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WO2025094848A1 - 細胞保存液及び細胞保存方法 - Google Patents

細胞保存液及び細胞保存方法 Download PDF

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Publication number
WO2025094848A1
WO2025094848A1 PCT/JP2024/038157 JP2024038157W WO2025094848A1 WO 2025094848 A1 WO2025094848 A1 WO 2025094848A1 JP 2024038157 W JP2024038157 W JP 2024038157W WO 2025094848 A1 WO2025094848 A1 WO 2025094848A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
hours
adherent cells
solution
cell preservation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/038157
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕一郎 樋口
洋志 末水
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central Institute For Experimental Medicine And Life Science
Original Assignee
Central Institute For Experimental Medicine And Life Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central Institute For Experimental Medicine And Life Science filed Critical Central Institute For Experimental Medicine And Life Science
Publication of WO2025094848A1 publication Critical patent/WO2025094848A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a cell preservation solution and a cell preservation method that enable long-term refrigerated preservation of adherent cells.
  • PHH primary human hepatocytes
  • Non-Patent Document 1 In order to maintain the characteristics of PHH in vitro for a long period of time, it is important to maintain the cultured cells at as high a density as possible.
  • plateable grade adhered cells
  • suspension grade floating cells
  • Plateable grade PHH can generally be cultured on a surface for more than four weeks and can be used in vitro for long periods of time, making them more useful than suspension grade PHH, which can only be used for about eight hours after thawing.
  • a method for selectively producing plateable grade frozen PHH has not yet been established, and it is said that only about 30% of commercially available frozen PHH is plateable grade.
  • PHH when suspended in a storage solution and kept under refrigerated conditions (4°C, on ice), they can be stored for a short period of time while maintaining their high ability to adhere to culture substrates, but PHH stored in a refrigerator for a long period of time loses their ability to adhere to culture substrates.
  • a storage time of at least 48 to 72 hours, preferably about 96 hours, door-to-door is required, so there is a demand for the development of a cell storage method that allows adhesive cells such as PHH to maintain their high ability to adhere to culture substrates even after long periods of unfrozen storage.
  • Non-patent literature 2 reports that the viability and ability to adhere to collagen I plates of PHHs stored in multiple organ preservation solutions under refrigeration were maintained for up to approximately 24 hours of storage, but decreased significantly with longer storage times.
  • Non-Patent Document 3 reports that PHH was refrigerated in a cell preservation solution of a special composition containing an iron chelating agent, and then heated to alleviate cell death caused by low-temperature stress.
  • the cell preservation solution used in Non-Patent Document 3 has a complex composition and is difficult to reconstitute.
  • Patent Document 1 discloses a method for culturing vascular smooth muscle cells by culturing the cells in a suspension culture medium composition containing deacylated gellan gum or a salt thereof. However, it does not disclose the ability of cells stored in a refrigerated medium composition to attach to a culture substrate, nor does it mention the effects on cells other than vascular smooth muscle cells.
  • Patent Document 2 discloses that good viability can be maintained for a long period of time by storing cells or tissues in a non-frozen state in a liquid composition containing deacylated gellan gum or a salt thereof and an acidic polysaccharide such as alginic acid. However, there is no disclosure about the ability of cells stored in a liquid composition under refrigeration to attach to a culture substrate.
  • the present invention aims to provide a cell preservation liquid and a cell preservation method that enable long-term refrigerated preservation of adherent cells while retaining their ability to adhere to a culture substrate.
  • a further objective of the present invention is to provide a cell culture method that enables two-dimensional culture of adherent cells after long-term refrigerated preservation while retaining the cell characteristics.
  • the inventors conducted extensive research to solve the above problems, and discovered that when adhesive cells were stored for an extended period of time in a cell preservation solution containing a high molecular weight polymer such as deacylated gellan gum or a salt thereof under refrigeration, the cells did not settle to the bottom of the container but remained suspended, and their ability to adhere to the culture substrate in the subsequent two-dimensional culture was significantly improved, which led to the completion of the present invention.
  • a high molecular weight polymer such as deacylated gellan gum or a salt thereof under refrigeration
  • the present invention includes the following.
  • [1] A method for preserving adherent cells, comprising refrigerating and preserving adherent cells in a cell preservation solution containing a high molecular weight polymer in a non-frozen state.
  • [10] A method for culturing adherent cells, comprising refrigerating and storing the adherent cells by the method described in any one of [1] to [9] above, and then two-dimensionally culturing the adherent cells.
  • a cell preservation solution containing a polymer for refrigerated preservation of adherent cells in a non-frozen state [13] A cell preservation solution containing a polymer for refrigerated preservation of adherent cells in a non-frozen state.
  • the present invention enables long-term refrigerated storage of adherent cells while retaining their ability to adhere to a culture substrate.
  • the present invention also enables two-dimensional culture of adherent cells that have been refrigerated for long periods while retaining their cellular characteristics.
  • FIG. 1 is a set of photographs showing the state of cells in UW solution and UW+FP solution 24 hours after the start of refrigerated storage.
  • FIG. 2 shows the viable cell recovery (A) and viability (B) of cells refrigerated for 24, 48, 72, or 96 hours in UW or UW+FP solution.
  • FIG. 3 shows the plating efficiency (plating index) 24 hours after plating of cells that had been refrigerated in UW solution or UW+FP solution for 24 hours, 48 hours, 72 hours, or 96 hours.
  • Figure 4 shows a phase contrast image (B) of cells refrigerated for 24, 48, 72, or 96 hours in UW or UW+FP solution 24 hours after seeding on a plate.
  • phase contrast image (A) of freshly isolated HepaSH cells from humanized liver is also shown.
  • the white bar at the bottom right of each photograph is a scale bar of 200 ⁇ m.
  • FIG. 5 shows the ATP amount (A) in cells refrigerated for 24 hours in UW solution and UW+FP solution, ROS activity (B) indicated by the mean fluorescence intensity derived from DCFH-DA, and LDH activity (C) in the medium 4 hours after seeding on a plate.
  • Figure 6 shows phase contrast images of cells seeded on a plate on the first, third, fifth, and seventh day of maintenance culture after refrigerated storage in UW+FP solution for 72 hours. For comparison, phase contrast images of freshly isolated HepaSH cells from humanized liver are also shown.
  • the white bar at the bottom right of each photograph is a scale bar of 200 ⁇ m. 7 shows the drug metabolizing enzyme activity in cells refrigerated for 72 hours in UW+FP solution, seeded on a plate, and maintained in culture for 1 (A), 4 (B), and 8 (C) days.
  • 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, and 3A4/5 represent phenacetin O-deethylation activity by CYP1A2, diclofenac 4'-hydroxylation activity by CYP2C9, omeprazole 5'-hydroxylation activity by CYP2C19, metoprolol O-demethylation activity by CYP2D6, and midazolam 1'-hydroxylation activity by CYP3A4/5, respectively.
  • 8 is a set of photographs showing the results of immunostaining of the liver 5 weeks after transplantation of HepaSH cells refrigerated for 72 hours in UW+FP solution into the liver of a TK-NOG-hIL6 mouse after induction of liver damage.
  • FIG. 9A shows the results of flow cytometry analysis of cells isolated from the liver 6 weeks after transplantation of HepaSH cells refrigerated for 72 hours in UW+FP solution into the liver of a TK-NOG-hIL6 mouse after induction of liver damage, and B shows a photograph showing the state of maintenance culture of the reisolated HepaSH cells after seeding them on a plate.
  • the white bar at the bottom right of the photograph in FIG. 9B is a 200 ⁇ m scale bar.
  • FIG. 10 shows the fixation efficiency 24 hours after seeding onto plates of cells that had been refrigerated for 24 or 96 hours in UW solution, UW+FP solution, UW+Def solution, or UW+FP&Def solution.
  • 11 shows phase contrast images of cells refrigerated for 24 or 96 hours in UW solution, UW+FP solution, UW+Def solution, or UW+FP&Def solution, taken 24 hours after seeding onto a plate.
  • the white bar at the bottom right of each image is a scale bar of 200 ⁇ m.
  • FIG. 12 shows the results of a permeation test of a fluorescent substance added to the medium after cells that had been refrigerated for 96 hours in UW solution, UW+FP solution, or UW+FP&Def solution were maintained in a transwell for 7 days.
  • 13 is a photograph showing a phase contrast image of cells on the 7th day of plate culture after refrigerated storage for 96 hours in UW solution (B), UW+FP solution (C), or UW+FP&Def solution (D).
  • B UW solution
  • C UW+FP solution
  • D UW+FP&Def solution
  • FIG. 14 is a photograph showing phase contrast images of cells that were refrigerated for 72 hours in UW solution or UW+FP solution and then pre-warmed or cells that were not pre-warmed (control) seeded onto a collagen I-coated 24-well plate 24 hours later.
  • 15 shows the viable cell recovery rate (A), viability (B), ROS activity (C), and fixation efficiency (D) of cells that were pre-warmed or not pre-warmed after refrigerated storage in UW solution or UW+FP solution for 72 hours. Open bars: no pre-warming, shaded bars: pre-warming.
  • FIG. 16 shows the fixation efficiency in cells that were pre-warmed or not pre-warmed (control) after refrigerated storage for 96 hours in UW+FP solution (control) or UW+FP solution containing Def (UW+FP&Def solution).
  • Figure 17 is a photograph showing phase contrast images of cells that were refrigerated for 96 hours in UW+FP solution (control) or UW+FP solution with Def added (UW+FP&Def solution), and then pre-warmed or not pre-warmed, seeded onto a plate 24 hours later.
  • the present invention provides a cell preservation solution containing a polymeric polymer.
  • the present invention also provides a method for preserving adherent cells, which comprises preserving cells, particularly adherent cells, in a non-frozen state in the presence of a polymeric polymer, more specifically in a cell preservation solution containing a polymeric polymer.
  • the present invention also provides a method for culturing adherent cells, which comprises two-dimensionally culturing adherent cells preserved according to such a preservation method.
  • the present invention relates to a method for preserving adherent cells, which comprises refrigerating and preserving adherent cells in a cell preservation solution containing a high molecular weight polymer in a non-frozen state.
  • the term "cell preservation solution” refers to a liquid composition suitable for stably preserving cells while maintaining their viability.
  • the cell preservation solution of the present invention is different from a liquid medium suitable for cell growth.
  • the "cell preservation solution” of the present invention may be a cell preservation solution for non-frozen storage or refrigerated storage.
  • the “cell preservation solution” of the present invention is not a cell preservation solution for frozen storage.
  • the “cell preservation solution” of the present invention contains an aqueous solvent and a polymer.
  • the "cell preservation solution” of the present invention may be prepared based on a commercially available or existing cell preservation solution or organ preservation solution, or may be newly prepared.
  • the "cell preservation solution” of the present invention may be prepared using Belzer UW® cold preservation solution (UW solution) for non-cryopreservation as a base.
  • the composition of Belzer UW® cold storage solution is as follows: hydroxyethyl starch (Pentafraction) 50 g/L, lactobionic acid (as lactone) 35.83 g/L, potassium dihydrogen phosphate 3.4 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 1.23 g/L, raffinose pentahydrate 17.83 g/L, adenosine 1.34 g/L, allopurinol 0.136 g/L, total glutathione 0.922 g/L, potassium hydroxide 5.61 g/L, sodium hydroxide/hydrochloric acid (added to adjust pH to 7.4 at 20° C.), and water.
  • a solution having the composition of Belzer UW® cold preservation solution (UW solution) or a solution containing the same and also containing a high molecular weight polymer can be used as the cell preservation solution in the present invention.
  • the term "high molecular weight polymer” refers to a polymer having a weight average molecular weight of 10,000 or more.
  • the molecular weight of the high molecular weight polymer can be determined, for example, by gel permeation chromatography (GPC) in terms of pullulan.
  • GPC gel permeation chromatography
  • Examples of the high molecular weight polymer used in the present invention include, but are not limited to, polysaccharides.
  • the polysaccharide used as the high molecular weight polymer of the present invention may be an acidic polysaccharide having an anionic functional group.
  • examples of the high molecular weight polymer include, but are not limited to, those composed of one or more selected from the group consisting of deacylated gellan gum, gellan gum, hyaluronic acid, rhamsan gum, diutan gum, xanthan gum, carrageenan, xanthan gum, hexuronic acid, fucoidan, pectin, pectic acid, pectinic acid, alginic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, and rhamnan sulfate, and salts thereof.
  • the "salt" with respect to the polymer may be, for example, a salt of an alkali metal such as lithium, sodium, or potassium, a salt of an alkaline earth metal such as calcium, barium, or magnesium, a salt of aluminum, zinc, copper, or iron, an ammonium salt, a salt with an organic amine, or a salt with an amino acid, but is not limited thereto.
  • the polymer of the present invention comprises deacylated gellan gum or a salt thereof.
  • the cell preservation solution of the present invention comprises only deacylated gellan gum or a salt thereof as the polymer.
  • the cell preservation solution of the present invention contains, as a high molecular weight polymer, an acidic polysaccharide (e.g., alginic acid, pectin, or pectinic acid) or a salt thereof that maintains a random coil state in a divalent metal cation medium and can be crosslinked via a divalent metal ion in addition to deacylated gellan gum or a salt thereof, it may further contain a divalent metal cation such as calcium ion.
  • the deacylated gellan gum or a salt thereof may be phosphorylated.
  • the weight average molecular weight of the deacylated gellan gum or a salt thereof may be preferably 10,000 to 50,000,000, more preferably 1,000,000 to 10,000,000.
  • the deacylated gellan gum or a salt thereof a commercially available product may be used.
  • the Polymer FP series manufactured by Nissan Chemical Industries, Ltd. for example, FP001
  • FP001 solution included as a component of FCeM® Preparation Kit can be used as the high molecular weight polymer reagent.
  • "KELCOGEL (registered trademark of CP Kelco) CG-LA” manufactured by Sansho Co., Ltd. may be used as the deacylated gellan gum or a salt thereof.
  • the cell preservation solution containing the polymer of the present invention may contain the polymer, for example, deacylated gellan gum or a salt thereof, at a concentration of 0.001 to 1% (W/V), preferably 0.005 to 0.3% (W/V), more preferably 0.01 to 0.3% (W/V), for example, 0.01 to 0.03% (W/V) or 0.015 to 0.03% (W/V).
  • the concentration of deacylated gellan gum or a salt thereof can be expressed in terms of the free deacylated gellan gum.
  • % (W/V) means weight/volume %.
  • adhesive cells refer to cells that can be maintained in a state of adhering (attaching) to a culture substrate.
  • suspension cells refer to cells that cannot adhere (attach) to a culture substrate. Suspension cells gradually lose their function when cultured in a liquid medium, so it is difficult to maintain and culture them for a long period of time. Maintenance culture means culturing cells while maintaining their morphology and function. Adherent cells can be successfully used in two-dimensional culture and three-dimensional culture.
  • the adherent cells used in the present invention may be derived from any organ or tissue, for example, but not limited to, hepatocytes (i.e., adherent hepatocytes).
  • the adherent cells may be any animal cells, for example, mammalian cells such as primate cells, canine cells, feline cells, etc.
  • the adherent cells may be human cells or non-human animal cells, for example, non-human mammalian cells (non-human primate cells).
  • the adherent cells may be human hepatocytes (i.e., human adherent hepatocytes).
  • the adhesive cells used in the present invention are preferably, but not limited to, primary cells.
  • the adhesive cells used in the present invention may be immortalized cells or may not be immortalized cells.
  • the adhesive cells used in the present invention may be cells induced to differentiate from stem cells (e.g., iPS cells, mesenchymal stem cells, etc.).
  • stem cells e.g., iPS cells, mesenchymal stem cells, etc.
  • primary cells refers to cells collected or isolated from living tissue that can only proliferate (divide) a finite number of times.
  • primary cells includes not only cells collected or isolated from natural living tissue, but also cells isolated from tissues or organs that have been reconstructed by transplanting primary cells into the body (e.g., into the liver after induction of liver damage) of non-human animals that lack or have a reduced immune response to humans, such as immunodeficient animals or immunotolerant animals.
  • Non-human animals with deficient or reduced immune responses to humans that are used to reconstruct tissues or organs from primary cells include, but are not limited to, non-human vertebrates with deficient or reduced immune responses to humans described in the specification of International Publication WO2020/122178, such as TK-NOG-hIL6 mice (hyperimmunodeficient mice in which a non-human animal human thymidine kinase gene and a human IL-6 gene have been introduced in an expressible manner into NOG mice derived from NOD/SCID mice in which the IL2 receptor ⁇ -chain gene has been knocked out).
  • TK-NOG-hIL6 mice hyperimmunodeficient mice in which a non-human animal human thymidine kinase gene and a human IL-6 gene have been introduced in an expressible manner into NOG mice derived from NOD/SCID mice in which the IL2 receptor ⁇ -chain gene has been knocked out.
  • the concentration of the adherent cells in the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer during preservation may be any cell concentration, but in one embodiment, the concentration is preferably 1x10 to 1x10 cells/mL, more preferably 5x10 to 7x10 cells /mL, for example, 1x10 cells/mL.
  • the adherent cells are preserved in a cell preservation solution containing the above-mentioned polymer, and preferably refrigerated in a non-frozen state.
  • refrigerated storage means storage under temperature conditions of above 0°C to 10°C, typically 2 to 5°C, for example 4°C.
  • adherent cells can be preserved in a non-frozen state (e.g., refrigerated) for a long period of time in a cell preservation solution containing a high molecular weight polymer.
  • the time for which adherent cells are preserved in a non-frozen state in a cell preservation solution containing a high molecular weight polymer according to the present invention is not limited to the following, and may be up to 100 hours, for example up to 96 hours, or up to 72 hours.
  • the time for preserving adherent cells in a non-frozen state in a cell preservation solution containing a high molecular weight polymer may be 1 hour or more, typically 24 hours or more, preferably 40 hours or more, for example, 48 hours or more, 70 hours or more, or 72 hours or more, or 1 to 100 hours, 24 to 100 hours, 40 to 100 hours, 48 to 100 hours, 70 to 100 hours, 72 to 100 hours, 1 to 96 hours, 24 to 96 hours, 40 to 96 hours, 48 to 96 hours, 70 to 96 hours, 72 to 96 hours, 72 to 100 hours, or 24 to 72 hours.
  • the adherent cells are preferably in a suspended state, in which case the adherent cells can be refrigerated and preserved in a suspended state.
  • the preservation effect is enhanced by the cells remaining suspended in the preservation solution without settling, thereby reducing ischemic stress.
  • the adherent cells are stored in a non-frozen state (e.g., refrigerated) in a cell preservation solution containing the above-mentioned high molecular weight polymer, allowing the cells to be stably preserved without compromising their ability to attach to the culture substrate.
  • the "ability to adhere” of adherent cells to a culture substrate means the ability of the adherent cells to attach to a culture substrate, reach a confluent state, and maintain the confluent state when the adherent cells are seeded on the culture substrate and cultured two-dimensionally.
  • a "confluent state” means a state in which the seeded adherent cells occupy 80% or more of the surface area of the culture surface of the culture substrate (confluency of 80% or more).
  • “adhesion” means that the cells attach to the culture substrate in a state in which they can be cultured.
  • the adherent cells stored in a non-frozen state under refrigeration in the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer retain their ability to adhere to a culture substrate, and therefore can be suitably used for solid-phase culture on a culture substrate, particularly two-dimensional culture (also called monolayer culture), after refrigeration storage in the cell preservation solution. Therefore, the method for preserving adherent cells of the present invention can be a method for preserving adherent cells in a non-frozen state under refrigeration in the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer while retaining their ability to adhere to a culture substrate in two-dimensional culture.
  • the method for preserving adherent cells of the present invention can be a method for preserving adherent cells to be subjected to two-dimensional culture (e.g., plate culture) after refrigeration storage in a non-frozen state in the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer.
  • two-dimensional culture e.g., plate culture
  • PHH primary hepatocytes
  • a conventional cell preservation solution When primary hepatocytes (PHH) are suspended in a conventional cell preservation solution and placed under refrigerated conditions (4°C, on ice), they can be preserved for a short time while maintaining their high ability to adhere to the culture substrate.
  • the ability of PHH to adhere to the culture substrate decreases, and the cells become in a state where there are gaps between the cells (non-confluent state).
  • PHH cultured in a state where there are gaps between the cells (non-confluent state) changes cell morphology and loses the characteristics of hepatocytes (drug metabolism enzyme activity, etc.).
  • hepatocytes and other adhesive cells can retain their ability to adhere to the culture substrate, and as a result, other cell characteristics of the adhesive cells can also be maintained.
  • the cell morphology is maintained in the adhesive cells refrigerated in the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer.
  • the enzyme activity specific to the cells is maintained in the adhesive cells refrigerated in the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer.
  • drug metabolizing enzyme activity examples include, but are not limited to, cytochrome P450 enzyme activities such as phenacetin O-deethylation activity by CYP1A2, diclofenac 4'-hydroxylation activity by CYP2C9, omeprazole 5'-hydroxylation activity by CYP2C19, metoprolol O-demethylation activity by CYP2D6, and midazolam 1'-hydroxylation activity by CYP3A4/5.
  • cytochrome P450 enzyme activities such as phenacetin O-deethylation activity by CYP1A2, diclofenac 4'-hydroxylation activity by CYP2C9, omeprazole 5'-hydroxylation activity by CYP2C19, metoprolol O-demethylation activity by CYP2D6, and midazolam 1'-hydroxylation activity by CYP3A4/5.
  • the adhesive cells refrigerated and stored in the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer maintain a healthier state as shown by, for example, an increase in the amount of ATP in the cells, and show suppression of an increase in ROS activity indicating ischemic stress.
  • Adherent cells refrigerated in a cell preservation solution containing the above-mentioned polymer show increased adhesion efficiency (plating index) on the culture substrate on which they are seeded after refrigerated storage. It is believed that refrigerating the adherent cells in a cell preservation solution containing the above-mentioned polymer significantly reduces ischemic stress on the adherent cells, which also leads to the above-mentioned effects.
  • an iron chelating agent may be further added to the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer.
  • a cell preservation solution further containing an iron chelating agent in addition to the above-mentioned polymer can be used.
  • the iron chelating agent may include, but is not limited to, deferoxamine and/or ferrostatin.
  • the iron chelating agent may be added to the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer at a concentration of preferably 10 ⁇ M to 5 mM, for example, 100 ⁇ M to 1 mM, or 300 ⁇ M to 700 ⁇ M, but is not limited to these ranges.
  • the adherent cells refrigerated and stored according to the above-mentioned method for preserving adherent cells retain a high ability to adhere to a culture substrate, and therefore can be suitably used for two-dimensional culture.
  • the present invention also provides a method for culturing adherent cells, which includes refrigerating and preserving the adherent cells according to the above-mentioned method for preserving adherent cells in a cell preservation solution containing the above-mentioned polymer, and then two-dimensionally culturing the adherent cells.
  • Such a method for culturing adherent cells may include refrigerating and preserving the adherent cells using a method for preserving adherent cells, seeding the adherent cells on a culture substrate, and performing two-dimensional culture.
  • the culture substrate means a solid-phase material or substance to which cells can adhere during culture and function as a scaffold.
  • the culture substrate may be, but is not limited to, a culture plate such as a multi-well plate, a dish, a flask, a bottle, a slide glass, a cover glass, a film, a membrane, a porous carrier, a hollow fiber, a fiber, or the like.
  • the culture substrate may be made of any cell scaffold material, but is not limited to, a plastic such as glass, polystyrene, polyethylene terephthalate, polysulfone, polyethersulfone, polycarbonate, or the like, a metal such as silver or gold, a metal oxide such as indium-tin oxide, or a ceramic.
  • the culture substrate may also have a surface (culture surface) coated with a scaffold material such as collagen, elastin, fibronectin, vitronectin, laminin, gelatin, or the like.
  • the adherent cells preserved in the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer can be seeded on a collagen-coated culture substrate and cultured two-dimensionally.
  • collagen used for coating include, but are not limited to, collagen I, collagen nanofiber, etc.
  • Two-dimensional culture is a monolayer culture on a culture substrate (solid phase).
  • the two-dimensional culture is called a plate culture.
  • Two-dimensional culture on a culture substrate of adherent cells stored refrigerated in a cell preservation solution may be a plate culture.
  • Two-dimensional culture of adherent cells may be performed based on normal culture conditions for two-dimensional culture.
  • Two-dimensional culture is preferably performed under heated conditions.
  • two-dimensional culture can be performed preferably at 30 to 40°C, more preferably at 35 to 40°C, even more preferably at 35 to 38°C, typically at 37°C.
  • two-dimensional culture can be performed for, for example, 1 hour to 6 months, preferably 10 hours to 3 months, or 20 hours to 2 weeks.
  • the adherent cells refrigerated in the cell preservation solution containing the polymer may be subjected to a heating treatment and then subjected to two-dimensional culture.
  • the heating treatment may be any heating treatment capable of reducing low-temperature stress of the cells.
  • the heating treatment can be performed by suspending the adherent cells refrigerated in the cell preservation solution containing the polymer in a liquid medium such as a seeding medium, and then incubating the cells at preferably 30 to 40°C, more preferably 35 to 40°C, even more preferably 35 to 38°C, typically 37°C, for 20 to 60 minutes, for example 30 to 60 minutes.
  • the adherent cells refrigerated and then subjected to a heating treatment and then subjected to two-dimensional culture By subjecting the adherent cells refrigerated and then subjected to a heating treatment and then subjected to two-dimensional culture, the low-temperature stress of the adherent cells during refrigerated storage can be reduced and the plating efficiency (plating index) can be improved.
  • the present invention also provides a cell preservation solution containing a high molecular weight polymer as described above, which is preferably used in the cell preservation method and cell culture method of the present invention.
  • the cell preservation solution containing the high molecular weight polymer of the present invention is suitable for preserving cells, particularly adherent cells, in a non-frozen state for a long period of time (e.g., refrigerated storage).
  • the cell preservation solution containing the high molecular weight polymer of the present invention may be for preserving adherent cells in a non-frozen state for up to 100 hours, for example up to 96 hours, or up to 72 hours, refrigerated storage.
  • the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer of the present invention may be for refrigerating and preserving adherent cells in a non-frozen state for 1 hour or more, typically 24 hours or more, preferably 40 hours or more, for example, 48 hours or more, 70 hours or more, or 72 hours or more, or 1 to 100 hours, 24 to 100 hours, 40 to 100 hours, 48 to 100 hours, 70 to 100 hours, 72 to 100 hours, 1 to 96 hours, 24 to 96 hours, 40 to 96 hours, 48 to 96 hours, 70 to 96 hours, 72 to 96 hours, 72 to 100 hours, or 24 to 72 hours.
  • the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer of the present invention may also be for refrigerating and preserving adherent cells while maintaining their ability to adhere to a culture substrate in two-dimensional culture.
  • the cell preservation solution containing the above-mentioned polymer of the present invention may be for preserving adherent cells to be subjected to two-dimensional culture after long-term refrigerated storage in a non-frozen state.
  • the cell preservation solution containing the polymer of the present invention can be used to maintain the ability of adherent cells to adhere to a culture substrate during refrigerated storage and to improve the preservation of adherent cells during refrigerated storage.
  • the cell preservation solution containing the polymer of the present invention is particularly suitable for refrigerated storage of hepatocytes, including human hepatocytes.
  • Example 1 Preparation of a cell preservation solution containing a high molecular weight polymer and preservation of cells in the preservation solution FCeM® Preparation Kit (Nissan Chemical, product code 385-07981) containing high molecular weight polymer FP001 solution as a component was used to prepare a cell preservation solution.
  • High molecular weight polymer FP001 solution contains deacylated gellan gum.
  • Belzer UW® cold preservation solution Preservation Solutions, Inc.; purchased from Astellas Pharma; product code 01544782; hereinafter also referred to as UW solution
  • UW solution was used as the base of the cell preservation solution.
  • FP001 solution was added to UW solution and mixed to prepare a cell preservation solution UW+FP solution (final concentration of high molecular weight polymer: 0.02% (W/V)).
  • the prepared UW+FP solution was used for cell preservation without dilution as described below.
  • HepaSH cells are cells isolated from humanized livers reconstructed by transplanting primary human hepatocytes (PHH) into the livers of hyperimmunodeficient TK-NOG-hIL6 mice (Uehara et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 663 (2023) 132-141., International Publication WO2020/122178) after induction of liver damage.
  • PHL primary human hepatocytes
  • TK-NOG-hIL6 mice Uehara et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 663 (2023) 132-141., International Publication WO2020/122178
  • HepaSH cells were added to UW solution or UW+FP solution to prepare a cell suspension with a concentration of 1x107 cells/mL, and then stored (refrigerated) at 4°C for 96 hours in a 15mL centrifuge tube (Greiner Bio-One) as a storage container.
  • Figure 1 shows the state of cells in the storage solution 24 hours after the start of storage. Cells suspended in UW solution precipitated, but cells suspended in UW+FP solution did not precipitate even after 24 hours of storage and remained floating.
  • the cells in the UW solution or the UW+FP solution were sampled every 24 hours during the 96-hour storage period, and the ability of the cells to attach to the scaffold after storage was tested.
  • the cell samples were suspended in a seeding medium (William's E medium + 10% fetal bovine serum, 100 U /mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 5 mg/mL insulin) at a concentration of 1x106 cells/mL, seeded at 0.5 mL/well on a collagen I-coated 24-well plate (Corning; product code 356408), and cultured overnight in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ).
  • a seeding medium (William's E medium + 10% fetal bovine serum, 100 U /mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 5 mg/mL insulin) at a concentration of 1x106 cells/mL, seeded at 0.5 mL/well on a collagen I-coated 24-well
  • the medium was replaced with a seeding medium containing the cell nucleus staining fluorescent dye Hoechst 33342 (Dojindo Science Institute, product code H342), and after 30 minutes of incubation and staining, phase contrast images were taken using EVOS cell imaging systems (Thermo Fisher Scientific) to measure the average number of nuclei per fixed area (within a 200 ⁇ m grid).
  • EVOS cell imaging systems Thermo Fisher Scientific
  • Example 2 Reduction of ischemic stress in cells preserved in a high molecular weight polymer-containing preservation solution HepaSH cells (30 specimens) were suspended in UW solution or UW+FP solution at a concentration of 1 x 107 cells/mL in the same manner as in Example 1, and preserved for 24 hours at 4°C. The number of viable cells after preservation at 4°C for 24 hours was counted.
  • the amount of ATP per 1000 cells was then determined for cells stored at 4°C for 24 hours using a CellTiter- Glo® 2.0 Cell Viability Assay (Promega) and measuring luminescence with an EnSpire multimode plate reader (PerkinElmer). The results are shown in FIG. 5A. Compared to UW solution, cells stored in UW+FP solution showed statistically significantly higher ATP levels. During the process of cell death, the amount of ATP in the cells decreases. This result shows that storage in the presence of a high molecular weight polymer keeps cells in a healthier state even after long storage times.
  • ROS activity which is an indicator of ischemic stress in cells after storage at 4°C
  • ROS activity was measured using a total ROS detection kit (Dojindo Institute, product code R252) for cells stored at 4°C for 24 hours.
  • the cells stored at 4°C for 24 hours were stained with anti-HLA antibody (BD, product code 555555) and the Highly Sensitive DCFH-DA dye included in the kit according to the kit's instruction manual, and then suspended in loading buffer (Loading buffer; 1x) supplemented with propidium iodide (PI).
  • BD Fluorescence X
  • PI propidium iodide
  • the mean fluorescence intensity (FITC mean) derived from DCFH-DA in a PI-negative (indicating viable cells) and HLA-positive (indicating human hepatocytes) cell population was calculated and compared between UW solution and UW+FP solution. The results are shown in Figure 5B.
  • the FITC mean was statistically significantly higher in cells preserved in UW solution compared to cells preserved in UW+FP solution. In this assay, the higher the amount of ROS accumulated in the cells, the higher the FITC mean. That is, the amount of ROS accumulated in the cells preserved in UW solution increased, indicating enhanced ischemic stress. This result indicates that preservation in the presence of a high molecular weight polymer reduces ischemic stress in the cells.
  • the cells stored at 4°C for 24 hours were suspended in the above-mentioned seeding medium, seeded on a collagen I-coated 24-well plate, and cultured for 4 hours, after which the culture supernatant was collected.
  • Lactate dehydrogenase (LDH) activity in the collected culture supernatant was measured as an indicator of cell death using a CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay (Promega, product code G7890) according to the manufacturer's instructions.
  • Fluorescence was measured using a plate reader Infinite F200F Pro (TECAN). The fluorescence intensity measured for the culture supernatant was standardized against the measured value in unused seeding medium (control medium). The results are shown in Figure 5C.
  • LDH activity was statistically significantly higher in cells stored in UW solution than in cells stored in UW+FP solution.
  • cell death is enhanced, LDH leaks from within the cells into the medium, increasing LDH activity in the culture supernatant.
  • cell death was enhanced after seeding. It is believed that when stored in UW solution, cell death was enhanced after seeding due to enhanced ischemic stress. This result indicates that storage in the presence of a high molecular weight polymer can reduce cell death after seeding on a culture substrate due to enhanced ischemic stress.
  • Example 3 Maintenance of cell characteristics after storage in cell preservation solution HepaSH cells (4 specimens) were suspended in UW+FP solution at a concentration of 1x107 cells/mL and stored at 4°C for 72 hours in the same manner as in Example 1. The cells thus refrigerated for 72 hours were seeded on a collagen I-coated 24-well plate and cultured for 8 days (maintenance culture). As a control, HepaSH cells immediately after isolation from humanized liver (freshly isolated HepaSH cells) were seeded on a collagen I-coated 24-well plate and similarly cultured for 8 days (maintenance culture).
  • the medium was changed to Cellartis® Power TM Primary HEP medium (Takara Bio, product code Y20020), and the medium was replaced with the same medium on the first day of culture (the day after seeding), the third day, the fifth day, and the seventh day.
  • Phase contrast images of the cells on the first, third, fifth, and seventh days of culture are shown in FIG. 6. Throughout the culture period up to the seventh day, there was no difference in cell morphology depending on whether or not the cells were preserved in the cell preservation solution, and the confluent state was maintained in the plate culture.
  • HepaSH cells harvested on the first, fourth, and eighth days of culture were incubated with Williams' Medium E, no Phenol Red (Thermo Fisher Scientific, product code A12176) containing phenacetin (a substrate for CYP1A2) (100 ⁇ M), diclofenac (a substrate for CYP2C9) (40 ⁇ M), omeprazole (a substrate for CYP2C19) (10 ⁇ M), metoprolol (a substrate for CYP2D6) (5 ⁇ M), and midazolam (a substrate for CYP3A4/5) (5 ⁇ M), which are typical substrates of the drug-metabolizing enzyme group human cytochrome P450, for 1 hour at 37° C.
  • the metabolites contained in the medium were then measured using a liquid chromatography tandem mass spectrometer.
  • the metabolites of these substrates were measured as indicators of the activity of each drug metabolizing enzyme, namely acetaminophen due to the O-deethylation activity of phenacetin by CYP1A2, 4'-hydroxydiclofenac due to the 4'-hydroxylation activity of diclofenac by CYP2C9, 5'-hydroxyomeprazole due to the 5'-hydroxylation activity of omeprazole by CYP2C19, O-demethylated metoprolol due to the O-demethylation activity of metoprolol by CYP2D6, and 1'-hydroxymidazolam due to the 1'-hydroxylation activity of midazolam by CYP3A4/5.
  • the HepaSH cells in each well were dissolved in CelLytic TM MT Cell Lysis Reagent (Sigma-Aldrich, product code C3228), and the protein concentration was quantified using TaKaRa BCA Protein Assay Kit (Takara Bio, product code T9300A).
  • the drug metabolism enzyme activity was expressed as the amount of metabolite generated per unit time and unit protein weight.
  • Figure 7 shows the drug metabolism enzyme activity expressed as the amount of metabolite per unit protein weight.
  • HepaSH cells suspended in UW+FP solution at a concentration of 1x107 cells/mL as described above and stored at 4°C for 72 hours were transplanted via the spleen into the liver of TK-NOG-hIL6 mice after induction of liver damage.
  • the liver was collected and formalin-fixed, and then paraffin sections were prepared, stained with hematoxylin and eosin (H&E) and immunostained with an anti-human mitochondrial antibody (Merck, product code MAB1273), and images were obtained using a slide scanner NanoZoomer (Hamamatsu Photonics). The results are shown in Figure 8.
  • HepaSH cells (9 specimens) were suspended at a concentration of 1x107 cells/mL in UW solution or UW+FP solution with or without the addition of an iron chelating agent (final concentration 500 ⁇ M, deferoxamine; hereinafter also referred to as Def), and stored (refrigerated) at 4°C for 24 hours or 96 hours.
  • an iron chelating agent final concentration 500 ⁇ M, deferoxamine; hereinafter also referred to as Def
  • UW+Def solution the UW+FP solution with Def added is referred to as UW+FP&Def solution.
  • the cells after refrigeration were seeded on collagen I-coated 24-well plates, and 24 hours after seeding, they were stained and the average number of nuclei was measured.
  • the plating efficiency (plating index) was calculated from the measured average number of nuclei in the same manner as in Example 1.
  • HepaSH cells were suspended in UW solution, UW+FP solution, or UW+FP&Def solution at a concentration of 1x107 cells/mL, stored at 4°C for 96 hours, suspended in seeding medium, seeded on a transwell (Corning, product code 354495) coated with rat collagen I (Corning, product code 354236), and maintained in a 7-day culture (plate culture).
  • a medium containing PE streptavidin (BD, product code 554061) was added to the upper layer of the transwell, and the lower layer of the medium was collected 15, 30, and 60 minutes after the addition of PE streptavidin, and the fluorescence was measured using a plate reader Infinite F200F Pro (TECAN).
  • PE-streptavidin migrates from the upper layer to the lower layer through the gaps between the cells, and fluorescence derived from the fluorescent dye PE (phycoerythrin) is detected in the medium.
  • HepaSH cells (10 specimens) were suspended in UW solution or UW+FP solution at a concentration of 1 x 107 cells/mL in the same manner as in Example 1, and stored at 4°C for 72 hours. Half of the suspension was then harvested, suspended in 10 times the volume of seeding medium, and incubated in a thermostatic water bath at 37°C for 30 minutes for pre-warming treatment.
  • the cells that had been pre-warmed were stained with trypan blue and counted for viable cell count and total cell count using a hemocytometer according to the method described in Example 1, and the viable cell recovery rate and survival rate were calculated. Furthermore, according to the method described in Example 1, phase contrast images were taken 24 hours after seeding, and the plating efficiency (plating index) was calculated, and ROS activity was measured according to the method described in Example 2. As a control, a similar storage test and measurement were performed except that the pre-warming treatment was not performed. The results are shown in Figures 14 and 15.
  • pre-warming treatment showed a statistically significant improvement in viability for cells preserved in both UW solution and UW+FP solution ( Figure 15B). Furthermore, pre-warming treatment showed a statistically significant reduction in ROS activity and an increase in fixation efficiency for cells preserved in both UW solution and UW+FP solution ( Figures 15C and D). Pre-warming also has the effect of reducing low-temperature stress on cells, and this effect is thought to have led to the improvement in viability, reduction in ROS activity, and increase in fixation efficiency.
  • HepaSH cells (6 specimens) were suspended in UW+FP solution or UW+FP&Def solution at a concentration of 1x107 cells/mL, and stored at 4°C for 96 hours. The cells were then suspended in 10 times the amount of seeding medium and incubated at 37°C for 30 minutes in a thermostatic water bath for pre-warming. The cells after pre-warming were seeded on a collagen I-coated 24-well plate and cultured overnight. Phase contrast images were taken 24 hours after seeding according to the method described in Example 1, and the plating efficiency (plating index) was calculated. The results are shown in Figures 16 and 17.
  • Examples 1 to 4 it has been shown that ischemic stress in cells that occurs during storage in a cell preservation solution becomes apparent after the preserved cells are seeded on a culture substrate and culture is started. Examples 1 to 4 show that cells that survived despite being subjected to ischemic stress during storage in a cell preservation solution undergo accelerated cell death when seeded on a culture substrate after storage and cultured, resulting in a decrease in the cell adhesion efficiency in culture on the culture substrate, and further show that the present invention can significantly improve such cell death and the decrease in adhesion efficiency.
  • the present invention allows adherent cells to maintain their ability to attach to a culture substrate during long-term refrigerated storage in an unfrozen state, thereby enabling long-distance transportation, such as air transportation, of adherent cells to be used for two-dimensional culture after refrigerated storage.

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Abstract

本発明は、高分子ポリマーを含む細胞保存液中で接着性細胞を、非凍結状態で冷蔵保存することを含む、接着性細胞の保存方法；接着性細胞を当該方法による保存後に二次元培養することを含む接着性細胞の培養方法；及びそれらの方法における使用に好適な高分子ポリマーを含む細胞保存液に関する。

Description

細胞保存液及び細胞保存方法
　本発明は、接着性細胞の長時間の冷蔵保存を可能にする細胞保存液及び細胞保存方法に関する。
　初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の平面培養は、薬物動態試験や毒性解析試験など、新薬の開発過程に広く利用されている。ＰＨＨを平面培養する際、細胞密度が低くなると薬物代謝酵素の発現量が低下することが知られている（非特許文献１）。ＰＨＨの特性をｉｎ　ｖｉｔｒｏで長期間維持するためには、培養細胞をできる限り高密度な状態で維持することが重要となる。
　市販の凍結ＰＨＨには、培養基質上での定着培養が可能なプレータブルグレード（接着性細胞）と、定着培養ができないサスペンジョングレード（浮遊細胞）の２種類が存在する。プレータブルグレードのＰＨＨは、一般的に４週間以上の平面培養が可能であり、長期間にわたりｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用することができることから、融解後８時間程度しか使用できないサスペンジョングレードのＰＨＨと比較してより有用性が高い。しかし、プレータブルグレードの凍結ＰＨＨを選択的に作製する方法は未だ確立されておらず、一般的に市販される凍結ＰＨＨにおいて、プレータブルグレードである凍結ＰＨＨは三割程度と言われている。
　一方、ＰＨＨを保存液に懸濁して冷蔵条件下（４℃、氷中）に置くと、短時間は培養基質への高い定着能力を維持したまま保存することができるが、長時間冷蔵保存したＰＨＨでは培養基質への定着能力が低下する。ＰＨＨなどの細胞を長距離輸送する場合、例えば、日本から欧州に輸送するには空路であってもドアーツードアで少なくとも４８～７２時間、好ましくは９６時間程度の保存時間を要することから、長時間の非凍結保存を行ってもＰＨＨ等の接着性細胞が培養基質への高い定着能力を維持することが可能な細胞保存方法の開発が求められている。
　非特許文献２は、複数の臓器保存液中で冷蔵保存したＰＨＨについて、生存率及びコラーゲンＩプレートへの定着能力はおよそ２４時間の保存時間までは維持されたが、保存時間がさらに長くなると顕著に低下したことを報告している。
　非特許文献３は、鉄キレート剤を添加した特殊な組成の細胞保存液中でＰＨＨを冷蔵保存し、加温処理することにより、低温ストレスによる細胞死を緩和したことを報告している。しかし非特許文献３で使用している細胞保存液は複雑な組成を有しており、再構成が難しい。
　特許文献１は、脱アシル化ジェランガム又はその塩を含む培地組成物中で血管平滑筋細胞を浮遊培養することによる、血管平滑筋細胞の培養方法を開示している。しかし当該培地組成物中で冷蔵保存した細胞の、培養基質への定着能力については開示されておらず、血管平滑筋細胞以外の細胞への効果についても言及されていない。
　特許文献２は、脱アシル化ジェランガム又はその塩とアルギン酸などの酸性多糖類を含む液体組成物中で、細胞又は組織を非凍結状態で保存することにより、良好な生存性を長期間維持できることを開示している。しかし、当該液体組成物中で冷蔵保存した細胞の、培養基質への定着能力については開示されていない。
国際公開ＷＯ２０１６／１２１８９６ 国際公開ＷＯ２０１９／０４９９８５
Yamasaki et al., PLOS ONE, 15(9): (2020) e0237809 Duret et al., Cell Transplantation, Vol. 24, pp. 2541-2555 (2015) Pless et al., Cell Transplantation, Vol. 21, pp. 23-37 (2012)
　本発明は、培養基質への定着能力を保持したままで接着性細胞の長時間の冷蔵保存を可能にする、細胞保存液及び細胞保存方法を提供することを課題とする。本発明はまた、長時間の冷蔵保存後の接着性細胞の二次元培養を細胞特性を保持しながら可能にする細胞培養方法を提供することをさらなる課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、脱アシル化ジェランガム又はその塩のような高分子ポリマーを含む細胞保存液中で接着性細胞を長時間冷蔵保存したところ、細胞が容器底部に沈澱せず懸濁状態が保たれ、その後の二次元培養において培養基質への定着能力が顕著に高まったことを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］高分子ポリマーを含む細胞保存液中で接着性細胞を、非凍結状態で冷蔵保存することを含む、接着性細胞の保存方法。
［２］高分子ポリマーが脱アシル化ジェランガム又はその塩を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］接着性細胞を、二次元培養における培養基質への定着能力を保持しながら冷蔵保存する、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］接着性細胞が、最長１００時間にわたり冷蔵保存される、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］接着性細胞が、７０時間以上にわたり冷蔵保存される、上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］接着性細胞が肝細胞である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］接着性細胞が細胞保存液中で懸濁状態にある、上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記細胞保存液が、鉄キレート剤をさらに含む、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］鉄キレート剤がデフェロキサミンを含む、上記［８］に記載の方法。
［１０］上記［１］～［９］のいずれかに記載の方法により、接着性細胞を冷蔵保存した後、接着性細胞を二次元培養することを含む、接着性細胞の培養方法。
［１１］接着性細胞を、コラーゲンでコーティングされた培養基質上に播種し、二次元培養する、上記［１０］に記載の方法。
［１２］冷蔵保存した接着性細胞を、加温処置した後、二次元培養に供する、上記［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］接着性細胞を非凍結状態で冷蔵保存するための、高分子ポリマーを含む細胞保存液。
［１４］高分子ポリマーが脱アシル化ジェランガム又はその塩を含む、上記［１３］に記載の細胞保存液。
［１５］接着性細胞を、二次元培養における培養基質への定着能力を保持しながら冷蔵保存するための、上記［１３］又は［１４］に記載の細胞保存液。
［１６］接着性細胞を最長１００時間にわたり冷蔵保存するための、上記［１３］～［１５］のいずれかに記載の細胞保存液。
［１７］接着性細胞が肝細胞である、上記［１３］～［１６］のいずれかに記載の細胞保存液。
［１８］鉄キレート剤をさらに含む、上記［１３］～［１７］のいずれかに記載の細胞保存液。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２３－１８６１６２号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、培養基質への定着能力を保持したままで接着性細胞の長時間の冷蔵保存が可能になる。本発明によれば、長時間の冷蔵保存後の接着性細胞の、細胞特性を保持した二次元培養も可能になる。
図１は、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液中での冷蔵保存開始から２４時間後の保存液中の細胞の様子を示す写真である。 図２は、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液中で２４時間、４８時間、７２時間、又は９６時間にわたり冷蔵保存した細胞の生細胞回収率（Ａ）及び生存率（Ｂ）を示す。 図３は、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液中で２４時間、４８時間、７２時間、又は９６時間にわたり冷蔵保存した細胞のプレート播種２４時間後の定着効率（ｐｌａｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ）を示す。 図４は、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液中で２４時間、４８時間、７２時間、又は９６時間にわたり冷蔵保存した細胞のプレート播種２４時間後の位相差像（Ｂ）を示す写真である。比較のため、ヒト化肝臓からの単離直後（Ｆｒｅｓｈｌｙ　ｉｓｏｌａｔｅｄ）のＨｅｐａＳＨ細胞の位相差像（Ａ）も示した。各写真の右下の白のバーは、２００μｍのスケールバーである。 図５は、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液中で２４時間冷蔵保存した細胞におけるＡＴＰ量（Ａ）、ＤＣＦＨ－ＤＡ由来の平均蛍光強度を指標とするＲＯＳ活性（Ｂ）、及びプレート播種４時間後における培地中のＬＤＨ活性（Ｃ）を示す。 図６は、ＵＷ＋ＦＰ液中で７２時間冷蔵保存した後、プレートに播種した細胞の維持培養１日目、３日目、５日目、及び７日目の位相差像を示す写真である。比較のため、ヒト化肝臓からの単離直後（Ｆｒｅｓｈｌｙ　ｉｓｏｌａｔｅｄ）のＨｅｐａＳＨ細胞の位相差像も示した。各写真の右下の白のバーは、２００μｍのスケールバーである。 図７は、ＵＷ＋ＦＰ液中で７２時間冷蔵保存した後、プレートに播種して維持培養１日目（Ａ）、４日目（Ｂ）、及び８日目（Ｃ）の細胞における、薬物代謝酵素活性を示す。図中の１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４／５は、それぞれ、ＣＹＰ１Ａ２によるフェナセチンＯ－脱エチル化活性、ＣＹＰ２Ｃ９によるジクロフェナク４’－ヒドロキシル化活性、ＣＹＰ２Ｃ１９によるオメプラゾール５’－ヒドロキシル化活性、ＣＹＰ２Ｄ６によるメトプロロールＯ－脱メチル化活性、ＣＹＰ３Ａ４／５によるミダゾラム１’－ヒドロキシル化活性を示す。 図８は、ＵＷ＋ＦＰ液で７２時間冷蔵保存したＨｅｐａＳＨ細胞を、ＴＫ－ＮＯＧ－ｈＩＬ６マウスの肝障害誘導後の肝臓中に再移植した後、移植５週目の肝臓についての免疫染色の結果を示す写真である。Ａ：Ｈ＆Ｅ染色、Ｂ：抗ヒトミトコンドリア抗体による染色。 図９は、ＵＷ＋ＦＰ液で７２時間冷蔵保存したＨｅｐａＳＨ細胞を、ＴＫ－ＮＯＧ－ｈＩＬ６マウスの肝障害誘導後の肝臓中に再移植した後、移植６週目の肝臓から単離した細胞のフローサイトメトリー解析の結果（Ａ）、及びそのようにして再単離したＨｅｐａＳＨ細胞をプレートに播種した後の維持培養の様子を示す写真（Ｂ）である。図９Ｂの写真の右下の白のバーは、２００μｍのスケールバーである。 図１０は、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液、ＵＷ＋Ｄｅｆ液、又はＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液中で２４時間又は９６時間冷蔵保存した細胞の、プレートへの播種の２４時間後の定着効率を示す。 図１１は、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液、ＵＷ＋Ｄｅｆ液、又はＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液中で２４時間又は９６時間冷蔵保存した細胞の、プレートへの播種の２４時間後の位相差像を示す写真である。各写真の右下の白のバーは、２００μｍのスケールバーである。 図１２は、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液、又はＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液中で９６時間冷蔵保存した細胞をトランスウェル上で７日間の維持培養後、培地に添加した蛍光物質の透過試験の結果を示す。 図１３は、ＵＷ液（Ｂ）、ＵＷ＋ＦＰ液（Ｃ）、又はＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液（Ｄ）中で９６時間冷蔵保存した細胞の、平面培養７日目の時点の細胞の位相差像を示す写真である。比較のため、ヒト化肝臓からの単離直後（Ｆｒｅｓｈｌｙ　ｉｓｏｌａｔｅｄ）のＨｅｐａＳＨ細胞の位相差像（Ａ）も示した。 図１４は、ＵＷ液、又はＵＷ＋ＦＰ液中で７２時間冷蔵保存した後、事前加温処置を行った細胞、又は事前加温処置を行わなかった細胞（対照）の、コラーゲンＩコート２４ウェルプレートに播種して２４時間後の位相差像を示す写真である。 図１５は、ＵＷ液、又はＵＷ＋ＦＰ液中で７２時間冷蔵保存した後、事前加温処置を行った細胞、又は事前加温処置を行わなかった細胞における、生細胞回収率（Ａ）、生存率（Ｂ）、ＲＯＳ活性（Ｃ）、及び定着効率（Ｄ）を示す。白抜きバー：事前加温なし、網掛けバー：事前加温あり。 図１６は、ＵＷ＋ＦＰ液（対照）、又はＤｅｆを添加したＵＷ＋ＦＰ液（ＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液）中で９６時間冷蔵保存した後、事前加温処置を行った細胞、又は事前加温処置を行わなかった細胞（対照）における定着効率を示す。 図１７は、ＵＷ＋ＦＰ液（対照）、又はＤｅｆを添加したＵＷ＋ＦＰ液（ＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液）中で９６時間冷蔵保存した後、事前加温処置を行った細胞、又は事前加温処置を行わなかった細胞の、プレートへの播種の２４時間後の位相差像を示す写真である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、高分子ポリマーを含む細胞保存液を提供する。本発明はまた、高分子ポリマーの存在下で、より具体的には、高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、細胞、特に、接着性細胞を、非凍結状態で保存することを含む、接着性細胞の保存方法を提供する。さらに本発明は、そのような保存方法に従って保存した接着性細胞を二次元培養することを含む、接着性細胞の培養方法も提供する。
　特に、本発明は、高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、接着性細胞を、非凍結状態で冷蔵保存することを含む、接着性細胞の保存方法に関する。
　本発明において「細胞保存液」とは、細胞を生存状態を維持しながら安定的に保存するのに適した液体組成物を意味する。本発明の細胞保存液は、細胞の増殖に適した液体培地とは異なる。好ましい実施形態では、本発明の「細胞保存液」は、非凍結保存用又は冷蔵保存用の細胞保存液であり得る。本発明の「細胞保存液」は、凍結保存用の細胞保存液ではない。本発明の「細胞保存液」は、水性溶媒と高分子ポリマーとを含む。
　本発明の「細胞保存液」は、市販の又は既存の細胞保存液又は臓器保存液をベースとして調製してもよいし、新たに調製してもよい。一実施形態では、本発明の「細胞保存液」は、非凍結保存用のベルザーＵＷ（Ｒ）冷保存液（ＵＷ液）をベースとして使用して調製してもよい。ベルザーＵＷ（Ｒ）冷保存液（ＵＷ液）の組成は以下のとおりである：ヒドロキシエチルスターチ（ペンタフラクション（Ｐｅｎｔａｆｒａｃｔｉｏｎ））　５０ｇ／Ｌ、ラクトビオン酸（ラクトンとして）　３５．８３ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム　３．４ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物　１．２３ｇ／Ｌ、ラフィノース五水和物　１７．８３ｇ／Ｌ、アデノシン　１．３４ｇ／Ｌ、アロプリノール　０．１３６ｇ／Ｌ、総グルタチオン（ｔｏｔａｌ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）　０．９２２ｇ／Ｌ、水酸化カリウム　５．６１ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム／塩酸（２０℃でｐＨ７．４への調整のために添加）、及び水。一実施形態では、ベルザーＵＷ（Ｒ）冷保存液（ＵＷ液）の組成を有する溶液又はそれを含む液であって、かつ、高分子ポリマーを含む溶液を、本発明における細胞保存液として用いることができる。
　本発明において、高分子ポリマーとは、重量平均分子量が１０，０００以上のポリマーを指す。高分子ポリマーの分子量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によりプルラン換算で決定することができる。本発明で用いる高分子ポリマーとしては、例えば、多糖類が挙げられるが、それに限定されない。好ましい実施形態では、本発明の高分子ポリマーとして用いる多糖類は、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類であってよい。具体的には、高分子ポリマーの例としては、脱アシル化ジェランガム、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、アルギン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、及びラムナン硫酸、並びにそれらの塩からなる群より選択される１種又は２種以上から構成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。高分子ポリマーに関して「塩」は、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩、及びアルミニウム、亜鉛、銅、鉄等の塩、アンモニウム塩、有機アミンとの塩、アミノ酸との塩等であってよいが、これらに限定されない。より好ましい実施形態では、本発明の高分子ポリマーは、脱アシル化ジェランガム又はその塩を含む。一実施形態では、本発明の細胞保存液は、高分子ポリマーとして、脱アシル化ジェランガム又はその塩のみを含む。別の実施形態では、本発明の細胞保存液は、高分子ポリマーとして、脱アシル化ジェランガム又はその塩に加えて、別の高分子ポリマー、例えば、アルギン酸、ペクチン、又はペクチン酸などの他の多糖類を含む。別の実施形態では、本発明の細胞保存液は、高分子ポリマーとして、脱アシル化ジェランガム又はその塩に加えて、二価金属カチオン媒体中でランダムコイル状態を維持し、かつ二価金属イオンを介して架橋できる酸性多糖類（例えば、アルギン酸、ペクチン、又はペクチン酸）又はその塩を含む。本発明の細胞保存液が、高分子ポリマーとして、脱アシル化ジェランガム又はその塩に加えて、二価金属カチオン媒体中でランダムコイル状態を維持し、かつ二価金属イオンを介して架橋できる酸性多糖類（例えば、アルギン酸、ペクチン、又はペクチン酸）又はその塩を含む場合、カルシウムイオン等の二価金属カチオンをさらに含んでもよい。脱アシル化ジェランガム又はその塩は、リン酸化したものを使用してもよい。脱アシル化ジェランガム又はその塩の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００～５０，０００，０００、より好ましくは１，０００，０００～１０，０００，０００であり得る。脱アシル化ジェランガム又はその塩としては、市販品を使用してもよい。一実施形態では、日産化学株式会社製のポリマーＦＰシリーズ、例えば、ＦＰ００１を使用してもよい。一実施形態では、ＦＣｅＭ（Ｒ）　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（日産化学、製品コード　３８５－０７９８１）の構成要素として含まれるＦＰ００１液を、高分子ポリマー試薬として使用することができる。別の実施形態では、脱アシル化ジェランガム又はその塩として、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ－ＬＡ」を使用してもよい。
　一実施形態では、本発明の高分子ポリマーを含む細胞保存液は、高分子ポリマー、例えば脱アシル化ジェランガム又はその塩を、０．００１～１％（Ｗ／Ｖ）の濃度、好ましくは０．００５～０．３％（Ｗ／Ｖ）の濃度、より好ましくは０．０１～０．３％（Ｗ／Ｖ）の濃度、例えば０．０１～０．０３％（Ｗ／Ｖ）、又は０．０１５～０．０３％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含むものであり得る。脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、フリー体の脱アシル化ジェランガム換算値で示すことができる。本明細書において、％（Ｗ／Ｖ）は、重量／体積％を意味する。
　本発明において、接着性細胞とは、培養基質に接着（付着）した状態で維持培養することができる細胞を意味する。一方、浮遊細胞とは、培養基質に接着（付着）できない細胞を意味する。浮遊細胞は、液体培地中の培養で徐々にその機能を失うため、長期間にわたり維持培養することは困難である。なお、維持培養とは、細胞をその形態や機能を維持しながら培養することを意味する。接着性細胞は、二次元培養や三次元培養に成功裏に用いることができる。
　本発明で用いる接着性細胞は、任意の臓器又は組織に由来するものであってよく、例えば、肝細胞（すなわち、接着性肝細胞）であり得るが、それに限定されない。接着性細胞は、任意の動物細胞であってよく、例えば、霊長類細胞、イヌ細胞、ネコ細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。接着性細胞は、ヒト細胞であってもよいし、非ヒト細胞、例えば、非ヒト哺乳動物細胞（非ヒト霊長類細胞）などの非ヒト動物細胞であってもよい。好ましい実施形態では、接着性細胞は、ヒト肝細胞（すなわち、ヒト接着性肝細胞）であり得る。
　本発明で用いる接着性細胞は、初代細胞であることが好ましいが、それに限定されない。本発明で用いる接着性細胞は、不死化細胞であってもよいし、不死化細胞でなくてもよい。本発明で用いる接着性細胞は、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞など）から分化誘導した細胞であってもよい。本発明において「初代細胞」とは、生体組織から採取又は単離された、有限回数までしか増殖（分裂）できない細胞を意味する。本発明における「初代細胞」は、天然の生体組織から採取又は単離された細胞だけでなく、免疫不全動物又は免疫寛容動物のような、ヒトに対する免疫反応が欠損又は低下した非ヒト動物の体内（例えば、肝障害誘導後の肝臓内）に初代細胞を移植して再構築した組織又は臓器から単離された細胞も包含する。初代細胞からの組織又は臓器の再構築に使用する、ヒトに対する免疫反応が欠損又は低下した非ヒト動物としては、国際公開ＷＯ２０２０／１２２１７８の明細書等に記載されたヒトに対する免疫反応が欠損又は低下した非ヒト脊椎動物、例えば、ＴＫ－ＮＯＧ－ｈＩＬ６マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス由来でＩＬ２受容体γ鎖遺伝子がノックアウトされたＮＯＧマウスに、非ヒト動物ヒトチミジンキナーゼ遺伝子とヒトＩＬ－６遺伝子が発現可能に導入された超免疫不全マウス）が挙げられるが、それらに限定されない。
　保存の際の、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中の接着性細胞の濃度は、任意の細胞濃度であってよいが、一実施形態では、好ましくは１ｘ１０６～１ｘ１０８細胞／ｍＬ、より好ましくは５ｘ１０６～７ｘ１０７細胞／ｍＬ、例えば、１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度であってもよい。
　本発明の方法では、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、接着性細胞を保存し、好ましくは、非凍結状態で冷蔵保存する。本発明において「冷蔵保存」とは、０℃超～１０℃、典型的には、２～５℃、例えば４℃の温度条件下での保存を意味する。
　本発明では、高分子ポリマーを含む細胞保存液中、接着性細胞を、長時間にわたり、非凍結状態で保存（例えば、冷蔵保存）することができる。本発明により、高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、接着性細胞を非凍結状態で保存する時間は、以下に限定するものではないが、最長１００時間であってよく、例えば最長９６時間、又は最長７２時間であってよい。本発明により、高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、接着性細胞を非凍結状態で保存する時間は、１時間以上、典型的には２４時間以上、好ましくは４０時間以上、例えば、４８時間以上、７０時間以上、又は７２時間以上、あるいは、１～１００時間、２４～１００時間、４０～１００時間、４８～１００時間、７０～１００時間、７２～１００時間、１～９６時間、２４～９６時間、４０～９６時間、４８～９６時間、７０～９６時間、７２～９６時間、７２～１００時間、又は２４～７２時間であってもよい。
　本発明の細胞保存液中で、接着性細胞は懸濁状態が好ましく、その場合、接着性細胞は懸濁状態で冷蔵保存され得る。本発明では、保存液中において細胞が沈澱せず懸濁状態を維持することで、虚血性ストレスが低減されることにより、保存効果が高まると考えられる。
　本発明の方法では、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、接着性細胞を、非凍結状態で保存（例えば、冷蔵保存）することにより、接着性細胞の、培養基質への定着能力を損なうことなく、細胞を安定的に保存することができる。
　本発明において、接着性細胞の培養基質への「定着能力」とは、接着性細胞を培養基質上に播種して二次元培養をしたときに、接着性細胞が培養基質上に付着し、コンフルエントな状態に達し、そのコンフルエントな状態を維持することができる、接着性細胞の能力を意味する。本発明において「コンフルエントな状態」とは、培養基質の培養面の表面積の８０％以上を播種した接着性細胞が占める状態（８０％以上のコンフルエンシー）を意味する。一方、本発明において「接着」とは、細胞が培養基質上に培養可能な状態で付着することを意味する。
　好ましい実施形態では、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で非凍結状態で冷蔵保存した接着性細胞は、培養基質への定着能力を保持していることから、細胞保存液中での冷蔵保存後、培養基質上での固相培養、特に、二次元培養（単層培養とも称される）に好適に用いることができる。したがって、本発明の接着性細胞の保存方法は、接着性細胞を、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、二次元培養における培養基質への定着能力を保持しながら、非凍結状態で、冷蔵保存する方法であり得る。あるいは、本発明の接着性細胞の保存方法は、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で非凍結状態で冷蔵保存後に二次元培養（例えば、平面培養）に供すべき接着性細胞を、保存するための方法であり得る。
　初代肝細胞（ＰＨＨ）を従来の細胞保存液に懸濁して冷蔵条件下（４℃、氷中）に置くと、短時間は培養基質への高い定着能力を維持したまま保存することができるが、長時間冷蔵保存すると、ＰＨＨの培養基質への定着能力は低下し、細胞間に隙間がある状態（コンフルエントでない状態）となる。細胞間に隙間がある状態（コンフルエントでない状態）で培養したＰＨＨは細胞形態が変化し、肝細胞としての特性（薬物代謝酵素活性等）も喪失する。本発明の方法により、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で非凍結状態で冷蔵保存することにより、肝細胞をはじめとする接着性細胞は、培養基質への定着能力を保持することができ、その結果、接着性細胞の他の細胞特性も維持することもできる。好ましい実施形態では、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で冷蔵保存された接着性細胞において、細胞形態が維持される。好ましい実施形態では、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で冷蔵保存された接着性細胞において、当該細胞に特有の酵素活性が維持される。例えば、肝細胞である接着性細胞を上記のようにして冷蔵保存した場合、その細胞形態が維持されるとともに、薬物代謝酵素活性が維持される。薬物代謝酵素活性としては、例えば、ＣＹＰ１Ａ２によるフェナセチンＯ－脱エチル化活性、ＣＹＰ２Ｃ９によるジクロフェナク４’－ヒドロキシル化活性、ＣＹＰ２Ｃ１９によるオメプラゾール５’－ヒドロキシル化活性、ＣＹＰ２Ｄ６によるメトプロロールＯ－脱メチル化活性、ＣＹＰ３Ａ４／５によるミダゾラム１’－ヒドロキシル化活性などの、シトクロムＰ４５０酵素活性が挙げられるが、それらに限定されない。また、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で冷蔵保存された接着性細胞は、例えば、細胞内のＡＴＰ量亢進等で示されるようにより健康な状態を維持しており、虚血性ストレスを示すＲＯＳ活性の増加抑制を示す。上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で冷蔵保存された接着性細胞は、冷蔵保存後に播種された培養基質において定着効率（Ｐｌａｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ）の亢進を示す。上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、接着性細胞を冷蔵保存することにより、接着性細胞に対する虚血性ストレスを顕著に低減することができ、それが上記の効果にもつながると考えられる。
　本発明では、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液に、さらに鉄キレート剤を添加してもよい。本発明では、上記の高分子ポリマーに加えて、鉄キレート剤をさらに含む、細胞保存液を用いることができる。鉄キレート剤は、デフェロキサミン、及び／又はフェロスタチン等を含むものであってよいが、それに限定されない。鉄キレート剤は、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液に、好ましくは、１０μＭ～５ｍＭ、例えば、１００μＭ～１ｍＭ、又は３００μＭ～７００μＭの濃度で添加してもよいが、これらの範囲に限定されない。上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液に鉄キレート剤をさらに添加することにより、接着性細胞の定着効率（Ｐｌａｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ）のさらなる亢進が認められ、接着性細胞の定着能力が向上する。
　上記のような接着性細胞の保存方法により冷蔵保存した接着性細胞は、培養基質への高い定着能力を保持していることから、二次元培養に好適に使用することができる。本発明は、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で、上記のような接着性細胞の保存方法に従って、接着性細胞を冷蔵保存した後、接着性細胞を二次元培養することを含む、接着性細胞の培養方法も提供する。
　このような接着性細胞の培養方法は、接着性細胞の保存方法により、接着性細胞を冷蔵保存した後、接着性細胞を培養基質上に播種し、二次元培養を行うことを含む、接着性細胞の培養方法であり得る。
　本発明において培養基質とは、培養時に細胞が接着して足場として機能できる固相材料又は物質を意味する。培養基質は、以下に限定されないが、例えば、マルチウェルプレートなどの培養プレート、ディッシュ（培養皿）、フラスコ、ボトル、スライドガラス、カバーガラス、フィルム、メンブレン、多孔質担体、中空ファイバー、ファイバー等であり得る。培養基質は、以下に限定されないが、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート等のプラスチック、銀、金等の金属、インジウム－スズ酸化物等の金属酸化物、セラミック等の任意の細胞足場材で製造されたものであってよい。培養基質はまた、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ゼラチン等の足場材で表面（培養面）がコーティングされていてもよい。
　一実施形態では、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で保存した接着性細胞を、コラーゲンでコーティングされた培養基質上に播種し、二次元培養することができる。コーティングに用いるコラーゲンとしては、コラーゲンＩ、コラーゲンナノファイバー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　二次元培養は、培養基質（固相）上での単層培養である。接着性細胞を播種する培養基質の表面が平面である場合、二次元培養は平面培養と称される。細胞保存液中で冷蔵保存した接着性細胞の培養基質上での二次元培養は、平面培養であってもよい。
　接着性細胞の二次元培養は、二次元培養の通常の培養条件に基づいて行えばよい。二次元培養は加温条件下で行うことが好ましい。一実施形態では、二次元培養は、好ましくは３０～４０℃、より好ましくは３５～４０℃、さらに好ましくは３５～３８℃、典型的には３７℃で実施することができる。一実施形態では、二次元培養は、例えば、１時間～６ヶ月、好ましくは、１０時間～３ヶ月、又は２０時間～２週間にわたって行うことができる。
　本発明の方法では、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で冷蔵保存した接着性細胞を、加温処置した後、二次元培養に供してもよい。加温処置は、細胞の低温ストレスを低減できる任意の加温処置であってよい。加温処置は、上記の高分子ポリマーを含む細胞保存液中で冷蔵保存した接着性細胞を、播種培地などの液体培地に懸濁し、次いで、好ましくは３０～４０℃、より好ましくは３５～４０℃、さらに好ましくは３５～３８℃、典型的には３７℃で、２０～６０分、例えば３０分～６０分にわたり保温することにより、実施することができる。冷蔵保存した接着性細胞を、加温処理した後に、二次元培養に供することにより、接着性細胞の冷蔵保存における低温ストレスを低減し、定着効率（Ｐｌａｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ）を向上させることができる。
　本発明は、本発明の細胞保存方法及び細胞培養方法において好適に使用される、上述のような、高分子ポリマーを含む細胞保存液も提供する。本発明の上記高分子ポリマーを含む細胞保存液は、細胞、特に、接着性細胞を、非凍結状態で長時間にわたり保存（例えば、冷蔵保存）するために好適である。本発明の上記高分子ポリマーを含む細胞保存液は、接着性細胞を、非凍結状態で、最長１００時間、例えば最長９６時間、又は最長７２時間にわたり、冷蔵保存するためのものであってよい。本発明の上記高分子ポリマーを含む細胞保存液は、接着性細胞を、非凍結状態で、１時間以上、典型的には２４時間以上、好ましくは４０時間以上、例えば、４８時間以上、７０時間以上、又は７２時間以上、あるいは、１～１００時間、２４～１００時間、４０～１００時間、４８～１００時間、７０～１００時間、７２～１００時間、１～９６時間、２４～９６時間、４０～９６時間、４８～９６時間、７０～９６時間、７２～９６時間、７２～１００時間、又は２４～７２時間にわたり、冷蔵保存するためのものであってよい。
　本発明の上記高分子ポリマーを含む細胞保存液はまた、接着性細胞を、二次元培養における培養基質への定着能力を保持しながら冷蔵保存するためのものであってよい。本発明の上記高分子ポリマーを含む細胞保存液は、非凍結状態での長時間にわたる冷蔵保存後に二次元培養に供すべき接着性細胞を、保存するためのものであってよい。
　本発明の高分子ポリマーを含む細胞保存液は、冷蔵保存時に接着性細胞の培養基質への定着能力を保持し、冷蔵保存における接着性細胞の保存性を向上させるために用いることができる。本発明の高分子ポリマーを含む細胞保存液は、ヒト肝細胞をはじめとする肝細胞の冷蔵保存のために特に好適である。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、以下の実施例において、統計学的解析におけるp値は全て、対応のある２群のｔ検定により算出し、ｐ＜０．０５で有意差ありとした。
［実施例１］高分子ポリマー含有細胞保存液の調製及び保存液中での細胞の保存
　高分子ポリマーＦＰ００１液を構成要素として含むＦＣｅＭ（Ｒ）　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（日産化学、製品コード　３８５－０７９８１）を細胞保存液の調製に使用した。高分子ポリマーＦＰ００１液は脱アシル化ジェランガムを含む。ベルザーＵＷ（Ｒ）冷保存液（Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．；　アステラス製薬より購入；製品コード　０１５４４７８２；　以下、ＵＷ液とも称する）を細胞保存液のベースとして使用した。
　ＦＣｅＭ（Ｒ）　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔの使用説明書の記載に従って、ＵＷ液に、ＦＰ００１液を添加し、混合することにより、細胞保存液ＵＷ＋ＦＰ液（高分子ポリマーの終濃度：０．０２％（Ｗ／Ｖ）を調製した。調製したＵＷ＋ＦＰ液は、希釈せずに後述のとおり細胞保存のために使用した。
　ＵＷ＋ＦＰ液中での細胞の保存効果を確認するため、ヒト肝細胞ＨｅｐａＳＨ細胞（Uehara et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 663 (2023) 132-141.； 実中研、日本）を使用した。ＨｅｐａＳＨ細胞は、ヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）を超免疫不全ＴＫ－ＮＯＧ－ｈＩＬ６マウス（Uehara et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 663 (2023) 132-141.、国際公開ＷＯ２０２０／１２２１７８）の肝障害誘導後の肝臓内に移植して再構築したヒト化肝臓から単離される細胞である。ここでは異なる６匹のマウスより単離した６検体のＨｅｐａＳＨ細胞を使用した。
　ＨｅｐａＳＨ細胞を、ＵＷ液、又はＵＷ＋ＦＰ液に添加し、１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度の細胞懸濁液とした後、１５ｍＬ遠沈管（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を保存容器として使用して４℃で９６時間保存（冷蔵保存）した。図１に保存開始から２４時間後の保存液中の細胞の様子を示す。ＵＷ液中に懸濁された細胞は沈殿したが、ＵＷ＋ＦＰ液中に懸濁された細胞は２４時間保存後も沈殿せず、浮遊状態を保っていた。
　９６時間の保存期間中、ＵＷ液、又はＵＷ＋ＦＰ液中の細胞を２４時間おきにサンプリングした。得られた細胞試料にトリパンブルー液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　製品コード　１５２５００６１）を添加し、ヘモサイトメーター（ＦＭＧ，　製品コード　５２１－１０）を用いて生細胞数及び全細胞数をカウントした。保存開始時の生細胞数に対する各サンプリング時点での生細胞数の比率（生細胞回収率;　％　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）と、各サンプリング時点での全細胞数（生細胞及び死細胞を含む）に対する生細胞数の割合（生存率；　％　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を算出した。その結果を図２に示す。ＵＷ液と比較して、ＵＷ＋ＦＰ液中で保存した細胞の生細胞回収率、生存率に大きな差はなく、高分子ポリマーＦＰの添加がこれらに影響しないことが示された。
　また、９６時間の保存期間中、２４時間おきにサンプリングした、ＵＷ液、又はＵＷ＋ＦＰ液中の細胞について、保存後の細胞の足場上での定着能力を試験した。細胞試料を、１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で播種培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　Ｅ培地　＋　１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、５ｍｇ／ｍＬ　インスリン）に懸濁し、これをコラーゲンＩコート２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；　製品コード　３５６４０８）に０．５ｍＬ／ウェルで播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％　ＣＯ２）中で一晩培養した。播種後２４時間の時点で、細胞核染色蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（同仁科学研究所、製品コード　Ｈ３４２）を含む播種培地に培地を交換し、３０分間インキュベーションして染色した後、ＥＶＯＳ　ｃｅｌｌ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、位相差像を撮影し、一定面積当たり（２００μｍ格子内）の平均核数を測定した。比較のため、ヒト化肝臓からの単離直後のＨｅｐａＳＨ細胞（Ｆｒｅｓｈｌｙ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ＨｅｐａＳＨ　ｃｅｌｌｓ）を、上記と同様に、播種培地に懸濁し、コラーゲンＩコート２４ウェルプレートに播種し、２４時間培養後に染色して、平均核数を測定した。単離直後のＨｅｐａＳＨ細胞の播種の２４時間後の平均核数（１００％）に対する、細胞保存液中での保存後の細胞の播種２４時間後の平均核数の比率を算出し、それを定着効率（Ｐｌａｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ）とした。結果を図３及び図４に示す。
　保存期間を通じて、ＵＷ＋ＦＰ液中で保存された細胞は、ＵＷ液中で保存された細胞よりも高い定着効率を示し、７２時間保存後も定着効率は約８０％であった（図３）。位相差像（図４）でも、ＵＷ液中で保存した細胞は、４８時間以上保存した場合は平面培養時に細胞間に隙間が確認できコンフルエントな状態が保たれなかったのに対し、ＵＷ＋ＦＰ液中で保存した細胞は、７２時間保存後も、細胞間に隙間のないコンフルエントな状態を保って平面培養することができたことが観察された。
　高分子ポリマーを含む保存液中で細胞を保存することにより、長時間の保存後も、細胞の定着能力を維持できることが示された。
［実施例２］高分子ポリマー含有保存液中で保存した細胞における虚血性ストレスの低減
　ＨｅｐａＳＨ細胞（３０検体）を、実施例１と同様にして、ＵＷ液、又はＵＷ＋ＦＰ液に１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、４℃で２４時間保存した。４℃で２４時間保存後の細胞の生細胞数をカウントした。
　次いで、４℃で２４時間保存後の細胞について、細胞１０００個当たりのＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｒ）　２．０　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、発光量をＥｎＳｐｉｒｅマルチモードプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定することにより決定した。結果を図５Ａに示す。ＵＷ液と比較して、ＵＷ＋ＦＰ液中で保存した細胞の方が、統計学的に有意に高いＡＴＰ量を示した。細胞死に向かう過程において、細胞内のＡＴＰ量は減少する。すなわちこの結果は、高分子ポリマー存在下で保存することにより、長時間の保存後も、細胞がより健康な状態に保たれることを示している。
　また、４℃で２４時間保存後の細胞について、トータルＲＯＳ検出キット（同仁科学研究所、製品コード　Ｒ２５２）を使用し、保存後の細胞における虚血性ストレスの指標となる活性酸素（ＲＯＳ，　Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ）の量（ＲＯＳ活性）を測定した。４℃で２４時間保存後の細胞を、抗ＨＬＡ抗体（ＢＤ、商品コード　５５５５５５）、及びキットの使用説明書に従って当該キット内のＨｉｇｈｌｙ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ＤＣＦＨ－ＤＡ色素を用いて染色後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加したローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ；　１ｘ）中に懸濁した。染色後の細胞を、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩセルソーター（ＢＤ）を用いて解析した。ＰＩ陰性（生細胞を示す）、かつＨＬＡ陽性（ヒト肝細胞を示す）の細胞集団における、ＤＣＦＨ－ＤＡ由来の平均蛍光強度（ＦＩＴＣ　ｍｅａｎ）を算出し、それをＵＷ液とＵＷ＋ＦＰ液の間で比較した。結果を図５Ｂに示す。ＵＷ液中で保存された細胞では、ＵＷ＋ＦＰ液中で保存された細胞と比較して、ＦＩＴＣ　ｍｅａｎが統計学的に有意に高かった。このアッセイでは、細胞内のＲＯＳ蓄積量が多いほど、ＦＩＴＣ　ｍｅａｎが高くなる。すなわち、ＵＷ液中で保存した細胞では、ＲＯＳ蓄積量が増加し、虚血性ストレスの亢進が示された。この結果は、高分子ポリマーの存在下で保存することより、細胞における虚血性ストレスが低減されることを示している。
　さらに、４℃で２４時間保存後の細胞を、上記播種培地に懸濁し、コラーゲンＩコート２４ウェルプレートに播種し、４時間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を、細胞死の指標として、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ　Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、製品コード　Ｇ７８９０）を用いて使用説明書に従って測定した。蛍光測定には、プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ２００Ｆ　Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ）を用いた。培養上清について測定した蛍光強度は、未使用の播種培地（対照培地）における測定値に対して標準化した。結果を図５Ｃに示す。ＵＷ液中で保存された細胞では、ＵＷ＋ＦＰ液中で保存された細胞と比較して、ＬＤＨ活性が統計学的に有意に高かった。細胞死が亢進すると、細胞内から培地中にＬＤＨが漏出することにより、培養上清のＬＤＨ活性が高くなる。すなわち、ＵＷ液中の保存では、播種後に細胞死が亢進した。ＵＷ液中の保存では、虚血性ストレスの亢進によって播種後に細胞死が亢進したと考えられる。この結果は、高分子ポリマーの存在下で保存することより、虚血性ストレスの亢進による培養基質への播種後の細胞死を低減できることを示している。
［実施例３］細胞保存液中での保存後の細胞特性の維持
　ＨｅｐａＳＨ細胞（４検体）を、実施例１と同様にして、ＵＷ＋ＦＰ液に１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、４℃で７２時間保存した。そのようにして７２時間冷蔵保存した細胞を、コラーゲンＩコート２４ウェルプレートに播種し、８日間培養（維持培養）した。対照として、ヒト化肝臓からの単離直後のＨｅｐａＳＨ細胞（Ｆｒｅｓｈｌｙ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ＨｅｐａＳＨ　ｃｅｌｌｓ）を、コラーゲンＩコート２４ウェルプレートに播種し、同様に８日間培養（維持培養）した。播種の４時間後、培地をＣｅｌｌａｒｔｉｓ（Ｒ）　ＰｏｗｅｒＴＭ　Ｐｒｉｍａｒｙ　ＨＥＰ　ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ、製品コード　Ｙ２００２０）に変更し、さらに培養１日目（播種の翌日）、３日目、５日目、及び７日目に、同培地にて培地交換を行った。図６に、培養１日目、３日目、５日目、及び７日目の細胞の位相差像を示す。７日目までの培養期間を通じて、細胞保存液中での保存の有無による細胞形態に差異はなく、平面培養においてコンフルエントな状態が維持された。
　また、７日目までの培養期間中、培養１日目、４日目、８日目の細胞における主要薬物代謝酵素の活性を測定した。培養１日目、４日目、８日目にそれぞれ採取したＨｅｐａＳＨ細胞を、薬物代謝酵素群ヒトシトクロムＰ４５０の典型的な基質であるフェナセチン（ＣＹＰ１Ａ２の基質）（１００μＭ）、ジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９の基質）（４０μＭ）、オメプラゾール（ＣＹＰ２Ｃ１９の基質）（１０μＭ）、メトプロロール（ＣＹＰ２Ｄ６の基質）（５μＭ）、及びミダゾラム（ＣＹＰ３Ａ４／５の基質）（５μＭ）を添加した培地Ｗｉｌｌｉａｍｓ’　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ，　ｎｏ　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品コード　Ａ１２１７６）と３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、培地に含まれる代謝物を液体クロマトグラフタンデム質量分析計で測定した。それら基質の代謝物として、ＣＹＰ１Ａ２によるフェナセチンのＯ－脱エチル化活性によりアセトアミノフェンが、ＣＹＰ２Ｃ９によるジクロフェナクの４’－ヒドロキシル化活性により４’－ヒドロキシジクロフェナクが、ＣＹＰ２Ｃ１９によるオメプラゾールの５’－ヒドロキシル化活性により５’－ヒドロキシオメプラゾールが、ＣＹＰ２Ｄ６によるメトプロロールのＯ－脱メチル化活性によりＯ－脱メチル化メトプロロールが、ＣＹＰ３Ａ４／５によるミダゾラムの１’－ヒドロキシル化活性により１’－ヒドロキシミダゾラムが、それぞれの薬物代謝酵素活性を示す指標として測定された。また、各ウェル中のＨｅｐａＳＨ細胞を、ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭ　ＭＴ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、製品コード　Ｃ３２２８）に溶解し、ＴａＫａＲａ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（タカラバイオ、製品コード　Ｔ９３００Ａ）を用いて、タンパク質濃度を定量した。上記の薬物代謝酵素活性を、単位時間及び単位タンパク質重量当たりの生成された代謝物量として表した。図７に、単位タンパク質重量当たりの代謝物量で表した薬物代謝酵素活性を示す。冷蔵保存していない細胞における薬物代謝酵素活性との比較により、ＵＷ＋ＦＰ液中で７２時間冷蔵保存したＨｅｐａＳＨ細胞は、培養８日目までの培養期間を通じ、薬物代謝酵素活性を維持していることが示された。
　以上の結果から、高分子ポリマー存在下で保存された細胞は、長時間の冷蔵保存後もその細胞特性を保持できることが示された。特に、肝細胞がその薬物代謝酵素活性を維持できることは、肝細胞の保存・輸送等において非常に重要である。
　さらに、上記のようにしてＵＷ＋ＦＰ液に１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、４℃で７２時間保存したＨｅｐａＳＨ細胞を、ＴＫ－ＮＯＧ－ｈＩＬ６マウスの肝障害誘導後の肝臓中に経脾移植した。移植後５週目に肝臓を採取してホルマリン固定した後、パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色及び抗ヒトミトコンドリア抗体（Ｍｅｒｃｋ、製品コード　ＭＡＢ１２７３）を用いた免疫染色を実施し、スライドスキャナＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ（浜松ホトニクス）を用いて画像を取得した。結果を図８に示す。レシピエントマウス肝臓の大部分が、ヒトミトコンドリア陽性であるヒト肝細胞に置換されていることが示された（図８Ａ及びＢ）。また、７２時間冷蔵保存したＨｅｐａＳＨ細胞を肝障害誘導後の肝臓中に移植したＴＫ－ＮＯＧ－ｈＩＬ６マウスの別の個体において、移植後６週目にＨｅｐａＳＨ細胞の再単離を実施した。単離した細胞を、抗ＨＬＡ抗体、及び抗Ｈ２ｋＤ抗体（ＢＤ、製品コード　５５３５６６）で染色し、フローサイトメトリーにて解析したところ、単離した細胞の９６％以上がＨＬＡ陽性のヒト肝細胞であった（図９Ａ）。再単離したＨｅｐａＳＨ細胞をコラーゲンＩコートプレートに播種することで、移植前の細胞と同様に定着培養を行うことも可能であった（図９Ｂ）。この結果より、高分子ポリマー存在下で保存した肝細胞は、長時間の冷蔵保存後も、肝臓再構成能力を維持していることが示された。
［実施例４］鉄キレート剤の添加及び事前加温の効果
１）鉄キレート剤の添加
　細胞内の遊離鉄イオンを除去する鉄キレート剤により、鉄依存性の細胞死であるフェロトーシスを回避する効果が得られると考えた。そこで、細胞保存液への高分子ポリマー添加に加えて、鉄キレート剤の添加を併用することにより、細胞保存液中で保存された細胞の定着能力がさらに向上するかどうかを調べた。
　鉄キレート剤（終濃度５００μＭ、デフェロキサミン；　以下、Ｄｅｆとも表記する）を添加した又は無添加の、ＵＷ液、又はＵＷ＋ＦＰ液に、ＨｅｐａＳＨ細胞（９検体）を、１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、４℃で２４時間、又は９６時間保存（冷蔵保存）した。以下では、Ｄｅｆを添加したＵＷ液をＵＷ＋Ｄｅｆ液、Ｄｅｆを添加したＵＷ＋ＦＰ液をＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液と称する。
　冷蔵保存後の細胞を、コラーゲンＩコート２４ウェルプレートに播種し、播種の２４時間後に染色して、平均核数を測定した。測定した平均核数から、実施例１と同様にして、定着効率（Ｐｌａｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ）を算出した。
　結果を図１０及び図１１に示す。２４時間冷蔵保存後の細胞では、ＵＷ液（非添加）と比較して、ＵＷ＋ＦＰ液、ＵＷ＋Ｄｅｆ液、及びＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液中で保存した場合、定着効率の統計学的に有意な亢進が示されたが、高分子ポリマーとＤｅｆの併用による相加的な効果は認められなかった（図１０）。一方、９６時間冷蔵保存後の細胞では、ＵＷ液（非添加）と比較して、ＵＷ＋ＦＰ液、ＵＷ＋Ｄｅｆ液、及びＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液中で保存した場合に、定着効率の統計学的に有意な亢進が示されたことに加えて、ＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液における高分子ポリマーとＤｅｆの併用により、高分子ポリマー又はＤｅｆ単独の添加と比較して、定着効率の統計学的に有意な亢進が示された（図１０）。さらに、特に９６時間冷蔵保存後の細胞では、ＵＷ液、又はＵＷ＋Ｄｅｆ液中で保存した場合には、その後の平面培養においてコンフルエントな状態が保たれなかったのに対し、ＵＷ＋ＦＰ液、又はＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液中で保存した場合には、位相差像からも、平面培養においてコンフルエントな状態が保持されることが示された（図１１）。虚血性ストレスとフェロトーシスの両方を回避可能にする高分子ポリマーと鉄キレート剤の併用により、コンフルエントな状態での培養を可能にする細胞の定着能力が、細胞保存液中での９６時間保存後まで維持されることが示された。
　また、ＨｅｐａＳＨ細胞を、ＵＷ液、ＵＷ＋ＦＰ液、又はＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液に、１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、４℃で９６時間保存した後、播種培地に懸濁し、ラットコラーゲンＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、製品コード　３５４２３６）にてコーティングしたトランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、製品コード　３５４４９５）に播種し、７日間の維持培養（平面培養）を実施した。培養７日目の時点で、トランスウェル上層にＰＥストレプトアビジン（ＢＤ、製品コード　５５４０６１）を含む培地を加え、ＰＥストレプトアビジン添加の１５分、３０分、６０分後に下層の培地を回収し、蛍光をプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ２００Ｆ　Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ）を用いて測定した。このアッセイでは、平面培養においてコンフルエントな状態が維持されていないと、細胞間の隙間を通ってＰＥストレプトアビジンが上層から下層に移行し、培地中に蛍光色素ＰＥ（フィコエリスリン）由来の蛍光が検出される。
　比較のため、ヒト化肝臓からの単離直後のＨｅｐａＳＨ細胞（Ｆｒｅｓｈｌｙ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ＨｅｐａＳＨ　ｃｅｌｌｓ）を播種したウェル（Ｆｒ）と、細胞を播種していないウェル（細胞無し）についても、同様にして蛍光測定を行った。測定した蛍光強度は、未使用の播種培地（対照培地）における測定値に対して標準化した。蛍光強度の測定結果を図１２に示す。また平面培養７日目の時点の細胞の位相差像を図１３に示す。
　ＵＷ液中で９６時間保存した細胞では位相差像において細胞間の隙間が観察され（図１３Ｂ）、ＰＥストレプトアビジン添加（細胞への曝露）の１５分後には蛍光が検出された（図１２）。それに対し、ＵＷ＋ＦＰ液、ＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液で９６時間保存した細胞では、位相差像において細胞間の隙間は観察されず（図１３Ｃ及びＤ）、単離直後のＨｅｐａＳＨ細胞（Ｆｒ）と同様に、ＰＥストレプトアビジン添加の３０分後でも蛍光はほとんど検出されなかった（図１２）。以上の結果から、高分子ポリマー、又は高分子ポリマーと鉄キレート剤の存在下で９６時間冷蔵保存したＨｅｐａＳＨ細胞が、７日間の平面培養を経た後も、コンフルエントな状態を維持していることが示された。
２）事前加温による低温ストレス緩和
　低温保存後の細胞を播種培地に懸濁し、３７℃で３０～６０分間保温した後にコラーゲンＩプレートに播種することにより、播種後の細胞死が抑えられるのではないかと考えた。そこで、細胞保存液への高分子ポリマー添加に加えて、播種前の加温処置（事前加温）を併用することによる効果を調べた。
　ＨｅｐａＳＨ細胞（１０検体）を、実施例１と同様にして、ＵＷ液、又はＵＷ＋ＦＰ液に１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、４℃で７２時間保存した後、その半量を採取し、１０倍量の播種培地に細胞を懸濁し、恒温水槽中で３７℃で３０分間インキュベートすることにより事前加温（Ｐｒｅ－ｗａｒｍｉｎｇ）処置を行った。
　事前加温処置を施した細胞について、実施例１に記載の方法に従い、トリパンブルー液での染色及びヘモサイトメーターにより生細胞数及び全細胞数をカウントし、生細胞回収率及び生存率を算出した。さらに、実施例１に記載の方法に従い、播種の２４時間後の位相差像を撮影し、定着効率（Ｐｌａｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ）を算出し、また実施例２に記載の方法に従い、ＲＯＳ活性の測定を行った。対照として、事前加温処置を行わないこと以外は同様の保存試験及び測定を行った。その結果を図１４及び図１５に示す。
　事前加温処置により、ＵＷ液で保存された細胞では、生細胞回収率の低下傾向が示されたが、ＵＷ＋ＦＰ液で保存された細胞では生細胞回収率はほとんど変化しなかった（図１５Ａ）。事前加温は、虚血性ストレスを蓄積した障害細胞の死滅を促進することから、ＵＷ液で保存された細胞は虚血性ストレスを蓄積していたために生細胞回収率が低下したが、ＵＷ＋ＦＰ液で保存された細胞では虚血性ストレスの蓄積が少なく障害細胞が少なかったために生細胞回収率が低下しなかったと考えられる（図１５Ａ）。
　一方、生存率は、ＵＷ液、及びＵＷ＋ＦＰ液のいずれで保存された細胞についても、事前加温処置により、統計学的に有意な改善が示された（図１５Ｂ）。さらに、事前加温処置により、ＵＷ液、及びＵＷ＋ＦＰ液のいずれで保存された細胞についても、統計学的に有意な、ＲＯＳ活性の低減、及び定着効率の亢進が示された（図１５Ｃ及びＤ）。事前加温は細胞の低温ストレスを軽減する効果も有しており、当該効果により生存率の改善、ＲＯＳ活性の低減、及び定着効率の亢進がもたらされたと考えられる。
　以上の結果から、事前加温処置により、高分子ポリマー存在下でも、冷蔵保存後の細胞の低温ストレスが緩和されることが示された。
３）鉄キレート剤の添加及び事前加温による低温ストレス緩和の併用
　ＨｅｐａＳＨ細胞（６検体）を、ＵＷ＋ＦＰ液、又はＵＷ＋ＦＰ＆Ｄｅｆ液に、１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、４℃で９６時間保存した後、１０倍量の播種培地に細胞を懸濁し、恒温水槽中で３７℃で３０分間インキュベートすることにより事前加温（Ｐｒｅ－ｗａｒｍｉｎｇ）処置を行った。事前加温処置後の細胞を、コラーゲンＩコート２４ウェルプレートに播種し、一晩培養した後、実施例１に記載の方法に従い、播種の２４時間後の位相差像を撮影し、定着効率（Ｐｌａｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ）を算出した。その結果を図１６及び図１７に示す。鉄キレート剤の添加と、事前加温は、いずれも定着効率を統計学的に有意に亢進させることが示された。鉄キレート剤の添加と事前加温処置を併用した場合、定着効率は、対照（ＵＷ＋ＦＰ液、鉄キレート剤及び事前加温処置無し）と比較して統計学的に有意に亢進したが、鉄キレート剤の添加と事前加温処置の併用による相加・相乗効果は認められなかった。位相差像から、冷蔵保存されたいずれの細胞も、コンフルエントな状態で平面培養されたことが示された（図１７）。
　実施例１～４では、細胞保存液中での保存中に生じた細胞での虚血性ストレスが、保存後の細胞を培養基質上に播種して培養を開始した後に顕在化することが示されている。実施例１～４により、細胞保存液中での保存中は虚血性ストレスを受けても生存していた細胞を、保存後に培養基質上に播種して培養すると細胞死の亢進を生じ、培養基質上での培養における細胞の定着効率が低下することが示され、さらに、本発明により、そのような細胞死や定着効率の低下を顕著に改善できることが示された。
　本発明は、接着性細胞の非凍結状態での長期間の冷蔵保存において培養基質への定着能力を維持することができ、それにより冷蔵保存後に二次元培養に供する接着性細胞について空路輸送などの長距離輸送も可能にすることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (18)

  1. 　高分子ポリマーを含む細胞保存液中で接着性細胞を、非凍結状態で冷蔵保存することを含む、接着性細胞の保存方法。
  2. 　高分子ポリマーが脱アシル化ジェランガム又はその塩を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　接着性細胞を、二次元培養における培養基質への定着能力を保持しながら冷蔵保存する、請求項１に記載の方法。
  4. 　接着性細胞が、最長１００時間にわたり冷蔵保存される、請求項１に記載の方法。
  5. 　接着性細胞が、７０時間以上にわたり冷蔵保存される、請求項１に記載の方法。
  6. 　接着性細胞が肝細胞である、請求項１に記載の方法。
  7. 　接着性細胞が細胞保存液中で懸濁状態にある、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記細胞保存液が、鉄キレート剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. 　鉄キレート剤がデフェロキサミンを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の方法により、接着性細胞を冷蔵保存した後、接着性細胞を二次元培養することを含む、接着性細胞の培養方法。
  11. 　接着性細胞を、コラーゲンでコーティングされた培養基質上に播種し、二次元培養する、請求項１０に記載の方法。
  12. 　冷蔵保存した接着性細胞を、加温処置した後、二次元培養に供する、請求項１０に記載の方法。
  13. 　接着性細胞を非凍結状態で冷蔵保存するための、高分子ポリマーを含む細胞保存液。
  14. 　高分子ポリマーが脱アシル化ジェランガム又はその塩を含む、請求項１３に記載の細胞保存液。
  15. 　接着性細胞を、二次元培養における培養基質への定着能力を保持しながら冷蔵保存するための、請求項１３に記載の細胞保存液。
  16. 　接着性細胞を最長１００時間にわたり冷蔵保存するための、請求項１３に記載の細胞保存液。
  17. 　接着性細胞が肝細胞である、請求項１３に記載の細胞保存液。
  18. 　鉄キレート剤をさらに含む、請求項１３に記載の細胞保存液。
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