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WO2025143049A1 - 神経変性疾患の予防及び／又は治療剤 - Google Patents

神経変性疾患の予防及び／又は治療剤 Download PDF

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WO2025143049A1
WO2025143049A1 PCT/JP2024/045989 JP2024045989W WO2025143049A1 WO 2025143049 A1 WO2025143049 A1 WO 2025143049A1 JP 2024045989 W JP2024045989 W JP 2024045989W WO 2025143049 A1 WO2025143049 A1 WO 2025143049A1
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disease
genes
therapeutic agent
preventive
expression
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雅弘 福井
龍一郎 影山
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RIKEN
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits or suppresses, in whole or in part, the expression and/or function of any of the genes listed in Table 1 above, or a protein derived from any of the genes, but preferred examples include the following:
  • the above-mentioned low molecular weight compounds can be found in a compound library, etc., by, for example, the following screening method.
  • a screening method comprising: (1) a step of applying a test substance to neural stem cells and measuring the expression of any of the genes listed in Table 1 above or a protein derived from the gene; and (2) a step of selecting a test substance that has an effect of inhibiting the expression of the gene from the results of step (1).
  • the substances selected by the above screening method are capable of efficiently activating and proliferating neural stem cells to produce a large number of neurons.
  • it is possible to restore neural stem cells in the aged brain to the state they were in when they were adolescent or younger, which is expected to produce a large number of neurons and improve memory and learning abilities.
  • It is also expected to have a therapeutic effect on neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, as it can efficiently activate endogenous neural stem cells to produce a large number of neurons and improve memory and learning abilities.
  • the second embodiment of the preventive and/or therapeutic agent for neurodegenerative diseases of the present invention is characterized in that it contains as an active ingredient a promoter of the expression and/or function of any of the ligand-receptor gene sets listed in Table 2 above, or of each protein derived from any of the gene sets.
  • the ligand-receptor sets listed in Table 2 above are activated downstream of iPaD, as shown in the examples described below. That is, when dormant neural stem cells are activated by iPaD treatment, the secretion of the corresponding ligand of the ligand-receptor set in the hippocampus is increased and activated, which is expected to act on surrounding cells and suppress the deposition of amyloid beta (A ⁇ ).
  • the preventive and/or therapeutic agent for neurodegenerative diseases of the present invention contains as an active ingredient a substance that has an effect of promoting (activating) the expression and/or function of the ligand-receptor set, or any of the ligands or receptors, as in the case of iPaD treatment.
  • nucleic acid sequences of the genes in Table 2 above known sequences can be adopted as the coding region (CDS) of the mRNA sequence of each of the above genes, and for example, the transcript sequence of each gene registered in Ensembl, a base sequence database, can be used.
  • the nucleic acid sequences of the genes in Table 2 in the present invention are identical to the transcript sequences of the genes registered in Ensembl, or have a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more, and the peptides they encode have activity corresponding to each of the genes registered in the Ensembl base sequence database.
  • genes listed in Table 2 above are derived from mammals such as humans, monkeys, pigs, horses, cows, rabbits, sheep, goats, cats, dogs, guinea pigs, and mice, and are preferably derived from humans, monkeys, or mice, with humans being even more preferred.
  • the promoter is not particularly limited as long as it promotes the expression and/or function of any of the genes listed in Table 2 above, or a protein derived from any of the genes.
  • the agent for preventing and/or treating neurodegenerative diseases of the present invention is administered to a subject by lumbar puncture, intraventricular injection, intrathecal bolus injection or infusion, intraganglionic injection, intraneural injection, or subcutaneous injection.
  • the dosage of the agent for preventing and/or treating neurodegenerative diseases of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dosage can be selected depending on various conditions such as the type of disease, the age and symptoms of the patient, the route of administration, the purpose of treatment, and the presence or absence of concomitant medication.
  • Specific diseases for which the preventive and/or therapeutic agent for neurodegenerative diseases of the present invention is effective include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, and dementia caused by frontotemporal lobar degeneration.
  • the preventive and/or therapeutic agent for neurodegenerative diseases of the present invention is preferably used for Alzheimer's disease and Parkinson's disease, from the viewpoint that the effect of the preventive and/or therapeutic agent for neurodegenerative diseases of the present invention can be more effectively obtained.
  • any method known in the art for measuring gene expression, protein expression, and protein activity in various cells may be used.
  • a method may be used in which the expression and/or activity of each gene or each protein is measured in the presence and absence of a test substance, and a judgment is made based on the difference between the presence and absence of the test substance, or the ratio between the two, etc.
  • a test substance that exerts an effect of suppressing the expression of the above genes, or an effect of suppressing the expression or activity of a protein derived from the above genes is selected.
  • the DG-SGZ was analyzed in ⁇ 3 mice in each experiment. The DG region of each mouse was evaluated every 7th section. Immunostaining was performed on all sections except those damaged for labeling. Z-stack images were then captured using a confocal microscope (LSM780 or LSM980) with a 10x or 20x objective. Stained cells were quantified using ImageJ and expressed as the number of cells per mm3 of the DG-SGZ in each image.
  • iPaD enhances neurogenesis and inhibits A ⁇ deposition
  • the hippocampal dentate gyrus of 5-month-old 5XFAD mice was injected with either a control lentivirus or an iPaD lentivirus (Plagl2 overexpression combined with Dyrk1a knockdown; see Non-Patent Document 6 for details) under the control of the Hes5 promoter activated in NSCs (neural stem cells).
  • the hippocampal regions were examined after a set period (4, 8, or 12 weeks post-lentivirus infection (wpi)). Lentivirus-infected NSCs and their progeny became mCherry+ ( Figure 1).
  • ligand-receptor pairs published in CellTalkDB (http://tcm.zju.edu.cn/celltalkdb/) were extracted, and ligand-receptor pairs such as Apoe-Abca1/Trem2, Il33-Il1rl1, Ccl3-Ccr5, C3/Icam1-Itgb2, and Lgals3-Mertk shown in Table 4 below were confirmed to be upregulated downstream of iPaD treatment. These ligand-receptor pairs are known to improve Alzheimer's disease pathology (Salta E.
  • GO term analysis of the downregulated genes included genes involved in cell morphogenesis, extracellular matrix (ECM), and development and growth (Figure 4B). Although some ECM proteins are known to be involved in the pathology of Alzheimer's disease (Sun et al., 2021, Role of the extracellular matrix in Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci 13: 707466), the functional significance of most other genes has not been analyzed. Therefore, we decided to examine whether knockdown of these genes would improve the pathology of Alzheimer's disease using the miR-E backbone shRNA system (Fellmann et al., 2013, An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Rep 5: 1704-1713). The knockdown strategy is shown in Figure 5.
  • Maml2, Rpl29, Ptgds, Ell3, Prkag2, Cspp1, Gfra2, Itpk1, and Mical3 were selected as genes that were widely expressed but most significantly suppressed by iPaD treatment, and the overall knockdown effect on A ⁇ pathology was examined.
  • expression of miR-E backbone shRNA (sequence numbers 1 to 8 in Table 3) for each gene was induced together with mCherry under the control of the elongation factor promoter, a ubiquitous promoter, in the hippocampus of 5XFAD mice, and the effect was examined 8 weeks later (Figure 5).
  • Prkag2 is one of the subunits ( ⁇ subunit 2) that make up AMP-activated protein kinase (AMPK). It is known that AMPK signaling activates autophagy to degrade amyloid ⁇ deposits, reduces lipid droplets, and activates the phagocytic ability of microglia. It is thought that AMPK signaling improves the pathology of Alzheimer's disease through these actions.
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • Prkag2 knockdown was analyzed using a neural stem cell culture system, and AMPK activity was increased (Figure 9).
  • AMPK activity was increased.
  • the expression changes of other AMPK subunits were examined using qPCR.
  • knockdown of Prkag2 significantly increases the expression of many subunits (catalytic subunits Prkaa1 and Prkaa2, structural subunit Prkab1, and regulatory subunit Prkkag1) ( Figure 10), which is thought to increase AMPK activity. Therefore, it is thought that Prkag2 knockdown improves the pathology of Alzheimer's disease by activating AMPK signaling.
  • iPaD activates AMPK signaling in the surrounding area by activating neural stem cells.
  • neural stem cells activated by iPaD and the new neurons differentiated from them secrete AMPK activating factors we searched for secretory factors and receptors involved in AMPK signaling among the genes activated by iPaD.
  • Adipoq-Adipor2, Il33-Il1rl1, and Il17a-Il17rc were identified ( Figure 12).
  • iPaD was applied to a neural stem cell culture system, the expression of Adipoq, Il33, and Il17a was increased ( Figure 13). Therefore, it was thought that iPaD increases the production of Adipoq, Il33, and Il17a in neural stem cells, activates AMPK signaling in the surrounding area, and improves amyloid pathology.
  • Prkag2 is one of the regulatory subunits of AMP-activated kinase (AMPK), which regulates cellular energy metabolism. It has been reported that Prkag2 expression is upregulated in postmortem brains of Alzheimer's disease patients (Bharadwaj and Martins 2020, PRKAG2 gene expression is elevated and its protein levels are associated with increased Amyloid- ⁇ accumulation in the Alzheimer's disease brain. J Alzheimers Dis 74: 441-448), but it was unclear whether this upregulation contributed to A ⁇ pathology or simply responded to alleviate the pathology. We found that knockdown of Prkag2 most effectively suppressed A ⁇ deposition in 5XFAD mice, suggesting that downregulation of Prkag2 expression improves A ⁇ pathology not only in mice but also in humans.
  • AMPK AMP-activated kinase
  • Maml proteins are involved in the regulation of the Notch signaling factor RBPj (Lin et al., 2002, Identification of new human mastermind proteins defines a family that consists of positive regulators for notch signaling. J Biol Chem 277: 50612-50620;Wu et al., 2002, Identification of a family of mastermind-like transcriptional coactivator Maml2 is a family of three coactivators for various transcription factors, including MEF2C (Shen et. al., 2006, The Notch coactivator, MAML1, functions as a novel coactivator for MEF2C-mediated transcription and is required for normal myogenesis. Genes Dev 20: 675-688.).

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Abstract

本発明は、成体脳において新生ニューロン数を増やす新規の、神経変性疾患の予防及び／又は治療剤を提供することを目的とする。　本発明は、下記表１に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質、の阻害剤を有効成分とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療剤である。

Description

神経変性疾患の予防及び／又は治療剤
　本発明は、成体脳における神経新生の活性化とアミロイドβ沈着抑制のための新規な方法、並びにこの方法を用いた神経変性疾患の予防及び／又は治療剤に関する。
　ヒトを含めた哺乳類成体脳においても神経幹細胞や神経前駆細胞が絶対数は少ないものの存在し、脳の領域によっては神経新生を行っていることが明らかになってきている。しかし、成体脳の神経幹細胞の大部分は静止状態であり増殖能やニューロン産生能は低い。この増殖能やニューロン産生能は加齢とともにさらに低くなるため、老化脳で新たに生まれるニューロン（新生ニューロン）はほとんど存在しない。新生ニューロンの著しい減少は認知症といった脳機能低下や、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患の原因とも考えられている。
　そのような状況下、成体脳にわずかに存在する神経幹細胞、神経前駆細胞を、成長因子等の刺激により増幅、分化させ、機能回復を促そうとする試みが行われている（非特許文献１参照）。しかし、その効果は十分とは言えない。また、胎児脳やES細胞及びiPS細胞由来の神経幹細胞、神経前駆細胞を用いた細胞移植治療モデルの研究も盛んに行われているが、脳における細胞移植治療は、正常な神経回路網の再構築が可能かどうかも明らかではなく、副作用のリスクも大きい。さらに、これまで成体脳における新生ニューロン数を増やす多くの試みがなされてきたが、その効果はまだ限定的である（非特許文献１～５参照）。
　一方、本願発明者らは以前に、すでに増殖能や神経形成能を失っている老化した神経幹細胞が、ジンクフィンガー転写因子遺伝子Plagl2の発現を誘導し、ダウン症候群（老化を促進することが知られている遺伝性疾患）に関連する遺伝子であるDyrk1aの活性を阻害することで機能的に若返り、そのように若返った神経幹細胞が幼若海馬で観察されるレベルで連続的に増殖し、新しいニューロンを産生し、認知を改善することを示した。また、この治療がアルツハイマー病モデルマウスである5XFADマウスにおいて神経新生を活性化し、Aβ沈着を減少させ、認知を改善することを見出した（非特許文献６、特許文献１）。
国際公開公報２０２２／１８６０８９
Nagahara AH et al. (2009) Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor in rodent and primate models of Alzheimer's disease, Nat.Med.,vol.15(3),pp.331-337. Henriette van Praag et al.,Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice,J Neurosci.,2005 Sep 21;25(38):8680-5 Benedetta Artegiani et al.,Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse brain. J Exp Med.2011 May 9;208(5):937-48 Benraiss, A.et al.(2013) Mobilization of endogenous progenitor cells regenerates functionally-integrated medium spiny striopallidal projection neurons and delays disease progression in a transgenic model of Huntington's disease. Cell Stem Cell 12, 787-799 Berdugo-Vega, G.et al.(2020). Increasing neurogenesis refines hippocampal activity rejuvenating navigational learning strategies and contextual memory throughout life. Nat. Commun. 11, 135 Kaise, T.et.al., (2022) Functional rejuvenation of aged neural stem cells by Plagl2 and anti-Dyrk1a activity. Genes Dev 36: 23-37
　本発明は、成体脳における神経新生の活性化とアミロイド-β（Aβ）沈着抑制のための新規な方法を提供すること、並びにこの方法を用いた神経変性疾患の予防及び／又は治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは以前に、アルツハイマー病モデルマウスである5XFADマウスにおいて、Plagl2発現誘導活性及び抗Dyrk1a活性を有するレンチウイルス（iPaD）を投与すると、成体脳における神経新生が効率的に活性化され、アミロイド-β（Aβ）沈着が減少し、認知機能が改善することを示していた。この研究結果に基づき、さらに研究を進め、5XFADマウスにおけるiPaD処理の下流イベントを調べたところ、グローバルなRNA-seqと機能解析により、5XFADマウスに対しiPaD処理を行うことで、特定の遺伝子発現が有意に減少すること、及び特定の遺伝子（リガンド－受容体の組み合わせ）の発現が有意に増強することを明らかにした。さらに、iPaD処理で発現が減少した上記特定の遺伝子のうち、Prkag2（protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2）、Maml2（Mastermind2）、Gfra2（glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha-2）、Rpl29（ribosomal protein L29）をそれぞれノックダウンしたところ、成体脳における神経新生が効率的に活性化され、アミロイド-β（Aβ）の沈着が減少するという結果を得た。成体脳における神経新生の活性化は、加齢に関連した認知機能障害や神経変性疾患を改善する可能性があることから、Prkag2、Gfra2、Maml2および/またはRpl29のノックダウンは、アルツハイマー病を含むこのような神経変性疾患の治療戦略として有望であることが強く示唆された。
　即ち、本発明は、iPaD処理の下流で発現が低下することが明らかになった特定の遺伝子をターゲットとし、これらの発現を制御することでアルツハイマー病等の神経変性疾患の予防及び治療を可能とする核酸医薬等に関する発明である。即ち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］下記表１に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質、の阻害剤を有効成分とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［２］上記阻害剤が、
（Ａ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するmiR-shRNA（microRNA adapted short hairpin RNA）の核酸配列、及び上記核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを有するベクター、
（Ｂ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するsiRNA、shRNA、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に由来するタンパク質に対する抗体、又は
（Ｄ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子又はそれに由来するタンパク質の、発現及び／又は機能に対して阻害効果を有する低分子化合物
である、［１］に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
［３］上記遺伝子が、哺乳類の遺伝子である、［１］又は［２］に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
［４］上記ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はプラスミドベクターである、［２］又は［３］に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
［５］腰椎穿刺によって投与される、［１］から［４］のいずれかに記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
［６］下記表２に記載のいずれかのリガンド－受容体の遺伝子セット、若しくはいずれかの遺伝子セットに由来するタンパク質、
の発現及び／又は機能の促進剤を有効成分とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［７］上記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び前頭側頭葉変性症に起因する認知症から成る群より選択される少なくとも１種である、［１］から［６］のいずれかに記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
［８］上記神経変性疾患が、アルツハイマー病、及びパーキンソン病から成る群より選択される少なくとも１種である、［１］から［６］のいずれかに記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
［９］上記神経変性疾患が、アルツハイマー病である、［１］から［６］のいずれかに記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
　本発明によると、上記特定の遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の発現を抑制、阻害することで、成体脳における神経新生を効率的に活性化し、アミロイド-βの沈着を減少させることができる。このような成体脳における神経新生の活性化、アミロイド-βの沈着減少は、加齢に関連した認知機能障害や神経変性疾患の改善に繋がると考えられることから、Prkag2、Gfra2、Maml2、Rpl29等の上記特定の遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質のノックダウンは、アルツハイマー病を含む神経変性疾患の治療戦略として有望であることが強く示唆された。
図１Ａは、iPaD処理によるアルツハイマー病モデルマウス脳における神経新生の長期的活性化を示す図である。コントロールまたはiPaDレンチウイルスを5ヶ月齢の5XFADマウスの海馬歯状回に注入し、その後の段階（感染後4、8、12週（wpi））で脳切片を免疫組織化学的に調べた。MCM2+細胞の定量データを下段に、4wpiにおけるMCM2の発現を上段に示す。レンチウイルスに感染したNSCsとその子孫細胞はmCherry+である。iPaD処理により、MCM2+活性化NSCsの数がコントロールに比べて増加した。N = 4. 図１Ｂは、図１Ａと同じ実験におけるDCX+細胞の定量データを下段に、4wpiにおけるDCXの発現を上段に示したものである。レンチウイルスに感染したNSCsとその子孫細胞はmCherry+である。iPaD処理により、DCX+新生神経芽細胞の数がコントロールに比べて増加した。N = 4. 図２は、iPaD処理によるアルツハイマー病モデルマウス脳におけるAβ沈着の抑制効果を示す図である。コントロールまたはiPaDレンチウイルスを5ヶ月齢の5XFADマウスの海馬歯状回に注入し、その後の段階（4、8、12wpi）で脳切片を免疫組織化学的に調べた。Aβ沈着の定量化データを右側に示す。iPaD処理はAβ沈着を減少させた。N = 4. 図３は、iPaD処理によりマウス海馬において発現上昇又は発現低下した遺伝子を示す図である。コントロールまたはiPaDレンチウイルスを5ヶ月齢の5XFADマウスの海馬歯状回に注入し、4週間後（4wpi）に海馬を単離し、RNA-seq解析に供した。5XFADマウスの海馬では、iPaD処理によって多くの遺伝子が有意に発現上昇又は発現低下した（p値＜0.05）。 図４Ａは、5XFADマウスの海馬において、iPaD処理により有意に発現が上昇した592遺伝子のジーンオントロジー（GO）解析の結果を示す図である。 図４Ｂは、5XFADマウスの海馬において、iPaD処理により有意に発現が低下した462遺伝子のジーンオントロジー（GO）解析の結果を示す図である。 図５は、ユビキタスプロモーターである伸長因子プロモーター（ｐEFS）の制御下にmCherryと核局在化シグナル（3NLS）を3回繰り返すmiR-EバックボーンshRNAシステムを用いたノックダウン戦略を示す図である。このノックダウンシステムはレンチウイルスを用いて5XFADマウスの海馬歯状回に導入された。 図６Ａは、5XFADマウスにおけるMaml2、Ptgds、Ell3、Prkag2、Rpl29、Gfra2、Itpk1、Mical3のノックダウンによる神経新生を比較した図であり、各遺伝子のノックダウンまたはコントロール（Control）のレンチウイルスを5-6ヵ月齢の5XFADマウスに投与し、8週間後に脳を調べた結果を示す。Prkag2のノックダウンが最も効果的に神経新生を活性化した。N = 4. 図６Ｂは、図６Ａと同じ実験における、DCX+細胞の定量データを示す。Prkag2のノックダウンが最も効果的に神経新生を活性化した。N = 4. 図７Ａは、5XFADマウスにおけるMaml2、Ptgds、Ell3、Prkag2、Rpl29、Gfra2、Itpk1、Mical3のノックダウンによるAβの沈着減少効果を示す図であり、各遺伝子のノックダウンまたはコントロール（Ctr）のレンチウイルスを5-6ヵ月齢の5XFADマウスに投与し、8週間後に脳を調べた結果を示す。Prkag2とGfra2のノックダウンが最も効果的にAβ沈着を減少させた。N = 4. 図７Ｂは、図７Ａと同じ実験における、Aβ沈着の定量データを示す。Prkag2とGfra2のノックダウンが最も効果的にAβ沈着を減少させた。N = 4. 図８は、４ヶ月齢マウス（野生型及び5XFAD）と８ヶ月齢マウス（5XFAD）における脂肪滴（BODIPYの白い点々）および活性型AMPK（pAMPKの白い点々）の組織染色画像を示す図である。 図９は、培養神経幹細胞にPrkag2ノックダウン・レンチウイルス（Prkag2 shRNA）あるいはコントロール・レンチウイルス（Control）を感染させて２日後に細胞抽出物を回収し、Western blot法で細胞抽出物のpAMPK量を測定した結果を示す図である。 図１０は、図９と同様に得た細胞抽出物について、qPCR法で各AMPKサブユニットのmRNA量を測定した結果を示す図である。 図１１は、培養神経幹細胞にPrkag2ノックダウン（Prkag2 shRNA）、Maml2ノックダウン（Maml2 shRNA）レンチウイルスあるいはコントロール・レンチウイルス（Control）を感染させて２日後にEdU取込み細胞を定量した結果を示す図である。 図１２は、iPaDで活性化する遺伝子群の中でAMPKシグナルに関わる分泌因子・受容体ペアの探索を行った結果を模式的に示す図である。その結果、Adipoq-Adipor2、Il33-Il1rl1、Il17a-Il17rcのペアが同定された。 図１３は、培養神経幹細胞にiPaDレンチウイルス（iPaD）あるいはコントロール・レンチウイルス（Control）を感染させて２日後に細胞抽出物を回収し、qPCR法でAMPKシグナルに関わる分泌因子のmRNA量を測定した結果を示す図である。
　以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、分子生物学的手法は、特に明記しない限り当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
　本発明者らは以前に、アルツハイマー病モデルマウスである5XFADマウスにおいて、Plagl2発現誘導及び抗Dyrk1a活性を有するレンチウイルス（iPaD）を投与すると、成体脳における神経新生が効率的に活性化され、アミロイド-β沈着が減少し、認知機能が改善することを示していた。この研究結果に基づき、さらに研究を進め、5XFADマウスにおけるiPaD処理の下流イベントを調べたところ、グローバルなRNA-seqと機能解析により、5XFADマウスに対しiPaD処理を行うことで、下記表１に示す特定の遺伝子発現が有意に減少すること、及び下記表２に示す特定の遺伝子（リガンド－受容体の組み合わせ）の発現が有意に増強することが明らかになった。iPaD処理で発現が減少した上記特定の遺伝子のうち、Prkag2（protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2）、Maml2（mastermind like transcriptional coactivator 2）、Gfra2（glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha-2）、Rpl29（ribosomal protein L29）をそれぞれノックダウンしたところ、成体脳における神経新生が効率的に活性化され、アミロイド-βの沈着が減少するという結果を得た。成体脳における神経新生の活性化は、加齢に関連した認知機能障害や神経変性疾患を改善する可能性があることから、Prkag2、Maml2のような、上記表１に示す特定の遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の阻害剤、また、上記表２に示す特定のリガンド－受容体の遺伝子セット、若しくはいずれかの遺伝子セットに由来するタンパク質の発現及び／又は機能の促進剤は、アルツハイマー病を含む神経変性疾患の治療戦略として有望であることが強く示唆された。
＜神経変性疾患の予防及び／又は治療剤＞
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤の第１の実施形態は、上記表１に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の阻害剤を有効成分とすることを特徴とする。また、本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤の第２の実施形態は、上記表２に記載のいずれかのリガンド－受容体の遺伝子セット、若しくはいずれかの遺伝子セットに由来するそれぞれのタンパク質の発現及び／又は機能の促進剤を有効成分とすることを特徴とする。以下にそれぞれの実施形態について説明する。
［第１の実施形態］
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤の第１の実施形態は、上記表１に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の阻害剤を有効成分とすることを特徴とする。
　上記表１の遺伝子の核酸配列としては、上記の各遺伝子のmRNA配列のコーディング領域（CDS）として既知の配列を採用することができ、例えば遺伝子データベースであるEnsemblに登録されている各遺伝子のTranscript sequenceを使用できる。本発明における表１の遺伝子の核酸配列としては、Ensemblに登録されている当該遺伝子のTranscript sequenceと同一、又は８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、且つこれらがコードするタンパク質が、Ensemblの塩基配列データベース等に登録されているそれぞれの遺伝子に対応する活性を有するものである。
　上記表１に記載の遺伝子の由来は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、モルモット、マウス等の哺乳類であり、中でもヒト、サル、マウス由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
　上記阻害剤は、上記表１に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の発現及び／又は機能の、一部又は全部を阻害、抑制するものであれば特に限定されないが、例えば以下のようなものが好ましい例として挙げられる。
（Ａ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するmiR-shRNA（microRNA adapted short hairpin RNA）の核酸配列、及び上記核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを有するベクター
（Ｂ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するsiRNA、shRNA、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド
（Ｃ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に由来するタンパク質に対する抗体
（Ｄ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子又はそれに由来するタンパク質の、発現及び／又は機能に対して阻害効果を有する低分子化合物
　以下に、それぞれについて説明する。
（Ａ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するmiR-shRNA（microRNA adapted short hairpin RNA）の核酸配列、及び上記核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを有するベクター
　上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するmiR-shRNA（microRNA adapted short hairpin RNA）とは、上記遺伝子の発現を抑制することができるshRNA（RNA干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のRNA配列）のひとつである。shRNAは、生体内でDicerにより分解を受けてsiRNAを生成することができるRNAである。shRNAは、二本鎖のステムとヘアピンループを含むステムループ構造を有する。このヘアピンループ部分の配列は特に限定されないが、５～１２塩基の配列とすることができる（Kawasaki H. et. al., Nucleic Acid Res. (2003) 31: 700-707）。miR-shRNAは、miRNA経路に適応されたshRNAであり、RNAポリメラーゼIIにより発現し、DroshaとDicer両方により切断されて作用する。このようなmiR-shRNAとしては、上記遺伝子の発現を抑制することができる核酸配列を有するものであれば特に限定されず、当業者に周知の方法により上記表１に示す遺伝子配列を元に設計し、適宜製造することができる。
　本実施形態においては、上記miR-shRNAの核酸配列にはプロモーター配列が作動可能に連結されている。ここで、「作動可能に連結されたプロモーター配列」におけるプロモーター配列としては、神経幹細胞等の神経系細胞内で機能するプロモーター配列を採用できる。このようなプロモーター配列としては、例えば神経幹細胞で機能するHes5プロモーター、GFAPプロモーター、Sox2プロモーター、Lfngプロモーター、U6プロモーター、H1プロモーター等が挙げられる。
　ここで「作動可能に連結されている」とは、記載される成分が、その意図された方式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）と目的のポリヌクレオチド配列との間の機能的連結を指し、直接連結、間接連結（間に別のポリヌクレオチド配列が介在する場合）でもよい。本開示においては、プロモーター配列が、連結した目的のmiR-shRNA（microRNA adapted short hairpin RNA）の核酸配列の転写を導く。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体を意味する。本明細書において、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」又は「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）の配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント」といった場合には、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及び／又はＴによって示される配列を含むポリヌクレオチド又はその断片部分を意味する。
　本発明において、ポリヌクレオチドは、さらに、mRNAの転写、タンパク質への翻訳などを補助するエンハンサー配列、Kozak配列、適切なポリアデニル化シグナル配列などの公知の配列を含んでもよい。
　本発明において、ポリヌクレオチドを神経幹細胞等のターゲット細胞に導入するための構成は特に限定されないが、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体等のベクターを用いる方法、又はリポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション等の手法を挙げることができる。
　本実施形態のポリヌクレオチドをターゲット細胞に導入する際には、上記のうち、ベクターを用いることが好ましい。本発明において用いられるベクターとしては、ターゲット細胞（神経幹細胞等）に効率的に遺伝子を送達できるベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、単純ヘルペスウイルスベクター）、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、パポーバウイルスベクター（例えば、SV40）等のウイルスベクター；プラスミドベクター；ファージミドベクター；コスミドベクター；ラムダファージ、M13ファージ等のバクテリオファージ等が挙げられる。これらのうち、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、プラスミドベクターが好ましく、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターがより好ましく、レンチウイルスベクターがさらに好ましい。
　具体的な発現ベクターの例としては、哺乳動物細胞でのレンチウイルス媒介性遺伝子導入及び発現用のpLenti4/V5-DEST（商標）、pLenti6/V5-DEST（商標）及びpLenti6.2/V5-GW/lacZ（Invitrogen）；哺乳動物細胞での発現用のpClneoベクター（Promega）等が挙げられる。
　ベクターには、目的の遺伝子が発現可能なように、上述のプロモーター、エンハンサーの他、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイト等の制御配列を含むことができる。また、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子等の選択マーカー配列、mCherry（赤色蛍光タンパク質）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAG等のレポーター遺伝子配列等を含むことができる。
　本実施形態のmiR-shRNA及び上記プロモーター等を含むベクターをターゲットである神経幹細胞、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等に導入して形質転換させると、上記表１に記載の遺伝子をノックダウンすることができる。このように形質転換された神経幹細胞等のターゲット細胞は、活性化して増殖し、多数のニューロンを生み出す等、細胞の機能を十分発揮するように分化することができる。本実施形態の上記ベクターは、成体脳、加齢脳、疾患脳等に内在する神経幹細胞等に対して好適に使用され得る。
（Ｂ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するsiRNA、shRNA、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤が含有する阻害剤としては、上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（small hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、dsRNA（double-stranded RNA）、miRNA（microRNA）等が挙げられる。本発明の効果の観点からは、これらのうち、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。
　siRNAとは、標的遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列又はその部分配列（標的ヌクレオチド配列）と相補的な配列を有するRNAとその相補鎖とからなる２本鎖オリゴRNAである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖ＲＮＡであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２重鎖構造を形成するRNA（shRNA）や、第１の配列と第２の配列の２重鎖構造の両末端をループ構造で閉環状にしたダンベル型の核酸もsiRNAに含まれる。
　siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は双方の５’末端又は３’末端にオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングとは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の末端における１～数個（例えば、１、２、３個）の塩基の付加により形成されるものである。siRNAの塩基長は、RNA干渉を誘導できる限り特に制限されず、例えば、片側鎖として１０～５０塩基、１５～３０塩基、又は２１～２７塩基である。
　siRNAは、上記表１に記載の遺伝子に対応するmRNAを標的とするsiRNAであって、当該mRNAの塩基配列の情報を基に設計することが可能であり、RNA干渉を誘導できる限り配列は特に限定されない。siRNAは、公知の手法を用いて、化学的に合成すること、又は遺伝子組換え技術を用いて産生することができる。
　shRNAとは、生体内でDicerにより分解を受けてsiRNAを生成することができるRNAである。shRNAは、二本鎖のステムとヘアピンループを含むステムループ構造を有する。このヘアピンループ部分の配列は特に限定されないが、５～１２塩基の配列とすることができる（Kawasaki H. et. al., Nucleic Acid Res. (2003) 31: 700-707）。ここに記載するshRNAは、上述の（Ａ）におけるmiR-shRNA以外のshRNAを指し、Simple-stem-loop-based shRNAに分類されるものである。このshRNAはRNAポリメラーゼIIIにより発現し、Dicerにより切断され、作用する。このようなshRNAは、当業者に周知の方法により上記表１に示す遺伝子配列を元に設計し、製造することができる。
　アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンス核酸）の配列は、標的遺伝子又はその一部と相補的な配列であることが望ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限り、完全に相補的である必要はなく、標的遺伝子の転写産物に対して、好ましくは９０％以上の相補性、より好ましくは９５％以上の相補性を有していればよい。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するため、アンチセンス核酸の長さは１５塩基以上が好ましい。さらに、非特異的な影響を回避するため標的遺伝子の異なる配列に相補的な複数のアンチセンス核酸を用いるのが好ましい。アンチセンス核酸としては、標的遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明におけるアンチセンス核酸に含まれる。
　dsRNAは、RNAi効果を有するものであり、上記表１に記載の遺伝子に対応するmRNAにおける連続する任意のRNA領域と同一の配列からなるセンスRNA、及び当該センスRNAに相補的な配列からなるアンチセンスRNAからなるdsRNAである。上記「連続する任意のRNA領域」の長さは、通常２０～３０塩基であり、好ましくは２１～２３塩基である。
　miRNAは、ヘアピン様構造のRNA前駆体として転写され、RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素により切断され、RISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与する１５～２５塩基の非コーディングRNAを意味する。本発明におけるmiRNAには、当該miRNAの前駆体（pre-miRNA、pri-miRNA）も包含する。
　これらのsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（small hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、dsRNA（double-stranded RNA）、miRNA（microRNA）等としては、これらを発現する発現ベクターを使用することもできる。なお、発現ベクターとする場合には、上記目的の遺伝子が発現可能なように、当該ベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含むことができる。また、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子等の選択マーカー配列、mCherry（赤色蛍光タンパク質）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAG等のレポーター遺伝子配列等を含むことができる。
（Ｃ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に由来するタンパク質に対する抗体
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤が含有する阻害剤としては、上記表１に記載のいずれかの遺伝子に由来するタンパク質に対する抗体が挙げられる。上記遺伝子に由来するタンパク質とは、上記遺伝子がコードするアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。上記阻害剤としては、上記遺伝子に由来するタンパク質、上記遺伝子がコードするアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体であって、このタンパク質の機能を阻害、抑制、低減させるものが好ましい。
　本発明において、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的または部分的にコードされる、１または複数のポリペプチドを含むタンパク質を意味し、抗原上の特定のエピトープに結合可能な分子または複数の分子を含む。本発明において、前記「抗体」の形態は、全長の免疫グロブリン（Fc領域およびFab領域を有する抗体、全長抗体）でもよいし、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv抗体（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Fv（dsFv）、一本鎖抗体（scFv）、およびこれらの重合体（例えば、ダイアボディー）等があげられる。前記抗体は、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。前記抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト化抗体でもよい。前記抗体は、例えば、二重特異性またはオリゴ特異性（oligo specific）抗体であってもよい。これらの抗体は、当業者に従来公知の方法により製造することができる。
（Ｄ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子又はそれに由来するタンパク質の、発現及び／又は機能に対して阻害効果を有する低分子化合物
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤が含有する阻害剤としては、上記表１に記載のいずれかの遺伝子又はそれに由来するタンパク質の発現及び／又は機能に対して阻害効果を有する低分子化合物が挙げられる。
　上記低分子化合物は、化合物ライブラリー等の中から、例えば次のようなスクリーニング方法によって見出すことができる。
（１）神経幹細胞に被験物質を作用させ、上記表１に記載のいずれかの遺伝子又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現を測定する工程、及び
（２）上記工程（１）の結果から、上記遺伝子の発現抑制効果を奏する被験物質を選定する工程を含むスクリーニング方法。
　上記スクリーニング方法によって選定された物質は、神経幹細胞を効率良く活性化して増殖させ、多数のニューロンを生み出すことが可能である。そのため、老齢脳における神経幹細胞を青年期かそれ以上に若い時期の状態に戻すことができ、多数のニューロンを生み出し、記憶や学習能力を改善することが期待できる。また、アルツハイマー病等の神経変性疾患への治療効果も期待でき、内在する神経幹細胞が効率良く活性化して多数のニューロンを生み出し、記憶・学習能力を改善することができる。
［第２の実施形態］
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤の第２の実施形態は、上記表２に記載のいずれかのリガンド－受容体の遺伝子セット、若しくはいずれかの遺伝子セットに由来するそれぞれのタンパク質の発現及び／又は機能の促進剤を有効成分とすることを特徴とする。上記表２に記載のリガンド－受容体のセットは、後述の実施例で示すとおり、iPaDの下流で活性化されるものである。すなわち、休眠状態の神経幹細胞がiPaD処置により活性化されると、海馬における上記リガンド－受容体のセットの該当リガンドの分泌の増加、活性化がおこり、周囲の細胞に作用し、アミロイドβ（Aβ）の沈着を抑制することが期待される。本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤は、iPaD処置と同様に、上記リガンド－受容体のセット、又は上記リガンド、受容体のいずれかの発現及び／又は機能の促進（活性化）効果を奏する物質を有効成分とするものである。
　上記表２の遺伝子の核酸配列としては、上記の各遺伝子のmRNA配列のコーディング領域（CDS）として既知の配列を採用することができ、例えば塩基配列データベースであるEnsemblに登録されている各遺伝子のTranscript sequenceを使用できる。本発明における表２の遺伝子の核酸配列としては、Ensemblに登録されている当該遺伝子のTranscript sequenceと同一、又は８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、且つこれらがコードするペプチドがEnsemblの塩基配列データベースに登録されているそれぞれの遺伝子に対応する活性を有するものである。
　上記表２に記載の遺伝子の由来は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、モルモット、マウス等の哺乳類であり、中でもヒト、サル、マウス由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
　上記促進剤は、上記表２に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の発現及び／又は機能を促進するものであれば特に限定されない。
［神経変性疾患の予防及び／又は治療剤の用法、用量、具体的な対象疾患等］
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤は、腰椎穿刺、脳室内注射、髄腔内のボーラス注射又は注入、神経節内注射、神経内注射、皮下注射によって対象に投与される。
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤が有効である具体的疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭葉変性症に起因する認知症等が挙げられる。これらのうち、本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤の効果がより得られるという観点から、アルツハイマー病、パーキンソン病、に対して好適に用いられる。
＜治療方法＞
　本発明は、上記表１に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の阻害剤を神経変性疾患の予防及び／又は治療のために用いることを特徴とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療方法も含む。また、本発明は、上記表２に記載のいずれかのリガンド－受容体の遺伝子セット、若しくはいずれかの遺伝子セットに由来するそれぞれのタンパク質の発現及び／又は機能の促進剤を神経変性疾患の予防及び／又は治療のために用いることを特徴とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療方法も含む。
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療方法は以下のとおりである。
［１］上記表１に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の阻害剤を投与することを特徴とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
［２］上記阻害剤が、
（Ａ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するmiR-shRNA（microRNA adapted short hairpin RNA）の核酸配列、及び上記核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを有するベクター、
（Ｂ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するsiRNA、shRNA、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（Ｃ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に由来するタンパク質に対する抗体、又は
（Ｄ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子又はそれに由来するタンパク質の、発現及び／又は機能に対して阻害効果を有する低分子化合物
である、［１］に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
［３］上記遺伝子が、哺乳類の遺伝子である、［１］又は［２］に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
［４］上記ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はプラスミドベクターである、［２］又は［３］に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
［５］腰椎穿刺によって投与される、［１］から［４］のいずれかに記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
［６］上記表２に記載のいずれかのリガンド－受容体の遺伝子セット、若しくはいずれかの遺伝子セットに由来するタンパク質、
の発現及び／又は機能の促進剤を投与することを特徴とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
［７］上記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び前頭側頭葉変性症に起因する認知症から成る群より選択される少なくとも１種である、［１］から［６］のいずれかに記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
［８］上記神経変性疾患が、アルツハイマー病、及びパーキンソン病から成る群より選択される少なくとも１種である、［１］から［６］のいずれかに記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
［９］上記神経変性疾患が、アルツハイマー病である、［１］から［６］のいずれかに記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療方法。
　本発明の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤についての具体的な説明は、神経変性疾患の予防及び／又は治療剤の項の説明をそのまま適用できる。
＜神経変性疾患の予防及び／又は治療用物質のスクリーニング方法＞
　本発明の第１の実施形態は、神経変性疾患の予防及び／又は治療用物質のスクリーニング方法であって、
（１）神経幹細胞に被験物質を作用させ、上記表１に記載のいずれかの遺伝子の発現又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現及び／若しくは活性を測定する工程、並びに
（２）上記工程（１）の結果から、上記遺伝子の発現抑制効果又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現抑制効果若しくは活性抑制効果を奏する被験物質を選定する工程を有する、方法を含む。
　上記神経幹細胞としては、各種動物由来の神経幹細胞の初代培養細胞の他、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞等の幹細胞から周知の方法を用いて分化させた神経幹細胞、MEB5等のマウス神経幹細胞株等の細胞株を用いてもよい。
　本発明における被験物質は、特に限定されるものではなく、例えば天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質（抗体を含む）、ペプチド等の単一物質；化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物；細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物又は動物細胞抽出物の抽出物等を挙げることができる。また、本発明における被験物質としては、これらの混合物であってもよい。
　上記表１に記載のいずれかの遺伝子の発現又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現及び／若しくは活性を測定する方法としては、各種細胞における遺伝子発現、タンパク質発現、タンパク質の活性を測定する方法として従来公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、被検物質の存在下及び非存在下で各遺伝子の発現、各タンパク質の発現及び／又は活性を測定し、被検物質の存在下及び非存在下での差や、両者の比等に基づいて判定する方法等が挙げられる。これらの方法等を用い、上記遺伝子の発現抑制効果又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現抑制効果若しくは活性抑制効果を奏する被験物質を選定する。
　本発明の第２の実施形態は、神経変性疾患の予防及び／又は治療用物質のスクリーニング方法であって、
（i）神経幹細胞に被験物質を作用させ、上記表２に記載のいずれかの遺伝子の発現、又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現及び／若しくは活性を測定する工程、並びに
（ii）上記工程（i）の結果から、上記遺伝子の発現促進効果又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現促進効果若しくは活性化効果を奏する被験物質を選定する工程を有する、方法を含む。
　上記神経幹細胞及び上記被験物質については、上記第１の実施形態における説明を適用できる。
　上記表２に記載のいずれかの遺伝子の発現、又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現及び／若しくは活性を測定する方法としては、各種細胞における遺伝子発現、タンパク質発現、タンパク質の活性を測定する方法として従来公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、被検物質の存在下及び非存在下で各遺伝子の発現、各タンパク質の発現及び／又は活性を測定し、被検物質の存在下及び非存在下での差や、両者の比等に基づいて判定する方法等が挙げられる。これらの方法等を用い、上記遺伝子の発現促進効果又は上記遺伝子に由来するタンパク質の発現促進効果若しくは活性増強効果を奏する被験物質を選定する。
　上記スクリーニング方法によって選定された物質は、神経幹細胞を効率良く活性化して増殖させ、多数のニューロンを生み出すことが可能である。そのため、老齢脳における神経幹細胞を青年期かそれ以上に若い時期の状態に戻すことができ、多数のニューロンを生み出し、記憶や学習能力を改善することが期待できる。また、アルツハイマー病等の神経変性疾患への治療効果も期待でき、内在する神経幹細胞が効率良く活性化して多数のニューロンを生み出し、記憶・学習能力を改善することができる。
　以下の実施例にて本開示を具体的に説明するが、本開示はこれらの実施例によって限定的に解釈されるものではない。
　本実施例において用いた材料及び方法は以下のとおりである。
〈動物〉
　アルツハイマー病モデルマウスである5XFADマウス（Oakley et. al., 2006）を、Jackson Laboratoryから入手した。簡単に言うと、5XFADマウスはマウスThy1プロモーター（Tg6799系統）の制御下で変異ヒトアミロイド前駆体タンパク質（APP）（スウェーデン変異:K670N、M671L;フロリダ突然変異:I716V;ロンドン突然変異:V717I）とプレセニリン1（PS1）（M146L;L286V）の二重トランスジェニック構築物を保有している。5×FAD系統（B6/SJL遺伝的背景）をJackson Laboratoryから入手し、C57BL/6J野生型（WT）マウスと2世代以上戻し交配した。WT同腹仔マウスを対照動物として用いた。すべてのマウスは京都大学実験動物の管理と使用のためのガイドラインに従って取り扱われた。実験プロトコールは京都大学ウイルス・再生医科学研究所実験動物委員会の承認を得た。
〈レンチウイルスの構築〉
　各遺伝子の配列をCSII-1.6-kb-pmHes5-mCherry-3NLS-MCS、またはCSII-pEFS-mCherry-3NLS-MCSプラスミドにサブクローニングしてレンチウイルスを生産した。レンチウイルス生産のために、各CSIIプラスミド84μg、gag-polプラスミド（psPAX2）36.5μg、およびVSV-Gプラスミド（pMD2.G）11.7μgを、1 mg/mlポリエチレンイミン-MAX（Polysciences社）860μLを用いて、5つの15cm皿のHEK293細胞に共トランスフェクトした。細胞を10μM Forskolin、1mMピルビン酸ナトリウムおよびGlutaMax（Thermo社）を含むOptiPRO無血清培地（Gibco社）で培養し、3日後に培地を回収した。合計100mLの培地を8,000×gで12時間および13,000×gで4時間の遠心分離によりPBS 100μLに濃縮した。レンチウイルス力価は、培養NSCに感染させることによって測定され、典型的には2×107単位/mlの力価が得られた。miR-Eバックボーンを有するレンチウイルスベクターを遺伝子発現ノックダウンに使用した。以下の表に示した配列をノックダウンに使用した。陰性対照としては、スクランブルシーケンスを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
〈マウスにおけるレンチウイルス感染〉
　in vivoスクリーニングおよび神経新生誘導のため、レンチウイルス1μL（3.75×105 U/mL）を歯状回の両側に、ブレグマからの前後方向=-2.0 mm,側方=±1.4 mm,腹側=2.0 mmの座標で0.125μL/minの流量で定位的に送達した。続いて脳切片を免疫組織化学的に検査した。
〈免疫組織化学的解析〉
　脳組織の免疫組織化学的解析のため、マウスに4%パラホルムアルデヒドを含むPBSを用いて経心灌流を行った。その後、脳を、4%パラホルムアルデヒドを含むPBSで後固定し、30%スクロースを含むPBSで連続的に一晩インキュベートして凍結保護し、埋め込み、OCT（Tissue TEK）で凍結した。連続した50μm厚の冠状凍結切片を、クライオスタットを用いて得た。ウサギ抗ダブルコルチン（1:500;セルシグナリングテクノロジー14802）、ウサギ抗MCM2（1:500;アブカムab4461）、ラット抗mCherry（1:500;インビトロゲンM11217）、マウス抗βアミロイド（クローン6E10;1:500;バイオレジェンド9320）の一次抗体を用いた。一次抗体は2晩、二次抗体は1晩反応させた。
〈標識細胞の定量〉
　DG-SGZは各実験で3匹以上のマウスで分析した。各マウスのDG領域を7番目のセクションごとに評価した。標識のために損傷したセクションを除くすべてのセクションに免疫染色を行った。その後、zスタック画像を10倍または20倍の目的で共焦点顕微鏡（LSM780またはLSM980）を用いて撮影した。染色された細胞はImageJを用いて定量し、各画像のDG-SGZのmm3あたりの細胞数として表した。
〈アミロイドβ（Aβ）沈着の定量〉
　各マウスの脳切片を７枚毎にマウス抗アミロイドβ一次抗体（クローン6E10;1:500;バイオレジェンド9320）で標識し、蛍光標識二次抗体で検出した。免疫染色後、zスタック像を10倍または20倍の目的で共焦点顕微鏡（LSM780またはLSM980）を用いて得た。Aβプラークの数は、適切な閾値処理とノイズデスペックル処理後にImageJを用いて定量した。結果は各画像のDG-SGZのmm3あたりのプラークの被覆面積として表した。
〈レンチウイルス注入5XFADマウスからの歯状回組織の調製とトランスクリプトーム解析〉
　5カ月齢5XFADマウスにレンチウイルスを感染させた4週間後に、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いてDG組織からトータルRNAを分離した。RNAの品質はRNA Bioanalyzerを用いて評価し、すべてのサンプルでRNA Integrity Number（RIN）が9以上であることを確認した。シーケンシングライブラリーはNEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB）を用いて調製した。Paired-endシーケンシングはHiSeq X（Illumina）を用いて行った。cDNA配列はマウス参照ゲノムmm10にアラインメントし、STARを用いてカウントし、TPM正規化法によりedgeRを用いて正規化した。異常値を示すサンプルは解析から除外した。遺伝子発現解析およびGOエンリッチメント解析はedgeRおよびMetascapeを用いて行った。リガンド-レセプターペアリストはCellTalkDB（Shaoら2021）から取得した。
〈統計解析〉
　データは平均値±SEMで示した。統計解析はR softwareを用いて行った。統計学的差異は、一元配置分散分析および二元配置分散分析、Tukey-Kramer法およびBonferroni法を用いて事後比較検定を行った。P値<0.05を統計学的有意差ありとした。
１．iPaDによる神経新生の亢進およびAβ沈着の抑制
　神経新生の活性化がアルツハイマー病に及ぼす影響を明らかにするため、5カ月齢の5XFADマウスの海馬歯状回に、NSC（神経幹細胞）で活性化されるHes5プロモーターの制御下で、対照のレンチウイルスまたはiPaDのレンチウイルス（Plagl2過剰発現とDyrk1aノックダウンの併用：詳細は非特許文献６参照）を注入した。海馬領域は一定期間後（4, 8,または12週間のレンチウイルス感染後（wpi））に検査した。レンチウイルスに感染したNSCとその子孫はmCherry+となった（図１）。対照のレンチウイルス注入5XFADマウスでは、すべての検査段階で活性化されたNSC（MCM2+、図1A、コントロール）またはDCX+神経芽細胞が非常に少なく（図１Ｂ、コントロール）、神経新生が有意に阻害されていることが示された。対照的に、iPaDレンチウイルス注入5XFADマウスでは、すべての検査段階で活性化されたNSC（MCM2+、図１Ａ、iPaD）およびDCX+神経芽細胞（図１Ｂ、iPaD）が豊富に存在し、NSCが有意に活性化され、神経新生が持続的に亢進していることが示された。
　また、Aβ病態に対するiPaD治療の影響についても検討した。対照のレンチウイルス注入5XFADマウスでは、Aβ沈着は加齢とともに増加した（図２、コントロール）。それに対し、iPaDレンチウイルス注入5XFADマウスでは、Aβ沈着は加齢とともに増加しなかった（図２、iPaD）。以上より、iPaD治療はNSCを効率的に活性化し、神経新生を促進し、Aβ沈着を減少させることが示唆された。なお、Plagl2過剰発現とDyrk1aノックダウンの併用を、本開示者らが「iPaD（inducing Plagl2 and anti-Dyrk1a）」と名付けた。
２．iPaDの下流イベント
　iPaD処理によって、NSCがアルツハイマー病の表現型を改善するメカニズムを理解するために、5カ月齢の5XFADマウスの海馬歯状回にiPaDレンチウイルスを注入し、4週間後に海馬を分離してRNA-seq解析を行った。その結果、iPaD処理NSCは5XFADマウスの海馬全体で592の遺伝子を有意にアップレギュレーションし、462の遺伝子をダウンレギュレーションした（図３、p値<0.05）。
　アップレギュレーションされた遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）解析を行ったところ、これらの遺伝子中には、ミエリン形成、免疫、サイトカイン、ミクログリアに関与する遺伝子が含まれていた（図４Ａ）。これらの遺伝子から、CellTalkDB（http://tcm.zju.edu.cn/celltalkdb/）で公開されているリガンド受容体ペアを抽出したところ、下記表４に示すApoe-Abca1/Trem2、Il33-Il1rl1、Ccl3-Ccr5、C3/Icam1-Itgb2、Lgals3-Mertkなどのリガンド-受容体ペアが、iPaD処理の下流でアップレギュレートされているリガンド受容体ペアであることが確認された。これらのリガンド受容体ペアは、アルツハイマー病の病態を改善することが知られていることから（Salta E.et al., 2023. Adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer’s disease: a road map to clinical relevance. Cell Stem Cell 30: 120-136）、これらの結果は、iPaD処理がこれらのリガンド-受容体ペアを活性化することにより、アルツハイマー病の病態を改善することを示唆している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ダウンレギュレーションされた遺伝子のGO項解析では、細胞形態形成、細胞外マトリックス（ECM）、発生成長に関与する遺伝子が含まれていた（図４Ｂ）。いくつかのECMタンパク質はアルツハイマー病の病態に関与することが知られているが（Sun et al., 2021, Role of the extracellular matrix in Alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci 13: 707466）、その他のほとんどの遺伝子の機能的意義は解析されていない。そこで、これらの遺伝子のノックダウンがアルツハイマー病の病態を改善するかどうかをmiR-EバックボーンshRNAシステムを用いて検討することにした（Fellmann et al., 2013, An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Rep 5: 1704-1713）。このノックダウンのストラテジーを図５に示す。
３．Prkag2、Gfra2、Rpl29、Maml2のノックダウンによる神経新生の増加とAβ沈着の減少
　5XFADマウスの海馬でiPaD処理により最も有意に発現が低下した遺伝子のリストを下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記表中、広く発現しているが、iPaD処理により最も有意に抑制されたMaml2、Rpl29、Ptgds、Ell3、Prkag2、Cspp1、Gfra2、Itpk1、Mical3を選択し、Aβの病態に対する全体的なノックダウン効果を検討した。レンチウイルスを用いて、5XFADマウスの海馬において、ユビキタスプロモーターである伸長因子プロモーター（elongation factor promoter）の制御下で、mCherryとともに各遺伝子のmiR-EバックボーンshRNA（表３の配列番号１～８）の発現を誘導し、8週間後にその効果を検討した（図５）。
　検討した上記遺伝子のうち、プロテインキナーゼAMP活性化非触媒サブユニットγ2をコードするPrkag2、グリア細胞系由来神経栄養因子ファミリー受容体α2をコードするGfra2、リボソームを構成するタンパクの一つをコードするRpl29のノックダウンがより効果的にDCX+神経芽細胞数を増加させ（図６Ａ、Ｂ）、Aβ沈着を抑制した（図７Ａ、Ｂ）。Notchシグナル伝達のコアクチベーターをコードするMaml2のノックダウンも同様にDCX+神経芽細胞数を増加させ（図６Ａ、Ｂ）、Aβ沈着を抑制した（図７Ａ、Ｂ）が、Prkag2よりも効果は低かった。これらの結果は、Prkag2、Gfra2、Rpl29およびMaml2のノックダウンが効果的に神経新生を活性化し、Aβ病態を改善することを示唆し、これらの遺伝子がアルツハイマー病治療の新たな標的となることを示唆している。
　以上のように、細胞形態形成、細胞外マトリックス（ECM）、発生成長に関与する多くの遺伝子がiPaD治療によりダウンレギュレーションされ、その中でもPrkag2、Gfra2、Rpl29およびMaml2のダウンレギュレーションが神経新生の活性化とAβ蓄積の抑制に重要であることを見出した。
４．Prkag2のノックダウンによる神経新生の増加とAβ沈着の減少の作用機構の解明
　ノックダウンによって最も顕著に神経新生の増加とAβ沈着の減少効果を示したPrkag2に注目し、その作用機構を探った。Prkag2はAMP-activated protein kinase（AMPK）を構成するサブユニットの一つ（γサブユニット２）である。AMPKシグナルはautophagyを活性化してアミロイドβ沈着を分解するとともに、脂肪滴（lipid droplet）を減少させてミクログリアの貪食能を活性化することが知られている。これらの作用によってAMPKシグナルはアルツハイマー病の病態を改善すると考えられている。活性化型AMPK（AMPKαサブユニットのThr172のリン酸化 = pAMPK）量を測定したところ、４ヶ月齢の5xFADマウスでは野生型と比べて同程度のpAMPK陽性細胞が存在し、脂肪滴（BODIPY+）の量も同程度であった（図８、4M WTおよび4M 5xFAD）。しかし、８ヶ月齢になると、5xFADマウスではpAMPK陽性細胞が顕著に減少し、逆に脂肪滴の量は増加していた（図８、8M 5xFAD）。また、この時期の5xFADマウスではアミロイドβの沈着も顕著に増加していた。したがって、AMPKシグナルの低下がアミロイドβ沈着や脂肪滴増加といったアルツハイマー病の病態悪化につながることが示唆された。
　次に、神経幹細胞培養系を使ってPrkag2ノックダウンの効果を解析したところ、AMPKの活性が増加した（図９）。Prkag2ノックダウンでAMPKの活性が増加する理由を明らかにするためにAMPKの他のサブユニットの発現変化をqPCR法で調べた。その結果、Prkag2をノックダウンすると多くのサブユニット（触媒サブユニットであるPrkaa1とPrkaa2、構造サブユニットであるPrkab1、制御サブユニットであるPrkkag1）の発現が、有意に増加することがわかり（図１０）、そのためにAMPKの活性が増加すると考えられた。したがって、Prkag2ノックダウンはAMPKシグナルを活性化することによってアルツハイマー病の病態を改善すると考えられた。
　さらに、培養系の神経幹細胞の増殖に対するPrkag2ノックダウンの効果を調べたところ、有意差はなかったが、Prkag2ノックダウンによってEdU取込みに増加傾向があることがわかった（図１１）。したがって、Prkag2ノックダウンは直接神経幹細胞に働いて増殖能を活性化することが示唆された。一方、Maml2ノックダウンではそのような効果は見られなかった（図１１）。
　最後に、iPaDで神経幹細胞を活性化することで周辺領域のAMPKシグナルが活性化する分子機構を探った。iPaDによって活性化した神経幹細胞やそこから分化する新生ニューロンがAMPK活性化因子を分泌することが示唆されたので、iPaDで活性化する遺伝子群の中でAMPKシグナルに関わる分泌因子・受容体の探索を行った。その結果、Adipoq-Adipor2、Il33-Il1rl1、Il17a-Il17rcが同定された（図１２）。さらに、神経幹細胞培養系でiPaDを作用させたところ、Adipoq、Il33、およびIl17aの発現が増加していた（図１３）。したがって、iPaDによって神経幹細胞でのAdipoq、Il33、Il17aの産生が増えて周辺領域のAMPKシグナルが活性化し、アミロイド病態が改善すると考えられた。
　Prkag2は細胞のエネルギー代謝を調節するAMP活性化キナーゼ（AMPK）の調節サブユニットの一つである。アルツハイマー病患者の死後脳においてPrkag2の発現がアップレギュレーションされることが報告されているが（Bharadwaj and Martins 2020, PRKAG2 gene expression is elevated and its protein levels are associated with increased Amyloid-β accumulation in the Alzheimer’s disease brain. J Alzheimers Dis 74: 441-448）、このアップレギュレーションがAβ病態に寄与しているのか、単に病態を緩和するために反応しているのかは不明であった。5XFADマウスにおいてPrkag2のノックダウンが最も効果的にAβ沈着を抑制することを見出し、Prkag2発現のダウンレギュレーションがマウスのみならずヒトにおいてもAβ病態を改善することを示唆した。また、Prkag2のノックダウンが5XFADマウスにおける神経新生を効果的に活性化することも見出したが、このメカニズムはまだ解析されていない。AMPKの触媒サブユニットであるAMPKα1の抑制がアルツハイマー病モデルマウスの認知障害を軽減することは既に報告されている（Zimmermann et.al.,2020, Brain-specific repression of AMPKα1 alleviates pathophysiology in Alzheimer’s model mice. J Clin Invest 130: 3511-3527）。また、AMPKのノックダウンが筋萎縮性側索硬化症モデル動物を防御することも示されている（Lim et.al., 2012, Reduced activity of AMP-activated protein kinase protects against genetic models of motor neuron disease. J Neurosci 32: 1123-1141）。これらのデータは、AMPKシグナル伝達の調節がアルツハイマー病を含む様々な神経変性疾患の治療に重要であることを示唆している。
　Gfra2はアルツハイマー病患者の死後脳でアップレギュレートされるが（Haytural et.al.,2021, Insights into the changes in the proteome of Alzheimer disease elucidated by a meta-analysis. Sci Data 8: 312）、アルツハイマー病におけるその役割は不明である。そのリガンドであるグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）は、軸索の成長とニューロンの生存を調節することが示され、アルツハイマー病患者のニューロンはGDNFに対する応答を欠くことが示された（Konishi et. al., 2014, Deficiency of GDNF receptor GFRα1 in Alzheimer’s neurons results in neuronal death. J Neurosci 34: 13127-13138）。アルツハイマー病患者では、年齢をマッチさせた対照と比較して、血清中のGDNF濃度は有意に低く、髄液中のGDNF濃度は有意に高かった（Straten et.al., 2009, Glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) concentrations in cerebrospinal fluid and serum of patients with early Alzheimer’s disease and normal controls. J Alzheimers Dis 18: 331-337.）。これらの結果は、髄液中のGDNFのアップレギュレーションが、神経栄養サポートを強化するための適応反応である可能性を示唆している。GDNFは異なる受容体サブタイプであるGfra1に選択的に結合するため、Gfra2のノックダウンはGDNFとGfra1の相互作用を促進する可能性がある。しかし、Gfra2欠損マウスは行動障害と記憶障害（Voikar et. al., 2004, Impaired behavioural flexibility and memory in mice lacking GDNF family receptor α2. Eur J Neurosci 20: 308-312）を示し、正常な脳機能には一定レベルのGfra2発現が必要であることを示唆している。Gfra2のノックダウンがどのようにAβ病態を改善するかについては、今後の解析が必要である。GDNFはAMPKシグナル伝達（Katila et. al., 、2020）によりアップレギュレートされるため、Prkag2とGfra2のノックダウンはAMPK-GDNF経路活性を調節してAβ病態を改善する可能性がある。
　Mamlタンパク質はNotchシグナル伝達因子RBPj（Lin et.al., 2002, Identification of new human mastermind proteins defines a family that consists of positive regulators for notch signaling. J Biol Chem 277: 50612-50620;Wu et. al., 2002, Identification of a family of mastermind-like transcriptional coactivators for mammalian notch receptors. Mol Cell Biol 22: 7688-7700.）や筋細胞エンハンサー因子2C（Shen et. al., 2006, The Notch coactivator, MAML1, functions as a novel coactivator for MEF2C-mediated transcription and is required for normal myogenesis. Genes Dev 20: 675-688.）などの様々な転写因子に対する3つのコアクチベーターのファミリーである。したがって、Maml2のノックダウンはNotchシグナル伝達を含む多くの遺伝子の発現をダウンレギュレートすると考えられる。今回我々は、Maml2のノックダウンが効果的に神経新生を活性化し、Aβ沈着を減少させることを見出した。成体脳では、NSCの静止はNotchエフェクターHes1の高発現（Sueda et.al., 2019, High Hes1 expression and resultant Ascl1 suppression regulate quiescent vs. active neural stem cells in the adult mouse brain. Genes Dev 33: 511-523）によって制御されており、Maml2のノックダウンはHes1の発現をダウンレギュレートし、NSCの活性化につながる可能性がある。しかし、Maml2のノックダウンによるAβ沈着の減少メカニズムについては、まだ解析されていない。最近、ヒトのアルツハイマー病患者においてMaml2がアップレギュレートされることが示され（Xiong et.al.,2023, Epigenomic dissection of Alzheimer’s disease pinpoints causal variants and reveals epigenome erosion. Cell 186: 4422-4437）、Maml2のノックダウンがマウスのみならずヒトにおいてもAβ病態の減少に有効である可能性が示唆された。
　Prkag2、Gfra2、Maml2、および/またはRpl29のノックダウンは成体神経新生を活性化し、Aβ沈着を減少させ、活性化された神経新生の程度とAβ沈着の減少の程度が互いによく相関していることに注目した。神経新生の活性化はAβ沈着を減少させ、Aβ沈着の減少は神経新生を活性化するという2つの事象は互いに密接に関連している可能性がある。成体神経新生の活性化は加齢に伴う認知機能障害や神経変性疾患（Benraiss et.al., 2013, Mobilization of endogenous progenitor cells regenerates functionally-integrated medium spiny striopallidal projection neurons and delays disease progression in an transgenic model of Huntington’s disease. Cell Stem Cell 12: 787-799.;Choi et.al., 2018, Combined adult neurogenesis and BDNF mimic exercise effects on cognition in an Alzheimer’s mouse model. Science 361: eaan8821.;Diaz-Moreno et.al., 2018, Noggin rescues age-related stem cell loss in the brain of senescent mice with neurodegenerative pathology. Proc Natl Acad Sci USA 115: 11625-11630）を改善することができるため、Prkag2、Gfra2、Maml2、および/またはRpl29のノックダウンはアルツハイマー病を含む様々な脳障害の治療戦略として有望であることが示された。
　本発明によると、上記特定の遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質の発現を抑制、阻害することで、成体脳における神経新生を効率的に活性化し、アミロイド-βの沈着を減少させることができる。このような成体脳における神経新生の活性化、アミロイド-βの沈着減少は、加齢に関連した認知機能障害や神経変性疾患の改善に繋がると考えられることから、Prkag2、Gfra2、Maml2、Rpl29等の上記特定の遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質のノックダウンは、アルツハイマー病を含む神経変性疾患の治療戦略として有望であることが強く示唆された。

Claims (9)

  1. 　下記表１に記載のいずれかの遺伝子、若しくはいずれかの遺伝子に由来するタンパク質、の阻害剤を有効成分とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  2. 　上記阻害剤が、
    （Ａ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するmiR-shRNA（microRNA adapted short hairpin RNA）の核酸配列、及び上記核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列
    を含むポリヌクレオチドを有するベクター、
    （Ｂ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に対するsiRNA、shRNA、若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、
    （Ｃ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子に由来するタンパク質に対する抗体、又は
    （Ｄ）上記表１に記載のいずれかの遺伝子又はそれに由来するタンパク質の、発現及び／又は機能に対して阻害効果を有する低分子化合物
    である、請求項１に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
  3. 　上記遺伝子が、哺乳類の遺伝子である、請求項１又は２に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
  4. 　上記ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はプラスミドベクターである、請求項２又は３に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
  5. 　腰椎穿刺によって投与される、請求項１から４のいずれか１項に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
  6. 　下記表２に記載のいずれかのリガンド－受容体の遺伝子セット、若しくはいずれかの遺伝子セットに由来するタンパク質、
    の発現及び／又は機能の促進剤を有効成分とする、神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  7. 　上記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び前頭側頭葉変性症に起因する認知症から成る群より選択される少なくとも１種である、請求項１から６のいずれか１項に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
  8. 　上記神経変性疾患が、アルツハイマー病、及びパーキンソン病から成る群より選択される少なくとも１種である、請求項１から６のいずれか１項に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
  9. 　上記神経変性疾患が、アルツハイマー病である、請求項１から６のいずれか１項に記載の神経変性疾患の予防及び／又は治療剤。
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