTGCAGGAATTCGATGTAAATTAGGCTGTGCCTCTTC 11
역방향 TAAGGATAACTAAAAGTACTACTAATATGCCGGATGCG 12
pepB
다운스트림		 정방향 CCGGCATATTAGTAGTACTTTTAGTTATCCTTATTCGTTTAACAGC 13
역방향 GCTAGGTCGACTAGCGTGATCGTAGACAAACAAACCCAGG 14
pepD
업스트림		 정방향 CCGGGCTGCAGGAATTCGATGTGGATCGAGAGTTTAGCGATC 15
역방향 CAAGGAGACTTAACAGTACTTTATTTGATTTGCTGCCGGATG 16
pepD
다운스트림		 정방향 AGCAAATCAAATAAAGTACTGTTAAGTCTCCTTGTCGATCAC 17
역방향 GCTAGGTCGACTAGCGTGATGATTAGCGACCGGAGATTG 18
pepN
업스트림		 정방향 CCGGGCTGCAGGAATTCGATGATGGAAGCGCGACATATC 19
역방향 CATTCGGTTATTTAAGTACTAAATAACCTTTAGCATCTTTTATAGAGTC 20
pepN
다운스트림		 정방향 GCTAAAGGTTATTTAGTACTTAAATAACCGAATGGCGGCAATAG 21
역방향 GCTAGGTCGACTAGCGTGATGCAGTAAGCAAACATTACGC 22
glsA
업스트림		 정방향 CCGGGCTGCAGGAATTCGATCACCGCCTGCACTAAATC 23
역방향 GTTCATCATGAAGTACTCTTTTGTTAACTCCTTTTTATAGATGC 24
glsA
다운스트림		 정방향 GAGTTAACAAAAGAGTACTTCATGATGAACACGGAAGGTAATAAC 25
역방향 GCTAGGTCGACTAGCGTGATCAGCGAGATATAAAGCAACGTG 26
glsB
업스트림		 정방향 CCGGGCTGCAGGAATTCGATCATTCGGTGGTTATGGCATC 27
역방향 TCCAGGAGTAGAAAAGTACTTGCAGTCTCTCGATCCAC 28
glsB
다운스트림		 정방향 ATCGAGAGACTGCAAGTACTTTTCTACTCCTGGACCGCAG 29
역방향 CTAGCTAGGTCGACTAGCGTGATGATCCGTTTATTGTGCTTAACG 30
타겟 유전자 프라이머 방향 서열 (5' -> 3') 서열
번호
dppA 정방향 GAAACCAGCATGATCAGCATC 31
역방향 CACGAAGTGGCGAGTAATC 32
pepA 정방향 CACGCGGTAGGCTTTATAG 33
역방향 AATTTGCGCGAGGAACAC 34
pepB 정방향 GATATCACCATCGGCTTCAATG 35
역방향 CGATGATGTTGACGCCATC 36
pepD 정방향 CCTTATCCGATGCGGTATTTAC 37
역방향 GTAACCTGCCTGAAGTTAAAAAG 38
pepN 정방향 GCTTAACGATGGTTTCTTGTACTTC 39
역방향 GTATGAATACTGCTCGTCTGAAC 40
glsA 정방향 GTTTCTTGCTGGCGCTC 41
역방향 CGACGATCACATAACCCACATG 42
glsB 정방향 GATAGCCAGTGAAACCAGTC 43
역방향 CTGAAAAAATGCGTACTGGAAC 44
1-2. 스핑고박테리움(Sphingobacterium_sp.) 유래의 알파-아미노산 에스테르 아실기 전이효소(α-Amino acid ester acyltransferase)와 신규 알파-아미노산 에스터 아실기 전이효소 유전자의 클로닝
선행 특허에서 사용된 스핑고박테리움(Sphingobacterium sp.) 유래의 알파-아미노산 에스터 아실기전이효소(α-Amino acid ester acyltransferase)를 암호화 하는 유전자와 신규 알파-아미노산 에스터 아실기 전이효소를 암호화 하는 F0358_12975 유전자를 합성하여, pET28a 벡터에 도입함으로써, 2종의 플라스미드를 구축하였고, 이들을 각각 pSAET와 pCutisAET로 명명하였다. 표 3은 선행 특허(대한민국 등록특허 제10-0762730호)에서 사용되었던 SAET와 F0358_12975의 아미노산 서열이다.
효소 명 아미노산 서열 서열
번호
CutisAET MSGLSFAQDVKADSLYVRQHYDKIEQLIPMRDGTKLFTAIYMPKDKSKNYPVLLNRTPYT
VAPYGADAYKKSLGNFPAEMREGFIFVYQDVRGRWMSEGEFEDVRPVNKSKNKKAIDETT
DTYDTLEWLSKNMKNYNQKAGIYGISYPGFYSTMSLINSHPTLKAVSPQAPVTNWYLGDD
FHHNGVLFLNDSFKFMSSFGVKRPQPITPDKGPKSFEYPIKDNYRFYLEGGSVKELKNTY
FQDNIKFYNDLFAHPDYDQFWQDRNPLPHLTHVKPAVMTVGGFFDAEDAYGAFETYKAIE
KQNPNATNILVAGPWFHGGWVRAKGDTFGDMQFGSSTGEYYQQQIELPFFNYYLKDKGDF
KPTEARIFITGSNEWKQFETWPPKNSSTKKMFLQANGKIAFNQSNTATFDEYVSDPNHPV
PYQEGVLETRSREYMVDDQRFASTRPDVMVYQTDVLTEDITVTGPVINHLFVSSTGTDAD
YVVKLIDVYPEDTPKFNEKLMAGYQNLIRAEIMRAKYRNSFEKPEAMIPNQKTSVMYTMP
DVGHTFKKGHRIMIQVQNTWFPLADRNPQQFMNVYEATAKDFLKQTQRIYHDSFIEIPVL
NK		 1
SAET MKNTISCLTLALLSASQLHAQTAADSAYVRDHYEKTEVAIPMRDGKKLFTAIYSPKDKSK
KYPVLLNRTPYTVSPYGQNEYKKSLGNFPQMMREGYIFVYQDVRGKWMSEGDFEDIRPTT
YSKDKKAIDESTDTYDALEWLQKNLKNYNGKAGLYGISYPGFYSTVGLVKTHPSLKAVSP
QAPVTDWYIGDDFHHNGVLFLQDAFTFMSTFGVPRPKPITPDQFKGKIQIKEADKYNFFA
EAGTARELKEKYFGDSVQFWNDLFKHPDYDDFWKSRVITNSLQEVKPAVMVVGGFFDAED
AYGTFKTYQSIEDKSKKNNSILVAGPWYHGGWVRAEGNYLGDIQFEKKTSITYQEQFEQP
FFKYYLKDEGNFAPSEANIFVSGSNEWKHFEQWPPKNVETKKLYFQPQGKLGFDKVQRTD
SWDEYVTDPNKPVPHQGGVIQNRTREYMVDDQRFAASRPDVMVYQTEPLTEDLTIVGPIK
NFLKVSSTGTDADYVVKLIDVYPNDAASYQGKTMAGYQMMVRGEIMAGKYRNGFDKAQAL
TPGMVEKVNFEMPDVAHTFKKGHRIMVQVQNSWFPLAERNPQVFLAPYTATKADFRKATQ
RIFHDVNNATYIEFSVLKD		 2
1-3. L-알라닐-L-글루타민 생산 균주 구축
상기 실시예 1-2에서 구축된 벡터 pSAET와 pCutisAET를 상기 실시예 1-1에서 제작된 CE11EC007균주에 형질전환하여 L-알라닐-L-글루타민 생산 균주 2종을 획득하였고, 이들 균주를 각각 Ec_SAET와 Ec_CutisAET로 명명하였다.
실시예 2. L-알라닐-L-글루타민 생합성 균주의 생산능 평가
상기 실시예 1에서 제작한 Ec_SAET와 Ec_CutisAET 균주의 L-알라닐-L-글루타민 생산능을 확인하고자 아래의 방법으로 균주를 배양하였다.
먼저, 50 μg/ml 농도의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 배지(Luria-Bertani broth) 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 0.25 ml의 종 배양액을 접종하고 O.D.600 값이 0.4 ~ 0.6이 되었을 때 IPTG (Isopropyl-β-D-thio-galactoside) 0.6 mM을 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 25℃에서 18시간 동안 200 rpm에서 진탕 배양하였으며, 배양 종료 후, 배양액 1 ml을 원심 분리하여 균체를 회수하고, 동량의 PBS (Phosphate-buffered saline (pH 7.0))로 세척하여 효소 반응에 이용하였다.
효소 반응은 50 mM 농도의 알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride)과 100 mM 농도의 글루타민(glutamine)이 첨가된 0.2 M 보레이트 버퍼(Borate buffer)(pH 8.5) 900μl에 상기 방법으로 준비된 습균체 100μl를 첨가함으로써 시작하였다. 효소 반응은 1시간 동안 진행되었으며, 반응 종료 후에 원심분리기를 이용하여 균체를 제거하고, 효소 반응액을 HPLC로 분석하였다. 효소반응 결과는 표 4와 같다.
균주 명 반응온도 (℃) L-알라닐-L-글루타민 전환율(%)*
Ec_SAET 25 26.1
37 14.9
50 0
Ec_CutisAET 25 43.5
37 41.5
50 44.1
* L-알라닐-L-글루타민의 전환율(%)은 아래와 같이 계산하였다.
(생성된 L-알라닐-L-글루타민의 몰 농도 X 100) χ (반응에 투입된 L-알라닌 메틸 에스터 염산염의 몰 농도)
상기 실험 결과, 효소 반응 온도 25℃, 37℃에서 CutisAET는 SAET대비 67%, 그리고 179% 향상된 L-알라닐-L-글루타민 전환율(%)을 보여주었으며(표 4, 도 2, 및 도 3 참조), 특히 반응 온도 50℃에서 CutisAET는 44.1%의 L-알라닐-L-글루타민 전환율(%)을 달성하였지만, SAET은 L-알라닐-L-글루타민을 생산하지 못하였다(표 4 및 도 4 참조).
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법은 L-알라닐-L-글루타민을 효율적으로 합성 및/또는 생산할 수 있으며, 특히 본 발명에 따른 단백질은 고온에서도 L-알라닐-L-글루타민을 합성할 수 있다는 특징이 있어, L-알라닐-L-글루타민 생산에 유용하게 이용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (13)

  1. (a) 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주를 상기 단백질을 생산하는데 적합한 시간 및 조건 하에 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양물에 알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride) 및 글루타민(glutamine)을 혼합하는 단계; 및
    (c) L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)을 수득하는 단계;
    를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine)의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 알파-아미노산 에스테르 아실기 전이효소(α-amino acid ester acyltransferase, AET)인 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 25℃ 내지 50℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 대장균인 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 L-알라닐-L-글루타민의 생합성을 위한 기질을 투여하여 L-알라닐-L-글루타민을 합성하는 단계인 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 대장균은 dppA, pepA, pepB, pepD, pepN, glsA 및 glsB 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 균주는 프로모터(promoter)에 작동 가능하게 연결된 상기 서열번호 1로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 기질은 카르복실기 성분 및 아민 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 카르복실기 성분 및 아민 성분은 50 내지 600 mM의 농도로 투여되는 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 카르복실기 성분은 아미노산 에스테르, 아미노산 아미드 및 L-알라닌 메틸 에스테르 염산염(L-alanine methyl ester hydrochloride)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산 방법.
  11. 서열번호 1로 이루어진 단백질 또는 서열번호 1로 이루어진 단백질을 발현하는 재조합 균주 중 하나 이상을 포함하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단백질은 알파-아미노산 에스테르 아실기 전이효소(α-amino acid ester acyltransferase, AET)인 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산용 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 단백질은 50℃에서도 효소 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine) 생산용 조성물.
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