WO2025061675A1

WO2025061675A1 - Cascade system for the fermentation of biomass

Info

Publication number: WO2025061675A1
Application number: PCT/EP2024/075900
Authority: WO
Inventors: Franziskus Schnabel; Daniel MacGowan von Holstein; Nina-Katharina Krahe; Jörg BORMANN; Martin Hacker; Marc Zillmann; Lars Malter
Original assignee: Kynda Biotech GmbH
Current assignee: Kynda Biotech GmbH
Priority date: 2023-09-18
Filing date: 2024-09-17
Publication date: 2025-03-27
Anticipated expiration: 2026-03-18
Also published as: DE102023125142A1

Abstract

The present invention relates to a cascade system for the fermentation of biomass, comprising a first pre-culture vessel, an optional second pre-culture vessel and a main-culture vessel, which are connected or can be connected to one another in this sequence by way of controllable valve couplings such that the content of one vessel can be transferred partially or completely into the next vessel, each vessel having an agitating, dispersing and/or cutting device, an inlet for the supply of nutrient medium, a pressure-equalizing valve and an inlet for compressed gas. The present invention also relates to a method for the fermentation of biomass, comprising (a) the provision of a starter culture, (b) the contamination-free transfer of the starter culture into a first pre-culture vessel, (c) the fermentation of biomass in the first pre-culture vessel, initiated by the starter culture, to obtain a first pre-culture, (d) the partial or complete transfer of the first pre-culture from the first pre-culture vessel into a main-culture vessel and (e) the fermentation of further biomass in the main-culture vessel to obtain a fermented biomass.

Description

Kaskadensystem zur Fermentation von Biomasse Cascade system for biomass fermentation

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kaskadensystem zur Fermentation von Biomasse, umfassend einen ersten Vorkulturbehälter, einen optionalen zweiten Vorkulturbehälter und einen Hauptkulturbehälter, welche in dieser Reihenfolge über steuerbare Ventilkupplungen derart miteinander verbunden bzw. verbindbar sind, dass der Inhalt eines Behälters teilweise oder vollständig in den nächsten Behälter überführbar ist, wobei jeder Behälter eine Rühr-, Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung, einen Einlass zur Zufuhr von Nährmedium, ein Druckausgleichsventil sowie einen Einlass für Druckgas aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Fermentation von Biomasse, umfassend (a) das Bereitstellen einer Starterkultur, (b) das kontaminationsfreie Überführen der Starterkultur in einen ersten Vorkulturbehälter, (c) das Fermentieren von Biomasse im ersten Vorkulturbehälter, welches durch die Starterkultur initiiert wird, um eine erste Vorkultur zu erhalten, (d) das teilweise oder vollständige Überführen der ersten Vorkultur aus dem ersten Vorkulturbehälter in einen Hauptkulturbehälter und (e) das Fermentieren von weiterer Biomasse im Hauptkulturbehälter, um eine fermentierte Biomasse zu erhalten. The present invention relates to a cascade system for the fermentation of biomass, comprising a first pre-culture container, an optional second pre-culture container and a main culture container, which are connected or connectable to one another in this order via controllable valve couplings in such a way that the contents of one container can be partially or completely transferred to the next container, wherein each container has a stirring, dispersing and/or cutting device, an inlet for supplying nutrient medium, a pressure equalization valve and an inlet for compressed gas. The present invention further relates to a method for fermenting biomass, comprising (a) providing a starter culture, (b) transferring the starter culture in a contamination-free manner into a first pre-culture container, (c) fermenting biomass in the first pre-culture container, which is initiated by the starter culture, in order to obtain a first pre-culture, (d) partially or completely transferring the first pre-culture from the first pre-culture container into a main culture container and (e) fermenting further biomass in the main culture container in order to obtain a fermented biomass.

Der großtechnischen Herstellung von Pilzbiomasse (auch als Myzel bezeichnet) mittels Fermentation kommt eine immer größere Bedeutung zu, da diese als Nahrungsmittel und insbesondere als Fleischersatz zunehmend Verwendung findet. The large-scale production of fungal biomass (also known as mycelium) by fermentation is becoming increasingly important, as it is increasingly used as a food and, in particular, as a meat substitute.

Um Zellen in großen Volumina zu kultivieren, erfolgt die Beimpfung eines Fermentationsreaktors bzw. -behälters geeigneter Größe zur Kultivierung von Pilzbiomasse üblicherweise über eine sogenannte Starterkultur, die einige Tage in einem separaten und kleineren Behälter, z. B. einem Schüttelkolben, bebrütet wurde. Prozessseitig hat sich etabliert, ausgehend von der Starterkultur zunächst eine Vorkultur oder eine Serie immer größer werdender Vorkulturen herzustellen, bevor mit einer solchen Vorkultur dann die Beimpfung des eigentlichen Fermenters erfolgt. Diese Abfolge von Kultivierungsschritten ermöglicht es auch, den Mikroorganismus aus einer statischen Starterkultur (bspw. Kryokultur) zu revitalisieren, mit jeder Passage in ein nächstes Vorkulturbehältnis mit frischen Nährstoffen zu versorgen und schlussendlich hinreichend Zellen angezogen zu haben, um die Hauptkultur mit reichlich vitaler Biomasse zu beimpfen. To cultivate cells in large volumes, a fermentation reactor or vessel of suitable size for cultivating fungal biomass is usually inoculated using a so-called starter culture, which has been incubated for several days in a separate, smaller container, such as a shake flask. From a process perspective, it has become established to first create a preculture or a series of increasingly larger precultures from the starter culture, before then inoculating the actual fermenter with such a preculture. This sequence of cultivation steps also makes it possible to revitalize the microorganism from a static starter culture (e.g., cryoculture), providing it with fresh nutrients with each passage into the next preculture container. and finally to have grown sufficient cells to inoculate the main culture with plenty of vital biomass.

Entsprechend beruht die konventionelle Biomassefermentation auf einer manuellen Beimpfung von Kulturen, die aufeinander folgen. Zunächst wird in der Regel eine kleine Menge (d.h. die Starterkultur) des Mikroorganismus, beispielsweise eines Pilzes, aus einer Gefrierkultur oder von einer Agarplatte genommen und in ein kleines Volumen eines Nährmediums überführt. Diese erste Vorkultur dient der Revitalisierung des Mikroorganismus und wird in der Regel anteilig oder vollständig und gegebenenfalls nach einem manuell durchgeführten Zerkleinerungsschritt (beispielsweise mit einem Dispergierer) in eine zweite Vorkultur überführt. Die zweite Vorkultur dient hauptsächlich der Vermehrung der Biomasse in einem geringeren Volumen als in der Hauptkultur. Üblicherweise wird die zweite Vorkultur ebenfalls zerkleinert und genutzt, um mit möglichst vielen, vitalen Zellen die Hauptkultur zu starten, die dann, mit der großen Menge an Inokulum, schnell Biomasse erzeugt und nach verhältnismäßig kurzer Zeit geerntet werden kann. Accordingly, conventional biomass fermentation is based on the manual inoculation of successive cultures. First, a small amount (i.e., the starter culture) of the microorganism, for example, a fungus, is usually taken from a frozen culture or an agar plate and transferred to a small volume of nutrient medium. This first pre-culture serves to revitalize the microorganism and is usually transferred partially or completely, and if necessary after a manual grinding step (e.g., with a disperser), into a second pre-culture. The second pre-culture primarily serves to propagate the biomass in a smaller volume than in the main culture. Typically, the second pre-culture is also ground and used to start the main culture with as many vital cells as possible. The main culture, with the large amount of inoculum, then quickly produces biomass and can be harvested after a relatively short time.

Auf diese Weise kann ausgehend von einem Inokulum mit vergleichsweise geringer Anzahl an Zellen schließlich auch ein großes Volumen an Kulturmedium mit einer hohen Zellteilungsrate kultiviert werden. Das beschleunigt den gesamten Prozess und macht ihn wirtschaftlicher, da der technisch und energetisch aufwändige Betrieb des Hauptkulturbehälters möglichst effizient gestaltet wird. In this way, starting with an inoculum with a comparatively small number of cells, a large volume of culture medium with a high cell division rate can ultimately be cultivated. This accelerates the entire process and makes it more economical, as the technically and energy-intensive operation of the main culture vessel is designed as efficiently as possible.

Jeder Transfer einer Kultur in einen nächsten Reaktor erfordert menschliches Zutun und birgt somit das Risiko einer Kontamination mit einem unerwünschten Mikroorganismus. Eine solche Kontamination würde den Bioprozess im Fermentationsbehälter gefährden. Um Kontaminationen bestmöglich zu verhindern, ist eine möglichst sterile Umgebung, beispielsweise eine sterile Werkbank, sowie mikrobiologisch geschultes Fachpersonal erforderlich, das üblicherweise zur Kontaminationsvermeidung bei der Arbeit eine persönliche Schutzausrüstung trägt. Every transfer of a culture to the next reactor requires human intervention and thus carries the risk of contamination with an undesirable microorganism. Such contamination would jeopardize the bioprocess in the fermentation vessel. To best prevent contamination, an environment as sterile as possible, such as a sterile workbench, is required, as well as microbiologically trained personnel who typically wear personal protective equipment while working to prevent contamination.

Darüber hinaus müssen die Kulturen in der Regel mechanisch homogenisiert werden (entweder während der Kultivierung oder vor dem Überführen in den nächsten Fermentationsbehälter, um die Wuchsfreudigkeit des Myzels oder anderer Mikroorganismen zu erhöhen, indem neue Wachstumspole freigelegt werden. Dieser Schritt wird in der Regel manuell durchgeführt und erfordert das Öffnen des Kulturgefäßes, was das Kontaminationsrisiko zusätzlich erhöht. Daher sind auch hier eine möglichst sterile Umgebung und standardisierte Arbeitsabläufe nötig, um eine Kontamination der Kultur mit einem unerwünschten Mikroorganismus zu verhindern. In addition, the cultures usually need to be mechanically homogenized (either during cultivation or before transferring to the next fermentation vessel) to increase the vigor of the mycelium or other microorganisms by exposing new growth poles. This This step is usually performed manually and requires opening the culture vessel, which further increases the risk of contamination. Therefore, a sterile environment and standardized workflows are necessary to prevent contamination of the culture with an undesirable microorganism.

Dies macht die Fermentation (nicht nur unter Verwendung von Pilzkulturen, sondern gleichermaßen auch unter Verwendung von Bakterien-, Hefe- oder sonstigen Zellkulturen) zu einem sehr arbeits- und kontrollintensiven Verfahren. Die Fermentation ist arbeitsintensiv, weil mehrere mit Medium gefüllte Gefäße mit dem gewünschten Mikroorganismus in einer sterilen Umgebung beimpft und kultiviert werden müssen. Die Arbeiten zur Herstellung und Aufbereitung dieser Kulturen müssen an sterilen Werkbänken unter Verwendung mikrobiologischer Instrumente (Pipetten, sterile Impfösen, Spatel, Autoklaven, Brutschränke, Dispergierstäbe usw.) durchgeführt werden, die aufwändig zu bedienen, zu reinigen und zu warten sind. Die Starterkulturen müssen für jede Charge einzeln zubereitet werden, da sie aufgrund der abnehmenden Lebensfähigkeit nicht über einen längeren Zeitraum als Flüssigkultur gelagert werden können. Das Verfahren ist auch sehr kontrollintensiv, um die Kontaminationsfreiheit in allen Schritten zu gewährleisten. Wie vorstehend erläutert, ist die konventionelle Herstellung von Starter-, Vor- und Hauptkulturen, deren Bebrütung sowie Transfer mikrobiologisch riskant, da bei fast jedem Prozessschritt die Gefahr einer Kontamination mit unerwünschten Mikroorganismen besteht, was den Ablauf und die Effizienz des Prozesses gefährden würde. Daher müssen zu verschiedenen Zeitpunkten Proben zur Kontaminationskontrolle genommen werden. Diese Proben werden auf geeignete Medien ausgebracht und bebrütet. Darüber hinaus werden die Proben lichtmikroskopisch und gegebenenfalls molekularbiologisch (beispielsweise durch ITS-Sequenzierung) auf ihre Reinheit überprüft. All diese Verfahren sind notwendig, um die Reinheit der Kulturen in diesem kontaminationsanfälligen System zu gewährleisten. This makes fermentation (not only using fungal cultures, but equally using bacterial, yeast, or other cell cultures) a very labor- and control-intensive process. Fermentation is labor-intensive because multiple vessels filled with medium must be inoculated and cultured with the desired microorganism in a sterile environment. The work involved in preparing and preparing these cultures must be carried out on sterile workbenches using microbiological instruments (pipettes, sterile inoculation loops, spatulas, autoclaves, incubators, dispersing rods, etc.), which are complex to operate, clean, and maintain. Starter cultures must be prepared individually for each batch because they cannot be stored as liquid cultures for extended periods due to their declining viability. The process also requires very intensive control to ensure freedom from contamination at all steps. As explained above, the conventional production of starter, pre-culture, and main cultures, as well as their incubation and transfer, poses a microbiologic risk, as contamination with undesirable microorganisms exists at almost every process step, which would jeopardize the process's efficiency. Therefore, samples must be taken at various times to check for contamination. These samples are then plated on suitable media and incubated. Furthermore, the samples are checked for purity using light microscopy and, if necessary, molecular biology (e.g., ITS sequencing). All of these procedures are necessary to ensure the purity of the cultures in this contamination-prone system.

Der Aufwand, welcher für ein solches herkömmliches Fermentationsverfahren betrieben werden muss, wird beispielsweise aus der Publikation von J. Alcantara et al. (Fermentation 2017, 3(3), 30) deutlich. The effort required for such a conventional fermentation process is clearly demonstrated, for example, by the publication by J. Alcantara et al. (Fermentation 2017, 3(3), 30).

Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein System zur Fermentation von Biomasse sowie ein entsprechendes Verfahren bereitzustellen, durch deren Verwendung das Risiko einer Kontamination mit einem unerwünschten Mikroorganismus verringert und der Arbeits- und Kontrollaufwand reduziert wird, um eine Erhöhung der Effizienz des Fermentationsprozesses zu erreichen. Against this background, the present invention is based on the object of providing a system for the fermentation of biomass and a corresponding process to provide methods of production, the use of which reduces the risk of contamination with an undesirable microorganism and reduces the labor and control effort in order to achieve an increase in the efficiency of the fermentation process.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst. This object is achieved by the embodiments characterized in the claims.

Erfindungsgemäß wird insbesondere ein Kaskadensystem zur Fermentation von Biomasse, umfassend einen ersten Vorkulturbehälter, einen optionalen zweiten Vorkulturbehälter und einen Hauptkulturbehälter, welche in dieser Reihenfolge über steuerbare Ventilkupplungen derart miteinander verbunden bzw. verbindbar sind, dass der Inhalt eines Behälters teilweise oder vollständig in den nächsten Behälter überführbar ist, wobei jeder Behälter eine Rühr-, Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung, einen Einlass zur Zufuhr von Nährmedium, ein Druckausgleichsventil sowie einen Einlass für Druckgas aufweist. According to the invention, in particular, a cascade system for the fermentation of biomass is provided, comprising a first pre-culture container, an optional second pre-culture container and a main culture container, which are or can be connected to one another in this order via controllable valve couplings in such a way that the contents of one container can be partially or completely transferred to the next container, wherein each container has a stirring, dispersing and/or cutting device, an inlet for supplying nutrient medium, a pressure equalization valve and an inlet for compressed gas.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einem Kaskadensystem eine Serie an Fermentationsbehältern bzw. -reaktoren verstanden, die derart miteinander verbunden bzw. verbindbar sind, dass der Inhalt eines Behälters teilweise oder vollständig in den nächsten Behälter überführbar ist. In the context of the present invention, a cascade system is understood to mean a series of fermentation vessels or reactors which are or can be connected to one another in such a way that the contents of one vessel can be partially or completely transferred to the next vessel.

Das erfindungsgemäße Kaskadensystem umfasst einen ersten Vorkulturbehälter, der zur Kultivierung einer ersten Vorkultur dient. Das erfindungsgemäße Kaskadensystem umfasst weiter einen optionalen zweiten Vorkulturbehälter, der zur Kultivierung einer zweiten Vorkultur verwendet werden kann. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Kaskadensystem auch einen dritten Vorkulturbehälter, der zur Kultivierung einer dritten Vorkultur dient. Weitere Vorkulturbehälter sind bei Bedarf ebenfalls möglich. Die Vorkulturbehälter können unabhängig voneinander jede geeignete Größe aufweisen, beispielsweise mit Volumina im Bereich von 10L und 500L. Das Volumen des ersten Vorkulturbehälters sowie das Volumen des zweiten Vorkulturbehälters liegen vorzugsweise im Bereich von 20L bis 50L. Es ist weiter bevorzugt, dass das Volumen des optionalen zweiten Vorkulturbehälters größer als das des ersten Vorkulturbehälters ist und dass etwaige weitere Vorkulturbehälter noch größer als der zweite Vorkulturbehälter sind. The cascade system according to the invention comprises a first pre-culture container, which serves for cultivating a first pre-culture. The cascade system according to the invention further comprises an optional second pre-culture container, which can be used for cultivating a second pre-culture. According to a further embodiment of the present invention, the cascade system also comprises a third pre-culture container, which serves for cultivating a third pre-culture. Additional pre-culture containers are also possible if required. The pre-culture containers can independently of one another have any suitable size, for example with volumes in the range of 10 L and 500 L. The volume of the first pre-culture container as well as the volume of the second pre-culture container are preferably in the range of 20 L to 50 L. It is further preferred that the volume of the optional second pre-culture container is larger than that of the first pre-culture container and that any additional pre-culture containers are even larger than the second pre-culture container.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Kaskadensystem weiter einen Starterkulturbehälter, der in der Kaskade vor dem ersten Vorkulturbehälter angeordnet ist und über eine Sterilkupplung mit dem ersten Vorkulturbehälter verbunden oder verbindbar ist. Der Starterkulturbehälter dient zur Bereitstellung einer Starterkultur, die dann in den ersten Vorkulturbehälter zur Herstellung einer ersten Vorkultur überführt werden kann. Die Sterilkupplung wird nachfolgend noch näher erläutert. Der Starterkulturbehälter kann jede geeignete Größe aufweisen, beispielsweise mit Volumina im Bereich von 1 L bis 50L. Das Volumen des optionalen Starterkulturbehälters liegt vorzugsweise im Bereich von 5L bis 10L. Es ist besonders bevorzugt, dass das Volumen des Starterkulturbehälters kleiner als das der in der Kaskade nachfolgenden Vor- und Hauptkulturbehälter ist. In a preferred embodiment, the cascade system according to the invention further comprises a starter culture container, which is arranged in the cascade upstream of the first pre-culture container and is connected or connectable to the first pre-culture container via a sterile coupling. The starter culture container serves to provide a starter culture, which can then be transferred to the first pre-culture container for the production of a first pre-culture. The sterile coupling is explained in more detail below. The starter culture container can be of any suitable size, for example with volumes in the range of 1 L to 50 L. The volume of the optional starter culture container is preferably in the range of 5 L to 10 L. It is particularly preferred that the volume of the starter culture container is smaller than that of the pre-culture and main culture containers following in the cascade.

Das erfindungsgemäße Kaskadensystem umfasst schließlich einen Hauptkulturbehälter, der zur Kultivierung der Hauptkultur dient. Dieser kann ebenfalls jede geeignete Größe aufweisen, beispielsweise mit Volumina im Bereich von 1.000L und 50.000L. Das Volumen des Hauptkulturbehälters liegt vorzugsweise im Bereich von 5.000L bis 20.000L, besonders bevorzugt im Bereich von 7.000L bis 10.000L. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das Volumen des Hauptkulturbehälters im Bereich zwischen 1.000L und 50.000L und das Volumen des ersten und/oder optionalen zweiten Vorkulturbehälters liegt im Bereich zwischen 10L und 500L. Finally, the cascade system according to the invention comprises a main culture container, which serves to cultivate the main culture. This container can also have any suitable size, for example, with volumes in the range of 1,000L to 50,000L. The volume of the main culture container is preferably in the range of 5,000L to 20,000L, particularly preferably in the range of 7,000L to 10,000L. In a preferred embodiment of the present invention, the volume of the main culture container is in the range between 1,000L and 50,000L, and the volume of the first and/or optional second preculture container is in the range between 10L and 500L.

Die Vor- und Hauptkulturbehälter sind erfindungsgemäß über steuerbare Ventilkupplungen derart miteinander verbunden bzw. verbindbar, dass der Inhalt eines Behälters teilweise oder vollständig in den nächsten Behälter überführbar ist. Dabei sind die Behälter beginnend mit ersten Vorkulturbehälter über den zweiten oder mögliche weitere Vorkulturbehälter mit dem Hauptkulturbehälter verbunden bzw. verbindbar. Dazu können alle geeigneten Ventilkupplungen verwendet werden. Diese sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise werden die steuerbaren Ventilkupplungen über ein softwarebasiertes Prozess leitsystem gesteuert. Üblicherweise nimmt die Größe der Kultur im Verlauf der Kaskade zu, d.h. die Starterkultur stellt eine vergleichsweise kleine Kultur dar und die erste Vorkultur ist im Vergleich zu dieser bereits größer. Die optionale zweite Vorkultur und etwaige weitere Vorkulturen sind dann vorzugsweise ebenfalls größer als die jeweils vorangegangene Vorkultur. Die Hauptkultur dient dazu, die fermentierte Biomasse in möglichst großem Umfang herzustellen und stellt daher üblicherweise die größte der Kulturen dar. Daher ist es bevorzugt, dass das Volumen der Behälter in der Kaskade vom optionalen Starterkulturbehälter über den ersten Vorkulturbehälter über den optionalen zweiten Vorkulturbehälter (und gegebenenfalls weitere Vorkulturbehälter) zum Hauptkulturbehälter zunimmt. According to the invention, the pre-culture and main culture containers are connected or connectable to one another via controllable valve couplings such that the contents of one container can be partially or completely transferred to the next container. Starting with the first pre-culture container, the containers are connected or connectable to the main culture container via the second or possible additional pre-culture containers. Any suitable valve couplings can be used for this purpose. These are known to those skilled in the art. The controllable valve couplings are preferably controlled via a software-based process control system. Typically, the size of the culture increases over the course of the cascade, i.e. the starter culture is a comparatively small culture and the first pre-culture is already larger in comparison. The optional second pre-culture and any further pre-cultures are then preferably also larger than the respective preceding pre-culture. The main culture serves to produce the fermented biomass on the largest possible scale and is therefore usually the largest of the cultures. Therefore, it is preferred that the volume of the containers in the cascade increases from the optional starter culture container via the first pre-culture container via the optional second pre-culture container (and optionally further pre-culture containers) to the main culture container.

Jeder der vorstehend genannten Behälter umfasst vorzugsweise ein Gehäuse sowie einen Gehäusedeckel. Das Gehäuse sowie der Deckel jedes Behälters können unabhängig voneinander aus jedem geeigneten Material bestehen. Vorzugsweise bestehen Gehäuse und Deckel aus hitze- und druckbeständigen Materialien, so dass diese ohne Weiteres den bei der Fermentation üblichen Bedingungen für eine Hitzesterilisation bzw. für ein Autoklavieren standhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Gehäuse und/oder der Deckel aus Edelstahl. Jeder Behälter kann unabhängig voneinander auch jedwede geeignete Form aufweisen. Beispielsweise können die Behälter eine für Fermentationsreaktoren übliche im Wesentlichen zylindrische Form aufweisen. Each of the aforementioned containers preferably comprises a housing and a housing lid. The housing and lid of each container can independently consist of any suitable material. Preferably, the housing and lid are made of heat- and pressure-resistant materials so that they can easily withstand the heat sterilization and autoclaving conditions typical for fermentation. In a preferred embodiment of the present invention, the housing and/or the lid are made of stainless steel. Each container can independently also have any suitable shape. For example, the containers can have a substantially cylindrical shape typical for fermentation reactors.

Andere Formen, beispielsweise mit einem rechteckigen, quadratischen oder ovalen Querschnitt sind aber ebenfalls möglich. Other shapes, for example with a rectangular, square or oval cross-section, are also possible.

Das Gehäuse und der Deckel sind miteinander verbunden oder verbindbar. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Behälter durch den Deckel aseptisch verschließbar. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einem aseptisch verschließbaren Deckel verstanden, dass dieser kontaminationssicher und gasdicht verschließbar ist, so dass im verschlossenen Zustand keine Fremdkeime in die Behälter eindringen können. Der Deckel kann zum Befüllen und/oder Reinigen geöffnet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Deckel mittels eines Schraubverschlusses, mittels eines Drehverschlusses, mittels einer Klemmverschraubung über Klemmen oder mittels eines oder mehrerer Spannringe mit dem Gehäuse verbunden bzw. verbindbar. Bei dem Schraubverschluss kann es sich beispielsweise um eine Milchrohrverschraubung aus Edelstahl handeln. Besonders bevorzugt ist eine Klemmverschraubung über Klemmen. The housing and the lid are connected or connectable to one another. According to a preferred embodiment, the containers can be aseptically closed by the lid. In the context of the present invention, an aseptically sealable lid is understood to mean that it can be closed in a contamination-proof and gas-tight manner, so that no foreign germs can penetrate into the container when closed. The lid can be opened for filling and/or cleaning. In a preferred embodiment of the present invention, the lid is connected or connectable to the housing by means of a screw cap, a twist cap, a compression fitting via clamps, or one or more clamping rings. The screw cap can be, for example, a dairy pipe fitting made of Stainless steel. A compression fitting using clamps is particularly preferred.

Jeder der Vor- und Hauptkulturbehälter des erfindungsgemäßen Kaskadensystems weist eine Rühr-, Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung auf. Diese dient insbesondere dazu, den festen Anteil des Behälterinhalts zu zerkleinern und/oder den Behälterinhalt umzurühren. Auf diese Weise kann die Wuchsfreudigkeit der Zellkultur (beispielsweise des Myzels) erhöht werden, indem neue Wachstumspole freigelegt werden. Weiterhin erleichtert eine Zerkleinerung den nachfolgenden Transfer des Behälterinhalts in einen anderen Fermentationsbehälter. Die Rühr-, Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung kann jede Vorrichtung sein, die zum Zerkleinern des festen Anteils des Behälterinhalts und/oder zum Umrühren des Behälterinhalts geeignet ist. Vorzugsweise ist die Rühr-, Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung aus einem Dispergierer, einem Häcksler und/oder einem Rührwerk ausgewählt. Die Rühr-, Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung kann in dem Behälter an jeder geeigneten Position angeordnet sein. So kann diese beispielsweise innen am Deckel befestigt sein und von oben in den Behälter hineinragen. Alternativ ist es aber auch möglich, dass die Rühr-, Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung am Boden des Gehäuses angeordnet ist. Vorzugsweise ragt sie in diesem Fall von unten in den Behälter hinein. Weitere Ausgestaltungen sind ebenfalls möglich. Der Behälter kann beispielsweise seitlich ein angeflanschtes Rohrsystem aufweisen, durch das der Behälterinhalt mittels einer Pumpe durchgepumpt werden kann und in dem sich auch die Rühr-, Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung befindet. Each of the pre-culture and main culture vessels of the cascade system according to the invention has a stirring, dispersing, and/or cutting device. This serves in particular to comminute the solid portion of the vessel contents and/or to stir the vessel contents. In this way, the vigor of the cell culture (for example, the mycelium) can be increased by exposing new growth poles. Furthermore, comminution facilitates the subsequent transfer of the vessel contents to another fermentation vessel. The stirring, dispersing, and/or cutting device can be any device suitable for comminuting the solid portion of the vessel contents and/or for stirring the vessel contents. Preferably, the stirring, dispersing, and/or cutting device is selected from a disperser, a chopper, and/or an agitator. The stirring, dispersing, and/or cutting device can be arranged in any suitable position within the vessel. For example, it can be attached to the inside of the lid and protrude into the vessel from above. Alternatively, it is also possible for the stirring, dispersing, and/or cutting device to be located at the bottom of the housing. In this case, it preferably extends into the container from below. Other configurations are also possible. For example, the container can have a flanged pipe system on the side through which the container contents can be pumped by means of a pump, and in which the stirring, dispersing, and/or cutting device is also located.

Jeder der Vor- und Hauptkulturbehälter des erfindungsgemäßen Kaskadensystems weist ferner einen Einlass zur Zufuhr von Nährmedium auf. Über diesen Einlass können bei Bedarf auch andere Komponenten als das Nährmedium zugegeben werden. Der Einlass kann jede geeignete Öffnung an dem Behälter sein, durch die Nährmedium und gegebenenfalls auch weitere Komponenten zugeführt werden können. Der Einlass kann beispielsweise der vorstehend genannte Gehäusedeckel sein. Es ist aber auch möglich, dass an dem Gehäuse oder Gehäusedeckel eine weitere Öffnung vorhanden ist, durch die das Nährmedium zugeführt werden kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die vorstehend beschriebene steuerbare Ventilkupplung an dem jeweiligen Behälter den Einlass zur Zufuhr von Nährmedium dar. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Einlass zur Zufuhr von Nährmedium um eine Sterilkupplung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einer Sterilkupplung eine Verbindungskupplung für Rohr- bzw. Schlauchleitungen verstanden, die sterilisierbar ist. Diese kann beispielsweise aus Edelstahl, Titan, Legierungen aus Nickel, Molybdän, Chrom und Eisen und Kombinationen davon aufgebaut sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Sterilkupplung totraumfrei. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Sterilkupplung zur in-line Sterilisation mit Dampf (SIP - „Sterilization in Place“) geeignet. Ganz besonders bevorzugt ist die Sterilkupplung eine flachdichtende Sterilkupplung. Die Sterilkupplung ist derart ausgestaltet, dass über sie Nährmedium und ggf. weitere Komponenten dem Behälter zugeführt werden können und/oder der Behälterinhalt teilweise oder im Wesentlichen vollständig entnommen oder in einen weiteren Behälter überführt werden kann, ohne dass dazu der Behälter geöffnet werden muss. Each of the pre-culture and main culture containers of the cascade system according to the invention further comprises an inlet for supplying nutrient medium. Components other than the nutrient medium can also be added via this inlet if required. The inlet can be any suitable opening on the container through which nutrient medium and optionally also further components can be supplied. The inlet can, for example, be the aforementioned housing cover. However, it is also possible for a further opening to be present on the housing or housing cover through which the nutrient medium can be supplied. According to a preferred embodiment of the present invention, the above-described controllable valve coupling on the respective container provides the Inlet for supplying nutrient medium. According to another preferred embodiment of the present invention, the inlet for supplying nutrient medium is a sterile coupling. In the context of the present invention, a sterile coupling is understood to be a connecting coupling for pipes or hoses that can be sterilized. This can be made, for example, from stainless steel, titanium, alloys of nickel, molybdenum, chromium and iron, and combinations thereof. In a preferred embodiment of the present invention, the sterile coupling is free of dead spaces. In a further preferred embodiment, the sterile coupling is suitable for in-line sterilization with steam (SIP - "Sterilization in Place"). Most preferably, the sterile coupling is a flat-sealing sterile coupling. The sterile coupling is designed such that nutrient medium and, if necessary, other components can be supplied to the container via it and/or the container contents can be partially or essentially completely removed or transferred to another container without the container having to be opened.

Jeder der Vor- und Hauptkulturbehälter des erfindungsgemäßen Kaskadensystems weist ferner ein Druckausgleichsventil auf, welches dazu dient, den Aufbau eines Überdrucks im Behälter während der Sterilisation oder der Fermentation zu verhindern. Ebenso wie der Einlass zur Zufuhr von Nährmedium kann das Druckausgleichsventil an jeder geeigneten Stelle des Behälters angeordnet sein, beispielsweise am Deckel oder am Gehäuse. Wenn das Druckausgleichsventil am Gehäuse angeordnet ist, sollte es sich vorzugsweise oberhalb der maximalen Füllhöhe des Behälters, beispielsweise im oberen Drittel des Gehäuses, befinden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Druckausgleichsventil ein federbelastetes Rückschlagventil. Each of the pre-culture and main culture containers of the cascade system according to the invention further comprises a pressure equalization valve, which serves to prevent the buildup of excess pressure in the container during sterilization or fermentation. Like the inlet for supplying nutrient medium, the pressure equalization valve can be arranged at any suitable location on the container, for example, on the lid or on the housing. If the pressure equalization valve is arranged on the housing, it should preferably be located above the maximum fill level of the container, for example, in the upper third of the housing. According to a preferred embodiment, the pressure equalization valve is a spring-loaded check valve.

Jeder der Behälter des erfindungsgemäßen Kaskadensystems weist ferner einen Einlass für Druckgas für die Zufuhr von Druckgas auf, was der Belüftung (vorzugsweise der Sauerstoffversorgung) des Behälterinhalts und/oder dem Umrühren des Behälterinhalts dient. Der Einlass für Druckgas kann an jeder geeigneten Stelle des Behälters angeordnet sein, beispielsweise am Deckel oder am Gehäuse. Vorzugsweise ist dieser jedoch am Gehäuse angeordnet und dort besonders bevorzugt unterhalb der maximalen Füllhöhe des Behälters, beispielsweise im unteren Drittel des Gehäuses. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Einlass für Druckgas um ein Druckluftzustromventil. Each of the containers of the cascade system according to the invention further comprises a compressed gas inlet for supplying compressed gas, which serves to aerate (preferably supply oxygen) the container contents and/or to stir the container contents. The compressed gas inlet can be arranged at any suitable location on the container, for example on the lid or on the housing. Preferably, however, it is arranged on the housing and there particularly preferably below the maximum filling level of the container, for example in the lower third of the housing. In a preferred In one embodiment of the present invention, the inlet for compressed gas is a compressed air inlet valve.

Jeder der Behälter kann weitere optionale Komponenten umfassen. Der Behälter kann beispielsweise weiter eine Heizvorrichtung aufweisen, welche zur Sterilisation des Behälterinhalts und/oder zur Bereitstellung der erforderlichen Temperaturen für die Fermentation eingerichtet ist. Diese Heizvorrichtung kann beispielsweise am Boden des Gehäuses und/oder im Mantel bzw. in den Seitenwänden des Gehäuses (ggf. in Form eines doppelwandigen Behälters) angeordnet sein. Each of the containers can comprise further optional components. For example, the container can further comprise a heating device configured to sterilize the container contents and/or to provide the required temperatures for fermentation. This heating device can be arranged, for example, at the bottom of the housing and/or in the shell or side walls of the housing (possibly in the form of a double-walled container).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Kaskadensystem weiter ein softwarebasiertes Prozessleitsystem zur Steuerung und Überwachung der Fermentation sowie der Überführung des Inhalts eines Behälters in den jeweils nächsten Behälter oder ist mit diesem verbindbar. Dazu kann das softwarebasiertes Prozessleitsystem insbesondere zur Steuerung der steuerbaren Ventilkupplungen dienen. Es ist weiter besonders bevorzugt, dass mindestens ein Behälter einen Sensor zur Messung des Bewuchses der Kultur im Behälter aufweist, welcher mit dem softwarebasiertes Prozessleitsystem verbunden oder verbindbar ist. Vorzugsweise umfassen alle Behälter einen entsprechenden Sensor. Geeignete Sensoren sind beispielsweise Temperatur-, pH- und Gelöstsauerstoffsensoren. Weiterhin kommen auch photometrische Sensoren in Betracht, mit denen die Durchdringung eines Lichtsignals durch die Kultur gemessen werden kann. Mit diesen Sensoren ist es möglich, den Fortschritt der Fermentation zu erfassen und entsprechend eine Zerkleinerung des jeweiligen Behälterinhalts sowie die Überführung eines Behälterinhalts in den nächsten Behälter (beispielsweise von dem ersten Vorkulturbehälter in den Hauptkulturbehälter) zu initiieren. Durch das softwarebasierte Prozessleitsystem kann dies alles automatisiert und zum jeweils günstigsten Zeitpunkt (bezogen insbesondere auf die Steuerung der Ventile, die den Inhalt des einen Behälters in den nächsten entlassen) erfolgen, so dass keine aktive Überwachung des Prozesses durch das Laborpersonal notwendig ist. Beispielsweise kann die erste Vorkultur aus dem ersten Vorkulturbehälter nach etwa 4 bis 6 Tagen in den nächsten Behälter entlassen werden, die optionale zweite Vorkultur aus dem zweiten Vorkulturbehälter nach etwa 3 bis 5 Tagen in den nächsten Behälter entlassen werden und die Hauptkultur kann beispielsweise nach etwa 5 bis 10 Tagen entlassen werden. Das softwarebasierte Prozessleitsystem kann darüber hinaus die Durchmischung der Biomasse in den einzelnen Behältern über den Einstrom von Druckluft und/oder über die Rührwerke steuern. Dabei ist beispielsweise eine Erhöhung der Durchmischung/Drehzahl sowie des Lufteintrags in das System mit steigender Zelldichte/Biomasse möglich. Dies kann beispielsweise anhand der Gelöstsauerstoffkonzentration oder anhand der Viskosität gesteuert werden. Dabei kann zum Beispiel ein bestimmter Sauerstoffwert als Sollwert vorgegeben werden. In a further preferred embodiment of the present invention, the cascade system further comprises a software-based process control system for controlling and monitoring the fermentation and the transfer of the contents of one container to the next container, or is connectable to the latter. For this purpose, the software-based process control system can be used, in particular, to control the controllable valve couplings. It is further particularly preferred that at least one container has a sensor for measuring the growth of the culture in the container, which sensor is connected or connectable to the software-based process control system. Preferably, all containers comprise a corresponding sensor. Suitable sensors include, for example, temperature, pH, and dissolved oxygen sensors. Photometric sensors, with which the penetration of a light signal through the culture can be measured, are also contemplated. These sensors make it possible to detect the progress of the fermentation and accordingly initiate comminution of the respective container contents and the transfer of a container content to the next container (for example, from the first pre-culture container to the main culture container). The software-based process control system allows all of this to be automated and performed at the most convenient time (particularly with regard to the control of the valves that release the contents of one container into the next), eliminating the need for active monitoring of the process by laboratory personnel. For example, the first pre-culture can be released from the first pre-culture container into the next container after approximately 4 to 6 days, the optional second pre-culture can be released from the second pre-culture container into the next container after approximately 3 to 5 days, and the main culture can be released after approximately 5 to 10 days. The software-based process control system Furthermore, the mixing of the biomass in the individual containers can be controlled via the inflow of compressed air and/or via the agitators. For example, the mixing speed and air input into the system can be increased with increasing cell density/biomass. This can be controlled, for example, based on the dissolved oxygen concentration or viscosity. For example, a specific oxygen value can be specified as a target value.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kaskadensystems ist mindestens einer der Behälter an eine Reinigungs- und/oder Hygenisierungsanlage angeschlossen oder anschließbar. Besonders bevorzugt sind alle Behälter an eine zentrale Reinigungs- und/oder Hygenisierungsanlage angeschlossen oder anschließbar. Entsprechende Anlagen sind dem Fachmann bekannt. Weiterhin ist es bevorzugt, dass zumindest ein Behältereinlass zur Zufuhr von Nährmedium eine Dampfsterilisationseinrichtung aufweist. Besonders bevorzugt weisen alle Behälter am Behältereinlass eine Dampfsterilisationseinrichtung auf. Auf diese Weise kann die Reinigung bzw. Hygienisierung des oder der Behälter sowie der entsprechenden Einlässe ebenfalls automatisiert erfolgen, ohne dass eine manuelle Reinigung oder Hygienisierung durch das Laborpersonal erforderlich ist. In a preferred embodiment of the cascade system according to the invention, at least one of the containers is connected or connectable to a cleaning and/or sanitizing system. Particularly preferably, all containers are connected or connectable to a central cleaning and/or sanitizing system. Such systems are known to those skilled in the art. Furthermore, it is preferred that at least one container inlet for supplying nutrient medium has a steam sterilization device. Particularly preferably, all containers have a steam sterilization device at the container inlet. In this way, the cleaning or sanitizing of the container(s) and the corresponding inlets can also be automated, without the need for manual cleaning or sanitizing by laboratory personnel.

Der kaskadenartige Aufbau des erfindungsgemäßen Kaskadensystems zur Fermentation von Biomasse und die Verbindung der einzelnen Behälter über steuerbare Ventile erübrigt menschliche Eingriffe während der Inkubation der Vorkulturen. Daher kommt ein mit dieser Anlage betriebener Prozess ohne mikrobiologisch geschultes Fachpersonal aus. Darüber hinaus erlaubt der modulare Aufbau der einzelnen Behälter die flexible Erweiterung des Systems gemäß den individuellen Anforderungen an einen gegebenen Bioprozess. Ferner erleichtert die optionale Einbindung aller Behälter in eine zentrale Reinigungs- und Hygienisierungsanlage die Reinigung und Hygienisierung des Systems und erübrigt menschliches Zutun weitestgehend. Eine manuelle Reinigung und Sterilisierung einzelner Gefäße und Instrumente entfällt somit. Der Einbau eines Zerkleinerungssystems in die einzelnen Behälter ermöglicht ferner die vollautomatische Zerkleinerung der Biomasse vor der Überführung in den nächsten Behälter, ohne dass ein Öffnen der Behälter nötig wäre. Das verringert den Arbeitsaufwand und die Gefahr einer Kontamination mit einem Fremdkeim. Das Kaskadensystem lässt sich in einer bevorzugten Ausführungsform kontaminationsfrei über eine Starterkultur, die vorzugsweise mittels einer totraumfreien Sterilkupplung an den ersten Vorkulturbehälter angeschlossen werden kann, beimpfen. Das reduziert den Arbeitsaufwand, die instrumentellen Anforderungen (hinsichtlich Sterillabor) und die Gefahr einer Kontamination mit einem Fremdkeim. Die vorzugsweise Computer-gestützte Prozessführung optimiert den Prozessablauf und gewährleistet den Übergang von einem Behälter zum nächsten in der optimalen Wuchsphase der Kultur. Darüber hinaus wird die Zerkleinerung der Biomasse hierüber optimal gesteuert. The cascade-like structure of the inventive cascade system for the fermentation of biomass and the connection of the individual containers via controllable valves eliminates the need for human intervention during the incubation of the pre-cultures. Therefore, a process operated with this system does not require microbiologically trained personnel. Furthermore, the modular design of the individual containers allows for flexible expansion of the system according to the individual requirements of a given bioprocess. Furthermore, the optional integration of all containers into a central cleaning and sanitization system facilitates cleaning and sanitization of the system and largely eliminates the need for human intervention. Manual cleaning and sterilization of individual vessels and instruments is thus eliminated. Furthermore, the installation of a comminution system in the individual containers enables fully automated comminution of the biomass before transfer to the next container, without the need to open the containers. This reduces labor and the risk of contamination with foreign germs. In a preferred embodiment, the cascade system can be inoculated contamination-free using a starter culture, which can preferably be connected to the first pre-culture container using a dead-space-free sterile coupling. This reduces labor, instrumentation requirements (regarding a sterile laboratory), and the risk of contamination with foreign germs. The preferably computer-assisted process control optimizes the process flow and ensures the transition from one container to the next during the optimal growth phase of the culture. Furthermore, the comminution of the biomass is optimally controlled.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Fermentation von Biomasse, umfassend (a) das Bereitstellen einer Starterkultur, (b) das kontaminationsfreie Überführen der Starterkultur, vorzugweise über eine Sterilkupplung, in einen ersten Vorkulturbehälter, (c) das Fermentieren von Biomasse im ersten Vorkulturbehälter, welches durch die Starterkultur initiiert wird, um eine erste Vorkultur zu erhalten, (d) das teilweise oder vollständige Überführen der ersten Vorkultur aus dem ersten Vorkulturbehälter in einen Hauptkulturbehälter und (e) das Fermentieren von weiterer Biomasse im Hauptkulturbehälter, um eine fermentierte Biomasse zu erhalten. The present invention further relates to a method for the fermentation of biomass, comprising (a) providing a starter culture, (b) transferring the starter culture, preferably via a sterile coupling, into a first pre-culture container in a contamination-free manner, (c) fermenting biomass in the first pre-culture container, which is initiated by the starter culture, in order to obtain a first pre-culture, (d) partially or completely transferring the first pre-culture from the first pre-culture container into a main culture container and (e) fermenting further biomass in the main culture container in order to obtain a fermented biomass.

In Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zunächst eine Starterkultur bereitgestellt. Erfindungsgemäß kann jede geeignete Starterkultur für die jeweils vorgesehene Fermentation verwendet werden. Beispielsweise können dies Starterkulturen für die Fermentation unter Verwendung von Bakterien-, Pilz- oder sonstigen biologischen Zellkulturen sein. Ebenso kann die Starterkultur Enzyme (Fermente) enthalten, welche die Fermentation im Rahmen ihres enzym katalysierten Stoffwechsels ausführen. Vorzugsweise enthält die Starterkultur Pilzbiomasse (Myzel). Dabei wird die Fermentation unter Verwendung von Pilzkulturen durchgeführt. Dementsprechend enthält auch die fermentierte Biomasse - als Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens - vorzugsweise Pilzbiomasse (Myzel). Die vorliegende Erfindung kann aber auch für Fermentationen unter Verwendung von Hefen eingesetzt werden, beispielsweise auch in Zusammenhang mit Präzisionsfermentationsprozessen. Vorzugsweise wird die Starterkultur in dem vorstehend beschriebenen Starterkulturbehälter bereitgestellt. In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Starterkultur kontaminationsfrei in einen ersten Vorkulturbehälter überführt. Vorzugsweise erfolgt diese Überführung aus einem Starterkulturbehälter, der eine Sterilkupplung aufweist. Bei dem ersten Vorkulturbehälter handelt es sich bevorzugt um den vorstehend beschriebenen ersten Vorkulturbehälter. Entsprechende Sterilkupplungen wurden ebenfalls bereits vorstehend beschrieben. In step (a) of the process according to the invention, a starter culture is first provided. According to the invention, any suitable starter culture for the particular fermentation intended can be used. For example, these can be starter cultures for fermentation using bacterial, fungal, or other biological cell cultures. The starter culture can also contain enzymes (ferments) that carry out the fermentation as part of their enzyme-catalyzed metabolism. Preferably, the starter culture contains fungal biomass (mycelium). The fermentation is carried out using fungal cultures. Accordingly, the fermented biomass—as a product of the process according to the invention—preferably also contains fungal biomass (mycelium). However, the present invention can also be used for fermentations using yeasts, for example, in connection with precision fermentation processes. The starter culture is preferably provided in the starter culture container described above. In step (b) of the method according to the invention, the starter culture is transferred contamination-free into a first pre-culture container. This transfer preferably takes place from a starter culture container that has a sterile coupling. The first pre-culture container is preferably the first pre-culture container described above. Corresponding sterile couplings have also already been described above.

In Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Fermentieren von Biomasse im ersten Vorkulturbehälter, welches durch die Starterkultur initiiert wird, um eine erste Vorkultur zu erhalten. Dazu kann jedwede Biomasse verwendet werden, die als Nährmedium zur Kultivierung von Mikroorganismen geeignet ist. Entsprechende Nährmedien sind dem Fachmann bekannt und sind in Abhängigkeit von der vorgesehenen Fermentationsprodukt wählbar. Ganz allgemein setzt sich ein entsprechendes Nährmedium aus mindestens einer Kohlenhydrat- und Stickstoffquelle zusammen, die als Substrat beispielsweise für die Pilzzellen dienen. Bei dem Nährmedium kann es sich beispielsweise um ein stärke- und/oder proteinhaltiges Mehl oder um ein künstliches Nährmedium handeln. Beispielsweise kann es sich dabei um jeden N- und C-haltige agroindustriellen Nebenstrom handeln (stärkehaltige Fraktionen aus der Proteinisolation (bspw. aus Leguminosen), Kleie, etc.). Zusätzlich kann das Medium optional ein Geliermittel wie beispielsweise Stärke, Agar Agar, Agarose, Pektin oder Gelatine enthalten, um ein Aushärten bzw. Gelieren bei Hitzebehandlung zu ermöglichen. Besonders bevorzugt wird als Biomasse eine stärkehaltige Fraktion aus der Erbse verwendet, die ein Nebenprodukt der Proteinisolierung darstellt. Diese Fraktion ist hinreichend in Bezug auf C- und N-Quellen und geliert dank der Stärke. Unter Hitzebehandlung wird in diesem Zusammenhang die Behandlung bei einer Temperatur von mindestens 72°C bezeichnet. Vorzugsweise wird eine Temperatur von mindestens 95°C für die Hitzebehandlung verwendet, besonders bevorzugt eine Temperatur im Bereich von 105°C bis 125°C. In step (c) of the process according to the invention, biomass is fermented in the first preculture container, initiated by the starter culture, to obtain a first preculture. Any biomass suitable as a nutrient medium for cultivating microorganisms can be used for this purpose. Suitable nutrient media are known to those skilled in the art and can be selected depending on the intended fermentation product. Generally speaking, a suitable nutrient medium consists of at least one carbohydrate and nitrogen source, which serve as a substrate, for example, for the fungal cells. The nutrient medium can be, for example, a starch- and/or protein-containing flour or an artificial nutrient medium. For example, it can be any N- and C-containing agro-industrial side stream (starch-containing fractions from protein isolation (e.g., from legumes), bran, etc.). Additionally, the medium can optionally contain a gelling agent such as starch, agar agar, agarose, pectin, or gelatin to enable hardening or gelling upon heat treatment. A starchy fraction from peas, a by-product of protein isolation, is particularly preferably used as the biomass. This fraction is sufficient in terms of C and N sources and gels thanks to the starch. Heat treatment in this context refers to treatment at a temperature of at least 72°C. Preferably, a temperature of at least 95°C is used for the heat treatment, particularly preferably a temperature in the range of 105°C to 125°C.

Das Fermentieren der Biomasse erfolgt durch die übliche, dem Fachmann bekannte Art und Weise. Die Dauer der Fermentation kann dabei in geeigneter Weise gewählt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Fermentationsdauer in Schritt (c) 2 Tage bis 14 Tage und vorzugsweise 5 bis 10 Tage. Weiterhin kann während des Fermentierens Druckluft zugeführt werden. Dies dient der Belüftung (vorzugsweise der Sauerstoffversorgung) und/oder dem Umrühren des Behälterinhalts. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Inhalt des ersten Vorkulturbehälters während des Fermentierens mittels einer Dispergier- und/oder Schneidevorrichtung mindestens einmal für eine Dauer von mindestens 10 Sekunden zerkleinert bzw. homogenisiert. Dies ermöglicht es, unerwünschte Pellets, die sich während der Fermentation bilden (beispielsweise Myzelpellets) während der laufenden Kultivierung des Myzels ohne menschliches Zutun und ohne die Gefahr eines Eintrags von unerwünschten Fremdkeimen mechanisch aufzubrechen. Damit gelingt es, im laufenden Prozess neue Wachstumspole freizulegen, das Myzel zu verjüngen und insgesamt den Ertrag zu erhöhen. Erfindungsgemäß wird der Behälterinhalt im sterilen Zustand umgewälzt und zeitgleich zerkleinert, um die Pellets aufzubrechen und zu zerkleinern. Es werden einzelne Fragmente (beispielsweise Myzelfragmente) in das umgebende Medium freigesetzt. Diese können sich neu verzweigen und so an mehreren Polen wachsen. Da die Zerkleinerung der Pellets weder die Unterbrechung des Fermentationsprozesses noch das Öffnen des Behälters erfordert, resultiert hieraus auch kein erhöhtes Kontam inationsrisiko. The biomass is fermented in a conventional manner known to those skilled in the art. The duration of the fermentation can be chosen as appropriate. According to a preferred embodiment of the present invention, the fermentation duration in step (c) is 2 to 14 days, and preferably 5 to 10 days. Furthermore, compressed air can be supplied during the fermentation. This serves to aerate (preferably supply oxygen) and/or stir the container contents. In a preferred embodiment, the contents of the first preculture container are comminuted or homogenized at least once during fermentation using a dispersing and/or cutting device for a duration of at least 10 seconds. This makes it possible to mechanically break up unwanted pellets that form during fermentation (e.g., mycelium pellets) during the ongoing cultivation of the mycelium without human intervention and without the risk of introducing unwanted foreign germs. This makes it possible to expose new growth poles during the ongoing process, rejuvenate the mycelium, and increase the overall yield. According to the invention, the container contents are circulated in a sterile state and simultaneously comminuted to break up and comminute the pellets. Individual fragments (e.g., mycelium fragments) are released into the surrounding medium. These fragments can re-branch and thus grow at multiple poles. Since the crushing of the pellets does not require interruption of the fermentation process or opening of the container, there is no increased risk of contamination.

In Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das teilweise oder vollständige Überführen der ersten Vorkultur aus dem ersten Vorkulturbehälter in einen Hauptkulturbehälter. Bei diesem handelt es sich vorzugsweise um den vorstehend beschriebenen Hauptkulturbehälter. Wie vorstehend beschrieben, ist dieser Hauptkulturbehälter vorzugsweise größer als der erste Vorkulturbehälter. In step (d) of the method according to the invention, the first preculture is partially or completely transferred from the first preculture container into a main culture container. This is preferably the main culture container described above. As described above, this main culture container is preferably larger than the first preculture container.

In Schritt (e) erfolgt schließlich das Fermentieren von weiterer Biomasse im Hauptkulturbehälter, um eine fermentierte Biomasse zu erhalten. Für diesen Fermentierungsschritt gelten die gleichen Ausführungen wir zuvor für den Fermentierungsschritt im ersten Vorkulturbehälter, nur dass hier eine größere Menge an Hauptkultur im Vergleich zu der Vorkultur erzeugt wird. Vorzugsweise enthält die fermentierte Biomasse Pilzbiomasse. Finally, in step (e), additional biomass is fermented in the main culture vessel to obtain a fermented biomass. The same explanations apply to this fermentation step as for the fermentation step in the first pre-culture vessel, except that a larger amount of main culture is produced compared to the pre-culture. The fermented biomass preferably contains fungal biomass.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Kaskadensystem durchgeführt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird bei dem Verfahren die erste Vorkultur zunächst in einen zweiten Vorkulturbehälter überführt, in welchem weitere Biomasse fermentiert wird und diese dann teilweise oder vollständig in den Hauptkulturbehälter überführt wird. Vorzugsweise umfasst das Verfahren während mindestens eines Fermentierungsschrittes weiter das Zerkleinern und/oder das Umrühren des Behälterinhaltes. Ebenso ist es bevorzugt, dass das Verfahren während mindestens eines Fermentierungsschrittes weiter den Schritt des Belüftens des Behälterinhaltes mit Luft umfasst. In a preferred embodiment, the process according to the invention is carried out in the cascade system according to the invention described above. According to a further preferred embodiment, the first preculture is first transferred to a second preculture container, in which further biomass is fermented and then partially or completely transferred to the main culture container. Preferably, the method further comprises comminuting and/or stirring the container contents during at least one fermentation step. It is also preferred that the method further comprises the step of aerating the container contents with air during at least one fermentation step.

Die Erfindung wird nun anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Behälters zur Fermentation von Biomasse beschrieben. The invention will now be described using an embodiment with reference to a schematic representation of a container according to the invention for the fermentation of biomass.

Figur 1 zeigt ein Kaskadensystem, welches einen Starterkulturbehälter 1 mit einer Sterilkupplung 2 aufweist. Der Starterkulturbehälter 1 ist über die Sterilkupplung 2 mit einen ersten Vorkulturbehälter 3 verbunden. Der erste Vorkulturbehälter 3 ist wiederum über eine steuerbare Ventilkupplung 4 mit einem zweiten Vorkulturbehälter 5 verbunden. Dieser ist über eine weitere steuerbare Ventilkupplung 6 mit einem Hauptkulturbehälter 7 verbunden. Jeder der Behälter umfasst ein Gehäuse sowie einen Gehäusedeckel (der auch als Einlass zur Zufuhr von Nährmedium dient). Die Vorkulturbehälter 3 und 5 sowie der Hauptkulturbehälter 7 weisen ferner eine Dispergiervorrichtung, ein Druckausgleichsventil sowie einen Einlass für Druckgas auf (nicht gezeigt). Figure 1 shows a cascade system comprising a starter culture container 1 with a sterile coupling 2. The starter culture container 1 is connected to a first pre-culture container 3 via the sterile coupling 2. The first pre-culture container 3 is in turn connected to a second pre-culture container 5 via a controllable valve coupling 4. This second pre-culture container 5 is connected to a main culture container 7 via a further controllable valve coupling 6. Each of the containers comprises a housing and a housing lid (which also serves as an inlet for supplying nutrient medium). The pre-culture containers 3 and 5, as well as the main culture container 7, further comprise a dispersing device, a pressure equalization valve, and an inlet for compressed gas (not shown).

Bezugszeichenliste List of reference symbols

1 Starterkulturbehälter 1 starter culture container

2 Sterilkupplung 2 sterile coupling

3 Erster Vorkulturbehälter 3 First pre-culture container

4 Steuerbare Ventilkupplung 4 Controllable valve coupling

5 Zweiter Vorkulturbehälter 5 Second pre-culture container

6 Steuerbare Ventilkupplung 6 Controllable valve coupling

7 Hauptkulturbehälter 7 Main culture containers

Claims

Patent claims

1. Cascade system for the fermentation of biomass, comprising

- a first pre-culture container,

- an optional second pre-culture container and

- a main culture container, which are connected or connectable to one another in this order via controllable valve couplings in such a way that the contents of one container can be transferred partially or completely into the next container, each container

- a stirring, dispersing and/or cutting device,

- an inlet for the supply of nutrient medium,

- a pressure equalization valve and

- has an inlet for compressed gas.

2. Cascade system according to claim 1, which further comprises a starter culture container which is arranged in the cascade in front of the first pre-culture container and is connected or connectable to the first pre-culture container via a sterile coupling.

3. Cascade system according to claim 1 or 2, wherein the volume of the containers in the cascade increases from the optional starter culture container via the first pre-culture container via the optional second pre-culture container to the main culture container.

4. Cascade system according to one of claims 1 to 3, wherein the volume of the main culture container is in the range between 1,000L and 50,000L and the volume of the first and/or optional second pre-culture container is in the range between 10L and 500L.

5. Cascade system according to one of claims 1 to 4, which further comprises a software-based process control system for controlling and monitoring the fermentation and the transfer of the contents of one container into the next container or is connectable thereto.

6. Cascade system according to claim 5, wherein at least one container has a sensor for measuring the growth of the culture in the container, which sensor is connected or connectable to the software-based process control system.

7. Cascade system according to one of claims 1 to 6, wherein at least one container is connected or connectable to a cleaning and/or sanitizing system.

8. Cascade system according to claim 7, wherein all containers are connected or connectable to a central cleaning and/or sanitizing system.

9. Cascade system according to one of claims 1 to 8, wherein at least one container inlet for supplying nutrient medium has a steam sterilization device.

10. Cascade system according to one of claims 1 to 9, wherein the controllable valve coupling on the respective container represents the inlet for supplying nutrient medium.

11. Cascade system according to one of claims 1 to 10, wherein the stirring, dispersing and/or cutting device is selected from a disperser, a chopper and/or an agitator.

12. A process for the fermentation of biomass, comprising

(a) providing a starter culture,

(b) the contamination-free transfer of the starter culture, preferably via a sterile coupling, into a first pre-culture container,

(c) fermenting biomass in the first pre-culture container, which is initiated by the starter culture, to obtain a first pre-culture,

(d) the partial or complete transfer of the first pre-culture from the first pre-culture container into a main culture container and

(e) fermenting further biomass in the main culture vessel to obtain a fermented biomass.

13. The method according to claim 12, which is carried out in the cascade system according to one of claims 1 to 11.

14. The method according to claim 12 or 13, wherein the first pre-culture is first transferred into a second pre-culture container in which further biomass is fermented and this is then partially or completely transferred into the main culture container.

15. A method according to any one of claims 12 to 14, which further comprises comminuting and/or stirring the contents of the container during at least one fermentation step.

16. A method according to any one of claims 12 to 15, which further comprises the step of aerating the container contents with air during at least one fermentation step.

17. The method according to claim 16, wherein the fermented biomass contains fungal biomass (mycelium).