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WO2025074996A1 - 外科手術又は移植手術における虚血再灌流障害を抑制するための製剤 - Google Patents

外科手術又は移植手術における虚血再灌流障害を抑制するための製剤 Download PDF

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Publication number
WO2025074996A1
WO2025074996A1 PCT/JP2024/035097 JP2024035097W WO2025074996A1 WO 2025074996 A1 WO2025074996 A1 WO 2025074996A1 JP 2024035097 W JP2024035097 W JP 2024035097W WO 2025074996 A1 WO2025074996 A1 WO 2025074996A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
organ
integer
active ingredient
formula
ischemia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/035097
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一広 ▲高▼橋
幸夫 長崎
竜也 小田
朋幸 杉
愛樹 丸島
奨 坂上
欽司 古屋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tsukuba NUC
Original Assignee
University of Tsukuba NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tsukuba NUC filed Critical University of Tsukuba NUC
Publication of WO2025074996A1 publication Critical patent/WO2025074996A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A61K31/787—Polymers containing nitrogen containing heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to a preparation for blocking or ischemic blood flow to an organ, and further to suppressing organ damage caused by ischemia-reperfusion. More specifically, the present invention relates to a preparation that uses, as an active ingredient, a polymeric micelle formed from an amphiphilic block copolymer that contains a hydrophobic polymer segment having a cyclic nitroxyl radical in the side chain and a hydrophilic poly(ethylene glycol) (PEG) segment.
  • PEG poly(ethylene glycol)
  • Non-Patent Document 1 hepatoduodenal ligament blood flow interruption
  • This process of blood flow interruption and resumption causes severe damage to the organ as "ischemia-reperfusion injury," and hepatoduodenal ligament blood flow interruption for more than 15 minutes may cause irreversible damage to the liver, so blood flow interruption for more than 15 minutes is not currently performed. Furthermore, repeated blockage of blood flow, even for periods of less than 15 minutes, can cause irreversible damage to the liver and cause severe ischemia-reperfusion injury, leading to postoperative liver failure that can be fatal.
  • Non-Patent Document 2 also see Orci LA, et al. BJS 2013;100:600-609, hereafter sometimes referred to as Non-Patent Document 3.
  • these have not been shown to be effective, and no drugs have been used in clinical applications to date.
  • Non-Patent Document 4 ischemia-reperfusion injury in the field of organ transplantation cannot be solved by antioxidants.
  • the present inventors have developed self-assembled antioxidant nanoparticles or redox nanoparticles, in particular nanoparticles formed by self-assembly in an aqueous solution from amphiphilic block copolymers containing a hydrophobic polymer segment having a cyclic nitroxyl radical (particularly TEMPO (2,2,6,6-tetramethylpiperidinooxy radical)) in the side chain and a hydrophilic poly(ethylene glycol) (PEG) segment, which are known as preparations capable of scavenging free radicals generated by ischemia or inflammation (see WO 2009/133647 A, hereinafter sometimes referred to as Patent Document 1; see also WO 2016/052463 A, hereinafter sometimes referred to as Patent Document 2).
  • a hydrophobic polymer segment having a cyclic nitroxyl radical particularly TEMPO (2,2,6,6-tetramethylpiperidinooxy radical)
  • PEG poly(ethylene glycol)
  • JP 2013-166711 A discusses the use of polymeric micellar nanoparticles, abbreviated as N-TEMPO-RNP and O-TEMPO-RNP, for the prevention or treatment of cardiac ischemia-reperfusion injury, as disclosed in Patent Document 1.
  • N-TEMPO-RNP polymeric micellar nanoparticles
  • O-TEMPO-RNP polymeric micellar nanoparticles
  • the blood pressure fluctuations in test animals after administration of both RNPs are observed, and O-TEMPO-RNP, which is said not to cause a decrease in blood pressure, is used as the active ingredient.
  • O-TEMPO-RNP is intravenously administered to a beagle dog that has been placed in an ischemic state 45 minutes after the ischemia, reperfusion is performed 5 minutes after administration, and the heart is removed 4 hours later to measure the size of myocardial infarction. As a result, it is disclosed that the size of myocardial infarction is significantly reduced.
  • Patent Document 3 examines the possibility of using a preparation containing N-TEMPO-RNP and O-TEMPO-RNP as a pharmaceutical preparation for preventing or treating cardiac ischemia/reperfusion injury, and confirms the effectiveness of only the latter, O-TEMPO-RNP, as it does not exhibit a blood pressure lowering effect.
  • N-TEMPO-RNP can be used safely and can significantly and strongly suppress ischemia-reperfusion injury in the treated organ.
  • N-TEMPO-RNP accumulated in specific and significantly increased amounts in the target organ one hour after blood flow was resumed.
  • blood collection data collected six hours later confirmed that liver damage could be significantly and strongly suppressed compared to the control. No serious side effects such as kidney damage were observed when nanoparticles were administered preoperatively in this way.
  • N-TEMPO-RNP or O-TEMPO-RNP, which has a longer blood retention time than N-TEMPO-RNP, preoperatively. Therefore, the main themes of the present invention or disclosed in this specification include the following:
  • a formulation for suppressing ischemia-reperfusion injury in a treatment target organ during surgery or transplantation comprising a copolymer represented by the following formula (I) and containing, as an active ingredient, polymeric micelles having a nano-sized average diameter in an aqueous solution as measured by dynamic light scattering (DLS):
  • A represents unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkyl, the substituents when substituted being formyl or a group of formula R 1 R 2 CH-, where R 1 and R 2 independently represent C 1 -C 4 alkoxy or R 1 and R 2 together represent -OCH 2 CH 2 O-, -O(CH 2 ) 3 O- or -O(CH 2 ) 4 O-;
  • L 1 is a direct bond or or selected from -(CH 2 ) b S-, -CO ( CH 2 ) b S-, -(CH 2 ) b NH-, -(CH 2 )
  • Topic 2 The formulation of Aspect 1, wherein the organ comprises at least one selected from the group consisting of heart, lung, kidney, liver, pancreas, and small intestine.
  • the operation is a surgical operation comprising the steps of cutting off blood flow, followed by removal of a part or all of an organ, and then reperfusing the organ, and further comprising a step of parenterally administering the active ingredient to a patient or subject before cutting off blood flow, and wherein suppression of ischemia-reperfusion injury in the treated organ means suppression to a significantly higher degree than in a case not including a step of parenterally administering the active ingredient to a patient or subject.
  • the surgery is a transplant surgery, comprising a step of parenterally administering the active ingredient to an organ donor to be transplanted, and extracting the organ to be transplanted after spontaneous cardiac arrest in the donor, and then a step of preserving or perfusing the extracted organ with an organ preservation solution containing the active ingredient as a step simulated as reperfusion, and the suppression of ischemia-reperfusion injury in the treated organ means a significantly higher suppression than a step of not administering the active ingredient to the organ donor and preserving the extracted organ in an organ preservation solution not containing the active ingredient.
  • the surgery is a transplant surgery, comprising a step of parenterally administering the active ingredient to a brain-dead organ donor to be transplanted, causing cardiac arrest, and then circulating an organ preservation solution containing the active ingredient throughout the donor's body, followed by a step simulated as reperfusion, in which the extracted organ is preserved or perfused with the organ preservation solution containing the active ingredient, and wherein suppression of ischemia-reperfusion injury in the treated organ means a significantly higher suppression than a step in which the active ingredient is not administered to the organ donor and the extracted organ is preserved or perfused with an organ preservation solution not containing the active ingredient.
  • the surgery is a transplant surgery, which includes a step of parenterally administering the active ingredient to a transplant recipient patient, followed by implantation of the organ to be transplanted, and a step of blood reperfusion, and wherein suppression of ischemia-reperfusion injury in the treated organ means suppression to a significantly higher degree than in a case not including a step of parenterally administering the active ingredient to the transplant recipient;
  • a polymeric micelle for suppressing ischemia-reperfusion injury in a treated organ during surgery or transplantation comprising a copolymer represented by the following formula (I), and having a nano-sized average diameter in an aqueous solution as measured by dynamic light scattering (DLS):
  • A represents unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkyl, the substituents when substituted being formyl or a group of formula R 1 R 2 CH-, where R 1 and R 2 independently represent C 1 -C 4 alkoxy or R 1 and R 2 together represent -OCH 2 CH 2 O-, -O(CH 2 ) 3 O- or -O(CH 2 ) 4 O-;
  • L 1 is a direct bond or or selected from -(CH 2 ) b S-, -CO ( CH 2 ) b S-, -(CH 2 ) b NH-, -(CH 2 ) b CO-, -CO-
  • a method for suppressing ischemia-reperfusion injury in a treated organ during surgery or transplantation comprising the step of administering to a patient or subject in need thereof an effective amount of polymeric micelles comprising a copolymer represented by the following formula (I) and having a nano-sized average diameter in an aqueous solution as measured by dynamic light scattering (DLS):
  • A represents unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkyl, the substituents when substituted being formyl or a group of formula R 1 R 2 CH-, where R 1 and R 2 independently represent C 1 -C 4 alkoxy or R 1 and R 2 together represent -OCH 2 CH 2 O-, -O(CH 2 ) 3 O- or -O(CH 2 ) 4 O-;
  • L 1 is a direct bond or or selected from -(CH 2 ) b S-, -CO ( CH 2 ) b S-, -(CH 2 )
  • the preparation is administered systemically to a patient or subject parenterally before a surgical or transplant operation, and the preparation can be selectively accumulated in the organ that has been the subject of ischemia, and it is possible to significantly suppress the organ damage caused by ischemia-reperfusion compared to a control. Therefore, for example, in a surgical operation involving liver resection, it is possible to reduce postoperative liver damage and the occurrence of liver failure. Furthermore, it is possible to extend the continuous blood flow occlusion time, and it is possible to shorten the total surgery time.
  • a preparation capable of suppressing ischemia-reperfusion injury during liver resection has not been developed in actual clinical practice, and if the safety of liver resection can be improved simply by administering it intravenously, it would be a major innovation in the history of liver surgery that has been running for more than 130 years.
  • the preparation may lead to improved graft function and survival due to its effect of suppressing ischemia-reperfusion injury.
  • a preparation capable of suppressing unavoidable ischemia-reperfusion injury has not been developed in the past. If it were possible to increase the success rate of transplant surgery simply by administering the drug intravenously to organ donors and transplant recipients, or by adding it to the preservation solution after submission, it would be a major innovation that stands out in the 70-year-plus history of transplant surgery.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the schedule of animal experiments in Test Example 1.
  • 1 is a graph showing the results of biochemical evaluation part 1 in Test Example 1.
  • 1 is a graph showing the results of biochemical evaluation part 2 in Test Example 1.
  • 1 is a black-and-white photograph, instead of a microscope image, of liver tissue in histological evaluation part 1 in Test Example 1, taken after hematoxyline-eosin staining.
  • 1 is a black-and-white photograph, instead of a micrograph, taken after TUNEL staining of liver tissue cells in histological evaluation part 2 in Test Example 1.
  • 1 is a graph showing the results of histological evaluation part 2 in Test Example 1.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the schedule of animal experiments in Test Example 2.
  • FIG. 1 is a photograph in place of a fluorescent microscope image of liver tissue taken after treatment in Test Example 2.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the schedule of animal experiments in Test Example 3.
  • 1 is a graph showing the measurement results of biological indicators when refrigerated storage was performed in biological evaluation part 1 of Test Example 3.
  • 1 is a graph showing the measurement results of biological indicators when thermal preservation was performed in biological evaluation part 1 of Test Example 3.
  • 1 is a graph showing the measurement results of biological indicators when refrigerated storage was performed in biological evaluation part 2 of Test Example 3.
  • 13 is a graph showing the measurement results of biological indicators when thermal preservation was performed in biological evaluation part 2 of Test Example 3.
  • 13 is a graph showing the measurement results of biological indicators when refrigerated storage was performed in biological evaluation part 3 of Test Example 3.
  • FIG. 13 is a graph showing the measurement results of biological indicators when thermal preservation was performed in biological evaluation part 3 of Test Example 3.
  • 1 is a black-and-white photograph, instead of a microscope image, of liver tissue sampled during cold storage in the histological evaluation of Test Example 3, taken after staining with Hematoxyline-Eosin.
  • 1 is a black-and-white photograph, instead of a microscope image, of liver tissue sampled during thermal preservation in the histological evaluation of Test Example 3, taken after staining with Hematoxyline-Eosin.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the schedule of animal experiments in Test Example 4.
  • 1 is a graph showing the measurement results of biological indicators up to the time when heart rate resumed after heart transplantation in physiological evaluation part 1 of Test Example 4.
  • 1 is a graph showing the measurement results of biological indicators of cardiac output strength in physiological evaluation part 1 of Test Example 4.
  • Ischemia-reperfusion injury in surgery or organ transplantation refers primarily to a phenomenon in which biochemical parameters that indicate the function of an organ that has been resected, extracted, or transplanted deteriorate compared to preoperative values or compared to standard values in healthy individuals, or the histological evaluation of the organ declines. However, in a broader sense, it is not limited to these, and refers to some kind of damage to the organ that is the subject of surgery or to the surrounding organs, organs, or tissues caused by the surgery.
  • a "patient or subject” is a person from whom at least a part of an organ is to be removed, extracted, or transplanted; in the case of transplant surgery, this may be either the organ donor or the transplant recipient.
  • Cutting off blood flow to an organ is primarily a means of reducing bleeding during the resection, transection, or extraction of an organ, and there is no limitation on the form or type of means employed.
  • transplant surgery such cutting off of blood flow is performed in organ donor patients before the transplant target organ is extracted or harvested, and in transplant recipients before the organ corresponding to the transplanted organ is harvested.
  • transplant recipients before the harvested organ is implanted in the patient, the patient's blood vessels and the blood vessels of the transplanted organ are anastomosed, and blood flow is stopped until blood flow is resumed; such a state of occlusion is also included in the above-mentioned cutting off of blood flow.
  • the patient Before liver transection begins, the patient is intravenously administered a fixed dose of polymeric micelles containing a copolymer represented by formula (I) and having a nano-sized average diameter in an aqueous solution as measured by dynamic light scattering (DLS), or polymeric micelles having a nano-sized average diameter formed from a copolymer represented by formula (I) (these polymeric micelles are sometimes abbreviated as "nanoparticles”), or a formulation containing nanoparticles as an active ingredient.
  • the patient is allowed to wait several minutes, for example about 3 minutes, until the nanoparticles are distributed throughout the body, and then the hepatoduodenal ligament blood flow is blocked to begin liver transection.
  • Organ removal from donors in a cardiac arrest state (heart, lungs, liver, kidneys, pancreas, small intestine)
  • the nanoparticle formulation is intravenously administered to the organ donor at a fixed dose (e.g., 90 mg/kg) in accordance with the timing of heparin administration.
  • a fixed dose e.g. 90 mg/kg
  • each organ is removed, and the graft is manually perfused with an organ preservation solution (e.g., 1.0 mg/mL) containing the nanoparticle formulation, and the antioxidant nanoparticle formulation is filled into the graft.
  • organ preservation solution e.g., 1.0 mg/mL
  • the nanoparticle formulation is intravenously administered to the organ donor at a fixed dose (e.g., 90 mg/kg) in accordance with the timing of heparin administration.
  • a fixed dose e.g. 90 mg/kg
  • the self-assembling antioxidant nanoparticle formulation is perfused throughout the donor's body with an organ preservation solution (e.g., 1.0 mg/mL) containing the self-assembling antioxidant nanoparticle formulation.
  • organ preservation solution e.g., 1.0 mg/mL
  • Each transplant organ is removed and manually perfused with the organ preservation solution containing the self-assembling antioxidant nanoparticle formulation to fill the graft with the antioxidant nanoparticle formulation.
  • simple cooling preservation or machine perfusion preservation is performed with the preservation solution containing the antioxidant nanoparticle formulation.
  • the nanoparticle formulation (e.g., 90 mg/kg) is administered intravenously or intraportally to the recipient patient, and the patient is allowed to wait for several minutes, e.g., about 3 minutes, until the nanoparticles are distributed throughout the body. Then, each graft is implanted and blood is reperfused.
  • the nanoparticles include or consist of a copolymer represented by formula (I), and their preparation methods are described in Patent Document 1 or Patent Document 2.
  • the average diameter of the nano-size is in the order of nanometers, and may be in the range of 5 nm to 500 nm, 10 nm to 300 nm, 10 nm to 100 nm, or 10 nm to 60 nm, but is not limited thereto.
  • L 2 is -(CH 2 ) a -NH-(CH 2 ) a - or -(CH 2 ) a -O-(CH 2 ) a -, where each a is independently 0 or an integer of 1 to 5 or 1 to 3, and preferably each a is the integer 0.
  • the nano-size refers to the average diameter when the nanoparticles are measured by dynamic light scattering (DLS) in an aqueous solution.
  • m represents an integer of 2 to 10,000, but may represent an integer of 5 to 1,000 or 10 to 500, while n represents an integer of 3 to 100, but may represent an integer of 5 to 100 or 5 to 60.
  • C 1 -C 12 alkyl includes straight chain, branched or cyclic alkyl having 1 to 12 carbon atoms, typically including, but not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, hexyl, heptyl, octyl, isooctyl, 2-ethylhexyl, nonyl, isononyl, decyl, isodecyl, undecyl, dodecyl, etc.
  • the nanoparticles thus formed collapse upon being protonated in a low pH environment, and therefore typically accumulate specifically in the liver where blood flow has been blocked, which is in a low pH environment, and in some cases, in the surrounding organs or organs, or in transplanted organs, and collapse in situ to expose cyclic nitroxide radicals that exert a redox effect, which are understood to be effective in removing the "bad" active oxygen involved in the injury caused by ischemia and the subsequent reperfusion of blood flow.
  • nanoparticles equivalent to O-TEMPO-RNP in which the -NH- portion is -O-, have a half-life several times longer than N-TEMPO-RNP, and can remain or remain in the blood circulation or storage solution for a longer period of time, according to pharmacokinetic studies. Therefore, it is presumed that either N-TEMPO-RNP or O-TEMPO-RNP nanoparticles will act effectively depending on the type or circumstances of the surgery or transplant operation.
  • the nanoparticles formed as described above can be dissolved or uniformly dispersed in an aqueous medium (an aqueous solution that may contain physiological salt or a pH adjuster, if necessary), and can be reconstituted with water, so that they can be provided as a preparation in various forms. Therefore, for example, they can be made into parenteral preparations in various forms, including parenteral preparations (including intravenous injections, subcutaneous administration agents, etc.). Such parenteral preparations can contain a typical pharma- ceutically acceptable medium, such as water, glycol, sucrose, lactose, etc., as long as it does not adversely affect the stability of the nanoparticles in the aqueous medium.
  • the optimal dose of such preparations varies depending on the type of surgery and the condition of the patient or subject undergoing surgery, so a uniform dose cannot be specified, but the dose can be determined by a specialist based on data obtained through small-scale clinical trials, etc.
  • the nanoparticles may be contained as an active ingredient in an amount of at least 5% by weight.
  • the proportion of the active ingredient in these preparations or compositions may vary and may conveniently be between about 30% and about 90% by weight based on the total weight of the preparation or composition.
  • the nanoparticles may be effective over a wide range of dosages, so that, for example, in the treatment of an adult, the dosage may be about 50 to about 1000 mg per kg of body weight or about 100 to about 500 mg per kg of body weight.
  • the nanoparticles used in the following examples are copolymers produced by the method described in Patent Document 2, and are formed, for example, as follows from a block copolymer (PEG-b-PMNT) represented by formula (I), in which A is methyl, L 1 is paraxylylene, m is about 40, p is 15, q is 4, a is 0, Z is S(C ⁇ S)-Ph, Ph is unsubstituted phenyl, and R 1 is the residue shown at the left end of the three types of cyclic nitroxy radicals listed above: 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl.
  • PEG-b-PMNT block copolymer represented by formula (I), in which A is methyl, L 1 is paraxylylene, m is about 40, p is 15, q is 4, a is 0, Z is S(C ⁇ S)-Ph, Ph is unsubstituted phenyl, and R 1 is the residue shown at the left end of the three types
  • PEG-b-PMNT was dissolved in dimethylformamide (DMF) at a concentration of 150 mg/mL, the solution was placed in a dialysis membrane, sealed, and dialyzed against distilled water to produce nanoparticles. The distilled water was replaced every 2, 4, 8, and 20 hours after the start of dialysis, and the solution in the dialysis membrane was collected after 24 hours. PBS with a 10-fold concentration was added to the solution in the dialysis membrane so that the final concentration was 1x PBS concentration.
  • the particle size and particle size distribution were measured using dynamic light scattering (DLS), and the particle size (Z-Ave) was 26.5 nm, the polydispersity index (PDI) was 0.12, and the particle size distribution was uniform.
  • DFS dynamic light scattering
  • Biochemical evaluation part 1 As a biochemical evaluation in Test Example 1, the changes in GPT, GOT and LDH, which are indicators of liver function, were measured. The results are shown in Figure 2. As can be seen from Figure 2, in the case where the preparation of the present invention was used, a significant decrease was observed in all of the indicators related to the degree of liver inflammation, compared to the control, which is the case where the preparation was not used.
  • Biochemical evaluation part 2 The results of measuring the serum concentration of TBRS (2-thiobarbituric acid reactive substances), an oxidative stress marker, 24 hours after surgery in Test Example 1 are shown in Figure 3. As can be seen from Figure 3, in the cases where the preparation of the present invention was used, a significant decrease in TBRS, an oxidative stress marker, was observed compared to the control where no preparation was used.
  • Histological evaluation 1 was performed by staining the resected liver tissue 6 and 24 hours after the operation in Test Example 1 with hematoxylin-eosin. Black and white photographs taken after staining, instead of microscopic images, are shown in FIG. 4. The original microscopic photographs in this organ transplant are color images. In order to obtain clearer information, we are prepared to submit the color images if necessary.
  • FIG. 4 in the control group, hepatocytes around the hepatic vein began to become hollow after 6 hours of ischemia, whereas hollowing was mild in the RNP-administered group. In addition, in the control group, extensive necrosis was observed after 24 hours of ischemia, but the area of necrosis was small in the RNP-administered group.
  • Histological evaluation part 2 The second histological evaluation was performed by TUNEL staining to evaluate apoptosis of the resected hepatocytes 6 and 24 hours after the operation in Test Example 1.
  • the black and white photographs taken after TUNEL staining are shown in FIG. 5, and the percentage (%) of the TUNEL positive area is shown in FIG. 6.
  • the original microscopic photographs of the organ transplant are color images. If necessary, we are prepared to submit the color images to obtain clearer information. In the cases where this preparation was used (RNP group), the TUNEL staining positive area was reduced 6 and 24 hours after the operation compared to the cases where this preparation was not used (control group). These results show that cell death was suppressed by administration of RNP.
  • Test Example 2 According to the schematic diagram of the schedule of the animal experiment shown in FIG. 7, experimental animals were administered RNP (90 mg/kg) and divided into an IR- group in which the hepatoduodenal ligament blood flow was not blocked, and an IR+ group in which the hepatoduodenal ligament blood flow was blocked. Fluorescent microscopic images of liver tissue were taken one hour after the end of the blockage to evaluate the accumulation of RNP in the liver. A black and white photograph instead of the fluorescent photograph is shown in FIG. 8. The original of the microscope image is a color image. If necessary, we are prepared to submit the color image to obtain clearer information.
  • organ preservation solution Wisconsin solution, hereafter abbreviated as UW solution
  • the liver was immediately removed, and the former was simply cooled and preserved at 4°C in UW solution without RNP added, and the latter was simply heated and preserved at 37°C in UW solution (1.0 mg/ml) with RNP added. After preservation, biochemical and histological evaluations were performed on the preservation solution and the preserved liver.
  • Biochemical evaluation part 2 In the second biochemical evaluation, the concentration of glutathione (hereinafter abbreviated as GSH) contained in liver tissue collected 6, 12, and 24 hours after the start of storage in the cold storage of Test Example 3 was measured. The results are shown in FIG. 12. Since GSH exhibits antioxidant activity by reducing reactive oxygen species, a low GSH level can be interpreted as a strong oxidative stress. From FIG. 12, the control group to which the preparation was not added showed a decrease in GSH, an antioxidant, compared to the case to which the preparation of the present invention was added. Next, the concentration of GSH contained in liver tissue collected 6 and 12 hours after the start of storage in the warm storage of Test Example 3 was measured. The results are shown in FIG. 13. From FIG.
  • the control to which the preparation was not added showed a tendency for GSH, an antioxidant, to decrease after 6 hours of storage, compared to the case to which the preparation of the present invention was added, and a significant decrease in GSH was observed after 12 hours. From the above, it can be seen that the oxidative stress of preserved organs was reduced by adding RNP to the preservation solution during cold or warm preservation.
  • dROM Diacron-Reactive Oxygen Metabolites, a derivative (R-OOH) of
  • the histological evaluation was carried out by staining the liver tissue collected 6 and 24 hours after the start of cold storage in Test Example 3 with Hematoxyline-Eosin. Black-and-white photographs in place of the microscope images taken after staining are shown in FIG. 16. The original microscope photographs in the organ transplantation are color images. In order to obtain clearer information, the color images are available if necessary. From FIG. 16, the morphology of the liver tissue was maintained in both the control group and the RNP-added group 6 hours after storage, but after 24 hours, the liver cells in the control group were destroyed and the sinusoids were enlarged, whereas in the RNP group, the destruction of the liver cells was small and the sinusoids were hardly enlarged.
  • the histological evaluation in the warm storage was carried out by staining the liver tissue collected 3 and 12 hours after the start of storage with Hematoxyline-Eosin. Black-and-white photographs in place of the microscope images taken after staining are shown in FIG. 17.
  • the original microscope photographs in the organ transplantation are color images. In order to obtain clearer information, we are prepared to submit color images if necessary.
  • hepatocytes began to decompose and the sinusoids expanded from 3 hours after storage, whereas in the RNP group, the morphology of liver tissue was maintained.
  • Fig. 18 shows a schematic diagram of the schedule of the animal experiment.
  • Donor experimental animals C57BL/6 mice
  • the control group was perfused with 4 ml of organ preservation solution (UW solution)
  • the heart graft was removed, and the excised heart graft was washed with 4 ml of UW solution.
  • the RNP group was perfused with 4 ml of RNP-added UW solution (1 mg/ml), the heart graft was removed, and the excised heart graft was washed with 4 ml of RNP-added UW solution. Subsequently, the heart grafts in the control group were cold-preserved in UW solution at 4°C for 24 hours, while the RNP group was cold-preserved in UW solution containing RNP (1 mg/dl) for 24 hours at 4°C.
  • the recipients in the control group were intravenously administered saline, and the recipients in the RNP group were intravenously administered RNP (90 mg/kg), and then the heart grafts were intraperitoneally transplanted.
  • Physiological evaluations were performed on the recipients and heart grafts in each group.
  • Physiological evaluation part 1 The time from resumption of blood flow to resumption of heartbeat in each group of grafted heart pieces is shown in Figure 19.
  • the preparation of the present invention was used (RNP group)
  • the time until resumption of heartbeat was shortened compared to the control group not using the preparation.
  • the heartbeat intensity at the time of resumption of heartbeat after blood perfusion and 6 hours after surgery in each group is shown in Figure 20 according to the Stanford Cardiac Surgery Laboratory Graft Scoring System (maximum 4 points).
  • an increase in heartbeat intensity was observed at each time compared to the control not using the preparation. From the above, it can be seen that the heartbeat of the heart graft after transplantation is more advantageous in terms of time and intensity in the case where the preparation of the present invention is used than in the case where the preparation of the present invention is not used.

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Abstract

外科手術又は移植手術における虚血再灌流傷害を効果的に抑制するための製剤が開示される。当該製剤の活性成分として、下記式（Ｉ）：で表され、式中の主要な可変基又は部分の中、Ｌ２－Ｒ１のＬ２が－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－又は－（ＣＨ２）ａ－Ｏ－（ＣＨ２）ａ－を表し、ここで、各ａは、独立して０又は１～５の整数であり、Ｒ１が環状ニトロキシドラジカルである、ことを特徴とする共重合体を含み、水溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定によりナノサイズの平均経を有する高分子ミセルが使用される。当該高分子ミセルを、原則として、外科手術又は移植手術における臓器摘出術の術前に患者又は臓器提供者に非経口的に投与され、また移植手術においては摘出臓器を当該高分子ミセルを含有する保存液中に保存又は灌流することにより、また、移植手術においては移植対象患者に当該高分子ミセルを非経口的に投与することにより、虚血再灌流により手術の処置対象である臓器の損傷が抑制される。

Description

外科手術又は移植手術における虚血再灌流障害を抑制するための製剤
　本発明は、臓器への血流の遮断又は阻血、さらに、虚血再灌流により生じる臓器障害を抑制するための製剤に関し、より具体的には、前記製剤として、環状ニトロキシルラジカルを側鎖に有する疎水性のポリマーセグメントと親水性のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）セグメントを含む両親媒性ブロック共重合体から形成される高分子ミセルを活性成分として使用する製剤に関する。
＜外科手術、主に肝臓手術に関わる技術＞
　肝切除手術時の出血を低下させる方法の一つとして肝十二指腸間膜血流遮断（Pringle法：Mise Y, et al. Liver Cancer 2013;55-66 doi:10,1159/000346225、参照。以下、非特許文献１と称する場合あり。）が広く行われている。これは、肝臓への血流を一時的（約１５分）に遮断している間に肝臓の実質離断を進め、続く５分間で肝実質離断を中断し、肝臓への血流を再開させることで、肝臓組織への酸素、栄養を回復させるものである。この血流遮断―再開のプロセスは「虚血再灌流障害」として臓器に大きな障害を与え、１５分以上の肝十二指腸間膜血流遮断で、肝臓に不可逆的な傷害を与える可能性があるために、現在１５分を超過する血流遮断は行われていない。また、１５分以内であっても、繰り返し血流遮断を行うことで、肝臓に不可逆的な傷害を与えたり、強い虚血再灌流障害が起き、致死に繋がる術後肝不全を発症することもある。
　虚血再灌流障害は、阻血期間に発生する、所謂、「悪玉」活性酸素が細胞を傷害することによってもたらされる。過去には、術前大量ステロイド投与や術中プロスタグランジンＥ１製剤で、肝障害を軽減できるとの報告もあった（丸橋繁、他　日臨外誌　1999;60:329-334、参照。以下、非特許文献２と称する場合あり。また、Orci LA, et al. BJS 2013;100:600-609、参照。以下、非特許文献３と称する場合あり。）が、実際にこれらでの効果を認めず、臨床応用された薬剤は今までにない。
＜臓器移植の成功率向上に関わる技術＞
　臓器移植手術において、提供される臓器（心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、小腸など）は一定時間の阻血状況におかれ、レシピエントの体に植え込まれて血流を再開させるという行程をとる。血液再開時には、活性酸素を主体とした組織傷害物質が、移植臓器を構成する細胞から大量に産生され、移植臓器に直接的な傷害を及ぼす。阻血時間中に起きる臓器障害と移植後臓器血流再開時の虚血再灌流障害をいかに軽減できるかは、移植の成功率に関わる大きな課題である。このような課題を解決するものとして、過去には、Ｎ－アセチルシステインやエダラボンなどの抗酸化剤の有効性について動物実験レベルの報告があるが、実臨床での効果を認めなかった（Orban JC, et al. Transplantation 2015;99:746-753、以下、非特許文献４と称する場合あり。）。従って、臓器移植分野における虚血再灌流障害は、抗酸化剤では解決できないと考えられてきた。
＜活性酸素等の消去に関わる技術＞
　活性酸素は様々な臓器に組織傷害を来たし、多くの疾患の原因となっていることが、近年の研究で明らかになってきた。活性酸素には臓器障害を来す「悪玉」活性酸素だけでなく、正常細胞内のミトコンドリアの電子伝達系を含む酸化還元反応に必須な、所謂「善玉」活性酸素も存在する。活性酸素を抑制する抗酸化剤の開発が過去に盛んに行われてきたが、従来の抗酸化剤は正常細胞にも取り込まれ、細胞内の酸化還元バランスを破壊してしまい、正常細胞の機能も抑制するため、副作用が強く臨床応用に結びつかなかった。このような背景の下、本発明者の一部が開発した自己組織化抗酸化ナノ粒子又はレドックスナノ粒子、特に、環状ニトロキシルラジカル（特に、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチルピペリジノオキシラジカル））を側鎖に有する疎水性のポリマーセグメントと親水性のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）セグメントを含む両親媒性ブロック共重合体から水溶液中で自己集積化により高分子ミセル化したナノ粒子は、虚血や炎症で生じるフリーラジカルを消去することができる製剤として知られている（WO 2009/133647 A、参照。以下、特許文献１と称する場合あり。また、WO 2016/052463 A、参照。以下、特許文献２と称する場合あり。）。さらに、特開2013-166711号公報（JP 2013-166711 A）（以下、特許文献３と称する場合あり。）には、特許文献１に開示されているとおり、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰ、Ｏ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰと略記されている高分子ミセル化したナノ粒子の心臓虚血・再灌流障害の予防又は治療に向けた使用について検討されている。特許文献３では、前記両ＲＮＰがそれぞれ、被験動物に投与された後の当該動物における血圧変動について観察され、血圧低下を示さないとされるＯ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰが活性成分として使用されている。より具体的には、虚血状態にされたビーグル犬に、虚血から４５分が経過した後、Ｏ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰが静脈投与され、投与５分後、再灌流が行われ、４時間後心臓が摘出され、心筋梗塞サイズが測定されている。その結果、心筋梗塞サイズが著しく低減したことが開示されている。
　前述の、外科手術、主に肝臓手術に関わる技術や臓器移植の成功率向上に関わる技術において使用され、又は使用の検討された虚血再灌流障害を抑制する製剤は、必ずしも、満足できる効果を示さなかった。そこで、仮に、外科手術や臓器移植においてＮ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰ又はＯ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰを使用する事で、簡便かつ効果的に虚血再灌流障害を抑制できる可能性があるならば、これらの使用について検討してみる価値があるであろう。
　心臓虚血・再灌流障害の予防又は治療用の製薬学的製剤として、例えば、特許文献３では、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰとＯ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰを含む製剤の使用可能性について検討され、血圧低下作用を示さないとの観点から後者のＯ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰについてのみ有効性が確認されている。
　しかし今回、外科手術又は移植手術における虚血再灌流を模倣したモデル動物では、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰも安全に使用でき、かつ、処置対象とする臓器の虚血再灌流障害を有意に強く抑制できることが確認された。具体的には、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰを、虚血再灌流障害を加える前に被験動物に投与すると、血流再開後１時間が経過した時点で、対象臓器にＮ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰが特異的、かつ、有意に増加した量で集積することが確認された。またその後６時間が経過した時点での採血データから、肝臓の臓器障害がコントロールに比べて有意に強く抑制できることも確認された。このような術前のナノ粒子の投与において、腎障害などの重篤な副作用は認められなかった。これらの動物実験の結果から、ヒト患者における肝臓手術又は臓器移植においても、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰも、また、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰよりも血中滞留性が長いＯ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰも、術前に投与する事により虚血再灌流障害を抑制できる可能性があると考えられる。　したがって、本発明として又は本明細書に開示される主たる主題として、次のものを挙げることができる。
［主題１］
　下記式（Ｉ）で表される共重合体を含み、水溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定によりナノサイズの平均直径を有する高分子ミセルを活性成分として含む、外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための製剤。
式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　上式中、
Ａは、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
Ｌ1は、直接結合又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
で表される基から選ばれるか、又は－（ＣＨ２）ｂＳ－、－ＣＯ（ＣＨ２）ｂＳ－、－（ＣＨ２）ｂＮＨ－、－（ＣＨ２）ｂＣＯ－、－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－から選ばれ、ここで各ｂは、独立して、１～５の整数であり（これらの基が、結合の方向性により異なる構造を表す場合には、ここに、記載されている方向性を以って式（Ｉ）中に組み込まれるものとする。）、
Ｌ２－Ｒ１は、Ｌ２が－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－又は－（ＣＨ２）ａ－Ｏ－（ＣＨ２）ａ－であり、ここで各ａは、独立して、０又は１～５の整数であり、Ｒ１が、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
で表される環状ニトロキシドラジカル残基のいずれかであり（ここで、Ｒ’はメチルである。）、
Ｒ２は、クロロ、ブロモ又はヒドロキシルであり、
上記において、Ｌ２－Ｒ１とＲ２を有するポリマー主鎖中の反復単位はランダムに存在し、Ｌ２－Ｒ１を有する単位ｐは２～１００の範囲内にある整数であり、Ｒ２を有する単位ｑは存在しない（ゼロ）か、若しくは１～２０の整数の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなり、
ＺはＨ、ＳＨ又はＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈは１又は２個のメチルまたはメトキで置換されていてもよいフェニルを表し、
ｍは２～１０，０００の整数を表し、
ｎは３～１００の整数を表す。
［主題２］
　前記臓器は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、小腸から選ばれる１種を少なくとも含む、主題１に記載の製剤。
［主題３］
　前記臓器は、肝臓である、主題１に記載の製剤。
［主題４］
　主題１又は２に記載された外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための製剤であって、次の（ｉ）～（ｉｖ）から選ばれる構成要件を具備する前記製剤。
（ｉ）　前記手術は、外科手術であって、血流遮断後に臓器の一部または全部を切除し、次いで血液再灌流する各ステップを含み、かつ、血流遮断前に前記活性成分が患者又は被験者に非経口的に投与されるステップを含み、前記処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するは、前記活性成分が患者又は被験者に非経口的に投与されるステップを含まない場合に比べ、有意に高く抑制することを意味する。
（ｉｉ）　前記手術は、移植手術であって、移植対象臓器提供者に前記活性成分が非経口的に投与され、前記提供者に自然心停止が起きた後に、移植対象臓器が摘出されるステップを含み、次いで、再灌流と擬制されるステップとして、摘出された臓器が前記活性成分を含む臓器保存液で保存又は灌流されるステップを含み、前記処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するは、臓器提供者に前記活性成分を投与せず、前記摘出された臓器が前記活性成分を含まない臓器保存液で保存されるステップを含む場合に比べ、有意に高く抑制することを意味する。
（ｉｉｉ）　前記手術は、移植手術であって、脳死下の移植対象臓器提供者に前記活性成分が非経口的に投与され、心停止を起こした後に、前記活性成分を含有する臓器保存液を前記提供者の全身に循環させるステップを含み、次いで、再灌流と擬制されるステップとして、摘出された臓器が前記活性成分を含む臓器保存液で保存又は灌流されるステップを含み、前記処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するは、臓器提供者に前記活性成分を投与せず、前記摘出された臓器が前記活性成分を含まない臓器保存液で保存又は灌流されるステップを含む場合に比べ、有意に高く抑制することを意味する。
（ｉｖ）　前記手術は、移植手術であって、移植対象患者に前記活性成分を非経口的に投与した後、移植する臓器の植込みを行うステップ、さらに、血液再灌流ステップを含み、前記処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するは、前記活性成分が移植対象者に非経口的に投与されるステップを含まない場合に比べ、有意に高く抑制することを意味する。
［主題５］
　外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための、下記式（Ｉ）で表される共重合体を含み、水溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定によりナノサイズの平均直径を有する高分子ミセル。
式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　上式中、
Ａは、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
Ｌ1は、直接結合又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
で表される基から選ばれるか、又は－（ＣＨ２）ｂＳ－、－ＣＯ（ＣＨ２）ｂＳ－、－（ＣＨ２）ｂＮＨ－、－（ＣＨ２）ｂＣＯ－、－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－から選ばれ、ここで各ｂは、独立して、１～５の整数であり（これらの基が、結合の方向性により異なる構造を表す場合には、ここに、記載されている方向性を以って式（Ｉ）中に組み込まれるものとする。）、
Ｌ２－Ｒ１は、Ｌ２が－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－又は－（ＣＨ２）ａ－Ｏ－（ＣＨ２）ａ－であり、ここで各ａは、独立して、０又は１～５の整数であり、Ｒ１が、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
で表される環状ニトロキシドラジカル残基のいずれかであり（ここで、Ｒ’はメチルである。）、
Ｒ２は、クロロ、ブロモ又はヒドロキシルであり、
上記において、Ｌ２－Ｒ１とＲ２を有するポリマー主鎖中の反復単位はランダムに存在し、Ｌ２－Ｒ１を有する単位ｐは２～１００の範囲内にある整数であり、Ｒ２を有する単位ｑは存在しない（ゼロ）か、若しくは１～２０の整数の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなり、
ＺはＨ、ＳＨ又はＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈは１又は２個のメチルまたはメトキで置換されていてもよいフェニルを表し、
ｍは２～１０，０００の整数を表し、
ｎは３～１００の整数を表す。
 [主題６]
　外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための方法であって、下記式（Ｉ）で表される共重合体を含み、水溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定によりナノサイズの平均直径を有する高分子ミセルの有効量を、それを必要とする患者又は被験者に投与するステップ含む、前記方法。
式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　上式中、
Ａは、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
Ｌ1は、直接結合又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
で表される基から選ばれるか、又は－（ＣＨ２）ｂＳ－、－ＣＯ（ＣＨ２）ｂＳ－、－（ＣＨ２）ｂＮＨ－、－（ＣＨ２）ｂＣＯ－、－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－から選ばれ、ここで各ｂは、独立して、１～５の整数であり（これらの基が、結合の方向性により異なる構造を表す場合には、ここに、記載されている方向性を以って式（Ｉ）中に組み込まれるものとする。）、
　Ｌ２－Ｒ１は、Ｌ２が－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－又は－（ＣＨ２）ａ－Ｏ－（ＣＨ２）ａ－であり、ここで各ａは、独立して、０又は１～５の整数であり、Ｒ１が、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
で表される環状ニトロキシドラジカル残基のいずれかであり（ここで、Ｒ’はメチルである。）、
Ｒ２は、クロロ、ブロモ又はヒドロキシルであり、
上記において、Ｌ２－Ｒ１とＲ２を有するポリマー主鎖中の反復単位はランダムに存在し、Ｌ２－Ｒ１を有する単位ｐは２～１００の範囲内にある整数であり、Ｒ２を有する単位ｑは存在しない（ゼロ）か、若しくは１～２０の整数の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなり、
ＺはＨ、ＳＨ又はＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈは１又は２個のメチルまたはメトキで置換されていてもよいフェニルを表し、ｍは２～１０，０００の整数表し、
ｎは３～１００の整数を表す。
　本発明によれば、前記製剤を外科手術又は移植手術の術前に患者又は被験者に対して全身的に非経口投与することにより、前記製剤を選択的に虚血の対象となった臓器に集積させることができ、虚血再灌流による当該臓器障害をコントロールに比べて有意に抑制できる可能性がある。したがって、例えば、肝臓切除を伴う外科手術では、術後肝障害を軽減し肝不全の発現を低減することができる可能性がある。さらに、連続血流遮断時間を延長することが可能になり、全手術時間を短縮できる可能性がある。過去に、実臨床で肝切除時の虚血再灌流障害を抑制できる製剤が開発されたことは無く、例えば、静脈内投与するだけで肝切除の安全性を高めることができれば、１３０年以上の肝臓外科の歴史の中でも、特出する大きなイノベーションになる。また、臓器移植領域において、前記製剤は、その虚血再灌流障害抑制効果により、移植片の機能と生着の向上につながる可能性がある。過去に、臓器移植領域において、不可避の虚血再灌流障害を抑制できる製剤が開発されたことは無なかった。臓器提供患者、移植対象患者（レシピエント）に静脈内投与若しくは提出後の保存液中に添加するだけで、移植手術の成功率を高める事ができれば、７０年以上の移植外科の歴史の中でも、特出する大きなイノベーションになる。
試験例１における、動物実験のスケジュールについての概念図である。 試験例１における、生化学的評価その１を行った結果のグラフ表示である。 試験例１における、生化学的評価その２を行った結果のグラフ表示である。 試験例１における、組織学的評価その１の肝組織をＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ－Ｅｏｓｉｎ染色後撮影した顕微鏡像に代わる白黒写真である。 試験例１における、組織学的評価その２の肝組織の細胞をＴＵＮＥＬ染色後撮影した顕微鏡写真に代わる白黒写真である。 試験例１における、組織学的評価その２を行った結果のグラフ表示である。 試験例２における、動物実験のスケジュールについての概念図である。 試験例２における、処置後に撮影した肝臓組織の蛍光顕微鏡像に代わる写真である。 試験例３における、動物実験のスケジュールについての概念図である。 試験例３の生物学的評価その１における冷却保存を行ったときの生物学的指標の測定結果のグラフ表示である。 試験例３の生物学的評価その１における温熱保存を行ったときの生物学的指標の測定結果のグラフ表示である。 試験例３の生物学的評価その２における冷却保存を行ったときの生物学的指標の測定結果のグラフ表示である。 試験例３の生物学的評価その２における温熱保存を行ったときの生物学的指標の測定結果のグラフ表示である。 試験例３の生物学的評価その３における冷却保存を行ったときの生物学的指標の測定結果のグラフ表示である。 試験例３の生物学的評価その３における温熱保存を行ったときの生物学的指標の測定結果のグラフ表示である。 試験例３の組織学的評価における冷却保存を行ったときに採取された肝組織をＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ－Ｅｏｓｉｎ染色後撮影した顕微鏡像に代わる白黒写真である。 試験例３の組織学的評価における温熱保存を行ったときに採取された肝組織をＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ－Ｅｏｓｉｎ染色後撮影した顕微鏡像に代わる白黒写真である。 試験例４における、動物実験のスケジュールについての概念図である。 試験例４の生理学的評価その１における心臓移植後の心拍数再開時間までの生物学的指標の測定結果のグラフ表示である。 試験例４の生理的評価その１における心拍出強度の生物学的指標の測定結果のグラフ表示である。
発明の詳細な記述
　本明細書中で使用する用語は、特記しない限り、当該技術分野で常用されている意味内容を有するものと解釈される。
　「外科手術又は臓器移植手術における虚血再灌流障害」は、主として、切除若しくは摘出又は移植対象の臓器の機能を表す生化学的パラメータが、術前のものに比べて又は健常者における基準値に比べて悪化するか、当該臓器の組織学的評価が低下する現象である。しかし、広義には、これらに限定されることなく、当該手術を原因として手術対象臓器又はその周囲の臓器又は器官若しくは組織が何らかの傷害を受けることを意味する。
　「患者又は被験者」は、臓器の少なくとも一部が切除若しくは摘出又は移植される対象者であり、移植手術にあっては、臓器提供患者（ドナー）又は移植対象患者（レシピエント）のいずれであってもよい。
　「臓器への血流の遮断」は、主として、臓器の切除若しくは離断又は摘出時の出血を低下させる手段であり、採用される手段の形式又は種類が限定されるものでない。また、移植手術においては、このような血流の遮断は、臓器提供患者においては、移植対象臓器が摘出又は採取される前に、移植対象者においては、移植される臓器に対応する臓器の摘出前に実施され、さらには、採取された臓器が患者に埋め込まれる前に、患者の血管と移植臓器の血管は吻合され、血流が再開されるまで血流が流されないが、このような阻血状態も、上記血流の遮断に包含される。
　外科手術、主に肝臓手術、移植手術は、下記＜外科手術、主に肝臓手術に関わる技術＞及び＜臓器移植の成功率向上に関わる技術＞に概述するように進められるが、限定されるものでなく、簡潔かつ、具体的には、次のように進められる場合がある。
＜外科手術、主に肝臓手術に関わる技術＞
　肝離断が始まる前に、患者に式（Ｉ）で表される共重合体を含み、水溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定によりナノサイズの平均経を有する高分子ミセル、若しくは式（Ｉ）で表される共重合体から形成されたナノサイズの平均経を有する高分子ミセル（以上の高分子ミセルは「ナノ粒子」と略称される場合がある。）、又はナノ粒子を活性成分として含む製剤の一定用量を静脈内投与する。その後、前記ナノ粒子が全身に分布するまで数分間、例えば、約３分間待機してから、肝十二指腸間膜血流遮断を行って肝離断を開始する。　
＜臓器移植の成功率向上に関わる技術＞
１．心停止下で臓器提供者からの臓器摘出（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、小腸）
　臓器提供者に前記ナノ粒子製剤をヘパリンの投与のタイミングに合わせて一定用量（例えば、９０ｍｇ／ｋｇ）で静脈内投与する。そして、自然心停止が起きた後に、各臓器を取り出し、前記ナノ粒子製剤を含む臓器保存液（例えば、１．０ｍｇ／ｍＬ）で移植片の用手灌流を行い、移植片内に抗酸化ナノ粒子製剤を満たす。その後、抗酸化ナノ粒子製剤を含有する保存液で単純冷却保存もしくは機械灌流保存を行う。
２．脳死下の臓器提供者の処置からの臓器摘出（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、小腸）
　臓器提供者に前記ナノ粒子製剤をヘパリンの投与のタイミングに合わせて一定用量（例えば、９０ｍｇ／ｋｇ）で静脈内投与する。臓器提供者に心臓切開による心停止を起こした後に、自己組織化抗酸化ナノ粒子製剤を含有する臓器保存液（例えば、１．０ｍｇ／ｍＬ）で提供者の全身に自己組織化抗酸化ナノ粒子製剤を灌流させる。それぞれの移植臓器を摘出し、自己組織化抗酸化ナノ粒子製剤を含有する臓器保存液で用手灌流を行い、移植片内に抗酸化ナノ粒子製剤を満たす。その後、抗酸化ナノ粒子製剤を含有する保存液で単純冷却保存もしくは機械灌流保存を行う。
３．摘出臓器の植込み
　前記ナノ粒子製剤（例えば、９０ｍｇ／ｋｇ）を移植対象患者に静脈内投与または門脈内投与を行い、全身にナノ粒子が分布するまで数分間、例えば、約３分間待機する。その後、各移植片の植込みを行い、血液再灌流を行う。
＜自己組織化抗酸化ナノ粒子＞
　前記ナノ粒子は、式（Ｉ）で表される共重合体を含むか、又は当該共重合体から構成され、それらの調製方法は、特許文献１又は特許文献２に記載されている。ナノサイズの平均直径は、ナノメーターの桁のサイズにあり、限定されるものでないが、５ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～３００ｎｍ、１０ｎｍ～１００ｎｍ、又は１０ｎｍ～６０ｎｍの範囲内にある場合がある。本発明では、特許文献１又は特許文献２に記載されている高分子ミセルの中、上記式（Ｉ）で表される共重合体において、中のＬ２が－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－又は－（ＣＨ２）ａ－Ｏ－（ＣＨ２）ａ－であり、ここで、各ａは、独立して０又は１～５若しくは１～３の整数であり、好ましくは、各ａは、整数０である。ナノサイズは、水溶液中で当該ナノ粒の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った場合の平均経を意味する。
　また、式（Ｉ）において、ｍは、２～１０，０００の整数を表すが、５～１，０００又は１０～５００の整数を表す場合があり、一方、ｎは、３～１００の整数を表すが、５～１００又は５～６０の整数を表す場合がある。
　式（Ｉ）において、変動可能な基又は部分について定義するＣ１－Ｃ１２アルキル、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ等におけるアルキル部分について、例えば、Ｃ１－Ｃ１２アルキルは炭素原子１個～１２個を有する直鎖若しくは分岐若しくは環状アルキルを含み、限定されるものでないが、典型的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、２－エチルヘキシル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル等が挙げられる。
　上述した、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰに相当するナノ粒子に含まれるか又はナノ粒子を構成する、式（Ｉ）で表される共重合体は、上記－ＮＨ－部がプロトン化を起こさない中性より高いｐＨ下の水性媒体中で複数の分子が集積し、会合して自己組織化抗酸化ナノ粒子を形成する。一方で、理論により、本発明の技術範囲は何ら制限されるものでないが、こうして形成されたナノ粒子は、低ｐＨ環境下でプロトン化されることにより崩壊するので、通常、低ｐＨ環境となる血流遮断を行った肝臓、場合により、さらにはその周囲の臓器若しくは器官、又は移植臓器に特異的に集積し、その場で崩壊することによって露出され、レドックス作用を奏する環状ニトロキシドラジカルが、虚血と、それに続く血流の再灌流に起因する傷害に関与する「悪玉」活性酸素を除去する上で、効果的に働くものと理解される。一方、上記－ＮＨ－部が－Ｏ－であるＯ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰに相当するナノ粒子は、体内動態の検討により、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰより半減期が数倍長く、血液循環中や保存液中でより長く滞留または存在し得る。したがって、Ｎ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰ又はＯ－ＴＥＭＰＯ－ＲＮＰのいずれのナノ粒子も、外科手術又は移植手術の種類又は状況に応じて、効果的に作用するものと推察される。
＜製剤＞
　上記のように形成されたナノ粒子は、水性媒体（必要により、生理食塩やｐＨ調整剤を含むことのできる水溶液）に溶解又は均一に分散でき、また、水で再構成することができるので、種々の形態の製剤として提供できる。そのため、例えば、非経口製剤（静脈投与型注入剤、皮下投与用剤、等を含む。）をはじめ、各種形態にある非経口製剤とすることができる。このような非経口剤は、ナノ粒子の水性媒体中での安定性に悪影響を及ばさない限り、通常の製薬学的に許容される媒体、例えば、　水、グリコール、スクロース、ラクトース等を含めることができる。
　このような製剤は、対象とする手術の様式、手術を行う患者や被験者の状態によって、最適用量が変動するので用量を一律に特定することはできないが、用量は、小規模の臨床試験等を通して得られるデータ等に基づいて専門医が決定することができる。限定されるものでないが、例えば、活性成分として当該ナノ粒子を、重量換算で、少なくとも５重量％含められる。これらの製剤又は組成物中での有効成分の割合は　、変動可能であり、好都合には、その製剤又は組成物の総重量当たり約３０重量％と約９０重量％の間であることができる。当該ナノ粒子は、広範な投与用量で有効である場合があるので、例えば、成人の治療では、体重１ｋｇ当たり、約５０～約１０００ｍｇ又は約１００～約５００ｍｇの用量であることができる。
　以下、本発明について具体例を用いてさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでない。
　以下の例で使用するナノ粒子は、特許文献２に記載の方法によって製造された共重合体であって、式（Ｉ）で表され、式中の、Ａがメチルであり、Ｌ１がパラキシリレンであり、ｍが約４０であり、ｐが１５であり、ｑが４であり、ａが０であり、ＺがＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈが非置換フェニルであり、Ｒ１が上記に列挙された３種の環状ニトロキシラジカルの中の左端に示される残基：２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl）である、ブロック共重合体（ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ）から、例えば、次のように形成されたものである。
　ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かし、その溶液を透析膜に入れて密閉し、蒸留水に対して透析を行うことでナノ粒子を作製した。蒸留水は透析開始から２、４、８、２０時間ごとに交換し、２４時間後に透析膜内の溶液を回収した。透析膜内の溶液に１０倍の濃さを持つＰＢＳを最終濃度が１倍のＰＢＳ濃度になるように加えた。動的光散乱法（ＤＬＳ）により、粒径と粒径分布を測定した結果、粒径（Ｚ－Ａｖｅ）は２６．５ｎｍ、多分散指数（ＰＤＩ）は０．１２となり粒径分布がそろったものである。
試験例１：
　図１に示される動物実験のスケジュールについての概念図に沿って、実験動物（ＳＤラット１０－１２週齢）にＰＢＳを投与するコントロール群（ｎ＝５または６）と前記ナノ粒子（以下、ＲＮＰと略、９０ｍｇ／ｋｇ）を投与するＲＮＰ群（ｎ＝５または６）に分け、それぞれを投与１０分後に肝十二指腸間膜を一括血流遮断し、２０分間の肝虚血再灌流を誘導した。　術後６、２４時間で肝障害について、生化学的及び組織的な評価を行った。
（１）生化学的な評価のその１：
　試験例１における生化学的な評価として、肝機能の指標であるＧＰＴ，ＧＯＴ及びＬＤＨの変動を測定した。その結果を図２に示す。図２から、本発明の製剤を使用する事例では、前記製剤を使用しない事例であるコントロールに比べ、肝臓の炎症の程度に関与する前記指標の全てに有意な低下が認められる。
（２）生化学的な評価のその２：
　試験例１における酸化ストレスマーカーであるＴＢＲＳ（２－チオバルビツール酸反応物質）の術後２４時間における血清濃度測定を行った結果を図３に示す。図３から、本発明の製剤を使用する事例では、前記製剤を使用しないコントロールに比べ、酸化ストレスマーカーであるＴＢＲＳに有意な低下が認められる。
（３）組織学的評価その１：
　組織学的評価その１は、試験例１における術後６、２４時間に切除された肝組織をヘマトキシシリン－エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ－Ｅｏｓｉｎ）染色することにより実施した。染色後撮影した顕微鏡像に代わる白黒写真を、図４に示す。なお、当該臓器移植における顕微鏡写真のオリジナルはカラー像である。より明確な情報を得るために、必要があれば当該カラー像を提出する用意がある。図４から、コントロール群では虚血６時間後には肝静脈周囲の肝細胞に空砲化が始まっているのに対して、ＲＮＰ投与群での空砲化は軽度であった。また、虚血２４時間後においてはコントロール群では広汎な壊死を認めたものの、ＲＮＰ投与群では壊死範囲は少なかった。
（４）組織学的評価その２：
　組織学的評価その２は、試験例１における術後６、２４時間に切除された肝細胞のアポトーシス評価を行うためのＴＵＮＥＬ染色することにより実施した。ＴＵＮＥＬ染色後撮影した際の顕微鏡写真に代わる白黒写真を図５に示し、ＴＵＮＥＬ陽性領域の割合（％）グラフ表示を図６に示す。なお、当該臓器移植における顕微鏡写真のオリジナルはカラー像である。より明確な情報を得るために、必要があれば当該カラー像を提出する用意がある。本製剤を使用する事例（ＲＮＰ群）では、本製剤を使用しない事例（コントロール群）よりも、術後６時間、２４時間におけるTUNEＬ染色陽性領域の減少を認めた。これらの結果から、ＲＮＰ投与により細胞死が抑制されたことが解かる。
試験例２：
　図７に示される動物実験のスケジュールについての概念図に沿って、実験動物にＲＮＰ（９０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、肝十二指腸間膜血流遮断を加えないＩＲ－群と、肝十二指腸間膜血流遮断を加えるＩＲ＋群に分け、それぞれを遮断終了後１時間でＲＮＰの肝臓集積を評価すべく、肝臓組織の蛍光顕微鏡像を撮影した。当該蛍光写真像に代わる白黒写真を図８に示す。なお、当該顕微鏡像のオリジナルはカラー像である。より明確な情報を得るために、必要があれば、当該カラー像を提出する用意がある。撮影像から両群について比較したところ、肝十二指腸間膜血流遮断を加えたＩＲ＋群で肝類洞におけるＲＮＰの集積が増加していた。この現象により、ＲＮＰが特異的に傷害肝に集積することで、効率的に肝障害が低減したと考えられた。
試験例３：
　臓器移植における臓器保存効果を検証するために、図９に示される動物実験のスケジュールについての概念図に沿って、実験動物（ＳＤラット）に生食を投与するコントロール群（ｎ＝３から６）とＲＮＰ（９０ｍｇ／ｋｇ）を投与するＲＮＰ群（ｎ＝３から６）に分け、それぞれ投与１０分後に開腹し、前者には大動脈からＲＮＰを添加しない臓器保存液（ウィスコンシン液、以下、ＵＷ液と略）４０ｍｌで全身灌流を行い、後者には同じく大動脈からＲＮＰを添加したＵＷ液（１.０ｍｇ/ｍｌ）で全身灌流を行った後に、下大静脈切開により排血を行い、全身の臓器にＵＷ液を満たす。その後、直ちに肝臓を取り出し、前者はＲＮＰを添加しないＵＷ液で、後者はＲＮＰを添加したＵＷ液（１.０ｍｇ/ｍｌ）で４℃での単純冷却保存、あるいは３７℃での単純温熱保存を行った。
　保存後、保存液および保存された肝臓について、生化学的および組織的評価を行った。
（１）生化学的評価その１
　冷却保存において、肝臓の臓器障害の生化学的指標としてＬＤＨとＧＰＴの変動を測定し、その結果を図１０に示す。図１０から、本発明の製剤を添加した事例では、前記製剤を使用しない事例であるコントロールに比べ、肝臓の臓器障害に関連するＬＤＨおよびＧＰＴの低下を認めた。また、ストレスマーカーであるTBARSの保存液濃度も、本発明の製剤を使用する事例では、前記製剤を使用しないコントロールに比べ、低下が認められた。一方、温熱保存においても、肝臓の臓器障害の生化学的指標としてＬＤＨとＧＰＴの変動を測定し、その結果を図１１に示す。図１１から、本発明の製剤を使用した事例では、前記製剤を使用しないコントロールに比べ、肝臓の臓器障害に関連するＬＤＨおよびGPTに低下を認めた。また、ストレスマーカーであるTBARSの保存液濃度も発明の製剤を使用する事例では、前記製剤を使用しないコントロールに比べ、有意な低下が認められた。以上から、冷却保存あるいは温熱保存において、保存液にＲＮＰを添加することにより、保存臓器の臓器障害が低減されたことが解かる。
（２）生化学的評価その２：
　生化学的評価その２は、試験例３の冷却保存における保存開始後６、１２、２４時間に採取された肝組織に含有されるグルタチオン（以下、ＧＳＨと略記）濃度測定を行った。結果を図１２に示す。ＧＳＨは活性酸素種などを還元することで、抗酸化作用を示すため、ＧＳＨが低いと、酸化ストレスが強くかかっていると解釈できる。図１２から、前記製剤を添加しないコントロール群は、本発明の製剤を添加する事例に比べ、抗酸化物質であるＧＳＨの低下が認められた。次に、試験例３の温熱保存における保存開始後６、１２時間に採取された肝組織に含有されるＧＳＨの濃度測定を行った。結果を図１３に示す。図１３から、前記製剤を添加しないコントロールは、本発明の製剤を添加する事例に比べ、保存後６時間において抗酸化物質であるＧＳＨの低下傾向を認め、１２時間ではＧＳＨの有意な低下が認められた。以上から、冷却保存あるいは温熱保存において、保存液にＲＮＰを添加することにより保存臓器の酸化ストレスが低減されたことが解かる。
（３）生化学的評価その３：
　生化学的評価その３は、試験例３の冷却保存における保存開始後６、１２、２４時間に採取された肝組織に含有される酸化ストレス度（dROM: Diacron - Reactive Oxygen Metabolites: 過酸化水素（H₂O₂）の誘導体(R-OOH)であり、脂質過酸化（L-OOH）など過酸化された脂質、タンパク質、アミノ酸、核酸等を測定。以下、dROM)と、抗酸化力（BAP: Biological Antioxidant Potential: 血液や組織の還元力をもつ物質(グルタチオン、 チオール類、アスコルビン酸、ビリルビン、尿酸など)による三価鉄から二価鉄への還元力、すなわち抗酸化力を測定。以下、BAP）、および、dROMとBAPから算出される相対的酸化ストレス度 (Oxidative stress index: dROM/BAP*100。以下、OSI)を評価した（各群n=3） 。実験は、肝組織のホモジュネートを遠心して得られた上澄みを用いてdROM, BAPの測定に使用した。その結果を図１４に示す。図１４から、本発明の製剤を添加した事例（RNP群）は、前記製剤を添加しないコントロール群に比べて、酸化ストレス度(dROM)が各時間において低く、抗酸化力(BAP)が高く、相対的酸化ストレス度（OSI）が低い傾向を確認できた。次に、試験例３の温熱保存における保存開始後６、１２時間に採取された肝組織に含有されるdROM、BAP、OSIの度測定を行った（各群n=3） 。その結果を図１５に示す。図１５から、温阻血においても冷阻血と同様に、本発明の製剤を添加した事例（RNP群）は、前記製剤を添加しないコントロール群に比べて、酸化ストレス度(dROM)が各時間において低く、抗酸化力(BAP)が高く、相対的酸化ストレス度(OSI)が低い傾向を確認できた。温阻血12時間のBAPは本発明の製剤を添加した事例（RNP群）において、有意に高かった。以上から、冷却保存あるいは温熱保存において、保存液にＲＮＰを添加することにより保存臓器の組織の過酸化を抑制し、組織のもつ抗酸化力を維持し、臓器保存時に起きる組織の酸化ストレスを低減することが解る。  
（４）組織学的評価：
　組織学的評価は、試験例３の冷却保存における保存開始後６、２４時間に採取された肝組織をＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ－Ｅｏｓｉｎ染色することにより実施した。染色後撮影した顕微鏡像に代わる白黒写真を、図１６に示す。なお、当該臓器移植における顕微鏡写真のオリジナルはカラー像である。より明確な情報を得るために、必要があれば当該カラー像を提出する用意がある。図１６から保存後６時間では、コントロール群とＲＮＰ添加群の両群で、肝組織の形態は保たれていたが、２４時間後にはコントロール群の肝細胞は崩壊しており、類洞の拡大を認めたのに対して、ＲＮＰ群では肝細胞の崩壊は少なく、類洞の拡大はほとんど認められなかった。次に、温熱保存における組織学的評価を、保存開始後３，１２時間に採取された肝組織をＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ－Ｅｏｓｉｎ染色することにより実施した。染色後撮影した顕微鏡像に代わる白黒写真を、図１７に示す。なお、当該臓器移植における顕微鏡写真のオリジナルはカラー像である。より明確な情報を得るために、必要があれば当該カラー像を提出する用意がある。コントロール群では、保存後３時間から、肝細胞は崩壊し始め、類洞の拡大を認めるのに対して、ＲＮＰ群では、肝組織の形態は保たれていた。１２時間後には、コントロール群の肝細胞の大部分が崩壊しており、類洞も広く開大しているのに対して、ＲＮＰ投与群では、肝細胞の崩壊は始まっていたが、類洞の拡大は軽度であった。以上から、冷却保存あるいは温熱保存において、保存液にＲＮＰを添加することにより、保存臓器の臓器障害が低減されたことが解かる。
試験例４：
　臓器移植における臓器保存期間中の虚血を経て、さらに臓器植込みに伴う虚血再灌流障害の抑制効果を検証するために、図１８に動物実験のスケジュールについての概念図を示した。ドナーとなる実験動物（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）に生食を静脈投与するコントロール群（n=２）とＲＮＰ（９０ｍｇ／ｋｇ）を投与するRNP群（n=２）に分けた。各群に生食あるいはRNP投与後５分で、コントロール群には臓器保存液（UW液）４ｍｌで全身灌流後、心臓移植片を取り出し、さらにUW液４ｍｌで摘出した心臓移植片を洗浄した。これに対して、RNP群にはRNP添加UW液（1mg/ml）４ｍｌで全身灌流後、心臓移植片を取り出し、さらにRNP添加UW液４mlで摘出した心臓移植片を洗浄した。引き続き、コントロール群の心臓移植片をUW液で４℃、２４時間冷保存し、一方で、RNP群はRNP添加UW液（1mg/dl）で４℃、２４時間冷保存した。移植手術開始５分前に、コントロール群のレシピエントには生食を静脈投与し、RNP群のレシピエントにはRNP （９０ｍｇ／ｋｇ）を静脈投与し、心臓移植片の腹腔内移植を行った。
　各群のレシピエントあるいは心臓移植片の生理学的評価を行った。
（１）生理学的評価その１
　各群の移植心臓片の血流再開から心拍再開までの時間について図１９に示した。本発明製剤を使用する事例（RNP群）では、前記製剤を使用しないコントロール群に比べ、心拍再開までの短縮が認められた。次に、各群の血液灌流後の心拍動再開時、術後６時間の心拍強度をStanford Cardiac Surgery Laboratory Graft Scoring System（４点満点）に準じて、図２０に示した。本発明の製剤を使用する事例では、前記製剤を使用しないコントロールに比べ、各時間における心拍強度の上昇を認めた。以上から、本発明の製剤を使用する事例では、本発明の製剤を使用しない事例よりも、移植後の心臓移植片の心拍が、時間的にも強度的にも有利になることが解かる。
　本発明によれば、外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための製剤が提供されるので、本発明は少なくとも、当該製剤を製造又は販売する産業において利用可能である。

Claims (6)

  1. 下記式（Ｉ）で表される共重合体を含み、水溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定によりナノサイズの平均経を有する高分子ミセルを活性成分として含む、外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための製剤。
    式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    　上式中、
    Ａは、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
    Ｌ1は、直接結合又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    で表される基から選ばれるか、又は－（ＣＨ２）ｂＳ－、－ＣＯ（ＣＨ２）ｂＳ－、－（ＣＨ２）ｂＮＨ－、－（ＣＨ２）ｂＣＯ－、－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－から選ばれ、ここで各ｂは、独立して、１～５の整数であり、
    Ｌ２－Ｒ１は、Ｌ２が－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－又は－（ＣＨ２）ａ－Ｏ－（ＣＨ２）ａ－であり、ここで各ａは、独立して、０又は１～５の整数であり、
    Ｒ１が、式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    で表される環状ニトロキシドラジカル残基のいずれかであり（ここで、Ｒ’はメチルである。）、
    Ｒ２は、クロロ、ブロモ又はヒドロキシルであり、
    上記において、Ｌ２－Ｒ１とＲ２を有するポリマー主鎖中の反復単位はランダムに存在し、Ｌ２－Ｒ１を有する単位ｐは２～１００の範囲内にある整数であり、Ｒ２を有する単位ｑは存在しない（ゼロ）か、若しくは１～２０の整数の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなり、
    ＺはＨ、ＳＨ又はＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈは１又は２個のメチルまたはメトキで置換されていてもよいフェニルを表し、
    ｍは２～１０，０００の整数を表し、
    ｎは３～１００の整数を表す。
  2. 前記臓器は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、小腸から選ばれる１種を少なくとも含む、請求項１に記載の製剤。
  3. 前記臓器は、肝臓である、請求項１に記載の製剤。
  4. 請求項１又は２に記載された外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための製剤であって、次の（ｉ）～（ｉｖ）から選ばれる構成要件を具備する前記製剤。
    （ｉ）　前記手術は、外科手術であって、血流遮断後に臓器の一部または全部を切除し、次いで血液再灌流する各ステップを含み、かつ、血流遮断前に前記活性成分が患者又は被験者に非経口的に投与されるステップを含み、前記処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するは、前記活性成分が患者又は被験者に非経口的に投与されるステップを含まない場合に比べ、有意に高く抑制することを意味する。
    （ｉｉ）　前記手術は、移植手術であって、移植対象臓器提供者に前記活性成分が非経口的に投与され、前記提供者に自然心停止が起きた後に、移植対象臓器が摘出されるステップを含み、次いで、再灌流と擬制されるステップとして、摘出された臓器が前記活性成分を含む臓器保存液で保存又は灌流されるステップを含み、前記処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するは、臓器提供者に前記活性成分を投与せず、前記摘出された臓器が前記活性成分を含まない臓器保存液で保存されるステップを含む場合に比べ、有意に高く抑制することを意味する。
    （ｉｉｉ）　前記手術は、移植手術であって、脳死下の移植対象臓器提供者に前記活性成分が非経口的に投与され、心停止を起こした後に、前記活性成分を含有する臓器保存液を前記提供者の全身に循環させるステップを含み、次いで、再灌流と擬制されるステップとして、摘出された臓器が前記活性成分を含む臓器保存液で保存又は灌流されるステップを含み、前記処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するは、臓器提供者に前記活性成分を投与せず、前記摘出された臓器が前記活性成分を含まない臓器保存液で保存又は灌流されるステップを含む場合に比べ、有意に高く抑制することを意味する。
    （ｉｖ）　前記手術は、移植手術であって、移植対象患者に前記活性成分を非経口的に投与した後、移植する臓器の植込みを行うステップ、さらに、血液再灌流ステップを含み、前記処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するは、前記活性成分が移植対象者に非経口的に投与されるステップを含まない場合に比べ、有意に高く抑制することを意味する。
  5. 外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための、下記式（Ｉ）で表される共重合体を含み、水溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定によりナノサイズの平均経を有する高分子ミセル。
    式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    　上式中、
    Ａは、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
    Ｌ1は、直接結合又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    で表される基から選ばれるか、又は－（ＣＨ２）ｂＳ－、－ＣＯ（ＣＨ２）ｂＳ－、－（ＣＨ２）ｂＮＨ－、－（ＣＨ２）ｂＣＯ－、－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－から選ばれ、ここで各ｂは、独立して、１～５の整数であり、
    　Ｌ２－Ｒ１は、Ｌ２が－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－又は－（ＣＨ２）ａ－Ｏ－（ＣＨ２）ａ－であり、ここで各ａは、独立して、０又は１～５の整数であり、
    Ｒ１が、式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    で表される環状ニトロキシドラジカル残基のいずれかであり（ここで、Ｒ’はメチルである。）、
    Ｒ２は、クロロ、ブロモ又はヒドロキシルであり、
    上記において、Ｌ２－Ｒ１とＲ２を有するポリマー主鎖中の反復単位はランダムに存在し、Ｌ２－Ｒ１を有する単位ｐは２～１００の範囲内にある整数であり、Ｒ２を有する単位ｑは存在しない（ゼロ）か、若しくは１～２０の整数の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなり、
    ＺはＨ、ＳＨ又はＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈは１又は２個のメチルまたはメトキで置換されていてもよいフェニルを表し、
    ｍは２～１０，０００の整数を表し、
    ｎは３～１００の整数を表す。
  6. 外科手術又は移植手術における処置対象臓器の虚血再灌流障害を抑制するための方法であって、下記式（Ｉ）で表される共重合体を含み、水溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）測定によりナノサイズの平均経を有する高分子ミセルの有効量を、それを必要とする患者又は被験者に投与するステップ含む、前記方法。
    式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    　上式中、
    Ａは、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
    Ｌ1は、直接結合又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
    で表される基から選ばれるか、又は－（ＣＨ２）ｂＳ－、－ＣＯ（ＣＨ２）ｂＳ－、－（ＣＨ２）ｂＮＨ－、－（ＣＨ２）ｂＣＯ－、－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－から選ばれ、ここで各ｂは、独立して、１～５の整数であり、
    Ｌ２－Ｒ１は、Ｌ２が－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－又は－（ＣＨ２）ａ－Ｏ－（ＣＨ２）ａ－であり、ここで各ａは、独立して、０又は１～５の整数であり、Ｒ１が、式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
    で表される環状ニトロキシドラジカル残基のいずれかであり（ここで、Ｒ’はメチルである。）、
    Ｒ２は、クロロ、ブロモ又はヒドロキシルであり、
    上記において、Ｌ２－Ｒ１とＲ２を有するポリマー主鎖中の反復単位はランダムに存在し、Ｌ２－Ｒ１を有する単位ｐは２～１００の範囲内にある整数であり、Ｒ２を有する単位ｑは存在しない（ゼロ）か、若しくは１～２０の整数の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなり、
    ＺはＨ、ＳＨ又はＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈは１又は２個のメチルまたはメトキで置換されていてもよいフェニルを表し、ｍは２～１０，０００の整数表し、
    ｎは３～１００の整数を表す。
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JP2013166711A (ja) * 2012-02-14 2013-08-29 Univ Of Tsukuba 高分子化ニトロキシドラジカル化合物を含有する虚血再還流障害の処置剤
WO2023068362A1 (ja) * 2021-10-22 2023-04-27 ＣｒｅｓｔｅｃＢｉｏ株式会社 レドックスナノ粒子の細胞処理への使用

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