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WO2025009619A1 - 重症筋無力症患者におけるｃｄ８陽性ｔ細胞活性化の解析方法及び診断方法 - Google Patents

重症筋無力症患者におけるｃｄ８陽性ｔ細胞活性化の解析方法及び診断方法 Download PDF

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WO2025009619A1
WO2025009619A1 PCT/JP2024/024500 JP2024024500W WO2025009619A1 WO 2025009619 A1 WO2025009619 A1 WO 2025009619A1 JP 2024024500 W JP2024024500 W JP 2024024500W WO 2025009619 A1 WO2025009619 A1 WO 2025009619A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
positive
myasthenia gravis
activated
gene
Prior art date
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Pending
Application number
PCT/JP2024/024500
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English (en)
French (fr)
Inventor
慧 藤森
直 福島
史也 星賀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Denka Co Ltd
Original Assignee
Denka Co Ltd
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Publication date
Application filed by Denka Co Ltd filed Critical Denka Co Ltd
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Pending legal-status Critical Current
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention broadly relates to a method for analyzing a sample derived from a subject who is suffering from or may be suffering from myasthenia gravis.
  • Myasthenia gravis is an autoimmune disease caused by autoantibodies.
  • a typical symptom is muscle weakness in the limbs, one of the causes of which is the appearance of antibodies (autoantibodies) against components of the patient's own body.
  • Neuromuscular transmission is inhibited by autoantibodies produced in the patient's body against molecules present in the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction, such as acetylcholine receptors (AChR) and muscle-specific tyrosine kinase (MuSK).
  • AChR acetylcholine receptors
  • MoSK muscle-specific tyrosine kinase
  • Non-Patent Documents 1-3 Because the appearance of autoantibodies was thought to be the main cause of myasthenia gravis, research into myasthenia gravis to date has focused mainly on CD4-positive T cells, which are involved in humoral immunity (Non-Patent Documents 1-3).
  • Treatments for myasthenia gravis include steroids and immunosuppressants, but currently there is a shift towards treatments that target antibodies produced by B cells via CD4-positive T cells, the antibody-producing B cells themselves, cytokines that activate B cells, and complement, which causes antibody-induced damage, such as molecular targeted drugs.
  • antibodies used in these treatments include efgartigimod (anti-FcRn antibody), rituximab (anti-CD20 monoclonal antibody), satralizumab (IL-6 receptor neutralizing antibody), and ravulizumab (complement neutralizing antibody).
  • Nico Melzer et al. "Clinical features, pathogenesis, and treatment of myasthenia gravis: a supplement to the Guidelines of the German Neurological Society", J Neurol. 2016 Aug;263(8):1473-94. Anthony Behin et al., “New Pathways and Therapeutic Targets in Autoimmune Myasthenia Gravis”, J Neuromuscul Dis. 2018; 5(3): 265-277. Fredrik Romi et al., "Pathophysiology and immunological profile of myasthenia gravis and its subgroups", Curr Opin Immunol. 2017 Dec;49:9-13.
  • the inventors used gene expression analysis to compare peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from myasthenia gravis patients and healthy individuals, and found that CD8+ T cells were activated in myasthenia gravis patients.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • CD8+ T cells involved in cellular immunity or their gene signatures could be new therapeutic targets for myasthenia gravis.
  • a method of analyzing a sample comprising: 1. A method comprising determining whether CD8-positive T cells are activated in a sample from a subject suffering from or likely to suffer from myasthenia gravis. [2] The method according to [1], wherein the presence or absence of activation is determined based on the expression level of a signature gene of CD8-positive T cells or its expression product in a sample. [3] The method according to [2], wherein the signature gene is a gene related to cytotoxicity and/or activation of CD8-positive T cells.
  • the signature genes were ABHD17A, AC004687.1, ACTB, ACTG1, ADGRG1, AL138963.3, ANXA2, ANXA6, AREG, ARHGDIB, ARPC1B, ARPC5L, B2M, BCL3, BIN2, BTG1, BTG2, BTN3A2, CALR, CAPZB, CCL4, CCL5, CCND3, CD 27, CD3D, CD3E, CD5, CD52, CD6, CD63, CD69, CD7, CD74, CD8A, CD8B, CEBPD, CFL1, CIR1, CLIC1, CL IC3, CMC1, CORO1A, CRIP1, CST7, CTSW, CXCR3, CXCR4, CYBA, CYTIP, DDIT4, DDX3Y, DDX5, DNAJA1, D NAJB1, DUSP1, DUSP2, DUSP5, EEF1G, EFHD2, EIF1, EML4, EVL, FCGR3A, FCRL6,
  • the signature gene is 1) genes expressed in early activated CD8 positive T cells, the group consisting of CXCR4, CD69, IFITM1, IL32, CCL4 and IFITM2; or 2) genes expressed in late activated CD8 positive T cells, the group consisting of IL32, IFITM2, CXCR4, IFITM1, CCL4, CCL5, ZFP36L2, CD74, JUNB and TNFAIP3;
  • a marker for the treatment, prevention, or diagnosis of myasthenia gravis comprising a signature gene of CD8-positive T cells or its expression product.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing myasthenia gravis comprising: A pharmaceutical composition comprising an active ingredient that targets CD8-positive T cells, a signature gene of the cells or its expression product, or a factor that activates CD8-positive T cells, or a molecule whose expression is enhanced in activated CD8-positive T cells.
  • the pharmaceutical composition according to [11], wherein the CD8 positive T cells are early or late activated CD8 positive T cells.
  • activating factors of CD8-positive T cells that are activated in myasthenia gravis and factors whose expression is increased can serve as surrogate markers for determining the effectiveness of treatment when treatment targeting CD8-positive T cells is administered.
  • Wanlin Jin et al. report the results of single-cell analysis of PBMCs derived from healthy individuals and patients with myasthenia gravis, and also mention CD8+ T cells ("Single-cell RNA-Seq reveals transcriptional heterogeneity and immune subtypes associated with disease activity in human myasthenia gravis", Cell Discovery volume 7, Article number: 85 (2021)).
  • Single-cell RNA-Seq reveals transcriptional heterogeneity and immune subtypes associated with disease activity in human myasthenia gravis
  • Cell Discovery volume 7, Article number: 85 (2021) Cell Discovery volume 7, Article number: 85 (2021
  • Fig. 4a, b the result of combining analysis data of PBMCs from healthy individuals and patients with myasthenia gravis and characterizing each cell population (e.g., Fig. 4a, b), and this is not comparative data between healthy individuals and patients with myasthenia gravis, nor is it data showing activation of CD8+ T cells in patients with myas
  • FIG. 1 shows whole cell clusters from samples from healthy individuals and myasthenia gravis patients subjected to single cell RNA analysis.
  • FIG. 2 shows the general cell marker gene expression profiles used for annotation.
  • FIG. 3 shows violin plots visualizing gene expression related to cytotoxicity in each cluster.
  • FIG. 4 shows the results of confirming gene expression related to cell activation and cytotoxicity in each cluster.
  • a method of analysing a sample comprising determining whether CD8 positive T cells are activated in a sample from a subject suffering from or likely to suffer from myasthenia gravis.
  • Myasthenia gravis is an autoimmune disease, and symptoms include ptosis, diplopia due to impaired eye movement, muscle weakness in the limbs, swallowing disorders, and speech disorders. In severe cases, respiratory muscle paralysis leads to hypoventilation. It is believed that myasthenia gravis occurs when autoantibodies are produced in the patient's body against molecules present in the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction, and that these antibodies inhibit neuromuscular transmission.
  • the cause of myasthenia gravis is not limited to an autoimmune reaction, such as the production of antibodies against acetylcholine receptors (AChR), but also includes cases where the disease is caused by drugs such as immune checkpoint inhibitors, cases where anti-Musk antibodies or anti-LRP4 antibodies are elevated, cases where the titer of any autoantibody is not clearly elevated but the disease is observed, and congenital cases where the AChR is low from birth.
  • Myasthenia gravis may be systemic or localized, for example, ocular muscle type.
  • myasthenia gravis includes all classifications, such as adult type I (ocular muscle type), adult type II (systemic type), adult type III (acute severe symptoms), adult type IV (late severe type), adult type V (muscle atrophy type), childhood onset type, and thymoma.
  • Myasthenia gravis can be diagnosed by known methods, for example, based on the positivity of known markers such as AChR antibodies in a sample.
  • the severity of myasthenia gravis can be classified into Class I to V in the MGFA (MG Foundation of America) clinical classification. Class I or higher is diagnosed as myasthenia gravis.
  • the myasthenia gravis is selected from the following group as described in Myasthenia Gravis/Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome Clinical Practice Guidelines 2022: ⁇ Ocular muscle type MG (oMG) ⁇ AChR antibody-positive non-thymoma systemic MG - Early-onset MG (g-EOMG) (age at onset ⁇ 50 years) - Late-onset MG (g-EOMG) (age at onset > 50 years) ⁇ AChR antibody positive thymoma systemic type MG -Thymoma-associated MG (g-TAMG) ⁇ Systemic MG positive for pathogenic autoantibodies other than AChR antibodies -MuSK antibody positive MG (g-MuSKMG) ⁇ Systemic MG without detectable pathogenic autoantibodies - Antibody-negative MG (g-SNMG) (including LRP4 antibody-positive MG)
  • analysis refers to any analysis related to myasthenia gravis, such as analysis that leads to elucidation of the mechanism of action of myasthenia gravis (e.g., onset, progression, recurrence, etc.) and the provision of medically useful information regarding the diagnosis, treatment, prevention, prognosis, etc. of myasthenia gravis.
  • the analysis method may include, depending on the purpose, steps that are necessary as appropriate before or after the step of determining whether or not CD8-positive T cells are activated. Additional steps include, but are not intended to be limiting, a step of preparing the sample before analysis, a step of analyzing the sample from a different perspective, a step of further analyzing the data regarding activation obtained in the analysis step, particularly the data regarding differences from healthy subjects, a step of providing information regarding the sample that is useful for the diagnosis and treatment of physicians, etc. based on knowledge obtained by the analysis, such as a step of classifying the sample as a sample from a subject who has developed or may develop myasthenia gravis, etc.
  • the specimen may be any specimen capable of evaluating the activation of CD8-positive T cells.
  • specimens include blood or its components, cell or tissue extracts from the subject from which the specimen is derived, or urine, cerebrospinal fluid, tracheal aspirate, bronchoalveolar lavage fluid, etc.
  • Blood components include whole blood, blood cells, serum, plasma, etc.
  • Peripheral blood or peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived from peripheral blood are preferred specimens.
  • PBMCs may be prepared using known means such as density gradient centrifugation, immunomagnetic separation, and sedimentation.
  • the sample includes genomic DNA, RNA such as mRNA, proteins, and/or combinations thereof collected from a subject.
  • the sample preferably includes RNA to enable analysis of gene expression levels.
  • the sample may also include cDNA using RNA as a template.
  • Samples are collected from subjects who are suffering from or may be suffering from myasthenia gravis.
  • the number of times samples are collected can be set appropriately depending on the purpose of the analysis, and may be collected once for diagnosis, or multiple times for purposes such as prognosis observation after treatment.
  • the subject from which the specimen is derived is not limited to humans, but may be a non-human animal capable of developing myasthenia gravis, particularly a mammal, such as a rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, horse, pig, cow, dog, cat, monkey, etc.
  • the subject may have been diagnosed with myasthenia gravis prior to the analysis method of the present invention by using known markers, such as anti-acetylcholine receptor (AChR) antibodies, anti-muscle specific receptor tyrosine kinase (MuSK) antibodies, and/or low-density lipoprotein receptor-related protein 4 (Lrp4) antibodies, or known tests, such as the edrophonium (Tensilon) test, ice pack test, and repetitive stimulation test.
  • known markers such as anti-acetylcholine receptor (AChR) antibodies, anti-muscle specific receptor tyrosine kinase (MuSK) antibodies, and/or low-density lipoprotein receptor-related protein 4 (Lrp4) antibodies
  • known tests such as the edrophonium (Tensilon) test, ice pack test, and repetitive stimulation test.
  • the subject may be further treated for myasthenia gravis.
  • treatments include known treatments such as anticholinesterase inhibitors, as well as treatments targeting CD8-positive T cells, the signature gene or its expression product of the cells, factors that activate CD8-positive T cells, or molecules whose expression is increased in activated CD8-positive T cells.
  • CD8 positive T cells refers to T cells or populations thereof that express CD8 on their surface.
  • CD8 positive T cells are a term commonly used in the art and are also referred to as cytotoxic T lymphocytes (CTLs).
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • Whether or not the CD8-positive T cells in a sample are activated can be determined by comparing them with a control, for example, CD8-positive T cells in a sample from a healthy individual, or by comparing them with the past results of the subject from whom the sample was derived.
  • a control for example, CD8-positive T cells in a sample from a healthy individual, or by comparing them with the past results of the subject from whom the sample was derived.
  • the control includes housekeeping genes.
  • the method of analyzing a sample includes determining that CD8 positive T cells are activated in the sample.
  • activation refers to any change in CD8-positive T cells derived from myasthenia gravis. Such a change may be a specific change in CD8-positive T cells seen in myasthenia gravis patients, such as a change in the expression of a gene or cell surface marker (e.g., CD25) that is strongly associated with myasthenia gravis, or a change in cell proliferation of CD8-positive T cells. There may be multiple changes assessed, for example, an expression profile of multiple genes in CD8-positive T cells may be used.
  • the change in CD8 positive T cells derived from myasthenia gravis is preferably at least 1.1-fold, 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, or 6- to 10-fold increase compared to the control.
  • Changes can be evaluated using known analytical methods such as transcriptome analysis, expression analysis, and expression variation analysis.
  • the expression levels of nucleic acids and proteins in a sample can be qualitatively and/or quantitatively measured by microarray analysis, PCR (RT-PCR), immunohistochemistry, immunofluorescence, mass spectrometry, Northern blot, Western blot, etc.
  • Single-cell analysis includes processes such as dimensionality reduction, clustering, and annotation.
  • Clustering is a method for grouping cells based on similarity, which makes it possible to classify collections of cells with similar characteristics or gene expression patterns (for example, a population of CD8-positive T cells and a population of CD4-positive T cells).
  • genes markers that are expressed specifically by cell type for each cluster, it is possible to estimate the function and importance of each gene.
  • the presence or absence of activation is determined based on the amount of expression of a signature gene or its expression product of CD8-positive T cells in a sample.
  • Signature gene as used herein in the context of CD8-positive T cells, means a gene that is specific to CD8-positive T cells or a gene that is statistically significantly expressed in CD8-positive T cells compared to other cells.
  • the significance level may be, for example, a P value of 0.05 or less and a log2FC of more than 0.25, more than 0.30, more than 0.35, more than 0.40, more than 0.45, more than 0.50, more than 0.55, more than 0.60, more than 0.65, more than 0.70, more than 0.75, more than 0.80, more than 0.85, more than 0.90, or more than 0.95.
  • Expression products of signature genes include polynucleotides such as mRNA, transcription products such as cDNA synthesized from mRNA, translation products such as proteins, and fragments thereof.
  • the signature genes of CD8-positive T cells can be identified by evaluating the differential expression of genes in cells of healthy subjects and patients with myasthenia gravis using known techniques such as single-cell analysis. For example, single-cell analysis can be used to evaluate the percentage of cells in which a gene is expressed, and the gene that is expressed in a greater number of CD8-positive T cells can be determined as the signature gene.
  • the signature genes of CD8+ T cells are ABHD17A, AC004687.1, ACTB, ACTG1, ADGRG1, AL138963.3, ANXA2, ANXA6, AREG, ARHGDIB, ARPC1B, ARPC5L, B2M, BCL3, BIN2, BTG1, BTG2, BTN3A2, CALR, CAPZB, CCL4, CCL5, CCND3, CD27, CD3D, CD3E, CD5, CD52, CD6, CD63, CD69, CD7, CD74, CD8A, CD8B, CEBPD, CFL1 , CIR1, CLIC1, CLIC3, CMC1, CORO1A, CRIP1, CST7, CTSW, CXCR3, CXCR4, CYBA, CYTIP, DDIT4, DDX3 Y, DDX5, DNAJA1, DNAJB1, DUSP1, DUSP2, DUSP5, EEF1G, EFHD2, EIF1, EML4, EVL, FCGR
  • the signature genes of CD8 positive T cells are DUSP2, ZFP36, HLA-DRB1, MTRNR2L12, IL32, GZMA, ACTB, IFITM2, ZFP36L2, GZMH, FCGR3A, CXCR4, TXNIP, MT-ATP6, IFITM1, CD8B, PFN1, CD8A, HCST, CD74, LINC02446, S100A6, HLA-DPA1, HLA-DPB1, JUNB, LGALS1, CYBA, HOPX, ANXA6, HLA-DRA, CFL1, MT-ND4L, NKG7, CD6 3, FGFBP2, FLNA, CD3D, CTSW, S100A4, TMSB4X, PRDM1, DDIT4, UCP2, AL13896 3.3, ACTG1, ABHD17A, LSP1, CCND3, CCL4, CD52, ARPC1B, PPP1CA, CCL5, CORO 1A, CLIC3, HLA-C,
  • the signature genes of CD8 positive T cells are DUSP2, MTRNR2L12, ZFP36, JUNB, MT-ATP6, CXCR4, DUSP1, GZMH, ZFP36L2, FGFBP2, NKG7, S100A4, IFITM2, HLA-DRB1, TXNIP, FCGR3A, CD8B, AL138963.3, TSC22D3, CD8A, SPON2, GZMA , IL32, KLRD1, CD74, HLA-DPA1, TRBC2, PFN1, S100A6, CFL1, CTSW, SH3BGRL3, HCST, CD69, CCND3, ANXA6, RPL41 , IFITM1, FLNA, CCL4, HLA-DPB1, MT-ND5, ACTB, B2M, HOPX, DDIT4, EFHD2, DNAJB1, ABHD17A, CST7, TMSB10, MT- ND4L, PRDM1, FCRL6, HLA-C, LSP1,
  • the signature genes of CD8 positive T cells are JUNB, DUSP2, ZFP36, CXCR4, ZFP36L2, CD69, FOS, DUSP1, TSC22D3, TXNIP, MTRNR2L12, DNAJB1, DDIT4, MT-ATP6, KLF2, SLC2A3, IFIT M1, BTG1, NR4A2, CD74, TMSB10, CCND3, AL138963.3, MT-ND4L, HLA-DRB1, IL32, CCL4, TNFAIP3, HLA-C, TENT5C, RGS1, DUSP5, CYTIP, BTG2, GZMH, MT-ND5, TMSB4X, MT-CYB, S OCS3, CD8B, PPP1R15A, PFN1, IFITM2, VIM, CFL1, MT-CO1, HLA-DPA1, GZMK, DDX5, CRI P1, PIK3R1, MAP3K8, B2M, AREG, H
  • the signature genes are ACTB, ACTG1, ADGRG1, AL138963.3, ANXA2, ANXA6, AREG, ARHGDIB, ARPC1B, B2M, BIN2, BTG1, BTG2, CALR, CAPZB, CCL4, CCL5, CCND3, CD3D, CD3E, CD52, CD63, CD69, CD7, CD74, CD8A, CD8B, CFL1, CLIC1, CLIC3, CMC1, CORO1A, CRIP1 , CST7, CTSW, CXCR4, CYBA, CYTIP, DDIT4, DDX5, DNAJB1, DUSP1, DUSP2, DUSP5, EFHD2, EVL, FCGR3A, FCRL6, FGFBP2, FLNA, FOS, G STP1, GZMA, GZMH, GZMK, HCST, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, HLA-DRB1, H
  • Signature genes may be any combination of multiple of these genes, e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 10, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113,
  • the signature gene is preferably one involved in the activation or cytotoxicity of CD8-positive T cells. Proteins encoded by genes involved in activation are generally known to increase in expression upon T cell activation. Among these activation proteins, those that have direct cytotoxicity are classified as cytotoxic proteins.
  • the genes involved in activation are ZFP36, ZFP36L2, IL-32, IFITM2, CXCR4, IFITM1, CD74, CCL4, CCL5, JUNB, and ITGB7, and the genes associated with cytotoxicity are GZMA, GZMH, NKG7, CTSW, and PRF1.
  • the genes involved in activation are CXCR4, S100A4, IFITM2, IL-32, CD69, IFITM1, CCL4, JUNB, ZFP36L2, CD74, and ITGB2, and the genes associated with cytotoxicity are GZMH, NKG7, GZMA, and CTSW.
  • the genes involved in activation are CXCR4, CD69, IFITM1, IL-32, CCL4, IFITM2, JUNB, ZFP36L2, FOS, KLF2, CD74, and TNFAIP3, and the genes associated with cytotoxicity are GZMH and GZMK.
  • the signature gene may be a gene expressed in early activated CD8+ T cells. It is known that CD69 is a marker for early activation of immune cells and the like (Stem Cells, Volume 12, Issue 5, 1994, Pages 456-465, doi: 10.1002/stem.5530120502). As used herein, CD8+ T cells expressing CD69 are considered to be early activated CD8+ T cells, and CD8+ T cells that have lost CD69 expression are considered to be late activated CD8+ T cells.
  • the late-activated genes are DUSP2, ZFP36, HLA-DRB1, MTRNR2L12, IL32, GZMA, ACTB, IFITM2, ZFP36L2, GZMH, FCGR3A, CXCR4, TXNIP, MT-ATP6, IFITM1, CD8B, PFN1, CD8A, HCST, CD74, LINC02446, S100A6, HLA-DPA1, HLA-DPB1, JUNB, LGALS1, CYBA, HOPX, ANXA6, HLA-DRA, CFL1, MT-ND4L, NKG7, CD63, FGF BP2, FLNA, CD3D, CTSW, S100A4, TMSB4X, PRDM1, DDIT4, UCP2, AL138963.3, ACTG1, ABHD17A, LSP1, CCND3, CCL4, CD52, ARPC1B, PPP1CA, CCL5, CORO1A, C LIC3, HLA-C, TRGV
  • the genes activated in the metaphase are DUSP2, MTRNR2L12, ZFP36, JUNB, MT-ATP6, CXCR4, DUSP1, GZMH, ZFP36L2, FGFBP2, NKG7, S100A4, IFITM2, HLA-DRB1, TXNIP, FCGR3A, CD8B, AL138963.3, TSC22D3, CD8A, SPON2, GZMA, IL32, KLRD1, CD74, HLA-DPA1, TRBC2, PFN1, S100A6, CFL1, CTSW, SH3BGRL3, HCST, CD69, CCND3, ANXA6, RPL41, IFIT M1, FLNA, CCL4, HLA-DPB1, MT-ND5, ACTB, B2M, HOPX, DDIT4, EFHD2, DNAJB1, ABHD17A, CST7, TMSB10, MT-ND4L , PRDM1, FCRL6, HLA-C, LSP1, MT-CY
  • the early-activating genes are JUNB, DUSP2, ZFP36, CXCR4, ZFP36L2, CD69, FOS, DUSP1, TSC22D3, TXNIP, MTRNR2L12, DNAJB1, DDIT4, MT-ATP6, KLF2, SLC2A3, IFITM1, BT G1, NR4A2, CD74, TMSB10, CCND3, AL138963.3, MT-ND4L, HLA-DRB1, IL32, CCL4, TNFA IP3, HLA-C, TENT5C, RGS1, DUSP5, CYTIP, BTG2, GZMH, MT-ND5, TMSB4X, MT-CYB, SOCS 3, CD8B, PPP1R15A, PFN1, IFITM2, VIM, CFL1, MT-CO1, HLA-DPA1, GZMK, DDX5, CRIP1, PIK3R1, MAP3K8, B2M, AREG, HLA-DPB
  • the signature genes are one or more selected from the group consisting of GZMA, GZMH, NKG7, CTSW, PRF1, and GZMK.
  • the genes expressed in early activated CD8+ T cells are one or more selected from the group consisting of CXCR4, CD69, IFITM1, IL32, CCL4, IFITM2, JUNB, ZFP36L2, FOS, KLF2, CD74, and TNFAIP3.
  • the genes expressed in late activated CD8 positive T cells are one or more selected from the group consisting of IL32, IFITM2, CXCR4, IFITM1, CCL4, CCL5, ZFP36L2, CD74, JUNB, and TNFAIP3.
  • the analysis method can be used to diagnose and treat myasthenia gravis. Diagnosis also includes determining the type of myasthenia gravis, deciding on a treatment plan, and predicting the prognosis.
  • the analysis method includes a step of evaluating that the treatment is effective in treating the subject if the number of activated CD8-positive T cells is reduced compared to before the treatment.
  • the analysis method includes a step of evaluating that a patient suffering from myasthenia gravis has a high number of activated CD8-positive T cells compared to a healthy subject, and that a treatment targeting CD8-positive T cells, a signature gene or an expression product thereof, a factor that activates CD8-positive T cells, or a molecule whose expression is enhanced in activated CD8-positive T cells is effective.
  • the analytical method plays an auxiliary role in helping doctors and others diagnose myasthenia gravis.
  • the analytical method may be performed in combination with known diagnostic methods.
  • diagnostic methods include blood tests using anti-acetylcholine receptor (AChR) antibodies, anti-muscle specific receptor tyrosine kinase (MuSK) antibodies, LDL receptor-related protein 4 (Lrp4) antibodies, etc. as indicators, as well as thyroid function tests, electromyogram tests, etc.
  • Clinical assessment of myasthenia gravis uses the MGFA clinical classification to assess severity, the QMG (quantitative MG) score, and the MG-ADL (activities of daily living) scale to score daily life status.
  • Patients who have been determined to have myasthenia gravis may be treated with a treatment that targets CD8-positive T cells, the signature gene or its expression product of the cells, or a factor that activates CD8-positive T cells, a treatment that targets a molecule whose expression is increased in activated CD8-positive T cells, or other known treatment methods.
  • treatment methods for myasthenia gravis include methods that use drugs such as anticholinesterase inhibitors such as mestinon and myterase, corticosteroids, and immunosuppressants such as tacrolimus and cyclosporine, intravenous immunoglobulin injections, blood purification therapy, and extended thymectomy.
  • Treatment for myasthenia gravis is decided by a doctor depending on the symptoms, type, and severity of the disease. For example, in cases with thymoma, extended thymectomy is the first choice of treatment in principle. In cases without thymoma, thymectomy is applicable only to patients who are anti-AChR antibody positive, who are systemic, and who have had the disease for less than five years. Thymectomy is not recommended for patients who are anti-MuSK antibody positive.
  • cholinesterase inhibitors may be used to monitor the progress, but in cases where these are ineffective, steroid drugs are selected. In order to achieve a rapid effect, steroid pulse therapy may be administered intermittently.
  • steroid therapy In cases where symptoms affect all skeletal muscles throughout the body, including the limb and trunk muscles, steroid therapy and immunosuppressants are used in combination.
  • blood purification therapy In refractory cases or acute exacerbations, blood purification therapy, high-dose immunoglobulin therapy, and steroid pulse therapy may be performed.
  • the treatment effect is evaluated according to the MGFA postintervention status indicators and classified as complete remission, pharmacological remission, minor symptoms, improvement, unchanged, worsening, related death, etc.
  • a marker for the treatment, prevention or diagnosis of myasthenia gravis comprising a signature gene of CD8-positive T cells or an expression product thereof.
  • the type of marker is not particularly limited and may be a diagnostic marker, a prognostic marker, a pharmacodynamic marker, a predictive marker, a monitoring marker, etc.
  • the marker can also be used to classify a cell population containing CD8 positive T cells into specific subsets.
  • the CD8-positive T cell signature gene or its expression product is a surrogate marker for evaluating the efficacy of a therapy targeting CD8-positive T cells.
  • the signature gene of CD8-positive T cells or its expression product is a biomarker for selecting whether a treatment targeting CD8-positive T cells is effective.
  • the CD8+ T cell signature gene or its expression product is a surrogate marker for evaluating the efficacy of a therapy targeting early and late CD8+ T cells.
  • the CD8+ T cell signature gene or its expression product is a biomarker for selecting whether a treatment targeting early or late CD8+ T cells is effective.
  • the above markers can be used in combination with known markers for myasthenia gravis, such as autoantibodies (AChR antibodies, MuSK antibodies, etc.).
  • autoantibodies AChR antibodies, MuSK antibodies, etc.
  • compositions for the treatment or prevention of myasthenia gravis, comprising: Provided is a pharmaceutical composition comprising an active ingredient that targets CD8-positive T cells, a signature gene of the cells or its expression product, or a factor that activates CD8-positive T cells, or a molecule whose expression is enhanced in activated CD8-positive T cells.
  • the CD8+ T cells are early activated CD8+ T cells.
  • the CD8+ T cells are late activated CD8+ T cells.
  • the pharmaceutical composition may be combined with another active ingredient, so long as the function of the active ingredient is not impaired.
  • ingredients include ingredients that target CD4-positive T cells, the signature gene or its expression product of the cells, or factors that activate CD4-positive cells, or molecules whose expression is increased in activated CD8-positive T cells, and drugs known as therapeutic agents for myasthenia gravis, such as anticholinesterase inhibitors such as mestinon and mytelase, corticosteroids, and immunosuppressants such as tacrolimus and cyclosporine.
  • the pharmaceutical composition may contain components such as pharma- ceutical acceptable buffers, stabilizers, preservatives and other additives.
  • Pharmaceutically acceptable components are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can select and use, within the scope of their ordinary practice, appropriate components according to the form of the formulation, for example, from those described in specifications such as the 18th Revised Japanese Pharmacopoeia.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • GEMs Gel Beads-in-Emulsion
  • CMOS complementary metal-oxide-semiconductor
  • cDNA preparation and library construction for single-cell gene expression were performed using Chromium Next GEM Single Cell 5' Reagent Kits v2 (10x Genomics).
  • the resulting libraries were quantified using Qubit dsDNA Assay (ThermoFisher Scientific) and TapeStation D1000 ScreenTape (Agilent Technologies). They were then analyzed on a HiSeq platform (Illumina) in a 150 bp paired-end configuration, generating approximately 350M paired-end reads per sample. The sequencing reads were further trimmed to Read1: 26 bp and Read2: 90 bp.
  • NGS data was processed using Cell Ranger (version 6.1.2). Reads were mapped to the human reference genome (GRCh 38) and UMIs were matched to gene and cell barcodes to obtain expression profile matrices. These expression profile matrices were used for analysis using Seurat (version 4.1.1), a package for single-cell RNA sequencing data analysis in the statistical analysis software R (version 4.1.3).
  • the obtained clusters were divided into cells derived from healthy individuals and cells derived from myasthenia gravis patients, and expression pattern analysis was performed on both to identify genes that showed a significant increase in expression in cells from myasthenia gravis patients.
  • the expression profile matrix was corrected using Seurat's PrepSCTFindMarkers function, and expression pattern analysis was performed using the FindMarker function.
  • a Log2-Fold change of 0.25 and a p-value of 0.05 or less were defined as a significant increase in expression.
  • Figure 2 shows the expression levels of the marker genes used for annotation by cluster.
  • the color of the circles in Figure 2 represents the logarithm of the average expression level, with the closer to blue the color, the higher the expression level.
  • the size of the circle indicates the percentage of cells in which the gene is expressed, with a larger circle indicating that the gene is expressed in more cells.
  • p_val is the probability of significance
  • avg_log2FC is the log2 of the expression variation ratio (MG/HC).
  • the following table shows genes whose expression was altered in CD8 positive T cells.
  • p_val is the significance probability
  • avg_log2FC is the log2 of the expression change ratio (MG/HC).

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Abstract

本発明は、検体を解析する方法であって、重症筋無力症に罹患しているか、又は罹患している可能性がある対象由来の検体において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化されているか否かを決定する工程を含む、方法、を提供する。

Description

重症筋無力症患者におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化の解析方法及び診断方法
　本発明は広く、重症筋無力症に罹患しているか、又は罹患している可能性がある対象由来の検体を解析する方法等に関する。
　重症筋無力症は、自己抗体により引き起こされる自己免疫疾患である。代表的な症状は四肢の筋力の低下であり、その原因の一つとして、自分の体の成分に対する抗体（自己抗体）が出現することが挙げられる。神経筋接合部のシナプス後膜に存在する分子、例えばアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）や筋特異的チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）に対して患者体内で作られた自己抗体により神経筋伝達が阻害され、その結果、脳の指令が運動神経から筋肉へうまく伝わらなくなり、筋肉が十分に収縮せず、最終的に筋力が低下する。
　自己抗体の出現が重症筋無力症の主な原因として考えられていたことから、これまでの重症筋無力症の研究は、主に液性免疫に関与するＣＤ４陽性Ｔ細胞が中心となっていた（非特許文献１－３）。
　重症筋無力症の治療としては、ステロイドや免疫抑制剤による治療等があるが、現在は、分子治療標的薬のように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を介してＢ細胞から産生される抗体や、抗体産生するＢ細胞自身、Ｂ細胞活性化のサイトカイン、抗体による障害性を惹起する補体を対象とする治療にシフトしてきている。これらの治療に使用される抗体の例として、エフガルチギモド（抗ＦｃＲｎ抗体）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）、サトラリズマブ（ＩＬ－６レセプター中和抗体）、ラブリズマブ（補体中和抗体）等がある。
　現在の薬物療法・手術療法でも重症筋無力症の根治は不可能であり、難治となる例も少なくない。そのため、重症筋無力症を治療する上での新たな標的の探索が求められている。
　本発明者らは、遺伝子発現解析を使って重症筋無力症患者と健常人の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の比較を行った結果、重症筋無力症患者ではＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化していることを見出した。つまり、細胞性免疫に関与するＣＤ８陽性Ｔ細胞又はその遺伝子シグネチャーは重症筋無力症の新たな治療標的となり得る。
　すなわち、本願は以下の発明を包含する。
［１］
　検体を解析する方法であって、
　重症筋無力症に罹患しているか、又は罹患している可能性がある対象由来の検体において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化されているか否かを決定する工程を含む、方法。
［２］
　活性化の有無が、検体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物の発現量の多寡に基づき決定される、［１］に記載の方法。
［３］
　シグネチャー遺伝子が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞傷害性及び／又は活性化に関する遺伝子である、［２］に記載の方法。
［４］
　シグネチャー遺伝子が、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＣ００４６８７．１、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ１、ＡＤＧＲＧ１、ＡＬ１３８９６３．３、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ６、ＡＲＥＧ、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＡＲＰＣ５Ｌ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ３、ＢＩＮ２、ＢＴＧ１、ＢＴＧ２、ＢＴＮ３Ａ２、ＣＡＬＲ、ＣＡＰＺＢ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＮＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ６、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ７４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＥＢＰＤ、ＣＦＬ１、ＣＩＲ１、ＣＬＩＣ１、ＣＬＩＣ３、ＣＭＣ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴ７、ＣＴＳＷ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＹＢＡ、ＣＹＴＩＰ、ＤＤＩＴ４、ＤＤＸ３Ｙ、ＤＤＸ５、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＢ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＳＰ２、ＤＵＳＰ５、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＦＨＤ２、ＥＩＦ１、ＥＭＬ４、ＥＶＬ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＲＬ６、ＦＧＦＢＰ２、ＦＬＮＡ、ＦＯＳ、ＦＴＨ１、ＧＧＮＢＰ２、ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ７、ＧＳＴＰ１、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＨＣＳＴ、ＨＩＮＴ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＤＬ、ＨＯＰＸ、ＩＤ２、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＬ３２、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ６、ＫＬＲＢ１、ＫＬＲＣ１、ＫＬＲＤ１、ＬＣＰ１、ＬＥＦ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＩＮＣ０２４４６、ＬＭＮＡ、ＬＳＰ１、ＬＴＢ、ＬＹ６Ｅ、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＴ２Ａ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＡＴＰ８、ＭＴ－ＣＯ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＭＴ－ＮＤ５、ＭＴ－ＮＤ６、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＭＹＡＤＭ、ＭＹＬ１２Ａ、ＭＹＬ６、ＮＣＲ３、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＧ７、ＮＲ４Ａ２、ＯＡＺ１、ＰＦＮ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＭＡＩＰ１、ＰＰＤＰＦ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＥＬＩＤ１、ＰＲＦ１、ＰＳＭＥ１、ＰＳＭＥ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＡＣ２、ＲＢＭ３９、ＲＥＬ、ＲＥＬＢ、ＲＧＳ１、ＲＯＲＡ、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ４Ｙ１、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１ＰＲ１、ＳＢＤＳ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＮＲＰＡ１、ＳＯＣＳ３、ＳＰＯＣＫ２、ＳＰＯＮ２、ＳＲＧＮ、ＳＴＫ１７Ａ、ＴＣＦ７、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＴＬＮ１、ＴＭＳＢ１０、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＢＣ２、ＴＲＧＶ１０、ＴＲＧＶ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＸＮＩＰ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＣＰ２、ＶＩＭ、ＷＨＡＭＭ、ＹＰＥＬ５、ＺＥＢ２、ＺＦＰ３６、ＺＦＰ３６Ｌ１及びＺＦＰ３６Ｌ２から成る群から選択される１又は複数の遺伝子である、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］
　シグネチャー遺伝子が、
１）早期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現する遺伝子であって、ＣＸＣＲ４、ＣＤ６９、ＩＦＩＴＭ１、ＩＬ３２、ＣＣＬ４及びＩＦＩＴＭ２から成る群、あるいは
２）後期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現する遺伝子は、ＩＬ３２、ＩＦＩＴＭ２、ＣＸＣＲ４、ＩＦＩＴＭ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＣＤ７４、ＪＵＮＢ及びＴＮＦＡＩＰ３から成る群、
から選択される１又は複数の遺伝子である、［２］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　対象が、重症筋無力症に罹患しており、尚且つＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする処置を受けている、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
　処置前との比較で、活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞が減少している場合に、前記処置が対象の治療に有効であると評価される、［６］に記載の方法。
［８］
　対象が、重症筋無力症に罹患している可能性がある、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
　健常者との比較で、活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞が多い場合に、重症筋無力症に罹患しており、尚且つＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする治療が有効であると評価される、［８］に記載の方法。
［１０］
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物を含む、重症筋無力症の治療、予防又は診断のためのマーカー。
［１１］
　重症筋無力症の治療又は予防のための医薬組成物であって、
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする有効成分を含む、医薬組成物。
［１２］
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞が、早期又は後期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞である、［１１］に記載の医薬組成物。
　従来、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化されているか否かを指標として重症筋無力症を評価する方法は存在していなかったが、本発明により、重症筋無力症の新規解析方法、細胞性免疫に関与するＣＤ８陽性Ｔ細胞を標的とした治療や予防の新規手段の提供が可能となる。
　また、重症筋無力症で活性化するＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化因子および発現が亢進する因子は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を対象とする治療が実施された場合、治療効果を判断するサロゲートマーカーとなる。
　Wanlin Jinらの報告には、健常人と重症筋無力症患者に由来するＰＢＭＣのシングルセル解析を行った結果が示されており、また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞についての言及もある（”Single-cell RNA-Seq reveals transcriptional heterogeneity and immune subtypes associated with disease activity in human myasthenia gravis”, Cell Discovery volume 7, Article number: 85 (2021)）。しかしながら、同報告において示されているのは、健常人と重症筋無力症患者のＰＢＭＣの解析データを合体させて、各細胞集団のキャラクタリゼーションを行った結果であり（例えばＦｉｇ．４ａ，ｂ）、これは健常人と重症筋無力症患者との比較データではなく、また、重症筋無力症患者におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化を示すデータでもない。
図１は、シングルセルＲＮＡ解析にかけた健常人及び重症筋無力症患者由来の検体の細胞全体のクラスターを示す。 図２は、アノテーションに用いた一般的な細胞マーカー遺伝子発現プロファイルを示す。 図３は、各クラスターにおける細胞傷害性に関する遺伝子発現を可視化したバイオリンプロットを示す。 図４は、各クラスターにおける細胞活性化・細胞傷害性に関する遺伝子発現を確認した結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について説明するが、本発明の範囲は以下の実施形態に限定して解釈されない。
（解析方法）
　第一の態様において、検体を解析する方法であって、重症筋無力症に罹患しているか、又は罹患している可能性がある対象由来の検体において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化されているか否かを決定する工程を含む、方法、が提供される。
　重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ　ｇｒａｖｉｓ：ＭＧ）は、自己免疫疾患の一つであり、その症状の例としては、眼瞼下垂、眼球運動障害による複視、四肢の筋力低下、嚥下障害、構音障害等が挙げられる。重症例では呼吸筋麻痺による低換気状態となる。重症筋無力症は、神経筋接合部のシナプス後膜に存在する分子に対して患者体内で自己抗体が作られ、この抗体により神経筋伝達が阻害されると考えられている。
　本明細書で使用する場合、重症筋無力症の原因は、自己免疫反応、例えばアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）に対する抗体が作られてしまうことに限定されず、例えば免疫チェックポイント阻害薬のような薬剤によって発症したものや、抗Ｍｕｓｋ抗体、あるいは抗ＬＲＰ４抗体が上昇しているもの、あるいは、いずれの自己抗体価も明確に上昇していないが、重症筋無力症の発症が認められるもの、ＡＣｈＲが生まれつき少ないような先天性のものも包含する。重症筋無力症は全身性でも局所性、例えば眼筋型でもよい。発症時期や症状の程度も限定されず、重症筋無力症には、成人第Ｉ型（眼筋型）、成人第ＩＩ型（全身型）、成人第ＩＩＩ型（急性激症状）、成人第ＩＶ型（晩期重症型）、成人第Ｖ型（筋萎縮型）、小児期発症型、胸腺腫の合併等のあらゆる分類のものが含まれる。
　重症筋無力症の診断は、公知の手法、例えば検体においてＡＣｈＲ抗体等の公知のマーカーが陽性であることを基準に行うことができる。重症筋無力症の重症度は、ＭＧＦＡ（ＭＧ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）のｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎにおけるＣｌａｓｓ　Ｉ乃至Ｖを指標として分類することができる。Ｃｌａｓｓ　Ｉ以上が重症筋無力症と診断される。
　一実施形態において、重症筋無力症は、重症筋無力症／ランバート・イートン筋無力症候群診療ガイドライン２０２２に記載のような、以下の群から選択される。
・眼筋型ＭＧ　（ｏＭＧ）
・ＡＣｈＲ抗体陽性の非胸腺腫全身型ＭＧ
－早期発症ＭＧ（ｇ－ＥＯＭＧ）　（発症年齢＜５０歳）
－後期発症ＭＧ（ｇ－ＥＯＭＧ）　（発症年齢＞５０歳）
・ＡＣｈＲ抗体陽性の胸腺腫全身型ＭＧ
－胸腺腫関連ＭＧ（ｇ－ＴＡＭＧ）
・ＡＣｈＲ抗体以外の病原性自己抗体陽性全身型ＭＧ
－ＭｕＳＫ抗体陽性ＭＧ（ｇ－ＭｕＳＫＭＧ）
・病原性自己抗体非検出全身型ＭＧ
－抗体陰性ＭＧ（ｇ－ＳＮＭＧ）（ＬＲＰ４抗体陽性ＭＧも含む）
　本明細書で使用する場合、「解析」とは、重症筋無力症に関連するあらゆる解析、例えば重症筋無力症の作用機序（例えば発生、進行、再発等）の解明や、重症筋無力症の診断、治療、予防、予後等に関する、医学的に有用な情報の提供に繋がる解析を意味する。
　解析方法は、その目的に応じて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化されているか否かを決定する工程の前後に適宜必要な工程を含み得る。追加の工程としては、限定することを意図するものではないが、解析前に検体を調製する工程、検体を別の観点で解析する工程、解析工程で得られた活性化に関するデータ、特に健常者との差分に関するデータを更に解析する工程、解析により得られた知見に基づき検体に関して医師等の診断や治療に役立つ情報を提供する工程、例えば当該検体を、重症筋無力症を発症しているか、発症する可能性がある対象の検体であるとして分類する工程等を含む。
　検体は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化を評価することができるものであればどのようなものでもよい。そのような検体の例としては、検体の由来となる対象の血液又はその成分、細胞又は組織の抽出液、あるいは尿、脳脊髄液、気管吸引液、気管支肺胞洗浄液等が挙げられる。血液成分としては全血、血球、血清、血漿等がある。末梢血又は末梢血由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が検体として好ましい。ＰＢＭＣは、密度勾配遠心法、免疫磁気分離法、沈降法等の公知の手段を用いて調製され得る。
　検体は、対象から採取されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、タンパク質及び／又はそれらの組合せなどを含む。検体は、遺伝子の発現レベルの分析を可能にするためのＲＮＡを含むことが好ましい。検体は、ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡを含んでいてもよい。
　検体は、重症筋無力症に罹患しているか、又は罹患している可能性がある対象から採取される。採取の回数は解析の目的に応じて適宜設定することができ、診断の場合は１回でもよいし、また、治療後の予後観察等の目的のために複数回であってもよい。
　検体の由来となる対象はヒトに限定されず、重症筋無力症を発症し得る非ヒト動物、特に哺乳動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、サル等であってもよい。
　対象は公知のマーカー、例えば抗アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）抗体及び／又はＬＤＬ受容体関連タンパク質４（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４：Ｌｒｐ４）抗体や、公知の試験、例えばエドロホニウム（テンシロン）試験、アイスパック試験、反復刺激試験等により、本発明の解析方法の前に重症筋無力症に罹患していると診断されていてもよい。
　対象は、重症筋無力症に罹患していると診断された後、更に重症筋無力症の治療を受けていてもよい。そのような治療には、抗コリンエステラーゼ阻害薬等の公知のもの以外にも、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする処置も含まれる。
　本明細書で使用する場合、「ＣＤ８陽性Ｔ細胞」は、表面上にＣＤ８を発現するＴ細胞又はその集団を意味する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、当業界で一般的に使用されている用語であり、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とも称される。
　検体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化されているか否かの判断は、コントロール、例えば健常者由来の検体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞との比較、あるいは、検体の由来となっている対象自身の過去のものとの比較に基づいて行うことができる。遺伝子の変化を指標とする場合、コントロールにはハウスキーピング遺伝子が含まれる。
　一実施形態において、検体を解析する方法は、検体においてＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化していることを決定する工程を含む。
　重症筋無力症患者のＣＤ８陽性Ｔ細胞では、ある特定の遺伝子やある特定の遺伝子の組み合わせの発現が有意に変化しており、そのような変化を指標として活性化の有無を決定することができる。
　本明細書で使用する場合、「活性化」とは、重症筋無力症に由来するＣＤ８陽性Ｔ細胞の任意の変化を意味する。このような変化は、重症筋無力症患者において見られる、ＣＤ８陽性Ｔ細胞における固有の変化、例えば、重症筋無力症と関連が強い遺伝子や細胞表面マーカー（例えばＣＤ２５）の発現の変化、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞増殖における変化であってもよい。評価される変化は複数でもよく、例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の複数の遺伝子の発現プロファイルが使用され得る。
　重症筋無力症に由来するＣＤ８陽性Ｔ細胞の変化は、コントロールとの比較で、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍又は６～１０倍増加していることが好ましい。
　変化を評価する方法はトランスクリプトーム解析、発現解析、発現変動解析等の公知の解析方法を用いることができる。マイクロアレイ分析、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、免疫組織化学的検査、免疫蛍光法、質量分析、ノーザンブロット、ウエスタンブロット等によって、検体中の核酸やタンパク質の発現のレベルを定性的及び／又は定量的に測定することができる。
　発現変動解析の手法の一つとして、シングルセルＲＮＡ解析がある。シングルセル解析は、例えば次元削減、クラスタリング、アノテーション等の工程を含む。クラスタリングは、類似性に基づいて細胞をグループ化するための手法であり、これにより、類似した特徴や遺伝子発現パターンを持つ細胞の集まり（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の集団とＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団）を分類することができる。また、各クラスターについて、細胞の種類によって特異的に発現する遺伝子(マーカー)の発現量をプロットすることで、各遺伝子の機能や重要性の推定が可能となる。
　一実施形態において、活性化の有無は、検体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物の発現量の多寡に基づき決定される。
　「シグネチャー遺伝子」とは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞との関連で本明細書において使用する場合、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に固有の遺伝子、又は、他の細胞との比較で、ＣＤ８陽性Ｔ細胞において統計学的に有意に発現している遺伝子、を意味する。有意水準は、例えば、Ｐ値が０．０５以下で、尚且つｌｏｇ２ＦＣが０．２５超、０．３０超、０．３５超、０．４０超、０．４５超、０．５０超、０．５５超、０．６０超、０．６５超、０．７０超、０，７５超、０．８０超、０．８５超、０．９０超又は０．９５超であってもよい。シグネチャー遺伝子の発現産物には、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ等の転写産物、タンパク質等の翻訳産物、それらの断片が含まれる。
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子は、シングルセル解析等の公知の手法を用い、健常者と重症筋無力症患者の細胞における遺伝子の差次的発現を評価することにより同定することができる。例えば、シングルセル解析により、遺伝子が発現している細胞の割合を評価し、より多くのＣＤ８陽性Ｔ細胞で発現している遺伝子をシグネチャー遺伝子と決定することができる。
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子は、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＣ００４６８７．１、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ１、ＡＤＧＲＧ１、ＡＬ１３８９６３．３、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ６、ＡＲＥＧ、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＡＲＰＣ５Ｌ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ３、ＢＩＮ２、ＢＴＧ１、ＢＴＧ２、ＢＴＮ３Ａ２、ＣＡＬＲ、ＣＡＰＺＢ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＮＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ６、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ７４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＥＢＰＤ、ＣＦＬ１、ＣＩＲ１、ＣＬＩＣ１、ＣＬＩＣ３、ＣＭＣ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴ７、ＣＴＳＷ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＹＢＡ、ＣＹＴＩＰ、ＤＤＩＴ４、ＤＤＸ３Ｙ、ＤＤＸ５、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＢ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＳＰ２、ＤＵＳＰ５、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＦＨＤ２、ＥＩＦ１、ＥＭＬ４、ＥＶＬ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＲＬ６、ＦＧＦＢＰ２、ＦＬＮＡ、ＦＯＳ、ＦＴＨ１、ＧＧＮＢＰ２、ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ７、ＧＳＴＰ１、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＨＣＳＴ、ＨＩＮＴ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＤＬ、ＨＯＰＸ、ＩＤ２、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＬ３２、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ６、ＫＬＲＢ１、ＫＬＲＣ１、ＫＬＲＤ１、ＬＣＰ１、ＬＥＦ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＩＮＣ０２４４６、ＬＭＮＡ、ＬＳＰ１、ＬＴＢ、ＬＹ６Ｅ、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＴ２Ａ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＡＴＰ８、ＭＴ－ＣＯ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＭＴ－ＮＤ５、ＭＴ－ＮＤ６、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＭＹＡＤＭ、ＭＹＬ１２Ａ、ＭＹＬ６、ＮＣＲ３、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＧ７、ＮＲ４Ａ２、ＯＡＺ１、ＰＦＮ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＭＡＩＰ１、ＰＰＤＰＦ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＥＬＩＤ１、ＰＲＦ１、ＰＳＭＥ１、ＰＳＭＥ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＡＣ２、ＲＢＭ３９、ＲＥＬ、ＲＥＬＢ、ＲＧＳ１、ＲＯＲＡ、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ４Ｙ１、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１ＰＲ１、ＳＢＤＳ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＮＲＰＡ１、ＳＯＣＳ３、ＳＰＯＣＫ２、ＳＰＯＮ２、ＳＲＧＮ、ＳＴＫ１７Ａ、ＴＣＦ７、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＴＬＮ１、ＴＭＳＢ１０、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＢＣ２、ＴＲＧＶ１０、ＴＲＧＶ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＸＮＩＰ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＣＰ２、ＶＩＭ、ＷＨＡＭＭ、ＹＰＥＬ５、ＺＥＢ２、ＺＦＰ３６、ＺＦＰ３６Ｌ１及びＺＦＰ３６Ｌ２から成る群から選択され得る。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子は、ＤＵＳＰ２、ＺＦＰ３６、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＩＬ３２、ＧＺＭＡ、ＡＣＴＢ、ＩＦＩＴＭ２、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＧＺＭＨ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＣＸＣＲ４、ＴＸＮＩＰ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＩＦＩＴＭ１、ＣＤ８Ｂ、ＰＦＮ１、ＣＤ８Ａ、ＨＣＳＴ、ＣＤ７４、ＬＩＮＣ０２４４６、Ｓ１００Ａ６、ＨＬＡ－ＤＰＡ１，ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＪＵＮＢ、ＬＧＡＬＳ１、ＣＹＢＡ、ＨＯＰＸ、ＡＮＸＡ６、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＣＦＬ１、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＮＫＧ７、ＣＤ６３、ＦＧＦＢＰ２、ＦＬＮＡ、ＣＤ３Ｄ、ＣＴＳＷ、Ｓ１００Ａ４、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＰＲＤＭ１、ＤＤＩＴ４、ＵＣＰ２、ＡＬ１３８９６３．３、ＡＣＴＧ１、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＬＳＰ１、ＣＣＮＤ３、ＣＣＬ４、ＣＤ５２、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＣＣＬ５、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＬＩＣ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＲＧＶ２，ＴＲＢＣ２、ＬＣＰ１、ＲＡＣ２、ＤＵＳＰ１、ＥＶＬ、Ｂ２Ｍ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＣＬＩＣ１、ＩＴＧＢ７、ＣＲＩＰ１、ＭＹＬ６、ＡＮＸＡ２、ＣＡＬＲ、ＯＡＺ１、ＰＲＦ１、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＣＤ７、ＡＲＥＧ、ＴＲＧＶ１０、ＰＳＭＥ２、ＣＳＴ７、ＦＣＲＬ６、ＳＰＯＮ２、ＰＳＭＥ１、ＫＬＲＤ１、ＭＴ－ＮＤ６、ＰＴＰＲＣ、ＣＤ３Ｅ、ＭＹＬ１２Ａ、ＣＡＰＺＢ、ＴＹＲＯＢＰ、ＰＲＥＬＩＤ１、ＴＬＮ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＧＳＴＰ１、ＫＬＲＣ１、ＡＤＧＲＧ１、ＭＴ２Ａ、ＩＤ２、ＮＣＲ３、ＢＩＮ２、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＶＩＭ、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＲＰＳ１４、ＤＤＸ３Ｙ、ＧＧＮＢＰ２、ＳＮＲＰＡ１、ＲＰＬ３４、ＲＥＬ、ＹＰＥＬ５、ＲＰＬ３９、ＤＮＡＪＡ１、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＡＲＰＣ５Ｌ、ＲＰＬ３７、ＲＰＳ２７、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＲＰＬＰ０、ＭＹＡＤＭ、ＳＢＤＳ、ＲＰＳ１０、ＣＩＲ１、ＳＰＯＣＫ２、ＲＥＬＢ、ＷＨＡＭＭ、ＩＲＦ１、Ｓ１ＰＲ１、ＳＴＫ１７Ａ、ＣＤ６、ＲＢＭ３９、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＲＰＳ２１、ＫＬＦ６、ＥＭＬ４、ＬＭＮＡ、ＣＤ５、ＢＣＬ３、ＲＰＳ２８、ＢＴＮ３Ａ２、ＩＦＩＴ２、ＪＵＮ、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１７、ＧＩＭＡＰ７、ＥＩＦ１、ＥＦ１Ｇ、ＦＴＨ１、ＭＴ－ＡＴＰ８、ＲＰＳ２９、ＩＬ７Ｒ、ＰＭＡＩＰ１、ＪＵＮＤ、ＮＦＫＢＩＡ、ＲＰＳ４Ｙ１及びＲＰＳ２６から成る群から選択される１又は複数である。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子は、ＤＵＳＰ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＺＦＰ３６、ＪＵＮＢ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＣＸＣＲ４、ＤＵＳＰ１、ＧＺＭＨ、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＦＧＦＢＰ２、ＮＫＧ７、Ｓ１００Ａ４、ＩＦＩＴＭ２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＴＸＮＩＰ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＡＬ１３８９６３．３、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＣＤ８Ａ、ＳＰＯＮ２、ＧＺＭＡ、ＩＬ３２、ＫＬＲＤ１、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＴＲＢＣ２、ＰＦＮ１、Ｓ１００Ａ６、ＣＦＬ１、ＣＴＳＷ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＨＣＳＴ、ＣＤ６９、ＣＣＮＤ３、ＡＮＸＡ６、ＲＰＬ４１、ＩＦＩＴＭ１、ＦＬＮＡ、ＣＣＬ４、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＭＴ－ＮＤ５、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＨＯＰＸ、ＤＤＩＴ４、ＥＦＨＤ２、ＤＮＡＪＢ１、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＣＳＴ７、ＴＭＳＢ１０、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＰＲＤＭ１、ＦＣＲＬ６、ＨＬＡ－Ｃ、ＬＳＰ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＩＴＧＢ２、ＬＹ６Ｅ、ＺＥＢ２、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＤ５２、ＣＡＰＺＢ、ＩＤ２、ＭＹＬ１２Ａ、ＬＣＰ１、ＰＰＤＰＦ、ＳＲＧＮ、ＭＴ２Ａ、ＣＤ３Ｄ、ＢＴＧ２、ＣＭＣ１、ＲＰＬ３６、ＬＥＦ１、ＲＰＬ３８、ＣＤ２７、ＮＦＫＢ１、ＲＰＳ１３、ＲＰＬ１０、ＲＰＬＰ１、ＨＩＮＴ１、ＲＰＬ３４、ＴＣＦ７、ＲＰＬ３７、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２７、ＥＭＬ４、ＣＸＣＲ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ２１、ＳＴＫ１７Ａ、Ｓ１ＰＲ１、ＧＩＭＡＰ４、ＩＬ７Ｒ、ＢＴＮ３Ａ２、ＭＴ－ＡＴＰ８、ＲＰＬ１７、ＦＴＨ１、ＪＵＮＤ、ＬＴＢ、ＲＰＳ２９、ＪＵＮ、ＥＥＦ１Ｇ、ＧＩＭＡＰ７、ＲＰＳ４Ｙ１及びＲＰＳ２６から成る群から選択される１又は複数である。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＤＵＳＰ２、ＺＦＰ３６、ＣＸＣＲ４、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＣＤ６９、ＦＯＳ、ＤＵＳＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＸＮＩＰ、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＤＮＡＪＢ１、ＤＤＩＴ４、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＫＬＦ２、ＳＬＣ２Ａ３、ＩＦＩＴＭ１、ＢＴＧ１、ＮＲ４Ａ２、ＣＤ７４、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＮＤ３、ＡＬ１３８９６３．３、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＩＬ３２、ＣＣＬ４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ５、ＣＹＴＩＰ、ＢＴＧ２、ＧＺＭＨ、ＭＴ－ＮＤ５、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＭＴ－ＣＹＢ、ＳＯＣＳ３、ＣＤ８Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＰＦＮ１、ＩＦＩＴＭ２、ＶＩＭ、ＣＦＬ１、ＭＴ－ＣＯ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＧＺＭＫ、ＤＤＸ５、ＣＲＩＰ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＭＡＰ３Ｋ８、Ｂ２Ｍ、ＡＲＥＧ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＮＲＮＰＤＬ、ＣＭＣ１、ＲＰＬ３４、ＡＣ００４６８７．１、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ１０、ＩＬ７Ｒ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＲＯＲＡ、ＲＰＬ３７、ＦＴＨ１、ＲＰＬ３９、ＰＲＦ１、ＧＩＭＡＰ４、ＢＴＮ３Ａ２、Ｓ１ＰＲ１、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２１、ＣＥＢＰＤ、ＧＩＭＡＰ７、ＲＰＳ２９、ＫＬＲＢ１、ＲＰＳ４Ｙ１及びＲＰＳ２６から成る群から選択される１又は複数である。
　一実施形態において、シグネチャー遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ１、ＡＤＧＲＧ１、ＡＬ１３８９６３．３、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ６、ＡＲＥＧ、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＡＲＰＣ１Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＢＩＮ２、ＢＴＧ１、ＢＴＧ２、ＣＡＬＲ、ＣＡＰＺＢ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＮＤ３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ５２、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ７４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＦＬ１、ＣＬＩＣ１、ＣＬＩＣ３、ＣＭＣ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴ７、ＣＴＳＷ、ＣＸＣＲ４、ＣＹＢＡ、ＣＹＴＩＰ、ＤＤＩＴ４、ＤＤＸ５、ＤＮＡＪＢ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＳＰ２、ＤＵＳＰ５、ＥＦＨＤ２、ＥＶＬ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＲＬ６、ＦＧＦＢＰ２、ＦＬＮＡ、ＦＯＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＨＣＳＴ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＤＬ、ＨＯＰＸ、ＩＤ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＬ３２、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＪＵＮＢ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＬＦ２、ＫＬＲＣ１、ＫＬＲＤ１、ＬＣＰ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＩＮＣ０２４４６、ＬＳＰ１、ＬＹ６Ｅ、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＴ２Ａ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＣＯ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＭＴ－ＮＤ５、ＭＴ－ＮＤ６、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＭＹＬ１２Ａ、ＭＹＬ６、ＮＣＲ３、ＮＫＧ７、ＮＲ４Ａ２、ＯＡＺ１、ＰＦＮ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＤＰＦ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＥＬＩＤ１、ＰＳＭＥ１、ＰＳＭＥ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＡＣ２、ＲＧＳ１、ＲＰＬ４１、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ６、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＯＣＳ３、ＳＰＯＮ２、ＳＲＧＮ、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＴＬＮ１、ＴＭＳＢ１０、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＢＣ２、ＴＲＧＶ１０、ＴＲＧＶ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＸＮＩＰ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＣＰ２、ＶＩＭ、ＺＥＢ２、ＺＦＰ３６及びＺＦＰ３６Ｌ２から成る群から選択される。シグネチャー遺伝子はこれらの遺伝子の複数の組み合わせ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０又は１３１の組み合わせである。
　シグネチャー遺伝子は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化や細胞傷害性に関与するものが好ましい。活性化に関与する遺伝子によりコードされるタンパク質は、一般的に、Ｔ細胞が活性化することでその発現の上昇が知られているものである。それらの活性化タンパク質の内、直接的に細胞傷害性を有するものが細胞傷害性のタンパク質として分類される。
　一実施形態において、活性化に関与する遺伝子はＺＦＰ３６、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＩＬ－３２、ＩＦＩＴＭ２、ＣＸＣＲ４、ＩＦＩＴＭ１、ＣＤ７４、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＪＵＮＢ、ＩＴＧＢ７であり、また、細胞傷害性に関連する遺伝子はＧＺＭＡ、ＧＺＭＨ、ＮＫＧ７、ＣＴＳＷ、ＰＲＦ１である。
　一実施形態において、活性化に関与する遺伝子はＣＸＣＲ４、Ｓ１００Ａ４、ＩＦＩＴＭ２、ＩＬ－３２、ＣＤ６９、ＩＦＩＴＭ１、ＣＣＬ４、ＪＵＮＢ、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＣＤ７４、ＩＴＧＢ２であり、また、細胞傷害性に関連する遺伝子はＧＺＭＨ、ＮＫＧ７、ＧＺＭＡ、ＣＴＳＷである。
　一実施形態において、活性化に関与する遺伝子はＣＸＣＲ４、ＣＤ６９、ＩＦＩＴＭ１、ＩＬ－３２、ＣＣＬ４、ＩＦＩＴＭ２、ＪＵＮＢ、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＦＯＳ、ＫＬＦ２、ＣＤ７４、ＴＮＦＡＩＰ３であり、また、細胞傷害性に関連する遺伝子はＧＺＭＨ、ＧＺＭＫである。
　シグネチャー遺伝子は早期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現する遺伝子であってもよい。ＣＤ６９は、免疫細胞等の早期の活性化を示すマーカーであることは、知られている(Stem Cells, Volume 12, Issue 5, 1994, Pages 456-465, doi : 10.1002/stem.5530120502）。本明細書で使用する場合、ＣＤ６９を発現しているＣＤ８陽性Ｔ細胞を、早期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞とし、ＣＤ６９の発現の消失したＣＤ８陽性Ｔ細胞を、後期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞とする。
　一実施形態において、後期に活性化する遺伝子は、ＤＵＳＰ２、ＺＦＰ３６、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＩＬ３２、ＧＺＭＡ、ＡＣＴＢ、ＩＦＩＴＭ２、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＧＺＭＨ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＣＸＣＲ４、ＴＸＮＩＰ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＩＦＩＴＭ１、ＣＤ８Ｂ、ＰＦＮ１、ＣＤ８Ａ、ＨＣＳＴ、ＣＤ７４、ＬＩＮＣ０２４４６、Ｓ１００Ａ６、ＨＬＡ－ＤＰＡ１，ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＪＵＮＢ、ＬＧＡＬＳ１、ＣＹＢＡ、ＨＯＰＸ、ＡＮＸＡ６、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＣＦＬ１、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＮＫＧ７、ＣＤ６３、ＦＧＦＢＰ２、ＦＬＮＡ、ＣＤ３Ｄ、ＣＴＳＷ、Ｓ１００Ａ４、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＰＲＤＭ１、ＤＤＩＴ４、ＵＣＰ２、ＡＬ１３８９６３．３、ＡＣＴＧ１、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＬＳＰ１、ＣＣＮＤ３、ＣＣＬ４、ＣＤ５２、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＣＣＬ５、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＬＩＣ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＲＧＶ２，ＴＲＢＣ２、ＬＣＰ１、ＲＡＣ２、ＤＵＳＰ１、ＥＶＬ、Ｂ２Ｍ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＣＬＩＣ１、ＩＴＧＢ７、ＣＲＩＰ１、ＭＹＬ６、ＡＮＸＡ２、ＣＡＬＲ、ＯＡＺ１、ＰＲＦ１、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＣＤ７、ＡＲＥＧ、ＴＲＧＶ１０、ＰＳＭＥ２、ＣＳＴ７、ＦＣＲＬ６、ＳＰＯＮ２、ＰＳＭＥ１、ＫＬＲＤ１、ＭＴ－ＮＤ６、ＰＴＰＲＣ、ＣＤ３Ｅ、ＭＹＬ１２Ａ、ＣＡＰＺＢ、ＴＹＲＯＢＰ、ＰＲＥＬＩＤ１、ＴＬＮ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＧＳＴＰ１、ＫＬＲＣ１、ＡＤＧＲＧ１、ＭＴ２Ａ、ＩＤ２、ＮＣＲ３、ＢＩＮ２、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＶＩＭ、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＲＰＳ１４、ＤＤＸ３Ｙ、ＧＧＮＢＰ２、ＳＮＲＰＡ１、ＲＰＬ３４、ＲＥＬ、ＹＰＥＬ５、ＲＰＬ３９、ＤＮＡＪＡ１、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＡＲＰＣ５Ｌ、ＲＰＬ３７、ＲＰＳ２７、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＲＰＬＰ０、ＭＹＡＤＭ、ＳＢＤＳ、ＲＰＳ１０、ＣＩＲ１、ＳＰＯＣＫ２、ＲＥＬＢ、ＷＨＡＭＭ、ＩＲＦ１、Ｓ１ＰＲ１、ＳＴＫ１７Ａ、ＣＤ６、ＲＢＭ３９、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＲＰＳ２１、ＫＬＦ６、ＥＭＬ４、ＬＭＮＡ、ＣＤ５、ＢＣＬ３、ＲＰＳ２８、ＢＴＮ３Ａ２、ＩＦＩＴ２、ＪＵＮ、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１７、ＧＩＭＡＰ７、ＥＩＦ１、ＥＦ１Ｇ、ＦＴＨ１、ＭＴ－ＡＴＰ８、ＲＰＳ２９、ＩＬ７Ｒ、ＰＭＡＩＰ１、ＪＵＮＤ、ＮＦＫＢＩＡ、ＲＰＳ４Ｙ１及びＲＰＳ２６から成る群から選択される１又は複数である。
　一実施形態において、中期に活性化する遺伝子は、ＤＵＳＰ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＺＦＰ３６、ＪＵＮＢ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＣＸＣＲ４、ＤＵＳＰ１、ＧＺＭＨ、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＦＧＦＢＰ２、ＮＫＧ７、Ｓ１００Ａ４、ＩＦＩＴＭ２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＴＸＮＩＰ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＡＬ１３８９６３．３、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＣＤ８Ａ、ＳＰＯＮ２、ＧＺＭＡ、ＩＬ３２、ＫＬＲＤ１、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＴＲＢＣ２、ＰＦＮ１、Ｓ１００Ａ６、ＣＦＬ１、ＣＴＳＷ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＨＣＳＴ、ＣＤ６９、ＣＣＮＤ３、ＡＮＸＡ６、ＲＰＬ４１、ＩＦＩＴＭ１、ＦＬＮＡ、ＣＣＬ４、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＭＴ－ＮＤ５、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＨＯＰＸ、ＤＤＩＴ４、ＥＦＨＤ２、ＤＮＡＪＢ１、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＣＳＴ７、ＴＭＳＢ１０、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＰＲＤＭ１、ＦＣＲＬ６、ＨＬＡ－Ｃ、ＬＳＰ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＩＴＧＢ２、ＬＹ６Ｅ、ＺＥＢ２、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＤ５２、ＣＡＰＺＢ、ＩＤ２、ＭＹＬ１２Ａ、ＬＣＰ１、ＰＰＤＰＦ、ＳＲＧＮ、ＭＴ２Ａ、ＣＤ３Ｄ、ＢＴＧ２、ＣＭＣ１、ＲＰＬ３６、ＬＥＦ１、ＲＰＬ３８、ＣＤ２７、ＮＦＫＢ１、ＲＰＳ１３、ＲＰＬ１０、ＲＰＬＰ１、ＨＩＮＴ１、ＲＰＬ３４、ＴＣＦ７、ＲＰＬ３７、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２７、ＥＭＬ４、ＣＸＣＲ３、ＮＦＫＢＩＡ、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬ３９、ＲＰＳ２１、ＳＴＫ１７Ａ、Ｓ１ＰＲ１、ＧＩＭＡＰ４、ＩＬ７Ｒ、ＢＴＮ３Ａ２、ＭＴ－ＡＴＰ８、ＲＰＬ１７、ＦＴＨ１、ＪＵＮＤ、ＬＴＢ、ＲＰＳ２９、ＪＵＮ、ＥＥＦ１Ｇ、ＧＩＭＡＰ７、ＲＰＳ４Ｙ１及びＲＰＳ２６から成る群から選択される１又は複数である。
　一実施形態において、早期に活性化する遺伝子は、ＪＵＮＢ、ＤＵＳＰ２、ＺＦＰ３６、ＣＸＣＲ４、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＣＤ６９、ＦＯＳ、ＤＵＳＰ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＸＮＩＰ、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＤＮＡＪＢ１、ＤＤＩＴ４、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＫＬＦ２、ＳＬＣ２Ａ３、ＩＦＩＴＭ１、ＢＴＧ１、ＮＲ４Ａ２、ＣＤ７４、ＴＭＳＢ１０、ＣＣＮＤ３、ＡＬ１３８９６３．３、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＩＬ３２、ＣＣＬ４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ５、ＣＹＴＩＰ、ＢＴＧ２、ＧＺＭＨ、ＭＴ－ＮＤ５、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＭＴ－ＣＹＢ、ＳＯＣＳ３、ＣＤ８Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＰＦＮ１、ＩＦＩＴＭ２、ＶＩＭ、ＣＦＬ１、ＭＴ－ＣＯ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＧＺＭＫ、ＤＤＸ５、ＣＲＩＰ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＭＡＰ３Ｋ８、Ｂ２Ｍ、ＡＲＥＧ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＮＲＮＰＤＬ、ＣＭＣ１、ＲＰＬ３４、ＡＣ００４６８７．１、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ１０、ＩＬ７Ｒ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＲＯＲＡ、ＲＰＬ３７、ＦＴＨ１、ＲＰＬ３９、ＰＲＦ１、ＧＩＭＡＰ４、ＢＴＮ３Ａ２、Ｓ１ＰＲ１、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２１、ＣＥＢＰＤ、ＧＩＭＡＰ７、ＲＰＳ２９、ＫＬＲＢ１、ＲＰＳ４Ｙ１及びＲＰＳ２６から成る群から選択される１又は複数である。
　一実施形態において、シグネチャー遺伝子は、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＨ、ＮＫＧ７、ＣＴＳＷ、ＰＲＦ１及びＧＺＭＫから成る群から選択される１又は複数である。
　一実施形態において、早期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現する遺伝子は、ＣＸＣＲ４、ＣＤ６９、ＩＦＩＴＭ１、ＩＬ３２、ＣＣＬ４、ＩＦＩＴＭ２、ＪＵＮＢ、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＦＯＳ、ＫＬＦ２、ＣＤ７４及びＴＮＦＡＩＰ３から成る群から選択される１又は複数である。
　一実施形態において、後期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現する遺伝子は、ＩＬ３２、ＩＦＩＴＭ２、ＣＸＣＲ４、ＩＦＩＴＭ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＣＤ７４、ＪＵＮＢ及びＴＮＦＡＩＰ３から成る群から選択される１又は複数である。
　解析方法は重症筋無力症の診断や治療に使用可能である。診断には、重症筋無力症の種類の決定や、その後治療方針の決定、予後の予測も含まれる。
　一実施形態において、解析方法は、処置前との比較で、活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞が減少している場合に、前記処置が対象の治療に有効であると評価する工程を含む。
　一実施形態において、解析方法は、健常者との比較で、活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞が多い場合に、重症筋無力症に罹患しており、尚且つＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする治療が有効であると評価する工程を含む。
　解析方法は、医師等が重症筋無力症を診断する上での補助的な役割を果たす。このような重症筋無力症の診断に使用される場合、解析方法は公知の診断方法と組み合わせて実施され得る。そのような診断方法には、抗アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）抗体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４（Ｌｒｐ４）抗体等を指標とする血液検査、更には甲状腺機能検査、筋電図検査等が含まれる。
　重症筋無力症の臨床評価には、重症度を評価するＭＧＦＡのｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＱＭＧ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＭＧ）スコア、日常生活の状態を点数化するＭＧ－ＡＤＬ（ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｄａｉｌｙ　ｌｉｖｉｎｇ）スケール等が用いられる。
　重症筋無力症に罹患していると決定された患者に対しては、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子を標的とする治療や、活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的にした治療、その他公知の治療方法が行われてもよい。重症筋無力症の治療方法の例としては、メスチノンやマイテラーゼのような抗コリンエステラーゼ阻害薬、副腎皮質ステロイド、タクロリムスやシクロスポリンのような免疫抑制剤のような薬剤を用いる手法や、免疫グロブリン静注、血液浄化療法、拡大胸腺摘除術等が挙げられる。
　重症筋無力症の治療は、重症筋無力症の症状、種類、重症度等に応じて医師等により適宜決定されるものであり、例えば、胸腺腫合併例の場合、原則、拡大胸腺摘除術が治療の第一選択となる。胸腺腫非合併例における胸腺摘除術の適用されるのは、抗ＡＣｈＲ抗体陽性患者であり、全身性であること、また、罹病期間が５年以内であることが条件となる。胸腺摘除術は抗ＭｕＳＫ抗体陽性患者へは推奨されない。
　眼筋の筋力低下・易疲労性が限局する眼筋型はコリンエステラーゼ阻害薬で経過を見る場合もあるが、非有効例にはステロイド薬が選択される。速効性の観点からステロイドパルス療法を間欠的に施行する場合もある。
　症状が四肢筋、体幹筋など全身の骨格筋に及ぶ全身型は、ステロイド療法薬と免疫抑制剤が併用される。
　難治例や急性増悪時には、血液浄化療法、免疫グロブリン大量療法、ステロイドパルス療法が行われる場合がある。
　治療効果の評価は、ＭＧＦＡ　ｐｏｓｔｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓにおける指標により、完全寛解、薬理学的寛解、軽微症状、改善、不変、増悪、関連死等に分類される。
（マーカー）
　第二の態様において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物を含む、重症筋無力症の治療、予防又は診断のためのマーカー、が提供される。
　マーカーの種類は特に限定されず、診断マーカー、予後マーカー、薬力学マーカー、予測マーカー、モニタリングマーカー等であってもよい。マーカーは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を含む細胞集団を特定のサブセットに分類するのにも使用できる。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を標的とした治療における有効性を評価するためのサロゲートマーカーである。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を標的とした治療が効くかどうか選別するためのバイオマーカーである。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物は、早期・後期のＣＤ８陽性Ｔ細胞を標的とした治療における有効性を評価するためのサロゲートマーカーである。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物は、早期・後期のＣＤ８陽性Ｔ細胞を標的とした治療が効くかどうか選別するためのバイオマーカーである。
　上記マーカーは、重症筋無力症の公知のマーカー、例えば自己抗体（ＡＣｈＲ抗体、ＭｕＳＫ抗体等）と組み合わせて使用することができる。
（医薬組成物）
　第三の実施態様において、重症筋無力症の治療又は予防のための医薬組成物であって、
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする有効成分を含む、医薬組成物、が提供される。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、早期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
　一実施形態において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、後期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
　医薬組成物は、有効成分の機能が損なわれない限り、別の有効成分と組み合わせてもよい。そのような成分として、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ４陽性細胞を活性化する因子を標的とする成分又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子や、重症筋無力症の治療薬として公知の、メスチノンやマイテラーゼのような抗コリンエステラーゼ阻害薬、副腎皮質ステロイド、タクロリムスやシクロスポリンのような免疫抑制剤のような薬剤が挙げられる。
　医薬組成物には薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の添加剤といった成分を含んでもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十八改訂日本薬局方等の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
　以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１．重症筋無力症患者におけるCD8陽性T細胞活性化の同定
　重症筋無力症患者に罹患した患者4人と健常者6人から末梢血単核細胞(以下、PBMCとする)を収集した。これらの患者4人はいずれも、臨床所見で重症筋無力症の病態を示し、尚且つAChR抗体が検出された者である。凍結されたPBMCを37℃のウォーターバスで迅速に解凍し、0.1%BSAを含有したMg/Caフリーの1×D-PBSで3回洗浄した。D-PBS/0.1%BSAで再懸濁をした後、40 μmのセルストレーナーで残留している粒子を除去し、細胞数と生存率を確認し、以下の手順に従いscRNA-seqシークエンシングライブラリーの調整と解析を行った。
　生存率が80-90%であることを確認した約10,000個の細胞について、Chromium Controller (10x Genomics)を使い、逆転写試薬とバーコード付きオリゴヌクレオチドを入ったGel Beadで個々の細胞を単一のoil Emulsionに取り込むことで、GEM (Gel Beads-in -Emulsion)を生成した。一般的に、細胞の65%がGEMに取り込まれる。逆転写反応により、各単一細胞Emulsionに固有のタグをcDNAに標識することができる。cDNA調整と単一細胞遺伝子発現のためのライブラリー構築は、Chromium Next GEM Single Cell 5' Reagent Kits v2 (10x Genomics)を用いて実施した。
　得られたライブラリーは、Qubit dsDNA Assay (ThermoFisher Scientific) と TapeStation D1000 ScreenTape (Agilent Technologies) により定量された。その後、150bpペアエンド構成のHiSeqプラットフォーム(illumina）で解析し、サンプルあたり約350Mペアエンドリードを生成した。このシーケンスリードを更にRead1: 26 bpとRead2: 90 bpにトリミングした。
　各サンプルについて、得られたNGSデータをCell Ranger (バージョン6.1.2)により処理した。ヒトリファレンスゲノム(GRCh 38)に対してリードをマッピングし、さらにUMIを遺伝子および細胞バーコードと対応付けることで、発現プロファイル行列を取得した。これらの発現プロファイル行列は統計解析ソフトR(バージョン4.1.3)のシングルセルRNAシークエンシングデータ解析用パッケージであるSeurat(バージョン4.1.1)による解析に用いた。
　クラスタリングに先立ち、データのクオリティが低い細胞を除外した。検出された遺伝子が200以下、またはミトコンドリア遺伝子の発現量が全体の10%を超える細胞を取り除いた。また解析上重要ではないT細胞レセプター遺伝子を発現プロファイル行列から除外した。選択された細胞について、SeuratのSCTransform関数によりUMIカウントの正規化を行い、また変動の大きい遺伝子を選択した。サンプル間のバッチ差を補正するため、SeuratのFindIntegrationAnchors関数とIntegrateData関数により発現プロファイル行列を処理した。更にSeuratのRunPCA関数により主成分分析を行った。主成分の寄与率を鑑み、第30主成分までをその後の解析の為に保持することとした。細胞のクラスタリングはSeuratのFindCluster関数により行った。各クラスターがいずれの細胞種に属するかは細胞種のマーカー遺伝子として一般的に知られている遺伝子の発現量をクラスター間で比較することにより行った。
　得られたクラスターについて、それぞれ健常人由来と重症筋無力症患者由来の細胞に分け、両者について発現変動解析を行い、重症筋無力症患者の細胞において有意な発現上昇がみられる遺伝子を特定した。SeuratのPrepSCTFindMarkers関数により発現プロファイル行列を補正し、FindMarker関数により発現変動解析を行った。Log2-Fold changeが0.25、p-valueが0.05以下を有意の発現の上昇と定義した。
　クラスタリングとアノテーションの結果を可視化するため、発現プロファイルをUMAPにより低次元化してプロットしたものを図1に示す。CD8陽性T細胞について、大きく3つのクラスターに分かれた。
　アノテーションに用いたマーカー遺伝子のクラスターごとの発現量を図2に示す。図2中の丸の色は発現量平均についてlogを取ったものを表しており、青色に近づくほど、高いことを示している。また、丸の大きさは該当遺伝子が発現している細胞の割合を示しており、大きいほどより多くの細胞で発現していることを示している。
　3つのクラスターに分かれたCD8陽性T細胞について、細胞傷害性に関する遺伝子発現を確認した。結果を図3に示す。図中の横軸は発現量平均についてlogを取ったものを表している。その結果、重症筋無力症患者においてGZMA、GZMH、NKG7、CTSW、PRF1、GZMKの発現上昇が見られ、活性化していることが判明した。
　CD8陽性T細胞の活性化を評価した結果を以下の表に示す。表中のp_valは有意確率、avg_log2FCは発現変動比(MG/HC)についてlog2を取ったものである。重症筋無力症患者においてGZMA、GZMH、NKG7、CTSW、PRF1、GZMKの発現上昇が見られ、活性化していることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以下の表にCD8陽性T細胞において発現が変化している遺伝子を示す。表中のp_valは有意確率、avg_log2FCは発現変動比(MG/HC)についてlog2を取ったものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　各細胞について、細胞活性化・細胞傷害性に関する遺伝子発現を確認した。結果を図4に示す。横軸は発現量平均についてlogを取ったものを表している。その結果、重症筋無力症患者において特定の遺伝子の発現上昇が見られ、活性化していること、つまり、これらの遺伝子が早期・後期のCD8陽性T細胞を標的とした治療における有効性を評価するためのサロゲートマーカーや、早期・後期のCD8陽性T細胞を標的とした治療が効くかどうか選別するためのバイオマーカーの候補となることが判明した。
　上記表の中から、フローサイトメトリー等の手法によりタンパク質レベルを確認することでCD8陽性T細胞の各種マーカー（活性化マーカー、早期活性化マーカー等）の決定を行うことができる。
　現在、重症筋無力症の分子標的薬は液性免疫を標的としたものが主とされているが、上記結果から、細胞性免疫に関与するCD8陽性T細胞が新たな治療標的となる可能性が示された。また、現状CD8陽性T細胞治療におけるサロゲートマーカーは存在しないため、上記遺伝子等は重症筋無力症の診断や治療において有用となる新規のマーカーとなり得る。

Claims (12)

  1. 　検体を解析する方法であって、
    　重症筋無力症に罹患しているか、又は罹患している可能性がある対象由来の検体において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化されているか否かを決定する工程を含む、方法。
  2. 　活性化の有無が、検体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物の発現量の多寡に基づき決定される、請求項１に記載の方法。
  3. 　シグネチャー遺伝子が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞傷害性及び／又は活性化に関する遺伝子である、請求項２に記載の方法。
  4. 　シグネチャー遺伝子が、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＣ００４６８７．１、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ１、ＡＤＧＲＧ１、ＡＬ１３８９６３．３、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ６、ＡＲＥＧ、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＡＲＰＣ５Ｌ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ３、ＢＩＮ２、ＢＴＧ１、ＢＴＧ２、ＢＴＮ３Ａ２、ＣＡＬＲ、ＣＡＰＺＢ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＮＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ６、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ７４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＥＢＰＤ、ＣＦＬ１、ＣＩＲ１、ＣＬＩＣ１、ＣＬＩＣ３、ＣＭＣ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴ７、ＣＴＳＷ、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＹＢＡ、ＣＹＴＩＰ、ＤＤＩＴ４、ＤＤＸ３Ｙ、ＤＤＸ５、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＢ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＳＰ２、ＤＵＳＰ５、ＥＥＦ１Ｇ、ＥＦＨＤ２、ＥＩＦ１、ＥＭＬ４、ＥＶＬ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＲＬ６、ＦＧＦＢＰ２、ＦＬＮＡ、ＦＯＳ、ＦＴＨ１、ＧＧＮＢＰ２、ＧＩＭＡＰ４、ＧＩＭＡＰ７、ＧＳＴＰ１、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＨＣＳＴ、ＨＩＮＴ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＤＬ、ＨＯＰＸ、ＩＤ２、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＬ３２、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ６、ＫＬＲＢ１、ＫＬＲＣ１、ＫＬＲＤ１、ＬＣＰ１、ＬＥＦ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＩＮＣ０２４４６、ＬＭＮＡ、ＬＳＰ１、ＬＴＢ、ＬＹ６Ｅ、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＴ２Ａ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＡＴＰ８、ＭＴ－ＣＯ１、ＭＴ－ＣＹＢ、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＭＴ－ＮＤ５、ＭＴ－ＮＤ６、ＭＴＲＮＲ２Ｌ１２、ＭＹＡＤＭ、ＭＹＬ１２Ａ、ＭＹＬ６、ＮＣＲ３、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＧ７、ＮＲ４Ａ２、ＯＡＺ１、ＰＦＮ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＭＡＩＰ１、ＰＰＤＰＦ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＥＬＩＤ１、ＰＲＦ１、ＰＳＭＥ１、ＰＳＭＥ２、ＰＴＰＲＣ、ＲＡＣ２、ＲＢＭ３９、ＲＥＬ、ＲＥＬＢ、ＲＧＳ１、ＲＯＲＡ、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ４Ｙ１、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１ＰＲ１、ＳＢＤＳ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＮＲＰＡ１、ＳＯＣＳ３、ＳＰＯＣＫ２、ＳＰＯＮ２、ＳＲＧＮ、ＳＴＫ１７Ａ、ＴＣＦ７、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＴＬＮ１、ＴＭＳＢ１０、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＢＣ２、ＴＲＧＶ１０、ＴＲＧＶ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＸＮＩＰ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＣＰ２、ＶＩＭ、ＷＨＡＭＭ、ＹＰＥＬ５、ＺＥＢ２、ＺＦＰ３６、ＺＦＰ３６Ｌ１及びＺＦＰ３６Ｌ２から成る群から選択される１又は複数の遺伝子である、請求項２に記載の方法。
  5. 　シグネチャー遺伝子が、
    １）早期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現する遺伝子であって、ＣＸＣＲ４、ＣＤ６９、ＩＦＩＴＭ１、ＩＬ３２、ＣＣＬ４及びＩＦＩＴＭ２から成る群、あるいは
    ２）後期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現する遺伝子は、ＩＬ３２、ＩＦＩＴＭ２、ＣＸＣＲ４、ＩＦＩＴＭ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＣＤ７４、ＪＵＮＢ及びＴＮＦＡＩＰ３から成る群、
    から選択される１又は複数の遺伝子である、請求項４に記載の方法。
  6. 　対象が、重症筋無力症に罹患しており、尚且つＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする処置を受けている、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　処置前との比較で、活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞が減少している場合に、前記処置が対象の治療に有効であると評価される、請求項６に記載の方法。
  8. 　対象が、重症筋無力症に罹患している可能性がある、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 　健常者との比較で、活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞が多い場合に、重症筋無力症に罹患しており、尚且つＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする治療が有効であると評価される、請求項８に記載の方法。
  10. 　ＣＤ８陽性Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物を含む、重症筋無力症の治療、予防又は診断のためのマーカー。
  11. 　重症筋無力症の治療又は予防のための医薬組成物であって、
    　ＣＤ８陽性Ｔ細胞、当該細胞のシグネチャー遺伝子又はその発現産物、あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する因子、又は活性化したＣＤ８陽性Ｔ細胞において発現が亢進している分子を標的とする有効成分を含む、医薬組成物。
  12. 　ＣＤ８陽性Ｔ細胞が、早期又は後期に活性化しているＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項１１に記載の医薬組成物。
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