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WO2025063278A1 - コアシェル構造の三次元構造物 - Google Patents

コアシェル構造の三次元構造物 Download PDF

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Publication number
WO2025063278A1
WO2025063278A1 PCT/JP2024/033645 JP2024033645W WO2025063278A1 WO 2025063278 A1 WO2025063278 A1 WO 2025063278A1 JP 2024033645 W JP2024033645 W JP 2024033645W WO 2025063278 A1 WO2025063278 A1 WO 2025063278A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dimensional structure
epidermal keratinocytes
cell
cells
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/033645
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
昌拓 岡村
徹 厚木
友里 佐藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kose Corp
Original Assignee
Kose Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kose Corp filed Critical Kose Corp
Publication of WO2025063278A1 publication Critical patent/WO2025063278A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional structure with a core-shell structure, a method for producing a three-dimensional structure with a core-shell structure, and a method for evaluating the skin's homeostasis function using a three-dimensional structure with a core-shell structure.
  • Skin tissue is composed of the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue, and each of these plays a different role in maintaining skin homeostasis.
  • the epidermis which is in contact with the outside world, is composed of epidermal keratinocytes, and has a multilayer structure of layers with different differentiation stages of epidermal keratinocytes (specifically, the basal layer, spinous layer, granular layer, and stratum corneum).
  • epidermal keratinocytes differentiate from an undifferentiated state and finally peel off from the skin surface at the stratum corneum, which is a metabolic cycle that occurs at a regular interval, and this metabolic cycle is called turnover.
  • the epidermis which is in contact with the outside world, plays a role in barrier functions that prevent the evaporation of moisture from the body or the invasion of pathogens, etc. into the body.
  • the dermis supports the skin with collagen, elastin, etc., and plays a role in maintaining its shape and elasticity.
  • Patent Document 1 proposes a "three-dimensional cultured skin model having an artificially created dermis (dermis equivalent) layer, comprising the structures described in the following (1) to (3): (1) a dermis equivalent layer obtained by culturing a mixture of collagen and fibroblasts; (2) a layer of epidermal keratinocytes; and (3) melanocytes engrafted between the dermis equivalent layer of (1) and the epidermal keratinocyte layer of (2).”
  • Patent Document 2 discloses a three-dimensional cultured human skin model comprising, from the bottom, A, a support layer containing fibroblasts, B, a support layer containing dendritic cells, and C, an epidermal keratinocyte layer, in which the epidermal keratinocytes in C are in the form of a sheet seeded on the support layer containing the dendritic cells in B.
  • Non-Patent Document 1 proposes the preparation of three-dimensional (3D) dermal papilla (DP) cells by sequentially seeding dermal papilla (DP) cells, HaCaT keratinocytes, and human dermal fibroblast (HDF) cells into three-dimensional (3D) microwells made of polyethylene glycol diacrylate hydrogel.
  • Non-Patent Document 2 proposes three-dimensional cell culture using a clinostat (a state similar to a microgravity environment) to reproduce the changes in skin caused by microgravity, thereby enabling understanding of the effects of microgravity on human health before space exploration.
  • skin models are useful when evaluating skin homeostasis maintenance functions such as skin barrier function.
  • the inventors believed that, compared to sheet-like skin models, roughly spherical three-dimensional structures in which cells aggregate to form clumps, such as spheroids, can be obtained with fewer cells, fewer steps, and a shorter culture period, and that the roughly spherical three-dimensional structures obtained can be used to easily perform screening, evaluation, analysis, measurement, and other tests under a variety of conditions.
  • the cells to be seeded in the method of this embodiment can be cultured by a known cell culture method, and the desired number of cells and seeding can be obtained or collected.
  • the seeded cells can be cultured under a specified culture condition, the cells that have grown after the culture are collected, and the number of cells is adjusted to prepare a cell suspension with the desired number of cells to be seeded.
  • the cell culture equipment used in the step of adjusting the number of seeded cells in this embodiment is preferably one that is generally used for proliferation culture, and for example, in the step of adjusting the number of seeded cells or the like, the recess in which seeding or the like is performed is preferably a recess with a flat bottom such as a petri dish, and/or is preferably one that has been treated with a culture substrate (coating agent).
  • the number of days for culture is not particularly limited, but a suitable lower limit is preferably 1 day or more, more preferably 2 days or more, and even more preferably 3 days or more, and a suitable upper limit is preferably 7 days or less, more preferably 6 days or less, and even more preferably 5 days or less.
  • Cell counting can be done using methods commonly used in cell culture, such as automated cell counting (e.g., cell counter using image data, Coulter counter, flow cytometer, etc.) and manual cell counting, with a Coulter counter being preferred.
  • the "predetermined culture conditions" in the method of the present embodiment are not particularly limited, but the culture temperature and atmosphere conditions are not particularly limited, but general culture conditions are preferred.
  • the culture temperature is preferably a general culture temperature, preferably 36 to 38°C, more preferably 36.5 to 37.5°C.
  • the culture atmosphere is preferably a general atmosphere, preferably under 4 to 6% CO2 , more preferably under 4.5 to 5.5 % CO2. More suitable culture conditions are preferably 36.5 to 37.5°C and 4.5 to 5.5% CO2 , more preferably 37°C and 5% CO2 (an atmosphere of 5% carbon dioxide and 95% air).
  • the "predetermined culture conditions” can be adopted as the "predetermined culture conditions" in the above-mentioned ⁇ a. Adjustment of the number of cells to be seeded>, the below-mentioned ⁇ b. Preparation of fibroblast cell clusters>, and ⁇ c. Coating of epidermal keratinocytes on cell clusters>.
  • the medium used in this embodiment is not particularly limited, and a medium for the cells to be cultured can be used depending on the cells.
  • Examples of the medium include a medium for fibroblasts and a medium for epidermal keratinocytes, and one or more selected from these can be used.
  • the fibroblast medium may be one or more selected from media obtained by known manufacturing methods or commercially available products (e.g., Fibroblast Medium (Takara Bio), HFDM-1 Medium (Cell Science Institute), Fibrolife S2 Medium Complete Kit (Lifeline Cell Technology), etc.). More specifically, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is preferred, and DMEM/F-12 medium, which is a 1:1 mixture of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) and Ham's F-12 medium, is even more preferred.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • F-12 medium which is a 1:1 mixture of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) and Ham's F-12 medium
  • the medium for epidermal keratinocytes may be one or more selected from media obtained by known manufacturing methods or commercially available products (e.g., Keratinocyte Growth Medium 2 (Promocell), MCDB153 Medium (Cosmo Corporation), HuMedia-KG2 (Kurabo), etc.).
  • Keratinocyte Growth Medium 2 Promocell
  • MCDB153 Medium Cosmo Corporation
  • HuMedia-KG2 HuMedia-KG2 (Kurabo), etc.
  • an epidermal keratinocyte 3D-differentiation medium a medium for three-dimensional epidermal keratinocyte models that does not contain animal- or human-derived components.
  • characteristic medium components of the medium for epidermal keratinocytes include, for example, ckDME-Ham medium, which contains, for example, 24.3 mg/L adenine, 5 mg/L insulin, and 0.01 mg/L EGF (Non-Patent Document 3 (Reference): Sergio Cortez Ghio et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(8), 2174; https://doi.org/10.3390/ijms19082174).
  • fibroblasts for seeding it is preferable to use a medium for fibroblasts, and when growing epidermal keratinocytes for seeding, it is preferable to use a medium for epidermal keratinocytes.
  • a medium may be selected for the same purpose in the following sections of ⁇ a. Adjustment of cells and cell number for seeding>.
  • a medium for fibroblasts may also be used in ⁇ b. Preparation of fibroblast masses> described below.
  • a medium for epidermal keratinocytes e.g., medium for epidermal keratinocytes, co-culture medium
  • a mixed culture medium using, for example, CnT-PR-3D for epidermal keratinocyte culture and, for example, DMEM/F12 (supplemented with 1 mM CaCl2 and 5% FBS) for fibroblast culture may be used.
  • the epidermal keratinocytes and fibroblasts used for seeding in the method of this embodiment are not particularly limited, and include, for example, normal cells (e.g., normal epidermal keratinocytes, normal fibroblasts, etc.), differentiation-induced cells derived from pluripotent stem cells (e.g., epidermal keratinocytes, fibroblasts, etc.), etc., and are one or more types selected from these.
  • differentiation-induced cells derived from pluripotent stem cells to manufacture a three-dimensional structure, there is an advantage that the skin homeostasis maintenance function can be evaluated or tested for a longer period of time than when normal cells are used.
  • These cells are preferably derived from a mammal, and the mammal is not particularly limited, and is preferably derived from a human.
  • a pre-culture for increasing the number of fibroblasts to be seeded before co-culture it is preferable to use a general method for growing fibroblasts, and more preferably to use a medium for fibroblasts for the culture.
  • a pre-culture for increasing the number of epidermal keratinocytes to be seeded before co-culture it is preferable to use a general method for growing epidermal keratinocytes, and more preferably to use a medium for epidermal keratinocytes for the culture.
  • Normal cells used for seeding As normal cells to be used for seeding in the method of this embodiment, normal fibroblasts and/or normal epidermal keratinocytes are preferred.
  • Normal skin fibroblasts are not particularly limited and can be obtained by known production methods or commercially available products. Examples of normal skin fibroblasts include neonatal foreskin skin fibroblasts, adult skin fibroblasts, and adult oral fibroblasts. One or more types selected from these can be used.
  • normal epidermal keratinocytes are not particularly limited and can be obtained by known production methods or commercially available products.
  • examples include neonatal foreskin epidermal keratinocytes, normal human pediatric epidermal keratinocytes, normal human adult epidermal keratinocytes, etc., and one or more types selected from these can be used.
  • pluripotentiated cells derived from pluripotent stem cells used for seeding include epidermal keratinocytes derived from pluripotent stem cells and fibroblasts derived from pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells used in this embodiment are stem cells that have pluripotency and can differentiate into all cells present in a living body, and also have proliferation ability.
  • Examples of the pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), embryonic stem cells derived from cloned embryos by nuclear transplantation (ntES cells), spermatogonial stem cells (GS cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), somatic stem cells derived from skin, bone marrow, fat, etc. (Muse cells, mesenchymal stem cells, etc.), and one or more types selected from these can be used. These cells can be produced by known production methods or obtained from the market or public institutions.
  • the cells are preferably derived from mammalian cells, particularly human cells.
  • Embryonic stem cells are stem cells established from the inner cell mass of early mammalian embryos (e.g. blastocysts) such as humans and mice.
  • Spermatogonial stem cells are pluripotent stem cells derived from sperm and are the cells that are the source of spermatogenesis.
  • Embryonic germ cells are cells established from primordial germ cells during the fetal stage.
  • iPS cells Induced pluripotent stem cells
  • iPS cells can be produced by known production methods, and can also be purchased commercially or as custom-made products (see, for example, Patent Document 3 (Reference): JP 2023-018632 A, paragraphs [0021] to [0027], etc.).
  • spherical microcarriers for example, it is 50 to 1,000 ⁇ m, and the preferred upper limit is preferably 300 ⁇ m or less or 250 ⁇ m or less, preferably 100 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less, more preferably 120 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less, and even more preferably 150 ⁇ m or 200 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less.
  • the size of the resulting three-dimensional structure, cell layer, center portion, etc. can be adjusted to the appropriate size as described in "2. Three-dimensional structure according to this embodiment" above.
  • the co-culture medium used in this embodiment may contain medium components that enable the proliferation of fibroblasts and epidermal keratinocytes, and the components of the co-culture medium may be prepared using these commercially available products or components contained therein.
  • the co-culture medium is adjusted in terms of the concentration of animal- or human-derived components and/or calcium concentration.
  • concentration of calcium chloride (preferably CaCl 2 ) in the co-culture medium is preferably 0.8 to 4 mM, more preferably 0.9 to 3.0 mM, and even more preferably 1.0 to 2.0 mM.
  • the mixing ratio of the medium for epidermal keratinocytes and the medium for fibroblasts in the mixed co-culture medium used in this embodiment is not particularly limited, but is preferably 4:1 to 1:4, more preferably 3:1 to 1:3, even more preferably 2:1 to 1:2, and more preferably 1:1.
  • the mixing ratio of the epidermal keratinocyte medium and the fibroblast medium in the co-culture mixed medium may be appropriately selected and combined by appropriately adopting the upper and lower limits of the mixing ratio described above, but a suitable range is more preferably 3:1 to 1:3, even more preferably 2:1 to 1:2, and even more preferably 1:1.
  • the mixing ratio of the medium for epidermal keratinocytes and the medium for fibroblasts in the mixed medium for co-culture may be appropriately selected and combined by appropriately adopting the upper and lower limit values of the mixing ratio described above, but a suitable range is more preferably 3:1 to 1:3, even more preferably 2:1 to 1:2, and even more preferably 1:1.
  • the mixing ratio of the epidermal keratinocyte medium and the fibroblast medium may be such that the epidermal keratinocyte medium accounts for 95% or more, 90% or more, 85% or more, 80% or more, or 75% or more of the total amount of the epidermal keratinocyte medium and the fibroblast medium is 100%.
  • the co-culture medium or in some cases a medium for epidermal keratinocytes
  • the co-culture medium, or in some cases a medium for epidermal keratinocytes can also be used when evaluating the skin homeostasis function using the three-dimensional structure, and further, the culture period (evaluable period) of the three-dimensional structure can be extended.
  • Preparation of fibroblast masses> above is not particularly limited, but a suitable lower limit is preferably 1 x 102 or more, more preferably 5 x 102 or more, and even more preferably 1 x 103 or more, and a suitable upper limit is preferably 1 x 105 or less, more preferably 5 x 104 or less, even more preferably 2 x 104 or less, and even more preferably 1 x 104 , and the suitable numerical range is preferably 1 x 103 to 1 x 104 .
  • the number of epidermal keratinocytes to be seeded on the cell culture substrate is not particularly limited, but a suitable lower limit is preferably 5 x 102 or more, more preferably 1 x 103 or more, and a suitable upper limit is preferably 5 x 104 or less, more preferably 2 x 104 or less, and even more preferably 1 x 104 or less, and the suitable numerical range is preferably 1 x 103 to 1 x 104 .
  • the ratio of the number of fibroblasts and the number of epidermal keratinocytes (number of fibroblasts/number of epidermal keratinocytes) used in this embodiment is not particularly limited, but a suitable lower limit is preferably 1/4 or more, more preferably 1/2 or more, even more preferably 1 or more, more preferably 4 or more, and more preferably 8 or more, from the viewpoint of appropriate tight junction formation in the epidermal keratinocyte layer, and a suitable upper limit is not particularly limited, but from the viewpoint of covering the entire area of the fibroblast mass with epidermal keratinocytes, for example, 10 or less, preferably 9 or less, and more preferably 8 or less.
  • the number of fibroblasts to be seeded is preferably the number of fibroblasts seeded in one well of the cell culture equipment when preparing a fibroblast cell mass
  • the number of epidermal keratinocytes to be seeded is preferably the number of epidermal keratinocytes to be seeded in one well of the cell culture equipment when covering the prepared fibroblast cell mass with the epidermal keratinocytes.
  • ⁇ d. Evaluation of skin homeostasis function> In the above step ⁇ c. Covering epidermal keratinocytes on fibroblast mass>, after obtaining a three-dimensional structure having a core-shell structure according to this embodiment, the "3. Method for evaluating skin homeostasis function using the three-dimensional structure according to this embodiment" described below may be performed including the step ⁇ d. Evaluation of skin homeostasis function>, or ⁇ d. > may be performed after the above step ⁇ c. >. This makes it possible to search for or select a substance having a skin homeostasis function, and more preferably to search for or select a substance related to skin homeostasis suitable for an individual. Note that ⁇ d. Evaluation of skin homeostasis function> will be described in detail in the "3. Method for evaluating skin homeostasis function using the three-dimensional structure according to this embodiment” described below, and the contents of this description may be adopted as appropriate.
  • the cell culture equipment used in the method of the present embodiment is not particularly limited, but is preferably a cell culture equipment that can be used for cell culture, such as, but not limited to, flasks, dishes, petri dishes, bottles, plates, tubes, centrifuge tubes, etc., and disposable products are preferred.
  • Examples of the material of the equipment include, but are not limited to, glass and plastic resin (preferably polystyrene resin). One or more types selected from these examples can be used.
  • the material (product) of the cell culture equipment is not particularly limited, but is preferably one or more selected from synthetic resins (preferably plastics) such as styrene-based resins (polystyrene or styrene copolymers, etc.), polycarbonate, polyolefin-based resins (polyethylene, polypropylene, polyester, ethylene copolymers, etc.), (meth)acrylic resins, silicone resins, amino resins, fluororesins, and polyimide resins, and glass substrates.
  • synthetic resins preferably plastics
  • synthetic resins preferably plastics
  • synthetic resins preferably plastics
  • synthetic resins preferably plastics
  • styrene-based resins polystyrene or styrene copolymers, etc.
  • polycarbonate polyolefin-based resins
  • (meth)acrylic resins silicone resins, amino
  • plastics more preferably styrene-based resins, polyolefin-based resins (polyethylene, polypropylene), styrene-based resins, and polycarbonate
  • styrene-based resins are even more preferred.
  • the step of producing a three-dimensional structure, a cell mass, or an approximately spherical object such as a spheroid it is preferable to culture the seeded cells on a cell adhesion inhibiting surface (more preferably a hydrophilized surface) of a cone-shaped recess. Also, in the proliferation step of increasing the number of cells, it is preferable to culture them on a culture substrate treated surface of a flat recess such as a petri dish.
  • the bottom of the mortar-shaped recess has a shape that allows multiple cells to gather in the central region of the bottom of the recess. It is more preferable that the bottom of the recess is V-shaped or U-shaped, and by making it easier for cells seeded in a V-shaped or U-shaped depression (approximately conical, approximately truncated conical, etc.) to gather, it is possible to obtain a better shape for an approximately spherical cell mass, which has the advantage of making it easier to form a fibroblast cell mass that will be the nucleus of a three-dimensional structure, or to make it easier to form a shell cell layer that covers the nucleus of a three-dimensional structure.
  • the wells into which the cells are seeded are preferably subjected to a cell adhesion suppression treatment, and this surface treatment can suppress adhesion of the cells to the surface of the wells, and also makes it easy to peel off the three-dimensional structure after culture.
  • the surface treatment makes it easier for the seeded cells to gather in the central region of the wells and adhere to each other, thereby forming a better roughly spherical object (e.g., a fibroblast cell cluster, a cell cluster with a core-shell structure).
  • the cell adhesion inhibiting treatment is not particularly limited, but examples thereof include surface treatment for hydrophilization.
  • hydrophilic treatment examples include, but are not limited to, plasma treatment, corona discharge treatment, oxidizing agent treatment, and hydrophilic substance (preferably, a cell adhesion inhibitor such as polyethylene glycol) coating treatment.
  • hydrophilic substance coating include high molecular weight polymer coating. One or more types selected from these can be used.
  • a cell detachment agent is used, and the cell detachment agent is preferably a cell detachment component that is generally used to detach cultured cells from cell culture equipment during animal cell culture, or an agent containing such a component.
  • Components used for cell detachment include trypsin-based proteases (trypsin, trypsin-like proteases, etc.) and serine proteases such as chymotrypsin; metal proteases such as dispase; Ca-dependent proteases such as actinase; neutral proteases; proteases having protease and collagenase activity; enzyme-free detachment systems such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and sodium citrate; TrypLE (trademark), etc., and one or more selected from these may be used, but are not limited thereto.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • TrypLE trademark
  • the cell detachment agent a commercially available cell detachment agent may be used.
  • a physical cell detachment means may be used, for example, a cultured cell detachment device such as a cell scraper (manufactured by Corning) may be used.
  • laminin fragments are preferred, more preferably laminin 511 fragments, even more preferably laminin 511E8 fragments, and even more preferably those derived from humans.
  • the "thing” in “culturing” may be expressed as a “process” or a “step”
  • a “process” may be expressed as a “thing” or a step
  • a “step” may be expressed as a “thing” or a “process”.
  • a “process” in a “process” may be expressed as an "apparatus or part configured to perform a process”
  • an "apparatus” may be expressed as a “mechanism or part”
  • a “part” may be expressed as a “part or apparatus for providing in a mechanism, apparatus, system, etc.”
  • Tests on the three-dimensional structure can be performed using one or more types selected from physical tests (e.g., pressure/depressurization adjustment, vibration adjustment, pressure adjustment, light irradiation such as ultraviolet light or natural light, etc.), physiological/biochemical tests (markers, fluorescent staining, etc.), and chemical tests (searching for test substances, etc.).
  • physical tests e.g., pressure/depressurization adjustment, vibration adjustment, pressure adjustment, light irradiation such as ultraviolet light or natural light, etc.
  • physiological/biochemical tests markers, fluorescent staining, etc.
  • chemical tests searching for test substances, etc.
  • the selected substance can be contained as an active ingredient in a skin homeostasis maintaining agent (preferably an agent for promoting skin barrier function, or an agent for promoting moisturizing or turnover), an agent for preventing, improving or treating rough skin, etc. (hereinafter also referred to as "skin homeostasis maintaining agent, etc.”), or can be used in the skin homeostasis maintaining agent, etc.
  • the agent may be a composition.
  • the selected substance may also be used to manufacture a skin homeostasis maintaining agent, etc.
  • the present embodiment may also provide the selected substance, or a use thereof, for maintaining skin homeostasis or for use in maintaining skin homeostasis. This embodiment can also provide a method for maintaining skin homeostasis using the selected substance, or a method for maintaining skin homeostasis using an agent containing the selected substance.
  • prevention refers to preventing or delaying the onset of symptoms or disease in the subject, or reducing the risk of onset of symptoms or disease in the subject.
  • improvement refers to improving or maintaining the disease, symptoms, or condition in the subject; preventing or delaying deterioration; or reversing, preventing, or delaying progression.
  • the selected substance or skin homeostasis maintenance functional agent can be incorporated into, for example, oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, liquids, and suspensions; external preparations such as dermatological preparations, patches, eye drops, nasal drops, oral preparations, and suppositories; and parenteral preparations such as drops and injections, but are not limited to these.
  • oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, liquids, and suspensions
  • external preparations such as dermatological preparations, patches, eye drops, nasal drops, oral preparations, and suppositories
  • parenteral preparations such as drops and injections, but are not limited to these.
  • the selected substance or total secretion regulator can be produced using a known production method.
  • the selected substance may be a commercially available product.
  • the content of the selected substance is not particularly limited, and the selected substance can be preferably contained in an amount of about 0.001 to 99% by mass, more preferably about 0.01 to 50% by mass, and even more preferably about 0.1 to 10% by mass, of the total amount of the agent or composition.
  • Methods for using the selected substance or skin homeostasis maintaining functional agent include, but are not limited to, administration such as transdermal administration, oral administration, and administration by injection; oral ingestion; and application to the skin.
  • administration such as transdermal administration, oral administration, and administration by injection; oral ingestion; and application to the skin.
  • the amount of the selected substance to be used or administered is not particularly limited as long as it is an amount that can obtain the effects of the present invention, and may be appropriately adjusted depending on the dosage form of the preparation, the application site, age, sex, etc.
  • the skin homeostasis maintenance function, etc. can be produced using known production methods.
  • the skin homeostasis maintenance function, etc. can also contain optional ingredients such as various additives, if necessary.
  • epidermal keratinocytes or fibroblasts are one or more types selected from normal cells (normal epidermal keratinocytes, normal fibroblasts), and epidermal keratinocytes and fibroblasts derived from pluripotent stem cells.
  • a method for producing a three-dimensional structure having a core-shell structure comprising co-culturing microspheres and seeded epidermal keratinocytes.
  • the microspheres are preferably microcarriers or cell clusters, more preferably approximately spherical.
  • the microcarriers are preferably extracellular matrix component-coated microcarriers.
  • the cell clusters are preferably fibroblast cell clusters prepared from a plurality of fibroblasts.
  • a method for producing a three-dimensional core-shell structure by co-culturing microspheres and seeded epidermal keratinocytes using a cell culture device the microspheres being preferably fibroblast cell masses prepared from seeded fibroblasts or microcarriers coated with extracellular matrix components.
  • a method for producing a three-dimensional structure with a core-shell structure which comprises seeding and culturing epidermal keratinocytes in a cell culture vessel or medium containing microspheres.
  • the cells used are preferably cultured on the cell adhesion-inhibiting surface of the cone-shaped depression, and the cells used are preferably fibroblast clumps and/or epidermal keratinocytes.
  • the microspheres may be cell masses having extracellular matrix components obtained by seeding and culturing fibroblasts, or may be microcarriers coated with extracellular matrix components.
  • the extracellular matrix component is preferably collagen (e.g., types 1 to 19), more preferably collagen types 1 and 4.
  • test (3) is one or more types selected from a physical test, a physiological/biochemical test, and a chemical test on the three-dimensional structure.
  • test (3) is one or more types selected from a physical test, a physiological/biochemical test, and a chemical test on the three-dimensional structure.
  • a medium containing at least a medium for epidermal keratinocytes is preferred, and when the microspheres are fibroblast clumps, a co-culture medium is preferred.
  • a mixture comprising a medium for fibroblasts and a medium for epidermal keratinocytes for use in the method according to [24] or [25] above, or use of a medium for fibroblasts and a medium for epidermal keratinocytes for producing a medium for use in the method according to [24] or [25] above.
  • FIG. 3 Three-dimensional structure with a core-shell structure, comprising a fibroblast cell mass as the core and epidermal keratinocytes as the shell, was produced as follows (see FIG. 3 ), to obtain the three-dimensional structure with a core-shell structure of Production Example 1. Specifically, fibroblast cells were seeded in a well and cultured for a certain period of time to prepare a core of a fibroblast cell mass, and then epidermal keratinocytes for forming a shell were seeded in the same well, followed by static culture.
  • the fibroblast mass to be used as the core of the three-dimensional structure was prepared as follows. [Adjustment of seeding number of fibroblasts] Normal human fibroblasts NHDF (LIFELINE CELL TECHNOLOGY, model number FC-0001 (neonatal foreskin)) were cultured for 3 days in FibroLife S2 medium (low serum liquid medium for proliferation of normal human skin fibroblasts (phenol red-free), FibroLife S2 Comp kit LIFELINE CELL TECHNOLOGY, model number LFC-LL0011) at 37°C and 5% CO2 . For the culture, a polystyrene tissue culture plate (cylindrical wells, coating agent: laminin 511E8 fragment) was used. On the second day of culture, the medium was replaced with FibroLife S2 medium.
  • FibroLife S2 medium low serum liquid medium for proliferation of normal human skin fibroblasts (phenol red-free), FibroLife S2 Comp kit LIFELINE CELL TECHNOLOGY, model number LFC
  • LFB-LM0001 FibroLife BM: Basal medium for skin fibroblasts * (phenol red, antibacterial agent free) 500mL
  • LFK-LS1038 FibroLife S2 LifeFactors: Additive set for proliferation of skin fibroblasts, low serum type (L-glutamine (7.5 mM), hFGF-B (5 ng/mL), insulin (5 ⁇ g/mL), ascorbic acid (50 ⁇ g/mL), hydrocortisone (1 ⁇ g/mL), FBS (2% V/V), gentamicin (30 ⁇ g/mL), amphotericin B (15 ng/mL)) (final concentration in kit medium)
  • Human iPS cell-derived epidermal keratinocytes were cultured in CnT-07 (CELLnTEC) medium supplemented with 20ng/mL EGF (MACS) and 10 ⁇ M Y-27632 at 37°C and 5% CO2 .
  • CnT-07 CELLnTEC
  • EGF EGF
  • 10 ⁇ M Y-27632 at 37°C and 5% CO2 .
  • Polystyrene tissue culture plates (cylindrical wells, coating agent: laminin 511E8 fragment) were used for the culture.
  • the medium was replaced with CnT-07 (CELLnTEC) medium supplemented with 20ng/mL EGF (MACS) and 10 ⁇ M Y-27632.
  • Hyf medium a co-culture medium
  • DMEM/F12 medium medium for fibroblasts
  • FBS Sigma-Aldrich
  • CELLnTEC CnT-PR-3D medium
  • the cells were washed with PBS(-) and then detached using TrypLE (TM) Select Enzyme.
  • the detached epidermal keratinocytes were separated by centrifugation and suspended in the above-mentioned co-culture medium so that the epidermal keratinocytes were 5 ⁇ 10 4 cells/mL.
  • the fibroblast medium was removed by suction from each well of the above-mentioned 96-well multi-well plate while leaving the fibroblast clumps. After removing the medium by suction from each well, a cell suspension of epidermal keratinocytes was seeded at 100 ⁇ L/well into each well where the fibroblast clumps remained.
  • One well contained one fibroblast clump and co-culture medium containing 5 ⁇ 10 3 cells/mL of epidermal keratinocytes.
  • the core-shell 3D construct containing fibroblasts and epidermal keratinocytes produced as described above was cultured and maintained at 37°C under 5% CO2 .
  • the medium was replaced with co-culture medium at 100 ⁇ L/well every day.
  • the 3D construct which was at least composed of a core of normal fibroblasts and a shell of epidermal keratinocytes after differentiation induction derived from iPS cells, could be cultured continuously for 22 days in the co-culture medium.
  • the undifferentiated layer is a collagen XVII-positive cell layer
  • the differentiated layer is a collagen XVII-negative cell layer.
  • occludin which is expressed in the granular layer, which is the later differentiation stage of epidermal keratinocytes ( Figure 7)
  • the outermost layer (figure 7) of the three-dimensional structure, it can be assumed that the epidermal keratinocyte layer undergoes a stepwise differentiation process from the inside to the outside.
  • Limiting dilution of KURARAY collagen-coated PVA microspheres> (1) Take a small amount of powdered PVA microspheres and dilute it with an appropriate amount of half medium (DMEM/F12 supplemented with 5% FBS and 1mM CaCl2 : CnT-PR-3D 1:1)* (2) The diluted solution from (1) above was seeded at 50 ⁇ L/well into a V-bottom 96-well plate. (3) A well containing only one PVA microsphere was selected under a microscope, and this was used to obtain the three-dimensional core-shell structure of Preparation Example 2.
  • ⁇ Test Example 6> The time-dependent changes in the localization of the three-dimensional core-shell structure obtained in Production Example 2 were observed under a fluorescent microscope using antibodies against Hoechest, CollagenXVII (basal cell marker), Ki67, and Occludin (tight junction (TJ) marker). These markers were used according to the [Various markers] in Production Example 1 above, as well as the evaluation criteria for Occludin staining, the evaluation criteria when using proliferation markers, and the evaluation criteria when using basal cell markers.
  • FIG. 10 is a grayscale photograph showing the time-dependent changes in the types of seeded epidermal keratinocytes (iKC, HPEK) and the localization of an epidermis-specific marker (OccludinKi-67) in a three-dimensional core-shell structure obtained in Production Example 2, as observed with a fluorescence microscope (see FIG. 10 ).
  • the size of the three-dimensional core-shell structures (spheroids) obtained in Production Example 2 varies depending on the culture conditions (cell seeding number, culture days, medium type, etc.), but is generally within the range of 300 to 500 ⁇ m, and the major axis of the three-dimensional core-shell structures in Production Example 2 was, for example, 312, 370, or 400 ⁇ m.
  • the major axis of the three-dimensional structures was measured using ImageJ, using the midline cross-sectional image taken with a confocal laser microscope (LSM900, ZEISS).
  • Production Example 2 can stably distinguish between undifferentiated and differentiated epidermal keratinocyte layers.
  • the undifferentiated layer is a collagen XVII-positive cell layer
  • the differentiated layer is a collagen XVII-negative cell layer.
  • occludin which is expressed in the granular layer, which represents the later differentiation stage of epidermal keratinocytes, was confirmed in the outermost layer (outermost layer) of the three-dimensional structure, it can be inferred that the epidermal keratinocyte layer undergoes a stepwise differentiation process from the inside to the outside.
  • spheroids can be produced by seeding and culturing epidermal keratinocytes on a cell cultureware containing a single PVA microcarrier.
  • This spheroid (mass) was a mass having a three-dimensional core-shell structure, in which (a) the center was a single microcarrier, and (b) the shell portion was a cell layer including an undifferentiated layer and a differentiated layer, which was composed at least of multiple tight junctions present between the cells of the surface cell layer and multiple epidermal keratinocytes.

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Abstract

本発明は、表皮角化細胞を含む新規な三次元構造物及びこれを製造する技術を提供すること。　本発明は、表面に存在するタイトジャンクションを有し、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、　細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物である中心部と、を含む、 コアシェル構造の三次元構造物。物を提供する。前記マイクロ球状物が、マイクロキャリア又は細胞塊である、ことが好ましい。

Description

コアシェル構造の三次元構造物
　本発明は、コアシェル構造の三次元構造物、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法、コアシェル構造の三次元構造物を用いる皮膚恒常性維持機能の評価方法等に関する。
　近年、皮膚の正常な機能を維持し、衰えた皮膚の機能を回復させるといった皮膚の恒常性の維持が着目されるようになってきている。皮膚の組織は、表皮、真皮及び皮下組織から構成されており、これらはそれぞれ異なる役割にて、皮膚の恒常性の維持に役立っている。外界に接する表皮は、表皮角化細胞（ケラチノサイト）により構成されているが、表皮角化細胞の分化段階が異なる層（具体的には、基底層、有棘層、顆粒層及び角質層）の重層構造となっている。そして、表皮では、表皮角化細胞が、未分化の状態から分化し、最終的に角質層にて皮膚表面から剥がれ落ちるといったことが、一定の周期で代謝サイクルとして行われており、このような代謝サイクルをターンオーバーと呼んでいる。また、外界に接する表皮は、体内からの水分の蒸散又は体内への病原体等の侵入などを防ぐバリア機能等の役割を担っている。一方、真皮は、コラーゲンやエラスチン等により皮膚を支え、その形や弾力を保つ役割を担っている。
　近年では、モデル動物実験の代替として、動物の皮膚組織に類似の真皮及び表皮を含む三次元構造をとるシート状の三次元培養皮膚モデルを用い、このシート状の三次元培養皮膚モデルを入れたウェル内にて、皮膚のバリア機能やターンオーバー等の皮膚恒常性維持機能の評価を行うようになってきている。このような皮膚の恒常性を研究するために、皮膚の水分測定装置等による測定の他、種々のマーカーを用いるようにもなってきている。
　以下のような三次元培養皮膚モデルが、提案されている。
　例えば、特許文献１には、「以下の（１）～（３）に記載の構造を含む、人為的に作製された真皮（真皮同等物）層を有する３次元培養皮膚モデル。（１）コラーゲンおよび線維芽細胞を混合したものを培養することにより得られる、真皮同等物の層。（２）表皮角化細胞の層。（３）（１）の真皮同等物の層と、（２）の表皮角化細胞の層との間に、生着したメラノサイト。」が提案されている。
　また、特許文献２には、下から順に、Ａ線維芽細胞を含む支持体層、Ｂ樹状細胞を含む支持体層、およびＣ表皮角化細胞層、を含むことを特徴とする三次元培養ヒト皮膚モデルであり、前記Ｃにおける表皮角化細胞が、前記Ｂの樹状細胞を含む支持体層の上に播種されたシート状のものであることが開示されている。
　また、シート状以外にも、以下のような三次元構造物が提案されている。
　例えば、非特許文献１では、ポリエチレングリコールジアクリレートヒドロゲルから製造された三次元（３Ｄ）マイクロウェルに、毛乳頭（ＤＰ）細胞、ＨａＣａＴケラチノサイト及びヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞を順次に播種し、３次元毛乳頭（ＤＰ）細胞を作製することが提案されている。
　また、非特許文献２では、クリノスタット（微小重力環境に近い状態）を使用した三次元細胞培養で微小重力による皮膚の変化を再現し、宇宙探査前に微小重力が人間の健康に及ぼす影響を理解できるための三次元細胞培養が提案されている。
特開２０１０－１９３８２２号公報 特開２００６－３３３７６３号公報 特開２０２３－０１８６３２号公報
Justin J Y Tan  et al., Cell Prolif. 2019 Sep ; 52(5):e12668. Dong Hyun Choi et al., npj Microgravity volume 7, Article number: 20 (2021). Sergio Cortez Ghio et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(8), 2174. Okita K. et.al., Nature Methods, 2011,8:409-12. Ido H, et al., J Biol Chem. 2007, 282, 11144-11154.
　このように、皮膚バリア機能等の皮膚恒常性維持機能を評価する場合には、皮膚モデルは有益である。そして、本発明者らは、シート状の皮膚モデルに比べて、スフェロイドのような細胞同士が凝集して塊状になった略球状の三次元構造物は、より少ない細胞数及びより少ない工程及びより短い培養期間で得ることができ、得られた略球状の三次元構造物を用いて多くの条件でのスクリーニング、評価、分析や測定等の試験が行いやすいと考えた。
　しかしながら、非特許文献１では、３次元毛乳頭細胞が提案されているが、線維芽細胞塊のコアの外側を表皮角化細胞が覆うようなコアシェル構造の三次元構造物の開示はない。また、非特許文献２では、特殊な装置を用いて微小重力下での三次元細胞培養の技術及びそれによる特殊な三次元構造物の開示であり、また宇宙探査前に微小重力が人間の健康に及ぼす影響の検討を目的とするものである。このため、非特許文献２に開示の技術は、通常の細胞培養で行われているような地球の重力下での培養技術ではない。また、皮膚バリア機能等の皮膚恒常性維持機能も良好に評価できる略球状の三次元構造物が望まれていた。
　そこで、本発明は、表皮角化細胞を含む新規な三次元構造物及びこれを製造する技術を提供することを主な目的とする。
　本発明者らは、タイトジャンクションが三次元構造物に存在した方が、皮膚恒常性維持機能（例えば、皮膚バリア機能等）等をより精度良く試験できると考えた。しかしながら、タイトジャンクションを有し、表皮角化細胞を含む略球状の三次元構造物についての十分な知見はない。また、表皮の重要な機能であるバリア機能を担うタイトジャンクションを形成し、それに対する薬剤の効果を評価できる略球状の三次元構造物が望まれていた。このため、本発明者らは、タイトジャンクションを有する三次元構造物及びこれを製造する技術を提供することを第２の目的とした。
　そして、本発明者らは、鋭意検討した結果、マイクロ球状物及び播種した表皮角化細胞を共培養することで、複数の表皮角化細胞と複数のタイトジャンクションとを含む細胞層を含む、コアシェル構造の新規な三次元構造物が提供できることを見出した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
　本発明は、表面に存在するタイトジャンクションを有し、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、
　細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物である中心部と、を含む、コアシェル構造の三次元構造物を提供できる。
　本発明は、マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを共培養する、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供できる。
　本発明は、前記三次元構造物を用いる、皮膚恒常性維持機能の評価方法を提供できる。
　前記マイクロ球状物が、マイクロキャリア又は細胞塊であってもよい。
　前記表皮角化細胞が、多能性幹細胞由来の表皮角化細胞であってもよい。
　前記三次元構造物は、皮膚恒常性維持機能評価に用いてもよい。
　前記マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを培養する際に、表皮角化細胞用培地を少なくとも含む培地、又は、表皮角化細胞用培地と線維芽細胞用培地とを含む培地を、使用してもよい。
　前記三次元構造物の大きさが、前記マイクロ球状物の大きさを１としたときに、１．０５以上１．５以下になるように培養してもよい。
　本発明は、表皮角化細胞を含む新規な三次元構造物及びこれを製造する技術を提供することができる。
本実施形態における、複数のタイトジャンクション及び複数の表皮角化細胞を含むシェル部分の細胞層と、複数の細胞（例えば線維芽細胞）を含むコア部分の中心部と、から少なくとも構成されるコアシェル構造の三次元構造物の一例の概略図を示すが、本発明はこれに限定されない。 本実施形態における、複数のタイトジャンクション及び複数の表皮角化細胞を含むシェル部分の細胞層と、マイクロキャリアを含むコア部分の中心部と、から少なくとも構成されるコアシェル構造の三次元構造物の一例の概略図を示すが、本発明はこれに限定されない。 コアに細胞塊が存在する本第１実施形態のコアシェル構造の三次元構造物の製造例の一例を示すが、本発明はこれに限定されない。 コアにマイクロキャリアが存在する本第２実施形態のコアシェル構造の三次元構造物の製造例の一例を示すが、本発明はこれに限定されない。 本第１実施形態において製造された、コアとして細胞塊を用いたコアシェル構造の三次元構造物の光学顕微鏡写真を示すが、本発明はこれに限定されない。 本第１実施形態において製造されたコアとして細胞塊を用いたコアシェル構造の三次元構造物の蛍光観察のグレー写真の図を示すが、本発明はこれに限定されない。また、当該グレー写真の図は、（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ陽性細胞の占有率の求め方）も示す。サンプル１　全体(1)：3.907／Occludin陽性細胞領域(2)：1.035／占有率：1.035/3.907×100 = 26.5%。サンプル２　全体(1)：6.384／Occludin陽性細胞領域(1-2)：5.843／占有率：5.843/6.384×100 = 91.5%。 本第１実施形態の製造方法において、表皮角化細胞培養用培地と線維芽細胞培養用培地の混合比率（表皮細胞用：線維芽細胞用）１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、０：１００のときに、得られた細胞塊を示す蛍光顕微鏡（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ染色像）のグレー写真の図である。 本第１実施形態の製造方法において、ＮＨＤＦ：ｉＫＣが８：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：８のときに得られた細胞塊を示す蛍光顕微鏡観察（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ染色像）のグレー写真の図である。 皮膚の構造と表皮特異的マーカーの局在を示す概念図である。 得られた本第１実施形態のコアシェル構造の三次元構造物における、Ｋｉ－６７抗体、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ抗体、ＣｏｌｌａｇｅｎＸＶＩＩ抗体を用いたときの培養期間中の染色性及び局在を蛍光顕微鏡で確認したときのグレー写真の図である。 得られた本第１実施形態のコアシェル構造の三次元構造物における、播種した表皮角化細胞の種類（ｉＫＣ、ＨＰＥＫ）と表皮特異的マーカー（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ，　Ｋｉ－６７）局在の経時変化を蛍光顕微鏡で確認したときのグレー写真の図である。 得られた本第２実施形態のコアシェル構造の三次元構造物における、播種した表皮角化細胞の種類（ＨＰＥＫ）と表皮特異的マーカー（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｋｉ－６７）局在の経時変化を蛍光顕微鏡で確認したときのグレー写真の図である。Ｏｃｃｌｕｄｉｎ染色、Ｋｉ－６７染色以外に、本第２実施形態のコアシェル構造の三次元構造物における、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（Ｒ）核酸染色された及びＣｏｌｌａｇｅｎＸＶＩＩ染色された、それぞれのグレー写真図も示す。 得られた本第１実施形態のコアシェル構造の三次元構造物のコア部分に線維芽細胞塊があり、その細胞塊の表面は細胞外マトリックス（Ｃｏｌ１又はＣｏｌ４）を有することを示すグレー写真の図である。上段図は、培養３週間後の３次元構造物であり、３次元構造物を、細胞外マトリックスの１種Ｃｏｌ　ＩＶ（４）の抗体で染色したものである。下段図は、培養３週間後の３次元構造物であり、３次元構造物を、細胞外マトリックスの１種Ｃｏｌ　Ｉ（１）の抗体で染色したものである。
　以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、本明細書において百分率は特に断りのない限り容量による表示である（容量／容量％）。また、各数値範囲（～）の上限値（以下）と下限値（以上）は、所望により、任意に組み合わせることができる。
１．本実施形態に係る三次元構造物
　本実施形態は、表皮角化細胞と細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物とを含むコアシェル構造の三次元構造物を提供できる。本実施形態は、好ましくは、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、マイクロ球状物である中心部と、から少なくとも構成されているコアシェル構造の三次元構造物を提供でき、当該マイクロ球状物は細胞外マトリックス成分を表面に有することが、好ましい。本実施形態は、前記中心部の周囲を、前記細胞層が、三次元構造物の表層部として、覆っていることが、より好ましい。本実施形態は、細胞層の表面にタイトジャンクションを有することが好ましく、外部に接する細胞層の表層に存在する、隣り合う分化後の表皮角化細胞と分化後の表皮角化細胞との間にタイトジャンクションを有することが好ましい。
　前記細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物における「マイクロ球状物」は、マイクロキャリア（好適には非細胞系マイクロキャリア）又は細胞塊（好適には線維芽細胞塊）が好ましく、それぞれのコアシェル構造の三次元構造物を、本第１実施形態（図１Ａ参照）及び本第２実施形態（図１Ｂ参照）ともいい、当該中心部の表面は、細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン）を有することが好ましい。
　例えば、本第１実施形態の場合、本第１実施形態は、複数の表皮角化細胞と複数の線維芽細胞とを含むコアシェル構造の三次元構造物を提供するものである。本第１実施形態は、好ましくは、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、複数の線維芽細胞で少なくとも構成されている中心部と、から少なくとも構成されているコアシェル構造の三次元構造物を提供でき、当該中心部の表面は細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン）を有する。
　例えば、本第２実施形態の場合、本第２実施形態は、複数の表皮角化細胞と１つのマイクロキャリアとを含むコアシェル構造の三次元構造物を提供するものである。本第２実施形態は、好ましくは、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、１つのマイクロキャリアから構成される中心部と、から少なくとも構成されているコアシェル構造の三次元構造物を提供でき、当該中心部の表面は細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン）を有する。本第２実施形態の利点としては、例えば、細胞が表皮角化細胞の１種類で良いため操作が簡便であること；評価の際に特別な細胞の分離工程を必要とせず、皮膚バリアに重要な表皮を構成する表皮角化細胞のみを純粋に評価できること；ｉＰＳ細胞由来の表皮角化細胞を使用した場合では、個人の特性を純粋に反映した生体模倣モデルとなり、各個人の肌特性や薬剤への反応性を評価できることなどが挙げられる。そして、本第２実施形態の利点としては、本第１実施形態と同様に表皮角化細胞を表層部に有するとともに、コア部分にマイクロキャリアを用いているので、表層部を評価する際に他種の細胞影響を少なくできると考える。さらに、本第２実施形態は、本第１実施形態と比較した場合、マイクロキャリアを用いるため細胞塊作製よりも作業工数やコスト低減などの製造方法でも有利であると考えられ、生産効率化や大量生産化がより容易になると考える。
　また、本実施形態において、中心部をコア部分ともいい、表層部をシェル部分ともいう。また、三次元構造物は、シェル部分（表層部）の中心方向の内層と、コア部分（中心部）の外径方向の外層とが接触状態であることがより好ましく、当該接触状態に細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン）が存在することがより好ましい。例えば、本第１実施形態の場合には、コア部分が線維芽細胞塊であることが好ましく、本第２実施形態の場合には、コア部分がマイクロキャリアであることが好ましい。
　また、本実施形態は、前記細胞層は、表面にタイトジャンクションを有する複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層であること、及び／又は、前記中心部は、マイクロ球状物であることが、好ましく、当該マイクロ球状物は、前記中心部の表面に、細胞外マトリックス成分を有することがより好ましい。前記中心部は、細胞塊又はマイクロキャリアであることが好ましく、細胞塊の場合には第１実施形態、マイクロキャリアの場合には第２実施形態であってもよい。前記中心部は、複数の線維芽細胞で少なくとも構成されている１つの線維芽細胞塊であること、又は、１つのマイクロキャリアであることが好ましい。
　また、本実施形態の好適な態様としては、表面の細胞層の細胞間に存在する複数のタイトジャンクションと、複数の表皮角化細胞とで少なくとも構成されている細胞層と、細胞外マトリックス成分を有するマイクロ球状物である中心部と、を含む、コアシェル構造の三次元構造物を提供できる。このときのマイクロ球状物の好ましい態様については、上述した第１実施形態又は第２実施形態を、適宜採用できる。
　また、本実施形態の好適な態様としては、前記細胞層は、分化した表皮角化細胞を含む分化層と、中心方向にある未分化の表皮角化細胞を含む未分化層とから少なくとも構成される層であること、及び／又は、前記タイトジャンクションは、三次元構造物の表面の細胞層に存在する分化した表皮角化細胞の隣り合う細胞間に存在することである。
　本実施形態の別の好適な態様として、三次元構造物の表層部が、複数の表皮角化細胞と、その最外層に存在する隣り合う表皮角化細胞と表皮角化細胞との間にあるタイトジャンクションとで少なくとも構成されている、及び、三次元構造物の中心部がマイクロ球状物（例えば、複数の線維芽細胞、１つのマイクロキャリアなど）で少なくとも構成されている、コアシェル構造の三次元構造物も提供できる。
　また、本実施形態の別の好適な態様として、（ａ）細胞層表面の細胞間に存在するタイトジャンクションと、複数の表皮角化細胞とで少なくとも構成されている細胞層と、（ｂ）中心部として、細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物とを含む、コアシェル構造の三次元構造物も提供できる。
　前記マイクロ球状物は、ある種の細胞であって複数の細胞から少なくとも構成されている細胞外マトリックス成分被覆層を有する１つの細胞塊、又は、細胞外マトリックス成分被覆層を有する１つのマイクロキャリアが好ましく、それぞれを、細胞塊を有する第１実施形態、マイクロキャリアを有する第２実施形態としてもよい。
　第１実施形態に用いられる、ある種の細胞は、同一種又は異なる種の組み合わせでもよいが、同一種であることが好ましく、より好ましくは線維芽細胞である。
　第２実施形態に用いられる、マイクロキャリアは、非細胞系であることが好ましい。
　また、本実施形態の別の好適な態様として、（ａ）複数の表皮角化細胞と、三次元構造物の表面に存在し隣り合う表皮角化細胞同士の間に存在するタイトジャンクションとを少なくとも含む表層部にある細胞層と、（ｂ）中心部にあるマイクロ球状物（例えば、非細胞系又は細胞系）、と、を含む、コアシェル構造の三次元構造物も提供できる。
　また、マイクロ球状物（好適には、マイクロキャリア又は線維芽細胞塊）を核部分として、当該核部分が表皮角化細胞を含む層で覆われていることが、より好ましい。好適な前記（ｂ）は、（ｂ１）複数の線維芽細胞を含む、中心部にある線維芽細胞塊、又は、（ｂ２）非細胞系球状物であり、中心部にある非細胞系マイクロキャリアであることが好ましく、それぞれを、細胞塊を有する第１実施形態、マイクロキャリアを有する第２実施形態としてもよい。
　本実施形態に係る三次元構造物は、皮膚バリア機能等の皮膚恒常性維持機能評価に用いることが好適である。
　また、本実施形態係る三次元構造物は、後述する「２．本実施形態に係る三次元構造物の製造方法」にて製造できる。
　なお、本実施形態の説明において、後述する「２．」「３．」「４．」等の説明と重複する、表皮角化細胞、線維芽細胞、マイクロ球状物、マイクロキャリア、コアシェル構造、多能性幹細胞、細胞培養器材などの各構成や各方法などの説明については適宜省略するが、後述する「２．」「３．」「４．」等の説明が、本実施形態にも当てはまり、適宜採用することができる。
＜コアシェル構造＞
　本明細書におけるコアシェル構造としては、マイクロ球状物が中心部となることが好ましく、及び、その中心部の周りにさらに複数の細胞が被覆し形成される細胞層が、表層部となることが好ましく、当該細胞層は複層構造であることがより好ましく、マイクロ球状物は細胞外マトリックス成分を有することがより好ましい。マイクロ球状物は、複数の細胞から形成される細胞塊でもよいし、マイクロキャリアでもよい。
　本第１実施形態においては、細胞塊を構成する細胞と、細胞層を構成する細胞とは、異なる細胞であることが、より好ましい。本第２実施形態においては、非細胞系マイクロキャリアと、細胞層を構成する細胞とであることが、より好ましい。
　なお、マイクロ球状物を核又はコアともいい、表層部又は表層部の細胞層を、シェルともいう。また、三次元構造物のマイクロ球状物の位置は、コアシェル構造を形成できるような位置であることが好ましく、三次元構造物の中心でなくともよく、中心部（中心又はその周辺）でもよい。また、三次元構造物の細胞層は、中心部から外方向に存在することが好ましい。本実施形態において、外方向は、外径方向であることが好ましい。
　例えば、本実施形態の三次元構造物は、図１Ａ及び図１Ｂに限定されず、図１Ａ及び図１Ｂのようなコア部分とそのシェル部分を有する構造をコアシェル構造ともいう。例えば、図１Ａ及び図１Ｂに示すような本実施形態の三次元構造物の好適な例として、（ａ）線維芽細胞塊又はマイクロキャリアのようなコアと、（ｂ）最外層及び最内層を含む分化後の表皮角化細胞層と未分化の表皮角化細胞層とを含む表皮角化細胞層のようなシェルと、を含む、コアシェル構造の三次元構造物が挙げられる。例えば、本第１実施形態に係るコアシェル構造の三次元構造物１は、線維芽細胞１１を含む線維芽細胞塊１０ａのコア部分と、表皮角化細胞の細胞層２０のシェル部分とから少なくとも構成され、当該細胞層２０には、タイトジャンクション３０と、未分化の表皮角化細胞層２１と、分化後の表皮角化細胞層２２及び最表層２３とを含み、未分化の表皮角化細胞層２１には未分化の表皮角化細胞２０１を含み、分化後の表皮角化細胞層２２及び最表層２３には分化後の表皮角化細胞２０２を含むことが挙げられる。例えば、本第２実施形態に係るコアシェル構造の三次元構造物１は、本第１実施形態に係るコアシェル構造の三次元構造物１のコア部分が、線維芽細胞塊１０ａに代えてマイクロキャリア１０ｂであり、このマイクロキャリア１０ｂと、本第１実施形態の表皮角化細胞の細胞層２０のシェル部分と同じ構成である表皮角化細胞の細胞層２０のシェル部分を含むことが挙げられる。
　＜三次元構造物の中心部＞
　本実施形態において、三次元構造物の中心部は、特に限定されないが、マイクロキャリア又は細胞塊などのマイクロ球状物であることが好ましく、細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物であることがより好ましい。当該マイクロ球状物として、特に限定されないが、細胞塊（好適には線維芽細胞塊）又はマイクロキャリア（好適には非細胞系）が好ましい。このうち、マイクロキャリア（好適には非細胞系）が好ましく、これにより細胞層に関する皮膚恒常性維持機能評価を行う際に、表皮角化細胞以外の細胞を用いないため、他の細胞による影響を減らすことができる。
　＜細胞外マトリックス成分＞
　細胞外マトリックス成分として、特に限定されないが、例えば、コラーゲン（例えば、各Ｉ型～ＸＩＸ型）、ヒアルロン酸又はその塩（ナトリウムなど）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン（例えば、各１～１５（例えば、ラミニン５１１Ｅ８など）、テネイシン、トロンボスポンジン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン等の細胞外マトリックス；ポリ－Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド、ｎ－イソプロピルアクリルアミド、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル等の細胞外マトリックス代用素材が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上である。細胞外マトリックス成分としては、細胞外マトリックス及び／又は細胞外マトリックス代用素材を用いることができ、細胞外マトリックスが好ましい。なお、細胞外マトリックス成分は、細胞と細胞との間を埋める非細胞性の物質であってもよく、細胞接着性作用を発揮させる成分又は有している成分であることが好ましい。
　マイクロ球状物の表面にある細胞外マトリックス成分として、好ましくはコラーゲンであり、より好ましくはコラーゲン１型及び／又はコラーゲン４型であるが、これに限定されず、また、マイクロ球状物の細胞外マトリックス成分の存在を確認する場合には、コラーゲン（好適にはコラーゲン１型、４型）を確認することができる。細胞外マトリックス成分の例示を確認する場合、それに応じた確認可能なマーカーを適宜使用することができ、市販品（試薬キットなど）などを用いることができる。
　また、本実施形態において、このうちのマイクロ球状物の表面が、細胞外マトリックス成分確認マーカーにて細胞外マトリックス成分の存在が確認できる三次元構造物であることが望ましく、細胞外マトリックス成分確認マーカーのうち、コラーゲンが好ましく、より好ましくは、少なくともCol 1及び／又はCol IVにてこれらのうちの１つ又は両方の存在が確認できる三次元構造物である。なお、当該確認は、目的とする遺伝子又はタンパク質の発現を確認できる方法であれば特に限定されず、染色、発現量などが挙げられ、後述する評価方法で用いる方法を適宜採用できる。
　本第１実施形態において、三次元構造物の中心部は、複数の線維芽細胞を含んでおり、これら線維芽細胞から少なくとも構成されている線維芽細胞塊が好ましく、その表面に細胞外マトリックス成分を有することが好ましい。当該線維芽細胞は、培養可能な線維芽細胞が好ましく、より好ましくは正常線維芽細胞及び／又は多能性幹細胞由来の線維芽細胞であり、さらに好ましくは正常線維芽細胞である。
　本第２実施形態において、三次元構造物の中心部は、１つの球状マイクロキャリアから構成されていることが好ましく、その表面に細胞外マトリックス成分を有することが好ましい。当該マイクロキャリアは、非細胞系であることが好ましい。非細胞系とは、生細胞又は死細胞、増殖又は分裂しない細胞などが挙げられ、動物由来の細胞でないことが好ましい。
　＜マイクロキャリア＞
　本実施形態に用いられる中心部は、１つの球状マイクロキャリアであってもよく、複数のマイクロキャリアから構成される１つの塊物であってもよいが、１つの球状マイクロキャリアがマイクロ球状物のコアを形成することが、作業性容易、工程数低減又はコスト的な観点から、好ましい。
　１つの塊状マイクロキャリアは、同一形状又は異なる形状、同一粒径又は異なる粒径などの複数のマイクロキャリアを適宜組み合わせて形成してもよい。
　本実施形態に用いられるマイクロキャリアは、市販品を入手して使用してもよく、例えばコラーゲンコートＰＶＡマイクロキャリア（クラレ　ＰＶＡマイクロキャリア（コラーゲン１型）、CorningRコラーゲンコートマイクロキャリアなど）、マイクロキャリア（CorningR　無処理マイクロキャリアなど）が挙げられ、また、後述するようなマイクロキャリアも挙げることができ、これらから１種又は２種以上を用いることができる。また、マイクロキャリアは、公知の製造方法を参考にして製造してもよい。
　マイクロキャリアに用いられる材料は、有機物、無機物、又はこれらの複合材料であってよく、材料を疎水化したもの又は疎水性基が導入された材料であってもよい。これらの材料から、マイクロキャリアを形成することができる。マイクロキャリアは、細胞適合性の観点から、有機物を含むことが好ましい。有機物として疎水部を有するポリマーによって形成されるマイクロキャリアを用いて細胞培養してもよい。疎水性基としては、例えば、鎖状又は環状炭化水素基、芳香族炭化水素基等が挙げられる。
　有機物として、特に限定されないが、例えば、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、（メタ）アクリル系ポリマー、（メタ）アクリルアミド系ポリマー、シリコーン系ポリマー、エポキシ樹脂等の合成高分子（樹脂）；コラーゲン、ゼラチン等の天然高分子（タンパク質又はペプチド）；ペクチン、ペクチン酸塩等のポリガラクツロン酸、アルギン酸、セルロース、架橋アガロース、デキストラン、キトサン及びこれらの塩（例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉなどのアルカリ金属、Ｃａ、Ｍｇなどのアルカリ土類金属）等の多糖類などが挙げられる。無機物として、例えば、ガラス、セラミック、金属、合金、金属酸化物等が挙げられる。樹脂のうち、可とう性樹脂、熱可塑性樹脂、熱可塑性エラストマーなどが好ましい。有機物のうち、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリエステル等の樹脂が挙げられ、このうち、ポリビニルアルコールが好ましい。「（メタ）アクリル酸系ポリマー」とは、アクリル酸系ポリマー若しくはメタクリル酸系ポリマー又はこれらの混合物を意味し、（メタ）アクリル酸単量体などから形成される重合体又は共重合体でもよい。
　マイクロキャリアは、細胞適合性の観点から、ハイドロゲルから形成されるマイクロキャリアを用いてもよい。このハイドロゲルとしては、ポリビニルアルコール、（メタ）アクリル系ポリマーのナトリウム塩、親水性基が多量に導入された共重合体、ゼラチン等が挙げられる。親水性ポリマーに疎水性基が導入されたハイドロゲルを用いてもよい。
　マイクロキャリアの表面には、細胞の付着を促進する観点から、細胞外マトリックス成分（好適には細胞接着性ポリマー）が、配置されていてもよい。当該細胞外マトリックス成分（好適には細胞接着性ポリマー）としては、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD  Biosciences）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸等及びこれらの塩が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。このうち、コラーゲンが好ましい。
　マイクロキャリアの表面には、細胞の付着を促進する観点から、カチオン性官能基が導入されていてもよい。カチオン性官能基として、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、アミノ基等の置換又は非置換のカチオン性アミノ基を含む基などが挙げられる。
　マイクロキャリアの形状としては、例えば、球状、扁平状、円柱状、板状、角柱状等が挙げられる。マイクロキャリアは、球状マイクロキャリアを含むことが好ましい。マイクロキャリアは、内部に細孔を有する多孔質マイクロキャリアであっても、内部に細孔を有しないマイクロキャリアであってもよく、中空のマイクロキャリアであってもよい。
　マイクロキャリアは、細胞の接着性を高めるなどの理由から、コーティング材で被覆されていてもよく、当該コーティング材は、細胞外マトリックス成分に関連するものがより好ましい。当該コーティング材として、特に限定されないが、例えば、ポリ－Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｉ型～ＸＩＸ型コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン－１～１２、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　マイクロキャリアの平均粒子径（Ｄ５０）は、細胞の増殖促進の観点から、特に限定されないが、例えば５０～１，０００μｍであり、好適な下限値として、好ましくは１００μｍ以上、より好ましくは１２０μｍ以上、さらに好ましくは１５０μｍ以上であり、また、好適な上限値として、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは４００μｍ以下、さらに好ましくは３００又は２５０μｍ以下であり、より好適な数値範囲として１００～５００μｍであることが好ましく、１２０～２５０μｍがより好ましく、１５０～２５０μｍであることがさらに好ましい。マイクロキャリアの平均粒子径（Ｄ５０）の場合は、生理食塩水又は培地中のメジアン径（Ｄ５０）として測定した値とする。マイクロキャリアの平均粒子径は、レーザー回折散乱式の粒子径分布測定装置により測定することができる。
　細胞培養に用いるマイクロキャリアは、細胞培養に供される細胞のサイズよりも大きいことが好ましい。
　＜三次元構造物の細胞層＞
　本実施形態において、三次元構造物の細胞層（好適には表層部）にある表皮角化細胞層は、複数の表皮角化細胞を含み、これらから少なくとも構成されていることが好ましい。当該細胞層は、表皮角化細胞層であることが好ましい。当該表皮角化細胞は、培養可能な表皮角化細胞が好ましく、より好ましくは正常表皮角化細胞及び／又は多能性幹細胞由来の表皮角化細胞であり、さらに好ましくは多能性幹細胞由来の表皮角化細胞である。当該三次元構造物の表皮角化細胞が、多能性幹細胞由来の表皮角化細胞であることによって、より長い期間での皮膚恒常性維持機能の評価又は試験を行うことができるという利点がある。
　＜細胞層：タイトジャンクション＞
　本実施形態において、細胞層（好適には表皮角化細胞層）の外部に接する表面に存在する細胞と細胞との隙間には、タイトジャンクションが存在することがより好ましく、当該タイトジャンクションは、細胞と細胞との間を目張りするように存在し、細胞間隙における物質の自由な透過を制限するようなバリア機能を発揮できる。また、本実施形態では、タイトジャンクションは、三次元構造物の表面の表皮角化細胞層に存在する複数の分化後の表皮角化細胞において隣り合う細胞間に存在することが好ましく、最外層に存在する分化後の表皮角化細胞間に存在しかつ外部に接している部分であることがより好ましい。後記〔実施例〕に示すように、本実施形態では、タイトジャンクションを最外層に多く存在している三次元構造物が確認されており、タイトジャンクションの量及びその局在は、ＴＪマーカーによって評価できる。本実施形態における好適なタイトジャンクションは、三次元構造物の略中心断面をみると点状にみえ、三次元構造物の表面をみると網目状にみえることがある（図１等参照）。
　なお、一般的に、タイトジャンクションは、細胞同士を接着させる細胞間結合のことをいい、隣り合う上皮細胞をつなぎ、さまざまな物質（化合物、イオン、水など）が細胞間隙を介して透過するのを制限するためのバリアとして働いているといわれている。皮膚のタイトジャンクションは、角層の内側にある顆粒層の２層目の細胞（ＳＧ２細胞）がＴＪバリアを形成し、面上では蜂の巣のような網目模様をし、皮膚のバリア機能を担っているとされている。
　＜細胞層：表皮角化細胞層＞
　本実施形態において、表皮角化細胞層は、中心部から外方向に、未分化の表皮角化細胞を含む未分化の細胞層と、分化後の表皮角化細胞を含む分化後の細胞層とから少なくとも構成される多層であることが好ましい。また、当該表皮角化細胞層は、外方向にある分化後の表皮角化細胞から少なくとも構成されている分化後の細胞層と、中心方向にある未分化の表皮角化細胞から少なくとも構成されている未分化の細胞層とから少なくとも構成されている層であることが好ましい。また、表皮角化細胞層は、最外層及び最内層を含む分化後の細胞層と、未分化の細胞層と、を含むことが、より好ましい。
　＜表皮角化細胞層：未分化の細胞層＞
　本実施形態の三次元構造物の好適な態様として、マイクロ球状物（例えば、線維芽細胞塊、マイクロキャリアなど）に接する表皮角化細胞は、未分化状態を保っていることであり、未分化の表皮角化細胞を含む層を表皮角化細胞の基底細胞層ともいう。当該マイクロ球状物に接している表皮角化細胞は、コアとなるマイクロ球状物を覆うように未分化状態の表皮角化細胞層を形成していることが好ましい。当該未分化状態の表皮角化細胞層は、好ましくは表皮角化細胞層に含まれる層であり、より好ましくは、表皮角化細胞層のなかで中心方向に存在する層、及び／又は、三次元構造物の中心部を超えて外方向に存在する層である。この未分化状態の表皮角化細胞又はその層から、分裂して新たな細胞が形成され、分裂した新たな表皮角化細胞は順次に外方向（好適には外径方向）に向かって押し上げられ、分化後の表皮角化細胞を形成することが好ましい。このような外方向に表皮角化細胞を順次押し出すような表層部の表皮角化細胞層が存在することで、通常の皮膚のターンオーバーに近い状態での試験が設定できるので、皮膚ターンオーバー等の皮膚恒常性維持機能の評価をより精度良くできる。このような未分化細胞の量及びその局在は、基底細胞マーカーによって評価することができる。また、このような未分化次いで分化になる細胞の量及びその局在は、増殖マーカーによって評価することができる。
　＜表皮角化細胞層：分化後の細胞層＞
　本実施形態の三次元構造物の好適な態様として、未分化状態の表皮角化細胞層を覆うように分化状態の表皮角化細胞層を形成していることが好ましい。当該分化状態の表皮角化細胞層は、好ましくは表皮角化細胞層に含まれる層であり、より好ましくは、未分化の細胞層から外方向に存在する層である。この分化状態の表皮角化細胞は、外方向に複数の層が形成されていることが好ましく、外部に接する分化後の表皮角化細胞の最外層が形成されていることがより好ましい。さらに、分化後の細胞層は、当該分化後の表皮角化細胞の最外層と、未分化の表皮角化細胞層に接する分化後の表皮角化細胞の最内層とを含む２層以上であることが、よりさらに好ましい。当該最外層は外部に接し、最内層は未分化の表皮角化細胞層に接することがより好ましい。
　本実施形態は、実際の皮膚の状態に類似し、表皮角化細胞が適切な層で適切な未分化及び分化後の状態になっている細胞層を有し、かつ、当該細胞層に適切な位置でのタイトジャンクションを有する三次元構造物を提供することができる。このため、本実施形態の三次元構造物は、皮膚恒常性維持機能評価等の各種試験を行うのに適している。なお、本実施形態の三次元構造物は、従来のシート状などの三次元培養物よりも、各種試験時に用いる細胞数が少なく、スクリーニング系実験との相性がよいという利点を有する。
　＜三次元構造物に用いられる線維芽細胞及び表皮角化細胞の由来＞
　本実施形態の三次元構造物を調製する際に用いられる細胞の由来としては、特に限定されず、例えば、正常細胞由来（例えば、正常表皮角化細胞、正常線維芽細胞等）、多能性幹細胞由来（好適にはｉＰＳ細胞由来）の分化誘導細胞由来等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上である。好適な態様として、三次元構造物の表皮角化細胞層は、表皮角化細胞を用いて調製されたものであることが好ましく、多能性幹細胞由来及び／又は正常細胞由来の表皮角化細胞から少なくとも形成されたものであることがより好ましく、さらに好ましくは三次元構造物の表皮角化細胞層が、播種した多能性幹細胞由来の表皮角化細胞によって形成された表皮角化細胞層である。また、好適な態様としては、三次元構造物の中心部が線維芽細胞塊である場合には、当該塊が、正常細胞由来の線維芽細胞から少なくとも形成されたものであることが好ましい。
　また、これら細胞の由来は、特に限定されないが、哺乳動物由来が好ましく、当該哺乳動物としては、特に限定されず、例えば、ヒト、ブタ、げっ歯類（マウス、ラットなど）、愛玩動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコなど）などが挙げられ、これらから１種又は２種以上用いることができ、このうちヒト由来が好ましい。
　＜三次元構造物の形状、大きさ等＞
　本実施形態の三次元構造物の形状又はマイクロ球状物（例えば、細胞塊、マイクロキャリアなど）の形状は、特に限定されないが、塊状や略円球状（例えば楕円球状や正円球状等）になっていることが好ましい。
　なお、本実施形態の形状や大きさなどは、顕微鏡写真等から測定することができる。具体的には、三次元構造物及びスフェロイド（細胞塊）の大きさ（長径又は直径）の測定は、光学顕微鏡観察にて撮影された画像を用いて、画像解析ソフトに搭載された計測モードにて実施できる。写真から計測された平均長径はおよそ５００μｍである。より好適な態様として、三次元構造物などを、共焦点レーザー顕微鏡で撮影した像を用いて、ImageJにて大きさを測定することができ、三次元構造物などのような略球状の場合には、正中断面像を用いて大きさを測定することが好ましい。なお、細胞層の厚みについては、細胞層の厚み＝三次元構造物の大きさ－マイクロ球状物（例えば、線維芽細胞塊、細胞塊、マイクロキャリアなど）の大きさから、算出できる。
　本実施形態の三次元構造物の大きさ（長径）は、特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは３００μｍ以上、より好ましくは３５０μｍ以上、さらに好ましくは４００μｍ以上であり、また、この好適な上限値として、好ましくは７００μｍ以下、より好ましくは６００μｍ以下又は５００μｍ以下であり、より好適な数値範囲としては、好ましくは３００～７００μｍ、より好ましくは４００～６００μｍである。本実施形態の三次元構造物の大きさ（長径）の大きさは、上述した光学顕微鏡観察の画像解析を用いて測定できる。
　なお、本第２実施形態における三次元構造物の大きさ（長径）は、特に限定されないが、上述した本実施形態の３次元構造物の大きさ（長径）の好適な上限値及び好適な下限値を適宜組み合わせたり採用したりしてもよく、この好適な下限値として、好ましくは３００μｍ以上、より好ましくは３５０μｍ以上、さらに好ましくは４００μｍ以上であり、また、この好適な上限値として、好ましくは７００μｍ以下、より好ましくは６００μｍ以下又は５００μｍ以下である。本第２実施形態における三次元構造物の大きさ（長径）は、概ね３００～５００μｍである。この大きさは、上述した光学顕微鏡観察の画像解析を用いて測定できる。
　マイクロ球状物の大きさ（長径又は直径）は、特に限定されないが、例えば５０～１，０００μｍが挙げられ、この好適な下限値として、好ましくは１００μｍ以上、より好ましくは１２０μｍ以上、さらに好ましくは１５０μｍ以上であり、また、この好適な上限値として、好ましくは６００又は５６０μｍ以下、より好ましくは５００又は４８０μｍ以下、さらに好ましくは４００又は３００μｍ以下、より好ましくは２５０μｍ以下である。この大きさは、上述した光学顕微鏡観察の画像解析を用いて測定できる。
　マイクロキャリアの大きさ（長径又は直径）は、特に限定されないが、例えば５０～１，０００μｍであり、好適な下限値として、好ましくは１００μｍ以上、より好ましくは１２０μｍ以上、さらに好ましくは１５０μｍ以上であり、また、好適な上限値として、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは４００μｍ以下、さらに好ましくは３００又は２５０μｍ以下であり、より好適な数値範囲として１００～５００μｍであることが好ましく、１２０～２５０μｍがより好ましく、１５０～２５０μｍであることがさらに好ましい。この大きさは、上述した光学顕微鏡観察の画像解析を用いて測定できる。
　本第１実施形態における三次元構造物中の細胞塊（好適には線維芽細胞塊）の大きさ（長径又は直径）は、特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは２４０μｍ以上、より好ましくは３２０μｍ以上であり、また、この好適な上限値として、好ましくは５６０μｍ以下、より好ましくは４８０μｍ以下であり、より好適な数値範囲としては、好ましくは２４０～５６０μｍ、より好ましくは３２０～４８０μｍである。この大きさは、上述した光学顕微鏡観察の画像解析を用いて測定できる。
　本第２実施形態における三次元構造物中のマイクロキャリアの大きさ（長径又は直径）は、特に限定されないが、例えば５０～１，０００μｍであり、好適な下限値として、好ましくは１００μｍ以上、より好ましくは１２０μｍ以上、さらに好ましくは１５０μｍ以上であり、また、好適な上限値として、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは４００μｍ以下、さらに好ましくは３００又は２５０μｍ以下であり、より好適な数値範囲としては、好ましくは１００～５００μｍ、好ましくは１２０～２５０μｍである。この大きさは、上述した光学顕微鏡観察の画像解析を用いて測定できる。
　本実施形態における三次元構造物中の表皮角化細胞を含む細胞層の大きさ（厚み）は、特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは６０μｍ以上、より好ましくは８０μｍ以上であり、また、この好適な上限値として、好ましくは１４０μｍ以下、より好ましくは１２０μｍ以下であり、より好適な数値範囲としては、好ましくは６０～１４０μｍ、より好ましくは８０～１２０μｍである。当該細胞層の大きさ（厚み）は、中心部が細胞塊又はマイクロキャリアのいずれでも適用でき、適宜採用することができる。
　本実施形態において中心部に細胞塊（好適には線維芽細胞塊）を用いる場合には、本実施形態における三次元構造物中の細胞数（好適には線維芽細胞数）は、特に限定されないが、好ましくは１×１０２～１×１０５ｃｅｌｌ／三次元構造物、より好ましくは１×１０３～２×１０４ｃｅｌｌ／三次元構造物であり、また、本実施形態における三次元構造物中の表皮角化細胞数は、特に限定されないが、好ましくは１×１０２～１×１０５ｃｅｌｌ／三次元構造物、より好ましくは１×１０３～２×１０４ｃｅｌｌ／三次元構造物である。
　本実施形態における三次元構造物の大きさは、特に限定されないが、中心部のマイクロ球状物の大きさ（長径）を１としたときに、好適な下限値として、好ましくは１．０５以上、より好ましくは１．１以上、また、好適な上限値として、好ましくは３．０以下、より好ましくは２．０以下、さらに好ましく１．５以下であり、当該好適な数値範囲としては、好ましくは１．０５以上１．５以下である。
　また、本第１実施形態又は本第２実施形態における、中心部のマイクロ球状物の大きさ（長径）を１としたときの三次元構造物の大きさは、上述した「本実施形態における三次元構造物の大きさ」における好適な上限値及び好適な下限値を適宜採用することができ、例えば、本第１実施形態の場合には好ましくは１．０５以上１．５以下であり、本第２実施形態の場合には、好ましくは１．０５以上１．５以下である。
　本第１実施形態における三次元構造物中の線維芽細胞数及び表皮角化細胞数の含有割合（線維芽細胞数／表皮角化細胞数）は、特に限定されないが、この好適な下限値としては、表皮角化細胞層における適切なタイトジャンクション形成の観点から、好ましくは１／４以上、より好ましくは１／２以上、さらに好ましくは１以上、より好ましくは４以上、より好ましくは５以上、より好ましくは６以上、より好ましくは７又は８以上であり、また、この好適な上限値としては、特に限定されないが、線維芽細胞塊全域の表皮角化細胞による被覆の観点から、例えば、２０、１５、１３、又は１１以下が挙げられ、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下、さらに好ましくは８以下である。
　本実施形態における三次元構造物中の線維芽細胞数及び表皮角化細胞数、これらの含有割合は、後述の三次元構造物の製造方法で説明するような、ある三次元構造物の製造の際にそれぞれの播種に使用した細胞数換算（播種細胞数換算：ｃｅｌｌ／ｍＬ）で表すことが好ましい。
　本実施形態の三次元構造物は、培養可能期間がより長くできるので、培養期間をより長くすることができ、この培養期間中に各種試験等を行うことができ、当該試験としては、評価、測定、分析、検出、観察等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。本実施形態の三次元構造物は、培養期間を適宜長くできるので、各種試験の期間も適宜長くすることができ、これにより、より精度が高くより信頼性の高い試験結果を得ることができ、当該試験結果に基づき評価結果や判定結果等を導き出すことができるという利点がある。
　本実施形態の三次元構造物の培養期間又は培養可能期間は、特に限定されないが、この好適な下限値及び上限値は、後述する「２．本実施形態に係る三次元構造物の製造方法」での説明を適宜採用することができ、当該好適な数値の範囲としては、より好ましくは３～３５日間、さらに好ましくは６～２２日間である。当該培養期間又は培養可能期間の起点は、「表皮角化細胞を播種した後」であることが、より好ましい。
　なお、三次元構造物の培養は、１日毎に、共培養培地で、培地交換することが好ましい。また、三次元構造物の保存方法は、特に限定されないが、動物細胞を保存する方法を採用することができ、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結保護試薬の存在下、完全合成培地中で、液体窒素中に保存する方法等が挙げられる。
　＜三次元構造物の用途（皮膚恒常性維持機能評価等の各種試験）＞
　本実施形態における三次元構造物は、各種試験に使用することができるが、皮膚恒常性維持機能評価に用いることがより好ましいため、皮膚恒常性維持機能に関する各種評価に対応できるような状態、性状又は機能等を有することが好ましい。三次元構造物のより好適な態様としては、実際の皮膚のように、基底層に存在する表皮角化細胞が増殖、分化し、顆粒層にタイトジャンクションが適切に局在するように構成されていることである。三次元構造物のより好適な具体例としては、表層部にタイトジャンクションを有すること、コア部分に接する表皮角化細胞の群又は層が未分化状態であること、及びシェル部分とコア部分とが接触状態にあることの３つを有することである。当該三次元構造物を用いることにより、バリア機能等の皮膚恒常性維持機能の評価を、実際の皮膚を用いたときのように、より精度よく行うことができる。
　例えば、本実施形態の三次元構造物を用いて皮膚の恒常性維持や皮膚の物性などの試験（研究や探索など）を行ったり、本実施形態の三次元構造物を用いて皮膚バリア機能等の皮膚恒常性維持の調整（抑制や促進、機能の低下・悪化や向上など）に関する物質の各種試験（評価、研究、開発、探索、スクリーニング等）を行うことができる。
　三次元構造物は、隣り合う細胞間にタイトジャンクションを有することが好ましい。従来、表皮角化細胞から構成される表層部にタイトジャンクションを有するコアシェル構造の三次元構造物の報告はない。表層部にタイトジャンクションを有することで、バリア機能をより精度よく評価しやすい。
　また、三次元構造物は、細胞層に細胞増殖能を有することが好ましく、コア部分に接する表皮角化細胞が未分化状態であることがより好ましい。三次元構造物の細胞層に存在する細胞が細胞増殖を有することで、評価可能期間が長く設定することができ、より長期な観察等による維持状態や変更状態などを取得することも可能になる。また、コア部分に接する未分化状態の表皮角化細胞が存在することで、実際の皮膚は基底層が増殖し分化するためこの状態に近いので、皮膚恒常性維持機能（例えば、細胞の増殖能、バリア機能など）を評価しやすいという本実施形態には利点がある。また、本実施形態において、コア部分にマイクロキャリアを用いることで、表皮角化細胞から構成される細胞層に関する種々の評価を行った場合に他種の細胞の影響を少なくすることができるという利点がある。
　三次元構造物の状態の判断又は判定に用いるマーカーとしては、例えば、ＴＪマーカー、角層形成関連マーカー、増殖細胞マーカー、分化細胞マーカー、基底細胞（未分化細胞）マーカー等から選択される１種又は２種以上を用いることができる。例えば、ＴＪマーカーの染色ターゲットとしては、例えば、Occludin、ZO-1、Claudin-1などが挙げられ、このうちOccludinが好ましい。角層形成関連マーカーとしては、Filaggrin、Caspase 14などが挙げられ、このうちFilaggrinが好ましい。増殖細胞マーカーとしては、例えば、Ki-67、PCNAなどが挙げられ、このうち、Ki-67が好ましい。分化細胞マーカーとしては、Keratin 10、Involucrin、Loricrinなどが挙げられ、Keratin 10（初期分化）及びLoricrin（終末分化）が好ましい。基底細胞（未分化細胞）マーカーとしては、例えば、Keratin 5、Keratin 14、Collagen XVIIが挙げられ、このうち、colagen XVIIが好ましい。それぞれのマーカーごとに応じた、適切な遺伝子発現状態、適切な染色性、適切な局在を確認できるので、本実施形態の三次元構造物の性状又は機能の発現状態（好適には、タイトジャンクション、細胞増殖能、未分化・分化状態、コア表面の細胞外マトリックス）を確認できる。
　三次元構造物は、皮膚恒常性維持機能評価に用いることができる。
　一般的に、恒常性維持とは、組織の機能が内部や外部の環境因子の変化に関わらず、あるべき状態で一定に保たれること、と言われている。
　本実施形態の三次元構造物を用いる皮膚（表皮）恒常性維持に関わる機能として、例えば、表皮細胞の増殖能（Ki-67（細胞増殖））、分化能（collagen XVII (未分化）、keratin 10（初期分化）、loricrin（終末分化）等）、バリア機能（Occludin（TJ）、filaggrin（角層）等）等を含み、各評価方法は、例えば、ノーザンブロッティング、リアルタイムPCR、マイクロアレイ、RNAシークエンス、などの抽出したメッセンジャーRNAを用いた解析、もしくはウェスタンブロッティング、ELISA、質量分析によるプロテオミクス、マルチプレックスアッセイ、などの抽出したタンパク質を用いた解析、in situ ハイブリダイゼーション、蛍光免疫染色などの組織学的な解析が挙げられる。これらから１種又は２種以上を用いることができる。
　皮膚恒常性維持機能評価は、皮膚恒常性維持機能の評価が可能な各種マーカーを用いて判定することができる。使用するマーカーとしては、特に限定されず、公知の手法又は市販品キット等を用いることができる。使用するマーカーの発現の量及び局在が分かるような測定又は検出方法を用いることが好ましい。使用するマーカーの測定方法又は検出方法は、そのマーカーに応じた測定方法及び検出方法を適宜採用することが好ましい。例えば、蛍光顕微鏡観察法（レーザー走査型、共焦点レーザー型（例えば、共焦点レーザー走査型等）、多光子励起型（二光子レーザー型等）、光シート蛍光型）、遺伝子増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法など）が挙げられる。
　この発現状態を考慮して、本実施形態の三次元構造物を、より適切な皮膚恒常性維持機能評価に用いることができ、これによってより適切な評価を得ることができる。
　三次元構造物は、皮膚恒常性維持機能を有するものが好ましく、当該皮膚恒常機能維持機構を有する三次元構造物を用いることで、皮膚組織の状態（例えば、機能、性状等）の探索等に用いることができる。
　また、被験物質を実際の生体皮膚に接触させたときの動向を予測するために、本実施形態の三次元構造物を用いることができ、当該三次元構造物を、被験物質の適否の判断、皮膚の状態判断等に用いることもできる。
　また、本実施形態は、個々又は個人の体細胞に基づいた多能性幹細胞を作製し、個々又は個人の多能性幹細胞由来の表皮角化細胞を用いた三次元構造物を作製することも可能である。このため、本実施形態は、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を用いることで、個々又は個人の皮膚状態の探索等を行うことができ、また、個々又は個人に適切な又は不適切な被験物質の探索等を行うこともできる。
２．本実施形態に係る三次元構造物の製造方法
　本実施形態は、マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを、共培養することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供でき、マイクロ球状物は１つが好ましい。また、共培養を開始する際に、共培養に用いるマイクロ球状物は、細胞外マトリックス成分を表面に有していてもよい。
　本実施形態における製造方法は、マイクロ球状物として、細胞塊又はマイクロキャリアを用いることが好ましい。好適な細胞塊は、播種した細胞から調製された細胞塊が好ましい。好適なマイクロキャリアは、細胞外マトリックス成分が表面に被覆されているマイクロキャリアが好ましい。なお、細胞塊をコア部分として共培養に用いる場合には、このときの細胞塊の表面に細胞外マトリックス成分が被覆されていないともよく、調製後の三次元構造物における細胞塊（表層）と細胞層（内層）との間に細胞外マトリックス成分が存在することが好ましい。
　好適な態様として、本第１実施形態は、播種した線維芽細胞から調製された線維芽細胞塊と、播種した表皮角化細胞とを、共培養することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供できる。
　好適な態様として、本第２実施形態は、マイクロキャリアと、播種した表皮角化細胞とを、共培養することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供できる。
　また、本実施形態は、マイクロ球状物を含む細胞培養器材に、表皮角化細胞を播種して共培養することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供できる。また、本実施形態は、マイクロ球状物を含む培地に、表皮角化細胞を播種して培養することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供できる。また、本実施形態の別の態様として、マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを共培養することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供できる。
　そして、本実施形態の製造方法によって、上記「１．本実施形態に係る三次元構造物」に記載のような、コアシェル構造の三次元構造物を得ることができる。
　本実施形態の説明において、上述した「１．」、後述する「３．」「４．」等の説明と重複する、表皮角化細胞、マイクロ球状物、マイクロキャリア、線維芽細胞、コアシェル構造、多能性幹細胞、細胞培養器材などの各構成や各方法などの説明については適宜省略するが、上述した「１.」、後述する「３．」「４．」等の説明が、本実施形態にも当てはまり、適宜採用することができる。
　また、本実施形態の別の態様として、マイクロ球状物に、さらに表皮角化細胞を播種して表面層を調製することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供できる。当該マイクロ球状物は、細胞塊又は球状マイクロキャリアのいずれであってもよい。
　また、好適な製造方法として、共培養工程の前工程として、線維芽細胞を播種して、中心部になる線維芽細胞塊を調製することを、含んでもよい。好適な製造方法として、共培養工程の前工程として、球状マイクロキャリアを細胞外マトリックス成分でコーティングし、中心部になる細胞外マトリックス成分コーティング処理済みの球状マイクロキャリアを調製することを、含んでもよい。また、本第１実施形態の別の態様として、播種した線維芽細胞と、播種した表皮角化細胞とを共培養することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法を提供できる。
　また、本実施形態の別の態様として、すり鉢状凹部の細胞接着抑制処理表面上に、マイクロ球状物を配置し、さらに表皮角化細胞を播種してこれらを共培養することを含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法も提供できる。
　好適な製造方法として、共培養前に、すり鉢状凹部の細胞接着抑制処理表面上に、線維芽細胞を播種して培養してもよく、また、共培養前に、すり鉢状凹部の細胞接着抑制処理表面上に、マイクロキャリアを配置して調製してもよい。
　好適な態様としては、前記共培養にて、マイクロ球状物（例えば、線維芽細胞塊又は球状マイクロキャリア）を表皮角化細胞層が覆うようにコアシェル構造が形成される、コアシェル構造の三次元構造物を製造する方法を提供できる。また、より好適な態様としては、前記細胞層は、未分化の表皮角化細胞層と、分化後の表皮角化細胞層と、最表層の分化後の表皮角化細胞間に存在する複数のタイトジャンクションとを含むように構成される、コアシェル構造の三次元構造物を製造する方法を提供できる。
　また、本実施形態の別の態様として、マイクロ球状物に、複数の表皮角化細胞を播種して共培養を行うことで、当該線維芽細胞塊を当該表皮角化細胞で覆い、複数のタイトジャンクションが存在する三次元構造物の表層部を調製すること、を含む、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法も提供できる。前記マイクロ球状物として線維芽細胞塊を調製する場合、複数の線維芽細胞を播種して培養を行い、三次元構造物のコア部分である線維芽細胞塊を調製することを含んでもよい。前記マイクロ球状物として、細胞外マトリックス成分のコーティングを有する球状マイクロキャリアを用いてもよい。
　本実施形態の製造方法における好適な態様として、三次元構造物を製造する際に、播種に使用する線維芽細胞及び表皮角化細胞は、正常細胞由来の細胞及び／又は多能性幹細胞由来の分化誘導細胞であることが好ましい。
　本実施形態の製造方法における好適な態様として、三次元構造物を製造する際に、播種する細胞をすり鉢状凹部（例えばＵ字状、Ｖ字状等の窪み）で培養することであり、当該凹部は、その表面が細胞接着抑制処理表面であることがより好ましく、さらに、当該処理は親水化処理であることがさらに好ましい。
　本実施形態の製造方法における好適な態様として、三次元構造物を製造する際に、マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを培養する際に、表皮角化細胞用培地を少なくとも含む培地を使用することであり、表皮角化細胞用培地と線維芽細胞用培地とを含む培地を使用してもよい。また、三次元構造物の調製後に、評価の際に用いる培地も、使用するマイクロ球状物及び表皮角化細胞を考慮し、表皮角化細胞用培地を少なくとも含む培地、又は、表皮角化細胞用培地と線維芽細胞用培地とを含む培地を用いることができる。
　本第１実施形態の製造方法における好適な態様として、三次元構造物を製造する際に、前記線維芽細胞塊と、播種した表皮角化細胞とを培養する際に、表皮角化細胞用培地と線維芽細胞用培地とを含む培地を使用することである。
　本第２実施形態の製造方法における好適な態様として、三次元構造物を製造する際に、前記球状マイクロキャリアと、播種した表皮角化細胞とを培養する際に、表皮角化細胞用培地とを含む培地を使用することである。
　本実施形態の製造方法における好適な態様として、三次元構造物を製造する際に、前記表皮角化細胞を播種した後の培養期間を６～２２日間とすることである。このようなことから、三次元構造物を評価に用いるための可能培養期間は、前記表皮角化細胞を播種した後の培養期間を６日間以上とすることが好ましい。
　また、本実施形態の製造における好適な態様として、三次元構造物を製造する際に、マイクロ球状物の大きさを１としたときに、三次元構造物の大きさが、１．０５以上１．５以下になるように培養することが好ましく、光学顕微鏡観察などにて大きさを確認しながら培養することができる。
　また、本第１実施形態の製造方法における好適な態様として、三次元構造物を製造する際に、前記線維芽細胞と前記表皮角化細胞の播種数比率が、好ましくは１：４以上、より好ましくは１：４～８：１とすることである。
　また、本実施形態の別の好適な態様として、本実施形態に係る三次元構造物又は本実施形態の製造方法にて得られた三次元構造物を用いる、試験方法又は皮膚恒常性維持機能の評価方法を提供できる。また、本実施形態の別の好適な態様として、皮膚恒常性維持機能の評価方法に、上述した本実施形態の製造方法を含めてもよく、好適な一例としては、本実施形態に係る三次元構造物の製造方法を行うこと、製造された三次元構造物を用いて試験（好適には皮膚恒常性維持機能の評価）を行うこと、を含む、皮膚恒常性維持機能の評価方法を提供してもよい。
　本実施形態の製造方法にて、中心部にマイクロ球状物（好適には線維芽細胞塊又はマイクロキャリア）を含み、表層部に表皮角化細胞及びタイトジャンクションを含む、コアシェル構造の三次元構造物を得ることができ、より好適な態様として、上記「１．」のような本実施形態に係るコアシェル構造の三次元構造物を得ることができる。当該三次元構造物は、表面の細胞層の細胞間に存在する複数のタイトジャンクションと、複数の表皮角化細胞とで少なくとも構成されている細胞層と、複数の線維芽細胞で少なくとも構成されている中心部のマイクロ球状物（好適には線維芽細胞塊又はマイクロキャリア）と、を含む、コアシェル構造の三次元構造物であることが好ましく、さらに好ましくは、未分化の細胞層及び分化後の細胞層を含む表皮角化細胞層をシェル部分として含む、コアシェル構造の三次元構造物である。
　＜本実施形態に係る三次元構造物の製造方法の好適な製造例＞
　以下に、本実施形態の製造例の一例を示すが、本実施形態に係る三次元構造物の製造方法は、これに限定されない。
　本実施形態に係るコアシェル構造の三次元構造物の製造方法は、マイクロ球状物（好適には、線維芽細胞塊、マイクロキャリア）に表皮角化細胞を被覆させることを含むことが好ましい。
　本実施形態の方法における好適な製造例として、（ａ）マイクロ球状物を、すり鉢状凹部を有するウェルに配置し、所定の培地にて所定期間培養を行い、前処理すること、及び、（ｂ）マイクロ球状物が存在するすり鉢状凹部を有するウェルに、表皮角化細胞を播種し、共培養培地又は表皮角化細胞用培地にて培養を行い、コアシェル構造の三次元構造物を調製すること、を含むことが好ましい。当該マイクロ球状物は、線維芽細胞塊又はマイクロキャリアであることが好ましい。また、マイクロ球状物が非細胞系である場合には、前記（ａ）の前処理において、所定期間の培養を行わなくともよい。
　また、本第１実施形態に係るコアシェル構造の三次元構造物の製造方法は、線維芽細胞塊を調製すること、及び、調製された線維芽細胞塊に表皮角化細胞を被覆させることを含むことが、好ましい。
　本第１実施形態の方法における好適な製造例として、播種した線維芽細胞から得られた線維芽細胞塊に、表皮角化細胞を被覆させること、を含むことが好ましい。
　本実施形態の方法におけるより好適な製造例として、（ａ）線維芽細胞を、すり鉢状凹部を有するウェルに播種し、線維芽細胞用培地にて培養を行い、線維芽細胞塊を調製すること、及び、（ｂ）調製された線維芽細胞塊が存在するすり鉢状凹部を有するウェルに、表皮角化細胞を播種し、共培養培地にて培養を行い、コアシェル構造の三次元構造物を調製すること、を含むことが好ましい。
　本第１実施形態の方法におけるより好適な製造例として、前記（ａ）及び／前記（ｂ）の調製を行う前に、播種するための線維芽細胞数及び／又は表皮角化細胞数を調整することをさらに含むことが好ましく、前処理としての播種のための細胞を増殖させることを含むことがより好ましい。これにより、所望の播種数、線維芽細胞の播種数と表皮角化細胞の播種数との使用割合等になるように、必要に応じて所望の細胞及び播種細胞数を得ることができる。
　＜ａ．播種するための細胞及び細胞数の調整＞
　本実施形態の方法において播種する細胞は、公知の細胞培養方法にて培養を行い、所望の細胞及び播種数を取得又は回収することができる。例えば、播種した細胞を、所定の培養条件下で培養し、培養後に増殖した細胞を回収し、その細胞数を調整して所望の播種数の細胞懸濁液を調製することなどが挙げられる。より具体的な例として、細胞を、単数又は複数の細胞培養器材に播種し、所定の培養条件下で培養し、２～７日程度培養後に、適宜ＰＢＳ（－）にて洗浄後、剥離剤で細胞培養器材から剥離し、遠心及び上清の除去後、剥離した細胞を、培養液等に添加し、細胞懸濁液を得ることができる。所望の播種数の細胞懸濁液は、遠心及び上清除去後の培養液等の溶液添加量調整等により得ることができる。
　表皮角化細胞を増殖させる場合には、一般的な表皮角化細胞の培養方法（例えば、３７℃、５％ＣＯ２、表皮角化細胞用培地等）に従って行うことができる。コート剤としてはコラーゲン又はラミニン又はそれらの断片が好ましく、細胞剥離剤としてはトリプシン又はトリプシン様酵素が好ましい。
　線維芽細胞を増殖させる場合には、一般的な線維芽細胞の培養方法（例えば、３７℃、５％ＣＯ２、線維芽細胞用培地等）に従って行うことができる。
　これにより、コアの作製に使用する細胞及び／又はシェルの作製に使用する細胞を、得る又は準備することができる。本実施形態における播種細胞数の調整工程で用いる細胞培養器材は、一般的に増殖培養のときに用いているものが好ましく、例えば、播種細胞数の調整工程などの工程において、播種などが行われる凹部は、シャーレ等のような底部がフラット状の凹部が好ましく、及び／又は、培養基質（コート剤）が処理されたものが好ましい。
　培養日数は特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上、さらに好ましくは３日以上であり、また、この好適な上限値として、好ましくは７日以下、より好ましくは６日以下、さらに好ましくは５日以下である。
　細胞数のカウントは、細胞培養において一般的に用いられている方法を採用することができ、例えば、自動セルカウント（例えば、画像データによるセルカウンター、コールターカウンター、フローサイトメーター等）、マニュアルセルカウントなどが挙げられるが、コールターカウンターによるセルカウンターが好ましい。マニュアルセルカウントは、光学顕微鏡と血球計算盤を用いて、細胞濃度（Cells/mL）＝（〔１区画当たりの平均細胞数）×希釈倍率〕／１区画当たりの液量（ｍL））で計算できる。
　＜培養条件＞
　本実施形態の方法における「所定の培養条件下」は、特に限定されないが、培養温度及び雰囲気条件は、特に限定されないが、一般的な培養条件が好ましい。培養温度は、一般的な培養温度が好ましく、好ましくは３６～３８℃、より好ましくは３６．５～３７．５℃である。培養雰囲気は、一般的な雰囲気が好ましく、好ましくは４～６％ＣＯ２下、より好ましくは４．５～５．５％ＣＯ２下である。より好適な培養条件としては、好ましくは３６．５～３７．５℃で４．５～５．５％ＣＯ２下であり、より好ましくは３７℃で５％ＣＯ２（５％炭酸ガス９５％空気の雰囲気）下である。当該「所定の培養条件下」は、上述した＜ａ．播種するための細胞数の調整＞、後述する＜ｂ．線維芽細胞塊の調製＞、＜ｃ．細胞塊への表皮角化細胞の被覆＞における「所定の培養条件下」として採用できる。
　＜培養培地＞
　本実施形態に用いる培地は、特に限定されないが、培養する細胞に応じてその細胞用の培地を用いることができ、例えば、線維芽細胞用培地、及び、表皮角化細胞用培地などが挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　線維芽細胞用培地は、公知の製造方法にて得られた培地又は市販品（例えば、線維芽細胞用培地（タカラバイオ）、HFDM-1 Medium (細胞科学研究所)、Ｆｉｂｒｏｌｉｆｅ　Ｓ２　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社)など）から選択される１種又は２種以上を用いることができる。より具体的には、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）が好ましく、さらに好ましくは、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）とＨａｍ’ｓ Ｆ－１２培地を１：１で混合した ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地である。
　表皮角化細胞用培地は、公知の製造方法にて得られた培地又は市販品（例えば、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）、ＭＣＤＢ１５３培地（コスモ・株式会社）、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）など）から選択される１種又は２種以上を用いることができる。また、三次元構造物を作成する際には、表皮角化細胞３Ｄ－分化用培地（動物又は人間由来成分が含まれない三次元表皮角化細胞モデル用培地）を用いることが好ましい。なお、表皮角化細胞用培地の特徴的な培地成分は、例えば、ckDME-Ham培地が挙げられ、例えば、アデニンが２４．３ｍｇ／Ｌ、インスリンが５ｍｇ／Ｌ、ＥＧＦが０．０１ｍｇ／Ｌなどを含むものが挙げられる（非特許文献３（参考文献）：Sergio Cortez Ghio et al.,Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(8), 2174;https://doi.org/10.3390/ijms19082174）。
　播種するために線維芽細胞を増殖させる場合には、線維芽細胞用培地を用いることが好ましく、播種するために表皮角化細胞を増殖させる場合には、表皮角化細胞用培地を用いることが好ましい。
　なお、＜ａ．播種するための細胞及び細胞数の調整＞内の以降においても、同様の目的にて培地を選択してもよい。また、後述する＜ｂ．線維芽細胞塊の調製＞においても、線維芽細胞用培地を用いてもよい。後述する＜ｃ．マイクロ球状物への表皮角化細胞の被覆＞及び＜ｄ．皮膚恒常性維持機能評価＞においては、後述するように少なくとも表皮角化細胞用培地を含む培地（例えば、表皮角化細胞用培地、共培養培地）を用いることが好ましい。共培養培地としては、例えば、表皮角化細胞培養用のうち、例えば、CnT-PR-3Dを、線維芽細胞培養用のうち、例えばDMEM/F12 (supplemented with 1mM CaCl2 and 5% FBS)を併用した混合培養培地を用いてもよい。
　＜播種に使用する細胞（線維芽細胞、表皮角化細胞）＞
　本実施形態の方法で播種に使用する表皮角化細胞及び線維芽細胞としては、特に限定されず、例えば、正常細胞（例えば、正常表皮角化細胞、正常線維芽細胞等）、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞（例えば、表皮角化細胞、線維芽細胞等）等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上である。多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を三次元構造物の製造に使用することで、正常細胞を使用する場合よりも、より長い期間での皮膚恒常性維持機能の評価又は試験を行うことができるという利点がある。これら細胞は、哺乳動物由来が好ましく、当該哺乳動物としては、特に限定されず、好ましくは、ヒト由来である。
　また、共培養を行う前に、播種する線維芽細胞数を増やすための前培養としては、一般的な線維芽細胞の増殖方法を用いることが好ましく、より好ましくは、線維芽細胞用培地を用いて培養を行うことである。また、共培養を行う前に、播種する表皮角化細胞数を増やすための前培養としては、一般的な表皮角化細胞の増殖方法を用いることが好ましく、より好ましくは、表皮角化細胞用培地を用い培養を行うことである。
　＜播種に使用する正常細胞＞
　本実施形態の方法に用いる播種に使用する正常細胞としては、正常線維芽細胞及び／又は正常表皮角化細胞が好ましい。
　正常皮膚線維芽細胞としては、特に限定されず、公知の製造方法又は市販品にて得ることができ、例えば、新生児包皮皮膚線維芽細胞、成人皮膚線維芽細胞、成人口腔線維芽細胞などが挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　また、正常表皮角化細胞としては、特に限定されず、公知の製造方法又は市販品にて得ることができ、例えば、ヒト由来の場合には、例えば、新生児包皮表皮角化細胞、正常ヒト小児表皮角化細胞、正常ヒト成人表皮角化細胞などが挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　＜播種に使用する多能性幹細胞由来の分化誘導細胞＞
　また、多能性幹細胞由来の細胞としては、多能性幹細胞由来の表皮角化細胞、多能性幹細胞由来の線維芽細胞が好ましい。多能性幹細胞を製造する際に、その対象動物の体細胞を用いることで、その対象動物特有の皮膚の恒常性維持や皮膚の物性などを評価したり、その対象動物により適合した皮膚外用剤や医薬品などを提供できる。
　＜多能性幹細胞＞
　本実施形態に用いる多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ増殖能を併せ持つ幹細胞であり、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植によるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、皮膚や骨髄や脂肪等を由来とする体性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞や間葉系幹細胞等）等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。これら細胞は、公知の製造方法にて製造したり、市場や公的機関等から取得したりすることができる。当該細胞は、好適には哺乳動物の細胞、特にヒト細胞を由来にすることが好適である。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウス等の哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された幹細胞である。精子幹細胞は、精子由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される細胞である。
　人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、公知の製造方法にて製造することができ、また、市販品又はオーダーメイド品を購入することもできる（例えば、特許文献３（参考文献）：特開２０２３－０１８６３２号公報の段落〔００２１〕～〔００２７〕等参照）。
　前記多能性幹細胞は、ＥＳ細胞及び／又はｉＰＳ細胞が好適であり、より好適にはｉＰＳ細胞である。当該ｉＰＳ細胞は、哺乳動物（好適にはヒト）の細胞を由来とするものが好適である。通常、ｉＰＳ細胞の作製に用いる細胞は、特に限定されず、体細胞由来のｉＰＳ細胞が好適である。
　本実施形態では、ｉＰＳ細胞の作製に用いる体細胞としては、分化細胞が好適であり、当該分化細胞のうち、皮膚系の細胞が好適であり、このうち、表皮角化細胞（「角化細胞」、「皮膚角化細胞」又は「ケラチノサイト」ともいう。）や皮膚線維芽細胞（「線維芽細胞」、「ファイブロブラスト」）がより好適である。さらに、本実施形態において、体細胞の表皮角化細胞や皮膚線維芽細胞を用いて作製されたｉＰＳ細胞が、皮膚恒常性維持機能評価の観点から、好適である。なお、表皮角化細胞および皮膚線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞は、公知の表皮角化細胞由来のｉＰＳ細胞の製造方法を用いて、得ることができる（例えば、非特許文献４（参考文献）：Okita K. et.al., Nature Methods, 2011,8:409-12.）。
　なお、本実施形態に用いる体細胞は、卵子、卵母細胞、精子等の生殖系細胞又はＥＳ細胞等の分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好適には、ヒトを含む哺乳動物の動物細胞）をいう。体細胞は、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、及び成熟した健全な若しくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代培養、及び株化細胞のいずれも包含される。
　体細胞として、より具体的な例として、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、表皮角化細胞、毛細胞、幹細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞、脳細胞、胚細胞、腎細胞、及び脂肪細胞等の分化した細胞；等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。この体細胞のうち、多能性幹細胞由来の細胞を分化誘導させて得る細胞と同じ、線維芽細胞及び／又は表皮角化細胞を用いることが好ましい。
　＜ｂ．マイクロ球状物の調製＞
　本実施形態の方法におけるマイクロ球状物の調製工程としては、特に限定されず、公知の方法などを参照して調製することができ、適宜市販品を入手し、使用することもできる。
　マイクロ球状物が細胞塊である場合には、下記の＜ｂ－１．線維芽細胞塊の調製＞を参考にして細胞塊を調製してもよく、細胞塊のうち、線維芽細胞塊が好ましい。
　また、マイクロ球状物がマイクロキャリア（好適には、球状マイクロキャリア）である場合には、上述した＜三次元構造物の中心部＞＜マイクロキャリア＞に記載のマイクロキャリアが挙げられ、これらから１種又は２種以上を用いることができる。
　また、マイクロキャリアへの細胞外マトリックス成分のコーティング調製方法として、公知のコーティング方法を適宜採用することができる。コラーゲンコート方法の１例として、例えば、樹脂製の培養デュッシュへのコラーゲンコート方法を参考にすることができ、所定のコラーゲン濃度（例えば０．０１％、０．０５％、０．１％）にて、マイクロキャリアを、室温（２０～３７℃程度）、コーティング時間（添加直後に除去又は０．２５ｈ～１．５ｈ又は１０～１４ｈ程度）にて、コーティング処理を行う。必要に応じて、希塩酸（０．０１Ｎ）又は酢酸溶液（５ｍＭ）の希釈溶媒を用いてもよく、コーティング後の洗浄液として滅菌水又はＰＢＳを用いて単数又は複数回（２～５回）洗浄してもよい。また、コラーゲンの型は、特に限定されず、例えば１型、４型などを用いることができる。
　＜ｂ－１．線維芽細胞塊の調製＞
　本実施形態の方法における線維芽細胞塊の調製工程としては、播種した複数の線維芽細胞を、細胞培養器材に存在させて、所定の培養条件下にて、培養することが好ましい。線維芽細胞塊（スフェロイド）の調製には、すり鉢状凹部の底部が単数又は複数ある細胞培養器材を用いることが好ましい、及び／又は、細胞接着抑制処理が施されている凹部を有する細胞培養器材を用いることが好ましい。細胞培養器材に播種する細胞数は、特に限定されないが、好ましくは１×１０２～１×１０５である。一般的に、スフェロイドとは、細胞同士が集合・凝集化した略球状の細胞集合体のことをいう。
　また、線維芽細胞塊の調製工程において使用する培地としては、線維芽細胞用培地を用いることが好ましい。
　線維芽細胞塊の調製工程において使用する培地としては、線維芽細胞及び培養液を含む細胞懸濁液に調製後、当該細胞懸濁液を播種することが、より好ましい。播種する線維芽細胞は、公知の培養方法によって、線維芽細胞を増殖培養し回収し、所望の播種数に調整することが好ましい。
　線維芽細胞塊の調製工程における培養期間は、特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは０．５日以上、より好ましくは１日以上であり、また、この好適な上限値としては、好ましくは７日以下、より好ましくは４日以下、さらに好ましくは２日以下である。
　さらに、線維芽細胞塊の調製工程において細胞の播種後に細胞塊を得るまでの培養日数は特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは０．２５日以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、この好適な上限値として、好ましくは２日以下、より好ましくは１日以下である。
　＜ｃ．マイクロ球状物への表皮角化細胞の被覆＞
　本実施形態の方法におけるマイクロ球状物（好適には、球状マイクロキャリア又は線維芽細胞塊）への表皮角化細胞の被覆工程としては、単数又は複数のマイクロ球状物（好適には１つ）と、播種した複数の表皮角化細胞とを、細胞培養器材に存在させて、所定の培養条件下にて、培養することが好ましい。当該被覆工程で使用する細胞培養器材としては、上述した＜ａ．＞＜ｂ．＞で使用した器材を引続き使用してもよく、又は、上述した＜ａ．＞＜ｂ．＞で使用した器材と同等の器材を用いてもよい。これにより、マイクロ球状物に表皮角化細胞が被覆された三次元構造物又はスフェロイドを得ることができる。より好適な三次元構造物としては、マイクロ球状物（好適には、球状マイクロキャリア又は線維芽細胞塊）をコアとし、表皮角化細胞をシェルとする、コアシェル構造の三次元構造物又はスフェロイドである。一般的に、スフェロイドとは、細胞同士が集合・凝集化した球状の細胞集合体のことをいう。
　被覆に用いる際のマイクロ球状物（好適には、球状マイクロキャリア又は線維芽細胞塊）の大きさ（長径又は直径）は、特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは５０μｍ以上、１００μｍ以上、１５０μｍ以上、２００μｍ以上、２４０μｍ以上、又は３２０μｍ以上であり、また、この好適な上限値として、好ましくは５６０μｍ以下、より好ましくは４８０μｍ以下であり、より好適な数値範囲としては、好ましくは２４０～５６０μｍ、より好ましくは３２０～４８０μｍである。球状マイクロキャリアの場合は、例えば５０～１，０００μｍであり、好適な上限値としては好ましくは３００μｍ以下又は２５０μｍ以下であり、１００μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、１２０μｍ以上２５０μｍ以下がより好ましく、１５０μｍ又は２００μｍ以上２５０μｍ以下であることがさらに好ましい。なお、得られる三次元構造物、細胞層、中心部等の大きさは、上記「２．本実施形態に係る三次元構造物」で説明した大きさを適宜採用し、その大きさになるように調製できる。
　表皮角化細胞が被覆された三次元構造物の調製には、底部がすり鉢状である凹部が単数又は複数ある細胞培養器材を用いることが好ましい、及び／又は、細胞接着抑制処理が施されている凹部を有する細胞培養器材を用いることが好ましい。細胞培養器材に播種する表皮角化細胞数は、特に限定されないが、好ましくは５×１０２～５×１０４である。
　また、表皮角化細胞が被覆された三次元構造物の調製工程において使用する培地としては、好ましくは表皮角化細胞用培地を含む培地、より好ましくは表皮角化細胞用培地又は共培養培地のいずれかであり、当該共培養培地として、線維芽細胞用培地及び表皮角化細胞用培地の混合培地が好ましい。非細胞系のマイクロキャリアをコアとする場合には、表皮角化細胞用培地を使用してもよく、線維芽細胞塊をコアとする場合には、共培養培地が好ましい。このとき用いる表皮角化細胞は、多能性幹細胞から分化誘導された多能性幹細胞由来の表皮角化細胞が好ましく、より好ましくはｉＰＳ細胞から分化誘導されたｉＰＳ細胞由来の表皮角化細胞である。
　また、本実施形態の三次元構造物を得る培養期間としては、得られた三次元構造物が評価等に使用できるようにするために、表皮角化細胞を播種後、２又は３日以上共培養することが好ましく、より好ましくは６日以上であり、また、この好適な上限値は特に限定されないが、培養可能期間との観点から、好ましくは１４日以下、より好ましくは１０日以下であり、概ね６日程度でもよい。これによりマイクロ球状物を表皮角化細胞が被覆したコアシェル構造の三次元構造物を得ることができる。当該三次元構造物を得る培養期間は、三次元構造物の製造期間であってもよく、下記の培養可能期間の説明を適宜採用してもよい。三次元構造物の調製工程における培養期間では、後述する「３．本実施形態に係る三次元構造物を用いる、皮膚恒常性維持機能評価方法」を、「ｄ．皮膚恒常性維持機能評価工程」として、行ってもよい。
　本実施形態の三次元構造物の培養期間又は培養可能期間は、特に限定されないが、表皮角化細胞を播種した後の培養期間として、この好適な下限値としては、好ましくは４日間以上、より好ましくは５日間以上、さらに好ましくは６日間以上、また、この好適な上限値としては、特に制限はなく、培養条件を調整することで上限値を調整することも可能であるが、例えば、４０、３８、３５、３４、３３、３２、３１、３０、又は２９日間が挙げられ、好ましくは３５日間以下、より好ましくは２８日間以下、さらに好ましくは２２日間以下である。当該好適な数値の範囲としては、好ましくは４～３５日間、より好ましくは６～２２日間である。なお、三次元構造物の培養は、１日毎に、表皮角化細胞用培地共培養培地で、培地交換することが好ましい。
　さらに好適な態様としては、マイクロ球状物を含む細胞培養器材に、複数の表皮角化細胞を播種して培養する。そして、マイクロ球状物への表皮角化細胞の被覆には、すり鉢状凹部の底部が単数又は複数ある細胞培養器材を用いることが好ましい、及び／又は、細胞接着抑制処理が施されている凹部を有する細胞培養器材を用いることが好ましい。
　表皮角化細胞を播種する前の細胞培養器材には、表皮角化細胞用培地を含む培地（例えば、表皮角化細胞用培地、共培養培地）が含まれていてもよいし、細胞塊を調製後に細胞培養機材から培地を除去し、播種する表皮角化細胞を含む細胞懸濁液の液を培地としてもよく、当該液は、表皮角化細胞用培地又は共培養培地が好ましい。マイクロ球状物が、マイクロキャリアの場合には、表皮角化細胞用培地又は共培養培地が好ましく、線維芽細胞塊の場合には、好ましくは、線維芽細胞用培地及び表皮角化細胞用培地を含む混合培地（以下、「共培養用混合培地」ともいう）である。
　表皮角化細胞を被覆する際の線維芽細胞塊は、上述した＜ｂ－１．線維芽細胞塊の調製＞にて得られた線維芽細胞塊がより好ましく、より好適な態様としては、播種した線維芽細胞から調製された線維芽細胞塊である。線維芽細胞及び培養液を含む細胞懸濁液に調製後、当該細胞懸濁液を播種することが、より好ましい。播種する線維芽細胞は、公知の培養方法によって、線維芽細胞を増殖培養し回収し、所望の播種数に調整することが好ましい。
　表皮角化細胞を被覆する際のマイクロキャリアは、上述した＜マイクロキャリア＞に記載のマイクロキャリアが好ましく、ＰＶＡマイクロキャリアがより好ましく、より好適な態様としては、細胞外マトリックス成分にてコートされた細胞外マトリックス成分のコートマイクロキャリア（好適にはＰＶＡマイクロキャリア）が好ましく、細胞外マトリックス成分は、コラーゲンであることが好ましく、当該コラーゲンとして１型、４型などが挙げられる。
　＜共培養培地＞
　マイクロ球状物を表皮角化細胞で被覆した三次元構造物を調製する際に、培地は特に限定されず、例えば単一培地又は単一培地を混合させた混合培地であってもよく、共培養培地が好ましく、この共培養培地は、線維芽細胞と表皮角化細胞とを共に培養できるように各種成分が含まれている培地が好ましい。例えば、共培養培地は、線維芽細胞用培地及び表皮角化細胞用培地を混合して調製でき、より好ましくは、線維芽細胞用培地及び表皮角化細胞用培地を含む混合培地である。また、共培養培地を、線維芽細胞と表皮角化細胞とを共培養する際に、及び／又は、線維芽細胞塊と表皮角化細胞とを共培養する際に用いることが好ましい。
　本実施形態に用いる共培養培地は、線維芽細胞及び表皮角化細胞が増殖可能な培地組成成分を、組成成分として用いることができ、これらの市販品又は含有成分を用いて共培養培地の組成成分を調製してもよい。
　より好適な共培養培地は、動物又は人間由来成分の濃度及び／又はカルシウム濃度を調整することが好ましい。共培養培地中のカルシウム塩化物（好適にはＣａＣｌ２）の濃度は、好ましくは０．８～４ｍＭ、より好ましくは０．９～３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０～２.０ｍＭである。
　本実施形態に用いる共培養用混合培地における表皮角化細胞用培地及び線維芽細胞用培地の混合割合は、特に限定されないが、好ましくは４：１～１：４、より好ましくは３：１～１：３、さらに好ましくは２：１～１：２、より好ましくは１：１である。
　コアに細胞塊が存在する本第１実施形態の場合には、共培養用混合培地における表皮角化細胞用培地及び線維芽細胞用培地の混合割合は、上述した混合割合の上限値及び下限値を適宜採用して組み合わせてもよいが、好適な範囲として、より好ましくは３：１～１：３、さらに好ましくは２：１～１：２、よりさらに好ましくは１：１である。。
　コアにマイクロキャリアが存在する本第２実施形態の場合には、共培養用混合培地における表皮角化細胞用培地及び線維芽細胞用培地の混合割合は、上述した混合割合の上限値及び下限値を適宜採用して組み合わせてもよいが、好適な範囲として、より好ましくは３：１～１：３、さらに好ましくは２：１～１：２、よりさらに好ましくは１：１である。
なお、本第２実施形態の場合には、線維芽細胞用培地を用いず表皮角化細胞用培地１００％を用いてもよく、表皮角化細胞用培地及び線維芽細胞用培地の混合割合は、表皮角化細胞用培地及び線維芽細胞用培地の合計量１００％としたときに、表皮角化細胞培地が９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上であってもよい。
　共培養培地、場合よっては表皮角化細胞用培地を用いることにより、マイクロ球状物（好適には線維芽細胞塊、マイクロキャリア）の周囲に表皮角化細胞が覆い、表皮角化細胞の増殖能・分化能を有し、皮膚バリア機能を有する三次元構造物を得ることができる。また、共培養培地、場合よっては表皮角化細胞用培地を、三次元構造物を用いての皮膚恒常性維持機能評価のときに用いることもでき、さらに、三次元構造物の培養期間（評価可能期間）をより長くすることもできる。
　＜線維芽細胞と表皮角化細胞と各播種数＞
　本実施形態に用いる線維芽細胞及び表皮角化細胞の各播種数は、特に限定されない。
　前記＜ｂ．線維芽細胞塊の調製＞において細胞培養器材に播種する線維芽細胞数は、特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは１×１０２以上、より好ましくは５×１０２以上、さらに好ましくは１×１０３以上であり、また、この好適な上限値としては、好ましくは１×１０５以下、より好ましくは５×１０４以下、さらに好ましくは２×１０４以下であり、よりさらに好ましくは１×１０４であり、当該好適な数値範囲としては、好ましくは１×１０３～１×１０４である。
　前記線維芽細胞塊への表皮角化細胞の被覆工程において、細胞培養器材に播種する表皮角化細胞数は、特に限定されないが、この好適な下限値として、好ましくは５×１０２以上、より好ましくは１×１０３以上であり、また、この好適な上限値としては、好ましくは５×１０４以下、より好ましくは２×１０４以下、さらに好ましくは１×１０４以下であり、当該好適な数値範囲としては、好ましくは１×１０３～１×１０４である。
　本実施形態に用いる線維芽細胞数及び表皮角化細胞数の含有割合（線維芽細胞数／表皮角化細胞数）は、特に限定されないが、この好適な下限値としては、表皮角化細胞層における適切なタイトジャンクション形成の観点から、好ましくは１／４以上、より好ましくは１／２以上、さらに好ましくは１以上、より好ましくは４以上、より好ましくは８以上であり、また、この好適な上限値としては、特に限定されないが、線維芽細胞塊全域の表皮角化細胞による被覆の観点から、例えば、１０以下が挙げられ、好ましくは９以下、より好ましくは８以下である。なお、＜線維芽細胞と表皮角化細胞と各播種数＞については、上述した＜三次元構造物の形状、大きさ等＞で説明した「線維芽細胞数及び表皮角化細胞数の含有割合（線維芽細胞数/表皮角化細胞数）」の構成を適宜採用してもよい。
　なお、線維芽細胞の播種数は、線維芽細胞塊を調製する際に、細胞培養器材の１ウェルに播種する線維芽細胞数であることが好ましく、表皮角化細胞の播種数は、調製された線維芽細胞塊に表皮角化細胞を被覆させる際に、細胞培養器材の１ウェルに播種する表皮角化細胞数であることが好ましい。
　＜ｄ．皮膚恒常性維持機能評価＞
　上記＜ｃ．線維芽細胞塊への表皮角化細胞の被覆＞工程において、本実施形態に係るコアシェル構造の三次元構造物を得た後に、後述する「３．本実施形態に係る三次元構造物を用いる、皮膚恒常性維持機能評価方法」を、＜ｄ．皮膚恒常性維持機能評価＞工程を含めて行ってもよいし、上記＜ｃ．＞後に＜ｄ．＞を引き続き行ってもよい。これにより、皮膚恒常性機能作用を有する物質を探索又は選定でき、より好適には個人に適した皮膚恒常性に関する物質を探索又は選定できる。なお、＜ｄ.皮膚恒常性維持機能評価＞は、後述する「３．本実施形態に係る三次元構造物を用いる、皮膚恒常性維持機能評価方法」にて詳述し、この説明内容を適宜採用することができる。
　＜その他＞
　＜細胞培養器材＞
　本実施形態の方法に用いる細胞培養器材は、特に限定されないが、通常、細胞培養に用いることができる細胞培養器材が好ましく、例えば、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、ボトル、プレート、チューブ、遠沈管等が挙げられるが、これらに限定されず、また、ディスポ製品が好適である。当該器材の材質としては、例えば、ガラス製、プラスチック樹脂製（好適にはポリスチレン樹脂製）などが挙げられるが、これらに限定されない。これら例示から選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　細胞培養器材の材質（製）は、特に限定されないが、スチレン系樹脂（ポリスチレン又はスチレン共重合体等）、ポリカーボネート、ポリオレフィン系樹脂（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、エチレン共重合体等）、（メタ）アクリル系樹脂、シリコーン樹脂、アミノ樹脂、フッ素樹脂、及びポリイミド樹脂等の合成樹脂（好適にはプラスチック）、ガラス基材から選択される１種又は２種以上が好適である。このうち、プラスチック（より好適には、スチレン系樹脂、ポリオレフィン系樹脂（ポリエチレン、ポリプロピレン）、スチレン系樹脂、ポリカーボネート）が好ましく、さらにこのうちスチレン系樹脂（より好適にはポリスチレン）がより好ましい。
　本実施形態の方法は、上述したように、三次元構造物、細胞塊又はスフェロイドのような略球状物を製造する工程では、播種した複数の細胞を、すり鉢状凹部の細胞接着抑制処理表面（より好適には親水化表面）上で培養することが好ましい。また、細胞数を増やすような増殖工程では、シャーレ等のような平面状凹部の培養基質処理表面上で培養することが好ましい。
　略球状物の製造において、前記すり鉢状凹部の底部が、当該凹部の底部の中心領域に複数の細胞が集合しうる形状であることが好ましい。当該凹部の底部が、Ｖ字状又はＵ字状であることが、より好ましく、Ｖ字状又はＵ字状の窪み（略円錐形状、略円錐台形状等）に播種された細胞が集合しやすくなることで、より良好な略球状細胞塊の形状にすることができ、三次元構造物の核となる線維芽細胞塊を形成しやすくなり、又は、三次元構造物の核を覆うようなシェル部の細胞層が形成しやすくなる利点がある。
　前記略球状物の製造において、細胞を播種する凹部には、細胞接着抑制処理を施すことが好ましく、この表面処理により、凹部の表面に細胞が接着するのを抑制することができ、培養後に三次元構造物を剥離することも容易にできる。当該表面処理により、播種された細胞が凹部の中心領域に集合し細胞同士が接着しやすくなることで、より良好な略球状物（例えば、線維芽細胞塊、コアシェル構造の細胞塊）の形状にすることができる。
　前記細胞接着抑制処理としては、特に限定されないが、例えば親水化の表面処理などが挙げられる。
　前記略球状物の製造において、凹部に親水化の表面処理を施すことがより好ましく、当該親水化として、例えば、プラズマ処理、コロナ放電処理、酸化剤処理、親水物質（好適には、ポリエチレングリコールなどの細胞接着抑制剤など）コーティング処理などが挙げられるが、これらに限定されない。親水物質コーティングとして、高分子ポリマーコーティングなどが挙げられる。これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　＜細胞剥離剤＞
　本実施形態の方法では、細胞剥離剤を用い、当該細胞剥離剤として、一般的に動物細胞培養の際に細胞培養器材と培養細胞とを剥離するために用いる細胞剥離成分又は当該成分を含む剤が好適である。
　細胞剥離に用いる成分としては、トリプシン系プロテアーゼ（トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ等）及びキモトリプシン等のセリンプロテアーゼ；ディスパーゼ等の金属プロテアーゼ；アクチナーゼ等のＣａ依存性プロテアーゼ；中性プロテアーゼ；プロテアーゼ及びコラゲナーゼ活性を有するプロテアーゼ等の酵素剥離系と、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸ナトリウム等の酵素フリー剥離系；ＴｒｙｐＬＥ（商標）等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができるが、これらに特に限定されない。細胞剥離剤として、市販の細胞剥離剤を用いてもよい。また、細胞剥離手段として、物理的な細胞剥離手段を使用してもよく、例えば、セルスクレーパー（コーニング社製）等の培養細胞の剥離器材を使用してもよい。
　前記細胞剥離剤のうち、酵素又は酵素を含むものが好適であり、当該酵素として、さらにプロテアーゼ系酵素が好適であり、よりさらにトリプシン系酵素が好適であり、より好適にはトリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）セレクト酵素等のトリプシン系プロテアーゼ；ＴｒｙｐＬＥ（商標）セレクト酵素；トリプシン様作用を有する組換えタンパク質（より好適には遺伝子組換えの微生物由来トリプシン様プロテアーゼ）である。「トリプシン系酵素」とは、トリプシン及びトリプシン様酵素を含む意味である。
　「トリプシン様」とは、トリプシンと同様又は類似の動態及び切断特性を示すものが好適であり、より好適には、細胞剥離において、プロトコールの変更を行うことなく、トリプシンを直接置き換え可能である。トリプシンの切断特性としては、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン）のカルボキシ基側のペプチド結合を加水分解することができる特性である。
　また、酵素の由来は、動物由来、微生物由来のいずれでもよいが、微生物由来が好適であり、プロテアーゼ又はトリプシンを産生可能なように遺伝子組換えされた遺伝子組換え微生物由来がより好適であり、さらに遺伝子組換え真菌由来がさらに好適である。
　前記細胞剥離剤は、プロテアーゼ、及び／又は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）セレクト酵素を含むものが好適であり、当該プロテアーゼは、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）セレクト酵素から選択される１種又は２種以上を用いることがより好適であり、さらに好適にはトリプシン及び／又はＴｒｙｐＬＥ（商標）セレクト酵素である。また、好適な細胞剥離剤としては、例えば、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥ（商標）セレクト酵素、及び当該ＴｒｙｐＬＥ（商標）セレクト酵素及び０．５～１．５ｍＭＥＤＴＡを含む細胞剥離剤などが挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　なお、細胞剥離剤を用いて接着細胞を細胞培養器材から剥離する処理は、物理的処理を併用することが好適である。物理的処理として、例えば、ピペッティング操作（吸引・噴射等）等による水流発生手段、接着細胞を剥離可能なヘラ状スクレーパー等掻き取り手段等が挙げられるが、水流発生手段（好適には、吸引及び噴射による剥離後の剥離細胞の回収）が、細胞損傷低減の観点から、好適である。
　また、回収した剥離細胞は、遠心分離等の分離手段を行ってもよく、これによりさらに単一細胞を回収して次の細胞培養に用いてもよい。
　＜培養基質（コート剤）＞
　本実施形態の方法では、必要に応じて、培養基質を含むコート剤を用い、当該コート剤を用いて細胞培養器材と細胞とが接する部分を培養基質でコートしてもよい。培養基質は、細胞培養器材の表面に対する細胞の接着性を向上又は改善するものであることが好ましく、当該培養基質により細胞培養器材の表面をコートすることで、細胞培養器材の表面に対する細胞の接着性を向上又は改善することができる。コーティング処理は、培養基質を含む溶液を細胞培養器材に入れた後、当該溶液を適宜除去すること等が挙げられるが、これに特に限定されず、公知のコーティング処理を適宜採用することができる。
　培養基質として、特に限定されないが、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、マトリゲル、フィブリン、トロンビン等の細胞外マトリックス成分；ポリＬ－リシン、ポリＤ－リシン等のアミノ酸ポリマー等及びこれらの断片等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　培養基質のうち、コラーゲン及びその断片、ラミニン及びその断片から選択される１種又は２種以上が好適であり、ラミニン及びその断片がより好適である。ラミニンはヒト由来のものが好適である。ラミニン及びその断片は、インテグリンα６Ｂ１との結合活性が解離定数１０ｎＭ以下を示すものが好適である。コラーゲン又はコラーゲン断片、ラミニン又はラミニン断片は、市販品を用いることが好適である。
　ラミニン断片として、ラミニン５１１をエラスターゼにて消化して得られる断片であるＥ８フラグメント（ラミニン５１１Ｅ８断片又はラミニン５１１Ｅ８ともいう）（非特許文献５（参考文献）：Ido H, et al, J Biol Chem. 2007, 282, 11144-11154）、遺伝子組み換えカイコ繭より発現した組み換えヒトラミニン５１１Ｅ８断片等が挙げられる。
　ラミニン及びその断片のうち、ラミニン断片が好適であり、より好適にはラミニン５１１断片、さらに好適にはラミニン５１１Ｅ８断片であり、さらにヒト由来が好適である。
　＜e.本実施形態の製造方法にて得られたコアシェル構造の三次元構造物＞
　本実施形態の製造方法にて、表面の細胞層の細胞間に存在する複数のタイトジャンクションと、複数の表皮角化細胞とで少なくとも構成されている細胞層と、三次元構造物の中心部である細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物と、を含む、コアシェル構造の三次元構造物を製造することができ、より好ましくは、未分化の細胞層及び分化後の細胞層を含む表皮角化細胞層をシェル部分として含む、コアシェル構造の三次元構造物である。
　そして、得られた三次元構造物は、ＴＪマーカー、増殖マーカー及び、細胞外マトリックス成分マーカー、基底細胞マーカーのこれらにて適切な染色性、適切な局在を確認できるような性質を有することが好ましい。得られた三次元構造物の大きさ（長径又は直径）は、好ましくは３００～７００μｍであり、当該三次元構造物中の線維芽細胞塊の大きさ（長径又は直径）は、好ましくは２４０～５６０μｍであり、当該三次元構造物中の表皮角化細胞を含む細胞層の大きさ（厚み）は、好ましくは６０～１４０μｍである。また、これらの大きさについては、＜三次元構造物の形状、大きさ等＞で説明した構成を適宜採用してもよい。
　また、本実施形態に係る製造方法にて、上記「１．本実施形態に係る三次元構造物」を得ることができる。
　得られた三次元構造物の培養可能期間は、この好適な下限値及び上限値は、上述した「２．本実施形態に係る三次元構造物の製造方法」での説明を適宜採用することができ、当該好適な数値の範囲としては、より好ましくは４～３５日間、さらに好ましくは６～２２日間である。当該培養期間又は培養可能期間の起点は、「表皮角化細胞を播種した後」であることが、より好ましい。なお、三次元構造物の培養は、１日毎に、共培養培地で、培地交換することが好ましい。
　本明細書では、「培養すること」等の「こと」を、「工程」又は「ステップ」としてもよいし、「工程」を「こと」又はステップとしてもよいし、「ステップ」を「こと」又は「工程」としてもよい。また、本実施形態では、「工程」等の「工程」は、「工程を行うように構成されている装置又は部」であってもよく、「装置」は、「機構又は部」であってもよく、「部」は、「機構、装置又はシステム等に備えるための部又は装置」であってもよい。
３．本実施形態に係る三次元構造物を用いる、皮膚恒常性維持機能評価方法
　本実施形態の方法は、本実施形態に係る三次元構造物、又は、本実施形態に係る三次元構造物の製造方法にて得られた三次元構造物を用いて、皮膚恒常性維持機能の評価を行う方法を提供できる。
　本実施形態に係る三次元構造物の評価可能な期間としては、特に限定されないが、線維芽細胞塊に対して表皮角化細胞を播種した後、６～２２日間であることが好ましい。なお、三次元構造物は、線維芽細胞塊に対して表皮角化細胞を播種した後３日程度で形成できる。
　本実施形態の説明において、上述した「２．」「３．」、後述する「４．」等の説明と重複する、表皮角化細胞、マイクロ球状物、球状マイクロキャリア、線維芽細胞、コアシェル構造、多能性幹細胞、細胞培養器材などの各構成や各処理方法などの説明については適宜省略するが、上述した「２．」「３．」後述する「４．」等の説明が、本実施形態にも当てはまり、適宜採用することができる。
　三次元構造物に対して各種の物性的処理又は化学的処理等を与えることにより、従来のモデル（動物皮膚モデル又は三次元皮膚モデル）にはない新たな物性能力（はり、弾力性、シミ、あれなど）や化学処理能（被験物質、酸やアルカリ成分、皮脂等）を見出すことも可能になる。本実施形態では、多能性幹細胞由来の細胞を用いることができるので、対象動物の体細胞を使用することにより、オーダーメイド的な三次元構造物を製造し、物理的、化学的又は生理・生化学的な状態を確認することができる。三次元構造物に対する試験としては、物理的試験（例えば、加減圧調整、振動調整、押圧調整、紫外線や自然光等の光照射等）、生理・生化学的試験（マーカー、蛍光染色等）、及び、化学的試験（被験物質の探索等）から選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　本実施形態に係る三次元構造物に対して、被験物質を用いること又は接触させることで、皮膚に対して影響を与える被験物質の評価又は選定を行うことができる。好適な態様として、三次元構造物を、被験物質の有無の培養培地で、培養することがより好ましい。このとき、被験物質を評価する際に、被験物質の結果を、コントロール（例えば、無添加コントロール、ポジティブコントロール又はネガティブコントロール）の結果と、対比してもよい。被験物質の濃度を調整し、濃度変化（増減、勾配）による皮膚恒常性維持機能評価を行っても良い。
　皮膚恒常性維持機能評価方法において、三次元構造物を用いるため、＜ｃ．マイクロ球状物への表皮角化細胞の被覆＞のときの培養条件を用いることが好ましい。使用する培地としては、好ましくは共培養培地又は表皮角化細胞用培地（好適には共培養培地、場合によっては表皮角化細胞用培地）を用いることであり、１日毎に共培養培地を交換することが好ましい。また、被験物質を含む共培養培地又は表皮角化細胞用培地を用いてもよい。評価期間は、三次元構造物の培養可能期間を採用することが好ましく、例えば、６～２２日間がより好ましく、当該培養可能期間を、三次元構造物の評価可能期間若しくは使用可能期間としてもよい。
　本実施形態の方法における別の側面として、皮膚恒常性維持機能を発揮する物質、若しくは皮膚恒常性維持機能の有効成分、及び／又は皮膚恒常性維持機能剤を提供することを目的とすることも可能である。これにより、皮膚恒常性維持機能に関する技術を提供することができ、具体的に、皮膚恒常性維持作用を有する物質、若しくは皮膚恒常性維持機能の有効成分、及び／又は皮膚恒常性維持機能剤を提供することができる。これにより、皮膚の恒常性維持に対する薬剤を提供することができる。なお、剤は、組成物であってもよい。
　本実施形態の方法における皮膚恒常性維持機能剤の評価及び／又は選択方法によって、選択された物質（以下、「選定物質」ともいう）を、皮膚恒常性維持作用を有する物質として、又は、皮膚恒常性維持機能剤の有効成分として、提供することができる。
　また、当該皮膚恒常性維持機能剤の評価及び／又は選択方法は、本実施形態における皮膚恒常性維持機能剤の評価及び／又は選択の装置又はシステムであってもよい。
　皮膚恒常性維持作用として、例えば、皮膚バリア機能維持作用、皮膚ターンオーバー維持作用、抗炎症作用、抗酸化作用、肌色調節作用などが挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、皮膚バリア機能維持作用による保湿作用、抗炎症作用による肌荒れ予防作用などが挙げられる。これらから１種又は２種以上を選択することができる。　よって、本実施形態の皮膚恒常性維持機能剤の評価及び／又は選択方法によって得られた選定物質は、皮膚恒常性維持機能を有するので、皮膚バリア機能、ターンオーバー、保湿、肌荒れ防止等に対する効果又は影響を確認できる。
　前記選定物質は、特に限定されず、天然由来又は人工由来の何れでもよく、また、単品又は混合物の何れでもよい。また、選定物質は、化合物、微生物又はこの培養物、抽出物、及びこれらの混合物、並びに組成物などから選択される１種又は２種以上であることが好適である。化合物は、無機化合物、有機化合物の何れでもよい。
　より好適な具体的な選定物質として、脂質、ビタミン、カロテノイド等が挙げられ、さらに例えばリン脂質又はその誘導体（例えばＬＰＡ等）も挙げられる。　
　前記選定物質は、皮膚恒常性維持機能剤（好適には皮膚バリア機能の促進剤、保湿やターンオーバーの促進剤）、肌荒れの予防・改善・治療剤等（以下、「皮膚恒常性維持剤等」ともいう）の有効成分として含有させること又は当該皮膚恒常性維持剤等に使用することができる。なお、当該剤は、組成物であってもよい。
　また、前記選定物質は、皮膚恒常性維持剤等を製造するために使用することができる。　また、本実施形態は、皮膚恒常性を維持するための又は皮膚恒常性維持に使用するための、前記選定物質、又はその使用を提供することもできる。
　本実施形態は、前記選定物質を用いる皮膚恒常性維持方法、又は前記選定物質を含む剤を用いる皮膚恒常性維持方法を提供することも可能である。
　＜疾患、症状＞
　前記選定物質は、当該生理活性作用を発揮するため、皮膚恒常性維持機能の低下や日焼け等に起因する疾患又は肌荒れ等の症状に対する予防、改善又は治療の方法に使用することができる。
　肌荒れや日焼け等に起因する疾患又は肌荒れ等の症状として、特に限定されないが、例えば、湿疹、色素沈着、シワ、たるみ、ニキビ、吹き出物、乾燥肌などが挙げられ、これらからなる群から１種又は２種以上を選択することができる。
　また、本実施形態の用途として、例えば、皮膚バリア機能、乾燥肌、シワ、ニキビ等の予防、改善又は治療用等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本実施形態において、「予防」とは、適用対象における症状若しくは疾患の発症の防止若しくは発症の遅延、又は適用対象における症状若しくは疾患の発症の危険性を低下させること等をいう。本技術において、「改善」とは、適用対象における疾患、症状又は状態の好転又は維持；悪化の防止又は遅延；進行の逆転、防止又は遅延をいう。
　本実施形態は、前記選定物質を、例えば、化粧料、皮膚外用剤、医薬部外品、飲食品、飼料等に、使用することができるが、これらに特に限定されない。
　また、前記「皮膚恒常性維持機能剤等」は、例えば、化粧料、皮膚外用剤、医薬部外品、飲食品、飼料等として、使用してもよいが、これらに特に限定されない。
　このうち、化粧料、及び皮膚外用剤、医薬品、及び医薬部外品等が好ましく、皮膚の表皮層及び／又は真皮層に影響を与えるための用途が好ましい。
　本実施形態が、例えば、化粧料、及び皮膚外用剤の場合には、前記選定物質又は皮膚恒常性維持機能剤等を、例えば、乳液、クリーム、化粧水、パック、洗浄料、メーキャップ化粧料、分散液、軟膏、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等の種々の形態の化粧料又は皮膚外用剤に配合することができるが、これらに限定されない。
　本実施形態が、例えば、医薬品、及び医薬部外品の場合には、前記選定物質又は皮膚恒常性維持機能剤等を、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤等の経口剤；外皮用剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤、口腔剤、坐剤等の外用剤；点滴剤、注射剤等の非経口剤に配合することできるが、これらに限定されない。
　前記選定物質又は全分泌調節剤等は、公知の製造方法を利用して製造することができる。前記選定物質は、市販品の物質を用いてもよい。
　前記選定物質の含有量は、特に制限はなく、剤又は組成物の全量中、前記選定物質を、好ましくは０．００１～９９質量％、より好ましくは０．０１～５０質量％、さらに好ましくは０．１～１０質量％程度含有させることができる。
　前記選定物質又は皮膚恒常性維持機能剤等の適用対象は、ヒト、及び非ヒト動物（例えば、ペット、家畜等）等に適用することができる。このうち、ヒト及びペットが好ましく、より好ましくはヒトである。
　前記選定物質又は皮膚恒常性維持機能剤等の使用方法としては、経皮投与、経口投与、注射による投与等の投与；経口摂取；皮膚への塗布等が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記選定物質の使用量又は投与量としては、本発明の効果が得られる量であればよく、特に制限はなく、当該製剤の剤型、適用部位、年齢、性別等に応じて適宜調整するとよい。
　皮膚恒常性維持機能等は、公知の製造方法を利用して製造することができる。また、当該皮膚恒常性維持機能等は、前記選定物質の他に、必要に応じて各種添加剤等の任意成分を併用することができる。
　前記任意成分として、化粧料、皮膚外用剤、医薬品、飲食品、又は飼料等において許容される成分を適宜配合することができ、例えば、賦形剤、着色剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、界面活性剤、保存剤、保湿剤、ｐＨ調整剤等から選択される１種又は２種以上を適宜使用してもよく、これにより所望の剤型を得ることができる。
４．また、本技術は、以下の別の側面、又は、以下の構成もしくは技術的特徴を適宜採用することも可能である。
・〔１〕　表面に存在するタイトジャンクションを有し、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、
　細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物である中心部と、を含む、コアシェル構造の三次元構造物。
　前記細胞層表面の細胞層の細胞間に存在する複数のタイトジャンクションと、複数の表皮角化細胞とで少なくとも構成されていることが好適である。前記細胞層は、分化した表皮角化細胞を含む分化層と、中心方向にある未分化の表皮角化細胞を含む未分化層とから少なくとも構成される層であることが好適である。また、前記タイトジャンクションは、三次元構造物の表面の細胞層に存在する分化した表皮角化細胞の隣り合う細胞間に存在することが好適である。
・〔２〕　前記マイクロ球状物が、マイクロキャリア又は細胞塊である、前記〔１〕に記載の三次元構造物。
・〔３〕　表面に存在するタイトジャンクションを有し、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、
　三次元構造物の中心部が、複数の線維芽細胞で少なくとも構成されている線維芽細胞塊と、を含む、コアシェル構造の三次元構造物。
・〔４〕　表面に存在するタイトジャンクションを有し、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、
　三次元構造物の中心部が、細胞外マトリックス成分を表面に有する球状マイクロキャリアと、を含む、コアシェル構造の三次元構造物。
・〔５〕　前記表皮角化細胞又は前記線維芽細胞が、正常細胞（正常表皮角化細胞、正常線維芽細胞）、並びに、多能性幹細胞由来の表皮角化細胞及び線維芽細胞、から選択される１種又は２種以上である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１つに記載の三次元構造物。
・〔６〕　皮膚恒常性維持機能評価に用いる、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１つに記載の三次元構造物。
・〔７〕マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを共培養する、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法。
　前記マイクロ球状物が、マイクロキャリア又は細胞塊であることが好適であり、これらは略球状であることがより好適である。当該マイクロキャリアは、細胞外マトリックス成分コートマイクロキャリアであることが好適である。当該細胞塊は、複数の線維芽細胞から調製された線維芽細胞塊であることが好適である。
・〔８〕　マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを、細胞培養器材を用いて、共培養する、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法。当該マイクロ球状物は、播種した線維芽細胞から調製された線維芽細胞塊又は細胞外マトリックス成分にて被覆されたマイクロキャリアであることが好適である。
・〔９〕　マイクロ球状物を含む細胞培養器材又は培地に、表皮角化細胞を播種して培養する、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法。使用する細胞をすり鉢状凹部の細胞接着抑制処理表面上で培養することが好適であり、使用する細胞は、線維芽細胞塊及び／又は表皮角化細胞が好適である。また、共培養培地を含むウェルを単数又は複数有する細胞培養器材を用いることが好適である。
・〔１０〕　すり鉢状凹部の細胞接着抑制処理表面上に、マイクロ球状物を配置し、さらに表皮角化細胞を播種してこれらを共培養することを含む、マイクロ球状物を覆う表皮角化細胞層がシェルとして形成され、当該細胞層は、未分化の表皮角化細胞層と、分化後の表皮角化細胞層と、最表層の分化後の表皮角化細胞間に存在する複数のタイトジャンクションとを含むように形成される、コアシェル構造の三次元構造物を製造する方法。
　前記マイクロ球状物は、線維芽細胞を播種して培養して得られた細胞外マトリックス成分を有する細胞塊であってもよく、細胞外マトリックス成分コートのマイクロキャリアであってもよい。
・〔１１〕　前記マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを培養する際に、表皮角化細胞用培地を少なくとも含む培地、又は、表皮角化細胞用培地と線維芽細胞用培地とを含む培地を、使用する、前記〔７〕～〔１０〕のいずれか１つに記載の三次元構造物の製造方法。
・〔１２〕　前記表皮角化細胞を播種した後の培養期間を、好ましくは６日間以上、より好ましくは６～２２日間とする、前記〔７〕～〔１１〕のいずれか１つに記載の三次元構造物の製造方法。当該培養期間は、培養可能期間、試験可能期間、又は評価可能期間であってもよく、このような期間にて、前記〔７〕～〔１１〕のいずれか１つに記載の三次元構造物を用いる、試験や評価等を行ってもよい。
・〔１３〕　前記三次元構造物の大きさが、前記マイクロ球状物の大きさを１としたときに、１．０５以上１．５以下になるように培養する、前記〔７〕～〔１２〕のいずれか１つに記載の三次元構造物の製造方法。
・〔１４〕　前記線維芽細胞と前記表皮角化細胞の播種数比率が、好ましくは１：４以上、より好ましくは１：４～８：１である、前記〔７〕～〔１３〕のいずれか１つに記載の三次元構造物の製造方法。
・〔１５〕　前記表皮角化細胞又は前記線維芽細胞が、正常細胞（正常表皮角化細胞、正常線維芽細胞）、並びに、多能性幹細胞由来の表皮角化細胞及び線維芽細胞、から選択される１種又は２種以上である、前記〔７〕～〔１４〕に記載のいずれか１つに記載の三次元構造物の製造方法。
・〔１６〕　前記播種する表皮角化細胞又は前記播種する線維芽細胞が、正常細胞（正常表皮角化細胞、正常線維芽細胞）、並びに、多能性幹細胞由来の細胞（表皮角化細胞、線維芽細胞）から選択される１種又は２種以上であり、好ましくは多能性幹細胞由来の細胞であり、より好ましくは前記播種する表皮角化細胞が、多能性幹細胞由来の表皮角化細胞（より好適にはｉＰＳ細胞由来の表皮角化細胞）である、前記〔７〕～〔１５〕に記載のいずれか１つに記載の三次元構造物の製造方法。当該ｉＰＳ細胞は、対象動物由来の体細胞に基づいたｉＰＳ細胞であることが、より好適である。
・〔１７〕　前記マイクロキャリアは、有機物、無機物、又はこれらの複合材料由来である、前記〔７〕～〔１６〕に記載のいずれか１つに記載の三次元構造物の製造方法。
　前記マイクロキャリアは、樹脂が好ましく、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、（メタ）アクリル系ポリマー、（メタ）アクリルアミド系ポリマー、シリコーン系ポリマー、エポキシ樹脂から選択される１種又は２種以上が、好ましい。
・〔１８〕　前記マイクロキャリアは、細胞外マトリックス成分コートのマイクロキャリアである、前記〔７〕～〔１７〕に記載のいずれか１つに記載の三次元構造物の製造方法。前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲン（例えば、各１型～１９型）が好ましく、コラーゲン１型、４型がより好ましい。
・〔１９〕　（１）マイクロ球状物（好適にはマイクロキャリア又は線維芽細胞塊）を調製すること、及び／又は、（２）マイクロ球状物と表皮角化細胞に基づきコアシェル構造の三次元構造物を得ること、を含む、三次元構造物の製造方法又は三次元構造物を用いる試験方法。
・〔２０〕　前記（１）及び／又は前記（２）の前に、播種するための細胞を増殖すること、を含む、前記〔１９〕に記載の方法。
・〔２１〕　前記（２）の後に、（３）前記三次元構造物を用いる試験を行うこと、を含む、前記〔１９〕～〔２０〕に記載のいずれか１つに記載の方法。前記試験が、皮膚恒常性維持機能評価のための試験であることが好ましい。
・〔２２〕　前記（３）試験が、前記三次元構造物に対する物理的試験、生理・生化学的試験、及び、化学的試験から選択される１種又は２種以上である、前記〔２１〕に記載の方法。
・〔２３〕　前記三次元構造物に被験物質を接触させ培養すること、及び、接触後に被験物質の機能を判定することを含む、前記〔１９〕～〔２２〕に記載のいずれか１つに記載の方法。
・〔２４〕　前記〔１〕～〔６〕に記載のいずれか１つ記載の三次元構造物、又は、前記〔７〕～〔１８〕に記載のいずれか１つの製造方法にて得られた三次元構造物を用いる、皮膚恒常性維持機能の評価方法。
・〔２５〕　前記〔２４〕に記載の三次元構造物を用いて、皮膚恒常性維持機能（正又は負）を有する物質を評価又は選定する方法。
・〔２６〕　表皮角化細胞用培地を少なくとも含む培地（表皮角化細胞用培地若しくは共培養培地）又は共培養培地を用いる、前記〔２４〕又は前記〔２５〕に記載の方法。前記マイクロ球状物が、マイクロキャリアの場合には、表皮角化細胞用培地を少なくとも含む培地が好ましく、線維芽細胞塊の場合には、共培養培地が好ましい。
・〔２７〕　前記〔２４〕又は前記〔２５〕に記載の方法に用いるための、線維芽細胞用培地及び表皮角化細胞用培地を含む混合物、又は、前記〔２４〕又は前記〔２５〕に記載の方法に用いる培地を製造するための線維芽細胞用培地及び表皮角化細胞用培地の使用。
　以下、実施例等に基づいて本実施形態等をさらに詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例等は、本技術の代表的な実施例等の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
＜＜製造例１［線維芽細胞塊］：コアシェル構造の三次元構造物及びその製造方法＞＞
　以下のようにして、線維芽細胞塊をコアとし、表皮角化細胞をシェルとするコアシェル構造の三次元構造物を製造し（図３参照）、製造例１のコアシェル構造の三次元構造物とした。具体的には、線維芽細胞をウェルに播種し、一定期間培養して線維芽細胞塊のコアを作製したうえで、シェルを形成するための表皮角化細胞を同じウェルに播種し、その後静置培養を行った。
＜三次元構造物のコア調製＞
　三次元構造物のコアとする線維芽細胞塊の製造を、以下のようにして行った。
　〔線維芽細胞の播種数の調整〕
　正常ヒト線維芽細胞NHDF(LIFELINE CELL TECHNOLOGY、型番FC-0001（新生児包皮）)を、37℃、5%CO2の下で、FibroLife S2培地（正常ヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清液体培地(フェノールレッド不含)、FibroLife S2 Comp kit LIFELINE CELL TECHNOLOGY、型番LFC-LL0011)で3日間培養した。培養にはポリスチレン製の組織培養プレート（円柱状のウェル、コート剤：ラミニン５１１Ｅ８断片）を用いた。培養2日目にFibroLife S2培地で培地交換を行った。
〔FibroLife S2 Comp kit （LFB-LM0001及びLFK-LS1038）〕
　LFB-LM0001：FibroLife BM：皮膚線維芽細胞用基礎培地※(フェノールレッド、抗菌剤不含)500mL
　LFK-LS1038：FibroLife S2 LifeFactors：皮膚線維芽細胞増殖用添加剤セット 低血清タイプ（L-グルタミン(7.5 ｍM)、hFGF-B(5ng/mL)、インスリン(5μg/mL)、アスコルビン酸(50μg/mL)、ハイドロコーチゾン（1μg/mL）、FBS(2%V/V)、ゲンタマイシン(30μg/mL)・アンフォテリシンB(15ng/mL)）(kit培地中の最終濃度)
　上記線維芽細胞を３日間培養したものを細胞懸濁液とし、〔線維芽細胞細胞塊の調製〕において、この細胞懸濁液を用いて線維芽細胞を播種し、三次元構造の核となるコアを作製した。
　線維芽細胞をPBS(-) にて洗浄し、TrypLE(TM)  Select Enzyme (Gibco, 型番12563011) を用いて剥離した。
　剥離した細胞を遠心分離機によって分離し、細胞を5% FBS(Sigma-Aldrich)及び1% CaCl2入りのDMEM/F12培地にて1×105 cells/mL になるように懸濁した。
　なお、セルカウントは、コールターカウンター（CDA-1000, シスメックス株式会社）により、カウントした。
　〔線維芽細胞の細胞塊の調製〕
　線維芽細胞の細胞懸濁液（1×105 cells/mL）をV字底の96穴マルチウェルプレートに、100μL/wellで播種し、37℃、5%CO2の下で１日培養した。播種後１日培養を行うことによって、ウェルのV字底の底面に細胞がまとまり、塊を形成した。このようにして、線維芽細胞塊が調製でき、これを三次元構造物のコアとした。
　なお、正常線維芽細胞の播種数は、1ウェル当たり、1×104cellsであった。当該V字底の96穴マルチウェルプレートは、材質：PS（ポリスチレン）、細胞培養表面処理済（高分子ポリマーの親水化表面処理）、ノンパイロジェン、滅菌済、1ウェル当たり培養面積（cm2）：0.38、1ウェル当たり最大容量（mL）：0.32、サイズ（mm）：127.8×85.5×16.5。
＜三次元構造物のシェル調製＞
　V字底の96穴マルチウェルプレートの各ウェルに存在する線維芽細胞塊のコアに、ヒトiPS細胞から誘導した表皮角化細胞を、播種し、共培養し、本製造例１の3次元構造物を作製した。なお、ヒトiPS細胞に代えて正常ヒト表皮角化細胞を用い共培養によっても3次元構造物を作製できる。
　〔ヒトiPS細胞由来の表皮角化細胞の播種数の調整〕
　ヒトiPS細胞由来の表皮角化細胞を、37℃、5%CO2の下で、20ng/mL EGF(MACS)、10μM Y-27632を補充した CnT-07 (CELLnTEC)培地で培養した。培養にはポリスチレン製の組織培養プレート（円柱状のウェル、コート剤：ラミニン５１１Ｅ８断片）を用いた。培養2日目に、20ng/mL EGF(MACS)、10μM Y-27632を補充した CnT-07 (CELLnTEC)培地で培地交換を行った。
　表皮角化細胞と線維芽細胞の共培養には、5% FBS (Sigma-Aldrich)、1mM CaCl2 を補充したDMEM/F12培地（線維芽細胞用培地）と、CnT-PR-3D培地(CELLnTEC)（表皮角化細胞用培地）とを、1:1（容量：容量）で混合して調製した共培養培地（以後、「Half培地」ともいう）を用いた。
　表皮角化細胞の播種については、細胞をPBS(-)にて洗浄したのちにTrypLE(TM) Select Enzymeを用いて剥離した。剥離した表皮角化細胞を遠心分離機によって分離し、表皮角化細胞を上述した共培養培地にて、表皮角化細胞が5×104 cells/mLになるように懸濁した。線維芽細胞用培地を、上述の96穴マルチウェルプレートの各ウェルから、線維芽細胞塊を残しつつ、吸引除去した。各ウェルから培地を吸引除去した後に、線維芽細胞塊が残る各ウェルに、表皮角化細胞の細胞懸濁液を100μL/wellで播種した。１ウェルには、線維芽細胞塊１及び表皮角化細胞5×103 cells/mLを含む共培養培地が存在した。
　上述で製造された線維芽細胞及び表皮角化細胞を含むコアシェル構造の3次元構造物（本製造例１）を37℃、5% CO2 の下で培養維持した。１日毎に共培養培地で、培地交換を100μL/wellで行った。正常線維芽細胞のコアと、ｉＰＳ細胞由来の分化誘導後の表皮角化細胞のシェルから少なくとも構成される3次元構造物は、共培養培地にて、２２日間培養持続ができた。
　〔各種マーカー〕
　タイトジャンクション（TJ）マーカーとして、Occludinを選択した。増殖マーカーとして、Ki67を選択した。基底細胞マーカーとして、collagen XVIIを選択した。これらは、公知の方法又は市販品抗体を用いた。市販品としては、Occludin抗体：抗オクルディン（Occludin）抗体 クローン1C17 ZooMAb（R）ウサギ・モノクローナル（Sigma-Aldrich社製）、Ki67抗体：抗Ki67抗体 クローン1O15 ZooMAb（R）ウサギモノクローナル（Sigma-Aldrich社製）、collagen XVII抗体：抗COL17A1 [NC16a-3]抗体（GeneTex社製）等が挙げられる。
　〔サンプリングについて（RNA）〕
　１．同条件のスフェロイドを滅菌済み1.5mL チューブに培地ごと回収する。；２．培地を極力除去する。；３．TRIzolを 400μL添加する。；４．スフェロイドが見えなくなるまでボルテックスを行う。；５．－80℃へ。
　〔サンプリングについて（染色）〕
　１．同条件のスフェロイドをスライドグラス上に移す。；２．スフェロイドをエタノールで固定する；３．ブロッキング後、目的の一次抗体及び二次抗体を用いて免疫染色を行う。
　＜試験例１：培地の混合比率の検討＞
　培地は、5% FBS、1mM CaCl2 を補充したDMEM/F12培地と、CnT-PR-3D培地を表１に挙げた比率で混合した培地を用い、細胞は、表皮角化細胞としてｉＰＳ細胞より分化させた表皮角化細胞（ｉＫＣ）、また線維芽細胞としてＮＨＤＦを用い、上記＜コアシェル構造の三次元構造物及びその製造方法＞に従って本製造例１のコアシェル構造の三次元構造物を得た。ｉＫＣを播種してから３週後に、三次元構造物を抗Occludin抗体で免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡撮影（LSM900、ZEISS）を行った。撮影した像は、ImageJを用いて、三次元構造物の全体の面積、及びマニュアルで指定したOccludin陽性細胞領域の面積を測定し、Occludin陽性細胞領域の面積／三次元構造物の全体の面積を三次元構造物の全体に対するOccludin陽性細胞の占有率とした（図４）。
　・タイトジャンクション：構成因子であるOccludinに対する抗体を用いて染色される。三次元構造物の最表層を覆うように網目状に存在する。
　・線維芽細胞塊の状態、線維芽細胞塊が球状であり、表皮角化細胞層と比べて透明度が低い。
　・表皮角化細胞層の状態、線維芽細胞塊を均一に纏った球状の構造物。
＜得られたコアシェル構造の三次元構造物の大きさ＞
　得られた本製造例１のコアシェル構造の三次元構造物（スフェロイド）の大きさは、培養条件（細胞播種数、培養日数、培地種等）によっても異なってくるが、概ね３００～７００μｍの範囲内の大きさであり、本製造例１のコアシェル構造物の三次元構造物の長径は、例えば４４２、４６０、４７０μｍであった。三次元構造物の長径は、共焦点レーザー顕微鏡（LSM900、ZEISS）で撮影した像の正中断面像を用いて、ImageJにて長さを測定した。
　＜試験例１の結果＞
 
 
　＜Occludin 染色性の評価基準＞
　三次元構造物全体に対するOccludin陽性細胞の占有率（図４参照）をもとに、以下の基準に従って判定した。
○（優）：８０％以上
△（合格）：５０％以上、８０％より少ない
×（不合格）：５０％より少ない
　＜混合培地の比率とOccludinの染色性＞
　表皮角化細胞培養用培地と線維芽細胞培養用培地の混合比率が５０：５０のものでOccludin陽性細胞の三次元構造物全体に対する占有率が最も高く（９１．５％）判定は優であった。２５：７５（７３．９％）、７５：２５（５３．８％）はその次に占有率が高く判定は合格であった（図５参照）。
　＜試験例２：線維芽細胞及び表皮角化細胞との播種数比率の検討＞
　ＮＨＤＦ、及びｉＫＣを表２で上げた細胞数で播種し、培養液はHalf培地を用いて培養を行った。それ以外は、上記＜コアシェル構造の三次元構造物及びその製造方法＞に従って、本製造例１のコアシェル構造の三次元構造物を得た。ｉＫＣを播種してから３週後に、三次元構造物を抗Occludin抗体で免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡撮影（LSM900、ZEISS）を行った。Occludinの占有率の算出および合否の評価は実施例１と同様の手法および基準を用いて行った。
 
 
 
 
　＜試験例２の結果＞
　線維芽細胞とiKCの播種比率が８：１のものでOccludin陽性細胞の本製造例１の三次元構造物全体に対する占有率が最も高く（９４．２％）、次いで４：１（８１．３％）で、判定は優であった。２：１（７６．７％）、１：１（７５．２％）、１：２（７６．９％）、１：４（５４．２）について、判定は合格であった（図６参照）。
　＜試験例３：培養可能期間の検討と表皮角化細胞特異的マーカーの確認＞
1.0 x 104のＮＨＤＦを、5.0 x 10３のｉＫＣ、Half培地を用いて、上記＜コアシェル構造の三次元構造物及びその製造方法＞に従って本製造例１のコアシェル構造の三次元構造物を得た。ｉＫＣを播種してから６，１４、２２日後に、三次元構造物を回収し、各種抗体で免疫染色した後、共焦点レーザー顕微鏡撮影（LSM900、ZEISS）を行った。合否の評価基準は＜試験例1＞の合否の評価基準に加え、表皮角化細胞層の増殖マーカーおよび基底細胞マーカーを用いた評価基準を活用した。
 
 
 
 
　＜増殖マーカーを用いた際の評価基準＞
＜・染色性＞
○（合格）　表皮角化細胞の増殖がまだらに確認される
×（不合格）　増殖マーカーの染色が確認されない
 
＜・局在＞
○（合格）　増殖マーカーが線維芽細胞塊に直接触れる表皮角化細胞で確認される
×（不合格）　増殖マーカーが表皮角化細胞層全体にまだらで確認される
 
　＜基底細胞マーカーを用いた際の評価基準＞
＜・染色性＞
○（合格）　基底細胞マーカーの染色が認められる
×（不合格）　基底細胞マーカーの染色が認められない
 
＜・局在＞
○（合格）　基底細胞マーカーが線維芽細胞塊に直接触れる表皮角化細胞のみに確認される
×（不合格）　基底細胞マーカーが表皮角化細胞層全体に確認される
 
　＜総合判定の評価基準＞
○（優）　各マーカーの染色が適切な局在で確認される
△（合格）　各マーカーの染色は認められるものの、局在が一部適切ではない
×（不合格）　各マーカーの染色が認められない
 
　＜試験例３の結果＞
　以上のように、表皮角化細胞層における未分化/分化については安定して区別できている。未分化層はcollagen XVII陽性細胞層であり、分化層はcollagen XVII陰性細胞層である。さらに表皮角化細胞の後期の分化段階である顆粒層で発現する（図７）occludinが、三次元構造物の最表層（最外層）で確認できたことから、表皮角化細胞層は内側から外側に向かって、段階的な分化工程を踏んでいると推定できる。
　そして、線維芽細胞塊のコアがiKCで覆われたコアシェル構造のスフェロイドを共培養培地で培養することで、タイトジャンクションおよび分化マーカーであるOccludinの発現がスフェロイドの最表層で全面的に認められた。また、14日間培養スフェロイドおよび22日間培養スフェロイドでは、表皮角化細胞の増殖マーカー及び未分化マーカー（Ki67, collagen XVII）の局在が生体と同様、線維芽細胞塊（真皮層）に直接触れる一層の表皮角化細胞層で確認された（図８参照）。
　＜試験例４：表皮角化細胞種の検討＞
　線維芽細胞塊に播種する表皮角化細胞の種類を変えた以外は、上記＜試験例３＞と同様にして、本製造例１のコアシェル構造の三次元構造物を得た。このとき用いた表皮角化細胞種は、正常ヒト表皮角化細胞 (HPEK) およびiKCである。合否の評価基準は＜試験例3＞の合否の評価基準を用いた。
 
 
　＜試験例４の結果＞
　結果を表５及び図９に示した。８日間培養スフェロイドでは、線維芽細胞塊のコアに播種された表皮角化細胞の種類に問わず、タイトジャンクションマーカーである Occludin および増殖マーカー Ki67 の発現が認められた。一方で、22日間培養スフェロイドでは、iKCを用いたスフェロイドのみでタイトジャンクションマーカーと増殖マーカーの適正な位置での陽性が認められた。(図９参照）。
　＜試験例５：選定物質の評価＞
　上記＜試験例３＞と同様にして、本製造例１のコアシェル構造の三次元構造物を得た。表皮角化細胞を播種した後、５及び６日後にタイトジャンクション強化成分として知られるリゾホスファチジン酸（LPA）を０、１、１０、１００μｇ／ｍＬとなるよう添加した。その後７日目にサンプルを回収し、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した後、各プライマーを用いてｑＰＣＲを行った。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
　＜試験例５の結果＞
　TJマーカー遺伝子であるクロ―ディン１（CLDN1）およびオクルーディン（OCLN）において、LPA濃度依存的な発現上昇が見られた。終末分化マーカーであるロリクリン（LOR）、角化関連マーカーであるフィラグリン（FLG）において、LPA１００μｇ／ｍＬで発現の上昇が見られた。これらのことからＬＰＡはＴＪバリア機能強化、表皮角化細胞の終末分化促進、角化促進の作用を持つことが考えられた。 
＜＜製造例２[マイクロキャリア]：コアシェル構造の三次元構造物及びその製造方法＞＞
　以下のようにして、PVAミクロスフェアをコアとし、表皮角化細胞をシェルとするコアシェル構造の三次元構造物を製造し（図１Ｂ参照）、製造例２のコアシェル構造の三次元構造物とした。具体的には、PVAミクロスフェア１つをウェルに配置したうえで、シェルを形成するための表皮角化細胞を同じウェルに播種し、その後、静置培養を行った。線維芽細胞の細胞塊を、PVAミクロスフェアに代えた以外は、製造例１と同様の方法にて製造することができる。
＜PVAミクロスフェア＞
　粒子サイズ（D50）：200-250μｍ
　表面処理：コラーゲン　Type I
　乾燥1gあたりの表面積：2600cm2　
　膨潤度（PBS浸潤時）：10　
　MSC1リットル培養時の推奨投入量：1.54g　
　滅菌：ガンマ線照射
＜１．KURARAY社コラーゲンコート PVAミクロスフェアの限界希釈＞
　（１）粉末状のPVAミクロスフェアを少量取り、適量のhalf培地 (DMEM/F12 supplemented with 5% FBS and 1mM CaCl2 : CnT-PR-3D = 1:1) で希釈する※
　（２）上記（1）の希釈液を V字底96-well プレートに 50μL/well で播種
　（３）顕微鏡下で PVAミクロスフェアが 1個のみ入っているウェルを探し、これを用いて、製造例２のコアシェル構造の三次元構造物を得た。
＜２．限界希釈で播種したPVAミクロスフェアに HPEK を播種＞
　（１）T75フラスコ上で培養したHPEKの培地を除去し、PBS(-) にて２回洗浄
　（２）剥離剤 TrypLE Selectを HPEKに 1mL 添加　
　（３）37℃ 10min. インキュベート
　（４）インキュベート中に 3mL の half培地を 15mL遠心管に入れておく
　（５）インキュベートした細胞に2mL PBS(-) を添加し、ピペッティングで細胞を剥離し、上記（４）に回収
　（６）改めて 2mL PBS(-) をT75フラスコに添加し、数回ピペッティング後に上記（４）に回収
　（７）細胞を遠心（190×g, 5min.）
　（８）上清を除去し、沈殿した細胞を half培地 2mL にて再懸濁
　（９）細胞懸濁液の細胞濃度を計測
　（１０）5×10^4 cells/mL になるように half培地にて希釈
　（１１）上記（１０）を 100μL/well ずつ PVAミクロスフェアの入ったV字底96-well プレートに播種
　（１２）　37℃ 5% CO2 でインキュベート。100μL/well half培地にて毎日培地交換し、２週間培養。
＜３．HPEK-PVAミクロスフェアスフェロイドの免疫染色＞
　（１）1.5mLチューブに数個のHPEK-PVAミクロスフェアスフェロイドを取り、極力培地を除去する
　（２）冷エタノールを用いて固定する
　（３）エタノールを除去し、PBS(-)で洗浄する
　（４）スフェロイドをガラススライドに移し、ブロッキングを行う
　（５）一次抗体の希釈液を用いて免疫染色をする
　　　COL17, Ki67, Occludin に特異的な抗体 の希釈液
　（６）PBS(-) で洗浄する
　（７）二次抗体の希釈液を用いて免疫染色をする
　　　　各一次抗体を認識する抗体および核染色試薬を混ぜた反応液
　（８）PBS(-) で洗浄する
　（９）封入剤でスフェロイドをガラススライドに封入する
＜試験例６＞
　本製造例２により得られたコアシェル構造の三次元構造物について、Hoechest、CollagenXVII（基底細胞マーカー）、Ki67、Occludin（タイトジャンクション（TJ）マーカー）の抗体を用いて、当該三次元構造物の局在の経時変化を、蛍光顕微鏡で確認した。これらマーカーを、上記＜製造例１＞の〔各種マーカー〕及び＜Occludin 染色性の評価基準＞＜増殖マーカーを用いた際の評価基準＞＜基底細胞マーカーを用いた際の評価基準＞などに従って、用いた。
　本製造例２により得られたコアシェル構造の三次元構造物における、播種した表皮角化細胞の種類（ｉＫＣ、ＨＰＥＫ）と表皮特異的マーカー（ＯｃｃｌｕｄｉｎＫｉ－６７）局在の経時変化を蛍光顕微鏡で確認したときのグレー写真である（図１０参照）。
　得られた本製造例２のコアシェル構造の三次元構造物（スフェロイド）の大きさは、培養条件（細胞播種数、培養日数、培地種等）によっても異なってくるが、概ね３００～５００μｍの範囲内の大きさであり、本製造例２のコアシェル構造物の三次元構造物の長径は、例えば３１２、３７０、４００μｍであった。三次元構造物の長径は、共焦点レーザー顕微鏡（LSM900、ZEISS）で撮影した像の正中断面像を用いて、ImageJにて長さを測定した。
　これらの結果より、本製造例２は本製造例１と同様、表皮角化細胞層における未分化/分化については安定して区別できている。未分化層はcollagen XVII陽性細胞層であり、分化層はcollagen XVII陰性細胞層である。さらに表皮角化細胞の後期の分化段階である顆粒層で発現するoccludinが、三次元構造物の最表層（最外層）で確認できたことから、表皮角化細胞層は内側から外側に向かって、段階的な分化工程を踏んでいると推定できる。
＜試験例７＞
　本製造例１で得られた三次元構造物のコア部分の線維芽細胞塊の表面に、細胞外マトリックス成分を構成する因子（Col １又はCol 4）が存在しているかどうかを確認した。
　その結果、線維芽細胞塊の回りにCol １及びCol 4が存在していることが検証できた（図１１参照）。
　このことから、製造例１及び製造例２のコア部分の表面には、コラーゲンが少なくとも存在し、細胞外マトリックス成分が存在することが認められた。
　＜総合的検討＞
　これにより、１ウェルに、線維芽細胞塊をコアとし、表皮角化細胞をそのコアのシェルとするコアシェル構造の三次元構造物を得ることができた。製造例１で得られた三次元構造物は、中心部が複数の線維芽細胞で構成されている線維芽細胞塊と、当該線維芽細胞塊を複数の表皮角化細胞が層のように覆っており、外部に接する表面に存在する表皮角化細胞同士の間に複数のタイトジャンクションを有している。線維芽細胞塊に接する表皮角化細胞は、未分化状態の表皮角化細胞であって、第１層を形成し、この第１層は基底細胞層に相当する。この第１層の外径方向に、第２層、第３層・・・と第２層以降は、分化した複数の表皮角化細胞が存在し、分化後の表皮角化細胞層（単層又は多層）を形成している。
　以上のように、播種した線維芽細胞から調製された線維芽細胞を含む細胞培養器材に、表皮角化細胞を播種して培養することによって、スフェロイド（塊）を製造できることが確認できた。
　そして、このスフェロイド（塊）は、（ａ）中心部が、複数の線維芽細胞で少なくとも構成されている線維芽細胞塊であり、（ｂ）シェル部が、表面の細胞層の細胞間に存在する複数のタイトジャンクションと、複数の表皮角化細胞とで少なくとも構成されている、未分化層と分化層とを含む細胞層である、コアシェル構造の三次元構造を有する塊であった。
　また、１ウェルに、マイクロキャリアをコアとし、表皮角化細胞をそのコアのシェルとするコアシェル構造の三次元構造物を得ることができた。製造例２で得られた三次元構造物は、中心部が１つのPVAミクロスフェアを複数の表皮角化細胞が層のように覆っており、外部に接する表面に存在する表皮角化細胞同士の間に複数のタイトジャンクションを有している。線維芽細胞塊に接する表皮角化細胞は、未分化状態の表皮角化細胞であって、第１層を形成し、この第１層は基底細胞層に相当する。この第１層の外径方向に、第２層、第３層・・・と第２層以降は、分化した複数の表皮角化細胞が存在し、分化後の表皮角化細胞層（単層又は多層）を形成している。
　以上のように、１つのPVAマイクロキャリアを配置し含む細胞培養器材に、表皮角化細胞を播種して培養することによって、スフェロイド（塊）を製造できることが確認できた。
　そして、このスフェロイド（塊）は、（ａ）中心部が、１つのマイクロキャリアであり、（ｂ）シェル部が、表面の細胞層の細胞間に存在する複数のタイトジャンクションと、複数の表皮角化細胞とで少なくとも構成されている、未分化層と分化層とを含む細胞層である、コアシェル構造の三次元構造を有する塊であった。
　本発明者らは、コアシェル構造の三次元構造物は、コア部分について細胞塊及びマイクロキャリアの何れでもよく、これらは細胞外マトリックス成分を表面に有し、かつ、その回りに表皮角化細胞の細胞層を有していることが好ましいと、考えた。
　よって、表面に存在するタイトジャンクションを有し、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物である中心部と、を含む、コアシェル構造の三次元構造物を提供できた。
１　コアシェル構造の三次元構造物；１ａ　第１実施形態の三次元構造物、１ｂ　第２実施形態の三事件構造物；１０ａ　線維芽細胞塊、１０ｂ　マイクロキャリア；１１　線維芽細胞；２０　表皮角化細胞の細胞層；２１　未分化の表皮角化細胞層；２２　分化後の表皮角化細胞層；２３　最表層；２０１　未分化の表皮角化細胞；２０２　分化後の表皮角化細胞；３０　タイトジャンクション 

Claims (8)

  1. 　表面に存在するタイトジャンクションを有し、複数の表皮角化細胞で少なくとも構成されている細胞層と、
    　細胞外マトリックス成分を表面に有するマイクロ球状物である中心部と、を含む、
    コアシェル構造の三次元構造物。
  2. 　前記マイクロ球状物が、マイクロキャリア又は細胞塊である、請求項１に記載の三次元構造物。
  3. 　前記表皮角化細胞が、多能性幹細胞由来の表皮角化細胞である、請求項１又は２に記載の三次元構造物。
  4. 　皮膚恒常性維持機能評価に用いる、請求項１又は２に記載の三次元構造物。
  5. 　マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを共培養する、コアシェル構造の三次元構造物の製造方法。
  6. 　前記マイクロ球状物と、播種した表皮角化細胞とを培養する際に、表皮角化細胞用培地を少なくとも含む培地、又は、表皮角化細胞用培地と線維芽細胞用培地とを含む培地を使用する、請求項５に記載の三次元構造物の製造方法。
  7. 　前記三次元構造物の大きさが、前記マイクロ球状物の大きさを１としたときに、１．０５以上１．５以下になるように培養する、請求項５又は６に記載の三次元構造物の製造方法。
  8. 　請求項１に記載の三次元構造物を用いる、皮膚恒常性維持機能の評価方法。
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