WO2025053168A1

WO2025053168A1 - 染色方法、染色のための液体組成物、及び染色のためのキット

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Publication number: WO2025053168A1
Application number: PCT/JP2024/031684
Authority: WO
Inventors: 正宣大塚; 和香長谷川; 賢杉田; 淳二伊藤; 圭吾水澤
Original assignee: Canon Inc; Canon Virginia Inc
Current assignee: Canon Inc; Canon Virginia Inc
Priority date: 2023-09-08
Filing date: 2024-09-04
Publication date: 2025-03-13
Anticipated expiration: 2026-03-08

Abstract

生物学的試料を、インクジェット方式で吐出させた染色液で染色できる方法を提供する。生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含有する液体組成物を、インクジェット方式の液体吐出ヘッドから吐出し、前記生物学的試料に付与する工程を有することを特徴とする染色方法を提供する。

Description

染色方法、染色のための液体組成物、及び染色のためのキット

　本発明は、生物学的試料を染色する染色方法、染色のための液体組成物、及び染色のためのキットに関する。具体的には、生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含有する液体組成物を、インクジェット方式の液体吐出ヘッドから吐出し、前記生物学的試料に付与する工程を有することを特徴とする染色方法、該染色に用いられる液体組成物、及び該染色に用いられるキットに関する。

　近年の分子生物学の発展により、生体内に存在する物質の解析に対する重要性が増している。例えば、癌組織切片から再発や転移に関わるタンパク質や化学物質を明らかにするといった試みが数多くなされている。

　細胞や組織等の生物学的試料中のタンパク質や化学物質を解析する手段としては、顕微鏡による観察が多く用いられる。この場合、生物学的試料中のタンパク質や化学物質等の標的を同定する手段として、抗体等の標的に特異性を有するタンパク質（リガンドタンパク質）を介して、標的を標識し、発色、発光、蛍光等で検出するという方法が用いられている。

　リガンドタンパク質を含む液体組成物をピペットディスペンサーを用いて、標的に付与する方法があるがピペットの洗浄や交換場所を必要となり装置が大型になるために装置を小型化させたい要望がある。

　特許文献１には、生物学的試料の上に約１ｐＬ～約５０ｐＬの間の試薬小滴を分配する方法が開示されている。また、特許文献１には、この試薬小滴をインクジェットで分配する方法も開示されている。

特表２０１８－５１７８９５号公報

　特許文献１では、インクジェットで抗体試薬組成物等の小滴を付与し、免疫染色を行っている。本発明者らは、特許文献１に記載の抗体試薬組成物をインクジェット方式で吐出した。その結果、特に高周波数で吐出する場合、すなわち、短時間の吐出間隔で吐出する場合において、抗体試薬組成物の吐出体積が意図した液滴体積から大幅に小さくなってしまう場合があった。

　本発明の目的は、インクジェット方式の吐出で、生物学的試料における標的に特異性を有するリガンドタンパク質を、所望の液滴体積で付与することができ、すなわち、効率的な液体体積で付与することができる染色方法、染色のための液体組成物、及び染色のためのキットを提供することである。

　本発明は、生物学的試料を染色する染色方法を提供する。詳細には、生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含有する液体組成物を、インクジェット方式の液体吐出ヘッドから吐出し、前記生物学的試料に付与する工程を有することを特徴とする染色方法である。

　また、本発明は、生物学的試料の染色のための液体組成物を提供する。詳細には、生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含有する液体組成物である。さらに、本発明は、生物学的試料の染色のためのキットを染色する染色方法を提供する。詳細には、生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含有する液体組成物を含む、インクジェット方式を用いた生物学的試料の染色のためのキットである。

　本発明によれば、インクジェット方式の吐出で、生物学的試料における標的に特異性を有するリガンドタンパク質を、所望の液滴体積で付与することができ、すなわち、効率的な液体体積で付与することができる。

　以下、好適な実施の形態を挙げて、本発明を詳細に説明する。
　本発明は第一の実施形態として、生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含有する液体組成物を、インクジェット方式の液体吐出ヘッドから吐出し、前記生物学的試料に付与する工程を有することを特徴とする染色方法を提供する。

　サーマルインクジェット方式のインクジェット方式を用いる場合について説明する。液体吐出ユニットについては、吐出口の口径、吐出に利用される熱パルスの熱量、それに用いるマイクロ・ヒーター等のサイズ精度が高く、再現性を高くすることが可能である。ヘッド上には、多数の液体吐出ユニットが高密度に配置される。一方、上述のとおり、液体吐出ユニットの再現性を高くすることができるため、多数の液体吐出ユニット全体において、吐出される液体について、その液滴径分布を狭くすることが可能である。また、ヘッドは、製作コストが低く、また、汎用性も高い。たとえば、ヘッドを適宜交換して用いる小型の吐出装置の需要があるが、このような吐出装置への適用性も高い。従って、吐出装置の小型化や利便性が求められる場合に、特に、サーマルインクジェット方式の吐出装置が好ましい。

　しかし、本発明者らの検討によると、タンパク質を含む液体組成物は添加物を加えずにサーマルインクジェット方式で吐出した場合、タンパク質の種類や濃度にもよるが、吐出周波数５～５０ｋＨｚの高周波数領域では、タンパク質未添加物と比較して吐出体積が大幅に減少することが確認されている。

　吐出体積が大幅に減少する原因は定かではないが、発明者らは以下のように考えている。タンパク質は一般的に疎水部が折りたたまれるような高次構造を有していることが知られる。その疎水部を介してタンパク質がヒーター部に吸着すると、加熱によって一時的に不溶物が析出する。ヒーターの次の駆動までに不溶物の水中への再溶解が一部間に合わない。ヒーター部分の一部しか加熱されないために吐出体積の大幅な減少が認められる、と推定している。
　また、ヒーター部で加熱され、一度は不溶化したリガンドタンパク質は、生理活性が低下することが懸念される。

　効率的に多くの液体を吐出させるためにはある程度以上の高周波数で吐出しなければならない。本実施形態において好ましい駆動周波数は、０．1ｋＨｚ～１００ｋＨｚであり、より好ましくは、１ｋＨｚ～５０ｋＨｚである。

　本発明者らは鋭意検討した結果、リガンドタンパク質を含む液体組成物にアミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種と、界面活性剤と、を添加することでリガンドタンパク質の生理活性の維持と十分な吐出体積の確保を両立することができた。

　アミノ酸と界面活性剤を組み合わせることで十分な吐出体積の確保に十分に寄与する原因については明らかになっていないが、以下のように推定される。
　アミノ酸は水中でタンパク質と弱く相互作用する。そのため、タンパク質がアミノ酸で覆われて、加熱したヒーター部での不溶物の析出を大幅に抑制することができる。そして、共存する界面活性剤によってヒーター上に堆積したわずかな不溶物を即座に再溶解でき、ヒーターが清浄な状態を維持でき、ヒーター部に堆積したタンパク質が凝固して目詰まりを生じることを防ぐことができる。以上によって十分な吐出体積を確保できていると考えている。

＜生物学的試料＞
　本実施形態における生物学的試料は、リガンドタンパク質が有する特異性が機能しうる標的を含む可能性がある限り、特に限定されるものではない。例えば、培養した細胞、動物の体液（例えば、血液、血清、血漿、ずい液、汗、唾液、尿等）、毛髪、排泄物、臓器、組織、又は動植物それ自体、若しくは、それらを固定後パラフィン包埋した試料や、乾燥体等を挙げることができる。また、生物由来の物質を含み、付与されるリガンドタンパク質が有する特異性が機能しうる標的を含む可能性がある、河川水、湖沼水、海水、上下水道の水、土壌等を挙げることもできる。

　生物学的試料は、固相に固定されていてもよい。固相に固定することで、液体組成物付与後に、洗浄工程等において余剰な液体組成物を取り除く工程を簡便に行うことができる。

　固相の例としては、ポリスチレン樹脂粒子、ナイロン樹脂粒子、ガラス粒子、ガラス平板、ポリスチレンマイクロプレート、ラテックス粒子、各種磁性粒子、金属粒子、金属で被覆された粒子、金属平板、金属で被覆された平板、各種多孔質体、各種電極等が挙げられるがこれに限るものではない。この中でも、スライドガラスのようなガラス平板は好適に用いられる。

　固相に表面修飾を施し、固相と生物学的試料との結合を強固にしたものは、本実施形態で好適に用いられる。固相と生物学的試料との結合については、リガンドタンパク質の生物学的試料における標的に対する特異性を阻害しないのであれば、特に限定されるものではない。固相の表面修飾の例として、アミノ基、カルボキシル基、チオール基やジスルフィド基、水酸基といった官能基の付加、あるいは特定のアミノ酸配列を有する化合物の付加等が挙げられる。

　また、固相に親水化処理を施し、非特異的な吸着を抑制した固相としたものも、本実施形態で好適に用いられる。

＜アミノ酸＞
　アミノ酸とは、炭素原子を中心にアミノ基とカルボキシル基を有する化合物及びその誘導体をさし、本実施形態において、アミノ酸は、特に限定されず、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、分枝鎖アミノ酸、芳香族アミノ酸、含硫アミノ酸などのいずれであってもよく、また、その分子量も限定されず、Ｄ体、Ｌ体についても限定されない。好ましくは、生体を構成するタンパク質及びペプチドを構成する２０種類のアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、及びこれらの塩である。

　アミノ酸の中でもさらに好ましいのは、アルギニン、リシン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリン、トレオニン、アラニン、及びこれらの塩であり、この中でとりわけ好ましいのは、アルギニン、リシン、グリシン及びこれらの塩である。
　なお本発明に用いられるアミノ酸について、Ｌ体、Ｄ体は問わない。

　塩としては、酸性から中性のアミノ酸に対しては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩を例示できる。また、中性から塩基性のアミノ酸に対しては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸、ラウリル酸等の脂肪酸を含むカルボン酸塩、シュウ酸塩等を例示できる。塩として好ましくは、酸性アミノ酸に対しては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩を挙げられ、中性アミノ酸に対してはナトリウム塩、カリウム塩であり、塩基性アミノ酸に対しては、塩酸塩、酢酸塩、脂肪酸塩を挙げられる。

＜界面活性剤＞
　界面活性剤は、特に限定なく用いられる。例としては、アルキルスルホン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルカルボン酸ナトリウム等のアニオン性界面活性剤；式（１）で表されるアセチレングリコール系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ソルビタンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル、グリセリンアルキルエステル、アルコールアルコキシレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等のノニオン性界面活性剤；アルキルトリメチルアンモニウムクロライド、アルキルトリメチルアンモニウムブロマイド、ジアルキルジメチルアンモニウムクロライド、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド等のカチオン性界面活性剤；アルキルベタイン、アルキルジメチルアミンオキサイド、コール酸塩誘導体等の両性界面活性剤を挙げることができる。さらに、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物のナトリウム塩やポリアクリル酸ナトリウム等の高分子型の界面活性剤を用いることができる。

　スルホン酸基、カルボン酸基、アミノ基等のイオン性基、あるいは、ポリオキシエチレン基、ポリグリセリル基等の親水性非イオン性基をラジカル重合性化合物に結合させ、界面活性能を付与したラジカル重合性化合物を用いることもできる。

　界面活性剤としては特に式（１）で表される構造を有するアセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。式（１）で表される界面活性剤で、市販されるものとしては、アセチレノールＥ１３Ｔ、Ｅ４０、Ｅ６０、Ｅ１００、Ｅ２００（以上、川研ファインケミカル製）、サーイノール４６５、４８５（以上、日信化学工業製）等を挙げることができる。

　式（１）で表される界面活性剤は、たとえばヒーターのような発熱素子と液体組成物との界面への配向や吸着が速いため、発熱素子へのタンパク質の吸着を抑制すると考えられる。また、発熱素子に付着し疎水面が露出したタンパク質に対して、式（１）で表される界面活性剤は配向や吸着が速いと考えられる。この作用により、式（１）で表される界面活性剤は、発熱素子へのタンパク質の堆積を抑制し、吐出の安定化に寄与すると考えられる。
（前記式（１）中、ｘ及びｙは、１．０≦ｘ＋ｙ≦３０．０の関係を満たす。）

　界面活性剤の添加量は、いずれも液体組成物の全質量を基準として、０．０１質量％以上３質量％以下とすることが好ましく、０．０５質量％以上０．４０質量％以下とすることがさらに好ましい。

＜インクジェット＞
　本実施形態における液体組成物を付与する方法は、インクジェット方式（単にインクジェットともいう）の液体吐出ヘッドから吐出し、生物学的試料に付与する工程を有することを特徴とする。

　液体吐出ヘッドとしては、電気－熱変換体により液体組成物に膜沸騰を生じさせ気泡を形成することで液体組成物を吐出する形態、電気－機械変換体によって液体組成物を吐出する形態、静電気を利用して液体組成物を吐出する形態を挙げることができる。なかでも、高速で高密度の印刷を実施する観点から、電気－熱変換体を利用する、すなわち液体組成物に熱エネルギーを付与する発熱素子を有する液体吐出ヘッドが好ましい。

　熱エネルギーの作用により液体吐出ヘッドから液体組成物を吐出するインクジェット方式では、タンパク質を含有する液体組成物が発熱素子に接すると、タンパク質が発熱素子に付着する場合がある。この現象が連続すると、タンパク質が発熱素子に堆積する。その結果、熱エネルギーの作用が液体組成物に伝わりにくくなり、吐出体積減少、吐出不良等の原因になる場合がある。

＜標的に対して特異性を有するタンパク質＞
　本実施形態において、液体組成物は、標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質を含有する。本明細書において、標的に対して特異性を有する分子をリガンドといい、標的に対して特異性を有するタンパク質をリガンドタンパク質という。

　また、「標的に対して特異性を有する」とは、標的との解離定数が１μＭ以下であることをいう。染色に用いるリガンドタンパク質としては、標的に対して１μＭ以下の解離定数を有するリガンドタンパク質であれば特に限定されず、酵素、抗体、抗原タンパク質、受容体、サイトカイン、ホルモン、血清タンパク質、等が挙げられる。

　リガンドタンパク質は、上記以外の公知のものであっても、あるいは、新規なものであってもよい。本実施形態の染色に用いるリガンドタンパク質としては、解離定数の低さ、分子の構造安定性の観点から、特に抗体又は抗体フラグメントが好ましい。

＜抗体、抗体フラグメント＞
　抗体とは、特定の抗原又は物質に応答して免疫系により誘発されるイムノグロブリンファミリーの総称であり、特定の標的を認識し、かつ、この標的に結合することができる物質である。抗体は、マウス、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ヒト等様々な動物種から得ることができる。また、ヒト化抗体、キメラ抗体等を用いることもできる。また、抗体は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とのいずれでもよい。

　抗体フラグメントとは、抗体の一部分であり、標的分子に特異的に結合することのできるものを指す。抗体フラグメントとして例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変（ＶＨ）領域単独、軽鎖可変（ＶＬ）領域単独、ＶＨとＶＬの複合体、あるいはラクダ化ＶＨドメイン、又は抗体の相補正決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチド、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結した一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）が挙げられる。

＜標識物質＞
　リガンドタンパク質は、標識物質で修飾されていることが好ましい。標識物質で修飾されていることにより、染色後に生物学的試料における標的の存在位置を確認することができる。ここで、「修飾」とは、リガンドタンパク質と標識物質とを、物理的に吸着させる、化学的に結合させる、又はその両方によって吸着及び結合させることをいう。

　リガンドタンパク質への標識物質の修飾は、物理吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の方法により、行うことができる。
　物理吸着法では、リガンドタンパク質と標識物質を緩衝液等の溶液中で混合し接触させる方法等が挙げられる。例えば、標識物質が金コロイドやラテックスである場合は物理吸着法が有効であり、リガンドタンパク質と金コロイドとを緩衝液中で混合し接触させることで、金コロイド標識リガンドタンパク質を得ることができる。
　化学的結合法では、リガンドタンパク質と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させて、抗体と標識物質双方のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、又は水酸基等と反応させる方法等が挙げられる。また、標識物質にカルボジイミドを結合させた誘導体を作製し、リガンドタンパク質のアミノ基と反応させる方法も挙げられる。例えば、標識物質が蛍光物質や酵素、又は化学発光物質である場合、化学結合法が有効である。

　標識物質としては、低分子化合物、微粒子、酵素、蛍光色素、及び蛍光タンパク質等が挙げられる。
　低分子化合物の具体例としては、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル等が挙げられる。
　微粒子の具体例としては、金コロイド、フェライト粒子、ラテックスビーズ、フェライト内包ラテックスビーズ、蛍光物質内包ラテックスビーズ、アガロースビーズ等が挙げられる。
　酵素の具体例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
　蛍光色素の具体例としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴｅｘａｓＲｅｄ、フルオレセイン、インドシアニングリーン、及びＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ５６８）が挙げられる。また、ユーロピウム錯体のような希土類蛍光錯体を用いることもできる。蛍光タンパク質の具体例としては、例えば、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）及びその誘導体、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎが挙げられる。
　その中でも、標識物質は、ビオチン、酵素、蛍光色素、及び蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも一つであることが好ましい。すなわち、リガンドタンパク質は、ビオチン、酵素、蛍光色素、及び蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも一つの標識物質で修飾されていることが好ましい。
　また、標識物質は、以上に挙げた材料を複数使用したものでも構わない。また、以上に挙げた材料以外を用いても構わない。

＜ブロッキング剤＞
　生物学的試料をリガンドタンパク質で染色する際に、標的以外の部分へのリガンドタンパク質の非特異吸着を抑制するため、いわゆるブロッキング剤を用いることができる。液体組成物に、リガンドタンパク質と共にブロッキング剤を含有させることにより、良好な染色結果を得ることができる。ブロッキング剤としては、牛血清アルブミン、カゼイン、動物血清、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール，リン脂質及びそれらを含む化合物等が挙げられる。その中でも、ブロッキング剤は、牛血清アルブミン及びカゼインからなる群より選択される少なくとも一つであることが好ましい。また、市販されているブロッキング剤を使用することもできる。この中でも、液体組成物におけるブロッキング剤の含有量は、液体組成物の全質量を基準として、０．１質量％以上１０質量％以下が好ましい。ブロッキング剤にタンパク質を用いる場合、インクジェット方式による吐出を考慮し、液体組成物におけるリガンドタンパク質を含む総タンパク質の含有量を、液体組成物の全重量を基準として、０．００１質量％以上３質量％以下にすることが好ましく、０．００１質量％以上０．３質量％以下であることがより好ましい。

＜水溶性有機溶剤＞
　液体組成物は、リガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含む。さらに、液体組成物には、吐出を安定にする目的のために、必要に応じて水溶性有機溶剤を添加することができる。水溶性有機溶剤としては、例えば、アルコール類、ポリアルキレングリコール類、グリコールエーテル類、含窒素化合物類、含硫黄化合物類等を挙げることができる。具体例としては、グリセリン（２９０℃）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１８９℃）、エチレングリコール（１９７℃）、ジエチレングリコール（２４５℃）、平均分子量６００のポリエチレングリコール（２００℃以上）、プロピレングリコール（１８７℃）、トリエチレングリコール（２４４℃）、１，２－ペンタンジオール（１８７℃）、１，２－ヘキサンジオール（２２３℃）、エチレングリコールモノブチルエーテル（１７１℃）、ジエチレングリコールモノブチルエーテル（１８０℃）、２－ピロリドン（２４５℃）、トリエタノールアミン（２０８℃）、チオジグリコール（２８２℃）が挙げられる。括弧内は沸点を示す。

　本実施形態において水溶性有機溶剤には、沸点１８０℃以上の水溶性有機溶剤を用いることが好ましい。沸点が１８０℃以上の有機溶剤を含有させることで、吐出口からの液体成分の蒸発を効果的に抑制できる。これらの中から選択した２種類以上のものを混合して用いることもできる。
　液体組成物における水溶性有機溶剤の含有量は、液体組成物の全質量を基準として、５質量％以上３０質量％以下が好ましく、さらに１０質量％以上２０質量％以下が好ましい。

＜第二の液体組成物＞
　本実施形態における染色方法は、第一の液体組成物が付与された生物学的試料に、第二の液体組成物を付与する工程をさらに有していてもよい。
　第二の液体組成物には、これまでに説明した液体組成物（第一の液体組成物）に含有されるリガンドタンパク質（第一のタンパク質）に対して特異性を有するタンパク質（第二のタンパク質）を含有する。なお、「リガンドタンパク質に対して特異性を有する」とは、リガンドタンパク質との解離定数が１μＭ以下であることをいう。例えば、第一の液体組成物に含有されるリガンドタンパク質がウサギ由来抗体ならば、第二の液体組成物に含有されるリガンドタンパク質としてヤギ由来抗ウサギ抗体を用いることができる。また、例えば、第一の液体組成物に含有されるリガンドタンパク質がビオチン標識ウサギ由来抗体ならば、第二の液体組成物のリガンドタンパク質としてヤギ由来抗ウサギ抗体だけでなく、アビジンやストレプトアビジンを用いることができる。

　第二のタンパク質は前述の標識物質で修飾されていることが好ましい。この標識物質で修飾された第二のタンパク質を用いることで、第一のタンパク質に標識物質を修飾する必要がなく、標識物質で修飾されることで標的への特異性が低下してしまうような第一のタンパク質を用いることができるためである。第二のタンパク質は、ビオチン、酵素、蛍光色素、及び蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも一つで修飾されていることが好ましい。

　第二の液体組成物を付与する方法は、第一の液体組成物の付与方法であるインクジェット法を用い、すなわち、インクジェット方式の液体吐出ヘッドから第二の液体組成物を吐出する方法とすることができる。また、グラビアロールやブレードにより接触により付与する方法、スプレーやピペットによる滴下で非接触により付与する方法を用いることができる。
　生体試料を傷つけない観点からは、非接触の方法により付与する方法が好ましい。

＜基質＞
　標識物質として、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等の酵素を用いた場合、酵素に対して反応する発色基質を用いて発色させることができる。酵素と該酵素の発色・発光性基質の組み合わせを用いることも可能である。例えば、酵素としてルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼが挙げられる。これらの基質として次の発色剤を組み合せることにより発色させることができる。例として、ルシフェリン、３，３′－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、３，３′－（３，３′－ジメトキシ－４，４′－ビフェニレン）ビス［２－（４－ニトロフェニル）－５－フェニル－２Ｈ－テトラゾリウムクロライド］（ＮＢＴ）等が挙げられる。

　よって、本実施形態にかかる染色方法は、リガンドタンパク質が酵素で修飾されている場合、リガンドタンパク質を含む液体組成物が付与された生物学的試料に、酵素の基質を付与する工程をさらに有することが好ましい。また、本実施形態にかかる染色方法が、生物学的試料に第一の液体組成物を付与する工程と、第二の液体組成物を付与する工程とを有し、前記第一の液体組成物に含有される第一のタンパク質（リガンドタンパク質）が酵素で修飾されておらず、第二のタンパク質が酵素で修飾されている場合、第一の液体組成物及び第二の液体組成物が付与された生物学的試料に、酵素の基質を付与する工程をさらに有することが好ましい。また、酵素の基質は、第三の液体組成物に含有されていてもよい。

＜緩衝液＞
　液体組成物の溶媒として、緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液等の各種緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液を用いることによりｐＨの変化が抑えられ、リガンドタンパク質の保存安定性が向上する。

　また、液体組成物は塩を含むことができる。例えば塩化ナトリウム等のナトリウム塩、塩化カリウム等のカリウム塩、塩化マグネシウム等のマグネシウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。塩濃度を調節することにより、標的と、その標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質との結合以外の非特異吸着を抑制することができる。

＜洗浄工程＞
　生物学的試料に対して、標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質付与後に、生物学的試料と未反応のリガンドタンパク質を、試料と分離する、洗浄工程を含むことが好ましい。洗浄工程を行うことにより、標的以外の場所に残存したリガンドタンパク質による発色等を抑制することができ、染色後の観察で標的の位置を明確にすることができる。

＜その他＞
　液体組成物には、上記成分以外にも必要に応じて、消泡剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、粘度調整剤、防錆剤、防腐剤、防黴剤、酸化防止剤、還元防止剤、キレート剤等種々の添加剤を含有させてもよい。
　また、液体組成物には、上記成分の他に、尿素やその誘導体、平均分子量１０００以上のポリエチレングリコール、トリメチロールプロパン、及びトリメチロールエタン等の２５℃で固体の水溶性有機溶剤を含有させてもよい。

　また、本発明は第二の実施形態として、生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含有する液体組成物を提供する。また、本発明は第三の実施形態として生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、界面活性剤、及び水を含有する液体組成物を含む、インクジェット方式を用いた生物学的試料の染色のためのキットを提供する。

　キットにおいて、標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質と、アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種と、界面活性剤と、水とを含有する液体組成物は混合されていても、別個でもよく、それぞれ、又は混合して容器に入っていてよい。また、キットは、さらなる希釈液、ブロッキング剤、陽性コントロール、陰性コントロール、説明書等を備えてもよい。陽性コントロールは、測定しうる標的が含まれることが明らかな組織切片、液体試料、等を挙げられる。また、さらには、キットはインクジェット方式の吐出ヘッドに装着可能なカートリッジ容器を含んでもよい。

　以下、実施例及び比較例を用いて本実施形態をさらに詳細に説明する。本発明は、その要旨を超えない限り、下記の実施例によって何ら限定されるものではない。尚、以下の実施例の記載において、「部」とあるのは特に断りのない限り質量基準である。

＜生物学的試料１＞
　生物学的試料１として、ＨＥＲ２－ＩＨＣポジコンスライド（ＰＳ－１７００１、パソロジー研究所社）を用いた。この市販スライドにはＨＥＲ２タンパク質の発現量に応じて、陰性「０」、弱陽性「１＋」、中陽性「２＋」、強陽性「３＋」の４種類の培養細胞株が貼付されている。

＜緩衝液の調製＞
　５０ｍＭＴｒｉｓ・ｂａｓｅの水溶液と１５０ｍＭ塩化ナトリウムの水溶液を混合し、塩酸でｐＨ７．６とした後、ポアサイズ０．２２μｍの滅菌フィルターにて加圧ろ過し、緩衝液を調製した。この緩衝液を、以下ＴＢＳバッファーとする。各種リガンドタンパク質、各種界面活性剤、固体溶剤は、この緩衝液にあらかじめ溶解させた上で調製した。

＜リガンドタンパク質＞
　リガンドタンパク質１として、ポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ａ０４８５，Ｄａｋｏ社製）を用いた。ＨＥＲ２とは、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－２）である。

　リガンドタンパク質２として、モノクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体（４２９０，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。

　リガンドタンパク質３として、ポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ａ０４８５，Ｄａｋｏ社製）をペプシンで消化したＦ（ａｂ′）２をＦＩＴＣ標識したものを用いた。Ｆ（ａｂ′）２は以下のプロトコール通りに作製した。まず、抗体を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．７５）にて透析した。その後、ブタ胃粘膜由来ペプシン固定化アガロース（シグマ社製品）を添加し、３７℃中で３時間反応させた。その後、０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加えてｐＨ７．０にして反応を停止させた。遠心分離法でペプシン固定化アガロースを除去した。さらに、同溶液をプロテインＡ固定化アガロースカラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を通過させた。ＴＢＳバッファーに対して室温で２時間透析を施し、Ｆ（ａｂ′）２溶液を得た。さらに、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ－ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社）を用いてメーカーのプロトコール通りに行うことで、ＦＩＴＣ標識を施したＦ（ａｂ′）２を用意した。

　リガンドタンパク質４として、ポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ａ０４８５，Ｄａｋｏ社製）にビオチンを標識したリガンドタンパク質を用いた。ビオチン標識は、ＢｉｏｔｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ－ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社）を用いてメーカーのプロトコール通りに行うことで、ビオチン標識を施したポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体を用意した。

　リガンドタンパク質５として、ポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ａ０４８５，Ｄａｋｏ社製）に西洋ワサビペルオキシダーゼを標識したリガンドタンパク質を用いた。酵素標識は、ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ－ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社）を用いてメーカーのプロトコール通りに行うことで、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識を施したポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体を用意した。

　リガンドタンパク質６として、ポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ａ０４８５，Ｄａｋｏ社製）にアルカリホスファターゼを標識したリガンドタンパク質を用いた。酵素標識は、ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ－ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社）を用いてメーカーのプロトコール通りに行うことで、アルカリホスファターゼ標識を施したポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体を用意した。

　リガンドタンパク質７として、ポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ａ０４８５，Ｄａｋｏ社製）にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ－ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社）を用いてメーカーのプロトコール通りに行うことで、ＦＩＴＣ標識を施したポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体を用意した。

　リガンドタンパク質８として、ポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ａ０４８５，Ｄａｋｏ社製）にＲ－ＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ－ＮＨ２（商品名、同仁化学研究所社）を用いてメーカーのプロトコール通りに行うことで、Ｒ－フィコエリスリン標識を施したポリクローナルウサギ由来抗ヒトＨＥＲ２抗体を用意した。

　リガンドタンパク質９として、ＤｕａｌＬｉｎｋＳｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ（ＨＲＰ標識ポリマー試薬）（Ｋ４０６３、Ｄａｋｏ社）を用意し、そのまま使用した。

　リガンドタンパク質１０として、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（フナコシ株式会社）を用意した。

　リガンドタンパク質１１として、ビオチン標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ（フナコシ株式会社）を用意した。

　リガンドタンパク質１２として、ＨＲＰ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ（フナコシ株式会社）を用意した。

　リガンドタンパク質１３として、ＦＩＴＣ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ（フナコシ株式会社）を用意した。

　リガンドタンパク質１４として、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ（フナコシ株式会社）を用意した。

＜リガンドタンパク質以外のタンパク質（ブロッキング剤）＞
　リガンドタンパク質以外のタンパク質として、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ社）を用いた。

＜界面活性剤＞
　以下の（ａ）～（ｈ）に示す界面活性剤を用いた。
（ａ）Ａ―Ｅ１００：アセチレノールＥ１００（川研ファインケミカル製）
　式（１）において、ｘ＋ｙ＝１０の化合物である。
（ｂ）Ａ―Ｅ４０：アセチレノールＥ１００（川研ファインケミカル製）
　式（１）において、ｘ＋ｙ＝４の化合物である。
（ｃ）Ｔｗｅｅｎ８０（東京化成工業株式会社製）
　ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル系の構造であり、式（１）で表される界面活性剤ではない。
（ｄ）ＢＩО―ＳОＦＴ　Ｎ９１―８（Ｓｔｅｐａｎ社製）
　アルコールアルコキシレート系の構造であり、式（１）で表される界面活性剤ではない。
（ｅ）Ｔｒｉｔｏｎ―Ｘ１００（Ｍｅｒｃｋ製）
　ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系の構造であり、式（１）で表される界面活性剤ではない。
（ｆ）ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社製）
　式（１）で表される界面活性剤ではない。
（ｇ）ＣＴＡＢ：セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業株式会社製）
　アルキルトリメチルアンモニウムブロマイド系の構造であり、式（１）で表される界面活性剤ではない。
（ｈ）ＣＨＡＰＳ：３－［３－（コラミドプロピル）ジメチルアンモ二オ］プロパンスルホン酸（同仁化学研究所製）
　コール酸塩誘導体の両性界面活性剤であり、式（１）で表される界面活性剤ではない。

＜基質＞
　以下の基質を用いた。
（ａ）ＬｉｑｕｉｄＤＡＢ＋（製品名　Ｋ３４６５、Ｄａｋｏ社製）
（ｂ）ＢＣＩＰ－ＮＢＴ溶液キット（ナカライテスク株式会社製）

＜第一の液体組成物の調製＞
　第一の液体組成物として、Ａ－１からＡ－４９を、それぞれ、各成分を、表１－１、表１－２、表１－３、表１－４に示す含有量になるように混合して調製した。表中の数字は、固形分の含有量（質量％）を示す。

＜第二の液体組成物の調製＞
　第二の液体組成物として、Ｂ－１からＢ－６を、それぞれ、各成分を、表２に示す含有量になるように混合して調製した。表中の数字は、固形分の含有量を示す。第二の液体組成物Ｂ－１は、メーカーから供給されたものをそのまま使用したため、表２ではその旨を記した。

＜第三の液体組成物の調製＞
　第三の液体組成物として、Ｃ－１からＣ－３を調製した。Ｃ－１、及びＣ－２は、いずれもそれぞれの基質をメーカーのプロトコール通りに調製した後、各成分を、表３に示す含有量になるように混合して調製した。表中の数字は、固形分の含有量を示す。Ｃ－３として、第二の液体組成物であるＢ－２として調製したものと同じものを用いた。なお、Ｃ－１、Ｃ－２はいずれもリガンドタンパク質を含んでいない。

＜生物学的試料２＞
　生物学的試料２として、Ｋｉ６７－ＩＨＣポジコンスライド（ＰＳ－１７００４、パソロジー研究所社）を用いた。この市販スライドにはＫｉ６７タンパク質の発現量が異なっている陰性「－」豚肝組織、強陽性「＋」細胞株包埋サンプルの２種類のサンプルが貼付されている。

＜リガンドタンパク質＞
　リガンドタンパク質１５として、モノクローナルマウス由来抗ヒトＫｉ-６７抗体（М７２４０，Ｄａｋｏ社製）を用いた。Ｋｉ－６７は１０番染色体長腕に存在する遺伝子により発現するタンパク質であり、休止期を除く全ての細胞核に発現するため、細胞増殖マーカーとして利用されている。
　リガンドタンパク質１６として、ＨＲＰ標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ（フナコシ株式会社）を用意した。

＜界面活性剤＞
　以下の（ａ）に示す界面活性剤を用いた。
（ａ）Ａ―Ｅ１００：アセチレノールＥ１００（川研ファインケミカル製）

＜第一の液体組成物の調製＞
　第一の液体組成物Ａ－５０はリガンドタンパク質１５を０．００１質量％、ＢＳＡを０．５質量％、リシンを１質量％、グリセリンを１０質量％、界面活性剤Ａ－Ｅ１００
を０．１質量％になるようにＴＢＳ緩衝液で調製した。

＜第二の液体組成物の調製＞
　第二の液体組成物Ｂ－７はリガンドタンパク質１６を０．００１質量％、ＢＳＡを０．５質量％、リシンを１質量％、グリセリンを１０質量％、界面活性剤Ａ－Ｅ１００
を０．１質量％になるようにＴＢＳ緩衝液で調製した。

（吐出体積評価）
　３μｍのノズル径を持つサーマルジェット方式による液体吐出ヘッドを用意し、これに接続したタンク内にＢＣ－３４５Ｂｋインク（キヤノン製）を充填した。液体吐出ヘッドに電気的に接続したコントローラにより吐出ヘッドを駆動して、周波数１５ｋＨｚ、電圧１３ボルトにて液体を吐出口から吐出させ、超高速度カメラにて吐出された液体を観察しリガメント法にて体積を算出し、これを１００％とした。
　つづいて、液体Ａ－１～Ａ－５０、液体Ｂ－１～Ｂ－７、液体Ｃ－１～Ｃ－２の液体組成物を同様の条件で吐出させ、以下の基準で吐出された液体の吐出体積を評価した。
（評価基準）
Ａ：９５％以上
Ｂ：９０％以上９５％未満
Ｃ：７０％以上９０％未満
Ｄ：４０％以上７０％未満
Ｅ：４０％未満

　表４に液体組成物Ａ－１～Ａ－５０、Ｂ－１～Ｂ－７、Ｃ－１～Ｃ－２の吐出体積の評価結果を示す。

＜染色諧調性の評価＞
　各液体組成物を用いて細胞を染色した。
　観察した結果、以下の基準で染色諧調性を評価した。
　評価結果は、表５－１、表５－２、表５－３、表５－４に記載した。
　なお、生物学的試料１を用いた場合は以下の基準で評価を行った。
Ａ：ＨＥＲ２「０」「１＋」「２＋」「３＋」発現量に応じて、段階的に鮮明に染色し判定が容易だった。
Ｂ：ＨＥＲ２発現量に応じて、段階的に染色し判定できた。
Ｃ：ＨＥＲ２「０」「２＋」「３＋」は段階的に染色するが「０」と「１＋」の差が不明瞭で、陰性か弱陽性かの判定が困難だった。
Ｄ：ＨＥＲ２「０」と「３＋」は段階的に染色するが「０」、「１＋」、「２＋」の差が不明瞭で、陰性、弱陽性、中陽性の判定が困難だった。
Ｅ：ＨＥＲ２「０」、「１＋」、「２＋」、「３＋」の差が不明瞭で全く判定できなかった。
　また、生物学的試料２を用いた場合は以下の基準で評価を行った。
Ａ：Ｋｉ６７「－」「＋」の染色判定が容易だった。
Ｅ：Ｋｉ６７「－」「＋」の染色判定が困難だった。
　表５－１、５－２、５－３、５－４、５－５に染色諧調性の評価結果を示す。

　生物学的試料１および２の脱パラフィン処理工程、生物学的試料１および２の抗原賦活化処理工程、生物学的試料１および２のブロッキング処理工程、生物学的試料２の透過処理、液体付与、観察は、以下のように行った。

（１）生物学的試料１および２の脱パラフィン処理
ａ）キシレン代替品・クリアプラス（株式会社ファルマ）を入れた容器に生物学的試料１および２を浸漬し、室温で５分間、静置させた。また、この操作を２回行った。
ｂ）９９．５％エタノール（キシダ化学株式会社）を入れた容器に標本を浸漬し、室温で３分間、静置させた。また、この操作を２回行った。
ｃ）９５％エタノールを入れた容器に標本を浸漬し、室温で５分間、静置させた。また、この操作を２回行った。
ｄ）純水を入れた容器に標本を浸漬し、室温で１分間、静置させた。

（２）生物学的試料１および２の抗原賦活化処理
ａ）９６～９８℃に加温したＴａｒｇｅｔＲｅｔｒｉｅｖａｌＳｏｌｕｔｉｏｎ，ｐＨ９．０（Ｄａｋｏ社）液中に生物学的試料１および２を浸漬させて、４０分間、加熱した。加熱後室温まで放冷した。
ｂ）ＴＢＳバッファーを入れた容器に生物学的試料１および２を浸漬し、室温で３分間、静置させた。また、この操作を２回行った。

（３）生物学的試料１および２のブロッキング処理
ａ）生物学的試料１および２にパーオキシダーゼブロッキング試薬（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＢｌｏｃｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎＤａｋｏＲＥＡＬ（Ｄａｋｏ社））１００μＬ滴下し、湿潤箱中で５分間静置した。
ｂ）ＴＢＳバッファーを入れた容器に生物学的試料１および２を浸漬し、室温で３分間、静置させた。また、この操作を２回行った。この後の工程については、実施例毎に異なる方法で行った。

（４）生物学的試料２の透過処理
界面活性剤（ｅ）を０.２質量％添加したＴＢＳバッファーに生物学的試料２を浸漬し、室温で１５分間静置した。
　実施例１～５２、比較例１～４については、共通して以下の工程を行った。

（１）生物学的試料１、２への第一の液体組成物付与
ａ）生物学的試料１において、ＨＥＲ２タンパクの発現量が異なる４種類の培養細胞株を囲むように、生物学的試料２において、Ｋｉ－６７タンパクの発現量が異なる２種類の培養細胞株を囲むように、１ｃｍ^２の枠をパップペン（リキッドブロッカー、大道産業（株）製）で作製した。
ｂ）表５－１～表５－５に示す通り、生物学的試料１、２に第一の液体組成物をインクジェットで吐出させて滴下した。具体的には第一の液体組成物をインクジェットプリンター（商品名：ＴＳ－２０３キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。あらかじめ吐出体積評価にて液滴１滴の吐出体積を計測した後、１ｃｍ^２あたり３０μＬとなるように設定した条件で、パップペンで作製した枠内に、第一の液体組成物を滴下した。
　滴下後、湿潤箱中で６０分間静置した。
ｃ）所定時間経過後、ＴＢＳバッファーを入れた容器に生物学的試料１、２を浸漬し、室温で３分間、静置させた。また、この操作を２回行った。

（２）第二の液体組成物付与
ａ）表５－１～表５－５に示す通り、生物学的試料１、２に第二の液体組成物をパップペンで作製した枠内に、あらかじめ吐出体積評価にて液滴１滴の吐出体積を計測した後、１ｃｍ^２あたり５０μＬとなるように設定した条件で第二の液体組成物を滴下した。滴下後、湿潤箱中で３０分間静置した。表５－１～表５－５中、「未使用」は上記操作を行わなかった。
ｂ）ＴＢＳバッファーを入れた容器に生物学的試料１、２を浸漬し、室温で３分間、静置させた。また、この操作を２回行った。

（３）第三の液体組成物付与
ａ）表５－１～表５－５に示す通り、生物学的試料１に第三の液体組成物をパップペンで作製した枠内に、あらかじめ吐出体積評価にて液滴１滴の吐出体積を計測した後、１ｃｍ^２あたり５０μＬとなるように設定した条件で第三の液体組成物を滴下し、湿潤箱中で５分間静置した。表５－１～表５－５中、「未使用」は上記操作を行わなかった。
ｂ）ポアサイズ０．２２μｍの滅菌フィルターにて加圧ろ過した水を入れた容器に生物学的試料１を浸漬し、室温で３分間、静置させた。また、この操作を２回行った。

（４）観察
　実施例１、２、５、６、９～４５、４７、比較例１～４については顕微鏡ＢＺ－Ｘ８１０（キーエンス社）を用いた。明視野観察に対応した４０倍の対物レンズを用いて画像を取得した。
　実施例３、４、７、８、４６、４８～５２においては、蛍光観察に対応した４０倍の対物レンズと、蛍光フィルターユニットであるＢＺ－ＸフィルタＧＦＰＯＰ－８７７６３（キーエンス社、励起波長４７０ｎｍ、検出波長５２５ｎｍ）を用いて、生物学的試料１の蛍光画像を取得した。次に、位相差観察に対応した対物レンズと位相差観察用コンデンサを用いて、生物学的試料１の位相差画像を取得した。次に、取得した蛍光画像には緑色の代替色、位相差画像に対しては灰色の代替色を適用した。その後、２枚の画像を加算合成法により重ね合わせ、１枚の合成画像を生成した。
　実施例８においては、蛍光観察に対応した４０倍の対物レンズと、蛍光フィルターユニットであるＢＺ－ＸフィルタＴＲＩＴＣＯＰ－８７７６４（キーエンス社、励起波長５４５ｎｍ、検出波長６０５ｎｍ）を用いて、生物学的試料１の蛍光画像を取得した。次に、位相差観察に対応した対物レンズと位相差観察用コンデンサを用いて、生物学的試料１の位相差画像を取得した。次に、取得した蛍光画像には橙色の代替色、位相差画像に対しては灰色の代替色を適用した。その後、２枚の画像を加算合成法により重ね合わせ、１枚の合成画像を生成した。

　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。

　本願は、２０２３年９月８日提出の日本国特許出願特願２０２３－１４６４４５及び２０２４年８月２０日提出の日本国特許出願特願２０２４－１３９２３１を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。

Claims

　生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、
　アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、
　界面活性剤、及び水
を含有する液体組成物を、インクジェット方式の液体吐出ヘッドから吐出し、前記生物学的試料に付与する工程を有することを特徴とする染色方法。
　前記リガンドタンパク質が抗体又は抗体フラグメントを含む請求項１に記載の染色方法。
　前記リガンドタンパク質は、ビオチン、酵素、蛍光色素、及び蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも一つで修飾されている、請求項１又は２に記載の染色方法。
　前記リガンドタンパク質は、酵素で修飾されており、前記液体組成物が付与された前記生物学的試料に、前記酵素の基質を付与する工程をさらに有する請求項１から３のいずれか１項に記載の染色方法。
　前記液体組成物は、さらに、牛血清アルブミン及びカゼインからなる群より選択される少なくとも一つを含有する請求項１から４のいずれか１項に記載の染色方法。
　前記液体組成物における前記リガンドタンパク質の含有量は、前記液体組成物の全質量を基準として、０．００１質量％以上３質量％以下である請求項１から５のいずれか１項に記載の染色方法。
　前記界面活性剤が下記式（１）で表される構造を有することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の染色方法。
（前記式（１）中、ｘ及びｙは、１．０≦ｘ＋ｙ≦３０．０の関係を満たす。）
　前記液体組成物における前記リガンドタンパク質の含有量は、前記液体組成物の全質量を基準として、０．００１質量％以上０．３質量％以下である請求項１から７のいずれか１項に記載の染色方法。
　前記アミノ酸がアルギニン、リシン、グリシン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリン、トレオニン、及びアラニンからなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項１から８のいずれか１項に記載の染色方法。
　前記アミノ酸がアルギニン、リシン、及びグリシンからなる群より選択された少なくとも１種を含む請求項１に記載の染色方法。
　前記液体組成物は、水溶性有機溶剤を含有する請求項１から１０のいずれか１項に記載の染色方法。
　前記液体組成物が付与された前記生物学的試料に、前記リガンドタンパク質に対して特異性を有する第二のタンパク質を含有する第二の液体組成物を付与する工程をさらに有する請求項１から１１のいずれか１項に記載の染色方法。
　前記第二のタンパク質は、ビオチン、酵素、蛍光色素、及び蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも一つで修飾されている請求項１２に記載の染色方法。
　前記第二のタンパク質は、酵素で修飾され、前記第二の液体組成物が付与された前記生物学的試料に、該酵素に対する発色基質を付与する工程をさらに有する請求項１２又は１３に記載の染色方法。
　生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、
　アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、
　界面活性剤、及び
　水
を含有する液体組成物。
　生物学的試料における標的に対して特異性を有するリガンドタンパク質、
　アミノ酸及びその塩類から選択された少なくとも１種、
　界面活性剤、及び
　水
を含有する液体組成物を含む、
インクジェット方式を用いた生物学的試料の染色のためのキット。
　さらに、インクジェット方式の吐出ヘッドに装着可能なカートリッジ容器を含む請求項１６に記載のキット。