[go: up one dir, main page]

WO2025075163A1 - 自己反応性ｄｎ２ｂ細胞が産生する自己抗体およびその使用 - Google Patents

自己反応性ｄｎ２ｂ細胞が産生する自己抗体およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2025075163A1
WO2025075163A1 PCT/JP2024/035660 JP2024035660W WO2025075163A1 WO 2025075163 A1 WO2025075163 A1 WO 2025075163A1 JP 2024035660 W JP2024035660 W JP 2024035660W WO 2025075163 A1 WO2025075163 A1 WO 2025075163A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
antibody
amino acid
acid sequence
autoantibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/035660
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
康悦 小笠原
智徳 石井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku University NUC
Original Assignee
Tohoku University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tohoku University NUC filed Critical Tohoku University NUC
Publication of WO2025075163A1 publication Critical patent/WO2025075163A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to an autoantibody produced by autoreactive DN2B cells and its use. More specifically, the present invention relates to an autoantibody produced by autoreactive DN2B cells or an antigen-binding fragment thereof, an antibody having the antigen-binding site of the autoantibody, a diagnostic agent for systemic lupus erythematosus, and a method for testing a blood sample.
  • This application claims priority to U.S. Provisional Application No. 63/542,310, filed in the United States on October 4, 2023, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • SLE Systemic lupus erythematosus
  • Non-Patent Document 1 It has been reported that double negative 2 (DN2) cells are increased in SLE patients (Non-Patent Document 1).
  • the present disclosure aims to provide an antibody or an antigen-binding fragment thereof that is useful for diagnosing systemic lupus erythematosus, a diagnostic agent for systemic lupus erythematosus that uses the antibody or antigen-binding fragment, and a method for testing blood samples that is useful for diagnosing systemic lupus erythematosus.
  • the present disclosure includes the following aspects.
  • An antibody or an antigen-binding fragment thereof selected from the group consisting of the following (a) to (c): (a) an antibody comprising a heavy chain variable region having HCDR1, HCDR2 and HCDR3 derived from a V chain shown in Table 1 in any combination of Nos.
  • a diagnostic agent for systemic lupus erythematosus comprising the autoantibody or antigen-binding fragment thereof according to [1] or [2].
  • a diagnostic agent for systemic lupus erythematosus comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof according to [3] or [4].
  • a method for testing a blood sample comprising a step of measuring the expression level of an autoantibody produced by autoreactive DN2B cells in a blood sample collected from a test subject, wherein a higher expression level of the autoantibody than a reference value indicates a high possibility that the test subject is suffering from systemic lupus erythematosus.
  • the present disclosure provides an antibody or antigen-binding fragment thereof useful for diagnosing systemic lupus erythematosus, a diagnostic agent for systemic lupus erythematosus using the antibody or antigen-binding fragment, and a method for testing blood samples useful for diagnosing systemic lupus erythematosus.
  • Bar graph (n 1) examining PLD4 expression in immune cells from healthy donors (HD) and systemic lupus erythematosus (SLE) patients.
  • pDCs human plasmacytoid dendritic cells
  • BDCA-2 + cells indicate pDCs.
  • the results of FSC-A analysis of CD19 + cells, PLD4 + cells, and plasmablasts (PB) from SLE patients (SLE21, SLE17) are shown.
  • Flow cytometry plots compartmentalizing CD19 + B cells into "PLD4+ blast” and "PLD4+ small” based on PLD4 expression and FSC-A Box plot showing the proportion of PLD4+blasts in SLE patients. Box plot comparing SLEDAI scores between SLE patients with a high (H) and low (L) PLD4+ blast ratio. Box plot comparing SLEDAI scores between SLE patients with a high (H) and low (L) proportion of PLD4 + B cells. A plot evaluating the correlation between the ratio of PLD4+ blasts and the ratio of plasmablasts in SLE patients. Plot assessing the correlation between the proportion of PLD4 + B cells and the proportion of plasmablasts in SLE patients.
  • FIG. 1 shows the results of IgG ELISpot analysis of CD19 + B cells and PLD4 + blast cells collected from two SLE patients (SLE13 and SLE28) cultured in vitro for 4 days with a TLR7 ligand or a TLR9 ligand.
  • pDCs were defined as CD14-, CD3-, CD19-, and CD11c-negative and BDCA-2-positive.
  • B cells were defined as CD19-, CD2-, CD14-, and CD16-negative.
  • Tr transitional B cells
  • NAV naive B cells
  • Mem memory B cells
  • DN double negative B cells
  • PB plasmablasts. Box plots showing the results of comparing the proportions of each B cell subpopulation between CD19 + B cells and PLD4 + B cells. *P ⁇ 0.05, ***P ⁇ 0.005. Mann-Whitney U test.
  • Tr transitional B cells
  • NAV naive B cells
  • Mem memory B cells
  • DN double-negative B cells
  • PB plasmablasts.
  • Flow cytometry plots analyzing the ratios of CD11c + cells and CXCR5 - cells for the subpopulations of CD27 + memory cells and IgD + naive cells contained in PLD4 + blast.
  • Alexa488 Recombinant monoclonal antibody was used as the primary antibody, Purified anti-human CD16 (Mouse IgG) was used as the secondary antibody, and Goat anti-Mouse IgG (Alexa Fluor 488) was used as the tertiary antibody.
  • a numerical range expressed using " ⁇ ” means that the range includes the numbers written before and after " ⁇ " as the lower and upper limits.
  • the term “comprises” means that it may contain components other than the target component.
  • the term “consists of” means that it does not contain components other than the target component.
  • the term “consists essentially of” means that it does not contain components other than the target component in a form that exerts a special function (such as a form that completely loses the effect of the invention). In this specification, when “comprises,” it includes forms that "consist of” and forms that “consist essentially of.”
  • Proteins, peptides, nucleic acids, vectors, and cells may be isolated. "Isolated” means in a natural state or separated from other components. “Isolated” may be substantially free of other components. “Substantially free of other components” means that the content of other components contained in the isolated component is negligible. The content of other components contained in the isolated component may be, for example, 10% by mass or less, 5% by mass or less, 4% by mass or less, 3% by mass or less, 2% by mass or less, 1% by mass or less, 0.5% by mass or less, or 0.1% by mass or less.
  • the proteins, peptides, nucleic acids, vectors, and cells described herein may be isolated proteins, isolated peptides, isolated nucleic acids, isolated vectors, and isolated cells, respectively.
  • Nucleic acid sequences are written in generally accepted single letter codes unless otherwise indicated. Nucleic acid sequences are written from 5' to 3' unless otherwise indicated.
  • Amino acid sequences are written in the commonly accepted one-letter or three-letter codes unless otherwise specified. Amino acid sequences are written from N-terminus to C-terminus unless otherwise specified.
  • sequence identity between nucleic acid sequences or amino acid sequences is determined by aligning two nucleic acid sequences or amino acid sequences with gaps at the insertion and deletion sites so that the corresponding bases or amino acids are most commonly matched, and calculating the percentage of matching bases or amino acids relative to the entire nucleic acid sequence or the entire amino acid sequence excluding gaps in the resulting alignment.
  • sequence identity between nucleic acid sequences or amino acid sequences can be determined using various homology search software known in the art.
  • the value of sequence identity between nucleic acid sequences can be obtained by calculation based on an alignment obtained by the known homology search software BLASTN, and the value of sequence identity between amino acid sequences can be obtained by calculation based on an alignment obtained by the known homology search software BLASTP.
  • Antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, i.e., molecules that contain an antigen-binding site that specifically binds an antigen. Antibodies may be polyclonal, monoclonal, or chimeric.
  • the basic antibody structural unit is known to comprise a tetramer.
  • Each tetramer has two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one light chain (about 25 kDa) and one heavy chain (about 50-70 kDa).
  • the amino-terminal portion of each chain contains a variable region primarily responsible for antigen recognition.
  • the carboxy-terminal portion of each chain defines a constant region primarily responsible for effector function.
  • antibody molecules obtained from humans are associated with one of the classes IgG, IgM, IgA, IgE and IgD, which differ from each other depending on the nature of the heavy chain present in the molecule. Some classes have subclasses such as IgG1, IgG2.
  • the light chains may be kappa or lambda chains.
  • Antibodies may be derived from any organism. Examples of organisms from which antibodies may be derived include, but are not limited to, mammals (humans, mice, rats, rabbits, horses, cows, pigs, monkeys, dogs, etc.) and birds (chickens, ostriches).
  • Specifically bind means that an antibody reacts with one or more antigenic determinants of a specific antigen, but does not react with other antigens or binds with a much lower affinity.
  • the dissociation constant (KD) between the antibody and the specific antigen is preferably 10 -8 mol/L or less, and more preferably 10 -13 mol/L or more and 10 -9 mol/L or less.
  • the dissociation constant (KD) between the antibody and the specific antigen can be measured by a plasmon resonance assay (e.g., BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden, etc.) using purified antigen.
  • the complementarity determining region is the site in an antibody that is involved in binding to an antigen, and is the site in an antibody molecule where the amino acid sequence changes the most depending on the antigen.
  • CDR complementarity determining region
  • the three CDRs in the heavy chain variable region are referred to as HCDR1, HCDR2, and HCDR3, in order from the N-terminus.
  • the three CDRs in the light chain variable region are referred to as LCDR1, LCDR2, and LCDR3, in order from the N-terminus.
  • CDRs can be determined according to known definitions.
  • CDRs can be determined, for example, by the definitions of Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))) or Chothia (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) and Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)).
  • the CDR may be one defined on the ImMunoGeneTics (http://imgt.org) site.
  • a V gene segment, a D gene segment, and a J gene segment are rearranged to form a heavy chain variable region coding region.
  • a J gene segment and a J gene segment are rearranged to form a light chain variable region coding region.
  • HCDR3 is usually located in a region extending from the 3' end of the V region to the 5' end of the J region.
  • the region from the 104th cysteine residue (C) from the N-terminus encoded by the V region to the 5th tryptophan residue (W) from the N-terminus encoded by the J region may be defined as HCDR3.
  • LCDR3 is usually located in a region extending from the 3'-end of the V region to the 5'-end of the J region.
  • the region from the cysteine residue (C) located at the most C-terminus in the amino acid sequence encoded by the J region to the tryptophan residue (W) or phenylalanine residue (F) located at the most N-terminus in the amino acid sequence encoded by the J region may be defined as LCDR3.
  • Antigen-binding site refers to the site in an antibody that is involved in binding to an antigen.
  • the antigen-binding site preferably includes the HCDR3 of an antibody, more preferably includes the three CDRs of the heavy chain variable region (HCDR1 to HCDR3), and even more preferably includes the three CDRs of the heavy chain variable region (HCDR1 to HCDR3) and the three CDRs of the light chain variable region (LCDR1 to LCDR3).
  • Antibodies that include the same antigen-binding site bind to the same epitope.
  • an "antigen-binding fragment” refers to a polypeptide that contains a portion of an antibody and maintains the antigen-binding ability of the original antibody.
  • the antigen-binding fragment preferably contains the antigen-binding site of the original antibody, more preferably contains the HCDR3 of the original antibody, and further preferably contains all six CDRs (HCDR1 to HCDR3, LCDR1 to LCDR3) of the original antibody.
  • antigen-binding fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , variable region fragments (Fv), disulfide-linked Fv, single chain Fv (scFv), sc(Fv) 2 , and the like.
  • Autoantibody refers to an antibody that specifically binds to an antigen produced in one's own body.
  • Examples of autoantibodies include antinuclear antibodies.
  • Antinuclear antibodies refer to autoantibodies whose antigens are components that make up the cell nuclei present in one's own cells.
  • antinuclear antibodies include anti-dsDNA antibodies whose antigens are double-stranded DNA, anti-Sm antibodies whose antigens are non-histone nuclear proteins, and anti-histone antibodies whose antigens are histones.
  • DN2B cells refers to double negative 2B cells. DN2B cells are IgD-negative and CD27-negative B cells. "Autoreactive DN2B cells” are DN2B cells that produce autoantibodies. In one embodiment, autoreactive DN2B cells are strongly CD11c positive, CD21 negative, strongly CD19 positive, and CXCR5 negative. IgD (Immunoglobulin D) is composed of one pair of heavy chains and one pair of light chains. CD27 is a member of the TNF receptor superfamily.
  • Examples of the amino acid sequence of human CD27 include those registered under NCBI Reference Sequence: NP_001233.2, NP_001400192.1, NP_001400193.1, NP_001400194.1, NP_001400195.1, NP_001400196.1, or NP_001400197.1.
  • CD11c (ITGAX integrin subunit alpha X) is a member of the integrin family and covalently associates with the integrin ⁇ 2 chain. Examples of the amino acid sequence of human CD11c include those registered under NCBI Reference Sequence: NP_000878.2 or NP_001273304.1.
  • CD21 (CR2 complement C3d receptor 2) is a complement regulatory protein.
  • Examples of the amino acid sequence of human CD21 include those registered under NCBI Reference Sequence: NP_001006659.1 or NP_001868.2.
  • CD19 is a member of the immunoglobulin superfamily and is known as a B cell marker.
  • Examples of the amino acid sequence of human CD19 include those registered under NCBI Reference Sequence: NP_001171569.1, NP_001372661.1, or NP_001761.3.
  • CXCR5 CXC motif chemokine receptor 5
  • Examples of the amino acid sequence of human CXCR5 include those registered under NCBI Reference Sequence: NP_001707.1 or NP_116743.1.
  • a cell is "positive” for a protein means that the cell expresses the protein in detectable amounts. If a cell is positive for a membrane protein, the protein is present in detectable amounts on the cell membrane. A cell is "negative” for a protein means that the cell does not express that protein in detectable amounts. If a cell is negative for a membrane protein, the cell does not have detectable amounts of that protein present in its cell membrane.
  • the protein is a membrane protein, whether a cell is positive or negative for the protein can be determined by flow cytometry analysis using an antibody that specifically binds to the protein.
  • a cell When a cell is "strongly positive" for a protein, it means that the cell expresses a high amount of that protein compared to the average expression of that protein in cells of the same type. B cells that are strongly positive for CD11c express more of CD11c compared to the average expression of CD11c in B cells. B cells that are strongly positive for CD19 express more of CD19 compared to the average expression of CD19 in B cells.
  • PLD4 phospholipase D family member 4
  • PLD4 is an enzyme that catalyzes the reaction of hydrolyzing phosphatidylcholine to produce phosphatidic acid and choline, and induces various intracellular signal transduction.
  • amino acid sequence of human PLD4 include those registered in the NCBI Reference Sequence database as NP_001295103.1 (sequence number 131) and NP_620145.2 (sequence number 132).
  • a first aspect of the present disclosure is an autoantibody or an antigen-binding fragment thereof produced by DN2B cells.
  • the DN2B cells are IgD-negative and CD27-negative B cells.
  • the autoreactive DN2B cells are strongly CD11c-positive, CD21-negative, strongly CD19-positive, and CXCR5-negative.
  • the autoreactive DN2B cells are PLD4-positive.
  • the autoreactive DN2B cells can be obtained by obtaining IgD-negative and CD27-negative B cells by flow cytometry analysis, and then selecting cells that are strongly CD11c-positive, CD21-negative, strongly CD19-positive, and CXCR5-negative from this B cell fraction.
  • the autoreactive DN2B cells can be obtained by selecting PLD4-positive B cells by flow cytometry analysis.
  • PLD4-positive B cells refer to B cells that express PLD4 as a surface antigen. PLD4-positive B cells can be obtained by selecting B cells by flow cytometry analysis using an anti-PLD4 antibody. In the examples described below, PLD4-positive B cells are also referred to as "PLD4 + B cells.”
  • the animal from which the autoreactive DN2B cells are derived is not particularly limited.
  • animals from which the autoreactive DN2B cells are derived include mammals (humans, mice, rats, rabbits, horses, cows, pigs, monkeys, dogs, etc.), birds (chickens, ostriches), etc.
  • B cells can be isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by known methods.
  • B cells can be obtained from PBMCs, for example, using a commercially available B cell isolation kit.
  • the autoreactive DN2B cells may be induced by stimulating B cells with a TLR ligand.
  • TLR ligand examples include TLR7 ligands and TLR9 ligands.
  • TLR7 ligand examples include R-848 (Resiquimod), Gardiquimod, Imiquimod, Loxoribine, etc.
  • TLR9 ligand examples include oligonucleotides containing a CpG motif.
  • a drug that induces BCR cross-linking signaling may be used to induce the autoreactive DN2B cells.
  • the drug that induces BCR cross-linking signaling include anti-IgG antibodies or antigen-binding fragments thereof, and anti-IgM antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the autoreactive DN2B cells that produce autoantibodies may be autoreactive DN2B cells of similar size to plasmablasts (diameter of about 8 to 20 ⁇ m).
  • the 25th percentile of the FSC-A of plasmablasts determined by flow cytometry analysis may be set as a threshold (e.g., 60K), and autoreactive DN2 cells (hereinafter also referred to as "DN2B+blast” or "PLD4+blast”) larger than this FSC-A may be used.
  • DN2B+blast autoreactive DN2 cells
  • FSC-A represents the voltage pulse area where the FSC is detected by an optical detector.
  • autoreactive DN2B cells can be produced by known methods.
  • autoreactive DN2B cells can be produced by culturing P autoreactive DN2B cells in the presence of a TLR ligand (e.g., a TLR7 ligand, a TLR9 ligand, etc.).
  • a TLR ligand e.g., a TLR7 ligand, a TLR9 ligand, etc.
  • the medium used for culturing the autoreactive DN2B cells may be a medium normally used for culturing B cells.
  • Specific examples of the medium include RPMI1640 medium, Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, DMEM/F12 medium, Advanced DMEM/F12 medium, IMDM medium, Medium199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Ham's F12 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof. Serum (fetal bovine serum (FBS)), serum substitutes, etc. may be added to these media.
  • Autoreactive DN2B cells can produce autoantibodies by culturing them in the medium described above with the addition of a TLR ligand.
  • the culture conditions for autoreactive DN2B cells can be the same as those typically used for culturing B cells. Temperature conditions include 37°C, which is close to body temperature. Carbon dioxide concentrations include, for example, 0.03 to 10%, with 5% being a specific example.
  • the autoantibodies produced by autoreactive DN2B cells can be purified by combining known purification techniques such as salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and gel filtration chromatography.
  • Examples of autoantibodies produced from autoreactive DN2B cells include antibodies selected from the group consisting of the following (a) to (c): (a) an antibody comprising a heavy chain variable region having HCDR1, HCDR2 and HCDR3 derived from a V chain shown in Table 1 above in any combination of Nos. 1 to 10 of Table 1; (b) an antibody comprising a light chain variable region having LCDR1, LCDR2 and LCDR3 derived from a V chain shown in Table 2 above in any combination of Nos. 1 to 10 in Table 1; (c) An antibody comprising a heavy chain variable region having HCDR1, HCDR2, and HCDR3 derived from a V chain listed in Table 1 in any combination of Nos. 1 to 10 in Table 1, and a light chain variable region having LCDR1, LCDR2, and LCDR3 derived from a V chain listed in Table 2 in any combination of Nos. 1 to 10 in Table 1.
  • the heavy chain variable region defined by combination No. 1 has CDR1 and CDR2 derived from the V chain that is VH1-18-01, and HCDR3 No. 1 (CAREQLGLIDYW: SEQ ID NO: 10).
  • the heavy chain variable region defined by combination No. 2 has CDR1 and CDR2 derived from the V chain that is VH4-34-01, and HCDR3 of No. 2 (CARAGATLNRFDPW: SEQ ID NO: 11).
  • the heavy chain variable region defined by the combination of No. 3 has CDR1 and CDR2 derived from the V chain of VH1-18-01, and HCDR3 of No. 3 (CPRGIVVNWFDPW: SEQ ID NO: 12). The same applies to the heavy chain variable regions defined by the combinations of No. 4 to No. 10 in Table 1.
  • the light chain variable region defined by combination No. 1 has CDR1 and CDR2 derived from the V chain of KV1-16-02, and LCDR3 of No. 1 (CQQYSSYPRTF: SEQ ID NO: 20).
  • the light chain variable region defined by the combination of No. 2 has CDR1 and CDR2 derived from the V chain of KV2-30-02, and LCDR3 of No. 2 (CMQGTHWPPDPHTF: SEQ ID NO: 21).
  • the light chain variable region defined by the combination of No. 3 has CDR1 and CDR2 derived from the V chain of KV2-30-02, and HCDR3 of No. 3 (CQQYNSYPLTF: SEQ ID NO: 22). The same applies to the light chain variable regions defined by the combinations of No. 4 to No. 10 in Table 2.
  • the V chain sequences in Tables 1 and 2 can be obtained from the ImMunoGeneTics (http://imgt.org) website.
  • the V chains in Tables 1 and 2 are human V chains.
  • Amino acid sequences encoded by nucleic acid sequences that have 60% or more sequence identity to nucleic acid sequences registered in ImMunoGeneTics can be used as the amino acid sequences of the V chains listed in Tables 1 and 2.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH1-18-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:112.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH4-34-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:113.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH1-8-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:114.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH1-8-02 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:115.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH7-4-1-02 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:116.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH5-51-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:117.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH3-30-04 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:118.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH3-30-3-03 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:119.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH3-74-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:120.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH2-70-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:121.
  • the amino acid sequence of the V chain of VH3-64-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:122.
  • the amino acid sequence of the V chain of KV1-16-02 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:123.
  • the amino acid sequence of the V chain of KV2-30-02 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:124.
  • the amino acid sequence of the V chain of KV1-5-03 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:125.
  • the amino acid sequence of the V chain of KV3-15-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:126.
  • the amino acid sequence of the V chain of KV1-6-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:127.
  • the amino acid sequence of the V chain of KV3-20-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:128.
  • the amino acid sequence of the V chain of KV1-27-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:129.
  • the amino acid sequence of the V chain of KV1-NL1-01 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:130.
  • the heavy chain variable region of the combination No. 1 in Table 1 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:59.
  • the heavy chain variable region of the combination No. 2 in Table 1 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:60.
  • the heavy chain variable region of the combination No. 3 in Table 1 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:61.
  • the light chain variable region of the combination No. 1 in Table 2 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:65.
  • the light chain variable region of the combination No. 2 in Table 2 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:66.
  • the heavy chain variable region of the combination No. 3 in Table 2 includes an amino acid sequence having 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:67.
  • amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region of No. 1 in Table 1 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 77.
  • amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region of No. 1 in Table 1 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 78.
  • amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region of No. 2 in Table 1 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 80.
  • amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region of No. 2 in Table 1 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 81.
  • amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region of No. 3 in Table 1 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 83.
  • amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region of No. 3 in Table 1 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 84.
  • amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region of No. 1 in Table 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 97 or 98.
  • amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region of No. 1 in Table 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 99.
  • amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region of No. 2 in Table 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 101.
  • amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region of No. 1 in Table 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 102.
  • amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region of No. 3 in Table 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 104.
  • amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region of No. 3 in Table 2 is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 105.
  • autoantibodies produced by PLD4-positive B cells include the following antibodies:
  • An antibody comprising a heavy chain variable region including HCDR1 having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 77, 80 or 83, HCDR2 having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 78, 81 or 84, and HCDR3 having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 79, 82 or 85.
  • An antibody comprising a light chain variable region including an LCDR1 having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 97, 98, 101 or 104, an LCDR2 having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 99, 102 or 105, and an LCDR3 having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 100, 103, 106 or 107.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region defined in (4) above and a light chain variable region defined in (7) above.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region defined in (6) above and a light chain variable region defined in (9) above.
  • the HCDR1 to HCDR3 and LCDR1 to LCDR3 described in (1) to (9) above each preferably consist of the amino acid sequence of the designated sequence number.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region defined in (18) above and a light chain variable region defined in (21) above.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region defined in (17) above, the heavy chain variable region comprising HCDR1 to HCDR3 defined in (4) above, and a light chain variable region defined in (20) above, the light chain variable region comprising LCDR1 to LCDR3 defined in (7) above.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region defined in (18) above, the heavy chain variable region comprising HCDR1 to HCDR3 defined in (5) above, and a light chain variable region defined in (21) above, the light chain variable region comprising LCDR1 to LCDR3 defined in (8) above.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region defined in (19) above, the heavy chain variable region comprising HCDR1 to HCDR3 defined in (6) above, and a light chain variable region defined in (22) above, the light chain variable region comprising LCDR1 to LCDR3 defined in (9) above.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:59.
  • the mutation when the heavy chain variable region or the light chain variable region has a mutation with respect to the amino acid sequence described in the designated SEQ ID NO:, the mutation may be any of substitution, deletion, insertion, and addition, or a combination of these.
  • the mutation is preferably present in a region (framework region) other than the CDRs (HCDR1 to HCDR3, LCDR1 to LCDR3).
  • amino acids with similar chemical properties can be classified into groups, for example, acidic amino acids, basic amino acids, and neutral amino acids.
  • the acidic amino acid group includes aspartic acid and glutamic acid.
  • the basic amino acid group includes lysine, arginine, and histidine.
  • neutral amino acids can be further classified into amino acids with a hydrocarbon chain (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), amino acids with a hydroxyl group (serine, threonine), amino acids with a sulfur atom (cysteine, methionine), amino acids with an amide group (asparagine, glutamine), amino acids with an imino group (proline), amino acids with an aromatic group (phenylalanine, tyrosine, tryptophan), etc.
  • a hydrocarbon chain glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline
  • amino acids with a hydroxyl group serine, threonine
  • amino acids with a sulfur atom cysteine, methionine
  • amino acids with an amide group asparagine, glutamine
  • amino acids with an imino group proline
  • amino acids with an aromatic group phenylalanine, tyros
  • the autoantibody produced by autoreactive DN2B cells is preferably an antinuclear antibody. It is believed that the autoantibody produced by autoreactive DN2B cells is involved in the pathology of SLE. As shown in the examples described later, the BCR repertoire of autoreactive DN2B cells (especially PLD4+blast) is biased. Therefore, the antibody produced by autoreactive DN2B cells has the same base sequence as BCR and is an autoantibody. This autoantibody can be used as a marker for SLE. In addition, the autoantibody produced by autoreactive DN2B cells can be used as a diagnostic agent for SLE. For example, it can be used to quantify the autoantibody involved in the pathology of SLE in a blood sample (plasma, serum, etc.) to be tested by competitive ELISA or the like.
  • a second aspect of the present disclosure is an antibody (hereinafter also referred to as an "autoantibody-derived antibody”) or an antigen-binding fragment thereof, comprising an antigen-binding site contained in the autoantibody according to the first aspect (hereinafter also referred to as an "autoreactive DN2B cell-derived autoantibody”).
  • the autoantibody-derived antibody preferably contains a heavy chain variable region including HCDR3 possessed by an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody. It is more preferable that the autoantibody-derived antibody contains a heavy chain variable region including HCDR1 to HCDR3 possessed by an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody. It is even more preferable that the autoantibody-derived antibody contains a heavy chain variable region including HCDR1 to HCDR3 possessed by an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody, and a light chain variable region including LCDR1 to LCDR3 possessed by an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody.
  • Antibodies derived from autoantibodies can be obtained, for example, by using antibody genes possessed by autoreactive DN2B cells.
  • messenger RNA mRNA
  • cDNA complementary DNA
  • the heavy chain VDJ region and light chain VJ region are amplified from the cDNA by a nucleic acid amplification method (e.g., PCR method), and the obtained fragment is linked to a constant region coding sequence and cloned into an appropriate expression vector.
  • the expression vector is introduced into an appropriate cell and cultured to obtain an autoantibody-derived antibody.
  • the autoantibody-derived antibody can be purified by a known purification method (salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, etc.).
  • the constant region coding sequence may be derived from the same animal species as the animal species from which the autoreactive DN2B cells are derived, or may be derived from a different animal species.
  • An autoantibody-derived antibody may be obtained by designing an antibody gene or an antigen-binding fragment gene based on the amino acid sequence of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody.
  • a nucleic acid sequence encoding HCDR1 to HCDR3 of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody is linked to a nucleic acid sequence encoding a heavy chain framework (FR) to design a heavy chain variable region coding sequence.
  • FR heavy chain framework
  • a nucleic acid having a heavy chain variable region coding sequence may be chemically synthesized by the phosphoramidite method or the like.
  • a nucleic acid having a heavy chain variable region coding sequence is linked to a heavy chain constant region coding sequence and cloned into an appropriate expression vector.
  • a nucleic acid sequence encoding LCDR1 to LCDR3 of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody is linked to a nucleic acid sequence encoding a light chain framework (FR) to design a light chain variable region coding sequence.
  • a nucleic acid having a light chain variable region coding sequence may be chemically synthesized by the phosphoramidite method or the like.
  • a nucleic acid having a light chain variable region coding sequence is linked to a light chain constant region coding sequence and cloned into an appropriate expression vector.
  • the heavy chain coding sequence and the light chain coding sequence may be cloned into the same expression vector. This expression vector can be introduced into appropriate cells and cultured to obtain an autoantibody-derived antibody.
  • the FR coding sequence and the constant region coding sequence may be derived from the same animal species as the animal species from which the DN2B cells are derived, or may be derived from a different animal species.
  • the heavy chain variable region and/or the light chain variable region may be derived from an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody in its entirety, including the FCDR and FR.
  • the autoantibody-derived antibody may be obtained by producing a transgenic animal incorporating a gene encoding the autoantibody-derived antibody designed as described above.
  • the autoantibody-derived antibody can be obtained by purifying the body fluids (e.g., blood, milk, etc.) of the transgenic animal.
  • the nucleic acid sequence encoding the antigen-binding fragment can be designed appropriately depending on the structure of the antigen-binding fragment.
  • scFv has a structure in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked by a linker. Therefore, by linking a heavy chain variable region containing HCDR1 to HCDR3 of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody and a light chain variable region containing LCDR1 to LCDR3 of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody via a linker coding sequence, a nucleic acid containing an scFv coding sequence can be obtained.
  • Antibodies derived from autoantibodies include antibodies selected from the group consisting of (a) to (c) above, and antibodies selected from the group consisting of (1) to (37) above.
  • Representative examples of nucleic acid sequences encoding the V chains and CDRs in Tables 1 and 2 described in (a) to (c) are shown in Tables 8 to 13.
  • Representative examples of nucleic acid sequences encoding the amino acid sequences of the SEQ ID NOs designated in (1) to (37) are shown in Tables 14 to 17.
  • the autoantibody-derived antibody has the same antigen specificity as the autoreactive DN2B cell-derived autoantibody. Therefore, the autoantibody-derived antibody binds to an antigen produced in the body of the individual from which the autoreactive DN2B cell is derived.
  • the autoantibody-derived antibody is preferably an antinuclear antibody. Since the autoantibody-derived antibody has the same antigen specificity as the autoreactive DN2B cell-derived autoantibody, it can be used as a diagnostic agent for SLE, similar to the autoreactive DN2B cell-derived autoantibody.
  • a third aspect of the present disclosure is a diagnostic agent for systemic lupus erythematosus (hereinafter also referred to as an "SLE diagnostic agent”), which comprises at least one selected from the group consisting of the autoantibody according to the first aspect (autoreactive DN2B cell-derived autoantibody) or an antigen-binding fragment thereof, and the antibody according to the third aspect (antibody derived from an autoantibody) or an antigen-binding fragment thereof.
  • SLE diagnostic agent for systemic lupus erythematosus
  • the SLE diagnostic agent may contain other components in addition to at least one of the autoreactive DN2B cell-derived autoantibody, the autoantibody-derived antibody, and the antigen-binding fragment thereof.
  • the other components include, but are not limited to, solvents, diluents, vehicles, excipients, flow enhancers, binders, granulating agents, dispersing agents, suspending agents, wetting agents, lubricants, disintegrants, solubilizing agents, stabilizers, emulsifiers, and fillers.
  • One type of pharma- ceutically acceptable carrier may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the SLE diagnostic agent may be at least one of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody, an autoantibody-derived antibody, and an antigen-binding fragment thereof dissolved in a buffer solution.
  • the SLE diagnostic agent may be at least one of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody, an autoantibody-derived antibody, and an antigen-binding fragment thereof dissolved in a buffer solution and lyophilized.
  • buffer solutions include, but are not limited to, phosphate buffered saline, Tris buffer, citrate buffer, acetate buffer, etc.
  • the autoreactive DN2B cell-derived autoantibody, the autoantibody-derived antibody, and the antigen-binding fragments thereof may be labeled.
  • the labeling substance for labeling is not particularly limited, and any known substance may be used.
  • the labeling substance include enzyme labeling substances, fluorescent labeling substances, radioisotope labeling substances, electrochemiluminescence labeling substances, metal nanoparticles, and the like.
  • the enzyme labeling substance include peroxidase (e.g., horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, and the like.
  • fluorescent labeling substance examples include carboxyfluorescein (FAM), 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein (JOE), fluorescein isothiocyanate (FITC), tetrachlorofluorescein (TET), 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (HEX), Cy3, Cy5, Alexa568, Alexa647, and the like.
  • radioisotope-labeled substances examples include iodine-125.
  • electrochemiluminescent labeling substances include ruthenium complexes. Labeling can be performed by appropriately selecting a known method depending on the type of labeling substance.
  • the SLE diagnostic agent may be combined with other items to form an SLE diagnostic kit.
  • Other items included in the SLE diagnostic kit include instruments and reagents used in competitive ELISA.
  • Instruments used in competitive ELISA include, but are not limited to, solid-phase carriers such as well plates, antigens, labeling substance detection reagents, blood sample preparation reagents, diluents, buffer solutions, blocking reagents, and instructions for use.
  • the autoreactive DN2B cell-derived autoantibody and the autoantibody-derived antibody are antinuclear antibodies
  • the antigen may be cells of the animal species from which the autoreactive DN2B cells are derived.
  • a fourth aspect of the present disclosure is a method for testing a blood sample.
  • the method includes a step of measuring the expression level of an autoantibody produced by autoreactive DN2B cells in a blood sample collected from a test subject.
  • a higher expression level of the autoantibody than a reference value indicates that the test subject is likely to be affected by systemic lupus erythematosus.
  • the test of the blood sample can be performed in vitro.
  • the test subject is a subject to be tested for the possibility of suffering from SLE.
  • the test subject is not particularly limited as long as it is an animal that may suffer from SLE. Specific examples of the test subject include humans and non-human mammals.
  • Blood sample refers to a sample derived from blood components collected from a test subject.
  • Blood samples include plasma, serum, and blood cells, as well as samples obtained by subjecting these to some kind of processing.
  • Samples obtained by processing blood cells include cell populations obtained by culturing blood cells, and culture supernatants obtained by culturing blood cells.
  • Methods for measuring the expression level of autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies include a method for measuring the mRNA of autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies and a method for measuring autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies.
  • a sample containing B cells is used as the blood sample.
  • An example of the sample containing B cells is peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • a cell population obtained by culturing a blood cell sample (e.g., PBMCs) containing B cells in the presence of a TLR ligand (TLR7 ligand, TLR9 ligand, etc.) may be used.
  • a known method can be used for measuring mRNA.
  • An example of a method for measuring mRNA is RT-qPCR.
  • a primer specific to the mRNA of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody is used as a primer for use in RT-qPCR.
  • Such a primer can be designed, for example, from any of the nucleic acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 50 to 55 (see Tables 8 to 13).
  • the primer is preferably a primer capable of amplifying the heavy chain variable region coding region or the light chain variable region coding region of an autoreactive DN2B cell-derived autoantibody, and more preferably a primer capable of amplifying the heavy chain variable region coding region.
  • the primer is preferably a primer capable of amplifying at least a part of the HCDR3 coding region or the LCDR3 coding region, and more preferably a primer capable of amplifying at least a part of the HCDR3 coding region.
  • the forward primer can be designed, for example, to anneal to a region 5' from the HCDR3 coding region.
  • the reverse primer can be designed, for example, to anneal to a region including at least a part of the HCDR3 coding region.
  • Measurement of mRNA also allows detection of autoantibodies and diagnosis of SLE.
  • primers capable of amplifying nucleic acid sequences encoding H1 to H3 can be used.
  • Specific examples of nucleic acid sequences encoding H1 to H3 are shown in Tables 8 to 10, respectively.
  • primers can be designed in the region where the sequences of H1-1 to H1-5 shown in Table 8 are common.
  • the blood sample may be plasma or serum, or may be a culture supernatant obtained by culturing a blood cell sample (e.g., PBMC) containing B cells in the presence of a TLR ligand (e.g., TLR7 ligand, TLR9 ligand, etc.).
  • a blood cell sample e.g., PBMC
  • TLR ligand e.g., TLR7 ligand, TLR9 ligand, etc.
  • Methods for measuring autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies include, for example, competitive ELISA using at least one selected from the group consisting of isolated autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies, autoantibody-derived antibodies, and antigen-binding fragments thereof (hereinafter also referred to as "test antibody").
  • test antibody an antigen is immobilized on a solid-phase carrier such as a well plate, and reacted with a blood sample and a labeled test antibody. The binding of the test antibody to the antigen is inhibited depending on the amount of autoreactive DN2B cell-derived autoantibody contained in the blood sample.
  • the autoreactive DN2B cell-derived autoantibody present in the blood sample can be measured by measuring the test antibody bound to the antigen.
  • the test antibody is an antinuclear antibody
  • the antigen can be cells of the same animal species as the test subject.
  • an expression level of autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies higher than the reference value indicates that the test subject is highly likely to be suffering from SLE.
  • an expression level of autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies higher than the reference value indicates that the blood sample is derived from a test subject who is highly likely to be suffering from SLE.
  • An expression level of autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies lower than the reference value indicates that the blood sample is derived from a test subject who is low likely to be suffering from SLE.
  • the reference value may be, for example, a numerical value calculated by performing statistical processing or the like from the expression levels of autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies measured in a group of healthy subjects consisting of an arbitrary number of people.
  • the reference value may be, for example, a numerical value calculated by performing statistical processing or the like from the expression levels of autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies measured in a group of subjects consisting of an arbitrary number of people suffering from SLE.
  • the reference value may be, for example, a cutoff value calculated by ROC analysis or the like from the expression levels of autoreactive DN2B cell-derived autoantibodies measured in a group of healthy subjects and a group of subjects suffering from SLE.
  • the method of this embodiment may include other steps in addition to the measurement step.
  • the other steps include a step of definitively diagnosing SLE in a test subject who is likely to have SLE, and a step of treating SLE in a test subject who is likely to have SLE.
  • SLE can be diagnosed, for example, by clinical and immunological findings associated with the symptoms of SLE.
  • SLE treatment methods include, for example, administration of nonsteroidal anti-inflammatory drugs, glucocorticoids, hydroxychloroquine, and immunosuppressants.
  • the present disclosure may also include the following aspects.
  • a method for diagnosing systemic lupus erythematosus comprising a step of measuring the expression level of an autoantibody produced by autoreactive DN2B cells in a blood sample collected from a test subject, wherein a higher expression level of the autoantibody than a standard value indicates a high possibility that the test subject is suffering from systemic lupus erythematosus.
  • a method for treating systemic lupus erythematosus comprising: a step (a) of measuring the expression level of an autoantibody produced by autoreactive DN2B cells in a blood sample collected from the test subject; a step (b) of determining that the test subject, in which the expression level of the autoantibody measured in the step (a) is higher than a reference value, is suffering from systemic lupus erythematosus; and a step (c) of treating the test subject for systemic lupus erythematosus determined to be suffering from systemic lupus erythematosus in the step (b).
  • (C) A method for collecting data for diagnosing systemic lupus erythematosus, comprising a step of measuring the expression level of an autoantibody produced by autoreactive DN2B cells in a blood sample collected from a test subject, wherein a higher expression level of the autoantibody than a standard value indicates a high possibility that the test subject is suffering from systemic lupus erythematosus.
  • D Systemic lupus erythematosus markers including DN2B cell-derived autoantibodies.
  • F Use of a polypeptide selected from the group consisting of an isolated DN2B cell-derived autoantibody, an autoantibody-derived antibody, and an antigen-binding fragment thereof, for the manufacture of a diagnostic agent for systemic lupus erythematosus.
  • Anti-human PLD4 monoclonal antibodies were generated by immunizing female BALB/c mice with a purified recombinant fusion protein (cDNA: SEQ ID NO: 1) in which the extracellular domain of the PLD4 molecule was bound to the Fc region of mouse immunoglobulin (Ig) G2a.
  • cDNA SEQ ID NO: 1
  • Ig mouse immunoglobulin
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell isolation and naive B cell isolation
  • PBMCs PBMCs after removal of RBCs were used for flow cytometry, cell culture, or isolation of naive B cells.
  • Naive B cells were isolated using the Naive B Cell Isolation Kit ii, human (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • RT-qPCR real-time quantitative PCR analysis of PLD4 gene expression
  • ABI Prism 7000 Applied Biosystems
  • cDNA was synthesized from individual cells using the SYBR green qPCR SuperMix-UDG kit (Invitrogen).
  • human PBMCs were isolated from apheresis products of healthy donor blood (Memorial Blood Centers of Minnesota, Minneapolis, MN, USA) (Takeda Y, S, et al. Int J Mol Sci 2017 18:1162.).
  • tissue expression BD TM MTC multiple tissue cDNA panel (Takara Bio) was used.
  • PCR was performed using ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). 50 cycles of 50°C, 2 minutes; 95°C, 10 minutes; 95°C, 15 seconds; and 60°C, 1 minute were performed. Each transcript was normalized with the value of human glyceraldehyde-3-phosphatase (GAPDH) gene to account for sample variability.
  • GPDH human glyceraldehyde-3-phosphatase
  • PLD4 sense primer sequence 1 5'-AGGACATCCACCGACCTG-3' (SEQ ID NO: 2)
  • PLD4 sense primer sequence 2 5'-GTGAAAGTCTTCATCGTGCCG-3' (SEQ ID NO: 3)
  • PLD4 antisense primer sequence 1 5'-GCAAAACCCCTGTGA-3' (SEQ ID NO: 4)
  • PLD4 antisense primer sequence 2 5'-GTGCTGCTGAAGTAATCCTCC-3' (SEQ ID NO: 5)
  • GAPDH sense primer sequence 5'-AGCCACATCGCTCAGACAG-3' (SEQ ID NO: 6)
  • RT-qPCR was performed to estimate the expression of PLD4 in cultured naive B cells.
  • Total RNA was extracted from cultured naive B cells using RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen), and cDNA was synthesized using ReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo).
  • the relative expression of PLD4 was analyzed by RT-qPCR using SYBR Green PCR kit (Qiagen).
  • PCR was performed using CFX Connect TM Real Time System (BioRad). PCR was performed for 40 cycles of 50°C, 2 minutes; 95°C, 15 minutes; 94°C, 10 seconds; 55°C, 1 minute; and 72°C, 1 minute.
  • RNA expression was normalized to the housekeeping gene ⁇ 2MG.
  • PBMCs (1 ⁇ 10 6 cells/tube) suspended in staining buffer (PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) and 10% normal mouse serum (Abeam, Cambridge, UK) were stained with the following fluorescent antibodies.
  • staining buffer PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) and 10% normal mouse serum (Abeam, Cambridge, UK)
  • B cells were defined using CD20 (PE-Cy7) and CD3CD14CD16 (V450). PLD4 was then stained as described above. To remove dead cells, 5 ⁇ L of 7-AAD (BD Pharmingen) was added to 100 ⁇ L of cell solution 5 min before cytometric analysis. Compensation was performed using anti-mouse Ig, ⁇ /Negative Control Compensation Particle Set (BD, Biosciences).
  • 7-AAD BD Pharmingen
  • mice were fixed and permeabilized with True-Nuclear TM Transcription Factor Buffer Set (BioLegend) according to the manufacturer's instructions.
  • Mouse IgG (Peprotech, NJ, USA) was added at a concentration of 100 ⁇ g/mL to block non-specific binding, followed by the addition of fluorescent antibodies against T-bet (APC) or mouse IgG1 (APC).
  • APC fluorescent antibodies against T-bet
  • API mouse IgG1
  • Flow cytometry data were analyzed using FlowJo software (Treestar).
  • PLD4+ blast or CD19 + B cells were sorted using FACS Aria II (BD, Biosciences). Because the number of sortable PLD4+ blast cells was not sufficiently large (maximum 3,000 cells from 20 mL of peripheral blood), CD19- and CD3 + , CD14 + , or CD16 + cells (non-B cell PBMCs) were simultaneously sorted as scaffold cells.
  • RPMI1640 no stimulation
  • 0.15 ⁇ M CpG ODN 2006 Invivogen
  • 1 ⁇ g/mL R848 Sigma-Aldrich
  • AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Antihuman IgG and IgM H+L
  • Jackson ImmunoResearch PA, USA
  • IgG-ASCs IgG antibody-secreting cells
  • 1,000 sorted PLD4+blast or plasmablast-gated CD19 + B cells were plated with 10,000 non-B PBMCs. Then, 1 ⁇ g/mL R848 or 0.15 ⁇ M CpG ODN 2006 was added. After 4 days of culture, IgG-ASCs were counted by ELISpot.
  • IgG-secreting cells were detected using ELISpot Human IgG (HRP) Kit (Mabtech) according to the manufacturer's instructions. Briefly, Multiscreen IP HTS 0.45 ⁇ m (Merck Millipore) was coated with 15 ⁇ g/mL anti-IgG antibody overnight at 4°C. The wells were washed twice with PBS and then blocked with PBS and 1% BSA for 1 h. After removing the blocking solution, cultured cells were added to the wells and incubated at 37°C under 5% CO2 for 16-20 h.
  • HRP ELISpot Human IgG Kit
  • BCR repertoire analysis of cultured B cells B cell receptor (BCR) repertoire analysis was performed similarly to the method previously described for T cell repertoire (Cho M, Ishida K, et al. Int Immunol. 2008 Jan;20(1):155-64). Briefly, cultured B cells were harvested and washed with PBS by centrifugation. First-strand cDNA was synthesized using oligo(dT) primers and SuperscriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen), and second-strand cDNA was synthesized using RNase H and T4 DNA polymerase (Invitrogen). A short adapter with "T” replaced by "U” was ligated to the cDNA library.
  • Uracil DNA Glycosylase (Takara) was added to digest the short strands and generate single-stranded adapter ligations.
  • the adapted library was amplified by PCR.
  • the amplified products (BCR library) were sequenced using a next-generation sequencer (Illumina) according to the manufacturer's instructions. Sequencing results were analyzed using IMGT-V-QUEST (https://www.imgt.org/IMGT_vquest/input). Sequences sharing identical V- and J-gene segments and with identical CDR3 sequences were identified as identical.
  • V(D)J and constant region (IgG1) sequences were amplified separately by PCR, and sequences overlapping the vector cloning site were added.
  • the PCR products were individually inserted into pHEK Ultra expression vector (Takara Bio) using NEBuilder HiFi DNA Assembly cloning kit (New England BioLabs).
  • the closed vector containing the V(D)J + constant region sequence was transformed into One Shot Top10 chemically competent Escherichia coli cells (Invitrogen), cultured overnight, and the plasmid was purified using Plasmid Midi kit (Qiagen).
  • This plasmid was transfected into Expi293FTM cells using ScreenFectTMUP-293 kit (FUJIFILM Wako). Expi293 cells were grown to 7.5 x 107 cells. After 5 days of culture, secreted mAbs were purified using Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs (Cytiva). Specifically, the cultured cell supernatant was added to a PierceTM Disposable 5 mL Polypropylene Column (Thermo Fisher Scientific) loaded with 500 ⁇ L of Protein G Sepharose. After washing the column with 20 mM sodium phosphate, the antibody was eluted with 100 mM Tris-HCl (pH 9.0).
  • a control antibody for enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
  • IgG sequence from B cells isolated from a normal donor was subcloned, and then mAbs were synthesized and purified.
  • ELISA Human Antinuclear Antibody
  • ANA Human Antinuclear Antibody
  • CUSABIO Human Antinuclear Antibody
  • sera from SLE patients known to be ANA + and sera from healthy subjects were used at 101-fold dilution.
  • 50 ⁇ g/mL of PLD4+blast-derived mAbs or mAbs from control samples were added to the healthy subject sera.
  • OD450 was measured for each sample.
  • PLD4 is predominantly expressed in pDCs and then B cells
  • SAGE sequence analysis of gene expression comparing gene transcription in human plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and monocytes detected that the PLD4 gene was predominantly transcribed in pDCs (Takeda Y, et al. Int J Mol Sci 2017 18:1162.).
  • RT-qPCR was performed using pDCs, B cells, T cells, monocytes, and natural killer cells to examine PLD4 mRNA expression in peripheral immune cells. As a result, PLD4 expression was highest in pDCs, followed by B cells. PLD4 expression in B cells was much lower than that in pDCs ( Figure 1A).
  • PLD4 + pDCs The frequency of PLD4 + pDCs was similar to that of HD, but PLD4 + B cells were significantly increased in SLE patients (Fig. 1C).
  • B cells from SLE patients have various characteristics. For example, transitional B cells, double negative (DN) cells, and plasmablasts are increased in SLE patients compared to healthy controls (Akita K, et al, Front Immunol. 2020;11:498703; doi 10.3389/fimmu.2020.498703; Wardowska A, et al. Int Immunopharmacol. 2020 Jun 1;83:106451; doi 10.1016/j.intimp.2020.106451; Grodonne Y, et al. J Autoimmun.
  • PLD4+blast overlaps phenotypically and functionally with DN2B cells
  • PLD4 + B cells contain almost no plasmablasts, so we considered that these PLD4 + B cells were more activated than other cells and focused on cells with a size similar to that of plasmablasts. Therefore, we defined the larger portion of PLD4 + B cells as "PLD4 + blast” and the rest as “PLD4 + small” by using the 25th percentile of FSC-A of plasmablasts as a threshold (Fig. 1E).
  • PLD4+blast Further characterization of PLD4+blast revealed that it overlapped with DN2 cells, which are phenotypically characterized as IgD- , CD27- , CD11c ++ , and CXCR5- (Fig. 2A).
  • DN2 cells which are phenotypically characterized as IgD- , CD27- , CD11c ++ , and CXCR5- (Fig. 2A).
  • PLD4+blast were not included in the DN cell population (IgD + or CD27 + cells), and most were CD11c ++ and CXCR5- cells, suggesting that PLD4+blast are highly homogenous in terms of cell ontology (Fig. 7A).
  • intracellular staining of the transcription factor T-bet revealed that most of the PLD4+blast were T-bet++, one of the key features of DN2B cells (Fig. 2B).
  • TLR7 or TLR9 Stimulation of TLR7 or TLR9 is sufficient to induce PLD4 + B cells in HD.
  • PBMCs isolated from HD were stimulated with anti-IgG/IgM (BCR cross-linking), TLR7 ligand alone, TLR9 ligand alone, or BCR + TLR9 ligand, and flow cytometry analysis was performed on the second day.
  • PLD4 + B cells were not induced by BCR signal alone, but PLD4 + B cells were significantly induced by TLR alone or BCR + TLR stimulation (Figure 3A, B).
  • PLD4+blast was obtained from one patient with an SLE flare who had elevated antibody titers of anti-dsDNA antibodies (>400 IU/mL), anti-Sm antibodies (>46 IU/mL), and anti-SS-A antibodies (>1200 IU/mL) and had developed class IV lupus nephritis.
  • PLD4+blast accounted for 8.5% of CD19 + B cells.
  • the obtained PLD4+blast was stimulated with TLR7 ligands and inflammatory cytokines for 4 days to promote the differentiation of B cells into antibody-secreting cells (ASCs).
  • ASCs antibody-secreting cells
  • the repertoire of TLR-stimulated PLD4+blast was biased.
  • the ratio of the top three repertoires accounted for more than 50% of the total, but this was probably due to stimulation and culture, and was not included in the repertoire of CD19 + B cells cultured in a similar manner (Tables 2 to 5).
  • these amplified repertoires were probably repertoires of antibodies secreted in vitro, and synthesized recombinant monoclonal antibodies from the sequences of the three largest repertoires. Of the three antibodies synthesized, two showed antinuclear activity in ELISA ( Figure 4D). Therefore, PLD4+blast is likely to contain autoreactive cells.
  • Table 4 shows the top 10 heavy chain sequences obtained from the repertoire analysis of cultured PLD4+blast.
  • Table 5 shows the top 10 ⁇ chain sequences obtained from the repertoire analysis of cultured PLD4+blast.
  • Table 6 shows the top 10 heavy chain sequences obtained in the repertoire analysis of cultured CD19 + B cells.
  • Table 7 shows the top 10 ⁇ chain sequences obtained in the repertoire analysis of cultured CD19 + B cells.
  • amino acid sequences of the V chains in Tables 2 and 4 above can be obtained from the ImMunoGeneTics (IMGT) IMGT Repertoire (IG and TR) website (https://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/#h2_4).
  • IMGT ImMunoGeneTics
  • IG and TR IMGT Repertoire
  • nucleic acid sequence of H1 is shown in Table 8.
  • nucleic acid sequence of H2 is shown in Table 9.
  • nucleic acid sequence of H3 is shown in Table 10.
  • nucleic acid sequence of L1 is shown in Table 11.
  • nucleic acid sequence for L2 is shown in Table 12.
  • nucleic acid sequence for L3 is shown in Table 13.
  • the boxed "atg” indicates the translation initiation site of BCR mRNA.
  • the portion from this "atg” to the underlined sequence is the signal peptide.
  • the underlined sequence indicates the start of the variable region of the BCR.
  • the double underlines indicate, from the 5' side, CDR1, CDR2 and CDR3.
  • the sequences of the H1, H2 and H3 variable regions are shown in Table 14.
  • the sequences of the L1, L2 and L3 variable regions are shown in Table 15.
  • the sequences of the CDRs of H1, H2 and H3 are shown in Table 16.
  • the sequences of the CDRs of L1, L2 and L3 are shown in Table 17.
  • a fraction of cells thought to be autoantibody-producing cells was obtained from the peripheral blood of SLE patients and used as a positive control cell population.
  • the autoantibody gene (H1) was amplified by RT-PCR for the cell populations isolated from the peripheral blood of SLE patients, the cell populations from the peripheral blood of healthy subjects, and the positive control.
  • the RT-PCR method is shown below.
  • SLE positive control
  • PLD4-positive cells and peripheral blood mononuclear cells not containing B cells were stimulated with R848 (TLR7/8 ligand). Only PLD4-positive cells were antibody-producing cells.
  • the Amplification Plot and Melt Curve Plot when using the index-head (internal control) primer are shown in Figures 8A and 8B, respectively.
  • the present disclosure provides an antibody or antigen-binding fragment thereof useful for diagnosing systemic lupus erythematosus, a diagnostic agent for systemic lupus erythematosus using the antibody or antigen-binding fragment, and a method for testing blood samples useful for diagnosing systemic lupus erythematosus.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体又はその抗原結合断片。また、前記自己抗体の抗原結合部位を含む抗体又はその抗原断片。また、前記自己抗体若しくは前記抗体又はそれらの抗原結合断片を含む、全身性エリテマトーデスの診断薬。また、検査対象から採取された血液試料において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から産生される自己抗体の発現量を測定する工程を含み、前記自己抗体の発現量が基準値よりも高いことが、前記検査対象が全身性エリテマトーデスに罹患している可能性が高いことを示す、血液試料の検査方法。

Description

自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体およびその使用
　本発明は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体又はその抗原結合断片、前記自己抗体の抗原結合部位を有する抗体、全身性エリテマトーデスの診断薬、および血液試料の検査方法に関する。
　本願は、２０２３年１０月４日に、米国に出願された米国仮出願第６３／５４２，３１０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、血液に複数の自己抗体が存在することを特徴とする自己免疫性慢性疾患である。これらの自己抗体は、免疫複合体を形成することにより臓器組織に沈着し、病原性の役割を果たすと考えられている。
　ＳＬＥ患者においては、ダブルネガティブ２（ＤＮ２）細胞が増加していることが報告されている（非特許文献１）。
Jenks SA, Cashman KS, Zumaquero E, Marigorta UM, Patel AV, Wang Xiaoqian, et al. Distinct Effector B Cells Induced by Unregulated Toll-like Receptor 7 Contribute to Pathogenic Responses in Systemic Lupus Erythematosus. Immunity. 2018 Oct 16;49(4):725-739.e6; doi 10.1016/j.immuni.2018.08.015
　本開示は、全身性エリテマトーデスの診断に有用な抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又は抗原結合断片を用いた全身性エリテマトーデスの診断薬、および全身性エリテマトーデスの診断に有用な血液試料の検査方法を提供することを課題とする。
　本開示は、以下の態様を含む。
　［１］自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体又はその抗原結合断片。
　［２］前記自己抗体が抗核抗体である、［１］に記載の自己抗体又はその抗原結合断片。
　［３］［１］又は［２］に記載の自己抗体が含む抗原結合部位を含む抗体又はその抗原結合断片。
　［４］下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される抗体又はその抗原結合断片：
　（ａ）表１に記載のＶ鎖に由来するＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２並びにＨＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する重鎖可変領域を含む抗体；
　（ｂ）表２に記載のＶ鎖に由来するＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２並びにＬＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する軽鎖可変領域を含む抗体；
　（ｃ）表１に記載のＶ鎖に由来するＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２並びにＨＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する重鎖可変領域と、表２に記載のＶ鎖に由来するＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２並びにＬＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する軽鎖可変領域と、を含む抗体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　［５］［１］又は［２］に記載の自己抗体又はその抗原結合断片を含む、全身性エリテマトーデスの診断薬。
　［６］［３］又は［４］に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、全身性エリテマトーデスの診断薬。
　［７］検査対象から採取された血液試料において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から産生される自己抗体の発現量を測定する工程を含み、前記自己抗体の発現量が基準値よりも高いことが、前記検査対象が全身性エリテマトーデスに罹患している可能性が高いことを示す、血液試料の検査方法。
　本開示によれば、全身性エリテマトーデスの診断に有用な抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又は抗原結合断片を用いた全身性エリテマトーデスの診断薬、および全身性エリテマトーデスの診断に有用な血液試料の検査方法を提供することができる。
健常ドナー（ＨＤ）と全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の免疫細胞におけるＰＬＤ４発現を調べた棒グラフ（ｎ＝１）。 ＨＤおよびＳＬＥ患者のヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）およびＢ細胞におけるＰＬＤ４＋細胞を示す代表的なフローサイトメトリープロット。ＢＤＣＡ－２＋細胞はｐＤＣを示す。ＣＤ１９＋細胞はＢ細胞を示す。 ＨＤ（ｎ＝１９）およびＳＬＥ患者（ｎ＝４０）におけるＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の比率を示す箱ひげ図。 ＳＬＥ患者（ＳＬＥ２１、ＳＬＥ１７）のＣＤ１９＋細胞、ＰＬＤ４＋細胞、および形質芽細胞（ＰＢ）について、ＦＳＣ－Ａを解析した結果を示す。 ＰＬＤ４発現とＦＳＣ－Ａに基づいて、ＣＤ１９＋　Ｂ細胞を「ＰＬＤ４＋　ｂｌａｓｔ」および「ＰＬＤ４＋　ｓｍａｌｌ」にコンパ―メント化したフローサイトメトリープロット。 ＳＬＥ患者におけるＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率を示す箱ひげ図。 ＳＬＥ患者をＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率が高い群（Ｈ）および低い群（Ｌ）でＳＬＥＤＡＩスコアを比較した箱ひげ図。 ＳＬＥ患者をＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の比率が高い群（Ｈ）および低い群（Ｌ）でＳＬＥＤＡＩスコアを比較した箱ひげ図。 ＳＬＥ患者において、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率と形質芽細胞の比率との相関を評価したプロット図。 ＳＬＥ患者において、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の比率と形質芽細胞の比率との相関を評価したプロット図。 代表的なＳＬＥ患者において、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞、ＰＬＤ４＋ｓｍａｌｌ、およびＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの各細胞集団におけるＤＮ２Ｂ細胞（ＣＤ２７－、ＣＸＣＲ５－）の比率を評価したフローサイトメトリープロット。 代表的なＳＬＥ患者において、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞、ＰＬＤ４＋ｓｍａｌｌ、およびＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの各細胞集団における細胞内Ｔ－ｂｅｔの陽性度を示すヒストグラム。 ＤＮ２Ｂ細胞の比率とＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率との相関を示すプロット図。 ＤＮ２Ｂ細胞をＰＬＤ４およびＦＳＣ－Ａで評価した代表的なプロ―サイトメトリープロット。 ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率が高い群（Ｈ）および低い群（Ｌ）で、腎炎の合併率を比較した棒グラフ。＊＊＊Ｐ＜０．００５。Ｆｉｓｈｅｒの正確検定とＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定。 ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率が高い群（Ｈ）および低い群（Ｌ）で、抗Ｓｍ抗体価を比較した棒グラフ。＊＊＊Ｐ＜０．００５。Ｆｉｓｈｅｒの正確検定とＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定。 ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率が高い群（Ｈ）および低い群（Ｌ）で、抗ｄｓＤＮＡ抗体価を比較した棒グラフ。ｎｓ，有意差なし。Ｆｉｓｈｅｒの正確検定とＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定。 新たにＳＬＥを発症した１１人の患者において、免疫抑制療法前および免疫抑制療法後のＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率を解析した図。＊＊＊Ｐ＜０．００５。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定。 ＨＤのＰＢＭＣを、刺激物質（抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（ＢＣＲ架橋）、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド）とともにｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養したときの代表的なフローサイトメトリープロット。 ＨＤのＰＢＭＣを、刺激物質（抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（ＢＣＲ架橋）、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド）とともにｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養したときに誘導されたＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の比率を比較した箱ひげ図。＊＊＊Ｐ＜０．００５。Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定。 ３人のＨＤから単離したナイーブＢ細胞をＴＬＲ９リガンド有りまたはＴＬＲ９リガンド無しで２日間培養した後、ＰＬＤ４　ｍＲＮＡの発現をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した結果を示すグラフ。＊Ｐ＜０．０５。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定。 ２人のＳＬＥ患者（ＳＬＥ１３、ＳＬＥ２８）から採取された形質芽細胞（Ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔ）およびＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔを、ＰＶＤＦ膜に直接播種した後、ＩｇＧ　ＥＬＩＳｐｏｔを行った結果を示す図。 ２人のＳＬＥ患者（ＳＬＥ１３、ＳＬＥ２８）から採取したＣＤ１９＋　Ｂ細胞及びＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔを、ＴＬＲ７リガンド又はＴＬＲ９リガンドとともにｉｎ　ｖｉｔｒｏで４日間培養し、ＩｇＧ　ＥＬＩＳｐｏｔを行った結果を示す図。 図４ＢのＥＬＩＳｐｏｔの結果から算出されたＢ細胞１０００個当たりのスポット数を示すグラフ。 培養ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔのレパトアから作製されたから組み換えモノクローナルを用いたＥＬＩＳＡにより得られたＯＤ４５０の測定値を示す棒グラフ。Ｉ：Ｈ１＋Ｌ１，ＩＩ：Ｈ２＋Ｌ２，ＩＩＩ：Ｈ３＋Ｌ３，ＩＶ：１人のＨＤからのランダム増幅モノクローナル抗体，Ｖ：ＨＤ血清，ＶＩ：ＳＬＥ患者血清。ＮＤ，検出されず。 複数の臓器組織のｃＤＮＡ（ｎ＝１）についてＲＴ－ｑＰＣＲによりＰＬＤ４　ｍＲＮＡを定量した結果を示す棒グラフ。ＰＬＤ４　ｍＲＮＡの相対発現量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現により正規化した。Ｂｒ：脳、Ｃｏｌ：結腸、Ｈｒｔ：心臓、Ｋｉｄ：腎臓、Ｌｅｕ：白血球、Ｌｉｖ：肝臓、Ｍｕ：筋肉、Ｏｖ：卵巣、Ｐａｎ：膵臓、Ｐｌａ：胎盤、Ｐｒｏ：前立腺、Ｓ．Ｉｎｔ：小腸、Ｓｐｌ：脾臓、Ｔｅｓ：精巣、Ｔｈｙ：胸腺。 フローサイトメトリーのゲーティングストラテジーを示す図。ｐＤＣは、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３陰性、ＣＤ１９陰性およびＣＤ１１ｃ陰性で、ＢＤＣＡ－２陽性と定義した。Ｂ細胞は、ＣＤ１９陽性で、ＣＤ２陰性、ＣＤ１４陰性およびＣＤ１６陰性と定義した。 ＨＤから採取されたＣＤ３＋ＣＤ４＋　Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ８＋　Ｔ細胞、ＣＤ１４＋細胞およびＣＤ１６＋細胞の亜集団におけるＰＬＤ４の陽性度を示す代表的なヒストグラム。 ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｂ細胞（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ）、ナイーブＢ細胞（Ｎａｉｖｅ）、ダブルネガティブＢ細胞（ＤＮ）、メモリーＢ細胞（Ｍｅｍｏｒｙ）および形質芽細胞（Ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔ）を定義するフローサイトメトリーのゲーティングストラテジーを示す図。 Ｂ細胞の各亜集団の比率をＨＤ（ｎ＝６）およびＳＬＥ患者（ｎ＝３６）で比較した結果を示す箱ひげ図。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００５。Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定。Ｔｒ：ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｂ細胞、ＮＡＶ：ナイーブＢ細胞、Ｍｅｍ：メモリーＢ細胞、ＤＮ：ダブルネガティブＢ細胞、ＰＢ：形質芽細胞。 Ｂ細胞の各亜集団の比率をＣＤ１９＋　Ｂ細胞およびＰＬＤ４＋　Ｂ細胞で比較した結果を示す箱ひげ図。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００５。Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定。Ｔｒ：ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｂ細胞、ＮＡＶ：ナイーブＢ細胞、Ｍｅｍ：メモリーＢ細胞、ＤＮ：ダブルネガティブＢ細胞、ＰＢ：形質芽細胞。 ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔに含まれるＣＤ２７＋メモリー細胞およびＩｇＤ＋ナイーブ細胞の亜集団について、ＣＤ１１ｃ＋細胞およびＣＸＣＲ５－細胞の比率を解析したフローサイトメトリープロット。 ＳＬＥ患者におけるＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率と血清Ｃ３値（左図）および血清Ｃ４値（右図）との相関を評価したプロット図。スピアマン順位相関係数（ρ）およびｐ値を示す。 陽性対照、ＳＬＥ患者ＰＢＭＣおよびＨＤのＰＢＭＣから取得されたｃＤＮＡにおいて、Ｉｎｄｅｘ－ｈｅａｄ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ）用プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行ったときのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｌｏｔ。 陽性対照（２Ｈ）、ＳＬＥ患者ＰＢＭＣ（４Ｈ）およびＨＤのＰＢＭＣ（６Ｈ）から取得されたｃＤＮＡにおいて、Ｉｎｄｅｘ－ｈｅａｄ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ）用プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行ったときのＭｅｌｔ　Ｃｕｒｖｅ　Ｐｌｏｔ。 陽性対照（２Ｈ）、ＳＬＥ患者ＰＢＭＣ（４Ｈ）およびＨＤのＰＢＭＣ（６Ｈ）から取得されたｃＤＮＡにおいて、Ｈ１用プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行ったときのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｌｏｔ。 陽性対照（２Ｈ）、ＳＬＥ患者ＰＢＭＣ（４Ｈ）およびＨＤのＰＢＭＣ（６Ｈ）から取得されたｃＤＮＡにおいて、Ｈ１用プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行ったときのＭｅｌｔ　Ｃｕｒｖｅ　Ｐｌｏｔ。 Ｈ１（ＶＨ１－１８－０１－Ｊ４－０２） の核酸配列を用いて作製された組み換えモノクローナル抗体を用いて行われた蛍光免疫染色画像。ＤＡＰＩ：ＤＡＰＩ染色。Ａｌｅｘａ４８８：１次抗体として組み換えモノクローナル抗体、２次抗体としてＰｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ１６　（Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ）、３次抗体としてＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８）を用いた。
　「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　特に明示されない限り、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数および複数を包含し、「１以上」と理解される。
　「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）態様を包含する。
　タンパク質、ペプチド、核酸、ベクター、及び細胞は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態又は他の成分から分離された状態を意味する。「単離された」ものは、他の成分を実質的に含まないものであり得る。「他の成分を実質的に含まない」とは、単離された成分に含まれる他の成分の含有量が無視できる程度であることを意味する。単離された成分に含まれる他の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、４質量％以下、３質量％以下、２質量％以下、１質量％以下、０．５質量％以下、又は０．１質量％以下であり得る。本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド、核酸、ベクター、及び細胞は、それぞれ、単離されたタンパク質、単離されたペプチド、単離された核酸、単離されたベクター、及び単離された細胞であり得る。
　核酸配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。特に明示しない限り、核酸配列は、５’側から３’側に向かって記載される。
　アミノ酸配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コード又は３文字コードで記載される。特に明示しない限り、アミノ酸配列は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載される。
　核酸配列どうし又はアミノ酸配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つの核酸配列又はアミノ酸配列を、対応する塩基又はアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアライメント中のギャップを除く、核酸配列全体又はアミノ酸配列全体に対する一致した塩基又はアミノ酸の割合として求められる。核酸配列又はアミノ酸配列どうしの配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、核酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができ、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
　「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。抗体はポリクローナルでもよく、モノクローナルでもよく、キメラでもよい。
　基本的抗体構造単位は４量体を含むことが知られている。各４量体は同一の２対のポリペプチド鎖を有し、各対が１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）および１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は抗原認識を主に担っている可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能を主に担っている定常領域を定義している。一般的に、ヒトから得られた抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質により相互に異なっているクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連する。一部のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２のようなサブクラスを有する。ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であってよい。
　抗体は、いずれの生物に由来するものでもよい。抗体が由来する生物としては、例えば、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、イヌ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　「特異的に結合する」とは、抗体が特定の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応するが、他の抗原とは反応しないか、はるかに低値の親和性で結合することを意味する。抗体が特定の抗原に特異的に結合する場合、抗体と特定の抗原と解離定数（ＫＤ）は、１０－８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１０－１３ｍｏｌ／Ｌ以上１０－９ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。抗体と特定の抗原と解離定数（ＫＤ）は、精製抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ等）等により測定することができる。
　相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体において抗原との結合に関与する部位であり、抗体分子中で抗原に応じて最もアミノ酸配列が変化する部位である。ＣＤＲは、一般的に、重鎖可変領域に３つ、および軽鎖可変領域に３つ存在する。本明細書および請求の範囲においては、重鎖可変領域に存在する３つのＣＤＲを、Ｎ末端側から順にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と記載する。軽鎖可変領域に存在する３つのＣＤＲを、Ｎ末端側から順にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と記載する。ＣＤＲは、公知の定義により決定することができる。ＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))）、又はＣｈｏｔｈｉａ（Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) and Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)）の定義により、決定することができる。
　ＣＤＲは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）のサイトで定義されるものを用いてもよい。ヒトの抗体の重鎖の遺伝子座では、Ｖ遺伝子断片、Ｄ遺伝子断片、およびＪ遺伝子断片が再構成されて、重鎖可変領域コード領域が形成される。ヒトの抗体の軽鎖の遺伝子座では、Ｊ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片が再構成されて、軽鎖可変領域コード領域が形成される。
　ＨＣＤＲ３は、通常、Ｖ領域の３’末端からＪ領域の５’末端にわたる領域に位置する。Ｖ領域にコードされるＮ末端側から１０４番目のシステイン残基（Ｃ）から、Ｊ領域にコードされるＮ末端側５番目のトリプトファン残基（Ｗ）までの領域を、ＨＣＤＲ３として定義してもよい。
　ＬＣＤＲ３は、通常、Ｖ領域の３’末端からＪ領域の５’末端にわたる領域に位置する。Ｊ領域にコードされるアミノ酸配列において最もＣ末端側に位置するシステイン残基（Ｃ）から、Ｊ領域にコードされるアミノ酸配列において最もＮ末端側に位置するトリプトファン残基（Ｗ）もしくはフェニルアラニン残基（Ｆ）までの領域を、ＬＣＤＲ３として定義してもよい。
　「抗原結合部位」とは、抗体において抗原との結合に関与する部位を指す。抗原結合部位は、抗体のＨＣＤＲ３を含むことが好ましく、重鎖可変領域の３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３）を含むことがより好ましく、重鎖可変領域の３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３）および軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３）を含むことがさらに好ましい。同一の抗原結合部位を含む抗体は、同一のエピトープに結合する。
　「抗原結合断片」は、抗体の一部を含むポリペプチドであって、元の抗体の抗原結合性を維持しているポリペプチドを指す。抗原結合断片は、元の抗体の抗原結合部位を含むことが好ましく、元の抗体のＨＣＤＲ３を有することがより好ましく、元の抗体の６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３）を全て含むことがさらに好ましい。抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２等が挙げられる。
　「自己抗体」とは、自己の体内で生成される抗原に対して特異的に結合する抗体を指す。自己抗体としては、例えば、抗核抗体が挙げられる。
　「抗核抗体」とは、自己の細胞中に存在する細胞核を構成する成分を抗原とする自己抗体を指す。抗核抗体としては、例えば、二本鎖ＤＮＡを抗原とする抗ｄｓＤＮＡ抗体、非ヒストン核タンパク質を抗原とする抗Ｓｍ抗体、ヒストンを抗原とする抗ヒストン抗体等が挙げられる。
　「ＤＮ２Ｂ細胞」とは、ダブルネガティブ２Ｂ細胞を指す。ＤＮ２Ｂ細胞は、ＩｇＤ陰性且つＣＤ２７陰性のＢ細胞である。「自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞」とは、自己抗体を産生するＤＮ２Ｂ細胞である。一実施形態において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞は、ＣＤ１１ｃ強陽性、ＣＤ２１陰性、ＣＤ１９強陽性、且つＣＸＣＲ５陰性である。
　ＩｇＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ　Ｄ）は、１対の重鎖及び１対の軽鎖から構成される。
　ＣＤ２７は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ヒトＣＤ２７のアミノ酸配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１２３３．２、ＮＰ＿００１４００１９２．１、ＮＰ＿００１４００１９３．１、ＮＰ＿００１４００１９４．１、ＮＰ＿００１４００１９５．１、ＮＰ＿００１４００１９６．１、又はＮＰ＿００１４００１９７．１で登録されたもの等が挙げられる。
　ＣＤ１１ｃ（ＩＴＧＡＸ　ｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ａｌｐｈａ　Ｘ）は、インテグリンファミリーのメンバーであり、インテグリンβ２鎖と共有結合的に会合する。ヒトＣＤ１１ｃのアミノ酸配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００８７８．２、又はＮＰ＿００１２７３３０４．１で登録されたもの等が挙げられる。
　ＣＤ２１（ＣＲ２　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｃ３ｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２）は、補体調節タンパク質である。ヒトＣＤ２１のアミノ酸配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１００６６５９．１、又はＮＰ＿００１８６８．２で登録されたもの等が挙げられる。
　ＣＤ１９は、免疫グロブロンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞マーカーとして知られている。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１１７１５６９．１、ＮＰ＿００１３７２６６１．１、又はＮＰ＿００１７６１．３で登録されたもの等が挙げられる。
　ＣＸＣＲ５（Ｃ－Ｘ－Ｃ　ｍｏｔｉｆ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５）は、ＣＸＣケモカイン受容体ファミリーのメンバーである。ヒトＣＸＣＲ５のアミノ酸配列としては、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１７０７．１、又はＮＰ＿１１６７４３．１で登録されたもの等が挙げられる。
　細胞がタンパク質に関して「陽性」とは、細胞が当該タンパク質を検出可能な量で発現していることを意味する。細胞が膜タンパク質について陽性である場合、当該細胞の細胞膜には当該タンパク質が検出可能な量で存在している。
　細胞がタンパク質に関して「陰性」とは、細胞が当該タンパク質を検出可能な量で発現していないことを意味する。細胞が膜タンパク質について陰性である場合、当該細胞の細胞膜には当該タンパク質が検出可能な量で存在していない。
　タンパク質が膜タンパク質である場合、細胞が当該タンパク質について陽性であるか陰性であるかは、当該タンパク質に特異的に結合する抗体を用いたフローサイトメトリー解析により、判定することができる。
　細胞がタンパク質に関して「強陽性」とは、細胞が、同種の細胞における当該タンパク質の平均的な発現量と比較して、当該タンパク質を多く発現していることを意味する。ＣＤ１１ｃ強陽性であるＢ細胞は、Ｂ細胞におけるＣＤ１１ｃの平均的な発現量と比較して、ＣＤ１１ｃを多く発現している。ＣＤ１９強陽性であるＢ細胞は、Ｂ細胞におけるＣＤ１９の平均的な発現量と比較して、ＣＤ１９を多く発現している。
　「ＰＬＤ４」（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｄ　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　４）は、ホスファチジルコリンを加水分解してホスファチジン酸とコリンを産生する反応を触媒し、様々な細胞内シグナル伝達を引き起こす酵素である。ヒトＰＬＤ４のアミノ酸配列としては、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースに、ＮＰ＿００１２９５１０３．１（配列番号１３１）およびＮＰ＿６２０１４５．２（配列番号１３２）として登録されたものが挙げられる。
　［ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体又はその抗原結合断片］
　本開示の第１の態様は、ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体又はその抗原結合断片である。
　ＤＮ２Ｂ細胞は、ＩｇＤ陰性且つＣＤ２７陰性のＢ細胞である。一実施形態において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞は、ＣＤ１１ｃ強陽性、ＣＤ２１陰性、ＣＤ１９強陽性、且つＣＸＣＲ５陰性である。一実施形態において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞は、ＰＬＤ４陽性である。自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞は、フローサイトメトリー解析により、ＩｇＤ陰性且つＣＤ２７陰性のＢ細胞を取得し、次いでこのＢ細胞画分から、ＣＤ１１ｃ強陽性、ＣＤ２１陰性、ＣＤ１９強陽性、且つＣＸＣＲ５陰性である細胞を選別することにより、取得することができる。あるいは、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞は、フローサイトメトリー解析により、ＰＬＤ４陽性Ｂ細胞を選別することにより取得することができる。
　「ＰＬＤ４陽性Ｂ細胞」とは、ＰＬＤ４を表面抗原として発現するＢ細胞を指す。ＰＬＤ４陽性Ｂ細胞は、抗ＰＬＤ４抗体を用いたフローサイトメトリー解析によりＢ細胞を選別することにより取得することができる。後述の実施例において、ＰＬＤ４陽性Ｂ細胞は、「ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞」とも記載される。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞の由来する動物は特に限定されない。例えば、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が由来する動物としては、哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、イヌ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ）等が挙げられる。
　Ｂ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から公知の方法により単離することができる。Ｂ細胞は、例えば、市販のＢ細胞単離キットを用いて、ＰＢＭＣから取得することができる。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞は、Ｂ細胞をＴＬＲリガンドで刺激することにより誘導してもよい。ＴＬＲリガンドとしては、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド等が挙げられる。ＴＬＲ７リガンドとしては、Ｒ－８４８（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ等が挙げられる。ＴＬＲ９リガンドとしては、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞の誘導には、ＴＬＲリガンドに加えて、ＢＣＲ架橋シグナリングを誘導する薬剤を用いてもよい。ＢＣＲ架橋シグナリングを誘導する薬剤としては、例えば、抗ＩｇＧ抗体もしくはその抗原結合断片、抗ＩｇＭ抗体もしくはその抗原結合断片等が挙げられる。
　自己抗体を産生させる自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞は、形質芽細胞（ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔ）と同程度の大きさ（直径８～２０μｍ程度）の自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞を用いてもよい。例えば、フローサイトメトリー解析により、形質芽細胞のＦＳＣ－Ａの２５パーセンタイルを閾値（例えば、６０Ｋ）とし、このＦＳＣ－Ａよりも大きい自己反応性ＤＮ２細胞（以下、「ＤＮ２Ｂ＋ｂｌａｓｔ」又は「ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔ」ともいう）を用いてもよい。「ＦＳＣ」は、細胞にレーザーが照射された場合の前方散乱光を表す。「ＦＳＣ－Ａ」は、ＦＳＣが光学検出器により検出された電圧パルス面積を表す。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞からの自己抗体の産生は、公知の方法により行うことができる。例えば、Ｐ自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞を、ＴＬＲリガンド（例えば、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド等）の存在下で培養することにより、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から自己抗体を産生させることができる。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞の培養に用いる培地は、Ｂ細胞の培養に通常用いられる培地を用いることができる。培地の具体例としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられる。これらの培地に、血清（ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））、血清代替物等を添加してもよい。自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞は、前記のような培地に、ＴＬＲリガンドを添加して培養することにより、自己抗体を産生させることができる。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞の培養条件は、Ｂ細胞の培養に通常用いられる培養条件とすることができる。温度条件としては、体温に近い３７℃が挙げられる。二酸化炭素濃度としては、例えば、０．０３～１０％が挙げられ、具体例としては５％が挙げられる。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から産生された自己抗体は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知の精製手法を組み合わせて、精製することができる。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から産生される自己抗体としては、例えば、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される抗体が挙げられる。
　（ａ）上記表１に記載のＶ鎖に由来するＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２並びにＨＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する重鎖可変領域を含む抗体；
　（ｂ）上記表２に記載のＶ鎖に由来するＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２並びにＬＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する軽鎖可変領域を含む抗体；
　（ｃ）上記表１に記載のＶ鎖に由来するＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２並びにＨＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する重鎖可変領域と、表２に記載のＶ鎖に由来するＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２並びにＬＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　表１において、Ｎｏ．１の組合せで定義される重鎖可変領域は、ＶＨ１－１８－０１であるＶ鎖に由来するＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに、Ｎｏ．１のＨＣＤＲ３（ＣＡＲＥＱＬＧＬＩＤＹＷ：配列番号１０）を有する。
　表１において、Ｎｏ．２の組合せで定義される重鎖可変領域は、ＶＨ４－３４－０１であるＶ鎖に由来するＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに、Ｎｏ．２のＨＣＤＲ３（ＣＡＲＡＧＡＴＬＮＲＦＤＰＷ：配列番号１１）を有する。
　表１において、Ｎｏ．３の組合せで定義される重鎖可変領域は、ＶＨ１－１８－０１であるＶ鎖に由来するＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに、Ｎｏ．３のＨＣＤＲ３（ＣＰＲＧＩＶＶＮＷＦＤＰＷ：配列番号１２）を有する。
　表１におけるＮｏ４～Ｎｏ．１０の組合せで定義される重鎖可変領域も同様である。
　表２において、Ｎｏ．１の組合せで定義され軽鎖可変領域は、ＫＶ１－１６－０２であるＶ鎖に由来するＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに、Ｎｏ．１のＬＣＤＲ３（ＣＱＱＹＳＳＹＰＲＴＦ：配列番号２０）を有する。
　表２において、Ｎｏ．２の組合せで定義される軽鎖可変領域は、ＫＶ２－３０－０２であるＶ鎖に由来するＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに、Ｎｏ．２のＬＣＤＲ３（ＣＭＱＧＴＨＷＰＰＤＰＨＴＦ：配列番号２１）を有する。
　表２において、Ｎｏ．３の組合せで定義される軽鎖可変領域は、ＫＶ２－３０－０２であるＶ鎖に由来するＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに、Ｎｏ．３のＨＣＤＲ３（ＣＱＱＹＮＳＹＰＬＴＦ：配列番号２２）を有する。
　表２におけるＮｏ４～Ｎｏ．１０の組合せで定義される軽鎖可変領域も同様である。
　表１および表２のＶ鎖の配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）のサイトから取得することができる。表１および表２のＶ鎖は、ヒトのＶ鎖である。ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓに登録されている核酸配列に６０％以上の配列同一性を有する核酸配列にコードされるアミノ酸配列を、表１および表２に記載のＶ鎖のアミノ酸配列として用いることができる。
　ＶＨ１－１８－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１１２に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ４－３４－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１１３に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ１－８－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ１－８－０２のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１１５に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ７－４－１－０２のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ５－５１－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ３－３０－０４のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ３－３０－３－０３のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ３－７４－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ２－７０－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２１に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＶＨ３－６４－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２２に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＫＶ１－１６－０２のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２３に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＫＶ２－３０－０２のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２４に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＫＶ１－５－０３のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２５に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＫＶ３－１５－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２６に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＫＶ１－６－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＫＶ３－２０－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＫＶ１－２７－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＫＶ１－ＮＬ１－０１のＶ鎖のアミノ酸配列としては、配列番号１３０に記載のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　表１のＮｏ．１の組合せの重鎖可変領域としては、配列番号５９に記載されるアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　表１のＮｏ．２の組合せの重鎖可変領域としては、配列番号６０に記載されるアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　表１のＮｏ．３の組合せの重鎖可変領域としては、配列番号６１に記載されるアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　表２のＮｏ．１の組合せの軽鎖可変領域としては、配列番号６５に記載されるアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　表２のＮｏ．２の組合せの軽鎖可変領域としては、配列番号６６に記載されるアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　表２のＮｏ．３の組合せの重鎖可変領域としては、配列番号６７に記載されるアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　表１のＮｏ．１の重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１のアミノ酸配列としては、配列番号７７に記載のアミノ酸配列が挙げられる。表１のＮｏ．１の重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ２のアミノ酸配列としては、配列番号７８に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　表１のＮｏ．２の重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１のアミノ酸配列としては、配列番号８０に記載のアミノ酸配列が挙げられる。表１のＮｏ．２の重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ２のアミノ酸配列としては、配列番号８１に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　表１のＮｏ．３の重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１のアミノ酸配列としては、配列番号８３に記載のアミノ酸配列が挙げられる。表１のＮｏ．３の重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ２のアミノ酸配列としては、配列番号８４に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　表２のＮｏ．１の軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１のアミノ酸配列としては、配列番号９７または９８に記載のアミノ酸配列が挙げられる。表２のＮｏ．１の軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ２のアミノ酸配列としては、配列番号９９に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　表２のＮｏ．２の軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１のアミノ酸配列としては、配列番号１０１に記載のアミノ酸配列が挙げられる。表２のＮｏ．１の軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ２のアミノ酸配列としては、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　表２のＮｏ．３の軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１のアミノ酸配列としては、配列番号１０４に記載のアミノ酸配列が挙げられる。表２のＮｏ．３の軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ２のアミノ酸配列としては、配列番号１０５に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　ＰＬＤ４陽性Ｂ細胞から産生される自己抗体の具体例としては、例えば、以下の抗体が挙げられる。
　（１）配列番号７７、８０または８３に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７８、８１または８４に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および、配列番号７９、８２または８５に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（２）配列番号９７、９８、１０１または１０４に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号９９、１０２または１０５に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および、配列番号１００、１０３、１０６または１０７に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（３）上記（１）に定義される重鎖可変領域と、上記（２）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（４）配列番号７７に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および、配列番号７９に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（５）配列番号８０に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号８１に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および、配列番号８２に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（６）配列番号８３に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および、配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（７）配列番号９７または９８に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号９９に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および、配列番号１００に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（８）配列番号１０１に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および、配列番号１０３に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（９）配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０５に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および、配列番号１０６または１０７に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（１０）上記（４）～（６）のいずれかに定義される重鎖可変領域と、上記（７）～（９）のいずれかに定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（１１）上記（４）に定義される重鎖可変領域と、上記（７）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（１２）上記（５）に定義される重鎖可変領域と、上記（８）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（１３）上記（６）に定義される重鎖可変領域と、上記（９）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　前記（１）～（９）に記載されるＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３は、それぞれ指定される配列番号のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
　（１４）配列番号５９～６１のいずれかに記載されるアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（１５）配列番号６５～６７のいずれかに記載されるアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（１６）上記（１４）に定義される重鎖可変領域と、上記（１５）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（１７）配列番号５９に記載されるアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（１８）配列番号６０に記載のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（１９）配列番号６１に記載のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（２０）配列番号６５に記載のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（２１）配列番号６６に記載のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（２２）配列番号６７に記載のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（２３）上記（１７）に定義される重鎖可変領域と、上記（２０）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（２４）上記（１８）に定義される重鎖可変領域と、上記（２１）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（２５）上記（１９）に定義される重鎖可変領域と、上記（２２）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（２６）上記（１７）に定義される重鎖可変領域であって、上記（４）に定義されるＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、上記（２０）に定義される重鎖可変領域であって、上記（７）に定義されるＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（２７）上記（１８）に定義される重鎖可変領域であって、上記（５）に定義されるＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、上記（２１）に定義される重鎖可変領域であって、上記（８）に定義されるＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（２８）上記（１９）に定義される重鎖可変領域であって、上記（６）に定義されるＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、上記（２２）に定義される重鎖可変領域であって、上記（９）に定義されるＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（２９）配列番号５９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（３０）配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（３１）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体。
　（３２）配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（３３）配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（３４）配列番号６７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
　（３５）上記（２９）に定義される重鎖可変領域と、上記（３２）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（３６）上記（３０）に定義される重鎖可変領域と、上記（３３）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　（３７）上記（３１）に定義される重鎖可変領域と、上記（３４）に定義される軽鎖可変領域と、を含む抗体。
　上記（１４）～（２２）において、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域が、指定される配列番号に記載のアミノ酸配列に対して変異を有する場合、前記変異は、置換、欠失、挿入および付加のいずれでもよく、これらの組合せでもよい。前記変異は、ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３）以外の領域（フレームワーク領域）に存在することが好ましい。
　アミノ酸配列のアミノ酸残基が置換される場合、元のアミノ酸残基が有する側鎖と化学的性質が類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれる。
　化学的性質が類似するアミノ酸は、例えば、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、および中性アミノ酸のグループに分類することができる。
　酸性アミノ酸のグループとしては、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。塩基性アミノ酸のグループとしては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。中性アミノ酸は、側鎖に応じてさらに、炭化水素鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン）、ヒドロキシ基を有するアミノ酸（セリン、スレオニン）、硫黄原子を有するアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を有するアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を有するアミノ酸（プロリン）、芳香族基を有するアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）等に分類することができる。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体は、好ましくは抗核抗体である。自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体は、ＳＬＥの病態に関与すると考えられる。後述する実施例に示すように、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞（特にＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔ）のＢＣＲレパトアには偏りがある。したがって、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する抗体は、ＢＣＲと同じ塩基配列であって、自己抗体である。この自己抗体は、ＳＬＥのマーカーとして使用することができる。また、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体は、ＳＬＥの診断薬として用いることができる。例えば、検査対象の血液サンプル（血漿、血清等）において、競合ＥＬＩＳＡ等により、ＳＬＥの病態に関与する自己抗体を定量するために用いることができる。
　［抗体またはその抗原結合断片］
　本開示の第２の態様は、前記第１の態様にかかる自己抗体（以下、「自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体」ともいう）が含む抗原結合部位を含む抗体（以下、「自己抗体由来抗体」ともいう）又はその抗原結合断片である。
　自己抗体由来抗体は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体が有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。自己抗体由来抗体は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体が有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことがより好ましい。自己抗体由来抗体は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体が有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体が有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含むことがさらに好ましい。
　自己抗体由来抗体は、例えば、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が有する抗体遺伝子を利用して取得することができる。例えば、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、前記ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、前記ｃＤＮＡから重鎖のＶＤＪ領域および軽鎖のＶＪ領域を核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ法）により増幅して、得られた断片を定常領域コード配列と結合させて、適切な発現ベクターにクローニングする。この発現ベクターを適切な細胞に導入して培養することにより、自己抗体由来抗体を取得することができる。自己抗体由来抗体は、公知の精製手法（塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等）により精製することができる。定常領域コード配列は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が由来する動物種と同じ動物種に由来してもよく、異なる動物種に由来してもよい。
　自己抗体由来抗体は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体のアミノ酸配列に基づいて抗体遺伝子又は抗原結合断片遺伝子を設計して、取得してもよい。例えば、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３をコードする核酸配列を、重鎖フレームワーク（ＦＲ）をコードする核酸配列と連結して、重鎖可変領域コード配列を設計する。重鎖可変領域コード配列を有する核酸は、ホスホロアミダイト法等により化学合成してもよい。重鎖可変領域コード配列を有する核酸は、重鎖定常領域コード配列と連結して、適切な発現ベクターにクローニングする。同様に、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３をコードする核酸配列を、軽鎖フレームワーク（ＦＲ）をコードする核酸配列と連結して、軽鎖可変領域コード配列を設計する。軽鎖可変領域コード配列を有する核酸は、ホスホロアミダイト法等により化学合成してもよい。軽鎖可変領域コード配列を有する核酸は、軽鎖定常領域コード配列と連結して、適切な発現ベクターにクローニングする。重鎖コード配列及び軽鎖コード配列は、同一の発現ベクターにクローニングしてもよい。この発現ベクターを適切な細胞に導入して培養することにより、自己抗体由来抗体を取得することができる。ＦＲコード配列および定常領域コード配列は、ＤＮ２Ｂ細胞が由来する動物種と同じ動物種に由来してもよく、異なる動物種に由来してもよい。また、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域は、ＦＣＤＲおよびＦＲを含む全体について、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体に由来するものを用いてもよい。
　自己抗体由来抗体は、上記のように設計した自己抗体由来抗体をコードする遺伝子を組み込んだトランスジェニック動物を作製して取得してもよい。自己抗体由来抗体は、当該トランスジェニック動物の体液（例えば、血液、ミルク等）を精製から精製することにより、取得することができる。
　抗原結合断片をコードする核酸配列は、抗原結合断片の構造に応じて、適宜設計することができる。例えば、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがリンカーで連結された構造を有する。そのため、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とをリンカーコード配列を介して連結することにより、ｓｃＦｖコード配列を含む核酸を取得することができる。
　自己抗体由来抗体としては、上記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される抗体、並びに、上記（１）～（３７）からなる群より選択される抗体、が挙げられる。（ａ）～（ｃ）に記載される表１および表２のＶ鎖およびＣＤＲをコードする核酸配列の代表例が、表８～１３に示されている。（１）～（３７）で指定される配列番号のアミノ酸配列をコードする核酸配列の代表例が、表１４～１７に示されている。
　自己抗体由来抗体は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体と同一の抗原特異性を有する。したがって、自己抗体由来抗体は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が由来する個体の体内で生成される抗原に結合する。自己抗体由来抗体は、好ましくは抗核抗体である。自己抗体由来抗体は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体と同一の抗原特異性を有するため、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体と同様に、ＳＬＥの診断薬として用いることができる。
　［全身性エリテマトーデスの診断薬］
　本開示の第３の態様は、全身性エリテマトーデスの診断薬（以下、「ＳＬＥ診断薬」ともいう）である。ＳＬＥ診断薬は、上記第１の態様にかかる自己抗体（自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体）もしくはその抗原結合断片、および、上記第３の態様にかかる抗体（自己抗体由来抗体）もしくはその抗原結合断片からなる群より選択される少なくとも１種を含む。
　ＳＬＥ診断薬は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体、自己抗体由来抗体、および、これらの抗原結合断片からなる少なくとも１種に加えて、他の成分を含んでもよい。他の成分としては、溶媒、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、流動促進剤、結合剤、造粒剤、分散化剤、懸濁化剤、湿潤剤、滑沢剤、崩壊剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、充填剤等が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　ＳＬＥ診断薬は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体、自己抗体由来抗体、および、これらの抗原結合断片からなる少なくとも１種を緩衝液に溶解したものでもよい。あるいは、ＳＬＥ診断薬は、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体、自己抗体由来抗体、および、これらの抗原結合断片からなる少なくとも１種を緩衝液に溶解させて、凍結乾燥したものでもよい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体、自己抗体由来抗体、および、これらの抗原結合断片は、標識かされていてもよい。標識化のための標識物質は、特に限定されず、公知のものを用いることができる。標識物質としては、例えば、酵素標識物質、蛍光標識物質、放射性同位体標識物質、電気化学発光標識物質、金属ナノ粒子等が挙げられる。酵素標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。蛍光標識物質としては、例えば、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’,７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト（ＨＥＸ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。放射性同位体標識物質としては、ヨウ素１２５等が挙げられる。電気化学発光標識物質としては、ルテニウム錯体等が挙げられる。標識化は、標識物質の種類に応じて、公知の方法を適宜選択して行うことができる。
　ＳＬＥ診断薬は、他の物品と組み合わせて、ＳＬＥ診断キットとしてもよい。ＳＬＥ診断キットが含む他の物品としては、例えば、競合ＥＬＩＳＡに使用される器具および試薬が挙げられる。競合ＥＬＩＳＡに使用される器具としては、ウェルプレート等の固相担体、抗原、標識物質検出試薬、血液試料調製試薬、希釈剤、緩衝液、ブロッキング試薬、使用説明書等が挙げられるが、これらに限定されない。自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体および自己抗体由来抗体が抗核抗体である場合、抗原としては自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が由来する動物種の細胞を用いることができる。
　［血液試料の検査方法］
　本開示の第４の態様は、血液試料の検査方法である。前記検査方法は、検査対象から採取された血液試料において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から産生される自己抗体の発現量を測定する工程を含む。前記自己抗体の発現量が基準値よりも高いことが、前記検査対象が全身性エリテマトーデスに罹患している可能性が高いことを示す。血液試料の検査は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うことができる。
　＜自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の発現量測定工程＞
　検査対象は、ＳＬＥに罹患している可能性が検査される対象である。検査対象は、ＳＬＥに罹患する可能性がある動物であれば、特に限定されない。検査対象の具体例としては、ヒト、および非ヒト哺乳動物が挙げられる。
　「血液試料」とは、検査対象から採取された血液成分に由来する試料を指す。血液試料は、血漿、血清、および血液細胞、並びに、これらに何らかの処理をして得られる試料を包含する。血液細胞を処理して得られる試料としては、血液細胞を培養して得られる細胞集団、および、血液細胞を培養して得られる培養上清が挙げられる。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の発現量の測定方法としては、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体のｍＲＮＡを測定する方法、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体を測定する方法が挙げられる。
　（ｍＲＮＡを測定する方法）
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体のｍＲＮＡを測定する場合、血液試料としては、Ｂ細胞を含む試料を用いる。Ｂ細胞を含む試料としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が挙げられる。血液試料としては、Ｂ細胞を含む血液細胞試料（例えば、ＰＢＭＣ）を、ＴＬＲリガンド（ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド等）の存在下で培養して得られた細胞集団を用いてもよい。
　ｍＲＮＡの測定は、公知の方法を用いることができる。ｍＲＮＡの測定方法としては、ＲＴ－ｑＰＣＲが挙げられる。ＲＴ－ｑＰＣＲに用いるプライマーは、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体のｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いる。そのようなプライマーは、例えば、配列番号５０～５５（表８～１３参照）のいずれかに記載の核酸配列から設計することができる。プライマーは、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の重鎖可変領域コード領域又は軽鎖可変領域コード領域を増幅可能なプライマーが好ましく、重鎖可変領域コード領域を増幅可能なプライマーを用いることがより好ましい。プライマーは、ＨＣＤＲ３コード領域又はＬＣＤＲ３コード領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーが好ましく、ＨＣＤＲ３コード領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーがより好ましい。フォワードプライマーは、例えば、ＨＣＤＲ３コード領域よりも５’側の領域にアニーリングするように設計することができる。リバースプライマーは、例えば、ＨＣＤＲ３コード領域の少なくとも一部を含む領域にアニーリングするように設計することができる。
　ｍＲＮＡの測定により、自己抗体の検出および、ＳＬＥの診断を行うこともできる。
　後述する実施例で示すように、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞のＢＣＲのレパトアは偏っている。重鎖については、表４に示されるＨ１～Ｈ３の比率が全体の５０％を占めていた。したがって、プライマーとしては、Ｈ１～Ｈ３をコードする核酸配列を増幅可能なプライマーを用いることができる。Ｈ１～Ｈ３をコードする核酸配列の具体例は、表８～１０にそれぞれ示されている。中でも、表８に示される核酸配列（Ｈ１をコードする核酸配列）に基づいて、プライマーを設計することが好ましい。例えば、表８に示されるＨ１－１～Ｈ１－５で配列が共通する領域に、プライマーを設計することができる。
　（自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体を測定する方法）
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体を測定する場合、血液試料としては、血漿または血清を用いることができる。あるいは、血液試料としては、Ｂ細胞を含む血液細胞試料（例えば、ＰＢＭＣ）を、ＴＬＲリガンド（ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ９リガンド等）の存在下で培養して得られた培養上清を用いてもよい。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の測定方法としては、例えば、単離された自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体および自己抗体由来抗体、ならびにこれらの抗原結合断片からなる群より選択される少なくとも１種（以下、「検査用抗体」ともいう）を用いた競合ＥＬＩＳＡが挙げられる。例えば、ウェルプレート等の固相担体に、抗原を固定し、血液試料および標識化された検査用抗体と反応させる。血液試料中に含まれる自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の量に応じて、検査用抗体の抗原への結合が阻害される。したがって、抗原に結合した検査用抗体を測定することにより、血液試料中に存在する自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体を測定することができる。検査用抗体が抗核抗体である場合、抗原としては、検査対象と同じ動物種の細胞を用いることができる。
　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の発現量が基準値よりも高いことは、検査対象がＳＬＥに罹患している可能性が高いことを示す。すなわち、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の発現量が基準値よりも高いことは、血液試料が、ＳＬＥに罹患している可能性が高い検査対象に由来することを示す。自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の発現量が基準値よりも低いことは、血液試料が、ＳＬＥに罹患している可能性が低い検査対象に由来することを示す。
　基準値は、例えば、任意の人数で構成される健常対象グループにおいて測定された自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の発現量から、統計処理等を行って算出された数値でもよい。基準値は、例えば、任意の人数で構成されるＳＬＥに罹患している対象グループにおいて測定された自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の発現量から、統計処理等を行って算出された数値であってもよい。基準値は、例えば、健常対象グループおよびＳＬＥに罹患している対象グループにおいて測定された自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体の発現量から、ＲＯＣ解析等により算出されたカットオフ値であってもよい。
　本実施形態の方法は、上記測定工程に加えて、他の工程を含んでもよい。他の工程としては、ＳＬＥに罹患している可能性が高い検査対象についてＳＬＥの確定診断をする工程、ＳＬＥに罹患している可能性が高い検査対象についてＳＬＥの治療を行う工程が挙げられる。
　ＳＬＥの診断は、例えば、ＳＬＥの症状に関連する臨床所見および免疫所見により行うことができる。
　ＳＬＥの治療方法としては、例えば、非ステロイド系消炎鎮痛剤、グルココルチコイド、ヒドロキシクロロキン、免疫抑制剤の投与等が挙げられる。
　［他の態様］
　本開示は、以下の態様も含み得る。
　（Ａ）検査対象から採取された血液試料において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から産生される自己抗体の発現量を測定する工程を含み、前記自己抗体の発現量が基準値よりも高いことが、前記検査対象が全身性エリテマトーデスに罹患している可能性が高いことを示す、全身性エリテマトーデスの診断方法。
　（Ｂ）検査対象から採取された血液試料において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から産生される自己抗体の発現量を測定する工程（ａ）と、前記工程（ａ）で測定された前記自己抗体の発現量が基準値よりも高い検査対象を、前記検査対象が全身性エリテマトーデスに罹患していると判定する工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）で全身性エリテマトーデスに罹患していると判定された検査対象に対して全身性エリテマトーデスの治療を行う工程（ｃ）と、を含む、全身性エリテマトーデスの治療方法。
　（Ｃ）検査対象から採取された血液試料において、自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞から産生される自己抗体の発現量を測定する工程を含み、前記自己抗体の発現量が基準値よりも高いことが、前記検査対象が全身性エリテマトーデスに罹患している可能性が高いことを示す、全身性エリテマトーデスを診断するためのデータを収集する方法。
　（Ｄ）ＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体を含む全身性エリテマトーデスマーカー。
　（Ｅ）全身性エリテマトーデスの診断に用いるための、単離されたＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体、自己抗体由来抗体、およびこれらの抗原結合断片からなる群より選択されるポリペプチド。
　（Ｆ）全身性エリテマトーデスの診断薬を製造するための、単離されたＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体、自己抗体由来抗体、およびこれらの抗原結合断片からなる群より選択されるポリペプチドの使用。
　（Ｇ）全身性エリテマトーデスの診断するための、単離されたＤＮ２Ｂ細胞由来自己抗体、自己抗体由来抗体、およびこれらの抗原結合断片からなる群より選択されるポリペプチドの使用。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
　［方法］
　（実験モデル及び被験者詳細）
　合計２３人の成人の健常ドナー（ＨＤ）から末梢血を採取した。生体外フローサイトメトリー解析とｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激アッセイには、それぞれ１９人と９人のドナーのサンプルを用いた。２０１８～２０２１年の間に活動性疾患状態の有無にかかわらずＡＣＲ１９９７基準を満たし、本研究への参加に同意した全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者４０人を集めた。培養及びレパートリー解析アッセイでは、ＳＬＥ患者１人のサンプルを用いた。当該ＳＬＥ患者は、活動性腎炎と抗ｄｓＤＮＡ抗体及び抗Ｓｍ抗体の上昇とを伴う疾患フレア（ｄｉｓｅａｓｅ　ｆｌａｒｅ）を有するＳＬＥ患者である。
　（ＰＬＤ４に対するモノクローナル抗体の生成）
　抗ヒトＰＬＤ４モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）であるＴ１Ｓ－ｍＡｂｓは、ＰＬＤ４分子の細胞外ドメインがマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ２ａのＦｃ領域に結合した精製組換え融合タンパク質（ｃＤＮＡ：配列番号１）を雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫することにより作製した。詳細な方法は、国際公開第ＷＯ２０１３／１１５４１０号に記載の方法に従った。
　（末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離及びナイーブＢ細胞の単離）
　３０ｍＬの末梢血をヘパリンコートチューブで採取した。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いたＦｉｃｏｌｌ勾配法により単離した。その後、ＰＢＭＣをアンピシリン／ストレプトマイシンと１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，ＳＥＲＡＮＡ，ＮＹ，ＵＳＡ）とを添加したｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）に懸濁し、ＲＢＣ溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて赤血球（ＲＢＣ）溶解反応を行った。ＲＢＣを除去した残りのＰＢＭＣを、フローサイトメトリー、細胞培養又はナイーブＢ細胞の単離に用いた。ナイーブＢ細胞は、Ｎａｉｖｅ　Ｂ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｉｉ，ｈｕｍａｎ　（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，　Ｇｌａｄｂａｃｈ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造者の指示に従って単離した。
　（ＰＬＤ４遺伝子発現のリアルタイム定量ＰＣＲ解析）
　免疫細胞及び組織臓器におけるＰＬＤ４遺伝子発現の比較のために、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行った。簡単に説明すると、ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ　ｑＰＣＲ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、個々の細胞からｃＤＮＡを合成した。免疫細胞の解析には、健常ドナーの血液のアフェレーシス産物（Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）からヒトＰＢＭＣを単離した（Takeda Y, S, et al. Int J Mol Sci 2017 18:1162.）。組織発現を調べるために、ＢＤＴＭ　ＭＴＣ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃＤＮＡ　ｐａｎｅｌ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）を用いた。ＰＣＲはＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＰＣＲは、５０℃，２分間；９５℃，１０分間；９５℃，１５秒間；及び６０℃，１分間を５０サイクル行った。各転写物は、サンプルのばらつきを考慮し、ヒトグリセルアルデヒド－３－リン酸化水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の値で正規化した。ＰＣＲ反応のプライマー配列は以下の通りである。
　ＰＬＤ４センスプライマー配列１：５’－ＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧ－３’（配列番号２）
　ＰＬＤ４センスプライマー配列２：５’－ＧＴＧＡＡＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＧ－３’（配列番号３）
　ＰＬＤ４アンチセンスプライマー配列１：５’－ＧＣＡＡＡＡＣＣＣＣＴＧＴＧＡ－３’（配列番号４）
　ＰＬＤ４アンチセンスプライマー配列２：５’－ＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号５）
　ＧＡＰＤＨセンスプライマー配列：５’－ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号６）
　ＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー配列：５’－ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ－３’（配列番号７）
　β２ＭＧセンスプライマー配列：５’－ＣＣＡＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴ－３’（配列番号８）
　β２ＭＧアンチセンスプライマー配列：５’－ＣＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡ－３’（配列番号９）
　培養ナイーブＢ細胞におけるＰＬＤ４の発現を推定するために、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。培養ナイーブＢ細胞からＲＮｅａｓｙ（登録商標）　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）　ｑＰＣＲ　ＲＴ　ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＬＤ４の相対発現は、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたＲＴ－ｑＰＣＲで解析した。ＰＣＲは、ＣＦＸ　ＣｏｎｎｅｃｔＴＭ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。ＰＣＲは、５０℃，２分間；９５℃，１５分間；９４℃，１０秒間；５５℃，１分間；及び７２℃，１分間を４０サイクル行った。各サンプルにおいて、ｃＤＮＡコピー数は、閾値サイクル（Ｃｔ）を標準プラスミド（コピー数１０６、１０５、１０４、１０３、１０２および１０）により生成されたものと比較することにより決定した。ＲＮＡ発現はハウスキーピング遺伝子β２ＭＧで正規化した。
　（フローサイトメトリー解析及びセルソーティング）
　染色バッファー（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１０％正常マウス血清を含むＰＢＳ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））に懸濁した１×１０６個／ｔｕｂｅのＰＢＭＣを以下の蛍光抗体で染色した。
　セット１：ＣＤ４３（ＦＩＴＣ），ＣＤ１９（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５），ＣＤ３８（ＡＰＣ），ＩｇＤ（ＰＥ－Ｃｙ７），ＣＤ２４（ＡＰＣ－Ｃｙ７），ＣＤ３ＣＤ１４ＣＤ１６（Ｖ４５０），ＣＤ２７（Ｖ５００）
　セット２：ＣＤ１１ｃ（ＦＩＴＣ），ＣＤ１９（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５），ＣＤ３８（ＡＰＣ）／ＣＤ２１（ＡＰＣ），ＩｇＤ（ＰＥ－Ｃｙ７），ＣＸＣＲ５（ＡＰＣ－Ｃｙ７），ＣＤ３ＣＤ１４ＣＤ１６（Ｖ４５０），ＣＤ２７（Ｖ５００）
　セット３：ＣＤ１１ｃ（ＦＩＴＣ），ＢＤＣＡ２（ＡＰＣ），ＣＤ１４（ＡＰＣ－Ｃｙ７），ＣＤ３ＣＤ１４（Ｖ４５０），ＣＤ１６（Ｖ５００）
　セット４：ＣＤ４（ＦＩＴＣ），ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５），ＣＤ３（ＡＰＣ－Ｃｙ７），ＣＤ１４ＣＤ１９ＣＤ１６（Ｖ４５０）
　氷上で２０分間インキュベートした後、各チューブ内の細胞を１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで懸濁し、アイソタイプ染色とホスホリパーゼＤ４（ＰＬＤ４）染色用に２本のチューブに分けた。ビオチン化マウスＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはビオチン化Ｔ１Ｓ－ｍＡｂｓを５μｇ／ｍＬ添加した。氷上で２０分間インキュベートした後、両方のチューブを洗浄し、再度懸濁し、ＰＥ－ストレプトアビジン（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を１μｇ／ｍＬ添加した。氷上で１５分間インキュベートした後、染色したＰＢＭＣをＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩ（ＢＤ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で分析した。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養ＰＢＭＣについては、ＣＤ２０（ＰＥ－Ｃｙ７）とＣＤ３ＣＤ１４ＣＤ１６（Ｖ４５０）を用いてＢ細胞を定義した。その後、上記のようにＰＬＤ４を染色した。死細胞を除去するために、サイトメトリー解析の５分前に、１００μＬの細胞液に５μＬの７－ＡＡＤ（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加した。補正は、抗マウスＩｇ，κ／Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｅｔ（ＢＤ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
　細胞内Ｔ－ｂｅｔ染色のために、２×１０６個のＰＢＭＣを固定し、Ｔｒｕｅ－ＮｕｃｌｅａｒＴＭ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて製造者の指示に従って透過処理した。マウスＩｇＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）を１００μｇ／ｍＬの濃度で添加し、非特異的結合をブロックした後、Ｔ－ｂｅｔ（ＡＰＣ）またはマウスＩｇＧ１（ＡＰＣ）に対する蛍光抗体を添加した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて解析した。
　後述の細胞培養アッセイのために、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔまたはＣＤ１９＋Ｂ細胞をＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩ（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した。選別可能なＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの数は十分多くないため（末梢血２０ｍＬから最大３，０００細胞）、ＣＤ１９－およびＣＤ３＋、ＣＤ１４＋もしくはＣＤ１６＋細胞（非Ｂ細胞ＰＢＭＣ）を足場細胞として同時に選別した。
　（ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞刺激及び培養）
　ＰＬＤ４誘導アッセイのために、完全ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）に懸濁した５×１０５個のＰＢＭＣまたは１×１０５個のナイーブＢ細胞を９６ウェル非組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に播種した。刺激として、ＲＰＭＩ１６４０（刺激なし）、０．１５μＭのＣｐＧ　ＯＤＮ　２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、１μｇ／ｍＬのＲ８４８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、または１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬもしくは２５μｇ／ｍＬのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ　Ｆ（ａｂ’）２　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ａｎｄ　ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を添加し、細胞を２日間培養した後、上記のようにフローサイトメトリー解析を行った。
　Ｂ細胞をＩｇＧ抗体分泌細胞（ＩｇＧ－ＡＳＣ）に分化させるために、選別した１，０００個のＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔまたは形質芽細胞をゲートアウトしたＣＤ１９＋　Ｂ細胞を、１０，０００個の非Ｂ細胞ＰＢＭＣとともにプレートに播種した。その後、１μｇ／ｍＬのＲ８４８または０．１５μＭのＣｐＧ　ＯＤＮ　２００６を添加した。培養４日後、ＩｇＧ－ＡＳＣをＥＬＩＳｐｏｔでカウントした。
　（ＩｇＧ分泌細胞のＥＬＩＳｐｏｔ）
　ＩｇＧ分泌細胞は、ＥＬＩＳｐｏｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　（ＨＲＰ）　Ｋｉｔ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を用い、製造者の指示に従い検出した。簡単に説明すると、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ　ＩＰ　ＨＴＳ　０．４５μｍ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に１５μｇ／ｍＬの抗ＩｇＧ抗体を４℃で一晩コートした。ウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳと１％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、培養細胞をウェルに加え、５％　ＣＯ２下、３７℃で１６～２０時間インキュベートした。
　０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを洗浄した後、二次ビオチン化抗ＩｇＧ抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。二次ビオチン化抗ＩｇＧ抗体は、キットに含まれる二次ビオチン化抗ＩｇＧ抗体をＭｉｌｌｅｘ－ＨＶ　０．４５μｍ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過して用いた。２時間インキュベート後、ウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μＬ加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ＥＬＩＳｐｏｔ用基質（Ｍａｂｔｅｃｈ）を１００μＬ加えた。スポットを１５～２０分間現像し、ウェルを水道水で洗浄して現像を停止した。プレートをＭＩＮＥＲＶＡＴＥＣＨに送り、スポット数をカウントした。
　（培養Ｂ細胞のＢＣＲレパトア解析）
　Ｂ細胞レセプタ（ＢＣＲ）レパトア解析は、Ｔ細胞レパトアについて以前に記載された方法と同様に行った（Cho M, Ishida K, et al. Int Immunol. 2008 Jan;20(1):155-64）。簡単に説明すると、培養Ｂ細胞を回収し、遠心分離によってＰＢＳで洗浄した。オリゴ（ｄＴ）プライマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ　ＩＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をと用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅ　ＨとＴ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを用いて第二鎖ｃＤＮＡを合成した。「Ｔ」を「Ｕ」に置き換えた短鎖アダプターをｃＤＮＡライブラリーに結合させた。Ｕｒａｃｉｌ　ＤＮＡ　Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を加えて短鎖を消化し、一本鎖アダプターのライゲーションを作製した。アダプターを付加したライブラリーをＰＣＲで増幅した。増幅産物（ＢＣＲライブラリー）には、次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造者の指示に従い使用した。シーケンシングの結果は、ＩＭＧＴ－Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｉｎｐｕｔ）を用いて解析した。同一のＶ－遺伝子セグメントおよびＪ－遺伝子セグメントを共有し、同一のＣＤＲ３配列を有する配列は、同一のものとして同定された。
　（組み換えモノクローナル抗体の合成）
　ベクタークローニング、トランスフェクション、および抗体の精製を行った。Ｖ（Ｄ）Ｊと定常領域（ＩｇＧ１）の配列を別々にＰＣＲで増幅し、ベクタークローニング部位と重なる配列を付加した。ＰＣＲ産物を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録少々）ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、ｐＨＥＫ　Ｕｌｔｒａ発現ベクター（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）に個別に挿入した。Ｖ（Ｄ）Ｊ＋定常領域配列を含むクローズドベクターをＯｎｅ　Ｓｈｏｔ　Ｔｏｐ１０　ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、一晩培養した後、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドを精製した。このプラスミドを、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＵＰ－２９３キット（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）を用いてＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞にトランスフェクトした。Ｅｘｐｉ２９３細胞は７．５×１０７細胞まで増殖させた。５日間の培養後、分泌されたｍＡｂｓをＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ　Ｐａｃｋｓ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて精製した。具体的には、培養細胞の上清を５００μＬのプロテインＧセファロースをロードしたＰｉｅｒｃｅＴＭ　Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　５　ｍＬ　Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加えた。２０ｍＭリン酸ナトリウムでカラムを洗浄後、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で抗体を溶出した。
　酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）用の対照抗体としては、正常ドナーから分離したＢ細胞のＩｇＧ配列からランダムに１つを選んでサブクローニングし、その後ｍＡｂｓを合成し、精製した。
　（抗核抗体活性測定のためのＥＬＩＳＡ）
　組換え型ｍＡｂの自己反応性を調べるために、Ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＡＮＡ）　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＣＵＳＡＢＩＯ）を製造者の指示に従い使用した。対照にはＡＮＡ＋であることが既知であるＳＬＥ患者血清と健常人血清とを１０１倍希釈で用いた。健常人血清にはＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔ由来ｍＡｂｓまたは対照サンプル由来ｍＡｂｓを５０μｇ／ｍＬ添加した。各サンプルについてＯＤ４５０を測定した。
　（統計解析）
　Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ　Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて群間の値を比較した。スピアマンの順位相関係数は、細胞頻度と臨床測定値との相関を解析するために計算された。Ｆｉｓｈｅｒの正確検定は、特定の臨床症状の群間相対リスクの有意性を分析するために使用された。同じ患者または検体で異なる時点または異なる条件で測定された幾つかの値については、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号順位和検定を行った。すべての解析は、Ｒバージョン４．１．２（Ｔｈｅ　Ｒ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて行った。Ｐ値は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５で示した。
　［結果］
　（ＰＬＤ４はｐＤＣで次いでＢ細胞で優位に発現される）
　ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）と単球の遺伝子転写を比較した遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）では、ＰＬＤ４遺伝子がｐＤＣで優位に転写されていることが検出された（Takeda Y, et al. Int J Mol Sci 2017 18:1162.）。ｐＤＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、およびナチュラルキラー細胞を用いてＲＴ－ｑＰＣＲを行い、末梢免疫細胞におけるＰＬＤ４のｍＲＮＡ発現を調べた。その結果、ＰＬＤ４の発現はｐＤＣで最も高く、次いでＢ細胞で高かった。Ｂ細胞でのＰＬＤ４の発現は、ｐＤＣよりもはるかに低かった（図１Ａ）。次に、臓器別のＰＬＤ４発現を調べた。複数の組織から採取したｃＤＮＡパネルを用いてＲＴ－ｑＰＣＲを行ったところ、脾臓と末梢白血球においてＰＬＤ４のｍＲＮＡ発現が最も高かった（図５Ａ）。これらの結果から、ＰＬＤ４はｐＤＣで高発現し、Ｂ細胞ではｐＤＣよりも発現量が少なく、その発現は免疫関連臓器に集中していることが確認された。
　（ＰＬＤ４＋Ｂ細胞はＳＬＥ患者で有意に増加している）
　ＰＢＭＣにおけるＰＬＤ４の細胞表面発現を調べた。ＰＬＤ４に対するモノクローナル抗体（Ｔ１Ｓ－ｍＡｂ）を作製した。これを用いて、まず健常ドナー（ＨＤ）のＰＢＭＣに対してフローサイトメトリーを行った（図５Ｂ）。ｐＤＣの大部分はＰＬＤ４陽性であったが、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞はＣＤ１９＋　Ｂ細胞のわずか数％であった（図１Ｂ）。他の免疫細胞では表面ＰＬＤ４の発現は検出されず（ｎ＝３、図５Ｃ）、ｍＲＮＡ発現解析と一致した。次いで、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣを検査した。ＳＬＥ患者４０人を検査し、そのほとんど（３２人、８０％）が新たに発症した未治療のＳＬＥであった（表３）。ＰＬＤ４＋　ｐＤＣの頻度はＨＤと同程度であったが、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞はＳＬＥ患者で有意に増加していた（図１Ｃ）。ＳＬＥ患者のＢ細胞には様々な特徴がある。例えば、ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｂ細胞、ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞、および形質芽細胞は、健常対照と比較してＳＬＥ患者で増加している（Akita K, et al, Front Immunol. 2020;11:498703; doi 10.3389/fimmu.2020.498703; Wardowska A, et al. Int Immunopharmacol. 2020 Jun 1;83:106451; doi 10.1016/j.intimp.2020.106451; Dieudonne Y, et al. J Autoimmun. 2019 Aug;102:150-8; doi 10.1016/j.jaut.2019.05.002）。これまでの報告と一致して、ＤＮ細胞と形質芽細胞は、我々のコホートではＨＤよりも有意に豊富であった。さらに、統計学的に有意ではなかったが、ＳＬＥ患者ではｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｂ細胞の頻度が高く、３０％まで激増した患者もいた（図６Ａ、図６Ｂ）。ＳＬＥ患者で増加したＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の細胞組成を見ると、ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ　Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、およびＤＮ細胞の占める割合が、Ｂ細胞全体よりも大きかった。しかしながら、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞は、形質芽細胞をほとんど含んでいなかった（図６Ｃ）。これらの結果から、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞は、ＳＬＥ患者で増殖しており、細胞組成の点でユニークであることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（「ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔ」は表現型的及び機能的にＤＮ２Ｂ細胞とオーバーラップする）
　ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の特異性を解析するために、細胞の活性化状態をほぼ反映すると推定されるＦＳＣ－Ａで表される細胞サイズに注目した（Akita K, et al,. Front Immunol. 2020;11:498703; doi 10.3389/fimmu.2020.498703）。Ｂ細胞集団全体の中で、形質芽細胞が最も大きな細胞サイズを示した。ＳＬＥ患者の一部では、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の分画が細胞サイズの点で形質芽細胞に匹敵した（図１Ｄ）。上述したように、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞は形質芽細胞をほとんど含まないので、このＰＬＤ４＋　Ｂ細胞は他の細胞よりも活性化されていると考え、形質芽細胞と同程度の大きさの細胞に注目した。そこで、形質芽細胞のＦＳＣ－Ａの２５パーセンタイルを閾値として、このようなＰＬＤ４＋　Ｂ細胞のより大きな部分を「ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔ」、それ以外を「ＰＬＤ４＋ｓｍａｌｌ」と定義した（図１Ｅ）。ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率は、ＳＬＥ患者ではほぼ０％から最大１０％超（平均＝３．１％、ＳＤ＝２．６）の範囲であった（図１Ｆ）。ＳＬＥ患者をＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率（平均値［３．１％］より高いか低いか）で２群に分けると、高値群（Ｈ）は低値群（Ｌ）より有意にＳＬＥＤＡＩスコアが高かったが、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞（ｂｌａｓｔ＋ｓｍａｌｌ）の比率で分けるとこの差はなくなった（図１Ｇ、Ｈ）。さらに、形質芽細胞とＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率は有意に相関していたが、ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の比率は有意に相関していなかった（図１Ｉ、Ｊ）。このことは、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔはＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の中の別個の集団として見るべきであり、ＳＬＥ患者の疾患活動性を反映していることを示唆している。
　さらにＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの特徴を調べると、表現型的にＩｇＤ－、ＣＤ２７－、ＣＤ１１ｃ＋＋、およびＣＸＣＲ５－を特徴とするＤＮ２細胞とオーバーラップすることがわかった（図２Ａ）。加えて、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔはＤＮ細胞集団（ＩｇＤ＋またはＣＤ２７＋の細胞）に含まれず、ほとんどがＣＤ１１ｃ＋＋且つＣＸＣＲ５－細胞であったことから、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔは細胞オントロジーの点で非常に均質であることが示唆された（図７Ａ）。これと一致して、転写因子Ｔ－ｂｅｔの細胞内染色から、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔのほとんどがＤＮ２Ｂ細胞の重要な特徴の一つであるＴ－ｂｅｔ＋＋であることが明らかになった（図２Ｂ）。予想通り、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔとＤＮ２Ｂ細胞の比率は有意に相関していた（図２Ｃ）。さらに、ＤＮ２Ｂ細胞集団の中で、ＰＬＤ４＋　ＤＮ２Ｂ細胞はＰＬＤ４－細胞よりも大きな細胞サイズを示した（図２Ｄ）。臨床症状に関しては、高発現のＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔ群（ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔ　Ｈ）は、低発現のＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔ群（ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔＬ）と比較して、腎炎の合併率が高く、抗ｄｓＤＮＡ抗体ではなく抗Ｓｍ抗体価が高かった（図２Ｅ－Ｇ）。さらに、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの比率は、血清Ｃ３レベルおよび血清Ｃ４レベルと有意に逆相関していた（図７Ｂ）。一部の症例では免疫抑制療法後にＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの有意な減少が観察された（ｎ＝１１、図２Ｈ）。これらの結果から、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの増加は、ＤＮ２Ｂ細胞の増加と同様に、ある種の疾患活動性を反映していることが示唆された。
　（ＴＬＲ７またはＴＬＲ９の刺激はＨＤにおけるＰＬＤ４＋　Ｂ細胞の誘導に十分である）
　Ｂ細胞の表面ＰＬＤ４発現量が活性化状態によって異なるかどうかを検討した。ＨＤからの単離ＰＢＭＣを抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（ＢＣＲ架橋）、ＴＬＲ７リガンド単独もしくはＴＬＲ９リガンド単独、またはＢＣＲ＋ＴＬＲ９リガンドで刺激し、２日目にフローサイトメトリー解析を行った。ＰＬＤ４＋　Ｂ細胞はＢＣＲシグナルのみでは誘導されなかったが、ＴＬＲ単独またはＢＣＲ＋ＴＬＲ刺激ではＰＬＤ４＋　Ｂ細胞が有意に誘導された（図３Ａ、Ｂ）。ナイーブＢ細胞を単離した後、ＴＬＲ９リガンドで刺激すると、ＰＬＤ４のｍＲＮＡレベルは非刺激時と比較して有意に上昇した（図３Ｃ）。したがって、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９刺激後のＰＬＤ４発現の上昇は、刺激ｐＤＣからのサイトカインなどの外的要因によるものではなく、ＴＬＲ刺激に応答したＢ細胞内在性のｄｅ　ｎｏｖｏ合成によるものであった。ほとんどのサンプルにおいて、ＢＣＲ＋ＴＬＲ９刺激の組み合わせは、ＴＬＲ９単独よりもＰＬＤ４＋　Ｂ細胞を誘導することができ、下流のシグナル伝達経路の相乗効果を示唆していた（図３Ｂ）。
　（ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの最大レパトアから合成されたＩｇＧ抗体は抗核活性を示した）
　ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔは、ある種の疾患状態と相関し、ＤＮ２Ｂ細胞とオーバーラップすることから、自己反応性が高く、ＳＬＥ患者における自己抗体産生に関与している可能性が高いと推測された。まず、２人のＳＬＥ患者から採取したＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔのＩｇＧ抗体産生能をＥＬＩＳｐｏｔで評価した。ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔはＩｇＧ産生能を示さなかったが（図４Ａ）、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９リガンドと共に培養すると、ＣＤ１９＋　Ｂ細胞全体よりも旺盛なＩｇＧ抗体産生を示した（図４Ｂ、Ｃ）。
　次いで、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔの自己反応性を調べようと試みた。目的のＢ細胞集団の自己反応性を調べるには、細胞を培養して産生された抗体を測定する方法がよく用いられる。しかし、この方法は再現性と感度の点で問題があり、特に細胞数が少ない場合には難しい。これらの問題を回避するために、培養ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔのＢＣＲレパトア解析を行った。ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔは、抗ｄｓＤＮＡ抗体（＞４００　ＩＵ／ｍＬ）、抗Ｓｍ抗体（＞４６　ＩＵ／ｍＬ）、および抗ＳＳ－Ａ抗体（＞１２００　ＩＵ／ｍＬ）の上昇した抗体価を有し、且つクラスＩＶのループス腎炎を発症したＳＬＥフレアを有する１人の患者１人から取得された。ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔは、ＣＤ１９＋　Ｂ細胞の８．５％を占めた。取得されたＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔをＴＬＲ７リガンドと炎症性サイトカインで４日間刺激し、Ｂ細胞の抗体分泌細胞（ＡＳＣ）への分化を促進した。ＴＬＲ刺激を受けたＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔのレパトアは偏っていた。その結果、上位３つのレパトアの比率が全体の５０％以上を占めたが、これはおそらく刺激と培養によるもので、同様に培養されたＣＤ１９＋　Ｂ細胞のレパトアには含まれていなかった（表２～５）。これらの増幅されたレパトアは、おそらくｉｎ　ｖｉｔｒｏで分泌された抗体のレパトアであろうと推論し、３つの最も大きなレパトアの配列から組換えモノクローナル抗体を合成した。合成された３つの抗体のうち、２つはＥＬＩＳＡで抗核活性を示した（図４Ｄ）。したがって、ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔは自己反応性細胞を含む可能性が高い。
　表４は、培養ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔのレパトア解析で得られた重鎖の上位１０配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５は、培養ＰＬＤ４＋ｂｌａｓｔのレパトア解析で得られたκ鎖の上位１０配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表６は、培養ＣＤ１９＋　Ｂ細胞のレパトア解析で得られた重鎖の上位１０配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表７は、培養ＣＤ１９＋　Ｂ細胞のレパトア解析で得られたκ鎖の上位１０配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記表２および表４のＶ鎖のアミノ酸配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のＩＭＧＴ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ（ＩＧ　ａｎｄ　ＴＲ）のサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／＃ｈ２＿４）から取得することができる。
　Ｈ１の核酸配列の例を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　Ｈ２の核酸配列の例を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　Ｈ３の核酸配列の例を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　Ｌ１の核酸配列の例を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　Ｌ２の核酸配列の例を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　Ｌ３の核酸配列の例を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表７～１３中、四角で囲んだ「ａｔｇ」は、ＢＣＲｍＲＮＡの翻訳開始点を示す。この「ａｔｇ」から下線で示す配列の前までがシグナルペプチドである。
　下線で示す配列は、ＢＣＲの可変領域の開始点を示す。
　二重下線は、５’側から順に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を示す。
　Ｈ１、Ｈ２およびＨ３の可変領域の配列を表１４に示す。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の可変領域の配列を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　Ｈ１、Ｈ２およびＨ３のＣＤＲの配列を表１６に示す。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３のＣＤＲの配列を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　［リアルタイム（ＲＴ）－ＰＣＲによるＳＬＥの診断］
　自己抗体遺伝子を選択的に増幅して検出することにより、ＳＬＥの診断が可能かを検討とした。
　ＳＬＥ患者末梢血から、自己抗体産生細胞と思われる分画を取得し、陽性対照の細胞集団とした。ＳＬＥ患者の末梢血から分離した細胞集団、健常人末梢血から細胞集団、および前記陽性対照について、ＲＴ－ＰＣＲ法により、自己抗体遺伝子（Ｈ１）を増幅した。ＲＴ－ＰＣＲの方法を以下に示す。
　機材：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　３（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
　使用した試薬：Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭ　Ｐｏｗｅｒ　ＳＹＢＲＴＭ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ
　プライマー配列：
　＜Ｉｎｄｅｘ－ｈｅａｄ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ）＞
　フォワード：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣ（配列番号１０８）
　リバース：ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＣＣＧＧＴＧ（配列番号１０９）
　＜Ｈ１（ＶＨ１－１８－０１－Ｊ４－０２）＞
　フォワード：ＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡ（配列番号１１０）
　リバース：ＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＴＧＡＧＡ（配列番号１１１）
　ＰＣＲ反応条件を表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　各細胞集団は、ＴＬＲリガンドを用いて刺激した後、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成後、次世代シークエンサー解析のためのインデックス配列を付与した。これをもとに、Ｉｎｄｅｘ－ｈｅａｄ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いて、ｃＤＮＡ量を定量した。Ｈ１用プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ量当たりの増幅割合（ＰＣＲサイクル数）によりＨ１遺伝子の増幅を評価した。
　使用した各細胞集団の詳細は以下の通りである。
　２Ｈ：ＳＬＥ（陽性対照）：ＰＬＤ４陽性細胞と、Ｂ細胞を含まない末梢血単核球とをＲ８４８（ＴＬＲ７／８リガンド）で刺激。抗体産生細胞は、ＰＬＤ４陽性細胞のみ。
　４Ｈ：ＳＬＥ：ＰＢＭＣ（ＰＬＤ４陽性細胞を含む末梢血から得られた単核球）をＣｐＧ（ＴＬＲ９リガンド）で刺激。
　６Ｈ：健常人末梢血単核球をＣｐＧ（ＴＬＲ９リガンド）で刺激。
　Ｉｎｄｅｘ－ｈｅａｄ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ）用プライマーを用いたときのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＰｌｏｔおよびＭｅｌｔ　Ｃｕｒｖｅ　Ｐｌｏｔを図８Ａ及び図８Ｂにそれぞれ示す。
　Ｈ１用プライマーを用いたときのＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＰｌｏｔおよびＭｅｌｔ　Ｃｕｒｖｅ　Ｐｌｏｔを図９Ａ及び図９Ｂにそれぞれ示す。
　陽性対照（２Ｈ）では、ＰＣＲのサイクル数が少ない段階（７サイクル程度）で、増幅産物を検出することができた（図９Ａ）。
　ＳＬＥ患者サンプル（４Ｈ）では、３２サイクルで増幅産物を検出することができた（図９Ａ）。
　健常人サンプル（６Ｈ）では、２８サイクルで増幅産物を検出できたように見えた（図９Ａ）。しかしながら、Ｍｅｌｔ　ｃｕｒｖｅ　Ｐｌｏｔにより、Ｈ１遺伝子の増幅産物とは異なる別の産物が増幅していることが確認された（図９Ｂ）。
　以上の結果から、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＰｌｏｔおよびＭｅｌｔ　Ｃｕｒｖｅ　Ｐｌｏｔを組み合わせて用いることにより、ＲＴ－ＰＣＲ法により、ＳＬＥの診断が可能であることが示された。
　［組み換えモノクローナル抗体を用いた蛍光免疫染色］
　Ｈ１（Ｖ鎖：ＶＨ１－１８－０１、Ｊ鎖：４－０２）およびＬ１（Ｖ鎖：ＫＶ１－１６－０２、Ｊ鎖：１－０１）の核酸配列を用いて作製された組み換えモノクローナル抗体（定常領域：ヒトＦｃ　ＩｇＧ）について、蛍光免疫染色により、抗核活性を調べた。蛍光免疫染色の詳細を以下に示す。
　使用細胞：Ｈｅｐ－２（ヒト咽頭癌由来）
　固定：４％パラホルムアルデヒド
　透過処理：０．２％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
　ブロッキング：１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ、室温（約２５℃）、１時間
　１次抗体：組み換えモノクローナル抗体（Ｈ１（Ｖ鎖：ＶＨ１－１８－０１、Ｊ鎖：４－０２）；Ｌ１（Ｖ鎖：ＫＶ１－１６－０２、Ｊ鎖：１－０１）；Ｆｃ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ）、室温（約２５℃）、１時間
　２次抗体：Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ１６　（Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ）、室温（約２５℃）、１時間
　３次抗体：Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８）、室温（約２５℃）、１時間
　蛍光免疫染色の結果を図１０に示す。組み換えモノクローナル抗体により、核が染色されていることが確認された。この結果から、組み換えモノクローナル抗体は、抗核活性を有することが確認された。
　本開示によれば、全身性エリテマトーデスの診断に有用な抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又は抗原結合断片を用いた全身性エリテマトーデスの診断薬、および全身性エリテマトーデスの診断に有用な血液試料の検査方法を提供することができる。
　以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付のクレームの範囲によってのみ限定される。

Claims (7)

  1. 　自己反応性ＤＮ２Ｂ細胞が産生する自己抗体又はその抗原結合断片。
  2. 　前記自己抗体が抗核抗体である、請求項１に記載の自己抗体又はその抗原結合断片。
  3. 　請求項１又は２に記載の自己抗体の抗原結合部位を含む抗体又はその抗原結合断片。
  4. 　下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される抗体又はその抗原結合断片：
    　（ａ）表１に記載のＶ鎖に由来するＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２並びにＨＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する重鎖可変領域を含む抗体；
    　（ｂ）表２に記載のＶ鎖に由来するＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２並びにＬＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する軽鎖可変領域を含む抗体；
    　（ｃ）表１に記載のＶ鎖に由来するＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２並びにＨＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する重鎖可変領域と、表２に記載のＶ鎖に由来するＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２並びにＬＣＤＲ３を表１のＮｏ．１～１０のいずれかの組合せで有する軽鎖可変領域と、を含む抗体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  5. 　請求項１又は２に記載の自己抗体又はその抗原結合断片を含む、全身性エリテマトーデスの診断薬。
  6. 　請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、全身性エリテマトーデスの診断薬。
  7. 　検査対象から採取された血液試料において、ＤＮ２Ｂ細胞から産生される自己抗体の発現量を測定する工程を含み、
    　前記自己抗体の発現量が基準値よりも高いことが、前記検査対象が全身性エリテマトーデスに罹患している可能性が高いことを示す、
    　血液試料の検査方法。
PCT/JP2024/035660 2023-10-04 2024-10-04 自己反応性ｄｎ２ｂ細胞が産生する自己抗体およびその使用 Pending WO2025075163A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202363542310P 2023-10-04 2023-10-04
US63/542,310 2023-10-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025075163A1 true WO2025075163A1 (ja) 2025-04-10

Family

ID=95283486

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/035660 Pending WO2025075163A1 (ja) 2023-10-04 2024-10-04 自己反応性ｄｎ２ｂ細胞が産生する自己抗体およびその使用

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025075163A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015189638A2 (en) * 2014-06-12 2015-12-17 Queen Mary University Of London Antibody
JP2018050532A (ja) * 2016-09-28 2018-04-05 株式会社膠原病研究所 自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法、および、自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法
JP2018526443A (ja) * 2015-08-31 2018-09-13 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 全身性エリテマトーデスを治療するためのｌｇａｌｓ３ｂｐの調節方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015189638A2 (en) * 2014-06-12 2015-12-17 Queen Mary University Of London Antibody
JP2018526443A (ja) * 2015-08-31 2018-09-13 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 全身性エリテマトーデスを治療するためのｌｇａｌｓ３ｂｐの調節方法
JP2018050532A (ja) * 2016-09-28 2018-04-05 株式会社膠原病研究所 自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法、および、自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. STRENZEL, J. DIRKS, G. HAASE, U. FISCHER, J. FISCHER, A. HOLL-WIEDEN C. HOFMANN, H. MORBACH: " Expansion of autoreactive CD27-IGD- double negative b cells in the joints of antinuclear antibody positive JIA patients", PEDIATRIC RHEUMATOLOGY, vol. 20, no. Suppl 2 no. 75, 20 September 2022 (2022-09-20) - 23 September 2022 (2022-09-23), Lo , pages 19 - 035, XP009562249, ISSN: 1546-0096 *
IMANISHI, AKIKO; HAYASHI, NOBUHIDE: "The automation and international guideline of the examination for antinuclear antibodies", BULLETIN OF KOBE TOKIWA UNIVERSITY, vol. 12, 31 March 2019 (2019-03-31), JP, pages 1 - 8, XP009562596, ISSN: 1884-5487, DOI: 10.20608/00001035 *
JENKS SCOTT A.; CASHMAN KEVIN S.; ZUMAQUERO ESTHER; MARIGORTA URKO M.; PATEL AAKASH V.; WANG XIAOQIAN; TOMAR DEEPAK; WOODRUFF MATT: "Distinct Effector B Cells Induced by Unregulated Toll-like Receptor 7 Contribute to Pathogenic Responses in Systemic Lupus Erythematosus", IMMUNITY, vol. 49, no. 4, 9 October 2018 (2018-10-09), AMSTERDAM, NL , pages 725, XP085507079, ISSN: 1074-7613, DOI: 10.1016/j.immuni.2018.08.015 *
MIMORI AKIO: "II. Systemic lupus erythematosus", JOURNAL OF THE JAPANESE SOCIETY OF INTERNAL MEDICINE, vol. 104, no. 10, 1 January 2015 (2015-01-01), pages 2118 - 2124, XP093299943 *
MOCKRIDGE; CHAPMAN; SPELLERBERG; SHETH; FLEMING; ISENBERG; STEVENSON: "Sequence analysis of V4–34‐encoded antibodies from single B cells of two patients with systemic lupus erythematosus (SLE)", CLINICAL AND EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, vol. 114, no. 1, 25 December 2001 (2001-12-25), GB , pages 129 - 136, XP071084220, ISSN: 0009-9104, DOI: 10.1046/j.1365-2249.1998.00703.x *
YASAKA KEN: " Expansion of PLD4-positive B cells and its significance in systemic lupus erythematosus", NEWSLETTER (HEMATOLOGY AND IMMUNOLOGY NEWSLETTER)), vol. 37, 1 February 2023 (2023-02-01), pages 1 - 8, XP093299948 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10604576B2 (en) Antibodies and immunocytokines
JP6767931B2 (ja) Ｔ細胞受容体ベータ定常領域に対する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原抗体（ｃａｒ）
JP6412072B2 (ja) 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体
JP2021120374A (ja) 疾患の処置における使用のためのｃｄ３イプシロンおよびｂｃｍａに対する二重特異的抗体
JP2021508475A (ja) 共有抗原を標的とする抗原結合タンパク質
JP6868655B2 (ja) Ｃｄ６結合パートナーの使用およびそれに基づく方法
AU2010225456A1 (en) Biomarkers and uses thereof
CN104284903B (zh) 抗磷脂酶d4抗体
JP2021520208A (ja) Ｈｈｌａ２受容体としてのｋｉｒ３ｄｌ３、抗ｈｈｌａ２抗体、およびその使用
KR20190057113A (ko) 인터루킨-2에 결합하는 항체 및 그 용도
JP2016503286A (ja) Ｃｌｅｃ１４ａに特異性を持つ新規な抗体及びその用途
JP2022517461A (ja) Ｇｍ－ｃｓｆアンタゴニストを使用した免疫療法関連毒性の治療方法
JP2021530511A (ja) 抗ｐｄ−１抗体、投薬量、およびその使用
JP2025134794A (ja) 多発性硬化症に対する交差反応性エピトープ
JP2010527978A (ja) 抗ＴＮＦα抗体を用いた治療に対する患者の応答を予測するための方法
US20200115452A1 (en) Anti-phosphotyrosinylated pd-1 antibodies and uses thereof
JP2018025554A (ja) 炎症性疾患のマーカー
US8435530B2 (en) Methods for suppressing activity of activated interferon-producing cells
JP2024514830A (ja) 新規腫瘍特異的抗原を使用する骨髄性障害および急性白血病の診断および処置
WO2025075163A1 (ja) 自己反応性ｄｎ２ｂ細胞が産生する自己抗体およびその使用
AU2006295717B2 (en) T-cell adhesion molecule and antibody directed against the molecule
KR102896511B1 (ko) SIRPα 변이체에 특이적으로 결합하는 항체
TW202308688A (zh) 以gm-csf拮抗劑治療免疫療法相關毒性之方法
JP2025516472A (ja) 胃腸炎症性障害を処置する方法における使用のための抗ｂｔｎ３ａ抗体
TW202342528A (zh) 抗人類ｃｘｃｌ１抗體

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24874762

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1