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WO2025142889A1 - 細胞外小胞を分級する装置、および細胞外小胞を分級し、細胞外小胞に含まれるタンパク質を検出または分析するためのインビトロの方法 - Google Patents

細胞外小胞を分級する装置、および細胞外小胞を分級し、細胞外小胞に含まれるタンパク質を検出または分析するためのインビトロの方法 Download PDF

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WO2025142889A1
WO2025142889A1 PCT/JP2024/045586 JP2024045586W WO2025142889A1 WO 2025142889 A1 WO2025142889 A1 WO 2025142889A1 JP 2024045586 W JP2024045586 W JP 2024045586W WO 2025142889 A1 WO2025142889 A1 WO 2025142889A1
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WO
WIPO (PCT)
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flow path
particle size
sample
inlet
extracellular vesicles
Prior art date
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Pending
Application number
PCT/JP2024/045586
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English (en)
French (fr)
Inventor
葉月 志賀
達也 島
直人 藤井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biophenoma
Biophenoma Inc
Original Assignee
Biophenoma
Biophenoma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biophenoma, Biophenoma Inc filed Critical Biophenoma
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Pending legal-status Critical Current
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • a device for sorting extracellular vesicles comprising: A micro/nano channel device
  • the micro/nano channel device comprises: A receiver for receiving a sample (first sample); a first flow path through which a first sample from a receiver flows; a first inlet through which a first sample flows from a first flow path; The first inlet is connected to a second flow path, the first inlet being an inlet that prevents the passage of extracellular vesicles having a particle size exceeding a first reference particle size, and the second flow path being a flow path for passing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size, the second flow path being connected to a first reservoir, and a first analysis sample containing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size being accumulated in the first reservoir, and the first flow path being connected to a third flow path having a diameter through which a second sample containing extracellular vesicles that do not pass through
  • the method includes steps for obtaining each analytical sample only including size-based fractionation of extracellular vesicles (e.g., filtering with a filter such as a 0.22 ⁇ m pore size filter, ultrafiltration with an ultrafiltration filter such as an ultrafiltration filter having a molecular weight cutoff of 100 kDa, and size-based classification with a micro/nano channel device), centrifugation, solution exchange, and separation of extracellular vesicles by polymer precipitation.
  • size-based fractionation of extracellular vesicles e.g., filtering with a filter such as a 0.22 ⁇ m pore size filter, ultrafiltration with an ultrafiltration filter such as an ultrafiltration filter having a molecular weight cutoff of 100 kDa, and size-based classification with a micro/nano channel device
  • centrifugation e.g., centrifugation, solution exchange, and separation of extracellular vesicles by polymer precipitation.
  • a classification device comprising a micro/nano channel device 600,
  • the micro/nano channel device 600 includes: A receiver 10 for receiving a sample (first sample); a first flow path 21 through which a first sample flows; a first inlet 31 through which a first sample flows from a first flow path 21;
  • the first inlet 31 is connected to the second flow path 22, the first inlet 31 being an inlet that prevents the passage of extracellular vesicles having a particle size exceeding a first reference particle size, the second flow path 22 being a flow path for passing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size, the second flow path 22 being connected to a first reservoir 11, a first analysis sample containing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size being accumulated in the reservoir 11, the first flow path 21 being connected to a third flow path 23 into which a second sample containing extracellular vesicles that do not pass through the first inlet 31 (i.e.
  • the micro/nano channel device 600 includes: A receiver 10 for receiving a sample (first sample); a first flow path 21 through which a first sample flows; a first inlet 31 through which a first sample flows from a first flow path 21; The first inlet 31 is connected to the second flow path 22, the first inlet 31 being an inlet that prevents the passage of extracellular vesicles having a particle size exceeding a first reference particle size, the second flow path 22 being a flow path for passing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size, the second flow path 22 being connected to a first reservoir 11, and a first analysis sample containing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size being accumulated in the reservoir 11, the first flow path 21 being connected to a third flow path 23 into which a second sample containing extracellular vesicles that do not pass through the first inlet 31 (i.e., the inlet
  • a "subject” includes mammals, rodents such as mice and rats, livestock animals such as pigs and cows, pets such as dogs and cats, and primates such as humans and monkeys.
  • the subject is preferably a human.
  • the subject may be healthy, at risk of developing a disease or pathological condition, or have a disease or pathological condition.
  • Extracellular vesicles are typically obtained from cell culture supernatants or tissue supernatants by affinity chromatography, size exclusion chromatography, polymer precipitation, ultracentrifugation, and ultrafiltration, and combinations thereof.
  • the properties of the obtained extracellular vesicles vary greatly depending on the method of acquisition.
  • cells secrete various extracellular vesicles to the outside of the cells it is not always easy to identify useful extracellular vesicles having specific properties from among them, or to concentrate, enrich, isolate, or purify them.
  • Apoptotic vesicles are vesicles that cells generate by programmed cell death (apoptosis) and have a diameter of 50 to 5000 nm. Apoptotic vesicles are known to express annexin V, phosphatidylserine, etc.
  • CD9 refers to a member of a protein family called tetraspanin, which has a transmembrane domain and is present on the cell membrane or the membrane of an exosome.
  • the standard sequence of human CD9 is registered at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) as NCBI Reference Sequence: NP_001760.
  • CD9 includes proteins that have a sequence corresponding to the sequence registered as NCBI Reference Sequence: NP_001760 and have the function of CD9. Examples of antibodies that bind to CD9 include, but are not limited to, clones HI9a, MZ3, M2/57, SN4 C3-3A2, Bu16, MEM-61, and MF1. Antibodies that have heavy chain CDR1-3 and light chain CDR1-3 of any of these clones and bind to CD9 may also be useful anti-CD9 antibodies.
  • CD63 refers to a member of a protein family called tetraspanin, which has a transmembrane domain and is present on the cell membrane or the membrane of an exosome.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • CD63 includes proteins that have a sequence corresponding to the sequence registered under the above GenBank Accession No. AAH13017.1 and have the function of CD63.
  • Antibodies that bind to CD63 include, but are not limited to, clones MEM-259, Ts63, TEA3/18, CC25, REA1055, RFAC4, ME491, MX-49.129.5, H5C6, 3H6, and AD1. Antibodies that have heavy chain CDR1-3 and light chain CDR1-3 of any of these clones and bind to CD63 may also be useful anti-CD63 antibodies.
  • CD81 refers to a member of a protein family called tetraspanin, which has a transmembrane domain and is present on the cell membrane or the membrane of an exosome.
  • the standard sequence of human CD81 is registered with the National Center for Biotechnology Information (NCBI) under GenBank Accession No. AAH93047.1.
  • CD81 includes proteins that have a sequence corresponding to the sequence registered under the above GenBank Accession No. AAH93047.1 and have the function of CD81.
  • Examples of antibodies that bind to CD81 include, but are not limited to, clones 1D6, 5A6, 2F7, Eat2, REA513, JS-81, M38, and A1504.
  • Antibodies that have heavy chain CDR1-3 and light chain CDR1-3 of any of these clones and bind to CD81 may also be useful anti-CD81 antibodies.
  • isolation refers to the removal of at least one other component from the environment in which it was produced. Thus, isolation does not require purification to the point of being a single component, but allows for other components to be present in the same composition. Isolation of extracellular vesicles only requires that they are separated from other components to a degree sufficient for analysis.
  • a biological sample refers to a sample (e.g., extracellular fluid, and bodily fluid) obtained from a subject.
  • Biological samples include blood, saliva, tears, urine, peritoneal fluid, pleural fluid, and secretions (e.g., endocrine and exocrine fluids, e.g., digestive fluids such as pancreatic juice).
  • a biological sample is a liquid sample (also referred to as a "biological liquid sample”) suitable for application to a micro/nanofluidic device.
  • a "blood sample” refers to blood (e.g., peripheral blood) or a blood-derived sample (e.g., serum and plasma) obtained from a subject.
  • the present disclosure provides an in vitro method for detecting or quantifying proteins contained in the lumen of extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicles comprise exosomes.
  • the present disclosure also provides an in vitro method for detecting or quantifying proteins contained in the lumen of exosomes.
  • Extracellular vesicles isolated by polymer precipitation generally contain a large amount of impurities.
  • substances that cause clogging of the micro/nano channel devices are removed by pretreatment, and the extracellular vesicles in the sample are sorted by size in the micro/nano channel devices. Therefore, the application of biological samples to micro/nano channel devices can minimize the effects of impurities.
  • size classification includes classification into one or more, two or more, three or more, or four or more groups, resulting in one or more, two or more, three or more, or four or more analytical samples, respectively. According to the present disclosure, at least one or more, two or more, three or more, four or more, or all of the obtained analytical samples can be subjected to analysis.
  • Analysis may be performed on the entire exosome, or after separating the exosomes into membrane and luminal fractions, analysis can be performed on each of the membrane and luminal fractions of the exosomes. Separation can be performed by extracting the luminal fraction by disrupting the exosomes and then solubilizing the membrane fraction after extraction. Exosomes can be disrupted by mechanical treatment (e.g., freeze-thawing or ultrasonic disruption) or chemical treatment (e.g., detergent treatment). Furthermore, after extraction of the luminal fraction, the membrane fraction can be solubilized by detergent treatment under conditions suitable for solubilizing the membrane fraction.
  • exosome membrane and luminal fractions can also be performed using, for example, a commercially available kit (e.g., Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction kit (89842; Thermo Fisher Scientific)) (see Iha et al., Analytical Biochemistry, 654:114831, 2022).
  • a commercially available kit e.g., Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction kit (89842; Thermo Fisher Scientific)
  • Analysis of proteins contained in exosomes, or analysis of proteins contained in the membrane or luminal fraction of exosomes may be performed by a protein detection or quantification technique having a detection sensitivity of at least 10 ⁇ 15 moles/assay or more, 10 ⁇ 16 moles/assay or more, 10 ⁇ 17 moles/assay or more, or 10 ⁇ 18 moles/assay or more (e.g., 10 ⁇ 15 moles/assay to 10 ⁇ 21 moles/assay, e.g., 10 ⁇ 15 moles/assay to 10 ⁇ 20 moles/assay, e.g., 10 ⁇ 15 moles/assay to 10 ⁇ 19 moles/assay, and e.g., 10 ⁇ 15 moles/assay to 10 ⁇ 18 moles/assay) when measuring, for example, 100 ⁇ L of sample per assay.
  • the problem with the purification of extracellular vesicles using a micro/nano channel device is that it cannot process a large amount of sample. More specifically, the detection sensitivity of this ELISA is insufficient.
  • the enzyme cycling method can obtain a detection sensitivity of 10 ⁇ 15 moles/assay, and the improved enzyme cycling method (see, for example, JP5265816B and JP5500985B) can obtain a detection sensitivity of 10 ⁇ 18 moles/assay (examples of detection of substances at 10 ⁇ 21 moles/assay have also been found in this system), thus overcoming the problems of the micro/nano channel device. Therefore, in the present disclosure, the improved enzyme cycling method combined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is preferably used for the analysis of analytical samples.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the improved enzyme cycling method may be, for example, a thio-nicotinamide adenine dinucleotide (thio-NAD) cycling method.
  • thio-NAD 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase
  • 3 ⁇ -HSD 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase
  • NNADH and thio-NAD 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase
  • 3 ⁇ -HSD catalyzes substrate cycling between 3 ⁇ -hydroxysteroids and the corresponding 3-ketosteroids.
  • Thio-NAD is reduced by the above reaction to form thio-NADH. Quantitative determination of thio-NADH allows detection and quantification of 3 ⁇ -hydroxysteroids.
  • Thio-NADH has an absorbance at 405 nm.
  • the amount of thio-NADH can be measured by measuring the absorbance at 405 nm.
  • 3 ⁇ -hydroxysteroids can be produced from their phosphorylated form by alkaline phosphatase.
  • alkaline phosphatase as the enzyme for the enzyme-labeled antibody method and phosphorylated 3 ⁇ -hydroxysteroids as the substrate, thio-NADH can be produced according to the amount of antigen.
  • the substrate for alkaline phosphatase may include a substrate having an androsterone skeleton (wherein the androsterone skeleton has a hydroxyl group at the 3 ⁇ position and a carbonyl group at the 17 position), such as androsterone 3-phosphate, e.g., 17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -androstan-3 ⁇ -ol 3-phosphate.
  • alkaline phosphatase may be linked to an amino group or a sulfhydryl group of an antibody via a maleimide group or an N-hydroxysuccinimide group (NHS group) that has been added thereto.
  • enzyme labeling utilizing the binding of biotin and avidins is a well-known and commonly used technique that may be used to prepare enzyme-labeled antibodies.
  • the proteins to be detected or quantified may preferably include tetraspanin family proteins (e.g., one, two, or all selected from the group consisting of CD9, CD63, and CD81). By measuring these, it can be verified that the obtained extracellular vesicles contain exosomes.
  • Other proteins to be detected or quantified are membrane proteins or luminal proteins contained in extracellular vesicles such as exosomes (see, for example, Iha et al., 2022, supra).
  • the membrane proteins or luminal proteins may be disease markers. Disease markers include, but are not limited to, tumor markers and brain and nerve disease markers.
  • the proteins to be detected or quantified may include one or more, preferably two or more proteins other than exosome markers such as tetraspanin family proteins.
  • the protein to be detected or quantified may be, for example, amyloid beta.
  • Amyloid beta (A ⁇ ) is the main component of amyloid plaques found in the brains of Alzheimer's disease patients.
  • a ⁇ is derived from the amyloid precursor protein and is produced by cleavage by ⁇ -secretase and ⁇ -secretase.
  • a ⁇ (1-40), A ⁇ (1-42), and the A ⁇ (1-42)/A ⁇ (1-40) ratio may be detected or quantified.
  • a ⁇ (1-40) may be detected, for example, by an antibody that binds to A ⁇ (1-40), including, but not limited to, clones 2294, 5C3, BAM-10, BDI350, and Ab40.1, and any of the antibodies having heavy chain CDRs 1-3 and light chain CDRs 1-3 of these antibodies.
  • a ⁇ (1-42) can be detected, for example, by an antibody that binds to A ⁇ (1-42), and can be detected, for example, but not limited to, clones EPR9296, mOC64, 2C2G5, 12F4, and NR221P, and antibodies having heavy chain CDR1-3 and light chain CDR1-3 of these antibodies.
  • these peptides can be quantified by ELISA assay using a standard product.
  • NfL neurofilament light chain
  • Tumor markers are not particularly limited, but include, for example, blood cancers such as acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, B-cell lymphoma, multiple myeloma, and T-cell lymphoma, myelodysplastic syndrome, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, undifferentiated cancer, large cell carcinoma, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, mesothelioma, skin cancer, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, vaginal cancer, cervical cancer, head and neck cancer, uterine cancer, cervical cancer, liver cancer, and gallbladder cancer.
  • blood cancers such as acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, B
  • tumor markers include solid cancers such as carcinoma, bile duct cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, lung cancer, colon cancer, large intestine cancer, rectal cancer, small intestine cancer, stomach cancer, esophageal cancer, testicular cancer, ovarian cancer, bladder cancer, and brain tumors, as well as cancers of bone tissue, cartilage tissue, adipose tissue, muscle tissue, vascular tissue, and hematopoietic tissue, as well as sarcomas such as chondrosarcoma, Ewing's sarcoma, malignant hemangioendothelioma, malignant Schwannoma, osteosarcoma, and soft tissue sarcoma, and blastomas such as hepatoblastoma, medulloblastoma, nephroblastoma, neuroblastoma, pancreatoblastoma, pleuropulmonary blastoma, and retinoblastoma.
  • solid cancers such as carcinoma
  • Tumor markers include, but are not limited to, CEA, AFP, hCG, CA-125, CA19-9, PSA, HER2/neu, MUC1, MAGE, NY-ESO-1, WT1, PSMA, CTA, EGFR, BCL-2, mutant KRAS, cyclin D1, TERT, CD20, mutant BRAF, TAG-72, glial cell tumor tissue factor, CX3CR1, and mutant MET. Proteins that may be measured include MHC class I and/or MHC class II.
  • a series of steps from ELISA to the thio-NAD cycling method may be automated using the CLOCK technology (JP Patent Publication 2017-75807 and Abe et al., Analytical Methods, 12: 4858-4866, 2020).
  • CLOCK technology a micro/nano channel device (particularly a disk-shaped device) having a reservoir for introducing reagents, a reaction chamber, and a channel connecting the reservoir and the reaction chamber is used, and the reagents can be transferred to the reaction chamber in an appropriate order and reacted by utilizing the centrifugal force generated by rotating the micro/nano channel device.
  • the device has multiple channels having channels formed from a reservoir containing the reagent toward the reaction chamber so as to move away from the center of rotation (starting point) during centrifugation, and each channel is configured to have a channel of the same length or different lengths, and when the channels have different lengths, the order in which the reagents are introduced into the reaction chambers is adjusted accordingly.
  • a part of the flow path into the reaction chamber may have two U-shaped flow paths and a flow path sandwiched between them (i.e., a flow path extending in a direction counter to the centrifugal force), which can prevent leakage of reagents into the reaction chamber.
  • This micro/nano flow path device does not need to have driving members such as valves and pumps, and can be easily manufactured by injection molding.
  • an in vitro method for detecting or quantifying a protein contained in an exosome in a biological sample comprising: Precipitating extracellular vesicles in a biological sample by a polymer precipitation method and dispersing them in a solution to obtain a first solution containing extracellular vesicles; Applying the first solution to a micro/nano channel device and classifying the extracellular vesicles by size in the micro/nano channel device to obtain a second solution (analysis sample) containing exosomes; The method further includes detecting or quantifying exosome proteins in the second solution (analysis sample).
  • the detection or quantification can be performed by ELISA and the enzyme cycling method or the improved enzyme cycling method, as described above.
  • exosomes can be analyzed without performing a complicated and time-consuming process such as ultracentrifugation when preparing exosomes.
  • the polymer precipitation method has a problem in that it produces a large amount of impurities
  • the impurities can be removed by applying the method to a filtering process (e.g., a filtering process using a filter with a pore size of 0.22 ⁇ m and an ultrafiltration process using a filter with a molecular weight cutoff of 100 KDa) and a micro/nano channel device.
  • a micro/nano channel device cannot process a large amount of sample, and can only process samples on the order of microliters (less than 1 mL), but the enzyme cycling method, especially the improved enzyme cycling method, enables protein detection from a trace amount of sample.
  • a method for easily and quickly obtaining and analyzing exosome fractions can be provided.
  • sample pretreatment and classification can be completed in a short period of time.
  • all steps from the prepared biological sample to the detection and quantification of proteins in exosomes contained therein can be completed within one week, six days, five days, four days, three days, or two days, for example, within two to four days, or within two, three, or four days.
  • sample pretreatment and classification can be completed within one week, six days, five days, four days, three days, or two days, for example, within two to four days, or within one to three days, or within one, two, three, or four days.
  • the acquisition of a biological sample containing extracellular vesicles and polymer precipitation require, for example, about 2 hours to about 3 hours
  • classification by a micro/nano channel device requires, for example, about 20 minutes to about 30 minutes. Therefore, the time required to obtain an exosome fraction by classification is, for example, about 2 hours 20 minutes to about 3.5 hours.
  • the time required to further fractionate the exosome fraction into membrane components and luminal components is, for example, about 2 hours to about 3 hours.
  • the enzyme cycling method is, for example, about 3 hours to about 5 hours. Therefore, the time required to detect proteins from a biological sample can be within 1 day, 18 hours, 15 hours, 12 hours, or 10 hours, for example, about 7 hours to 11 hours, for example, about 8 hours to about 9 hours.
  • a micro/nano channel device may be used in the above method.
  • the present disclosure provides a micro/nano channel device suitable for use in the above method, and a device for sorting extracellular vesicles (particularly exosomes) including the micro/nano channel device.
  • a classification device for extracellular vesicles is provided with a micro/nano channel device.
  • the first reference particle size may be a lower limit of the exosome particle size, for example, about 30 nm to about 65 nm, about 40 nm to about 60 nm, about 45 nm to about 55 nm, or about 50 nm.
  • the first sample is filtered, for example, by a filter with a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • the reservoir 11 contains extracellular vesicles below the first reference value, and the reservoir 12 contains an exosome fraction. Therefore, the second analysis sample (a sample containing extracellular vesicles having a particle size equal to or larger than the first reference particle size) contained in the reservoir 12 can be subjected to analysis.
  • the first analysis sample contained in the reservoir 11 may be analyzed for monitoring extracellular vesicles.
  • the first analytical sample need not be analyzed if not necessary, and may, for example, be discarded.
  • the micro/nanofluidic device 100 includes: A receiver 10 for receiving a sample (first sample); a first flow path 21 through which a first sample flows; a first inlet 31 through which a first sample flows from a first flow path 21; The first inlet 31 is connected to the second flow path 22, the first inlet 31 being an inlet that prevents the passage of extracellular vesicles having a particle size exceeding a first reference particle size, the second flow path 22 being a flow path for passing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size, the second flow path 22 being connected to a first reservoir 11, a first analysis sample containing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size being accumulated in the first reservoir 11, the first flow path 21 being connected to a third flow path 23 having a diameter that allows the second sample to pass without clogging,
  • the micro/nano channel device comprises: The second sample inlet 32 is further provided for receiving the second
  • the second inlet 32 is connected to the fourth flow path 24, the second inlet 32 is an inlet that prevents the passage of extracellular vesicles having a particle size exceeding the second reference particle size, and the fourth flow path 24 is a flow path for passing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the second reference particle size, the fourth flow path 24 is connected to the second reservoir 12, and a second analysis sample containing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the second reference particle size is accumulated in the second reservoir 12, and the third flow path 23 is connected to a fifth flow path 25 into which a third sample containing extracellular vesicles that do not pass through the second inlet 32 (i.e., the inlet 32 to the fourth flow path 24) flows and has a diameter that allows the third sample to pass without clogging;
  • the micro/nano channel device comprises: A reservoir (eg, waste liquid container) 41 is provided into which the third sample flows from the
  • the first sample flows through the first channel 21 and flows toward the first inlet 31, and particles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size pass through the first inlet 31 and the second channel 22 to accumulate in the first reservoir 11 and become the first analysis sample.
  • particles having a particle size exceeding the first reference particle size cannot pass through the first inlet 31, flow into the third channel 23, and flow toward the second inlet 32.
  • the micro/nanofluidic device of the present disclosure classifies the extracellular vesicles according to (or based on) size, and provides an analytical sample containing extracellular vesicles of different particle sizes.
  • the fourth sample contained in the reservoir 41 may be subjected to analysis, or may be discarded if not needed.
  • the micro/nanofluidic device 200 includes: A receiver 10 for receiving a sample (first sample); a first flow path 21 through which a first sample flows; a first inlet 31 through which a first sample flows from a first flow path 21; The first inlet 31 is connected to the second flow path 22, the first inlet 31 being an inlet that prevents the passage of extracellular vesicles having a particle size exceeding a first reference particle size, the second flow path 22 being a flow path for passing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size, the second flow path 22 being connected to a first reservoir 11, a first analysis sample containing extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size being accumulated in the first reservoir 11, the first flow path 21 being connected to a third flow path 23 having a diameter that allows the second sample to pass without clogging,
  • the micro/nano channel device comprises: The second sample inlet 32 is further provided for receiving the second
  • the first sample flows through the first channel 21 and flows toward the first inlet 31, and particles having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size pass through the first inlet 31 and the second channel 22 to accumulate in the first reservoir 11 and become the first analysis sample.
  • particles having a particle size exceeding the first reference particle size cannot pass through the first inlet 31, flow into the third channel 23, and flow toward the second inlet 32.
  • Particles having a particle size equal to or smaller than the second reference particle size pass through the second inlet 32 and the fourth channel 24 to accumulate in the second reservoir 12 and become the second analysis sample.
  • Particles having a particle size exceeding the second reference particle size cannot pass through the second inlet 32, and flow into the fifth channel 25.
  • Particles having a particle size equal to or smaller than the third reference particle size pass through the third inlet 33 and the sixth flow path 26 and are accumulated in the third reservoir 13, which becomes the third analysis sample.
  • Particles having a particle size exceeding the third reference particle size cannot pass through the third inlet 33, flow into the seventh flow path 27, and are introduced into the reservoir (e.g., waste liquid container) 41 into which the fourth sample flows.
  • the micro/nano channel device of the present disclosure classifies the extracellular vesicles according to (or based on) size, and provides an analysis sample containing extracellular vesicles of different particle sizes.
  • the fourth sample contained in the reservoir 41 may be used for analysis, or may be discarded if not needed.
  • the first reference particle size may be about 30 nm to about 65 nm, about 35 nm to about 60 nm, about 40 nm to about 60 nm, about 45 nm to about 55 nm, or about 50 nm.
  • the second reference particle size may be about 120 nm to about 180 nm, about 130 nm to about 170 nm, about 140 nm to about 160 nm, or about 150 nm. This allows, for example, separation of exosomes and non-exosomes from extracellular vesicles.
  • Samples containing extracellular vesicles or debris having a particle size equal to or smaller than the first reference particle size may be discarded or collected for analysis.
  • Analysis may include, for example, analysis of cells, extracellular vesicles other than exosomes, or debris thereof.
  • the presence of cells, extracellular vesicles other than exosomes, or debris thereof may be utilized for quality control of exosomes and their isolation conditions. For example, if the amount of exosome fragments is below a standard value, it is determined that the exosomes have been well isolated, and the exosome-containing fraction is collected. However, if the amount of exosome fragments is above or exceeds the standard value, it is determined that the exosomes have not been well isolated, and the exosome-containing fraction is not analyzed, and the fraction is discarded.
  • the first standard particle size is about 30 nm to about 65 nm, about 40 nm to about 60 nm, about 45 nm to about 55 nm, or about 50 nm.
  • the third standard particle size may be about 120 nm to about 180 nm, about 130 nm to about 170 nm, about 140 nm to about 160 nm, or about 150 nm. This allows, for example, exosomes and non-exosomes to be separated from extracellular vesicles.
  • the second standard particle size is between the first standard particle size and the third standard particle size, and is suitable when exosomes are to be further classified by size for analysis.
  • the amount of cell debris is equal to or less than a reference value, it is evaluated that the exosomes have been well isolated, and a fraction containing exosomes is collected, but when the amount of exosome debris is equal to or greater than the reference value, it is evaluated that the exosomes have not been well isolated, and the fraction containing exosomes is not analyzed, and the fraction is discarded.
  • a classification unit including an inlet and a reservoir for this purpose and a flow path connecting the inlet and the reservoir can be further added to the flow path.
  • the classification unit has an nth inlet, a 2nth flow path, and an nth reservoir, where n is a natural number, and the nth inlet and the nth reservoir are connected by the 2nth flow path.
  • the nth inlet is designed to satisfy the nth reference particle size ⁇ the nth + 1th reference particle size
  • the 2nth flow path is designed so that the extracellular vesicles that have passed through the nth inlet can pass through
  • the nth reservoir is connected to the 2nth flow path, so that the nth analysis sample can be accumulated in the nth reservoir.
  • the reservoirs are designed so that a sample for analysis can be removed from each reservoir, for example by having an opening that allows access to the sample for analysis by a microchip or needle.
  • the opening could have a lid that can be opened and closed.
  • the lid could be physically destroyed (e.g. the lid is a membrane that can be broken) to obtain the sample for analysis from the reservoir, or the lid could be opened and the sample for analysis could be obtained from the reservoir.
  • the inlets 31, 32, and 33 have holes that act as structural obstacles to prevent the passage of extracellular vesicles having sizes exceeding the first, second, and third reference sizes, respectively.
  • the second, third, and fourth flow paths have the same cross-sectional shape as the inlets 31, 32, and 33, respectively, or have a larger cross-sectional shape, thereby allowing extracellular vesicles having sizes equal to or smaller than the first, second, and third reference sizes, respectively, to accumulate in the reservoirs 11, 12, and 13, respectively.
  • the inlets 31, 32, and 33 are equipped with filtration filters, which can prevent the passage of extracellular vesicles having a particle size exceeding the first, second, and third reference particle size, respectively.
  • a person skilled in the art can select a filtration filter having an appropriate pore size as appropriate.
  • the second flow path, the third flow path, and the fourth flow path have the same cross-sectional shape as the inlets 31, 32, and 33, respectively, or a larger cross-sectional shape, which allows extracellular vesicles having a particle size equal to or smaller than the first, second, and third reference particle size, respectively, to accumulate in the reservoirs 11, 12, and 13, respectively.
  • the sample flows through a channel 111 formed toward each inlet 112. Therefore, extracellular vesicles that pass through each inlet 112 pass through a channel 113 connected to a reservoir 114 and are accumulated in the reservoir 114. Furthermore, extracellular vesicles that do not pass through each inlet 112 flow to the channel 115 without leakage.
  • the inlet 112 is formed as a channel that is bent at a substantially right angle, but this is not necessarily required, and it is sufficient that the channel and inlet are formed so that the sample flowing through the channel 111 efficiently comes into contact with the inlet 112.
  • the biological sample loaded onto the receiver 10 progresses through the flow path by capillary action, and classification of the extracellular vesicles is achieved. In one embodiment, the biological sample loaded onto the receiver 10 progresses through the flow path by the pressure of the liquid delivery, and classification of the extracellular vesicles is achieved.
  • the micro/nano channel device itself does not have any actuating parts such as pumps or valves. Therefore, the micro/nano channel device is easy to manufacture.
  • the micro/nano channel device can be made by injection molding.
  • the inner surfaces of the channels, filters, receivers, and reservoirs that come into contact with the liquid in the micro/nano channel device can be hydrophilic (e.g., can have a hydrophilic coating).
  • the micro/nano channel device e.g., micro/nano channel devices 100, 200, and 600
  • a disk-shaped substrate see, e.g., Figures 4 and 5
  • the centrifugal force generated by rotation draws the sample loaded into the receiver 10 into the channel, thereby achieving classification of the extracellular vesicles.
  • multiple micro/nano channel devices are mounted on one substrate, but multiple devices are not necessarily required, and it is acceptable to mount only one micro/nano channel device. However, from the viewpoint of improving processing capacity, it is preferable that multiple micro/nano channel devices are mounted on one substrate.
  • the substrates may be stacked in a removable manner.
  • multiple substrates may be stacked to allow classification of multiple specimens at once.
  • the receivers of each micro/nano channel device are configured to be accessible from the top layer of the substrate.
  • the receiver itself may be on or within the substrate, but it is preferable that the receiver or the inlet of the channel flowing into the receiver is present in the top layer of the substrate.
  • the stacked substrates are separated after classification, and the analytical samples contained in each reservoir are collected.
  • the micro/nano channel device is vibrated to prevent clogging.
  • the micro/nano channel device is configured so that vibration is applied to the inlet to prevent clogging of the inlet (for example, the micro/nano channel device is placed on a vibration generator so that vibration is applied to the micro/nano channel device).
  • the micro/nano channel device is configured so that vibration is applied to the channel to prevent clogging of the channel (for example, the micro/nano channel device is placed on a vibration generator so that vibration is applied to the micro/nano channel device).
  • the micro/nano channel device of the present disclosure is preferably provided on or within a disk-shaped substrate 501.
  • the substrate 501 may have any shape as long as it is rotatable.
  • the substrate 501 may have a rotationally symmetric shape.
  • the substrate may have a regular polygonal shape or a disk shape.
  • the substrate 501 may rotate about its center of gravity as the axis of rotation.
  • the micro/nano channel device of the present disclosure may also be provided on the back surface of the substrate 501. In this case, the receiver 10 of the micro/nano channel device formed on the back surface is preferably configured to allow sample introduction from the front surface.
  • a plurality of micro/nano channel devices of the present disclosure may be provided on a substrate (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 or more).
  • a substrate e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 or more.
  • four micro/nano channel devices of the present disclosure are mounted on one substrate 501.
  • the classification device 500 for extracellular vesicles has a vibration mechanism 504 and can impart vibration to the micro/nano channel device 501 of the present disclosure. Vibration may be constantly imparted to the micro/nano channel device of the present disclosure, or may be imparted at a predetermined timing. Vibration of the micro/nano channel device of the present disclosure will be beneficial in preventing clogging of the sample in each channel and at each inlet.
  • the classification device 500 for extracellular vesicles has a rotation mechanism 502, a support shaft 503, and a substrate 501, and the rotation mechanism 502 and the substrate 501 are connected (fixed) by the support shaft 503.
  • the rotation can be performed at a speed appropriate for the sample to move through the channel.
  • the classification device 500 for extracellular vesicles has a vibration mechanism 504, a rotation mechanism 502, a support shaft 503, and a substrate 501.
  • the extracellular vesicles can be classified by size.
  • the classified samples can then be subjected to analysis.
  • Example 1 of a micro/nano channel device 200 Example 2 of a micro/nano channel device 10: Sample inlet (receiver) 11: First reservoir 12: Second reservoir 13: Third reservoir 21: First flow path 22: Second flow path 23: Third flow path 24: Fourth flow path 25: Fifth flow path 26: Sixth flow path 27: Seventh flow path 31: Inlet of second flow path 32: Inlet of fourth flow path 33: Inlet of sixth flow path 41: Reservoir (e.g., waste liquid container) 111: nth flow channel 112: pth inlet 113: n+1th flow channel 114: pth reservoir 115: n+2th flow channel 300: Example of a disk-shaped substrate having a plurality of micro/nano flow channel device examples 1 mounted thereon 400: Example of a disk-shaped substrate having a plurality of micro/nano flow channel device examples 2 mounted thereon 500: Example of a classification device 501: Disk-shaped substrate having a micro/n

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Abstract

本開示は、細胞外小胞を分級する装置に関する。本開示はまた、細胞外小胞を分級し、細胞外小胞に含まれるタンパク質を検出または分析するためのインビトロの方法に関する。

Description

細胞外小胞を分級する装置、および細胞外小胞を分級し、細胞外小胞に含まれるタンパク質を検出または分析するためのインビトロの方法
　本開示は、細胞外小胞を分級する装置（より具体的にはマイクロ／ナノ流路デバイス）、および細胞外小胞を分級し、細胞外小胞に含まれるタンパク質を検出または分析するためのインビトロの方法に関する。
　細胞は、細胞外小胞を細胞外に放出する。放出される細胞外小胞は、放出する細胞の生理状態に応じた内容物を含む。したがって、細胞外小胞を分析することにより、放出した細胞の生理状態を推測し得る。例えば、エクソソームを分析することにより、そのソースにがん細胞が含まれるかを推測することができると期待されている。非特許文献１では、がん細胞から放出されるエクソソームを単離し、タンパク質を分析する方法が開示されている。
　非特許文献２では、エクソソームの膜分画と内腔分画を分離して、それぞれを分析する方法が開示されている。さらに、特許文献１および２では、チオ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオ－ＮＡＤ）サイクリング法が開示されている。チオ－ＮＡＤサイクリング法では、チオ－ＮＡＤとＮＡＤＨ、および３α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α－ＨＳＤ）の存在下で、その基質であるアンドロステロン３－リン酸などのアンドロステロン骨格を有する基質を生成すると、その量に応じて感度よくチオ－ＮＡＤＨが産生される。この手法は、非特許文献１および２においても用いられている。チオ－ＮＡＤＨは、４０５ｎｍの吸光により定量が可能である。
ＪＰ５２６５８１６Ｂ ＪＰ５５００９８５Ｂ
Ｉｈａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　６５４：　１１４８３１，　２０２２ Ｔｓｕｒｕｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒｓ，　１４（１６）：　３８８７，　２０２２
　本開示は、細胞外小胞を分級する装置、および細胞外小胞を分級し、細胞外小胞に含まれるタンパク質を検出または分析するためのインビトロの方法を提供する。本開示では、好ましくは、細胞外小胞はエクソソームであり、装置は、エクソソーム分画をサイズに基づく分級により取得する装置であり、および、方法は、エクソソームを分級し、エクソソームに含まれるタンパク質を検出または分析するためのインビトロの方法であり得る。本開示はまた、例えば、ポリマー沈殿法とマイクロ流路デバイスによる分級と高感度タンパク質検出技術を組み合わせることによって、少量サンプルからでも迅速または簡便にエクソソーム分画を調製し、エクソソームに含まれる膜タンパク質または内腔タンパク質を分析する方法を提供する。本開示の方法では、エクソソーム分画の取得工程は、好ましくは、基本的には粒径サイズに基づく分離と、ポリマー沈殿法による沈殿によるエクソソームの精製工程しか含まない。
　本開示によれば、例えば以下の発明が提供される。
（１）エクソソームを含む分析用試料を分析するためのインビトロの方法（例えば、エクソソームの内腔に含まれるタンパク質を検出または定量するためのインビトロの方法）であって、
　対象から得られた生体試料を用意することと、
　分級デバイス中のマイクロ／ナノ流路デバイス内で前記生体試料中の細胞外小胞をサイズによる分級に供して、これにより、エクソソームを含む少なくとも１以上の分析用試料を得ることと、
　得られた各分析用試料に含まれるエクソソームの内腔のタンパク質を検出または定量することと、
を含む、方法。
（２）上記（１）に記載の方法であって、
　前記検出または定量が、分析用試料中に存在するタンパク質に結合した酵素標識抗体と、前記酵素による基質からの生成物の検出または定量であり、前記生成物の検出または定量は、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤおよび／またはチオＮＡＤＰ、並びにデヒドロゲナーゼ（ＤＨ）の存在下で、酵素サイクリング反応によりチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨを生成させ、生成したチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨの存在を検出するまたはその量を測定することで行う、
　好ましくは、分析用試料中に存在するタンパク質に結合した酵素標識抗体と、前記酵素による基質からの生成物の検出または定量が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）と酵素サイクリング法または酵素サイクリング改良法により、
　さらに好ましくは、ＥＬＩＳＡが、アルカリホスファターゼ標識抗体と、リン酸化３α－ヒドロキシステロイドを含む基質の脱リン酸化反応を含み、酵素サイクリング法が、チオ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）存在下で、３α－ヒドロキシステロイドを含む基質を３α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α－ＨＳＤ）と反応させてチオ－ＮＡＤＨを生成することを含む、
方法。
（３）上記（１）または（２）に記載の方法であって、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバと、
　第１の試料が流れる第１の流路と、
　第１の流路から第１の試料が流入する第１の流入口を備え、
　第１の流入口は第２の流路に連結し、第１の流入口は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料がリザーバに蓄積され、第１の流路は、第１の流入口（すなわち、第２の流路への流入口）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、第３の流路から第３の試料が流入するリザーバを備え、第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料がリザーバに蓄積する、方法。
（４）上記（１）または（２）に記載の方法であって、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第１の試料が流れる第１の流路と、
　第１の流路から第１の試料が流入する第１の流入口を備え、
　第１の流入口は第２の流路に連結し、第１の流入口は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路は、第１のリザーバに連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、第１の流路は、第２の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第３の流路から第２の試料が流入する第２の流入口をさらに備え、
　第２の流入口は第４の流路に連結し、第２の流入口は、第２の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第４の流路は、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第４の流路は、第２のリザーバに連結し、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、第３の流路は、第２の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第３の試料が流入し、第３の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第５の流路に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第５の流路から第３の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）または、第５の流路から第３の試料が流入する第３の流入口をさらに備え、
　第５の流路が第３の流入口を備えている場合には、第３の流入口は第６の流路に連結し、第３の流入口は、第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第６の流路は、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第６の流路は、第３のリザーバに連結し、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積され、第５の流路は、第６の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第４の試料が流入し、第４の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第７の流路に連結し、第７の流路は、第４の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）または、更なる流路に連結されていてもよく、
　第１の基準粒径＜第２の基準粒径＜第３の基準粒径を満たし、
　第１の分析用試料、第２の分析用試料、および第３の分析用試料のいずれか１以上が分析される（特に、前記分析用試料のいずれか１以上に含まれるエクソソームの内腔に含まれるタンパク質が検出または定量される）、
方法。
（５）上記（３）または（４）に記載の方法であって、
　マイクロ／ナノ流路デバイスが、円盤状の基板内または基板上に形成されている、
方法。
（６）上記（３）～（５）のいずれかに記載の方法であって、
　マイクロ／ナノ流路デバイスが、回転し、回転による遠心力が流路中の試料を駆動し、これにより、試料が流路を流れ、試料中の細胞外小胞が分級される、方法。
（７）上記（３）～（６）のいずれかに記載の方法であって、
　マイクロ／ナノ流路デバイスが、振動し、これにより、流入口の目詰まりが防がれる、または解消される、方法。
（８）上記（４）～（７）のいずれかに記載の方法であって、
　第１の流路が第２の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第１の流路を流れる第１の試料が、第２の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第１の試料から第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、
　第３の流路が第４の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第３の流路を流れる第３の試料が、第４の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第３の試料から第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、
　第５の流路が第６の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第５の流路を流れる第５の試料が、第６の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第５の試料から第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積される、
方法。
（９）上記（１）～（８）のいずれかに記載の方法であって、
　単離された生体試料から、細胞外小胞の集団を含む試料を得ることが、ポリマー沈殿法によって細胞外小胞を沈降させることを含む、方法。
（１０）上記（９）に記載の方法であって、
　単離された生体試料から、細胞外小胞の集団を含む試料を得ることが、ポリマー沈殿法の前に試料を遠心処理および／またはフィルタリング処理に供することをさらに含み、これにより、細胞および細胞残屑が除去される、方法。
（１１）細胞外小胞の分級デバイスであって、
　マイクロ／ナノ流路デバイスを備え、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバと、
　レシーバからの第１の試料が流入する第１の流路と、
　第１の流路から第１の試料が流入する第１の流入口を備え、
　第１の流入口は第２の流路に連結し、第１の流入口は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路は、第１のリザーバに連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、第１の流路は、第２の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第３の流路から第２の試料が流入する第２の流入口をさらに備え、
　第２の流入口は第４の流路に連結し、第２の流入口は、第２の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第４の流路は、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第４の流路は、第２のリザーバに連結し、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、第３の流路は、第２の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第３の試料が流入し、第３の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第５の流路に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第５の流路から第３の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）または、第５の流路から第３の試料が流入する第３の流入口をさらに備え、
　第５の流路が第３の流入口を備えている場合には、第３の流入口は第６の流路に連結し、第３の流入口は、第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第６の流路は、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第６の流路は、第３のリザーバに連結し、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積され、第５の流路は、第６の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第４の試料が流入し、第４の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第７の流路に連結し、第７の流路は、第４の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）または、更なる流路に連結されていてもよく、
　第１の基準粒径＜第２の基準粒径＜第３の基準粒径を満たす、
分級デバイス。
（１２）上記（１１）に記載の分級デバイスであって、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスが、円盤状の基板内または基板上に形成されている、分級デバイス。
（１３）上記（１２）に記載の分級デバイスであって、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスを回転させる回転部を備え、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスが、回転し、回転による遠心力が流路中の試料を駆動し、これにより、各試料が流路を流れ、各試料中の細胞外小胞が分級される、分級デバイス。
（１４）上記（１１）～（１３）のいずれかに記載の分級デバイスであって、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスを振動させる振動発生部を備え、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスが、振動し、これにより、流入口の目詰まりが防がれる、分級デバイス。
（１５）上記（１１）～（１４）のいずれかに記載の分級デバイスであって、
　第１の流路が第２の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第１の流路を流れる第１の試料が、第２の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第１の試料から第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、
　第３の流路が第４の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第３の流路を流れる第３の試料が、第４の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第３の試料から第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、
　第５の流路が第６の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第５の流路を流れる第５の試料が、第６の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第５の試料から第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積される、
分級デバイス。
　本開示によればまた、ポリマー沈殿法によるエクソソームの沈殿と、サイズに基づく細胞外小胞からのエクソソームの分離を含む、エクソソーム分画の取得方法と、これを用いたタンパク質の検出または定量方法が提供される。
（２１）生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を検出または定量するためのインビトロの方法であって、
　生体試料中の細胞外小胞をポリマー沈殿法により沈殿させ、溶液に分散させて細胞外小胞を含む第１の溶液を得ることと、
　第１の溶液をマイクロ／ナノ流路デバイスに適用し、マイクロ／ナノ流路デバイス中でサイズにより細胞外小胞を分級して、エクソソームを含む第２の溶液（分析用試料）を得ることと、
を含む、方法。
（２２）上記（２１）に記載の方法であって、
　第２の溶液（分析用試料）中のエクソソームのタンパク質を検出または定量することをさらに含む、方法。
（２３）上記（２２）に記載の方法であって、
　検出または定量が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）と酵素サイクリング法または酵素サイクリング改良法により実施される、方法。
（２４）上記（２３）に記載の方法であって、
　ＥＬＩＳＡが、アルカリホスファターゼ標識抗体と、リン酸化３α－ヒドロキシステロイドを含む基質の脱リン酸化反応を含み、酵素サイクリング法が、チオ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）存在下で、３α－ヒドロキシステロイドを含む基質を３α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α－ＨＳＤ）と反応させてチオ－ＮＡＤＨを生成することを含む、方法。
（２５）上記（２１）～（２４）に記載の方法であって、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスが、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバと、
　レシーバからの第１の試料が流入する第１の流路と、
　第１の流路から第１の試料が流入する第１の流入口を備え、
　第１の流入口は第２の流路に連結し、第１の流入口は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路は、第１のリザーバに連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、第１の流路は、第２の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第３の流路から第２の試料が流入する第２の流入口をさらに備え、
　第２の流入口は第４の流路に連結し、第２の流入口は、第２の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第４の流路は、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第４の流路は、第２のリザーバに連結し、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、第３の流路は、第２の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第３の試料が流入し、第３の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第５の流路に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第５の流路から第３の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）または、第５の流路から第３の試料が流入する第３の流入口をさらに備え、
　第５の流路が第３の流入口を備えている場合には、第３の流入口は第６の流路に連結し、第３の流入口は、第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第６の流路は、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第６の流路は、第３のリザーバに連結し、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積され、第５の流路は、第６の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第４の試料が流入し、第４の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第７の流路に連結し、第７の流路は、第４の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）または、更なる流路に連結されていてもよく、
　第１の基準粒径＜第２の基準粒径＜第３の基準粒径を満たす、
方法。
（２６）上記（２１）～（２５）のいずれかに記載の方法であって、
　各分析用試料を得るまでの工程に、超遠心分離、およびアフィニティー精製の工程を含まない。
（２７）上記（２１）～（２５）のいずれかに記載の方法であって、
　各分析用試料を得るまでの工程は、サイズに基づく細胞外小胞の分画（例えば、０．２２μｍポアサイズのフィルタなどのフィルタによるフィルタリング処理、１００ｋＤａの分画分子量を有する限外ろ過フィルタなどの限外ろ過フィルタによる限外ろ過処理、および、マイクロ／ナノ流路デバイスによるサイズに基づく分級）、遠心分離、溶液交換、およびポリマー沈殿法による細胞外小胞の分離しか含まない、方法。
（２８）上記（２１）～（２５）のいずれかに記載の方法であって、
　第１の溶液を得るまでの工程（前処理工程）は、サイズに基づく細胞外小胞の分画（例えば、０．２２μｍポアサイズのフィルタなどのフィルタによるフィルタリング処理、１００ｋＤａの分画分子量を有する限外ろ過フィルタなどの限外ろ過フィルタによる限外ろ過処理）、遠心分離、溶液交換、およびポリマー沈殿法による細胞外小胞の分離しか含まない、方法。
（３１）分級デバイスであって、マイクロ／ナノ流路デバイス６００を備え、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイス６００は、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバ１０と、
　第１の試料が流れる第１の流路２１と、
　第１の流路２１から第１の試料が流入する第１の流入口３１を備え、
　第１の流入口３１は第２の流路２２に連結し、第１の流入口３１は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路２２は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路２２は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料がリザーバ１１に蓄積され、第１の流路２１は、第１の流入口３１（すなわち、第２の流路２２への流入口３１）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路２３に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、第３の流路２３から第３の試料が流入するリザーバ１２を備え、第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料がリザーバ１２に蓄積する、分級デバイス。
（３２）上記（２１）～（２４）に記載の方法であって、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイス６００は、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバ１０と、
　第１の試料が流れる第１の流路２１と、
　第１の流路２１から第１の試料が流入する第１の流入口３１を備え、
　第１の流入口３１は第２の流路２２に連結し、第１の流入口３１は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路２２は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路２２は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料がリザーバ１１に蓄積され、第１の流路２１は、第１の流入口３１（すなわち、第２の流路２２への流入口３１）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路２３に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、第３の流路２３から第３の試料が流入するリザーバ１２を備え、第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料がリザーバ１２に蓄積する、方法。
（３３）上記（１）～（９）のいずれかに記載の方法であって、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイス６００は、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバ１０と、
　第１の試料が流れる第１の流路２１と、
　第１の流路２１から第１の試料が流入する第１の流入口３１を備え、
　第１の流入口３１は第２の流路２２に連結し、第１の流入口３１は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路２２は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路２２は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料がリザーバ１１に蓄積され、第１の流路２１は、第１の流入口３１（すなわち、第２の流路２２への流入口３１）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路２３に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、第３の流路２３から第３の試料が流入するリザーバ１２を備え、第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料がリザーバ１２に蓄積する、方法。
本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスの例を示す。 本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスの更なる例を示す。 本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスにおける第１～３の流入口の例を示す。図中の矢印は試料の流れの方向を示す。 本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスの複数個を備えた円盤状の基板の例を示す。 本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスの複数個を備えた円盤状の基板の例を示す。 本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスを備えた円盤状の基板を含む分級デバイスの例を示す。 本開示による細胞外小胞の分離と分析のスキームの例を示す。 本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスの更なる例を示す。 積層化した複数の本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスを含む分級デバイスの例を示す。
＜定義＞
　本明細書では、単数形は複数形を除外しない。本明細書では、用語「含む」は用語「からなる」を包含する。用語「含む」は、記載のない第三の構成をさらに含むことを許容するが、用語「からなる」は、記載のない第三の構成をさらに含むことを許容しない。
　本明細書では、「対象」とは、哺乳動物、マウスおよびラットなどの齧歯類、ブタおよびウシなどの家畜動物、イヌおよびネコなどの愛玩動物、並びにヒトおよびサルなどの霊長類が挙げられる。対象は、好ましくはヒトである。対象は、健常者であるか、疾患もしくは病的状態を発症するリスクのある対象であるか、または、疾患もしくは病的状態を有する対象である。
　本明細書では、「細胞外小胞」は、細胞によって分泌される小胞である。細胞外小胞が有する膜は、細胞が有する膜に由来し、したがって、細胞膜上の構成要素（例えば、細胞膜を構成する脂質および膜タンパク質）の少なくとも１つ以上を含んでいる。細胞外小胞としては、アポトーシス小胞（粒径１μｍ～５μｍ）、微小胞（粒径１００ｎｍ～１０００ｎｍ）、エクソソーム（粒径５０ｎｍ～１５０ｎｍ）及びエクソメア（粒径３５ｎｍ程度またはそれ以下）が挙げられる。生体内では、細胞は細胞外（特に体液中）に細胞外小胞を分泌し、培養条件下では、細胞は細胞外（特に培養液中）に細胞外小胞を分泌する。細胞外小胞は、典型的には、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ポリマー沈降、超遠心分離、および限外ろ過、並びにこれらの組合せにより、細胞培養上清または組織上清から取得される。取得される細胞外小胞の特性は、取得方法により大きく異なる。また、細胞は様々な細胞外小胞を細胞外に分泌するため、その中から特定の性質を有する有用な細胞外小胞を特定すること、または濃縮、富化、単離、もしくは精製することは必ずしも容易ではない。エクソソームは、由来する細胞により異なるが、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、テトラスパニン（ＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９）、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＣ７０、およびＨＳＰ９０等）、およびフロチリンからなる群から選択される１つ以上、典型的にはすべてを発現する。エクソソームまたはその量は、例えば、テトラスパニンのいずれか１以上の発現により確認され得る。エクソソームまたはその量はまた、粒径により確認され得る。微小胞（ＭＶ）は、細胞膜が外側へ芽出して形成され、１００～１０００ｎｍ程度の直径を有する。ＭＶは、セレクチン、ＣＤ４０などを発現することで知られる。アポトーシス小胞は、細胞がプログラム細胞死（アポトーシス）により生じさせる小胞であり、５０～５０００ｎｍの直径を有する。アポトーシス小胞は、アネキシンＶ、ホスファチジルセリンなどを発現することで知られる。
　本明細書では、「ＣＤ９」は、テトラスパニンと呼ばれるタンパク質ファミリーの一員であり、膜貫通ドメインを有し、細胞膜やエクソソームの膜上に存在する。ヒトＣＤ９の標準的な配列は、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）においてＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＮＰ＿００１７６０として登録されている。ＣＤ９には、上記ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＮＰ＿００１７６０として登録されている配列に対応する配列を有し、ＣＤ９の機能を有するタンパク質が含まれる。ＣＤ９に結合する抗体としては、特に限定されないが例えば、クローンＨＩ９ａ、ＭＺ３、Ｍ２／５７、ＳＮ４　Ｃ３－３Ａ２、Ｂｕ１６、ＭＥＭ－６１、およびＭＦ１が挙げられる。これらのいずれかのクローンの重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を有し、ＣＤ９に結合する抗体もまた、有益な抗ＣＤ９抗体であり得る。
　本明細書では、「ＣＤ６３」は、テトラスパニンと呼ばれるタンパク質ファミリーの一員であり、膜貫通ドメインを有し、細胞膜やエクソソームの膜上に存在する。ヒトＣＤ６３の標準的な配列は、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）においてＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ１３０１７．１として登録されている。ＣＤ６３には、上記ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ１３０１７．１として登録されている配列に対応する配列を有し、ＣＤ６３の機能を有するタンパク質が含まれる。ＣＤ６３に結合する抗体としては、特に限定されないが例えば、クローンＭＥＭ－２５９、Ｔｓ６３、ＴＥＡ３／１８、ＣＣ２５、ＲＥＡ１０５５、ＲＦＡＣ４、ＭＥ４９１、ＭＸ－４９．１２９．５、Ｈ５Ｃ６、３Ｈ６、およびＡＤ１が挙げられる。これらのいずれかのクローンの重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を有し、ＣＤ６３に結合する抗体もまた、有益な抗ＣＤ６３抗体であり得る。
　本明細書では、「ＣＤ８１」は、テトラスパニンと呼ばれるタンパク質ファミリーの一員であり、膜貫通ドメインを有し、細胞膜やエクソソームの膜上に存在する。ヒトＣＤ８１の標準的な配列は、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）においてＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ９３０４７．１として登録されている。ＣＤ８１には、上記ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ９３０４７．１として登録されている配列に対応する配列を有し、ＣＤ８１の機能を有するタンパク質が含まれる。ＣＤ８１に結合する抗体としては、特に限定されないが例えば、クローン１Ｄ６、５Ａ６、２Ｆ７、Ｅａｔ２、ＲＥＡ５１３、ＪＳ－８１、Ｍ３８、およびＡ１５０４が挙げられる。これらのいずれかのクローンの重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を有し、ＣＤ８１に結合する抗体もまた、有益な抗ＣＤ８１抗体であり得る。
　本明細書では、「単離」とは、それが産生された環境から、少なくとも他の１以上の成分を除去することを指す。したがって、単離は、単一成分のみとなるまで精製することを要求せず、他の成分が同一組成物中に存在していることを許容する。細胞外小胞の単離は、分析に十分な程度に他の成分から分離されていればよい。
　本明細書では、「生体試料」とは、対象から得られるサンプル（例えば、細胞外液、および体液）を意味する。生体試料としては、血液、唾液、涙液、尿、腹水、胸水、および分泌液（例えば、内分泌液および外分泌液、例えば、膵液などの消化液）が挙げられる。本明細書では、生体試料は、マイクロ／ナノ流路デバイスへの適用に適した液体試料（「生体液体試料」ともいう）である。本明細書では、「血液サンプル」とは、対象から得られる血液（例えば、末梢血）または血液に由来するサンプル（例えば、血清および血漿）である。
　本明細書では、「抗体」は、免疫グロブリンを意味する。抗体は、様々なアイソタイプの抗体であり得、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＤであり得る。抗体は、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、細胞内で産生されるときにはシグナルペプチドを有しているが、細胞外に分泌されるときには当該シグナルペプチドは切除されている。抗体には、その全長を含む抗体（全長抗体）およびその抗原結合性断片が包含される。ある動物種の試料を検査する場合には、当該動物種のタンパク質に結合する抗体が用いられるべきである。例えば、ヒトの試料を検査する場合には、ヒトタンパク質に結合する抗体が用いられる。抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）により抗原と結合する。抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１～３）を含む重鎖と軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖とを含む。抗体は、重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（すなわち、重鎖ＣＤＲ１～３）と軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（すなわち、軽鎖ＣＤＲ１～３）を有する。可変領域中のＣＤＲ以外の部分は、抗体間でのバリエーションに乏しく、フレームワーク領域と呼ばれる。
本明細書では、「抗体の抗原結合性断片」は、抗体の断片であって、抗原への結合性を維持した断片を意味する。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（単鎖（Ｆｖ）２）が挙げられる。例えば、抗体をパパインで消化すると、Ｆａｂを得ることができる。あるいは、抗体をペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）２を得ることができ、これをさらに還元するとＦａｂ’を得ることができる。その他の抗体の抗原結合性断片も当業者に周知の方法で作製することができる。本発明ではこのような抗体の抗原結合性断片を用いることができる。
　本明細書では、「酵素標識抗体」とは、酵素標識法に用いられる抗体であり、特定の酵素により標識されている。酵素標識抗体は、固相化された抗原に結合するが、その後、試料および結合しなかった抗体が洗い流された後に、固相上に残った酵素標識抗体に対して基質を反応させ、反応生成物の存在または量により試料中の抗原の量を推定することに用いられる。
　本明細書では、「マイクロ流路デバイス」とは、試料が流れる流路を有するデバイスである。マイクロ流路デバイスにおいては、流路は、マイクロメートルオーダーおよび／またはサブマイクロメートルオーダー（ナノメートルオーダー）の高さおよび幅を有し、流路の目的に応じた粒径を有する細胞外小胞を含む試料をスムーズに流すことができる。本明細書では、マイクロ流路デバイスは、サブマイクロメートルオーダー（ナノメートルオーダー）の高さおよび幅の流路しか有しないデバイス（ナノ流路デバイス）を包含する概念であり、マイクロ／ナノ流路デバイスとも表記され得る。本開示のいずれの態様においても、マイクロ／ナノ流路デバイスは、好ましくはナノ流路デバイスである。
　本明細書では、「分析用試料」とは、分析に供され得る試料である。分析用試料が複数存在する場合には、全てが実際に分析される必要はないが、少なくともそのうちの１つは分析される。
＜本開示の方法＞
　本開示は、細胞外小胞の内腔に含まれるタンパク質を検出または定量するためのインビトロの方法を提供する。ある好ましい態様では、細胞外小胞は、エクソソームを含む。したがって、本開示は、エクソソームの内腔に含まれるタンパク質を検出または定量するためのインビトロの方法も提供する。
　本開示の方法は、単離された生体試料を得ることを含む。細胞外小胞は、対象から得られた生体試料中に含まれる。単離された生体試料は、前処理がなされており、これによりマイクロ／ナノ流路デバイスへの適用に適したものになっている。例えば、遠心分離やフィルタリング処理、限外ろ過処理、ポリマー沈降法処理により、流路を目詰まりさせる固形分等が除去されている。遠心分離は、細胞外小胞が沈殿しない程度の強度（例えば、２０００×ｇで３０分等）で行われ得る。フィルタリング処理は、例えば、市販の０．４５μｍまたは０．２２μｍのポアサイズを有するフィルタにより行われ得る。限外ろ過は、例えば、１００ｋＤａの分画分子量を有する限外ろ過フィルタにより行われ得る。ポリマー沈降法は、試料に親水性ポリマーを添加し、細胞外小胞の表面から水分子を奪って、細胞外小胞の溶解度を下げることにより、細胞外小胞を沈殿させる方法である。親水性ポリマーとしては、特に限定されないが例えば、ポリエチレングリコールなどの様々な親水性ポリマーを用いることができる。前処理は、遠心分離、フィルタリング処理、限外ろ過処理、およびポリマー沈降法処理の１以上、２、３、または全てを含み得る。前処理後に得られる細胞外小胞を含む集団は、少なくともエクソソームを含み、追加で、アボトーシス小胞、および微小胞（ＭＶ）を含み得る。前処理後の段階では、エクソソームは、他の細胞外小胞から単離されていない。細胞外小胞は、５０ｎｍ～１μｍの粒径範囲を有するが、このような細胞外小胞の集団を含む試料を得る方法は当業者であれば適宜実施することができる。
　マイクロ／ナノ流路デバイスは、微量の試料の分析に向いている。マイクロ／ナノ流路デバイスに適用する生体試料の容積は、特に限定されないが例えば、１μＬ～５００μＬ、１０μＬ～１００μＬ、５μＬ～５０μＬ、１μＬ～１０μＬ、または１μＬ～５μＬであり得る。微量の生体試料の分析が可能であり得る。
　本開示の方法は、前処理後の生体試料中の細胞外小胞をマイクロ／ナノ流路デバイス内でサイズによる分級に供して、これにより、エクソソームを含む少なくとも１以上の分析用試料を得ることをさらに含む。分析用試料は、例えば、１０３個／μＬ以上、１０４個／μＬ以上、１０５個／μＬ以上、１０６個／μＬ以上、または１０７個／μＬ以上の細胞外小胞を含み得る。分析用試料は、例えば、１０３個／μＬ～１０６個／μＬ、１０６個／μＬ～１０１０個／μＬ、１０７個／μＬ～１０９個／μＬ、１０８個／μＬ～１０１０個／μＬ、または１０９個／μＬ～１０１１個／μＬの細胞外小胞を含み得る。測定対象となるタンパク質によって取得量を適宜調整することができるであろう。
　ポリマー沈殿法により単離された細胞外小胞は、一般的には夾雑物を多く含む。しかし、マイクロ／ナノ流路デバイスに適用するために、マイクロ／ナノ流路デバイスの目詰まりの原因となる物質は前処理により除かれ、また、マイクロ／ナノ流路デバイス中では、サイズにより試料中の細胞外小胞が分級されるため、マイクロ／ナノ流路デバイスへの生体試料の適用は、夾雑物による影響を最小化され得る。
　マイクロ／ナノ流路デバイスでは、サイズによる分級は、１以上、２以上、３以上、または４以上の群への分級を含み、それぞれ１以上、２以上、３以上、または４以上の分析用試料が得られる。本開示によれば、得られた分析用試料の少なくとも１以上、２以上、３以上、４以上、またはすべてを分析に供することができる。
　分析は、エクソソーム全体に対して行ってもよいが、エクソソームを膜分画と内腔分画とに分離した後に、エクソソームの膜画分と内腔画分とのそれぞれに対して行うことができる。分離は、エクソソームの破壊による内腔画分の抽出と、抽出後の膜分画の可溶化によりなされ得る。エクソソームの破壊は、機械的処理（例えば、凍結融解処理や超音波破砕処理）または化学的処理（例えば、界面活性剤処理）により行うことができる。また、内腔画分の抽出後の膜画分の可溶化は、膜画分の可溶化に適した条件下における界面活性剤処理により行うことができる。エクソソームの膜画分と内腔画分の分離は、例えば、市販のキット（例えば、Ｍｅｍ－ＰＥＲ　Ｐｌｕｓ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（８９８４２；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて行うこともできる（Ｉｈａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　６５４：　１１４８３１，　２０２２参照）。
　エクソソームに含まれるタンパク質の分析、またはエクソソームの膜画分もしくは内腔画分に含まれるタンパク質の分析は、例えば、１アッセイあたり１００μＬの試料を測定する場合に、１０－１５モル／アッセイ以上、１０－１６モル／アッセイ以上、１０－１７モル／アッセイ以上または１０－１８モル／アッセイ以上（例えば、１０－１５モル／アッセイ～１０－２１モル／アッセイ、例えば、１０－１５モル／アッセイ～１０－２０モル／アッセイ、例えば、１０－１５モル／アッセイ～１０－１９モル／アッセイ、また例えば、１０－１５モル／アッセイ～１０－１８モル／アッセイ）の検出感度を少なくとも有するタンパク質検出または定量技術により行われ得る。そのような検出または定量技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）と組み合わせた酵素サイクリング法特に酵素サイクリング改良法（例えば、ＪＰ５２６５８１６ＢおよびＪＰ５５００９８５Ｂ参照）が挙げられ、エクソソームに含まれるタンパク質の分析、またはエクソソームの膜画分もしくは内腔画分に含まれるタンパク質の分析は、特に酵素サイクリング改良法により実施することができる。
　ＥＬＩＳＡは、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。サンドイッチＥＬＩＳＡでは、固相化された抗体と酵素標識抗体が用いられ得る。分析対象のタンパク質などの成分を抗体が固相化された表面（適宜ブロッキングされている）に接触させ、表面に結合させ、その後、結合しなかったタンパク質を洗い流し、酵素標識抗体で表面上のタンパク質を検出する。酵素標識抗体法では、酵素標識抗体中の酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）が基質を脱リン酸化して反応生成物が得られる。
　マイクロ／ナノ流路デバイスによる細胞外小胞の精製の課題は、大量の試料を処理できないことにある。より具体的には、このＥＬＩＳＡでは、検出感度が十分ではない。しかし、酵素サイクリング法では、１０－１５モル／アッセイの検出感度を得ることができ、酵素サイクリング改良法（例えば、ＪＰ５２６５８１６ＢおよびＪＰ５５００９８５Ｂ参照）によれば、１０－１８モル／アッセイの検出感度を得ることができる（この系では１０－２１モル／アッセイの物質の検出例も見出されている）から、マイクロ／ナノ流路デバイスによる課題を克服し得る。したがって、本開示では、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）と組み合わせた酵素サイクリング改良法が分析用試料の分析に好ましく用いられる。
　酵素サイクリング改良法は、例えば、チオ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオ－ＮＡＤ）サイクリング法であり得る。チオ－ＮＡＤサイクリング法では、３α－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α－ＨＳＤ）が用いられる。３α－ＨＳＤは、ＮＮＡＤＨとチオ－ＮＡＤの存在下で、３α－ヒドロキシステロイドとそれに対応する３－ケトステロイド間の基質サイクリングを触媒する。チオ－ＮＡＤは上記反応により還元され、チオ－ＮＡＤＨを形成する。チオ－ＮＡＤＨを定量することにより、３α－ヒドロキシステロイドの検出および定量が可能となる。チオ－ＮＡＤＨは、４０５ｎｍに吸光を有する。したがって、４０５ｎｍの吸光測定によってチオ－ＮＡＤＨ量を測定することができる。３α－ヒドロキシステロイドは、そのリン酸化形態からアルカリホスファターゼにより産生させ得る。酵素標識抗体法の酵素としてアルカリホスファターゼを用い、基質としてリン酸化３α－ヒドロキシステロイドを用いることにより、抗原量に応じたチオ－ＮＡＤＨの産生が可能となる。ある好ましい態様では、アルカリホスファターゼの基質は、アンドロステロン骨格を有する基質（但し、前記アンドロステロン骨格は、３α位にヒドロキシ基、１７位にカルボニル基を有する）、例えば、アンドロステロン３－リン酸、例えば、１７β－メトキシ－５β－アンドロスタン－３α－オール　３－リン酸を含み得る。アルカリホスファターゼは、特に限定されないが例えば、マレイミド基またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）を付加した上で、これらの基を介して抗体のアミノ基またはスルフヒドリル基と連結させることができる。その他、ビオチンとアビジン類との結合を利用した酵素標識などが周知慣用技術であり、酵素標識抗体の作製に用いられ得る。
　検出または定量されるタンパク質は、好ましくは、テトラスパニンファミリーのタンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１からなる群から選択される１つ、２つ、または全て）を含み得る。これらを測定することにより、得られた細胞外小胞がエクソソームを含むことを検証し得る。検出または定量されるタンパク質は、その他、エクソソーム等の細胞外小胞に含まれる膜タンパク質または内腔タンパク質である（例えば、上記Ｉｈａ　ｅｔ　ａｌ．，　２０２２参照）。膜タンパク質または内腔タンパク質は、疾患マーカーであり得る。疾患マーカーとしては特に限定されないが、腫瘍マーカーおよび脳神経疾患マーカーが挙げられる。検出または定量されるタンパク質は、テトラスパニンファミリーのタンパク質などのエクソソームマーカー以外の、１以上、好ましくは２以上のタンパク質を含み得る。
　検出または定量されるタンパク質としては、例えば、アミロイドβが挙げられる。アミロイドβ（Ａβ）は、アルツハイマー病患者の脳に認められるアミロイド班の主成分である。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質に由来し、β－セクレターゼおよびγ－セクレターゼによる切断により産生される。Ａβ（１－４０）、およびＡβ（１－４２）並びにＡβ（１－４２）／Ａβ（１－４０）比が検出または定量されうる。Ａβ（１－４０）は、例えば、Ａβ（１－４０）に結合する抗体により検出され得、特に限定されないが例えば、クローン２２９４、５Ｃ３、ＢＡＭ－１０、ＢＤＩ３５０、およびＡｂ４０．１、並びにこれらの抗体の重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を有する抗体のいずれかにより検出され得る。Ａβ（１－４２）は、例えば、Ａβ（１－４２）に結合する抗体により検出され得、特に限定されないが例えば、クローンＥＰＲ９２９６、ｍＯＣ６４、２Ｃ２Ｇ５、１２Ｆ４、およびＮＲ２２１Ｐ、並びにこれらの抗体の重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を有する抗体のいずれかにより検出され得る。例えば、標準品を用いたＥＬＩＳＡアッセイによりこれらのペプチドを定量することもできるであろう。脳神経疾患マーカーとしては、アミロイドベータの他、タウタンパク質、およびニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）がアルツハイマー病のマーカーとして知られ、α－シヌクレイン、およびドパミン輸送体、ＮｆＬがパーキンソン病マーカーとして知られ、ハンチンチン、およびＮｆＬがハンチントン病マーカーとして知られる。また、腫瘍マーカーとしては、特に限定されないが例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、ノンホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、膀胱がん、脳腫瘍等の固形がん、及び骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫等からなる群から選択される腫瘍のマーカーが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、特に限定されないが例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ｈＣＧ、ＣＡ－１２５、ＣＡ１９－９、ＰＳＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＷＴ１、ＰＳＭＡ、ＣＴＡ、ＥＧＦＲ、ＢＣＬ－２、変異型ＫＲＡＳ、サイクリンＤ１、ＴＥＲＴ、ＣＤ２０、変異型ＢＲＡＦ、ＴＡＧ－７２、グリア細胞腫瘍組織因子、ＣＸ３ＣＲ１、および変異型ＭＥＴが挙げられる。タンパク質としては、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩも測定され得る。
　ある態様では、ＥＬＩＳＡからチオ－ＮＡＤサイクリング法までの一連の工程は、ＣＬＯＣＫ技術を用いて自動化することもできるであろう（特開２０１７－７５８０７号およびＡｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ，　１２：　４８５８－４８６６，　２０２０）。ＣＬＯＣＫ技術では、試薬を導入するリザーバと、反応チャンバと、リザーバと反応チャンバを連結する流路を有するマイクロ／ナノ流路デバイス（特に円盤状デバイス）を用い、マイクロ／ナノ流路デバイスを回転させることにより発生する遠心力を活用して試薬を適切な順番で反応チャンバに送液し、反応させることができる。より具体的には、遠心時の回転中心（起点）から離れるように試薬を含むリザーバから反応チャンバに向けて形成された流路を有する複数のチャネルを有し、各チャネルが同じ長さまたは異なる長さの流路を有するように構成され、異なる長さの流路を有する場合には、それにより試薬が反応チャンバに導入される順序が調整されている。反応チャンバに流入する流路は、その一部において、Ｕ字形状の２つの流路と当該流路に挟まれた流路（すなわち、遠心力に対して逆行する方向に伸びる流路）を備えていてもよく、このようにすることで、試薬の反応チャンバへの漏れを防止することができる。このマイクロ／ナノ流路デバイスは、バルブやポンプなどの駆動部材を備える必要が無く、射出成形により簡便に製造し得る。
　本開示によれば、生体試料中のエクソソームに含まれるタンパク質を検出または定量するためのインビトロの方法であって、
　生体試料中の細胞外小胞をポリマー沈殿法により沈殿させ、溶液に分散させて細胞外小胞を含む第１の溶液を得ることと、
　第１の溶液をマイクロ／ナノ流路デバイスに適用し、マイクロ／ナノ流路デバイス中でサイズにより細胞外小胞を分級して、エクソソームを含む第２の溶液（分析用試料）を得ることと、
を含む、方法が提供される。この方法は、第２の溶液（分析用試料）中のエクソソームのタンパク質を検出または定量することをさらに含み得る。検出または定量は、上記の通り、ＥＬＩＳＡと酵素サイクリング法または酵素サイクリング改良法により実施することができる。このようにすることで、エクソソームを調製する際に超遠心分離などの煩雑で時間を要する工程を実施しないでエクソソームの分析が可能となる。ポリマー沈殿法では夾雑物が多いことが問題として指摘されているが、フィルタリング処理（例えば、０．２２μｍポアサイズのフィルタによるフィルタリング処理、および１００ＫＤａの分画分子量を有するフィルタによる限外ろ過処理）、およびマイクロ／ナノ流路デバイスに適用することで、夾雑物を除去することができる。マイクロ／ナノ流路デバイスでは、大量の試料を処理できず、例えば、マイクロリットルオーダー（１ｍＬ未満）の試料の処理がせいぜいであるが、酵素サイクリング法、特に酵素サイクリング改良法により、微量サンプルからのタンパク質検出が可能となる。このように、本開示によれば、簡便かつ迅速に、エクソソーム分画を取得し、分析する手法が提供され得る。本開示の方法は、試料の前処理、および分級処理が短期間で完了させ得る。本開示の方法は、例えば、１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内に、もしくは２日以内に、例えば、２日間～４日間で、または２日間、３日間、もしくは４日間で、用意された生体試料から、それに含まれるエクソソーム中のタンパク質の検出および定量までの全工程を完了し得る。本開示の方法は、例えば、試料の前処理、および分級処理が１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内に、もしくは２日以内に、例えば、２日間～４日間で、もしくは１日間～３日間で、または１日間、２日間、３日間、もしくは４日間で完了され得る。本開示の方法は、細胞外小胞を含む生体試料の取得およびポリマー沈殿で、例えば約２時間～約３時間を要し、マイクロ／ナノ流路デバイスによる分級に例えば約２０分～約３０分を要する。したがって、分級によるエクソソーム分画の取得までの時間は、例えば約２時間２０分～約３時間半程度である。エクソソーム分画をさらに膜成分と内腔成分とに分画する時間は、例えば、約２時間～約３時間である。酵素サイクリング法は、例えば、約３時間～約５時間である。したがって、生体試料からタンパク質の検出まで１日以内、１８時間以内、１５時間以内、１２時間以内、または１０時間以内、例えば、約７時間～１１時間、例えば、約８時間～約９時間であり得る。
＜本開示のマイクロ／ナノ流路デバイス＞
　上記方法においてマイクロ／ナノ流路デバイスが用いられ得る。本開示では、上記方法での使用に適したマイクロ／ナノ流路デバイス、および当該マイクロ／ナノ流路デバイスを含む細胞外小胞（特にエクソソーム）の分級デバイスが提供される。
　本開示によれば、細胞外小胞（特にエクソソーム）の分級デバイスは、マイクロ／ナノ流路デバイスを備える。
　本開示によれば、前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバ１０と、
　第１の試料が流れる第１の流路２１と、
　第１の流路２１から第１の試料が流入する第１の流入口３１を備え、
　第１の流入口３１は第２の流路２２に連結し、第１の流入口３１は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路２２は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路２２は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバ１１に蓄積され、第１の流路２１は、第１の流入口３１（すなわち、第２の流路２２への流入口３１）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路２３に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第３の流路２３から第３の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）４１または、第３の流路２３から第２の試料が流入する第２の流入口３２をさらに備え、
　第３の流路２３が第２の流入口３２を備えている場合には、第２の流入口３２は第４の流路２４に連結し、第２の流入口３２は、第２の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第４の流路２４は、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第４の流路２４は、第２のリザーバ１２に連結し、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバ１２に蓄積され、第３の流路２３は、第２の流入口３２（すなわち、第４の流路２４への流入口３２）を通過しない細胞外小胞を含む第３の試料が流入し、第３の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第５の流路２５に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第５の流路２５から第３の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）４１または、第５の流路２５から第３の試料が流入する第３の流入口３３をさらに備え、
　第５の流路２５が第３の流入口３３を備えている場合には、第３の流入口３３は第６の流路２６に連結し、第３の流入口３３は、第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第６の流路２６は、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第６の流路２６は、第３のリザーバ１３に連結し、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバ１３に蓄積され、第５の流路２５は、第３の流入口（すなわち、第６の流路２６への流入口３３）を通過しない細胞外小胞を含む第４の試料が流入し、第４の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第７の流路２７に連結し、第７の流路は、第４の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）４１または、更なる流路に連結されていてもよい。
　ある態様では、図８に示されるように、前記マイクロ／ナノ流路デバイス６００は、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバ１０と、
　第１の試料が流れる第１の流路２１と、
　第１の流路２１から第１の試料が流入する第１の流入口３１を備え、
　第１の流入口３１は第２の流路２２に連結し、第１の流入口３１は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路２２は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路２２は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料（または廃液）がリザーバ１１（または廃液容器１１）に蓄積され、第１の流路２１は、第１の流入口３１（すなわち、第２の流路２２への流入口３１）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路２３に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、第３の流路２３から第３の試料が流入するリザーバ１２を備え、第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料がリザーバ１２に蓄積する。この場合の第１の基準粒径は、エクソソーム粒径の下限値であり得、例えば、約３０ｎｍ～約６５ｎｍ、約４０ｎｍ～約６０ｎｍ、約４５ｎｍ～約５５ｎｍ、または約５０ｎｍであり得る。第１の試料は、例えば、０．２２μｍポアサイズのフィルタによりフィルタリング処理されている。この例示ケースの場合では、リザーバ１１に第１の基準値以下の細胞外小胞が含まれ、リザーバ１２にエクソソーム画分が含まれることとなる。したがって、リザーバ１２に含まれる第２の分析用試料（第１の基準粒径以上の細胞外小胞を含む試料）を分析に供することができる。なお、細胞外小胞のモニタリングのためにリザーバ１１に含まれる第１の分析用試料が分析されてもよい。第１の分析用試料は必要がなければ分析されなくてよく、例えば、廃棄されてもよい。
　ある態様では、図１に示されるように、前記マイクロ／ナノ流路デバイス１００は、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバ１０と、
　第１の試料が流れる第１の流路２１と、
　第１の流路２１から第１の試料が流入する第１の流入口３１を備え、
　第１の流入口３１は第２の流路２２に連結し、第１の流入口３１は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路２２は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路２２は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバ１１に蓄積され、第１の流路２１は、第１の流入口３１（すなわち、第２の流路２２への流入口３１）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路２３に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第３の流路２３から第２の試料が流入する第２の流入口３２をさらに備え、
　第３の流路２３が第２の流入口３２を備えている場合には、第２の流入口３２は第４の流路２４に連結し、第２の流入口３２は、第２の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第４の流路２４は、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第４の流路２４は、第２のリザーバ１２に連結し、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバ１２に蓄積され、第３の流路２３は、第２の流入口３２（すなわち、第４の流路２４への流入口３２）を通過しない細胞外小胞を含む第３の試料が流入し、第３の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第５の流路２５に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第５の流路２５から第３の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）４１を備える。
　ある好ましい態様では、第１の基準粒径＜第２の基準粒径＜第３の基準粒径を満たす。
　このような構成とすることで、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイス（例えば、マイクロ／ナノ流路デバイス１００）は、第１の試料が第１の流路２１を流れ、第１の流入口３１に向かって流れ、第１の基準粒径以下の粒径を有する粒子が、第１の流入口３１および第２の流路２２を通過して第１のリザーバ１１に蓄積され、第１の分析用試料となる。一方で、第１の基準粒径を超える粒径を有する粒子は、第１の流入口３１を通過できず、第３の流路２３に流入して、第２の流入口３２に向かって流れる。第２の基準粒径以下の粒径を有する粒子が、第２の流入口３２および第４の流路２４を通過して第２のリバーバ１２に蓄積され、第２の分析用試料となり、第２の基準値を超える粒径を有する粒子は、第２の流入口３２を通過できず、第５の流路２５に流入する。このようにして、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスは、細胞外小胞をサイズに応じて（または基づいて）分級し、粒径サイズの異なる細胞外小胞を含む分析用試料を提供する。リザーバ４１に含まれる第４の試料は、分析に供してもよいし、必要が無ければ廃棄してもよい。
　ある態様では、図２に示されるように、前記マイクロ／ナノ流路デバイス２００は、
　試料（第１の試料）を受けるレシーバ１０と、
　第１の試料が流れる第１の流路２１と、
　第１の流路２１から第１の試料が流入する第１の流入口３１を備え、
　第１の流入口３１は第２の流路２２に連結し、第１の流入口３１は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路２２は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路２２は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバ１１に蓄積され、第１の流路２１は、第１の流入口３１（すなわち、第２の流路２２への流入口３１）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路２３に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
　第３の流路２３から第２の試料が流入する第２の流入口３２をさらに備え、
　第３の流路２３が第２の流入口３２を備えている場合には、第２の流入口３２は第４の流路２４に連結し、第２の流入口３２は、第２の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第４の流路２４は、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第４の流路２４は、第２のリザーバ１２に連結し、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバ１２に蓄積され、第３の流路２３は、第２の流入口３２（すなわち、第４の流路２４への流入口３２）を通過しない細胞外小胞を含む第３の試料が流入し、第３の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第５の流路２５に連結し、
　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
第５の流路２５から第３の試料が流入する第３の流入口３３をさらに備え、
　第３の流入口３３は第６の流路２６に連結し、第３の流入口３３は、第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第６の流路２６は、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第６の流路２６は、第３のリザーバ１３に連結し、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバ１３に蓄積され、第５の流路２５は、第３の流入口（すなわち、第６の流路２６への流入口３３）を通過しない細胞外小胞を含む第４の試料が流入し、第４の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第７の流路２７に連結し、第７の流路は、第４の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）４１を備える。
　ある好ましい態様では、第１の基準粒径＜第２の基準粒径＜第３の基準粒径を満たす。
　このような構成とすることで、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイス（例えば、マイクロ／ナノ流路デバイス２００）は、第１の試料が第１の流路２１を流れ、第１の流入口３１に向かって流れ、第１の基準粒径以下の粒径を有する粒子が、第１の流入口３１および第２の流路２２を通過して第１のリザーバ１１に蓄積され、第１の分析用試料となる。一方で、第１の基準粒径を超える粒径を有する粒子は、第１の流入口３１を通過できず、第３の流路２３に流入して、第２の流入口３２に向かって流れる。第２の基準粒径以下の粒径を有する粒子が、第２の流入口３２および第４の流路２４を通過して第２のリザーバ１２に蓄積され、第２の分析用試料となる。第２の基準粒径を超える粒径を有する粒子は、第２の流入口３２を通過できず、第５の流路２５に流入する。第３の基準粒径以下の粒径を有する粒子が、第３の流入口３３および第６の流路２６を通過して第３のリザーバ１３に蓄積され、第３の分析用試料となる。第３の基準粒径を超える粒径を有する粒子は、第３の流入口３３を通過できず、第７の流路２７に流入し、第４の試料が流入するリザーバ（例えば、廃液容器）４１に導入される。このようにして、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスは、細胞外小胞をサイズに応じて（または基づいて）分級し、粒径サイズの異なる細胞外小胞を含む分析用試料を提供する。リザーバ４１に含まれる第４の試料は、分析に供してもよいし、必要が無ければ廃棄してもよい。
　前記マイクロ／ナノ流路デバイス１００におけるある好ましい態様では、第１の基準粒径は、約３０ｎｍ～約６５ｎｍ、約３５ｎｍ～約６０ｎｍ、約４０ｎｍ～約６０ｎｍ、約４５ｎｍ～約５５ｎｍ、または約５０ｎｍであり得る。ある好ましい態様では、第２の基準粒径は、約１２０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約１３０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約１４０ｎｍ～約１６０ｎｍ、または約１５０ｎｍであり得る。これによって、例えば、細胞外小胞からエクソソームとエクソソーム以外とを分離することができる。第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞または破片を含む試料は廃棄、または分析のために回収され得る。分析は、例えば、細胞、エクソソーム以外の細胞外小胞またはその破片の分析を含み得る。例えば、細胞、エクソソーム以外の細胞外小胞またはその破片の存在は、エクソソームおよびその単離条件の品質管理に活用され得る。例えば、エクソソームの破片の量が基準値以下である場合に、エクソソームが良好に単離されていると評価して、エクソソームを含む分画を回収するが、エクソソームの破片の量が基準値以上、または基準値を超える場合には、エクソソームが良好に単離されていないと評価してエクソソームを含む分画の分析を行わず、当該分画を廃棄することができる。
　前記マイクロ／ナノ流路デバイス２００におけるある好ましい態様では、第１の基準粒径は、約３０ｎｍ～約６５ｎｍ、約４０ｎｍ～約６０ｎｍ、約４５ｎｍ～約５５ｎｍ、または約５０ｎｍである。ある好ましい態様では、第３の基準粒径は、約１２０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約１３０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約１４０ｎｍ～約１６０ｎｍ、または約１５０ｎｍであり得る。これによって、例えば、細胞外小胞からエクソソームとエクソソーム以外とを分離することができる。また、第２の基準粒径は、第１の基準粒径と第３の基準粒径の間であり、エクソソームをさらにサイズで分級して分析したいときに好適である。第２の基準粒径は任意に設定され得、特に限定されないが、約７０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約１００ｎｍであり得る。第３の基準粒径以上の粒径を有する細胞外小胞または破片を含む試料は廃棄、または分析のために回収され得る。分析は、例えば、細胞、エクソソーム以外の細胞外小胞またはその破片等の分析を含み得る。例えば、細胞、細胞外小胞またはその破片の存在は、エクソソームおよびその単離条件の品質管理に活用され得る。例えば、細胞の破片等の量が基準値以下である場合に、エクソソームが良好に単離されていると評価して、エクソソームを含む分画を回収するが、エクソソームの破片の量が基準値以上、または基準値を超える場合には、エクソソームが良好に単離されていないと評価してエクソソームを含む分画の分析を行わず、当該分画を廃棄することができる。
　ある好ましい態様では、第１の基準粒径は約５０ｎｍであり、第２の基準粒径は約１００ｎｍであり、第３の基準粒径は約１５０ｎｍである。
　エクソソームをさらにサイズでさらに細かく分級したい場合には、流路に、そのための流入口とリザーバと前記流入口とリザーバを連結する流路を含む分級ユニットをさらに追加することができることを当業者であれば理解するであろう。例えば、分級ユニットは、ｎを自然数とし、第ｎの流入口と、第２ｎの流路と、第ｎのリザーバを有し、第ｎの流入口と、第ｎのリザーバとは第２ｎの流路により連結されている。第ｎの基準粒径＜第ｎ＋１の基準粒径を満たすように第ｎの流入口を設計し、第ｎの流入口を通過した細胞外小胞が通過できるように第２ｎの流路を設計し、第２ｎの流路に第ｎのリザーバを連結して、第ｎの分析用試料を第ｎのリザーバに蓄積することができる。このような分級ユニットを流路中に追加することにより、更なる詳細な細胞外小胞の分級が可能である。本発明の方法は、エクソソーム以外の細胞外小胞にも適用可能である。したがって、本発明によれば、細胞外小胞の分離方法であり、第１の基準粒径、第２の基準粒径、および第３の基準粒径はそれぞれ、取得したい小胞の粒径に応じて決定することができ、当業者が適宜決定することができる。細胞外小胞としては、アポトーシス小胞（粒径１μｍ～５μｍ）、微小胞（粒径１００ｎｍ～１０００ｎｍ）、エクソソーム（粒径５０ｎｍ～１５０ｎｍ）、及びエクソメア（粒径３５ｎｍ程度またはそれ以下）が挙げられ、それぞれの上限値、および下限値の周辺、並びにそれぞれの上限値を設定すれば、各細胞外小胞の全体を分離でき、下限値の中間の値に基準粒径を設定すれば、各細胞外小胞のうちの特定の粒径領域の小胞を分離することができよう。
　各リザーバからは分析用試料を取り出すことができるようにリザーバが設計されている。例えば、マイクロチップや針により分析用試料にアクセス可能な開口部を有する。あるいは、開口部は、開閉可能な蓋を備えていてもよいであろう。蓋は、物理的に破壊（例えば、蓋が破ることが可能な膜である）して、分析用試料をリザーバから取得してもよいし、蓋を開いてから分析用試料をリザーバから取得してもよい。
　ある好ましい態様では、流入口３１、３２、および３３は、孔を有し、当該孔が構造的な障害となって、それぞれ第１、第２、および第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げることができる。第２の流路、第３の流路、および第４の流路は、それぞれ、流入口３１、３２、および３３と同じ断面形状を有するか、またはそれよりも大きな断面形状を有し、これにより、それぞれ第１、第２、および第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞をリザーバ１１、１２、および１３にそれぞれ蓄積させることができる。
　ある好ましい態様では、流入口３１、３２、および３３は、ろ過フィルタを備え、これによりそれぞれ第１、第２、および第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げることができる。ろ過フィルタは、適切なポアサイズを有するものを当業者であれば適宜選択することができる。第２の流路、第３の流路、および第４の流路は、それぞれ、流入口３１、３２、および３３と同じ断面形状を有するか、またはそれよりも大きな断面形状を有し、これにより、それぞれ第１、第２、および第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞をリザーバ１１、１２、および１３にそれぞれ蓄積させることができる。
　ある態様では、孔は、矩形または円形であり得る。ある態様では、流路の断面も矩形または円形であり得る。
　本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスでは、図３に示されるように試料は、各流入口１１２に向けて形成された流路１１１を流れる。したがって、各流入口１１２を通過する細胞外小胞は、リザーバ１１４に連結された流路１１３を通過して、リザーバ１１４に蓄積される。また、各流入口１１２を通過しない細胞外小胞は、漏れなく流路１１５へ流れる。図では、流入口１１２は、略直角に折れ曲がった流路に形成されているが、必ずしもその必要はなく、流路１１１を流れる試料が流入口１１２に効率的に接触するように流路と流入口が形成されていればよい。
　ある態様では、レシーバ１０にロードされた生体試料は、毛細管現象により流路内を進行し、細胞外小胞の分級が達成される。ある態様では、レシーバ１０にロードされた生体試料は、送液の圧により流路内を進行し、細胞外小胞の分級が達成される。
　ある態様では、マイクロ／ナノ流路デバイス自体は、ポンプやバルブなどの駆動部分を有しない。したがって、マイクロ／ナノ流路デバイスの製造が容易である。例えば、マイクロ／ナノ流路デバイスは、射出成形により作成され得る。マイクロ／ナノ流路デバイス内の液体が接触する流路、フィルタ、レシーバ、およびリザーバのそれぞれの内面は、親水性であり得る（例えば、親水性のコーティングを有し得る）。
　ある好ましい態様では、リザーバ１１、１２、および１３、並びにリザーバ（例えば、廃液容器）４１は、それぞれ陰圧を有し、これにより、レシーバ１０にロードされたサンプルを流路内に引き込まれ、細胞外小胞の分級が達成される。
　ある好ましい態様では、マイクロ／ナノ流路デバイス（例えば、マイクロ／ナノ流路デバイス１００、２００、および６００）は、円盤状の基板上または基板内に設けられ（例えば、図４および５参照）、回転による遠心力によって、レシーバ１０にロードされたサンプルを流路内に引き込み、これにより細胞外小胞の分級が達成される。図では、一つの基板に複数のマイクロ／ナノ流路デバイスが搭載されているが、複数である必要は必ずしもなく、１つしかマイクロ／ナノ流路デバイスが搭載されていないことも許容される。但し、処理能力向上の観点からは、一つの基板に複数のマイクロ／ナノ流路デバイスが搭載されていることが好ましい。
　ある好ましい態様では、図９に示されるように、上記基板は、着脱可能に積層されてもよい。例えば、複数の基板が重層化され、一度に多検体を分級することができるように構成されていてもよい。その場合、各マイクロ／ナノ流路デバイスのレシーバは、基板の最上層から、アクセス可能に構成されている。例えば、レシーバ自体は、基板上または基板内にあってもよいが、レシーバまたはレシーバに流入する流路の流入口が基板の最上層に存在していることが好ましい。積層化された基板は、分級後にそれぞれ分離され、各リザーバに含まれる分析用試料が回収される。
　ある好ましい態様では、マイクロ／ナノ流路デバイスは、目詰まり防止のために振動する。例えば、流入口が目詰まりすることを防止するために、流入口に振動が加わるように、マイクロ／ナノ流路デバイスは構成される（例えば、マイクロ／ナノ流路デバイスに振動が加わるように、振動発生機上にマイクロ／ナノ流路デバイスが設置される）。また、流路が目詰まりすることを防止するために、流路に振動が加わるように、マイクロ／ナノ流路デバイスは構成される（例えば、マイクロ／ナノ流路デバイスに振動が加わるように、振動発生機上にマイクロ／ナノ流路デバイスが設置される）。
＜本開示の細胞外小胞（特にエクソソーム）の分級デバイス＞
　本開示によれば、細胞外小胞（特にエクソソーム）の分級デバイスが提供される。本開示の細胞外小胞（特にエクソソーム）の分級デバイス５００は、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスを有する。簡単には、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスを回転させる、および／または、これに振動を加えることができるものが想定される。
　本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスを回転させる観点で、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスは、円盤状の基板５０１上または基板内５０１に設けられていることが好ましい。基板５０１は、回転可能な形状であればどのような形状であってもよい。基板５０１は、回転対称な形状を有し得る。基板は、正多角形の形状または円盤状の形状を有し得る。基板５０１は、重心を回転軸として回転し得る。本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスは、基板５０１の裏面にもさらに設けられていてもよいであろう。この場合、裏面に形成されるマイクロ／ナノ流路デバイスのレシーバ１０は、表面から試料導入を可能とするように構成されていることが好ましい。
　多くの生体試料を同時に処理する観点で、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスは、基板上に複数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上）設けられていてもよい。例えば、図４および５の例では、１つの基板５０１に本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスが４つ搭載されている。
　ある好ましい態様では、細胞外小胞（特にエクソソーム）の分級デバイス５００は、振動機構５０４を有し、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイス５０１に振動を与えることができる。振動は、本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスに常に与えられていてもよく、あるいは、所定のタイミングで与えられてもよい。本開示のマイクロ／ナノ流路デバイスへの振動は、各流路内および各流入口での試料の目詰まり防止のために有益であろう。
　ある好ましい態様では、細胞外小胞（特にエクソソーム）の分級デバイス５００は、回転機構５０２と支軸５０３と基板５０１を有し、回転機構５０２と基板５０１は、支軸５０３で連結（固定）されている。これにより、回転機構５０２を駆動させることによって基板５０１を回転させることができ、したがって、基板５０１上、または内に形成されたマイクロ／ナノ流路デバイスを回転させてこれに遠心力を与えることができる。回転は、試料が流路を進むのに適切な速度で行われ得る。
　ある好ましい態様では、細胞外小胞（特にエクソソーム）の分級デバイス５００は、振動機構５０４と、回転機構５０２と支軸５０３と基板５０１を有する。
　このようにして、細胞外小胞をサイズで分級することができる。分級された試料は、その後、分析に供することができる。
図面内の符号の説明
１００：マイクロ／ナノ流路デバイスの例１
２００：マイクロ／ナノ流路デバイスの例２
１０：試料導入口（レシーバ）
１１：第１のリザーバ
１２：第２のリザーバ
１３：第３のリザーバ
２１：第１の流路
２２：第２の流路
２３：第３の流路
２４：第４の流路
２５：第５の流路
２６：第６の流路
２７：第７の流路
３１：第２の流路の流入口
３２：第４の流路の流入口
３３：第６の流路の流入口
４１：リザーバ（例えば、廃液容器）
１１１：第ｎの流路
１１２：第ｐの流入口
１１３：第ｎ＋１の流路
１１４：第ｐのリザーバ
１１５：第ｎ＋２の流路
３００：マイクロ／ナノ流路デバイスの例１を複数搭載した円盤状基板の例
４００：マイクロ／ナノ流路デバイスの例２を複数搭載した円盤状基板の例
５００：分級デバイスの例
５０１：マイクロ／ナノ流路デバイスを搭載した円盤状基板
５０２：モーター
５０３：円盤状基板とモーターとを連結する支軸
５０４：振動発生機
６００：マイクロ／ナノ流路デバイスの例３
７００：積層化したマイクロ／ナノ流路デバイスを含む分級デバイスの例


 

Claims (15)

  1. 　エクソソームの内腔に含まれるタンパク質を検出または定量するためのインビトロの方法であって、
    　対象から得られた生体試料を用意することと、
    　分級デバイス中のマイクロ／ナノ流路デバイス内で前記生体試料中の細胞外小胞をサイズによる分級に供して、これにより、エクソソームを含む少なくとも１以上の分析用試料を得ることと、
    　得られた各分析用試料に含まれるエクソソームの内腔のタンパク質を検出または定量することと、
    を含む、方法。
  2. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記検出または定量が、分析用試料中に存在するタンパク質に結合した酵素標識抗体と、前記酵素による基質からの生成物の検出または定量であり、前記生成物の検出または定量は、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤおよび／またはチオＮＡＤＰ、並びにデヒドロゲナーゼ（ＤＨ）の存在下で、酵素サイクリング反応によりチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨを生成させ、生成したチオＮＡＤＨおよび／またはチオＮＡＤＰＨの存在を検出するまたはその量を測定することで行う、
    方法。
  3. 　請求項１または２に記載の方法であって、
    　　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
    　試料（第１の試料）を受けるレシーバと、
    　第１の試料が流れる第１の流路と、
    　第１の流路から第１の試料が流入する第１の流入口を備え、
    　第１の流入口は第２の流路に連結し、第１の流入口は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路は、第１のリザーバ１１に連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料がリザーバに蓄積され、第１の流路は、第１の流入口（すなわち、第２の流路への流入口）を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路に連結し、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、第３の流路から第３の試料が流入するリザーバを備え、第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料がリザーバに蓄積する、方法。
  4. 　請求項１または２に記載の方法であって、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
    　第１の試料が流れる第１の流路と、
    　第１の流路から第１の試料が流入する第１の流入口を備え、
    　第１の流入口は第２の流路に連結し、第１の流入口は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路は、第１のリザーバに連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、第１の流路は、第２の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路に連結し、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
    　第３の流路から第２の試料が流入する第２の流入口をさらに備え、
    　第２の流入口は第４の流路に連結し、第２の流入口は、第２の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第４の流路は、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第４の流路は、第２のリザーバに連結し、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、第３の流路は、第２の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第３の試料が流入し、第３の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第５の流路に連結し、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
    　第５の流路から第３の試料が流入するリザーバまたは、第５の流路から第３の試料が流入する第３の流入口をさらに備え、
    　第５の流路が第３の流入口を備えている場合には、第３の流入口は第６の流路に連結し、第３の流入口は、第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第６の流路は、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第６の流路は、第３のリザーバに連結し、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積され、第５の流路は、第６の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第４の試料が流入し、第４の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第７の流路に連結し、第７の流路は、第４の試料が流入するリザーバまたは、更なる流路に連結されていてもよく、
    　第１の基準粒径＜第２の基準粒径＜第３の基準粒径を満たし、
    　第１の分析用試料、第２の分析用試料、および第３の分析用試料のいずれか１以上が分析される、
    方法。
  5. 　請求項３または４に記載の方法であって、
    　マイクロ／ナノ流路デバイスが、円盤状の基板内または基板上に形成されている、
    方法。
  6. 　請求項３～５のいずれか一項に記載の方法であって、
    　マイクロ／ナノ流路デバイスが、回転し、回転による遠心力が流路中の試料を駆動し、これにより、試料が流路を流れ、試料中の細胞外小胞が分級される、方法。
  7. 　請求項３～６のいずれか一項に記載の方法であって、
    　マイクロ／ナノ流路デバイスが、振動し、これにより、流入口の目詰まりが防がれる、または解消される、方法。
  8. 　請求項４～７のいずれか一項に記載の方法であって、
    　第１の流路が第２の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第１の流路を流れる第１の試料が、第２の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第１の試料から第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、
    　第３の流路が第４の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第３の流路を流れる第３の試料が、第４の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第３の試料から第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、
    　第５の流路が第６の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第５の流路を流れる第５の試料が、第６の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第５の試料から第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積される、
    方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の方法であって、
    　単離された生体試料から、細胞外小胞の集団を含む試料を得ることが、ポリマー沈殿法によって細胞外小胞を沈降させることを含む、方法。
  10. 　請求項９に記載の方法であって、
    　単離された生体試料から、細胞外小胞の集団を含む試料を得ることが、ポリマー沈殿法の前に試料を遠心処理および／またはフィルタリング処理に供することをさらに含み、これにより、細胞および細胞残屑が除去される、方法。
  11. 　細胞外小胞の分級デバイスであって、
    　マイクロ／ナノ流路デバイスを備え、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
    　試料（第１の試料）を受けるレシーバと、
    　レシーバからの第１の試料が流入する第１の流路と、
    　第１の流路から第１の試料が流入する第１の流入口を備え、
    　第１の流入口は第２の流路に連結し、第１の流入口は第１の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第２の流路は、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第２の流路は、第１のリザーバに連結し、第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、第１の流路は、第２の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第２の試料が流入し、第２の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第３の流路に連結し、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
    　第３の流路から第２の試料が流入する第２の流入口をさらに備え、
    　第２の流入口は第４の流路に連結し、第２の流入口は、第２の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第４の流路は、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第４の流路は、第２のリザーバに連結し、第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、第３の流路は、第２の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第３の試料が流入し、第３の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第５の流路に連結し、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスは、
    　第５の流路から第３の試料が流入するリザーバまたは、第５の流路から第３の試料が流入する第３の流入口をさらに備え、
    　第５の流路が第３の流入口を備えている場合には、第３の流入口は第６の流路に連結し、第３の流入口は、第３の基準粒径を超える粒径を有する細胞外小胞の通過を妨げる流入口であり、第６の流路は、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を通過させるための流路であり、第６の流路は、第３のリザーバに連結し、第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積され、第５の流路は、第６の流路の流入口を通過しない細胞外小胞を含む第４の試料が流入し、第４の試料を目詰まりなく通過させることができる径を有する第７の流路に連結し、第７の流路は、第４の試料が流入するリザーバまたは、更なる流路に連結されていてもよく、
    　第１の基準粒径＜第２の基準粒径＜第３の基準粒径を満たす、
    分級デバイス。
  12. 　請求項１１に記載の分級デバイスであって、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスが、円盤状の基板内または基板上に形成されている、分級デバイス。
  13. 　請求項１２に記載の分級デバイスであって、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスを回転させる回転部を備え、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスが、回転し、回転による遠心力が流路中の試料を駆動し、これにより、各試料が流路を流れ、各試料中の細胞外小胞が分級される、分級デバイス。
  14. 　請求項１１～１３のいずれか一項に記載の分級デバイスであって、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスを振動させる振動発生部を備え、
    　前記マイクロ／ナノ流路デバイスが、振動し、これにより、流入口の目詰まりが防がれる、分級デバイス。
  15. 　請求項１１～１４のいずれか一項に記載の分級デバイスであって、
    　第１の流路が第２の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第１の流路を流れる第１の試料が、第２の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第１の試料から第１の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第１の分析用試料が第１のリザーバに蓄積され、
    　第３の流路が第４の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第３の流路を流れる第３の試料が、第４の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第３の試料から第２の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第２の分析用試料が第２のリザーバに蓄積され、
    　第５の流路が第６の流路への流入口が配置された部分に屈曲を有し、第５の流路を流れる第５の試料が、第６の流路への流入口に向けて流れ、これにより、第５の試料から第３の基準粒径以下の粒径を有する細胞外小胞を含む第３の分析用試料が第３のリザーバに蓄積される、
    分級デバイス。


     
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