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WO2025018068A1 - 環状ｄｎａの製造方法 - Google Patents

環状ｄｎａの製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2025018068A1
WO2025018068A1 PCT/JP2024/021729 JP2024021729W WO2025018068A1 WO 2025018068 A1 WO2025018068 A1 WO 2025018068A1 JP 2024021729 W JP2024021729 W JP 2024021729W WO 2025018068 A1 WO2025018068 A1 WO 2025018068A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
dna
enzyme
circular dna
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/021729
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雅裕 中野
祥太 鈴木
正幸 末次
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Moderna Enzymatics Co Ltd
Original Assignee
Moderna Enzymatics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Moderna Enzymatics Co Ltd filed Critical Moderna Enzymatics Co Ltd
Publication of WO2025018068A1 publication Critical patent/WO2025018068A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing circular DNA in a cell-free system, and to a circular DNA used in said production method.
  • RCR Replication Cycle Reaction
  • Circular DNA especially circular double-stranded DNA
  • Circular DNA is used in a variety of situations, such as as a template plasmid for mRNA synthesis, and demand for it is increasing.
  • the main objective of the present invention is to provide an efficient method for producing circular DNA.
  • the present invention relates to the following.
  • [1] (1) preparing a circular DNA template, the circular DNA including (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and (ii) a gyrase binding sequence; The circular DNA does not contain a DnaA box cluster at a position different from the replication origin sequence; (2) The circular DNA prepared in (1) above and the following: The first group of enzymes catalyzes the replication of circular DNA; A second group of enzymes that synthesize two sister circular DNAs that form catenanes; and a third group of enzymes that catalyze the separation reaction of the two sister circular DNAs. and (3) incubating the reaction mixture formed in (2) at a temperature of 80° C.
  • a method for producing a circular DNA comprising the steps of: [2] The method of [1], wherein the replication origin sequence of (i) has a mutant double-strand cleavage region having a higher AT content than the double-strand cleavage region of a wild-type replication origin sequence, and the double-strand cleavage region has L, M, and R elements. [3] The method according to [1] or [2] above, wherein the gyrase binding sequence (ii) is a sequence derived from bacteriophage Mu.
  • [4] (1) preparing a circular DNA template, the circular DNA (i) including a replication origin capable of binding to an enzyme having DnaA activity, and the replication origin has a mutant double-strand cleavage region that has a higher AT content than the double-strand cleavage region of a wild-type replication origin, the double-strand cleavage region having L, M and R elements; (2) The circular DNA prepared in (1) above and the following: The first group of enzymes catalyzes the replication of circular DNA; A second group of enzymes that synthesize two sister circular DNAs that form catenanes; and a third group of enzymes that catalyze the separation reaction of the two sister circular DNAs. and (3) incubating the reaction mixture formed in (2) at a temperature of 80° C.
  • a method for producing a circular DNA comprising the steps of: [5] Further, following the above (3), (4) diluting the reaction mixture by at least two-fold with a solution not containing the first to third enzyme groups, and maintaining the resulting dilution under conditions in which the second enzyme group and the third enzyme group can act; The method according to [4] above, [6]
  • the mutated double-strand cleavage region Among the L, M and R elements constituting the double-strand cleavage region, the M and/or R element is a mutant double-strand cleavage region having a higher AT content compared to the wild-type M and/or R element.
  • the M element constituting the double-strand cleavage region is a mutant double-strand cleavage region having a repeated AT sequence, and/or the R element constituting the double-strand cleavage region is a mutant double-strand cleavage region having four or more consecutive KAK (K is T or G) motif sequences.
  • K is T or G
  • the circular DNA further comprises a ter sequence inserted outward relative to the replication origin sequence, the ter sequence is not adjacent to the replication origin sequence;
  • the reaction solution of (2) further contains a protein having an activity of binding to a ter sequence and inhibiting replication. Any of the methods [1] to [6] above.
  • the circular DNA further comprises a ter sequence inserted outward relative to a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity; the ter sequence is a ter sequence in which a mutation has been introduced into a wild-type ter sequence by substituting, deleting, or inserting one or more bases,
  • the first enzyme group includes an enzyme having DnaA activity, an enzyme having SSB or DnaB-type helicase activity, an enzyme having DNA helicase loader activity, an enzyme having DNA primase activity, an enzyme having DNA clamp activity, and an enzyme or enzyme group having DNA polymerase III activity;
  • the second group of enzymes includes an enzyme having DNA polymerase I activity and an enzyme having DNA ligase activity,
  • the third group of enzymes includes an enzyme having topoisomerase III activity or an enzyme having topoisomerase IV activity.
  • reaction solution further contains a linear-DNA-specific exonuclease.
  • reaction solution further contains a single-stranded DNA-specific exonuclease.
  • a circular DNA comprising (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity, and (ii) a gyrase binding sequence, The circular DNA does not contain a DnaA box cluster at a position different from the replication origin sequence.
  • a circular DNA comprising: (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity; (ii) a gyrase binding sequence; and (iii) a plasmid replication origin,
  • the circular DNA does not contain a DnaA box cluster at a position different from the replication origin sequence.
  • circular DNA can be produced efficiently.
  • circular DNA that can be produced efficiently by the PCR method can be provided.
  • FIG. 1 is a gel electrophoresis diagram in Example 5.
  • FIG. 1 is a gel electrophoresis diagram in Example 6.
  • FIG. 11 is a gel electrophoresis diagram in Example 7.
  • FIG. 11 is a gel electrophoresis diagram in Example 8.
  • FIG. 1 is a diagram of gel electrophoresis in Example 9-1.
  • FIG. 1 is a diagram of gel electrophoresis in Example 9-2.
  • FIG. 11 is a gel electrophoresis diagram in Example 10.
  • FIG. 13 is a gel electrophoresis diagram in Example 12.
  • FIG. 13 is a gel electrophoresis diagram in Example 13.
  • Figure 12A shows a schematic diagram of the amplification cycle of circular DNA by PCR
  • Figure 12B shows a schematic diagram of the process of initiation of replication from oriC
  • Fig. 13 shows the results of Example 14-2.
  • Fig. 13A shows the sequences of a wild type and two oriC cassette mutants.
  • Fig. 13B shows the results of amplifying DNA with different GC contents using three oriC cassettes.
  • Fig. 13C shows the results of real-time PCR performed using three oriC cassettes.
  • Fig. 14 shows the results of Example 14-3.
  • Fig. 14A shows the sequences of the wild type and two oriC cassette mutants.
  • Fig. 14B is a schematic diagram showing the mutation positions in four oriC cassette mutants.
  • Fig. 14A shows the sequences of the wild type and two oriC cassette mutants.
  • Fig. 14B is a schematic diagram showing the mutation positions in four oriC cassette mutants.
  • Fig. 14A shows the sequences of the wild type and
  • FIG. 14C shows the results of real-time PCR performed using five oriC cassettes.
  • Fig. 14D shows the results of amplifying DNA with different GC contents using four oriC cassettes.
  • Fig. 15 shows the results of Example 14-4.
  • Fig. 15A shows the sequences of the wild type and two oriC cassette mutants.
  • Fig. 15B is a schematic diagram showing the mutation positions in the three oriC cassette mutants.
  • Fig. 15C shows the results of real-time PCR performed using four oriC cassettes.
  • Fig. 15D shows the sequences of the wild type and four oriC cassette mutants.
  • Figure 16 shows the results of Example 14-5.
  • Figure 16A shows the results of DNA amplification by PCR at different temperatures using seven types of oriC cassettes.
  • FIG. 15 is a gel electrophoresis diagram in Example 15.
  • 13 is a graph showing the change in DNA concentration versus reaction time in Example 15.
  • FIG. 16 is a gel electrophoresis diagram in Example 16.
  • FIG. 17 is a gel electrophoresis diagram in Example 17.
  • 13 is a graph showing the change in DNA concentration versus reaction time in Example 18.
  • 13 is a graph showing the change in DNA concentration versus reaction time in Example 19.
  • the circular DNA used as the template is preferably double-stranded.
  • the circular DNA used as the template is not particularly limited as long as it contains a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and has the characteristics described below, and examples thereof include a circular DNA obtained by cutting a natural circular DNA such as a circular chromosome of a microorganism by enzyme treatment or the like, linking it to another DNA fragment, and circularizing the resultant, and a circular DNA that is entirely artificially synthesized.
  • a known replication origin sequence present in bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis can be obtained from a public database such as NCBI.
  • a replication origin sequence can also be obtained by cloning a DNA fragment capable of binding to an enzyme having DnaA activity and analyzing its base sequence.
  • a sequence in which one or more bases of a known replication origin sequence have been mutated by substitution, deletion, or insertion, and a modified sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity can also be used.
  • the replication origin sequence used in the present invention is preferably oriC and its modified sequence, and more preferably oriC derived from Escherichia coli and its modified sequence.
  • the circular DNA used as a template in this embodiment may be a circular DNA that originally contains a replication origin sequence, or may be a circular DNA that does not originally contain a replication origin sequence and has a replication origin sequence introduced therein.
  • the replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity is oriC derived from E. coli and a modified sequence thereof, and is a sequence having a length of 265 bp or more. In one embodiment, the replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity is a sequence having SEQ ID NO: 4, or a modified sequence of SEQ ID NO: 4, which does not have mutations in the 12 or 13 bases at both ends of SEQ ID NO: 4.
  • the replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity is a modified sequence of SEQ ID NO: 4, which is a sequence having SEQ ID NO: 29 (5' end) and/or SEQ ID NO: 30 (3' end) as underlined below, or a sequence having a sequence in SEQ ID NO: 29 or 30 in which one or more bases have been deleted, substituted or added.
  • the replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity is a modified sequence of oriC in which one or more of the eleven DnaA boxes present in oriC have been deleted.
  • the DnaA boxes of oriC are called R1, R5, ⁇ 2, I1, I2, R2, C3, C2, I3, C1, and R4 from the side closest to DUE.
  • the modified sequence of oriC is a sequence in which, of the eleven DnaA boxes, 1 to 6 selected from R2, C3, C2, I3, C1, and R4, for example, 1 to 5 selected from C3, C2, I3, C1, and R4, for example, C3, C2, I3, C1, and R4, have been deleted.
  • the circular DNA used in the method of this embodiment includes (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity, and (ii) a strong gyrase-binding sequence (SGS).
  • SGS is a binding sequence to which DNA gyrase binds and introduces negative supercoils into DNA.
  • the SGS may be a sequence derived from any biological species as long as it has a consensus sequence.
  • a phage-derived SGS or a plasmid-derived SGS may be used.
  • the SGS may also have a sequence before or after the consensus sequence, or may be a modified sequence of an SGS derived from any biological species.
  • the modified sequence refers to a base sequence in which a mutation is introduced to replace, delete, or insert one or more bases in the base sequence before modification while retaining the function of increasing the amplification efficiency of the circular DNA containing it by the RCR method.
  • the SGS is preferably a bacteriophage-derived SGS, more preferably a bacteriophage Mu-derived SGS (Mu-SGS) (Folarin et al., Bioengineering, 2019, vol.6(2):54.), and more preferably a sequence of SEQ ID NO:9 or a sequence including the same, from the viewpoint of obtaining a sufficient effect of increasing the amplification efficiency of the circular DNA in the replication origin sequence.
  • Mu-SGS bacteriophage Mu-derived SGS
  • the SGS may be located at any position on the circular DNA, and the distance from the replication initiation sequence is not particularly limited. In one embodiment, the SGS is adjacent to or close to the replication initiation sequence, and is located within 30 bases, 20 bases, 15 bases, 13 bases, or 10 bases from the end of the replication initiation sequence. In one embodiment, the SGS is adjacent to or close to the double-stranded cleavage region (DUE) end of the replication initiation sequence, and is located within 30 bases, 20 bases, 15 bases, 13 bases, or 10 bases from the DUE end of the replication initiation sequence.
  • DUE double-stranded cleavage region
  • the circular DNA used in the method of this embodiment includes (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and (ii) a gyrase binding sequence, and does not include a DnaA box cluster at a position different from the replication origin sequence.
  • the circular DNA used in the method of this embodiment includes (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity, (ii) a gyrase binding sequence, and (iii) a plasmid replication origin, and does not include a DnaA box cluster at a position different from the replication origin sequence.
  • Circular DNA having such a structure can be efficiently amplified by the PCR method described below, and more specifically, is useful for one or more of the following: amplification with a higher yield, amplification at a higher amplification rate, amplification with a smaller amount of enzyme, and accurate amplification from a lower concentration (e.g., one molecule) of circular DNA.
  • examples of the origin include known plasmid replication origins such as p15A type, F type, ColE1 type, psC101 type, P1 type, R1 type, R6K ⁇ type, ⁇ type, ⁇ B2 type, ⁇ B0 type, RK2 type, and P4 type, and p15A type and F type are particularly preferred.
  • examples of the p15A type replication origin include p15A, which is the replication origin of plasmids such as pACYC, or modified sequences thereof.
  • examples of the F type replication origin include fori, which is the replication origin of plasmids such as pBeloBAC, or modified sequences thereof.
  • a base sequence in which a mutation has been introduced to replace, delete, or insert one or more bases of the base sequence before modification while retaining the function as a plasmid replication origin can be used.
  • the circular DNA according to this embodiment has a plasmid replication origin, it is not ColE1 type.
  • ColE1-type replication origins include pMB1, which is the replication origin of plasmids such as pUC, pGEM, pTZ, and pBR322, and ColE1, which is the replication origin of plasmids such as pBluescript.
  • the template circular DNA does not contain a DnaA box cluster at a position different from the replication initiation sequence.
  • a DnaA box cluster is a region in which two or more DnaA boxes or sequences similar thereto, either forward or reverse, are present in close proximity within 50 bases.
  • the consensus sequence of the DnaA box is TT[A/T]TNCACA (DnaAB consensus sequence 1), and its reverse sequence is TGTGNA[A/T]AA (DnaAB consensus sequence 2).
  • These similar sequences are sequences in which one or more bases, for example 1, 2, 3, 4 or 5 bases, preferably 1 to 3 bases, and more preferably 1 to 2 bases, have been deleted, substituted or added in DnaAB consensus sequence 1 or DnaAB consensus sequence 2.
  • the p15A type replication origin, p15A, and the F type replication origin, fori do not contain a DnaA box cluster, while the ColE1 type replication origin, pUC, contains a DnaA box cluster.
  • the circular DNA of this embodiment is a circular DNA that does not have two or more, for example, three, of DnaAB consensus sequence 1, DnaAB consensus sequence 2, and sequences in which one to three, preferably one to two, bases are deleted, substituted, or added in these sequences, in a region different from the replication initiation sequence, and which is within 100 bases, 90 bases, 80 bases, 70 bases, 60 bases, or preferably within 50 bases (in the case of two, for example, within 50 bases, 40 bases, or 30 bases).
  • the circular DNA of this embodiment is not a circular DNA that contains DnaAB consensus sequence 1 or a similar sequence thereof, DnaAB consensus sequence 2 or a similar sequence thereof, and DnaAB consensus sequence 2 or a similar sequence thereof, in this order, within 50 bases.
  • the similar sequence is a sequence in which one to two bases are deleted, substituted, or added in the original sequence.
  • the circular DNA of this embodiment is not a circular DNA that contains DnaAB consensus sequence 1 or a similar sequence thereof, a similar sequence to DnaAB consensus sequence 2, and a similar sequence to DnaAB consensus sequence 2, in this order, within 50 bases.
  • the similar sequence is a sequence in which 1 to 2 bases have been deleted, substituted, or added in the original sequence.
  • a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity includes a DUE and a DnaA assembly region (DOR).
  • DOR DnaA assembly region
  • the circular DNA used in the method of this embodiment includes (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and (ii) a gyrase binding sequence, and (i) the replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity has one or more of the following characteristics (F1) to (F5).
  • (F1) Mutant DUE with higher AT content compared to wild-type DUE.
  • (F2) DUE has a repetitive AT sequence in the M element.
  • (F3) DUE has four or more consecutive KAK (K is T or G) motif sequences in the R element.
  • (F4) The R5M sequence of the DOR region has the same sequence as the consensus sequence of DnaA (TGTGNAWAA).
  • (F5) The DUE region has an increased number of TT[A/G]T(T) sequence motifs (eg, TTATT) compared to wild-type DUE.
  • the circular DNA of this embodiment has a mutant DUE with a higher AT content than the wild-type DUE.
  • a mutated sequence having a high AT content means that it has one or more, two or more, preferably three or more, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more, or nine or more mutations compared to the wild-type sequence before the mutation.
  • the mutations are deletion of C or G, or substitution of C or G with A or T, with the latter being more preferred.
  • the circular DNA of this embodiment has three 13-base elements with high AT content, called L, M and R elements, respectively (Katayama et al., Frontiers in Microbiology (2017) Vol. 8: 2496.).
  • the circular DNA of this embodiment has a mutant DUE with a high AT content compared to wild-type DUE, and preferably at least one, preferably at least two elements have a mutant DUE with a high AT content compared to wild-type DUE.
  • the circular DNA of this embodiment is more preferably a mutant DUE with a high AT content compared to wild-type DUE, more preferably an M or R element, and even more preferably an M and R element.
  • a mutant DUE with a high AT content compared to wild-type DUE is, for example, a sequence with an increased number of AT motifs (sequences of A and T) compared to wild-type DUE.
  • each DUE is a 13-mer having a sequence identical to the consensus sequence (GATCTnTTnTTTT: SEQ ID NO:110) (Bramhill, D., & Kornberg, A. (1988) Cell, 52(5), 743-755.).
  • the circular DNA of this embodiment has one or more, two or more, preferably three or more, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more or nine or more mutations in one or more of these sequences, for example, SEQ ID NO:111.
  • the circular DNA of this embodiment has one or more, preferably two or more, three or more or four or more mutations in SEQ ID NO:113 or SEQ ID NO:114, or in each of SEQ ID NO:113 and SEQ ID NO:114.
  • the mutation is a deletion of C or G, or a substitution of C or G with A or T, preferably a substitution of C or G with A or T.
  • the circular DNA of the present embodiment preferably has a repetitive AT sequence in the M element of DUE compared to wild-type DUE, for example, a sequence of (AT)n.
  • n is an integer of 2 or more, preferably an integer of 3 or more, 4 or more, or 5 or more.
  • the upper limit of n is not particularly limited, but is, for example, an integer of 30 or less, preferably an integer of 25 or less, 20 or less, or 15 or less, and in one aspect, is, for example, an integer of 12 or less, 10 or less, or 8 or less.
  • n is an integer of 3 to 10, an integer of 3 to 8, an integer of 5 to 8, an integer of 5 to 7, or 7.
  • the repetitive AT sequence in the M element may include a sequence other than the M element, so long as the sequence of the M element is included in the repetitive sequence.
  • the circular DNA of the present embodiment may have a repetitive AT sequence in the 5'-side sequence of the M element.
  • the repetitive AT sequence in the M element may include multiple repetitive AT sequences that are non-contiguous, so long as the AT sequence is repeated and the sequence of the M element is included in the repetitive sequence.
  • the circular DNA of this embodiment has, for example, in the M element of DUE (including its surrounding sequences), a sequence selected from GATATGTTCTATT (SEQ ID NO: 50), TATATATTCTATT (SEQ ID NO: 51), TATATATTATATATT (SEQ ID NO: 32), TTATTATATATAAC (SEQ ID NO: 52), ATATATATATTCTATT (SEQ ID NO: 53), and ATATATATATTATATT (SEQ ID NO: 54), or a sequence in which one or more bases (preferably one or more bases other than AT) of these sequences have been substituted, deleted, or inserted.
  • GATATGTTCTATT SEQ ID NO: 50
  • TATATATTCTATT SEQ ID NO: 51
  • TATATATTATATATT SEQ ID NO: 32
  • TTATTATATATAAC SEQ ID NO: 52
  • ATATATATATTCTATT SEQ ID NO: 53
  • ATATATATATTATATT SEQ ID NO: 54
  • the circular DNA of this embodiment has a mutant DUE in which the number of consecutive KAK motif sequences (K is T or G; in this specification, the same applies unless otherwise specified) in the R element of DUE is greater than that of wild-type DUE.
  • the consecutive KAK motif sequences in the R element may include sequences other than the R element, as long as the consecutive sequences include the sequence of the R element, that is, may include peripheral sequences centered on the R element.
  • this number is preferably 4 or more, 5 or more, 6 or more, or 7 or more.
  • the upper limit of the number of KAK motif sequences in the circular DNA of this embodiment is not particularly limited, but is preferably 15 or less, 10 or less, or 7 or less, for example.
  • the R element of DUE may have 5 to 7 consecutive KAK motif sequences.
  • the circular DNA of this embodiment has, for example, a sequence selected from GATTATTATTAG (SEQ ID NO: 55), GATTATTAGGAT (SEQ ID NO: 56), TATTATTATTAG (SEQ ID NO: 33), and TATTATTATTAGGAT (SEQ ID NO: 57) in the R element of DUE (including its surrounding sequence), a sequence in which T is replaced with G or G is replaced with T in the KAK motif of these sequences, or a sequence in which one or more bases of these sequences (preferably one or more bases other than the KAK motif sequence) are replaced, deleted, or inserted. Without being bound by theory, it is believed that this enhances the binding of the DnaA protein to the DUE region.
  • the circular DNA of this embodiment preferably has a DUE having an (AT)n sequence in the M element, where n is an integer of 3 or more, and a DUE having five or more consecutive KAK motif sequences in the R element.
  • the circular DNA of this embodiment has an increased number of TT[A/G]T(T) sequence motifs (e.g., TTATT) in DUE compared to wild-type DUE, and preferably has two or more, e.g., three or more TT[A/G]T(T) sequences (e.g., TTATT).
  • TTATT TT[A/G]T(T) sequence motifs
  • the circular DNA of this embodiment preferably has a DUE sequence of TATATATTATATATT (SEQ ID NO: 32) and TATTATTATTAG (SEQ ID NO: 33) or a sequence similar thereto.
  • These similar sequences are sequences in which one or more bases, for example 1, 2, 3, 4 or 5 bases, preferably 1 to 3 bases, more preferably 1 to 2 bases, and particularly preferably 1 base, are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 32 or 33.
  • DnaA-boxes there are 11 DnaA-boxes in the minimal oriC region ( Figure 12B), three of which (R1, R2, R4) have the same sequence 5'-TGTGnA[T/A]AA-3' and have high affinity for DnaA, whereas the remaining eight (R5M, ⁇ 2, l1, l2, C3, C2, l3, and C1) have 1 to 6 mutations that result in low affinity for DnaA.
  • Circular DNA having such a structure can be efficiently amplified when amplified by the PCR method described below, and more specifically, is useful for one or more of amplification with a higher yield, amplification at a higher amplification rate, amplification with a smaller amount of enzyme, and amplification at a lower temperature. Furthermore, circular DNA having such a structure allows for more accurate amplification even when the AT content of the entire circular DNA is high.
  • the circular DNA of this embodiment includes (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and (ii) a gyrase binding sequence, does not include a DnaA box cluster at a position different from the replication origin sequence, and the DUE has an (AT)n sequence in the M element, where n is an integer of 3 or more, and the DUE has five or more consecutive KAK motif sequences in the R element.
  • Circular DNA having such a structure can be efficiently amplified when amplified by the PCR method described below, and more specifically, is useful for one or more of amplification with a higher yield, amplification at a higher amplification rate, amplification with a smaller amount of enzyme, and amplification at a lower temperature. Furthermore, circular DNA having such a structure produces fewer by-products such as concatemers, allowing for more accurate amplification.
  • the circular DNA of this embodiment may further have a ter sequence inserted outward relative to the replication origin sequence.
  • the ter sequence is inserted outward relative to the end of the replication origin sequence far from the DUE.
  • the ter sequence is inserted outward relative to the end of the replication origin sequence close to the DUE. This makes it possible to suppress the production of DNA multimers and efficiently obtain an amplified product of the plasmid when a plasmid containing the DNA cassette is amplified in a test tube by PCR.
  • "inserting it outward from the replication origin sequence” means inserting the ter sequence in such a way that, due to the action of a combination of proteins that have the activity of binding to the ter sequence and inhibiting replication, replication that is directed outward from the replication origin sequence such as oriC is permitted, but replication that is directed inward toward the replication origin sequence is not permitted and is instead stopped.
  • the circular DNA of this embodiment further has a pair of ter sequences, each inserted outward relative to the replication origin sequence.
  • a pair of ter sequences, each inserted outward relative to the replication origin sequence means that one is inserted on the 5' side of the replication origin sequence, and the other is inserted on the 3' side of the replication origin sequence.
  • Examples of the ter sequence to be inserted on the 5' side of the replication origin sequence include the sequences shown in SEQ ID NOs: 34 to 49 below. Examples of the ter sequence to be inserted on the 3' side of the replication origin sequence include sequences that contain a complementary sequence to the base sequence inserted on the 5' side of the replication origin sequence.
  • the Tus-ter system in Escherichia coli and the RTP-ter system in Bacillus bacteria are known as replication termination systems that use a ter sequence and a protein that has the activity of binding to the ter sequence on DNA and inhibiting replication (Patent Document 3).
  • a ter sequence a ter sequence that can be used in these systems or a modified sequence thereof can be used.
  • a modified ter sequence refers to a base sequence in which a mutation has been introduced to replace, delete, or insert one or more bases in the base sequence before modification while retaining the function of the ter sequence.
  • the ter sequence of the circular DNA according to this embodiment may be a wild-type ter sequence, or a mutant ter sequence in which one or more bases of the wild-type ter sequence have been mutated by substitution, deletion, or insertion.
  • wild-type ter sequences that can be used in the Tus-ter system include 5'-GN[A/G][T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3' (SEQ ID NO: 34), 5'-G[T/G]A[T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3' (SEQ ID NO: 35), 5'-GTATGTTGTAACTA-3' (SEQ ID NO: 36), 5'-AGTATGTTGTAACTAAAG-3' (SEQ ID NO: 37), and 5'-AGTATGTTGTAACTAAAG-3' (SEQ ID NO: 38).
  • a preferred base sequence includes 5'-GGATGTTGTAACTA-3' (SEQ ID NO: 37), 5'-GTATGTTGTAACGA-3' (SEQ ID NO: 38), 5'-GTATGTTGTAACGA-3' (SEQ ID NO: 39), 5'-GGATGTTGTAACTA-3' (SEQ ID NO: 40), 5'-GGAAGTTGTAACGA-3' (SEQ ID NO: 41), or 5'-GTAAGTTGTAACGA-3' (SEQ ID NO: 42).
  • the ter sequence of the circular DNA according to this embodiment is preferably a mutant ter sequence.
  • mutant ter sequences include a base sequence including a modified sequence in which one or several bases in the base sequence of SEQ ID NO: 34 are substituted.
  • the mutant ter sequence possessed by the circular DNA according to this embodiment is preferably 5'-GN[A/G][T/A]GTTGTA C C[T/G]A-3' (SEQ ID NO: 43) or 5'-GTATGTTGTAcCTA-3' (SEQ ID NO: 44), and an example thereof includes 5'-AGTATGTTGTA C CTAAAG-3' (SEQ ID NO: 5) having SEQ ID NO: 44.
  • a ter sequence that can be used in the RTP-ter system includes a base sequence including 5'-AC[T/A][A/G]ANNNNN[C/T]NATGTACNAAAT-3' (sequence number 45).
  • the ter sequence for use in the RTP-ter system of the DNA cassette of the present invention is preferably a base sequence containing 5'-ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAAT-3' (SEQ ID NO: 46), 5'-ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAATTTTCA-3' (SEQ ID NO: 47), 5'-GAACTAATTAAACTAGTACTAAATTTTCA-3' (SEQ ID NO: 48), or 5'-ATACTAATTGATCCATGTACTAAATTTTCA-3' (SEQ ID NO: 49).
  • the ter sequence is not particularly limited in its position, as long as it is inserted outward relative to the replication origin sequence, and may be positioned between the replication origin sequence and the SGS, or may be positioned on the outside. In one embodiment, it is preferable that the ter sequence is not adjacent to the replication origin sequence, and when the circular DNA has a pair of ter sequences each facing outward relative to the replication origin sequence, it is preferable that at least one of them is not adjacent to the replication origin sequence. For example, it is preferable that the distance between the 3' terminal base of at least one of the ter sequences and the end of the replication origin sequence (preferably the end of the replication origin sequence farther from the DUE) is 5 bases or more, for example 10 bases or more.
  • a circular DNA having such a configuration can be amplified efficiently when amplified by the RCR method described below, and more specifically, is useful for one or more of amplification with a higher yield, amplification with a smaller amount of enzyme, and amplification with a higher amplification rate.
  • the circular DNA of this embodiment may further have one or a pair of ter sequences inserted inwardly relative to the replication origin sequence.
  • "inserting inwardly relative to the replication origin sequence” means inserting the ter sequence in a direction that does not allow replication in a direction outward from the replication origin sequence such as oriC and stops it, while allowing replication in a direction toward the replication origin sequence, due to the action of a combination of proteins that have the activity of binding to the ter sequence and inhibiting replication.
  • the ter sequence is not adjacent or close to the replication origin sequence.
  • the one or a pair of ter sequences inserted inwardly relative to the replication origin sequence is at least 50 bases, at least 75 bases, at least 100 bases, at least 150 bases, or at least 200 bases away from the replication origin sequence.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment includes (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and (ii) a gyrase binding sequence.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment includes a modified sequence of oriC as a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity, in which one to five of the DnaA boxes selected from C3, C2, I3, C1, and R4 are deleted, and a gyrase binding sequence.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is the circular DNA of (a) or (b) above, further comprising a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity, which has any one or more of the following characteristics (F1) to (F5): (F1) a mutant DUE with a higher AT content compared to the wild type; (F2) the DUE has a repetitive AT sequence in the M element; (F3) the DUE has four or more consecutive KAK motif sequences in the R element; (F4) the R5M sequence in the DOR region has a sequence identical to the consensus sequence of DnaA (TGTGNAWAA); and (F5) the number of TT[A/G]T (T) sequence motifs (e.g., TTATT) in the DUE region is increased compared to the wild type.
  • F1 a mutant DUE with a higher AT content compared to the wild type
  • F2 the DUE has a repetitive AT sequence in the M element
  • F3 the DUE has four or more consecutive KAK motif
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment comprises a replication origin capable of binding to an enzyme having DnaA activity, and the replication origin has any one or more of the following characteristics (F1) to (F5): (F1) a mutant DUE with a higher AT content compared to the wild type, (F2) the DUE has a repetitive AT sequence in the M element, (F3) the DUE has four or more consecutive KAK motif sequences in the R element, (F4) the R5M sequence in the DOR region has a sequence identical to the consensus sequence of DnaA (TGTGNAWAA), and (F5) the number of TT[A/G]T (T) sequence motifs (e.g., TTATT) in the DUE region is increased compared to the wild type.
  • F1 a mutant DUE with a higher AT content compared to the wild type
  • F2 the DUE has a repetitive AT sequence in the M element
  • the DUE has four or more consecutive KAK motif sequences in the R element
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is any one of the circular DNAs (a) to (d) above, further comprising one or a pair of ter sequences inserted outward relative to the replication origin sequence.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is the circular DNA of (d) above, in which the ter sequence is not adjacent to the replication origin sequence.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is the circular DNA of (a) or (b) above, further comprising one or a pair of ter sequences flanked by a replication origin sequence and the gyrase binding sequence and inserted outward relative to these sequences.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is the circular DNA of (a) or (b) above, further comprising one or a pair of ter sequences inserted outward relative to the replication origin sequence, and the distance between the gyrase binding sequence and the replication origin sequence is greater than the distance between the ter sequence and the replication origin sequence.
  • the circular DNA produced by the method of the present embodiment is any one of the circular DNAs (e) to (h) above, in which the ter sequence is a mutated ter sequence.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is any one of the circular DNAs (e) to (h) above, wherein the ter sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 5, 43, or 44.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is any one of the circular DNAs (a) to (j) above, which does not contain a DnaA box cluster at a position different from the replication origin sequence.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is any one of the circular DNAs (a) to (j) above, which does not contain a DnaA box cluster. It does not contain a DnaA box cluster.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is any of the circular DNAs (a) to (j) above, and does not have a region within 60 bases (e.g., within 50 bases) at a position different from the replication origin sequence, which region contains DnaAB consensus sequence 1 or a sequence similar thereto, DnaAB consensus sequence 2 or a sequence similar thereto, and DnaAB consensus sequence 2 or a sequence similar thereto, in this order.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is any of the circular DNAs (a) to (j) above, and does not have a region within 40 bases (e.g., within 30 bases) at a position different from the replication origin sequence, which region contains DnaAB consensus sequence 1 or a sequence similar thereto, and DnaAB consensus sequence 2 or a sequence similar thereto, in this order.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is any of the circular DNAs (a) to (j) above, and does not have a region within 60 bases (e.g., within 50 bases) that contains DnaAB consensus sequence 1 or a sequence similar thereto, DnaAB consensus sequence 2 or a sequence similar thereto, and DnaAB consensus sequence 2 or a sequence similar thereto, in this order.
  • the circular DNA produced by the method of this embodiment is any of the circular DNAs (a) to (j) above, and does not have a region within 40 bases (e.g., within 30 bases) that contains DnaAB consensus sequence 1 or a sequence similar thereto, and DnaAB consensus sequence 2 or a sequence similar thereto, in this order.
  • the circular DNA prepared as described above is amplified by PCR.
  • the first group of enzymes catalyzes the replication of circular DNA;
  • the first group of enzymes that catalyze the replication of circular DNA for example, the group of enzymes described in Kaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90 can be used.
  • the first enzyme group include one or more enzymes or enzyme groups selected from the group consisting of an enzyme having DnaA activity, one or more types of nucleoid proteins, an enzyme or enzyme group having DNA gyrase activity, a single-stranded DNA binding protein (SSB), an enzyme having DnaB-type helicase activity, an enzyme having DNA helicase loader activity, an enzyme having DNA primase activity, an enzyme having DNA clamp activity, and an enzyme or enzyme group having DNA polymerase III * activity, or all combinations of the enzymes or enzyme groups.
  • SSB single-stranded DNA binding protein
  • the first enzyme group includes an enzyme having DnaA activity, a single-stranded DNA binding protein (SSB), an enzyme having DnaB-type helicase activity, an enzyme having DNA helicase loader activity, an enzyme having DNA primase activity, an enzyme having DNA clamp activity, and an enzyme or enzyme group having DNA polymerase III * activity.
  • SSB single-stranded DNA binding protein
  • DnaB-type helicase activity an enzyme having DnaB-type helicase activity
  • an enzyme having DNA helicase loader activity an enzyme having DNA primase activity
  • an enzyme having DNA clamp activity an enzyme or enzyme group having DNA polymerase III * activity.
  • DnaA derived from E. coli can be preferably used.
  • DnaA derived from E. coli may be contained in the reaction solution as a monomer in the range of 1.0 nM to 10 ⁇ M, preferably 1.0 nM to 5.0 ⁇ M, 1.0 nM to 3 ⁇ M, 1 nM to 1.5 ⁇ M, 1.0 nM to 1.0 ⁇ M, 1.0 nM to 500 nM, 50 nM to 200 nM, or 50 nM to 150 nM, but is not limited thereto.
  • Nucleoid protein refers to a protein contained in a nucleoid.
  • the one or more nucleoid proteins used in the present invention are not particularly limited in terms of their biological origin, as long as they are enzymes having the same activity as the nucleoid proteins of E. coli.
  • IHF derived from E. coli i.e., a complex (heterodimer or homodimer) of IhfA and/or IhfB, or HU derived from E. coli, i.e., a complex of hupA and hupB, can be preferably used.
  • coli may be contained in the reaction solution as a hetero/homo dimer in a range of 5 nM to 400 nM, preferably 5 nM to 200 nM, 5 nM to 100 nM, 5 nM to 50 nM, 10 nM to 50 nM, 10 nM to 40 nM, or 10 nM to 30 nM, but is not limited thereto.
  • HU derived from E. coli may be contained in the reaction solution in the range of 1 nM to 50 nM, preferably 5 nM to 50 nM, or 5 nM to 25 nM, but is not limited thereto.
  • the enzyme or group of enzymes having DNA gyrase activity there is no particular limitation on their biological origin, so long as they have an activity similar to that of E. coli DNA gyrase.
  • a complex consisting of GyrA and GyrB derived from E. coli can be suitably used.
  • the complex consisting of GyrA and GyrB derived from E. coli may be contained in the reaction solution as a heterotetramer in a range of 20 nM to 500 nM, preferably in a range of 20 nM to 400 nM, 20 nM to 300 nM, 20 nM to 200 nM, 50 nM to 200 nM, or 100 nM to 200 nM, but is not limited thereto.
  • SSB single-stranded DNA binding protein
  • coli may be contained in the reaction solution as a homotetramer in a range of 20 nM to 1000 nM, preferably in a range of 20 nM to 500 nM, 20 nM to 300 nM, 20 nM to 200 nM, 50 nM to 500 nM, 50 nM to 400 nM, 50 nM to 300 nM, 50 nM to 200 nM, 50 nM to 150 nM, 100 nM to 500 nM, or 100 nM to 400 nM, but is not limited thereto.
  • DnaB-type helicase activity there is no particular limitation on its biological origin, so long as it has activity similar to that of DnaB from E. coli.
  • DnaB derived from E. coli can be preferably used.
  • DnaB derived from E. coli may be contained in the reaction solution as a homohexamer in a range of 5 nM to 200 nM, preferably 5 nM to 100 nM, 5 nM to 50 nM, or 5 nM to 30 nM, but is not limited thereto.
  • DnaC derived from Escherichia coli can be preferably used.
  • DnaC derived from Escherichia coli may be contained in the reaction solution as a homohexamer in a range of 5 nM to 200 nM, preferably 5 nM to 100 nM, 5 nM to 50 nM, or 5 nM to 30 nM, but is not limited thereto.
  • DnaG derived from E. coli can be preferably used.
  • DnaG derived from E. coli may be contained in the reaction solution as a monomer in the range of 20 nM to 1000 nM, preferably in the range of 20 nM to 800 nM, 50 nM to 800 nM, 100 nM to 800 nM, 200 nM to 800 nM, 250 nM to 800 nM, 250 nM to 500 nM, or 300 nM to 500 nM, but is not limited thereto.
  • DnaN derived from E. coli can be preferably used.
  • DnaN derived from E. coli may be contained in the reaction solution as a homodimer in a range of 10 nM to 1000 nM, preferably in a range of 10 nM to 800 nM, 10 nM to 500 nM, 20 nM to 500 nM, 20 nM to 200 nM, 30 nM to 200 nM, or 30 nM to 100 nM, but is not limited thereto.
  • the enzyme or enzyme group having DNA polymerase III * activity is not particularly limited in biological origin, as long as it is an enzyme or enzyme group having the same activity as the DNA polymerase III * complex of E. coli.
  • an enzyme group containing any of DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, and HolE derived from E. coli preferably an enzyme group containing the complex of DnaX, HolA, HolB, and DnaE derived from E. coli, more preferably an enzyme group containing the complex of DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, and HolE derived from E. coli, can be suitably used.
  • coli-derived DNA polymerase III* complex may be contained as a heteromultimer in the reaction solution in a range of 2 nM to 50 nM, preferably in a range of 2 nM to 40 nM, 2 nM to 30 nM, 2 nM to 20 nM, 5 nM to 40 nM, 5 nM to 30 nM, or 5 nM to 20 nM, but is not limited thereto.
  • the two sister circular DNAs that form a catenane refer to two circular DNAs that are synthesized by a DNA replication reaction and are in a linked state.
  • the second group of enzymes that catalyze the Okazaki fragment ligation reaction to synthesize two sister circular DNAs that form catenanes can be, for example, one or more enzymes selected from the group consisting of enzymes having DNA polymerase I activity, enzymes having DNA ligase activity, and enzymes having RNase H activity, or a combination of such enzymes.
  • the second group of enzymes preferably includes an enzyme having DNA polymerase I activity and an enzyme having DNA ligase activity.
  • E. coli-derived DNA polymerase I As an enzyme having DNA polymerase I activity, there is no particular limitation on its biological origin, so long as it has activity similar to that of E. coli DNA polymerase I.
  • E. coli-derived DNA polymerase I can be suitably used.
  • E. coli-derived DNA polymerase I may be contained in the reaction solution as a monomer in the range of 10 nM to 200 nM, preferably 20 nM to 200 nM, 20 nM to 150 nM, 20 nM to 100 nM, 40 nM to 150 nM, 40 nM to 100 nM, or 40 nM to 80 nM, but is not limited thereto.
  • E. coli-derived DNA ligase As an enzyme having DNA ligase activity, there is no particular limitation on its biological origin, so long as it has activity similar to that of E. coli DNA ligase.
  • E. coli-derived DNA ligase or T4 phage DNA ligase can be suitably used.
  • E. coli-derived DNA ligase may be contained in the reaction solution as a monomer in the range of 10 nM to 200 nM, preferably 15 nM to 200 nM, 20 nM to 200 nM, 20 nM to 150 nM, 20 nM to 100 nM, or 20 nM to 80 nM, but is not limited thereto.
  • RNase H derived from Escherichia coli can be suitably used.
  • RNase H derived from Escherichia coli may be contained in the reaction solution as a monomer in the range of 0.2 nM to 200 nM, preferably in the range of 0.2 nM to 200 nM, 0.2 nM to 100 nM, 0.2 nM to 50 nM, 1 nM to 200 nM, 1 nM to 100 nM, 1 nM to 50 nM, or 10 nM to 50 nM, but is not limited thereto.
  • the third enzyme group that catalyzes the separation reaction of the two sister circular DNAs for example, the enzyme group described in Peng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575 can be used.
  • the third enzyme group can be one or more enzymes selected from the group consisting of enzymes having topoisomerase IV activity, enzymes having topoisomerase III activity, and enzymes having RecQ-type helicase activity, or a combination of such enzymes.
  • it is preferable that the third enzyme group includes an enzyme having topoisomerase IV activity and/or an enzyme having topoisomerase III activity.
  • Escherichia coli-derived topoisomerase III As an enzyme having topoisomerase III activity, there is no particular limitation on its biological origin, so long as it has activity similar to that of Escherichia coli topoisomerase III.
  • Escherichia coli-derived topoisomerase III can be suitably used.
  • Escherichia coli-derived topoisomerase III may be contained in the reaction solution as a monomer in a range of 20 nM to 500 nM, preferably in a range of 20 nM to 400 nM, 20 nM to 300 nM, 20 nM to 200 nM, 20 nM to 100 nM, or 30 to 80 nM, but is not limited thereto.
  • RecQ-type helicase activity there is no particular limitation on its biological origin, so long as it has activity similar to that of E. coli RecQ.
  • RecQ derived from E. coli can be suitably used.
  • RecQ derived from E. coli may be contained in the reaction solution as a monomer in the range of 20 nM to 500 nM, preferably in the range of 20 nM to 400 nM, 20 nM to 300 nM, 20 nM to 200 nM, 20 nM to 100 nM, or 30 to 80 nM, but is not limited thereto.
  • topoisomerase IV activity there is no particular limitation on its biological origin, so long as it has activity similar to that of Escherichia coli topoisomerase IV.
  • Escherichia coli-derived topoisomerase IV which is a complex of ParC and ParE, can be suitably used.
  • Escherichia coli-derived topoisomerase IV may be contained as a heterotetramer in the reaction solution in a range of 0.1 nM to 50 nM, preferably in a range of 0.1 nM to 40 nM, 0.1 nM to 30 nM, 0.1 nM to 20 nM, 1 nM to 40 nM, 1 nM to 30 nM, 1 nM to 20 nM, 1 nM to 10 nM, or 1 nM to 5 nM, but is not limited thereto.
  • the reaction solution may further contain an enzyme.
  • an enzyme e.g., Tus protein derived from Escherichia coli
  • the reaction solution may further contain a protein (e.g., Tus protein derived from Escherichia coli) that has the activity of binding to the ter sequence and inhibiting replication.
  • the reaction solution may further contain a linear DNA-specific exonuclease.
  • a linear DNA-specific exonuclease in the reaction solution reduces the amount of linear DNA generated by double-strand breaks during the amplification reaction, and has the effect of improving the yield of the desired circular DNA.
  • a linear DNA-specific exonuclease is an enzyme that sequentially hydrolyzes linear DNA from the 5' or 3' end.
  • RecBCD exonuclease V
  • ⁇ exonuclease exonuclease III
  • exonuclease VIII Exonuclease VIII
  • T5 exonuclease T7 exonuclease
  • Plasmid-Safe registered trademark
  • ATP-Dependent DNase epicentre
  • the linear DNA exonuclease may be contained in the reaction solution in a range of 0.001 to 1.0 U/ ⁇ L, preferably 0.005 U to 1.0 U/ ⁇ L, 0.01 to 1.0 U/ ⁇ L, 0.05 to 1.0 U/ ⁇ L, or 0.1 to 1.0 U/ ⁇ L, but is not limited thereto.
  • the enzyme activity unit (U) for linear DNA exonuclease is a unit where 1 U is the amount of enzyme required to make 1 nmol of deoxyribonucleotides of linear DNA acid-soluble in a reaction at 37°C for 30 minutes.
  • the reaction solution may further contain a single-stranded DNA-specific exonuclease.
  • the presence of a single-stranded DNA-specific exonuclease in the reaction solution reduces the amount of low-molecular-weight secondary amplification products generated during the amplification reaction, and has the effect of improving the yield of the desired circular DNA.
  • a single-stranded DNA-specific exonuclease is an enzyme that sequentially hydrolyzes nucleotides at the 5' or 3' end of a single-stranded DNA.
  • exonuclease I exo I
  • RecJ RecJ
  • exonuclease T etc.
  • a preferred single-stranded DNA-specific exonuclease is exo I.
  • the single-stranded DNA-specific exonuclease may be contained in the reaction solution in a range of 0.1 to 1.0 U/ ⁇ L, preferably 0.15 to 1.0 U/ ⁇ L, 0.2 to 1.0 U/ ⁇ L, or 0.2 to 0.5 U/ ⁇ L, but is not limited thereto.
  • the enzyme activity unit (U) for exo I is a unit where 1 U is the amount of enzyme required to make 10 nmol of deoxyribonucleotides of single-stranded DNA acid-soluble in a reaction at 37°C for 30 minutes.
  • the enzyme activity unit (U) for RecJ is a unit where 1 U is the amount of enzyme required to make 0.05 nmol of deoxyribonucleotides of single-stranded DNA acid-soluble in a reaction at 37°C for 30 minutes.
  • the enzymes contained in the reaction solution containing the first, second and third enzyme groups may be commercially available or may be extracted from microorganisms and purified as necessary. Extraction and purification of enzymes from microorganisms can be appropriately carried out using techniques available to those skilled in the art.
  • enzymes other than those derived from E. coli are used as the first, second, and third enzyme groups, they can be used in a concentration range that corresponds in terms of enzyme activity units to the concentration range specified for the enzymes derived from E. coli.
  • the reaction solution may contain a buffer, ATP, GTP, CTP, UTP, dNTP, a magnesium ion source, and an alkali metal ion source.
  • the buffer solution contained in the reaction solution is not particularly limited as long as it is suitable for use at pH 7 to 9, preferably pH 8.
  • Examples include Tris-HCl, Tris-OAc, Hepes-KOH, phosphate buffer, MOPS-NaOH, and Tricine-HCl.
  • a preferred buffer solution is Tris-HCl or Tris-OAc.
  • the concentration of the buffer solution can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited, but in the case of Tris-HCl or Tris-OAc, a concentration of 10 mM to 100 mM, 10 mM to 50 mM, or 20 mM can be selected, for example.
  • ATP means adenosine triphosphate.
  • concentration of ATP contained in the reaction solution at the start of the reaction may be, for example, in the range of 0.1 mM to 3 mM, and preferably in the range of 0.1 mM to 2 mM, 0.1 mM to 1.5 mM, or 0.5 mM to 1.5 mM.
  • GTP, CTP, and UTP mean guanosine triphosphate, cytidine triphosphate, and uridine triphosphate, respectively.
  • concentrations of GTP, CTP, and UTP contained in the reaction solution at the start of the reaction may each be independently in the range of, for example, 0.1 mM to 3.0 mM, and preferably in the range of 0.5 mM to 3.0 mM, or 0.5 mM to 2.0 mM.
  • dNTP is a general term for deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxycytidine triphosphate (dCTP), and deoxythymidine triphosphate (dTTP).
  • concentration of dNTP contained in the reaction solution at the start of the reaction may be, for example, in the range of 0.01 to 1 mM, preferably in the range of 0.05 mM to 1 mM, or 0.1 mM to 1 mM.
  • the magnesium ion source is a substance that provides magnesium ions (Mg2+) to the reaction solution. Examples include Mg(OAc)2, MgCl2, and MgSO4. A preferred magnesium ion source is Mg(OAc)2.
  • the concentration of the magnesium ion source contained in the reaction solution at the start of the reaction may be, for example, a concentration that provides magnesium ions in the range of 5 to 50 mM to the reaction solution.
  • the alkali metal ion source is a substance that provides alkali metal ions in the reaction solution.
  • alkali metal ions include sodium ions (Na+) and potassium ions (K+).
  • alkali metal ion sources include potassium glutamate, potassium aspartate, potassium chloride, potassium acetate, sodium glutamate, sodium aspartate, sodium chloride, and sodium acetate.
  • a preferred alkali metal ion source is potassium glutamate or potassium acetate.
  • the concentration of the alkali metal ion source contained in the reaction solution at the start of the reaction may be a concentration that provides alkali metal ions in the reaction solution at 100 mM or more, preferably in the range of 100 mM to 300 mM, but is not limited to this.
  • the reaction solution further contains inhibitors of non-specific adsorption of proteins (bovine serum albumin, lysozyme, gelatin, heparin, casein, etc.), inhibitors of non-specific adsorption of nucleic acids (tRNA (transfer RNA), rRNA (ribosomal RNA), mRNA (messenger RNA), glycogen, heparin, oligo-DNA, poly(I-C) (polyinosine-polycytidine), poly(dI-dC) (polydeoxyinosine-polydeoxycytidine), poly(A) (polyadenine), and poly(dA) (polydeoxyadenine), etc.), linear DNA-specific exonuclease (RecBCD, ⁇ exonuclease, etc.), and ⁇ -terminal ...
  • proteins bovine serum albumin, lysozyme, gelatin, heparin, casein, etc.
  • nucleic acids t
  • the reaction solution may contain nuclease, exonuclease III, exonuclease VIII, T5 exonuclease, T7 exonuclease, Plasmid-Safe (registered trademark) ATP-Dependent DNase (epicentre), etc.), RecG-type helicase (E. coli-derived RecG, etc.), ammonium salts (ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, etc.), and reducing agents (DTT, ⁇ -mercaptoethanol, glutathione, etc.), and if the reaction solution contains E. coli-derived DNA ligase, it may also contain its cofactor NAD (nicotinamide adenine dinucleotide).
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • the reaction mixture containing the enzyme and the cell-free protein expression system may be mixed directly with the circular DNA serving as a template to form a reaction mixture for amplifying the circular DNA.
  • the cell-free protein expression system may be a cell-free translation system using total RNA, including RNA having a sequence complementary to the base sequence of the gene encoding the enzyme, mRNA, or an in vitro transcription product as the template RNA, or may be a cell-free transcription translation system using genes encoding each enzyme or expression vectors containing genes encoding each enzyme as the template DNA.
  • the reaction solution is mixed with the circular DNA to form a reaction mixture, and the reaction mixture is incubated at a temperature in the range of 80°C or less, thereby obtaining a reaction product containing the amplified circular DNA.
  • the amplification may be isothermal or non-isothermal.
  • isothermal amplification there are no particular limitations on the isothermal conditions as long as they allow the DNA amplification reaction or DNA replication reaction to proceed.
  • a certain temperature that is included in the optimal temperature of the DNA polymerase can be used.
  • isothermal conditions include a certain temperature of 15°C or higher, 16°C or higher, 18°C or higher, 20°C or higher, 23°C or higher, 24°C or higher, 25°C or higher, 26°C or higher, 27°C or higher, or 30°C or higher, and a certain temperature of 80°C or lower, 75°C or lower, 70°C or lower, 65°C or lower, 60°C or lower, 50°C or lower, 45°C or lower, 40°C or lower, 35°C or lower, or 33°C or lower.
  • the isothermal condition may be, for example, a constant temperature included in the range of 15°C to 80°C, 16°C to 80°C, 18°C to 80°C, 20°C to 80°C, or 25°C to 80°C, 15°C to 75°C, 16°C to 75°C, 18°C to 75°C, 20°C to 75°C, or 25°C to 75°C, 15°C to 70°C, 16°C to 70°C, 18°C to 70°C, 20°C to 70°C, or 25°C to 70°C, 15°C to 65°C, 16°C to 65°C, 18°C to 65°C, 20°C to 65°C, or 25°C to 65°C, a constant temperature included in the range of 25°C to 50°C, a constant temperature included in the range of 25°C to 40°C, a constant temperature included in the range of 30°C to 33°C, or about 30°C.
  • isothermal in isothermal amplification means maintaining the temperature within a range of ⁇ 7°C, ⁇ 5°C, ⁇ 3°C, or ⁇ 1°C relative to the temperature set during the reaction.
  • the reaction time for isothermal amplification can be set appropriately depending on the amount of the amplification product of the desired circular DNA, and can be, for example, 1 hour to 30 hours, preferably 2 hours to 25 hours, more preferably 3 hours to 20 hours, and even more preferably 5 hours to 15 hours.
  • the circular DNA of this embodiment can achieve a high amplified concentration even in a short reaction time.
  • circular DNA When circular DNA is amplified non-isothermally, it can be amplified under temperature conditions in which incubation is repeated in a temperature cycle at two temperatures below 80°C, preferably below 65°C.
  • the first temperature of the temperature cycle is a temperature at which double-stranded DNA can start replicating
  • the second temperature is a temperature at which the initiation of replication is suppressed and the DNA extension reaction proceeds.
  • the first temperature can be 30°C or higher, for example, 30°C to 80°C, 30°C to 50°C, 30°C to 40°C, or 37°C.
  • Incubation at the first temperature is not particularly limited, but may be 10 seconds to 10 minutes per cycle, and 1 minute is preferred.
  • the second temperature can be 27°C or lower, for example, 10°C to 27°C, 16°C to 25°C, or 24°C.
  • Incubation at the second temperature is not particularly limited, but is preferably set according to the length of the circular DNA to be amplified, and may be, for example, 1 second to 10 seconds per 1,000 bases per cycle.
  • the number of temperature cycles is not particularly limited, but may be 10 to 50 cycles, 20 to 45 cycles, 25 to 45 cycles, or 40 cycles.
  • the method of this embodiment may further include incubating at a temperature in the range of 80°C or less to obtain a reaction product containing the amplified circular DNA, diluting the reaction product by at least 2-fold, preferably 3-fold, 4-fold or 5-fold, with a solution that does not contain the first to third enzyme groups, and then maintaining (re-warming).
  • dilution of the enzyme groups suppresses the initiation of new replication, while ongoing replication extension, catenation, and separation reactions continue to proceed due to the effect of residual enzymes.
  • by-products generated by nicks or the like during the reaction can be repaired during this process due to the effect of residual ligase, etc. Therefore, the transition from amplification intermediates and by-products to the final product is specifically induced, and an improvement in the yield of the desired circular DNA can be expected.
  • the post-dilution maintenance can be carried out under conditions in which the second and third enzyme groups are active, for example, at 15 to 50°C, preferably 20 to 40°C, and more preferably 25 to 35°C, for example, for 10 minutes to 3 hours, preferably 15 minutes to 2 hours, and more preferably 20 minutes to 1 hour.
  • the composition of the solution that does not contain the first to third enzyme groups is not particularly limited as long as it is a solution in which the second and third enzyme groups can act, and it is possible to use a solution that has the same composition as the reaction solution except that it does not contain the first, second, and third enzyme groups.
  • a solution contains a buffer solution, ATP, GTP, CTP, UTP, dNTP, a magnesium ion source, and an alkali metal ion source.
  • the solution may further contain one or more selected from the above-mentioned non-specific adsorption inhibitor of protein, non-specific adsorption inhibitor of nucleic acid, ammonium salt, reducing agent, and NAD.
  • the circular DNA when the circular DNA has a replication initiation sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity that has a mutant DUE with a higher AT content than the wild type, it is preferable to further include diluting the circular DNA by at least two-fold with a solution that does not contain the first to third enzyme groups, and then maintaining (re-incubating) the circular DNA.
  • This embodiment also relates to a circular DNA that includes a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and a gyrase binding sequence, and does not include a DnaA box cluster at a position different from the replication origin sequence.
  • This embodiment also relates to a circular DNA that includes a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity, a gyrase binding sequence, and a plasmid replication origin, and the plasmid replication origin does not include a DnaA box cluster.
  • the circular DNA may have one or a pair of ter sequences.
  • the replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity of the circular DNA may be a mutant DUE. For each sequence, the description in the method for producing the circular DNA above can be referred to. Such a circular DNA can be efficiently amplified by the PCR method.
  • the circular DNA serving as a template for the method of this embodiment can be prepared by simply preparing a DNA cassette containing (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and (ii) a gyrase binding sequence, a DNA cassette containing (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and having a mutant DUE with a higher AT content than the wild type, a DNA cassette containing (i) a replication origin sequence capable of binding to an enzyme having DnaA activity and (ii) a gyrase binding sequence and having a mutant DUE with a higher AT content than the wild type, or any of these DNA cassettes having one or a pair of ter sequences, and linking the DNA cassette to a DNA fragment or circular DNA that does not contain a DnaA box cluster.
  • the DNA fragment or circular DNA that does not contain a DnaA box cluster may be derived from a commercially available plasmid, for example, a plasmid that uses p15A or fori as the plasmid replication origin, or a linear DNA obtained by enzymatic cleavage of the same.
  • the method of linking the DNA fragment or circular DNA not containing a DnaA box cluster to the DNA cassette is not particularly limited.
  • a linking reaction between linear DNA fragments for example, the infusion method, the Gibson Assembly method, the Golden Gate Assembly method, a method using a commercially available kit such as USER (registered trademark) Cloning (NEB), the Recombination Assembly method (WO 2019/009361), etc. are known, and such known techniques can be used.
  • a ligation reaction between linear DNA and circular DNA for example, Gateway cloning using a site-specific recombination mechanism is known, and a reagent kit is commercially available (manufactured by Thermo Fisher).
  • a method using a homologous recombination reaction using a RecA family recombinase and, if necessary, an exonuclease may also be used.
  • a mutant ter sequence (terG16 sequence, SEQ ID NO:5) is linked adjacent to the 5' side of the oriC sequence (SEQ ID NO:4) derived from the E. coli chromosome, a complementary sequence of the terG16 sequence is linked near the 3' side of the oriC, a Tac promoter sequence (SEQ ID NO:6) is further near the 5' side of the terG16 sequence, and a terminator sequence of the E. coli fdhF gene (SEQ ID NO:7) is further near the 3' side of the complementary sequence of the terG16 sequence.
  • a DNA fragment was prepared as an OriC2.0 cassette (426 bp, SEQ ID NO:8).
  • the terG16 sequence is a single-base mutant sequence of the base sequence of SEQ ID NO:37.
  • the underlined portion is the terG16 sequence, and the portion in capital letters in the region sandwiched between the underlined portions is the oriC sequence (286 bp).
  • OriCsg cassette a DNA fragment in which SGS (SEQ ID NO: 9) was linked to the 5' side of oriC was prepared as OriCsg cassette (582 bp, SEQ ID NO: 10).
  • the base sequence is shown in Table 5.
  • the region shown in underlined capital letters represents SGS (bold letters represent SGS consensus sequences), and the region shown in capital letters near the center (not underlined) represents the oriC sequence. Additionally, the region enclosed in a box represents the terG16 sequence and its complementary sequence.
  • E1-p15A plasmid An E1 sequence (579 bp) containing a marker gene was ligated to pACYC plasmid (Nippon Gene Co., Ltd.) by the USER method described below, and amplified by PCR to prepare a plasmid with a full length of 3.5 kbp.
  • H2-p15A plasmid An H2 sequence (a sequence encoding a part of a known virus, 3.8 kbp) was ligated to a pACYC plasmid (Nippon Gene Co., Ltd.) by the USER method described below, and amplified by PCR to prepare a plasmid with a full length of 6.8 kbp.
  • pUC plasmid An E1 sequence (579 bp) was ligated to plasmid pUC4K (GenBank accession number: X06404, full length 3.9 kbp) by the USER method described below, and amplified by PCR amplification reaction to create a plasmid with a full length of 3.5 kbp.
  • pBeloBAC plasmid manufactured by NEB (GenBank accession number: U51113, full length 7.5 kb)
  • Example 1 Ligation and amplification of p15A plasmid and OriC cassette
  • Each of the OriC cassette fragments of Preparation Examples 1 to 5 and partial fragments of the two p15A plasmids of Preparation Example 6 were prepared by PCR using primers containing dUTP as shown in Table 8.
  • u represents deoxyuridine (dU).
  • the prepared DNA fragments were mixed and added to 5 ⁇ L of a reaction solution (1 ⁇ rCutSmart buffer (NEB), 7.5% by mass PEG8000, 10 mU/ ⁇ L Thermolabile USER II Enzyme (NEB.
  • the PCR amplification reaction was carried out as follows. 0.5 ⁇ L of the solution containing the template was mixed with 4.5 ⁇ L of the reaction mixture (diluted appropriately) having the composition shown in Table 9 to prepare a PCR amplification reaction solution (5 ⁇ L). The PCR amplification reaction was carried out by incubating the PCR amplification reaction solution at 33°C for 10 hours, and then cooling to 4°C.
  • SSB is SSB derived from E. coli
  • IHF is a complex of IhfA and IhfB derived from E. coli
  • DnaG is DnaG derived from E. coli
  • DnaN is DnaN derived from E. coli
  • Pol III* is a DNA polymerase III* complex consisting of DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, and HolE derived from E. coli
  • DnaB is DnaB derived from E. coli
  • DnaC is Dn derived from E. coli.
  • aC DnaA, E. coli-derived DnaA, RNaseH, E.
  • coli-derived RNaseH Ligase, E. coli-derived DNA ligase, Pol I, E. coli-derived DNA polymerase I, GyrA, E. coli-derived GyrA, GyrB, E. coli-derived GyrB, Topo IV, E. coli-derived ParC and ParE complex, Topo III, E. coli-derived topoisomerase III, RecQ, E. coli-derived RecQ.
  • SSB was prepared by purifying an E. coli expression strain of SSB through a process including ammonium sulfate precipitation and ion exchange column chromatography.
  • IHF was prepared by purifying from an Escherichia coli strain co-expressing IhfA and IhfB through a process including ammonium sulfate precipitation and affinity column chromatography.
  • DnaG was prepared by purification from an Escherichia coli expression strain of DnaG through a process including ammonium sulfate precipitation, anion exchange column chromatography, and gel filtration column chromatography.
  • DnaN was prepared by purification from an Escherichia coli expression strain of DnaN through a process including ammonium sulfate precipitation and anion exchange column chromatography.
  • Pol III* was prepared by purifying from an Escherichia coli strain co-expressing DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ and HolE through a process including ammonium sulfate precipitation, affinity column chromatography, and gel filtration column chromatography.
  • DnaB and DnaC were purified and prepared from an Escherichia coli strain co-expressing DnaB and DnaC through a process including ammonium sulfate precipitation, affinity column chromatography, and gel filtration column chromatography.
  • DnaA was prepared by purification from an Escherichia coli expression strain of DnaA through a process including ammonium sulfate precipitation, dialysis precipitation, and gel filtration column chromatography.
  • GyrA and GyrB were prepared by purification from a mixture of an E. coli expression strain for GyrA and an E.
  • Topo IV was prepared by purifying a mixture of an E. coli expression strain for ParC and an E. coli expression strain for ParE through a process including ammonium sulfate precipitation, affinity column chromatography, and gel filtration column chromatography.
  • Topo III was prepared by purification from an E. coli expression strain of Topo III through a process including ammonium sulfate precipitation and affinity column chromatography. RecQ was purified and prepared from an E.
  • coli expression strain of RecQ through a process including ammonium sulfate precipitation, affinity column chromatography, and gel filtration column chromatography.
  • RNase H, Ligase, and Pol I were commercially available enzymes derived from Escherichia coli (Takara Bio). Tus was purified and prepared from an E. coli expression strain of Tus through a process including affinity column chromatography and gel filtration column chromatography.
  • Example 2 Ligation and Amplification of pUC Plasmid and OriC Cassette
  • Each of the OriC cassette fragments of Preparation Examples 1 to 3 and a partial fragment of the pUC plasmid of Preparation Example 6 were prepared by PCR using a primer containing dUTP.
  • the primers used were those shown in Example 1 and those shown in Table 10.
  • the prepared DNA fragments were mixed and ligated by the same method as in Example 1. Using the same method as in Example 1, a PCR amplification reaction was performed using the ligated DNA as a template to amplify the desired circular DNA.
  • Example 3 Ligation and amplification of pBeloBAC plasmid and OriC cassette
  • OriC cassette fragments of Preparation Examples 1 to 3 and 5 and a partial fragment of the pBeloBAC plasmid of Preparation Example 6 were prepared by PCR using the primers shown in Table 11.
  • Example 4 Cloning of circular DNA incorporating OriC cassette into E. coli
  • the circular DNA obtained in Examples 1 and 2 was introduced into Escherichia coli NEB stable strain (manufactured by NEB) by chemical method. Then, a part of it was cultured at 30°C for 24 hours on LB agar medium containing 33 ⁇ g/mL kanamycin. A plurality of Escherichia coli colonies were selected from the agar plate medium, and each transformed Escherichia coli was shake-cultured at 30°C for 24 hours in 5 mL of liquid medium containing 33 ⁇ g/mL kanamycin. LB liquid medium was used as the liquid medium.
  • a commercially available DNA extraction kit (product name “QIAprep Spin Miniprep Kit”, manufactured by QIAGEN) was used for plasmid extraction.
  • a portion of the plasmid DNA solution eluted with 50 ⁇ L of 10 mM Tris-Cl (pH 8.5) solution was treated with the restriction enzyme XbaI, and the concentration was measured using a fluorometer (product name "Quantus (registered trademark) Fluorometer", manufactured by Promega).
  • Example 4-2 The circular DNA obtained in Example 3 was introduced into E. coli DH5 ⁇ strain (manufactured by Takara) by chemical method. Then, a part of it was cultured at 37° C. for 16 hours on LB agar medium containing 20 ⁇ g/mL chloramphenicol. A plurality of E. coli colonies were selected from the agar plate medium, and each transformed E. coli was shake-cultured at 37° C. for 16 hours in 5 mL of liquid medium containing 20 ⁇ g/mL chloramphenicol. LB liquid medium was used as the liquid medium.
  • a commercially available DNA extraction kit (product name "QIAprep Spin Miniprep Kit", manufactured by QIAGEN) was used for plasmid extraction.
  • An RCR amplification reaction solution was prepared by mixing 1 ⁇ L (200 pg/ ⁇ L) of each of the solutions of plasmids (6 types) in which three types of OriC cassettes (OriC1.0, OriC2.0, OriCsg) were incorporated into two types of p15A plasmids and plasmids (2 types) in which two types of OriC cassettes (OriC2.0, OriCsg) were incorporated into a pUC plasmid, with 99 ⁇ L of a reaction mixture having the composition shown in Table 9.
  • the RCR amplification reaction solution was incubated at 33° C. for 10 hours to carry out an RCR amplification reaction, and then cooled to 4° C.
  • reaction mixture was then subjected to agarose gel electrophoresis together with a marker, and the separated bands were stained with dsGreen.
  • Example 6 Of the eight plasmids used in Example 5, five plasmids having the E1 sequence were used, and the same experiment as in Example 5 was performed three times for each sample. As shown in FIG. 2, the same results as in Example 5 were obtained, and when p15A plasmid and OriCsg were combined, the DNA concentration after amplification was higher than when other OriC cassettes were used. Also, as in Example 5, when pUC plasmid and OriCsg were combined, no significant increase in the DNA concentration after amplification was observed compared to other OriC cassettes. The average values of the three experiments are shown in Table 12.
  • Example 7 Using the three plasmids obtained in Example 4 in which three types of OriC cassettes (OriC1.0, OriC2.0, OriCsg) were incorporated into pBeloBAC, the same experiment as in Example 5 was performed four times for each sample. As shown in FIG. 3, when pBeloBAC plasmid was used, the DNA concentration after amplification was higher when OriCsg was combined, as in the case of using p15A plasmid, compared to the case of using other OriC cassettes. The average values of the experiments are shown in Table 13 (for the experiment using OriC1.0 cassette, the average value was calculated from the results of three experiments).
  • Example 8 Using the four plasmids obtained in Example 4 in which four OriC cassettes (OriC1.0, OriC2.0, OriCsg, OriC_Stuffer) were incorporated into the E1-p15A plasmid, the same experiment as in Example 5 was performed three times for each sample. As shown in FIG. 4, when the pBeloBAC plasmid was used, as in the case of using the p15A plasmid, the DNA concentration after amplification was higher when OriCsg was combined than when other OriC cassettes were used. On the other hand, when the MuSGS sequence of OriCsg was changed to the Stuffer sequence, the DNA concentration after amplification was lower than that of OriCsg. The average values of the experiment are shown in Table 14.
  • Example 9 [Example 9-1] Using the four plasmids obtained in Example 4 in which four OriC cassettes (OriC1.0, OriC2.0, OriCsg, OriC5.6AT) were incorporated into pBeloBAC, the same experiment as in Example 5 was carried out three times for each sample. As shown in FIG. 5, when the pBeloBAC plasmid was used, the DNA concentration after amplification was higher in the order of OriC5.6AT > OriCsg > OriC2.0 > OriC1.0. When the OriC5.6AT cassette was used, there was more open circular DNA (OC) after amplification compared to the other OriC cassettes.
  • OriC5.6AT cassette there was more open circular DNA (OC) after amplification compared to the other OriC cassettes.
  • Example 9-2 After amplifying the circular DNA in the same manner as in Example 9-1, a portion of the RCR amplification reaction solution (1 ⁇ L) was diluted 1/5 with the RCR reaction buffer shown in Table 9. The diluted solution was incubated at 30° C. for 30 minutes and cooled on ice (finalization treatment). Thereafter, a portion of each reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis together with a marker in the same manner as in Example 9-1, and the separated bands were stained with dsGreen. The results are shown in FIG. 6. Compared to Example 9-1, the amount of OC was reduced when the OriC5.6AT cassette was used.
  • Example 10 Using the four types of plasmids used in Example 9, an experiment similar to that of Example 5 was carried out, except that the PCR amplification reaction conditions were 24°C, 27°C, 30°C or 33°C for 10 hours. The results are shown in Figure 7. As shown in Figure 7, circular DNA containing OriC1.0 as the OriC cassette was hardly amplified at 27°C or lower. A small amount of amplification was observed at 27°C for circular DNA containing OriC2.0 or OriCsg. Amplification was observed even at 24°C for circular DNA containing OriC5.6AT, and amplification at a lower temperature was possible compared to the cases where other OriC cassettes were used.
  • Example 11 An experiment similar to that of Example 5 was carried out using four types of plasmids obtained in Example 4 in which four types of OriC cassettes (OriC1.0, OriC2.0, OriCsg, OriC5.6AT) were incorporated into the E1-p15A plasmid, except that the PCR amplification reaction conditions were 33° C. for 3 hours, 6 hours, or 10 hours.
  • the results are shown in FIG. 8.
  • the change in DNA concentration versus reaction time is shown in the graph of FIG. 9 and Table 15.
  • Example 12 A fragment of the commercially available pACYC184_DNA plasmid (Nippon Gene Co., Ltd.) having a replication origin region derived from the p15A plasmid and the OriC cassette fragments of Preparation Examples 2 and 3 (OriC2.0 and OriCsg) were prepared by PCR using the primers shown in Table 16.
  • the fragments were ligated using a homologous recombination reaction in the same manner as in Example 3, and then a PCR amplification reaction was carried out using the ligated DNA as a template to amplify circular DNA in which OriC2.0 or OriCsg had been incorporated into the pACYC184 plasmid. E. coli cloning was then carried out in the same manner as in Example 4-2.
  • Example 13 A linear DNA not having the sequence of E. coli ori was prepared from the pACYC184 plasmid used in Example 12. Each OriC cassette fragment and a partial fragment of the pACYC184 plasmid of Example 12 were prepared by PCR using the primers shown in Table 18.
  • the prepared linear DNA was ligated to the OriC cassette fragments (OriC2.0 and OriCsg) using a homologous recombination reaction in the same manner as in Example 12, and then a PCR amplification reaction was carried out using the ligated DNA as a template to amplify circular DNA in which OriC2.0 or OriCsg was incorporated into the pACYC184 plasmid that does not have an ori.
  • Example 14 In Example 14, the following procedure was used.
  • Non-Patent Document 1 Amplification reactions were performed using the RCR method based on previously published methods (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2) with minor modifications. 5 ⁇ L of the RCR reaction mixture containing 1 ⁇ RCR buffer I, 1 ⁇ RCR buffer II, 1 ⁇ enzyme mix, and 3 ng/ ⁇ L ⁇ phage DNA was used and incubated at 33° C. for 12 hours. The RCR reaction was diluted with 1 ⁇ RCR buffer and incubated at 30° C. for 30 minutes. When the template was AT-rich circular DNA, AT-RCR was used using the previously published RCR reaction mixture containing 300 nM HU and 100 nM H-NS to enhance amplification.
  • PCR amplification was performed using KOD One polymerase (TOYOBO).
  • the resulting fragment was gel extracted and purified by column purification (Macherey-Nagel).
  • the resulting oriC mutant fragment was incorporated into a pSV- ⁇ -galactosidase (pSV ⁇ ; Promega) vector (7.2 kb) using E. coli RecA and exonuclease III by a previously reported method (WO 2023/038145, Example 1) and amplified by the RCR method.
  • the resulting amplified product was purified by column purification (Macherey-Nagel).
  • the amplified DNA was detected every 10 min using a SYBR filter.
  • the doubling time of the amplified DNA in the PCR system was calculated from the slope of the logarithmic phase of the amplification curve.
  • all mutants were cloned into pSV ⁇ plasmid with a GC content of 52%.
  • a 13 kb minichromosome containing oriCwt was used as a competitor and mixed with a 7 kb minichromosome containing an oriC mutant at a ratio of 200 pM:100 pM.
  • the DNA mixture was amplified using the RCR amplification method described above with minor modifications. Each RCR reaction was carried out using 10 ⁇ L of reaction mixture containing the final concentrations of 1 ⁇ RCR buffer I and II, 0.05% Tween 20, and 0.5 ⁇ RE enzyme mixture.
  • the RCR reaction mixture was preincubated at 20° C. for 15 min and then mixed with the DNA mixture on ice to prevent initiation of the RCR reaction. After addition of the DNA mixture, the RCR amplification was carried out at 30° C. for 12 h.
  • the RCR reaction was diluted with 1 ⁇ RCR buffer, incubated at 30° C. for 30 min, and mixed with Stop buffer. An aliquot was then mixed with Stop buffer and analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the resulting amplified product was introduced into a pSV- ⁇ -galactosidase vector (pSV ⁇ ) (6.8 kb, 53% GC) (Promega) using the method described in Example 1 of WO 2023/038145, and amplified to obtain a minichromosome carrying oriCwt (pSV ⁇ -oriCwt).
  • pSV ⁇ pSV- ⁇ -galactosidase vector
  • a minichromosome having oriC2.0AT, oriC3.0AT, oriC3.4AT, or oriC3.6AT> was constructed using the primer pairs listed in Table 21. Specifically, among the primer pairs listed in Table 21, P1/P4 and P2/P3, P1/P6 and P2/P5, and P1/P8 and P2/P7 were used. Then, these two primer pairs were used separately to PCR amplify the oriC region of the template pSV ⁇ -oriCwt DNA in two. The two resulting fragments were then assembled by overlap PCR using the P1/P2 primers, and then introduced into the pSV ⁇ vector using the method described in Example 1 of WO 2023/038145.
  • the minichromosome carrying oriC3.6AT was constructed using the following primer pair. Among the primer pairs shown in Table 21, the oriC region of the template pSV ⁇ -oriC3.0AT DNA was divided into two and PCR amplified using P1/P10 and P2/P9. The two resulting fragments were then assembled by overlap PCR using the P1/P2 primers, and then introduced into the pSV ⁇ vector using the method described in Example 1 of WO 2023/038145.
  • oriC4.0AT was constructed as follows: oriC3.6AT was used as a template to PCR amplify the primer pairs P1/P12 and P2/P7 listed in Table 21 to obtain two fragments, which were then assembled by overlap PCR using P1/P2 and then introduced into the pSV ⁇ vector using the method described in Example 1 of WO2023/038145.
  • oriC5.4AT and oriC5.6AT were constructed using primer pairs P1/P12 and P2/P11, and P1/P14 and P2/P13, respectively. These primer pairs were used for PCR amplification using oriC3.4AT and oriC3.6AT as templates.
  • the assembly fragments generated by overlap PCR using P1/P2 were introduced into pSV ⁇ vector using the method described in Example 1 of WO2023/038145 to obtain circular DNA incorporating oriC5.4AT and oriC5.6AT.
  • oriC6.0AT was constructed as follows: fragments obtained using oriC4.0AT as a template were assembled by overlap PCR using primer pairs P1/P14, P12/P13, and P2/P11 listed in Table 21. The resulting assembly product was introduced into pSV ⁇ vector using the method described in Example 1 of WO2023/038145.
  • Minichromosomes containing oriC mutants which were created and amplified using the method described in Example 1 of WO 2023/038145, were purified using a spin column (product name: QIAprep Spin Miniprep Kit, manufactured by Qiagen). The sequences of the oriC mutants were confirmed by Sanger sequencing.
  • oriCdueM9T, oriCdueM9A, oriCdueM13T, or oriCdueM13A A 7 kb minichromosome containing a polyA or T sequence in the DUE-M or DUE-R region was constructed.
  • oriCdueM9T, oriCdueM9A, oriCdueM13T, and oriCdueM13A were designed with primer pairs P15/P16, P17/P18, P19/P20, and P21/P22, respectively, as shown in Table 21. These primers were used in the subsequent inverse PCR amplification using pSV ⁇ -oriCwt DNA as a template.
  • FIG. 12A is a schematic diagram of the amplification cycle by the RCR method.
  • the amplification process starts from the replication origin (oriC) and exponentially amplifies circular DNA through bidirectional amplification, resulting in supercoiled DNA.
  • the initiation step proceeds only when double-stranded DNA is cleaved at oriC.
  • FIG. 12B is a schematic diagram of the initiation process in oriC.
  • oriC contains an AT-rich double-stranded cleavage domain (DUE) and an initiation protein DnaA assembly domain (DOR).
  • ATP-bound DnaA (ATP-DnaA) binds to DOR and forms a homomultimeric complex, which cleaves the AT-rich DUE and allows the entry of DnaB helicase.
  • Dark arrows R1, R5M, R2, and R4 indicate the DnaA-ADP binding site.
  • Light arrows ( ⁇ 2, l1, l2, C3, C2, l3, and C1) indicate the DnaA-ATP binding site.
  • FIG. 13A Schematic diagrams of the oriC2.0AT and oriC3.0AT sequences created in Example 14-1 are shown in Figure 13A.
  • DUE L, M, and R indicate 13-mer repeat sequences.
  • R1 indicates the DnaA-box R1 sequence.
  • the dotted frame indicates the region (1-60 bp) used to calculate the GC content shown on the right side of the sequence.
  • the sequences in Figure 13A are shown in Table 22.
  • the underline in the wild type indicates the DnaA ssDUE binding sequence (TT[A/G]T(T)), the letters in boxes indicate bases that differ from the wild type sequence, and "-" indicates a base deletion. Each base number was assigned based on the region 70 bp upstream from just before the R1 DnaA-box base.
  • the 10 kb fragment with a GC content of 23% contained a region where the double strand derived from the DUE of oriC2.0AT was easily cleaved, making it difficult for the DNA structure (negative supercoil) necessary for the initiation of replication to form, and therefore the 10 kb fragment with a GC content of 21% was amplified, but the 10 kb fragment with a GC content of 23% was not amplified.
  • the amplification rate was calculated by the doubling time calculated from the slope of the logarithmic plot of amplification shown in Figure 13C.
  • Real-time PCR analysis showed that the amplification rates of oriC2.0AT (29.5 min) and oriC3.0AT (24.7 min) increased by 1.1-fold and 1.3-fold, respectively, compared with oriCwt (31.9 min).
  • oriC2.0AT (10%) showed a slower amplification rate than oriC3.0AT (20%) (high GC content), suggesting that the amplification rate is enhanced by sequence specificity in addition to the reduced GC content of the DUE region.
  • Example 14-3 PCR amplification 1 using OriC mutants with mutations in DUE and DOR
  • Schematic diagrams of the oriC3.0AT and oriC4.0AT sequences prepared in Example 14-1 are shown in FIG. 14A.
  • the mutations in oriC4.0AT compared to oriC3.0AT are shown on the SNPs line.
  • "-" in the sequence indicates a deletion of a base, and lowercase letters indicate a sequence that does not match the DnaA consensus sequence in the DOR region.
  • each base number was assigned with the region 70 bp upstream from just before the base of the R1 DnaA-box as the starting point.
  • Tables 23 and 24 The three sequences in Figure 14A are shown in Tables 23 and 24. Letters in boxes indicate bases that differ from the wild-type sequence. Lowercase letters indicate sequences that do not match the DnaA consensus sequence in the DOR region.
  • the underlined regions indicate the M and R elements of DUE from the 5' side, and ".” indicates a base deletion.
  • the underlined regions indicate the ⁇ 2, I1, and I2 elements of DOR from the 5' side.
  • Figure 14B shows a schematic diagram of mutations on oriC3.0AT, oriC3.4AT, oriC3.6AT, and oriC4.0AT.
  • the asterisks indicate the positions of mutated bases that differ from the wild type.
  • oriC3.4AT is a cassette that has only a mutation in the DOR of oriC4.0AT.
  • oriC3.6AT is a cassette that has only a mutation in the DUE of oriC4.0AT.
  • circular DNA amplification was performed using a method similar to the real-time PCR method of Example 14-2, and the calculated doubling times (min) and standard deviations of DNA amplification are shown at the far right of Figure 14B.
  • Figure 14C shows the results of real-time PCR performed using oriCwt, oriC3.0AT, oriC3.4AT, oriC3.6AT, and oriC4.0AT in a manner similar to that of Example 14-2.
  • oriC4.0AT has three mutations in the DOR portion, G137T in ⁇ 2, C150T in I1, and G161T in I2, compared to oriC3.0AT.
  • Figures 14B and 14C real-time PCR analysis showed that the amplification rate of oriC4.0AT (23.4 min) was 1.4-fold and 1.05-fold faster than oriCwt (31.9 min) and oriC3.0AT (24.7 min), respectively.
  • oriC3.6AT (20.7 min) a cassette that only has mutations in the DUE of oriC4.0AT, had an even higher amplification rate (1.1-fold) and a faster rise in the amplification curve compared to oriC4.0AT.
  • oriC3.4AT (34.1 min), a cassette with only a mutation in the DOR of oriC4.0AT, showed a 0.7-fold decrease in amplification rate compared to oriC4.0AT, and an increase in the amplification curve similar to that of oriCwt.
  • the DUE mutation significantly improved the amplification rate.
  • the oriC cassettes that showed an increased amplification rate had a continuous KAK sequence in the R element of the DUE region, and the oriC cassettes with particularly high amplification rates further contained a repetitive AT sequence on the left (5') side of the M element of the DUE region.
  • Figure 14D shows the results of amplifying circular DNA with different GC contents using oriCwt, oriC3.0AT, oriC3.6AT, and oriC4.0AT, as in Example 14-2. 10 kb DNA fragments with GC contents of 23% and 56% were assembled with each oriC cassette to obtain circular DNA. The resulting DNA was amplified by PCR, electrophoresed on a 1% agarose gel in 0.5x TBE, and stained with SYBR Green I.
  • Example 14-4 PCR amplification 2 using OriC mutants having mutations in DUE and DOR Compared to Example 14-3, it was confirmed whether the DNA amplification rate in the RCR method would change by further reducing the GC content of DUE and increasing the number of KAK sequences. Furthermore, an additional mutation was introduced into R5M, which is particularly important for the initiation of DnaA homo-oligomer formation, among DOR, to confirm whether the DNA amplification rate in the RCR method would change.
  • FIG. 15A A schematic diagram of the oriC4.0AT and oriC6.0AT sequences created in Example 14-1 is shown in Figure 15A.
  • "-" in the sequence indicates a base deletion
  • lowercase letters indicate a sequence that does not match the DnaA consensus sequence in the DOR region.
  • the underlines indicate consecutive KAK sequences.
  • the base numbers are assigned starting from the region 70 bp upstream from just before the base of the R1 DnaA-box.
  • Figure 15B shows a schematic diagram of the mutations on oriC5.4AT, oriC5.6AT, and oriC6.0AT.
  • the asterisk indicates the position of the mutated base that differs from the wild type.
  • oriC5.4AT is a cassette that has the same mutation as that in the DOR of oriC6.0AT.
  • oriC5.6AT is a cassette having the sequence shown in Table 7, and in particular, has the same mutation as that in the DUE (M and R) of oriC6.0AT.
  • circular DNA amplification was performed using a method similar to the real-time PCR method of Example 14-2, and the calculated doubling time (min) and standard deviation of DNA amplification are shown at the far right of Figure 15B.
  • Figure 15C shows the results of real-time PCR performed using oriCwt, oriC5.4AT, oriC5.6AT, and oriC6.0AT in a manner similar to that of Example 14-2.
  • oriC5.4AT which has only the DOR mutation of oriC6.0AT
  • the DNA amplification rate increased by 1.05 times compared to oriC6.0AT.
  • oriC5.4AT was used, the DNA amplification rate in the PCR method was higher (1.3 times) compared to oriCwt.
  • the rise of the amplification curve was only slightly faster than oriCwt.
  • the end of replication was also earlier than oriCwt.
  • FIG. 15D Schematic diagrams of the oriCdueM9T, oriCdueM9A, oriCdueR13T, and oriCdueR13A sequences created in Example 14-1 are shown in Figure 15D. These are mutants of DUE-M or DUE-R with polyA or polyT sequences. The underlines are the same as in Figure 15A. As in Figure 13, the base numbers of each are assigned starting from the region immediately before the base of the R1 DnaA-box and 70 bp upstream. In addition, circular DNA amplification was performed using these mutant oriC cassettes in the same manner as the real-time PCR method in Example 14-2. The calculated DNA amplification doubling time (min) and standard deviation are shown at the far right of Figure 15D. "N.D.” indicates that DNA amplification was not detected.
  • Table 27 The five sequences in Figure 15D are shown in Table 27.
  • boxed letters indicate bases that differ from the wild-type sequence, and shaded letters indicate consecutive KAK sequences.
  • the underlined regions indicate, from the 5' side, the M and R elements of DUE.
  • Example 14-5 We investigated whether the oriC cassette mutant enables PCR amplification at low temperatures.
  • 1 pM of the 7 kb circular DNA having oriCwt, oriC3.4AT, oriC3.6AT, oriC4.0AT, oriC5.4AT, oriC5.6AT, and oriC6.0AT prepared in Example 14-1 was amplified by PCR at 16° C., 18° C., 20° C., or 33° C. for 12 hours.
  • the results of 1% agarose gel electrophoresis (AGE) of the amplified products are shown in FIG. 16A.
  • Example 14-1 a competitive test was carried out using oriCwt, oriC3.4AT, oriC5.4AT, oriC5.6AT and oriC6.0AT prepared in Example 14-1.
  • Amplification of 7 kb circular DNA containing each oriC was carried out using 13 kb circular DNA containing oriCwt as a competitor.
  • the 7 kb DNA and 13 kb DNA were mixed in a ratio of 100 pM:200 pM and amplified using an RCR reaction mixture containing an enzyme mixture for amplification in the RCR method (RE mix) at a final concentration of 0.25x, 0.5x or 1.0x.
  • the results of separation of the amplified products by 1.0% agarose gel electrophoresis are shown in Figure 16B.
  • the graph at the bottom of Figure 16B shows the percentage of 13 kb DNA present, calculated from band intensity using NIH ImageJ software (Schneider, C.A., Rasband, W.S., and Eliceiri, K.W. (2012) NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods, vol.9(7), p.671-675.).
  • oriC3.4AT and oriC5.4AT competed with oriCwt, suggesting that increased binding of DnaA to the DnaA box led to a greater tendency to bind to the DnaA mutants than to the wild type. These mutants appeared to be more competitive under conditions of low DnaA levels without increasing the amplification rate.
  • oriC5.6AT was more likely to open at low concentrations of DnaA compared to the wild-type sequence (data not shown).
  • Example 15 The same experiment as in Example 5 was carried out using the plasmid obtained in Example 4 in which OriCsg was incorporated into the E1-p15A plasmid and the plasmid in which OriC5.6ATsg was incorporated instead of OriCsg, except that the RCR amplification reaction conditions were 30° C. for 6 hours, 10 hours, 15 hours, or 20 hours.
  • the RCR amplification a reaction mixture having the composition shown in Table 9 was appropriately diluted and used. During the reaction, 0.05% Tween 20 (Wako) was added.
  • the OriC5.6ATsg cassette has an OriCsg cassette sequence (SEQ ID NO: 10) in which oriC is the same as oriC of OriC5.6ATsg.
  • the base sequence is shown in Table 28.
  • the underlined uppercase region represents SGS, as in OriCsg.
  • the region in uppercase near the center represents the oriC sequence, as in OriC5.6AT.
  • the bolded portion represents the DUE portion
  • the boxed portion of the bolded portion represents the mutated portion in the mutant DUE.
  • the underlined portions represent the M element (underlined portion on the 5' end) and R element (underlined portion on the 3' end, which has a one-base deletion mutation) of DUE.
  • the boxed region represents the terG16 sequence and its complementary sequence.
  • the OriC5.6ATsg cassette was incorporated into the p15A plasmid using the same method as in Example 1.
  • the primers used were OriC_FW_1 and OriC_RV_1 in Table 8. Cloning was then performed using the same method as in Example 4-1 to obtain a plasmid in which OriC5.6ATsg was incorporated into the E1-p15A plasmid.
  • Example 16 As in Example 15, two types of plasmids in which OriCsg or OriC5.6ATsg was incorporated into the E1-p15A plasmid were used, and the same experiment as in Example 5 was carried out, except that the PCR amplification reaction conditions were 20°C, 25°C, or 30°C for 5 hours, 10 hours, or 20 hours.
  • a reaction mixture having the composition shown in Table 9 was appropriately diluted and used. During the reaction, 0.05% Tween 20 (Wako) was added.
  • Example 17 The same experiment as in Example 5 was carried out using the plasmid obtained in Example 4 in which OriC5.6AT was incorporated into the E1-p15A plasmid and the plasmid obtained in Example 15 in which OriC5.6ATsg was incorporated into the E1-p15A plasmid, except that the PCR amplification reaction conditions were 30° C. for 6 hours, 10 hours, or 20 hours.
  • a reaction mixture having the composition shown in Table 9 was appropriately diluted and used. During the reaction, 0.05% Tween 20 (Wako) was added.
  • Example 18 A cassette was created that had a terG16 sequence and its complementary sequence adjacent to both ends of an oriC sequence having a mutated DUE portion similar to that of the OriC5.6ATsg cassette shown in Example 15, and further 5' to the oriC sequence and the terG16 sequence, had an SGS similar to that of the OriC5.6ATsg cassette, and was named OriC7.0 cassette.
  • the following plasmids were prepared: A plasmid obtained in Example 15 in which OriC5.6ATsg was incorporated into the E1-p15A plasmid. Similarly, a plasmid in which OriC7.0 was incorporated into E1-p15A plasmid. Two types of plasmids obtained in Example 4, in which two types of OriC cassettes (OriC2.0, OriCsg) were incorporated into the E1-p15A plasmid.
  • Example 5 An experiment similar to that of Example 5 was carried out, except that the PCR amplification reaction conditions were 30°C for 5, 10, 15 or 20 hours.
  • the reaction mixture with the composition shown in Table 9 was appropriately diluted and used. 0.05% Tween 20 (Wako) was added during the reaction.
  • Example 19 An experiment similar to that of Example 18 was carried out, except that the PCR amplification reaction conditions were 37° C. for 2 hours, 5 hours, or 10 hours. The change in DNA concentration versus reaction time is shown in FIG. 22. The results were similar to those of Example 18, and showed that the DNA amplification rate was increased at a reaction temperature of 37° C. compared to 30° C. (Example 18).

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Abstract

本発明は、環状ＤＮＡの効率のよい製造方法を提供する。本発明は、（１）鋳型となる環状ＤＮＡを用意することであって、環状ＤＮＡが、（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ii）ジャイレース結合配列を含み、前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まないこと、（２）前記（１）において用意した環状ＤＮＡと、以下：環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；及び２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；を含む反応液との反応混合物を形成すること；並びに（３）前記（２）において形成した反応混合物を、８０℃以下の温度でインキュベートすることであって、これにより、増幅した前記環状ＤＮＡを含む反応物を得ること、を含む、環状ＤＮＡの製造方法である。

Description

環状ＤＮＡの製造方法
　本発明は、無細胞系における、環状ＤＮＡの効率のよい製造方法及び当該製造方法に用いる環状ＤＮＡに関する。
　　本願は、２０２３年７月１９日に、日本に出願された特願２０２３－１１７９０４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　バイオテクノロジーの発展に伴い、試験管内での核酸増幅の技術開発が進んでいる。特に、無細胞系で環状ＤＮＡを増幅する技術としては、ＲＣＲ（Replication Cycle Reaction）法が存在する（特許文献１～３、非特許文献１～２）。
国際公開第２０１６／０８０４２４号 国際公開第２０１７／１９９９９１号 国際公開第２０１８／１５９６６９号
Su’etsugu et al., Nucleic Acids Research, 2017, vol.45(20), p.11525-11534. Hasebe, et al., Life, 2018, vol.8(4), p.43.
　環状ＤＮＡ、特に環状二本鎖ＤＮＡは、ｍＲＮＡ合成の際の鋳型プラスミドなど、多様な場面で用いられ、需要が高まっている。このような背景のもと、本発明は、効率のよい環状ＤＮＡの製造方法を提供することを主たる目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究した結果、従前のＲＣＲ法において、増幅対象の環状ＤＮＡが特定の配列を有することで、さらに、増幅効率が高まることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下に関する。
［１］　（１）鋳型となる環状ＤＮＡを用意することであって、環状ＤＮＡが、（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ii）ジャイレース結合配列を含み、
　前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない、こと、
（２）前記（１）において用意した環状ＤＮＡと、以下：
　環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
　カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；及び
　２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；
を含む反応液との反応混合物を形成すること；並びに
（３）前記（２）において形成した反応混合物を、８０℃以下の温度でインキュベートすることであって、これにより、増幅した前記環状ＤＮＡを含む反応物を得る、こと、
を含む、環状ＤＮＡの製造方法。
［２］　前記（i）の複製開始配列が、野生型複製開始配列の二重鎖開裂領域と比較してＡＴ含有率の高い変異二重鎖開裂領域を有し、二重鎖開裂領域は、Ｌ、Ｍ及びＲエレメントを有する、前記［１］の方法。
［３］　前記（ii）のジャイレース結合配列が、バクテリオファージＭｕ由来の配列である、前記［１］又は［２］の方法。
［４］　（１）鋳型となる環状ＤＮＡを用意することであって、環状ＤＮＡが（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含み、かつ、
　当該複製開始配列が、野生型複製開始配列の二重開裂領域と比較してＡＴ含有率の高い変異二重鎖開裂領域を有し、前記二重鎖開裂領域は、Ｌ、Ｍ及びＲエレメントを有する、こと、
（２）前記（１）において用意した環状ＤＮＡと、以下：
　環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
　カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；及び
　２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；
を含む反応液との反応混合物を形成すること；並びに
（３）前記（２）において形成した反応混合物を、８０℃以下の温度でインキュベートすることであって、これにより、増幅した前記環状ＤＮＡを含む反応物を得る、こと、
を含む、環状ＤＮＡの製造方法。
［５］　前記（３）に続いてさらに、
（４）前記第一から第三の酵素群を含まない溶液で反応物を２倍以上に希釈すること、及び、前記希釈後に、得られた希釈物を、前記第二の酵素群及び前記第三の酵素群が作用する条件で維持すること、
を含む、前記［４］の方法。
［６］　前記変異二重鎖開裂領域が、
　二重鎖開裂領域を構成するＬ、Ｍ及びＲエレメントのうち、Ｍ及び／又はＲエレメントが、野生型のＭ及び／又はＲエレメントと比較して高いＡＴ含有率を有する変異二重鎖開裂領域である、
　二重鎖開裂領域を構成するＭエレメントが反復的なＡＴ配列を有する変異二重鎖開裂領域である、及び／又は
　二重鎖開裂領域を構成するＲエレメントが４つ以上の連続したＫＡＫ（Ｋは、Ｔ又はＧ）モチーフ配列を有する変異二重鎖開裂領域である、
前記［２］～［５］のいずれかの方法。
［７］　前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列に対して外向きに挿入されたｔｅｒ配列をさらに含み、
　前記ｔｅｒ配列は、前記複製開始配列に隣接しておらず、
　前記（２）の反応液が、さらに、ｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質を含む、
前記［１］～［６］のいずれかの方法。
［８］　前記環状ＤＮＡが、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列に対して外向きに挿入されたｔｅｒ配列をさらに含み、
　前記ｔｅｒ配列が、野生型ｔｅｒ配列の１以上の塩基を、置換、欠失、又は挿入させる変異を導入したｔｅｒ配列であり、
　前記（２）の反応液が、さらに、ｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質を含む、前記［１］～［７］のいずれかの方法。
［９］　前記（３）のインキュベートが、等温でのインキュベートを含む、前記［１］～［８］のいずれかの方法。
［１０］　前記（３）のインキュベートが、６５℃以下の２つの温度でのインキュベートを繰り返す温度サイクル下でのインキュベートを含む、前記［１］～［８］のいずれかの方法。
［１１］　前記第一の酵素群が、ＤｎａＡ活性を有する酵素、ＳＳＢ、ＤｎａＢ型ヘリカーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素、ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡクランプ活性を有する酵素、及びＤＮＡポリメラーゼIII活性を有する酵素又は酵素群を含み、
　前記第二の酵素群が、ＤＮＡポリメラーゼＩ活性を有する酵素及びＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素を含み、
　前記第三の酵素群が、トポイソメラーゼＩＩＩ活性を有する酵素又はトポイソメラーゼＩＶ活性を有する酵素を含む、前記［１］～［１０］のいずれかの方法。
［１２］　前記反応液が、さらに、直鎖状ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを含む、前記［１］～［１１］のいずれかの方法。
［１３］　前記反応液が、さらに、一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを含む、前記［１］～［１２］のいずれかの方法。
［１４］　（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ii）ジャイレース結合配列を含む環状ＤＮＡであって、
　前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない、環状ＤＮＡ。
［１５］　（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列、（ii）ジャイレース結合配列、及び（iii）プラスミド複製起点を含む環状ＤＮＡであって、
　前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない、環状ＤＮＡ。
　本発明によれば、環状ＤＮＡを効率よく製造することができる。また、ＲＣＲ法により効率よく製造可能な環状ＤＮＡを提供することができる。
実施例５におけるゲル電気泳動の図である。 実施例６におけるゲル電気泳動の図である。 実施例７におけるゲル電気泳動の図である。 実施例８におけるゲル電気泳動の図である。 実施例９－１におけるゲル電気泳動の図である。 実施例９－２におけるゲル電気泳動の図である。 実施例１０におけるゲル電気泳動の図である。 実施例１１におけるゲル電気泳動の図である。 実施例１１における反応時間に対するＤＮＡ濃度の変化を示すグラフである。 実施例１２におけるゲル電気泳動の図である。 実施例１３におけるゲル電気泳動の図である。 図１２Ａは、ＲＣＲ法による環状ＤＮＡの増幅サイクルの模式図を示す。図１２Ｂは、ｏｒｉＣからの複製開始プロセスの模式図を示す。 実施例１４－２の結果を示す図である。図１３Ａは、野生型及び２種のｏｒｉＣカセット変異体の配列を示す。図１３Ｂは、３種のｏｒｉＣカセットを用いて異なるＧＣ含有率のＤＮＡを増幅した結果を示す。図１３Ｃは、３種のｏｒｉＣカセットを用いて実施したリアルタイムＲＣＲの結果を示す。 実施例１４－３の結果を示す図である。図１４Ａは、野生型及び２種のｏｒｉＣカセット変異体の配列を示す。図１４Ｂは、４種のｏｒｉＣカセット変異体における変異位置を示す模式図である。図１４Ｃは、５種のｏｒｉＣカセットを用いて実施したリアルタイムＲＣＲの結果を示す。図１４Ｄは、４種のｏｒｉＣカセットを用いて異なるＧＣ含有率のＤＮＡを増幅した結果を示す。 実施例１４－４の結果を示す図である。図１５Ａは、野生型及び２種のｏｒｉＣカセット変異体の配列を示す。図１５Ｂは、３種のｏｒｉＣカセット変異体における変異位置を示す模式図である。図１５Ｃは、４種のｏｒｉＣカセットを用いて実施したリアルタイムＲＣＲの結果を示す。図１５Ｄは、野生型及び４種のｏｒｉＣカセット変異体の配列を示す。 実施例１４－５の結果を示す図である。図１６Ａは、７種のｏｒｉＣカセットを用いて、異なる温度でＲＣＲ法によるＤＮＡ増幅を実施した結果を示す。図１６Ｂは、５種のｏｒｉＣカセットを用いて実施した、競合ＲＣＲ増幅の結果を示す。 実施例１５におけるゲル電気泳動の図である。 実施例１５における反応時間に対するＤＮＡ濃度の変化を示すグラフである。 実施例１６におけるゲル電気泳動の図である。 実施例１７におけるゲル電気泳動の図である。 実施例１８における反応時間に対するＤＮＡ濃度の変化を示すグラフである。 実施例１９における反応時間に対するＤＮＡ濃度の変化を示すグラフである。
　以下、本発明を実施する形態（本実施形態ともいう。）を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
＜環状ＤＮＡ＞
　本実施形態において、鋳型として用いる環状ＤＮＡは、２重鎖であることが好ましい。鋳型として用いる環状ＤＮＡは、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含み、以下で説明する特徴を有するものであれば、特に制限はされず、微生物の環状染色体等の天然の環状ＤＮＡを酵素処理等によって切断したもの等に別のＤＮＡ断片を連結し、それを環状化した環状ＤＮＡ、全て人工的に合成した環状ＤＮＡ等を例示することができる。
　ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌に存在する公知の複製開始配列を、ＮＣＢＩ等の公的なデータベースから入手することができる。また、複製開始配列は、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能なＤＮＡ断片をクローニングし、その塩基配列を解析することによって得ることもできる。本発明で用いられる複製開始配列としては、公知の複製開始配列の１個又は２個以上の塩基を、置換、欠失、又は挿入させる変異を導入した配列であって、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な改変配列も、使用することができる。本発明で用いられる複製開始配列は、好ましくはｏｒｉＣ及びその改変配列であり、より好ましくは大腸菌由来のｏｒｉＣ及びその改変配列である。本実施形態において鋳型として用いる環状ＤＮＡは、もともと複製開始配列を含む環状ＤＮＡであってもよいし、もともとは複製開始配列を含まない環状ＤＮＡに複製開始配列を導入したものであってもよい。
　一態様において、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列は、大腸菌由来のｏｒｉＣ及びその改変配列であって、２６５ｂｐ以上の長さを有する配列である。一態様において、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列は、配列番号４を有する配列であるか、配列番号４の配列の改変配列であって、配列番号４における両端１２又は１３塩基に変異を有しない配列である。一態様において、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列は、配列番号４の配列の改変配列であって、下記に下線で示す配列番号２９（５’末端）及び／又は配列番号３０（３’末端）を有する配列であるか、配列番号２９又は３０において、１又は複数の塩基が欠失、置換又は付加された配列を有する配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　一態様において、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列は、ｏｒｉＣの改変配列であって、ｏｒｉＣに存在する１１個のＤｎａＡボックスの１又は複数個が欠失した配列である。ｏｒｉＣのＤｎａＡボックスは、ＤＵＥに近い側から、Ｒ１、Ｒ５、τ２、Ｉ１、Ｉ２、Ｒ２、Ｃ３、Ｃ２、Ｉ３、Ｃ１及びＲ４と呼ばれる。一態様において、前記ｏｒｉＣの改変配列は、１１個のＤｎａＡボックスのうち、Ｒ２、Ｃ３、Ｃ２、Ｉ３、Ｃ１及びＲ４から選択される１～６個、例えばＣ３、Ｃ２、Ｉ３、Ｃ１及びＲ４から選択される１～５個、例えば、Ｃ３、Ｃ２、Ｉ３、Ｃ１及びＲ４が欠失した配列である。
　一態様において、本実施形態の方法において用いる環状ＤＮＡは、（ｉ）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ｉｉ）ジャイレース結合配列（strong gyrase-binding sequence、ＳＧＳ）を含む。ＳＧＳは、ＤＮＡジャイレースが結合し、ＤＮＡに負のスーパーコイルを導入する結合配列である。ＳＧＳとしては、そのコンセンサス配列であるＲＮＮＮＲＮＲ［Ｔ／Ｇ］ＧＲＹＣ［Ｇ／Ｔ］ＹＮＹＮ［Ｇ／Ｔ］ＮＹ（Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）（配列番号３１）又はその相補配列を含む配列が挙げられる（Lockshon and Morris, Journal of Molecular Biology, 1985, vol.181, p.63-74.）。ＳＧＳは、コンセンサス配列を有する限り、いずれの生物種由来の配列であってもよく、例えば、ファージ由来ＳＧＳ、プラスミド由来ＳＧＳを用いることができる。また、ＳＧＳは、コンセンサス配列の前後の配列を有してもよく、いずれかの生物種由来ＳＧＳの改変配列であってもよい。当該改変配列は、それを含む環状ＤＮＡの、ＲＣＲ法による増幅効率を高める機能を保持したまま、改変前の塩基配列の１個又は２個以上の塩基を、置換、欠失、又は挿入させる変異を導入した塩基配列を意味する。一態様において、ＳＧＳは、複製開始配列に環状ＤＮＡの増幅効率を高める効果を十分に得る観点から、バクテリオファージ由来のＳＧＳが好ましく、バクテリオファージＭｕ由来のＳＧＳ（Ｍｕ－ＳＧＳ）（Folarin et al., Bioengineering, 2019, vol.6(2):54.）がより好ましく、配列番号９の配列であるか又はこれを含む配列がより好ましい。
　ＳＧＳは、環状ＤＮＡのいずれの位置に配置されていてもよく、複製開始配列からの距離も特に限定されない。一態様において、ＳＧＳは、複製開始配列に隣接又は近接しており、複製開始配列の末端から３０塩基以内、２０塩基以内、１５塩基以内、１３塩基以内、又は１０塩基以内に配置される。一態様において、ＳＧＳは、複製開始配列の二重鎖開裂領域（ＤＵＥ）側末端に隣接又は近接しており、複製開始配列のＤＵＥ側末端から３０塩基以内、２０塩基以内、１５塩基以内、１３塩基以内、又は１０塩基以内に配置される。
　一態様において、本実施形態の方法において用いる環状ＤＮＡは、（ｉ）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ｉｉ）ジャイレース結合配列を含み、かつ、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない。一態様において、本実施形態の方法において用いる環状ＤＮＡは、（ｉ）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列、（ｉｉ）ジャイレース結合配列及び（ｉｉｉ）プラスミド複製起点を有し、かつ、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない。
　このような構成を有する環状ＤＮＡは、後述のＲＣＲ法により増幅した場合に効率よく増幅することができ、より特定すれば、より高い収量での増幅、より高い増幅速度での増幅、より少ない酵素量での増幅、及びより低濃度（例えば、１分子）の環状ＤＮＡからの正確な増幅のいずれか一以上に有用である。
　本実施形態に係る環状ＤＮＡがプラスミド複製起点を有する場合、例えば、ｐ１５Ａ型、Ｆ型、ＣｏｌＥ１型、ｐｓＣ１０１型、Ｐ１型、Ｒ１型、Ｒ６Ｋγ型、λ型、φＢ２型、φＢ０型、ＲＫ２型、Ｐ４型等公知のプラスミド複製起点が挙げられ、ｐ１５Ａ型及びＦ型が特に好ましい。ｐ１５Ａ型複製起点としては、ｐＡＣＹＣ等のプラスミドの複製起点であるｐ１５Ａ又はそれらの改変配列が挙げられる。Ｆ型複製起点としては、ｐＢｅｌｏＢＡＣ等のプラスミドの複製起点であるｆｏｒｉ又はそれらの改変配列が挙げられる。当該改変配列としては、プラスミド複製起点としての機能を保持したまま、改変前の塩基配列の１個又は２個以上の塩基を、置換、欠失、又は挿入させる変異を導入した塩基配列を使用することができる。一態様において、本実施形態にかかる環状ＤＮＡがプラスミド複製起点を有する場合、ＣｏｌＥ１型ではない。ＣｏｌＥ１型複製起点としては、ｐＵＣ、ｐＧＥＭ、ｐＴＺ、ｐＢＲ３２２等のプラスミドの複製起点であるｐＭＢ１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等のプラスミドの複製起点であるＣｏｌＥ１が挙げられる。
　本実施形態の一態様において、鋳型となる環状ＤＮＡは、前記複製開始配列と異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない。ＤｎａＡボックスクラスターとは、ＤｎａＡ　ボックス又はその類似配列が、順向き、逆向き問わず、２つ以上、５０塩基以内に近接して存在する領域である。ＤｎａＡボックスのコンセンサス配列は、ＴＴ［Ａ／Ｔ］ＴＮＣＡＣＡ（ＤｎａＡＢコンセンサス配列１）であり、その逆向き配列は、ＴＧＴＧＮＡ［Ａ／Ｔ］ＡＡ（ＤｎａＡＢコンセンサス配列２）であり、これらの類似配列は、ＤｎａＡＢコンセンサス配列１又はＤｎａＡＢコンセンサス配列２において、１又は複数、例えば、１、２、３、４又は５つの塩基、好ましくは１～３個の塩基、より好ましくは１～２個の塩基が、欠失、置換又は付加された配列である。ｐ１５Ａ型複製起点であるｐ１５Ａ及びＦ型複製起点であるｆｏｒｉは、ＤｎａＡボックスクラスターを含まず、ＣｏｌＥ１型複製起点であるｐＵＣは、ＤｎａＡボックスクラスターを含む。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、前記複製開始配列と異なる位置の領域であって、１００塩基以内、９０塩基以内、８０塩基以内、７０塩基以内、６０塩基以内、好ましくは５０塩基以内（２つの場合、例えば５０塩基以内、４０塩基以内、３０塩基以内）の領域に、ＤｎａＡＢコンセンサス配列１、ＤｎａＡＢコンセンサス配列２及びこれらの配列において、１～３個、好ましくは１～２個の塩基が欠失、置換又は付加された配列を、２つ以上、例えば、３つ、有さない環状ＤＮＡである。一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、ＤｎａＡＢコンセンサス配列１又はその類似配列、ＤｎａＡＢコンセンサス配列２又はその類似配列、及びＤｎａＡＢコンセンサス配列２又はその類似配列を、この順で、５０塩基以内に含む環状ＤＮＡではない。ここで、当該類似配列は、もとの配列において、１～２個の塩基が、欠失、置換又は付加された配列である。一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、ＤｎａＡＢコンセンサス配列１又はその類似配列、ＤｎａＡＢコンセンサス配列２の類似配列、及びＤｎａＡＢコンセンサス配列２の類似配列を、この順で、５０塩基以内に含む環状ＤＮＡではない。ここで、当該類似配列は、もとの配列において、１～２個の塩基が、欠失、置換又は付加された配列である。
　ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列（例えば、ｏｒｉＣ）は、ＤＵＥとＤｎａＡ集合領域（ＤＯＲ）を含む。ＡＴＰ結合型ＤｎａＡが複製開始配列に結合すると、ＤｎａＡ・ｏｒｉＣ複合体が構造変化し、ＤＵＥ領域内で二重鎖ＤＮＡが開裂してＤＮＡの複製が開始する。そこで、一態様において、本実施形態の方法において用いる環状ＤＮＡは、（ｉ）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ｉｉ）ジャイレース結合配列を含み、かつ、（ｉ）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列が、下記（Ｆ１）～（Ｆ５）のいずれか１以上の特徴を有する。
（Ｆ１）野生型ＤＵＥと比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥを有する。
（Ｆ２）ＤＵＥが、Ｍエレメントにおける反復的なＡＴ配列を有する。
（Ｆ３）ＤＵＥが、Ｒエレメントにおける４つ以上の連続したＫＡＫ（Ｋは、Ｔ又はＧ）モチーフ配列を有する。
（Ｆ４）ＤＯＲ領域のＲ５Ｍ配列が、ＤｎａＡのコンセンサス配列（ＴＧＴＧＮＡＷＡＡ）と同一の配列を有する。
（Ｆ５）野生型ＤＵＥと比較して、ＤＵＥ領域の、ＴＴ［Ａ／Ｇ］Ｔ（Ｔ）配列モチーフ（例えばＴＴＡＴＴ）の数が増加している。
　本実施形態の環状ＤＮＡは、野生型ＤＵＥと比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥを有する。
　本明細書中において、変異配列についてＡＴ含有率が高いとは、変異前の野生型配列と比較して、１以上、２以上、好ましくは３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上又は９以上の変異を有することを指す。変異は、Ｃ又はＧの欠失、Ｃ又はＧのＡ又はＴへの置換であり、後者がより好ましい。
　ＤＵＥは、ＡＴ含有率の高い１３塩基のエレメントを３つ有し、それぞれ、Ｌ、Ｍ及びＲエレメントと呼ばれる（Katayama et al., Frontiers in Microbiology (2017)Vol.8:2496.）。一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、野生型ＤＵＥと比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥを有し、好ましくは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのエレメントが、野生型ＤＵＥと比較してＡＴ含有率が高い変異ＤＵＥを有する。本実施形態の環状ＤＮＡは、より好ましくはＭ又はＲエレメントが、さらに好ましくはＭ及びＲエレメントが、野生型ＤＵＥのものと比較してＡＴ含有率が高い変異ＤＵＥである。野生型ＤＵＥと比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥは、例えば、野生型ＤＵＥと比較して、ＡＴモチーフ（ＡとＴが連続した部分）の増加した配列である。
　野生型ＤＵＥ並びに野生型ＤＵＥのＬ、Ｍ及びＲエレメントの配列を以下に示す。各ＤＵＥはコンセンサス配列（ＧＡＴＣＴｎＴＴｎＴＴＴＴ：配列番号１１０）と同一の配列を有する１３－ｍｅｒである(Bramhill, D., & Kornberg, A. (1988) Cell, 52(5), 743-755.)。一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、これらの配列の１以上、例えば、配列番号１１１において、１以上、２以上、好ましくは３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上又は９以上の変異を有する。一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、配列番号１１３又は配列番号１１４、或いは配列番号１１３及び配列番号１１４のそれぞれにおいて、１以上、好ましくは２以上、３以上、又は４以上の変異を有する。変異は、Ｃ又はＧの欠失、Ｃ又はＧのＡ又はＴへの置換であり、好ましくは、Ｃ又はＧのＡ又はＴへの置換である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、好ましくは、野生型ＤＵＥと比較して、ＤＵＥのＭエレメントにおける反復的なＡＴ配列を有しており、例えば（ＡＴ）ｎの配列を有する。ここで、ｎは、２以上の整数であり、好ましくは３以上、４以上、５以上の整数である。ｎの上限は特段限定されないが、例えば３０以下、好ましくは２５以下、２０以下、１５以下の整数であり、一態様において、例えば１２以下、１０以下又は８以下の整数である。例えば、ｎは、３～１０の整数、３～８の整数、５～８の整数、５～７の整数、又は７である。Ｍエレメントにおける反復的なＡＴ配列とは、Ｍエレメントの配列をその反復的な配列に含む限り、Ｍエレメント以外の配列を含んでもよい。一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、Ｍエレメントの５’側の配列が反復的なＡＴ配列を有してもよい。また、Ｍエレメントにおける反復的なＡＴ配列とは、ＡＴ配列が反復し、Ｍエレメントの配列をその反復的な配列に含む限り、複数の反復的なＡＴ配列が非連続で含まれてもよい。例えば、ある環状ＤＮＡが、ＤＵＥのＭエレメントにおいて（ＡＴ）ｎ’配列及び（ＡＴ）ｎ”配列を有してもよく、この場合、ＤＵＥのＭエレメントは、（ＡＴ）ｎの配列（ここで、ｎ＝ｎ’＋ｎ”）を有する。好ましい一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、例えば、ＤＵＥのＭエレメント（その周辺配列を含む）に、ＧＡＴＡＴＧＴＴＣＴＡＴＴ（配列番号５０）、ＴＡＴＡＴＡＴＴＣＴＡＴＴ（配列番号５１）、ＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴ（配列番号３２）、ＴＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣ（配列番号５２）、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＣＴＡＴＴ（配列番号５３）、及びＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴ（配列番号５４）から選択される配列、又はこれらの配列の１以上の塩基（好ましくはＡＴ以外の１以上の塩基）が、置換、欠失又は挿入された配列を有する。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、野生型ＤＵＥと比較して、ＤＵＥのＲエレメントにおける連続するＫＡＫモチーフ配列（Ｋは、Ｔ又はＧ。本明細書中において、特筆しない限り同様である。）が多い、変異ＤＵＥを有する。ここで、Ｒエレメントにおける連続するＫＡＫモチーフ配列とは、Ｒエレメントの配列をその連続する配列に含む限り、Ｒエレメント以外の配列を含んでもよく、すなわち、Ｒエレメントを中心とする周辺配列を含んでもよい。例えば、野生型のｏｒｉＣでは、ＤＵＥのＲエレメントにおける連続するＫＡＫモチーフ配列が３つ存在するが、本実施形態の環状ＤＮＡではこれが、４以上、５以上、６以上又は７以上であることが好ましい。本実施形態の環状ＤＮＡ中のＫＡＫモチーフ配列の数の上限は特に限定されないが、例えば、１５以下、１０以下又は７以下であることが好ましい。例えば、ＤＵＥのＲエレメントにおいて、連続する５～７つのＫＡＫモチーフ配列を有することができる。好ましい一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、例えば、ＤＵＥのＲエレメント（その周辺配列を含む）に、ＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧ（配列番号５５）、ＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧＧＡＴ（配列番号５６）、ＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧ（配列番号３３）、及びＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧＧＡＴ（配列番号５７）から選択される配列、これらの配列のＫＡＫモチーフにおいて、ＴがＧに又はＧがＴに置換された配列、或いはこれらの配列の１以上の塩基（好ましくはＫＡＫモチーフ配列以外の１以上の塩基）が、置換、欠失又は挿入された配列を有する。理論に束縛されるものではないが、これにより、ＤＵＥ領域内へのＤｎａＡタンパク質の結合が強化すると考えられる。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、好ましくは、ＤＵＥがＭエレメントにおける（ＡＴ）ｎ配列を有し、ここで、ｎは、３以上の整数であり、かつ、ＤＵＥがＲエレメントにおける５つ以上の連続するＫＡＫモチーフ配列を有する。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、野生型ＤＵＥと比較して、ＤＵＥにおけるＴＴ［Ａ／Ｇ］Ｔ（Ｔ）配列モチーフ（例えばＴＴＡＴＴ）の数が増加しており、好ましくは、２以上、例えば３以上のＴＴ［Ａ／Ｇ］Ｔ（Ｔ）配列（例えばＴＴＡＴＴ）を有する。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、ＤＵＥ配列が、ＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴ（配列番号３２）及びＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧ（配列番号３３）又はこれらの類似配列を有する配列であることが好ましい。これらの類似配列は、配列番号３２又は３３において、１又は複数、例えば、１、２、３、４又は５つの塩基、好ましくは１～３個の塩基、より好ましくは１～２個の塩基、特に好ましくは１個の塩基が、欠失、置換又は付加された配列である。
　ＤＯＲについて、最小限のｏｒｉＣ領域内には１１個のＤｎａＡ－ｂｏｘが存在し（図１２Ｂ）、そのうち３つ（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４）は同一の配列５’－ＴＧＴＧｎＡ［Ｔ／Ａ］ＡＡ－３’を有し、ＤｎａＡに対する高い親和性を有する。一方、残りの８つ（Ｒ５Ｍ、τ２、ｌ１、ｌ２、Ｃ３、Ｃ２、ｌ３及びＣ１）は、ＤｎａＡへの低親和性をもたらす１～６個の変異を有する。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、ＤＯＲのＲ５Ｍ配列が、ＤｎａＡのコンセンサス配列（ＴＧＴＧＮＡＷＡＡ；Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ、Ｗ＝Ａ又はＴ）と同一の配列を有する。
　このような構成を有する環状ＤＮＡ（このような構成のｏｒｉＣを有する環状ＤＮＡ）は、後述のＲＣＲ法により増幅した場合に効率よく増幅することができ、より特定すれば、より高い収量での増幅、より高い増幅速度での増幅、より少ない酵素量での増幅及びより低温での増幅のいずれか一以上に有用である。また、このような構成を有する環状ＤＮＡは、環状ＤＮＡ全体のＡＴ含有率が高い場合でも、より正確な増幅が可能である。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、（ｉ）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ｉｉ）ジャイレース結合配列を含み、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まず、かつ、ＤＵＥがＭエレメントにおける（ＡＴ）ｎ配列を有し、ここで、ｎは、３以上の整数であり、かつ、ＤＵＥがＲエレメントにおける５つ以上の連続するＫＡＫモチーフ配列を有する。
　このような構成を有する環状ＤＮＡ（このような構成のｏｒｉＣを有する環状ＤＮＡ）は、後述のＲＣＲ法により増幅した場合に効率よく増幅することができ、より特定すれば、より高い収量での増幅、より高い増幅速度での増幅、より少ない酵素量での増幅及びより低温での増幅のいずれか一以上に有用である。また、このような構成を有する環状ＤＮＡは、コンカテマーのような副生成物が少なく、より正確な増幅が可能である。
　本実施形態の環状ＤＮＡは、さらに、前記複製開始配列に対して外向きに挿入されたｔｅｒ配列を有していてもよい。一態様において、前記ｔｅｒ配列は、前記複製開始配列中のＤＵＥから遠い末端に対して外向きに挿入される。一態様において、前記ｔｅｒ配列は、前記複製開始配列中のＤＵＥに近い末端に対して外向きに挿入される。これにより、当該ＤＮＡカセットを含むプラスミドを、ＲＣＲ法により試験管内で増幅させる場合に、ＤＮＡマルチマーの産生を抑え、当該プラスミドの増幅産物を効率よく得ることができる。
　ｔｅｒ配列について「複製開始配列に対して外向きに挿入」するとは、ｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質の組合せの作用により、ｏｒｉＣのような複製開始配列より外側に向かう方向の複製に対しては複製を許容する一方、複製開始配列に向かって入ってくる方向の複製に対しては複製を許容せずに停止させる方向で、ｔｅｒ配列を挿入することを意味する。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、さらに、前記複製開始配列に対してそれぞれ外向きに挿入された一対のｔｅｒ配列を有する。ｔｅｒ配列について「複製開始配列に対してそれぞれ外向きに挿入された１対の」とは、一方が複製開始配列の５’側に挿入され、他方が複製開始配列の３’側に挿入された状態を意味する。
　複製開始配列の５’側に挿入されるｔｅｒ配列としては、例えば、後記の配列番号３４～４９に示される配列が挙げられる。複製開始配列の３’側に挿入されるｔｅｒ配列としては、例えば、複製開始配列の５’側に挿入された塩基配列の相補配列を含む配列が挙げられる。
　例えば、ＤＮＡ上のｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質とｔｅｒ配列による複製終結システムとしては、大腸菌においてはＴｕｓ－ｔｅｒシステム、バチルス属細菌ではＲＴＰ－ｔｅｒシステムが知られている（特許文献３）。ｔｅｒ配列としては、これらのシステムに使用できるｔｅｒ配列又はその改変配列を用いることができる。なお、ｔｅｒ配列の改変配列とは、ｔｅｒ配列としての機能を保持したまま、改変前の塩基配列の１個又は２個以上の塩基を、置換、欠失、又は挿入させる変異を導入した塩基配列を意味する。Ｔｕｓ－ｔｅｒシステムを用いる場合には、プラスミド複製の際にＴｕｓタンパク質を使用し、ＲＴＰ－ｔｅｒシステムを用いる場合には、プラスミド複製の際にＲＴＰタンパク質を使用する。
　本実施形態に係る環状ＤＮＡが有するｔｅｒ配列は、野生型ｔｅｒ配列であってもよく、野生型ｔｅｒ配列の１以上の塩基を、置換、欠失、又は挿入させる変異を導入した変異型ｔｅｒ配列であってもよい。Ｔｕｓ－ｔｅｒシステムに使用できる野生型ｔｅｒ配列としては、５’－ＧＮ［Ａ／Ｇ］［Ｔ／Ａ］ＧＴＴＧＴＡＡＣ［Ｔ／Ｇ］Ａ－３’（配列番号３４）が挙げられ、５’－Ｇ［Ｔ／Ｇ］Ａ［Ｔ／Ａ］ＧＴＴＧＴＡＡＣ［Ｔ／Ｇ］Ａ－３’（配列番号３５）、５’－ＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＴＡ－３’（配列番号３６）、５’－ＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＴＡＡＡＧ－３’（配列番号３７）、５’－ＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＴＡ－３’（配列番号３８）、５’－ＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＧＡ－３’（配列番号３９）、５’－ＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＴＡ－３’（配列番号４０）、５’－ＧＧＡＡＧＴＴＧＴＡＡＣＧＡ－３’（配列番号４１）、又は５’－ＧＴＡＡＧＴＴＧＴＡＡＣＧＡ－３’（配列番号４２）を含む塩基配列が好ましい。また、本実施形態に係る環状ＤＮＡが有するｔｅｒ配列としては、変異型ｔｅｒ配列が好ましい。変異型ｔｅｒ配列としては、配列番号３４の塩基配列中の１個又は数個の塩基を置換した改変配列を含む塩基配列が挙げられる。本実施形態に係る環状ＤＮＡが有する変異型ｔｅｒ配列としては、５’－ＧＮ［Ａ／Ｇ］［Ｔ／Ａ］ＧＴＴＧＴＡＣＣ［Ｔ／Ｇ］Ａ－３’（配列番号４３）、５’－ＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡｃＣＴＡ－３’（配列番号４４）が好ましく、例えば、配列番号４４を有する５’－ＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＡＡＡＧ－３’（配列番号５）が挙げられる。
　ＲＴＰ－ｔｅｒシステムに使用できるｔｅｒ配列としては、５’－ＡＣ［Ｔ/Ａ］［Ａ/Ｇ］ＡＮＮＮＮＮ［Ｃ/Ｔ］ＮＡＴＧＴＡＣＮＡＡＡＴ－３’（配列番号４５）を含む塩基配列が挙げられる。本発明に係るＤＮＡカセットが有するＲＴＰ－ｔｅｒシステムに使用するためのｔｅｒ配列としては、５’－ＡＣＴＡＡＴＴ［Ａ/Ｇ］Ａ［Ａ/Ｔ］Ｃ［Ｔ/Ｃ］ＡＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴ－３’（配列番号４６）、５’－ＡＣＴＡＡＴＴ［Ａ／Ｇ］Ａ［Ａ／Ｔ］Ｃ［Ｔ／Ｃ］ＡＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡ－３’（配列番号４７）、５’－ＧＡＡＣＴＡＡＴＴＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡ－３’（配列番号４８）、又は５’－ＡＴＡＣＴＡＡＴＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡ－３’（配列番号４９）を含む塩基配列が好ましい。
　ｔｅｒ配列は、複製開始配列に対して外向きに挿入されている限り、その配置は特に限定されず、複製開始配列とＳＧＳとの間に配置されてもよく、外側に配置されてもよい。一態様において、当該ｔｅｒ配列は、前記複製開始配列に隣接していないことが好ましく、環状ＤＮＡが１対のｔｅｒ配列を複製開始配列に対してそれぞれ外向きに有する場合、少なくともその一方は、前記複製開始配列に隣接していないことが好ましい。例えば、少なくとも一方のｔｅｒ配列の３’末端塩基と複製開始配列末端（好ましくは、複製開始配列におけるＤＵＥから遠い側の末端）の距離は５塩基以上、例えば１０塩基以上離れていることが好ましい。このような構成を有する環状ＤＮＡは、後述のＲＣＲ法により増幅した場合に効率よく増幅することができ、より特定すれば、より高い収量での増幅、より少ない酵素量での増幅及びより高い増幅速度での増幅のいずれか一以上に有用である。
　一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、さらに、前記複製開始配列に対して内向きに挿入された１つ又は１対のｔｅｒ配列を有していてもよい。ｔｅｒ配列について「複製開始配列に対して内向きに挿入」するとは、ｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質の組合せの作用により、ｏｒｉＣのような複製開始配列より外側に向かう方向の複製に対しては複製を許容せずに停止させる一方、複製開始配列に向かって入ってくる方向の複製に対しては複製を許容する方向で、ｔｅｒ配列を挿入することを意味する。この場合、ｔｅｒ配列が、前記複製開始配列に隣接又は近接していないことが好ましい。一態様において、前記複製開始配列に対して内向きに挿入された１つ又は１対のｔｅｒ配列は、前記複製開始配列から５０塩基以上、７５塩基以上、１００塩基以上、１５０塩基以上、又は２００塩基以上離れていることが好ましい。
（ａ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、（ｉ）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ｉｉ）ジャイレース結合配列を含む。
（ｂ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列としてｏｒｉＣの改変配列であって、ＤｎａＡボックスのうち、Ｃ３、Ｃ２、Ｉ３、Ｃ１及びＲ４から選択される１～５個が欠失した配列及びジャイレース結合配列を含む。
（ｃ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）又は（ｂ）の環状ＤＮＡであって、さらに、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列が、下記（Ｆ１）～（Ｆ５）のいずれか１以上の特徴を有する；（Ｆ１）野生型と比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥを有する、（Ｆ２）ＤＵＥが、Ｍエレメントにおける反復的なＡＴ配列を有する、（Ｆ３）ＤＵＥが、Ｒエレメントにおける４つ以上の連続したＫＡＫモチーフ配列を有する、（Ｆ４）ＤＯＲ領域のＲ５Ｍ配列が、ＤｎａＡのコンセンサス配列（ＴＧＴＧＮＡＷＡＡ）と同一の配列を有する、（Ｆ５）野生型と比較して、ＤＵＥ領域の、ＴＴ［Ａ／Ｇ］Ｔ（Ｔ）配列モチーフ（例えばＴＴＡＴＴ）の数が増加している。
（ｄ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含み、かつ、当該複製開始配列が、下記（Ｆ１）～（Ｆ５）のいずれか１以上の特徴を有する；（Ｆ１）野生型と比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥを有する、（Ｆ２）ＤＵＥが、Ｍエレメントにおける反復的なＡＴ配列を有する、（Ｆ３）ＤＵＥが、Ｒエレメントにおける４つ以上の連続したＫＡＫモチーフ配列を有する、（Ｆ４）ＤＯＲ領域のＲ５Ｍ配列が、ＤｎａＡのコンセンサス配列（ＴＧＴＧＮＡＷＡＡ）と同一の配列を有する、（Ｆ５）野生型と比較して、ＤＵＥ領域の、ＴＴ［Ａ／Ｇ］Ｔ（Ｔ）配列モチーフ（例えばＴＴＡＴＴ）の数が増加している。
（ｅ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）から（ｄ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、複製開始配列に対して外向きに挿入された１つ又は１対のｔｅｒ配列をさらに含む。
（ｆ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ｄ）の環状ＤＮＡであって、前記ｔｅｒ配列が前記複製開始配列に隣接していない。
（ｇ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）又は（ｂ）の環状ＤＮＡであって、複製開始配列と前記ジャイレース結合配列が隣接し、これらの配列に対して外向きに挿入された１つ又は１対のｔｅｒ配列をさらに含む。
（ｈ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）又は（ｂ）の環状ＤＮＡであって、複製開始配列に対して外向きに挿入された１つ又は１対のｔｅｒ配列をさらに含み、ジャイレース結合配列と複製開始配列の距離が、ｔｅｒ配列と複製開始配列との距離よりも遠い。
（ｉ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ｅ）から（ｈ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、前記ｔｅｒ配列が変異ｔｅｒ配列である。
（ｊ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ｅ）から（ｈ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、前記ｔｅｒ配列が配列番号５、４３又は４４の配列を含む。
（ｋ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）から（ｊ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、複製開始始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない。
（ｌ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）から（ｊ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、ＤｎａＡボックスクラスターを含まない。
ＤｎａＡボックスクラスターを含まない。
（ｍ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）から（ｊ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、前記複製開始配列と異なる位置に、６０塩基以内（例えば、５０塩基以内）の領域であって、ＤｎａＡＢコンセンサス配列１又はその類似配列、ＤｎａＡＢコンセンサス配列２又はその類似配列、及びＤｎａＡＢコンセンサス配列２又はその類似配列を、この順で含む領域を有さない。
（ｎ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）から（ｊ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、複製開始始配列とは異なる位置に、４０塩基以内（例えば、３０塩基以内）の領域であって、ＤｎａＡＢコンセンサス配列１又はその類似配列、及びＤｎａＡＢコンセンサス配列２又はその類似配列を、この順で含む領域を有さない。
（ｏ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）から（ｊ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、６０塩基以内（例えば、５０塩基以内）の領域であって、ＤｎａＡＢコンセンサス配列１又はその類似配列、ＤｎａＡＢコンセンサス配列２又はその類似配列、及びＤｎａＡＢコンセンサス配列２又はその類似配列を、この順で含む領域を有さない。
（ｐ）一態様において、本実施形態の方法で製造される環状ＤＮＡは、上記（ａ）から（ｊ）のいずれかの環状ＤＮＡであって、４０塩基以内（例えば、３０塩基以内）の領域であって、ＤｎａＡＢコンセンサス配列１又はその類似配列、及びＤｎａＡＢコンセンサス配列２又はその類似配列を、この順で含む領域を有さない。
　上記のとおり用意した環状ＤＮＡをＲＣＲ法により、増幅させる。より詳細には、環状ＤＮＡと、以下：
　環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
　カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；及び
　２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；
を含む反応液との反応混合物を形成し、当該反応混合物を、８０℃以下の範囲の温度でインキュベートして前記環状ＤＮＡを増幅させる。
　環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群としては、例えば、Kaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90に記載された酵素群を用いることができる。具体的には、第一の酵素群として、以下：ＤｎａＡ活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、ＤＮＡジャイレース活性を有する酵素又は酵素群、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質(single-strand binding protein（ＳＳＢ））、ＤｎａＢ型ヘリカーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素、ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡクランプ活性を有する酵素、及びＤＮＡポリメラーゼIII*活性を有する酵素又は酵素群、からなる群より選択される酵素又は酵素群の１つ以上、又は当該酵素又は酵素群の全ての組み合わせ、を例示することができ、一態様において、第一の酵素群は、ＤｎａＡ活性を有する酵素、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、ＤｎａＢ型ヘリカーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素、ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡクランプ活性を有する酵素、及びＤＮＡポリメラーゼIII*活性を有する酵素又は酵素群を含む。
　ＤｎａＡ活性を有する酵素としては、大腸菌のイニシエータータンパク質であるＤｎａＡと同様のイニシエーター活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば大腸菌由来のＤｎａＡを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＡは単量体として、反応液中、１．０ｎＭ～１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１．０ｎＭ～５．０μＭ、１．０ｎＭ～３μＭ、１ｎＭ～１．５μＭ、１．０ｎＭ～１．０μＭ、１．０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～２００ｎＭ、５０ｎＭ～１５０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　核様体タンパク質は、核様体に含まれるタンパク質をいう。本発明に用いる１種以上の核様体タンパク質は、大腸菌の核様体タンパク質と同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＩＨＦ、すなわちＩｈｆＡ及び／又はＩｈｆＢの複合体（ヘテロ二量体又はホモ二量体）や、大腸菌由来のＨＵ、すなわちｈｕｐＡ及びｈｕｐＢの複合体を好適に用いることができる。大腸菌由来のＩＨＦは、ヘテロ／ホモ２量体として、反応液中、５ｎＭ～４００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは５ｎＭ～２００ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～５０ｎＭ、１０ｎＭ～５０ｎＭ、１０ｎＭ～４０ｎＭ、１０ｎＭ～３０ｎＭ、の範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。大腸菌由来のＨＵは、反応液中、１ｎＭ～５０ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは５ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～２５ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＤＮＡジャイレース活性を有する酵素又は酵素群としては、大腸菌のＤＮＡジャイレースと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＧｙｒＡ及びＧｙｒＢからなる複合体を好適に用いることができる。大腸菌由来のＧｙｒＡ及びＧｙｒＢからなる複合体は、ヘテロ４量体として、反応液中、２０ｎＭ～５００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０ｎＭ～４００ｎＭ、２０ｎＭ～３００ｎＭ、２０ｎＭ～２００ｎＭ、５０ｎＭ～２００ｎＭ、１００ｎＭ～２００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）としては、大腸菌の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＳＳＢを好適に用いることができる。大腸菌由来のＳＳＢは、ホモ４量体として、反応液中、２０ｎＭ～１０００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０ｎＭ～５００ｎＭ、２０ｎＭ～３００ｎＭ、２０ｎＭ～２００ｎＭ、５０ｎＭ～５００ｎＭ、５０ｎＭ～４００ｎＭ、５０ｎＭ～３００ｎＭ、５０ｎＭ～２００ｎＭ、５０ｎＭ～１５０ｎＭ、１００ｎＭ～５００ｎＭ、１００ｎＭ～４００ｎＭ、の範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＤｎａＢ型ヘリカーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤｎａＢと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＤｎａＢを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＢは、ホモ６量体として、反応液中、５ｎＭ～２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは５ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～３０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素としては、大腸菌のＤｎａＣと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＤｎａＣを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＣは、ホモ６量体として、反応液中、５ｎＭ～２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは５ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～３０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤｎａＧと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＤｎａＧを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＧは、単量体として、反応液中、２０ｎＭ～１０００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０ｎＭ～８００ｎＭ、５０ｎＭ～８００ｎＭ、１００ｎＭ～８００ｎＭ、２００ｎＭ～８００ｎＭ、２５０ｎＭ～８００ｎＭ、２５０ｎＭ～５００ｎＭ、３００ｎＭ～５００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＤＮＡクランプ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤｎａＮと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＤｎａＮを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤｎａＮは、ホモ２量体として、反応液中、１０ｎＭ～１０００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１０ｎＭ～８００ｎＭ、１０ｎＭ～５００ｎＭ、２０ｎＭ～５００ｎＭ、２０ｎＭ～２００ｎＭ、３０ｎＭ～２００ｎＭ、３０ｎＭ～１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＤＮＡポリメラーゼIII*活性を有する酵素又は酵素群としては、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼIII*複合体と同様の活性を有する酵素又は酵素群であれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、ＨｏｌＣ、ＨｏｌＤ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、及びＨｏｌＥのいずれかを含む酵素群、好ましくは大腸菌由来のＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、及びＤｎａＥの複合体を含む酵素群、さらに好ましくは大腸菌由来のＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、ＨｏｌＣ、ＨｏｌＤ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、及びＨｏｌＥの複合体を含む酵素群を好適に用いることができる。大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼIII*複合体は、ヘテロ多量体として、反応液中、２ｎＭ～５０ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２ｎＭ～４０ｎＭ、２ｎＭ～３０ｎＭ、２ｎＭ～２０ｎＭ、５ｎＭ～４０ｎＭ、５ｎＭ～３０ｎＭ、５ｎＭ～２０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　本発明において、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡとは、ＤＮＡ複製反応によって合成された２つの環状ＤＮＡがつながった状態にあるものをいう。
　岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ活性を有する酵素、ＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素、及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、からなる群より選択される１つ以上の酵素又は当該酵素の組み合わせを例示することができる。一態様において、第二の酵素群は、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼＩ活性を有する酵素及びＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素を含む。
　ＤＮＡポリメラーゼＩ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩは、単量体として、反応液中、１０ｎＭ～２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０ｎＭ～２００ｎＭ、２０ｎＭ～１５０ｎＭ、２０ｎＭ～１００ｎＭ、４０ｎＭ～１５０ｎＭ、４０ｎＭ～１００ｎＭ、４０ｎＭ～８０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のＤＮＡリガーゼと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＤＮＡリガーゼ又はＴ４ファージのＤＮＡリガーゼを好適に用いることができる。大腸菌由来のＤＮＡリガーゼは、単量体として、反応液中、１０ｎＭ～２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１５ｎＭ～２００ｎＭ、２０ｎＭ～２００ｎＭ、２０ｎＭ～１５０ｎＭ、２０ｎＭ～１００ｎＭ、２０ｎＭ～８０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素としては、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を分解する活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨを好適に用いることができる。大腸菌由来のＲＮａｓｅＨは、単量体として、反応液中、０．２ｎＭ～２００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは０．２ｎＭ～２００ｎＭ、０．２ｎＭ～１００ｎＭ、０．２ｎＭ～５０ｎＭ、１ｎＭ～２００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～５０ｎＭ、１０ｎＭ～５０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群としては、例えば、Peng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575に記載された酵素群を用いることができる。具体的には、第三の酵素群として、トポイソメラーゼＩＶ活性を有する酵素、トポイソメラーゼＩＩＩ活性を有する酵素、及びＲｅｃＱ型ヘリカーゼ活性を有する酵素、から成る群より選択される１つ以上の酵素又は当該酵素の組み合わせを例示することができる。一態様において、好ましくは、トポイソメラーゼＩＶ活性を有する酵素及び／又はトポイソメラーゼＩＩＩ活性を有する酵素を含む。
　トポイソメラーゼＩＩＩ活性を有する酵素としては、大腸菌のトポイソメラーゼＩＩＩと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のトポイソメラーゼＩＩＩを好適に用いることができる。大腸菌由来のトポイソメラーゼＩＩＩは、単量体として、反応液中、２０ｎＭ～５００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０ｎＭ～４００ｎＭ、２０ｎＭ～３００ｎＭ、２０ｎＭ～２００ｎＭ、２０ｎＭ～１００ｎＭ、３０～８０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　ＲｅｃＱ型ヘリカーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のＲｅｃＱと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、大腸菌由来のＲｅｃＱを好適に用いることができる。大腸菌由来のＲｅｃＱは、単量体として、反応液中、２０ｎＭ～５００ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは２０ｎＭ～４００ｎＭ、２０ｎＭ～３００ｎＭ、２０ｎＭ～２００ｎＭ、２０ｎＭ～１００ｎＭ、３０～８０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　トポイソメラーゼＩＶ活性を有する酵素としては、大腸菌のトポイソメラーゼＩＶと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はない。例えば、ＰａｒＣとＰａｒＥの複合体である大腸菌由来のトポイソメラーゼＩＶを好適に用いることができる。大腸菌由来のトポイソメラーゼＩＶは、ヘテロ４量体として、反応液中、０．１ｎＭ～５０ｎＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは０．１ｎＭ～４０ｎＭ、０．１ｎＭ～３０ｎＭ、０．１ｎＭ～２０ｎＭ、１ｎＭ～４０ｎＭ、１ｎＭ～３０ｎＭ、１ｎＭ～２０ｎＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ、１ｎＭ～５ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
　反応液は、更なる酵素を含んでもよい。例えば、ＲＣＲ法で増幅する環状ＤＮＡが、上述のｔｅｒ配列を有する場合、反応液は更に、ｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質（例えば、大腸菌由来のＴｕｓタンパク質等）を含んでもよい。
　反応液はさらに、直鎖状ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを含んでいてもよい。直鎖状ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼが反応液中に存在することで、増幅反応中に二重鎖切断などによって生じる直鎖状ＤＮＡの量を低減し、目的の環状ＤＮＡの収率を向上させる効果がある。
　直鎖状ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼは、直鎖状ＤＮＡの５’末端もしくは３’末端から逐次的に加水分解する酵素である。直鎖状ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼは、直鎖状ＤＮＡの５’末端もしくは３’末端から逐次的に加水分解する活性を有するものであれば、その種類や生物学的由来に特に制限はない。例えば、ＲｅｃＢＣＤ（エキソヌクレアーゼＶ）、λエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVIII、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、及びPlasmid-Safe（登録商標）ATP-Dependent DNase (epicentre)などを用いることができる。直鎖状ＤＮＡエキソヌクレアーゼは反応液中、０．００１～１．０Ｕ／μＬ、好ましくは０．００５Ｕ～１．０Ｕ／μＬ、０．０１～１．０Ｕ／μＬ、０．０５～１．０Ｕ／μＬ、又は０．１～１．０Ｕ／μＬの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。直鎖状ＤＮＡエキソヌクレアーゼについての酵素活性単位（Ｕ）は、３７℃、３０分の反応において、直鎖状ＤＮＡの１ｎｍｏｌのデオキシリボヌクレオチドを酸可溶性とするのに必要な酵素量を１Ｕとした単位である。
　反応液はさらに、一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを含んでいてもよい。一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼが反応液中に存在することで、増幅反応中に生じる低分子の副次的な増幅産物の量を低減し、目的の環状ＤＮＡの収率を向上させる効果がある。
　一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡの５’末端もしくは３’末端のヌクレオチドを逐次的に加水分解する酵素である。一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡの５’末端又は３’末端のヌクレオチドを逐次的に加水分解する活性を有するものであれば、その種類や生物学的由来に特に制限はない。例えばエキソヌクレアーゼＩ（ｅｘｏ I）、ＲｅｃＪ、エキソヌクレアーゼＴ、などを用いることができる。好ましい一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼはｅｘｏ Iである。一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼは反応液中、０．１～１．０Ｕ／μＬの範囲、好ましくは０．１５～１．０Ｕ／μＬ、０．２～１．０Ｕ／μＬ、又は０．２～０．５Ｕ／μＬの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。ｅｘｏ Iについての酵素活性単位（Ｕ）は、３７℃、３０分の反応において、一本鎖ＤＮＡの１０ｎｍｏｌのデオキシリボヌクレオチドを酸可溶性とするのに必要な酵素量を１Ｕとした単位である。ＲｅｃＪについての酵素活性単位（Ｕ）は、３７℃、３０分の反応において、一本鎖ＤＮＡの０．０５ｎｍｏｌのデオキシリボヌクレオチドを酸可溶性とするのに必要な酵素量を１Ｕとした単位である。
　上記の第一、第二及び第三の酵素群を含む反応液に含まれる酵素は、市販されているものを用いてもよく、微生物等から抽出し、必要に応じて精製したものを用いてもよい。微生物からの酵素の抽出及び精製は、当業者に利用可能な手法を用いて適宜実施することができる。
　上記第一、第二及び第三の酵素群として、上記に示す大腸菌由来の酵素以外を用いる場合は、上記大腸菌由来の酵素について特定された濃度範囲に対して、酵素活性単位として相当する濃度範囲で用いることができる。
　反応液は、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ｄＮＴＰ、マグネシウムイオン源、及びアルカリ金属イオン源を含むものであってよい。
　反応液に含まれる緩衝液は、ｐＨ７～９、好ましくはｐＨ８、において用いるのに適した緩衝液であれば特に制限はない。例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ－ＯＡｃ、Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ、リン酸緩衝液、ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ、Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＨＣｌなどが挙げられる。好ましい緩衝液はＴｒｉｓ－ＨＣｌ又はＴｒｉｓ－ＯＡｃである。緩衝液の濃度は、当業者が適宜選択することができ、特に限定されないが、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ又はＴｒｉｓ－ＯＡｃの場合、例えば１０ｍＭ～１００ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、２０ｍＭの濃度を選択できる。
　ＡＴＰは、アデノシン三リン酸を意味する。反応開始時に反応液中に含まれるＡＴＰの濃度は、例えば０．１ｍＭ～３ｍＭの範囲であってよく、好ましくは０．１ｍＭ～２ｍＭ、０．１ｍＭ～１．５ｍＭ、０．５ｍＭ～１．５ｍＭの範囲であってよい。
　ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰは、それぞれグアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、及びウリジン三リン酸を意味する。反応開始時に反応液中に含まれるＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの濃度は、それぞれ独立して、例えば０．１ｍＭ～３．０ｍＭの範囲であってよく、好ましくは０．５ｍＭ～３．０ｍＭ、０．５ｍＭ～２．０ｍＭの範囲であってよい。
　ｄＮＴＰは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン
酸（ｄＴＴＰ）の総称である。反応開始時に反応液中に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば０．０１～１ｍＭの範囲であってよく、好ましくは０．０５ｍＭ～１ｍＭ、０．１ｍＭ～１ｍＭの範囲であってよい。
　マグネシウムイオン源は、反応液中にマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を与える物質である。例えば、Ｍｇ（ＯＡｃ）２、ＭｇＣｌ２、及びＭｇＳＯ４、などが挙げられる。好ましいマグネシウムイオン源はＭｇ（ＯＡｃ）２である。反応開始時に反応液中に含まれるマグネシウムイオン源の濃度は、例えば、反応液中にマグネシウムイオンを５～５０ｍＭの範囲で与える濃度であってよい。
　アルカリ金属イオン源は、反応液中にアルカリ金属イオンを与える物質である。アルカリ金属イオンとしては、例えばナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）が挙げられる。アルカリ金属イオン源の例として、グルタミン酸カリウム、アスパラギン酸カリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び酢酸ナトリウム、が挙げられる。好ましいアルカリ金属イオン源はグルタミン酸カリウム又は酢酸カリウムである。反応開始時に反応液中に含まれるアルカリ金属イオン源の濃度は、反応液中にアルカリ金属イオンを１００ｍＭ以上、好ましくは１００ｍＭ～３００ｍＭの範囲で与える濃度であってよいが、これに限定されない。
　反応液はさらに、タンパク質の非特異吸着抑制剤（ウシ血清アルブミン、リゾチーム、ゼラチン、ヘパリン、カゼイン等）、核酸の非特異吸着抑制剤（ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソーマルＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、グリコーゲン、ヘパリン、オリゴＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ－Ｃ）（ポリイノシン－ポリシチジン）、ｐｏｌｙ（ｄＩ－ｄＣ）（ポリデオキシイノシン－ポリデオキシシチジン）、ｐｏｌｙ（Ａ）（ポリアデニン）、及びｐｏｌｙ（ｄＡ）（ポリデオキシアデニン）等）、直鎖状ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ（ＲｅｃＢＣＤ、λエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ（登録商標）ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮａｓｅ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）等）、ＲｅｃＧ型ヘリカーゼ（大腸菌由来のＲｅｃＧ等）、アンモニウム塩（硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等）、還元剤（ＤＴＴ、β－メルカプトエタノール、グルタチオン等）を含むことができ、反応液が大腸菌由来のＤＮＡリガーゼを含む場合、その補因子であるＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を含んでもよい。
　上記酵素と、無細胞タンパク質発現系を含む反応液とを、そのまま鋳型となる環状ＤＮＡと混合して、環状ＤＮＡの増幅のための反応混合液を形成してもよい。無細胞タンパク質発現系は、上記酵素をコードする遺伝子の塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡを含む総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写産物等を鋳型ＲＮＡとする無細胞翻訳系であってもよく、各酵素をコードする遺伝子又は各酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター等を鋳型ＤＮＡとする無細胞転写翻訳系であってもよい。
　上記の反応液を環状ＤＮＡと混合して反応混合物を形成し、当該反応混合物を、８０℃以下の範囲の温度でインキュベートし、これにより、増幅した前記環状ＤＮＡを含む反応物を得る。増幅は、等温増幅でも、非等温増幅でもよい。
　等温増幅する場合、等温条件としては、ＤＮＡ増幅反応又はＤＮＡ複製反応が進行することのできるものであれば特に制限はない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの至適温度に含まれる一定の温度とすることができる。等温条件としては、例えば、１５℃以上、１６℃以上、１８℃以上、２０℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上又は３０℃以上の一定の温度、及び８０℃以下、７５℃以下、７０℃以下、６５℃以下、６０℃以下、５０℃以下、４５℃以下、４０℃以下、３５℃以下、又は３３℃以下の一定の温度が挙げられる。また、等温条件は、例えば、１５℃～８０℃、１６℃～８０℃、１８℃～８０℃、２０℃～８０℃又は２５℃～８０℃の範囲に含まれる一定の温度、１５℃～７５℃、１６℃～７５℃、１８℃～７５℃、２０℃～７５℃又は２５℃～７５℃の範囲に含まれる一定の温度、１５℃～７０℃、１６℃～７０℃、１８℃～７０℃、２０℃～７０℃又は２５℃～７０℃の範囲に含まれる一定の温度、１５℃～６５℃、１６℃～６５℃、１８℃～６５℃、２０℃～６５℃又は２５℃～６５℃の範囲に含まれる一定の温度、２５℃～５０℃の範囲に含まれる一定の温度、２５℃～４０℃の範囲に含まれる一定の温度、３０℃～３３℃の範囲に含まれる一定の温度、又は３０℃程度とすることができる。本明細書において等温増幅における「等温」は、反応中に設定した温度に対して±７℃、±５℃、±３℃、又は±１℃の温度範囲内に保つことを意味する。等温増幅の反応時間は、目的とする環状ＤＮＡの増幅産物の量に応じて適宜設定することができ、例えば、１時間～３０時間、好ましくは２時間～２５時間、より好ましくは３時間～２０時間、さらに好ましくは、５時間～１５時間とすることができる。一態様において、本実施形態の環状ＤＮＡは、短い反応時間でも高い増幅濃度が得られる。
　環状ＤＮＡを非等温増幅する場合、８０℃以下、好ましくは６５℃以下の２つの温度でのインキュベーションを繰り返す温度サイクル下でインキュベートする温度条件下で増幅することができる。温度サイクルの第一の温度は、二本鎖ＤＮＡの複製開始が可能な温度であり、第二の温度は、複製開始が抑制され、ＤＮＡの伸張反応が進行する温度である。第一の温度は、３０℃以上、例えば３０℃～８０℃、３０℃～５０℃、３０℃～４０℃、又は３７℃であり得る。第一の温度でのインキュベーションは、特に限定されないが、１サイクルあたり１０秒間～１０分間であってもよく、１分間が好ましい。第二の温度は、２７℃以下、例えば１０℃～２７℃、１６℃～２５℃、又は２４℃であり得る。第二の温度でのインキュベーションは、特に限定されないが、増幅する環状ＤＮＡの長さに合わせて設定することが好ましく、例えば１サイクルにつき、１０００塩基あたり１秒間～１０秒間であってもよい。温度サイクルのサイクル数は特に限定されないが、１０サイクル～５０サイクル、２０サイクル～４５サイクル、２５サイクル～４５サイクル、４０サイクルであってもよい。
　本実施形態の方法は、８０℃以下の範囲の温度でインキュベートし、これにより増幅した前記環状ＤＮＡを含む反応物を得た後に、第一から第三の酵素群を含まない溶液で２倍以上、好ましくは３倍、４倍又は５倍以上に希釈した後、維持（再保温）することをさらに含んでいてもよい。理論に束縛されるものではないが、酵素群の希釈により新たな複製開始が抑えられる一方で、進行途中の複製伸長、カテナン形成、分離反応は残留酵素の効果で継続して進行する。また、反応中にニックなどが入って生じた副生成物も、この過程で残留ライゲースなどの効果によって修復可能である。よって、増幅中間体や副生成物からの最終産物への移行が特異的に導かれ、目的の環状ＤＮＡの収率向上が期待できる。
　希釈後の維持は、第二の酵素群及び第三の酵素群が作用する条件で実施することができ、例えば、１５～５０℃、好ましくは２０℃～４０℃、より好ましくは２５℃～３５℃で、例えば、１０分間～３時間、好ましくは１５分間～２時間、より好ましくは２０分間～１時間、実施することができる。
　第一から第三の酵素群を含まない溶液は、第二の酵素群及び第三の酵素群が作用することができる溶液であれば特にその組成は限定されず、簡便には、第一、第二及び第三の酵素群を含まない以外は前記反応液と同じ組成の溶液を用いることができる。そのような溶液は、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ｄＮＴＰ、マグネシウムイオン源、及びアルカリ金属イオン源を含む。当該溶液は、さらに、上述の、タンパク質の非特異吸着抑制剤、核酸の非特異吸着抑制剤、アンモニウム塩、還元剤及びＮＡＤから選択される一以上を含んでもよい。
　一態様において、環状ＤＮＡにおいて、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列が、野生型と比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥを有する場合、第一から第三の酵素群を含まない溶液で２倍以上に希釈した後、維持（再保温）することをさらに含むことが好ましい。
　本実施形態は、また、環状ＤＮＡであって、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及びジャイレース結合配列を含み、かつ、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない、環状ＤＮＡにも関する。本実施形態は、また、環状ＤＮＡであって、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列、ジャイレース結合配列、及びプラスミド複製起点を含み、かつ、前記プラスミド複製起点がＤｎａＡボックスクラスターを含まない、環状ＤＮＡにも関する。当該環状ＤＮＡは、１つ又は１対のｔｅｒ配列を有してもよい。当該環状ＤＮＡのＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列は、変異ＤＵＥでもよい。各配列については、上記環状ＤＮＡの製造方法における記載を参照することができる。このような環状ＤＮＡは、ＲＣＲ法において、効率よく増幅することができる。
　本実施形態の一態様において、本実施形態の方法の鋳型となる環状ＤＮＡは、簡便には、（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ii）ジャイレース結合配列を含むＤＮＡカセット、（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含み、かつ、野生型と比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥを有するＤＮＡカセット、（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ii）ジャイレース結合配列を含み、かつ、野生型と比較してＡＴ含有率の高い変異ＤＵＥを有するＤＮＡカセット、又は１又は１対のｔｅｒ配列を有するこれらのいずれかのＤＮＡカセットを用意し、ＤｎａＡボックスクラスターを含まないＤＮＡ断片又は環状ＤＮＡと、当該ＤＮＡカセットとを連結して作成することができる。
　ＤｎａＡボックスクラスターを含まないＤＮＡ断片又は環状ＤＮＡは、市販のプラスミド由来であってもよく、例えば、ｐ１５Ａ又はｆｏｒｉをプラスミド複製起点とするプラスミド又はこれを酵素切断した直鎖ＤＮＡであってもよい。
　ＤｎａＡボックスクラスターを含まないＤＮＡ断片又は環状ＤＮＡと、当該ＤＮＡカセットとの連結方法は、特に限定されない。直鎖状ＤＮＡ断片同士の連結反応としては、例えば、Ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ法、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法、ＵＳＥＲ（登録商標）　Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＮＥＢ社製）等の市販のキットを用いた方法、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（国際公開第２０１９／００９３６１号）等が知られており、このような公知の技術を利用することができる。
　直鎖状ＤＮＡと環状ＤＮＡの連結反応としては、例えば、部位特異的組換え機構を利用したＧａｔｅｗａｙクローニングが知られており、試薬キットが市販されている（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製）。また、ＲｅｃＡファミリー組換え酵素と必要に応じてエキソヌクレアーゼとを用いた相同組換え反応を利用した方法（国際公開第２０２３／０２８１４５号）を用いてもよい。
　次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
［調製例１］
　大腸菌染色体由来のｏｒｉＣ配列の一部（２６４塩基）の両端に隣接してｔｅｒ配列を有する以下の配列を、ＯｒｉＣ１．０カセット（配列番号３）として調製した。下線部がｔｅｒ配列（配列番号１）、ｔｅｒ配列に挟まれている部分がｏｒｉＣ配列（配列番号２）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［調製例２］
　大腸菌染色体由来のｏｒｉＣ配列（配列番号４）の５’側に隣接して変異型ｔｅｒ配列（ｔｅｒＧ１６配列、配列番号５）が連結され、前記ｏｒｉＣの３’側近傍にｔｅｒＧ１６配列の相補配列が連結されており、ｔｅｒＧ１６配列のさらに５’側近傍にＴａｃプロモーター配列（配列番号６）が、ｔｅｒＧ１６配列の相補配列のさらに３’側近傍に大腸菌ｆｄｈＦ遺伝子のターミネーター配列（配列番号７）が、それぞれ配置されたＤＮＡ断片を、ＯｒｉＣ２．０カセット（４２６ｂｐ、配列番号８）として調製した。ｔｅｒＧ１６配列は、配列番号３７の塩基配列の一塩基変異配列である。下線部がｔｅｒＧ１６配列、下線部で挟まれた領域のうち、大文字で示した部分がｏｒｉＣ配列（２８６ｂｐ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［調製例３］
　ＯｒｉＣ２．０カセット配列において、ｏｒｉＣの５’側にＳＧＳ（配列番号９）が連結されたＤＮＡ断片を、ＯｒｉＣｓｇカセット（５８２ｂｐ、配列番号１０）として調製した。塩基配列を表５に示す。表中、下線付き大文字で示された領域がＳＧＳ（太字がＳＧＳのコンセンサス配列）、中央付近の大文字で示された領域（下線なし）がｏｒｉＣ配列を表す。また、四角で囲われた領域が、ｔｅｒＧ１６配列及びその相補配列を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［調製例４］
　ＯｒｉＣ２．０カセット配列において、ｏｒｉＣの５’側に大腸菌由来のＳｔｕｆｆｅｒ配列（大腸菌ゲノムのｏｒｉＣの外側に位置する、何ら機能を有さない配列）が連結されたＤＮＡ断片を、ＯｒｉＣｓｇ＿Ｓｔｕｆｆｅｒカセット（５８２ｂｐ、配列番号１１）として調製した。塩基配列を表６に示す。表中、下線付き大文字で示された領域がＳｔｕｆｆｅｒ配列、中央付近の大文字で示された領域（下線なし）がｏｒｉＣ配列を表す。また、四角で囲われた領域が、ｔｅｒＧ１６配列及びその相補配列を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［調製例５］
　ＯｒｉＣ２．０カセット配列において、ｏｒｉＣのＤＵＥを構成するＬ，Ｍ及びＲエレメントのうち、Ｍ及びＲエレメントが、野生型と比較してＡＴ含有率が高い変異ＤＵＥであるＤＮＡ断片を、ＯｒｉＣ５．６ＡＴカセット（４２７ｂｐ、配列番号１２）として調製した。塩基配列を表７に示す。表中、太字で示した部分が、ＤＵＥ部分であり、太字のうち四角で囲った部分が変異ＤＵＥにおける変異部分である。下線部分は、ＤＵＥのＭエレメント（５’末端側下線部）及びＲエレメント（３’末端側下線部。１塩基欠失変異を有する）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［調製例６］
　以下の４種のプラスミドを用意した。
・Ｅ１－ｐ１５Ａプラスミド：ｐＡＣＹＣプラスミド（ニッポン・ジーン社）に、マーカー遺伝子を含むＥ１配列（５７９ｂｐ）を、後述のＵＳＥＲ法により連結してＲＣＲ増幅反応により増幅し、全長３．５ｋｂｐのプラスミドを作成した。
・Ｈ２－ｐ１５Ａプラスミド：ｐＡＣＹＣプラスミド（ニッポン・ジーン社）に、Ｈ２配列（公知ウイルスの一部をコードする配列。３．８ｋｂｐ）を、後述のＵＳＥＲ法により連結してＲＣＲ増幅反応により増幅し、全長６．８ｋｂｐのプラスミドを作成した。
・ｐＵＣプラスミド：プラスミドｐＵＣ４Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ０６４０４、全長３．９ｋｂｐ）に、Ｅ１配列（５７９ｂｐ）を、後述のＵＳＥＲ法により連結してＲＣＲ増幅反応により増幅し、全長３．５ｋｂｐのプラスミドを作成した。
・ｐＢｅｌｏＢＡＣプラスミド：ＮＥＢ社製。（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ５１１１３、全長７．５ｋｂ）
［実施例１］ｐ１５ＡプラスミドとＯｒｉＣカセットの連結及び増幅
　調製例１～５の各ＯｒｉＣカセット断片と、調製例６の２種のｐ１５Ａプラスミドの一部断片を、それぞれｄＵＴＰを含む表８に記載のプライマーを用いてＰＣＲによって調製した。なお、表８中、ｕはデオキシウリジン（ｄＵ）を表す。調製した各ＤＮＡ断片を混合し、５μＬの反応液（１ｘｒＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社製）、７．５質量％のＰＥＧ８０００、１０ｍＵ／μＬ　Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ　ＵＳＥＲ　ＩＩ　Ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ社製。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを含み、ｄＵＴＰ部分の１塩基ギャップ化を引き起こす酵素である。）に加え、３７℃で１５分間、６０℃で５分間処理することにより連結した（ＵＳＥＲ法）。その後、連結したＤＮＡを鋳型にＲＣＲ増幅反応を行い、目的の環状ＤＮＡを増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ＲＣＲ増幅反応は、以下のとおり実施した。鋳型を含む溶液０．５μＬを、表９に示す組成の反応用混合物４．５μＬ（適宜希釈）に混合してＲＣＲ増幅反応溶液（５μＬ）を調製し、当該ＲＣＲ増幅反応溶液を３３℃で１０時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行い、その後４℃に冷却した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９中、ＳＳＢは大腸菌由来ＳＳＢ、ＩＨＦは大腸菌由来ＩｈｆＡ及びＩｈｆＢの複合体、ＤｎａＧは大腸菌由来ＤｎａＧ、ＤｎａＮは大腸菌由来ＤｎａＮ、Ｐｏｌ III*は大腸菌由来ＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、ＨｏｌＣ、ＨｏｌＤ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、及びＨｏｌＥからなる複合体であるＤＮＡポリメラーゼIII*複合体、ＤｎａＢは大腸菌由来ＤｎａＢ、ＤｎａＣは大腸菌由来ＤｎａＣ、ＤｎａＡは大腸菌由来ＤｎａＡ、ＲＮａｓｅＨは大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ、Ｌｉｇａｓｅは大腸菌由来ＤＮＡリガーゼ、Ｐｏｌ Iは大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｙｒＡは大腸菌由来ＧｙｒＡ、ＧｙｒＢは大腸菌由来ＧｙｒＢ、Ｔｏｐｏ IVは大腸菌由来ＰａｒＣ及びＰａｒＥの複合体、Ｔｏｐｏ IIIは大腸菌由来トポイソメラーゼIII、ＲｅｃＱは大腸菌由来ＲｅｃＱを表す。
　ＳＳＢは、ＳＳＢの大腸菌発現株から、硫安沈殿及びイオン交換カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　ＩＨＦは、ＩｈｆＡ及びＩｈｆＢの大腸菌共発現株から、硫安沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　ＤｎａＧは、ＤｎａＧの大腸菌発現株から、硫安沈殿、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　ＤｎａＮは、ＤｎａＮの大腸菌発現株から、硫安沈殿及び陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　Ｐｏｌ III*は、ＤｎａＸ、ＨｏｌＡ、ＨｏｌＢ、ＨｏｌＣ、ＨｏｌＤ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ及びＨｏｌＥの大腸菌共発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　ＤｎａＢ及びＤｎａＣは、ＤｎａＢ及びＤｎａＣの大腸菌共発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　ＤｎａＡは、ＤｎａＡの大腸菌発現株から、硫安沈殿、透析沈殿、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　ＧｙｒＡ及びＧｙｒＢは、ＧｙｒＡの大腸菌発現株とＧｙｒＢの大腸菌発現株の混合物から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　Ｔｏｐｏ IVは、ＰａｒＣの大腸菌発現株とＰａｒＥの大腸菌発現株の混合物から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　Ｔｏｐｏ IIIは、Ｔｏｐｏ IIIの大腸菌発現株から、硫安沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　ＲｅｃＱは、ＲｅｃＱの大腸菌発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
　ＲＮａｓｅＨ、Ｌｉｇａｓｅ、Ｐｏｌ Iは、市販の大腸菌由来の酵素を用いた（タカラバイオ社製）。
　Ｔｕｓは、Ｔｕｓの大腸菌発現株から、アフィニティーカラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
［実施例２］ｐＵＣプラスミドとＯｒｉＣカセットの連結・増幅
　調製例１～３の各ＯｒｉＣカセット断片と、調製例６のｐＵＣプラスミドの一部断片を、それぞれｄＵＴＰを含むプライマーを用いてＰＣＲによって調製した。プライマーは実施例１に示したもの及び表１０に記載のものを用いた。調製した各ＤＮＡ断片を混合し、実施例１と同様の手法により連結した。実施例１と同様の手法により、連結したＤＮＡを鋳型にＲＣＲ増幅反応を行い、目的の環状ＤＮＡを増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実施例３］ｐＢｅｌｏＢＡＣプラスミドとＯｒｉＣカセットの連結・増幅
　調製例１～３及び５の各ＯｒｉＣカセット断片と、調製例６のｐＢｅｌｏＢＡＣプラスミドの一部断片を、それぞれ表１１に記載のプライマーを用いてＰＣＲによって調製した。相同組換え反応として、２００ｐＭのプラスミドと２００ｐＭのオーバーラップ配列を付加した各ＯｒｉＣカセット断片を、５μＬの反応液（１μＭのＲｅｃＡ、８０ｍＵ／μＬのエキソヌクレアーゼIII、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのＡＴＰ、４ｍＭのクレアチンリン酸、２０ｎｇ／μＬのクレアチンキナーゼ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１５０ｍＭのＴＭＡＣ、５質量％のＰＥＧ８０００、及び１０容量％のＤＭＳＯ）に加え、４２℃で３０分間、６５℃で２分間インキュベートして、プラスミドと各ＯｒｉＣカセットを連結した。実施例１と同様の手法により、連結したＤＮＡを鋳型にＲＣＲ増幅反応を行い、目的の環状ＤＮＡを増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［実施例４］ＯｒｉＣカセットが組み込まれた環状ＤＮＡの大腸菌クローニング
［実施例４－１］
　実施例１及び２で得た環状ＤＮＡを、大腸菌ＮＥＢ　ｓｔａｂｌｅ株（ＮＥＢ社製）にケミカル法で導入した。その後、その一部を３３μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にて、３０℃で２４時間培養した。寒天平板培地から大腸菌コロニーを複数個選択し、各形質転換大腸菌を、３３μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む液体培地５ｍＬにて、３０℃で２４時間、振盪培養を行った。液体培地としては、ＬＢ液体培地を用いた。プラスミド抽出は、市販のＤＮＡ抽出キット（製品名「ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ」、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．５）溶液で溶出されたプラスミドＤＮＡ溶液について、一部を制限酵素ＸｂａＩで処理し、フルオロメーター（製品名「Ｑｕａｎｔｕｓ（登録商標） Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ」、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）による濃度測定を行った。
［実施例４－２］
　実施例３で得た環状ＤＮＡを、大腸菌ＤＨ５α株（Ｔａｋａｒａ社製）にケミカル法で導入した。その後、その一部を２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にて、３７℃で１６時間培養した。寒天平板培地から大腸菌コロニーを複数個選択し、各形質転換大腸菌を、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む液体培地５ｍＬにて、３７℃で１６時間、振盪培養を行った。液体培地としては、ＬＢ液体培地を用いた。プラスミド抽出は、市販のＤＮＡ抽出キット（製品名「ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ」、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。５０μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．５）溶液で溶出されたプラスミドＤＮＡ溶液について、一部を制限酵素ＸｂａＩで処理し、フルオロメーター（製品名「Ｑｕａｎｔｕｓ（登録商標）　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ」、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）による濃度測定を行った。
［実施例５］
　実施例４で得た、２種のｐ１５Ａプラスミドに３種のＯｒｉＣカセット（ＯｒｉＣ１．０、ＯｒｉＣ２．０、ＯｒｉＣｓｇ）を組み込んだプラスミド（６種）と、ｐＵＣプラスミドに２種のＯｒｉＣカセット（ＯｒｉＣ２．０、ＯｒｉＣｓｇ）を組み込んだプラスミド（２種）の溶液からそれぞれ１μＬ（２００ｐｇ／μＬ）を、表９に示す組成の反応用混合物９９μＬに混合してＲＣＲ増幅反応溶液を調製し、当該ＲＣＲ増幅反応溶液を３３℃で１０時間インキュベートすることによりＲＣＲ増幅反応を行い、その後４℃に冷却した。
　その後、反応液の一部をマーカーとともにアガロースゲル電気泳動し、分離したバンドをｄｓＧｒｅｅｎ染色した。
　また、反応液の一部を制限酵素ＸｂａＩで処理し、Ｑｕａｎｔｕｓ－ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）でＤＮＡ濃度を測定した。
　結果を図１に示す。ｐ１５ＡプラスミドとＯｒｉＣｓｇを組み合わせた場合に、他のＯｒｉＣカセットを用いた場合と比較して、増幅後のＤＮＡ濃度が高かった。ｐＵＣプラスミドとＯｒｉＣｓｇを組み合わせた場合、他のＯｒｉＣカセットと比較した増幅後ＤＮＡ濃度の大幅な増加は見られなかった。
［実施例６］
　実施例５で用いた８種のプラスミドのうち、Ｅ１配列を有する５種のプラスミドを用いて、実施例５と同様の実験を、各サンプルについて３回実施した。図２に示すとおり、実施例５と同様の結果が得られ、ｐ１５ＡプラスミドとＯｒｉＣｓｇを組み合わせた場合に、他のＯｒｉＣカセットを用いた場合と比較して、増幅後のＤＮＡ濃度が高かった。また、実施例５と同様に、ｐＵＣプラスミドとＯｒｉＣｓｇを組み合わせた場合、他のＯｒｉＣカセットと比較した増幅後ＤＮＡ濃度の大幅な増加は見られなかった。３回の実験の平均値を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［実施例７］
　実施例４で得た、ｐＢｅｌｏＢＡＣに３種のＯｒｉＣカセット（ＯｒｉＣ１．０、ＯｒｉＣ２．０、ＯｒｉＣｓｇ）を組み込んだプラスミド３種を用いて、実施例５と同様の実験を、各サンプルについて４回実施した。図３に示すとおり、ｐＢｅｌｏＢＡＣプラスミドを用いた場合にも、ｐ１５Ａプラスミドを用いた場合と同様、ＯｒｉＣｓｇを組み合わせた場合に、他のＯｒｉＣカセットを用いた場合と比較して、増幅後のＤＮＡ濃度が高かった。実験の平均値を表１３に示す（ＯｒｉＣ１．０カセットを用いた実験については、３回の実験結果から平均値を算出した）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［実施例８］
　実施例４で得た、Ｅ１－ｐ１５Ａプラスミドに４種のＯｒｉＣカセット（ＯｒｉＣ１．０、ＯｒｉＣ２．０、ＯｒｉＣｓｇ、ＯｒｉＣ＿Ｓｔｕｆｆｅｒ）を組み込んだプラスミド４種を用いて、実施例５と同様の実験を、各サンプルについて３回実施した。図４に示すとおり、ｐＢｅｌｏＢＡＣプラスミドを用いた場合にも、ｐ１５Ａプラスミドを用いた場合と同様、ＯｒｉＣｓｇを組み合わせた場合に、他のＯｒｉＣカセットと比較して、増幅後のＤＮＡ濃度が高かった。一方、ＯｒｉＣｓｇのうち、ＭｕＳＧＳ配列をＳｔｕｆｆｅｒ配列に変更した場合、増幅後のＤＮＡ濃度は、ＯｒｉＣｓｇと比較して低かった。実験の平均値を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［実施例９］
［実施例９－１］
　実施例４で得た、ｐＢｅｌｏＢＡＣに４種のＯｒｉＣカセット（ＯｒｉＣ１．０、ＯｒｉＣ２．０、ＯｒｉＣｓｇ、ＯｒｉＣ５．６ＡＴ）を組み込んだプラスミド４種を用いて、実施例５と同様の実験を、各サンプルについて３回実施した。図５に示すとおり、ｐＢｅｌｏＢＡＣプラスミドを用いた場合、ＯｒｉＣ５．６ＡＴ ＞ ＯｒｉＣｓｇ ＞ ＯｒｉＣ２．０ ＞ ＯｒｉＣ１．０の順で、増幅後のＤＮＡ濃度が高かった。ＯｒｉＣ５．６ＡＴカセットを用いた場合、他のＯｒｉＣカセットと比べて、増幅後にｏｐｅｎ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ＤＮＡ（ＯＣ）が多かった。
［実施例９－２］
　実施例９－１と同様にして環状ＤＮＡを増幅後、ＲＣＲ増幅反応溶液の一部（１μＬ）を、表９に示すＲＣＲ反応バッファーで５分の１希釈した。希釈物を３０℃で３０分間インキュベートし、氷冷した（Ｆｉｎａｌｉｚａｔｉｏｎ処理）。その後、実施例９－１と同様に各反応液の一部をマーカーとともにアガロースゲル電気泳動し、分離したバンドをｄｓＧｒｅｅｎ染色した。結果を図６に示す。実施例９－１と比較して、ＯｒｉＣ５．６ＡＴカセットを用いた場合のＯＣ量が減少した。
［実施例１０］
　実施例９で用いた４種のプラスミドを用いて、ＲＣＲ増幅反応条件を２４℃、２７℃、３０℃又は３３℃で１０時間とした以外は、実施例５と同様の実験を実施した。結果を図７に示す。図７に示すとおり、ＯｒｉＣカセットとしてＯｒｉＣ１．０を含む環状ＤＮＡは、２７℃以下ではほとんど増幅しなかった。ＯｒｉＣ２．０又はＯｒｉＣｓｇを含む環状ＤＮＡは、２７℃では少量の増幅が見られた。ＯｒｉＣ５．６ＡＴを含む環状ＤＮＡは２４℃でも増幅が見られ、他のＯｒｉＣカセットを用いた場合と比較して、低温での増幅が可能であった。
［実施例１１］
　実施例４で得た、Ｅ１－ｐ１５Ａプラスミドに４種のＯｒｉＣカセット（ＯｒｉＣ１．０、ＯｒｉＣ２．０、ＯｒｉＣｓｇ、ＯｒｉＣ５．６ＡＴ）を組み込んだプラスミド４種を用いて、ＲＣＲ増幅反応条件を３３℃で３時間、６時間、又は１０時間とした以外は、実施例５と同様の実験を実施した。結果を図８に示す。反応時間に対するＤＮＡ濃度の変化を図９のグラフ及び表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　図８及び９に示すとおり、ＤＮＡの増幅量は、ＯｒｉＣカセットとしてＯｒｉＣ５．６ＡＴを用いた場合が最も多く、増幅速度も他のカセットを用いた場合と比較して速かった。一方で、増幅反応の時間が長くなると、ＯＣの増加がみられた。
［実施例１２］
　ｐ１５Ａプラスミド由来の複製開始領域を有する市販のｐＡＣＹＣ１８４＿ＤＮＡプラスミド（ニッポン・ジーン社）の一部断片と、調製例２及び３のＯｒｉＣカセット断片（ＯｒｉＣ２．０及びＯｒｉＣｓｇ）を、表１６に記載のプライマーを用いてＰＣＲによって調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　実施例３と同様の手法により相同組換え反応を用いて連結し、その後、連結したＤＮＡを鋳型にＲＣＲ増幅反応を行い、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドにＯｒｉＣ２．０又はＯｒｉＣｓｇを組み込んだ環状ＤＮＡを増幅した。その後、実施例４－２と同様の手法で、大腸菌クローニングを行った。
　得られた２種のプラスミド（ＯｒｉＣ２．０を有するプラスミド：４６７１ｂｐ、ＯｒｉＣｓｇを有するプラスミド：４８２７ｂｐ）各２００ｐｇと、ＲＣＲ反応用混合物１００μＬとを用いて、実施例５と同様の手法によりＲＣＲ増幅反応、アガロースゲル電気泳動及びＤＮＡ濃度の測定を実施した。ＲＣＲ増幅には、表９に示す組成の反応用混合物を適宜希釈して用いた。反応時に、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｗａｋｏ）を０．０５％添加した。結果を図１０に示す。また、３回の実験の平均値を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　実施例５等とは異なるｐ１５Ａプラスミドを用いた場合でも、ＯｒｉＣｓｇを組み合わせた場合に、ＯｒｉＣ２．０と組み合わせた場合と比較して増幅後のＤＮＡ濃度が高いことが確認された。
［実施例１３］
　実施例１２で用いたｐＡＣＹＣ１８４プラスミドから、大腸菌ｏｒｉの配列を有しない直鎖ＤＮＡを調製した。各ＯｒｉＣカセット断片と、実施例１２のｐＡＣＹＣ１８４プラスミドの一部断片を、それぞれ表１８に記載のプライマーを用いてＰＣＲによって調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　調製した直鎖ＤＮＡと、ＯｒｉＣカセット断片（ＯｒｉＣ２．０及びＯｒｉＣｓｇ）とを、実施例１２と同様の手法により相同組換え反応を用いて連結し、その後、連結したＤＮＡを鋳型にＲＣＲ増幅反応を行い、ｏｒｉを持たないｐＡＣＹＣ１８４プラスミドにＯｒｉＣ２．０又はＯｒｉＣｓｇを組み込んだ環状ＤＮＡを増幅した。
　得られた２種の環状ＤＮＡ（ＯｒｉＣ２．０を有する環状ＤＮＡ：３９０１ｂｐ、ＯｒｉＣｓｇを有する環状ＤＮＡ：４０５７ｂｐ）２００ｐｇと、ＲＣＲ反応用混合物１００μＬとを用いて、実施例５と同様の手法によりＲＣＲ増幅反応、アガロースゲル電気泳動及びＤＮＡ濃度の測定を実施した。ＲＣＲ増幅には、実施例１２と同様の反応用混合物を用いた。結果を図１１に示す。ＯｒｉＣｓｇについては、２ロットについて実験した。また、３回の実験の平均値を表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　大腸菌ｏｒｉを有しないｐ１５Ａプラスミドを用いた場合でも、ＯｒｉＣｓｇを組み合わせた場合に、ＯｒｉＣ２．０と組み合わせた場合と比較して増幅後のＤＮＡ濃度が高いことが確認された。
［実施例１４］
　実施例１４では、以下の手法を用いた。
＜ＲＣＲ法による増幅＞
　既報の方法（非特許文献１、非特許文献２）に基づき、少し変更を加えて、ＲＣＲ法による増幅反応を実施した。１×ＲＣＲバッファーI、１×ＲＣＲバッファーII、１×酵素ミックス、及び３ｎｇ／μＬ λファージＤＮＡを含む５μＬのＲＣＲ反応用混合物を用い、３３℃で１２時間インキュベートした。ＲＣＲ反応物を１×ＲＣＲバッファーで希釈し、３０℃で３０分間インキュベートした。鋳型がＡＴリッチな環状ＤＮＡの場合、増幅を強化するために、既報のＲＣＲ反応用混合物に３００ｎＭ ＨＵ及び１００ｎＭ Ｈ－ＮＳを含有させたＲＣＲ反応用混合物を用いたＡＴ－ＲＣＲを使用した。低温におけるＲＣＲ増幅実験では、１×ＲＣＲバッファーＩ及びII、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．５×酵素ミックスを含む１０μＬの反応用混合物を用いた。ＲＣＲ反応物を１×ＲＣＲバッファーで希釈し、３０℃で３０分間インキュベートした。一部をストップバッファー（非特許文献２）と混合し、アガロースゲル電気泳動により解析した。ＲＡ法（国際公開第２０１９/００９３６１号）により、複数のＤＮＡのアセンブリを実施した。
　アガロースゲル電気泳動は、既報（Nara and Su'etsugu, Biotechniques, 2021, vol.71, p.528-533.）のとおり実施した。
＜ＯｒｉＣ変異体の構築＞
　各変異体及びそれを組み込んだ環状ＤＮＡの構築については、以下に詳述する。ＰＣＲ増幅は、ＫＯＤ Ｏｎｅポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用して行った。得られた断片をゲル抽出し、カラム精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社製）により精製した。得られたｏｒｉＣ変異体断片は、既報の手法（国際公開第２０２３／０３８１４５号、実施例１）により、大腸菌ＲｅｃＡとエキソヌクレアーゼIIIを用いてｐＳＶ－β－ガラクトシダーゼ（ｐＳＶβ; Ｐｒｏｍｅｇａ社製）ベクター（７．２ｋｂ）に組み込み、RCR法により増幅した。得られた増幅物を、カラム精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社製）により生成した。
＜リアルタイムＲＣＲ＞
　最終濃度が１×ＲＣＲバッファーＩ及びＩＩ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、３００ｎＭ ＹＯ－ＰＲＯ－1 ｉｏｄｉｎｅ（Ｅｘ/Ｅｍ＝４９１/５０９ｎｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、及び０．５×ＲＥ酵素混合物を含む１０μＬの反応用混合物を用いて、各反応を実施した。９μＬの前記反応用混合物を、２０℃で１５分間プレインキュベートした後、ＲＣＲ反応の開始を防ぐために氷上に置き換えた。次いで、ｏｒｉＣ ＤＮＡ １μＬを最終濃度1pMで加え、リアルタイムシステム（「Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ｓｙｓｔｅｍ」、Ｔａｋａｒａ社製）を使用して、ＲＣＲ反応を３０℃で開始した。増幅されたＤＮＡは、ＳＹＢＲフィルターを使用して１０分ごとに検出した。ＲＣＲシステムにおける増幅ＤＮＡの倍加時間を、増幅曲線の対数フェーズの傾きから算出した。各ｏｒｉＣ変異体の実験条件を標準化するため、全ての変異体をＧＣ含量５２％のｐＳＶβプラスミドにクローニングした。
＜競合増幅アッセイ＞
　ｏｒｉＣｗｔを含む１３ｋｂのミニ染色体を競合体として使用し、ｏｒｉＣ変異体を含む７ｋｂのミニ染色体と、２００ｐＭ：１００ｐＭの比率で混合した。ＤＮＡ混合物を、上述のＲＣＲ法による増幅に微修正を加えて増幅した。各ＲＣＲ反応は、最終濃度が１×ＲＣＲバッファーＩ及びＩＩ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、並びに０．５×ＲＥ酵素混合物を含む１０μＬの反応用混合物を使用して実施した。ＲＣＲ反応用混合物を、２０℃で１５分間プレインキュベート後、ＲＣＲ反応の開始を防ぐために氷上でＤＮＡ混合物と混合した。ＤＮＡ混合物の添加後、ＲＣＲ法による増幅を３０℃で１２時間実施した。ＲＣＲ反応物を１×ＲＣＲバッファーで希釈し、３０℃で３０分間インキュベートし、Ｓｔｏｐバッファーと混合した。その後、一部をＳｔｏｐバッファーと混合し、アガロースゲル電気泳動で分析した。
［実施例１４－１］ＯｒｉＣ変異体を組み込んだ環状ＤＮＡの構築
＜ＯｒｉＣｗｔを組み込んだ環状ＤＮＡ＞
　表２１に記載されたプライマーペアＰ１/Ｐ２を用いて、表２０に記載の配列を有する野生型ｏｒｉＣｗｔをＰＣＲ増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　得られた増幅物を、国際公開第２０２３／０３８１４５号の実施例１に記載の方法を用いて、ｐＳＶ－β－ガラクトシダーゼベクター（ｐＳＶβ）（６．８ｋｂ、５３％ＧＣ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に導入し、増幅し、ｏｒｉＣｗｔ を有するミニ染色体を得た（ｐＳＶβ－ｏｒｉＣｗｔ）。
＜ｏｒｉＣ２．０ＡＴ、ｏｒｉＣ３．０ＡＴ、ｏｒｉＣ３．４ＡＴ、又はｏｒｉＣ３．６ＡＴを組み込んだ環状ＤＮＡ＞
　表２１に記載のプライマーペアを使用して、ｏｒｉＣ２．０ＡＴ、ｏｒｉＣ３．０ＡＴ、又はｏｒｉＣ３．４ＡＴを有するミニ染色体を構築した。具体的には、それぞれ、表２１に記載のプライマーペアのうち、Ｐ１/Ｐ４とＰ２/Ｐ３、Ｐ１/Ｐ６とＰ２/Ｐ５、及びＰ１/Ｐ８とＰ２/Ｐ７を用いた。その後、これらの２つのプライマーペアを別々に用いて、鋳型であるｐＳＶβ－ｏｒｉＣｗｔ ＤＮＡのｏｒｉＣ領域を２つに分けてＰＣＲ増幅した。その後、得られた２つの断片を、Ｐ１/Ｐ２プライマーを使用してオーバーラップＰＣＲによりアセンブリし、その後、国際公開第２０２３／０３８１４５号の実施例１に記載の方法を用いて、ｐＳＶβベクターに導入した。
　ｏｒｉＣ３．６ＡＴを有するミニ染色体は、以下のプライマーペアを使用して構築した。表２１に示すプライマーペアのうち、Ｐ１／Ｐ１０とＰ２／Ｐ９を用いて、鋳型であるｐＳＶβ－ｏｒｉＣ３．０ＡＴ　ＤＮＡのｏｒｉＣ領域を２つに分けてＰＣＲ増幅した。その後、得られた２つの断片を、Ｐ１／Ｐ２プライマーを使用してオーバーラップＰＣＲによりアセンブリし、その後、国際公開第２０２３／０３８１４５号の実施例１に記載の方法を用いてｐＳＶβベクターに導入した。
＜ｏｒｉＣ４．０ＡＴ、ｏｒｉＣ５．４ＡＴ、又はｏｒｉＣ５．６ＡＴを組み込んだ環状ＤＮＡ＞
　ｏｒｉＣ４．０ＡＴは、次のように構築した。表２１に記載のプライマーペアＰ１/Ｐ１２及びＰ２/Ｐ７を用いて、ｏｒｉＣ３．６ＡＴを鋳型としてＰＣＲ増幅して得られた２つの断片を、Ｐ１/Ｐ２を使用してオーバーラップＰＣＲによりアセンブリし、その後、国際公開第２０２３／０３８１４５号の実施例１に記載の方法を用いてｐＳＶβベクターに導入した。
　ｏｒｉＣ５．４ＡＴ及びｏｒｉＣ５．６ＡＴは、それぞれ、プライマーペアＰ１/Ｐ１２とＰ２/Ｐ１１、及びＰ１/Ｐ１４とＰ２/Ｐ１３を使用して構築した。これらのプライマーペアを、ｏｒｉＣ３．４ＡＴとｏｒｉＣ３．６ＡＴを鋳型としたＰＣＲ増幅に用いた。Ｐ１/Ｐ２を使用したオーバーラップＰＣＲによって生成されたアセンブリ断片を、国際公開第２０２３／０３８１４５号の実施例１に記載の方法を用いてｐＳＶβベクターに導入し、ｏｒｉＣ５．４ＡＴ及びｏｒｉＣ５．６ＡＴを組み込んだ環状ＤＮＡを得た。
＜ｏｒｉＣ６．０ＡＴを組み込んだ環状ＤＮＡ＞
　ｏｒｉＣ６．０ＡＴは、次のように構築した。表２１に記載のプライマーペアＰ１/Ｐ１４、Ｐ１２/Ｐ１３、及びＰ２/Ｐ１１を使用して、ｏｒｉＣ４．０ＡＴを鋳型として得られた断片を、Ｐ１/Ｐ２を使用してオーバーラップＰＣＲによりアセンブリした。得られたアセンブリ産物を、国際公開第２０２３／０３８１４５号の実施例１に記載の方法を用いて、ｐＳＶβベクターに導入した。
　国際公開第２０２３／０３８１４５号の実施例１に記載の方法を用いて作成及び増幅したｏｒｉＣ変異体を含むミニ染色体は、スピンカラム（製品名「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ」、Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して精製した。ｏｒｉＣ変異体の配列は、サンガーシーケンシングによって確認した。
＜ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ｔ、ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ａ、ｏｒｉＣｄｕｅＭ１３Ｔ、又はｏｒｉＣｄｕｅＭ１３Ａを組み込んだ環状ＤＮＡ＞
　ＤＵＥ－Ｍ又はＤＵＥ－Ｒ領域にポリＡ又はＴ配列を含む７ｋｂミニ染色体を構築した。ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ｔ、ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ａ、ｏｒｉＣｄｕｅＭ１３Ｔ、及びｏｒｉＣｄｕｅＭ１３Ａは、それぞれ表２１に記載のプライマーペアＰ１５／Ｐ１６、Ｐ１７／Ｐ１８、Ｐ１９／Ｐ２０、及びＰ２１／Ｐ２２で設計した。これらのプライマーを、その後のｐＳＶβ－ｏｒｉＣｗｔ ＤＮＡを鋳型としたｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ増幅に使用した。
　その後、１００μＬのコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞（細胞名「ＤＨ５α ｈｉｇｈ Ｃｈａｍｐｉｏｎ」、ＳＭＯＢＩＯ社製）を、得られた断片 １μＬで直接形質変換した。得られた形質転換体を、３０℃で５０μｇ/ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢプレート上で選択した。３０℃、１６時間培養したこれらの形質転換細胞から、ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ｔ、ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ａ、ｏｒｉＣｄｕｅＭ１３Ｔ、及びｏｒｉＣｄｕｅＭ１３Ａを含むミニ染色体ＤＮＡを、スピンカラム（製品名「ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット」、Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して精製した。ｏｒｉＣ変異体の配列は、サンガーシーケンシングによって確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
[実施例１４－２］ＤＵＥに変異を有するＯｒｉＣ変異体によるＲＣＲ増幅
　図１２Ａは、ＲＣＲ法による増幅サイクルの模式図である。増幅プロセスは複製開始配列（ｏｒｉＣ）から開始し、双方向の増幅を通じて環状ＤＮＡを指数関数的に増幅し、スーパーコイルＤＮＡが得られる。開始ステップ(initiation)は、ｏｒｉＣで二本鎖ＤＮＡが開裂したときにのみ進行する。
　図１２Ｂは、ｏｒｉＣにおける開始プロセスの模式図である。ｏｒｉＣは、ＡＴリッチな二重鎖開裂領域（ＤＵＥ）と開始タンパク質であるＤｎａＡ集合領域（ＤＯＲ）を含む。ＡＴＰ結合型ＤｎａＡ（ＡＴＰ－ＤｎａＡ）はＤＯＲに結合し、ホモ多量体複合体を形成し、これによりＡＴリッチなＤＵＥが開裂し、ＤｎａＢヘリカーゼの進入が可能となる。濃い矢印（Ｒ１、Ｒ５Ｍ、Ｒ２及びＲ４）は、ＤｎａＡ－ＡＤＰ結合部位を示す。淡い矢印（τ２、ｌ１、ｌ２、Ｃ３、Ｃ２、ｌ３及びＣ１）は、ＤｎａＡ－ＡＴＰ結合部位を示す。
　ＤＵＥに変異を有するＯｒｉＣ変異体の、ＲＣＲ増幅効率への影響を調べた。実施例１４－１で作成したｏｒｉＣ２．０ＡＴ及びｏｒｉＣ３．０ＡＴ配列の模式図を図１３Ａに示す。ＤＵＥ　Ｌ、Ｍ及びＲは、反復１３－ｍｅｒ配列を示す。Ｒ１は、ＤｎａＡ－ｂｏｘ　Ｒ１配列を示す。点線枠は、配列の右側に示したＧＣ含量の計算に使用した領域（１～６０ｂｐ）を示す。図１３Ａ中の配列を表２２に示す。表２２中、野生型における下線は、ＤｎａＡ　ｓｓＤＵＥ結合配列（ＴＴ［Ａ／Ｇ］Ｔ（Ｔ））を示し、四角で囲った文字は、野生型配列と異なる塩基を示し、「－」は塩基欠失を示す。それぞれの塩基番号は、Ｒ１　ＤｎａＡ－ｂｏｘの塩基の直前から７０ｂｐ上流の領域を開始地点として付与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　ＧＣ含量５６％、２１％又は２３％の１０ｋｂ断片を、ｏｒｉＣ２．０ＡＴ（２．０ＡＴ）、ｏｒｉＣ３．０ＡＴ（３．０ＡＴ）、ｏｒｉＣｗｔ（ｗｔ）とアセンブリし、ＲＣＲ法を用いて増幅した。得られたＲＣＲ産物を０．５×ＴＢＥ中の１％ アガロースゲル電気泳動後、ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ　Ｉで染色した。結果を図１３Ｂに示す。図１３Ｂに示すとおり、野生型と比較して、ＯｒｉＣ２．０ＡＴ及びＯｒｉＣ３．０ＡＴカセットを用いた場合、野生型ｏｒｉＣでは増幅することができない、ＧＣ含有率の低い環状ＤＮＡ（すなわち、ＡＴ含有率の高い環状ＤＮＡ）の増幅効率が高まった。ＧＣ含量２３％の１０ｋｂ断片にはｏｒｉＣ２．０ＡＴのＤＵＥに由来する二重鎖が開裂しやすい領域があり、複製の開始に必要なＤＮＡ構造（ネガティブスーパーコイル）が形成されにくいため、ＧＣ含量２１％の１０ｋｂ断片は増幅するが、ＧＣ含量２３％の１０ｋｂ断片は増幅しなかったと推察された。
　ｏｒｉＣｗｔ、ｏｒｉＣ２．０ＡＴ及びｏｒｉＣ３．０ＡＴのリアルタイムＲＣＲを実施した。各ｏｒｉＣを含む７ｋｂの環状ＤＮＡ（ｐＳＶβ、５２％ＧＣ）の増幅を、ＹＯ－ＰＲＯ－Ｉインターカレーターの存在下、３０℃でＤＮＡ濃度１ｐＭから開始した。結果を図１３Ｃに示す。各グラフに付随する数値は、倍加時間及び標準偏差である。図１３Ｃに示すとおり、ｏｒｉＣ２．０ＡＴ及びｏｒｉＣ３．０ＡＴについては、増幅曲線の立ち上がり時間の強化がみられ、ＲＣＲ増幅の初期段階での増幅効率の改善が示唆された。
　図１３Ｃに示す、増幅の対数プロットの傾きから計算された倍化時間によって、増幅率を算出した。リアルタイムＲＣＲ分析から、ｏｒｉＣｗｔ（３１．９分）と比較して、ｏｒｉＣ２．０ＡＴ（２９．５分）及びｏｒｉＣ３．０ＡＴ（２４．７分）の増幅率がそれぞれ１．１倍及び１．３倍増加したことが示された。ＤＵＥのＧＣ含有率が低いにもかかわらず、ｏｒｉＣ２．０ＡＴ（１０％）はｏｒｉＣ３．０ＡＴ（２０％）（ＧＣ含有率が高い）に比べて増幅速度が遅かったことから、ＤＵＥ領域のＧＣ含有率の低下に加えて、配列特異性によって増幅率が強化されると考えられた。
　ｏｒｉＣ２．０ＡＴのＤＵＥには、５’－ＴＡＴＡＴＴＴＡＴ－３’の９塩基リピート配列３つが、５塩基及び９塩基の間隔を空けて観察された（図１３Ａ）。
　ｏｒｉＣ３．０ＡＴのＤＵＥ変異は、ＣからＡへの２つの置換と単一塩基の欠失変異である（図１３Ａ）。これらの変異により、ＧＣ含有率はｏｒｉＣｗｔと比較して５％低下した。また、ＤＵＥ－ＲのＫＡＫ配列の数（ＫＡＫモチーフが連続する数）は３から５に増加した。
　これらのＤＵＥ変異は、また、ＧＣ含有率を低下させ、ＤｎａＡ　ｓｓＤＵＥ結合配列であるＴＴ［Ａ／Ｇ］Ｔ（Ｔ）に類似したＴＡＴ配列モチーフ（例えばＴＴＡＴＴ）の数を増加させた。
[実施例１４－３]ＤＵＥ及びＤＯＲに変異を有するＯｒｉＣ変異体によるＲＣＲ増幅１
　ＤＵＥ及びＤＯＲに変異を有するＯｒｉＣ変異体の、ＲＣＲ増幅効率への影響を調べた。実施例１４－１で作成したｏｒｉＣ３．０ＡＴ及びｏｒｉＣ４．０ＡＴ配列の模式図を図１４Ａに示す。図１４Ａ中、ｏｒｉＣ３．０ＡＴと比較してｏｒｉＣ４．０ＡＴが有する変異を、ＳＮＰｓのライン上に示す。配列中の「－」は塩基の欠失を示し、小文字はＤＯＲ領域においてＤｎａＡコンセンサス配列と一致しない配列を示す。それぞれの塩基番号は、図１３と同様、Ｒ１　ＤｎａＡ－ｂｏｘの塩基の直前から７０ｂｐ上流の領域を開始地点として付与した。
　図１４Ａ中の３つの配列を表２３及び２４に示す。四角で囲った文字は、野生型配列と異なる塩基を示す。小文字はＤＯＲ領域においてＤｎａＡコンセンサス配列と一致しない配列を示す。表２３中、下線領域は、５’側から、ＤＵＥのＭエレメント及びＲエレメントを示し、「．」は塩基欠失を示す。表２４中、下線領域は、５’側から、ＤＯＲのτ２エレメント、Ｉ１エレメント、及びＩ２エレメントを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　図１４Ｂは、ｏｒｉＣ３．０ＡＴ、ｏｒｉＣ３．４ＡＴ、ｏｒｉＣ３．６ＡＴ及びｏｒｉＣ４．０ＡＴ上の変異の模式図を示す。アスタリスクは、野生型と異なる変異塩基の位置を示す。ｏｒｉＣ３．４ＡＴは、ｏｒｉＣ４．０ＡＴのＤＯＲにおける変異のみを有するカセットである。ｏｒｉＣ３．６ＡＴは、ｏｒｉＣ４．０ＡＴのＤＵＥにおける変異のみを有するカセットである。これらの変異ｏｒｉＣカセットを用いて、実施例１４－２のリアルタイムＲＣＲ法と同様の手法により環状ＤＮＡ増幅を行い、算出された、ＤＮＡ増幅の倍化時間（分）と標準偏差を図１４Ｂの最右に示す。
　図１４Ｃは、ｏｒｉＣｗｔ、ｏｒｉＣ３．０ＡＴ、ｏｒｉＣ３．４ＡＴ、ｏｒｉＣ３．６ＡＴ、及びｏｒｉＣ４．０ＡＴを用いて実施例１４－２と同様の手法によりリアルタイムＲＣＲを実施した結果を示す。
　図１４Ａに示すとおり、ｏｒｉＣ４．０ＡＴは、ｏｒｉＣ３．０ＡＴと比較して、ＤＯＲ部分に、τ２のＧ１３７Ｔ、Ｉ１のＣ１５０Ｔ、及びＩ２のＧ１６１Ｔの、３つの変異を有する。図１４Ｂ及びＣに示すとおり、リアルタイムＲＣＲ分析によれば、ｏｒｉＣ４．０ＡＴの増幅速度（２３．４分）は、ｏｒｉＣｗｔ（３１．９分）及びｏｒｉＣ３．０ＡＴ（２４．７分）と比較して、それぞれ１．４倍及び１．０５倍速かった。また、ｏｒｉＣ４．０ＡＴのＤＵＥにおける変異のみを有するカセットであるｏｒｉＣ３．６ＡＴ（２０．７分）は、ｏｒｉＣ４．０ＡＴと比較してさらに増幅速度が高く（１．１倍）、増幅曲線の立ち上がりも早かった。対照的に、ｏｒｉＣ４．０ＡＴのＤＯＲにおける変異のみを有するカセットであるｏｒｉＣ３．４ＡＴ（３４．１分）は、ｏｒｉＣ４．０ＡＴと比較して増幅速度が０．７倍に減少し、ｏｒｉＣｗｔと同様の増幅曲線の上昇を示した。これらの結果から、ＤＵＥの変異が増幅速度を大幅に改善すると考えられた。野生型ｏｒｉＣと比較すると、増幅速度の高まりがみられたｏｒｉＣカセットは、ＤＵＥ領域のＲエレメントに連続したＫＡＫ配列を有しており、特に増幅速度が高いｏｒｉＣカセットは、更に、ＤＵＥ領域のＭエレメントの左側（５’側）に反復的なＡＴ配列を含んでいた。
　図１４Ｄは、ｏｒｉＣｗｔ、ｏｒｉＣ３．０ＡＴ、ｏｒｉＣ３．６ＡＴ、及びｏｒｉＣ４．０ＡＴを用いて、実施例１４－２と同様、異なるＧＣ含有率の環状ＤＮＡの増幅をした結果を示す。２３％及び５６％のＧＣ含有量の１０ｋｂＤＮＡ断片を、各ｏｒｉＣカセットとアセンブリして環状ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡをＲＣＲ法により増幅し、０．５ｘ　ＴＢＥ中１％アガロースゲルで電気泳動後、ＳＹＢＲグリーンＩで染色した。
　図１４Ｄに示すとおり、実施例１４－２でｏｒｉＣ３．０ＡＴを用いた場合には増幅できなかった２３％ＧＣ含有率の環状ＤＮＡを、ｏｒｉＣ３．６ＡＴ及びｏｒｉＣ４．０ＡＴを用いた場合には増幅することができた。図１４Ａに示すとおり、ｏｒｉＣ３．６ＡＴ及びｏｒｉＣ４．０ＡＴは、ｏｒｉＣ３．０ＡＴと比較して、ＤＵＥ領域のＭエレメントの左側に反復的なＡＴ配列を含み、ＤＵＥ領域のＲエレメントに連続したＫＡＫ配列を有する。これにより、ＡＴ含有率の高いＤＮＡも増幅可能になったと考えられた。
［実施例１４－４］ＤＵＥ及びＤＯＲに変異を有するＯｒｉＣ変異体によるＲＣＲ増幅２
　実施例１４－３と比較して、ＤＵＥのＧＣ含有率をさらに下げ、ＫＡＫ配列の数を増やすことで、ＲＣＲ法におけるＤＮＡの増幅率が変化するかを確認した。さらに、ＤＯＲのうち、特にＤｎａＡホモオリゴマー形成の開始に重要なＲ５Ｍに追加の変異を導入し、ＲＣＲ法におけるＤＮＡの増幅率が変化するかを確認した。
　ＤＵＥ及びＤＯＲに変異を有するＯｒｉＣ変異体の、ＲＣＲ増幅効率への影響を調べた。実施例１４－１で作成したｏｒｉＣ４．０ＡＴ及びｏｒｉＣ６．０ＡＴ配列の模式図を図１５Ａに示す。図１５Ａ中、配列中の「－」は塩基の欠失を示し、小文字はＤＯＲ領域においてＤｎａＡコンセンサス配列と一致しない配列を示す。下線は、連続するＫＡＫ配列を示す。それぞれの塩基番号は、図１３と同様、Ｒ１　ＤｎａＡ－ｂｏｘの塩基の直前から７０ｂｐ上流の領域を開始地点として付与した。
　図１５Ａ中の３つの配列を表２５及び２６に示す。四角で囲った文字は、野生型配列と異なる塩基を示し、小文字はＤＯＲ領域においてＤｎａＡコンセンサス配列と一致しない配列を示し、網掛文字は、連続するＫＡＫ配列を示す。表２５中、下線領域は、５’側から、ＤＵＥのＭエレメント及びＲエレメントを示し、「．」は塩基欠失を示す。表２６中、下線領域は、５’側から、ＤＯＲのＲ５Ｍエレメント、τ２エレメント、Ｉ１エレメント、及びＩ２エレメントを示す。表２５に示すとおり、ｏｒｉＣ４．０ＡＴ及びｏｒｉＣ６．０ＡＴはＤＵＥ－Ｒにそれぞれ５つ及び７つのＫＡＫモチーフを含み、ＧＣ含有率は１０％に低下している。また、表２６に示すとおり、ＤＯＲ領域のＲ５Ｍ配列が、ＤｎａＡのコンセンサス配列と一致する配列を有する（図１５Ａ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　図１５Ｂは、ｏｒｉＣ５．４ＡＴ、ｏｒｉＣ５．６ＡＴ及びｏｒｉＣ６．０ＡＴ上の変異の模式図を示す。アスタリスクは、野生型と異なる変異塩基の位置を示す。ｏｒｉＣ５．４ＡＴは、ｏｒｉＣ６．０ＡＴのＤＯＲにおけるものと同じ変異を有するカセットである。ｏｒｉＣ５．６ＡＴは表７に示す配列を有するカセットであり、特に、ｏｒｉＣ６．０ＡＴのＤＵＥ（Ｍ及びＲ）におけるものと同じ変異を有する。これらの変異ｏｒｉＣカセットを用いて、実施例１４－２のリアルタイムＲＣＲ法と同様の手法により環状ＤＮＡ増幅を行い、算出された、ＤＮＡ増幅の倍化時間（分）と標準偏差を図１５Ｂの最右に示す。
　図１５Ｃは、ｏｒｉＣｗｔ、ｏｒｉＣ５．４ＡＴ、ｏｒｉＣ５．６ＡＴ、及びｏｒｉＣ６．０ＡＴを用いて実施例１４－２と同様の手法によりリアルタイムＲＣＲを実施した結果を示す。
　図１５Ｂ及びＣに示すとおり、ｏｒｉＣ６．０ＡＴの倍加時間（２５．８分）はｏｒｉＣ４．０ＡＴの倍加時間（２３．４分）よりも遅く、０．９倍に減少した。一方、ｏｒｉＣ６．０ＡＴのＤＵＥ変異のみを有するｏｒｉＣ５．６ＡＴ（２０．３分）を用いた場合のＤＮＡの増幅速度は速まり、ｏｒｉＣ３．６ＡＴ（２０．７分。図１４Ｂ及びＣ）よりも更に若干速かった。ＤＵＥ－ＲにおけるＫＡＫ配列の数は、ｏｒｉＣ５．６ＡＴでは７つ、ｏｒｉＣ３．６ＡＴでは５つである。
　一方、ｏｒｉＣ６．０ＡＴのＤＯＲ変異のみを有するｏｒｉＣ５．４ＡＴを用いた場合も（２４．５分）、ｏｒｉＣ６．０ＡＴと比較してＤＮＡ増幅速度が１．０５倍に増加した。ｏｒｉＣ５．４ＡＴを用いた場合、ｏｒｉＣｗｔと比較すると、ＲＣＲ法におけるＤＮＡの増幅速度が高かった（１．３倍）。但し、増幅曲線の立ち上がりは、ｏｒｉＣｗｔに比べてわずかに早い程度であった。複製の終了も、ｏｒｉＣｗｔに比べて早まった。
　ＤＵＥ－ＭＲ領域におけるＡ／Ｔ配列の増加によるＲＣＲ増幅への影響を調べた。実施例１４－１で作成したｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ｔ、ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ａ、ｏｒｉＣｄｕｅＲ１３Ｔ、及びｏｒｉＣｄｕｅＲ１３Ａ配列の模式図を図１５Ｄに示す。これらはポリＡ又はポリＴ配列を持つＤＵＥ－Ｍ又はＤＵＥ－Ｒの変異体である。下線は、図１５Ａと同様である。それぞれの塩基番号は、図１３と同様、Ｒ１　ＤｎａＡ－ｂｏｘの塩基の直前から７０ｂｐ上流の領域を開始地点として付与した。また、これらの変異ｏｒｉＣカセットを用いて、実施例１４－２のリアルタイムＲＣＲ法と同様の手法により環状ＤＮＡ増幅を行った。これにより算出されたＤＮＡ増幅の倍化時間（分）と標準偏差を、図１５Ｄの最右に示す。「Ｎ．Ｄ．」は、ＤＮＡの増幅が検出されなかったことを示す。
　図１５Ｄ中の５つの配列を表２７に示す。表２７中、四角で囲った文字は、野生型配列と異なる塩基を示し、網掛文字は、連続するＫＡＫ配列を示す。下線領域は、５’側から、ＤＵＥのＭエレメント及びＲエレメントを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　図１５Ｄに示すとおり、ＤＵＥ－ＭがポリＡ（ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ａ、４２．８分）及びポリＴ（ｏｒｉＣｄｕｅＭ９Ｔ、３５．３分）に変異した配列を用いた場合は、ＲＣＲ法によりＤＮＡ増幅が可能であったが、両ＤＵＥ－Ｍ変異体の倍加時間はｏｒｉＣｗｔ（３１．９分）よりも遅く、それぞれ０．７倍及び０．９倍低下した。一方、ポリＴを持つＤＵＥ－Ｒ変異体（ｏｒｉＣｄｕｅＲ１３Ｔ、６７．３分）の増幅率は、ポリＡ又はＴを持つＤＵＥ－Ｍ変異体よりもはるかに低く、ポリＡを有するＤＵＥ－Ｒ変異体（ｏｒｉＣｄｕｅＲ１３Ａ）では、ＤＮＡの増幅は観察されなかった。ＤＵＥ－ＭＲ領域にポリＡ又はＴを追加することでＧＣ含量を減少させると、増幅率を高めることなくＲＣＲ増幅が大幅に抑制されると考えられた。これらの結果からも、ＤＵＥ－ＭのＡＴモチーフの反復とＤＵＥ－ＲのＫＡＫモチーフがＲＣＲ増幅の強化に寄与すると考えられた。
　更に、ＲエレメントのＫＡＫモチーフを増加させた配列（ＧＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧｇａｔ（配列番号１１５）。大文字はＤＵＥ－Ｒ、小文字は３’側の配列、下線が野生型からの変異）を用いて同様の実験を行ったところ、このＤＵＥ－Ｒ変異体の倍加時間は２９．２±２．０分間となり、この結果からも、ＤＵＥ－ＲのＫＡＫモチーフがＲＣＲ増幅の強化に寄与すると考えられた。
　なお、ＤＵＥ－ＲにＡＴモチーフを増加した配列（ＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＧｇａｔ（配列番号１１６）。大文字はＤＵＥ－Ｒ、小文字は３’側の配列、下線が野生型からの変異）を用いて同様の実験を行ったところ、このＤＵＥ－Ｒ変異体の倍加時間は、野生型よりも増加した。
［実施例１４－５］
　ｏｒｉＣカセット変異体により、低温でのＲＣＲ増幅が可能となるか検討した。実施例１４－１で作成したｏｒｉＣｗｔ、ｏｒｉＣ３．４ＡＴ、ｏｒｉＣ３．６ＡＴ、ｏｒｉＣ４．０ＡＴ、ｏｒｉＣ５．４ＡＴ、ｏｒｉＣ５．６ＡＴ及びｏｒｉＣ６．０ＡＴを有する７ｋｂの環状ＤＮＡ　１ｐＭを、１６℃、１８℃、２０℃又は３３℃で１２時間、ＲＣＲ法により増幅した。増幅産物を、１％のアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）した結果を図１６Ａに示す。
　図１６Ａに示すとおり、ｏｒｉＣ５．６ＡＴ及びｏｒｉＣ６．０ＡＴを用いた場合、１８℃でも高い増幅が見られた。ｏｒｉＣ３．６ＡＴ及びｏｒｉＣ４．０ＡＴを用いた場合、１８℃ではわずかな増幅が確認された。ｏｒｉＣ５．６ＡＴ及びｏｒｉＣ６．０ＡＴを用いた場合、１６℃でもわずかな増幅が確認された。ＤＵＥの突然変異は、低温でのＲＣＲ増幅を促進する効果があり、特に、ＤＵＥ－Ｒの連続したＫＡＫ配列をもたらす変異の効果が高かった。連続するＫＡＫ配列が二本鎖ＤＮＡの開裂を強化し、ｏｒｉＣ３．６ＡＴに比べて低温での増幅効率を改善する可能性があると考えられた。
　次に、実施例１４－１で作成したｏｒｉＣｗｔ、ｏｒｉＣ３．４ＡＴ、ｏｒｉＣ５．４ＡＴ、ｏｒｉＣ５．６ＡＴ及びｏｒｉＣ６．０ＡＴを用いて競合試験を実施した。各ｏｒｉＣを含む７ｋｂの環状ＤＮＡの増幅を、競合物として、ｏｒｉＣｗｔを含む１３ｋｂの環状ＤＮＡを用いて実施した。７ｋｂＤＮＡと１３ｋｂＤＮＡは、１００ｐＭ：２００ｐＭの比率で混合し、ＲＣＲ法における増幅用の酵素混合物（ＲＥ ｍｉｘ））を０．２５×、０．５×、又は１．０×の最終濃度で含むＲＣＲ反応用混合物を用いて、増幅した。増幅産物を、１．０％のアガロースゲル電気泳動によって分離した結果を図１６Ｂに示す。図１６Ｂの下のグラフは、ＮＩＨ　ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Schneider,C.A., Rasband,W.S., and Eliceiri,K.W. (2012) NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods, vol.9(7), p.671-675.）を用いて、バンド強度から計算した１３ｋｂ　ＤＮＡの存在率（％）を示す。
　図１６Ｂに示すとおり、ｏｒｉＣ３．４ＡＴ及びｏｒｉＣ５．４ＡＴがｏｒｉＣｗｔに対する競合を示し、ＤｎａＡボックスに対するＤｎａＡへの結合が増加することで、野生型への結合よりもＤｎａＡ変異体への結合の傾向が高まることが示唆された。これらの変異体では、増幅速度は高められることなく、ＤｎａＡレベルが低い条件下でより競争力が高まると考えられた。ｏｒｉＣ５．６ＡＴが、野生型の配列に比べて低濃度のＤｎａＡで開きやすくなることをも確認した（データ示さず）。
［実施例１５］
　実施例４で得た、Ｅ１－ｐ１５ＡプラスミドにＯｒｉＣｓｇを組み込んだプラスミドと、ＯｒｉＣｓｇの代わりにＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇを組み込んだプラスミドとを用いて、ＲＣＲ増幅反応条件を３０℃で６時間、１０時間、１５時間又は２０時間とした以外は、実施例５と同様の実験を実施した。ＲＣＲ増幅には、表９に示す組成の反応用混合物を適宜希釈して用いた。反応時に、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｗａｋｏ）を０．０５％添加した。
　ＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇカセットは、ＯｒｉＣｓｇカセット配列（配列番号１０）において、ｏｒｉＣが、ＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇのｏｒｉＣと同様のカセットである。塩基配列を表２８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　表中、下線付きで示された大文字領域が、ＯｒｉＣｓｇと同様、ＳＧＳを表す。中央付近の大文字で示された領域（下線なし）が、ＯｒｉＣ５．６ＡＴと同様のｏｒｉＣ配列を表す。表中、太字で示した部分が、ＤＵＥ部分であり、太字のうち四角で囲った部分が変異ＤＵＥにおける変異部分である。下線部分は、ＤＵＥのＭエレメント（５’末端側下線部）及びＲエレメント（３’末端側下線部。１塩基欠失変異を有する）である。また、四角で囲われた領域が、ｔｅｒＧ１６配列及びその相補配列を表す。
　実施例１と同様の手法で、ｐ１５ＡプラスミドにＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇカセットを組み込んだ。プライマーは、表８中のＯｒｉＣ＿ＦＷ＿１及びＯｒｉＣ＿ＲＶ＿１を用いた。その後、実施例４－１と同様の手法によりクローニングを実施し、Ｅ１－ｐ１５ＡプラスミドにＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇを組み込んだプラスミドを得た。
　結果を図１７に示す。反応時間に対するＤＮＡ濃度の変化を図１８に示す。ＯｒｉＣｓｇ及びＯｒｉＣ５．６ＡＴの両方の特徴を有するＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇカセットを用いた場合、ＯｒｉＣｓｇカセットと比較して、増幅速度が速く、また、増幅後のＤＮＡ濃度が高かった。
［実施例１６］
　実施例１５と同様、Ｅ１－ｐ１５ＡプラスミドにＯｒｉＣｓｇ又はＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇを組み込んだ２種のプラスミドとを用いて、ＲＣＲ増幅反応条件を２０℃、２５℃又は３０℃で５時間、１０時間、又は２０時間とした以外は、実施例５と同様の実験を実施した。ＲＣＲ増幅には、表９に示す組成の反応用混合物を適宜希釈して用いた。反応時に、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｗａｋｏ）を０．０５％添加した。
　結果を図１９に示す。ＯｒｉＣｓｇ及びＯｒｉＣ５．６ＡＴの両方の特徴を有するＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇカセットを用いた場合、２５℃でも、より短時間でＤＮＡの増幅が見られ、ＯｒｉＣｓｇカセットと比較して、より低温でもＤＮＡが早く増幅した。
［実施例１７］
　実施例４で得た、Ｅ１－ｐ１５ＡプラスミドにＯｒｉＣ５．６ＡＴを組み込んだプラスミドと、実施例１５で得た、Ｅ１－ｐ１５ＡプラスミドにＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇを組み込んだプラスミドとを用いて、ＲＣＲ増幅反応条件を３０℃で６時間、１０時間、又は２０時間とした以外は、実施例５と同様の実験を実施した。ＲＣＲ増幅には、表９に示す組成の反応用混合物を適宜希釈して用いた。反応時に、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｗａｋｏ）を０．０５％添加した。
　結果を図２０に示す。ＯｒｉＣｓｇ及びＯｒｉＣ５．６ＡＴの両方の特徴を有するＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇカセットを用いた場合、ＯｒｉＣ５．６ＡＴカセットと比較して、コンカテマーが少なく、より正確な増幅が可能と考えられた。
［実施例１８］
　実施例１５で示したＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇカセットと同様の変異ＤＵＥ部分を有するｏｒｉＣ配列の両端に近接してｔｅｒＧ１６配列及びその相補配列を有し、当該ｏｒｉＣ配列及びｔｅｒＧ１６配列のさらに５’側に、ＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇカセットと同様のＳＧＳを有するカセットを作成し、ＯｒｉＣ７．０カセットとした。
　以下のプラスミドを用意した。
・実施例１５で得た、Ｅ１－ｐ１５ＡプラスミドにＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇを組み込んだプラスミド。
・同様にしてＥ１－ｐ１５ＡプラスミドにＯｒｉＣ７．０を組み込んだプラスミド。
・実施例４で得た、Ｅ１－ｐ１５Ａプラスミドに２種のＯｒｉＣカセット（ＯｒｉＣ２．０、ＯｒｉＣｓｇ）を組み込んだプラスミド２種。
　ＲＣＲ増幅反応条件を３０℃で５時間、１０時間、１５時間又は２０時間とした以外は、実施例５と同様の実験を実施した。ＲＣＲ増幅には、表９に示す組成の反応用混合物を適宜希釈して用いた。反応時に、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｗａｋｏ）を０．０５％添加した。
　反応時間に対するＤＮＡ濃度の変化を図２１に示す。実施例１５の結果と同様、ＯｒｉＣｓｇ及びＯｒｉＣ５．６ＡＴの両方の特徴を有するＯｒｉＣ５．６ＡＴｓｇカセット及びＯｒｉＣ７．０カセットを用いた場合、ＯｒｉＣｓｇカセットと比較して、増幅速度が速く、また、増幅後のＤＮＡ濃度が高かった。
［実施例１９］
　ＲＣＲ増幅反応条件を３７℃で２時間、５時間又は１０時間とした以外は、実施例１８と同様の実験を実施した。反応時間に対するＤＮＡ濃度の変化を図２２に示す。実施例１８の結果と同様の結果が得られ、３０℃の場合（実施例１８）と比較して、３７℃の反応温度では、ＤＮＡの増幅速度が高まることが示された。

Claims (15)

  1. 　（１）鋳型となる環状ＤＮＡを用意することであって、環状ＤＮＡが、（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ii）ジャイレース結合配列を含み、
    　前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない、こと、
    （２）前記（１）において用意した環状ＤＮＡと、以下：
    　環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
    　カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；及び
    　２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；
    を含む反応液との反応混合物を形成すること；並びに
    （３）前記（２）において形成した反応混合物を、８０℃以下の温度でインキュベートすることであって、これにより、増幅した前記環状ＤＮＡを含む反応物を得る、こと、
    を含む、環状ＤＮＡの製造方法。
  2. 　前記（i）の複製開始配列が、野生型複製開始配列の二重鎖開裂領域と比較してＡＴ含有率の高い変異二重鎖開裂領域を有し、二重鎖開裂領域は、Ｌ、Ｍ及びＲエレメントを有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記（ii）のジャイレース結合配列が、バクテリオファージＭｕ由来の配列である、請求項１に記載の方法。
  4. 　（１）鋳型となる環状ＤＮＡを用意することであって、環状ＤＮＡが（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含み、かつ、
    　当該複製開始配列が、野生型複製開始配列の二重開裂領域と比較してＡＴ含有率の高い変異二重鎖開裂領域を有し、前記二重鎖開裂領域は、Ｌ、Ｍ及びＲエレメントを有する、こと、
    （２）前記（１）において用意した環状ＤＮＡと、以下：
    　環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
    　カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；及び
    　２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；
    を含む反応液との反応混合物を形成すること；並びに
    （３）前記（２）において形成した反応混合物を、８０℃以下の温度でインキュベートすることであって、これにより、増幅した前記環状ＤＮＡを含む反応物を得る、こと、
    を含む、環状ＤＮＡの製造方法。
  5. 　　前記（３）に続いてさらに、
    （４）前記第一から第三の酵素群を含まない溶液で反応物を２倍以上に希釈すること、及び、前記希釈後に、得られた希釈物を、前記第二の酵素群及び前記第三の酵素群が作用する条件で維持すること、
    を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記変異二重鎖開裂領域が、
    　二重鎖開裂領域を構成するＬ、Ｍ及びＲエレメントのうち、Ｍ及び／又はＲエレメントが、野生型のＭ及び／又はＲエレメントと比較して高いＡＴ含有率を有する変異二重鎖開裂領域である、
    　二重鎖開裂領域を構成するＭエレメントが反復的なＡＴ配列を有する変異二重鎖開裂領域である、及び／又は
    　二重鎖開裂領域を構成するＲエレメントが４つ以上の連続したＫＡＫ（Ｋは、Ｔ又はＧ）モチーフ配列を有する変異二重鎖開裂領域である、
    請求項２又は４に記載の方法。
  7. 　前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列に対して外向きに挿入されたｔｅｒ配列をさらに含み、
    　前記ｔｅｒ配列は、前記複製開始配列に隣接しておらず、
    　前記（２）の反応液が、さらに、ｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質を含む、
    請求項１又は４に記載の方法。
  8. 　前記環状ＤＮＡが、ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列に対して外向きに挿入されたｔｅｒ配列をさらに含み、
    　前記ｔｅｒ配列が、野生型ｔｅｒ配列の１以上の塩基を、置換、欠失、又は挿入させる変異を導入したｔｅｒ配列であり、
    　前記（２）の反応液が、さらに、ｔｅｒ配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質を含む、請求項１又は４に記載の方法。
  9. 　前記（３）のインキュベートが、等温でのインキュベートを含む、請求項１又は４に記載の方法。
  10. 　前記（３）のインキュベートが、６５℃以下の２つの温度でのインキュベートを繰り返す温度サイクル下でのインキュベートを含む、請求項１又は４に記載の方法。
  11. 　前記第一の酵素群が、ＤｎａＡ活性を有する酵素、ＳＳＢ、ＤｎａＢ型ヘリカーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素、ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡクランプ活性を有する酵素、及びＤＮＡポリメラーゼIII活性を有する酵素又は酵素群を含み、
    　前記第二の酵素群が、ＤＮＡポリメラーゼＩ活性を有する酵素及びＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素を含み、
    　前記第三の酵素群が、トポイソメラーゼＩＩＩ活性を有する酵素又はトポイソメラーゼＩＶ活性を有する酵素を含む、請求項１又は４に記載の方法。
  12. 　前記反応液が、さらに、直鎖状ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項１又は４に記載の方法。
  13. 　前記反応液が、さらに、一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項１又は４に記載の方法。
  14. 　（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列及び（ii）ジャイレース結合配列を含む環状ＤＮＡであって、
    　前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない、環状ＤＮＡ。
  15. 　（i）ＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列、（ii）ジャイレース結合配列、及び（iii）プラスミド複製起点を含む環状ＤＮＡであって、
    　前記環状ＤＮＡが、前記複製開始配列とは異なる位置にＤｎａＡボックスクラスターを含まない、環状ＤＮＡ。
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SHOTA SUZUKI, TSUBASA MIYAUCHI, MASAYUKI SU’ETSUGU: "1P-179 Discovery of superior oriC by molecular evolution engineering in vitro", PROGRAMS AND LECTURE ABSTRACTS OF THE 45TH ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN; NOVEMBER 30TH - DECEMBER 2ND, 2022, vol. 45, 1 January 2022 (2022-01-01) - 2022-12-02, pages 1P - 179, XP009561284 *

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