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WO2024200864A1 - Verfahren zu synthetischen reinigung von peptiden ohne hplc - Google Patents

Verfahren zu synthetischen reinigung von peptiden ohne hplc Download PDF

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WO2024200864A1
WO2024200864A1 PCT/EP2024/058896 EP2024058896W WO2024200864A1 WO 2024200864 A1 WO2024200864 A1 WO 2024200864A1 EP 2024058896 W EP2024058896 W EP 2024058896W WO 2024200864 A1 WO2024200864 A1 WO 2024200864A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
alkyl
peptide
linker
ether
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/EP2024/058896
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Roderich SÜßMUTH
Romina SCHNEGOTZKI
Victor Prisyazhnoy
Manuel GEMANDER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Berlin
Original Assignee
Technische Universitaet Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Berlin filed Critical Technische Universitaet Berlin
Publication of WO2024200864A1 publication Critical patent/WO2024200864A1/de
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Pending legal-status Critical Current

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    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic

Definitions

  • the invention relates to the field of peptide synthesis, in particular peptide solid phase synthesis and the purification of the synthesis products produced thereby.
  • the invention relates to a linker molecule for the purification of a peptide according to the formula A-E-L-R.
  • the invention further relates to a method for purifying a peptide, comprising a. preparation of a linker-peptide construct comprising a linker molecule and the peptide, wherein the peptide is covalently bound to a synthesis solid phase and the linker molecule is covalently bound to the peptide via the R group, b.
  • the invention further relates to a kit for the purification of a peptide according to the method according to one of claims 6 to 13, characterized in that the kit comprises a. a linker molecule according to one of claims 1 to 5, or b.
  • a linker molecule precursor comprising the groups R and L of a linker molecule according to one of claims 1 to 5 and reagents for the covalent bonding of group A, optimally group A-E, to group R of the linker molecule precursor, and c. optionally reagents and solvents for the cleavage of protective groups of group A of the linker molecule or group R of the linker molecule precursor and for the one or more washing steps.
  • the invention further relates to the use of the linker molecule in a method for the purification of a peptide.
  • the invention relates to a method for producing and purifying a peptide, comprising producing a linker-peptide construct comprising a linker and a peptide, wherein the linker comprises an affinity group A and a cleavage group R and is covalently bound to the peptide via the cleavage group R and the peptide has been synthesized on a synthesis solid phase and is bound to the synthesis solid phase, cleaving the linker-peptide construct from the synthesis solid phase, binding the linker-peptide construct via the affinity group A of the linker to a purification solid phase, one or more washing steps to remove impurities from the linker-peptide construct, and releasing the peptide from the linker-peptide construct by cleaving the cleavage group R of the linker and separating the linker from the peptide.
  • the invention further relates to linkers for use in the method of the present invention, which comprise an affinity group A, linkage L, a cleavage group R and optionally an enhancer E.
  • linkers for use in the method of the present invention, which comprise an affinity group A, linkage L, a cleavage group R and optionally an enhancer E.
  • SPPS Solid phase synthesis
  • the first affinity purification was developed in 1976 by the inventor of the SPPS, R. B. Merrifield.[2] The binding principle was based on the formation of a thiol bond between peptide and purification resin. The use of thiols as affinity partners was subsequently developed by several groups and modified accordingly by using different cleavage groups.[3-9] When labeling strategies for proteins based on avidin-biotin interactions were increasingly used in the 1990s, this form of non-covalent binding was also used as a variant for the described affinity purification.[10- 17] However, these approaches, like the thiol variants, could not establish themselves as an alternative to HPLC purification.
  • oximes are molecules that are only stable in specific pH ranges, which means that it cannot be ruled out that traces of the linker are present in the purified target peptide.
  • the solvent used must be free of common impurities such as aldehydes or ketones, otherwise the linker will bind to these and not to the purification resin.
  • Another problem is the need for a fully deprotected peptide, since with this approach the reducing agent remains in the cleavage mixture and can only be removed by precipitation of the peptide.
  • the peptide is to have protective groups for further reaction after synthesis, precipitation is not possible due to the polarity.
  • the object of the present invention to provide automated and parallelizable purification methods and materials for use in such methods for peptides and peptide mixtures, for example for solid-phase synthesized peptides, which drastically reduce the costs of peptide production. Furthermore, it was an object of the present invention to provide linker molecules which can be used in the processes for purifying peptides and peptide mixtures of the present invention. The object of the invention is achieved by the features of the patent claims. Advantageous embodiments of the invention are described in the summary of the invention. The method of the present invention is based on a catch & release purification principle. First, the desired peptide is synthesized by means of solid phase peptide synthesis on the resin with one or more capping steps.
  • a linker which preferably contains an affinity group A, which is protected by a protective group, by reaction with the free N-terminus of the synthesized peptide.
  • the peptide is then cleaved from the synthesis resin and the protective group on the affinity group A of the linker is simultaneously removed.
  • the linker preferably also contains a cleavage group R, which is cleaved under appropriate cleavage conditions and releases the peptide.
  • the invention relates to a linker for use in a method for purifying a peptide.
  • the invention relates to a linker molecule for the purification of a peptide according to the formula A-E-L-R, where A is, R3 is the same or different and is selected from the group consisting of H, C1 to C10 alkyl (preferably C1 to C5 alkyl), C3 to C6 aryl (preferably C5 to C6 aryl), C2 to C10 alkenyl (preferably C2 to C5 alkenyl), C2 to C10 alkynyl (preferably C2 to C5 alkynyl), C1 to C10 alkyl ether (preferably C1 to C5 alkyl ether), aryl ether, alkylamide, arylamide, alkyl carbamate, alkyl ester, aryl ester, sulfonic acid, alkylsulfonic acid ester, arylsulfonic acid ester
  • R3 is the same or different and is selected from the group consisting of H, C1 to C5 alkyl, C5 to C6 aryl, C2 to C5 alkenyl, C2 to C5 alkynyl, C1 to C5 alkyl ether, aryl ether, alkylamide, arylamide, alkyl carbamate, alkyl ester, aryl ester, sulfonic acid, alkylsulfonic acid ester, arylsulfonic acid ester, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OR1 and OR2, wherein R1 and R2 are the same or different and are selected from the group consisting of H or a protecting group, wherein the protecting group is selected from the group consisting of ⁇ HUKPYZNHUKZM # ⁇ > ⁇ $% 6HO[ZMPYZNHUKZM #6> ⁇ $% #+& ⁇ HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM # ⁇ 9 ⁇ $%
  • the protecting group is selected from the group consisting of (trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), methylthiomethyl (MTM), ether (Ac2O), azidomethyl ether, allyl ether, prenyl ether, alkyl ether, benzyl ether, silyl ether (preferably trimethylsilyl ether (TMS), triisopropylsilyl ether (TiPS), tert-butyldimethylsilyl ether (TBDMS), tert-butyldiphenylsilyl ether (TBDPS) and triphenylsilyl ether (TPS)) and acetal.
  • SEM trimethylsilyl)ethoxymethyl
  • MTM methylthiomethyl
  • ether Ac2O
  • azidomethyl ether allyl ether
  • prenyl ether alkyl ether
  • benzyl ether silyl ether (preferably trimethylsilyl ether (TMS),
  • R5 is selected from the group consisting of H
  • Z is selected from the group consisting of H, C1 to C3 alkyl, and N-methyl.
  • r 1-20, preferably 1-10, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19 and 20.
  • n 1-10, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10.
  • k 1-6, such as 1, 2, 3, 4, 5 and 6.
  • the linker should preferably be completely cleaved after successful purification, so that no or only negligible traces of the linker are present in the synthesized peptide (target peptide).
  • the cleavage conditions should preferably be compatible with the functional groups used in peptide synthesis. For example, a hydrazine-cleavable linker proved to be advantageous because the mild cleavage conditions are compatible with all common functional groups in peptide synthesis.
  • the affinity binding of the linker to the purification solid phase by means of the affinity group A is preferably achieved by chelating a catechol derivative (affinity group A) in the form of a bidentate bond to the metal oxide surface of the purification solid phase.
  • affinity group A catechol derivative
  • the affinity group A can be attached to the cleavage group R by covalent bonding.
  • the linker preferably comprises an affinity group A, a linkage L, a cleavage group R and optionally an enhancer E.
  • the linker has a structure A-L-R.
  • the linker has a structure A-E-L-R.
  • R3 is the same or different and is selected from the group consisting of H, OH, C1 to C5 alkyl, C5 to C6 aryl, C2 to C5 alkenyl, C2 to C5 alkynyl, C1 to C5 alkyl ether, aryl ether, alkylamide, arylamide, alkyl carbamate, alkyl ester, aryl ester, sulfonic acid, alkylsulfonic acid ester, arylsulfonic acid ester, F, Cl, Br, I, NO 2 and NH 2nd
  • A is selected from the group consisting of and , where R3 is the same or different, selected from the group consisting of H, OH, C1 to C10 alkyl (preferably C1 to C5 alkyl), C3 to C6 aryl (preferably C5 to C6 aryl), C2 to C10 alkenyl (preferably C2 to C5 alkenyl), C2 to C10
  • R 3 electron-withdrawing (e.g. NO 2 , SO 3 H) or electron-donating (e.g. OMe) substituent.
  • the splitting group R is 1,3-dimethyl-5-acylbarbituric acid (DAB).
  • the cleavage group R is (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)alkyl (Dda).
  • the linker has the following chemical structure, wherein the cleavage group R is DAB: In one embodiment, the linker has the following chemical structure, wherein the cleavage group R is Dda: In one embodiment, the linker molecule is selected from the group consisting of and .
  • alkyl refers to a branched or unbranched saturated hydrocarbon group preferably having 1 to 10 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, pentyl, and the like.
  • Preferred alkyl groups have 1-10 carbon atoms, preferably 1-5 or 1-3, 2 or 1 carbon atoms.
  • alkyl groups described herein may be "substituted alkyl groups" in which one or more hydrogen atoms are substituted by a substituent such as halogen, cycloalkyl, alkoxy, hydroxyl, aryl or carboxyl.
  • a substituent such as halogen, cycloalkyl, alkoxy, hydroxyl, aryl or carboxyl.
  • heteroalkyl groups described herein may be "substituted heteroalkyl groups" in which one or more hydrogen atoms are substituted with a substituent such as halogen, cycloalkyl, alkoxy, hydroxyl, aryl or carboxyl.
  • cycloalkyl refers to a configuration derived from a cycloalkane by removal of a hydrogen atom, preferably forming cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl or the like.
  • cycloalkyl groups described herein may be "substituted cycloalkyls" in which one or more hydrogen atoms are substituted with a substituent such as halogen, cycloalkyl, alkoxy, hydroxyl, aryl or carboxyl.
  • alkoxy refers to a straight chain, branched or cyclic hydrocarbon configuration and combinations thereof, preferably containing 1-7 carbon atoms, more preferably 1-6, 1-5, 1-4 or 1-3 carbon atoms including an oxygen atom at the attachment site (such as O-alkyl).
  • alkoxy group is represented by the formula -OR or -ROR (such as -CH2OR), where R can be an alkyl group optionally substituted with halogen, aryl (also referred to as aryloxy), cycloalkyl or halogenated alkyl.
  • Suitable alkoxy groups are methoxy, ethoxy, n-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, sec-butoxy, cyclohexyloxy and the like.
  • aryl refers to any carbon-based aromatic group including but not limited to benzene, naphthalene and the like.
  • aromatic also includes a "heteroaryl” group, which is defined as an aromatic group containing at least one heteroatom in the ring of the aromatic group.
  • heteroatoms include nitrogen, oxygen, and sulfur.
  • the aryl group may be substituted with one or more groups including, but not limited to, alkyl, aryl, halogen, nitro, hydroxy, carboxylic acid, or alkoxy, or the aryl group may be unsubstituted.
  • heterocycles are acridinyl, azaindole (1H-pyrrolopyridinyl), azabenzimidazolyl, azaspirodecanyl, azepinyl, azetidinyl, aziridinyl, benzimidazolyl, benzofuranyl, dihydrobenzofuranyl, benzothiofuranyl, benzothiophenyl, benzoxazolyl, benzothiazolyl, benzotriazolyl, benzotetrazolyl, tooxazolyl, benzisothiazolyl, carbazolyl, 4aH-carbazolyl, carbolinyl, chromanyl, chromenyl, cinnolinyl, decahydroquinolinyl, 4,5-dihydrooxazolinyl, dioxazolyl, dioxazinyl, 1,3-dioxolanyl, 1,3-di
  • amine refers to a group of the formula -NRR', where R and R' can independently be hydrogen or an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, cycloalkyl, halogenated alkyl or heterocycloalkyl group as described above.
  • primary amine refers to a group of the formula -NH 2 .
  • secondary amine refers to a group of the formula -NRH, where R can be an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, cycloalkyl, halogenated alkyl or heterocycloalkyl group as described above.
  • secondary amine refers to a group of the formula -NRR', where R and R' can independently be an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, cycloalkyl, halogenated alkyl or heterocycloalkyl group as described above.
  • amide or "amido” is represented by the formula -C(O)NRR', where R and R' can independently be a hydrogen atom, an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, cycloalkyl, halogenated alkyl or heterocycloalkyl group as described above.
  • a suitable amido group is acetamido.
  • a “peptide”, also called “polyamide” or “oligoamide”, in the sense of the present invention is a chemical compound consisting of two or more amino acids which are covalently linked together by peptide bonds, also called amide bonds. Peptide bonds are formed by a condensation reaction in which the carboxyl group of one amino acid reacts with the amino group of another amino acid, releasing a molecule of water.
  • alkylamino refers to alkyl groups as defined above in which at least one hydrogen atom is replaced by an amino group.
  • carboxyl refers to a -COOH radical.
  • Substituted carboxyl refers to -COOR, where R is aliphatic, heteroaliphatic, alkyl, heteroalkyl, or a carboxylic acid or carboxylic acid ester.
  • carboxyl ester refers to -COOR, where R is alkyl.
  • hydroxyl is represented by the formula -OH.
  • hydroxyalkyl refers to an alkyl group in which at least one hydrogen atom is substituted by a hydroxyl group.
  • aralkyl or “alkylaryl” refers to an aryl group having an alkyl group, as defined above, attached to the aryl group, as defined above.
  • An example of an aralkyl group is a benzyl group.
  • Preferred optional substituents include, for example, the substituents defined for R3.
  • the term “carboxamide” is represented by the formula -C(O)-N(R)-R.
  • the term “primary, secondary or tertiary amine” is represented by the formula -N(R)-R.
  • the term “carbamate” is represented by the formula -NR-C(O)-O-R.
  • the term “imide” is represented by the formula -C(O)-N(R)-C(O)-R'.
  • the term “sulfide” is represented by the formula -S-R.
  • the term “sulfinyl” is represented by the formula -S(O)R.
  • sulfonyl is represented by the formula -SO 2 R.
  • sulfino is represented by the formula -SO 2 H.
  • sulfo or sulfonic acid
  • sulfonic acid ester is represented by the formula -SO 3 R, where R is preferably alkyl or aryl.
  • R, R' are preferably independently selected from the group of H, alkyl, aryl or according to one of the embodiments described above.
  • the groups R, R' also include the possibility of any group being attached to R or R'.
  • nitro refers to a NO 2 group.
  • protecting groups for use with the disclosed compounds are described in Greene and Wut's Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd Ed.; John Wiley & Sons, New York, 1999 and recited in various embodiments of the present invention.
  • the protecting groups are removed under conditions that do not affect the remaining portion of the molecule. These methods are well known in the art and include acid hydrolysis, hydrogenolysis and the like. Possible methods for the removal of protecting groups are also set forth in various embodiments of the present invention and in the examples.
  • Other protecting groups within the meaning of the present invention include, for example, without limitation, tert-butyloxycarbonyl (Boc) and fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc).
  • the removal of the protecting groups is also referred to as "deprotection" and the molecule after removal is referred to as a "deprotected molecule".
  • Particular examples of the presently disclosed compounds contain one or more asymmetric centers; therefore, these compounds can exist in various stereoisomeric forms. Accordingly, the compounds and compositions can be used as individual pure enantiomers or as stereoisomer mixtures, including racemic mixtures.
  • Double bonds which are present in the molecules according to the invention can be present in a cis or (Z) arrangement or a trans or (E) arrangement. In a cis or (Z) arrangement, both substituents are on the same side of the reference plane of the double bond.
  • both substituents of the double bond are on opposite sides of the reference plane of the double bond.
  • the compounds according to the invention can also be present in various polymorphic forms, e.g. as amorphous and crystalline polymorphic forms. All polymorphic forms of the compounds according to the invention are within the scope of the invention and are a further aspect of the invention.
  • the compounds according to the invention can also be present in various tautomeric forms, in particular the compounds can be present in the various forms of keto-enol tautomerism (keto form and enol form).
  • the compound of the invention may also contain deuterium as a replacement for hydrogen.
  • group A of the linker molecule comprises one or more protective groups.
  • the method additionally comprises the removal of the one or more protective groups of group A during or after the separation of the linker peptide construct from the synthesis solid phase, preferably by the addition of trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the separation of the protective group can also be carried out by adding other reagents.
  • the reagent is selected according to the protective group selected. A person skilled in the art is able to select a suitable reagent for the separation of these protective groups depending on the protective group, for example for the protective groups mentioned in the embodiments of this invention.
  • the linker peptide construct is released by adding reagent K (TFA/H2O/thioanisole/phenol/EDT in a volume ratio of 82.5:5:5:5:2.5) (sub-step b.).
  • the peptide is released from the linker peptide construct by adding a nucleophile (sub-step e.).
  • Nucleophiles for releasing the peptide from the linker peptide construct in the sense of the present invention include, without limitation, hydrazine, hydroxylamine, amino alcohols such as ethanol-2-amine and diamines such as 1,2-ethylenediamine.
  • the peptide is released from the linker-peptide construct by adding a nucleophile (sub-step e.), preferably by adding hydrazine, hydroxylamine, a diamine or an amino alcohol.
  • the peptide is released from the linker-peptide construct by adding hydrazine.
  • the peptide is released from the linker-peptide construct by adding hydroxylamine.
  • the peptide is released from the linker-peptide construct by adding hydrazine and/or hydroxylamine.
  • release refers here to the cleavage of the R group of the linker molecule, i.e. the cleavage of a covalent bond between the linker molecule and the peptide.
  • the purification process of the present invention preferably comprises several sub-steps: a) attachment of a linker molecule to a solid phase-synthesized peptide (linker-peptide construct) b) cleavage of the linker-peptide construct from the synthesis solid phase and simultaneous cleavage (deprotection) of the affinity group of the linker c) binding of the linker-peptide construct to a purification solid phase d) one or more washing steps to remove impurities, in particular termination sequences of the target peptide e) cleavage of the cleavage group and residue-free release of the target peptide f) optionally recycling of the metal oxide phase for reuse as a purification solid phase.
  • the insoluble metal oxides of the metal oxide phase are repeatedly washed with 3 to 6M HCl, for example 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 or 6 M HCl, until no residues of peptides or linker cleavage products can be found in the washing solution.
  • the metal oxide is neutralized with water and water/MeCN (1:1) and dried before it can be used again.
  • the invention relates to a method for producing and purifying a peptide, comprising a.
  • a linker-peptide construct comprising a linker and a peptide, wherein the linker comprises an affinity group A and a cleavage group R and is covalently bound to the peptide via the cleavage group R and the peptide was synthesized on a synthesis solid phase and is bound to the synthesis solid phase, b. Cleavage of the linker-peptide construct from the synthesis solid phase, c. Binding of the linker-peptide construct via the affinity group A of the linker to a purification solid phase, d. one or more washing steps to remove impurities from the linker-peptide construct, and e.
  • the preparation of the linker-peptide construct comprises adding the linker molecule to the peptide.
  • preparation of the linker peptide construct comprises the addition of a linker molecule precursor, wherein the linker peptide precursor comprises the groups R and L of the linker molecule and the group L comprises one or more protecting groups.
  • preparation of the linker peptide construct additionally comprises the cleavage of the one or more protecting groups of the group R of the linker molecule precursor and attachment of the group A, optimally the group A-E, to the group R of the linker molecule precursor.
  • linker molecule precursor refers to a part of the linker molecule of the present invention, preferably to a molecule which comprises the groups L and R, but not the groups A and E.
  • the linker molecule precursor can be extended by the groups A and optionally E by adding appropriate reagents in order to obtain a linker molecule according to the present invention according to the formula A-E-L-R or A-L-R.
  • extend refers to the covalent bonding of groups A or A-E to group L of the linker molecule precursor.
  • linker peptide construct or "peptide linker construct” in the sense of the present invention refers to a molecule comprising a linker molecule according to the present invention and a peptide, wherein the linker molecule is covalently bonded to the peptide by the group R.
  • the purification solid phase for example a metal oxide phase, can be recycled and used again as a purification solid phase.
  • the linker peptide construct is produced by binding the linker to the peptide.
  • the linker peptide construct is produced by binding the linker to the peptide under basic conditions.
  • the affinity group A is protected by one or more protective groups before the linker peptide construct is split off from the synthesis solid phase.
  • the protective groups of the affinity group A are removed during the Cleaving the linker construct from the affinity group A.
  • the cleavage of the protective group can also be referred to as "deprotection".
  • the protective groups of the affinity group A are cleaved by adding TFA, preferably 95% TFA.
  • the linker peptide construct is cleaved from the synthesis solid phase by adding TFA, preferably 95% TFA.
  • the deprotection (cleavage of the protective group of the affinity group A) and cleavage of the linker peptide construct from the synthesis solid phase was carried out with 95% TFA.
  • the peptide is released from the linker peptide construct by adding hydrazine.
  • the cleavage group R of the linker is cleaved by adding hydrazine and the peptide is released from the linker peptide construct.
  • the binding of the linker peptide construct via the affinity group A of the linker to a purification solid phase additionally comprises the addition of a buffer solution.
  • the buffer solution is an aqueous buffer solution comprising acetic acid (AcOH), Tris, phosphate, imidazole, piperazine, glycine, glycylglycine, maleate, malate, formate, citrate and/or succinate.
  • the aqueous buffer solution additionally comprises an inorganic acid, preferably HCl and/or a base, preferably an alkali hydroxide and/or alkaline earth hydroxides.
  • the buffer solution additionally comprises an organic solvent, preferably acetonitrile (ACN) and/or DMSO.
  • the buffer solution has a pH of 3.0 to 8.0, preferably 3.3 to 7.0, for example 3.0, 3.3, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 and 8.0.
  • the buffer solution comprises a 0.1M HCl/ACN/DMSO solution, preferably in a volume ratio of 1.25:1:0.25.
  • the one or more washing steps comprise the addition of a washing solution.
  • the washing solution comprises one or more solvents in which the purification solid phase is insoluble, preferably selected from the group consisting of water, dichloromethane (DCM), chloroform, carbon tetrachloride, ethyl acetate, diethyl ether, methyl tert-butyl ether, acetic acid, 2,2,2-trifluoroethanol, hexafluoroisopropanol, acetonitrile (ACN), tetrahydrofuran (THF), dioxane, pyridine, acetone, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, phenol, formamide, N-butylpyrrolidone (NBP) and N-methylpyrrolidone (NMP).
  • DCM dichloromethane
  • NBP N-butylpyrrolidone
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • the washing solution additionally comprises one or more solvents in which peptides and in particular peptide impurities show a high solubility, preferably DMSO and/or DMF.
  • the washing solution additionally comprises one or more chaotropic substances, preferably selected from the group consisting of guanidinium salts, thiocyanates, perchlorates, iodides, butanol, phenol, thiourea, urea, and ammonium sulfate. Chaotropic substances advantageously suppress nonspecific peptide interactions and thus improve the separation of peptide impurities and thus improve the purification of the synthesized peptide.
  • the washing solution is a 0.1M HCl/ACN solution.
  • the one or more washing steps comprise the addition of HCl/ACN, preferably 0.1M HCl/ACN.
  • the impurities comprise termination sequences of the peptide, which have arisen, for example, during solid phase synthesis.
  • Purification solid phases according to the present invention preferably comprise metal oxides that can immobilize catechols as ligands via hydrogen bonds or covalent bonds. Metal oxides with a large specific surface area, which is required for efficient binding, can be produced quickly and inexpensively or, depending on the type of metal oxide, are even already commercially available.
  • the purification solid phase comprises a metal oxide, preferably a metal oxide selected from the group consisting of TiO 2 , Fe 2 O 3 , Al 2 O 3, ZrO 2, Fe 3 O 4 , silicate and aluminosilicate.
  • the purification solid phase comprises a metal oxide, preferably a metal oxide selected from the group consisting of TiO 2 , Fe 2 O 3 , Al 2 O 3, ZrO 2, Fe 3 O 4 , montmorillonite, kaolinite and mullite.
  • solid phase synthesis in the sense of the present invention refers to a method for producing peptides. The method is characterized by its efficiency and the ability to produce relatively complex peptides in an automated process. The method essentially comprises the following steps: 1) Immobilization of the first building block of the peptide: The first step in solid phase peptide synthesis is the covalent bonding of an amino acid to a solid carrier material, also called the "synthesis solid phase".
  • Step-by-step chain extension After the first amino acid has been immobilized, further amino acids are gradually covalently bonded to the first amino acid. Before each step, the protective group of the free amino group of the previous amino acid, which is already bound, is removed so that the next amino acid can be linked to it via a peptide bond. After the addition of an amino acid, a washing step is carried out to remove excess reagents and by-products. 3) Cleavage and purification: As soon as the peptide chain has reached the desired length, it is cleaved from the solid support material.
  • Synthesis solid phases are used for solid phase synthesis, especially for peptide synthesis.
  • Synthesis solid phases include, for example, without limitation, polystyrene-based resins such as Wang resin and Rink amide resin, polyethylene glycol-based (PEG-based) resins such as TentaGel resin and ChemMatrix resin, polyacrylamide-based resins such as PAM resin or combinations of these, also called hybrid resins such as Cross-Linked Ethoxylate Acrylate Resin (CLEAR) resin.
  • polystyrene-based resins such as Wang resin and Rink amide resin
  • PEG-based resins such as TentaGel resin and ChemMatrix resin
  • polyacrylamide-based resins such as PAM resin or combinations of these
  • hybrid resins such as Cross-Linked Ethoxylate Acrylate Resin (CLEAR) resin.
  • the choice of the synthesis solid phase depends on various factors, including the specific requirements of peptide synthesis, such as the length and complexity of the peptide, the hydrophobicity and the need to protect or deactivate certain functional groups.
  • a person skilled in the art is able to select a suitable synthesis solid phase for the synthesis of a peptide by solid phase synthesis based on his or her specialist knowledge.
  • the production of the linkers of the present invention also called “affinity linkers” can advantageously be carried out in a few steps from inexpensive chemicals with satisfactory overall yields and is scalable to the multigram scale.
  • the price of metal oxides is low and due to the high loading only a small amount of material has to be used.
  • the method of the present invention enables the purification of peptides regardless of their functional groups.
  • the cleaved linker also called “cleavage reagent”
  • cleavage reagent can be removed by evaporation and does not remain in the end product. Precipitation of the peptide is therefore not absolutely necessary, so that protected peptides can also be purified.
  • the present invention relates to a kit which comprises a linker and optionally reagents and solvents for the purification of peptides using the method of the present invention.
  • the invention relates to a kit for the purification of a peptide according to the process of the invention, characterized in that the kit comprises a. a linker molecule according to one of claims 1 to 5, or b. a linker molecule precursor comprising the groups R and L of a linker molecule according to one of claims 1 to 5 and reagents for the covalent bonding of group A, optimally group A-E, to group R of the linker molecule precursor, and c. optionally reagents and solvents for the cleavage of protective groups of group A of the linker molecule or group R of the linker molecule precursor and for the one or more washing steps.
  • the kit comprises a. a linker molecule according to one of claims 1 to 5, or b. a linker molecule precursor comprising the groups R and L of a linker molecule according to one of claims 1 to 5 and reagents for the covalent bonding of group A, optimally group A-E, to group R of the linker molecule precursor,
  • the invention relates to the use of the linker molecule according to the invention in a method according to the present invention.
  • the method of the present invention is preferably used for the purification of peptides which have been produced by means of solid phase synthesis.
  • the peptides purified by means of the method of the present invention are then further purified by means of chromatographic methods, for example HPLC.
  • the method of the present invention can be used as the sole purification method for peptides produced by means of solid phase synthesis.
  • the method of the present invention can also be used as a first purification (pre-purification) before a subsequent purification by means of chromatographic methods.(for example HPLC) and thus improve the performance of these chromatographic methods.
  • pre-purification a first purification
  • HPLC chromatographic methods
  • the above-mentioned features and aspects relating to the linker or linker molecule have structural and functional effects on the other aspects of the invention, which comprise the method for purifying peptides and the kit, so that the linker or linker molecule, the method and the kit can each be described by the features of the other aspects or derived from them.
  • FIGURES The invention will be explained in more detail below using the figures and examples. The figures and examples do not limit the scope of the invention, but represent preferred embodiments of the aspects of the invention which serve to illustrate.
  • Fig.1 Developed affinity purifications in the order in which they were published (prior art).
  • Fig.2 Purification process of the start-up Belyntic (prior art)
  • Fig.3 Schematic structure of the linker molecules for use in the method of the present invention.
  • the cleavage group R reacts with the N-terminus of the peptide sequence to be purified.
  • A affinity group
  • E enhancer
  • L linkages
  • R cleavage group.
  • Fig.4 Schematic sequence of a catch & release purification according to the present invention.
  • the affinity group A of the linker binds to the purification solid phase to form an affinity pair.
  • Fig.5 Schematic representation of the catch & release purification according to the present invention using a catechol-Dda/DMB linker. In the first step, the linker was bound to the peptide bound to the resin of the synthesis solid phase under basic conditions (production of the linker-peptide construct).
  • the cleavage group R of the linker molecule precursor which comprises one or more protective groups, binds to the N-terminus of a peptide bound to a solid phase.
  • the one or more protective groups of the group R cleaved and the linker molecule precursor and the groups A-E are extended to obtain a linker peptide construct.
  • the affinity group A of the linker peptide construct binds to the purification solid phase to form an affinity pair.
  • the peptide is then released by cleaving the group R.
  • linker synthesis The production of the linkers was carried out over 6 steps, with a total yield of 10% (8, DAB linker) and 11% (9, Dda linker). An adapted synthesis route led to larger amounts of linkers on a multigram to decagram scale.
  • the synthesized linkers have the following structure: Peptide purification using metal oxide affinity binding Zirconium oxide ZrO was used for the purification experiment. 2 as metal oxide and the peptide H-VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG-NH synthesized by SPPS 2 (SEQ ID No.1) ( Figure 5).
  • the linker molecules were coupled quantitatively to the peptide on the resin of the synthesis solid phase in a separate approach (the SPPS of the peptide was carried out using Ac 2 O-capping).
  • the peptide was then cleaved from the resin of the synthesis solid phase by adding TFA and in the same step all protective groups of the affinity group A of the linker were removed (Figure 5, step 1).
  • the mixture was evaporated and the residue was dissolved in a mixture of 0.1M HCl/ACN/DMSO (1.25:1:0.25) and the solution was added to a purification solid phase containing zirconium oxide. After a reaction time of 1 hour, the suspension was centrifuged and the supernatant (Figure 5, step 2) was removed.
  • Method 2 A solution of NaClO 2 (11.95 g, 132.2 mmol, 2.0 equiv.) in H 2 O (66 mL) was added to a solution of 2,3-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde (26; 12.1 g, 66.1 mmol) and NaH 2 PO 4 ⁇ H 2 O (10.1 g, 72.6 mmol, 1.10 equiv) in H 2 O (27 mL) and DMSO (70 mL) were added dropwise. After stirring for another 30 min, the mixture was converted to a two-phase mixture of CH 2 Cl 2 and aqueous saturated NaHCO 3 solution (1:1, 200 mL).
  • Methyl 2,3-dihydroxy-5-nitrobenzoate (22; 1.06 g, 4.97 mmol, 1.00 equiv.) was added to the remaining red oil and the mixture was stirred at 160°C for 2 h. After cooling to room temperature, the solution was diluted with EtOAc (65 mL) and saturated aqueous NaHCO3 solution (8 mL) was added. The phases were separated and the organic phase was washed with saturated aqueous NaHCO3 solution (50 mL) and saturated aqueous NaCl solution (50 mL). The organic phase was dried over Na 2 SO 4 dried and the solvent removed under reduced pressure.
  • H2O 230 mL
  • CH2Cl2 100 mL
  • the aqueous phase was acidified with 10% aqueous citric acid solution (50 mL), after which the orange solution became colorless.
  • the aqueous phase was again extracted with CH2Cl2 ( 2 ⁇ 100 mL).
  • Linker synthesis during solid phase synthesis of peptides can also be assembled on the synthesis solid phase (see Figure 7).
  • a cleavage group R is immobilized with a free amine of the peptide on the synthesis solid phase in a similar way to the previous procedure.
  • the linker currently comprises structures of the parts L-R (such as in version 62) or E-L-R. If the linker contains protective groups that are compatible with standard peptide solid phase synthesis (e.g.
  • the synthesis resin with immobilized peptide and deprotected amino function was swollen for 10 minutes in the corresponding solvent and the solvent was filtered off.
  • the reagent in one embodiment the linker Dda, was then added according to the reaction conditions to be tested and the solution was mixed with the synthesis solid phase. After the reaction had ended, the liquid reaction medium was filtered off and the synthesis solid phase was washed several times.
  • solvents are chosen in which the metal oxides used are insoluble, e.g. water, water, dichloromethane (DCM), chloroform, carbon tetrachloride, ethyl acetate, diethyl ether, methyl tert-butyl ether, acetic acid, 2,2,2-trifluoroethanol, hexafluoroisopropanol, acetonitrile, tetrahydrofuran (THF), dioxane, pyridine, acetone, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, phenol, formamide, N-butylpyrrolidone (NBP), N-methylpyrrolidone (NMP).
  • N-butylpyrrolidone N-methylpyrrolidone
  • Additives can also be added to improve the solubility of peptides and in particular peptide impurities, e.g. B. DMSO, DMF etc.
  • Chaotropic substances such as guanidinium salts, thiocyanates, perchlorates, iodides, butanol, phenol, thiourea, urea or ammonium sulfate, which are used in particular as aqueous solutions, can be used to suppress non-specific peptide interactions.
  • the resulting suspensions must be separated into their solid (metal oxide purification solid phase, possibly with bound target peptide linker construct) and liquid components (supernatants or washing solutions).
  • the identity of the peaks in the chromatogram is determined using MS.
  • MS By integrating the UV absorption signals at 214 nm, the percentage of the target peptide in the total area of all peptide signals is then determined.
  • the composition and purity of all mixtures during the purification method (supernatant after immobilization on the metal oxide purification solid phase, content of the washing solutions, elution solutions) are determined analogously.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Linkermolekül für die Aufreinigung eines Peptids gemäß der Formel A-E-L-R. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Aufreinigung eines Peptids, umfassend a. Herstellung eines Linker-Peptid-Konstruktes, umfassend ein Linkermolekül und das Peptid, wobei das Peptid kovalent an einer Synthese Festphase gebunden ist und das Linkermolekül durch die Gruppe R kovalent an das Peptid gebunden ist, b. Abtrennung des Linker-Peptid-Konstruktes von der Synthese-Festphase, c. Bindung des Linker-Peptid-Konstruktes über die Gruppe A des Linkermoleküls an eine Aufreinigungs-Festphase, d. einen oder mehrere Waschschritte, und e. Freisetzung des Peptids aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Spaltung der Gruppe R des Linkermoleküls. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit für die Aufreinigung eines Peptids gemäß des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 6 bis 13, charakterisiert dadurch, dass das Kit umfasst a. ein Linkermolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, oder b. einen Linkermolekül-Vorläufer umfassend die Gruppen R und L eines Linkermoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und Reagenzien für die kovalente Anbindung der Gruppe A, optimal der Gruppe A-E an die Gruppe R des Linkermolekül-Vorläufers, und c. optional Reagenzien und Lösungsmittel für die Abspaltung von Schutzgruppen der Gruppe A des Linkermoleküls oder der Gruppe R des Linkermolekül-Vorläufers und für die einen oder mehreren Waschritte. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Linkermoleküls in einem Verfahren für die Aufreinigung eines Peptides.

Description

VERFAHREN ZU SYNTHETISCHEN REINIGUNG VON PEPTIDEN OHNE HPLC BESCHREIBUNG Die Erfindung betrifft den Bereich der Peptidsynthese, insbesondere der Peptid- Festphasensynthese und der Aufreinigung der dadurch hergestellten Syntheseprodukte. Die Erfindung betrifft ein Linkermolekül für die Aufreinigung eines Peptids gemäß der Formel A- E-L-R. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Aufreinigung eines Peptids, umfassend a. Herstellung eines Linker-Peptid-Konstruktes, umfassend ein Linkermolekül und das Peptid, wobei das Peptid kovalent an einer Synthese Festphase gebunden ist und das Linkermolekül durch die Gruppe R kovalent an das Peptid gebunden ist, b. Abtrennung des Linker-Peptid- Konstruktes von der Synthese-Festphase, c. Bindung des Linker-Peptid-Konstruktes über die Gruppe A des Linkermoleküls an eine Aufreinigungs-Festphase, d. einen oder mehrere Waschschritte, und e. Freisetzung des Peptids aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Spaltung der Gruppe R des Linkermoleküls. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit für die Aufreinigung eines Peptids gemäß des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 6 bis 13, charakterisiert dadurch, dass das Kit umfasst a. ein Linkermolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, oder b. einen Linkermolekül-Vorläufer umfassend die Gruppen R und L eines Linkermoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und Reagenzien für die kovalente Anbindung der Gruppe A, optimal der Gruppe A-E an die Gruppe R des Linkermolekül-Vorläufers, und c. optional Reagenzien und Lösungsmittel für die Abspaltung von Schutzgruppen der Gruppe A des Linkermoleküls oder der Gruppe R des Linkermolekül- Vorläufers und für die einen oder mehreren Waschritte. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Linkermoleküls in einem Verfahren für die Aufreinigung eines Peptides. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Aufreinigung eines Peptids, umfassend die Herstellung eines Linker-Peptid-Konstruktes, umfassend einen Linker und ein Peptid, wobei der Linker eine Affinitätsgruppe A und eine Spaltgruppe R umfasst und über die Spaltgruppe R kovalent an das Peptid gebunden wird und das Peptid an einer Synthese-Festphase synthetisiert wurde und an die Synthese-Festphase gebunden ist, Abspaltung des Linker-Peptid-Konstruktes von der Synthese-Festphase, Bindung des Linker-Peptid-Konstruktes über die Affinitätsgruppe A des Linkers an eine Aufreinigungs-Festphase, einen oder mehrere Waschschritte zur Entfernung von Verunreinigungen aus dem Linker-Peptid-Konstrukt, und Freisetzung des Peptids aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Spaltung der Spaltgruppe R des Linkers und Abtrennung des Linkers vom Peptid. Die Erfindung betrifft weiterhin Linker zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, welche eine Affinitätsgruppe A, Verknüpfung L, eine Spaltgruppe R und optional einen Verstärker E umfassen. HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK Die Festphasensynthese (SPPS) ist ein etabliertes Verfahren zur schnellen Synthese von Peptiden, welche unter Einsatz von Überschüssen das Lenken der Reaktion in die gewünschte Richtung ermöglicht, beispielsweise in Richtung eines bevorzugten Syntheseproduktes. Bei der SPPS können diese Überschüsse durch Waschen der festen Phase leicht entfernt werden. Dennoch resultiert das Verfahren der Festphasenpeptidsynthese nicht in allen Fällen in einer zufriedenstellenden Ausbeute der Produkte, die für verschiedene Anwendungen der hergestellten Peptide von höchstmöglicher Reinheit sein müssen. Aus diesem Grunde schließt sich an die Synthese mittels SPPS oft ein chromatographischer Reinigungsschritt mittels HPLC (high- performance liquid chromatography) an, der Limitierungen aufweist, wie beispielsweise die Beladungskapazität der Säulenmaterialien oder die chromatographische Auflösung. Auf Grund dieser Limitierungen stellt die Aufreinigung von Peptidmischungen eine anspruchsvolle Aufgabe dar, die einer hohen Expertise bedarf und beispielswiese der Automatisierung solcher Peptid- Herstellungs- und Aufreinigungsverfahren im Weg steht. Weiterhin steht der parallelisierten Peptid-Festphasensynthese zur schnellen Erzeugung größerer Peptidbibliotheken der Engpass durch eine sequentielle konventionelle HPLC-Aufreinigung gegenüber. Bisher wurde die herkömmliche Aufreinigungskapazität von Peptiden, durch die Verwendung mehrerer kostenintensiver HPLC-Geräte erzielt, welche weiterhin einen hohen Verbrauch an Lösemittel und Säulenmaterial aufweisen. Aus diesen Gründen ist die klassische chromatographische Aufreinigung von Peptiden äußerst zeit- und kostenintensiv. Diese Problemstellung führte im Stand der Technik zu Anstrengungen, die Qualität der synthetisierten Peptide zu verbessern. Eine Möglichkeit, um beispielsweise das Auftreten von Fehlsequenzen zu vermeiden, ist die Einführung eines sog. Capping-Schrittes,[1] bei dem der N- Terminus acetyliert wird und somit für eine Anknüpfung weiterer Aminosäuren nicht zur Verfügung steht. Dies führt zu Abbruchsequenzen, die eine verkürzte korrekte Teilsequenz des Ursprungspeptids aufweisen. Ein weiterer Ansatz beruht ebenfalls auf einem Capping während der Synthese, fügt aber im letzten Syntheseschritt vor der Abspaltung vom polymeren Träger einen Selektivitätslinker an den N-Terminus des Peptids an. Allein die korrekte und vollständige Sequenz trägt diesen Selektivitätslinker und kann über einen weiteren affinitätsbasierten Reinigungs- bzw. Chromatographieschritt an einem polymeren Träger gebunden werden. Die unerwünschten Teilsequenzen tragen diesen Selektivitätslinker nicht und binden im affinitätsbasierten Reinigungsschritt nicht an den polymeren Träger. Die Teilsequenzen können daher durch Waschschritte entfernt werden. Anschließend wird das gebundene Peptid von der Aufreinigungs-Festphase gelöst und als sauberes Produkt erhalten. In den vergangenen Jahrzehnten wurden eine Vielzahl an Varianten eines solchen Prinzips, nachfolgend als Catch & Release-Aufreinigung oder Affinitätsaufreinigung bezeichnet, entwickelt. In Abbildung 1 sind alle Methoden in Reihenfolge ihrer Veröffentlichung aufgeführt. Die Methoden lassen sich entsprechend ihrer Affinitätsbindung oder ihrer Spaltgruppe klassifizieren. Da die Wahl einer geeigneten Affinitätsbindung die größere Herausforderung darstellt, sind die nachfolgenden Erläuterungen entsprechend gegliedert. Die erste Affinitätsaufreinigung wurde bereits 1976 vom Erfinder der SPPS R. B. Merrifield entwickelt.[2] Das Bindungsprinzip basierte auf der Ausbildung einer Thiol-Bindung zwischen Peptid und Aufreinigungsharz. Die Nutzung von Thiolen als Affinitätspartner wurde nachfolgend von mehreren Gruppen adaptiert und durch den Einsatz unterschiedlicher Spaltgruppen entsprechend modifiziert.[3-9] Als in den 90er Jahren vermehrt Labelling-Strategien für Proteine auf Basis von Avidin-Biotin-Wechselwirkungen Anwendung fanden, wurde diese Form der nicht- kovalenten Bindung auch als Variante für die beschriebene Affinitätsaufreinigung eingesetzt.[10- 17] Jedoch konnten sich diese Ansätze, ebenso wie die Thiol-Varianten, nicht als Alternative zur HPLC-Aufreinigung etablieren. Ende der 90er Jahre stieg die Vielfalt an Affinitätsbindungen weiter an und eine Bindung durch Click-Reaktionen [18-20] oder die Bildung eines Oxims [21-26] finden sich bis heute in neu entwickelten Varianten wieder. Ein vielversprechendes Verfahren wurde vom 2018 geründeten Startup Belyntic entwickelt. Der entwickelte Ansatz basiert ebenfalls auf der Bildung eines Oxims als Affinitätseinheit (Aldehyd-funktionalisierte Agarose + Hydroxylamin-Linker). Bei dem spaltbaren Linker handelt es sich um ein Azid, welches unter reduktiven Bedingungen die Spaltung durch eine sogenannte self-immolation auslöst.[26] Auch wenn diese Methode für viele Peptide geeignet ist, gibt es doch einige Einschränkungen. Grundsätzlich ist keine Kompatibilität mit funktionellen Gruppen wie Disulfiden, Aziden und Phosphinen vorhanden. Des Weiteren handelt es sich bei Oximen um Moleküle, die nur in speziellen pH-Bereichen stabil sind, wodurch nicht ausgeschlossen werden kann, dass sich Spuren des Linkers im gereinigten Zielpeptid befinden. Das eingesetzte Lösungsmittel muss zwingend frei von üblichen Verunreinigungen wie Aldehyden oder Ketonen sein, da der Linker sonst an diese und nicht an das Aufreinigungsharz bindet. Ein weiteres Problem ist die Notwendigkeit eines vollentschützten Peptids, da bei diesem Ansatz das Reduktionsmittel im Spaltgemisch verbleibt und ausschließlich durch Fällung des Peptids entfernt werden kann. Soll das Peptid jedoch nach der Synthese noch Schutzgruppen für weitere Reaktion besitzen, ist aufgrund der Polarität keine Fällung möglich. In Anbetracht des Standes der Technik besteht daher ein erheblicher Bedarf an der Entwicklung und Bereitstellung von Verfahren für die Aufreinigung von Peptidgemischen, welche für eine breite Anzahl an Peptiden eingesetzt werden können und welche kostengünstiger und effizienter als die üblicherweise eingesetzten HPLC-Verfahren sind und so beispielsweise eine automatisierte Hochdurchsatzaufreinigung von mittels SPPS hergestellten Peptidgemischen ermöglichen. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG Aufgabe der Erfindung war es, die Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und Verfahren für die Aufreinigung von Peptiden und Peptidgemischen und Materialien zur Anwendung in solchen Verfahren bereitzustellen, welche eine höhere Aufreinigungseffizienz aufweisen und die Aufreinigung von Peptiden mit verschiedenen funktionellen Gruppen ermöglichen und somit eine breite Anwendbarkeit aufweisen. Weiterhin war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung Automatisier- und parallelisierbare Aufreinigungsmethoden und Materialien für die Anwendung in solchen Methoden für Peptide und Peptidgemische, beispielsweise für Festphasen-synthetisierte Peptide bereitzustellen, welche die Kosten der Peptidproduktion drastisch verringern. Weiterhin war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung Linkermoleküle bereitzustehen, welche in den Verfahren zur Aufreinigung von Peptiden und Peptidgemischen der vorliegenden Erfindung angewendet werden können. Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale der Patentansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung beruht auf einem Catch & Release- Aufreinigungsprinzip. Zunächst wird das gewünschte Peptid mittels Festphasenpeptidsynthese am Harz mit einem oder mehreren Capping-Schritten synthetisiert. Anschließend erfolgt die Einführung eines Linkers, welcher vorzugsweise eine Affinitätsgruppe A, welche durch eine Schutzgruppe geschützt ist, enthält, durch Reaktion mit dem freien N-Terminus des synthetisierten Peptides. Das Peptid wird anschließend vom Syntheseharz gespalten und simultan die Schutzgruppe auf der Affinitätsgruppe A des Linkers entfernt. Es folgt die Reaktion zwischen der Affinitätsgruppe A des Linkers und einer Aufreinigungs-Festphase. Peptide mit Fehlsequenz können nicht mit der Aufreinigungs-Festphase (Metalloxid) reagieren und werden mittels Waschschritten entfernt. Der Linker enthält vorzugsweise weiterhin eine Spaltgruppe R, welcher unter entsprechenden Spaltbedingungen gespalten wird und das Peptid freisetzt. In einem Aspekt betrifft die Erfindung einen Linker zur Verwendung in einem Verfahren zur Aufreinigung eines Peptids. In einem Aspekt betrifft die Erfindung Ein Linkermolekül für die Aufreinigung eines Peptids gemäß der Formel A-E-L-R, wobei A
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ist, R3 gleich oder unterschiedlich ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl (vorzugsweise C5 bis C6 Aryl), C2 bis C10 Alkenyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkenyl), C2 bis C10 Alkinyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkinyl), C1 bis C10 Alkylether (vorzugsweise C1 bis C5 Alkylether), Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, Halogenid (vorzugsweise F, Cl, Br oder I), NO2, NH2, OR1 und OR2, wobei R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H oder einer Schutzgruppe, wobei die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus <HUKPYZNHUKZM #<><$% 6HO[ZMPYZNHUKZM #6><$% #+&<HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM #<9<$% f& (Trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), Methylthiomethyl (MTM), Ester, Azidomethyl Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether und Acetal oder benachbarte OR1 und OR2 ein cyclisches Acetal bilden, oder zwei benachbarte R3 einen 3 bis 6-gliedrigen Ring bilden, der Ring Cycloalkyl, Cycloalken, Cycloalkin oder Aryl ist, optional eines oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, O oder S umfasst, und optional mit einem oder mehreren R3 subsituiert ist, X1 abwesend, C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), wobei Alkyl optional substituiert ist mit einem oder mehreren R3, und
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wobei r = 1-20, und R5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, und R7C=O, wobei R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl und Alkylaryl, wobei C3 bis C6 Aryl oder Alkylaryl optional mit zwei oder mehreren R3 subsituiert ist, wobei E ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
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und , n= 1-10, X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH und O, Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C5 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C3 Alkyl) und N-Alkyl (vorzugsweise N-Methyl), R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amin (primäres, sekundäres oder tertiäres Amin), Alkylamin, Hydroxyalkylamin, Alkenylamin, Alkinylamin, Guianidin, Alkylguanidin, Hydroxyguanidin, Alkylharnstoff, Alkylthioharnstoff, Aryl, Alkylaryl, Heteroaryl (vorzugsweise umfassend N, S und/oder O), Alkylheteroaryl (vorzugsweise umfassend N, S und/oder O), (CH2)4NHBoc und 3NHCNNH2, wobei L
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ist, X13 N ist oder abwesend ist, wobei X11 und X14 abwesend sind, wenn X13 abwesend ist, X11, X12 und X14 gleich oder unterschiedlich sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
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und , h=1-10, i=1-10, j=0-24, x = 1-10, X9 abwesend oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH, N-Alkyl (vorzugsweise N- Methyl) und O, X10 ist OH, R6 ist A oder E oder ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
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und , m=0-10, p=0-1, q=0-10, wobei R
Figure imgf000009_0002
ist, X15, X16 und X17 gleich oder unterschiedlich sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbonyl, C=S, C(CH3)=N, C(R9)2, wobei R9 gleich oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C3 Alkyl, Aryl und Heteroaryl (vorzugsweise umfassend N, O und/oder S) und NR10, wobei R10 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C3 Alkyl und Acetyl, und wobei wenn E abwesend ist, R kovalent an A gebunden ist. In einer Ausführungsform ist R3 gleich oder unterschiedlich, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C5 Alkyl, C5 bis C6 Aryl, C2 bis C5 Alkenyl, C2 bis C5 Alkinyl, C1 bis C5 Alkylether, Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OR1 und OR2, wobei R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H oder einer Schutzgruppe, wobei die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus <HUKPYZNHUKZM #<><$% 6HO[ZMPYZNHUKZM #6><$% #+&<HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM #<9<$% f& (Trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), Methylthiomethyl (MTM), Ester, Azidomethyl Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether und Acetal oder benachbarte OR1 und OR2 ein cyclisches Acetal bilden, In einer Ausführungsform ist die Schutzgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus <HUKPYZNHUKZM #<><$% 6HO[ZMPYZNHUKZM #6><$% #+&<HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM #<9<$% f& (Trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), Methylthiomethyl (MTM), Ether (Ac2O), Azidomethyl Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether (vorzugsweiseTrimethylsilylether (TMS), Triisopropylsilylether (TiPS), tert-Butyldimethylsilyl ether (TBDMS), tert- Butyldiphenylsilylether (TBDPS) und Triphenylsilylether (TPS)) und Acetal. In einer Ausführungsform ist X1 abwesend, C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), wobei Alkyl optional substituiert ist mit einem oder mehreren R3, und
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wobei r = 1-20, und R5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, und R7C=O, wobei R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl und Alkylaryl, wobei C3 bis C6 Aryl oder Alkylaryl optional mit zwei oder mehreren R3 subsituiert ist, und wobei A vorzugsweise an der durch r umfassten Bindungsstelle gebunden ist. In einer Ausführungsform ist R5 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, und R7C=O, wobei R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1 bis C5 Alkyl, C3 bis C6 Aryl und Alkylaryl, wobei C3 bis C6 Aryl oder Alkylaryl optional mit zwei oder mehreren R3 subsituiert ist. In einer Ausführungsform ist Z ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C3 Alkyl und N-Methyl. In einer Ausführungsform ist r = 1-20, vorzugsweise 1-10, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20. In einer Ausführungsform ist n = 1-10, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10. In einer Ausführungsform ist h = 1-10, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10. In einer Ausführungsform ist i = 1-10, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10. In einer Ausführungsform ist j = 1-24, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 und 24. In einer Ausführungsform ist x = 1-10, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10. In einer Ausführungsform ist m = 1-10, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10. In einer Ausführungsform ist p = 1-10, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10. In einer Ausführungsform ist q = 1-10, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10. In einer Ausführungsform ist k = 1-6, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5 und 6. Beim Design des Linkers auch „Linkermolekül“ genannt sind dabei verschiedene Aspekte zu berücksichtigen. Die Abspaltung des Linkers sollte nach erfolgreicher Aufreinigung vorzugsweise vollständig erfolgen, sodass keine oder nur vernachlässigbare Spuren des Linkers im synthetisierten Peptid (Zielpeptid) vorhanden sind. Des Weiteren sollten die Bedingungen der Abspaltung vorzugsweise kompatibel mit den in der Peptidsynthese eingesetzten funktionellen Gruppen sein. Dabei zeigte sich beispielsweise ein Hydrazin-spaltbarer Linker als vorteilhaft, da die milden Abspaltungsbedingungen mit allen üblichen funktionellen Gruppen in der Peptidsynthese kompatibel sind. Die Affinitätsbindung des Linkers mittels der Affinitätsgruppe A an die Aufreinigungs-Festphase erfolgt vorzugsweise durch die Chelatisierung eines Catecholderivats (Affinitätsgruppe A) in Form einer bidentaten Bindung an der Metalloxidoberfläche der Aufreinigungsfestphase. Es handelt sich vorzugsweise um eine selektive Bindung, da ausschließlich Catechol-artige Strukturen fest genug an der Oberfläche binden (Kd = 1020), um während der Waschschritte nicht weggespült zu werden. Die Stärke dieser Bindung hängt von der elektronischen Struktur der Catecholderivate, sowie deren Stabilität ab.[27] Außerdem können Verstärkerteile in Nähe der Catechol-Untereinheit zu einer besseren Bindung führen, indem sie Gegenkationen von den Metalloxidoberflächen verdrängen.[28-30] Durch einen Spacer auch Verknüpfungsteil L genannt, kann die die Affinitätsgruppe A durch kovalente Bindung an der Spaltgruppe R befestigt werden. In einer Ausführungsform umfasst der Linker vorzugsweise eine Affinitätsgruppe A, eine Verknüpfung L, eine Spaltgruppe R und optional einen Verstärker E. In einer weiteren Ausführungsform hat der Linker eine Struktur A-L-R. In einer weiteren Ausführungsform hat der Linker eine Struktur A-E-L-R. In einer weiteren Ausführungsform ist der Linker durch die Spaltgruppe R kovalent mit dem synthetisierten Peptid verbunden. Eine Schematische Darstellung eines Linkermoleküls des Aufbaus A-E-L-R ist in Figur 3 gezeigt. In einer Ausführungsform ist A ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
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wobei R3 gleich oder unterschiedlich ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, OH, C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl (vorzugsweise C5 bis C6 Aryl), C2 bis C10 Alkenyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkenyl), C2 bis C10 Alkinyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkinyl), C1 bis C10 Alkylether (vorzugsweise C1 bis C5 Alkylether), Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, Halogenid (vorzugsweise F, Cl, Br oder I), NO2 und NH2 R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H oder einer Schutzgruppe, wobei die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend DVT <HUKPYZNHUKZM #<><$% 6HO[ZMPYZNHUKZM #6><$% #+&<HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM #<9<$% f& (Trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), Methylthiomethyl (MTM), Ether (Ac2O), Azidomethyl Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether (vorzugsweiseTrimethylsilylether (TMS), Triisopropylsilylether (TiPS), tert-Butyldimethylsilyl ether (TBDMS), tert- Butyldiphenylsilylether (TBDPS) oder Triphenylsilylether (TPS)) und Acetal oder benachbarte OR1 und OR2 ein cyclisches Acetal bilden, k = 1-6, r=1-20, wobei der bei n=1-6 gebildete Ring Cycloalkyl, Cycloalken, Cycloalkin oder Aryl ist, optional eines oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, O oder S umfasst, und optional mit einem oder mehreren R3 subsituiert ist, und R5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, und R7C=O, wobei R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl),
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. In einer Ausführungsform ist R3 gleich oder unterschiedlich, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, OH, C1 bis C5 Alkyl, C5 bis C6 Aryl, C2 bis C5 Alkenyl, C2 bis C5 Alkinyl, C1 bis C5 Alkylether, Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, F, Cl, Br, I, NO2 und NH2. In einer Ausführungsform ist A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
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und , wobei R3 gleich oder unterschiedlich ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, OH, C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl (vorzugsweise C5 bis C6 Aryl), C2 bis C10 Alkenyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkenyl), C2 bis C10 Alkinyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkinyl), C1 bis C10 Alkylether (vorzugsweise C1 bis C5 Alkylether), Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, Halogenid (vorzugsweise F, Cl, Br oder I), NO2 und NH2, und R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H oder einer Schutzgruppe, wobei die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend DVT <HUKPYZNHUKZM #<><$% 6HO[ZMPYZNHUKZM #6><$% #+&<HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM #<9<$% f& (Trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), Methylthiomethyl (MTM), Ether (Ac2O), Azidomethyl Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether (vorzugsweise TMS, TiPS, TBDMS, TBDPS oder TPS) und Acetal oder benachbarte OR1 und OR2 ein cyclisches Acetal bilden, In einer Ausführungsform ist A
Figure imgf000013_0001
In einer Ausführungsform ist A
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In einer Ausführungsform ist R4 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
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und , wobei a=0-5, b= 1-5, c=1-5, d=1-5, e=1-5, f=0-1, g = 0-1, R8 gleich oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und C1 bis C3 Alkyl (vorzugsweise CH3), X8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O und S, X2 und B gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C1 bis C6 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C4 Alkyl), Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CH3 und CHOH, X3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und C1 bis C3 Alkyl (vorzugsweise CH3), In einer Ausführungsform ist R3 gleich oder unterschiedlich, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C5 Alkyl, C5 bis C6 Aryl, C2 bis C5 Alkenyl, C2 bis C5 Alkinyl, C1 bis C5 Alkylether, Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, F, Cl, Br, I, NO2, NH2, OR1 und OR2, wobei R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H oder einer Schutzgruppe, wobei die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus <HUKPYZNHUKZM #<><$% 6HO[ZMPYZNHUKZM #6><$% #+&<HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM #<9<$% f& (Trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), Methylthiomethyl (MTM), Ester, Azidomethyl Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether und Acetal oder benachbarte OR1 und OR2 ein cyclisches Acetal bilden, X4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C3 Alkyl, Aryl, Alkylsulfonsäure, Arylsulfonsäure, und X5, X6 und X7 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus C und N. In einer Ausführungsform umfasst der Linker eine Affinitätsgruppe A, vorzugsweise eine Affinitätsgruppe A gemäß einer der Strukturen 1 oder 2.
Figure imgf000014_0001
wobei wenn die Affinitätsgruppe A ungeschützt ist und vorzugsweise mit der Aufreinigungs- Festphase reagiert R1 = R2 = H, wobei R1 in der Synthese des Linkers vorzugsweise eine Schutzgruppe, beispielsweise eine cyclische Acetal-Schutzgruppe wie Acetonid (R1 = R2 = C(CH3)2) oder eine individuelle Schutzgruppen wie ein Ether ist, und R3 = elektronenziehender (beispielsweise NO2, SO3H) oder elektronenschiebender (beispielsweise OMe) Substituent. R1 kann zudem ohne Einschränkung eine Schutzgruppe ausgewählt aus der Gruppe <HUKPYZNHUKZM #<><$% 6HO[ZMPYZNHUKZM #6><$% #+&<HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM #<9<$% f& (Trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), Methylthiomethyl (MTM) Ether (Ac2O, Me3SiCl Abspaltung), Azidomethyl Ether (reduktive Abspaltung), Allyl Ether, Prenyl Ether, diverse Alkylether, Benzylether und Acetale wie Acetonide, Cyclohexyliden, Diphenylmethylen, Ceof (Cyclisches Ethylorthoformat) sein. In einer Ausführungsform umfasst der Linker optional einen Verstärker E, vorzugsweise einen Verstärker E gemäß einer der Strukturen 3 oder 4
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wobei R4 = eine basische Aminosäure ist, vorzugsweise (CH2)4NHBoc (Lysin) oder (CH2)3NHCNNH2 (Arginin). In einer Ausführungsform umfasst der Linker eine Verknüpfung L, vorzugsweise eine Verknüpfung L gemäß einer der Strukturen 5 oder 6
Figure imgf000015_0002
5 6 wobei n = 1-10. Beispielsweise kann hier die in den Beispielen offenbarte Verbindung 3 mit n = 6 genannt werden. In einer Ausführungsform ist L
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, wobei j=0-24, vorzugsweise j=1-15, besonders vorzugsweise j=1-10. In einer Ausführungsform ist L
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, wobei j=0-24, vorzugsweise j=1-15, besonders vorzugsweise j=1-10. In einer Ausführungsform umfasst der Linker eine Spaltgruppe R, vorzugsweise eine Spaltgruppe R gemäß der Struktur 7
Figure imgf000016_0002
wobei X = Z = NMe, CH2, und Y = CO, CMe2. In einer bevorzugten Ausführungsform ist X = Z = NMe und Y = CO. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Spaltgruppe R 1,3-Dimethyl-5-acylbarbitursäure (DAB). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist X = Z = CH2 und Y = CMe2. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Spaltgruppe R (4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)alkyl (Dda). In einer Ausführungsform hat der Linker die folgende chemische Struktur, wobei die Spaltgruppe R DAB ist:
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In einer Ausführungsform hat der Linker die folgende chemische Struktur, wobei die Spaltgruppe R Dda ist: In einer Ausführungsform ist das Linkermolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
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und . In Bezug auf die hier beschriebenen chemischen Verbindungen bezieht sich der Begriff "Alkyl" auf eine verzweigte oder unverzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, Pentyl und dergleichen. Bevorzugte Alkylgruppen haben 1-10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1- 5 oder 1-3, 2 oder 1 Kohlenstoffatome. Eine oder mehrere der hier beschriebenen Alkylgruppen können "substituierte Alkylgruppen" sein, bei denen ein oder mehrere Wasserstoffatome durch einen Substituenten wie Halogen, Cycloalkyl, Alkoxy, Hydroxyl, Aryl oder Carboxyl substituiert sind. Der Begriff "Heteroalkyl" bezieht sich auf eine verzweigte oder unverzweigte gesättigte Alkylgruppe, in der ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome wie Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ersetzt sind, wobei die Heteroatome auch oxidiert sein können, zum Beispiel N=O, S=O, SO2. Eine oder mehrere der hier beschriebenen Heteroalkylgruppen können "substituierte Heteroalkylgruppen" sein, bei denen ein oder mehrere Wasserstoffatome durch einen Substituenten wie Halogen, Cycloalkyl, Alkoxy, Hydroxyl, Aryl oder Carboxyl substituiert sind. Der Begriff "Cycloalkyl" bezieht sich auf eine Konfiguration, die sich von einem Cycloalkan durch Entfernung eines Wasserstoffatoms ableitet, wodurch vorzugsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl oder Ähnliches gebildet wird. Eine oder mehrere der hier beschriebenen Cycloalkylgruppen können "substituierte Cycloalkyle" sein, bei denen ein oder mehrere Wasserstoffatome mit einem Substituenten wie Halogen, Cycloalkyl, Alkoxy, Hydroxyl, Aryl oder Carboxyl substituiert sind. Der Begriff "Alkoxy" bezieht sich auf eine geradkettige, verzweigte oder zyklische Kohlenwasserstoffkonfiguration und deren Kombinationen, die vorzugsweise 1-7 Kohlenstoffatome, noch bevorzugter 1-6, 1-5, 1-4 oder 1-3 Kohlenstoffatome enthalten, die ein Sauerstoffatom an der Bindungsstelle (wie O-Alkyl) einschließen. Ein Beispiel für eine "Alkoxygruppe" wird durch die Formel -OR oder -ROR (wie -CH2OR) dargestellt, wobei R eine Alkylgruppe, gegebenenfalls substituiert mit Halogen, Aryl (auch als Aryloxy bezeichnet), Cycloalkyl oder halogeniertes Alkyl sein kann. Geeignete Alkoxygruppen sind Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, i-Propoxy, n-Butoxy, i-Butoxy, sec-Butoxy, Cyclohexyloxy und ähnliche. Der Begriff "Aryl" bezieht sich auf jede aromatische Gruppe auf Kohlenstoffbasis, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Benzol, Naphthalin und dergleichen. Der Begriff "aromatisch" schließt auch eine "Heteroaryl" Gruppe ein, die als eine aromatische Gruppe definiert ist, die mindestens ein Heteroatom im Ring der aromatischen Gruppe enthält. Beispiele für Heteroatome sind unter anderem Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel. Die Arylgruppe kann mit einer oder mehreren Gruppen substituiert sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Alkyl, Aryl, Halogen, Nitro, Hydroxy, Carbonsäure oder Alkoxy, oder die Arylgruppe kann unsubstituiert sein. Unter dem Begriff "Heterocyclus" versteht man gesättigte (Heterocycloalkyl), teilweise ungesättigte (Heterocycloalkenyl) oder ungesättigte (Heteroaryl) Kohlenwasserstoffringe mit 3 bis 15 Kohlenstoffatomen in einem mono- oder bicyclischen, kondensierten, verbrückten oder spirocyclischen Ring, in dem 1 bis 5 Kohlenstoffatome der 3 bis 15 Ringkohlenstoffatome durch Heteroatome wie Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ersetzt sind, wobei die Heteroatome auch oxidiert sein können, zum Beispiel N=O, S=O, SO2. Nicht einschränkende Beispiele für Heterocyclen sind Acridinyl, Azaindol (1H-Pyrrolopyridinyl), Azabenzimidazolyl, Azaspirodecanyl, Azepinyl, Azetidinyl, Aziridinyl, Benzimidazolyl, Benzofuranyl, Dihydrobenzofuranyl, Benzothiofuranyl, Benzothiophenyl, Benzoxazolyl, Benzthiazolyl, Benztriazolyl, Benztetrazolyl, Benzisoxazolyl, Benzisothiazolyl, Carbazolyl, 4aH-Carbazolyl, Carbolinyl, Chroma-nyl, Chromenyl, Cinnolinyl, Decahydrochinolinyl, 4,5-Dihydrooxazolinyl, Dioxazolyl, Dioxazinyl, 1,3- Dioxolanyl, 1,3-Dioxolenyl, 3,3-Dioxo[1,3,4]oxathiazinyl, 6H-1,5,2-Dithiazinyl, Dihydrofuro[2,3-b]- tetrahydrofuranyl, Furanyl, Furazanyl, Imidazolidinyl, Imidazolinyl, Imidazolyl, 1H-Indazolyl, In- Dolinyl, Indolizinyl, Indolyl, 3H-Indolyl, Isobenzofuranyl, Isochromanyl, Isoindazolyl, Isoindolinyl, Isoindolyl, Isochinolinyl (Benzimidazolyl), Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolinyl, Isoxazolyl, Isoxazolinyl, Isoxazolidinyl, 2-Isoxazolinyl, Ketopiperazinyl, Morpholinyl, Naphthyridinyl, Octahy- Droisochinolinyl, Oxadiazolyl, 1,2,3-Oxadiazolyl, 1,2, 4-Oxadiazolyl, 1,2,5-Oxadiazolyl, 1,3,4- Oxadiazolyl, 1,2-Oxa-thiepanyl, 1,2-Oxathiolanyl, 1,4-Oxazepanyl, 1,4-Oxazepinyl, 1,2-Oxazinyl, 1,3-Oxazinyl, 1,4-Oxazinyl, Oxazolidinyl, Oxazolinyl, Oxazolyl, Oxetanyl, Oxocanyl, Phenanthridinyl, Phenanthrolinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl, Phenoxathiinyl, Phenoxazinyl, Phthalazinyl, Piperazi-nyl, Piperidinyl, Pteridinyl, Purinyl, Pyranyl, Pyrazinyl, Pyrazolidinyl, Pyrazolinyl, Pyrazolyl, Pyridazinyl, Pyridooxazolyl, Pyridoimidazolyl, Pyridothiazolyl, Pyridinyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolidinonyl, Pyrrolinyl, 2H-Pyrrolyl, Pyrrolyl, Chinazolinyl, Chinolinyl, 4H-Chinolizinyl, Chinoxalinyl, Chinuclidinyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydroisochinolinyl, Tetrahydrochinolinyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydropyranyl, Tetrahydropyridinyl, Tetrahydrothiophenyl, Tetrazinyl, Tetrazolyl, 6H-1,2,5-Thiadiazinyl, 1,2,3-Thiadiazolyl, 1,2,4- Thiadiazolyl, 1,2,5-Thiadiazolyl, 1,3,4-Thiadiazolyl, Thianthrenyl, 1,2-Thiazinyl, 1,3-Thiazinyl, 1,4- Thiazinyl, 1,3-Thiazolyl, Thiazolyl, Thiazolidinyl, Thiazolinyl, Thienyl, Thietanyl, Thienothiazolyl, Thienooxazolyl, Thienoimidazolyl, Thiomorpholinyl, Thio-phenolyl, Thiophenyl, Thiopyranyl, 1,2,3- Triazinyl, 1,2,4-Triazinyl, 1,3,5-Triazinyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,2,3-Triazolyl, 1,2,4-Triazolyl, 1,2,5- Triazolyl, 1,3,4-Triazolyl und Xanthenyl. Der Begriff "Amin" bezieht sich auf eine Gruppe der Formel -NRR', wobei R und R' unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl-, halogenierte Alkyl- oder Heterocycloalkylgruppe wie oben beschrieben sein können. Der Begriff "primäres Amin" bezieht sich auf eine Gruppe der Formel -NH2. Der Begriff sekundäres Amin bezieht sich auf eine Gruppe der Formel -NRH, wobei R eine oben beschriebene Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl-, halogenierte Alkyl- oder Heterocycloalkylgruppe sein kann. Der Begriff sekundäres Amin bezieht sich auf eine Gruppe der Formel -NRR', in der R und R' unabhängig voneinander eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl-, halogenierte Alkyl- oder Heterocycloalkylgruppe, wie oben beschrieben, sein können. Der Begriff "Amid" oder "Amido" wird durch die Formel -C(O)NRR' dargestellt, wobei R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl-, halogenierte Alkyl- oder Heterocycloalkylgruppe wie oben beschrieben sein können. Eine geeignete Amidogruppe ist Acetamido. Ein „Peptid“, auch „Polyamid“ oder „Oligoamid“ genannt, im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine chemische Verbindung, die aus zwei oder mehr Aminosäuren besteht, welche durch Peptidbindungen, auch Amidbindungen genannt kovalent miteinander verbunden sind. Peptidbindungen entstehen durch eine Kondensationsreaktion, bei der die Carboxylgruppe einer Aminosäure mit der Aminogruppe einer anderen Aminosäure reagiert, wobei ein Molekül Wasser abgespalten wird. Peptide können in Oligopeptide, die typischerweise weniger als 20 Aminosäuren umfassen (beispielsweise aus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 und 19 Aminosäuren), Polypeptide, die 20 bis 50 Aminosäuren umfassen (beispielsweise aus 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Aminosäuren), und Proteine, die mehr als 50 Aminosäuren umfassen, unterteilt werden. Proteine können aus einem oder mehreren Polypeptiden zusammengesetzt sein. In einer Ausführungsform können Peptide mit der Methode der vorliegenden Erfindung aufgereinigt werden. In einer Ausführungsform können Oligopeptide, Polypeptide und/oder Proteine mittels der Methode der vorliegenden Erfindung aufgereinigt werden. "Carbonyl" bezieht sich auf eine Gruppe der Formel -C=O. Carbonyl-haltige Gruppen umfassen jeden Substituenten, der eine Kohlenstoff-Sauerstoff-Doppelbindung (C=O) enthält, einschließlich Acylgruppen, Amide, Carboxygruppen, Ester, Harnstoffe, Carbamate, Carbamatester, Carbonate, Carboxamide, Imide und Ketone und Aldehyde, wie Substituenten auf der Basis von -COR oder - RCHO, wobei R ein aliphatischer, heteroaliphatischer Rest, ein Alkyl- oder Heteroalkylrest, eine Hydroxylgruppe oder ein sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin, eine Phenylgruppe, eine substituierte Phenylgruppe (z.B. substituiert mit Halogen, C1-C3-Alkyl, Alkoxy, Amin), eine Carboxylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Amingruppe oder eine Arylgruppe ist. Der Begriff "Alkylamino" bezieht sich auf Alkylgruppen wie oben definiert, bei denen mindestens ein Wasserstoffatom durch eine Aminogruppe ersetzt ist. Der Begriff "Carboxyl" bezieht sich auf einen -COOH-Rest. Substituiertes Carboxyl bezieht sich auf -COOR, wobei R aliphatisch, heteroaliphatisch, Alkyl, Heteroalkyl oder eine Carbonsäure oder ein Carbonsäureester ist. Der Begriff "Carboxylester" bezieht sich auf -COOR, wobei R für Alkyl steht. Der Begriff "Hydroxyl" wird durch die Formel -OH dargestellt. Der Begriff "Hydroxyalkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, bei der mindestens ein Wasserstoffatom durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist. Der Begriff "Aralkyl" oder "Alkylaryl" bezieht sich auf eine Arylgruppe mit einer Alkylgruppe, wie oben definiert, die an die Arylgruppe, wie oben definiert, gebunden ist. Ein Beispiel für eine Aralkylgruppe ist eine Benzylgruppe. Optional substituierte Gruppen, wie "optional substituiertes Alkyl", beziehen sich auf Gruppen, wie eine Alkylgruppe, die, wenn sie substituiert sind, 1-5 Substituenten, typischerweise 1, 2 oder 3 Substituenten, aufweisen. Diese möglichen fakultativen Substituenten gelten für jede Gruppe der hier offengelegten Formel, in der ein fakultativer Substituent angegeben ist. Bevorzugte optionale Substituenten sind beispielsweise die für R3 definierten Substituenten. Der Begriff "Carboxamid" wird durch die Formel -C(O)-N(R)-R dargestellt. Der Begriff "primäres, sekundäres oder tertiäres Amin" wird durch die Formel -N(R)-R dargestellt. Der Begriff "Carbamat" wird durch die Formel -NR-C(O)-O-R dargestellt. Der Begriff "Imid" wird durch die Formel -C(O)-N(R)-C(O)-R' dargestellt. Der Begriff "Sulfid" wird durch die Formel -S-R wiedergegeben. Der Begriff "Sulfinyl" wird durch die Formel -S(O)R dargestellt. Der Begriff "Sulfonyl" wird durch die Formel -SO2R dargestellt. Der Begriff "Sulfino" wird durch die Formel -SO2H dargestellt. Der Begriff "Sulfo" oder Sulfonsäure“ wird durch die Formel -SO3H dargestellt. Der Begriff „Sulfonsäureester“ wird durch die Formel -SO3R dargestellt, wobei R vorzugsweise Alkyl oder Aryl ist. Für die obigen Definitionen sind R, R' vorzugsweise unabhängig voneinander aus der Gruppe von H, Alkyl, Aryl oder gemäß einer der oben beschriebenen Ausführungsformen ausgewählt. Die Gruppen R, R' umfassen auch die Möglichkeit, dass eine beliebige Gruppe an R oder R‘ angehängt wird. Der Begriff "Nitro" bezieht sich auf eine NO2-Gruppe. Der Begriff "3- bis 6-gliedrige Cycloalkyl- oder Arylringstruktur" bezieht sich auf eine Konfiguration, die eine 3-, 4-, 5- oder 6-gliedrige cyclische, gegebenenfalls aromatische Ringstruktur umfasst, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, wie ein oder mehrere N, O und/oder S, umfasst. Der Begriff "bicyclische Gruppe" bezieht sich auf eine Konfiguration, die zwei 3- bis 6-gliedrige cyclische, optional aromatische Ringstrukturen umfasst, die optional ein oder mehrere Heteroatome wie eines oder mehrere von N, O und/oder S enthalten, wobei die beiden Ringstrukturen durch zwei ihrer benachbarten Atome aneinander gebunden sind. Geschützte Derivate der offengelegten Verbindung kommen ebenfalls in Betracht, zum Beispiel zur Verwendung bei der Synthese der offengelegten Verbindungen. Eine Vielzahl geeigneter Schutzgruppen zur Verwendung mit den offengelegten Verbindungen ist in Greene und Wuts Protective Groups in Organic Synthesis; 3rd Ed.; John Wiley & Sons, New York, 1999 offengelegt und in verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung genannt. Im Allgemeinen werden die Schutzgruppen unter Bedingungen entfernt, die den verbleibenden Teil des Moleküls nicht beeinträchtigen. Diese Methoden sind in der Technik wohlbekannt und umfassen Säurehydrolyse, Hydrogenolyse und dergleichen. Mögliche Methoden für die Entfernung von Schutzgruppen sind zudem in verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und in den Beispielen ausgeführt. Weitere Schutzgruppen im Sinne der vorliegenden Erfidnung umfassen beispielsweise ohne Einschränkung tert-Butyloxycarbonyl (Boc) und Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). Die Entfernung der Schutzgruppen wird auch als „Entschützung“ bezeichnet und das Molekül nach der Entfernung als „entschütztes Molekül“ bezeichnet. Besondere Beispiele für die derzeit offenbarten Verbindungen enthalten einen oder mehrere asymmetrische Center; daher können diese Verbindungen in verschiedenen stereoisomeren Formen vorliegen. Dementsprechend können die Verbindungen und Zusammensetzungen als einzelne reine Enantiomere oder als Stereoisomerengemische, einschließlich racemischer Gemische, bereitgestellt werden. Doppelbindungen, welche in den erfindungsgemäßen Molekülen vorliegen, können in einer cis- bzw. (Z)-Anordnung oder einer trans- bzw. (E)-Anordnung vorliegen. Bei einer cis- bzw. (Z)- Anordnung befinden sich beide Substituenten auf der gleichen Seite der Referenzebene der Doppelbindung. Bei einer trans- bzw. (E)-Anordnung befinden sich beide Substituenten der Doppelbindung auf entgegengesetzten Seiten der Referenzebene der Doppelbindung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in verschiedenen polymorphen Formen vorliegen, z. B. als amorphe und kristalline polymorphe Formen. Alle polymorphen Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen gehören in den Rahmen der Erfindung und sind ein weiterer Aspekt der Erfindung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in verschiedenen tautomeren Formen vorliegen, insbesondere können die Verbindungen in den verschiedenen Formen der Keto-Enol-Tautomerie (Keto-Form und Enol-Form) vorliegen. Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch Deuterium als Ersatz für Wasserstoff enthalten. Es versteht sich, dass Substituenten und Substitutionsmuster der hierin beschriebenen Verbindungen von einem gewöhnlichen Fachmann ausgewählt werden können, um Verbindungen bereitzustellen, die chemisch stabil sind und die leicht durch in der Technik bekannte Techniken und weiter durch die in dieser Offenbarung dargelegten Methoden synthetisiert werden können. In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung eines Peptids, umfassend a. Herstellung eines Linker-Peptid-Konstruktes, umfassend ein Linkermolekül gemäß der vorliegenden Erfindung und das Peptid, wobei das Peptid an einer Synthese Festphase gebunden ist und das Linkermolekül durch die Gruppe R kovalent an das Peptid gebunden ist, b. Abtrennung des Linker-Peptid-Konstruktes von der Synthese-Festphase, c. Bindung des Linker-Peptid-Konstruktes über die Gruppe A des Linkermoleküls an eine Aufreinigungs-Festphase, d. einen oder mehrere Waschschritte, und e. Freisetzung des Peptids aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Spaltung der Gruppe R des Linkermoleküls. In einer Ausführungsform ist das Peptid kovalent an die Synthese-Festphase gebunden. In einer Ausführungsform umfasst die Gruppe A des Linkermoleküls eine oder mehrere Schutzgruppen. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich die Abspaltung der einen oder mehreren Schutzgruppen der Gruppe A bei oder nach der Abtrennung des Linker-Peptid- Konstruktes von der Synthese-Festphase, vorzugsweise durch die Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA). Die Abtrennung der Schutzgruppe, auch „Entschützung“ genannt kann auch durch Zugabe anderer Reagenzien erfolgen. Das Reagenz wird entsprechend der Schutzgruppe ausgewählt. Ein Fachmann ist in der Lage abhängig von der Schutzgruppe, beispielsweise für die in den Ausführungsformen dieser Erfindung genannten Schutzgruppen; ein geeignetes Reagenz für die Abtrennung dieser Schutzgruppen auszuwählen. In einer Ausführungsform wird das Linker-Peptid-Konstrukt durch Zugabe von Reagenz K (TFA/H2O/Thioanisol/Phenol/EDT in einem Volumenverhältnis von 82.5:5:5:5:2.5) freigesetzt (Teilschritt b.). In einer Ausführungsform wird das Peptid aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Zugabe eines Nucleophils freigesetzt (Teilschritt e.). Nucleophile für die Freisetzung des Peptids aus dem Linker-Peptid-Konstrukt im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen ohne Einschränkung Hydrazin, Hydroxylamin, Aminoalkohole wie beispielsweise Ethanol-2-amin und Diamine wie beispielsweise 1,2-Ethylendiamin. In einer Ausführungsform wir das Peptid aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Zugabe eines Nucleophils freigesetzt (Teilschritt e.), vorzugsweise durch Zugabe von Hydrazin, Hydroxylamin, eines Diamins oder eines Aminoalkohols. In einer Ausführungsform wird das Peptid aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Zugabe von Hydrazin freigesetzt. In einer Ausführungsform wird das Peptid aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Zugabe von Hydroxylamin freigesetzt. In einer Ausführungsform wird das Peptid aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Zugabe von Hydrazin und/oder Hydroxylamin freigesetzt. Der Begriff „Freisetzung“ bezieht sich hierbei auf die Spaltung der Gruppe R des Linkermoleküls, also die Spaltung einer kovalenten Bindung zwischen dem Linkermolekül und dem Peptid. Das Aufreinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise mehrere Teilschritte: a) Befestigung eines Linkermoleküls an einem Festphase-synthetisierten Peptid (Linker-Peptid-Konstrukt) b) Abspaltung des Linker-Peptid-Konstrukts von der Synthese-Festphase und gleichzeitige Abspaltung (Entschützung) der Affinitätsgruppe des Linkers c) Binden des Linker-Peptid-Konstrukts an eine Aufreinigungs-Festphase d) einen oder mehrere Waschschritte zur Entfernung von Verunreinigungen, insb. Abbruchsequenzen des Zielpeptids e) Spalten der Spaltgruppe und rückstandslose Freisetzung des Zielpeptids f) optional Recycling der Metalloxidphase zur Wiederverwertung als Aufreinigungs- Festphase. In einer Ausführungsform werden die unlöslichen Metalloxide der Metalloxidphase (Affinitäts- Festphase) wiederholt mit 3 bis 6M HCl gewaschen, beispielsweise 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 oder 6 M HCl, bis in der Waschlösung keine Rückstände von Peptiden oder Linker-Spaltprodukten mehr zu finden sind. In einer Ausführungsform wird das Metalloxid mit Wasser und Wasser/MeCN (1:1) neutralisiert und getrocknet, bevor es erneut eingesetzt werden kann. In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Aufreinigung eines Peptids, umfassend a. Herstellung eines Linker-Peptid-Konstruktes, umfassend einen Linker und ein Peptid, wobei der Linker eine Affinitätsgruppe A und eine Spaltgruppe R umfasst und über die Spaltgruppe R kovalent an das Peptid gebunden wird und das Peptid an einer Synthese-Festphase synthetisiert wurde und an die Synthese-Festphase gebunden ist, b. Abspaltung des Linker-Peptid-Konstruktes von der Synthese-Festphase, c. Bindung des Linker-Peptid-Konstruktes über die Affinitätsgruppe A des Linkers an eine Aufreinigungs-Festphase, d. einen oder mehrere Waschschritte zur Entfernung von Verunreinigungen aus dem Linker-Peptid-Konstrukt, und e. Freisetzung des Peptids aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Spaltung der Spaltgruppe R des Linkers und Abtrennung des Linkers vom Peptid. In einer Ausführungsform umfasst die Herstellung des Linker-Peptid-Konstruktes die Zugabe des Linkermoleküls zu dem Peptid. In einer Ausführungsform umfasst Herstellung des Linker-Peptid-Konstruktes die Zugabe eines Linkermolekül-Vorläufers, wobei der Linker-Peptidvorläufer die Gruppen R und L des Linkermoleküls umfasst und die Gruppe L eine oder mehrere Schutzgruppen umfasst. In einer Ausführungsform umfasst die Herstellung des Linker-Peptid-Konstruktes zusätzlich die Abspaltung der einen oder mehreren Schutzgruppen der Gruppe R des Linkermolekül-Vorläufers und Anbindung der Gruppe A, optimal der Gruppe A-E an die Gruppe R des Linkermolekül- Vorläufers. Der Begriff „Linkermolekül-Vorläufer“ oder „Linker-Voläufer“ bezieht sich dabei auf einen Teil des Linkermolküls der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise auf ein Molekül welches die Gruppen L und R, nicht jedoch die Gruppen A und E umfasst. Der Linkermolekül-Vorläufer kann durch Zugabe entsprechender Reagenzien um die Gruppen A und optional E verlängert werden, um so ein Linkermolekül entsprechend der vorliegenden Erfindung gemäß der Formel A-E-L-R oder A- L-R zu erhalten. Der Begriff „verlängern“ bezieht sich dabei auf die kovalente Anbindung der Gruppen A bzw. A-E an die Gruppe L des Linkemolekül-Vorläufers. Der Begriff „Linker-Peptid-Konstrukt“ oder „Peptid-Linker-Konstrukt“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Molekül umfassend ein Linkermolekül gemäß der vorliegenden Erfindung und ein Peptid, wobei das Linkermolekül durch die Gruppe R kovalent an das Peptid gebunden ist. In einer Ausführungsform kann die Aufreinigungs-Festphase, beispielsweise eine Metalloxidphase, wiederverwertet werden und erneut als Aufreinigungs-Festphase verwendet werden. In einer Ausführungsform wird das Linker-Peptid-Konstrukt durch Bindung des Linkers an das Peptid hergestellt. In einer Ausführungsform wird das Linker-Peptid-Konstrukt durch Bindung des Linkers an das Peptid unter basischen Bedingungen hergestellt. In einer Ausführungsform ist die Affinitätsgruppe A vor der Abspaltung des Linker-Peptid- Konstruktes von der Synthese-Festphase durch eine oder mehrere Schutzgruppen geschützt. In einer weiteren Ausführungsform werden die Schutzgruppen der Affinitätsgruppe A bei der Abspaltung des Linker-Konstruktes von der Affinitätsgruppe A abgespalten. Die Abspaltung der Schutzgruppe kann auch als „Entschützung“ bezeichnet werden. In einer Ausführungsform werden die Schutzgruppen der Affinitätsgruppe A durch die Zugabe von TFA, vorzugsweise 95% TFA abgespalten. In einer Ausführungsform wird Das Linker-Peptid-Konstrukt durch die Zugabe von TFA, vorzugsweise 95% TFA von der Synthese-Festphase abgespalten. Die Entschützung (Abspaltung der Schutzgruppe der Affinitätsgruppe A) und Abspaltung des Linker-Peptid-Konstruktes von der Synthese—Festphase erfolgte mit 95% TFA. In einer Ausführungsform wird das Peptid aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Zugabe von Hydrazin freigesetzt. In einer Ausführungsform wird die Spaltgruppe R des Linkers durch Zugabe von Hydrazin gespalten und das Peptid aus dem Linker-Peptid-Konstrukt freigesetzt. In einer Ausführungsform umfasst die Bindung des Linker-Peptid-Konstruktes über die Affinitätsgruppe A des Linkers an eine Aufreinigungs-Festphase zusätzlich die Zugabe einer Pufferlösung. In einer Ausführungsform ist die Pufferlösung eine wässrige Pufferlösung umfassend Essigsäure(AcOH), Tris, Phosphat, Imidazol, Piperazin, Glycin, Glycylglycin, Maleat, Malat, Format, Citrat und/oder Succinat. In einer Ausführungsform umfasst die wässrige Pufferlösung zusätzlich eine anorganische Säure, vorzugsweise HCl und/oder eine Base, vorzugsweise ein Alkali-Hydroxid und/oder Erdalkali-Hydroxide. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Pufferlösung zusätzlich ein organisches Lösungsmittel, vorzugsweise Acetonitril (ACN) und/oder DMSO. In einer Ausführungsform hat die Pufferlösung einen pH-Wert von 3.0 bis 8.0, vorzugsweise von 3.3 bis 7.0, beispielsweise 3.0, 3.3, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 und 8.0. In einer Ausführungsform umfasst die Pufferlösung eine 0.1M HCl/ACN/DMSO Lösung, vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von 1.25:1:0.25. In einer Ausführungsform umfassen die einen oder mehreren Waschschritte die Zugabe einer Waschlösung. In einer Ausführungsform umfasst die Waschlösung eines oder mehrere Lösungsmittel in welchen die Aufreinigungs-Festphase unlöslich ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasser, Dichlormethan (DCM), Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Ethylacetat, Diethylether, Methyl-tert-butylether, Essigsäure, 2,2,2-Trifluorethanol, Hexafluorisopropanol, Acetonitril (ACN), Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, Pyridin, Aceton, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, Phenol, Formamid, N-Butylpyrrolidon (NBP) und N-Methylpyrrolidon (NMP). In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Waschlösung zusätzlich eines oder mehrere Lösungsmittel, in welchem Peptide und insbesondere Peptidverunreinigungen eine hohe Löslichkeit zeigen, vorzugsweise DMSO und/oder DMF. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Waschlösung zusätzlich eine oder mehrere chaotrope Substanzen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Guanidiniumsalzen, Thiocyanaten, Perchloraten, Iodiden, Butanol, Phenol, Thioharnstoff, Harnstoff, und Ammoniumsulfat. Chaotrope Substanzen unterdrücken vorteilhafterweise unspezifischer Peptidwechselwirkungen und verbessern so die Abtrennung von Peptidverunreinigungen und verbessern somit die Aufreinigung des synthetisierten Peptides. In einer Ausführungsform ist die Waschlösung eine 0.1M HCl/ACN Lösung. In einer Ausführungsform umfassen die einen oder mehreren Waschschritte die Zugabe von HCl/ACN, vorzugsweise 0.1M HCl/ACN. In einer Ausführungsform umfassen die Verunreinigungen Abbruchsequenzen des Peptids, welche beispielsweise bei der Festphasensynthese entstanden sind. Aufreinigungs-Festphasen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen vorzugsweise Metalloxide, die Catechole als Liganden über Wasserstoffbrücken oder kovalente Bindungen immobilisieren können. Metalloxide mit einer großen spezifischen Oberfläche, welche für eine effiziente Bindung erforderlich ist, lassen sich schnell und kostengünstig herstellen oder sind je nach Art des Metalloxids sogar bereits kommerziell erhältlich. Solche Metalloxide sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TiO2, Fe2O3, Al2O3 und ZrO2. Da die Oxidoberfläche bereits Alkoholgruppen als Bindungspartner für die Affinitätsbindung trägt, muss vorzugsweise keine weitere Funktionalisierung der Aufreinigungs-Festphase erfolgen. In einer Ausführungsform umfasst die Aufreinigungs-Festphase ein Metalloxid, vorzugsweise ein Metalloxid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TiO2, Fe2O3, Al2O3, ZrO2, Fe3O4, Silikat und Alumosilikat. In einer Ausführungsform umfasst die Aufreinigungsfestphase ein Metalloxid umfasst, vorzugsweise ein Metalloxid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TiO2, Fe2O3, Al2O3, ZrO2, Fe3O4, Montmorillonit, Kaolinit und Mullit. Der Begriff „Festphasensynthese“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Herstellung von Peptiden, Die Methode zeichnet sich durch ihre Effizienz und die Möglichkeit aus, relativ komplexe Peptide in einem automatisierten Prozess herzustellen. Die Methode umfasst im Wesentlichen die folgenden Schritte: 1) Immobilisierung des ersten Bausteins des Peptids: Der erste Schritt in der Festphasenpeptidsynthese ist die kovalente Anbindung einer Aminosäure an ein festes Trägermaterial auch „Synthese-Festphase“ genannt, Die Aminosäure wird über ihre Carboxylgruppe kovalent an die Synthese-Festphase gebunden, während die Amino-Gruppe der Aminosäure durch eine Schutzgruppe geschützt wird, um eine ungewollte Reaktion zu vermeiden. 2) Schrittweise Kettenverlängerung: Nach der Immobilisierung der ersten Aminosäure werden weitere Aminosäuren schrittweise kovalent an die erste Aminosäure gebunden. Vor jedem Schritt wird die Schutzgruppe der freien Amino-Gruppe der vorhergehenden Aminosäure, welche bereits gebunden ist, entfernt, sodass die nächste Aminosäure über eine Peptidbindung an diese angeknüpft werden kann. Nach der Zugabe einer Aminosäure erfolgt ein Waschschritt, um überschüssige Reagenzien und Nebenprodukte zu entfernen. 3) Abspaltung und Reinigung: Sobald die Peptidkette die gewünschte Länge erreicht hat, wird sie vom festen Trägermaterial abgespalten. Zudem werden üblicherweise die verbliebenen Schutzgruppen entfernt. Für die Festphasensynthese, insbesondere bei der Peptidsynthese, werden verschiedene Synthese-Festphasen“ verwendet. Synthese-Festphasen umfassen beispielsweise ohne Einschränkung Polystyrol-basierte Harze wie Wang-Harz und Rink-Amid-Harz, Polyethylenglykol- basierte (PEG-basierte) Harze wie TentaGel-Harz und ChemMatrix-Harz, Polyacrylamid-basierte Harze wie PAM-Harz oder Kombinationen aus diesen, auch Hybrid-Harze genannt wie beispielswiese Corss-Linked Ethoxylate Acrylate Resin (CLEAR)-Harz. Die Wahl der Synthese-Festphase hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der spezifischen Anforderungen der Peptidsynthese, wie der Länge und Komplexität des Peptids, der Hydrophobizität und der Notwendigkeit, bestimmte funktionelle Gruppen zu schützen oder zu deaktivieren. Ein Fachmann ist anhand seines Fachwissens in der Lage eine geeignete Synthese-Festphase für die Synthese eines Peptids mittels Festphasensynthese auszuwählen. Die Herstellung der Linker der vorliegenden Erfindung, auch „Affinitätslinker“ genannt lässt sich vorteilhafterweise in wenigen Schritten aus preiswerten Chemikalien mit zufriedenstellenden Gesamtausbeuten realisieren und ist auf den Multigramm-Maßstab skalierbar. Zudem ist der Preis von Metalloxiden gering und aufgrund der hohen Beladung muss nur eine geringe Menge an Material eingesetzt werden. Durch diese Voraussetzungen sind die Kosten für den Einsatz der Methode der vorliegenden Erfindung um ein Vielfaches geringer als bei den Catch & Release- Aufreinigungen im Stand der Technik. Des Weiteren ermöglicht die Methode der vorliegenden Erfindung die Aufreinigung von Peptiden unabhängig von ihren funktionellen Gruppen. Der abgespaltene Linker auch „Spaltreagenz“ genannt kann mittels Verdampfung entfernt werden und verbleibt nicht im Endprodukt. Eine Fällung des Peptids ist damit nicht zwingend notwendig, sodass auch geschützte Peptide aufgereinigt werden können. Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem Aspekt auf ein Kit, welches einen Linker und optional Reagenzien und Lösungsmittel für die Aufreinigung von Peptiden mittels der Methode der vorliegenden Erfindung umfasst. In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Kit für die Aufreinigung eines Peptids gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens, charakterisiert dadurch, dass das Kit umfasst a. ein Linkermolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, oder b. einen Linkermolekül-Vorläufer umfassend die Gruppen R und L eines Linkermoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und Reagenzien für die kovalente Anbindung der Gruppe A, optimal der Gruppe A-E an die Gruppe R des Linkermolekül-Vorläufers, und c. optional Reagenzien und Lösungsmittel für die Abspaltung von Schutzgruppen der Gruppe A des Linkermoleküls oder der Gruppe R des Linkermolekül- Vorläufers und für die einen oder mehreren Waschritte. In einem Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Linkermoleküls in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführungsform wird die Methode der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zur Aufreinigung von Peptiden welche mittels Festphasensynthese hergestellt wurden angewendet. In einer weiteren Ausführungsform werden die mittels der Methode der vorliegenden Erfindung aufgereinigten Peptide anschließend mittels chromatographischer Methoden, beispielsweise HPLC, weiter aufgereinigt. Vorteilhafterweise kann die Methode der vorliegenden Erfindung als alleinige Aufreinigungsmethode für mittels Festphasensynthese hergestellte Peptide angewendet werden. Weiterhin kann die Methode der vorliegenden Erfindung auch als erste Reinigung (Vorreinigung) vor einer nachfolgenden Aufreinigung mittels chromatographischer Methoden (beispielsweise HPLC) angewendet werden und so die Performance dieser chromatographischer Methoden verbessern. Die oben genannten Merkmale und Aspekte in Bezug auf den Linker bzw. das Linkermolekül haben strukturelle und funktionelle Auswirkungen auf die anderen Aspekte der Erfindung, die das Verfahren zur Aufreinigung von Peptiden und das Kit umfassen, so dass der Linker bzw. das Linkermolekül, das Verfahren und das Kit jeweils durch die Merkmale der anderen Aspekte beschrieben oder von diesen abgeleitet werden können. FIGUREN Die Erfindung soll im Folgenden anhand der Abbildungen und Beispiele näher erläutert werden. Die Abbildungen und Beispiele beschränken den Umfang der Erfindung nicht, sondern stellen bevorzugte Ausführungsformen der Aspekte der Erfindung dar, die der Veranschaulichung dienen. Beschreibung der Figuren: Fig.1: Entwickelte Affinitätsaufreinigungen in Reihenfolge ihrer Veröffentlichung (Stand der Technik). Fig.2: Aufreinigungsverfahren des Start-ups Belyntic (Stand der Technik) Fig.3: Schematische Struktur der Linkermoleküle zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die Spaltgruppe R reagiert mit dem N-Terminus der zu aufreinigenden Peptidsequenz. A: Affinitätsgruppe, E: Verstärker, L: Verknüpfungen, R: Spaltgruppe. Fig.4: Schematischer Ablauf einer Catch & Release-Aufreinigung gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Affinitätsgruppe A des Linkers bindet an die Aufreinigungs-Festphase unter Bildung eines Affinitätspaars. Peptide sind standardmäßig C-terminale Carbonsäuren (R5 = OH) oder Amide (R5 = NH2) nach der Abspaltung von der Synthese-Festphase. Fig.5: Schematische Darstellung der Catch & Release-Aufreinigung gemäß der vorliegenden Erfidung mittels eines Catechol-Dda/DMB-Linkers. Im ersten Schritt wurde der Linker unter basischen Bedingungen mit dem Linker and das am Harz der Synthese-Festphase gebundene Peptid gebunden (Herstellung des Linker-Peptid-Konstruktes). Die Entschützung (Abspaltung der Schutzgruppe der Affinitätsgruppe A) und Abspaltung des Linker-Peptid-Konstruktes von der Synthese—Festphase erfolgte mit 95% TFA und das entschützte Peptid mit freier Catechol- Einheit der Affinitätsgruppe A wurde anschließend für die Aufreinigung zu Aufreinigungs- Festphase gegeben, welche ZrO2 enthält. Nach 2 h wurde der Überstand entfernt, der Rückstand gewaschen und das and die Aufreinigungs-Festphase gebundene Peptid durch die Zugabe von Hydrazin freigesetzt und eluiert. Fig.6: Synthese des Linkermoleküls NCat-Lys-Dda. Fig.7: Schematischer Ablauf einer Catch & Release-Aufreinigung gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Spaltgruppe R des Linkermolekül-Vorläufers, welche eine oder mehrere Schutzgruppen umfasst, bindet an den N-Terminus eines an eine Festphase gebundenen Peptids. Anschließend werden die einen oder mehreren Schutzgruppen des Gruppe R abgespalten und der Linkermolekül-Vorläufer und die Gruppen A-E verlängert, um so ein Linker- Peptid-Konstrukt zu erhalten. Die Affinitätsgruppe A des Linker-Peptid-Konstrukt bindet an die Aufreinigungs-Festphase unter Bildung eines Affinitätspaars. Anschließend wir das Peptid durch Spaltung der Gruppe R Freigesetzt. Peptide sind standardmäßig C-terminale Carbonsäuren (R5 = OH) oder Amide (R5 = NH2) nach der Abspaltung von der Synthese-Festphase. BEISPIELE Die Erfindung wird anhand der hier offengelegten Beispiele erläutert. Die aufgeführten Beispiele stellen Ausführungsformen der Erfindung dar und schränken den Umfang der Erfindung nicht ein. Die Beispiele sind als nicht einschränkende Veranschaulichung und technische Unterstützung für die Ausführung der Erfindung zu betrachten. Linker -Synthese Die Herstellung der Linker wurde über 6 Stufen, mit einer Gesamtausbeuten von 10% (8, DAB- Linker) und 11% (9, Dda -Linker) realisiert werden. Eine angepasste Syntheseroute führte zu größeren Mengen Linker im Multigramm bis Decagramm-Maßstab. Die synthetisierten Linker haben die folgende Struktur:
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Peptidaufreinigung mittels Metalloxid-Affinitätsbindung Für den Aufreinigungsversuch wurde Zirkoniumoxid ZrO2 als Metalloxid gewählt und das mittels SPPS synthetisierte Peptid H-VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG-NH2 eingesetzt (SEQ ID No.1) (Figur 5). Die Linkermoleküle wurden in einem separaten Ansatz quantitativ an das auf dem Harz der Synthese-Festphase befindliche Peptid gekuppelt (die SPPS des Peptids erfolgte mittel Ac2O-Capping). Durch die Zugabe von TFA wurde das Peptid anschließend vom Harz der Synthese-Festphase gespalten und im gleichen Schritt wurden alle Schutzgruppen der Affinitätsgruppe A des Linkers entfernt (Figur 5, Schritt 1). Im nächsten Schritt wurde das Gemisch verdampft und der Rückstand in einem Gemisch aus 0.1M HCl/ACN/DMSO (1.25:1:0.25) gelöst und die Lösung auf eine Aufreinigungs-Festphase, welche Zirkoniumoxid enthält gegeben. Nach 1 h Reaktionszeit wurde die Suspension zentrifugiert und der Überstand (Figur 5, Schritt 2) abgenommen. Der zurückgebliebene Feststoff wurde mehrfach mit unterschiedlichen Verhältnissen von 0.1M HCl/ACN gewaschen und die Suspension kräftig gemischt. Nach erneuter Zentrifugation wurde der Überstand an Waschlösung abgenommen (Figur 5, Schritt 3). Für die Abspaltung des Linkers durch Spaltung der Spaltgruppe R und Freisetzung des Peptides aus dem Linker-Peptid-Konstrukt (Linkerspaltung) wurde der Rückstand mit einer Hydrazin-Lösung versetzt und die Probe 2.5 h gemischt. Die Spaltung erfolgte quantitativ innerhalb von 30 min. Anschließend wurde das ZrO2 abfiltriert und das Filtrat mit aufgereinigtem Peptid erhalten (Figur 5, Schritt 4). Eine kinetische Untersuchung der Bindung der beiden Linker-Peptid-Varianten (DAB- oder Dda- Linker gebunden an das Peptid) am ZrO2 der Aufreinigungs-Festphase gab Aufschluss über die Reaktionsgeschwindigkeit. Beide Substanzen waren nach 1 h zwar noch in der Metalloxid- Suspension in Lösung nachweisbar, allerdings verringerte sich deren Konzentration nicht mehr. Die Messung bestätigte, dass nach 1 h die Komplexierung komplett erfolgt ist. Zur Bestimmung exakter Verhältnisse von benötigtem Metalloxid pro µmol Peptid wurde wie folgt gemessen: 400 µL-Aliquote einer Lösung aus hochreinem Linker-Peptid-Konstrukt (Reinheit >95%, 2.5mM) und Imipraminhydrochlorid (1.25mM) als interner Standard in 0.1M HCl/MeCN/DMSO (56:24:20) wurden zu verschiedenen Mengen Metalloxid (TiO2 und ZrO2, 2-60 mg) gegeben und 1 h unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die Suspensionen 1 min bei 15 krpm zentrifugiert und 10 µL jeden Überstands mit 40 µL H2O/MeCN + 0.1% HCO2H verdünnt und an einem Agilent 1290 HPLC System mit Anschluss an ein Thermo LTQ-Orbitrap- XL Massenspektrometer mit ESI Quelle vermessen. Eine Säule von Waters ACQUITY PRM 7A:7*1 #*.) c +'* NN% *'0 gN$ XVSGH I^S GLH 5VIUSHOOVOJ NLU GHO IPMJHOGHO ;]THNLUUHMO verwendet: H2O + 0.1% HCO2H (A) and MeCN + 0.1% HCO2H (B). Im Programm Freestyle" von Thermo Scientific" wurde die UV-Absorption im Bereich 209-211 nm mit dem Algorithmus PPD (resolved) analysiert und die Peaks von Linker-Peptid und internem Standard integriert. Das Verhältnis beider Peaks wurde gegen den Quotienten von Masse-Metalloxid und Stoffmenge- Linker-Peptid-Konstrukt aufgetragen. Durch lineare Regression konnte der Punkt extrapoliert werden, an welchem nach 1 h eine quantitative Bindung des Linker-Peptid-Konstruktes an das Metalloxid der Aufreinigungs-Festphase erwartet wird. Alle Werte wurden durch Triplikate ermittelt und sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Beladungsbestimmungen * Die Punkte näherten sich asymptotisch einer Sättigungsgrenze, sodass ein möglichst linearer Bereich für die Regression gewählt wurde. SEQ ID No. 2: FLPAALAGIGGILGKLF Peptid 1: Peptid 2: Dda-FLPAALAGIGGILGKLF- DAB-FLPAALAGIGGILGKLF- NH2 NH2 Metalloxide Beladungquant., extrapoliert (mg Metalloxid/µmol Peptid) ZrO2 (hergestellt) 75 17 (26*) ZrO2 (kommerziell, Alfa n/a 373 Aesar 011395.30) TiO2 (hergestellt) 75 39* TiO2 (kommerziell, Alfa 41 n/a Aesar 44429) Synthese weiterer Linkermoleküle Synthese von 2-Hydroxy-3-methoxy-5-nitrobenzoesäure (20)
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Rauchende Salpetersäure (1.7 mL, 2.6 g, 42 mmol, 1.4 Äquiv.) und konzentrierte Schwefelsäure (3.4 mL, 5.8 g, 60 mmol, 2.0 Äquiv.) wurden bei 0°C nacheinander zu einer Lösung von 2- Hydroxy-3-methoxybenzoesäure (5.01 g, 29.8 mmol) in CH2Cl2 (33 mL) getropft. Die Reaktionsmischung wurde bei max.5°C 50 min gerührt. Dann wurde Lösung weitere 18 h gerührt und langsam auf Raumtemperatur erwärmt. Im Anschluss wurde die Mischung auf Eiswasser (100 mL) geschüttet. Der ausgefallene braune Feststoff wurde über eine Glasfritte abfiltriert und mit wenig Wasser gewaschen. Der Rückstand wurde aus einem Wasser/Ethanol-Gemisch umkristallisiert. Nach Trocknen im Vakuum wurde 2-Hydroxy-3-methoxy-5-nitrobenzoesäure (20) als brauner Feststoff (1.52 g, 24%; Referenz [31]: 94%) erhalten. 1H-NMR (500.13 MHz, DMSO-d6) d = 8.23 (d, Jmeta = 2.4 Hz, 1H, 6-H), 7.87 (d, Jmeta = 2.6 Hz, 1H, 4-H), 3.92 (s, 3H, 3-OCH3) ppm. Synthese von 2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzaldehyd (26)
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2-Hydroxy-3-methoxy-5-nitrobenzaldehyd (12.49 g, 63.35 mmol) wurde mit 48%iger Bromwasserstoffsäure (50 mL) versetzt und 18.5 h bei 130°C gerührt. Wasser (100 mL) wurde hinzugegeben und die Mischung 4.5 h bei 4°C gekühlt. Der dunkle Feststoff wurde abfiltriert und das Filtrat mit CHCl3 (3 × 70 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt, bis ein gelber Feststoff (0.10 g) zurückblieb. 2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzaldehyd (26) wurde als brauner und gelber Feststoff (gesamt 12.2 g, quant.; Referenz [32]: 95%) erhalten. 1H-NMR (500.13 MHz, CDCl3) d = 11.76 (s, 1H, 1-CHO), 9.99 (s, 1H, 2-OH), 8.19 (s, 1H, 6-H), 8.05 (s, 1H, 4-H), 5.91 (br. s, 1H, 3-OH) ppm. 1H-NMR (500.13 MHz, DMSO-d6) d = 11.04 (br. s, 2H, 2-H, 3-H), 10.31 (s, 1H, 1-CHO), 8.00 (d, Jmeta = 2.7 Hz, 1H, 6-H), 7.79 (d, Jmeta = 2.9 Hz, 1H, 4-H) ppm. 13C-NMR (125.76 MHz, DMSO-d6) d = 189.80 (1-CHO), 156.04 (C-2), 147.21 (C-3), 139.15 (C- 5), 121.78 (C-1), 114.60 (C-6), 113.10 (C-4) ppm. Synthese von 2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzoesäure (21)
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Methode 1: 2-Hydroxy-3-methoxy-5-nitrobenzoesäure (20; 1.24 g, 5.84 mmol) wurde mit 48%iger Bromwasserstoffsäure (35 mL) versetzt und 4 h bei 120°C, anschließend 22 h bei 130°C gerührt. Die Lösung wurde dann unter vermindertem Druck bei 80°C eingeengt, zwei Mal mit einem Toluol/Wasser-Gemisch (1:1, 120 mL, dann 50 mL) versetzt und unter vermindertem Druck getrocknet.2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzoesäure (21) wurde als brauner Feststoff (1.23 g, quant.; Referenz [31]: 79%) erhalten. Methode 2: Eine Lösung von NaClO2 (11.95 g, 132.2 mmol, 2.0 Äquiv.) in H2O (66 mL) wurde bei Raumtemperatur über 2 h zu einer Lösung von 2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzaldehyd (26; 12.1 g, 66.1 mmol) und NaH2PO4·H2O (10.1 g, 72.6 mmol, 1.10 Äquiv.) in H2O (27 mL) und DMSO (70 mL) getropft. Nach weiteren 30 min Rühren wurde die Mischung zu einem Zweiphasengemisch aus CH2Cl2 und wässriger gesättigter NaHCO3-Lösung (1:1, 200 mL) geschüttet. Die Lösung wurde mit 6M Salzsäure bis zu pH 3 angesäuert und durch Kieselguhr abfiltriert. Der Filterkuchen wurde mit Et2O gründlich gewaschen und das Filtrat mit Et2O (5 × 200 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet und unter vermindertem Druck getrocknet.2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzoesäure (21) wurde als gelber Feststoff (13.1 g, 99%; Lit.[33]: quant.) erhalten. 1H-NMR (400.14 MHz, DMSO-d6) d = 8.10 (d, Jmeta = 2.8 Hz, 1H, 6-H), 7.74 (d, Jmeta = 3.1 Hz, 1H, 4-H) ppm. 13C-NMR (100.62 MHz, DMSO-d6) d = 170.78, 156.75, 146.93, 138.32, 116.37, 113.21, 113.13 ppm. Synthese von 2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzoesäuremethylester (22)
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Konz. H2SO4 (8.5 mL) wurde zu einer Lösung von 2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzoesäure (21; 1.23 g, 6.18 mmol) in MeOH (84 mL) vorsichtig zugegeben und die Mischung 23 h unter Rückfluss erhitzt. Nachdem die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde sie mit H2O (10 mL) und MTBE (50 mL) versetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit MTBE (3 × 100 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel wurde unter vermindertem Druck entfernt.2,3-Dihydroxy-5- nitrobenzoesäuremethylester (22) wurde als hellbrauner Feststoff (1.19 g, 90%; Referenz [34]: 82%) erhalten. 1H-NMR (400.14 MHz, DMSO-d6) d = 11.07 (br. s, 1H, 2-OH oder 3-OH), 10.73 (br. s, 1H, 2-OH oder 3-OH), 8.08 (d, Jmeta = 2.8 Hz, 1H, 6-H), 7.77 (d, Jmeta = 2.8 Hz, 1H, 4-H), 3.92 (s, 3H, 1- COOCH3) ppm. 13C-NMR (100.62 MHz, DMSO-d6) d = 167.27 (1-COOCH3), 154.56 (C-2), 146.97 (C-3), 138.72 (C-5), 116.25 (C-6), 113.88, 112.96 (C-4), 52.87 (1-COOCH3) ppm. Synthese von Methyl-2,2-bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxol-4-carboxylat (23)
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Eine Mischung aus 4,4‘-Dimethoxybenzophenon (2.03 g, 8.38 mmol, 1.69 Äquiv.) und Oxalylchlorid (3.9 mL, 5.8 g, 46 mmol, 9.3 Äquiv.) wurde 30 min bei 60°C gerührt. Anschließend wurde der Überschuss an Oxalylchlorid bei 110°C unter Atmosphärendruck abdestilliert. Zum verbleibenden roten Öl wurde 2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzoesäuremethylester (22; 1.06 g, 4.97 mmol, 1.00 Äquiv.) hinzugefügt und das Gemisch 2 h bei 160°C gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Lösung mit EtOAc (65 mL) verdünnt und mit gesättigter wässriger NaHCO3-Lösung (8 mL) versetzt. Die Phase wurden getrennt und die organische Phase wurde mit gesättigter wässriger NaHCO3-Lösung (50 mL) und gesättigter wässriger NaCl-Lösung (50 mL) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Eine Aufreinigung des Rückstands über Flashchromatographie an Kieselgel [d = 6 cm, h = 16 cm, F = 100 mL, c-C6H12 (F1-6) " c- C6H12/EtOAc = 98:02 (F7-16) " c-C6H12/EtOAc = 97:03 (F17-26) " c-C6H12/EtOAc = 95:05 (F27- 36) " c-C6H12/EtOAc = 90:10 (F37-80)] lieferte Methyl-2,2-bis(4-methoxyphenyl)-6- nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carboxylat [23; F57-67, Rf(c-C6H12/EtOAc = 9:1) = 0.08, 0.87 g, 36%; Referenz [34]: 82%] als gelben Feststoff. HRMS (pos. ESI): berechnet für C23H20NO8 [M+H]+ m/z = 438.1183, gefunden 438.1187 (+0.9 ppm). 1H-NMR (500.13 MHz, CDCl3) d = 8.44 (d, Jmeta = 2.4 Hz, 1H, 6-H), 7.81 (d, Jmeta = 2.3 Hz, 1H, 4- :$% 0'-0h0'-- #55a&BHLM HLOHT 55b66a&AQLOTZTUHNT% -:% - c ,a&:$% /'2+h/'12 #66a&BHLM HLOHT AA’BB‘-Spinsystems, 4H, 4 × 2‘-H), 3.97 (s, 3H, 1-COOCH3), 3.81 (s, 6H, 2 × 1‘-OCH3) ppm. 13C-NMR (125.76 MHz, CDCl3) d = 163.35 (1-COOCH3), 160.92 (C-1‘), 153.39 (C-2), 149.44 (C- 3), 142.26 (C-5), 130.66 (C-4‘), 128.22 (C-3‘), 122.07 (C-5‘), 120.73 (C-6), 113.93 (C-2‘), 112.05 (C-1), 107.11 (C-4), 55.52 (1‘-OCH3), 52.74 (1-COOCH3) ppm. Synthese von 2,2-Bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carbonsäure (24)
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Wasserfreies LiOH (0.49 g, 19.9 mmol, 10.0 Äquiv.) wurde zu einer Lösung von Methyl-2,2-bis(4- methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxol-4-carboxylat (23; 0.87 g, 2.0 mmol) in THF (20 mL) gegeben. Die Lösung wurde mit H2O (0.35 mL, 0.35 g, 20 mmol, 10.0 Äquiv.) versetzt und 5 h unter Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wurde anschließend unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in H2O (25 mL) aufgenommen. Die rote Lösung wurde mit Et2O (2 × 20 mL) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit wässriger gesättigter NH4Cl-Lösung (80 mL) und 3M Salzsäure bis pH 7-8 neutralisiert und anschließend mit EtOAc (4 × 25 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel wurde unter vermindertem Druck entfernt.2,2-Bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4- carbonsäure (24) wurde als gelber Feststoff (0.70 g, 83%; Referenz [34]: quant.) erhalten. HRMS (pos. ESI): berechnet für C22H18NO8 [M+H]+ m/z = 427.1027, gefunden 427.1027 (+0.7 ppm). 1H-NMR (500.13 MHz, DMSO-d6) d = 13.89 (br. s, 1H, 1-COOH), 8.21 (d, Jmeta = 2.4 Hz, 1H, 6- H), 7.98 (d, Jmeta 4 +'+ :[% *:% -&:$% 0'-,h0'-) #55a&BHLM HLOHT 55b66a&AQLOTZTUHNT% -:% - c ,a& :$% 0'),h0')) #66a&BHLM HLOHT 55b66a&AQLOTZTUHNT% -:% - c +a&:$% ,'00 #T% /:% + c *a&>7H3) ppm. 13C-NMR (125.76 MHz, DMSO-d6) d = 163.54 (1-COOH), 160.37 (C-1‘), 152.13 (C-2), 148.52 (C- 3), 141.61 (C-5), 130.02 (C-4‘), 127.86 (C-3‘), 120.54 (C-5‘), 120.39 (C-6), 113.95 (C-2‘), 106.65 (C-4), 55.30 (1‘-OCH3) ppm. Synthese von (S)-6-(2-Amino-6-(tert-butoxycarbonylamino)hexanamido)hexansäuremethylester (60)
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N,Ne&8LLTPQSPQZMFDSEPGLLNLG #0') N;% .'0 J% -. NNPM% *'). \RVLW'$ VOG L?S2EtN (6.75 mL, 5.00 g, 43.4 mmol, 1.01 Äquiv.) wurden zu einer Lösung von Fmoc-Lys(Boc)-OH (21.1 g, 45.0 mmol, 1.05 Äquiv.) und Oxyma (6.4 g, 45 mmol, 1.05 Äquiv.) in DMF (224 mL) gegeben und die Mischung wurde 5 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde 6- Aminohexansäuremethylesterhydrochlorid (7.77 g, 42.8 mmol, 1.00 Äquiv.) zugegeben und die Mischung 20 h bei Raumtemperatur gerührt. H2O (220 mL) wurde zugegeben und mit 10%iger wässriger Zitronensäure-Lösung ein pH von ca.4 eingestellt. Die Lösung wurde bei 0°C gekühlt und das weiße Präzipitat wurde abfiltriert und mit etwas H2O gewaschen. Der erhaltene weiße Feststoff wurde mit wasserfreiem Toluol versetzt und unter vermindertem Druck getrocknet. Dies lieferte ein etwa 1:10-Gemisch von Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Lys(Boc)-hexyl-OMe als weißen Feststoff (26.17 g), welches ohne weitere Aufreinigung weiter umgesetzt wurde. HRMS (pos. ESI) für Fmoc-Lys(Boc)-hexyl-OMe: berechnet für C33H45N3O7Na [M+Na]+ m/z = 618.3150, gefunden 618.3171 (+3.4 ppm). Eine Lösung aus dem zuvor erhaltenen Gemisch (5.36 g) in CH2Cl2 (80 mL) wurde mit Diethylamin (8 mL) versetzt und 2.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Lösung unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand mit Et2O versetzt. Die erhaltene Suspension wurde abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Das gelbe Öl wurde über automatisierte Flashchromatographie an Umkehrphase [Biotage Sfär Bio C1850 g, 70 mL/min, H2>(<H7=3 )h*'0 NLO ."% *'0h0'+ NLO .h+)"% 0'+h*)') NLO +)&/)"% *)')h*+'+ NLO /)"% *+'+h*-'. NLO /)&*))"% *-'.&*2') NLO *))"C DVIJHSHLOLJU% XDT #S)-6-(2-Amino-6-(tert- butoxycarbonylamino)hexanamido)hexansäuremethylester (60) als gelbes Öl (RT = 13.0 min, 1.2 g) lieferte. HRMS (pos. ESI): berechnet für C18H36N3O5 [M+H]+ m/z 4 ,0-'+/.)% JHIVOGHO ,0-'+/-. #h 1.3 ppm). 1H-NMR (400.14 MHz, DMSO-d6) d = 7.77 (t, J1‘-NH,1‘ = 5.7 Hz, 1H, 1‘-NH), 6.73 (t, J6- NH,6 = 5.5 Hz, 1H, 6-NH), 3.58 (s, 3H, 6‘-OCH3), 3.31 (br. s, 2H, -NH2$% ,')0h+'22 #N% ,:% *a&:2, 2- H), 2.87 (dt, J6,6-NH = 6.5 Hz, J6,5 = 6.4 Hz, 2H, 6-H2), 2.28 (t, J5‘,4‘ = 7.4 Hz, 2H, 5‘-H2$% *'..h*'-/ (m, 3H, 3-Ha, 4‘-H2$% *'-+h*'+) #N% 2:% ,&:b, 4-H2, 5-H2, 2‘-H2, 3‘-H2), 1.36 (s, 9H, 3 × 9-H3) ppm. 13C-NMR (100.62 MHz, DMSO-d6) d = 174.90 (C-1), 173.27 (C-6‘), 155.53 (C-7), 77.26 (C-8), 54.65 (C-2), 51.13 (6‘-OCH3), 39.72 (C-6), 38.00 (C-1‘), 34.92 (C-3), 33.20 (C-5‘), 29.42 (C-5)i, 28.79 (C-2‘)ii, 28.25 (C-9), 25.80 (C-3’)ii, 24.11 (C-4‘), 22.60 (C-4)i ppm. i,ii Zuordnungen ggf. vertauschbar. Synthese von (S)-6-(2-(2,2-bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carboxamido)-6- ((tert-butoxycarbonyl)amino)hexanamido)hexansäuremethylester (27)
Figure imgf000036_0001
N,Ne&8LLTPQSPQZMFDSEPGLLNLG #)'+/ N;% )'+* J% *'0 NNPM% *'). \RVLW'$ VOG L?S2EtN (0.27 mL, 0.20 g, 1.7 mmol, 1.05 Äquiv.) wurden zu einer Lösung von 2,2-Bis(4-methoxyphenyl)-6- nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carbonsäure (24; 0.70 g, 1.7 mmol, 1.0 Äquiv.), Oxyma (0.253 g, 1.78 mmol, 1.05 Äquiv.) und (S)-6-(2-Amino-6-(tert- butoxycarbonylamino)hexanamido)hexansäuremethylester (60; 0.633 g, 1.69 mmol, 1.0 Äquiv.) in DMF (17 mL) gegeben und die Mischung wurde 22 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde H2O (230 mL) hinzugefügt und mit CH2Cl2 (100 mL) extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit 10%iger wässriger Zitronensäure-Lösung (50 mL) angesäuert, woraufhin die orangefarbene Lösung farblos wurde. Die wässrige Phase wurde erneut mit CH2Cl2 (2 × 100 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand durch eine Filtersäule an Kieselgel (d = 6 cm, h = 5 cm, EtOAc/c-C6H12) voraufgereinigt und anschließend mittels automatisierter Flashchromatographie [Biotage Sfär Bio C1850 g, 70 mL/min, H2>(<H7=3 )h+'+ NLO ."% +'+h*,'- NLO .h/)"% *,'-h*1'2 NLO /)&*))"% *1'2& 21.1 min 100%] aufgereinigt, was (S)-6-(2-(2,2-bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole- 4-carboxamido)-6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexanamido)hexansäuremethylester (27) als gelben Feststoff [RT = 14.5 min, Rf(c-C6H12/EtOAc = 1:1) = 0.17, Rf(CH2Cl2/MeOH = 95:05) = 0.44, 0.97 g, 75%] lieferte. HRMS (pos. ESI): berechnet für C40H51N4O12 [M+H]+ m/z = 779.3498, gefunden 779.3508 (+1.3 ppm). 1H-NMR (500.13 MHz, DMSO-d6) d = 8.28 (d, J2‘-NH,2‘ = 7.5 Hz, 1H, 2‘-NH), 8.26 (d, Jmeta = 2.4 Hz, 1H, 6-H), 8.17 (dd, J1‘‘-NH,1‘‘-HA = J1‘‘-NH,1‘‘-HB = 5.6 Hz, 1H, 1‘‘-NH), 8.04 (d, Jmeta 4 +'- :[% *:% -&:$% 0'.+h0'-. #55a&BHLM HLOHT 55b66a&AQLOTZTUHNT% -:% - c 2&:$% 0')-h/'22 (BB‘-Teil eines AA’BB‘-Spinsystems, 4H, 4 × 10-H), 6.71 (t, J6‘-NH,6‘ = 5.4 Hz, 1H, 6‘-NH), 4.50 (ddd, J2‘,2‘-NH = J2‘,3‘-HA = J2‘,3‘-HB = 6.3 Hz, 1H, 2‘-H), 3.77 (s, 6H, 2 × 11-OCH3), 3.56 (s, 3H, 6‘‘- OCH3), AB-Signal (dA = 3.12 und dB = 3.07, JAB = 13.1 Hz, A-Teil spaltet zusätzlich auf als dt mit JA,1‘‘-NH = 6.9 Hz und JA,2‘‘ = 6.6 Hz, B-Teil spaltet zusätzlich auf als dt mit JB,1‘‘-NH = 6.9 Hz und JB,2‘‘ = 6.5 Hz, 2H, 1‘‘-HA, 1‘‘-HB), 2.86 (mc, 2H, 6‘-H2), 2.27 (t, J5‘‘,4‘‘ = 7.4 Hz, 2H, 5‘‘-H2$% *'1*h 1.63 (m, 2H, 3‘-H2), 1.52 (tt, J4‘‘,3‘‘ = 7.6 Hz, J4‘‘,5‘‘ = 7.4 Hz, 2H, 4‘‘-H2$% *'-.h*'+- #N% 1:% -a&:2, 5‘- H2, 2‘‘-H2, 3‘‘-H2), 1.32 (s, 9H, 3 × 9‘-H3) ppm. 13C-NMR (125.76 MHz, DMSO-d6) d = 173.24 (C-6‘‘), 170.56 (C-1‘), 160.45 (C-11), 160.43 (1- CONH), 155.52 (C-7‘), 149.80 (C-2), 148.01 (C-3), 142.29 (C-5), 129.93 (C-8), 127.74 (C-9), 127.64 (dia-C-9), 121.29 (C-7), 119.00 (C-6), 115.42 (C-1), 114.05 (C-10), 113.98 (dia-C-10), 106.50 (C-4), 77.26 (C-8‘), 55.30 (11-OCH3), 52.88 (C-2‘), 51.10 (6‘‘-OCH3), 39.77 (C-6‘), 38.42 (C-1‘‘), 33.17 (C-5‘‘), 32.34 (C-3‘), 29.27 (C-5‘), 28.57 (C-2‘‘), 28.17 (C-9‘), 25.76 (C-3‘‘), 24.07 (C- 4‘‘), 22.11 (C-4‘) ppm. Synthese von (S)-6-(2-(2,2-bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carboxamido)-6- ((tert-butoxycarbonyl)amino)hexanamido)hexansäure (61)
Figure imgf000037_0001
LiOH·H2O (0.51 g, 12 mmol, 10 Äquiv.) wurde zu einer Lösung von (S)-6-(2-(2,2-bis(4- methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carboxamido)-6-((tert- butoxycarbonyl)amino)hexanamido)hexansäuremethylester (27) in THF (12.5 mL) gegeben und die Mischung 21 h unter Rückfluss erhitzt. Das Lösemittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 10%iger wässriger Zitronensäure-Lösung (50 mL) aufgenommen. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc (3 × 30 mL) extrahiert und die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des Lösemittels unter vermindertem Druck lieferte (S)-6-(2-(2,2-bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carboxamido)-6-((tert- butoxycarbonyl)amino)hexanamido)hexansäure (61) als gelben Feststoff [Rf(CH2Cl2/MeOH = 95:05) = 0.24, 1.04 g, quant.]. HRMS (pos. ESI): berechnet für C39H49N4O12 [M+H]+ m/z 40/.',,-+% JHIVOGHO 0/.',,-) #h 0.3 ppm). 1H-NMR (500.13 MHz, CDCl3) d = 8.51 (d, Jmeta = 2.1 Hz, 1H, 6-H), 8.06 (d, JNH,2‘ = 7.5 Hz, 1H, 2‘-NH), 7.81 (d, Jmeta 4 +'* :[% *:% -&:$% 0'..h0'-0 #55a&BHLM HLOHT 55b66a&AQLOTZTUHNT% -:% - c 2&:$% /'2-h/'2* #66a&BHLM HLOHT 55b66a&AQLOTZTUHNT% -:% - c *)&:$% /'0) #ES' T% *:% *aa&=H), -'0.h-'/- #N% *:$% ,'1* #T% ,:% **&>7H3), 3.80 (s, 3H, 11-OCH3), 3.58 (br. s, 1H, 1‘‘-Ha$% ,'+0h 3.21 (m, 1H, 1‘‘-Hb), 3.16 (br. s, 1H, 6‘-Ha), 3.05 (br. s, 1H, 6‘-Hb), 2.34 (br. s, 2H, 5‘‘-H2), AB- Signal (dA = 1.97 und dB = 1.77, JAB = 14.2 Hz, A-Teil spaltet zusätzlich auf als dt mit JA,2‘ = 7.4 Hz und JA,4‘ = 7.1 Hz, B-Teil spaltet zusätzlich auf als dt mit JB,2‘ = 7.2 Hz und JB,4‘ = 7.0 Hz, 2H, 3‘-HA, 3‘-HB$% *'/-h*'., #N% /:% .a&:2, 2‘‘-H2, 4‘‘-H2), 1.44 (br. s, 4H, 4‘-H2, 3‘‘- H2), 1.41 (br. s, 9H, 3 × 9‘-H3) ppm. 13C-NMR (125.76 MHz, CDCl3) d = 171.30 (C-1’), 161.01 (1-CONH)i, 160.95 (C-11)i, 150.25 (C- 2), 148.64 (C-3), 143.08 (C-5), 130.49 (C-8), 130.37 (dia-C-9), 128.01 (C-9), 122.66 (C-7), 120.12 (C-6), 114.89 (C-1), 114.10 (C-10), 113.61 (dia-C-10), 106.71 (C-4), 79.85 (C-8’), 55.54 (11- OCH3), 55.52 (dia-11-OCH3), 53.71 (C-2‘), 40.48 (C-6’), 39.19 (C-1’’), 33.44 (C-5’’), 33.25 (C-3‘), 29.65 (C-4’)ii, 28.75 (C-2’’)iii, 28.52 (C-9‘), 26.01 (C-3’’)iii, 23.97 (C-4’’)iii, 22.61 (C-5’)ii ppm. Zuordnung vertauschbar. Synthese von tert-Butyl-(S)-(5-(2,2-bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4- carboxamido)-6-((6-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-6-hydroxyhexyl)amino)-6- oxohexyl)carbamat (28)
Figure imgf000038_0001
Eine Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (0.32 g, 1.6 mmol, 1.3 Äquiv.) in CH2Cl2 (12.7 mL) wurde innerhalb von 10 min bei 0°C zu einer Lösung von Dimedon (0.27 g, 1.9 mmol, 1.5 mmol), DMAP (0.23 g, 1.9 mmol, 1.5 Äquiv.) und (S)-6-(2-(2,2- bis(4-methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carboxamido)-6-((tert- butoxycarbonyl)amino)hexanamido)hexansäure (61; 0.97 g, 1.3 mmol, 1.0 Äquiv.) in CH2Cl2 (16.5 mL) getropft. Das Gemisch wurde dann 20 h bei Raumtemperatur gerührt und im Anschluss mit 10%iger wässriger Zitronensäure-Lösung (25 mL) versetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit CH2Cl2 (3 × 50 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit wässriger gesättigter NaCl-Lösung (100 mL) gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Das Lösemittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mittels automatisierter Flashchromatographie [Biotage Sfär Bio C1850 g, 70 mL/min, H2>(<H7=3 )h +'+ NLO ."% +'+h*,'- NLO .h/)"% *,'-h*1'2 NLO /)&*))"% *1'2&+*'* NLO *))"C DVIJHSHLOLJU% was zu einem Gemisch von O- und C-Acylderivaten iso-28 und 28 (RT = 15.3, 16.0 min, 0.55 g, 49%) führte. Um das O-Acylderivat iso-28 selektiv zu hydrolysieren, wurde das Gemisch in einer 0.1M 4- Methylimidazol-Lösung in MeCN (18 mL) 18 h bei 60°C gerührt. Nach Entfernen des Lösemittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand mittels automatisierter Flashchromatographie [Biotage Sfär Bio C1850 g, 70 mL/min, H2>(<H7=3 )h+'+ NLO ."% +'+h*,'- NLO .h/)"% *,'-h 18.9 min 60-100%, 18.9-21.1 min 100%] aufgereinigt, was tert-Butyl-(S)-(5-(2,2-bis(4- methoxyphenyl)-6-nitrobenzo[d][1,3]dioxole-4-carboxamido)-6-((6-(4,4-dimethyl-2,6- dioxocyclohexylidene)-6-hydroxyhexyl)amino)-6-oxohexyl)carbamat (28) als gelben Feststoff (RT = 16.0 min, 0.33 g, 29%) lieferte. HRMS (pos. ESI): berechnet für C47H59N4O13 [M+H]+ m/z 4110'-)0,% JHIVOGHO 110',2,- #h 15.7 ppm). 1H-NMR (500.13 MHz, DMSO-d6) d = 8.29 (d, J2‘-NH,2‘ = 7.5 Hz, 1H, 2‘-NH), 8.27 (d, Jmeta = 2.4 Hz, 1H, 6-H), 8.18 (dd, J1‘‘-NH,1‘‘-HA = J1‘‘-NH,1‘‘-HB = 5.6 Hz, 1H, 1‘‘-NH), 8.04 (d, Jmeta 4 +'- :[% *:% -&:$% 0'.*h0'-/ #55a&BHLM HLOHT 55b66a&AQLOTZTUHNT% -:% - c 2&:$% 0')-h/'22 (BB‘-Teil eines AA’BB‘-Spinsystems, 4H, 4 × 10-H), 6.72 (t, J6‘-NH,6‘ = 5.4 Hz, 1H, 6‘-NH), 4.50 (ddd, J2‘,2‘-NH = J2‘,3‘-HA = J2‘,3‘-HB = 6.3 Hz, 1H, 2‘-H), 3.770 (s, 3H, 11-OCH3), 3.767 (s, 3H, dia-11- OCH3), AB-Signal (dA = 3.13 und dB = 3.09, JAB = 13.2 Hz, A-Teil spaltet zusätzlich auf als dt mit JA,1‘‘-NH = 6.7 Hz und JA,2‘‘ = 6.6 Hz, B-Teil spaltet zusätzlich auf als dt mit JB,1‘‘-NH = 6.6 Hz und JB,2‘‘ = 6.5 Hz, 2H, 1‘‘-HA, 1‘‘-HB), 2.93 (t, J5‘‘,4‘‘ = 7.4 Hz, 2H, 5‘‘-H2$% +'11h+'1, #N% +:% /a&:2), 2.44 (br. s, 4H, 2 × 9‘‘-H2$% *'1*h*'0. #N% *:% ,a&:A$% *'0*h*'/- #N% *:% ,a&:B), 1.53 (tt, J4‘‘,3‘‘ = 7.5 Hz, J4‘‘,5‘‘ = 7.5 Hz, 2H, 4‘‘-H2), 1.44 (ddt, J2‘‘,1‘‘-HA = J2‘‘,1‘‘-HB = J2‘‘,3‘‘ = 7.3 Hz, 2H, 2‘‘-H2$% *',2h*'++ #N% 6H, 4‘-H2, 5‘-H2, 3‘‘-H2), 1.31 (s, 9H, 3 × 9‘-H3), 0.97 (s, 6H, 2 × 11‘‘-H3) ppm. 13C-NMR (125.76 MHz, DMSO-d6) d = 204.66 (C-6‘‘), 170.55 (C-1‘), 160.44 (C-11), 160.41 (dia- C-11), 160.25 (1-CONH), 155.51 (C-7‘), 149.81 (C-2), 148.01 (C-3), 142.28 (C-5), 129.94 (C-8), 129.87, 127.74 (C-9), 127.63 (dia-C-9), 121.29 (C-7), 119.02 (C-6), 115.41 (C-1), 114.05 (C-10), 113.97 (dia-C-10), 111.55 (C-7‘‘), 106.50 (C-4), 77.25 (C-8‘), 55.29 (11-OCH3), 52.87 (C-2‘), 39.77 (C-6‘), 39.52 (C-5‘‘), 38.46 (C-1‘‘), 32.37 (C-3‘), 30.26 (C-10’’), 29.29 (C-5‘), 28.71 (C-2‘‘), 28.17 (C-9‘), 27.48 (C-11’’), 26.04 (C-3‘‘), 23.84 (C-4‘‘), 22.11 (C-4‘) ppm. Linker-Synthese während der Festphasensynthese von Peptiden Zusätzlich zu oben genannten Synthesen von Linkern der Zusammensetzung A-E-L-R lassen sich Linker auch auf der Synthese-Festphase zusammenstellen (s. Figur 7). Dabei wird zunächst eine Spaltgruppe R mit einem freien Amin des Peptids auf der Synthese-Festphase analog zur bisherigen Verfahrensweise immobilisiert. Der Linker umfasst bisher Strukturen der Teile L-R (wie z. B. in der Ausführung 62) oder E-L-R. Beinhaltet der Linker Schutzgruppen, die mit Standard-Peptidfestphasensynthese kompatibel sind (z. B. Fmoc in Ausführung 62), können Teile des Linkers mit Standard-Festphasenmethoden (Fmoc-Entschützungen, Acetylierungen, Carbonsäureaktivierungen und Peptidbindungs- oder Esterbindungsknüpfungen) sukzessiv hinzugefügt werden. So entstanden beispielsweise folgende Linker-Peptid-Konstrukte: Belegt wurde die Synthese durch Abspalten des Linker-Peptid-Konstrukts von der Festphase mit einem üblichen Reaktionsgemisch, beispielsweise Reagent K (TFA/H2O/Thioanisol/Phenol/EDT = 82.5:5:5:5:2.5). Danach wurde das entschützte Gemisch mittels UPLC-MS analysiert und auf Vorhandensein der Massen von Peptid und Linker-Peptid-Konstrukt hin untersucht. Für das Peptid der Sequenz mit dem Linker 29 wurde beobachtet:
Figure imgf000040_0001
HRMS (pos. ESI): (DOPA)3-Lys-Dda-VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG-OH (SEQ ID No.1), berechnet für C127H190N31O40 [M+3H]3+ m/z = 930.1268, gefunden 930.1380 (+12.0 ppm). In einer anderen Ausführungsform entstand:
Figure imgf000041_0001
Nach selbiger Entschützung wurde mittels UPLC-HRMS die Synthese belegt. HRMS (pos. ESI): für das Peptid-Linker-Konstrukt 64 mit der Peptidsequenz - VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG-OH, berechnet für C172H268N40O49 [M+4H]4+ m/z = 919.7430, gefunden 919.7451 (+2.3 ppm). Linker-Verankerung an den Festphase-synthetisierten Peptiden Für Optimierungen der Verankerungen der Linker (z. B. Dimedon-basierte Linker wie Dda (Molekül 9)) am Festphasen-synthetisierten Peptid wurden verschiedene Reaktionsbedingungen (wie beispielsweise Lösemittel, Temperatur, Reaktionszeiten, Additive wie Säuren oder Basen, Konzentration und Äquivalente der Reagenzien) getestet. Dafür wurde das Syntheseharz mit immobilisiertem Peptid und entschützter Amino-Funktion zum Testen jeder Bedingung im entsprechenden Lösemittel 10 min gequellt und das Lösemittel abfiltriert. Anschließend wurde das Reagenz, in einer Ausführungsform der Linker Dda, gemäß der zu testenden Reaktionsbedingungen hinzugegeben und die Lösung mit der Synthese-Festphase durchmischt. Nach Beenden der Reaktion wurde das flüssige Reaktionsmedium abfiltriert und die Synthese- Festphase mehrfach gewaschen. Nach Abspalten von der Synthese-Festphase mit einem üblichen Reaktionsgemisch, beispielsweise Reagent K (TFA/H2O/Thioanisol/Phenol/EDT = 82.5:5:5:5:2.5), wurde das Gemisch mittels UPLC-MS analysiert und über Integration der UV- Absorptionen bei 214 nm das Verhältnis zwischen Peptid und Linker-Peptid-Konstrukt bestimmt. Einfluss des pH-Werts auf die Bindung des Linkers an Metalloxid- Aufreinigungsfestphasen Wässrige Pufferlösungen, z. B. AcOH, Tris, Phosphat, Imidazol, Piperazin, Glycin, Glycylglycin, Maleat, Malat, Format, Citrat, Succinat, wurden in ihren Pufferbereichen auf bestimmte pH-Werte eingestellt (z. B.3.3, 5.5, 7.0). Zur Einstellung des pH-Wertes wurden organische oder anorganische Säuren, bevorzugt HCl und als Basen bevorzugt Alkali- oder Erdalkali-Hydroxide benutzt. Unter Verwendung dieser Pufferlösungen mit oder ohne Zusätze von organischen Lösemitteln wie z. B. MeCN oder DMSO wurden Peptid-Linker-Konstrukte gelöst und bei gleichbleibendem pH-Wert mit Metalloxiden in Kontakt gebracht. Die Effizienz der Bindung der Catechol-Untereinheiten der Linkermoleküle wurde mittels der Konzentrationsabnahme nach Inkubation mit Metalloxiden bestimmt. Dafür wurde ein geeigneter Interner Standard benutzt, der nicht an Metalloxide bindet. Details zur Trennung von peptidhaltigen Lösungen und der Aufreinigungsfestphase während der Immobilisierungsschritte/Waschschritte Für alle Schritte der Methode werden Lösemittel gewählt, in denen die verwendeten Metalloxide unlöslich sind, z. B. Wasser, Wasser, Dichlormethan (DCM), Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Ethylacetat, Diethylether, Methyl-tert-butylether, Essigsäure, 2,2,2-Trifluorethanol, Hexafluorisopropanol, Acetonitril, Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, Pyridin, Aceton, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, Phenol, Formamid, N-Butylpyrrolidon (NBP), N- Methylpyrrolidon (NMP). Es können zur Verbesserung der Löslichkeit von Peptiden und insbesondere Peptidverunreinigungen auch Zusätze beigemischt werden, wie z. B. DMSO, DMF etc. Zur Unterdrückung unspezifischer Peptidwechselwirkung können chaotrope Substanzen wie z. B. Guanidiniumsalze, Thiocyanate, Perchlorate, Iodide, Butanol, Phenol, Thioharnstoff, Harnstoff, oder Ammoniumsulfat, welche insbesondere als wässrige Lösungen verwendet werden. Die entstehenden Suspensionen sind in ihre festen (Metalloxid-Aufreinigungsfestphase, ggf. mit gebundenem Zielpeptid-Linker-Konstrukt) und flüssigen Bestandteile (Überstände oder Waschlösungen) aufzutrennen. Dies kann geschehen durch Filtration durch geeignete Filterhilfsmittel (Fritten, Membranen, Filtermaterialien wie Kieselguhr), durch Zentrifugation und Dekantieren des Überstands oder durch Retention eines magnetischen Feststoffs durch Anlegen eines Magnetfelds. Vorgehen für Reinheitsbestimmung Mittels UPLC-MS (Thermo Fisher Scientific Orbitrap XL, Waters ACQUITY PRM CSHC18 #*.) c +'* NN% *'0 gN$ XVSGH GLH @HLOKHLU GHS KHSJHTUHMMUHO ?HQULGH HSNLUUHMU' 8D[V XVSGH FD' 1 mg Harz nach der SPPS, aber vor dem Befestigen des Linkers entnommen und getrocknet. Aus dieser Probe wurde über Standardabspaltungsmethoden, beispielsweise durch Behandlung mit Reagent K (TFA/H2O/Thioanisol/Phenol/EDT = 82.5:5:5:5:2.5) und anschließender Fällung des Peptidgemischs in Diethylether, die Reinheit des Zielpeptids ermittelt. Mittels MS wird die Identität der Peaks im Chromatogramm bestimmt. Durch Integration der UV-Absorptionssignale bei 214 nm wird dann der prozentuale Anteil des Zielpeptids an der Gesamtfläche aller Peptidsignale bestimmt. Die Zusammensetzung und Reinheit aller Gemische im Verlauf der Aufreinigungsmethode (Überstand nach Immobilisieren auf der Metalloxid-Aufreinigungsfestphase, Inhalt der Waschlösungen, Elutionslösungen) werden analog bestimmt. REFERENZEN [1] W. C. Chan, P. D. White (Hrsg.) The practical approach series, Oxford University Press, New York, 2000. [2] D. E. Krieger, B. W. Erickson, R. B. Merrifield, PNAS 1976, 3160. [3] G. Lindeberg, J. Tengborn, H. Bennich, U. Ragnarsson, J. Chromatogr. A 1978, 156, 366. [4] B. Ponsati, M. Ruiz-Gayo, E. Giralt, F. Albericio, D. Andreu, J. Am. Chem. Soc.1990, 112, 5345. [5] S. Funakoshi, H. Fukuda, N. Fujii, PNAS 1991, 88, 6981. [6] S. Funakoshi, H. Fukuda, WO9206107 (A1), 1992. [7] S. Funakoshi, H. Fukuda, US5994588 (A), 1999. [8] I. Sucholeiki, P. T. Lansbury, J. Org. Chem.1993, 58, 1318. [9] Z. 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Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Ein Linkermolekül für die Aufreinigung eines Peptids gemäß der Formel A-E-L-R, wobei A
Figure imgf000045_0001
ist, R3 gleich oder unterschiedlich ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl (vorzugsweise C5 bis C6 Aryl), C2 bis C10 Alkenyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkenyl), C2 bis C10 Alkinyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkinyl), C1 bis C10 Alkylether (vorzugsweise C1 bis C5 Alkylether), Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, Halogenid (vorzugsweise F, Cl, Br oder I), NO2, NH2, OR1 und OR2, wobei R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H oder einer Schutzgruppe, wobei die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methoxymethyl (MOM), 6HO[ZMPYZNHUKZM #6><$% #+&<HUKPYZHUKPYZ$NHUKZM #<9<$% f& (Trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM), Methylthiomethyl (MTM), Ester, Azidomethyl Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether und Acetal oder benachbarte OR1 und OR2 ein cyclisches Acetal bilden, oder zwei benachbarte R3 einen 3 bis 6-gliedrigen Ring bilden, der Ring Cycloalkyl, Cycloalken, Cycloalkin oder Aryl ist, optional eines oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, O oder S umfasst, und optional mit einem oder mehreren R3 subsituiert ist, X1 abwesend oder ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), wobei Alkyl optional substituiert ist mit einem oder mehreren R3, und
Figure imgf000045_0002
wobei r = 1-20, und R5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, und R7C=O, wobei R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl und Alkylaryl, wobei C3 bis C6 Aryl oder Alkylaryl optional mit zwei oder mehreren R3 subsituiert ist, wobei E ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000046_0001
und , n= 1-10, X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH und O, Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C5 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C3 Alkyl) und N-Alkyl (vorzugsweise N-Methyl), R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amin (primäres, sekundäres oder tertiäres Amin), Alkylamin, Hydroxyalkylamin, Alkenylamin, Alkinylamin, Guanidin, Alkylguanidin, Hydroxyguanidin, Alkylharnstoff, Alkylthioharnstoff, Aryl, Alkylaryl, Heteroaryl (vorzugsweise umfassend N, S und/oder O), Alkylheteroaryl (vorzugsweise umfassend N, S und/oder O), (CH2)4NHBoc und 3NHCNNH2, wobei L
Figure imgf000046_0002
X13 N ist oder abwesend ist, wobei X11 und X14 abwesend sind, wenn X13 abwesend ist, X11, X12 und X14 gleich oder unterschiedlich sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000046_0003
und , h=1-10, i=1-10, j=0-24, x = 1-10, X9 abwesend oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH, N-Alkyl (vorzugsweise N-Methyl) und O, X10 ist OH, R6 ist A oder E oder ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000047_0001
und , m=0-10, p=0-1, q=0-10, wobei R
Figure imgf000048_0001
X15, X16 und X17 gleich oder unterschiedlich sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbonyl, C=S, C(CH3)=N, C(R9)2, wobei R9 gleich oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C3 Alkyl, Aryl und Heteroaryl (vorzugsweise umfassend N, O und/oder S) und NR10, wobei R10 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C3 Alkyl und Acetyl, und wobei wenn E abwesend ist, R kovalent an A gebunden ist. 2. Linkermolekül gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000048_0002
wobei R3 gleich oder unterschiedlich ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, OH, C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl (vorzugsweise C5 bis C6 Aryl), C2 bis C10 Alkenyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkenyl), C2 bis C10 Alkinyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkinyl), C1 bis C10 Alkylether (vorzugsweise C1 bis C5 Alkylether), Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, Halogenid (vorzugsweise F, Cl, Br oder I), NO2 und NH2 R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H oder einer Schutzgruppe, wobei die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methoxymethyl (MOM), Benzyloxymethyl (BOM), (2-Methoxyethoxy)methyl #<9<$% f& #BSLNHUKZMTLMZM$HUKPYZNHUKZM #A9<$% <HUKZMUKLPNHUKZM #<B<$% 9TUHS% 5[LGPNHUKZM Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether (vorzugsweiseTrimethylsilylether (TMS), Triisopropylsilylether (TiPS), tert-Butyldimethylsilyl ether (TBDMS), tert-Butyldiphenylsilylether (TBDPS) oder Tripropylsilylether (TPS)) und Acetal oder benachbarte OR1 und OR2 ein cyclisches Acetal bilden, k = 1-6, r=1-20, wobei der bei n=1-6 gebildete Ring Cycloalkyl, Cycloalken, Cycloalkin oder Aryl ist, optional eines oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, O oder S umfasst, und optional mit einem oder mehreren R3 subsituiert ist, und R5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, und R7C=O, wobei R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl),
Figure imgf000049_0001
. 3. Linkermolekül gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000049_0002
und , wobei R3 gleich oder unterschiedlich ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, OH, C1 bis C10 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C5 Alkyl), C3 bis C6 Aryl (vorzugsweise C5 bis C6 Aryl), C2 bis C10 Alkenyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkenyl), C2 bis C10 Alkinyl (vorzugsweise C2 bis C5 Alkinyl), C1 bis C10 Alkylether (vorzugsweise C1 bis C5 Alkylether), Arylether, Alkylamid, Arylamid, Alkylcarbamat, Alkylester, Arylester, Sulfonsäure, Alkylsulfonsäureester, Arylsulfonsäureester, Halogenid (vorzugsweise F, Cl, Br oder I), NO2 und NH2, und R1 und R2 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H oder einer Schutzgruppe, wobei die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methoxymethyl (MOM), Benzyloxymethyl (BOM), (2-Methoxyethoxy)methyl #<9<$% f& #BSLNHUKZMTLMZM$HUKPYZNHUKZM #A9<$% <HUKZMUKLPNHUKZM #<B<$% 9TUHS% 5[LGPNHUKZM Ether, Allyl Ether, Prenyl Ether, Alkylether, Benzylether, Silylether (vorzugsweise TMS, TiPS, TBDMS, TBDPS oder TPS) und Acetal oder benachbarte OR1 und OR2 ein cyclisches Acetal bilden, 4. Linkermolekül gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000050_0001
und , wobei a=0-5, b= 1-5, c=1-5, d=1-5, e=1-5, f=0-1, g = 0-1, R8 gleich oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und C1 bis C3 Alkyl (vorzugsweise CH3), X8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O und S, X2 und B gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C1 bis C6 Alkyl (vorzugsweise C1 bis C4 Alykl), Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CH3 und CHOH, X3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und C1 bis C3 Alkyl (vorzugsweise CH3), R3 gemäß Anspruch 1 ist, X4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1 bis C3 Alkyl, Aryl, Alkylsulfonsäure, Arylsulfonsäure, und X5, X6 und X7 gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus C und N. 5. Linkermolekül gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Linkermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
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und . 6. Verfahren zur Aufreinigung eines Peptids, umfassend a. Herstellung eines Linker-Peptid-Konstruktes, umfassend ein Linkermolekül gemäß einem der vorherigen Ansprüche und das Peptid, wobei das Peptid an einer Synthese Festphase gebunden ist und das Linkermolekül durch die Gruppe R kovalent an das Peptid gebunden ist, b. Abtrennung des Linker-Peptid-Konstruktes von der Synthese-Festphase, c. Bindung des Linker-Peptid-Konstruktes über die Gruppe A des Linkermoleküls an eine Aufreinigungs-Festphase, d. einen oder mehrere Waschschritte, und e. Freisetzung des Peptids aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Spaltung der Gruppe R des Linkermoleküls. 7. Verfahren gemäß Anspruch 6, charakterisiert dadurch, dass die Gruppe A des Linkermoleküls eine oder mehrere Schutzgruppen umfasst. 8. Verfahren gemäß Anspruch 7, zusätzlich umfassend die Abspaltung der einen oder mehreren Schutzgruppen der Gruppe A bei oder nach der Abtrennung des Linker-Peptid- Konstruktes von der Synthese-Festphase, vorzugsweise durch die Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA). 9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, charakterisiert dadurch, dass das Peptid aus dem Linker-Peptid-Konstrukt durch Zugabe eines Nucleophils freigesetzt wird, vorzugsweise durch Zugabe von Hydrazin, Hydroxylamin oder eines Diamins. 10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, charakterisiert dadurch, dass die Aufreinigungs-Festphase ein Metalloxid umfasst, vorzugsweise ein Metalloxid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TiO2, Fe2O3, Al2O3, ZrO2, Fe3O4, Silikat und Alumosilikat. 11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10, charakterisiert dadurch, dass die Herstellung des Linker-Peptid-Konstruktes die Zugabe des Linkermoleküls zu dem Peptid umfasst. 12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11, charakterisiert dadurch, dass die Herstellung des Linker-Peptid-Konstruktes die Zugabe eines Linkermolekül-Vorläufers umfasst, wobei der Linker-Peptidvorläufer die Gruppen R und L des Linkermoleküls umfasst und die Gruppe L eine oder mehrere Schutzgruppen umfasst. 13. Verfahren gemäß Anspruch 12, charakterisiert dadurch, dass die Herstellung des Linker- Peptid-Konstruktes zusätzlich die Abspaltung der einen oder mehreren Schutzgruppen der Gruppe R des Linkermolekül-Vorläufers und Anbindung der Gruppe A, optimal der Gruppe A-E an die Gruppe R des Linkermolekül-Vorläufers umfasst. 14. Kit für die Aufreinigung eines Peptids gemäß des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 6 bis 13, charakterisiert dadurch, dass das Kit umfasst a. ein Linkermolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, oder b. einen Linkermolekül-Vorläufer umfassend die Gruppen R und L eines Linkermoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und Reagenzien für die kovalente Anbindung der Gruppe A, optimal der Gruppe A-E an die Gruppe R des Linkermolekül-Vorläufers, und c. optional Reagenzien und Lösungsmittel für die Abspaltung von Schutzgruppen der Gruppe A des Linkermoleküls oder der Gruppe R des Linkermolekül- Vorläufers und für die einen oder mehreren Waschritte. 15. Verwendung des Linkermoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 13.
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