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WO2025058075A1 - 放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物、及び放射性組成物 - Google Patents

放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物、及び放射性組成物 Download PDF

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Publication number
WO2025058075A1
WO2025058075A1 PCT/JP2024/032966 JP2024032966W WO2025058075A1 WO 2025058075 A1 WO2025058075 A1 WO 2025058075A1 JP 2024032966 W JP2024032966 W JP 2024032966W WO 2025058075 A1 WO2025058075 A1 WO 2025058075A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
myocarditis
group
vla
radioactive
labeled compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/032966
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
研 松岡
成二 ▲高▼島
貴嗣 瀬川
直史 渡部
定宏 仲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Publication of WO2025058075A1 publication Critical patent/WO2025058075A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/95—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in positions 2 and 4
    • C07D239/96—Two oxygen atoms

Definitions

  • This specification discloses a radioactive positron-emitting nuclide carbon-11 labeled compound, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or a radioactive composition.
  • Myocarditis is an inflammatory disease that mainly affects the myocardium. Myocarditis accounts for approximately 10% of sudden deaths, and approximately 30% of myocardial cases progress to chronic myocarditis (dilated cardiomyopathy). The mortality rate of myocarditis is 22%, with the mortality rate of fulminant myocarditis reaching 43%. According to Non-Patent Document 1, myocarditis is classified into lymphocytic myocarditis, giant cell myocarditis, eosinophilic myocarditis, and granulomatous myocarditis based on histological characteristics.
  • lymphocytic myocarditis is said to be viral infection, such as coxsackievirus and adenovirus.
  • Giant cell myocarditis, eosinophilic myocarditis, and granulomatous myocarditis are said to be often associated with complications such as cardiotoxic substances, drugs, autoimmunity, and systemic diseases.
  • Drugs such as anthracycline, fluorouracil, immune checkpoint inhibitors, and corona vaccines have been reported to cause myocarditis.
  • myocardial biopsy pathology examination In order to diagnose myocarditis and select a treatment, it is necessary to observe the myocardial tissue by myocardial biopsy pathology examination.
  • myocardial biopsy is highly invasive and may cause complications such as cardiac tamponade.
  • the biopsy site is limited to the right ventricular septum, there is a high possibility of false negative results.
  • the present invention aims to provide a compound that can act as a tracer to detect lymphocyte infiltration into myocardial tissue using positron emission tomography (PET) or other techniques.
  • PET positron emission tomography
  • the present invention may include the following embodiments.
  • Item 1 A radioactive positron-emitting nuclide carbon-11 labeled compound ([ 11 C] labeled compound) represented by the following general formula (I), or a pharma- ceutically acceptable salt thereof: (Wherein, R1 is a chlorine atom. m is an integer from 1 to 3. At least one of R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 7 is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, the alkyl group having a radioactive positron-emitting nuclide carbon-11 [ 11 C], and the rest are hydrogen atoms.
  • R8 is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Item 2. The 11 C-labeled compound according to Item 1, wherein the [ 11 C]-labeled compound is represented by the following general formula (II), or a pharma- ceutical acceptable salt thereof: (Wherein, R2 , R3 , R4 , R5 , R6 , R7 , and R8 are the same as above.
  • Item 3 The [ 11 C]-labeled compound according to item 1, wherein the [ 11 C]-labeled compound is represented by the following formula (1) or (2), or a pharma- ceutically acceptable salt thereof: : .
  • a radioactive composition comprising the [ 11 C]-labeled compound according to item 1, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof.
  • Item 5. The radioactive composition according to Item 4, which is used for detecting a lymphocytic inflammatory disease.
  • Item 6. The radioactive composition according to Item 5, wherein the lymphocytic inflammatory disease is myocarditis or myelitis (however, myocarditis excludes autoimmune myocarditis caused by myosin as an antigen).
  • Item 7. The radioactive composition according to Item 5, wherein the myocarditis develops dependently on the binding of Vcam-1 to VLA-4.
  • the radioactive composition according to Item 5 wherein the myocarditis is myocarditis caused by an immune checkpoint inhibitor.
  • Item 9. The radioactive composition according to Item 4, which is used to evaluate the therapeutic effect of myocarditis.
  • Item 10. The radioactive composition according to Item 4, which is used to predict the therapeutic effect of myocarditis.
  • Item 11. The radioactive composition according to Item 4, which is used to predict the therapeutic effect of a VLA-4 inhibitor for a patient with myocarditis or a patient suspected of having myocarditis, and to determine whether or not to implement said treatment for a patient for whom said treatment is determined to be effective.
  • PET positron emission tomography
  • the production scheme of [ 11 C]HCA2969 is shown.
  • the chromatogram of the produced [ 11 C]HCA2969 is shown.
  • the figure shows the stability of the produced [ 11 C]HCA2969 over time.
  • Macroscopic images of the heart on days 12, 19, and 25, as well as low- and high-magnification images of hematopoietic stained tissue, are shown.
  • the results of single-cell analysis of cell populations in myocardial tissue are shown.
  • Expression of Vcam-1 in CTLs on day 8, day 14, day 21, and day 25 is shown.
  • B Western blotting results for Vcam-1 expression.
  • C TNF ⁇ -dependent adhesion of cardiac fibroblasts to monocytes.
  • C Adhesion between cardiac fibroblasts and monocytes.
  • A Administration schedule of Vcam-1 neutralizing antibody and VLA-4 neutralizing antibody.
  • B Left ventricular fractional shortening (% fractional shortening; FS) measured by echocardiography for all mice in the CTL and neutralizing antibody groups.
  • C Box plots of left ventricular end-diastolic dimension and left ventricular fractional shortening on day 28 for the same mice as in (B).
  • D Kaplan-Meier curves for the CTL group and neutralizing antibody administration group.
  • A shows the administration schedule of neutralizing antibodies
  • B shows the Kaplan-Meier curves for each group.
  • %FS values of 3-week-old wild-type mice WT
  • F1 mice hetero: MRL-Pdcd1 -
  • MRL-Pdcd1 - crossed with wild-type mice and MRL-Pdcd1 -/- mice
  • MRL-Pdcd1 -/- mice homo
  • C The administration schedule of VLA-4 neutralizing antibodies. Clinical data for the CTL group, VLA-4 group, and normal EF group are shown.
  • Kaplan-Meier curves for the CTL group (symbol a) and the VLA-4 group (symbol b) are shown.
  • Kaplan-Meier curves for the CTL group (symbol a), VLA-4 group (symbol b), and normal EF group (symbol c) are shown.
  • the Kaplan-Meier curves for each group when VLA4 inhibitors were administered to MRL-Pdcd1 -/- mice are shown.
  • the symbol a indicates the AJM300(+) group
  • the symbol b indicates the AJM300(-) group.
  • the graph shows the heart rate and left ventricular contractility: %Fractional Shortening (%) results for each group when a VLA4 inhibitor was administered to MRL-Pdcd1 -/- mice .
  • the concentrations of soluble Vcam-1 in the serum of three healthy individuals (CTL), four patients with Covid-related myocarditis (Covid-related), eight patients with lymphocytic myocarditis (Lym), six patients with eosinophilic myocarditis (Eosi), and three patients with giant cell myocarditis (Giant) are shown.
  • the serum sVcam-1 concentrations in patients with lymphocytic myocarditis during the acute and recovery phases are shown.
  • Figure 21 (A) shows the radiation dose for each added amount of [ 11 C]HCA2969
  • Figure 21 (B) shows the radiation dose per 1 nM of [ 11 C]HCA2969.
  • PET/CT images taken with [ 11 C]HCA2969 in two MRL-Pdcd1 ⁇ / ⁇ mice are shown.
  • PET/CT images taken with [ 11 C]HCA2969 in two wild-type mice are shown.
  • PET/CT images taken in a rat model of autoimmune myocarditis using [ 11 C]HCA2969 are shown.
  • 1 shows the schedule of an experiment in which anti-VLA-4 neutralizing antibody was administered to a rat autoimmune myocarditis model.
  • FIG. 1 shows the schedule of an experiment in which AJM300 was administered to a rat autoimmune myocarditis model.
  • A Left ventricular contractility in the placebo group, the AJM300 administration group, and the neutralizing antibody administration group.
  • B Distribution of heart rates in the placebo group, the AJM300 administration group, and the neutralizing antibody administration group.
  • Figure 26 (A) shows an example of PET/CT imaging of wild-type mice (WT) and PD1 ⁇ / ⁇ mice (PD1 ⁇ / ⁇ ), while Figure 26 (B) shows box plots quantifying the accumulation in the heart of each group.
  • Fig. 27(A) shows myocardial tissue images of individuals marked with solid circles in the box plot of the placebo group in Fig. 26(B).
  • FIG. 27(B) shows myocardial tissue images of individuals marked with dotted circles in the box plot of the placebo group in Fig. 26(B).
  • Figure 28 shows the SUV median (Bq/ml) and SUV mean (Bq/ml) for the negative control (Control) group and the EAE model group (EAE).
  • Figure 28 (A) shows the SUV median (Bq/ml) and Figure 28 (B) shows the SUV mean (Bq/ml).
  • Figure 29 shows the results of the well counter measurement.
  • FIG. 30 shows the %ID/g of each individual in the EAE model group and the negative control group (CTL group).
  • FIG. 31 shows HE stained images of the spinal cord of each individual in the EAE model group.
  • Some embodiments relate to a radioactive positron-emitting nuclide carbon-11 labeled compound (hereinafter also referred to as "[ 11 C] labeled compound”), or a pharma- ceutically acceptable salt thereof.
  • the [ 11 C]-labeled compound is a compound represented by the following general formula (I) or a pharma- ceutically acceptable salt thereof: . (Wherein, R1 is a chlorine atom. m is an integer from 1 to 3.
  • At least one of R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 7 is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, the alkyl group having a radioactive positron-emitting nuclide carbon-11 [ 11 C], and the rest are hydrogen atoms.
  • R8 is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • m is preferably 2.
  • Examples of the straight-chain or branched-chain alkyl group having 1 to 6 carbon atoms for R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , and R 8 include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group, an n-pentyl group, a neopentyl group, an isopentyl group, a sec-pentyl group, a tert-pentyl group, an n-hexyl group, a 2-methylpentyl group, a 3-methylpentyl group, a 2,3-dimethylbutyl group, and a 2,2-dimethylbutyl group.
  • the linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, or an isopropyl group, and more preferably a methyl group.
  • [ 11 C] is preferably a carbon of a methyl group.
  • R 2 , R 3 , and R 7 are a hydrogen atom.
  • R8 is preferably a hydrogen atom or a methyl group, and more preferably a hydrogen atom.
  • a compound represented by the following general formula (II) is preferred: (Wherein, R2 , R3 , R4 , R5 , R6 , R7 , and R8 are the same as above.
  • the [ 11 C]-labeled compound is more preferably a compound represented by the following formula (1) or (2): , .
  • Salts of the [ 11C ] labeled compound include, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, nitrate, hydrobromide, sulfate, etc.; organic carboxylates such as acetate, trifluoroacetate, etc.; sulfonate, etc.; metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, etc.; and salts of basic substances such as ammonium salt.
  • inorganic acid salts such as hydrochloride, nitrate, hydrobromide, sulfate, etc.
  • organic carboxylates such as acetate, trifluoroacetate, etc.
  • sulfonate etc.
  • metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, etc.
  • salts of basic substances such as ammonium salt.
  • R 1 , m, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , and R 8 are the same as in general formula (I).
  • a medical cyclotron (CYPRIS HM-18, Sumitomo) is used to produce [ 11 C]CO 2 by the nuclear reaction of 14 N(p, ⁇ ) 11 C using N 2 gas as a target.
  • the obtained [ 11 C]CO 2 is introduced into a gas-phase methyl iodide synthesis apparatus (C-GPC-100, Sumitomo) to synthesize the highly reactive [ 11 C]trifluoromethanesulfonate ([ 11 C]CH 3 OTf).
  • [ 11 C]CH3OTf is introduced into a reaction vessel containing an acetone solution in which compound A is dissolved to a concentration of, for example, about 0.2 mg/mL to 1.5 mg/mL, and a base such as sodium hydroxide at a final concentration of about 0.003 mol/L to 0.008 mol/L, and bubbled.
  • compound A is dissolved to a concentration of, for example, about 0.2 mg/mL to 1.5 mg/mL, and a base such as sodium hydroxide at a final concentration of about 0.003 mol/L to 0.008 mol/L, and bubbled.
  • Compound B is obtained by this reaction.
  • a base such as sodium hydroxide is added to the bubbling solution obtained in (2) so that the final concentration is about 0.01 mol/L to 0.03 mol/L, and a deprotection reaction is carried out at room temperature (about 20°C to 27°C) for about 10 minutes.
  • Compound C is obtained by this reaction.
  • the [ 11 C] labeled compound can be prepared according to the following preparation scheme: .
  • step (2) compound QD is used as a starting material as a preferred embodiment of compound A in step (2) of the above-mentioned production method, so that [ 11 C]AJM300, which is a preferred embodiment of compound B, is obtained in step (2).
  • step (3) [ 11 C]HCA2969, which is a preferred embodiment of compound C, is obtained.
  • Radioactive Compositions Comprising [ 11 C]-Labeled Compounds or Pharmaceutically Acceptable Salts Thereof
  • One embodiment relates to radioactive compositions (hereinafter also simply referred to as "radioactive compositions") comprising [ 11 C]-labeled compounds or pharmaceutical acceptable salts thereof.
  • the radioactive composition may be in a dry state or in a liquid state dissolved in a solvent, such as ethanol, a mixture of ethanol and water (the ethanol content is greater than 0% and less than 99.5%), N,N-dimethylformamide, etc.
  • the radioactive composition can be administered at a radiation dose of about 1 MBq/kg to 500 MBq/kg, preferably about 3 MBq/kg to 100 MBq/kg.
  • the radioactive composition can be used to detect lymphocytic inflammatory diseases.
  • the lymphocytic inflammatory diseases are preferably those for which a VLA4 inhibitor is effective. More preferably, the lymphocytic inflammatory diseases include myocarditis, encephalomyelitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, and heart transplant rejection. Even more preferably, the lymphocytic inflammatory diseases include myocarditis and encephalomyelitis.
  • myocarditis refers to an inflammatory disease primarily affecting the myocardium. Myocarditis is classified based on the clinical course and includes acute myocarditis and chronic myocarditis. Acute myocarditis also includes fulminant myocarditis and myocarditis other than fulminant myocarditis. Chronic myocarditis includes dilated cardiomyopathy accompanied by ventricular hypertrophy and chronic myocarditis other than dilated cardiomyopathy.
  • myocarditis includes lymphocytic myocarditis, giant cell myocarditis, eosinophilic myocarditis, granulomatous myocarditis, etc. Viral infection has been reported as the cause of lymphocytic myocarditis.
  • Causing viruses include enterovirus infections, including coxsackievirus (group A or B), echovirus, and poliovirus; hepatitis virus (type A or C); influenza virus (type A or B); respiratory syncytial virus; mumps virus; measles virus; dengue virus; yellow fever virus; chikuningya virus; rabies virus; HIV virus; vaccinia virus; varicella-zoster virus; cytomegalovirus; herpes simplex virus; EB virus; measles virus; adenovirus; parvovirus, etc.
  • Giant cell myocarditis, eosinophilic myocarditis, and giant cell myocarditis have been reported to be caused by bacterial infection.
  • Eosinophilic myocarditis has been reported to be caused by fungal infection.
  • Granulomatous myocarditis is said to often occur in association with infectious diseases such as rickettsia infection, spirochete infection, protozoan infection, and parasitic infection; ingestion of drugs and chemicals; allergies, autoimmune diseases, Kawasaki disease, sarcoidosis, radiation exposure, and heat stroke.
  • Drugs that may cause myocarditis include anthracyclines, fluorouracil, immune checkpoint inhibitors, and corona vaccines.
  • Immune checkpoint inhibitors include anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, and anti-CTLA4 antibodies.
  • Myocarditis preferably does not include autoimmune myocarditis in which myosin is the antigen. Also, myocarditis preferably does not include eosinophilic myocarditis.
  • the myocarditis is preferably lymphocytic myocarditis. Also, the myocarditis is preferably myocarditis that develops dependently on the binding of Vcam-1 and VLA-4. More preferably, the myocarditis is caused by an immune checkpoint inhibitor.
  • VLA-4 is a protein also known as integrin subunit alpha 4, or CD49D, which in humans is expressed from a gene registered with the National Center for Biotechnology Information under Gene ID: 3676.
  • VLA-4 is a ligand for vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM1; CD106; INCAM-100).
  • [ 11 C] in the radioactive composition is used as a tracer in the body.
  • [ 11 C] can be detected by an examination using PET (positron emission tomography) (hereinafter also referred to as "PET examination").
  • PET examination can be performed according to a known method.
  • the PET examination may include an examination using only positron emission tomography, a PET-CT examination combining PET and CT examination, a PET-MRI examination combining PET and MRI, and the like.
  • the radioactive composition can be used to determine the therapeutic effect of myocarditis.
  • the therapeutic effect can be determined by: (1) obtaining a first PET examination image using the radioactive composition on a patient suspected of having myocarditis or a patient with myocarditis at a first time point; (2) treating the patient for myocarditis; (3) obtaining a second PET examination image using the radioactive composition on the patient during or after the treatment for myocarditis at a second time point after the first time point; (4) comparing the accumulation of [ 11 C] in the heart part in the first PET examination image and the second PET examination image; and (5) determining that the therapeutic effect is present when the accumulation of [ 11 C] in the second PET examination image is less than that in the first PET examination image, and/or determining that the therapeutic effect is not present when the accumulation of [ 11 C] in the second PET examination image is equal to or greater than that in the first PET examination image.
  • the radioactive compositions may be used to predict the efficacy of treatment with VLA-4 inhibitors. For example, if a PET examination image using a radioactive composition is obtained for a patient suspected of having myocarditis or a patient with myocarditis, and accumulation of [ 11 C] is observed in the cardiac region, it can be determined that treatment with a VLA-4 inhibitor is effective for the patient. Also, if a PET examination image using a radioactive composition is obtained for a patient suspected of having myocarditis or a patient with myocarditis, and accumulation of [ 11 C] is not observed in the cardiac region, it can be determined that treatment with a VLA-4 inhibitor is not effective for the patient.
  • Myocarditis is generally diagnosed by taking a sample of myocardial tissue via endomyocardial biopsy, and a definitive diagnosis is made from the tissue images. Therefore, a patient with myocarditis is intended to be a patient who has been definitively diagnosed with myocarditis.
  • a patient suspected of having myocarditis is intended to be a patient who has not been definitively diagnosed, but in whom the possibility of myocarditis has been suggested by tests such as an electrocardiogram; pulse; echocardiogram (tomographic images; evaluation of cardiac function such as left ventricular shortening fraction and left ventricular ejection fraction); blood CRP, AST, LDH, CK-MB, cardiac troponin (T or I), and sVcam-1; chest X-ray; and cardiac MRI.
  • tests such as an electrocardiogram; pulse; echocardiogram (tomographic images; evaluation of cardiac function such as left ventricular shortening fraction and left ventricular ejection fraction); blood CRP, AST, LDH, CK-MB, cardiac troponin (T or I), and sVcam-1; chest X-ray; and cardiac MRI.
  • Treatment for myocarditis can include, for example, administering a VLA-4 inhibitor or discontinuing the use of drugs that cause myocarditis.
  • VLA-4 inhibitors include anti-VLA-4 antibodies, or fragments containing the antigen-binding domain thereof.
  • the term "anti-VLA-4 antibody” is not limited as long as it can specifically bind to the VLA-4 protein and inhibit the functional expression thereof.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Both polyclonal and monoclonal antibodies can be appropriately prepared by those skilled in the art using known methods. When the antibody is a monoclonal antibody, it may be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody prepared using known methods.
  • the antibody may also be an antibody fragment such as Fab, F(ab) 2 , a diabody, scFv, a minibody, a peptibody, or a mimetibody.
  • the anti-VLA-4 antibody is a neutralizing antibody.
  • anti-VLA-4 antibodies include InVivoMAb anti-mouse/human VLA-4 (CD49d) (clone No. PS/2, Cat No. BE0071, Bio X Cell), and vedolizumab described in Ferreira, EFB et al. (Current Medicinal Chemistry, 2021, 28, 5884-5895).
  • the VLA-4 antagonist may be a type that competitively inhibits VLA-4 (competitive inhibition type) or a type that non-competitively inhibits VLA-4 (non-competitive inhibition type). The non-competitive inhibition type is preferable.
  • the VLA-4 antagonist may be a compound or a peptide.
  • VLA-4 antagonists include, for example, carotegrast methyl (Publication WO 2016/051828); SB683699/Firategrast, R411/Valategrast, CT7758/CDP323, DS-70, and TBC3486 described in Ferreira, E.F.B. et al. (Current Medicinal Chemistry, 2021, 28, 5884-5895); Slack, RJ (Nature Reviews Drug Discov Examples of such peptides include PN-943 and MORF-057 described in the literature (Francis, et al., volume 21, pages 60-78 (2022)); BIO1211 and BIO5192 described in Baiula, M et al. (Front Chem.
  • PN-943 is a peptide.
  • an inhibitor of VLA-4 is an RNA molecule that targets VLA-4 mRNA.
  • the RNA molecule is not limited as long as it targets VLA-4 mRNA and suppresses the expression of VLA-4 mRNA.
  • the RNA may be at least one selected from the group consisting of RNA molecules siRNA, shRNA, miRNA, and antisense RNA, which have the effect of degrading the target mRNA, and/or suppresses the translation of the target mRNA.
  • the sequence of these RNA molecules can be appropriately designed by a person skilled in the art using a known method based on the information on the base sequence of the target gene.
  • the RNA molecule may be prepared using a known method, or may be obtained and used from a commercially available source.
  • an example of an antisense RNA of VLA-4 is ATL1102 described in the literature: Limmroth, V. et al (Neurology 83 November 11, 2014).
  • An example of an RNA molecule or a vector capable of expressing the RNA molecule may be mentioned.
  • Vectors capable of expressing an RNA molecule targeting VLA-4 mRNA are not particularly limited as long as they can express an RNA molecule that suppresses the expression of the VLA-4 protein in an individual's body or cells.
  • hairpin RNA expression vectors and the like can be mentioned.
  • Hairpin RNA expression vectors include at least a sense strand DNA base sequence having the same sequence as the sense strand of the target mRNA (however, uracil in the mRNA is changed to thymine) downstream of a promoter base sequence suitable for expressing short-stranded RNA, such as a U6 promoter; a loop base sequence that forms a loop structure after transcription; an antisense strand DNA base sequence that can bind in whole or in part to the sense strand DNA base sequence in a complementary manner; and a terminator sequence.
  • vectors include plasmid vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, and the like.
  • AAV adeno-associated virus
  • An example of an inhibitor of VLA-4 is a genome editing system that targets the VLA-4 gene.
  • the genome editing system that targets the VLA-4 gene is not limited as long as it is a system that can cause recombination in the VLA-4 gene in the body of an individual.
  • the CompoZr Zinc Finger Nuclease (ZFN) system the TAL effector nuclease (TALEN) system, and the Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system can be mentioned.
  • the CRISPR/Cas9 system is preferable.
  • the CRISPR/Cas9 system using a vector is preferable.
  • the nucleic acid encoding CRISPR and the nucleic acid encoding Cas9 may be on different vectors or may be on one vector.
  • the promoter for causing CRISPR to function is not particularly limited, but the U6 promoter is preferred.
  • the promoter for causing Cas9 to function is not particularly limited, but a promoter expressed in mammalian cells, such as a cytomegalovirus promoter, is preferred.
  • a commercially available vector such as the pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 vector can be preferably used as the CRISPR/Cas9 system.
  • VLA-4 gene target sequence The sequence targeting the VLA-4 gene (hereinafter also referred to as "VLA-4 gene target sequence") incorporated into the CRISPR sequence is not limited as long as it is a sequence that can be incorporated into guide RNA (also referred to as gRNA, crRNA) by the CRISPR/Cas9 system, transcribed, and recombines the VLA-4 gene.
  • guide RNA also referred to as gRNA, crRNA
  • the VLA-4 gene target sequence can be a sequence of about 20 bases upstream of the 5' side of the base sequence "NGG" present in the VLA-4 gene.
  • the VLA-4 gene target sequence was determined using the Optimized CRISPR design tool (Massachusetts Institute of Technology, ZhangLab webpage (http://crispr.mit.edu/)), E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (German Cancer Research Center)), and ZiFiT Targeter (http://zifit.partner
  • the design can be performed using publicly known design tools such as those published in the Zing Finger Consortium (http://cas9.cbi.pku.edu.cn (Peking University)), CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp (University of Tokyo)), and CRISPR-P (http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/ (Hua Zhong Agricultural University)).
  • HLB column solid-phase extraction column
  • FIG. 6 shows the expression of Vcam-1 in each CTL on days 8, 14, 21, and 25.
  • Vcam-1 was expressed in vascular endothelial cells, but was also highly expressed in activated cardiac fibroblasts (Postn+/FAP+).
  • FIG. 7(A) shows the schedule for the adhesion experiment.
  • Cardiac fibroblasts were isolated from rat hearts isolated from neonatal rats after cell dispersion using collagenase type 2 (Worthington Biochemical Corporation, LS004176) and cultured in 96-well plates.
  • Splenic mononuclear cells were isolated from wild-type mice by homogenization and gravity separation using Optiprep (Serumtechnik Bernburg, 1893).
  • Optiprep Serumtechnik Bernburg, 1893
  • cardiac fibroblasts were cultured in 96-well plates for 48 hours, and the medium was replaced with TNF ⁇ +/- and cultured for another 24 hours.
  • TNF ⁇ (Peprotech, 300-01A) was added to the wells to a final concentration of 5-15 ng/ml.
  • Vcam-1 The induction of Vcam-1 by TNF ⁇ was confirmed by Western blotting.
  • Anti-Vcam1 antibody EPR5047 (Abcam, ab134047) was used as the primary antibody for Western blotting.
  • HRP-labeled anti-Rabbit antibody was used for detection.
  • the luminescence reagent used was Chemiluminescent One L (Nacalai tesque, 07880-70).
  • Western blotting of GAPDH was performed as an internal control.
  • Vcam-1 siRNA (SilencerTM Select Pre-Designed siRNA, siRNA ID s129593, Thermo; also called siVcam-1) was transfected into cardiac fibroblasts 2 hours after seeding in the wells at a final concentration of 30 nM using LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo, 13778075). 72 hours after seeding of cardiac fibroblasts in the wells, adhesion experiments with monocytes were performed. SilencerTM Select Negative Control No.1 siRNA (Thermo, 4390843) was used as a siRNA control (siCTL). The transfection amount was the same as that of siVcam-1. TNF ⁇ was added to 5 ng/ml 46 hours after transfection. Western blotting for Vcam-1 was carried out in the same manner as in 3.(1) above.
  • adherent mononuclear cells were counted using an In Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare Life Sciences).
  • MRL-Pdcd1-/- a cross between MRL-Faslpr/lpr, a spontaneous systemic lupus erythematosus mouse model, and C57BL/6-Pdcd1-/-, a PD-1 knockout mouse, is a spontaneous lymphocytic myocarditis model mouse in which 96% of mice develop myocarditis between 4 and 8 weeks of age.
  • the survival rate at 10 weeks of age is approximately 30%, which is significantly lower than that of wild-type mice.
  • the following myocarditis experiment was performed using this MRL-Pdcd1-/-.
  • PS/2 Cat No. BE0071, Bio X Cell
  • the dose of each compound was 10 ⁇ g/g.
  • the administration schedule was as shown in Figure 9 (A), from the 14th day after birth to the 26th day after birth, every 3 days. Echocardiograms were performed on the 14th and 28th days after birth. After obtaining the echocardiogram data on the 28th day after birth, blood samples were taken and hearts were sampled from all mice.
  • Figure 9 (B) shows the left ventricular fractional shortening (%FS) measured by echocardiography in all mice in the CTL and neutralizing antibody groups.
  • %FS left ventricular fractional shortening
  • FIG. 9 (D) shows Kaplan-Meier curves for the CTL group and the neutralizing antibody-administered group.
  • symbol a indicates the CTL group
  • symbol b indicates the neutralizing antibody group.
  • the number of individuals who died increased from the 20th day after birth in the CTL group.
  • VLA-4 neutralizing antibody Effect of VLA-4 neutralizing antibody The following study was carried out to determine whether Vcam-1 neutralizing antibody or VLA-4 neutralizing antibody contributes to reducing the mortality rate due to myocarditis.
  • VLA-4 In the VLA-4 group (symbol d), one individual died on the 18th day, but the remaining individuals survived until the 28th day after birth. This indicates that it is the VLA-4 neutralizing antibody that contributes to the improvement of the prognosis of myocarditis.
  • FIG. 11 shows the %FS values of 3-week-old wild-type mice (WT), F1 mice (hetero: MRL-Pdcd1-) crossed with wild-type mice and MRL-Pdcd1-/-, and MRL-Pdcd1-/- (homo).
  • WT wild-type mice
  • F1 mice hetero: MRL-Pdcd1-
  • MRL-Pdcd1-/- wild-type mice
  • MRL-Pdcd1-/- homo
  • the %FS value of the WT group was over 75%, with little difference between the first and fourth quartiles and little variation.
  • the %FS values of the homo and hetero groups were broadly distributed overall, with some individuals being high and some being low.
  • CTL group control group
  • VLA-4 administration group VLA-4 neutralizing antibody to examine the effect of VLA-4 neutralizing antibody.
  • the cutoff value between the good cardiac function group (normal EF group) and the poor cardiac function group was set at 70%, with groups with 70% or more being classified as the good cardiac function group and groups with lower cardiac function than 70% being classified as the poor cardiac function group.
  • VLA-4 neutralizing antibody was then administered according to the schedule shown in Figure 11 (C).
  • Body weight (BW), pulse rate (HR), and %FS value for each group are shown in Figure 12. There was no significant difference in each parameter between the CTL group and the VLA-4 group.
  • Figure 14 shows a Kaplan-Meier curve with the survival curve of the normal EF group (symbol c) added.
  • VLA-4 neutralizing antibodies to individuals with myocarditis improves the prognosis of myocarditis, regardless of the cardiac function data of each individual. It also suggests that administering VLA-4 neutralizing antibodies to individuals with myocarditis is effective in preventing or treating myocarditis.
  • the AJM300 group (+) was fed a 1% AJM300 mixed diet from 2 weeks of age until death.
  • mice in the AJM300(-) group underwent echocardiographic assessment of cardiac function when they reached 28 days of age, and were then euthanized to obtain heart and blood samples.
  • Soluble Vcam-1 concentration in human serum We compared serum concentrations of soluble Vcam-1 (sVcam-1) between healthy subjects and patients with myocarditis. The results of three healthy subjects (CTL), four subjects with Covid-related myocarditis (Covid-related), eight subjects with lymphocytic myocarditis (Lym), six subjects with eosinophilic myocarditis (Eosi), and three subjects with giant cell myocarditis (Giant) are shown in Figure 17. In all types of myocarditis, including lymphocytic myocarditis, serum sVcam-1 concentrations were elevated compared to healthy subjects. This suggests that the VLA-4/Vcam-1 pathway is involved in the development of myocarditis.
  • the above-mentioned anti-VLA-4 neutralizing antibody or AJM300 administration experiment was carried out on autoimmune myocarditis model rats.
  • the study groups were a placebo group (5 rats), an AJM300 administration group (4 rats), and a neutralizing antibody administration group (5 rats) in which anti-VLA-4 neutralizing antibody was administered.
  • the placebo group was fed a sample mixed with placebo (0.43% metolose + 0.14% aqdisol) from 3 days before to 3 weeks after the induction of myocarditis.
  • the AJM300 administration group was fed a sample containing 1% AJM300 from 3 days before to 3 weeks after the induction of myocarditis.
  • the neutralizing antibody administration group was intravenously administered 5mg/kg neutralizing antibody at the time of myocarditis induction (0w), 1 week (1w), 2 weeks (2w), and 3 weeks (3w) after the induction of myocarditis.
  • Left ventricular contractility and heart rate were evaluated 21 days after myocarditis induction.
  • Figure 25 (A) shows the left ventricular contractility of the placebo group, the AJM300 administration group, and the neutralizing antibody administration group.
  • Figure 25 (B) shows the distribution of heart rates of the placebo group, the AJM300 administration group, and the neutralizing antibody administration group.
  • each mouse was anesthetized with isoflurane (1-3% in 2 L O 2 ) and injected with [ 11 C]HCA2969 tracer (1-10 MBq: 10 ⁇ g of unlabeled HCA2969 contains 10 MBq of PET tracer) via the tail vein. 20 min after injection, PET/CT imaging was performed for 10 min.
  • Figure 26 (A) shows examples of PET/CT imaging of wild-type mice (WT) and PD1 -/- mice (PD1 -/- ). In PD1 -/- mice, accumulation of the [ 11C ]HCA2969 tracer was observed in the heart.
  • Figure 26 (B) shows box plots quantifying the accumulation in the heart for each group.
  • Figure 27(A) shows myocardial tissue images of an individual marked with a solid circle in the box plot of the placebo group in Figure 26(B). This individual had particularly high accumulation of the [ 11 C]HCA2969 tracer.
  • Figure 27(B) shows myocardial tissue images of an individual marked with a dotted circle in the box plot of the placebo group in Figure 26(B). This individual had particularly low accumulation of the [ 11 C]HCA2969 tracer.
  • mononuclear cell infiltration was observed in the tissue, indicating severe myocardial inflammation.
  • no signs of inflammation were observed in Figure 27(B).
  • the prepared cloudy emulsion solution was subcutaneously injected into both groin areas of each mouse to give a total volume of 200 ⁇ l (immunization day 0). Then, 100 ⁇ l of a solution (4 ⁇ g/ml) of Pertussis toxin (LBL) dissolved in PBS per mouse was intraperitoneally administered on the day of emulsion administration, and again intraperitoneally 48 hours later. From day 0 of immunization, the EAE disease score was recorded.
  • LBL Pertussis toxin
  • infiltration of inflammatory cells into the spinal cord and paralytic symptoms appear in about one week, peak at two weeks, and improve after four weeks. Inflammation is predominant in the spinal cord rather than the brain, and because inflammation occurs on the lumbar side, paralysis begins in the tail and hind legs.
  • mice that showed paralytic symptoms of EAE with a disease score of 0.5 or higher 15 days after immunization were used.
  • FIG. 28 shows the SUV median (Bq/ml) and SUV mean (Bq/ml) of the negative control (Control) group and the EAE model group (EAE).
  • Figure 28(A) shows the SUV median (Bq/ml), and
  • Figure 28(B) shows the SUV mean (Bq/ml).
  • high accumulation of the [ 11 C]HCA2969 tracer signal was observed in the EAE model group, indicating that the [ 11 C]HCA2969 tracer of the present invention can also detect inflammation in tissues other than the heart.
  • mice showing paralytic symptoms with an EAE disease score of 0.5 or more on the 15th day after immunization were administered [ 11C ]HCA2969 tracer according to the method described in 17-1 (2) above.
  • the mice were euthanized 30 minutes after administration, and the spinal cord and brain were collected. A portion of the collected tissues was subjected to radiation dose measurement using a well counter, and a portion was subjected to HE staining.
  • Results Figure 29 shows the results of the Well Counter measurement.
  • the EAE model group showed a significant increase in tracer signal accumulation in the spinal cord compared to the negative control group (CTL group). Accumulation also tended to increase in the brain.
  • CTL group negative control group
  • inflammatory cell infiltration occurs mainly in the spinal cord, so this accumulation was thought to reflect inflammatory cell infiltration.
  • Figure 30 shows the %ID/g of each individual in the EAE model group and the negative control group (CTL group).
  • Figure 31 shows HE staining images of the spinal cord of each individual in the EAE model group. Individuals marked with an asterisk in Figures 30 and 31 are individuals in which accumulation of [ 11 C]HCA2969 tracer was observed in the spinal cord. In EAE1, EAE2, EAE5, and EA6 individuals in which accumulation of [ 11 C]HCA2969 tracer was observed in the spinal cord tissue by HE staining.

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Abstract

心筋組織内へのリンパ球浸潤を陽電子放出断層撮影（PET：positron emission tomography）等により検出可能なトレーサーとなる化合物を提供することを一課題とする。 下記一般式（Ｉ）で表される放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物（［１１Ｃ］標識化合物）、又はその薬学的に許容される塩： （式中、 Ｒ１は、塩素原子である。 ｍは、１～３の整数である。 Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７の少なくとも１つは直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基であり、前記アルキル基は放射性陽電子放出核種炭素１１［１１Ｃ］を有し、それ以外は、水素原子である。 Ｒ８は、水素原子、又は直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基である。） により、課題を解決する。

Description

放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物、及び放射性組成物
　本明細書には、放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物、又はその薬学的に許容される塩、放射性組成物が開示される。
　心筋炎は、心筋を主座とした炎症性疾患である。心筋炎は、突然死の原因の約10％を占め、また、心筋症例の約30％が、慢性心筋炎（拡張型心筋症）に移行する。心筋炎の死亡率は22％であり、中でも劇症型心筋炎の死亡率は43％に達する。非特許文献１によれば、心筋炎は、組織学的特徴から、リンパ球性心筋炎、巨細胞性心筋炎、好酸球性心筋炎、肉芽腫性心筋炎に分類される。リンパ球性心筋炎の病因は、コクサッキーウイルス、アデノウイルス等のウイルス感染によるものが多いとされる。巨細胞性心筋炎、好酸球性心筋炎、肉芽腫性心筋炎は心毒性物質、薬物、自己免疫、全身性疾患などの合併症が多いとされている。薬物としては、アントラサイクリン、フルオロウラシル、免疫チェックポイント阻害剤、コロナワクチン等が心筋炎の原因になることが報告されている。中でも免疫チェックポイント阻害剤に関し、抗PD-1抗体単独投与例において0.5％、抗PD-L1抗体単独投与例において2.4％、抗CTLA4単独投与例において3.3％の心筋炎発症例が報告されている。免疫チェックポイント阻害剤に起因すると思われる心筋炎の病巣では、Tリンパ球優位の組織浸潤像が確認されている。さらに、免疫チェックポイント阻害剤の投与に起因して心筋炎を発症した場合、死亡率は、心不全による死亡率、及び心原性の死亡率を合わせると46％に上る（非特許文献２）。
Kociol. R. D. et al: Circulation. 2020;141 Mahmood, SS: J Am Coll Cardiol 2018;71:1755-64
　特に、劇症型心筋炎は急速に病態が進行し血行動態が破綻し、急性期の心筋障害が重症であると、炎症改善後も心機能は回復せず拡張型心筋症に移行し予後悪化につながる。そのため速やかに心筋炎の診断を行い、可及的に本剤による治療を開始することが望ましい。
　心筋炎の診断と治療の選択を行うためには、心筋生検病理検査により心筋組織の観察を行う必要がある。一方で、心筋生検は侵襲性が高く心タンポナーデ等の合併症を起こす恐れがある。また生検部位が右心室中隔壁に限局されているため、偽陰性が生じる可能性も高い。
　本発明は、心筋組織内へのリンパ球浸潤を陽電子放出断層撮影（PET：positron emission tomography）等により検出可能なトレーサーとなる化合物を提供することを一課題とする。
　本発明は以下の実施形態を含み得る。
項１．下記一般式（Ｉ）で表される放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物（［１１Ｃ］標識化合物）、又はその薬学的に許容される塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、
Ｒ１は、塩素原子である。
ｍは、１～３の整数である。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７の少なくとも１つは直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基であり、前記アルキル基は放射性陽電子放出核種炭素１１［１１Ｃ］を有し、それ以外は、水素原子である。
Ｒ８は、水素原子、又は直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基である。）
項２．前記［１１Ｃ］標識化合物が、下記一般式（ＩＩ）で表される、項１に記載の前記１１Ｃ標識化合物、又はその薬学的に許容される塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、上記に同じ。）。
項３．前記［１１Ｃ］標識化合物が、下記式（１）、又は（２）で表される、項１に記載の前記１１Ｃ標識化合物、又はその薬学的に許容される塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 。
項４．項１に記載の前記［１１Ｃ］標識化合物、又はその薬学的に許容される塩を含む、放射性組成物。
項５．リンパ球性炎症性疾患を検出するために使用される、項４に記載の放射性組成物。
項６．前記リンパ球性炎症性疾患が、心筋炎又は脊髄炎である、項５に記載の放射性組成物（ただし、心筋炎からはミオシンを抗原とする自己免疫性心筋炎を除く）。
項７．前記心筋炎が、Ｖｃａｍ－１とＶＬＡ－４の結合に依存的に発症する心筋炎である、項５に記載の放射性組成物。
項８．前記心筋炎が、免疫チェックポイント阻害剤に起因する心筋炎である、項５に記載の放射性組成物。
項９．心筋炎の治療効果を判定するために使用される、項４に記載の放射性組成物。
項１０．心筋炎の治療効果を予測するために使用される、項４に記載の放射性組成物。項１１．心筋炎患者、又は心筋炎が疑われる患者に対して、ＶＬＡ－４の阻害物質による治療効果を予測し、当該治療が有効であると判定される患者に対して当該治療の実施を判断するために使用される、項４に記載の放射性組成物。
　心筋組織内へのリンパ球浸潤を陽電子放出断層撮影（PET：positron emission tomography）等により検出可能なトレーサーとなる化合物を提供することができる。
[11C]HCA2969の製造スキームを示す。 製造した[11C]HCA2969のクロマトグラムを示す。 製造した[11C]HCA2969の経時的な安定性を示す。 Day 12、Day 19、及びDay 25における心臓のマクロ画像と、組織のhematopoietic染色像の弱拡大画像及び強拡大画像を示す。 シングルセル解析による心筋組織内の細胞のポピュレーション解析結果を示す。 CTL、day 8、day 14、day 21、day 25におけるVcam-1の発現を示す。 （A）接着実験のスケジュールを示す。（B）Vcam-1の発現に関するウエスタンブロッティングの結果を示す。（C）TNFα依存的な、心臓線維芽細胞と単核球の接着性を示す。 （A）実験のスケジュールを示す。（B）siVcam-1によるVcam-1遺伝子発現抑制効果を示す。（C）心臓線維芽細胞と単核球の接着性を示す。 （A）Vcam-1中和抗体とVLA-4中和抗体の投与スケジュールを示す。（B）CTL群、中和抗体群全てのマウスの心エコーにより測定した左室内径短縮率（％fractional shortening ; FS）を示す。（C）（B）と同じマウスの28日目の左室拡張末期径と左室内径短縮率箱ひげ図を示す。（D）CTL群と中和抗体投与群のKaplan-Meier曲線を示す。 （A）中和抗体の投与スケジュールを示す。（B）各群のKaplan-Meier曲線を示す。 （A）生後３週目の野生型マウス（WT）、野生型マウスとMRL-Pdcd1-/-を交配させたF1（hetero：MRL-Pdcd1-）、MRL-Pdcd1-/-（homo）の％FS値を示す。（B）homo群を％FSの高い群（心機能良好群：n=11）と％FSの低い群（心機能低下群：n=20）にわけた結果を示す。（C）VLA-4中和抗体の投与スケジュールを示す。 CTL群、VLA-4群、及びnormal EF群の臨床データを示す。 CTL群（符号a）、及びVLA-4群（符号b）のKaplan-Meier曲線を示す。 CTL群（符号a）、VLA-4群（符号b）、及びnormal EF群（符号c）のKaplan-Meier曲線を示す。 MRL-Pdcd1-/-にVLA4阻害剤投与を行った時の各群のKaplan-Meier曲線を示す。図中符号aはAJM300（＋）群を示し、符号bはAJM300（－）群を示す。 MRL-Pdcd1-/-にVLA4阻害剤投与を行った時の各群の心拍数と左室収縮能：%Fractional Shortening (%)の結果を示す。 健常人（CTL）３名、Covid関連心筋炎（Covid related）4名、リンパ球性心筋炎（Lym）8名、好酸球性心筋炎（Eosi）6名、巨細胞性心筋炎（Giant）3名の血清中の可溶性Vcam-1 濃度を示す。 リンパ球性心筋炎患者の急性期及び回復期における血清中sVcam-1濃度を示す。 図２１（A）に[11C]HCA2969の各添加量における放射線量を示す。図２１（B）に、[11C]HCA2969 1 nM当たりの放射線量を示す。 MRL-Pdcd1-/-マウス２匹に対して[11C]HCA2969を使用して撮像したPET/CT画像を示す。 野生型マウス２匹に対して[11C]HCA2969を使用して撮像したPET/CT画像を示す。 自己免疫性心筋炎モデルラットに対して[11C]HCA2969を使用して撮像したPET/CT画像を示す。 ラット自己免疫性心筋炎モデルに対する抗VLA-4中和抗体投与実験のスケジュールを示す。 ラット自己免疫性心筋炎モデルに対するAJM300投与実験のスケジュールを示す。 （A）Placebo群、AJM300投与群、中和抗体投与群の左室収縮能を示す。（B）Placebo群、AJM300投与群、中和抗体投与群の心拍数の分布を示す。 図２６（A）は、野生型マウス（WT）とPD1-/-マウス（PD1-/-）のPET/CTイメージングの例を示す。図２６（B）は、各群の心臓部の集積を定量化した箱ひげ図である。 図２７（A）は、図２６（B）のプラセボ群の箱ひげ図において実線の丸印をつけた個体の心筋組織画像を示す。図２７（B）は図２６（B）のプラセボ群の箱ひげ図において点線の丸印をつけた個体の心筋組織画像を示す。 図２８は、陰性対照（Control）群と、EAEモデル群（EAE）のSUV median (Bq/ml) とSUV mean (Bq/ml)を示す。図２８（A）は、SUV median (Bq/ml)であり、図２８（B）はSUV mean (Bq/ml)である。 図２９は、Well counterの測定結果を示す。 図３０は、EAEモデル群は陰性対照群（CTL群）の各個体の%ID/gを示す。 図３１は、EAEモデル群の各個体の脊髄のHE染色画像を示す。
１．放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物、又はその薬学的に許容される塩
　ある実施形態は、放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物（以下、「［１１Ｃ］標識化合物」とも表記する）、又はその薬学的に許容される塩に関する。
　［１１Ｃ］標識化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩である：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 。
（式中、
Ｒ１は、塩素原子である。
ｍは、１～３の整数である。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７の少なくとも１つは直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基であり、前記アルキル基は放射性陽電子放出核種炭素１１［１１Ｃ］を有し、それ以外は、水素原子である。
Ｒ８は、水素原子、又は直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基である。）
　ｍは、好ましくは２である。
　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８における直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基として、例えばメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ネオペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基を挙げることができる。
　直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基として、好ましくはメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基であり、より好ましくはメチル基である。
　［１１Ｃ］は、メチル基の炭素であることが好ましい。
　Ｒ２、Ｒ３、及びＲ７のいずれか１つ、いずれか２つ、あるいはすべては水素原子であることが好ましい。
　Ｒ８として、好ましくは水素原子、又はメチル基であり、より好ましくは水素原子である。
　［１１Ｃ］標識化合物として、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物が好ましい：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、上記に同じ。）。
　［１１Ｃ］標識化合物は、下記式（１）、又は（２）で表される化合物がより好ましい：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 。
　［１１Ｃ］標識化合物の塩として、例えば塩酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の有機カルボン酸塩；メタンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；又はナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩等の塩基性物質の塩を挙げることができる。
２．［１１Ｃ］標識化合物の製造方法
　［１１Ｃ］標識化合物は、下記製造スキームにしたがって製造することができる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記スキーム中、Ｒ１、ｍ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、一般式（Ｉ）と同じである。
　（１）例えば、医療用サイクロトロン（ＣＹＰＲＩＳ　ＨＭ－１８、住友）を用い、Ｎ２ガスをターゲットとして１４Ｎ（ｐ，α）１１Ｃの核反応により［１１Ｃ］ＣＯ２を製造する。得られた［１１Ｃ］ＣＯ２を気相法ヨウ化メチル合成装置（Ｃ－ＧＰＣ－１００、住友）に導入し、反応活性の高い［１１Ｃ］トリフルオロメタンスルホナート（［１１Ｃ］ＣＨ３ＯＴｆ）を合成する。
（２）［１１Ｃ］ＣＨ３ＯＴｆを、例えば０．２ｍｇ／ｍＬ～１．５ｍｇ／ｍＬ程度となるように化合物Ａを溶解したアセトン溶液及び終濃度で０．００３ｍｏｌ／Ｌ～０．００８ｍｏｌ／Ｌ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加えた反応容器に導入しバブリングする。この反応により、化合物Ｂが得られる。
（３）（２）で得られたバブリング後の液に終濃度で０．０１ｍｏｌ／Ｌ～０．０３ｍｏｌ／Ｌ程度となるように水酸化ナトリウム等の塩基を加えて、室温（２０℃～２７℃程度）で１０分間程度の脱保護反応を行う。この反応により、化合物Ｃが得られる。
（４）（３）で得られた液脱保護後の液から、ＨＰＬＣにより［１１Ｃ］ＨＣＡ２９６９を分取する。
　好ましくは、［１１Ｃ］標識化合物は、下記製造スキームにしたがって製造することができる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 。
　このスキームでは、上記製造方法の工程（２）において化合物Ａの好ましい態様として化合物ＱＤを出発材料として使用することにより、工程（２）では、化合物Ｂの好ましい態様である［１１Ｃ］ＡＪＭ３００が得られる。続いて、工程（３）では、化合物Ｃの好ましい態様である［１１Ｃ］ＨＣＡ２９６９が得られる。
３．［１１Ｃ］標識化合物を含む、又はその薬学的に許容される塩を含む、放射性組成物　ある実施形態は、［１１Ｃ］標識化合物を含む、又はその薬学的に許容される塩を含む、放射性組成物（以下、単に「放射性組成物」ともいう）に関する。
　放射性組成物は、乾燥状態であっても、溶媒に溶解された液体状態であってもよい。溶媒は、エタノール、エタノール及び水の混合物（エタノール含有量は、０％より多く、９９．５％未満）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等を挙げることができる。
　放射性組成物は、放射線量に換算して１ＭＢｑ／ｋｇ～５００ＭＢｑ／ｋｇ、好ましくは３ＭＢｑ／ｋｇ～１００ＭＢｑ／ｋｇ程度で、投与することができる。
　放射性組成物は、リンパ球性炎症性疾患を検出するために使用することができる。リンパ球性炎症性疾患として、好ましくはVLA4阻害剤が効果を示すリンパ球性炎症性疾患である。より好ましくは、リンパ球性炎症性疾患として心筋炎、脳脊髄炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、心臓移植拒絶反応を挙げることができる。さらに好ましくは、リンパ球性炎症性疾患として心筋炎、脳脊髄炎を挙げることができる。
　本明細書において「心筋炎」は、心筋を主座とした炎症性疾患である。心筋炎には、臨床経過に基づく分類では、急性心筋炎と慢性心筋炎が含まれる。また、急性心筋炎には、劇症型心筋炎と劇症型心筋炎以外の心筋炎が含まれる。慢性心筋炎には、心室の肥大を伴う拡張型心筋症と拡張型心筋症以外の慢性心筋炎が含まれる。
　また、組織学的な分類では、心筋炎には、リンパ球性心筋炎、巨細胞性心筋炎、好酸球性心筋炎、肉芽腫性心筋炎等が含まれる。リンパ球性心筋炎の病因として、ウイルス感染が報告されている。原因ウイルスとして、コクサッキーウイルス（Ａ群又はＢ群）、エコーウイルス、及びポリオウイルス等を含むエンテロウイルス感染；肝炎ウイルス（Ａ型又はＣ型）；インフルエンザウイルス（Ａ型又はＢ型）；ＲＳウイルス；ムンプスウイルス；麻疹ウイルス；デング熱ウイルス；黄熱病ウイルス；チクニングニアウイルス；狂犬病ウイルス；ＨＩＶウイルス；ワクチニアウイルス；帯状疱疹ウイルス；サイトメガロウイルス；単純ヘルペスウイルス；ＥＢウイルス；麻疹ウイルス；アデノウイルス；パルボウイルス等のウイルス感染によるものが多いとされる。巨細胞性心筋炎、好酸球性心筋炎、巨細胞性心筋炎は、細菌感染が原因となることが報告されている。好酸球性心筋炎は、真菌感染症が原因となることが報告されている。肉芽腫性心筋炎はリケッチア感染症、スピロヘータ感染症、原虫感染症、寄生虫感染症等の感染症；薬剤、化学物質の摂取；アレルギー、自己免疫疾患；川崎病；サルコイドーシス；放射被爆；熱射病などに合併することが多いとされている。心筋炎を惹起する可能性のある薬剤として、アントラサイクリン、フルオロウラシル、免疫チェックポイント阻害剤、コロナワクチン等を挙げることができる。免疫チェックポイント阻害剤として、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体を挙げることができる。
　心筋炎には、好ましくはミオシンを抗原とする自己免疫性心筋炎を含まない。また、心筋炎には、好ましくは好酸球性心筋炎を含まない。
　心筋炎として、好ましくはリンパ球性心筋炎である。また、心筋炎として、好ましくは、Ｖｃａｍ－１とＶＬＡ－４の結合に依存的に発症する心筋炎である。より好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤に起因する心筋炎である。
　本明細書において、ＶＬＡ－４は、integrin subunit alpha 4、又はCD49Dとも呼ばれるタンパク質であり、ヒトの場合、National Center for Biotechnology Informationに、Gene ID: 3676 として登録される遺伝子から発現されるたんぱく質である。ＶＬＡ－４は、vascular cell adhesion molecule 1（VCAM1；CD106; INCAM-100）のリガンドである。
　放射性組成物による心筋炎の検出は、放射性組成物内の［１１Ｃ］を体内におけるトレーサーとして使用する。［１１Ｃ］は、ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）を利用した検査（以下、「ＰＥＴ検査」とも表記する）により検出することができる。ＰＥＴ検査は、公知の方法にしたがって行うことができる。また、ＰＥＴ検査には、陽電子放出断層撮影のみの検査と、ＣＴ検査と組み合わせたＰＥＴ－ＣＴ検査、ＰＥＴとＭＲＩを組み合わせたＰＥＴ－ＭＲＩ検査等を含み得る。
　放射性組成物は、心筋炎の治療効果の判定に使用することができる。治療効果は、（１）第１の時点において、心筋炎が疑われる患者、又は心筋炎患者について放射性組成物を使用した第１のＰＥＴ検査画像を取得することと、（２）前記患者に心筋炎の治療を行うことと、（３）第１の時点よりも後の第２の時点であって、心筋炎の治療中又は治療後の前記患者について放射性組成物を使用した第２のＰＥＴ検査画像を取得することと、（４）第１のＰＥＴ検査画像及び第２のＰＥＴ検査画像における心臓部分の［１１Ｃ］の集積を比較することと、（５）第２のＰＥＴ検査画像における［１１Ｃ］の集積が第１のＰＥＴ検査画像よりも少ない場合に治療効果があると判定すること、及び／又は第２のＰＥＴ検査画像における［１１Ｃ］の集積が第１のＰＥＴ検査画像と同等以上の場合に治療効果がないと判定すること、により判定することができる。
　また、ある実施形態として、放射性組成物はＶＬＡ－４の阻害物質による治療効果を予測するために使用することができる。
　例えば、心筋炎が疑われる患者、又は心筋炎患者について放射性組成物を使用したＰＥＴ検査画像を取得し、心臓部分に［１１Ｃ］の集積が認められれば、前記患者にＶＬＡ－４の阻害物質による治療が有効であると判定できる。また、心筋炎が疑われる患者、又は心筋炎患者について放射性組成物を使用したＰＥＴ検査画像を取得し、心臓部分に［１１Ｃ］の集積が認められなければ、前記患者にＶＬＡ－４の阻害物質による治療が有効ではないと判定できる。
　心筋炎の診断は、一般的に心内膜心筋生検により心筋組織を採取し、その組織画像から確定診断を行う。したがって、心筋炎患者は、心筋炎であると確定診断がついた患者を意図する。心筋炎を疑う患者とは、確定診断には至っていないものの、心電図；脈拍；心エコー（断層画像；左室内径短縮率、左室駆出率等の心機能評価）；血液中のＣＲＰ、ＡＳＴ、ＬＤＨ、ＣＫ－ＭＢ、心筋トロポニン（Ｔ又はＩ）、ｓＶｃａｍ－１の測定；胸部Ｘ線；心臓ＭＲＩ等の検査により心筋炎の可能性が示唆された患者を意図する。
　心筋炎の治療は、例えばＶＬＡ－４の阻害物質の投与、心筋炎の原因薬物の使用停止等を挙げることができる。
　ＶＬＡ－４の阻害物質として、例えば、抗ＶＬＡ－４抗体、又はその抗原結合ドメインを含むフラグメント、を挙げることができる。
　本明細書において、「抗ＶＬＡ－４抗体」は、ＶＬＡ－４タンパク質に特異的に結合し、その機能発現を抑制できる限り制限されない。当該抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、いずれも当業者が公知の方法により適宜作成することができる。当該抗体がモノクローナル抗体である場合は、公知の方法により作成されるキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体であってもよい。また、前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ぺプチボディ、ミメティボディ等の抗体フラグメントであってもよい。好ましくは、抗ＶＬＡ－４抗体は、中和抗体である。例えば、抗ＶＬＡ－４抗体として、InVivoMAb anti-mouse/human VLA-4 (CD49d)（クローンNo. PS/2、Cat No. BE0071、Bio X Cell）、文献：Ferreira, E.F.B. et al（Current Medicinal Chemistry, 2021, 28, 5884-5895）に記載のＶｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ等を挙げることができる。
　本明細書において、ＶＬＡ－４アンタゴニストは、ＶＬＡ－４を競合的に阻害するタイプ（競合阻害型）であっても、非競合的に阻害するタイプ（非競合阻害型）であってもよい。好ましくは、非競合阻害型である。ＶＬＡ－４アンタゴニストは、化合物であってもペプチドであってもよい。
　ＶＬＡ－４アンタゴニストとして、例えば、カロテグラストメチル（文献：国際公開第２０１６／０５１８２８号）；文献：Ferreira, E.F.B. et al（Current Medicinal Chemistry, 2021, 28, 5884-5895）に記載のＳＢ６８３６９９／Ｆｉｒａｔｅｇｒａｓｔ、Ｒ４１１／ｖａｌａｔｅｇｒａｓｔ、ＣＴ７７５８／ＣＤＰ３２３、ＤＳ－７０、及びＴＢＣ３４８６；文献：Slack, RJ(Nature Reviews Drug Discovery volume 21, pages60-78 (2022))に記載のＰＮ－９４３、及びＭＯＲＦ－０５７；文献：Baiula, M et al (Front Chem . 2019 Jul 9;7:489)に記載のＢＩＯ１２１１、及びＢＩＯ５１９２；文献：Ohkuro, M et al（Nat Commun. 2018 May 17;9(1):1982ER464195-01）に記載のＥＲ４６４１９５－０１；ＥＲ４６４１９５－０１の類縁体であるＥ６００７を挙げることができる。ＰＮ－９４３は、ペプチドである。
　ＶＬＡ－４の阻害物質として、ＶＬＡ－４　ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ分子を挙げることができる。前記ＲＮＡ分子は、ＶＬＡ－４　ｍＲＮＡ　を標的とし、ＶＬＡ－４　ｍＲＮＡ　の発現を抑制できる限り制限されない。前記ＲＮＡとして、ＲＮＡ分子ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種等の標的ｍＲＮＡを分解する作用を有するもの、及び／又は標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制するものを挙げることができる。これらのＲＮＡ分子の配列は、標的である上記遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。また、当該ＲＮＡ分子は公知の手法に基づいて作製してもよく、市場に流通するものを入手して用いることもできる。例えば、ＶＬＡ－４のアンチセンスＲＮＡとして、文献：Limmroth, V. et al (Neurology 83 November 11, 2014)に記載のATL1102を挙げることができる。ＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクターを挙げることができる。
　ＶＬＡ－４　ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ分子を発現できるベクターは、個体の体内、又は細胞内で当該ＶＬＡ－４タンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子を発現できる限り特に制限されない。例えば、ヘアピン型ＲＮＡ発現ベクター等を挙げることができる。ヘアピン型ＲＮＡ発現ベクターは、例えばＵ６プロモーター等の短鎖ＲＮＡの発現に適したプロモーター塩基配列の下流に、標的ｍＲＮＡのセンス鎖と同じ配列（但しｍＲＮＡのウラシルはチミンに変わる）を有するセンス鎖ＤＮＡ塩基配列と；転写後にループ構造を形成するループ塩基配列と；前記センス鎖ＤＮＡ塩基配列と全体又は一部が相補的に結合することができるアンチセンス鎖ＤＮＡ塩基配列と；ターミネーター配列を少なくとも含む。ベクターは、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を例示することができる。
　ＶＬＡ－４の阻害物質として、ＶＬＡ－４遺伝子を標的とするゲノム編集システムを挙げることができる。ＶＬＡ－４遺伝子を標的とするゲノム編集システムは、個体の体内においてＶＬＡ－４遺伝子内に組換えを起こすことができるシステムである限り制限されない。例えば、ＣｏｍｐｏＺｒ　Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ　（ＴＡＬＥＮ）システム、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システム等を挙げることができる。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。好ましくは、ベクターを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。ベクターを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて、ＣＲＩＳＰＲをコードする核酸とＣａｓ９をコードする核酸は、異なるベクター上にあってもよく、また１つのベクター上にあってもよい。ＣＲＩＳＰＲを機能させるためのプロモーターは特に制限されないが、Ｕ６プロモーターが好ましい。Ｃａｓ９を機能させるためのプロモーターは特に制限されないが、サイトメガロウイルスプロモーター等の哺乳類細胞内で発現されるプロモーターが好ましい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムとして好ましくは、ｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９ベクター等の市販のベクターを使用することができる。
　ＣＲＩＳＰＲ配列に組み込まれる、ＶＬＡ－４遺伝子を標的とする配列（以下、“ＶＬＡ－４遺伝子標的配列”ともいう）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによってガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡともいう）に組み込まれて転写され、ＶＬＡ－４遺伝子を組換えることができる配列である限り制限されない。一般的には、ＶＬＡ－４遺伝子標的配列としては、ＶＬＡ－４遺伝子内に存在する塩基配列「ＮＧＧ」の５’側上流域の２０塩基前後の配列を選択することができるといわれている。ＶＬＡ－４遺伝子標的配列は、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｏｏｌ　（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ＺｈａｎｇＬａｂのウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／））、Ｅ－ＣＲＩＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／（ドイツがん研究センター））、ＺｉＦｉＴ　Ｔａｒｇｅｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉｔ／　（Ｚｉｎｇ　Ｆｉｎｇｅｒ　コンソーシアム））、Ｃａｓ９　ｄｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｓ９．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　（北京大学））、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ（東京大学））、ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｒｉｓｐｒ／（華中農業大学））等において公開されている公知のデザインツールを使用してデザインすることができる。
　以下に実施例を示して本発明についてより詳細に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定して解釈されるものではない。
　また、本実施例における全ての動物実験は実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従い、大阪大学動物実験委員会の承認を得て行った。
１．[11C]HCA2969の製造
　以下の手順に従って、[11C]HCA2969を製造した。合成スキームは、図１に示す。
（１）医療用サイクロトロン(CYPRIS HM-18、住友)を用い、N2ガスをターゲットとして14N(p, α)11Cの核反応により[11C]CO2を製造した。得られた[11C]CO2を気相法ヨウ化メチル合成装置(C-GPC-100、住友)に導入し、反応活性の高い[11C]トリフルオロメタンスルホナート（[11C]CH3OTf）を合成した。
（２）[11C]CH3OTfを1 mg/mL HCA2969前駆体(QD)/アセトン溶液 500μL及び1 mol/L NaOH 3 μLを加えた反応容器に導入しバブリングした。
（３）（２）で得られたバブリング後の液に0.1 mol/L NaOH 100 μLを加えて、室温10分間の脱保護反応を行った。
（４）（３）で得られた液脱保護後の駅に注射用水1 mLを加えて十分に混合後、その全量をHPLCに注入し、[11C]HCA2969を分取した。代表的なHPLCクロマトグラムを図2に示す。
（５）分取液を注射用水で希釈し、この全量を固相抽出カラム（HLBカラム）に[11C]HCA2969に保持させた。HLBカラムは、あらかじめエタノール10 mL及び注射用水20 mLでプレコンディショニングしておいた。
（６）（５）において[11C]HCA2969を保持させたHLBカラムを注射用水で洗浄して不純物を除去後、エタノールにより[11C]HCA2969を製品バイアルに回収した。製品バイアルにはエタノールの終濃度が10%程度になるよう生理食塩液を添加しておいた。製品バイアルに回収した[11C]HCA2969液を最終製剤とした。
（７）最終製剤の一部を抜き取り、品質試験を実施した。品質試験の結果、25μA、30分の照射条件にて得られた[11C]CO2を出発原料として、2 GBq前後の[11C]HCA2969が得られた。また、その放射化学的純度は、合成直後、さらには、合成90後においても90%以上と安定して高い値が得られることを確認した。結果を図３に示す。
２．自己免疫性心筋炎ラットモデルを使ったシングルセル解析
（１）自己免疫性心筋炎ラットモデル
　自己免疫性心筋炎ラットモデルはルイスラット（オス、8週齢）にPig Cardiac Myosin（ブタ心臓から自家精製） 10mg/mlとAdjuvant （CFA 10mg/ml；Chondrex社、7002）を投与し作成した。Pig Cardiac Myosinの投与日をDay 0とした。このモデルにおいて、Day 21に心筋炎の極期を迎えた。図４に、Day 12、Day 19、及びDay 25における心臓のマクロ画像と、組織のhematopoietic染色像の弱拡大画像及び強拡大画像を示す。Day 12で心筋組織内への炎症性細胞の浸潤が始まり、Day 19では、さらに強い炎症性細胞の浸潤を認めた。Day 25では、炎症による心筋組織の破壊が認められた。いずれの病期においても好酸球浸潤は認めなかった。
（２）シングルセル解析による心筋組織内の細胞のポピュレーション解析
　シングルセル解析は、ラット心臓を酵素（Liberase TM (Roche, 5401119001 / Liberase DH (Roche, 5401054001))で細胞分散し、Chromium (10x Genomics)で解析することにより行った。図５に結果を示す。図中“CTL”は抗原未投与のコントロールを示し、“Myocarditis day…”は、Pig Cardiac Myosin投与からの経過日数を示す。Day 21では、T細胞及び好中球の数が増加し、血管内皮細胞は相対的に減少した。また、単球及びマクロファージの数が顕著に増加したが、NK細胞は減少し、B細胞は確認されなかった。好酸球もまた検出されなかった。さらに、CTLとは異なり、活性化した心臓線維芽細胞集団が増加した。
　図６に、各CTL、day 8、day 14、day 21、day 25におけるVcam-1の発現を示す。Vcam-1は、血管内皮細胞に発現が認められたが、活性化心臓線維芽細胞（Postn+/FAP+）においても高い発現を示した。
３．in vitroにおける心臓線維芽細胞を用いた単核球の接着実験
　炎症性サイトカインである、TNFαの刺激によりVcam-1の発現が変化するか、また、TNFαの刺激により心臓線維芽細胞と単核球との接着性に変化が起こるかを確認するため本実験を行った。
（１）培養条件と接着条件
　図７（A）に接着実験のスケジュールを示す。
　心臓線維芽細胞として、ラット新生児から摘出した心臓をCollagenase type2（Worthington Biochemical Corporation, LS004176）で細胞分散後に単離した線維芽細胞を96well plateに培養した。脾臓単核球は、野生型マウスより脾臓を摘出し、ホモジナイズ後にOptiprep（Serumwerk Bernburg, 1893）による比重分離で単核球分画を採取した。接着実験は心臓線維芽細胞を96well plateに48時間培養し、TNFα +/-の培地交換を行いさらに24時間培養した。蛍光染色（Hoechst 33342（同人化学, 341-07901）, もしくはCytored（同人化学, 342-08531））した脾臓単核球を加え、30分37℃でインキュベートした。PBS(-)で6回Washを行い、非接着単核球を除去後に、In Cell Analyzer 6000（GE Healthcare Life Sciences）で接着単核球のカウントを行った。
　TNFα（Peprotech、300-01A）は、終濃度で5～15 ng/mlとなるようにウェルに添加した。
　TNFαによるVcam-1の誘導をウエスタンブロッティングで確認した。ウエスタンブロッティングの一次抗体としてAnti-Vcam1抗体EPR5047（Abcam、ab134047）を使用した。検出にはHRP標識抗Rabbit抗体を使用し、
発光試薬はケミルミワンL（Nacalai tesque、07880-70）を使用した。インターナルコントロールとして、GAPDHのウエスタンブロッティングを行った。
（２）結果
　ウエスタンブロッティングの結果を図７（B）に示す。ウエスタンブロッティングは、各サンプルにつきディプリケートで行った。Vcam-1の発現は、TNFαの添加0 hrにおいてもわずかに認められた。しかし、TNFαの添加12 hrs、及び24 hrsでより発現が増加した。また、図７（C）は、In Cell Analyzer 6000による撮像画像である。図７（C）に示すように、TNFαの刺激を受けることにより、心臓線維芽細胞は単核球との接着が強くなることが示された。
４．in vitroにおけるsiRNAを用いた心臓線維芽細胞と単核球の接着実験
　心臓線維芽細胞と単核球にVcam-1が直接接着していることを確認するため、siRNAを用いてV-cam-1をノックダウンした心臓線維芽細胞を使用し、単核球との接着性を確認した。
（１）実験条件
　図８（A）に本実験のスケジュールを示す。
　心臓線維芽細胞の培養、及び接着実験は、上記３．（１）と同様に行った。
　Vcam-1 siRNA（SilencerTM Select Pre-Designed siRNA, siRNA ID s129593, Thermo；siVcam-1とも呼ぶ）は、終濃度30nMとなるように、LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent (Thermo, 13778075)を使って、ウェルに播種後2時間の心臓線維芽細胞にトランスフェクトした。心臓線維芽細胞をウェルに播種してから72時間後に単核球との接着実験を行った。siRNAのコントロール（siCTL）として、SilencerTM Select Negative Control No.1 siRNA（Thermo、4390843）を使用した。トランスフェクション量は、siVcam-1と同量とした。また、トランスフェクション後46時間後にTNFαを5 ng/mlとなるように添加した。
　Vcam-1のウエスタンブロッティングは、上記３．（１）と同様に行った。
　単核球の検出には、In Cell Analyzer 6000（GE Healthcare Life Sciences）で接着単核球のカウントを行った。
（２）結果
　図８（B）に示す様に、siCTLをトランスフェクトした心臓線維芽細胞では、Vcam-1のシグナルが検出されたが、siVcam-1をトランスフェクトした心臓線維芽細胞ではVcam-1のシグナルが検出されなかった。このことから、siVcam-1は、心臓線維芽細胞内においてVcam-1の発現を抑制していることが示された。この実験系を用い、単核球との接着性を確認した。その結果を図８（C）に示す。siVcam-1をトランスフェクトした細胞では、単核球の接着が減少していた。一方、siCTLをトランスフェクトした細胞では、単核球の接着が認められた。このことから、心臓線維芽細胞と単核球との接着は、Vcam-1を介していることが示された。
５． Vcam-1中和抗体とVLA-4中和抗体との併用による心筋炎の予後改善効果の検証
　文献：Int Immunol. 2010 Jun;22(6):443-52によれば、自然発症型全身性エリテマトーデスマウスモデルであるMRL-Faslpr/lprとPD-1ノックアウトマウスであるC57BL/6-Pdcd1-/-を交配したMRL-Pdcd1-/-は、生後4週から8週で96％が心筋炎を発症するリンパ球性心筋炎自然発症モデルマウスである。また、生後10週における生存率は30％程度であり、野生型マウスと比較して著しく低い。このMRL-Pdcd1-/-を使用し、以下の心筋炎の実験を行った。
（１）Vcam-1中和抗体とVLA-4中和抗体の併用投与
　13匹のMRL-Pdcd1-/-をコントロール（CTL: n=7）とVcam-1中和抗体とVLA-4中和抗体の併用投与（中和抗体群: n=7）の2群に分けた。生後14日目からCTL群には生理食塩水を腹腔内に投与し、中和抗体群にはVcam-1中和抗体とVLA-4中和抗体を投与した。Vcam-1中和抗体として、InVivoMAb anti-mouse CD106 (VCAM-1)（クローンNo. M/K-2.7、Cat No. BE0027、Bio X Cell）を使用した。VLA-4中和抗体の中和抗体としてInVivoMAb anti-mouse/human VLA-4 (CD49d)（クローンNo. PS/2、Cat No. BE0071、Bio X Cell）。それぞれの投与量は、10μg/gとした。投与スケジュールは、図９（A）に示すように、生後14日目から3日おきに生後26日目まで行った。生後14日目と、28日目に心エコーを行った。また、生後28日目の心エコーデータ取得後に、全てのマウスについて採血と心臓の採取を行った。
（２）結果
　図９（B）にCTL群、中和抗体群全てのマウスの心エコーにより測定した左室内径率（％fractional shortening ; FS）を示す。CTL群では生後14日目に比較し、生後28日目では心室の収縮性が著しく低下した。一方、中和抗体投与群では、CTL群と比較し心室の収縮性の低下が軽度であった。図９（C）に、図９（B）に示した個体の28日目の左室拡張末期径［LVDd（mm）］と左室内径短縮率［%FS(%)］の箱ひげ図を示す。CTL群と中和抗体投与群の間のLVDd に優位な差は目認められなかった（p=0.22）。一方％FSは、中和抗体投与群で優位に高かった（p=0.0103）。図９（D）にCTL群と中和抗体投与群のKaplan-Meier曲線を示す。図中符号aはCTL群を示し、符号bは中和抗体群を示す。生後28日間までの検討では、CTL群では生後20日目から絶命する個体が増えた。一方、中和抗体投与群では絶命する個体は認められなかった。両群の差は、Log-rank解析において、p=0.033であり有意差が認められた。このことから、Vcam-1中和抗体とVLA-4中和抗体の併用投与により、心筋炎による死亡率が改善されることが示された。
６．VLA-4中和抗体の効果
　Vcam-1中和抗体とVLA-4中和抗体のどちらが心筋炎による死亡率の低下に貢献するか検討するため以下の検討を行った。
（１）抗体投与
　29匹のMRL-Pdcd1-/-をコントロール（CTL: n=12）と、Vcam-1中和抗体のみを投与するVcam-1群（n=5）と、VLA-4中和抗体を投与するVLA-4群（n=6）と、Vcam-1中和抗体とVLA-4中和抗体の併用投与するVcam-1/VLA-4群（n=6）の4群に分けた。
　各抗体の投与量は上記４．（１）と同量とした。図１０（A）に示すように、中和抗体の投与スケジュールも上記４．（１）と同様とした。
（２）結果
　図１０（B）に各群のKaplan-Meier曲線を示す。図中符号aはCTL群を示し、符号bはVcam-1群を示し、符号cはVcam-1/VLA-4群を示し、符号dはVLA-4群を示す。生後28日間までの検討では、CTL群（符号a）では生後19日目から絶命する個体が増えた。Vcam-1群（符号b）も生後20日から絶命する個体が増えた。一方、Vcam-1/VLA-4群（符号c）では、絶命した個体は認められなかった。VLA-4群（符号d）は、18日目で1個体絶命したものの、残る個体は生後28日目まで生存していた。このことから、心筋炎の予後の改善に貢献しているのは、VLA-4中和抗体であることが示された。
７．心機能が低下したマウス群におけるVLA-4中和抗体の効果
　図１１（A）に、生後３週目の野生型マウス（WT）、野生型マウスとMRL-Pdcd1-/-を交配させたF1（hetero：MRL-Pdcd1-）、MRL-Pdcd1-/-（homo）の％FS値を示す。WT群の％FS値は、75％以上でありばらつきは第1四分位と第4四分位間の差は少なくばらつきは少なかった。一方homo群とhetero群の％FS値は、高い個体もあれば、低い個体もあり、全体としてブロードに分布していた。
　そこで、図１１（B）に示す様にhomo群を％FSの高い群（心機能良好群：n=11）と％FSの低い群（心機能低下群：n=20）にわけ、さらに心機能低下群を、VLA-4中和抗体を投与しないコントロール群（CTL群）とVLA-4中和抗体を投与するVLA-4投与群（VLA-4群）に分けVLA-4中和抗体の効果を検討した。心機能良好群（normal EF群）と心機能低下群とのカットオフ値は、70％とし、70％以上の群を心機能良好群とし、70％よりも低い群を心機能低下群とした。その上で、図１１（C）に示すスケジュールでVLA-4中和抗体を投与した。各群の体重（BW）、脈拍（HR）、％FS値を図１２に示す。CTL群とVLA-4群間で各パラメータに有意差はなかった。
　図１３に、CTL群（符号a）とVLA-4群（符号b）のKaplan-Meier曲線を示す。Log-rank解析の結果、p=0.0285であり、VLA-4群は優位に生存率が延長していた。
　図１４に、さらに、normal EF群（符号c）の生存曲線を追加したKaplan-Meier曲線を示す。normal EF群は心機能が良好であり、VLA-4中和抗体を投与しなかった群であるが、VLA-4群と比較して有意に生存率が低いことが示された（Log-rank解析の結果、p=0.0275）。
　このことから、各個体の心機能データに捕らわれることなく、心筋炎個体にVLA-4中和抗体を投与することは、心筋炎の予後を改善することが示唆された。また、心筋炎個体にVLA-4中和抗体を投与することは、心筋炎の予防、又は治療に有効であることが示唆された。
８．VLA4阻害剤投与の効果
　VLA4阻害剤の1つであるAJM300（カロテグラストメチル）の投与が心筋炎による死亡率の低下に貢献するか検討するため以下の検討を行った。
（１）AJM300投与
　44匹のMRL-Pdcd1-/-をAJM300を投与しないAJM300（－）群（n=13）と、AJM300を投与するAJM300（＋）群（n=12）の2群に分けた。
　AJM300群（＋）には、生後2週から死ぬまでAJM300 1%混合給餌投与した。
　また、AJM300（－）群のうちの9匹と、AJM300（＋）群のうちの10匹は、28日齢になったときに心エコー心機能の評価を行い、安楽死させ心臓及び血液サンプルを採取した。
（２）結果
　図１５に各群のKaplan-Meier曲線を示す。図中符号aはAJM300（＋）群を示し、符号bはAJM300（－）群を示す。AJM300（＋）群は、AJM300（－）群と比較して有意に生存期間が延長していた（Log rank解析　p=0.0022）。このことから、VLA4阻害剤の投与は心筋炎の予後の改善に貢献することが示された。
　図１６に心エコー心機能検査によって測定した心拍数と左室収縮能：%Fractional Shortening (%)の結果を示す。AJM300（＋）群は、AJM300（－）群と比較して有意に徐脈が改善していた（t検定　p=0.0231）。また、AJM300（＋）群は、AJM300（－）群と比較して有意に左室収縮能が改善していた（t検定　p=0.0231）。このことから、VLA4阻害剤の投与は心機能の改善に貢献することが示された。
９．ヒトにおける血清中の可溶性Vcam-1 濃度
　可溶性Vcam-1 (sVcam-1)の血清中の濃度を健常人と心筋炎患者の間で比較した。
　健常人（CTL）３名、Covid関連心筋炎（Covid related）4名、リンパ球性心筋炎（Lym）8名、好酸球性心筋炎（Eosi）6名、巨細胞性心筋炎（Giant）3名の結果を図１７に示す。リンパ球性心筋炎を含むいずれのタイプの心筋炎でも健常人と比較して血清中sVcam-1濃度の上昇を認めた。このことから、心筋炎発症においてVLA-4/Vcam-1経路が関与していることが示唆された。
１０．心筋炎病態における血清中sVcam-1の推移
　3名のリンパ球性心筋炎患者の急性期及び回復期における血清中sVcam-1濃度を比較した。
　結果を図１８に示す。患者３名の血清中sVcam-1濃度は急性期には非常に高値を示していた。図１７に示す健常人の血清中sVcam-1濃度と比較してもわかるように、患者３名も回復期には、健常人レベルまで改善していた。
　このことから、心筋炎においてVLA-4/Vcam-1経路が関与していることが示唆された。
１１．[11C]HCA2969のマウス単核球VLA-4に対する結合性の評価
　マウスから回収した単核球を使用して[11C]HCA2969のVLA-4に対する結合性を評価した。
（１）方法
　マウスの脾臓から回収した単核球2×106個と、上記１．において合成した[11C]HCA2969を0.025 nM、0.1 nM、0.4 nM、1.6 nM、6.4 nM、25.6 nMとなるようにそれぞれ緩衝液（10mM Tris pH7.5, 0.1%BSA, 150mM NaCl, 2mM MnCl2, 2mM D-glucose）に添加し、混合した。混合後室温で20分間インキュベートし、細胞を緩衝液（10mM Tris pH7.5, 0.1%BSA, 150mM NaCl, 2mM MnCl2, 2mM D-glucose）で2回洗浄した。洗浄後の細胞について、シンチレーションカウンターで放射線量を測定した。
（２）結果
　図１９（A）に[11C]HCA2969の各添加量における放射線量を示す。図１９（B）に、[11C]HCA2969 1 nM当たりの放射線量を示す。(A)ではきれいな飽和曲線が描出され、(B)のScatchard分析により、平衡解離定数Kd 0.16nMとBmax 81.85 Bqを算出した。
１２．[11C]HCA2969を使用した心筋炎の検出
　上記５．において作製したMRL-Pdcd1-/-と野生型マウスにおいて、day 25-26にイソフルラン吸入麻酔下にて[11C]HCA2969トレーサーを約1-10MBq尾静脈投与し、PET/CTイメージングを行った。
　図２０に、MRL-Pdcd1-/-マウス２匹の結果を示す。いずれも、心臓へのトレーサーの集積が認められた。
　図２１に、野生型マウス２匹の結果を示す。いずれも、心臓へのトレーサーの集積は認められなかった。
１３．[11C]HCA2969を使用した自己免疫性心筋炎の検出
　上記２．において作製した自己免疫性心筋炎ラットモデルに対して、心筋炎極期となる誘発3週目において、イソフルラン吸入麻酔下にて[11C]HCA2969トレーサーを約1-10MBq尾静脈投与し、PET/CTイメージングを行った。
　図２２に示すように、心筋炎非誘発ラット（左：CTLと記載）と同様に自己免疫性心筋炎モデルラット（右：心筋炎と記載）でも、心臓へのトレーサーの集積は、認められなかった。
　図２３、図２４に示すように、自己免疫性心筋炎モデルラットに対して、上述した抗VLA-4中和抗体、又はAJM300投与実験を行った。検討群は、Placebo群5匹、AJM300 投与群4匹、抗VLA-4中和抗体を投与した中和抗体投与群5匹とした。Placebo群には心筋炎誘発3日前～3週目までPlacebo（0.43%メトローズ＋0.14%アクジゾル）を混合した試料を給餌した。AJM300投与群には心筋炎誘発3日前～3週目までAJM300を1%給餌混合した。中和抗体投与群には心筋炎誘発時（0w）、心筋炎誘発後1週間目（1w）、心筋炎誘発後２週間目（2w）、心筋炎誘発後３週間目（3w）に中和抗体を5mg/kg静脈投与した。心筋炎誘発後２１日目に、左室収縮能と、心拍数を評価した。図２５（A）にPlacebo群、AJM300投与群、中和抗体投与群の左室収縮能を示す。図２５（B）にPlacebo群、AJM300投与群、中和抗体投与群の心拍数の分布を示す。図２５に示すように、自己免疫性心筋炎モデルラットではPlacebo群、AJM300投与群、中和抗体投与群間において心機能に有意差は認めず、AJM300及び抗VLA-4中和抗体は心機能改善効果を示さなかった。
　上記１２．の結果と合わせることにより、[11C]HCA2969トレーサーはAJM300及び抗VLA-4中和抗体の治療効果が期待できる心筋炎モデルで心筋に集積を認めることが示された。
１４．[11C]HCA2969を使用した治療効果の判定
　次にPD1ノックアウトマウス（MRL- Pdcd1-/-マウス：PD1-/-マウス）を使って、[11C]HCA2969トレーサーによる心筋炎の治療効果を評価した。
（１）方法
　4週齢の野生型マウス群と、プラセボ群、AJM300投与群、抗VLA-4中和抗体投与群のPD1-/-マウス群を準備した。プラセボ群には通常飼料を与え、AJM300投与群には１％の割合でAJM300を混合した飼料を飼育開始から14日目から28日目まで与えた。抗VLA-4中和抗体投与群には通常飼料を与え、飼育後14日目と21日目に抗VLA-4中和抗体（10mg/kg）を腹腔内に投与した。
　飼育開始から28日目に、各マウスにイソフルラン（１～３％/２L O2）で麻酔をかけ、[11C]HCA2969トレーサー（１～10MBq：10μgの非ラベルHCA2969に10MBq のPETトレーサーが含まれる）を尾静脈から注入した。注入から20分後に10分間PET/CTイメージングを行った。
（２）結果
　結果を図２６及び図２７に示す。図２６（A）は、野生型マウス（WT）とPD1-/-マウス（PD1-/-）のPET/CTイメージングの例を示す。PD1-/-マウスでは、心臓部分に[11C]HCA2969トレーサーの集積を認めた。図２６（B）は、各群の心臓部の集積を定量化した箱ひげ図である。
　PD1-/-マウスのプラセボ群では、[11C]HCA2969トレーサーの集積を認めた。一方、AJM300投与群、抗VLA-4中和抗体投与群では、プラセボ群と比較して集積は低くなっていた。
　この結果から、[11C]HCA2969トレーサーは、AJM300及び抗VLA-4中和抗体の治療効果を判定できているものと考えられた。
　図２７（A）は図２６（B）のプラセボ群の箱ひげ図において実線の丸印をつけた個体の心筋組織画像を示す。この個体は[11C]HCA2969トレーサーの集積が特に高かった個体である。図２７（B）は図２６（B）のプラセボ群の箱ひげ図において点線の丸印をつけた個体の心筋組織画像を示す。この個体は、[11C]HCA2969トレーサーの集積が特に低かった個体である。図２７（A）では、組織に単核球の浸潤が認められ、心筋の炎症が強かった。一方、図２７（B）では、炎症所見は認められなかった。この結果から、 [11C]HCA2969トレーサーは、心筋の炎症に特異的に集積していると考えられた。
１５．[11C]HCA2969トレーサーを使用した心筋炎以外のVLA-4陽性リンパ球関連疾患の診断
　Experimental Autoimmune Encephalitis (EAE) model（マウス脳脊髄炎モデル：EAEマウス）を使用し、心筋炎以外のVLA-4陽性リンパ球関連疾患の診断における[11C]HCA2969の利用可能性を評価した。
１５－１．[11C]HCA2969トレーサーシグナルの患部への集積の観察
（１）EAEマウスの作製（immunization）
　H37RA結核菌毒素(BD)40mgをAdjuvant incomplete Freund(BD) 10mlに懸濁しComplete Freund’s Adjuvant (CFA)を調製した。MOG peptide(MOG 35-55, Biosynthesis)を生理食塩水で溶解し、1mg/mlの濃度とした。９週齢のオスのC57BL/6Jマウス1匹あたりCFA 100μlとMOG溶液100μlの両液を、ガラスシリンジ内で混合・懸濁してemulsionを作製した。作製した白濁のemulsion溶液をマウス1匹あたり200μlとなるように両側鼠径部に皮下注射した（immunization 0日目）。その後、百日咳毒素(Pertussis toxin, LBL)をPBSで溶解した溶液(4μg/ml)をマウス1匹あたり100μlをemulsion溶液投与日当日に腹腔内投与し、48時間後に再度腹腔内投与した。immunization 0日目から、EAEのdisease scoreを記録した。
　このモデルでは、およそ1週間で脊髄への炎症細胞の浸潤と麻痺症状が出現し、2週間でpeakを迎え、4週後には改善を示す。炎症は脳よりも脊髄に優位であり、腰髄側から炎症が起こるため、麻痺は尾や後肢から発症する。
　以下の実験では、immunization後 15日目においてEAEのdisease score 0.5以上の麻痺症状が現れているマウスを使用した。
（２）PET/CTイメージング
　immunization後 15日目に、各マウスにイソフルラン（１～３％/２L O2）で麻酔をかけ、[11C]HCA2969トレーサー（１～10MBq：10μgの非ラベルHCA2969に10MBq のPETトレーサーが含まれる）を尾静脈から注入した。注入から20分後に10分間PET/CTイメージングを行った。撮像は、胸髄～腰髄にRegion of Interest （ROI）を設定して[11C]HCA2969トレーサーシグナルの集積をカウントし、SUV median (Bq/ml)とSUV mean (Bq/ml)を算出した。
（３）結果
　図２８に陰性対照（Control）群と、EAEモデル群（EAE）のSUV median (Bq/ml) とSUV mean (Bq/ml)を示す。図２８（A）は、SUV median (Bq/ml)であり、図２８（B）はSUV mean (Bq/ml)である。いずれも、EAEモデル群において高い[11C]HCA2969トレーサーシグナルの集積を認めたことから、本発明の[11C]HCA2969トレーサーは、心臓以外の組織の炎症も検出できることが示された。
１５－２．[11C]HCA2969トレーサーの患部への取り込みの観察
　EAEモデルマウスを使用して、脊髄及び脳への[11C]HCA2969トレーサーの取り込みを観察した。
（１）方法
　上記１７－１．において作製したEAEモデルについて、immunization後 15日目においてEAEのdisease score 0.5以上の麻痺症状が現れているマウスに、上記１７－１．（２）に記載の方法にしたがって、[11C]HCA2969トレーサーを投与した。投与から30分後にマウスを安楽死させ、脊髄及び脳を採取した。採取した組織は、一部をWell counterにより放射線量を測定し、一部をHE染色に供した。
（２）結果
　図２９にWell counterの測定結果を示す。EAEモデル群は陰性対照群（CTL群）と比較して脊髄において有意なトレーサーシグナルの集積の増加を認めた。脳においても集積は増加傾向であった。EAEモデルでは脊髄を中心に炎症細胞浸潤が起こるため、この集積は炎症細胞浸潤を反映していると考えられた。
　図３０に、EAEモデル群は陰性対照群（CTL群）の各個体の%ID/gを示す。図３１にEAEモデル群の各個体の脊髄のHE染色画像を示す。図３０、及び図３１においてアスタリスクをつけた個体は脊髄に[11C]HCA2969トレーサーの集積が認められた個体である。脊髄に[11C]HCA2969トレーサーの集積が認められたEAE1、EAE2、EAE5、及びEA6の個体では、HE染色において脊髄組織にリンパ球浸潤が認められた。
　これらの結果から、[11C]HCA2969トレーサーは、心筋だけでなく、他の組織のリンパ球浸潤を伴う炎症の評価も可能であることが示された。

Claims (11)

  1. 　下記一般式（Ｉ）で表される放射性陽電子放出核種炭素１１標識化合物（［１１Ｃ］標識化合物）、又はその薬学的に許容される塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    Ｒ１は、塩素原子である。
    ｍは、１～３の整数である。
    Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７の少なくとも１つは直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基であり、前記アルキル基は放射性陽電子放出核種炭素１１［１１Ｃ］を有し、それ以外は、水素原子である。
    Ｒ８は、水素原子、又は直鎖又は分岐鎖の炭素数１～６のアルキル基である。）
  2. 　前記［１１Ｃ］標識化合物が、下記一般式（II）で表される、請求項１に記載の前記［１１Ｃ］標識化合物、又はその薬学的に許容される塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、上記に同じ。）。
  3. 　前記［１１Ｃ］標識化合物が、下記式（１）、又は（２）で表される、請求項１に記載の前記［１１Ｃ］標識化合物、又はその薬学的に許容される塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     。
  4. 　請求項１に記載の前記［１１Ｃ］標識化合物、又はその薬学的に許容される塩を含む、放射性組成物。
  5. 　リンパ球性炎症性疾患を検出するために使用される、請求項４に記載の放射性組成物。
  6. 　前記リンパ球性炎症性疾患、心筋炎又は脊髄炎である、請求項５に記載の放射性組成物（ただし、ミオシンを抗原とする心筋炎からは自己免疫性心筋炎を除く）。
  7. 　前記心筋炎が、Ｖｃａｍ－１とＶＬＡ－４の結合に依存的に発症する心筋炎である、請求項５に記載の放射性組成物。
  8. 　前記心筋炎が、免疫チェックポイント阻害剤に起因する心筋炎である、請求項５に記載の放射性組成物。
  9. 　心筋炎の治療効果を判定するために使用される、請求項４に記載の放射性組成物。
  10. 　心筋炎の治療効果を予測するために使用される、請求項４に記載の放射性組成物。
  11. 　心筋炎患者、又は心筋炎が疑われる患者に対して、ＶＬＡ－４の阻害物質による治療効果を予測し、前記治療が有効であると判定される患者に対して当該治療の実施を判断するために使用される、請求項４に記載の放射性組成物。 
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