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WO2024232421A1 - 可溶性ｆｌｔ－１に選択的に結合するｄｎａアプタマーおよびそのｄｎａアプタマーが固定化された担体 - Google Patents

可溶性ｆｌｔ－１に選択的に結合するｄｎａアプタマーおよびそのｄｎａアプタマーが固定化された担体 Download PDF

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WO2024232421A1
WO2024232421A1 PCT/JP2024/017306 JP2024017306W WO2024232421A1 WO 2024232421 A1 WO2024232421 A1 WO 2024232421A1 JP 2024017306 W JP2024017306 W JP 2024017306W WO 2024232421 A1 WO2024232421 A1 WO 2024232421A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sflt
dna aptamer
base
dna
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/017306
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健介 尾張
和伸 二見
高行 入山
悠 有吉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Tagcyx Biotechnologies Inc
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Tagcyx Biotechnologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC, Tagcyx Biotechnologies Inc filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to CN202480031966.3A priority Critical patent/CN121175423A/zh
Publication of WO2024232421A1 publication Critical patent/WO2024232421A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers

Definitions

  • the present invention relates to a DNA aptamer that binds to soluble FLT-1 (sFLT-1) and its uses.
  • DNA aptamers are ligand recognition molecules that are expected to have a wide range of applications as nucleic acid drugs.
  • complementary sequences within a DNA oligonucleotide molecule form complementary strands, causing the single-stranded DNA oligonucleotide to form secondary and tertiary structures, and this three-dimensional structure allows it to bind specifically and strongly to target molecules.
  • Preeclampsia is a disease that occurs in approximately one in 20 pregnant women and causes severe complications for the mother and fetus.
  • One of the causes of preeclampsia is an increase in the amount of soluble FLT-1 (soluble fms-like tyrosine kinase-1: hereafter referred to as "sFLT-1") in the blood.
  • sFLT-1 also known as "sVEGFR1
  • sVEGFR1 is a soluble form of VEGFR1 that binds to VEGF (vascular endothelial growth factor) and PLGF (placenta growth factor) in the blood, thereby inhibiting signals from their receptors, VEGFR1.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PLGF placenta growth factor
  • Non-Patent Document 1 Patent Document 1
  • Patent Document 2 Another example of non-specific removal of sFLT-1 is the removal of sFLT-1 by simple plasma exchange (Non-Patent Document 2).
  • sFLT-1 and dextran sulfate bind based on simple electrostatic interactions, and therefore the binding lacks specificity. For this reason, even useful components in the blood may be mistakenly removed due to electrostatic interactions.
  • components other than sFLT-1 may be adsorbed to dextran sulfate, saturating the binding surface on the dextran sulfate, reducing the efficiency of sFLT-1 removal, and so nonspecific removal of sFLT-1 is an issue when attempting removal using a dextran sulfate apheresis column.
  • the sFLT-1 removal method using simple plasma exchange requires supplementation of blood products associated with plasma exchange, and such supplementation may pose a risk of infection.
  • the present invention was made in consideration of these circumstances, and aims to provide a DNA aptamer and a carrier with an immobilized DNA aptamer as an sFLT-1 removal device that can more efficiently and specifically remove sFLT-1 from blood, is inexpensive, has uniform quality, and can be used more safely.
  • the DNA aptamer that selectively binds to sFLT-1 according to the present invention and the carrier on which the DNA aptamer is immobilized employ the following means.
  • the first aspect of the present invention provides a DNA aptamer that selectively binds to sFLT-1, which has a base sequence containing two artificial bases 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]-pyridin-3-yl (Ds), contains 13 to 18 bases between the two Ds, and at least one of the two Ds is located within a sequence that forms a single strand when a tertiary structure is formed.
  • Ds 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]-pyridin-3-yl
  • the DNA aptamer may have a base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 9.
  • the DNA aptamer may have the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3 or 4.
  • the DNA aptamer may be (a) a base sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 2 and 5 to 9, or (b) any sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 2 and 5 to 9, in which a base sequence having 3 to 7 bases linked to the 5' side of the Ds located on the 5' side of the two Ds and a base sequence having 3 to 7 bases counting from the 10th base from the Ds linked to the 3' side of the Ds located on the 3' side of the two Ds form a base pair.
  • the DNA aptamer has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 8.
  • the base X in the base sequence of SEQ ID NO: 6 or 7 is an artificially produced base, and the artificially produced base may be modified with a linker, a medium molecular weight compound, a polymeric compound, a biopolymer, or a polymer having affinity for a biopolymer.
  • the second aspect of the present invention provides a carrier on which the DNA aptamer according to the first aspect is immobilized, for use in an apheresis process.
  • the subject of the apheresis treatment using the carrier may be sFLT-1 positive blood.
  • the disease to which the apheresis treatment using the carrier is applied may be selected from the group consisting of preeclampsia, exudative age-related macular degeneration, central retinal vein occlusion, branch retinal vein occlusion, diabetic macular edema, choroidal neovascularization, malignant tumors, and Duchenne muscular dystrophy.
  • the third aspect of the present invention provides an sFLT-1 removal material that contains the DNA aptamer according to the first aspect.
  • the fourth aspect of the present invention provides an sFLT-1 removal kit that includes the DNA aptamer according to the first aspect.
  • the fifth aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the DNA aptamer according to the first aspect.
  • the pharmaceutical composition may be for the treatment and/or prevention of a disease selected from the group consisting of preeclampsia, exudative age-related macular degeneration, central retinal vein occlusion, branch retinal vein occlusion, diabetic macular edema, choroidal neovascularization, malignant tumors, and Duchenne muscular dystrophy.
  • a disease selected from the group consisting of preeclampsia, exudative age-related macular degeneration, central retinal vein occlusion, branch retinal vein occlusion, diabetic macular edema, choroidal neovascularization, malignant tumors, and Duchenne muscular dystrophy.
  • the DNA aptamer of the present invention that selectively binds to sFLT-1 binds specifically and strongly to sFLT-1. This makes it possible to more efficiently and specifically remove sFLT-1 from the blood.
  • the DNA aptamer of the present invention that selectively binds to sFLT-1 can be synthesized by chemical methods. Therefore, compared to synthesis methods using biological techniques, DNA aptamers with uniform quality can be provided at a lower cost.
  • DNA aptamer of the present invention that selectively binds to sFLT-1 can provide a carrier for separating sFLT-1 that is cheaper and safer to use.
  • FIG. 1 shows the results of binding ability screening by ELOSA for DNA aptamer candidates in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 shows the results of ELOSA binding ability screening of DNA aptamer candidates having modified sequences in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 shows the results of ELOSA binding screening of modified DNA sequences in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 shows the predicted secondary structures of the sequences obtained as a result of binding ability screening of modified DNA sequences.
  • FIG. 1 shows the secondary structures and variable bases of sequences obtained as a result of a second selection of modified DNA sequences.
  • FIG. 1 shows the results of a binding analysis of a DNA aptamer according to one embodiment of the present invention, using a C6 linker as a biotin linker, to sFLT-1 by surface plasmon resonance (SPR).
  • FIG. 1 shows the results of a binding analysis of a DNA aptamer according to one embodiment of the present invention, using a TEG linker as a biotin linker, to sFLT-1 by surface plasmon resonance (SPR).
  • FIG. 1 shows the results of stability analysis of the obtained aptamer candidates in human plasma.
  • FIG. 1 shows the results of an experiment confirming the ability of DNA aptamer-immobilized Sepharose according to one embodiment of the present invention to remove recombinant sFLT-1.
  • FIG. 1 shows the results of an experiment confirming the ability of DNA aptamer-immobilized Sepharose according to one embodiment of the present invention to remove sFLT-1 from the serum of preeclampsia patients.
  • DNA aptamers have the following advantages: (1) they are obtained by chemical synthesis, so there is a low risk of biological contamination; (2) they are generally low in antigenicity; (3) because they are DNA, they are sufficiently stable at room temperature under near-neutral conditions free of nucleic acid degrading enzymes (nucleases); and (4) they have almost no inhibitory activity against cytochrome P450, a drug metabolizing enzyme, so they do not affect concomitant drugs, and so their usefulness is expected. DNA aptamers also do not pose the problem of the production of antibodies against antibody drugs, which is one of the issues that arise when long-term treatment using antibodies is required, so they are molecules that are expected to be able to be administered over a long period of time.
  • a DNA aptamer is a ligand molecule in which complementary sequences in a DNA oligonucleotide molecule form complementary strands, causing a single-stranded DNA oligonucleotide to form a secondary or tertiary structure, and the three-dimensional structure allows specific and strong binding to a target molecule.
  • DNA aptamers have attracted attention as molecules that can inhibit, suppress, or enhance the activity of a target molecule, or selectively detect or extract a target molecule, by binding a DNA aptamer with a specific sequence.
  • DNA aptamers have a smaller molecular weight than antibodies, approximately 1/10 or less, they have high affinity and high target selectivity equivalent to antibodies. For this reason, a selective binding material to sFLT-1 that utilizes the properties of DNA aptamers can minimize the occurrence of side effects due to off-targets.
  • DNA aptamers can be produced by chemical synthesis, they are considered to be a suitable modality for solving the manufacturing issues associated with antibodies that may have similar target specificity and other functions.
  • target molecule refers to a substance that can be a binding target of a DNA aptamer
  • sFLT-1 is the target molecule.
  • "selectively binds to sFLT-1” includes that the DNA aptamer according to the present embodiment specifically and strongly binds to a target substance.
  • the DNA aptamer can be expressed by the value of the dissociation constant KD as an example of an index showing that the DNA aptamer "selectively binds to sFLT-1".
  • the dissociation constant KD of the DNA aptamer that selectively binds to sFLT-1 of the present invention is 1-digit nM or less, which is the KD value of a general antibody.
  • KD refers to a dissociation constant expressed by k off (dissociation rate)/k on (binding rate). The smaller the KD value, the stronger the affinity to the target molecule, and the smaller the k off value, the more difficult it is to dissociate after binding to the target molecule.
  • the inventors obtained multiple candidate DNA aptamer sequences that bind to sFLT-1 by the SELEX method using a DNA library containing the artificial base 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]-pyridin-3-yl (hereinafter also referred to as "Ds"). From these candidate sequences, they selected sequences using the binding strength to sFLT-1 as an index in the ELOSA system, and confirmed the binding ability and blood stability of the selected sequences by shortening them and adding mini-hairpin sequences, thereby identifying anti-sFLT-1 aptamer sequences.
  • Ds artificial base 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]-pyridin-3-yl
  • Sepharose beads to which this DNA aptamer was immobilized, they investigated the effect of removing sFLT-1 from inactivated FBS spiked with recombinant sFLT-1 in an amount equivalent to the amount of sFLT-1 in the blood of patients with preeclampsia. It was revealed that sFLT-1 could be removed in an sFLT-1 aptamer-dependent manner, which led to the completion of the present invention. A treatment for preeclampsia using sFLT-1 aptamers has not yet been established.
  • the DNA aptamer disclosed herein can provide an sFLT-1 removal device aimed at treating diseases involving sFLT-1, including preeclampsia. Furthermore, when the DNA aptamer disclosed herein is administered into the body, it may be applicable as a treatment for various diseases caused by signals from VEGFR1, which corresponds to the membrane-bound form of sFLT-1.
  • sFLT-1 As for sFLT-1, a comparison was made between the removal method using the DNA aptamer according to the present disclosure and the sFLT-1 specific removal (antibody) method described in Patent Document 2.
  • Example 1 of Patent Document 2 a column containing 0.1 ml of agarose beads to which 500 ⁇ g of anti-sFLT-1 antibody was immobilized was used to perform an experiment to remove sFLT-1 from 1 ml of amniotic fluid sample from a patient with preeclampsia containing 40 ng of sFLT-1. According to the results of Example 1 of Patent Document 2, the sFLT-1 removal rate after passing through the column three times was confirmed, and the most efficient antibody species (antibody 103) showed a removal rate of 87%.
  • Example 3 of Patent Document 2 an experiment using antibody species AG10B showed a removal rate of 98% from horse serum spiked with 40 ng of sFLT-1 as the best result.
  • the experimental conditions are different from the removal experiment using the sFLT-1 aptamer shown in Example 8 of this embodiment, and the performance cannot be simply compared.
  • the disruption of the sFLT-1/PLGF balance due to excessive removal of sFLT-1 has adverse effects such as arteriosclerosis.
  • aptamers are suitable as adsorbents for use in apheresis.
  • one of the performance properties of aptamers is low placental permeability, so it is considered that the use of aptamers is preferable in terms of use in pregnant women.
  • a "natural base” refers to a nucleic acid base contained in a nucleotide that exists in nature, and is any one of adenine, guanine, cytosine, and thymine.
  • an "artificially produced base” or “artificial base” refers to a nucleic acid base that does not exist in nature and is produced by an artificial method.
  • 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]-pyridin-3-yl (hereinafter referred to as "Ds") contained in the sequence of the DNA aptamer according to this embodiment is an example of an artificial base.
  • mini-hairpin sequence refers to a base sequence consisting of 7 to 14 bases that can increase the resistance to degradation by nucleases or increase the thermal stability of a DNA aptamer by increasing the Tm value of the DNA aptamer to which the mini-hairpin sequence is attached (see, e.g., International Publication No. WO 2016/143700).
  • the DNA aptamer according to this embodiment is an oligonucleotide having a base sequence that contains the artificial base 7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]-pyridin-3-yl (Ds) at two positions, and is a molecule that selectively binds to sFLT-1.
  • a DNA oligonucleotide having the base sequence shown in Table 1 can be used as the sFLT-1-binding DNA aptamer.
  • All of the base sequences listed in Table 1 contain a sequence of 13 to 18 bases between the two Ds.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 2 and 5 to 7, which include "FLT7" in the aptamer name, contain a sequence of 13 bases common to the two Ds.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 2, 5, and 6 all have three common bases on the 5' side of the 13 bases and 12 common bases on the 3' side, resulting in a common sequence of 30 bases in total.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 1 and 4, which include "FLT5" in the aptamer name contain a sequence of 18 bases common to the two Ds.
  • at least one of the two Ds is located within a sequence that forms a single strand when the tertiary structure is formed.
  • Base X is any unnatural base or artificially produced base, or represents an artificially produced base to which a linker, a low molecular weight compound, a peptide, an oligonucleic acid, an oligosaccharide, a protein or other high molecular weight compound (biopolymer) used in living organisms or a biocompatible polymer is bound.
  • “unnatural base” refers to a nucleic acid base that has a structure different from that of natural bases that exist in nature.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 6 to 8 have a mini-hairpin sequence consisting of 9 bases at the 3' end.
  • base X is located within the mini-hairpin sequence.
  • the functional molecules such as the low molecular weight compounds and biopolymers mentioned above, are bound to base X located within the mini-hairpin via a linker, so that when the DNA aptamer forms a tertiary structure, various functional molecules can be introduced without interfering with the site that has binding activity to the target substance.
  • the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 and 5 to 9 may be as shown in Table 1.
  • a base sequence having 3 to 7 bases linked to the 5' side of the Ds located on the 5' side of the two Ds and a base sequence having 3 to 7 bases counting from the 10th base from the Ds linked to the 3' side of the Ds located on the 3' side of the two Ds may be any sequence in which they form a base pair.
  • CCCCC linked to the 5' side of the Ds located on the 5' side of the two Ds and GGGGG, which are the 10th to 14th bases counting from the Ds, linked to the 3' side of the Ds located on the 3' side form a base pair.
  • This relationship in which five bases form a base pair, that is, one or more of the C-G pairs may be replaced with G-C, A-T, or T-A.
  • the DNA aptamer having the base sequence described in Table 1 of the present specification may be an oligonucleotide having the full length of the base sequence described in the table.
  • the DNA aptamer of this embodiment can be synthesized by a method known in the art.
  • the DNA aptamer of this embodiment can be chemically synthesized by a known solid-phase synthesis method.
  • the synthesized DNA aptamer is preferably purified by a method known in the art before use. Purification methods include, but are not limited to, gel purification, affinity column purification, and HPLC.
  • the base X in the sequence of the DNA oligonucleotide is preferably an artificially produced base.
  • an appropriate artificial base it is possible to introduce an amino group, a thiol group, a carboxyl group, an azide group, a hydroxyl group, an alkenyl group, a formyl group, a hydrazide group, a cyano group, etc. as an active functional group provided by the introduction of the artificial base X.
  • These active functional groups can be used as they are or after activation to be retained on a carrier that can be used in an apheresis column.
  • one end of a linker made of a hydrocarbon chain may be bound to base X, and the other end may be bound to a carrier, thereby holding the DNA aptamer on the carrier.
  • base X is a modified T (thymine) or A (adenine).
  • the active functional group introduced by base X can be bound to biocompatible polymers such as PEG (polyethylene glycol), POX (poly(2-oxazoline)), PMPC (poly(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)), or medium-sized or biopolymers such as peptides, oligonucleotides, and polysaccharides.
  • biocompatible polymers such as PEG (polyethylene glycol), POX (poly(2-oxazoline)), PMPC (poly(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)
  • medium-sized or biopolymers such as peptides, oligonucleotides, and polysaccharides.
  • Aptamers whose physical properties have been altered by binding these biocompatible polymers, medium-sized or biopolymers can be used not only in apheresis columns, but also as therapeutic agents for diseases that can be treated by inhibiting the function of sFLT-1.
  • Functional groups that can be used to bind medium-sized molecules or biopolymers include azide groups (-N 3 ), amino groups (-NH 2 ), carboxyl groups (-COOH) or their active esters, alkynyl groups (-CC) or cyclic structures containing an alkynyl structure, formyl groups (-CHO), hydrazide groups (-NH-NH 2 ), hydroxyl groups (-OH), thiol groups (-SH), cyano groups (-CN), vinyl groups (-CHCH 2 ), and maleimide groups.
  • polymeric compounds examples include polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 20,000 to 60,000, and any biocompatible polymer with a molecular weight of 20,000 or more.
  • PEG polyethylene glycol
  • biocompatible polymers are polymers that are not normally used in living organisms, and are safe when placed in the body and do not cause inflammation or toxic reactions.
  • medium molecular compounds include peptides, oligonucleic acids, oligosaccharides, proteins, PEG, and any biocompatible polymers with a molecular weight of more than 1,000 and less than 20,000.
  • the DNA aptamer according to this embodiment is fixed to a carrier and used in the apheresis process.
  • the carrier can be used for apheresis as long as it is made of a material that is stable in the body and has biocompatibility, such as surface-modified silica gel, surface-modified metal, glass, zeolite, polystyrene, polypropylene, polyethylene, acetylated cellulose, agarose, etc.
  • the carrier can be in the form of beads, fibers, woven fabric, nonwoven fabric, porous structure, etc.
  • the aptamer When immobilizing the DNA aptamer of this embodiment on a carrier, the aptamer can be immobilized at any position on the aptamer as long as the activity of the DNA aptamer is not impaired, and immobilization is not limited to using base X, which is an artificial base.
  • the carrier to which the DNA aptamer according to this embodiment is fixed it is expected to be fixed to a suitable carrier with biocompatibility to form an apheresis column, and the column is expected to be effective in removing sFLT-1 from sFLT-1 positive blood.
  • the DNA aptamer according to this embodiment may be administered locally or systemically, either unmodified or modified by binding a polymer using the base X in the mini-hairpin structure, and is expected to have the effect of alleviating or suppressing symptoms and treating diseases.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be administered by an appropriate method as long as the active ingredient is not inactivated. For example, it may be administered parenterally, such as by injection, aerosol, application, eye drops, or nasal drops, or it may be administered orally.
  • Diseases to which apheresis treatment using the carrier according to this embodiment is applied may be selected from the group consisting of preeclampsia, exudative age-related macular degeneration, central retinal vein occlusion, branch retinal vein occlusion, diabetic macular edema, choroidal neovascularization, malignant tumors, and Duchenne muscular dystrophy.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • an apheresis column carrying the DNA aptamer of this embodiment can remove 50% or more of sFLT-1 from the serum of patients with preeclampsia.
  • sFLT-1 can be removed more efficiently in a single treatment, providing a treatment method that is more sustained and has a higher therapeutic effect. Details will be explained in the examples below.
  • the DNA aptamer according to this embodiment selectively binds to sFLT-1, and can therefore be used as a research reagent for diseases involving sFLT-1. For example, whether in vitro or in vivo, the possibility that sFLT-1 is involved in a physiological phenomenon of interest can be evaluated and examined by tests using the DNA aptamer according to this embodiment, and the cause of the physiological phenomenon can be considered. Furthermore, the DNA aptamer according to this embodiment can be added as a reagent to cell culture medium or administered to animals, and used in a wide range of tests, including reaction systems that inhibit sFLT-1.
  • the DNA aptamer that selectively binds to sFLT-1 binds specifically and strongly to sFLT-1. Therefore, compared to conventional non-specific removal methods, it is possible to remove sFLT-1 from the blood more efficiently and specifically.
  • DNA aptamer that selectively binds to sFLT-1 can be synthesized by chemical methods. Compared to biological synthesis, chemical synthesis does not require the use of serum or other substances in its production. This means that problems inherent in the production of antibody drugs, such as the risk of biological contamination or quality differences between lots, do not arise, and aptamers with uniform quality can be provided at a lower cost.
  • the DNA aptamer that selectively binds to sFLT-1 according to this embodiment, and the carrier on which the DNA aptamer is immobilized, can be stored in a dry state or at room temperature. This provides improved convenience in terms of transportation and storage costs compared to carriers on which protein ligands such as antibodies are immobilized.
  • the DNA aptamer used in this example was chemically synthesized by the method described in WO 2013/073602 and WO 2016/143700.
  • the DNA aptamer having a base sequence containing an artificial base X according to this example was synthesized by introducing a modified dT amidite via a linker into the X position of the sequences of SEQ ID NOs: 6 and 7 using the method described in WO 2013/073602 and WO 2016/143700.
  • Other X substitutions can be synthesized by using commercially available artificial base or modified base amidites.
  • Example 1 Selection of DNA aptamers that bind to sFLT-1 using Ds predatormin DNA library
  • a DNA library containing the artificial base Ds was prepared according to the predetermining method described in International Publication No. 2013/073602. This DNA library is composed of DNA containing a total of 92 bases consisting of primer sequences arranged at both 3' and 5' ends, a tag sequence, a fixed sequence, and an intermediate portion having a random sequence. The artificial base Ds is incorporated at two positions in the intermediate random sequence, and the position of incorporation can be determined from the tag sequence.
  • a DNA library was prepared by chemically synthesizing and mixing sub-libraries having individual tag sequences.
  • Protein-SELEX for sFLT-1 was performed on a 1 mL scale using 5000 pmol of the above library as the starting material.
  • As the target protein Fctag-attached sFLT-1 or Histag-attached sFLT-1 (both manufactured by SinoBiological) was used depending on the round. After 7 rounds of selection, the obtained DNA was subjected to sequence analysis.
  • Example 2 Sequencing of DNA obtained by Protein-SELEX IonPGM sequencing (ThermoFisherScientific) was used to identify the base sequence of the DNA obtained after 7 rounds. When sequences that correctly retained the primer sequences at both ends were extracted from a total of 428,716 reads, the analysis subjects were 134,637 sequences. Based on the extracted sequences, clustering was performed under conditions in which sequences with two base differences were considered to be derived sequences, and the degree of sequence enrichment was confirmed, and five sequences were identified as binding sequence candidates. Each of these candidate sequences was chemically synthesized, and binding ability screening was performed individually.
  • Example 3 Binding Ability Screening of Candidate Sequences (ELOSA) Five candidate sequences were screened by binding ability analysis using the ELOSA method with the sequences immobilized on a plate. Specifically, 5 pmol of biotin-labeled sequences were added to a Neutravidin-coated plate (ThermoFisherScientific) and immobilized by shaking at room temperature for 30 minutes. Then, inactivated FBS (fetal bovine serum) was added to the well with the immobilized sequence and the well was blocked by shaking at room temperature for 30 minutes. After blocking, 400 nM of Histag-attached sFLT-1 recombinant protein was added and the binding reaction with the candidate sequence was carried out at room temperature for 30 minutes.
  • FBS fetal bovine serum
  • Example 4 Alteration of candidate sequences
  • the results are shown in FIG. 2.
  • 6-2-3-3-biotin used in Example 1 was used as a negative control
  • FLT11 was used as a positive control.
  • FLT7-1-1 SEQ ID NO: 6
  • FLT7-1-2 SEQ ID NO: 7
  • the predicted secondary structures of FLT7-1-1 and FLT7-1-2 are shown in Figures 4(a) and (b), respectively.
  • Example 5 Secondary selection of DNA aptamers obtained by Protein-SELEX
  • a second selection Doped selection
  • the secondary structure of the DNA aptamer was estimated.
  • selection was performed again using a library prepared at a ratio containing 55% of the base composition of the original sequence obtained in the 1st selection and 15% of the other nucleotides.
  • Histag-attached sFLT-1 was used, and 4 rounds were performed on a 1 mL scale using 5000 pmol of the library as the starting material.
  • the predicted secondary structure of the sequence obtained by Doped selection is shown in FIG. 5.
  • NGS analysis was performed using IonPGM sequencing (ThermoFisherScientific), and the top six sequences with high enrichment rates obtained from the analysis results were individually synthesized and subjected to binding analysis.
  • the variable base (pair) was only one base pair consisting of the third base from the 5' end and the third base from the 3' end.
  • the sequence of SEQ ID NO: 9 is a sequence in which the third base C from the 5' end is replaced with G, and the third base G from the 3' end is replaced with C.
  • Example 6 Binding analysis of DNA aptamer (FLT7-1-2) to sFLT-1
  • the binding ability of the DNA aptamer FLT7-1-2 obtained in Example 4 was measured by surface plasmon resonance (SPR) using a Biacore T200 from GE Healthcare. Biotin-labeled dT was introduced at the "X" position of the aptamer sequence.
  • the DNA aptamer was prepared by chemical synthesis. In the synthesis, two types of linkers, a C6 linker and a TEG (triethylene glycol) linker, were selected as linkers to be bound to biotin, and aptamers containing each were prepared.
  • the biotin-labeled DNA aptamer was mixed with D-PBS, heated to 95°C, and then rapidly cooled to fold (reconstitute) it.
  • a streptavidin-coated SA chip (Cytiva) was then used as the SPR sensor chip, and the biotin-labeled DNA aptamer was irreversibly immobilized on the chip, after which its binding to sFLT-1 was analyzed.
  • the SPR measurement conditions were a running buffer (D-PBS, 0.05% Tween 20) and a set temperature of 25°C.
  • Each DNA aptamer was immobilized on the sensor chip by folding a DNA solution diluted with D-PBS solution to 6.25 nM (heat denatured at 95°C for 5 minutes, then rapidly cooled on ice), followed by adding Tween 20 to a final concentration of 0.05%.
  • the DNA solution was immobilized on the SA chip by injecting 2.1 ⁇ L (equivalent to 25 seconds) at a flow rate of 5 ⁇ L/min. After immobilization, the DNA aptamer nonspecifically adsorbed on the SA chip was washed away by injecting 50 mM NaOH solution (5 ⁇ L, 5 times) at a flow rate of 20 ⁇ L/min.
  • the interaction between the immobilized DNA aptamer (FLT7-1-2) and sFLT-1 was monitored by injecting 0 nM, 1 nM, 2 nM, 4 nM, 8 nM, 16 nM, 32 nM, 64 nM, and 128 nM sFLT-1 solutions (diluted with running buffer).
  • the measurement conditions were a flow rate of 100 ⁇ L/min, a protein injection time of 150 seconds, and a dissociation time of 900 seconds.
  • the chip was regenerated (dissociation of bound proteins and refolding of DNA) by injecting 25 ⁇ L (equivalent to 15 seconds) of a 50 mM NaOH solution, followed by running buffer for 10 minutes.
  • a cell with no immobilized DNA was used as a reference cell, and its response value was subtracted from the sensorgram of each DNA aptamer.
  • Figure 6 shows the results when a C6 linker was used as the biotin linker. As a result of this measurement, the KD value of the obtained DNA aptamer was 210 ⁇ 0.006 pM.
  • Example 7 Analysis of stability of DNA aptamer in human plasma
  • the stability of the aptamer FLT7-1-2mh (SEQ ID NO: 8), in which the fifth base from the 3' end of FLT7-1-2 was replaced with A, against nucleases contained in human plasma was examined.
  • the DNA aptamer (final concentration 720 nM) was mixed so that the human plasma concentration was 96%, and the solution was incubated at 37°C. After 0 hours, 0.5 hours, 1 hour, 3 hours, and 6 hours, 20 ⁇ L of the mixed solution was mixed with 110 ⁇ L of 1 ⁇ TBE, 10M Urea solution to stop the degradation reaction.
  • Example 8 Confirmation of the ability of aptamer-immobilized Sepharose to remove recombinant sFLT-1
  • the sFLT-1 aptamer-immobilized beads were reacted with inactivated FBS spiked with recombinant sFLT-1 to confirm the rate of recombinant sFLT-1 removal.
  • sFLT-1 aptamer having an amino linker at the base at the X position of FLT7-1-2 was mixed with NHS-activated Sepharose beads (Cytiva) to prepare sFLT-1 aptamer-immobilized beads.
  • the sFLT-1 aptamer-immobilized beads (100, 200, 300, 400 and 500 ⁇ L slurry) were mixed with 1 mL of inactivated FBS containing 8 ng equivalent of recombinant sFLT-1 (Sino biological) at room temperature for 30 minutes.
  • the amount of recombinant sFLT-1 was set to be equivalent to the blood concentration of patients with preeclampsia.
  • the amount of sFLT-1 remaining in the supernatant was quantified by ELISA.
  • Example 9 Confirmation of the ability of aptamer-immobilized Sepharose to remove sFLT-1 from serum of patients with preeclampsia Using the aptamer-immobilized Sepharose described in Example 8, the sFLT-1 removal rate in the serum of patients with preeclampsia was confirmed. Specifically, taking into consideration the amount of sFLT-1 in the patient serum and the possibility that unknown binding inhibitors may be contained in the serum, the sFLT-1 aptamer-immobilized beads were increased to 600 ⁇ L slurry, and 500 ⁇ L of the patient serum was mixed at room temperature for 30 minutes. Thereafter, sFLT-1 in the supernatant was quantified in the same manner as in the method described in Example 8.

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Abstract

より効率的かつ特異的に血中の可溶性ＦＬＴ－１（ｓＦＬＴ－１）を除去可能であり、安価であり均一な品質を有し、より安全に使用することができるｓＦＬＴ－１除去デバイスとしてのＤＮＡアプタマーおよびＤＮＡアプタマーが固定化された分離用担体を提供する。本発明は、人工塩基７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イル（Ｄｓ）を２箇所に含む塩基配列を有し、ｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーを提供する。ＤＮＡアプタマーが固定化された、アフェレーシス処理に用いられる担体も提供される。

Description

可溶性ＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーおよびそのＤＮＡアプタマーが固定化された担体
　本発明は、可溶性ＦＬＴ－１（ｓＦＬＴ－１）に結合するＤＮＡアプタマーおよびその用途に関するものである。
　ＤＮＡアプタマーは近年、核酸医薬品として幅広い応用が期待されているリガンド認識分子である。ＤＮＡアプタマーは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド分子内の相補配列同士が相補鎖を形成することで、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが二次構造や三次構造を形成し、その立体構造によって標的分子と特異的かつ強固に結合する。
　妊娠高血圧腎症（Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ）は、妊婦の約２０分の１に生じ、母体および胎児に重篤な合併症を引き起こす疾患である。妊娠高血圧腎症の病因の一つとして、血中における可溶性ＦＬＴ－１（ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｍｓ－ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ－１：以下、「ｓＦＬＴ－１」という。）の量の上昇が挙げられている。ｓＦＬＴ－１は、「ｓＶＥＧＦＲ１」とも呼ばれるようにＶＥＧＦＲ１の可溶化フォームであって、血中のＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：血管内皮細胞増殖因子）およびＰＬＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：胎盤増殖因子）に結合することで、それらの受容体であるＶＥＧＦＲ１によるシグナルを阻害する。そのような阻害の結果、血管新生阻害および血管内皮障害を引き起こし、高血圧や蛋白尿といった症状を発現させる。よって、過剰な血中ｓＦＬＴ－１を直接的に除去することにより、症状の改善が見込まれる。
　ｓＦＬＴ－１が関連する妊娠高血圧腎症の治療を目的に、塩基性タンパク質としての性質を利用したデキストラン硫酸塩アフェレーシスカラムによってｓＦＬＴ－１を除去した例の報告（非特許文献１、特許文献１）がある。ｓＦＬＴ－１の非特異的除去の別の例としては、単純血漿交換によるｓＦＬＴ－１除去の例の報告（非特許文献２）も存在する。
特開２０１６－１４７０６５号公報
Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２７：９０３－９１３，２０１６ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．９６，Ｓ１０１－Ｓ１０６，２０２１
　デキストラン硫酸塩アフェレーシスカラムを用いる方法については、ｓＦＬＴ－１とデキストラン硫酸塩は、単純な静電的相互作用に基づいて結合するため、結合の特異性に欠ける。このため、血中の有用成分までも静電的相互作用で誤って除去される可能性がある。他にも、デキストラン硫酸塩にｓＦＬＴ－１以外の成分が吸着してデキストラン硫酸塩上の結合面が飽和し、ｓＦＬＴ－１の除去効率が下がる可能性があるなど、デキストラン硫酸塩アフェレーシスカラムを用いた除去の試みにはｓＦＬＴ－１の非特異的除去が問題となる。また単純血漿交換によるｓＦＬＴ－１除去方法は、血漿交換に伴う血液製剤の補完が必要であり、そのような補完により生じ得る感染の危険性も孕んでいる。
　ｓＦＬＴ－１の特異的除去デバイスとして、抗ｓＦＬＴ－１抗体コンジュゲートセファロースによるアフェレーシスカラム（米国特許第９５９２３３１号明細書）も公開されている。しかしながらこのカラムは、抗体を用いるためオートクレーブ滅菌が不可能であるという熱安定性の問題や、抗体の製造方法に起因する製造コストの高さ、ロット間の品質のブレなどが、問題点となり得る。
　以上の理由から、より効率的かつ特異的に血中のｓＦＬＴ－１を除去でき、安価に製造可能で均一な品質を有する、カラムに担持可能なｓＦＬＴ－１吸着材となる物質の開発が求められている。妊娠高血圧腎症治療における別観点から、ＶＥＧＦＲ１シグナル阻害目的とした抗ＶＥＧＦ抗体医薬も存在するが、抗体医薬には上述した製造に関する問題に加え、免疫原性や胎盤透過性といった問題点がある。
　本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、より効率的かつ特異的に血中のｓＦＬＴ－１を除去可能であり、安価であり均一な品質を有し、より安全に使用することができるｓＦＬＴ－１除去デバイスとしてのＤＮＡアプタマーおよびＤＮＡアプタマーが固定化された担体を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明に係るｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーおよびそのＤＮＡアプタマーが固定化された担体は以下の手段を採用する。
　本発明の第１の態様は、人工塩基７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イル（Ｄｓ）を２箇所に含む塩基配列を有し、２箇所のＤｓの間に１３個から１８個の塩基を含み、三次構造形成時に一本鎖を形成する配列内に２つのＤｓのうちの少なくとも一方が位置する、ｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーを提供する。
　上記第１の態様においては、ＤＮＡアプタマーは配列番号１から９のいずれかに記載の塩基配列を有していてもよい。
　上記第１の態様においては、ＤＮＡアプタマーは配列番号１，３または４に記載の塩基配列を有していてもよい。
　上記第１の態様においては、ＤＮＡアプタマーは（ａ）配列番号２および５から９のいずれかに記載の塩基配列を有しているか、または、（ｂ）配列番号２または５から９のいずれかに記載の塩基配列において、２個のＤｓのうち５’側に位置するＤｓの５’側に連結された、３個から７個の塩基を有する塩基配列と、２個のＤｓのうち３’側に位置するＤｓの３’側に連結された、Ｄｓから数えて１０番目の塩基から３個から７個の塩基を有する塩基配列とが、塩基対を形成する任意の配列であってもよい。
　上記第１の態様においては、ＤＮＡアプタマーは配列番号７または８に記載の塩基配列を有する。
　上記第１の態様においては、ＤＮＡアプタマーは、配列番号６または７に記載の塩基配列中の塩基Ｘが人工的に製造された塩基であり、該人工的に製造された塩基が、リンカー、中分子化合物、高分子化合物、生体高分子、または生体高分子に親和性のあるポリマーで修飾されていてもよい。
　本発明の第２の態様は、アフェレーシス処理に用いる、上記第１の態様に係るＤＮＡアプタマーが固定化された担体を提供する。
　上記第２の態様においては、担体を用いるアフェレーシス処理の対象がｓＦＬＴ－１　ポジティブな血液であってもよい。
　上記第２の態様においては、担体を用いるアフェレーシス処理を適用する疾患が、妊娠高血圧腎症、滲出性加齢黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、脈絡膜血管新生、悪性腫瘍、デュシェンヌ型筋ジストロフィーからなる群から選択されてもよい。
　本発明の第３の態様は、上記第１の態様に係るＤＮＡアプタマーを含むｓＦＬＴ－１除去材を提供する。
　本発明の第４の態様は、上記第１の態様に係るＤＮＡアプタマーを含むｓＦＬＴ－１除去キットを提供する。
　本発明の第５の態様は、上記第１の態様に係るＤＮＡアプタマーを含む医薬組成物を提供する。
　上記第５の態様においては、医薬組成物は、妊娠高血圧腎症、滲出性加齢黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、脈絡膜血管新生、悪性腫瘍、デュシェンヌ型筋ジストロフィーからなる群から選択される疾患の治療および／または予防のためのものであってもよい。
　本発明に係るｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーは、特異的かつ強固にｓＦＬＴ－１に結合する。よって、より効率的かつ特異的に血中のｓＦＬＴ－１を除去することができる。
　本発明に係るｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーは、化学的手法によって合成することができる。このため、生物学的手法による合成法と比較して、均一な品質を有するＤＮＡアプタマーをより安価に提供することができる。
　また、本発明に係るｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーにより、より安価でより安全に使用可能なｓＦＬＴ－１分離用担体を提供することができる。
本発明の一実施形態における、アプタマー候補であるＤＮＡについてＥＬＯＳＡによる結合能スクリーニングを行った結果を示す図である。 本発明の一実施形態における、改変した配列を有するＤＮＡアプタマー候補についてＥＬＯＳＡによる結合能スクリーニングを行った結果を示す図である。 本発明の一実施形態における、改変したＤＮＡ配列についてＥＬＯＳＡによる結合能スクリーニングを行った結果を示す図である。 改変したＤＮＡ配列についての結合能スクリーニングの結果得られた配列の、予想される二次構造を示す図である。 改変したＤＮＡ配列のセカンドセレクションの結果得られた配列の二次構造および可変塩基を示す図である。 ビオチンリンカーとしてＣ６リンカーを用いた、本発明の一実施形態に係るＤＮＡアプタマーの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるｓＦＬＴ－１への結合解析結果を示す図である。 ビオチンリンカーとしてＴＥＧリンカーを用いた、本発明の一実施形態に係るＤＮＡアプタマーの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるｓＦＬＴ－１への結合解析結果を示す図である。 得られたアプタマー候補のヒト血漿中における安定性解析の結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係るＤＮＡアプタマー固定セファロースによるリコンビナントｓＦＬＴ－１の除去能を確認した実験の結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係るＤＮＡアプタマー固定セファロースによる妊娠高血圧腎症患者血清中ｓＦＬＴ－１の除去能を確認した実験の結果を示す図である。
　ＤＮＡアプタマーは、（１）化学合成によって得られるため生物学的汚染リスクが低い、（２）一般に抗原性が低い、（３）ＤＮＡであるため、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）フリーの中性付近の条件では室温で十分な安定性がある、（４）薬物代謝酵素であるチトクロームＰ４５０の阻害活性がほとんどないことから併用の薬剤に影響を与えない、等の利点があり、その有用性が期待されている。またＤＮＡアプタマーは、抗体を用いた長期の治療が必要となる場合の問題の一つである、抗体薬に対する抗体が産生される、といった問題も生じることはないため、長期間にわたる投与も可能となることが期待されている分子である。
　本発明者らは、ｓＦＬＴ－１に選択的に結合させることで血中からｓＦＬＴ－１を選択的に分離可能とする分離資材としてのＤＮＡアプタマーの探索を試みた。ＤＮＡアプタマーとは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド分子内の相補配列同士が相補鎖を形成することで、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが二次構造や三次構造を形成し、その立体構造によって標的分子と特異的かつ強固に結合するリガンド分子である。特定の配列のＤＮＡアプタマーを結合させることより、標的分子の活性を阻害、抑制または亢進させたり、標的分子を選択的に検出または抽出することなどができる分子として近年注目されている。ＤＮＡアプタマーは、抗体よりも分子量が小さく、約１／１０以下であるも関わらず、抗体と同等の高い親和性を有し、高い標的選択性を有する。このため、ＤＮＡアプタマーの性質を利用したｓＦＬＴ－１への選択的結合材は、オフターゲットによる副作用の発生を最小限に抑えられる。またＤＮＡアプタマーは化学合成で生産可能であることから、同様の標的特異性等の機能を有し得る抗体が有する製造面での課題を解決可能な手段として適したモダリティであると考えられる。
　本明細書において「標的分子」とは、ＤＮＡアプタマーの結合対象となり得る物質をいい、本発明ではｓＦＬＴ－１を標的分子としている。本明細書において「ｓＦＬＴ－１に選択的に結合する」とは、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーが、標的物質に対して特異的かつ強固に結合することを含む。本発明の一実施形態においては、ＤＮＡアプタマーが「ｓＦＬＴ－１に選択的に結合する」ことを示す指標の一例として、解離定数ＫＤの値で表すことができる。本発明のｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマー解離定数ＫＤが、一般的な抗体のＫＤ値である１桁ｎＭ以下であると好適である。本明細書において、ＫＤとは、ｋｏｆｆ（解離速度）／ｋｏｎ（結合速度）で表される解離定数を指す。ＫＤの値が小さいほど、標的分子への親和性が強く、ｋｏｆｆの値が小さいほど、標的分子と結合した後に解離しにくいことを意味する。
　発明者らは、人工塩基７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イル（以下、「Ｄｓ」ともいう）を含むＤＮＡライブラリーを用いたＳＥＬＥＸ法によって、ｓＦＬＴ－１に結合するＤＮＡアプタマー候補配列を複数取得した。これら候補配列からＥＬＯＳＡの系でｓＦＬＴ－１に対する結合強度を指標に選抜し、選抜された配列の短鎖化およびミニヘアピン配列付加による結合能確認および血中安定性を確認し、抗ｓＦＬＴ－１アプタマー配列を同定した。このＤＮＡアプタマーを固定したセファロースビーズを用い、妊娠高血圧腎症患者の血中ｓＦＬＴ－１量と同等量のリコンビナントｓＦＬＴ－１をスパイクした非働化ＦＢＳからのｓＦＬＴ－１除去効果を調べたところ、ｓＦＬＴ－１アプタマー依存的にｓＦＬＴ－１を除去できることが明らかとなり、本発明の完成に至った。ｓＦＬＴ－１アプタマーを使用した妊娠高血圧腎症治療法は、未だ確立されていない。
　本開示に係るＤＮＡアプタマーによって、妊娠高血圧腎症をはじめとしたｓＦＬＴ－１が関与する疾患治療を目的としたｓＦＬＴ－１除去デバイスを提供することができる。また、本開示に係るＤＮＡアプタマーを体内投与した場合、ｓＦＬＴ－１の膜結合型に相当するＶＥＧＦＲ１のシグナルに起因する種々疾患の治療薬として応用できる可能性がある。
　ｓＦＬＴ－１について、本開示に係るＤＮＡアプタマーを用いる除去法と、特許文献２に記載のｓＦＬＴ－１特異的除去（抗体）法との比較を試みた。特許文献２のＥｘａｍｐｌｅ１では、５００μｇの抗ｓＦＬＴ－１抗体が固定された０．１ｍｌのアガロースビーズが含まれているカラムを用い、４０ｎｇのｓＦＬＴ－１が含まれる１ｍｌの妊娠高血圧腎症患者由来羊水サンプルからｓＦＬＴ－１の除去実験が行われた。特許文献２のＥｘａｍｐｌｅ１の結果によれば、３回カラムを通した後のｓＦＬＴ－１除去率を確認した結果、最も効率の良い抗体種（ａｎｔｉｂｏｄｙ１０３）で８７％とある。また、特許文献２のＥｘａｍｐｌｅ３にあるように、抗体種ＡＧ１０Ｂを用いた実験では、４０ｎｇのｓＦＬＴ－１がスパイクされたウマ血清からの除去率については、最も良い結果として９８％の除去率が示されている。しかしながら、本実施形態の実施例８で示したｓＦＬＴ－１アプタマーを用いた除去実験とは、実験条件が異なり、その性能は単純には比較できない。また、特許文献２の方法のように抗ｓＦＬＴ－１抗体を用いる手法では、ｓＦＬＴ－１の過剰な除去によるｓＦＬＴ－１／ＰＬＧＦバランスの破綻が、動脈硬化といった悪影響を及ぼすことも報告されている。また、先述したように、アプタマーの性能と抗体の性能とを比較すると、アフェレーシスに用いる吸着材としてはアプタマーが適している。加えて、アプタマーの性能として胎盤透過性が低いことも挙げられることから、妊婦への使用という点でアプタマーを用いる方が好ましいと考えられる。
　本開示における「天然型塩基」とは、自然界に存在するヌクレオチドが有する核酸塩基であって、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのいずれかをいう。
　本開示における「人工的に製造された塩基」または「人工塩基」とは、自然界には存在していない、人工的手法で製造された核酸塩基をいう。本実施形態に係るＤＮＡアプタマーの配列が含む７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イル（以下、「Ｄｓ」という。）は、人工塩基の一例である。
　本開示における「ミニヘアピン配列」とは、７～１４塩基からなる塩基配列であり、核酸分解酵素に対する分解耐性を高める、またはミニヘアピン配列が付されたＤＮＡアプタマーのＴｍ値を上げることでＤＮＡアプタマーの熱安定性を増加させ得る配列をいう（国際公開第２０１６／１４３７００号など参照）。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーは、人工塩基７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イル（Ｄｓ）を２箇所に含む塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、ｓＦＬＴ－１に選択的に結合する分子である。本実施形態においては、表１に記載の塩基配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドをｓＦＬＴ－１結合ＤＮＡアプタマーとして用いることができる。
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　表１に記載の塩基配列は、いずれも、２箇所のＤｓの間に１３～１８個の塩基配列を含んでいる。アプタマー名に「ＦＬＴ７」を含む配列番号２および５から７の塩基配列は、２箇所のＤｓの間に共通する１３塩基からなる配列を含んでいる。さらに、配列番号２，５および６の塩基配列はいずれも、共通する３塩基を上記１３塩基の５’側に有し、共通する１２塩基を３’側に有することで、合計で３０塩基からなる共通配列を有している。アプタマー名に「ＦＬＴ５」を含む配列番号１および４の塩基配列は、２箇所のＤｓの間に共通する１８塩基からなる配列を含んでいる。表１に記載の塩基配列を有するアプタマーは、三次構造形成時に一本鎖を形成する配列内に、２つのＤｓのうちの少なくとも一方が位置する。
　配列番号６および７の配列においては、３’末端から５番目の塩基を任意の塩基Ｘに置換している。塩基Ｘは、任意の非天然型塩基または人工的に製造された塩基であるか、または、人工的に製造された塩基に対してリンカー、低分子化合物、ペプチド、オリゴ核酸、オリゴ糖、タンパク質など生体で利用されている高分子化合物（生体高分子）や生体親和性のあるポリマーが結合されたものを表す。本明細書において「非天然型塩基」とは、自然界に存在する天然型塩基とは異なる構造を有する核酸塩基をいう。
　配列番号６から８の塩基配列は、３’末端側に９塩基からなるミニヘアピン配列を有している。配列番号６および７の塩基配列においては、塩基Ｘはミニヘアピン配列内に位置している。先に述べた低分子化合物、生体高分子などの機能分子は、リンカーを介してミニヘアピン内に位置する塩基Ｘに結合されるため、ＤＮＡアプタマーが三次構造を形成する際に、標的物質への結合活性を有する部位を干渉することなく各種機能分子の導入が可能となる。
　配列番号２および５から９のいずれかに記載の塩基配列は、表１に記載された通りの配列であってもよい。または、配列番号２または５から９のいずれかに記載の塩基配列において、２個のＤｓのうち５’側に位置するＤｓの５’側に連結された、３個から７個の塩基を有する塩基配列と、２個のＤｓのうち３’側に位置するＤｓの３’側に連結された、Ｄｓから数えて１０番目の塩基から３個から７個の塩基を有する塩基配列とが、塩基対を形成する任意の配列であってもよい。例えば、配列番号５の塩基配列では、２個のＤｓのうち５’側に位置するＤｓの５’側に連結されたＣＣＣＣＣと、３’側に位置するＤｓの３’側に連結された、Ｄｓから数えて１０～１４番目の塩基であるＧＧＧＧＧとが塩基対を形成する。この５塩基ずつが塩基対を形成する関係、すなわち、Ｃ－Ｇペアの１つまたは複数が、Ｇ－Ｃ、Ａ－ＴまたはＴ－Ａに置換されてもよい。
　本明細書の表１に記載の塩基配列を有するＤＮＡアプタマーは、表に記載された塩基配列を全長とするオリゴヌクレオチドであってもよい。これに代えて、例えば表面プラズモン共鳴解析に供するために、表１に記載の塩基配列の５’末端または３’末端に所定の塩基配列を付加することも可能である。
　本実施形態のＤＮＡアプタマーの製造方法は、本分野で公知の方法で合成することができる。例えば、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーは、公知の固相合成法によって化学的に合成することができる。合成後のＤＮＡアプタマーは、使用前に本分野で公知の方法によって精製するのが好適である。精製方法としては、ゲル精製法、アフィニティカラム精製法、ＨＰＬＣ法などがあるが、これらに限定されない。
　上記ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列中の塩基Ｘは人工的に製造された塩基であると好適である。人工塩基Ｘの導入により提供される活性官能基については、適当な人工塩基を選択することで、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、水酸基、アルケニル基、ホルミル基、ヒドラジド基、シアノ基等が導入可能で、これらの活性官能基については、そのまままたは活性化を行うことで、アフェレーシスのカラムに使用可能な担体への保持に使用することができる。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーにおいては、炭化水素鎖からなるリンカーの一端を塩基Ｘに結合させ、他端を担体に結合させることで、ＤＮＡアプタマーを担体に保持することとしてもよい。本実施形態に係るＤＮＡアプタマーにおいては、塩基ＸがＴ（チミン）またはＡ（アデニン）を修飾した塩基であると、好適である。
　塩基Ｘにより導入された活性官能基に、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＯＸ（ポリ（２－オキサゾリン））、ＰＭＰＣ（ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン））等の生体親和性ポリマー、あるいは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリサッカリド等の中分子または生体高分子を結合できる。これらの生体親和性ポリマーや中分子、生体高分子が結合されたことにより物性が変換されたアプタマーは、アフェレーシスカラムへの適用だけでなく、ｓＦＬＴ－１の機能を阻害することで治療が可能な疾患に対する治療薬とすることができる可能性がある。
　中分子または生体高分子を結合するための官能基としては、アジド基（－Ｎ３）、アミノ基（－ＮＨ２）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）またはその活性エステル、アルキニル基（－ＣＣ）またはアルキニル構造を含んだ環状構造、ホルミル基（－ＣＨＯ）、ヒドラジド基（－ＮＨ－ＮＨ２）、水酸基（－ＯＨ）、チオール基（－ＳＨ）、シアノ基（－ＣＮ）、ビニル基（－ＣＨＣＨ２）、マレイミド基が使用可能である。
　高分子化合物の例としては、分子量２００００以上６００００以下のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や、分子量２００００以上の生体親和性のある任意の高分子が挙げられる。生体親和性のあるポリマーとは、通常、生体内では用いられていないもののポリマー、生体内に入れても炎症や毒性反応を起こすことがない安全なものをいう。中分子化合物の例としては、分子量が１０００より大きく２００００より小さいペプチド、オリゴ核酸、オリゴ糖、タンパク質、ＰＥＧ、生体親和性のある任意のポリマーが挙げられる。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーは、担体に固定され、アフェレーシス処理に用いられる。本実施形態において、担体は、表面修飾されたシリカゲル、表面修飾された金属、ガラス、ゼオライト、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アセチル化セルロース、アガロース等、生体中で安定かつ生体親和性を有する材質のものであれば、アフェレーシス用途に使用可能である。担体の形態としては、ビーズ、繊維、織布、不織布、多孔質構造体等が使用可能である。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを担体に固定するにあたっては、ＤＮＡアプタマーが活性を損なわない限りにおいて、アプタマーの任意の位置で固定化が可能であり、人工塩基である塩基Ｘを使用しての固定化に限定されるものではない。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーが固定された担体の適用例としては、生体親和性のある適当な担体に固定してアフェレーシスカラムとし、そのカラムを用いてｓＦＬＴ－１ポジティブの血液中からｓＦＬＴ－１を除く効果を示すことが期待される。医薬組成物としては、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを無修飾のまま、またはミニヘアピン構造中の塩基Ｘを利用して高分子を結合させて修飾したものを、局所または全身投与を行うことで、症状の緩和、抑制や、疾患を治療する効果が期待できる。本実施形態の医薬組成物は、有効成分が失活しない範囲において、適当な方法によって投与することが可能である。例としては、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻といった非経口投与であってもよく、経口投与であってもよい。
　本実施形態に係る担体を用いるアフェレーシス処理を適用する疾患は、妊娠高血圧腎症、滲出性加齢黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、脈絡膜血管新生、悪性腫瘍、デュシェンヌ型筋ジストロフィーからなる群から選択され得る。
　現在市販されているデキストラン硫酸塩アフェレーシスカラムによる妊娠高血圧腎症患者の血漿中のｓＦＬＴ－１の平均除去率は１８％であり、その市販品を用いた場合には尿蛋白の減少や妊娠期間の延長といった一定の効果が認められる。しかしながら、血漿中のｓＦＬＴ－１の量は、市販品での処置後すぐに再上昇するとの報告がある（非特許文献１）。このため、市販品を用いる場合には、頻回な処置が必要と考えられる。
　これに対し、本実施形態のＤＮＡアプタマーを担持させたアフェレーシスカラムでは、妊娠高血圧腎症患者の血清からｓＦＬＴ－１を５０％以上除去することができることを確認できた。本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを固定化したビーズを用いることで、一度の処置でより効率的にｓＦＬＴ－１を除去することができ、持続的でより治療効果が高い治療法を提供できる。詳細は後述する実施例で説明する。
　本実施形態に係るＤＮＡアプタマーは、選択的にｓＦＬＴ－１に結合することから、ｓＦＬＴ－１が関わる疾患のための研究用試薬として使用することが可能である。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｉｎ　ｖｉｖｏを問わず、着目した生理的現象にｓＦＬＴ－１が関わっている可能性について、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーを作用させる試験により評価検討を行い、生理的現象の原因の考察を行うことができる。また、本実施形態に係るＤＮＡアプタマーの、細胞培養培地への試薬としての添加や、動物への投与により、ｓＦＬＴ－１を阻害する反応系を含む幅広い試験に使用することができる。
　本実施形態に係るｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーは、特異的かつ強固にｓＦＬＴ－１に結合する。よって、従来の非特異的除去法と比較して、より効率的かつ特異的に血中のｓＦＬＴ－１を除去することができる。
　また本実施形態に係るｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーは、化学的手法によって合成することができる。化学的合成法は、生物学的手法による合成法と比較して、その製造に血清などを用いる必要が無い。このため、生物学的汚染のおそれやロット間での品質の差など、抗体医薬製造が有する問題を生じることなく、均一な品質を有するアプタマーをより安価に提供することができる。
　本実施形態に係るｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマーおよびそのＤＮＡアプタマーが固定化された担体は、乾燥状態での保存や室温での保存が可能である。よって、輸送および保存のコスト面で、抗体等のタンパク性のリガンドを固定した担体と比較して、利便性が向上する。
　本実施例に用いるＤＮＡアプタマーは、国際公開第２０１３／０７３６０２号および国際公開第２０１６／１４３７００号に記載されている方法で化学合成した。本実施例に係る、人工塩基Ｘを含む塩基配列を有するＤＮＡアプタマーは、国際公開第２０１３／０７３６０２号および国際公開第２０１６／１４３７００号に記載の方法を用い、配列番号６および７の配列のＸの位置に、リンカーを介して修飾したｄＴ　Ａｍｉｄｉｔｅを導入することで合成した。その他のＸ置換体に関しては、市販の人工塩基または修飾塩基のアミダイトを用いることにより合成することが可能である。
＜実施例１：ＤｓプレデターミンＤＮＡライブラリーを用いたｓＦＬＴ－１に結合するＤＮＡアプタマーの選別＞
　国際公開第２０１３／０７３６０２号に記載のプレデターミン法に従って人工塩基Ｄｓを含むＤＮＡライブラリーの調製を行った。このＤＮＡライブラリーは、３’、５’両末端に配置されたプライマー配列と、タグ配列と、固定配列と、ランダム配列を有する中間部からなる計９２塩基の配列を含むＤＮＡで構成される。中間部のランダム配列中の２箇所に人工塩基Ｄｓを組み込んでおり、その組み込み位置は、タグ配列から判定できる。個別のタグ配列を有するサブライブラリーを化学合成し、混合することで、ＤＮＡライブラリーを調製した。ｓＦＬＴ－１に対するＰｒｏｔｅｉｎ－ＳＥＬＥＸを、上記ライブラリー５０００ｐｍｏｌを出発材料として１ｍＬのスケールで実施した。標的タンパク質としてＦｃｔａｇ付きｓＦＬＴ－１またはＨｉｓｔａｇ付きｓＦＬＴ－１（ともにＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を、ラウンドに応じて使用した。７ラウンドのセレクション終了後、得られたＤＮＡを配列の解析に供した。
＜実施例２：Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＳＥＬＥＸによって得られたＤＮＡの配列決定＞
　ＩｏｎＰＧＭｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、７ラウンド後に得られたＤＮＡの塩基配列の特定を行った。総リード（ｒｅａｄ）数４２８７１６配列から両末端のプライマー配列を正しく保持している配列を抽出したところ、解析対象は１３４６３７配列であった。抽出した配列を基に、２塩基違いの配列を派生配列とみなす条件でクラスタリングし、配列の濃縮程度を確認したところ、５配列が結合配列候補として挙がった。それらの候補配列をそれぞれ化学合成して、個々に結合能スクリーニングを実施した。
＜実施例３：候補配列の結合能スクリーニング（ＥＬＯＳＡ）＞
　候補配列５種について、配列をプレートに固定したＥＬＯＳＡ法による結合能解析によりスクリーニングにかけた。具体的には、５ｐｍｏｌのビオチン標識配列をＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティングプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加え、室温で３０分振盪することで固定した。その後、配列を固定したｗｅｌｌに非働化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を加え室温で３０分振盪することでブロッキングをした。ブロッキング後、４００ｎＭのＨｉｓｔａｇ付きｓＦＬＴ－１リコンビナントタンパク質を加え、室温で３０分間、候補配列との結合反応を行った。その後、１×Ｄ－ＰＢＳＴ（０．０５ｗｔ％　Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。配列に結合したｓＦＬＴ－１リコンビナントタンパク質の検出は、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓｔａｇ抗体（Ｒ＆Ｄ）で検出した。具体的には、非働化ＦＢＳ中で１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗Ｈｉｓｔａｇ抗体を加え、遮光下、室温で１時間振盪した。その後、１ｘＤ－ＰＢＳＴ（０．０５ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。そこに、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ）を加え、遮光下、室温で２０分間反応させた。その後、２ＮのＨ２ＳＯ４を加え反応を止め、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を計測することで候補配列とＨｉｓｔａｇ付きｓＦＬＴ－１との結合を検出した。
　ＯＤ４５０計測値を図１に示す。図１中の「ＮＣ（６－２－３－３－ｂｉｏｔｉｎ）」は以下に示す配列を有するネガティブコントロール、「ＰＣ（６－２－３－２－ｂｉｏｔｉｎ）」は以下に示す配列を有するポジティブコントロールを示している。解析の結果、ＦＬＴ５（配列番号１）、ＦＬＴ７（配列番号２）およびＦＬＴ１１（配列番号３）は、ポジティブコントロールの配列と比較して２倍以上高い結合能を示すことが分かった。
アプタマー名：６－２－３－３－ｂｉｏｔｉｎ
５’－ＧＣＡＣＣＣＡＡＤｓＴＧＡＴＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＣＣＴＴＴＡＧＧＤｓＴＴＡＧＡＧＧＣＣ－３’
アプタマー名：６－２－３－２－ｂｉｏｔｉｎ
５’－ＣＡＣＣＣＡＡＤｓＴＧＡＴＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧＤｓＴＴＡＧＡＧＧＧＣＧ－３’
＜実施例４：候補配列の改変＞
　実施例３で高い結合能を示した候補配列ＦＬＴ５およびＦＬＴ７について、短鎖化およびミニヘアピン配列付加による改変を行った。Ｈｉｓｔａｇ付きｓＦＬＴ－１に対して高い結合能を示した候補配列について、短鎖化を行い、実施例３に記載のＥＬＯＳＡ法と同様に、Ｈｉｓｔａｇ付きｓＦＬＴ－１に対する結合能を確認した。その結果を図２に示す。ネガティブコントロールとして実施例１で用いた６－２－３－３－ｂｉｏｔｉｎを、ポジティブコントロールとしてＦＬＴ１１を、それぞれ用いた。解析の結果、ＦＬＴ５－１（配列番号４）およびＦＬＴ７－１（配列番号５）が改変前のＦＬＴ５およびＦＬＴ７のそれぞれと比較して同等の結合能を維持していることが明らかとなった。
　次いで、二次構造予測を基に、更なる短鎖化およびミニヘアピン付加を行った。ＦＬＴ５－１、ＦＬＴ７－１それぞれについて、ステム長が異なる２種類の配列を合成した。短鎖化を施した配列は、プレートに５ｐｍｏｌを固定し、実施例３に記載のＥＬＯＳＡ法と同様に、Ｈｉｓｔａｇ付きｓＦＬＴ－１に対する結合能を確認した。ただしリコンビナントｓＦＬＴ－１濃度を、実施例３の４００ｎＭから２００ｎＭに変更し、結合能を確認した。結果を図３に示す。ＦＬＴ７－１を改変したＦＬＴ７－１－１（配列番号６）およびＦＬＴ７－１－２（配列番号７）が、ポジティブコントロールとして用いた改変前の配列ＦＬＴ７－１と同等の結合能を保持していた。ＦＬＴ７－１－１およびＦＬＴ７－１－２の予測される二次構造を、それぞれ図４（ａ）、（ｂ）に示す。
＜実施例５：Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＳＥＬＥＸによって得られたＤＮＡアプタマーのセカンドセレクション＞
　実施例４で得られた配列を含むＤＮＡアプタマーＦＬＴ７－１－２について、国際公開第２０１３／０７３６０２号の実施例３に記載の方法に準じてセカンドセレクション（Ｄｏｐｅｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を実施し、ＤＮＡアプタマーの二次構造の推定を行った。セカンドセレクションでは、１ｓｔセレクションで得られたオリジナル配列のそれぞれの塩基組成を５５％、その他ヌクレオチドをそれぞれ１５％含む割合で調製されたライブラリーを使って、再びセレクションを行った。セレクションでは、Ｈｉｓｔａｇ付きｓＦＬＴ－１のみを用い、５０００ｐｍｏｌのライブラリーを出発材料として１ｍＬのスケールで４ラウンドを実施した。Ｄｏｐｅｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎによって得られた配列の予測される二次構造を図５に示す。実施例２と同様に、ＩｏｎＰＧＭｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＮＧＳ解析を行い、解析結果から得られた濃縮率が高い配列上位６配列について、個々に合成し結合解析を行った。その結果、可変塩基（対）は、５’末端から３番目の塩基および３’末端から３番目の塩基からなる塩基対の一箇所のみであった。配列番号９の配列は、５’末端から３番目の塩基ＣがＧに、３’末端から３番目の塩基ＧがＣに、それぞれ置換された配列である。
＜実施例６：ＤＮＡアプタマー（ＦＬＴ７－１－２）のｓＦＬＴ－１に対する結合解析＞
　実施例４で得られたＤＮＡアプタマーＦＬＴ７－１－２の結合能を、ＧＥヘルスケア社のＢｉａｃｏｒｅＴ２００を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ビオチン標識されたｄＴをアプタマーの配列の「Ｘ」の位置に導入した。ＤＮＡアプタマーを化学合成によって調製した。合成にあたっては、ビオチンと結合させるリンカーとして、Ｃ６リンカーとＴＥＧ（トリエチレングリコール）リンカーの２種類を選択し、それぞれを含むアプタマー調製した。
　ビオチン標識されたＤＮＡアプタマーをＤ－ＰＢＳにて混合し、９５℃で加熱後急冷することでフォールディング（再構築）させて調製した。そして、ＳＰＲのセンサーチップとしてストレプトアビジンがコートされたＳＡチップ（Ｃｙｔｉｖａ）を用い、ビオチン標識されたＤＮＡアプタマーをチップへ不可逆的に固定化後、ｓＦＬＴ－１への結合を解析した。なお、ＳＰＲの測定条件は、ランニングバッファー（Ｄ－ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）、設定温度２５℃で行った。
　各ＤＮＡアプタマーのセンサーチップへの固定化は、６．２５ｎＭとなるようにＤ－ＰＢＳ溶液で希釈したＤＮＡ溶液をフォールディング処理（９５℃、５分間加熱変性後、氷上で急冷）した後、最終濃度０．０５％となるようにＴｗｅｅｎ２０を加えた。そのＤＮＡ溶液を流速５μＬ／ｍｉｎで２．１μＬ（２５秒相当）インジェクションすることで、ＳＡチップに固定化した。また、固定化後、流速２０μＬ／ｍｉｎで、５０ｍＭＮａＯＨ溶液をインジェクション（５μＬ、５回）することにより、ＳＡチップに非特異的に吸着されているＤＮＡアプタマーを洗浄した。固定化されたＤＮＡアプタマー（ＦＬＴ７－１－２）とｓＦＬＴ－１との相互作用検出は、０ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ、６４ｎＭおよび１２８ｎＭのｓＦＬＴ－１溶液（ランニングバッファーで希釈）をインジェクションすることでモニターした。測定条件は流速１００μＬ／ｍｉｎ、タンパク質インジェクション時間は１５０秒、ディソシエーション時間は９００秒である。
　チップの再生（結合タンパク質の解離およびＤＮＡのリフォールディング）は５０ｍＭＮａＯＨの溶液を２５μＬ（１５秒相当）インジェクション後、１０分間ランニングバッファーを流すことで行った。各ＤＮＡアプタマーのセンサーグラムは、センサーチップに対するバルク効果や非特異的吸着によるレスポンス値を差し引くために、ＤＮＡを固定化していないセルをリファレンスのセルとして、そのレスポンス値を各ＤＮＡアプタマーのセンサーグラムから差し引いた。ビオチンリンカーとしてＣ６リンカーを用いた結果を図６に示す。本測定の結果、得られたＤＮＡアプタマーのＫＤ値は２１０±０．００６ｐＭであった。
　ビオチンリンカーとしてＴＥＧリンカーを用いた結果を図７に示す。本測定の結果、得られたＤＮＡアプタマーのＫＤ値は１００±０．０２１ｐＭであった。
＜実施例７：ＤＮＡアプタマーのヒト血漿中における安定性解析＞
　ＦＬＴ７－１－２の３’末端から５番目の塩基をＡに置換したアプタマーＦＬＴ７－１－２ｍｈ（配列番号８）のヒト血漿中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性を調べた。ＤＮＡアプタマー（最終濃度７２０ｎＭ）を、ヒト血漿濃度が９６％となるように混合し、この溶液を３７℃でインキュベートした。０時間後、０．５時間後、１時間後、３時間後および６時間後に混合溶液２０μＬを１１０μＬの１×ＴＢＥ、１０ＭＵｒｅａ溶液と混合して分解反応を止めた。反応後のサンプルを７ＭＵｒｅａ変性１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ゲルをＳＹＢＲＧＯＬＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色して１本鎖核酸を検出した。ゲル泳動結果を図８に示す。ゲルの染色結果より、６時間インキュベートサンプルにおいても、分解物由来のバンドはほとんど観察されず、全長の状態で安定に存在することが明らかとなった。アフェレーシスにおける血液サンプルとの接触においても安定で、ｓＦＬＴ－１除去能を保持することが示唆された。
＜実施例８：アプタマー固定セファロースによるリコンビナントｓＦＬＴ－１の除去能の確認＞
　ｓＦＬＴ－１アプタマー固定ビーズと、リコンビナントｓＦＬＴ－１をスパイクした非働化ＦＢＳを反応させ、リコンビナントｓＦＬＴ－１除去率を確認した。具体的には、ＮＨＳ活性化セファロースビーズ（Ｃｙｔｉｖａ社）に、ＦＬＴ７－１－２のＸの位置の塩基にアミノリンカーを有するｓＦＬＴ－１アプタマーを混合し、ｓＦＬＴ－１アプタマー固定ビーズを調製した。ｓＦＬＴ－１アプタマー固定ビーズ（１００、２００、３００、４００および５００μＬスラリー）を、８ｎｇ相当のリコンビナントｓＦＬＴ－１（Ｓｉｎｏ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）が含まれる非働化ＦＢＳ１ｍＬと室温で３０分間混合した。リコンビナントｓＦＬＴ－１量は、妊娠高血圧腎症患者の血中濃度と同等に設定した。上清に残存するｓＦＬＴ－１量をＥＬＩＳＡ法で定量した。
　　定量結果を図９に示す。上清中のｓＦＬＴ－１残存量は、ビーズ量依存的に減少し、５００μＬスラリーのｓＦＬＴ－１アプタマー固定ビーズを用いた場合、ほぼ全量を除去できることが明らかとなった。
　＜実施例９：アプタマー固定セファロースによる妊娠高血圧腎症患者血清からのｓＦＬＴ－１の除去能の確認＞
　実施例８に記載したアプタマー固定セファロースを用い、妊娠高血圧腎症患者血清中のｓＦＬＴ－１除去率を確認した。具体的には、患者血清中のｓＦＬＴ－１の量や、血清中に未知の結合阻害因子が含まれる可能性を考慮し、ｓＦＬＴ－１アプタマー固定ビーズを６００μＬスラリーに増やし、患者血清５００μＬを室温で３０分間混合した。その後、実施例８に記載の方法と同様に上清中のｓＦＬＴ－１を定量した。結果を図１０に示す。患者１（ＴＤ－ＰＥ－００４）血清サンプルから約２４０００ｐｇ／ｍＬ（５９％）、患者２（ＴＤ－ＰＥ－００６）サンプルから約８２００ｐｇ／ｍＬ（５７％）のｓＦＬＴ－１が除去できることが明らかとなり、リコンビナントに限らず、天然型のｓＦＬＴ－１除去能を有していることが示された。

Claims (12)

  1. 　人工塩基７－（２－チエニル）－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］－ピリジン－３－イル（Ｄｓ）を２箇所に含む塩基配列を有し、２箇所のＤｓの間に１３個から１８個の塩基を含み、三次構造形成時に一本鎖を形成する配列内に２つのＤｓのうちの少なくとも一方が位置する、ｓＦＬＴ－１に選択的に結合するＤＮＡアプタマー。
  2. 　配列番号１，３または４に記載の塩基配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡアプタマー。
  3. 　（ａ）配列番号２または５から９のいずれかに記載の塩基配列を有する、または、
    　（ｂ）配列番号２または５から９のいずれかに記載の塩基配列において、２個のＤｓのうち５’側に位置するＤｓの５’側に連結された、３個から７個の塩基を有する塩基配列と、２個のＤｓのうち３’側に位置するＤｓの３’側に連結された、Ｄｓから数えて１０番目の塩基から３個から７個の塩基を有する塩基配列とが、塩基対を形成する任意の配列である、請求項１に記載のＤＮＡアプタマー。
  4. 　配列番号７または８に記載の塩基配列を有する、請求項３に記載のＤＮＡアプタマー。
  5. 　配列番号６または７に記載の塩基配列中の塩基Ｘが人工的に製造された塩基であり、該人工的に製造された塩基が、リンカー、中分子化合物、高分子化合物、生体高分子、または生体高分子に親和性のあるポリマーで修飾されている、請求項３に記載のＤＮＡアプタマー。
  6. 　請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーが固定化された、アフェレーシス処理に用いられる担体。
  7. 　前記アフェレーシス処理の対象がｓＦＬＴ－１ポジティブな血液である、請求項６に記載の担体。
  8. 　前記アフェレーシス処理を適用する疾患が、妊娠高血圧腎症、滲出性加齢黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、脈絡膜血管新生、悪性腫瘍、デュシェンヌ型筋ジストロフィーからなる群から選択される、請求項６に記載の担体。
  9. 　請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーを含むｓＦＬＴ－１除去材。
  10. 　請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーを含むｓＦＬＴ－１除去キット。
  11. 　請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーを含む医薬組成物。
  12. 　妊娠高血圧腎症、滲出性加齢黄斑変性、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、脈絡膜血管新生、悪性腫瘍、デュシェンヌ型筋ジストロフィーからなる群から選択される疾患の治療および／または予防のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
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