[go: up one dir, main page]

WO2025047369A1 - 算出方法、プログラム、定量方法、および高速液体クロマトグラフタンデム質量分析装置 - Google Patents

算出方法、プログラム、定量方法、および高速液体クロマトグラフタンデム質量分析装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2025047369A1
WO2025047369A1 PCT/JP2024/028378 JP2024028378W WO2025047369A1 WO 2025047369 A1 WO2025047369 A1 WO 2025047369A1 JP 2024028378 W JP2024028378 W JP 2024028378W WO 2025047369 A1 WO2025047369 A1 WO 2025047369A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lipid
sample
contained
quantitative value
lipids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/028378
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雄太 井原
美恵 下嶋
修一 中家
真希 山田
啓之 太田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Phytolipid Technologies Co Ltd
Original Assignee
Shimadzu Corp
Phytolipid Technologies Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp, Phytolipid Technologies Co Ltd filed Critical Shimadzu Corp
Publication of WO2025047369A1 publication Critical patent/WO2025047369A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers

Definitions

  • the present disclosure relates to a calculation method, a program, a quantification method, and a high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometer, and more specifically to a technology for improving the accuracy of lipid quantification.
  • Lipids are substances that are soluble in non-polar solvents and insoluble in water, and include substances with a variety of structures.
  • triacylglycerol in which one molecule of glycerol is linked by an ester bond to three molecules of fatty acid, can be of many different types depending on the types and combinations of fatty acids linked together, and the position of the fatty acids linked to the glycerol.
  • Some lipids produced by plants and algae have physiological activities that are useful to humans, and some can be used as biofuels. Therefore, when examining plant growth conditions with the aim of improving the production efficiency of a target lipid, for example, it is desirable to distinguish and quantitatively analyze the types of lipids in a sample containing multiple types of lipids extracted from the plant.
  • LC-MS/MS high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry
  • the tandem mass spectrometer breaks down the lipids to be measured and detects the ions derived from the breakdown products, making it possible to estimate the structure of the lipids to be measured, which is also useful for analyzing samples containing unknown lipids.
  • Non- Patent Document 1 discloses an example of a method for measuring lipids using LC-MS/MS.
  • Non-Patent Document 3 discloses an example of a method for estimating lipid structure using a tandem mass spectrometer.
  • One method for quantifying lipids in a sample using LC-MS/MS is a quantitative method that involves comparison with a standard substance. Specifically, a standard substance and the lipid to be measured are measured simultaneously, and the lipid is quantified by comparing the detection intensity with that of the standard substance. In this method, a different standard substance corresponds to each type of lipid, so when there are multiple lipids to be measured, the measurement costs can be high.
  • the present disclosure has been devised in light of this current situation, and its purpose is to provide a technology that improves the quantitative accuracy of lipids when measuring samples containing multiple types of lipids using LC-MS/MS, by using standard substances for some of the lipids being measured.
  • the calculation method is a method for calculating a relative sensitivity coefficient of a second lipid of a different type to a first lipid in an LC-MS/MS device, and includes the steps of: acquiring a quantitative value of a first lipid contained in a first sample containing the first lipid; acquiring a quantitative value of a second lipid contained in a second sample containing a second lipid; measuring the first sample by LC-MS/MS and determining the detection intensity of the first lipid from the obtained chromatogram; measuring the second sample by LC-MS/MS and determining the detection intensity of the second lipid from the obtained chromatogram; and calculating the relative sensitivity coefficient of the second lipid to the first lipid from the quantitative value of the first lipid, the quantitative value of the second lipid, the detection intensity of the first lipid, and the detection intensity of the second lipid.
  • the program according to the second aspect of the present disclosure is a program executed by a processor installed in a computer, and causes the computer to execute the above calculation method.
  • the calculation method is a method for calculating a lipid sensitivity coefficient in an LC-MS/MS device, and includes the steps of obtaining a quantitative value of lipids contained in a lipid-containing sample, measuring the sample by LC-MS/MS and determining the detection intensity derived from the lipids contained in the sample from the obtained chromatogram, and determining the lipid sensitivity coefficient from the quantitative value and the detection intensity.
  • the method includes a step of calculating a relative sensitivity coefficient of the second lipid to the first lipid from the amount value, the quantitative value of the second lipid contained in the second sample, the detection intensity of the first lipid contained in the first sample, and the detection intensity of the second lipid contained in the second sample; a step of measuring the third sample by LC-MS/MS and determining the detection intensity of each of the first lipid and the second lipid contained in the third sample; a step of measuring the quantitative value of the first lipid contained in the third sample by LC-MS/MS using a standard substance of the first lipid; and a step of quantifying the second lipid contained in the third sample using the relative sensitivity coefficient, the detection intensity of each of the first lipid and the second lipid contained in the third sample, and the quantitative value of the first lipid contained in the third sample.
  • the LC-MS/MS device is an LC-MS/MS device that quantifies a second lipid in a third sample containing a first lipid and a second lipid, and includes a liquid chromatograph, a mass spectrometer that analyzes components separated by the liquid chromatograph, and a data processor that receives measurement data from the mass spectrometer, the mass spectrometer determining the detection intensities of the first lipid and the second lipid contained in the third sample by measuring the third sample, and measuring the quantitative value of the first lipid contained in the third sample using a standard substance for the first lipid, and the data processor calculating the quantitative value of the second lipid contained in the third sample using the detection intensities and quantitative values of the first lipid and the second lipid contained in the third sample, and the relative sensitivity coefficient calculated by the calculation method described in the first aspect.
  • the quantitative accuracy of lipids can be improved by using standard substances for some of the lipids being measured.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an LC-MS/MS device according to an embodiment.
  • FIG. 1 is a functional block diagram of an LC-MS/MS device according to an embodiment.
  • 1 is a flow chart showing the steps of lipid analysis by LC-MS/MS.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining a method of calculating a relative sensitivity coefficient.
  • 1 is a flowchart showing a procedure for preparing a sample for calculating a relative response coefficient.
  • 1 is a flowchart showing a procedure for calculating a relative sensitivity coefficient from a prepared sample.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining a method for quantifying lipids using a relative response coefficient.
  • 1 is a flowchart showing a process of a lipid quantification method using a relative response coefficient.
  • Fig. 1 is a diagram showing a schematic overall configuration of an LC-MS/MS device 100 according to this embodiment.
  • the LC-MS/MS device 100 includes a liquid chromatograph 1, a mass spectrometer 2, a controller 3, a display 4, and an input unit 5.
  • the controller 3, the display 4, and the input unit 5 may be incorporated in the mass spectrometer 2.
  • the controller 3 may be a general-purpose computer provided at a position separate from the liquid chromatograph 1 and the mass spectrometer 2.
  • the LC-MS/MS device 100 can separate lipids contained in a sample into individual types of lipids and obtain detection intensities corresponding to each lipid.
  • Lipids are substances that are poorly soluble in water and easily soluble in organic solvents, and specific examples include simple lipids, complex lipids, cholesterol, steroids, carotenoids, and substances with structures similar to these.
  • Simple lipids include those in which alcohol and fatty acids are combined, such as triacylglycerol.
  • Complex lipids include those in which at least one of phosphate, sulfur, nitrogen base, and sugar is combined with alcohol and fatty acid, such as glycerophospholipids, sphingophospholipids, glyceroglycolipids, and sphingoglycolipids.
  • the liquid chromatograph 1 includes a mobile phase container 10, a pump 11, an injector 12, and a column 13.
  • the liquid chromatograph 1 can separate multiple types of lipids contained in a sample into each type of lipid by utilizing differences in interactions between the stationary phase and the mobile phase.
  • the mobile phase container 10 stores the mobile phase, which is a liquid that carries the sample injected into the liquid chromatograph 1.
  • the mobile phase is, for example, an organic solvent or water, or a mixture of these.
  • the organic solvent is, for example, 2-propanol, methanol, acetonitrile, chloroform, hexane, dichloromethane, and tetrahydrofuran.
  • the mobile phase may contain an acidic solution (for example, trifluoroacetic acid, formic acid, and ammonium formate) as an additive.
  • the liquid chromatograph 1 may contain a single mobile phase container or multiple mobile phase containers.
  • Pump 11 draws in the mobile phase stored in mobile phase container 10 and delivers it at a predetermined flow rate.
  • the flow rate of the mobile phase delivered by pump 11 may be constant during one measurement or may vary.
  • Liquid chromatograph 1 may include a single pump or multiple pumps.
  • the injector 12 injects a predetermined amount of sample, which has been prepared in advance in the mobile phase flow path, into the liquid chromatograph 1.
  • the sample is introduced from the injector 12 into the mobile phase delivered by the pump 11, and the mobile phase containing the sample is introduced into the column 13.
  • Column 13 is filled with a stationary phase, through which the mobile phase passes. As the sample passes through column 13, various lipids in the sample interact with the mobile phase and stationary phase, causing them to be separated in the time direction. The separated lipids are eluted from the outlet of column 13 and introduced into mass spectrometry section 2.
  • stationary phase There are no limitations on the type of stationary phase, so long as it is one that can be used to separate lipids.
  • the mass spectrometry section 2 includes an ionization chamber 20, a first intermediate chamber 21, a second intermediate chamber 22, and an analysis chamber 23.
  • the mass spectrometry section 2 performs mass analysis of the sample eluted from the liquid chromatograph 1.
  • the analysis in the mass spectrometry section 2 includes detecting peaks in the mass spectrum and measuring the mass-to-charge ratio of specific or non-specific substances contained in the sample.
  • the ionization chamber 20 has a probe 201 and a capillary 202.
  • the inside of the ionization chamber 20 is at atmospheric pressure.
  • the ionization chamber 20 is connected to the next stage first intermediate chamber 21 through a thin-diameter capillary 202.
  • the probe 201 sprays the sample introduced into the mass analysis unit 2 while imparting a biased charge to the sample.
  • the charged tiny droplets are split and made fine by the action of electrostatic force, and the lipids of the sample in the droplets are ionized in the process of evaporating the solvent.
  • the generated ions pass through the capillary 202 and are introduced into the first intermediate chamber 21.
  • the first intermediate chamber 21 has an ion guide 211 and a skimmer 212.
  • the inside of the first intermediate chamber 21 is a high vacuum.
  • the first intermediate chamber 21 and the second intermediate chamber 22 in the next stage are connected through a small hole drilled in the top of the skimmer 212.
  • the ion guide 211 focuses the ions introduced from the ionization chamber 20 in the previous stage and transports them to the subsequent stage via the skimmer 212.
  • the second intermediate chamber 22 has an ion guide 221.
  • the inside of the second intermediate chamber 22 is a high vacuum.
  • the ion guide 221 focuses the ions introduced from the first intermediate chamber 21 in the preceding stage and transports them to the following stage.
  • the analysis chamber 23 includes quadrupole mass filters 231 and 233, a collision cell 232, and an ion detector 234.
  • the quadrupole mass filter 231 is disposed before the collision cell 232, and the quadrupole mass filter 233 is disposed after the collision cell 232.
  • the inside of the analysis chamber 23 is at atmospheric pressure.
  • the analysis chamber 23 separates ions by mass and detects each of the separated ions to obtain a mass spectrum. From the obtained mass spectrum, information regarding the molecular weight, molecular formula, and chemical structure of the compound can be obtained.
  • the quadrupole mass filter 231 comprises a main rod electrode 2312 and a pre-rod electrode 2311 placed in front of it.
  • the main rod electrode 2312 separates ions according to their mass-to-charge ratio.
  • the pre-rod electrode 2311 corrects disturbances in the electric field at the inlet end and assists the function of the main rod electrode 2312.
  • the collision cell 232 includes a multipole ion guide 2321 inside.
  • the collision cell 232 is connected to a collision-induced dissociation (CID) gas supply mechanism (not shown), which introduces CID gas into the collision cell 232.
  • CID gas promotes dissociation of ions.
  • the multipole ion guide 2321 focuses the dissociated ions and transports them to the rear stage.
  • the CID gas is, for example, argon, nitrogen, helium, and xenon.
  • the quadrupole mass filter 233 comprises a main rod electrode 2332 and a pre-rod electrode 2331 placed in front of it.
  • the main rod electrode 2332 separates ions according to their mass-to-charge ratio.
  • the pre-rod electrode 2331 corrects disturbances in the electric field at the inlet end and assists the function of the main rod electrode 2332.
  • the ion detector 234 is, for example, a pulse count detector, and generates a detection signal whose number of pulse signals corresponds to the number of incident ions. This detection signal is output to the control unit 3.
  • the LC-MS/MS device 100 is equipped with electrospray ionization as the ionization method, but the ionization method is not limited to electrospray ionization, and atmospheric pressure chemical ionization or atmospheric pressure photoionization may also be used.
  • the control unit 3 is connected to and communicates with the liquid chromatograph 1 and the mass spectrometry unit 2, and is configured, for example, by a computer.
  • the control unit 3 controls the operation of the liquid chromatograph 1 and the mass spectrometry unit 2, and receives the measurement data acquired by the ion detector 234 of the mass spectrometry unit 2.
  • the control unit 3 also calculates the quantitative value of lipids based on the relative sensitivity coefficient and the measurement data.
  • the display unit 4 is configured, for example, with a liquid crystal display. In response to commands from the control unit 3, the display unit 4 displays the measurement data acquired by the ion detector 234 and the quantitative value of lipids calculated based on the measurement data.
  • the input unit 5 is composed of, for example, a keyboard, a mouse, etc.
  • the input unit 5 receives instructions from the user for the liquid chromatograph 1 and the mass spectrometry unit 2, and outputs them to the control unit 3.
  • a touch panel in which the display unit 4 and the input unit 5 are integrated may also be used.
  • FIG. 2 is a functional block diagram of the overall configuration of the LC-MS/MS device 100 according to this embodiment.
  • the control unit 3 has, as its main components, a CPU (Central Processing Unit) 30, a ROM (Read Only Memory) 31, a RAM (Random Access Memory) 32, a HDD (Hard Disk Drive) 33, a communication I/F (Interface) 34, a display I/F 35, and an input I/F 36.
  • a CPU Central Processing Unit
  • ROM Read Only Memory
  • RAM Random Access Memory
  • HDD Hard Disk Drive
  • Communication I/F Interface
  • the communication I/F 34 relays communication with external devices including the liquid chromatograph 1 and the mass spectrometry unit 2.
  • the communication I/F 34 is realized, for example, by a network adapter.
  • the communication method may be wireless communication such as Bluetooth (registered trademark) or wireless LAN, or wired communication using a USB (Universal Serial Bus) or the like.
  • the input I/F 36 relays data transmission between the CPU 30 and the input unit 5.
  • the input I/F 36 accepts various information provided by operating the input unit 5, such as the relative sensitivity coefficient, and commands for the liquid chromatograph 1 and the mass spectrometry unit 2.
  • the ROM 31 can non-temporarily store the programs executed by the CPU 30.
  • the RAM 32 can temporarily store data generated by the execution of the programs in the CPU 30, data input via the communication I/F 34, and commands input by the user via the input unit 5 for the liquid chromatograph 1 and the mass analysis unit 2, and can function as a primary storage device.
  • the HDD 33 is a non-volatile storage device, and can store relative sensitivity coefficients.
  • the control unit 3 may have a semiconductor storage device such as a flash memory instead of or in addition to the HDD 33.
  • FIG. 3 is a flow chart showing the steps of lipid analysis by LC-MS/MS.
  • T10 is performed manually by an analyst using experimental equipment used in general scientific experiments and mass spectrometry.
  • T12 and subsequent steps are performed by the LC-MS/MS device 100.
  • the lipids to be detected are assumed to be complex lipids with one polar head and two fatty acids, with glycerol as the linking part.
  • Fig. 3 illustrations of lipids and ions are added to explain the procedure in more detail.
  • the line segment represents the glycerol backbone
  • the ellipse represents the fatty acid
  • the diamond represents the polar head.
  • Lipids 61, 62, 63, and 64 are lipids having a structure in which two molecules of fatty acid, represented by two ellipses, are bound to the glycerol backbone represented by the line segment.
  • the length of the ellipse represents the length of the carbon chain of the fatty acid.
  • lipids 61 and 63 have the same polar head, but the fatty acids bound to them are different, so they are different types of lipids.
  • lipid 61 and lipid 64 have the same type of fatty acid bound to them and the same binding position, but have different polar head groups, making them different types of lipids. Therefore, lipids 61, 62, 63, and 64 each represent a different type of lipid.
  • step T10 the user prepares a sample containing multiple types of lipids.
  • step T12 the sample prepared in step T10 is separated into different types of lipids by liquid chromatography.
  • the sample introduced into liquid chromatograph 1 is introduced into column 13 together with the mobile phase delivered by pump 11.
  • column 13 lipids interact with the stationary phase and the mobile phase, but the degree of interaction differs depending on the type of lipid.
  • the speed at which lipids move through column 13 is determined by this interaction, so the speed at which lipids move differs depending on the type of lipid. Therefore, due to the difference in mobility of each lipid, lipids can be separated into different types in liquid chromatograph 1. Meanwhile, lipids 61, 62, 63, and 64, which have the same or nearly the same mobility, are eluted simultaneously.
  • step T12 the eluate containing lipids 61, 62, 63, and 64 is introduced into the mass spectrometry unit 2.
  • the processing in the mass spectrometry unit 2 is shown as step T14 in FIG. 3, and is further broken down into steps T16 to T24.
  • step T16 the lipids 61, 62, 63, and 64 introduced into the mass spectrometry unit 2 are ionized to generate ions 611, 621, 631, and 641, respectively.
  • the generated ions are introduced into the quadrupole mass filter 231.
  • step T18 of the ions 611, 621, 631, and 641 introduced into the quadrupole mass filter 231, only ion 621 is selected and introduced into the subsequent collision cell 232.
  • This selection is performed by the voltage applied to the main rod electrode 2312. That is, a voltage in which a predetermined radio frequency voltage and a DC voltage are superimposed is applied to the main rod electrode 2312, and the quadrupole mass filter 231 performs this selection by passing only ions having a specific mass-to-charge ratio according to the voltage applied to the main rod electrode 2312 among the various ions sent to the quadrupole mass filter 231.
  • the ions that have passed through the quadrupole mass filter 231 are called precursor ions.
  • ion 621 which is a precursor ion that has passed through quadrupole mass filter 231
  • a predetermined voltage is applied to the electrodes arranged in collision cell 232, and ion 621 introduced into collision cell 232 is accelerated in collision cell 232 at an acceleration corresponding to the voltage applied to the electrodes.
  • CID gas is supplied into collision cell 232 at a predetermined pressure.
  • accelerated ion 621 collides with CID gas with a predetermined collision energy and dissociates, generating ions 6211, 6212, 6213, 6214, and 6215. Ions generated from precursor ions are called product ions.
  • step T22 when the product ions 6211, 6212, 6213, 6214, and 6215 generated by dissociation of ion 621 are introduced into the quadrupole mass filter 233, only ion 6213, a product ion having a specific mass-to-charge ratio according to the voltage applied to the main rod electrode 2332 of the quadrupole mass filter 233, passes through the quadrupole mass filter 233.
  • step T24 the ion detector 234 detects ion 6213, which is a product ion that has passed through the quadrupole mass filter 233, and the process in FIG. 3 ends.
  • the ions to be detected are selected in two stages, at the quadrupole mass filter 231 and the quadrupole mass filter 233.
  • This highly selective analysis makes it possible to distinguish and detect ions derived from specific lipids from other ions. For example, in FIG. 3, if there is another ion having the same mass-to-charge ratio as ion 621, it may be difficult to select and detect only one of them in step T18. However, by detecting a product ion characteristic of one of those ions, it is possible to distinguish and detect two types of lipids with the same mass.
  • the lipid to be measured and a standard substance corresponding to the lipid whose quantitative value is known are measured by LC-MS/MS, and the lipid to be measured is quantified by comparing the detection intensities of the respective substances.
  • the standard substance is, for example, a substance in which some of the atoms constituting the lipid to be measured are replaced with a predetermined isotope.
  • a relative sensitivity coefficient is calculated by quantifying the difference in ionization efficiency of each lipid in LC-MS/MS, and each lipid is quantified from the detection intensity obtained by the measurement of LC-MS/MS using the relative sensitivity coefficient.
  • the relative sensitivity coefficient the difference in ionization efficiency for each type of lipid is corrected, so that the accuracy of quantification based on the detection intensity can be improved.
  • it is possible to quantify other lipids based on the quantitative value of a predetermined lipid as a standard it is possible to quantify lipids other than the predetermined lipid without using a standard substance corresponding to them.
  • the relative response coefficient is the response coefficient of another lipid relative to the response coefficient of a reference lipid.
  • the response coefficient is the quantitative value of the lipid relative to the detection intensity obtained by LC-MS/MS.
  • each sample contains a single type of lipid. This is because when a single type of lipid is contained in a sample, the quantitative accuracy of the lipid contained in the sample is improved compared to when a plurality of types of lipid are contained.
  • the lipid may be a lipid produced by chemical synthesis or may be a lipid extracted from a living body.
  • the living body may be, for example, an animal, a plant, or a bacterial body.
  • the quantitative value of the first lipid and the lipid different from the first lipid contained in the sample is obtained.
  • the quantitative value is, for example, concentration, amount of substance, and weight.
  • the amount of lipid is measured by quantifying the fatty acid constituting the lipid.
  • the device used for quantifying the lipid is not limited, and for example, at least one of gas chromatography, liquid chromatography, liquid chromatography mass spectrometer, gas chromatography mass spectrometry, high performance liquid chromatography tandem mass spectrometer, gas chromatography tandem mass spectrometer, balance, and electronic balance is used.
  • the sample is measured by LC-MS/MS, and the detection intensity of each lipid is obtained from a chromatogram derived from the first lipid and a type of lipid different from the first lipid contained in the sample.
  • the detection intensity is, for example, at least one of a peak area and a peak intensity.
  • sensitivity coefficient of the first lipid is calculated as a ratio of the detection intensity to the quantitative value of the first lipid contained in the sample. In the same manner, sensitivity coefficients are calculated for lipids of a type different from the first lipid.
  • Figure 4 is a diagram for explaining the method for calculating the relative sensitivity coefficient.
  • the samples assumed are sample A containing lipid A, which is a reference lipid; sample B containing lipid B; sample C containing lipid C; and sample D containing lipid D.
  • the quantitative value of lipid A contained in sample A is 4 mol/L
  • the quantitative value of lipid B contained in sample B is 3 mol/L
  • the quantitative value of lipid C contained in sample C is 10 mol/L
  • the quantitative value of lipid D contained in sample D is 2 mol/L.
  • the example in Figure 4 also shows the peak areas identified from the chromatograms obtained by analyzing each sample by LC-MS/MS.
  • the peak area derived from lipid A contained in sample A is 8
  • the peak area derived from lipid B contained in sample B is 3
  • the peak area derived from lipid C contained in sample C is 5
  • the peak area derived from lipid D contained in sample D is 8.
  • Figure 4 also shows the sensitivity coefficients obtained by dividing the quantitative value of lipids contained in each sample by the peak area obtained.
  • the sensitivity coefficient of lipid A is calculated to be 0.5
  • the sensitivity coefficient of lipid B is 1
  • the sensitivity coefficient of lipid C is 2
  • the sensitivity coefficient of lipid A is 0.25.
  • FIG. 4 shows the sensitivity coefficient for the first lipid, calculated by correcting the calculated sensitivity coefficient so that the sensitivity coefficient for the first lipid is 1. That is, the sensitivity coefficients for lipids A, B, C, and D were calculated to be 0.5, 1, 2, and 0.25, respectively, and by dividing each sensitivity coefficient by the sensitivity coefficient for lipid A, which is 0.5, the relative sensitivity coefficients for lipids B, C, and D to lipid A are calculated to be 2, 4, and 0.5, respectively.
  • Fig. 5 is a flow chart of the procedure for preparing a sample used for calculating the relative response coefficient from Arabidopsis thaliana.
  • Fig. 6 is a flow chart of the procedure for calculating the relative response coefficient using the prepared sample.
  • Fig. 5, like Fig. 3, is accompanied by pictures representing lipids and ions.
  • Figs. 5 and 6 it is assumed that the lipids are composed of fatty acids and glycerol, and that the relative response coefficient of glycerophospholipid is to be calculated.
  • Lipids 65, 66, 67, and 68 in Figure 5 are complex lipids with one polar head and two fatty acids, with glycerol as the linking moiety, as in Figure 3.
  • unshaded diamonds indicate a phosphate polar head
  • shaded diamonds indicate a polar head other than phosphate.
  • lipids 66 and 68 which have a phosphate polar head and two fatty acids, are classified as glycerophospholipids.
  • the process shown in Figure 5 is performed manually by an analyst using laboratory equipment used in general scientific experiments and mass spectrometry, or by partially automated laboratory equipment.
  • an extract containing lipids 65, 66, 67, and 68 is obtained from Arabidopsis thaliana by extraction with an organic solvent.
  • step U12 the lipids are separated by thin layer chromatography based on the difference in the polar head group of the lipid, and lipids 66 and 68, which are glycerophospholipids, are separated from lipids 65 and 67.
  • step U14 the fraction corresponding to glycerophospholipids containing lipids 66 and 68 physically separated on the solid phase of the thin layer chromatography is collected and dissolved in a solvent.
  • step U16 the solution obtained in step U14 is separated into the fatty acid compositions that make up lipids 66 and lipids 68 by a separation system consisting of a liquid chromatograph. Specifically, the solution obtained in step U14 is divided into fractions 71, 72, 73, 74, 75, and 76 by dividing the eluate from the separation system into fixed volumes.
  • fractions 71, 72, 73, 74, 75, and 76 obtained in step U16 are analyzed by LC-MS/MS to confirm whether each fraction contains lipids. As a result, it is revealed that fraction 72 contains lipid 66, and fraction 75 contains lipid 68.
  • step U20 fractions 72 and 75 are concentrated in step U18, and the concentrates obtained are redissolved to obtain sample 81 containing lipid 66 and sample 82 containing lipid 68. Samples 81 and 82 are then used in the process of step V10 in FIG. 6.
  • sample 81 and sample 82 are each subjected to the same process in parallel.
  • the following describes the process of sample 81 containing lipids 66 as an example.
  • steps other than step V38 are performed manually by an analyst using experimental equipment used in general scientific experiments and mass spectrometry, or by partially automated experimental equipment.
  • step V38 is performed by control unit 3. Note that the process corresponding to step V38 will be described in detail in steps S10 to S18 in FIG. 8, which will be described later.
  • step V10 the sample 81 containing the separated lipids 66 is concentrated by removing the solvent.
  • step V12 1 mL of methanol is added to the vessel to dissolve the lipids 66.
  • step V14 800 ⁇ L of the lysate obtained in step V12 is taken.
  • step V16 50 ⁇ L of 1 mM pentadecanoic acid (C15:0) solution is added to the solution separated in step V14 as a standard for measuring fatty acids.
  • the fatty acids used as the standard are not limited to the fatty acids mentioned above, and any fatty acid other than those constituting lipid 66 can be used.
  • step V18 900 ⁇ L of 3 M hydrochloric acid in methanol is added to the solution obtained in step V16.
  • step V20 the solution obtained in step V18 is heated at 85°C for 1 hour.
  • the fatty acids that make up lipid 66 are liberated by heating together with hydrochloric acid. Each of the liberated fatty acids becomes a fatty acid methyl ester.
  • lipid 66 has two types of fatty acids with different lengths, so two types of fatty acid methyl esters derived from each fatty acid are produced.
  • the pentadecanoic acid added in step V16 is also methyl esterified. Note that methyl esterification of fatty acids suppresses tailing of detection peaks in gas chromatography (GC) analysis described below, improves the volatility of the analyte, and improves the sensitivity of GC analysis.
  • GC gas chromatography
  • step V22 the lipids 66 obtained in step V20 and fatty acid methyl esters derived from pentadecanoic acid are extracted with hexane.
  • step V24 after removing the solvent from the extract extracted in step V22, the extract is dissolved in 100 ⁇ L of hexane.
  • step V26 the solution obtained in step V24 is analyzed by GC.
  • Fatty acid methyl esters derived from lipid 66 and pentadecanoic acid can be separated by GC.
  • Each separated fatty acid methyl ester is detected by a flame ionization detector (FID).
  • FID flame ionization detector
  • step V28 the molar concentration of the fatty acids of the lipids 66 contained in the sample 81 is calculated. Specifically, the mass concentration of the fatty acid methyl esters derived from the lipids 66 obtained in step V26 is quantified using an external calibration curve, and then the molar concentration of each fatty acid is calculated by correcting the mass concentration of the fatty acid methyl esters derived from the pentadecanoic acid added as an internal standard in step V16.
  • step V30 10 ⁇ L of the solution obtained in step V12 is removed and dried.
  • step V32 the dried material obtained in step V30 is dissolved in 200 ⁇ L of 40% 2-propanol.
  • step V34 insoluble precipitates are removed from the solution obtained in step V32.
  • step V36 the solution from which the precipitate was removed in step V34 is subjected to LC-MS/MS to obtain the area of the ion peak derived from lipid 66 contained in sample 81.
  • step V38 the control unit 3 obtains the molar concentration of lipid 66 contained in sample 81 calculated from the molar concentration of fatty acid obtained in step V28 and the area of the ion peak derived from lipid contained in sample 81 obtained in step V36, and calculates the molar concentration relative to the peak area of lipid 66.
  • the molar concentration relative to the peak area of lipid 68 obtained by a similar process is divided by the molar concentration relative to the peak area of lipid 66 to calculate the relative sensitivity coefficient of lipid 68 relative to lipid 66.
  • the LC-MS/MS device 100 ends the process of FIG. 6.
  • lipids contained in a sample using the relative sensitivity coefficient may be chemically synthesized or may be synthesized by a living organism.
  • the living organism may be, for example, an animal, a plant, or a fungus.
  • the sample may also contain lipids other than the lipids for which the relative sensitivity coefficient has been calculated.
  • a predetermined amount of a standard substance corresponding to at least one of the lipids contained in the sample and for which the relative sensitivity coefficient has been calculated is mixed with the sample.
  • the lipid selected here corresponds to the "reference lipid.” This allows the reference lipid contained in the sample to be quantified by comparing the detection intensity of the reference lipid contained in the sample with the detection intensity derived from the standard substance for a predetermined amount of the reference lipid mixed with the lipid.
  • the reference lipid is not limited to one type, and may be multiple types.
  • the detection intensity is, for example, peak area and peak intensity.
  • the sample is subjected to LC-MS/MS measurement, and chromatograms derived from each lipid contained in the sample and the above-mentioned standard substance are obtained.
  • the detection intensity of each lipid and the above-mentioned standard substance is obtained from the obtained chromatograms.
  • the relative amount ratio of each lipid contained in the sample is calculated by multiplying the detection intensity of each lipid by the corresponding relative sensitivity coefficient.
  • the quantitative value of each lipid contained in the sample is calculated by multiplying the quantitative value of the reference lipid quantified using the standard substance by the relative amount ratio of each lipid contained in the sample described above.
  • Figure 7 is a diagram for explaining the method for quantifying lipids using relative sensitivity coefficients.
  • sample X that contains at least lipids A, B, C, and D.
  • Lipid A' a standard substance for lipid A, is mixed into sample X at 1 mol/L, and the sample X mixed with lipid A' is subjected to LC-MS/MS measurement.
  • Figure 7 shows the peak areas identified from the chromatogram obtained by LC-MS/MS measurement.
  • the peak areas of lipids A, B, C, D, and A' are 4, 6, 10, 4, and 2, respectively. Furthermore, by comparing the peak areas of lipids A and A', it can be calculated that the concentration of lipid A in sample X is 2 mol/L.
  • Figure 7 shows the relative ratio of the amount of each lipid contained in sample X. By multiplying the obtained peak area by the relative sensitivity coefficient calculated in Figure 4, it is calculated that lipids B, C, and D are contained in sample X in amounts 3 times, 10 times, and 0.5 times the amount of lipid A.
  • Figure 7 shows the quantitative values of lipids contained in sample X. From the concentration of lipid A in sample X obtained by comparison with lipid A' and the relative amounts of lipids B, C, and D to lipid A, the concentrations of lipids B, C, and D in sample X are calculated to be 6 mol/L, 20 mol/L, and 1 mol/L.
  • the above-mentioned quantitative method by calculating the relative sensitivity coefficient prepared in advance, it is possible to quantify each lipid in a sample (lipids B, C, and D in the above example) other than the reference lipid (lipid A in the above example) without using the corresponding standard substance. Furthermore, the above-mentioned quantitative method can improve the accuracy of quantification compared to a quantitative method that simply compares peak areas, because the difference in ionization efficiency of each lipid is corrected.
  • the sensitivity coefficient of each lipid in advance, it is possible to calculate the amount of that lipid in the sample in subsequent measurements from the detection intensity.
  • the peak area of lipid B in Figure 7 is 6, and the sensitivity coefficient of lipid B in Figure 4 is 1, so it can be calculated that lipid B is contained in sample X in Figure 7 at 6 mol/L.
  • the absolute value of the detection intensity is easily affected by the state of the mass spectrometry unit 2 (for example, the degree of dirt on the probe 201), and the value is likely to vary depending on the timing of the measurement.
  • the relative sensitivity coefficient is unlikely to fluctuate even if the timing of the measurement is different. Therefore, as in the above example, by calculating the relative values between lipids using the relative sensitivity coefficient, and then quantifying at least one of the lipids using a standard substance to quantify multiple types of lipids, the accuracy of quantification can be improved compared to the measurement method in the comparative example and the measurement method using the sensitivity coefficient.
  • the relative sensitivity coefficient is a value that fluctuates little when the measurement conditions are kept constant, so it can be used in other LC-MS/MS devices by keeping the measurement conditions (for example, the solvent, column, and ionization method used) the same.
  • FIG. 8 is a diagram showing a flowchart of an example of a process performed to measure the amount of lipid contained in a sample using a relative response coefficient.
  • the process of Fig. 8 is called from the main routine and executed when the CPU 30 of the control unit 3 executes a given program.
  • the first sample and the second sample are samples used for calculating the relative response coefficient
  • the third sample is a sample that is the target of lipid quantification using the relative response coefficient.
  • the first lipid corresponds to the lipid that is the reference described above.
  • step S10 the CPU 30 receives the quantitative value of the first lipid in the first sample containing the first lipid obtained by a predetermined quantitative method.
  • the predetermined method is, for example, a method in which the first sample is separated by gas chromatography, and then fatty acids derived from the first lipid are measured by a flame ionization detector to quantify the first lipid.
  • step S12 the CPU 30 receives the quantitative value of the second lipid in the second sample containing the second lipid obtained by a predetermined quantitative method.
  • the predetermined method is, for example, a method in which the second sample is separated by gas chromatography, and then fatty acids derived from the second lipid are measured by a flame ionization detector to quantify the second lipid.
  • step S14 the CPU 30 receives from the ion detector 234 a chromatogram derived from the first lipid in the first sample introduced into the liquid chromatograph 1 by the injector 12, and determines the detection intensity of the first lipid in the first sample.
  • step S16 the CPU 30 receives from the ion detector 234 a chromatogram derived from the second lipid in the second sample introduced into the liquid chromatograph 1 by the injector 12, and calculates the detection intensity of the second lipid in the second sample.
  • step S18 the CPU 30 calculates a relative sensitivity coefficient of the second lipid to the first lipid using the amount of the first lipid contained in the first sample received in step S10, the amount of the second lipid contained in the second sample received in step S12, the detection intensity derived from the first lipid contained in the first sample determined in step S14, and the detection intensity derived from the second lipid contained in the second sample determined in step S16.
  • the calculated relative sensitivity coefficient of the second lipid to the first lipid is stored in the HDD 33.
  • step S20 the CPU 30 calculates a quantitative value of the first lipid contained in the third sample from the detection intensity derived from the first lipid in the third sample mixed with the first lipid standard substance and the standard substance.
  • step S22 the CPU 30 determines the detection intensities of the first and second lipids from the chromatograms derived from the third sample introduced into the liquid chromatograph 1 by the injector 12.
  • step S24 the CPU 30 calculates the quantitative value of the second lipid contained in the third sample from the relative sensitivity coefficient of the second lipid to the first lipid calculated in step S18, the quantitative value of the first lipid contained in the third sample calculated in step S20, and the detection intensities of the first lipid and the second lipid in the third sample determined in step S22.
  • the CPU 30 then ends the lipid quantification subroutine and returns processing to the main routine.
  • step S20 If the amount of lipids contained in a sample is quantified using the relative sensitivity coefficient once calculated, processing begins with step S20.
  • the amount of the first lipid contained in the third sample is measured using a standard substance, but the amount of the second lipid may be measured using a standard substance corresponding to the second lipid, and the amount of the first lipid may be calculated using a relative sensitivity coefficient.
  • the lipid quantification method using the relative sensitivity coefficients disclosed herein corrects for differences in ionization efficiency due to the type of lipid, thereby improving the accuracy of quantification using the detection sensitivity obtained by LC-MS/MS.
  • the lipid quantification method using the relative sensitivity coefficients disclosed herein eliminates the need to prepare standard substances for all lipids to be measured, thereby reducing the cost of measurement.
  • the organism when measuring lipids produced by a specific organism, the organism can be used to calculate the relative sensitivity coefficient, allowing the exact relative sensitivity coefficient to be created for the lipids contained in the organism. Furthermore, even if it is difficult to obtain a standard substance for the lipid to be measured, the lipid can be quantified without using the standard substance by using the measurement method using the relative sensitivity coefficient according to the present disclosure.
  • the calculation method is a method for calculating a relative sensitivity coefficient of a second lipid, which is different from the first lipid, to a first lipid in an LC-MS/MS device, and may include the steps of: acquiring a quantitative value of the first lipid contained in a first sample containing the first lipid; acquiring a quantitative value of the second lipid contained in a second sample containing the second lipid; measuring the first sample by the LC-MS/MS and determining the detection intensity of the first lipid from the obtained chromatogram; measuring the second sample by the LC-MS/MS and determining the detection intensity of the second lipid from the obtained chromatogram; and calculating the relative sensitivity coefficient of the second lipid to the first lipid from the quantitative value of the first lipid, the quantitative value of the second lipid, the detection intensity of the first lipid, and the detection intensity of the second lipid.
  • the calculation method described in paragraph 1 provides a technology for improving the quantitative accuracy of lipids when measuring multiple types of lipids by LC-MS/MS without using lipid standard substances other than the reference lipid.
  • each of the first lipid and the second lipid may be a glycerolipid.
  • the calculation method described in paragraph 2 provides a technology for improving the quantitative accuracy of glycerolipids in the measurement of multiple types of glycerolipids by LC-MS/MS without using a standard substance for glycerolipids other than the reference glycerolipid.
  • the quantitative value may be a quantitative value of the glycerolipid obtained by separating the fatty acids constituting the glycerolipid by gas chromatography and quantifying the fatty acids by a flame ionization detector.
  • the calculation method described in paragraph 3 provides a technology for improving the quantitative accuracy of glycerolipids in the measurement of multiple types of glycerolipids by LC-MS/MS, by using the quantitative values of glycerolipids obtained by separating the fatty acids that constitute the glycerolipids by gas chromatography and quantifying the fatty acids using a flame ionization detector, without using a standard substance for glycerolipids other than the reference glycerolipid.
  • the quantitative values of the first lipid and the second lipid may include at least one of concentration, amount of substance, and weight.
  • the calculation method described in paragraph 4 provides a technology for improving the quantitative accuracy of lipids in the measurement of multiple types of lipids by LC-MS/MS by using at least one of the concentration, amount of substance, and weight as a quantitative value, without using lipid standard substances other than the reference lipid.
  • the detection intensity may be calculated based on at least one of the peak intensity and the peak area calculated from the chromatogram.
  • the calculation method described in paragraph 5 provides a technology for improving the quantitative accuracy of lipids in the measurement of multiple types of lipids by LC-MS/MS, using detection intensity calculated based on at least one of the peak intensity and peak area calculated from the chromatogram obtained by LC-MS/MS measurement, without using lipid standard substances other than the reference lipid.
  • each of the first sample and the second sample may be extracted from at least one of plants, algae, and animals.
  • the calculation method described in paragraph 6 provides a technique for improving the quantitative accuracy of lipids in the measurement of multiple types of lipids by LC-MS/MS, using samples extracted from at least one of plants, algae, and animals, without using lipid standard substances other than the reference lipid.
  • the program is a program executed by a processor installed in a computer, and may cause the computer to execute any one of the calculation methods described in any one of the items 1 to 6.
  • the program described in paragraph 7 provides a technology for improving the quantitative accuracy of lipids when measuring multiple types of lipids by LC-MS/MS without using lipid standard substances other than the reference lipid.
  • the calculation method is a method for calculating a lipid sensitivity coefficient in an LC-MS/MS device, and may include the steps of acquiring a quantitative value of the lipid contained in a sample containing the lipid, measuring the lipid contained in the sample by the LC-MS/MS and determining a detection intensity derived from the lipid contained in the sample from the obtained chromatogram, and determining the sensitivity coefficient of the lipid from the quantitative value and the detection intensity.
  • the calculation method described in paragraph 8 provides a technique for quantifying lipids in lipid measurements by LC-MS/MS without using lipid standard substances other than the reference lipid.
  • the method may include a step of calculating a relative sensitivity coefficient of the second lipid to the first lipid from the quantitative value of the second lipid, the detection intensity of the first lipid contained in the first sample, and the detection intensity of the second lipid contained in the second sample; a step of measuring the third sample by the LC-MS/MS and determining the detection intensities of the first lipid and the second lipid contained in the third sample; a step of measuring the quantitative value of the first lipid contained in the third sample by the LC-MS/MS using a standard substance of the first lipid; and a step of quantifying the second lipid contained in the third sample using the relative sensitivity coefficient, the detection intensities of the first lipid and the second lipid contained in the third sample, and the quantitative value of the first lipid contained in the third sample.
  • the quantitative method described in paragraph 9 provides a technology for improving the quantitative accuracy of lipids in the measurement of multiple types of lipids by LC-MS/MS without using lipid standard substances other than the reference lipid.
  • the third sample may be extracted from at least one of a plant, an algae, and an animal.
  • the quantitative method described in paragraph 10 provides a technology for improving the quantitative accuracy of lipids in LC-MS/MS measurements of lipids extracted from at least one of plants, algae, and animals, without using lipid standard substances other than the reference lipid.
  • the LC-MS/MS device is an LC-MS/MS device that quantifies the second lipid in a third sample containing the first lipid and the second lipid, and includes a liquid chromatograph, a mass spectrometer that analyzes components separated by the liquid chromatograph, and a data processor that receives measurement data from the mass spectrometer.
  • the mass spectrometer determines the detection intensities of the first lipid and the second lipid contained in the third sample by measuring the third sample, and measures the quantitative value of the first lipid contained in the third sample using a standard substance for the first lipid.
  • the data processor may calculate the quantitative value of the second lipid contained in the third sample using the detection intensities of the first lipid and the second lipid contained in the third sample, the quantitative value, and the relative sensitivity coefficient calculated by the calculation method described in Item 1.
  • the LC-MS/MS device described in paragraph 11 provides a technology for improving the quantitative accuracy of lipids in lipid measurement by LC-MS/MS without using lipid standard substances other than the reference lipid.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

高速液体クロマトグラフタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）装置における第１の脂質に対する第２の脂質の相対感度係数の算出方法は、第１の試料に含まれる第１の脂質の定量値を取得するステップ（Ｓ１０）と、第２の試料に含まれる第２の脂質の定量値を取得するステップ（Ｓ１２）と、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって第１の試料を測定し、第１の脂質の検出強度を求めるステップ（Ｓ１４）と、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって第２の試料を測定し、第２の脂質の検出強度を求めるステップ（Ｓ１６）と、第１の脂質の定量値、第２の脂質の定量値、第１の脂質の検出強度、および第２の脂質の検出強度から、第１の脂質に対する第２の脂質の相対感度係数を算出するステップ（Ｓ１８）と、を含む。

Description

算出方法、プログラム、定量方法、および高速液体クロマトグラフタンデム質量分析装置
　本開示は、算出方法、プログラム、定量方法、および高速液体クロマトグラフタンデム質量分析装置に関し、より特定的には、脂質の定量精度を向上させる技術に関する。
　脂質は、無極性溶媒に可溶であり、かつ水に不溶である物質であり、様々な構造を有する物質を含む。たとえば、１分子のグリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合したトリアシルグリセロールは、結合する脂肪酸の種類とその組み合わせ、およびグリセロールへの脂肪酸の結合位置により、その種類は多岐にわたる。
　植物や藻類が産生する脂質には、ヒトにとって有用な生理活性を有するものや、バイオ燃料として使用できるものがある。したがって、たとえば、対象となる脂質の生産効率を向上させることを目的に植物の生育条件を検討する場合に、当該植物から抽出された複数の種類の脂質を含む試料において、脂質の種類を区別して定量的に分析することが望まれる。
　複数種類の脂質が含まれる試料において、種類別に脂質を分析する際には、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による測定は広く利用される。なぜならば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる脂質の測定においては、前段の高速液体クロマトグラフィにより試料に含まれる脂質を化学的性質の違いより分離し、分離された脂質を後段の質量分析計により高感度で検出することができるからである。また、タンデム質量分析計において、測定対象の脂質を分解し、分解物に由来するイオンを検出することで、測定対象の脂質の構造を推定することができるため、未知の脂質を含む試料の分析にも有用である。
　脂質成分の分析に関して、Jouhet　J,　Lupette　J,　Clerc　O,　Magneschi　L,　Bedhomme　M,　Collin　S,　Roy　S,　Marechal　E,　Rebeille　F　"LC-MS/MS　versus　TLC　plus　GC　methods:Consistency　of　glycerolipid　and　fatty　acid　profiles　in　microalgae　and　higher　plant　cells　and　effect　of　a　nitrogen　starvation."　PLoS　ONE,　13(10):e0206397,　2018.（非特許文献１）、およびKoivusalo　M,　Haimi　P,　Heikinheimo　L,　Kostiainen　R,　Somerharju　P　"　Quantitative　determination　of　phospholipid　compositions　by　ESI-MS:　effects　of　acyl　chain　length,　unsaturation,　and　lipid　concentration　on　instrument　response."　J　Lipid　Res　42(4):663-72,　2001.（非特許文献２）は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた脂質の測定方法の一例を開示している。
　脂質の種類の推定に関して、Shiva　S,　Vu　HS,　Roth　MR,　Zhou　Z,　Marepally　SR,　Nune　DS,　Lushington　GH,　Visvanathan　M,　Welti　R　"Lipidomic　analysis　of　plant　membrane　lipids　by　direct　infusion　tandem　mass　spectrometry."　Methods　Mol　Biol.　1009:79-91,　2013.（非特許文献３）は、タンデム質量分析計を用いた脂質の構造推定方法の一例を開示している。
Jouhet　J,　Lupette　J,　Clerc　O,　Magneschi　L,　Bedhomme　M,　Collin　S,　Roy　S,　Marechal　E,　Rebeille　F　"LC-MS/MS　versus　TLC　plus　GC　methods:Consistency　of　glycerolipid　and　fatty　acid　profiles　in　microalgae　and　higher　plant　cells　and　effect　of　a　nitrogen　starvation."　PLoS　ONE,　13(10):e0206397,　2018. Koivusalo　M,　Haimi　P,　Heikinheimo　L,　Kostiainen　R,　Somerharju　P　"　Quantitative　determination　of　phospholipid　compositions　by　ESI-MS:　effects　of　acyl　chain　length,　unsaturation,　and　lipid　concentration　on　instrument　response."　J　Lipid　Res　42(4):663-72,　2001. Shiva　S,　Vu　HS,　Roth　MR,　Zhou　Z,　Marepally　SR,　Nune　DS,　Lushington　GH,　Visvanathan　M,　Welti　R　"Lipidomic　analysis　of　plant　membrane　lipids　by　direct　infusion　tandem　mass　spectrometry."　Methods　Mol　Biol.　1009:79-91,　2013.
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて試料中の脂質を定量する方法としては、標準物質との比較による定量方法がある。具体的には、標準物質と測定対象の脂質を同時に測定し、当該標準物質との検出強度の比較により当該脂質を定量する。当該方法においては、脂質の種類ごとに対応する標準物質が異なるため、測定対象となる脂質が複数であるときは、測定コストが高くなる場合がある。
　一方で、複数の種類の脂質を含む試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定し、各々の脂質に由来する検出強度の比較により、脂質を分析する方法もある。しかしながら、脂質の種類ごとにイオン化効率が異なるので、検出強度が大きい脂質が検出強度が当該脂質よりも低い脂質に比べて、必ずしも試料中により多く含まれているとは限らない。すなわち、当該検出強度の比較による脂質の定量は、十分な定量精度を得ることができない場合がある。
　したがって、複数の種類の脂質をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析する際に、測定対象の一部の脂質の標準物質を用いて、十分な精度で複数の種類の脂質を定量できるような定量方法が求められている。
　本開示は、係る実情に鑑み考え出されたものであり、その目的は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類の脂質を含む試料の測定において、測定対象の一部の脂質の標準物質を用いて、脂質の定量精度を向上させる技術を提供することである。
　本開示の第１の態様に従う算出方法は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置における第１の脂質に対する第１の脂質とは異なる種類の第２の脂質の相対感度係数の算出方法であって、第１の脂質を含む第１の試料に含まれる第１の脂質の定量値を取得するステップと、第２の脂質を含む第２の試料に含まれる第２の脂質の定量値を取得するステップと、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって第１の試料を測定し、得られたクロマトグラムから第１の脂質の検出強度を求めるステップと、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって第２の試料を測定し、得られたクロマトグラムから第２の脂質の検出強度を求めるステップと、第１の脂質の定量値、第２の脂質の定量値、第１の脂質の検出強度、および第２の脂質の検出強度から、第１の脂質に対する第２の脂質の相対感度係数を算出するステップと、を含む。
　本開示の第２の態様に従うプログラムは、コンピュータに搭載されるプロセッサにより実行されるプログラムであって、コンピュータに上記の算出方法を実行させる。
　本開示の第３の態様に従う算出方法は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置における脂質の感度係数の算出方法であって、脂質を含む試料に含まれる脂質の定量値を取得するステップと、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって試料を測定し、得られたクロマトグラムから試料に含まれる脂質に由来する検出強度を求めるステップと、定量値および検出強度から、脂質の感度係数を求めるステップと、を含む。
　本開示の第４の態様に従う定量方法は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置において第１の脂質を含む第１の試料と第１の脂質とは異なる種類の第２の脂質を含む第２の試料を用いて算出された相対感度係数により第１の脂質および第２の脂質を含む第３の試料における第２の脂質の定量方法であって、第１の試料に含まれる第１の脂質の定量値を取得するステップと、第２の試料に含まれる第２の脂質の定量値を取得するステップと、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって第１の試料を測定し、得られたクロマトグラムから第１の脂質の検出強度を求めるステップと、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって第２の試料を測定し、得られたクロマトグラムから第２の脂質の検出強度を求めるステップと、第１の試料に含まれる第１の脂質の定量値、第２の試料に含まれる第２の脂質の定量値、第１の試料に含まれる第１の脂質の検出強度、および第２の試料に含まれる第２の脂質の検出強度から、第１の脂質に対する第２の脂質の相対感度係数を算出するステップと、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって第３の試料を測定し、第３の試料に含まれる第１の脂質および第２の脂質の各々の検出強度を求めるステップと、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって第１の脂質の標準物質を用いて、第３の試料に含まれる第１の脂質の定量値を測定するステップと、相対感度係数、第３の試料に含まれる第１の脂質および第２の脂質の各々の検出強度、ならびに第３の試料に含まれる第１の脂質の定量値、を用いて第３の試料に含まれる第２の脂質を定量するステップと、を含む。
　本開示の第５の態様に従うＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置は、第１の脂質および第２の脂質を含む第３の試料における第２の脂質を定量するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置であって、液体クロマトグラフ装置と、液体クロマトグラフ装置で分離された成分を分析する質量分析部と、質量分析部から測定データを受け付けるデータ処理部と、を備え、質量分析部は、第３の試料を測定することによって第３の試料に含まれる第１の脂質および第２の脂質の検出強度を求め、第１の脂質の標準物質を用いて、第３の試料に含まれる第１の脂質の定量値を測定し、データ処理部は、第３の試料に含まれる第１の脂質および第２の脂質の検出強度、定量値、ならびに第１の態様に記載された算出方法によって算出された相対感度係数を用いて第３の試料に含まれる第２の脂質の定量値を算出する。
　本開示によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類の脂質の測定において、測定対象の一部の脂質の標準物質を用いて、脂質の定量精度を向上させることができる。
実施の形態に係るＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置の概略構成図である。 実施の形態に係るＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置の機能ブロック図である。 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる脂質分析の工程を示すフローチャートである。 相対感度係数の算出方法を説明するための図である。 相対感度係数を算出するための試料を調製する手順を示すフローチャートである。 調製された試料から相対感度係数を算出する手順を示すフローチャートである。 相対感度係数を用いた脂質の定量方法を説明するための図である。 相対感度係数を用いた脂質の定量方法にかかる処理を示すフローチャートである。
　本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、図中の同一または相当部分については、同一符号を付してその説明は繰り返さない。
　［ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置の全体構成］
　図１は、本実施形態にかかるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００の全体構成を概略的に示す図である。図１に示すように、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００は、液体クロマトグラフ１と、質量分析部２と、制御部３と、表示部４と、入力部５と、を備える。制御部３、表示部４、および入力部５は、質量分析部２に組み込まれていてもよい。また、制御部３は液体クロマトグラフ１および質量分析部２とは離れた位置に設けられた、汎用的なコンピュータであってもよい。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００は、試料に含まれる脂質を個々の種類の脂質に分離し、各々の脂質に対応した検出強度を取得することができる。
　脂質とは、水に溶けにくく有機溶媒に溶けやすい物質であり、具体的には、たとえば、単純脂質、複合脂質、コレステロール、ステロイド、カロテノイド、およびこれらと構造が類似する物質である。単純脂質は、アルコールと脂肪酸が結合したものを含み、たとえば、トリアシルグリセロールである。複合脂質は、アルコールと脂肪酸に加え、リン酸、硫黄、窒素塩基および糖のうち少なくとも１つが結合したものであり、たとえば、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質、およびスフィンゴ糖脂質である。
　液体クロマトグラフ１は、移動相容器１０と、ポンプ１１と、インジェクタ１２と、カラム１３と、を含む。液体クロマトグラフ１は、試料に含まれる複数種類の脂質を固定相および移動相との相互作用の差を利用して各々の種類の脂質に分離することができる。
　移動相容器１０は、液体クロマトグラフ１に注入された試料を運ぶ液体である移動相を貯留する。移動相は、たとえば、有機溶媒または水、もしくはこれらの混合物である。有機溶媒は、たとえば、２－プロパノール、メタノール、アセトニトリル、クロロホルム、ヘキサン、ジクロロメタン、およびテトラヒドロフランである。移動相は、添加剤として酸性溶液（たとえば、トリフルオロ酢酸、ギ酸、およびギ酸アンモニウム）を含んでもよい。液体クロマトグラフ１が含む移動相容器は、単数であってもよいし、複数であってもよい。
　ポンプ１１は、移動相容器１０に貯留されている移動相を吸引して所定の流量で送給する。ポンプ１１が送給する移動相の流量は、１回の測定において一定であってもよいし、変化してもよい。液体クロマトグラフ１が含むポンプは、単数であってもよいし、複数であってもよい。
　インジェクタ１２は、移動相の流路にあらかじめ用意された試料を所定量だけ液体クロマトグラフ１に注入する。ポンプ１１から送給された移動相中に、インジェクタ１２から試料が導入され、当該試料を含む移動相はカラム１３に導入される。
　カラム１３は、固定相が充填されており、その内部を移動相が通過する。カラム１３を通過する際に、試料中の各種脂質が移動相および固定相と相互作用することで、時間方向に分離される。分離された脂質は、カラム１３の出口から溶出し、質量分析部２に導入される。なお、固定相は、脂質の分離に用いられるものであれば種類は限定されない。
　質量分析部２は、イオン化室２０と、第１中間室２１と、第２中間室２２と、分析室２３と、を含む。質量分析部２は、液体クロマトグラフ１より溶出された試料の質量分析を行う。質量分析部２における分析は、マススペクトルのピークを検出し、試料に含まれる特定または非特定の物質の質量電荷比を測定することを含む。
　イオン化室２０は、プローブ２０１およびキャピラリ２０２を有する。イオン化室２０内部は大気圧である。イオン化室２０と次段の第１中間室２１との間は、細径のキャピラリ２０２を通して連通している。プローブ２０１は、質量分析部２に導入された試料に片寄った電荷を付与しながら噴霧する。帯電した微小な液滴は、静電気力の作用によって分裂しながら微細化され、溶媒が蒸発する過程で液滴中の試料の脂質がイオン化される。生成されたイオンはキャピラリ２０２を通って、第１中間室２１に導入される。
　第１中間室２１は、イオンガイド２１１およびスキマー２１２を有する。第１中間室２１の内部は高真空である。第１中間室２１と次段の第２中間室２２とはスキマー２１２の頂部に穿設された小孔を通して連通している。イオンガイド２１１は前段のイオン化室２０より導入されたイオンを収束させつつ、スキマー２１２を介して後段へ輸送する。
　第２中間室２２は、イオンガイド２２１を有する。第２中間室２２の内部は高真空である。イオンガイド２２１は前段の第１中間室２１より導入されたイオンを収束させつつ、後段へ輸送する。
　分析室２３は、四重極マスフィルタ２３１，２３３と、コリジョンセル２３２と、イオン検出器２３４と、を含む。四重極マスフィルタ２３１は、コリジョンセル２３２の前段に配置され、四重極マスフィルタ２３３はコリジョンセル２３２の後段に配置される。分析室２３内部は大気圧である。分析室２３は、イオンを質量により分離し、分離された各々のイオンを検出することで、質量スペクトルを取得する。取得された質量スペクトルから、化合物の分子量、分子式、および化学構造に関する情報を得ることができる。
　四重極マスフィルタ２３１は、メインロッド電極２３１２と、その前段に配置されたプリロッド電極２３１１を備える。メインロッド電極２３１２は、イオンを質量電荷比に応じて分離する。プリロッド電極２３１１は、入口端での電場の乱れを補正し、メインロッド電極２３１２の働きを補助する。
　コリジョンセル２３２は、その内部に多重極イオンガイド２３２１を備える。コリジョンセル２３２は、衝突誘起解離（ＣＩＤ：Collision-induced　dissociation)ガスの供給機構（図示せず）と接続されており、当該供給機構はコリジョンセル２３２の内部にＣＩＤガスを導入する。ＣＩＤガスは、イオンの解離を促進させる。多重極イオンガイド２３２１は、解離されたイオンを収束させつつ、後段へ輸送する。ＣＩＤガスは、たとえば、アルゴン、窒素、ヘリウム、およびキセノンである。
　四重極マスフィルタ２３３は、メインロッド電極２３３２と、その前段に配置されたプリロッド電極２３３１を備える。メインロッド電極２３３２は、イオンを質量電荷比に応じて分離する。プリロッド電極２３３１は、入口端での電場の乱れを補正し、メインロッド電極２３３２の働きを補助する。
　イオン検出器２３４は、例えばパルスカウント型検出器であり、入射したイオンの数に応じた個数のパルス信号を検出信号として生成する。この検出信号は、制御部３へ出力される。
　上述した実施例においてはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００は、イオン化法として、エレクトロスプレイイオン化法を備えているが、イオン化法は、このエレクトロスプレイイオン化法に限られるものではなく、大気圧化学イオン化法、大気圧光イオン化法を用いてもよい。
　制御部３は、液体クロマトグラフ１および質量分析部２と通信接続され、たとえばコンピュータにより構成される。制御部３は、液体クロマトグラフ１および質量分析部２の動作を制御し、質量分析部２のイオン検出器２３４が取得した測定データを受け付ける。また、制御部３は、相対感度係数、および測定データに基づいて脂質の定量値を算出する。
　表示部４は、たとえば液晶ディスプレイにより構成される。表示部４は、制御部３からのコマンドに従い、イオン検出器２３４が取得した測定データおよび測定データに基づいて算出された脂質の定量値を表示する。
　入力部５は、たとえば、キーボード、マウスなどにより構成される。入力部５は、ユーザからの液体クロマトグラフ１および質量分析部２に対する指示を受け付けて、制御部３へ出力する。表示部４と入力部５とが一体化されたタッチパネルが用いられてもよい。
　図２は、本実施形態にかかるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００の全体構成の機能ブロック図である。図２に示すように、制御部３は、主たる構成要素として、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）３０と、ＲＯＭ（Read　Only　Memory）３１と、ＲＡＭ（Random　Access　Memory）３２と、ＨＤＤ（Hard　Disk　Drive）３３と、通信Ｉ／Ｆ（Interface）３４と、表示Ｉ／Ｆ３５と、入力Ｉ／Ｆ３６と、を有する。各構成要素はデータバスによって相互に接続されている。
　通信Ｉ／Ｆ３４は、液体クロマトグラフ１および質量分析部２を含む外部機器と通信を中継する。通信Ｉ／Ｆ３４は、たとえばネットワークアダプタによって実現される。通信方式は、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）または無線ＬＡＮなどの無線通信であってもよいし、ＵＳＢ（Universal　Serial　Bus）などを利用した有線通信であってもよい。
　表示Ｉ／Ｆ３５は、ＣＰＵ３０と表示部４との間のデータ伝送を中継する。表示Ｉ／Ｆ３５は、ＣＰＵ３０からのコマンドに従って、質量分析部２により得られた測定データおよび測定データに基づいて算出された脂質の定量値を表示するための信号を表示部４へ出力する。
　入力Ｉ／Ｆ３６は、ＣＰＵ３０と入力部５との間のデータ伝送を中継する。入力Ｉ／Ｆ３６は、入力部５の操作により与えられる各種情報、たとえば、相対感度係数、ならびに液体クロマトグラフ１および質量分析部２に対する指令を受け付ける。
　ＲＯＭ３１は、ＣＰＵ３０にて実行されるプログラムを非一時的に格納できる。ＲＡＭ３２は、ＣＰＵ３０におけるプログラムの実行により生成されるデータ、通信Ｉ／Ｆ３４を経由して入力されたデータ、ならびに入力部５を介してユーザから入力された液体クロマトグラフ１および質量分析部２に対する指令を、一時的に格納することができ、一次記憶装置として機能できる。ＨＤＤ３３は、不揮発性の記憶装置であり、相対感度係数を格納できる。制御部３は、ＨＤＤ３３に代えて、またはＨＤＤ３３に加えて、フラッシュメモリなどの半導体記憶装置を有していてもよい。
　［ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析における脂質の選択性］
　一般に生体からの抽出物には、複数の種類の脂質が含まれている。これらの脂質の中には、化学的性質が似ており、分子量が略同じである分子が含まれる。したがって、複数の種類の脂質を含む試料において、単一の種類の脂質を検出することは難しい場合が多い。しかしながら、上述したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００を用いることで、複数の種類の脂質を含む試料から、単一の種類の脂質を検出することが可能である。図１および図３を用いて、複数の種類の脂質を含む試料から単一の種類の脂質をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００によって検出する手順を説明する。図３は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる脂質分析の工程を示すフローチャートである。図３に示す処理のうち、Ｔ１０は、一般的な科学実験および質量分析に用いられる実験装置を用いて分析者の手作業で行なわれる。図３に示す処理のうち、Ｔ１２以降は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００にて行われる。
　検出の対象とする脂質は、グリセロールを連結部として、１本の極性頭部と２本の脂肪酸を有する複合脂質を想定する。図３には、手順の内容をより具体的に説明するために、脂質およびイオンを表す絵が付記されている。脂質６１，６２，６３，６４において、線分はグリセロール骨格を表し、楕円は脂肪酸を表し、菱形は極性頭部を表す。脂質６１，６２，６３，６４は、線分で示されたグリセロール骨格に、２つの楕円で示された２分子の脂肪酸が結合した構造を有する脂質である。楕円の長さは脂肪酸の炭素鎖の長さを表す。すなわち、楕円の長さが異なることは、脂肪酸の種類が異なることを表す。線影が付されている菱形は、線影が付されていない菱形とは異なる種類の極性頭部である。すなわち、脂質６１と脂質６３とでは、極性頭部は同一であるが、結合している脂肪酸が異なるため、脂質として異なる種類となる。また、脂質６１と脂質６４とでは、結合している脂肪酸の種類とその結合位置は同一であるが、極性頭部が異なるため、脂質として異なる種類となる。したがって、脂質６１，６２，６３，６４の各々は脂質としては異なる種類の脂質を示す。
　図３において、ステップＴ１０に示すように、ユーザは複数の種類の脂質を含む試料を用意する。
　ステップＴ１２において、ステップＴ１０で用意した試料を、液体クロマトグラフにより脂質の種類ごとに分離する。具体的には、液体クロマトグラフ１に導入された試料は、ポンプ１１によって送給される移動相とともにカラム１３に導入される。カラム１３において脂質は、固定相および移動層と相互作用をするが、相互作用の度合いが脂質の種類により異なる。当該相互作用により、カラム１３内を移動する速さが決定されるので、脂質の種類によって移動する速さが異なる。したがって、各々の脂質の移動度の違いにより、液体クロマトグラフ１では脂質を種類ごとに分離できる。一方で、移動度が同一もしくは略同じである脂質６１，６２，６３，６４は同時に溶出される。
　ステップＴ１２において脂質６１，６２，６３，６４を含む溶出液は、質量分析部２に導入される。質量分析部２における処理は、図３においてステップＴ１４として示され、また、ステップＴ１６～Ｔ２４として細分化して示される。
　ステップＴ１６において、質量分析部２に導入された脂質６１，６２，６３，６４はイオン化され、それぞれイオン６１１，６２１，６３１，６４１を生成する。生成されたイオンは四重極マスフィルタ２３１に導入される。
　ステップＴ１８において、四重極マスフィルタ２３１に導入されたイオン６１１，６２１，６３１，６４１のうち、イオン６２１のみが選択され後段のコリジョンセル２３２に導入される。当該選択は、メインロッド電極２３１２に印加された電圧により行われる。すなわち、メインロッド電極２３１２には所定の高周波電圧と直流電圧とが重畳された電圧が印加されており、四重極マスフィルタ２３１に送り込まれた各種イオンの中で、メインロッド電極２３１２に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するイオンのみを四重極マスフィルタ２３１は通過させることにより当該選択を行う。四重極マスフィルタ２３１を通過したイオンはプリカーサイオンと称される。
　ステップＴ２０において、四重極マスフィルタ２３１を通過したプリカーサイオンであるイオン６２１はコリジョンセル２３２に導入される。コリジョンセル２３２に配置された電極には所定の電圧が印加されており、コリジョンセル２３２に導入されたイオン６２１は、コリジョンセル２３２内で、電極に印加された電圧に応じた加速度に加速される。また、コリジョンセル２３２内には、所定の圧力でＣＩＤガスが供給される。これにより、加速されたイオン６２１は、所定のコリジョンエネルギでＣＩＤガスに衝突して解離し、イオン６２１１，６２１２，６２１３，６２１４，６２１５が生成される。プリカーサイオンから生成されたイオンは、プロダクトイオンと称される。
　ステップＴ２２において、イオン６２１の解離により生成されたプロダクトイオンであるイオン６２１１，６２１２，６２１３，６２１４，６２１５が四重極マスフィルタ２３３に導入されると、四重極マスフィルタ２３３のメインロッド電極２３３２に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンであるイオン６２１３のみが四重極マスフィルタ２３３を通過する。
　ステップＴ２４において、四重極マスフィルタ２３３を通過したプロダクトイオンであるイオン６２１３をイオン検出器２３４は検出し、図３における処理を終了する。
　上述したＭＳ／ＭＳ分析においては、検出されるイオンは四重極マスフィルタ２３１および四重極マスフィルタ２３３の２段階で選択されている。この選択性が高い分析によって、特定の脂質に由来するイオンを他のイオンと区別して検出することが可能となる。たとえば、図３において、イオン６２１と同一の質量電荷比を有するイオンが他に存在していた場合には、ステップＴ１８においていずれか一方のみを選択して検出することは難しい場合がある。しかしながら、それらのイオンのいずれか一方に特徴的なプロダクトイオンを検出することで同一の質量である２種類の脂質を区別して検出できる。
　［比較例に係るＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた脂質定量方法］
　比較例に係るＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた脂質定量方法では、測定対象の脂質、および定量値が既知の当該脂質に対応する標準物質をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定し、各々の検出強度を比較することによって測定対象の脂質を定量する。標準物質とは、たとえば、測定対象の脂質を構成する原子の一部が所定の同位体で置換されたものである。これは、測定対象の脂質と同一のイオン化効率を有し、分子量が測定対象の脂質とは異なるため質量分析計において区別して検出することができる物質である。したがってＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定において各々の物質のプロダクトイオンから得られた検出強度の比率が、各々の物質の量比と対応するので、測定対象の脂質を定量することができる。
　上述した方法においては、測定対象の脂質の種類ごとに標準物質を準備する必要がある。したがって、ユーザにとって標準物質の準備の負担がかかり、測定のコストが高くなる場合がある。
　また、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって複数種類の脂質を測定し、各々の検出強度を比較することにより、その量的な関係を推定する方法もある。しかしながら、脂質の種類ごとにイオン化効率が異なるため、他の脂質より検出強度が大きい脂質が最も多く試料に含まれるとは限らない。したがって、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって得られた検出強度を単純に比較する方法においては、十分な定量精度が得られない場合がある。
　［実施形態にかかる脂質定量方法］
　そこで、本実施形態にかかる脂質定量方法においては、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにおける各々の脂質のイオン化効率の違いを数値化した相対感度係数を算出し、これを用いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定により得られた検出強度から各々の脂質を定量する。相対感度係数を用いることにより、脂質の種類ごとのイオン化効率の違いが補正されるため、検出強度に基づいた定量の精度を向上させることができる。また、所定の脂質の定量値を基準として、それ以外の脂質を定量することが可能であるため、所定の脂質以外の脂質は、それらに対応する標準物質を用いることなく定量することが可能となる。
　［相対感度係数の算出方法］
　相対感度係数の算出方法について説明する。相対感度係数は、基準となる脂質の感度係数に対する相対的な他の脂質の感度係数である。感度係数は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより得られた検出強度に対するその脂質の定量値である。
　＜１．相対感度係数の算出のための試料の用意＞
　相対感度係数を算出する際には、基準となる第１の脂質を含む試料と、第１の脂質とは異なる種類の脂質を含む試料を用意する。この場合、各試料には単一の種類の脂質が含まれていることが好ましい。なぜならば、単一の種類の脂質が試料に含まれている場合には、複数の種類の脂質が含まれている場合と比較して試料に含まれる脂質の定量精度が向上されるからである。上記の脂質としては、化学合成により生成された脂質であってもよいし、生体から抽出された脂質であってもよい。生体とは、たとえば動物、植物、および菌体である。
　＜２．試料に含まれる脂質の定量＞
　上記の試料に含まれる第１の脂質および第１の脂質とは異なる種類の脂質の定量値を取得する。定量値とは、たとえば、濃度、物質量および重量である。また、脂質が脂肪酸を含む場合には、当該脂質を構成する脂肪酸を定量することによって、脂質の量を測定することを含む。脂質を定量する際に用いる機器は限定されないが、たとえば、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ質量分析計、ガスクロマトグラフィ質量分析、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析計、ガスクロマトグラフィタンデム質量分析計、はかり、および電子はかりの少なくともいずれか１つを用いて行われる。
　＜３．試料に含まれる脂質の検出強度の特定＞
　次に、上記試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより測定し、上記試料に含まれる第１の脂質および第１の脂質とは異なる種類の脂質に由来するクロマトグラムから、各々の脂質の検出強度を求める。検出強度とは、たとえば、ピーク面積およびピーク強度の少なくとも一方である。
　＜４．感度係数の算出＞
　試料に含まれる第１の脂質の定量値に対する検出強度の割合として、第１の脂質の感度係数を算出する。同様にして、第１の脂質とは異なる種類の脂質についても感度係数を算出する。
　＜５．感度係数を用いた相対感度係数の算出＞
　算出された感度係数を、第１の脂質の感度係数が１となるように補正することにより、第１の脂質に対する感度係数を算出することができる。
　相対感度係数の算出方法について、図４を用いて具体的に説明する。図４は、相対感度係数の算出方法を説明するための図である。
　図４においては、基準となる脂質である脂質Ａを含む試料Ａ、脂質Ｂを含む試料Ｂ、脂質Ｃを含む試料Ｃ、および脂質Ｄを含む試料Ｄを試料として想定する。図４の例では、試料Ａに含まれる脂質Ａの定量値は４ｍｏｌ／Ｌ、試料Ｂに含まれる脂質Ｂの定量値は３ｍｏｌ／Ｌ、試料Ｃに含まれる脂質Ｃの定量値は１０ｍｏｌ／Ｌ、試料Ｄに含まれる脂質Ｄの定量値は２ｍｏｌ／Ｌである。
　図４の例では、また、各々の試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析し得られたクロマトグラムから特定されたピーク面積が示されている。試料Ａに含まれる脂質Ａに由来するピーク面積は８、試料Ｂに含まれる脂質Ｂに由来するピーク面積は３、試料Ｃに含まれる脂質Ｃに由来するピーク面積は５、試料Ｄに含まれる脂質Ｄに由来するピーク面積は８である。
　図４には、さらに、各々の試料に含まれる脂質の定量値を得られたピーク面積で除することにより得られる感度係数が示されている。脂質Ａの感度係数は０．５、脂質Ｂの感度係数は１、脂質Ｃの感度係数は２、脂質Ａの感度係数は０．２５と算出される。
　そして、図４には、算出された感度係数を、第１の脂質の感度係数を１となるように補正することによって算出される、第１の脂質に対する感度係数が示されている。すなわち、脂質Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの感度係数はそれぞれ、０．５，１，２，０．２５と算出されたので、各々の感度係数を脂質Ａの感度係数である０．５で除することにより、脂質Ａに対する脂質Ｂ，Ｃ，Ｄの相対感度係数はそれぞれ２，４，０．５と算出される。
　［相対感度係数の算出手順］
　相対感度係数の算出の具体例として、図５および図６を参照して、シロイヌナズナが有する脂質の相対感度係数を算出する手順を説明する。図５は、シロイヌナズナから相対感度係数の算出のために用いる試料を調製する手順のフローチャートである。図６は、調製した試料を用いて相対感度係数の算出する手順のフローチャートである。図５には、図３と同様に、脂質およびイオンを表す絵が付記されている。図５および図６においては、脂質は脂肪酸とグリセロールからなり、そのうちグリセロリン脂質の相対感度係数を算出することを想定する。
　図５における脂質６５，６６，６７，６８は、図３と同様に、グリセロールを連結部として、１本の極性頭部と２本の脂肪酸を有する複合脂質である。また、図５においては線影のない菱形は、リン酸の極性頭部であることを示し、線影のある菱形は、リン酸以外の極性頭部であることを示す。すなわち、リン酸の極性頭部と２つの脂肪酸を有する脂質６６および６８は、グリセロリン脂質に分類される。なお、図５に示す処理は、一般的な科学実験および質量分析に用いられる実験装置を用いて分析者の手作業または、一部自動化された実験装置によって行なわれる。
　図５において、ステップＵ１０に示すように、有機溶媒による抽出によりシロイヌナズナから、脂質６５，６６，６７，６８を含む抽出液を得る。
　ステップＵ１２において、薄層クロマトグラフィにより、脂質の極性頭部の違いにより脂質を分け、グリセロリン脂質である脂質６６および６８を、脂質６５および脂質６７から分離する。
　ステップＵ１４に示すように、薄層クロマトグラフィの固相上で物理的に分離された脂質６６および脂質６８を含むグリセロリン脂質に該当する画分を回収し、溶媒に溶解させる。
　ステップＵ１６に示すように、ステップＵ１４で得た溶解液を液体クロマトグラフにより構成される分取システムによって、脂質６６および脂質６８を構成する脂肪酸組成ごとに分離する。具体的には、分取システムの溶出液を、一定容量ごとに取り分けることにより、ステップＵ１４で得た溶解液を画分７１，７２，７３，７４，７５，７６に分ける。
　ステップＵ１８に示すように、ステップＵ１６で得た画分７１，７２，７３，７４，７５，７６をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析し、各々の画分に脂質が含まれるかどうか確認する。その結果、画分７２には脂質６６が含まれ、画分７５には脂質６８が含まれることが明らかとなる。
　ステップＵ２０に示すように、ステップＵ１８で画分７２および画分７５を濃縮し、得られた濃縮物を再溶解することで、脂質６６を含む試料８１および脂質６８を含む試料８２が得られる。続いて、試料８１および試料８２は、図６におけるステップＶ１０の処理に用いられる。
　以下の処理においては、試料８１および試料８２は、各々並行して同一の処理がなされる。以下においては、脂質６６を含む試料８１の処理を例に説明する。なお、図６に示す処理のうちステップＶ３８以外は、一般的な科学実験および質量分析に用いられる実験装置を用いて分析者の手作業または、一部自動化された実験装置によって行なわれる。図６に示す処理のうち、ステップＶ３８は、制御部３にて行われる。なお、ステップＶ３８に該当する処理については、後述する図８におけるステップＳ１０～Ｓ１８において詳細に説明する。
　図６において、ステップＶ１０で示すように、分取した脂質６６を含む試料８１の溶媒を除去することにより濃縮する。
　ステップＶ１２において、容器に１ｍＬのメタノールを加え、脂質６６を溶解する。
　ステップＶ１４において、ステップＶ１２で得られた溶解液のうち、８００μＬを分取する。
　ステップＶ１６において、ステップＶ１４で分取した溶解液に、脂肪酸測定のための標準品として１ｍＭペンタデカン酸（Ｃ１５：０）溶液を５０μＬ加える。なお、標準品として使用される脂肪酸は、上述した脂肪酸には限られず、脂質６６を構成する脂肪酸以外であれば用いることができる。
　ステップＶ１８において、ステップＶ１６で得られた溶液に、３Ｍ塩酸メタノールを９００μＬ加える。
　ステップＶ２０において、ステップＶ１８で得られた溶液を、８５℃で１時間加熱する。脂質６６を構成する脂肪酸は塩酸とともに加熱されることにより遊離する。さらに遊離した脂肪酸の各々は、脂肪酸メチルエステルとなる。図５において脂質６６は長さの違う２種類の脂肪酸を有していることから、各々の脂肪酸に由来する２種類の脂肪酸メチルエステルが生成される。また、同時にステップＶ１６で加えたペンタデカン酸もメチルエステル化される。なお、脂肪酸をメチルエステル化すると、後述するガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析において、検出ピークのテーリングを抑制し、分析対象物の揮発性を向上させ、ＧＣ分析の感度が向上される。
　ステップＶ２２において、ステップＶ２０で得られた脂質６６およびペンタデカン酸に由来する脂肪酸メチルエステルをヘキサンにより抽出する。
　ステップＶ２４において、ステップＶ２２で抽出された抽出液の溶媒を除去した後に、１００μＬのヘキサンに溶解する。
　ステップＶ２６において、ステップＶ２４で得られた溶解液をＧＣで分析する。ＧＣにより、脂質６６およびペンタデカン酸に由来する脂肪酸メチルエステルを分離することができる。分離された各々の脂肪酸メチルエステルは、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）により検出される。その結果、脂質６６およびペンタデカン酸に由来する脂肪酸メチルエステルに由来するクロマトグラフを得ることができる。
　ステップＶ２８において、試料８１に含まれる脂質６６の脂肪酸のモル濃度が算出される。具体的には、ステップＶ２６で得られた脂質６６に由来する脂肪酸メチルエステルの質量濃度を外部検量線を用いて定量した後、ステップＶ１６で内部標準として加えたペンタデカン酸に由来する脂肪酸メチルエステルの質量濃度で補正することで各々の脂肪酸のモル濃度を算出する。
　ステップＶ３０において、ステップＶ１２で得られた溶解液のうち、１０μＬを分取し乾燥させる。
　ステップＶ３２において、ステップＶ３０で得られた乾燥物を２００μＬの４０％２－プロパノールに溶解する。
　ステップＶ３４において、ステップＶ３２で得られた溶解液から不溶性の沈殿物を除去する。
　ステップＶ３６において、ステップＶ３４で沈殿物を除去した溶解液をＬＣ－ＭＳ／ＭＳに供することで試料８１に含まれる脂質６６に由来するイオンピークの面積を得る。
　ステップＶ３８において、制御部３は、ステップＶ２８で得られた脂肪酸のモル濃度から算出された試料８１に含まれる脂質６６のモル濃度と、ステップＶ３６で得られた試料８１に含まれる脂質に由来するイオンピークの面積を取得し、脂質６６のピーク面積に対するモル濃度を算出する。同様の処理により得られた脂質６８のピーク面積に対するモル濃度を、脂質６６のピーク面積に対するモル濃度で除することで、脂質６６に対する脂質６８の相対感度係数を算出される。その後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置１００は、図６の処理を終了する。
　［相対感度係数を用いた脂質の定量方法］
　次に、相対感度係数を用いて試料に含まれる脂質の定量を行う方法を説明する。当該定量方法では、試料に含まれる脂質のうち、相対感度係数が算出された脂質について、定量することが可能である。なお、試料に含まれる脂質は、化学合成されたものであっても、生体によって合成されたものであっても構わない。生体とは、たとえば、動物、植物、菌類である。また、試料には相対感度係数が算出された脂質以外の脂質が含まれていてもよい。
　当該試料に含まれており、かつ、相対感度係数が算出されている脂質のうち、少なくとも１つの脂質に対応する標準物質を所定量、当該試料と混合する。ここで選択された脂質は、「基準となる脂質」に該当する。これにより当該試料に含まれる基準となる脂質の検出強度と、脂質に混合した所定の量の基準となる脂質に対する標準物質に由来する検出強度の比較により、当該試料に含まれる基準となる脂質を定量することができる。なお、基準となる脂質は１種類に限定されず、複数種類でもよい。検出強度は、たとえば、ピーク面積およびピーク強度である。
　試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定に供し、当該試料に含まれる各々の脂質および上記標準物質に由来するクロマトグラムを得る。得られたクロマトグラムから、各々の脂質および上記標準物質の検出強度をもとめる。
　上記標準物質の検出強度と基準となる脂質の検出強度を比較し、基準となる脂質の定量値を得る。
　各々の脂質の検出強度に対し、対応する相対感度係数を乗ずることにより、試料に含まれる各々の脂質の相対的な量の比が算出される。
　標準物質により定量した基準となる脂質の定量値と、上述した試料に含まれる各々の脂質の相対的な量の比とを乗ずることにより、試料に含まれる各々の脂質の定量値が算出される。
　上述した相対感度係数を用いた脂質の定量方法について、図７を用いて図４で算出した相対感度係数を例に具体的に説明する。図７は、相対感度係数を用いた脂質の定量方法を説明するための図である。
　図７の例では、少なくとも脂質Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄを含むサンプルＸがあると想定する。サンプルＸに脂質Ａの標準物質である脂質Ａ′を１ｍｏｌ／Ｌとなるように混合し、脂質Ａ′が混合されたサンプルＸをＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定に供する。
　図７には、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定で得られたクロマトグラムから、特定されたピーク面積が示されている。脂質Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ａ′の各々のピーク面積は、４，６，１０，４，２である。また、脂質Ａと脂質Ａ′のピーク面積の比較により、サンプルＸにおける脂質Ａの濃度は２ｍｏｌ／Ｌであることが算出できる。
　図７には、サンプルＸに含まれる各々の脂質の相対的な量の比が示されている。得られたピーク面積と、図４で算出した相対感度係数を乗ずることにより、脂質Ａの量に対して脂質Ｂ，Ｃ，Ｄは３倍，１０倍，０．５倍の量がサンプルＸに含まれていることが算出される。
　そして、図７には、サンプルＸに含まれている脂質の定量値が示されている。脂質Ａ′との比較により得られたサンプルＸの脂質Ａの濃度と、脂質Ａに対する脂質Ｂ，Ｃ，Ｄの相対的な量の比から、サンプルＸにおける脂質Ｂ，Ｃ，Ｄの濃度は、６ｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌであると算出される。
　上述した定量方法においては、あらかじめ用意した相対感度係数を算出しておくことで、基準となる脂質（上記の例において脂質Ａ）以外の脂質（上記の例において脂質Ｂ，Ｃ，Ｄ）においては対応する標準物質を使用せずに、試料中の各々の脂質を定量することが可能である。また、上述した定量方法は、ピーク面積を単純に比較する定量方法に比べて、各々の脂質のイオン化効率の違いが補正されているので、より定量の精度を向上させることができる。
　なお、各々の脂質の感度係数をあらかじめ算出しておくことで、その後の測定における試料中の当該脂質の量を検出強度から算出することが可能である。たとえば、図４および図７の脂質Ｂにおいて、図７における脂質Ｂのピーク面積は６であり、図４における脂質Ｂの感度係数は１であることから、図７におけるサンプルＸに脂質Ｂは６ｍｏｌ／Ｌ含まれていると算出することができる。しかしながら、検出強度の絶対値は、質量分析部２の状態（たとえば、プローブ２０１の汚れ具合）に影響されやすく、測定のタイミングによって値が変動しやすい。したがって、感度係数を用いて脂質の定量を行うことは可能であるが、感度係数の作成から時間が経過し、質量分析部２の状態が感度係数の作成時と異なる場合には、定量の精度が十分でない場合がある。
　一方で、相対感度係数は測定のタイミングが異なっていても変動しにくい。したがって、上述した例のように、相対感度係数で脂質間の相対値を算出した後に、当該脂質の少なくとも１つを標準物質により定量して、複数種類の脂質を定量することで、比較例に係る測定方法および感度係数を用いた測定方法に比べて、定量の精度を向上させることができる。
　相対感度係数は、測定条件を一定にすることで変動が少ない値であるため、測定条件（たとえば、使用する溶媒、カラム、およびイオン化方法）を同一にすることで、作成したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置とは、別のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置においても使用し得る。
　［処理の流れ］
　図８は、相対感度係数を用いて試料に含まれる脂質の量を測定するために実施される処理の一例のフローチャートを示す図である。一実現例では、図８の処理は、制御部３のＣＰＵ３０が所与のプログラムを実行した場合に、メインルーチンから呼び出されて実行される。なお、第１の試料および第２の試料は、相対感度係数の算出に用いられる試料であり、第３の試料は、相対感度係数を用いた脂質の定量の対象となる試料である。また、第１の脂質は、上述した基準となる脂質に該当する。
　ステップＳ１０にて、所定の定量方法により得られた第１の脂質が含まれる第１の試料における第１の脂質の定量値をＣＰＵ３０は受け付ける。所定の方法とは、たとえば、ガスクロマトグラフィにより第１の試料を分離した後に、第１の脂質に由来する脂肪酸を水素炎イオン化検出器により測定し、第１の脂質を定量する方法である。
　ステップＳ１２にて、所定の定量方法により得られた第２の脂質が含まれる第２の試料における第２の脂質の定量値をＣＰＵ３０は受け付ける。所定の方法とは、たとえば、ガスクロマトグラフィにより第２の試料を分離した後に、第２の脂質に由来する脂肪酸を水素炎イオン化検出器により測定し、第２の脂質を定量する方法である。
　ステップＳ１４にて、ＣＰＵ３０はインジェクタ１２により液体クロマトグラフ１に導入された第１の試料中の第１の脂質に由来するクロマトグラムをイオン検出器２３４から受け付け、第１の試料の第１の脂質の検出強度を求める。
　ステップＳ１６にて、ＣＰＵ３０はインジェクタ１２により液体クロマトグラフ１に導入された第２の試料中の第２の脂質に由来するクロマトグラムをイオン検出器２３４から受け付け、第２の試料の第２の脂質の検出強度を求める。
　ステップＳ１８にて、ＣＰＵ３０はステップＳ１０で受け付けた第１の試料に含まれる第１の脂質の量、ステップＳ１２で受け付けた第２の試料に含まれる第２の脂質の量、ステップＳ１４で求めた第１の試料に含まれる第１の脂質に由来する検出強度、およびステップＳ１６で求めた第２の試料に含まれる第２の脂質に由来する検出強度を用いて、第１の脂質に対する第２の脂質の相対感度係数を算出する。算出された第１の脂質に対する第２の脂質の相対感度係数は、ＨＤＤ３３に格納される。
　ステップＳ２０にて、ＣＰＵ３０は第１の脂質の標準物質が混合された第３の試料の第１の脂質および当該標準物質に由来する検出強度から、第３の試料に含まれる第１の脂質の定量値を算出する。
　ステップＳ２２にて、ＣＰＵ３０はインジェクタ１２により液体クロマトグラフ１に導入された第３の試料の第１の脂質および第２の脂質に由来するクロマトグラムから、各々の検出強度を求める。
　ステップＳ２４にて、ＣＰＵ３０はステップＳ１８にて算出した第１の脂質に対する第２の脂質の相対感度係数、ステップＳ２０にて算出した第３の試料に含まれる第１の脂質の定量値、ステップＳ２２にて求めた第３の試料の第１の脂質および第２の脂質の各々の検出強度から、第３の試料に含まれる第２の脂質の定量値を算出する。その後ＣＰＵ３０は、脂質定量サブルーチンを終了し、処理をメインルーチンに戻す。
　なお、一度算出された相対感度係数を用いて、試料に含まれる脂質の量を定量する場合には、ステップＳ２０の処理から開始される。
　また、上述した例では第３の試料に含まれる第１の脂質の量を標準物質により測定しているが、第２の脂質の量を第２の脂質に対応する標準物質を用いて測定して、第１の脂質の量を相対感度係数により求めてもよい。
　本開示に係る相対感度係数を用いた脂質の定量方法によっては、脂質の種類によるイオン化効率の違いが補正されるため、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより得られた検出感度を用いた定量の精度を向上させることができる。
　さらに、本開示に係る相対感度係数を用いた脂質の定量方法によっては、標準物質を測定対象の脂質すべてに対して用意する必要がないので、測定にかかるコストを抑制することができる。
　たとえば、所定の生物が産生する脂質を測定する場合には、当該生物を用いて相対感度係数を算出することで、当該生物に含まれる脂質について過不足なく相対感度係数を作成することができる。また、たとえば測定対象の脂質の標準物質を入手することが困難であっても、本開示による相対感度係数を用いた測定方法を用いることにより、当該標準物質を使用せずに、当該脂質を定量することが可能である。
　［態様］
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
　（第１項）　一態様における算出方法は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置における第１の脂質に対する第１の脂質とは異なる種類の第２の脂質の相対感度係数の算出方法であって、前記第１の脂質を含む第１の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値を取得するステップと、前記第２の脂質を含む第２の試料に含まれる前記第２の脂質の定量値を取得するステップと、前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第１の試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記第１の脂質の検出強度を求めるステップと、前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第２の試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記第２の脂質の検出強度を求めるステップと、前記第１の脂質の定量値、前記第２の脂質の定量値、前記第１の脂質の検出強度、および前記第２の脂質の検出強度から、前記第１の脂質に対する前記第２の脂質の相対感度係数を算出するステップと、を含んでいてもよい。
　第１項に記載の算出方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類の脂質の測定において、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第２項）　第１項に記載の算出方法において、前記第１の脂質および前記第２の脂質の各々は、グリセロ脂質であってもよい。
　第２項に記載の算出方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類のグリセロ脂質の測定において、基準となるグリセロ脂質以外のグリセロ脂質の標準物質を使用せずに、グリセロ脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第３項）　第２項に記載の算出方法において、前記定量値は、前記グリセロ脂質を構成する脂肪酸をガスクロマトグラフィにより分離し、水素炎イオン化検出器により前記脂肪酸を定量することで得られる前記グリセロ脂質の定量値であってよい。
　第３項に記載の算出方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類のグリセロ脂質の測定において、グリセロ脂質を構成する脂肪酸をガスクロマトグラフィにより分離し、水素炎イオン化検出器によりその脂肪酸を定量することで得られたグリセロ脂質の定量値を用いて、基準となるグリセロ脂質以外のグリセロ脂質の標準物質を使用せずに、グリセロ脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第４項）　第１項～第３項のいずれか１項に記載の算出方法において、前記第１の脂質および前記第２の脂質の各々の定量値は、濃度、物質量および重量のうち少なくとも１つを含んでよい。
　第４項に記載の算出方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類の脂質の測定において、濃度、物質量および重量のうち少なくとも１つを定量値として用いて、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第５項）　第１項～第４項のいずれか１項に記載の算出方法において、前記検出強度は、前記クロマトグラムから算出されるピーク強度およびピーク面積の少なくとも１つに基づいて算出されてもよい。
　第５項に記載の算出方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類の脂質の測定において、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定により得られたクロマトグラムから算出されるピーク強度およびピーク面積の少なくとも１つに基づいて算出された検出強度を用いて、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第６項）　第１項～第５項のいずれか１項に記載の算出方法において、前記第１の試料および前記第２の試料の各々は、植物、藻類、および動物のうち少なくとも１つから抽出されたものであってよい。
　第６項に記載の算出方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類の脂質の測定において、植物、藻類、および動物のうち少なくとも１つから抽出された試料を用いて、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第７項）　一態様におけるプログラムは、コンピュータに搭載されるプロセッサにより実行されるプログラムであって、前記コンピュータに第１項～第６項に記載のいずれか１項に記載の算出方法を実行させてもよい。
　第７項に記載のプログラムによれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類の脂質の測定において、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第８項）　一態様における算出方法は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置における脂質の感度係数の算出方法であって、前記脂質を含む試料に含まれる前記脂質の定量値を取得するステップと、前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記試料に含まれる前記脂質を測定し、得られたクロマトグラムから前記試料に含まれる前記脂質に由来する検出強度を求めるステップと、前記定量値および前記検出強度から、前記脂質の前記感度係数を求めるステップと、を含んでいてもよい。
　第８項に記載の算出方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる脂質の測定において、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質を定量するための技術が提供される。
　（第９項）　一態様における定量方法は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置において第１の脂質を含む第１の試料と前記第１の脂質とは異なる種類の第２の脂質を含む第２の試料を用いて算出された相対感度係数により前記第１の脂質および前記第２の脂質を含む第３の試料における前記第２の脂質の定量方法であって、前記第１の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値を取得するステップと、前記第２の試料に含まれる前記第２の脂質の定量値を取得するステップと、前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第１の試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記第１の脂質の検出強度を求めるステップと、前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第２の試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記第２の脂質の検出強度を求めるステップと、前記第１の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値、前記第２の試料に含まれる前記第２の脂質の定量値、前記第１の試料に含まれる前記第１の脂質の検出強度、および前記第２の試料に含まれる前記第２の脂質の検出強度から、前記第１の脂質に対する前記第２の脂質の相対感度係数を算出するステップと、前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第３の試料を測定し、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質および前記第２の脂質の各々の検出強度を求めるステップと、前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第１の脂質の標準物質を用いて、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値を測定するステップと、前記相対感度係数、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質および前記第２の脂質の各々の検出強度、ならびに前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質の前記定量値、を用いて前記第３の試料に含まれる前記第２の脂質を定量するステップと、を含んでいてもよい。
　第９項に記載の定量方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる複数の種類の脂質の測定において、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第１０項）　第９項に記載の定量方法において、前記第３の試料は、植物、藻類、および動物のうち少なくとも１つから抽出されたものであってよい。
　第１０項に記載の定量方法によれば、植物、藻類、および動物のうち少なくとも１つから抽出された脂質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定において、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　（第１１項）　一態様におけるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置は、前記第１の脂質および前記第２の脂質を含む第３の試料における前記第２の脂質を定量するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置であって、液体クロマトグラフ装置と、前記液体クロマトグラフ装置で分離された成分を分析する質量分析部と、前記質量分析部から測定データを受け付けるデータ処理部と、を備え、前記質量分析部は、前記第３の試料を測定することによって前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質および前記第２の脂質の検出強度を求め、前記第１の脂質の標準物質を用いて、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値を測定し、前記データ処理部は、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質および前記第２の脂質の検出強度、前記定量値、ならびに第１項に記載された算出方法によって算出された相対感度係数を用いて前記第３の試料に含まれる前記第２の脂質の定量値を算出してもよい。
　第１１項に記載のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる脂質の測定において、基準となる脂質以外の脂質の標準物質を使用せずに、脂質の定量精度を向上させるための技術が提供される。
　今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本開示の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。また、実施の形態中の各技術は、単独でも、また、必要に応じて実施の形態中の他の技術と可能な限り組み合わされても、実施され得ることが意図される。
　１　液体クロマトグラフ、２　質量分析部、３　制御部、４　表示部、５　入力部、１０　移動相容器、１１　ポンプ、１２　インジェクタ、１３　カラム、２０　イオン化室、２１　第１中間室、２２　第２中間室、２３　分析室、３０　ＣＰＵ、３１　ＲＯＭ、３２　ＲＡＭ、３３　ＨＤＤ、３４　通信Ｉ／Ｆ、３５　表示Ｉ／Ｆ、３６　入力Ｉ／Ｆ、１００　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置、２０１　プローブ、２０２　キャピラリ、２１１，２２１，２３２１　イオンガイド、２１２　スキマー、２３１，２３３　四重極マスフィルタ、２３２　コリジョンセル、２３４　イオン検出器、２３１１，２３３１　プリロッド電極、２３１２，２３３２　メインロッド電極。

Claims (11)

  1. 　高速液体クロマトグラフタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）装置における第１の脂質に対する第１の脂質とは異なる種類の第２の脂質の相対感度係数の算出方法であって、
    　前記第１の脂質を含む第１の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値を取得するステップと、
    　前記第２の脂質を含む第２の試料に含まれる前記第２の脂質の定量値を取得するステップと、
    　前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第１の試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記第１の脂質の検出強度を求めるステップと、
    　前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第２の試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記第２の脂質の検出強度を求めるステップと、
    　前記第１の脂質の定量値、前記第２の脂質の定量値、前記第１の脂質の検出強度、および前記第２の脂質の検出強度から、前記第１の脂質に対する前記第２の脂質の相対感度係数を算出するステップと、を含む相対感度係数の算出方法。
  2. 　前記第１の脂質および前記第２の脂質の各々は、グリセロ脂質である、請求項１に記載の算出方法。
  3. 　前記定量値は、前記グリセロ脂質を構成する脂肪酸をガスクロマトグラフィにより分離し、水素炎イオン化検出器により前記脂肪酸を定量することで得られる前記グリセロ脂質の定量値である、請求項２に記載の算出方法。
  4. 　前記第１の脂質および前記第２の脂質の各々の定量値は、濃度、物質量および重量のうち少なくとも１つを含む、請求項１または請求項２に記載の算出方法。
  5. 　前記検出強度は、前記クロマトグラムから算出されるピーク強度およびピーク面積の少なくとも１つに基づいて算出される、請求項１または請求項２に記載の算出方法。
  6. 　前記第１の試料および前記第２の試料の各々は、植物、藻類、および動物のうち少なくとも１つから抽出されたものである、請求項１または請求項２に記載の算出方法。
  7. 　コンピュータに搭載されるプロセッサにより実行されるプログラムであって、前記コンピュータに請求項１または請求項２に記載の算出方法を実行させる、プログラム。
  8. 　高速液体クロマトグラフタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）装置における脂質の感度係数の算出方法であって、
    　前記脂質を含む試料に含まれる前記脂質の定量値を取得するステップと、
    　前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記試料に含まれる前記脂質に由来する検出強度を求めるステップと、
    　前記定量値および前記検出強度から、前記脂質の前記感度係数を求めるステップと、を含む感度係数の算出方法。
  9. 　高速液体クロマトグラフタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）装置において第１の脂質を含む第１の試料と前記第１の脂質とは異なる種類の第２の脂質を含む第２の試料を用いて算出された相対感度係数により前記第１の脂質および前記第２の脂質を含む第３の試料における前記第２の脂質の定量方法であって、
    　前記第１の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値を取得するステップと、
    　前記第２の試料に含まれる前記第２の脂質の定量値を取得するステップと、
    　前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第１の試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記第１の脂質の検出強度を求めるステップと、
    　前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第２の試料を測定し、得られたクロマトグラムから前記第２の脂質の検出強度を求めるステップと、
    　前記第１の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値、前記第２の試料に含まれる前記第２の脂質の定量値、前記第１の試料に含まれる前記第１の脂質の検出強度、および前記第２の試料に含まれる前記第２の脂質の検出強度から、前記第１の脂質に対する前記第２の脂質の相対感度係数を算出するステップと、
    　前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第３の試料を測定し、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質および前記第２の脂質の各々の検出強度を求めるステップと、
    　前記ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって前記第１の脂質の標準物質を用いて、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値を測定するステップと、
    　前記相対感度係数、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質および前記第２の脂質の各々の検出強度、ならびに前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質の前記定量値、を用いて前記第３の試料に含まれる前記第２の脂質を定量するステップと、を含む定量方法。
  10. 　前記第３の試料は、植物、藻類、および動物のうち少なくとも１つから抽出されたものである、請求項９に記載の定量方法。
  11. 　前記第１の脂質および前記第２の脂質を含む第３の試料における前記第２の脂質を定量するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置であって、
    　液体クロマトグラフ装置と、
    　前記液体クロマトグラフ装置で分離された成分を分析する質量分析部と、
    　前記質量分析部から測定データを受け付けるデータ処理部と、を備え、
    　前記質量分析部は、
    　　前記第３の試料を測定することによって前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質および前記第２の脂質の検出強度を求め、
    　　前記第１の脂質の標準物質を用いて、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質の定量値を測定し、
    　前記データ処理部は、前記第３の試料に含まれる前記第１の脂質および前記第２の脂質の検出強度、前記定量値、ならびに請求項１に記載された算出方法によって算出された相対感度係数を用いて前記第３の試料に含まれる前記第２の脂質の定量値を算出する、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置。
PCT/JP2024/028378 2023-08-29 2024-08-08 算出方法、プログラム、定量方法、および高速液体クロマトグラフタンデム質量分析装置 Pending WO2025047369A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023139193 2023-08-29
JP2023-139193 2023-08-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025047369A1 true WO2025047369A1 (ja) 2025-03-06

Family

ID=94819123

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/028378 Pending WO2025047369A1 (ja) 2023-08-29 2024-08-08 算出方法、プログラム、定量方法、および高速液体クロマトグラフタンデム質量分析装置

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025047369A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090134323A1 (en) * 2002-06-26 2009-05-28 Gross Richard W Multidimensional mass spectrometry of serum and cellular lipids directly from biologic extracts
JP2017187469A (ja) * 2016-03-30 2017-10-12 花王株式会社 皮膚の健康の評価方法
JP2021119345A (ja) * 2014-10-30 2021-08-12 ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン 標識化グリコシルアミンの迅速調製およびそれを生成するグリコシル化生体分子の分析方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090134323A1 (en) * 2002-06-26 2009-05-28 Gross Richard W Multidimensional mass spectrometry of serum and cellular lipids directly from biologic extracts
JP2021119345A (ja) * 2014-10-30 2021-08-12 ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン 標識化グリコシルアミンの迅速調製およびそれを生成するグリコシル化生体分子の分析方法
JP2017187469A (ja) * 2016-03-30 2017-10-12 花王株式会社 皮膚の健康の評価方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry—What, how and why?
Rajski et al. Large pesticide multiresidue screening method by liquid chromatography-Orbitrap mass spectrometry in full scan mode applied to fruit and vegetables
Cajka et al. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry
JP7285218B2 (ja) 有機酸代謝物を検出かつ定量する質量分析法
Peng et al. Liquid–liquid extraction combined with differential isotope dimethylaminophenacyl labeling for improved metabolomic profiling of organic acids
JP2022517161A (ja) マイクロバイオータ関連代謝物の検出および定量のための質量分析検定法
CN110088615A (zh) 用于肾功能代谢物的检测和定量的质谱法测定方法
Rebane et al. Development of amino acid derivatization reagents for liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometric analysis and ionization efficiency measurements
Liu et al. Rapidly detecting tetrabromobisphenol A in soils and sediments by paper spray ionization mass spectrometry combined with isotopic internal standard
WO2007008307A2 (en) Data correction, normalization and validation for quantitative high-throughput metabolomic profiling
CN112730710B (zh) 通过引入系列不同同位素标签用于快速实时定量样品中目标分析物的检测方法
CN110494954A (zh) 脂质和生育酚的综合和定量分析
Pietrogrande et al. Enantiomeric resolution of biomarkers in space analysis: Chemical derivatization and signal processing for gas chromatography–mass spectrometry analysis of chiral amino acids
JP2007108060A (ja) 肌質の評価方法
WO2025047369A1 (ja) 算出方法、プログラム、定量方法、および高速液体クロマトグラフタンデム質量分析装置
Jayasinghe et al. Quantification of sugars and organic acids in biological matrices using GC-QqQ-MS
CN113092601B (zh) 一种化妆品中倍他米松17-丙酸酯及倍他米松21-丙酸酯的检测方法
CN107422053B (zh) 一种液质联用检测化妆品中三氯乙酸的方法
CN112326853B (zh) 一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法
Guo et al. Combined use of analyte protectants and precolumn backflushing for a robust, high-throughput quantitative determination of aroma compounds in cigarette mainstream smoke by gas chromatography-tandem mass spectrometry
de Bar et al. Development and comparison of chromatographic methods for the analysis of long chain diols and alkenones in biological materials and sediment
Ratnasekhar et al. Analytical platforms in metabolomics of health and disease
Li et al. Establishment of a novel large-scale targeted metabolomics method based on NFSWI-DDA mode utilizing HRMS and TQ-MS
Feng et al. Development of a quantitative structure-response relationships to estimate concentrations of plasticizer metabolites in urine without reference standards using non-targeted analysis with liquid chromatography high-resolution mass spectrometry
Sandra et al. The art and practice of lipidomics

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24859409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1