WO2024258237A1

WO2024258237A1 - 국소적 엑소좀 이질성 변화 측정 기반 액체생검

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Publication number: WO2024258237A1
Application number: PCT/KR2024/008252
Authority: WO
Inventors: 백세환; 김택민
Original assignee: Sol Bio Corp
Current assignee: Sol Bio Corp
Priority date: 2023-06-14
Filing date: 2024-06-14
Publication date: 2024-12-19
Anticipated expiration: 2025-12-14

Abstract

본 발명은 국소적 엑소좀 이질성 변화 측정 기반 액체생검에 관한 것으로, 엑소좀 모집단 샘플로부터 암 질환 등과 같은 특정 질환 관련 엑소좀을 소정의 표면 마커를 분리 마커로 사용하여 분리 마커에 대한 하위집단으로 분리함으로써 액체생검 샘플을 제조하고, 그 액체생검 샘플을 분리 마커 외 다른 2가지 표면 마커를 포획 및 탐지 마커로 이용하여 동일 삼중 마커를 탑재한 엑소좀을 분석한다.

Description

국소적 엑소좀 이질성 변화 측정 기반 액체생검

본 발명은 국소적 엑소좀 이질성 변화 측정 기반 액체생검에 관한 것으로, 엑소좀 모집단 샘플로부터 암 질환 등과 같은 특정 질환 관련 엑소좀을 소정의 표면 마커를 분리 마커로 사용하여 분리 마커에 대한 하위집단으로 분리함으로써 액체생검 샘플을 제조하고, 그 액체생검 샘플을 분리 마커 외 다른 2가지 표면 마커를 포획 및 탐지 마커로 이용하여 동일 삼중 마커를 탑재한 엑소좀을 분석하는 액체생검 기술에 관한 것이다.

최근에, 암 질환 및 퇴행성 질환 등 특정 질환 검사의 고통을 최소화하고 조기진단을 구현하기 위한 '액체생검 (liquid biopsy)' 개념이 소개되었다. 액체생검은 비침습적인 방법으로 비교적 간편하게 혈액, 타액, 소변 등과 같은 체액을 추출하여 특정 질환 관련 세포 혹은 이로부터 유출된 성분 (펩타이드, 단백질, 핵산, 소기관, 특정물질 등)에 대해 분석을 실시하는 방법이다. 이를 통해 특정 질환 발생 여부를 조기에 확인할 수 있으므로, 기존의 영상진단과 조직검사 그리고 혈액검사 방법 등과 같은 검사방법의 대안으로 주목받고 있다.

특정 질환 예를 들어, 암 질환 진단 시 액체생검을 이용하면 조직생검 (tissue biopsy)과 비교하여 일반적으로 다음과 같은 장점이 있다. 첫째로, 보통 침습적인 외과적 조직 채취가 잠재적인 위험이 있고 고가인 것에 비해, 액체생검 시 체액의 이용은 비교적 용이하고 합병증 위험이 경감된다. 둘째로, 조직생검은 필요 시 단일 부위에 대한 질환의 스냅촬영을 제공할 뿐이고 또한 질환 진행 및 치료에 대해 시시각각 모니터링을 할 수 없는데 반해, 액체생검을 이용하면 암 질환 진행에 대한 실시간 연속 모니터링이 가능하다. 셋째로, 조직생검을 통해서는 종양이 다양하기 때문에 그 구성에 대한 완전한 이해가 어렵지만, 액체생검 시에는 종양 세포로부터 생성된 바이오 물질을 수집하므로 분자 수준에서 종양의 구성에 대한 더 종합적인 분석이 가능하다. 넷째로, 조직생검에서는 샘플 크기가 제한되어 여러 진단 목적으로 나누어 쓸 경우 부족하게 되지만, 액체생검에서는 필요에 따라 다양한 체액으로부터 샘플의 다중 채취가 가능하다. 다섯째로, 조직생검에서 낮은 정확도로 인해 시험결과의 임상 유용성이 제한되는 데에 비해, 액체생검은 상대적으로 더 높은 정확도 (양성샘플 측정 정확도)와 민감도 (음성샘플 측정 정확도)를 제공하므로 임상 의사결정을 위한 확실한 결과를 제공할 수 있다.

암 질환 진단분야에서 액체생검용 바이오마커로서 순환종양세포 (circulating tumor cells; CTC), 세포유리 DNA (cell-free DNA), 및 엑소좀이 그 잠재력을 인정받고 있다. 순환종양세포는 농축 및 선별성 그리고 분리 핵산의 안정성은 우수하지만 혈액 내 분포량이 극히 적어서 암 질환의 조기진단에 사용하기 어렵다. 세포유리 DNA는 혈액 내 분포량은 많으나 농축 및 선별이 어렵고 또한 분리 핵산의 안정성이 낮다. 더욱이 타겟 질환과 관련없는 다량의 비특이 DNA의 존재로 인해 분석 시 잡음 (noise) 문제의 극복이 주요 현안이 되고 있다. 이러한 두 바이오마커와 비교하여, 엑소좀은 혈액 내 분포량이 많고, 농축 및 선별이 용이하며, 그리고 핵산을 안정된 상태로 분리할 수 있다. 다만, 각 엑소좀 입자 간 크기, 밀도, 함유된 단백질 및 핵산 성분들의 조성이 극히 이질적이어서 질환 관련 순수 엑소좀으로의 분리가 선행되어야 한다.

액체생검 바이오마커로서 엑소좀이 주목받고 있다. 인체 내 세포에서 미세 소포체 형태로 분비되어 그 유래 세포의 특징을 그대로 반영하고 있는 엑소좀 (30 ~ 150 nm 크기)은 혈액, 타액, 소변 등 다양한 체액에서 추출 가능하다. 엑소좀은 지질 이중층으로 되어있는 소포체이기 때문에 체내에서 안정적일 뿐만 아니라, protease, RNase, DNase 등의 공격으로부터 자유롭다. 따라서, 엑소좀을 암 질환 및 퇴행성 질환 등 특정 질환 진단의 새로운 바이오마커로 이용하려는 연구가 증가하고 있으며, 실제로 엑소좀이 함유한 단백질 및 RNA 등 구성성분을 마커로 이용한 암의 조기진단 및 동반진단 목적의 제품들이 개발되고 있다.

특히 암 관련 주요 사안으로, 엑소좀은 종양 발생, 암 전이, 및 약물 저항성에 있어서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 종양이 발생된 미시적 환경에서 다른 세포와 마찬가지로 종양세포들 또한 엑소좀 및 다른 미세 소포체를 분비하는데, 이 물질들은 혈관형성 촉진에 의한 종양의 진행 및 전이 시 종양세포 이동에 기여한다. 종양세포 유래 소포체들은 또한 면역억제에 관여하는 분자들을 함유하는데, 이 분자들은 T lymphocytes 혹은 natural killer cells를 불활성화 시킬 수 있으며, 혹은 면역반응을 억제하기 위해 regulatory T lymphocytes 혹은 myeloid cells의 분화를 촉진할 수 있다. 또한, 종양세포에서 분비된 엑소좀에 의한 종양 활성의 전이도 보고된 바 있다.

하지만, 체액에는 모든 세포에서 유래된 엑소좀이 혼합된 형태로 존재하기 때문에, 단순히 체액에서 분리된 벌크 모집단 (bulk population) 형태의 엑소좀 샘플로는 암 등 특정 질환을 정확하게 진단하기에 한계가 있다. 더욱이 질환 발병 초기에는 체액 내 특정 질환 관련 세포 유래의 엑소좀 농도가 상대적으로 매우 낮아서, 조기진단을 위해서는 체액으로부터 타겟 엑소좀의 분리 및 농축이 선행되어야 한다. 현존하는 엑소좀 분리 기술 중, 밀도 차이 기반의 초원심분리 방법이 재현성이 높으며 비교적 안정된 공정으로 인해 최상위 표준 (gold standard) 분리과정으로 채택되고 있다. 그러나 고가의 장비가 반드시 필요하고 분리 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해, 엑소좀을 침전시켜 분리하는 방법, size exclusion chromatography를 이용하거나, microfluidics를 이용하여 크기에 따라 분리하는 방법들이 개발되었다.

그러나 이와 같은 기존의 엑소좀 분리 기술들은 체액에 존재하는 모든 엑소좀을 하나의 모집단 형태로 제공하기 때문에, 암과 같은 특정 세포에서 유래된 극미량의 엑소좀을 선택적으로 탐지하는데 한계가 있다. 실제로, 세포에서 방출된 엑소좀들에는 생화학적 성분들 (막 단백질, 내부탑재 단백질 및 RNA 등)이 엑소좀 막이나 내부에 다양하게 포함되어 있어서, 성분 구성상 매우 이질적이다. 특히, 암세포로부터 유래된 엑소좀 중 특정 엑소좀에는 혈관신생 및 암전이 전초단계에서 국지적 환경조성 작업에 관여하는 mRNA 내지는 miRNA가 함유되어 있는 것으로 보고되고 있다. 더욱이 상기한 바와 같이 암 전이 시 상기한 특정 엑소좀은 면역세포의 사멸을 유도하거나 정상세포를 암세포화 하는 과정에 관여하는 생화학 성분들을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다.

암과 같은 특정 질환의 진단 시, 체액에 존재하는 모든 엑소좀이 포함된 벌크 모집단을 액체생검 샘플로 이용할 경우 높은 진단정확도를 얻기 매우 어렵다. 이것은 비특이 엑소좀들에 의해 야기되는 비특이 부착 등 샘플모체 효과 (sample matrix effect)로 인해 분석 특이도 및 민감도에 부정적 결과를 초래하기 때문이다. 이러한 분석적 문제를 극복하기 위해 특이성은 낮으나 특정 질환자의 체액에서 증가한다고 알려진 다중 바이오마커 (예: 엑소좀 표면에 존재하는 복수의 다른 단백질 마커들)를 동시에 측정하여 질환 발생 여부에 대한 판별에 사용할 수 있다. 그러나 다중 바이오마커 사용에 의한 시너지 효과는 일반적으로 제한적일 수밖에 없는데, 이것은 질환과 특이하게 연관되지 않은 대부분의 엑소좀 마커들의 질환 특이성이 근본적으로 낮기 때문이다.

이에 암과 같은 특정 질환의 발생과 연관된 엑소좀을 선택적으로 분리 및 분석하여 특정 질환의 진단에 활용하지 못하는 문제점을 해결하기 위한 방안이 절실히 요구되고 있는 상황이다.

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 일측면은 암, 퇴행성질환, 심장질환, 감염질환 등과 같은 특정 질환 관련 바이오마커를 발굴하고 이를 진단에 활용하기 위해, 엑소좀 모집단으로부터 분리 마커에 대한 엑소좀 아집단, 차아집단 또는 그 이하의 하부집단을 고수율 및 원래의 상태로 분리 및 회수하여 액체생검 샘플을 제조하고, 액체생검 샘플을 분리 마커 외 다른 2가지 표면 마커를 포획 및 탐지 마커로 이용하여 동일 삼중 마커를 탑재한 엑소좀을 분석하는 액체생검 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 실시예에 따른 액체생검은 (a) 인간 체내의 다수 세포로부터 각각 분비된 이종의 엑소좀을 함유하는 엑소좀 모집단 샘플로부터, 제1 표면 마커를 공통으로 가지는 제1 타겟 엑소좀을 하위집단으로 분리하고 회수하여, 엑소좀 하부집단을 포함하는 엑소좀 액체생검 샘플을 준비하는 단계; (b) 상기 엑소좀 하부집단에 속하고 제2 표면 마커를 공통으로 가지는 제2 타겟 엑소좀의 제3 표면 마커에 대한 정량적 신호를 측정하여, 삼중 마커 신호를 획득하는 단계; (c) 상기 제1 타겟 엑소좀의 제2 표면 마커에 대한 정량적 신호를 측정하여 획득한 이중 마커 신호와 상기 삼중 마커 신호의 측정값 비율로써 엑소좀 이질성 지표를 산출하는 단계; 및 (d) 산출된 상기 엑소좀 이질성 지표를 기반으로, 상기 엑소좀 액체생검 샘플을 분석하는 단계;를 포함한다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 정상인군 및 특정 질환의 환자군 각각의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 순차적으로 수행하여, 상기 정상인군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표, 및 상기 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 각각 산출하고, 상기 (d) 단계에서, 각각 산출된 상기 정상인군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표와 상기 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 대비하여, 상기 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커를 선별할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 질환 검진 대상자의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 바이오마커의 선별에 수행된 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 반복 수행하여 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 산출하고, 상기 (d) 단계에서, 산출된 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표와 상기 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 대비하여, 상기 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 상기 엑소좀 모집단 샘플 내 상기 이종의 엑소좀이 가지는 3개의 표면 마커 중, 어느 하나를 상기 제1 표면 마커로 선택하고, 다른 하나를 상기 제2 표면 마커로 선택하며, 나머지 하나를 상기 제3 표면 마커로 선택하는 총 6개의 선택 경로 중에 적어도 하나 이상을 선택하고, 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 순차적으로 반복 수행하여, N (N은 1 이상이고 6 이하인 자연수)개의 상기 엑소좀 이질성 지표를 산출할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 정상인군 및 특정 질환의 환자군 각각의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표, 및 상기 환자군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표를 각각 산출하고, 상기 (d) 단계에서, 각각 산출된 상기 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표와 상기 환자군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표를 기반으로, 상기 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커의 선택 경로를 선별할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 상기 (d) 단계에서, 상기 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표, 및 상기 환자군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표에 대한 사칙연산 또는 함수화를 통해 신규 지표를 각각 생성하고, 생성된 상기 신규 지표를 기반으로, 상기 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커의 선택 경로를 선별할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 질환 검진 대상자의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 반복 수행하여 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 산출하고, 상기 (d) 단계에서, 산출된 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표와 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 산출된 상기 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 대비하여, 상기 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 질환 검진 대상자의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 반복 수행하여 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 산출하고, 상기 (d) 단계에서, 산출된 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 신규 지표와 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 산출된 상기 환자군에 대한 상기 신규 지표를 대비하여, 상기 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 상기 (a) 단계는, 상기 제1 표면 마커와 특이적으로 결합하는 제1 특이결합소재를, 제1 가역적 링커를 이용해, 고상 (solid state)의 고정 부재에 결합시키는 단계; 상기 엑소좀 모집단 샘플과, 상기 고정 부재에 결합된 상기 제1 특이결합소재를 반응시켜, 다수의 상기 제1 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 상기 제1 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 아집단을 분리하는 단계; 및 포획된 상기 제1 타겟 엑소좀이 상기 고정 부재에서 분리되도록, 상기 제1 가역적 링커를 해리시켜, 상기 엑소좀 아집단을 회수하는 단계;를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 상기 엑소좀 아집단을 분리하는 단계, 및 상기 엑소좀 아집단을 회수하는 단계 사이에, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 제1 타겟 엑소좀이 포획된 상기 고정 부재를 농축하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 상기 (a) 단계는, 상기 엑소좀 아집단 내의 상기 제2 타겟 엑소좀이 가지는 상기 제2 표면 마커와 특이적으로 결합하는 제2 특이결합소재를, 상기 고정 부재에 결합시키는 단계; 및 회수된 상기 엑소좀 아집단을 함유하는 엑소좀 아집단 샘플과, 상기 고정 부재에 결합된 상기 제2 특이결합소재를 반응시켜, 다수의 상기 제2 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 상기 제2 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 차아집단을 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 상기 제2 특이결합소재를 상기 고정 부재에 결합시키는 단계에서, 상기 제2 특이결합소재가 제2 가역적 링커에 의해 상기 고정 부재에 결합되고, 포획된 상기 제2 타겟 엑소좀이 상기 고정 부재에서 분리되도록, 상기 제2 가역적 링커를 해리시켜, 상기 엑소좀 차아집단을 회수하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 상기 엑소좀 차아집단을 분리하는 단계, 및 상기 엑소좀 차아집단을 회수하는 단계 사이에, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 제2 타겟 엑소좀이 포획된 상기 고정 부재를 농축하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검에 있어서, 상기 이중 마커 신호는, 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로 측정될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.

이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명에 따르면, 타겟 질환 연관성이 상대적으로 낮지만 질환 관련 엑소좀을 포함하는 포괄적인 상위 집단의 엑소좀 특이 제1 마커 (분리 마커)에 대한 엑소좀 아집단 분리를 통해 타겟 질환과 연관성이 높은 특이 엑소좀을 차후 분리가 가능할 정도로 농축 및 회수할 수 있고, 분리 용액 내 엑소좀 특이 제2 마커 (포획 마커)에 대한 엑소좀 차아집단 포획 및 포획된 엑소좀 특이 제3 마커 (탐지 마커)에 대한 탐지를 통해 타겟 질환의 발생 및 확산에 관여하는 동일 삼중 바이오마커가 내포된 엑소좀을 액체생검 타겟으로 면역분석 할 수 있다.

또한, 체내 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀을 함유하는 엑소좀 모집단 샘플로부터, 특정 질환 관련 엑소좀을 함유하는 엑소좀 아집단, 차아집단 또는 그 이하의 하부집단을 분리 회수하여 액체생검 샘플을 제조한 후 그 액체생검 샘플을 대상으로 바이오마커 프로파일링 분석을 실시함으로써, 특정 질환에 특이한 단백질 등의 바이오마커들의 조성비 및 상호 연관성 특히, 이중, 및 삼중 등 복합 마커 공통 존재 비율을 발굴할 수 있다.

엑소좀 아집단, 차아집단 또는 그 이하의 하부집단 형태로 분리 및 농축된 액체생검 샘플을 분석 대상으로 하므로, 비특이 엑소좀이 제거되어 분석 시 잡음 (noise)이 최소화되고 특정 엑소좀 신호가 극대화되며, 이로 인해 엑소좀을 암 질환 등 특정 질환의 바이오마커로 이용 시, 현존하는 문제점인 엑소좀의 이질성 (heterogeneity)에 의한 비특이 엑소좀의 간섭이 최소화되어, 액체생검 샘플로부터 모세포의 생리학적 특성과 계보에 대한 정보를 정확히 파악할 수 있다.

또한, 본 발명을 질환 진단에 적용하면 암 질환, 퇴행성 질환, 심장질환, 감염질환 등 특정 질환에 대한 진단 정확도를 현저히 증가시켜서 병기의 초기에 질환의 진단이 가능한 조기 임상진단 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 질환 치료 시 치료제에 따라 병기의 진행 혹은 쇠퇴에 대한 정보의 획득이 가능하게 되므로 개인에 따라 맞춤 선별하는 동반진단에도 적용할 수 있다.

도 1의 본 발명의 실시예에 따른 액체생검의 순서도이다.

도 2는 본 발명의 실시예에 따른 액체생검 과정을 설명하는 도면이다.

도 3은 본 발명의 실시예에 따른 액체생검의 삼중 마커 신호 측정 과정을 설명하는 도면이다.

도 4는 본 발명의 실시예에 따른 액체생검의 엑소좀 이질성 지표를 산출하기 위한 마커분리 경로를 설명하는 도면이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 아집단 및 차아집단 샘플을 제조하는 장치를 개략적으로 도시한 구성도이다.

도 6 내지 도 9는 도 5에 도시된 제1 가역적 링커 및 제2 가역적 링커를 다양한 실시예에 따라 개략적으로 도시한 구성도이다.

도 10 내지 도 16은 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 액체생검 샘플을 제조하는 방법의 순서도이다.

도 17은 종래 방법과 대비되는 Neutral Release 기술을 사용한 신규의 순차적 마커 선택 프로세스 (A), 및 이에 따른 새로운 접근법에 대한 개념적 표현 (B)을 설명하는 도면이다.

도 18은 이질성 변화 지수 (R1, R2 및 R3)를 결정하는 과정 및 마커 선택 경로를 설명하는 도면이다.

도 19는 이질성 변화 패턴을 설명하는 도면이다.

도 20은 팬 엑소좀 테트라스파닌 (pan-exosome tetraspanin) 3종 마커, 즉, CD9, CD63, 및 CD81, 이용 시, 삼중 마커 양성 하위 클래스 'T'를 정량화하기 위한 순차적 마커 선택 전략을 도시하는 도면이다.

도 21은 삼중 마커 양성 하부집단 (T)의 크기를 정량화하는 과정을 설명하는 도면이다.

도 22는 이중 마커 양성 하부집단 (D+T)의 크기를 정량화는 종래 샌드위치 면역 분석법을 설명하는 도면이다.

도 23은 엑소좀 이질성 변화를 정량하기 위한 종합적인 실험 계획을 나타내는 표이다.

도 24는 수동 엑소좀 자성 분리 및 자동 엑소좀 자성 분리 조건을 비교한 표이다.

도 25는 Neutral Release 기술을 사용한 자동 엑소좀 자성 분리용 액체 관리 시스템을 도시한 도면이다.

도 26은 자동 엑소좀 분리 시스템 작동을 위한 설정 조건을 나타내는 표이다.

도 27은 Neutral Release 프로토콜을 사용한 자동 엑소좀 분리와 수동 분리의 성능 비교 결과이다.

도 28은 혈청에 세포주 RWPE-1 엑소좀 (1.28×10¹¹ particles/mL)을 첨가한 다양한 농도의 샘플에 대한 엑소좀 이질성 변화를 정량화한 결과이다.

도 29는 RWPE-1 (1.28×10¹¹ particles/mL), LNCaP (1.18×10¹¹ particles/mL) 및 PC3 (2.53×10¹¹ particles/mL)로부터 각각 생산된 엑소좀 샘플에 대한 농도별 이질성 변화 지표를 나타내는 그래프이다.

도 30은 다양한 임상 샘플에 대한 엑소좀 이질성 변화 지표를 나타내는 그래프이다.

도 31은 스톱오버 사이트 (특정 이중 마커를 공통으로 가지는 엑소좀 차아집단 영역)에 따른 이중 마커 양성 엑소좀 및 삼중 마커 양성 엑소좀의 이질성 변화를 정량화한 결과, 및 엑소좀 이질성 변화 지표를 나타내는 그래프이다.

도 32는 암 샘플을 정상 샘플과 구별하는 주요 요소를 나타내는 국소 이질성 변화 기반 진단 알고리즘을 설명하는 도면이다.

도 33은 서로 다른 세 번째 마커 (CD81, CD151, TSPAN8)를 이용하여 국소 이질성 변화 지표를 기반으로 샘플 분류 성능을 비교하는 도면이다.

도 34는 다양한 스톱오버 사이트에서 세 번째 마커로서 CD151을 평가한 결과이다.

도 35는 LNCaP 엑소좀 샘플을 사용하여 스톱오버 사이트 1 (CD9 및 CD63의 이중 마커를 공통으로 가지는 엑소좀 차아집단 영역)에서 CD151에 대한 이질성 변화를 측정한 결과이다.

도 36은 전립선 암 추적을 위한 스톱오버 사이트 1에서 CD151의 성능을 특성화한 결과이다.

도 37은 암 바이오마커 발견을 위한 특정 스톱오버 사이트의 잠재적 활용에 대한 포괄적인 시연을 설명하는 도면이다.

도 38은 전립선 암 샘플과 비 전립선 암 샘플에 대한 국소적 이질성 변화 지표 및 전립선 암 샘플에 대한 ROC 분석 결과이다.

도 39는 세 번째 마커의 이질성 변화를 결정하는 3가지 스톱오버 사이트의 성능을 비교하는 표이다.

도 40은 다양한 조직 및 암 상태에 따른 스톱오버 사이트 1의 CD151 이질성 변화의 특이성을 나타내는 그래프이다.

본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, "제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 상기 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 설명하기로 한다.

도 1의 본 발명의 실시예에 따른 액체생검의 순서도이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 액체생검 과정을 설명하는 도면이다. 또한, 도 3은 본 발명의 실시예에 따른 액체생검의 삼중 마커 신호 측정 과정을 설명하는 도면이다.

도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검은 인간 체내의 다수 세포로부터 각각 분비된 이종의 엑소좀을 함유하는 엑소좀 모집단 샘플로부터, 제1 표면 마커(A)를 공통으로 가지는 제1 타겟 엑소좀을 하위집단으로 분리하고 회수하여, 엑소좀 하부집단을 포함하는 엑소좀 액체생검 샘플을 준비하는 단계(S100), 엑소좀 하부집단에 속하고 제2 표면 마커를 공통으로 가지는 제2 타겟 엑소좀의 제3 표면 마커에 대한 정량적 신호를 측정하여, 삼중 마커 신호를 획득하는 단계(S200), 제1 타겟 엑소좀의 제2 표면 마커(B)에 대한 정량적 신호를 측정하여 획득한 이중 마커 신호와 삼중 마커 신호의 측정값 비율로써 국소적 엑소좀 이질성 지표(R)를 산출하는 단계(S300), 및 산출된 엑소좀 이질성 지표(R)를 기반으로, 엑소좀 액체생검 샘플을 분석하는 단계(S400)를 포함한다.

본 발명은 엑소좀 모집단 샘플로부터 암 질환 등과 같은 특정 질환 관련 엑소좀을 소정의 표면 마커를 분리 마커로 사용하여 분리 마커에 대한 하위집단으로 분리함으로써 액체생검 샘플을 제조하고, 그 액체생검 샘플을 분리 마커 외 다른 2가지 표면 마커를 포획 및 탐지 마커로 이용하여 동일 삼중 마커를 탑재한 엑소좀을 분석하는 액체생검 기술에 관한 것으로서, 본 발명의 실시예에 따른 액체생검은 엑소좀 액체생검 샘플 준비 단계(S100), 삼중 마커 신호 측정 단계(S200), 엑소좀 이질성 지표 산출 단계(S300), 및 샘플 분석 단계(S400)를 포함한다.

엑소좀 액체생검 샘플 준비 단계(S100)는 분석 대상이 되는 분석샘플로서, 엑소좀 모집단 샘플로부터, 제1 표면 마커(A)를 공통으로 가지는 제1 타겟 엑소좀을 하위집단으로 분리 및 회수하여 엑소좀 액체생검 샘플을 준비한다. 여기서, 엑소좀의 하위집단은 아집단, 차아집단, 그리고 그 이하의 하위집단을 모두 포함한다. 엑소좀 아집단은 엑소좀 모집단에 속하고, 공통적으로 적어도 하나 이상의 특정 마커를 가지는 엑소좀의 집단이고, 엑소좀 차아집단은 엑소좀 아집단의 일부로서 적어도 다른 하나 이상의 다른 마커를 공통을 구비하는 엑소좀의 집단이다. 그 이하의 하위집단 중 하나로서 엑소좀 차차아집단은 엑소좀 차아집단의 일부로서 적어도 또 다른 하나 이상의 다른 마커를 공통으로 가지는 엑소좀의 집단이며, 이러한 방식으로 그 이하의 또 다른 하위집단들이 정의될 수 있다. 한편, 엑소좀 모집단 샘플은 인간 체내의 다수 세포 또는 조직으로부터 각각 분비된 엑소좀들을 포함하는데, 여기의 엑소좀들은 이종의 엑소좀들을 함유한다. 이러한 엑소좀 모딥단 샘플로부터 엑소좀을 하위집단으로 분리하기 위해서, 본 발명은 면역친화 분리 기술을 이용할 수 있는데, 이에 대해서는 후술하도록 한다.

엑소좀 액체생검 샘플에 포함된 다양한 엑소좀들은 제1 표면 마커(A)를 공통으로 가지는데, 그 중 일부는 제1 표면 마커(A) 외에 제2 표면 마커(B)를 가지고, 또 다른 일부는 제1 표면 마커(A) 및 제2 표면 마커(B) 외에 다른 하나의 제3 표면 마커(C)를 가질 수 있다. 이하에서, 제1 표면 마커(A)를 가지는 엑소좀을 단일 마커 엑소좀, 제1 및 제2 표면 마커(A, B)를 가지는 엑소좀을 이중 마커 엑소좀, 제1, 제2 및 제3 표면 마커(A, B, C)를 모두 가지는 엑소좀을 삼중 마커 엑소좀이라 한다. 제1, 제2, 제3 표면 마커(A, B, C)는 엑소좀의 표면에 배열되는 소정의 질환 관련 바이오마커이다.

액체생검 샘플 내 엑소좀에 함유된 바이오마커 조성분포의 변화는 개별 환자에 대한 맞춤 진단 및 치료 정보를 제공할 수 있고, 또한 정확한 예후 혹은 차별화된 진단의 징후로서 중요하다. 엑소좀 유래 바이오마커들의 변화는 단일 조건 이상에 대한 반응을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 체액 내 예를 들어, 혈장 엑소좀은 혈액세포 및 주변 조직 모두로부터의 다양한 세포 자원에 의해 분비되므로 복합적 요인에 의한 변화일 수 있다.

액체생검 시 체액 내 엑소좀 표면에는 다양한 단백질들이 엑소좀마다 이질적으로 분포되어 있는데, 특히 암 질환과 연관된 특정 표면 단백질들은 발현 비율에 차이가 있기는 하지만 정상인의 엑소좀에서도 복합적으로 존재한다. Tetraspanins (CD9, CD63, CD81, CD82, CD151 등), histocompatibility complex (MHC) class-Ⅰ 및 class-Ⅱ 와 같은 cell type-specific molecules, adhesion molecules, HSP60, HSP70 등 표면 단백질의 종류 및 발현량은 모세포의 특징과 관련되어 증가하거나 감소할 수 있다. 예를 들어, tetraspanin 계열의 엑소좀 표면 단백질인 CD63은 B cell 에서 유래된 엑소좀의 lysosomal membrane에 포함되어 있는 단백질로 흑색종 암을 포함한 몇 가지 암 질환 환자의 샘플에서 증가한다.

이와 같은 배경하에서, 엑소좀 표면 단백질을 기반으로 엑소좀 하위집단으로의 면역친화 분리는 다음과 같은 장점을 제공할 수 있다. 첫째로, 밀도, 크기, 침전 등에 의거한 분리 방법들과 달리 항원-항체 부착반응을 이용하므로, 분리 후 용액에는 타겟 엑소좀 이외의 불순물의 내포가 최소화 된다. 상기한 바와 같이 진단 시 분석샘플에 불순물의 함량이 적을수록 비특이 반응 등 샘플 모체효과가 감소하므로 진단 민감도 및 특이도가 향상될 수 있다. 둘째로, 특정 질환과 연관된 엑소좀을 포함하지만 질환 연관성이 상대적으로 낮은 포괄적인 상위 집단의 엑소좀 마커에 대해 면역친화 분리를 실행하면, 분리된 하위집단 내에 특정 질환 관련 엑소좀의 농도를 증가시킬 수 있다. 이와 같은 접근방법은 엑소좀 모집단 내 질환 관련 엑소좀의 농도가 초기에 체액 내에서 탐지하기 어려울 정도로 낮은 경우에 유용하다. 이 경우, 분리된 하위집단을 진단 샘플로 이용하여 특정 질환 진단 시 그 민감도를 향상시킬 수 있다.

실제로, 증가된 수의 엑소좀 유래 단백질이 암 질환 뿐만 아니라 간염, 간 질환, 중추신경계 질환, 및 신장 질환 등 다양한 질환에 대한 잠재적인 바이오마커로 확인되고 있다. 현재까지 수 백종의 엑소좀 단백질들이 특정 질환과 관련 있는 것으로 보고되고 있고, 따라서 향후 제품개발 시 진단 혹은 분리 타겟으로 이용할 수 있다.

암 질환에 대한 예를 들면, 흑색종 암과 연관된 마커로서 CD63, caveolin-1, TYRP2, VLA-4, HSP70, 및 HSP90 이 있고, 전립선암과 연관된 마커로서 survivin 이 있고, 난소암과 연관된 마커로서 L1CAM, CD24, ADAM10, EMMPRIN, 및 claudin 이 있다. 방광암과 연관된 마커로서 EGF, resistin, 및 retinoic acid-induced protein 3 이 있고, 전립선암과 연관된 마커로서 PSA 및 PCA3 이 있다.

간염, 간 질환과 관련하여서는, 혈장 내 만성 C형 간염과 연관된 엑소좀 단백질 마커로서 CD81 이 있다. Tetraspanin 계열의 엑소좀 마커인 CD81은 C형 간염 바이러스 부착 그리고/혹은 세포 내로의 유입 시 결정적인 역할을 한다. 부가하여, 혈청 엑소좀 함유 CD81의 농도는 만성 C형 간염 환자에서 상승하고, 염증 및 섬유증 (fibrosis) 악화와도 연관되어 있다. 이로부터, 엑소좀 함유 CD81은 C형 간염 진단 및 치료 반응에 잠재적인 마커가 될 수 있음을 시사한다. 또한, 소변 내 급성 신장손상과 연관된 엑소좀 단백질 마커로서 Fetuin-A 및 ATF 3 이 있고, 간 손상과 연관된 마커로서 CD26, CD81, S1c3A1, 및 CD10 이 있다.

중추신경계 질환과 관련해서도, 많은 엑소좀 함유 단백질 바이오마커들이 그 질환의 진단에 잠재적으로 유용한 것으로 보고되고 있다. EGFRvIII (glioblastoma-specific epidermal growth factor receptor vIII)는 신경교아세포종 (glioblastoma) 환자의 혈청 엑소좀에서 발견되었는데, 이것은 신경교아세포종의 진단학적 탐지에 유용할 수 있다. 또한, 엑소좀 함유 아밀로이드 펩타이드는 알츠하이머 질환자의 뇌 플라그에 축적되는 것으로 보고되었다. Thr-181에 인산화된 Tau 단백질은 알츠하이머 질환의 잘 정립된 바이오마커인데, 온순한 증세의 알츠하이머 환자의 뇌척수액 표본으로부터 분리된 엑소좀에서 증가된 농도로 존재한다. 이와 같은 발견으로부터 알츠하이머의 조기진단에 엑소좀의 잠재적 가치가 부각되고 있다. 현재, 초기 알츠하이머 질환을 확인할 수 있는 진단 시험방법이 없는 상태이다.

또한, 신장 질환과 관련해서, 비침습 수단으로 얻을 수 있는 소변 엑소좀 내 함유 단백질들이 진단에 있어서 어떤 잠재적 유용성이 있는지 특히 요로 질환에 대해 탐구되고 있다. 예를 들어, 뇨 엑소좀 함유 fetuin-A는 정상인과 비교하여 중환자실의 급성 신장손상 환자에서 증가한다. ATF3는 또한 만성 신장질환자 혹은 정상인과 비교하여 급성 신장손상 환자로부터 분리된 엑소좀에서 단지 발견된다. 나아가, 뇨 엑소좀 단백질들은 방광암 및 전립선암에 대한 잠재적인 바이오마커로의 이용에도 연구되고 있다. 연구결과에 따르면, 두 종류의 전립선암 바이오마커인 PCA-3와 PSA가 전립선암 환자의 뇨에서 분리된 엑소좀에 존재한다. 전체적으로, 다른 체액에서 확인된 엑소좀 함유 단백질들은 향후 진단용 분석시스템 개발 시 타겟 플랫폼으로 이용될 전망이다.

그러나 상기한 바와 같은 엑소좀 마커들이 질환 관련하여 명확하게 특성화되어 있지 못하고 나아가 임상에 적용되지 못하고 있는데, 그 중대한 이유 중 하나로서 그 마커들이 단독으로 질환의 상태나 진행을 대표하지 못하고 있기 때문이다. 질환 관련 엑소좀 마커들은 다중으로 그리고 마커 그룹 간 복합적으로 상당히 복잡하게 상호 연관되어 타겟 세포에 작용할 것으로 예측된다. 특히, 암세포 유래 엑소좀은 체내 면역계 감시를 회피하기 위해 관여 마커의 종류, 숫자, 및 엑소좀 상 위치들이 암호화되어 있을 것으로 판단된다.

현재까지 단순한 샌드위치 면역분석을 이용한 엑소좀 상 마커들의 맵핑 (mapping) 방법으로 타겟 질환을 높은 정확도로 진단하기에는 기술적 한계에 도달한 상태이다. 따라서 3종 이상의 다중 단백질 마커의 조성 분포를 동일 샘플 내 엑소좀에 대해 동시에 심화 면역분석하는 기술은 엑소좀 마커를 특정 질환과의 상관성을 규명하는데 필수적이다. 예를 들어, 최근 세포 종류 및 유래에 따라 pan-exosome tetraspanins (CD9, CD63, 및 CD81) 간 조성비 및 상호 연관성 특히, 단일, 2중, 및 3중 복합 존재 비율이 현저히 다른 것으로 보고되고 있다. 그 조성비 및 상호 연관성을 쉽게 측정할 수 있는 경우, 엑소좀 출처의 예측이 가능하게 되므로 엑소좀 액체생검을 통해 특정 조직에서의 질환 등 이상 변화를 조기에 추적할 수 있게 된다.

현재 고가의 엑소좀 분석 전용기기를 이용하여 그 조성비 측정 및 임상에 대한 응용 연구가 활발히 진행되어 연구결과가 발표되고 있다. 그러나 일반 대학이나 연구소 등에서 소량 샘플에 대한 엑소좀 분석이 필요하지만 고가 장비의 접근성이 어려운 실정이다. 따라서 질환 관련 엑소좀 마커의 발굴에 대한 연구 개발을 확대하기 위해서는, 개별 연구실에서 ELISA 등 범용 면역분석 방법 및 시스템을 이용하여 엑소좀 대상 심화된 분석 접근성이 향상되어야 한다.

이와 같은 3종 이상의 마커에 대한 심화 면역분석을 실시하기 위해서는 사전에 샘플 내 엑소좀 마커에 대해 분리가 선행되어야 한다. 엑소좀 액체생검 샘플이 함유하고 있는 제1 타겟 엑소좀은 엑소좀 모집단 샘플로부터, 특정 1종 마커에 대해 분리되고 회수된 엑소좀 아집단, 특정 2종 마커에 대해 분리되고 회수된 엑소좀 차아집단, 또는 특정 3종 마커에 대해 분리되고 회수된 엑소좀 차차아집단을 구성하는 엑소좀일 수 있다. 예를 들어, 엑소좀 액체생검 샘플은 제1 표면 마커(A)를 공통으로 가지는 제1 타겟 엑소좀의 집단으로 분리된 엑소좀 아집단 샘플이거나, 또는 엑소좀 아집단에 속하고 나아가 제2 표면 마커(B)도 공통으로 가지는 제2 타겟 엑소좀의 집단으로 분리된 엑소좀 차아집단 샘플일 수 있다. 여기서, 제1 타겟 엑소좀은 제1 표면 마커(B)를 공통으로 가지는 엑소좀이며, 제2 타겟 엑소좀은 제1 표면 마커(A) 및 제2 표면 마커(B)를 공통으로 가지는 엑소좀이다.

엑소좀 액체생검 샘플에 대한 면역분석 시 일반적으로 포획 마커 및 탐지 마커 즉 2종에 대해 각각 특이한 항체를 이용하여 마커가 정의되는바, 아집단 엑소좀 샘플을 분석에 사용할 경우 3종 마커, 차아집단 샘플을 사용할 경우 4종 마커, 그리고 차차아집단 샘플을 사용할 경우 5종 마커에 대한 동시 분석이 가능하게 된다.

엑소좀을 아집단 혹은 그 이하의 하위집단으로 분리한 샘플을 얻으려면 면역친화 방법으로 분리한 엑소좀을 액상으로 회수할 수 있어야 하는데, 이와 관련한 엑소좀 액체생검 샘플을 제조하는 상세한 내용은 후술한다.

삼중 마커 신호 측정 단계(S200)에서는 엑소좀 액체생검 샘플 내 삼중 마커 엑소좀에 대한 정량적 신호를 측정한다. 이를 위해서, 엑소좀 아집단을 포함하는 엑소좀 액체생검 샘플의 경우에는 엑소좀 액체생검 샘플로부터 제2 표면 마커(B)를 공통으로 가지는 제2 타겟 엑소좀, 즉 이중 마커 엑소좀을 먼저 분리한다. 제2 타겟 엑소좀은 제2 표면 마커(B)와 특이적으로 결합하는 포획항체를 이용해 포획하여 분리할 수 있다. 그리고, 분리된 제2 타겟 엑소좀의 제3 표면 마커(C)에 대한 정량적 신호를 측정한다. 여기서, 제3 표면 마커(C)와 특이적으로 결합하는 탐지항체와 효소를 결합하여, 그 정량적 신호를 측정할 수 있다. 이러한 대표적인 탐지방식으로서 효소 면역분석법(ELISA)을 들 수 있다. 다만, 그 정량적 신호 측정방식이 반드시 이에 한정되는 것은 아니고 삼중 마커 엑소좀에 대한 정량적 신호를 측정할 수 있기만 하면 그 신호 측정법에 대한 특별한 제한은 없다. 한편, 엑소좀 차아집단을 포함하는 엑소좀 액체생검 샘플을 사용하는 경우에는 그 엑소좀 액체생검 샘플 내에 제2 표면 마커(B)를 가지는 제2 타겟 엑소좀이 이미 분리되어 있으므로, 별도의 제2 타겟 엑소좀 분리 공정은 불필요할 수 있다.

엑소좀 이질성 지표 산출 단계(S300)에서는 삼중 마커 신호 측정 단계(S200)에서 획득한 삼중 마커 신호를 기반으로 엑소좀 이질성 지표(R)를 생성한다. 엑소좀 이질성 지표(R)를 생성하기 위해서는 삼중 마커 신호의 측정값 이외의 변수로서, 이중 마커 신호의 측정값이 요구된다. 이중 마커 신호는 제1 타겟 엑소좀의 제2 표면 마커(B)에 대한 정량적 신호를 측정하여 얻을 수 있다.

여기서, 이중 마커 신호는 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로 측정될 수 있다. 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 제1 표면 마커(A)와 특이적으로 결합하는 포획항체를 반응시켜, 제1 타겟 엑소좀을 포획한 후, 제2 표면 마커(B)와 특이적으로 결합하는 탐지항체와 효소를 결합하여 그 정량적 신호를 측정할 수 있다. 즉, 효소 면역분석법 (ELISA)을 이용해 이중 마커 신호를 측정할 수 있다.

엑소좀 이질성 지표(R)는 이중 마커 신호의 측정값에 대한 삼중 마커 신호의 측정값 비율로서 정의될 수 있다.

샘플 분석 단계(S400)에서는 엑소좀 이질성 지표(R)를 사용하여, 엑소좀 액체생검 샘플을 분석한다. 엑소좀 이질성 지표(R)는 3종의 표면 마커(A, B, C) 간의 상호관계를 나타내는 지표로서, 그 상호관계는 소정의 질환별로 서로 다른 양상을 보일 수 있다. 이에, 엑소좀 이질성 지표(R)를 기반으로 특정 질환과 관련된 바이오마커를 발굴하고, 이를 그 질환의 검지에 이용할 수 있다.

일례로, 정상인군 및 특정 질환의 환자군 각각의 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 엑소좀 액체생검 샘플 준비 단계(S100)부터 상기 엑소좀 이질성 지표 산출 단계(S300)를 순차적으로 수행하여, 정상인군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R), 및 환자군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)를 각각 산출한다. 그런 다음, 샘플 분석 단계(S400)에서, 각각 산출된 정상인군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)와 환자군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)를 대비하여, 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커를 선별할 수 있다. 여기서, 정상인군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)와 환자군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)에 뚜렷한 차이가 있는 경우, 그 환자군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)가 그 환자군의 특정 질환과 관련이 있음을 알 수 있다.

이를 기초로 하여 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성할 수 있다. 즉, 질환 검진 대상자의 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 바이오마커의 선별에 수행된 상기 엑소좀 액체생검 샘플 준비 단계(S100)부터 상기 엑소좀 이질성 지표 산출 단계(S300)를 반복 수행하여 질환 검진 대상자에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)를 산출한 다음에, 샘플 분석 단계(S400)에서, 산출된 질환 검진 대상자에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)와 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표(R)를 대비하여, 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성할 수 있다.

도 4는 본 발명의 실시예에 따른 액체생검의 엑소좀 이질성 지표를 산출하기 위한 마커분리 경로를 설명하는 도면이다. 도 4를 참고로, 엑소좀 이질성 지표(R)는 3개의 표면 마커(A, B, C)에 대한 선택 순서에 따라 그 값이 달라질 수 있다. 엑소좀 모집단 샘플 내 이종의 엑소좀이 가지는 3개의 표면 마커(A, B, C) 중, 어느 하나를 상기 제1 표면 마커로 선택하고, 다른 하나를 상기 제2 표면 마커로 선택하며, 나머지 하나를 상기 제3 표면 마커로 선택하는 경우에 총 6개의 서로 다른 선택 경로가 만들어진다. 그 중에 적어도 하나 이상을 선택하고, 상기 엑소좀 액체생검 샘플 준비 단계(S100)부터 엑소좀 이질성 지표 산출 단계(S300)를 순차적으로 반복 수행하면, N (N은 1 이상이고 6 이하인 자연수)개의 엑소좀 이질성 지표(R)를 산출할 수 있다. 여기서, N 개의 엑소좀 이질성 지표(R)는 3개의 표면 마커(A, B, C)에 대한 선택 경로에 따라 서로 다른 특성을 나타내므로, 선택 경로별 엑소좀 이질성 지표(R)를 기반으로 특정 질환과 관련된 바이오마커를 발굴하고, 이를 그 질환의 검진에 이용할 수 있다.

일례로, 정상인군 및 특정 질환의 환자군 각각의 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표(R), 및 환자군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표(R)를 각각 산출한다. 그리고, 샘플 분석 단계(S400)에서, 각각 산출된 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표(R)와 상기 환자군에 대한 N 개의 엑소좀 이질성 지표(R)를 기반으로, 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커의 선택 경로를 선별할 수 있다. 여기서, N 개의 엑소좀 이질성 지표(R) 중 적어도 2개 이상의 지표 간의 상관관계를 고려하여, 바이오마커 선택 경로를 선별할 수 있다.

이를 기초로 하여 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성할 수 있다. 그 예로, 질환 검진 대상자의 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 상기 엑소좀 액체생검 샘플 준비 단계(S100)부터 엑소좀 이질성 지표 산출 단계(S300)를 반복 수행하여 질환 검진 대상자에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)를 산출하고, 산출된 질환 검진 대상자에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)와 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 산출된 환자군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)를 대비하여, 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성할 수 있다. 이때, 환자군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R) 외에 정상인군에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)도, 질환 검진 대상자에 대한 엑소좀 이질성 지표(R)와 대비될 수 있다.

한편, 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커의 선택 경로를 선별함에 있어서, 샘플 분석 단계(S400)에서, 각각 산출된 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표(R)와 상기 환자군에 대한 N 개의 엑소좀 이질성 지표(R)를 기반으로, 정상인군과 환자군 간 대비가 최대화될 수 있도록 N 개의 엑소좀 이질성 지표(R) 간 사칙연산, 즉 더하기, 빼기, 곱하기, 및 나누기를 하거나, 나아가 엑소좀 이질성 지표(R)가 함수화된 신규 지표를 이용할 수도 있다.

이 경우에, 질환 검진 대상자의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 상기 엑소좀 액체생검 샘플 준비 단계(S100)부터 엑소좀 이질성 지표 산출 단계(S300)를 반복 수행하여 질환 검진 대상자에 대한 엑소좀 이질성 지표를 산출하고, 샘플 분석 단계(S400)에서, 산출된 질환 검진 대상자에 대한 신규 지표와 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 산출된 환자군에 대한 상기 신규 지표를 대비하여, 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성할 수 있다.

이하에서는 엑소좀 액체생검 샘플을 준비하는 내용을 그 제조장치 및 제조방법을 들어 설명한다.

도 5는 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 아집단 및 차아집단 샘플을 제조하는 장치를 개략적으로 도시한 구성도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 액체생검 샘플 제조장치는 고상(solid state)의 고정 부재(10), 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀(1) 중 소정의 질환 관련 엑소좀(1a)이 가지는 제1 표면 마커(m1)와 특이적으로 결합하여 질환 관련 제1 타겟 엑소좀(1a)을 포획하는 제1 특이결합소재(20), 및 고정 부재(10)와 제1 특이결합소재(20)를 분리 가능하게 결합시키는 제1 가역적 링커(30)를 포함할 수 있다.

또한, 제1 특이결합소재(20)가 미결합된 상기 고정 부재(10)에 결합되고, 질환 관련 제1 타겟 엑소좀(1a)의 집단인 엑소좀 아집단(S) 내의 제2 타겟 엑소좀(1b)이 가지는 제2 표면 마커(m2)와 특이적으로 결합하여 제2 타겟 엑소좀(1b)을 포획하는 제2 특이결합소재(40)를 더 포함할 수 있다.

또한, 제2 특이결합소재(40)를 고정 부재(10)에 결합하기 위한 수단으로서, 제2 가역적 링커(50)를 더 포함할 수 있다.

고정 부재(10)는 고상(solid state)의 부재로서, 그 표면에 제1 가역적 링커(30), 제2 특이결합소재(40) 및 제2 가역적 링커(50)가 선택적으로 결합 고정될 수 있다. 하나의 고정 부재(10) 상에 제1 가역적 링커(30)가 결합 고정되었다가 분리되고 이후에 제2 특이결합소재(40) 또는 제2 가역적 링커(50)가 결합 고정될 수 있다. 또한, 제1 가역적 링커(30)가 고정되는 고정 부재(10)와, 제2 특이결합소재(40) 또는 제2 가역적 링커(50)가 고정되는 고정 부재(10)가 서로 다를 수 있다. 이러한 고정 부재(10)는 하이드로 젤, 자성비드, 라텍스 비드, 글라스 비드, 나노금속 구조체, 세공성 멤브레인, 및 비세공성 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다만, 고정 부재(10)가 반드시 상기에 한정되는 것은 아니고, 제1 가역적 링커(30), 제2 특이결합소재(40) 또는 제2 가역적 링커(50) 각각과 결합될 수 있는 소재이면 특별한 제한이 없다.

제1 특이결합소재(20) 및 제2 특이결합소재(40)는 소정의 엑소좀(1)을 선택적으로 포획하는 소재이다. 제1 특이결합소재(20) 및 제2 특이결합소재(40)는 엑소좀(1)이 가지는 표면 마커(m)와 특이적으로 결합함으로써, 엑소좀(1)을 포획한다. 여기서, 표면 마커(m)는 특정 질환 발생 시에 정상인과 비교하여 체액 내에 상대적으로 증가할 수 있는 바이오마커로서, 엑소좀(1)의 표면에 존재하는 단백질, 핵산, 지질성분, 당 성분, 펩타이드, 및 그 외의 생화학 성분 등을 포함할 수 있다. 이러한 표면 마커(m)는 항원-항체 반응 등과 같은 면역화학적 상호작용을 통해 제1 특이결합소재(20), 및 제2 특이결합소재(40)에 특이적으로 결합될 수 있다. 제1 특이결합소재(20), 및 제2 특이결합소재(40)는 엑소좀(1)의 표면 단백질 등과 항원-항체 반응하는 소정의 항체일 수 있다.

표면 마커(m) 중 제1 특이결합소재(20)와 특이적으로 결합하는 제1 표면 마커(m1)는 소정의 질환 관련 제1 타겟 엑소좀(1a) 표면에 존재한다. 따라서, 다수의 세포로부터 분리된 엑소좀(1)의 집단인 벌크 엑소좀 모집단(B)에서부터, 제1 표면 마커(m1)를 갖는 질환 관련 제1 타겟 엑소좀(1a)은 제1 특이결합소재(20)에 포획됨으로써 분리될 수 있다. 여기서, 분리된 질환 관련 제1 타겟 엑소좀(1a)의 집단이 엑소좀 아집단(S)이 된다.

이렇게 생성된 엑소좀 아집단(S) 내의 질환 관련 엑소좀(1a) 중 제2 표면 마커(m2)를 갖는 제2 타겟 엑소좀(1b)이 제2 특이결합소재(40)와 특이적으로 반응함으로써 이에 포획되어, 엑소좀 아집단(S) 내에서 엑소좀 차아집단(SA)이 분리된다. 엑소좀(1) 상의 제1 표면 마커(m1)는 제2 표면 마커(m2)와 비교하여, 특정 질환 진단에 이용 시 상대적으로 낮은 정확도를 나타내나, 체액 내에 상대적으로 높은 농도로 존재하며, 엑소좀(1) 집단의 마커에 따른 양적 체계 분류 시 상위에 위치하여 더 포괄적인 특성을 가질 수 있다.

본 발명에서는, 체액 내 농도가 낮을 것으로 예측되는 질환 특이 마커를 포함하는 상위 엑소좀 표면 단백질 마커(제1 표면 마커) 양성 엑소좀 아집단(S)을 1차 분리, 농축, 및 회수하여 준비된 엑소좀 액체생검 샘플을 사용하거나, 또는 엑소좀 아집단(S)을 대상으로 질환 특이 마커(제2 표면 마커)에 대한 2차 분리 및 농축을 실행하여 회수된 엑소좀 차아집단(SA)을 엑소좀 액체생검 샘플로 사용할 수 있다.

나아가 본 발명에서는, 다른 엑소좀 표면 단백질 마커에 대해 순차적으로 수행할 수 있는 분리, 농축, 및 회수 공정의 반복 횟수는 목적에 따라 2회 혹은 그 이상 연장될 수 있는바, 엑소좀 차아집단(SA)을 대상으로 또 다른 질환 특이 마커에 대한 분리 및 농축을 통해 회수된 그 하위집단을 엑소좀 액체생검 샘플로 사용해도 무방하다.

체액 내 엑소좀을 이용한 액체생검 시, 단순히 농축한 벌크 모집단 형태의 엑소좀 샘플에서 검사대상 질병에 선택적으로 분리된 엑소좀(disease-relevant exosome) 샘플 사용으로의 전환은 진단 정확도를 향상시킬 수 있다.

한편, 제1 특이결합소재(20)는 제1 가역적 링커(30)를 매개로 고정 부재(10)에 고정되었다가 분리될 수 있다. 제2 특이결합소재(40)는 직접 고정 부재(10)에 분리 없이 결합 고정되거나, 또는 제2 가역적 링커(50)의 도입에 의해 고정 부재(10)에 고정되었다가 분리될 수 있다.

가역적 링커 중 어느 하나인 제1 가역적 링커(30)는 제1 특이결합소재(20)를 고정 부재(10)에 분리 가능하게 결합시키고, 다른 하나의 제2 가역적 링커(50)는 제2 특이결합소재(40)를 고정 부재(10)에 분리 가능하게 결합시킨다. 여기서, 제2 특이결합소재(40)가 고정되는 고정 부재(10)에는 제1 특이결합소재(20)가 결합되지 않는다. 즉, 제1 특이결합소재(20)가 미결합된 고정 부재(10) 상에 제2 가역적 링커(50)를 통해 제2 특이결합소재(40)가 고정된다. 이러한 제1 가역적 링커(30)와 제2 가역적 링커(50)는 서로 동일한 소재 및 구조로 이루어지거나, 또는 서로 다르게 구현될 수 있는데, 구체적인 소재 및 구조에 대해서는 후술한다.

온화한 조건 하에서의 엑소좀 면역친화 분리는 리간드-바인더 부착반응 기반 가역적 링커를 이용하면 가능하다. 가역적 링커는 초기에 특정 엑소좀(1) 특이결합소재(항체)를 고정 부재(10) 상에 고정화시키는 역할을 하지만, 샘플 내 엑소좀(1)을 고정 부재(10)에 포획한 후에는 반응조건 변화를 통해 해리되어 포획된 엑소좀(1)을 회수할 수 있게 한다. 예를 들어, 친수성 및 소수성 결합을 통한 당-당 수용체 결합반응, 이온 간 혹은 이온-이온 수용체 결합반응, 기질-효소 반응, 항원-항체 반응, 핵산접합 반응, 호르몬-세포 수용체 반응, 및 리간드-나노 구조체 반응 외에 특히 폴리히스티딘택(polyhistidine-tag), 비오틴-아비딘(biotin-avidin) 반응, 및 킬레이터(chelator)를 이용한 부착반응 등이 가역적 링커로 이용될 수 있다. 이와 같은 부착반응들은 결합 후 바인더 구조변화 혹은 바인더에 대한 경쟁반응 등 링커의 바인더-리간드 간 친화력 조절을 통해 해리가 가능하다. 따라서, 가역적 링커를 이용하면 산성 pH와 같은 가혹조건을 사용하지 않고 샘플 내 엑소좀(1)을 면역학적으로 포획 후 온화한 조건 하에서 제2 타겟 엑소좀(1b)의 분리 및 회수가 가능하게 된다.

또한, 상기한 부착반응 기반 가역적 링커를 이용한 면역친화 분리공정으로, 밀도, 크기, 용해도, 막 투과성, 분자 구조, 및 자성 등 물리적, 생물학적, 그리고 화학적 특성을 이용하여 분리 및 회수를 가능하게 하는 모든 공정이 사용될 수 있다. 특히, 크로마토그래피 혹은 자성 분리 등 각별히 고안된 면역친화 분리 공정을 이용하면, 링커 내 바인더-리간드 간 친화력 조절을 통해 체액 내 미량의 엑소좀을 분리하고 회수하는 것이 가능하다. 예를 들어, 리간드 부착 시 유발되는 링커 내 바인더의 구조변화를 인식하는 인식소재의‘스위치 성 부착반응’을 이용하면 단지 리간드 유무에 따라 면역분리 공정을 통해 엑소좀의 분리 및 회수가 가능하다. 또한, 면역분리 시 리간드-바인더 반응에서 바인더에 대해 리간드와 경쟁 반응하는 리간드 유사 구조체를 이용한 경쟁 부착반응 방법을 도입하면 경쟁 부착반응 유무에 따라 엑소좀의 분리 및 회수가 가능하다.

이하에서는 전술한 제1 가역적 링커(30) 및 제2 가역적 링커(50)에 대해 자세하게 설명한다. 가역적 링커는 이하의 제1 ~ 제4 실시예에 따라 구현될 수 있는데, 제1 가역적 링커(30, 30a ~ 30d), 및 제2 가역적 링커(50, 50a ~ 50d)는 그 중 어느 하나로 이루어질 수 있다. 도 6 내지 도 9는 도 5에 도시된 제1 가역적 링커 및 제2 가역적 링커를 다양한 실시예에 따라 개략적으로 도시한 구성도이다.

도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 제1 실시예에 따른 가역적 링커(30a, 50a)는 리간드(31a), 바인더(33a), 및 인식소재(35a)를 포함할 수 있다.

리간드(31a)는 바인더(33a)에 탈착 가능하게 결합되는 물질로서, 당 분자, 이온, 기질, 항원, 펩타이드, 비타민, 성장인자, 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

바인더(33a)는 리간드(31a)와의 부착반응에 의해 구조변화(conformation change) 야기되는 물질이다. 이러한 바인더(33a)는 당 결합단백질, 이온 결합단백질, 효소, 항체, 앱타머, 세포 수용체, 및 나노 구조체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 바인더(33a) 및 리간드(31a)는 당 결합단백질-당 분자 쌍, 이온 결합단백질-이온 쌍, 효소-기질 쌍, 항원-항체 쌍, 앱타머(aptamer)-리간드 쌍, 세포 수용체-리간드 쌍, 나노 구조체-리간드 쌍 등과 같은 바인더-리간드 쌍을 이룰 수 있고, 가장 대표적인 바인더(33a)와 리간드(31a)의 예로는, 칼슘 결합단백질(calcium binding protein, CBP)과 칼슘 이온을 들 수 있다. 다만, 바인더(33a) 및 리간드(31a)가 반드시 상기 물질에 한정되는 것은 아니고, 서로 탈착 가능하게 결합하여 구조변화를 일으키는 물질이기만 하면 어떠한 것이라도 무방하다. 제1 실시예에 따른 가역적 링커에서 바인더(33a)는 제1 특이결합소재(20) 및/또는 제2 특이결합소재(40)와 중합되어 바인더-특이결합소재 중합체(C)를 형성한다.

인식소재(35a)는, 리간드(31a)와 결합하여 구조가 변한 바인더(33a)와 특이적으로 결합하는 물질로서, 항체, 단백질 수용체, 세포 수용체, 앱타머, 효소, 나노입자, 나노 구조체, 및 중금속 킬레이터(chelator)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다만, 상기 물질은 인식소재(35a)의 일례에 불과하므로, 반드시 이에 한정하여 본 발명의 권리범위가 정해져서는 안 된다. 일례로, 리간드(31a), 바인더(33a) 및 인식소재(35a) 사이의 결합 반응을 설명하면, 칼슘 이온(리간드)이 칼슘 결합단백질(바인더)과 1차 결합하여 칼슘 결합단백질의 구조변화가 야기되고, 구조가 변한 칼슘 결합단백질과 항체(인식소재) 사이에 항원-항체 반응이 일어나 서로 결합될 수 있다. 제1 실시예에 따른 가역적 링커에서 인식소재(35a)는 고정 부재(10)의 표면에 고정된다.

한편, 가역적 링커(30, 50)를 매개로 고정 부재(10)에 결합된 제1 특이결합소재(20) 및/또는 제2 특이결합소재(40)에 의해 엑소좀(1)이 포획되면, 반응조건 변화를 통해 가역적 링커를 해리시킴으로써, 포획된 엑소좀(1a, 1b)을 회수할 수 있다. 제1 실시예에 따른 가역적 링커(30a, 50a)의 경우에는 구조가 변한 바인더(33a)가 본래의 구조로 회복될 때에 해리될 수 있다. 일례로, 칼슘 이온(리간드)이 부착되어 구조가 변한 칼슘 결합단백질(바인더)에 항체(인식소재)가 결합되고 그 항체가 엑소좀(1)을 포획한 경우에, 칼슘 이온이 함유되지 않은 회수용액을 첨가하여, 칼슘 결합단백질로부터 칼슘 이온을 탈착시킴으로써, 칼슘 결합단백질의 구조를 회복시키고 칼슘 결합단백질과 항체를 분리할 수 있다.

도 7을 참고로, 본 발명의 제2 실시예에 따른 가역적 링커(30b, 50b)는 리간드(31b), 바인더(33b), 및 인식소재(35b)를 포함할 수 있다.

제2 실시예에 따른 가역적 링커(30b, 50b)의 리간드(31b), 바인더(33b), 및 인식소재(35b)는 각각 제1 실시예에 따른 가역적 링커(30a, 50a)의 리간드(31a), 바인더(33a), 및 인식소재(35a)와 대응되는바, 이하에서는 차이점 위주로 설명한다.

제1 실시예에 따른 가역적 링커(30a, 50a)에서는, 바인더(33a)가 특이결합소재(20, 40)와 중합되어 중합체(C)를 형성하고, 인식소재(35a)가 고정 부재(10)의 표면에 고정되는데 반해, 제2 실시예에 따른 가역적 링커(30b, 50b)의 경우에는 바인더(33b)가 고정 부재(10)의 표면에 고정되고, 인식소재(35b)가 특이결합소재(20, 40)와 중합되어 인식소재-특이결합소재 중합체(C)를 형성한다. 이외에는 제1 실시예에 따른 가역적 링커(30a, 50a)와 동일한바, 자세한 설명은 생략한다.

온화한 조건하에서 샘플 내 엑소좀 아집단 내지는 차아집단 회수를 가능하게 하는 제1 및 제2 실시예에 따른 가역적 링커(30, 50)의 일례로서, 칼슘 결합단백질과 같은 바인더(33a, 33b)가 이와 특이하게 반응하는 칼슘이온과 같은 리간드(31a, 31b)와 결합하여 야기되는 구조변화를 특이하게 인식하는 항체 등 인식소재(35a, 35b)가 이용될 수 있다. 이러한 항원-항체 반응과 같은 바인더-인식소재 반응은 칼슘이온과 같은 리간드(31a, 31b) 유무에 따라 신속하게 결합 혹은 해리되어 마치 스위치를 조작하여 불을 켜고 끄는 원리와 유사하기 때문에 '스위치 성 가역 부착반응(switch-like reversible binding)'으로 묘사된다.

도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 제3 실시예에 따른 가역적 링커(30c, 50c)는 리간드(31c), 및 바인더(33c)를 포함할 수 있다.

제3 실시예에 따른 가역적 링커(30c, 50c)의 리간드(31c)는 제1 특이결합소재(20) 및/또는 제2 특이결합소재(40)와 중합되어 특이결합소재-리간드 중합체(C)를 형성한다.

제3 실시예에 따른 가역적 링커(30c, 50c)의 바인더(33c)는 고정 부재(10)의 표면에 고정되는데, 엑소좀(1a, 1b)과 특이적으로 결합된 특이결합소재-리간드 중합체(C)와 결합함으로써, 엑소좀(1a, 1b)을 고정 부재(10)에 포획한다. 바인더(33c)는 리간드(31c)와 결합하되, 리간드(31c)와 경쟁반응하는 경쟁반응 리간드(32)가 첨가될 때에 경쟁반응 리간드(32)가 부착된다. 이로 인해, 리간드(31c)가 탈착되면서 엑소좀(1a, 1b)은 고정 부재(10)에서 분리되어 회수될 수 있다. 여기서, 리간드(31c)는 히스택(His-tag, polyhistidine-tag), 비오틴 등과 같은 비타민, 당 분자, 이온, 기질, 항원, 아미노산, 펩타이드, 핵산, 성장인자, 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 바인더(33c)는 2가 금속이온, 아비딘 류, 당 결합단백질, 이온 결합단백질, 효소, 항체, 앱타머, 단백질 수용체, 세포 수용체, 및 나노 구조체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 경쟁반응 리간드(32)는 이미다졸(imidazole), 비오틴 등과 같은 비타민, 당 분자, 이온, 기질, 항원, 아미노산, 펩타이드, 핵산, 성장인자, 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

일례로, 히스택을 리간드(31c)로, 2가 금속이온을 바인더(33c)로, 이미다졸을 경쟁반응 리간드(32)로 사용할 수 있다. 히스택은 단백질 내 최소 6개 이상의 히스티딘 (Histidine, His) 잔기로 구성된 아미노산 모티프로 보통 단백질의 N말단이나 C말단에 위치시켜 주로 재조합단백질의 발현 후 정제 시 사용된다. 여기서, 히스택으로 표지된 단백질은 세파로오스/아가로스 레진 상의 킬레이터와 결합된 2가 이온인 니켈이나 코발트와의 친화력을 이용하여 포획된 후, 이미다졸이 함유된 회수용액을 첨가하여 회수될 수 있다.

도 9를 참고로, 본 발명의 제4 실시예에 따른 가역적 링커(30d, 50d)는 리간드(31d), 및 바인더(33d)를 포함할 수 있다.

제4 실시예에 따른 가역적 링커(30d, 50d)의 리간드(31d), 및 바인더(33d)는 각각 제3 실시예에 따른 가역적 링커(30c, 50c)의 리간드(31c), 및 바인더(33c)와 대응되는바, 이하에서는 차이점 위주로 설명한다.

제3 실시예에 따른 가역적 링커(30c, 50c)에서는 리간드(31c)가 특이결합소재(20, 40)와 중합되고, 바인더(33c)가 고정 부재(10)의 표면에 고정되는데 반해, 제4 실시예에 따른 가역적 링커(30d, 50d)의 경우에는 리간드(31d)가 고정 부재(10)의 표면에 고정되고, 바인더(33d)가 특이결합소재(20, 40)와 중합되어 특이결합소재-바인더 중합체(C)를 형성한다. 이외에는, 동일하게 리간드(31d)가 바인더(33d)에 결합되지만, 경쟁반응 리간드(32)와의 경쟁반응에 의해 바인더(33d)로부터 분리된다.

한편, 엑소좀 액체생검 샘플 제조장치는, 반응기(도시되지 않음)를 더 포함할 수 있다. 반응기는 내부에 고정 부재(10)를 수용할 수 있다. 이때, 반응기에 엑소좀(1) 샘플이 첨가되면, 그 내부에서 제1 가역적 링커(30), 및 제1 특이결합소재(20)를 매개로 고정 부재(10)에 질환 관련 엑소좀(1a)이 포획되어 엑소좀 아집단(S)이 분리되고, 제1 가역적 링커(30)가 해리되어 엑소좀 아집단(S)이 회수된다. 또한, 회수된 엑소좀 아집단(S) 샘플을 반응기에 첨가하고, 제2 가역적 링커(50)와 제2 특이결합소재(40)를 이용해 고정 부재(10)에 제2 타겟 엑소좀(1b)이 포획되어 엑소좀 차아집단(SA)이 분리된다. 분리된 엑소좀 차아집단(SA)은 제2 가역적 링커(50)가 해리되면서 회수된다. 여기서, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해 고정 부재(10)를 농축함으로써, 엑소좀 아집단(S) 및/또는 엑소좀 차아집단(SA)을 농축할 수 있다. 예를 들어, 자성비드를 고정 부재(10)로 사용하는 경우, 자석을 이용해 질환 관련 엑소좀(1a) 및/또는 제2 타겟 엑소좀(1b)과 결합된 고정 부재(10)를 포획한 상태에서 상층액을 제거하고 자성비드를 제거함으로써 엑소좀 아집단(S) 및/또는 엑소좀 차아집단(SA)을 농축할 수 있다.

이하에서는 전술한 엑소좀 액체생검 샘플 제조장치를 이용한 액체생검 샘플 제조방법에 대해 설명한다. 엑소좀 액체생검 샘플 제조장치에 대해서는 상술하였는바, 중복되는 사항에 대해서는 설명을 생략하거나 간단하게만 기술한다.

도 10을 참고로, 본 발명의 제1 실시예에 따른 엑소좀 액체생검 샘플 제조방법은 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀 중 소정의 질환 관련 제1 타겟 엑소좀이 가지는 제1 표면 마커와 특이적으로 결합하는 제1 특이결합소재를, 제1 가역적 링커를 이용해, 고상(solid state)의 고정 부재에 결합시키는 단계(S110), 엑소좀의 집단을 함유하는 샘플 용액과, 고정 부재에 결합된 제1 특이결합소재를 반응시켜, 질환 관련 제1 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 질환 관련 제1 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 아집단을 분리하는 단계(S120), 및 포획된 질환 관련 제1 타겟 엑소좀이 고정 부재에서 분리되도록, 제1 가역적 링커를 해리시켜, 엑소좀 아집단을 회수하는 단계(S130)를 포함할 수 있다.

여기서, 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀인 집단인 벌크 엑소좀 집단이나 체액을 샘플 용액으로, 1차적으로 엑소좀 아집단을 분리 회수한 후에 이를 액체생검 샘플로 제공할 수 있다.

또한, 도 11과 같이, 엑소좀 아집단으로부터 엑소좀 차아집단을 분리 회수하여 액체생검 샘플을 제조하기 위해서, 엑소좀 아집단 내의 제2 타겟 엑소좀이 가지는 제2 표면 마커와 특이적으로 결합하는 제2 특이결합소재를, 고정 부재에 결합시키는 단계(S140), 및 회수된 엑소좀 아집단을 함유하는 엑소좀 아집단 용액과, 고정 부재에 결합된 제2 특이결합소재를 반응시켜, 제2 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 제2 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 차아집단을 분리하는 단계(S150)를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 제2 특이결합소재는 제2 가역적 링커에 의해 고정 부재에 결합될 수 있다.

먼저, 엑소좀 아집단을 분리 회수하기 위해서, 고정 부재에 제1 특이결합소재 및 제1 가역적 링커를 반응시킨다(S110). 이때, 제1 특이결합소재는 제1 가역적 링커를 매개로 고정 부재에 결합된다.

다음, 샘플 용액을 첨가함으로써, 제1 특이결합소재와 반응시킨다(S120). 여기서, 제1 특이결합소재가 샘플 용액에 함유된 질환 관련 제1 타겟 엑소좀의 제1 표면 마커와 특이적으로 결합한다. 이로써, 질환 관련 제1 타겟 엑소좀을 대상으로 하는 엑소좀 아집단이 고정 부재에 포획되어 샘플 용액으로부터 분리된다.

엑소좀 아집단이 분리된 후에는, 제1 가역적 링커를 해리시킨다(S130). 이때, 질환 관련 제1 타겟 엑소좀이 고정 부재로부터 분리되므로, 엑소좀 아집단을 회수할 수 있다.

질환 관련 엑소좀이 고정 부재로부터 분리되면, 그 고정 부재를 재활용하거나, 새로운 고정 부재를 이용해 고정 부재 상에 제2 특이결합소재를 결합한다(S140). 이때, 제2 특이결합소재를 직접 고정 부재에 결합하거나, 또는 제2 가역적 링커를 이용해 고정 부재에 결합할 수 있다.

다음, 회수된 엑소좀 아집단을 함유하는 엑소좀 아집단 용액을 제2 특이결합소재와 반응시킨다(S150). 이때, 제2 특이결합소재는 엑소좀 아집단 내의 제2 타겟 엑소좀의 제2 표면 마커와 특이적으로 결합하므로, 제2 타겟 엑소좀이 고정 부재에 고정된다. 이로써, 제2 타겟 엑소좀의 집합인 엑소좀 차아집단이 분리된다. 이렇게 회수되지 않고 고정 부재에 고정된 엑소좀 차아집단 형태로서 액체생검 샘플로 제공될 수 있다. 즉, 특정 질환 진단용 바이오마커가 차아집단 형태로 분리된 후 엑소좀을 회수하지 않고 바로 바이오마커에 대한 분석을 수행하거나 혹은 엑소좀을 용해시켜 용출된 바이오마커에 대한 분석을 수행하는 경우, 순차적 다중 면역친화 분리 공정 중 마지막 분리단계에서는 차아집단 엑소좀을 회수하지 않고 바로 바이오마커만을 샘플로 이용할 수 있다.

이하에서는 제1 가역적 링커 및 제2 가역적 링커에 관한 구체적 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

도 12는 전술한 제1 실시예에 따른 제1 가역적 링커(30a) 및 제2 가역적 링커(50a)를 이용한 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플의 제조방법을 도시한다. 도 10을 참고로, 먼저 인식소재(35a)를 고정 부재(10)의 표면에 고정시키고, 리간드(31a) 함유 리간드 용액, 바인더(33a) 및 제1 특이결합소재(20)를 반응시킨다. 이때, 바인더(33a)와 제1 특이결합소재(20)가 바인더-제1 특이결합소재 중합체(C)를 형성하고, 인식소재(35a)는 중합체(C)와 결합한다. 여기서, 리간드 용액 내에 함유된 리간드(31a)가 바인더(33a)에 결합되어 바인더(33a)의 구조변화가 야기되고, 구조가 변한 바인더(33a)를 인식소재(35a)가 특이적으로 인식하여 결합한다. 다음에, 벌크 엑소좀(1) 집단을 함유한 샘플 용액을 반응시킨다. 이때, 제1 특이결합소재(20)와 특이적으로 결합되는 제1 표면 마커(m1)를 갖는 질환 관련 제1 타겟 엑소좀(1a)이 고정 부재(10)에 포획되면서, 엑소좀 아집단(S)이 분리된다. 엑소좀 아집단(S)이 분리되면, 회수용액을 첨가하는데, 회수용액은 리간드(31a)를 함유하지 않은 리간드 비함유 용액으로서, 회수용액이 첨가되면 바인더(33a)에 결합된 리간드(31a)가 탈착하게 되고, 이로 인해 바인더(33a)의 변화된 구조가 원래 상태로 회복되면서 바인더(33a)와 인식소재(35a) 사이의 결합이 해리된다. 따라서, 엑소좀 아집단(S) 대상인 질환 관련 제1 타겟 엑소좀(1a)이 결합된 중합체(C)가, 인식소재(35a)로부터 분리되어, 엑소좀 아집단(S)을 회수할 수 있다.

다음에, 질환 관련 엑소좀(1a)이 분리되고 인식소재(35a)가 고정된 고정 부재(10)를 재활용하여 제2 가역적 링커(50a) 및 제2 특이결합소재(40)를 반응시킨다. 이때, 제2 가역적 링커(50a)는 제1 가역적 링커(30a)의 인식소재(35a)를 공유하고, 제1 가역적 링커(30a)와 비교하면 제1 특이결합소재(20)를 제2 특이결합소재(40)로 대체하여 고정 부재(10)에 결합한다. 여기에 회수된 엑소좀 아집단(S) 용액을 첨가하면, 제2 특이결합소재(40)가 엑소좀 아집단(S) 용액 내의 제2 타겟 엑소좀(1b)의 제2 표면 마커(m2)에 특이적으로 결합되어, 엑소좀 차아집단(SA)이 분리된다. 이때, 엑소좀 아집단(S)은 제1 가역적 링커(30a)의 바인더(33a)를 포함하기 때문에, 고정 부재(10)에 결합된 인식소재(35a)와 제1 가역적 링커(30a)의 바인더(33a)가 서로 반응할 수 있으므로, 제2 가역적 링커(50a) 및 제2 특이결합소재(40)를 반응시킨 후 고정 부재(10)에 결합된 인식소재(35a) 상의 잔여 부착자리를 바인더(33a) 등과 같은 적절한 반응성분으로 블로킹(blocking)할 수 있다.

일례로, 제1 실시예에 따른 제1 가역적 링크 및 제2 가역적 링크를 갖는 본 발명에 따라 CD63+/Cav1+ 엑소좀 차아집단(SA)을 분리하는 방법을 설명하면, 항체(가역적 인식소재)를 고체(고정 부재) 표면(Bead surface)에 고정시키고, 칼슘 결합단백질(CBP, 바인더)은 CD63 엑소좀 표면 단백질에 대한 특이항체(제1 특이결합소재)와 biotin-streptavidin linkage를 통해 중합한다(CBP-포획항체 중합체). 고정된 가역적 인식소재에 칼슘이온(예: >10 mM Ca² ⁺)이 포함된 용액에 용해된 CBP-포획항체 중합체를 첨가하면 ‘스위치 켬’ 인식반응에 의해 중합체는 고체표면에 고정된다. 동일한 용액에 준비된 벌크 엑소좀 샘플을 순차적으로 첨가하면 CD63 마커 포함 엑소좀이 고체표면의 포획항체와 반응하여 포획된다. 동일 용액으로 세척 후, 칼슘이 제거된 엑소좀 회수용액을 첨가하면, CBP와 결합되었던 칼슘이온이 탈착되어 ‘스위치 끔’ 상태가 되므로 포획되었던 엑소좀을 포획항체와 결합된 상태로 용액 내로 회수할 수 있다. 그 결과, CD63+ 엑소좀 아집단이 분리 회수되는데, 사용된 시료용액과 회수용액의 부피 비율에 따라 엑소좀의 농축도 가능하다. 추가적으로, 고체표면은 재생되어 다른 시료의 분리에 재활용될 수 있다.

순차적인 엑소좀 차아집단 분리를 위해, 재생되거나 새로운 고체표면에 가역적 인식소재를 고정시켜 특정 질환과 연관성이 높은 Cav1 엑소좀 표면 단백질에 대한 특이항체를 CBP와 중합시킨 후, 위에서와 동일하게 '스위치 켬' 인식반응을 통해 CBP-포획항체 중합체를 고체표면에 고정시킨다. 동일한 상태를 유지하면서 1차 분리 후 회수된 CD63+ 엑소좀 아집단을 2차 분리 샘플로 첨가하면 CD63 및 Cav1 마커 포함 (CD63+/Cav1+) 엑소좀이 고체표면의 포획항체와 반응하여 포획된다. 동일 용액으로 세척 후, 칼슘이 제거된 엑소좀 회수용액을 첨가하면, '스위치 끔' 상태가 되므로 포획되었던 엑소좀을 용액 내로 회수할 수 있다. 그 결과, 2차 분리를 통해 CD63+/Cav1+ 엑소좀 차아집단이 분리 회수된다.

한편, 엑소좀 차아집단의 분리 후 회수가 필요하지 않을 경우, 제2 가역적 링커의 도입 없이 포획항체를 직접 고체표면에 고정시켜 차아집단을 분리할 수도 있는데, 이 경우에 주로 포획된 엑소좀에 대해 면역분석을 수행하거나, 바로 포획된 채로 용해시켜 엑소좀 내부에 포함된 핵산을 추출 및 분자학적 검사를 수행한다.

도 13은 전술한 제3 실시예에 따른 제1 가역적 링커(30c) 및 제2 가역적 링커(50c)를 이용한 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플의 제조방법을 도시한다. 도 13을 참고로, 리간드(31c)를 질환 관련 제1 타겟 엑소좀(1a)의 제1 표면 마커(m1)와 특이적으로 반응하는 제1 특이결합소재(20)와 중합시키고, 고정 부재(10)에 결합된 바인더(33c)와의 친화력을 이용해 리간드-특이결합소재 중합체를 고정시킨 후에, 엑소좀(1) 샘플을 첨가하여 엑소좀 아집단(S)을 포획 분리하고, 경쟁반응 리간드(32)가 포함된 회수용액을 이용하여 엑소좀 아집단(S)을 회수한다.

다음에, 제2 타겟 엑소좀(1b)의 제2 표면 마커(m2)에 특이적으로 반응하는 제2 특이결합소재(40)와 리간드(31c)를 중합시키고, 고정 부재(10)에 결합된 바인더(33c)와 그 중합체(C)를 고정한 후에, 엑소좀 아집단(S) 용액을 첨가하여 엑소좀 차아집단(SA)을 포획 분리할 수 있다. 이때, 엑소좀 아집단(S)은 제1 가역적 링커(30c)의 리간드(31c)를 포함하기 때문에, 고정 부재(10)에 결합된 바인더(33c)와 제1 가역적 링커(30c)의 리간드(31c)가 서로 반응할 수 있으므로, 제2 가역적 링커(50c) 및 제2 특이결합소재(40)를 반응시킨 후 고정 부재(10)에 결합된 바인더(33c) 상의 잔여 부착자리를 리간드(31c) 등과 같은 적절한 반응성분으로 블로킹(blocking)할 수 있다.

일례로, 제3 실시예에 따른 제1 가역적 링크 및 제2 가역적 링크를 갖는 본 발명에 따라 CD63+/Cav1+ 엑소좀 차아집단을 분리하는 방법을 설명하면, 바인더(니켈 이온)를 고체표면(Bead surface)에 고정시키고, 리간드(히스택)는 제1 표면 마커(m1)로서 CD63 엑소좀(1) 표면 단백질에 대한 특이항체와 중합한다(히스택-포획항체 중합체). 고정된 니켈 이온에 히스택-포획항체 중합체를 첨가하면 바인더-리간드 반응에 의해 중합체는 고체표면에 고정된다. 동일한 용액에 준비된 벌크 엑소좀 시료를 첨가하면 CD63+ 엑소좀이 고체표면의 포획항체와 반응하여 포획된다. 용액으로 세척 후, 고농도의 경쟁반응 리간드(이미다졸)가 포함된 엑소좀 회수용액을 첨가하면, 경쟁반응에 의해 니켈 이온 결합되었던 히스택이 탈착되므로 포획되었던 엑소좀을 용액 내로 회수할 수 있다. 그 결과, CD63+ 엑소좀 아집단이 분리 회수되고, 고체표면은 재생되어 다음 시료의 분리에 재활용될 수 있다.

상기한 분리공정은 동일하게 위에서 회수된 CD63+ 엑소좀 아집단으로부터 CD63+/Cav1+ 엑소좀 차아집단의 순차적 분리에 이용된다. 이 경우, 리간드(히스택)는 제2 표면 마커로서 Cav1 엑소좀 표면 단백질에 대해 특이한 항체와 중합한다. 바인더-리간드 반응을 통해 중합체를 고체표면에 고정시킨 후, CD63+ 엑소좀 아집단 시료를 첨가하면 CD63+/Cav1+ 엑소좀이 고체표면의 포획항체와 반응하여 포획된다. 세척 후, 고농도의 경쟁반응 리간드(이미다졸)가 포함된 엑소좀 회수용액을 첨가하면, Con A와 결합되었던 CD63+/Cav1+ 엑소좀을 용액 내로 회수할 수 있다. 그 결과, CD63+/Cav1+ 엑소좀 차아집단이 분리 회수된다.

도 14는 전술한 제1 실시예에 따른 제1 가역적 링커(30a), 및 제3 실시예에 따른 제2 가역적 링커(50c)를 이용한 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플의 제조방법을 도시한다. 도 14를 참고로, 도 10에서 전술한 바와 같이 제1 실시예에 따른 제1 가역적 링커(30a)를 이용해 엑소좀 아집단(S)을 분리 및 회수하고, 도 13에서 전술한 바와 같이 제3 실시예에 따른 제2 가역적 링커(50c)를 이용해 엑소좀 차아집단(SA)을 분리할 수 있다. 이때, 엑소좀 아집단(S)은 제1 가역적 링커(30a)의 바인더(33a)를 포함하고 있지만, 엑소좀 차아집단(SA) 분리 시에는 상기 제1 실시예에 따른 바인더(33a)와 반응하지 않는 제3 실시예에 다른 바인더(33c)가 고정 부재(10)에 결합된 바, 즉 제1 가역적 링커(30a)와 다른 메커니즘으로 작동하는 제2 가역적 링커(50c)가 사용되므로 전술한 블로킹 공정이 불필요하다.

도 15는 전술한 제3 실시예에 따른 제1 가역적 링커(30c), 및 제1 실시예에 따른 제2 가역적 링커(50a)를 이용한 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플의 제조방법을 도시한다. 도 15를 참고로, 도 13에서 전술한 바와 같이 제3 실시예에 따른 제1 가역적 링커(30c)를 이용해 엑소좀 아집단(S)을 분리 및 회수한 후에, 도 10에서 전술한 바와 같이 제1 실시예에 따른 제2 가역적 링커(50a)를 이용해 엑소좀 차아집단(SA)을 분리할 수 있다. 이때, 엑소좀 아집단(S)은 제1 가역적 링커(30c)의 리간드(31c)를 포함하고 있지만, 엑소좀 차아집단(SA) 분리 시에는 상기 제1 가역적 링커(30c)와 구별되는 제2 가역적 링커(50a)를 채택하므로 전술한 블로킹 공정이 불필요하다.

도 16은 본 발명의 다른 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법의 순서도이다.

도 16를 참고로, 본 발명의 다른 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법은, 엑소좀 차아집단을 회수하는 단계(S160)를 더 포함할 수 있다. 여기서, 제2 특이결합소재는 제2 가역적 링커에 의해 고정 부재에 결합되는데, 제2 가역적 링커를 해리시킴으로써 포획된 제2 타겟 엑소좀을 고정 부재에서 분리하여, 엑소좀 차아집단을 회수할 수 있다.

또한, 엑소좀 아집단을 농축하는 단계(S125)를 더 포함할 수 있다. 샘플 용액을 첨가한 후, 회수용액을 첨가하기 전에, 엑소좀 아집단을 농축할 수 있다. 구체적으로, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 엑소좀 아집단 대상 질환 관련 엑소좀과 결합된 고정 부재를 농축한다. 일례로, 자성 비드를 고정 부재로 이용하고, 리간드 용액 및 샘플 용액이 혼합된 혼합용액 내에 자력을 통해 고정 부재를 소정의 공간 영역에 포획한 다음에, 고정 부재가 미함유된 혼합용액의 일부(예를 들어, 상층액)를 제거함으로써, 엑소좀 아집단을 농축할 수 있다.

동일한 방법으로, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 제2 타겟 엑소좀과 결합된 고정 부재를 농축함으로써, 엑소좀 차아집단을 농축할 수도 있다(S155).

이하에서는 실험예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

실험예

1. 개요

세포 및 조직으로부터 방출된 체액(예: 말초 혈액) 내의 엑소좀들은 이질성이 매우 높기 때문에, 질병 진단 및 치료 약물 모니터링을 위한 바이오마커로서 엑소좀을 활용하는데 제한이 있다. 따라서, 샘플 분석 전에 엑소좀을 분리하는 과정이 필요하다. 종래에는 엑조좀의 밀도, 크기, 용해도, 표면 마커 및 기타 요인들에 기반하여 엑소좀을 분리하여 이질성이 감소된 엑소좀 샘플을 얻었다.

암과 같은 특정 질병을 가진 환자 샘플과 건강인 샘플을 구별하는 수많은 엑소좀 바이오마커가 보고되고 있지만, 엑소좀 바이오마커 기반 진단 기술을 현장에 적용하기에는 한계가 있다. 이는 엑소좀 이질성의 동적 특성에서 비롯되는데, 체질 상태, 질병 상태, 샘플 전처리 및 분리 기술 등과 같은 다양한 요소에 따라 엑소좀 이질성 변화의 정도가 크게 달라질 수 있다. 이러한 상황에서 샘플에 의존적인 마커 검출은 일관성을 유지할 수 없다.

정확한 암 진단에 대한 한계를 극복하려면, 예를 들어 체액에서 엑소좀 샘플을 아집단 이하의 하부집단으로 분리하여 엑소좀 이질성과 관련된 문제들을 해소해야 한다. 그러나 크기, 밀도, 용해도 등에 따른 종래 단계별 분리는 초기 암 샘플의 분석에서 언급한 문제를 크게 개선하지 못한다. 표면 마커에 대해 엑소좀을 분리하는 시도를 할 수 있으나, 현재의 면역분리 기술로는 동일한 엑소좀의 여러 마커를 연속적, 반복적으로 분리할 수 없다.

본 발명은 아집단 또는 그 이하의 하부집단으로 엑소좀을 순차적으로 다단계 분리할 수 있는 혁신적인 엑소좀 분리 기술을 제안한다. 'Neutral Release'이라고 명명되는 본 기술은 기본적으로 가역적인 항원-항체 결합에 기반하여, 엑소좀을 온화한 조건에서 수화상태 (aqueous phase)로 회수할 수 있다. 나아가 회수한 엑소좀을 2종의 바이오마커를 공통으로 가지는 하부집단까지 추가로 분리할 수 있다. 벌크 집단에서 엑소좀 아집단을 분리하기 위한 주요 마커로서 테트라스파닌들 (tetraspanins, 예를 들어 CD9, CD63 및 CD81) 중 하나를 사용할 수 있고, 마커의 연속적인 분리를 통해, 엑소좀의 이질성을 줄일 수 있다.

본 발명에 이르기 위해서, 샘플 내 타겟 엑소좀을 생산하는 세포 공급원에 따른 엑소좀 이질성 변화를 추적하는 연구를 수행하였다. 엑소좀은 종양 미세환경에서 종양과 면역 세포의 상호 조절에 중요한 역할을 하며, 특정한 경우에는 면역 세포에서 유래한 엑소좀의 조성이 체액에서 급격히 증가하여, 비암성 상태와 비교할 때에 특정 엑소좀 하부집단에서 엑소좀 이질성의 변화가 더 크게 나타날 수 있다. 여기서 표면 마커를 연속적으로 선택하여, 면역 반응과 관련된 엑소좀을 포함하는 하부집단을 탐색했다. 이러한 하부집단은 건강한 기증자와 암 환자 두 그룹 간의 임상 샘플에서 국소적 이질성 변화에 대한 차등 분석을 통해 결정되었다. 이러한 접근 방식은 엑소좀의 이질성 변화에 의한 배경 잡음 (background noise)을 제거함으로써 바이오마커 발견을 위한 분석 모델의 기초가 될 수 있다.

2. 재료

칼슘이온이 칼슘 부착단백질(CBP)에 부착반응 시 변화된 CBP의 독특한 구조를 특이하게 인식하는 단일클론 항체는 본 발명자들에 의해 생산되었다. 또한, CBP로서 돌연변이 된 glucose-galactose binding protein(GGBP)를 선택하였고 이 단백질을 대장균(Escherichia coli; E. coli)으로부터 생산한 후 정제하였다. casein(sodium salt form, extract from bovine milk), bovine serum albumin (BSA), Tween-20, ProClin300, trehalose, ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA), biotin, human serum, 및 L-cysteine은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하였다. 자성 비드 (Dynabeads M-280 tosyl-activated, 2.8 νm in diameter), 스트렙타비딘 (streptavidin, SA), sulfosuccinimidyl-6-[biotinamido]-6-hexanamido hexanoate (NHS-LC-LC-biotin), RPMI 1640, Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), exosome-depleted fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, keratinocyte SFM supplied in separate packaging with recombinant EGF (rEGF) 및 bovine pituitary extract (BPE), succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), dithiothreitol (DTT), 및 Zeba Spin Desalting Column, 2 mL, (Zeba Column)은 Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, U.S.A.)에서 공급받았다. 항-CD9 항체 (Anti-CD9 antibody, clone HI9a), 항-CD63 항체 (anti-CD63 antibody, clone H5C6), 항-CD81 항체 (anti-CD81 antibody, clone 5A6), 항-CD151 항체 (anti-CD151 antibody, clone 50-6), 항-TSPAN8 항체 (anti-TSPAN8 antibody, clone TAL69)는 BioLegend (San Diego, CA, U.S.A.)에서 구입하였다. Streptavidin-poly-horseradish peroxidase 20 (HRP20) 중합 및 strep-poly HRP 중합 안정제 (stabilizer)는 Fitzgerald (Acton, MA, U.S.A)에서 구매하였다. 항체 희석액 (HAMA Blocker) 및 tetramethyl benzidine-HK (TMB-HK) 각각은 Abcam (Cambridge, U.K.) 및 Mossbio (Pasadena, Maryland, U.S.A.)로부터 구입하였다. Ultracel 100 kda 초여과 디스크 (ultrafiltration discs) 및 Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter (10 kDa MWCO; Amicon Filter)는 Merck/Millipore (Burlington, MA, U.S.A.)에서 구매하였다. StabilCoat Immunoassay Stabilizer, microwell plate, 및 FBS는 Surmodics (Eden Prairie, MN, U.S.A.), Corning (Somerville, MA, U.S.A.), 및 Cytiva (Marlborough, MA, U.S.A.)에서 각각 구입하였다.

인간 전립선암 세포주인 LNCaP와 PC-3, 인간 대장암 세포주인 HT-29와 HCT116, 그리고 인간 배아신장 세포주인 HEK293은 대한민국 서울에 위치한 한국 세포주 은행 (KCLB)에서 구입하였다. 전립선 상피 세포주인 RWPE-1은 미국 Manassas의 American Type Culture Collection (ATCC)에서 제공받았다. 건강한 개인과 전립선암 환자의 인간 혈청 임상 샘플은 미국 Maryland의 Precision for Medicine (PM)에서, 악성 흑색종 환자와 대장암 환자의 인간 혈청은 미국 Massachusetts의 iSpecimen (ISP)에서 각각 획득하였다.

3. 방법

3-1. 엑소좀 생산

세포 배양 및 엑소좀 생산. 지름 100 mm의 배양 접시에 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 첨가한 RPMI 1640 배지를 채운 후, LNCaP (2Х10⁶ cells), PC-3 cells (1Х10⁶ cells), HT-29 (2Х10⁶ cells), 및 HCT116 (2Х10⁶ cells)을 각각 그 배양 접시에 분주하고, 37℃ 및 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 세척하고, 동일한 배지 (10% 엑소좀이 제거된 FBS 포함)로 교체한 후 동일한 조건에서 48시간 동안 다시 배양하였다. 기본 배지로 DMEM을 사용한 것을 제외하고는 위와 동일한 조건으로 HEK293 세포 (1Х10⁶ cells)를 배양하였다. 케라티노사이트 (keratinocyte) SFM 배지 (0.05 mg/ml BPE 및 5 ng/ml rEGF 첨가)에 RWPE-1 세포 (1Х10⁶ cells)를 접종하여 배양하였다. 이 배양은 LNCaP 및 PC-3와 동일한 조건에서 72시간 동안 수행하고, 세척한 후에 동일한 배지에 rEGF만 추가하여 추가적으로 48시간 동안 배양했다.

엑소좀 샘플 스톡 ( Exosome sample stock) 준비. 엑소좀을 생산한 후, 각각의 접시에서 배지를 수거하였다. 세포를 펠릿화하기 위해서 1,000 g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 0.2 μm 시린지 필터로 여과하였다. 여과된 배지 (약 1,000 mL)를 초미세여과 (ultrafiltration)를 통해 농축하였다. 즉, 배지를 멤브레인 디스크 (Ultracel 100 kDa)가 포함된 Amicon 교반 셀 (400 mL capacity; Merck/Millipore, Burlington, MA, U.S.A.)에 넣고, 질소 가스 압력 10 psi 하에서 교반하여 부피가 약 40 mL 이하로 줄어들 때까지 농축하였다. 남은 배지를 교체하기 위해서 20 mM Tris-HCl, pH 7.4와 140 mM NaCl(TBS; 100 mL)을 추가한 후 다시 농축했다. 최종 부피가 18 mL 이하에 도달할 때에 엑소좀을 얻었다. 추가로 0.2 μm 필터로 여과한 후, trehalose (최종 0.95%)와 Proclin300 (최종 1%)이 포함된 TBS로 재구성하여 최종 부피를 18 mL로 조정했다. 엑소좀을 소분하여 급속 냉동 후, 사용 전까지 -80°C에서 보관했다. 엑소좀의 농도는 Yoon Idea Lab Co. (Seoul, Korea)에서 나노입자 추적 분석으로 측정하였다.

3-2. 엑소좀 분리를 위한 구성요소 준비

면역 자성비드 준비. 제조업체의 프로토콜에 따라 Tosyl 활성화 자성비드 (30 mg/mL에서 11 mL)를 자성으로 분리하고 100 mM 인산염 완충액 (pH 7.4, 100 mM PB; 48 mL)으로 세척했다. 상층액을 제거한 후, 100 mM PB로 희석한 항-CBP 항체 (clone 36F; 0.4 mg/mL에서 16.5 mL)와 3 M 황산암모늄 (11 mL)을 순차적으로 비드에 첨가했다. 실온에서 롤 믹서 (roll mixer)에 20시간 동안 배양하여 항체를 비드 표면에 화학적으로 결합시켰다. 그 후 비드를 100 mM PB로 세 차례 세척하고, 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.4)과 140 mM NaCl (PBS), 0.5% 카제인, 0.03% Proclin300 (Casein-PBS)을 포함한 용액에서 1시간 동안 그 잔여 표면을 블로킹했다. 블로킹 후에, 비드를 Casein-PBS로 세 번 세척하고, 용액에서 자성으로 분리한 다음, Casein-PBS로 재구성하여 최종 농도를 31.5 mg/mL로 조정했다. 비드는 사용 전까지 4°C에서 보관하였다.

SA 및 CBP 간 중합. PBS 내에 CBP (1 mg/mL, 550 μL)를 준비하고, 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.4, 10 mM PB) 내에 SA (5 mg/mL, 490 μL)를 준비했다. 10 mM PB에 희석된 DTT (최종 10 mM)로 CBP의 설프하이드릴기 (Sulfhydryl groups)를 실온에서 1시간 동안 활성화하였다. 동시에, DMSO에 희석된 SMCC (5 molar 이상)과 반응시켜 SA를 실온에서 30분 동안 활성화했다. 상기 두 단백질 구성 요소를 결합시켜 실온에서 2시간 동안 중합했다. 중합 후에, 탈이온수에 희석된 L-시스테인 (최종 2.22 mM)과 CaCl₂ (최종 2 mM)를 순차적으로 추가하여 남아있는 작용기를 비활성화했다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 최종 농도 0.25 mg/mL의 CBP-SA 중합체를 제조했다. 카제인 (최종 0.5%)과 Proclin300 (최종 0.03%)을 추가하고, 소분하여 급속 냉동한 다음에 사용 전까지 -80°C에서 중합체를 보관했다.

테트라스파틴에 특이적 항체의 비오틴화 ( Biotinylation of antibodies specific to tetraspanins ). PBS에 들어 있는 CD9(클론 HI9a), CD63(클론 H5C6) 또는 CD81(클론 5A6)에 특이적인 항체(0.5mg/mL에서 560μL)를, DMOS에 용해된 5몰 과량의 NHS-LC-LC-C-비오틴에 혼합한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 비오틴화 항체 (biotinylated antibody)를 분취하고 사용 전까지 4°C에서 보관했다. 이때, 최종 농도 05%의 카제인 (Casein)과 최종 농도 0.03%의 Proclin300을 첨가하였다.

3-3. 수동 모드에서 엑소좀 아집단 분리

샘플 준비. 본 실험예에서 사용된 샘플은 인간 남성 혈청으로, 암 환자와 건강한 사람에게서 기증받았으며, 샘플 결합 버퍼 (sample binding buffer) 또는 시그마 혈청 (Sigma serum)과 혼합된 세포주 엑소좀을 포함한다. 여기서, 시그마 혈청은 임상 샘플을 시뮬레이션하기 위한 대조군으로 사용되었다. 분리 전에 임상 샘플은 4°C에서 20분간 1,200 g로 원심분리했다. 침전물을 제거한 후 용액을 다시 4°C에서 1시간 동안 10,000 g로 원심분리했다. 상층액은 0.2 μm 필터를 통과시켜 여과한 후, 1시간 이내에 사용할 것은 4°C에 보관하고, 장기 보관용은 -80°C에 급속 냉동했다.

가역적 바인더를 고정하는 자성 비드 준비. CBP-SA 중합체 (200 μL, 농도 1 μg/mL)를 면역 자성 비드 (총 농도 0.15 mg/mL)에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 셰이커 (shaker)에서 혼합하여 결합시켰다 (1 단계; 도 24의 (A) 참조). 자성 분리로 상층액을 제거한 후, 세척 용액으로 비드를 세척했다. 세척 용액으로 10 mM CaCl2, 0.1% Tween-20, and 0.03% ProClin300을 포함하는 TBS (350 μL)를 사용했고, 15 ~ 20초 동안 볼텍싱 (vortexing)한 후, 자성 분리했다 (2 단계). 테트라스파닌 (tetraspanins)에 특이적인 비오틴화 항체 (200 μL, 농도 1 μg/mL)를 결합 버퍼 TBS (2% BSA, 10 mM CaCl₂, 0.1% Tween-20, 및 0.03% ProClin300 포함)에 희석하고, CBP-SA 중합체가 결합된 비드에 추가한 후, 동일한 조건에서 셰이커에서 혼합하여 반응시켰다 (3 단계). 비드를 세척하고, 상층액을 자성 분리로 제거했다 (4 단계). 결합 버퍼에 희석된 비오틴 용액 (200 μL, 농도 2 μg/mL)을 비드에 추가하여 남아 있는 SA 결합 부위를 포화시키고, 셰이커에서 30분 동안 반응시켰다 (5 단계). 비드를 세척하고, 상층액을 제거하여 가역적 엑소좀 분리를 위한 기능성 면역 자성 비드를 얻었다 (6 단계).

엑소좀 아집단 분리. 샘플 결합 버퍼 TBS (2% BSA, 20 mM CaCl₂, 0.2% Tween-20, 0.03% ProClin300, 및 25% HAMA blocker 포함) 100 μL와 준비된 엑소좀 샘플 (100 μL)을 순서대로 기능성 면역 자성 비드에 추가한 후, 셰이커에서 2시간 동안 반응시켰다 (7 단계). 비드를 세척 용액 (500 μL)으로 세척한 후, 상층액을 자성 분리로 제거했는데, 이 과정을 두 번 반복했다 (8-10 단계). 이로써 목표로 하는 엑소좀 아집단이 자성 비드에 포획된 형태로 분리되었다.

엑소좀 회수. TBS에 500 mM NaCl, 0.5% casein, 0.1% Tween-20, 0.03% ProClin300, 2 mM EDTA, 및 0.01% phenol red가 포함된 용출 용액 (200 μL)을 준비하고, 그 용출 용액에 엑소좀이 결합된 비드를 첨가하고 셰이커에서 30분간 인큐베이션하였다 (11 단계). 자성 분리로 상층액을 새 튜브에 수집하였다. 분리된 엑소좀을 즉시 사용하거나 -80°C에서 급속 냉동하여 보관했다.

3-4. 자동화 모드에서 엑소좀 아집단 분리

시약 디스펜싱 (Reagent dispensing). 자동화 모드에서 엑소좀 분리는 샘플 정제 시스템(Nextractor NX-32N; Genolution, 서울, 한국)을 사용하여 수행했다. 이 시스템은 96-딥 웰 플레이트 (96-deep well plate)를 사용한다. 여섯 가지 시약이 동일한 열의 웰에 분배되고, 엑소좀 분리는 행 방향 (row direction)으로 수행되었다 (도 24의 (B) 및 도 25의 (A) 참조). 첫번째 열에서, CBP-SA 중합체 (최종 농도 1 ㎍/mL)와 미리 혼합된 항-CBP 항체가 코팅된 면역 자성 비드 (200 μL; 농도 0.75 mg/mL)를 각 웰에 추가하였다. 두번째 열에, 결합 버퍼에 희석된 엑소좀 분리용 비오틴화 항체 (200 μL; 농도 1 ㎍/mL)를 로딩했다. 세번째 열에, 결합 버퍼에 준비된 비오틴 용액 (200 μL; 농도 2 ㎍/mL)를 로딩했다. 네번째 열에, 샘플 결합 버퍼 (100 μL)를 분배한 후, 앞서 전처리된 샘플 (각 100 μL)을 추가했다. 다섯번째 열에, 세척 용액 (1 mL)을 추가했다. 여섯번째 열에, 용출 용액 (200 μL)을 첨가했다.

엑소좀 분리 절차. 시약이 로딩된 96-딥 웰 플레이트를 샘플 정제 시스템(Nextractor NX-32N)의 플레이트 랙에 배치하고, 자기 로드 번들 (magnetic rod bundle)을 커버 strip (refer to Figure S5C)으로 덮었다 (도 25의 (B) 및 (C)의 참조). 시스템의 미리 설정된 프로그램에 따라 실온에서 엑소좀 분리 절차를 실행했다. 1단계에서부터 6단계를 거친 엑소좀 분리 과정이 완료되면, 96-딥 웰 플레이트를 시스템에서 제거하고, 각각의 분리된 엑소좀 샘플을 새로운 튜브로 옮겼다. 이렇게 분리된 엑소좀 아집단을 즉시 후속 분석에 사용하거나 -80°C에서 급속 냉동하여 보관하였다.

3-5. 엑소좀 분석

항체 코팅 플레이트 준비. 항-CD9 항체 (2.5 μg/mL; 클론 HI9a), 항-CD81 항체 (2.5 μg/mL; 클론 5A6) 및 항-CD63 항체 (1.0 μg/mL; 클론 H5C6)를 100 mM 탄산 완충액 (pH 9.6, ELISA 코팅 완충액)에 각각 희석했다. 각 항체 용액 (100 μL)을 마이크로웰 (microwells)로 옮기고 4°C에서 16시간 동안 배양했다. 항체가 코팅된 마이크로웰을 마이크로플레이트 세척 장치 (Wellwash™Versa Microplate Washer; Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 0.1% Tween-20이 포함된 PBS (웰당 300 μL)로 3회 세척했다. 그런 다음 마이크로웰을 StabilCoat Immunoassay Stabilizer (웰당 200 μL)로 채우고 실온에서 2시간 동안 배양했다. 안정제 용액 (stabilizer solution)을 제거한 후, 마이크로웰을 습도가 30% 미만인 클린룸에서 24시간 동안 건조한 후 알루미늄 파우치에 밀봉하여 4°C에서 보관했다.

검출용 항체의 비오틴화. 면역분석에서 검출에 사용되는 항체에 대해 비오틴화를 수행했다: 항-CD9 항체 (1.0 mg/mL; 클론 5A6), 항-CD63 항체 (1.0 mg/mL; 클론 H5C6), 항-CD81 항체 (1.0 mg/mL; 클론 5A6), 항-CD151 항체 (1.0 mg/mL; 클론 50-6) 및 항-TSPAN8 항체 (1.0 mg/mL; 클론 TAL69). 각 항체 용액(각 300 μL)의 완충액을 Zeba Column을 사용하여 PBS로 교체했다. 그런 다음 각 항체를 DMSO에 용해된 20몰 과량의 NHS-LC-LC-비오틴과 결합시키고 볼텍스 셰이커 (vortex shaker)에서 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척된 탈염 컬럼 (desalting column)을 사용하여 미결합 비오틴을 제거한 후, 비오틴화 항체를 사용할 때까지 4°C에서 0.1% Tween-20을 함유하는 Casein-PBS에 보관했다.

면역분석 절차. 적절한 포획용 항체 코팅 마이크로웰 플레이트와 이에 대응되는 검출용 비오틴화 항체를 결합하여 다양한 표적 엑소좀 마커에 대한 표준 샌드위치 면역분석을 수행했다. 분석 샘플에는 배지, 완충액 또는 시그마 혈청 (Sigma serum)에 희석된 세포주 엑소좀과 앞서 설명한 대로 전처리된 임상 혈청 샘플이 포함되었다. 샘플 (100 μL)을 마이크로웰에 별도로 첨가하고 실온에서 3시간 동안 셰이커에서 배양했다. 웰을 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS (270 μL)로 3회 세척하였다. 0.5% 카세인, 0.1% Tween-20 및 1% ProClin300을 포함하는 TBS (희석 완충액)에 희석된 비오틴화 검출 항체 (100 μL; 농도 0.1 μg/mL)를 웰로 옮기고 셰이커에서 1시간 동안 배양했다. 웰을 3회 세척한 후, SA-poly HRP20 (100 μL; 농도 66.67 ng/mL)을 각 웰에 첨가하고 동일한 조건에서 1시간 동안 반응시켰다. 웰을 다시 세척하고 신호 생성을 위해 기질 용액 (200 μL TMB-HK)을 첨가했다. 15분 후 0.5 M 황산용액 (50 μL)을 첨가하여 반응을 정지시키고 마이크로플레이트 리더 (Synergy H4; BioTek Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 450 nm 흡광도에서 신호를 측정하였다.

3-6. 엑소좀 샘플을 사용한 성능 특성화 절차

임상 샘플의 선택. 전립선암과 관련된 테스트 변수를 비교하는 데 사용하기 위해 건강한 개인과 전립선암, 결장암 또는 악성 흑색종을 앓고 있는 다양한 암 환자 등 남성 기증자의 혈청 샘플을 구입했다. 모든 건강한 개인 샘플은 HIV, HBsAg 및 HCV에 대해 음성 판정을 받은 40세 이상의 백인 기증자로부터 채취되었다. 암 샘플은 전립선암의 경우 52~80세, 대장암의 경우 43~69세, 악성 흑색종의 경우 50~81세(35세 환자 1명 제외)의 백인 기증자로부터 채취되었다. 모든 암 샘플은 해당 진단을 받은 것으로 확인되었다.

특정 이중 마커 양성 엑소좀의 정량화. 이중 마커 양성 엑소좀의 정량화를 위해, 전처리된 혈청을 희석 완충액에 적절한 비율로 희석하여 광학 밀도가 포화되는 것을 방지했다. 분석 샘플은 엑소좀 면역분석에 대해 전술한 바와 같이, 항체 코팅 플레이트와 비오틴화 항체의 올바른 조합을 사용하여 샌드위치 면역분석을 수행했다. 희석 완충액을 대조군 샘플로 사용하여 동일한 조건에서 분석했다. 모든 면역분석은 이중 반복으로 수행되었으며, 각 샘플에 대한 광학 밀도의 반복 측정 평균을 대조군에서 빼고, 국소적 이질성 변화 지표를 결정하는 데 사용되는 'D+T' 값을 얻었다.

세 번째 마커가 포함된 엑소좀의 정량화. 특정 이중 마커 양성 엑소좀 하위 집단인 'D+T' 내에서 세 번째 마커인 'T'를 정량화하기 위해, 아집단 샘플을 희석 완충액으로 적절하게 희석하고, 포획 및 검출 시약으로서 항체 코팅 플레이트와 비오틴화 항체를 결합하여 샌드위치 면역분석을 실시했다. 다른 조건은 이중 마커 양성 엑소좀을 정량화하기 위한 조건과 동일했다.

국소적 엑소좀 이질성 변화에 대한 지표 계산. 세 번째 마커의 국소적 엑소좀 이질성 변화에 대한 각 지표 R 또는 Rc는 세 번째 마커 'T'의 정량화된 값을 이중 마커 양성 엑소좀 'D+T'의 정량 값으로 나누어 결정했다. 유효 자릿수를 위해 그 역수인 1/R을 플롯팅에 사용했다.

스케일링 절차. 서로 다른 날짜에 실험을 수행하면서 발생할 수 있는 잠재적인 오류는 테스트 값을 표준 값으로 스케일링하여 보완했다. LNCaP 엑소좀을 표준샘플로 사용하였고, 테스트 샘플과 동일한 방법으로 3회 분석하였다. 1/Rs의 평균값을 표준품 (standard)에 대해 계산하고, 테스트 샘플의 1/Rs를 표준샘플의 값으로 나누어 스케일링을 수행했다. 이 스케일링은 팬 엑소좀 테트라스파닌 (pan-exosome tetraspanins)이 세 번째 마커로 사용된 경우의 측정에만 적용하였다.

데이터 도식화 및 성능 특성화. 한 쌍의 지표 R과 Rc의 값을 Excel을 사용하여 X-Y 그래프의 해당 축에 도식화하였다. 플롯상의 샘플 분포를 기반으로, 각 그래프의 컷오프 값 (cut-off value)에 의해 거짓 음성 결과 및 분해능을 결정하였다. 성능 비교를 위해 단일 매개 변수에 대한 다른 샘플 그룹의 데이터를 Excel의 box-and-whisker 그래프 기능을 사용하여 함께 도시하였다.

Receiver operating characteristic (ROC) 곡선 분석. CD151을 세 번째 마커로 사용하여 전임상 시험 (preclinical test)을 진행했다. 이는 스톱오버 사이트 1 (stopover site 1; CD9 및 CD63의 이중 마커를 공통으로 가지는 엑소좀 차아집단 영역)에서만 이루어졌으며, 건강한 개인 샘플 (18개), 전립선 암 샘플 (18개), 악성 흑색종 샘플 (12개), 대장암 샘플 (12개) 등 네 그룹의 샘플을 사용했다. R 및 Rc 쌍으로 된 지표값은 위에서 설명된 대로 측정되었으며, 전립선 암 그룹 (양성)의 데이터는 다른 세 그룹 (음성)과 비교되어 '1/R + 1/Rc' 매개 변수를 기반으로 판별 능력을 평가하기 위해 ROC 곡선을 사용했다. 간략히 설명하면, 전체 데이터 범위를 23개 구간으로 나누고, 각 구간의 샘플에 대한 음성 또는 양성의 수를 기록했다. 오름차순으로 정렬된 각 구간에 대해 누적 카운트를 계산하고, 거짓 양성 비율(FPR; false positive rate)과 진짜 양성 비율(TPR; true positive rate)을 결정했다. '1-특이도' (1-Specificity; FPR) 대 '민감도' (Sensitivity; TPR)의 플롯에서, 전립선 암 그룹과 비전립선 암 그룹 간의 구별을 평가하기 위해 곡선 아래 영역 (AUC) 값을 계산하였다.

4. 결과

4-1. 용어의 정의

가역적 링커를 사용하는 새로운 면역 자성 분리 기술인 Neutral Release를 개발하고, 이를 통해 엑소좀 표면 마커를 기반으로 엑소좀 아집단을 분리하고 액상 상태로 단일 마커 양성 엑소좀을 회수하였으며, 분리된 엑소좀을 다른 마커의 순차적 면역분리를 위한 샘플로 활용하였다. 분리 대상인 마커는 팬 엑소좀 테트라스파닌 (pan-exosome tetraspanins, CD9, CD63 및 CD81) 등 엑소좀의 표면에 존재하는 마커이다.

도 17은 종래 방법과 대비되는 Neutral Release 기술을 사용한 신규의 순차적 마커 선택 프로세스 (A), 및 이에 따른 새로운 접근법에 대한 개념적 표현 (B)을 설명하는 도면, 도 18은 이질성 변화 지수 (R1, R2 및 R3)를 결정하는 과정 및 마커 선택 경로를 설명하는 도면, 도 19는 이질성 변화 패턴을 설명하는 도면, 도 20은 팬 엑소좀 테트라스파닌 3종 마커, 즉, CD9, CD63, 및 CD81, 이용 시, 삼중 마커 양성 하위 클래스 'T'를 정량화하기 위한 순차적 마커 선택 전략을 도시하는 도면이다. 도 21은 삼중 마커 양성 하부집단 (T)의 크기를 정량화하는 과정을 설명하는 도면, 도 22는 이중 마커 양성 하부집단 (D+T)의 크기를 정량화는 종래 샌드위치 면역 분석법을 설명하는 도면, 도 23은 엑소좀 이질성 변화를 정량하기 위한 종합적인 실험 계획을 나타내는 표, 도 24는 수동 엑소좀 자성 분리 및 자동 엑소좀 자성 분리 조건을 비교한 표, 도 25는 Neutral Release 기술을 사용한 자동 엑소좀 자성 분리용 액체 관리 시스템을 도시한 도면, 도 26은 자동 엑소좀 분리 시스템 작동을 위한 설정 조건을 나타내는 표, 도 27은 Neutral Release 프로토콜을 사용한 자동 엑소좀 분리와 수동 분리의 성능 비교 결과, 도 28은 혈청에 세포주 RWPE-1 엑소좀 (1.28×10¹¹ particles/mL)을 첨가한 다양한 농도의 샘플에 대한 엑소좀 이질성 변화를 정량화한 결과이다. 도 29는 RWPE-1 (1.28×10¹¹ particles/mL), LNCaP (1.18×10¹¹ particles/mL) 및 PC3 (2.53×10¹¹ particles/mL)로부터 각각 생산된 엑소좀 샘플에 대한 농도별 이질성 변화 지표를 나타내는 그래프, 도 30은 다양한 임상 샘플에 대한 엑소좀 이질성 변화 지표를 나타내는 그래프, 도 31은 스톱오버 사이트 (특정 이중 마커를 공통으로 가지는 엑소좀 차아집단 영역)에 따른 이중 마커 양성 엑소좀 및 삼중 마커 양성 엑소좀의 이질성 변화를 정량화한 결과, 및 엑소좀 이질성 변화 지표를 나타내는 그래프, 도 32는 암 샘플을 정상 샘플과 구별하는 주요 요소를 나타내는 국소 이질성 변화 기반 진단 알고리즘을 설명하는 도면이다. 도 33은 서로 다른 세 번째 마커 (CD81, CD151, TSPAN8)를 이용하여 국소 이질성 변화 지표를 기반으로 샘플 분류 성능을 비교하는 도면, 도 34는 다양한 스톱오버 사이트에서 세 번째 마커로서 CD151을 평가한 결과, 도 35는 LNCaP 엑소좀 샘플을 사용하여 스톱오버 사이트 1 (CD9 및 CD63의 이중 마커를 공통으로 가지는 엑소좀 차아집단 영역)에서 CD151에 대한 이질성 변화를 측정한 결과이다. 도 36은 전립선 암 추적을 위한 스톱오버 사이트 1에서 CD151의 성능을 특성화한 결과, 도 37은 암 바이오마커 발견을 위한 특정 스톱오버 사이트의 잠재적 활용에 대한 포괄적인 시연을 설명하는 도면, 도 38은 전립선 암 샘플과 비 전립선 암 샘플에 대한 국소적 이질성 변화 지표 및 전립선 암 샘플에 대한 ROC 분석 결과이다. 도 39는 세 번째 마커의 이질성 변화를 결정하는 3가지 스톱오버 사이트의 성능을 비교하는 표, 도 40은 다양한 조직 및 암 상태에 따른 스톱오버 사이트 1의 CD151 이질성 변화의 특이성을 나타내는 그래프이다.

이중 마커 선택. Neutral Release 기술을 사용하면, CD9 양성 (CD9+)과 같은 특정 항원 A로 표시된 엑소좀 아집단을 액상으로 면역 자성 분리할 수 있다. 이후에 포획용 마커 B (예: CD63)에 특이적인 항체, 및 검출용 마커 C (예: CD81)에 특이적인 항체를 사용하여, 삼중 양성('A+B+C+') 엑소좀 하부집단을 정량화하는 면역 분석법을 설계할 수 있다 (도 17의 (A) 참조). 특정 엑소좀 하부집단과 해당 마커 간에 계층적인 상호관계가 존재하는 경우, 그 관계는 'A+B+' 엑소좀 하부집단에서 마커 C의 구성을 정량화할 수 있다.

엑소좀 이질성 변화. 연속적인 선택 과정 중에, 샘플 내의 엑소좀 이질성이 점진적으로 변한다. 이러한 변화는 선택한 마커와 그 선택 순서에 따라 달라진다. 이질성 변화는, 세포 기원에 따라 결정되는 엑소좀의 특성에 영향을 받을 수 있다 (도 17의 (B) 참조). 그 이질성 변화를 나타내는 매개 변수들은 복잡할 수 있지만, 'A+B+' 엑소좀에 존재하는 마커 C와 같은 세 번째 마커에 대한 탐지 항체를 이용하여 정량적으로 표현될 수 있다. 이러한 국소적 이질성 변화는 아집단 내에서 'A+B+' 하부집단의 신호에 대한 'A+B+C+' 하부집단 신호의 비율로 정의될 수 있다. 이러한 변화가 타겟 엑소좀의 기원과 관련이 있다면, 세포 성질의 변화를 특징으로 하는 질병을 진단하는데 사용 가능하다.

여기서, 테스트된 샘플의 국소적 이질성 변화는 지표 R을 사용하여 정량화할 수 있다. 이러한 지표 R은 3차 선택 후의 삼중 마커 양성 하부집단의 크기를, 2차 선택 후의 이중 마커 양성 하부집단의 크기로 나눈 값으로 정의된다. 여기서, 하부집단의 크기는 각각 삼중 (T) 및 이중 (D+T) 마커 양성 하부집단에 대한 면역분석 신호를 측정하여 결정할 수 있다. 선택의 순서는 3개의 마커 (A, B 및 C) 사이에서 시계 방향으로 회전하는 경우, 3개의 지표 (R1, R2 및 R3)가 실험적으로 결정될 수 있다 (도 18 참조). 별도로 각각 정량화된 삼중 마커 양성 하부집단의 크기는 서로 다를 수 있다. 이러한 불일치는 서로 다른 포획 항체 및 탐지 항체 쌍을 사용하는 서로 다른 샌드위치 면역 분석법을 사용한 결과에서 비롯된 것이다. 이러한 서로 다른 분석 조건을 프라임 (') 및 이중 프라임 (“) 기호로 표시했다.

샘플에 대한 서로 다른 R 값을 측정하면 개별 엑소좀에 표현된 3개의 마커에 의해 종합적으로 결정된 특성을 모니터링할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이중 마커 양성 엑소좀 하부집단은 마커 조성의 기초로 작용하고, 동일한 엑소좀에 존재하는 세 번째 마커를 측정할 수 있게 한다. 세 번째 마커의 조성 비율은 엑소좀의 특성에 따라 샘플마다 상이할 수 있다 (도 19 참조). 정상 조건에서 개개의 세포가 생산하는 엑소좀은 균일한 표면 마커 조성을 가지는 것으로 가정할 수 있다. 이러한 가정은 다른 세포와 조직에서 분비된 수많은 엑소좀 집단의 혼합으로 인해 발생하는 체액 내의 엑소좀 이질성을 관찰한 결과에 따른 것이다.

먼저 엑소좀 샘플 간의 국소적 이질성 변화에 대한 가설을 검증하기 위한 실험 시스템을 개발했다. 우리의 목표는 이질성 변화 지표 (R 지표들)가 특정 세포주에서 유래된 각 엑소좀 샘플과 고유하게 관련되어 있으며, 각 세포의 특성을 명확히 나타낼 수 있는지 여부를 확인하는 것이다. 그런 다음 이 개념을 더 복잡한 임상 샘플에 적용하여, 건강인과 암 환자의 혈청과 같은 보다 복잡한 샘플을 분석함으로써 암 진단을 위한 국소적 이질성 변화 기반 액체생검 접근법의 효과를 평가하였다. 더 나아가, 동일한 개념을 테스트하여, 다발성 암 검진에 사용 가능한 기술임을 확인하였다.

4-2. 국소적 엑소좀 이질성 변화의 정량화

엑소좀 선택 전략. 'T'의 정량화는 스톱오버 사이트 (stopover site), 'D1+T', 'D2+T', 및 'D3+T'로 명명된 이중 마커의 세 가지 다른 엑소좀 차아집단 영역을 통해 여러 경로로 계획될 수 있다 (도 20의 (A) 참조). 실험을 위해 선택된 이러한 삼중 마커는 팬 엑소좀 테트라스파닌들 (pan-exosome tetraspanins)인 CD9, CD63 및 CD81로, 각각 A, B 및 C 마커에 해당한다. 각각의 스톱오버 사이트를 통과하는 초기 선택 마커는, 최종 마커를 제외한 2개의 서로 다른 마커 중 어느 하나를 선택함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 'D1+T'가 스톱오버 사이트로 결정된 경우, 초기 선택 마커는 CD9 또는 CD63이어야 하며, 그 선택 경로는 CD81에서 종료된다. 전체적으로 'T'의 정량화는 도 20의 시계방향(경로 1로 정의) 또는 반시계방향(경로 2로 정의) 중 하나로 접근할 수 있도록 설계할 수 있다.

또한, 도 20의 (B)에 도시된 것처럼, 특정 샘플의 이질성 변화 정도는 초기 마커 선택 ('scheme'로 표시) 및 후속 마커 배열 ('route'로 표시)을 기반으로 결정된다. 기설정된 방식에 따라 R1~ R3 및 R1c~ R3c (여기서 'c'는 반시계 방향을 의미함) 등 6개의 이질성 변화 지표를 결정하여 엑소좀 이질성 변화 정도를 정량화할 수 있다.

실험적 접근 방식. 전술한 바와 같이, 'T' 및 'D+T' 하부집단의 크기를 결정하기 위해서, 삼중 팬 엑소좀 테트라스파닌 마커 및 이중 엑소좀 마커를 순차적으로 선택하기 위한 면역 분리 및 면역 분석을 고안했다 (도 21 및 도 22 참조). 이질성 변화 지표는 CD9, CD63 및 CD81 등 3가지 마커를 시계 또는 반시계 방향으로 순환시켜 최종적으로 결정한다 (종합적인 실험 계획으로, 도 23 참조).

'T'의 크기를 결정하기 위해, 삼중 팬 엑소좀 테트라스파닌 마커 (CD9, CD63 및 CD81)를 순차적으로 선택할 수 있는 면역 분리 및 면역 분석 프로토콜을 고안했다(도 17 및 도 21 참조). 첫 번째 표적 마커 A (예: CD9)를 기반으로 한 엑소좀을 분리하는 첫 번째 선택 단계에서 Neutral Release을 사용하였다. 분리 후, 용액 내 엑소좀 아집단 (예: CD9+ 엑소좀)을 두 번째 선택을 위한 샘플로 사용하였다. 두 번째 선택은 마커 B (예: CD63)에 특이적인 포획 항체가 내부 표면에 고정된 마이크로타이터 플레이트 웰 (microtiter plate well)에서 수행되었다. 여기서, 포획된 엑소좀은 두 개의 대상 마커 (예: CD9+CD63+)를 포함하며, 신호 생성 효소와 같은 추적자가 연결된 탐지 항체를 사용하여 마커 C (예: CD81)에 대한 분석을 수행하였다.

그런 다음, 팬 엑소좀 테트라스파닌 마커 중 처음 두 개에 대한 면역 분석을 통해 'D+T'의 크기를 정량화했다 (도 22 참조). 첫 번째 마커 (예: CD9)와 두 번째 마커 (예: CD63)는 마이크로타이터 플레이트 웰에서 각각 포획 항체와 탐지 항체에 의해 선택되었다. 이질성 변화 지표 R1은 'T'의 크기를 'D1+T'로 나눈 값으로 결정된다. 마찬가지로, 다른 지표 R2와 R3는 세 개의 마커를 시계 방향으로 순환하여 측정되었다 (도 20의 (A) 및 도 23 참조).

Neutral Release 기술을 사용하여 액상에서 엑소좀 아집단을 분리함으로써 온전하고 효율적으로 엑소좀을 회수하였다. 다만, 수동 자성 분리 과정은 11개의 복잡하고 노동 집약적인 단계가 포함되어 있어서 (도 24의 (A) 참조), 특히 임상 시험과 같이 대량의 샘플을 처리할 때에는 수율 및 후속 면역 분석에서 문제가 유발될 수 있다. 이러한 문제 해결을 위해, 자동 자성 분리 시스템을 도입했다. 여기서, Neutral Release 프로토콜을 총 6단계로 간소화했다 (도 24의 (B) 및 도 25 참조). 그럼에도 불구하고, 자동 분리 시스템의 성능은 아래 '분리 성능 비교' 절에서 제시된 것처럼 거의 동등한 성능을 발휘하였다.

'Neutral Release' 프로세스 자동화. Neutral Release 프로토콜에 기반하여 자동 자성 분리 시스템을 도입하였다 (도 25의 (A) 참조). 정확하고 일관된 엑소좀 분리를 위해 상업용 장비 (Nextractor NX-32N; Genolution; 서울, 한국)를 사용했다 (도 25의 (B) 및 도 26 참조). 이 장비는 최대 32개의 엑소좀 샘플을 처리하여, 각각의 아집단을 액상 상태로 분리할 수 있다. 전술한 바와 같이, 엑소좀 아집단은 두 번째 및 세 번째 마커를 선택하기 위한 후속 샌드위치 면역 분석에 사용되었다 (도 21 참조).

분리 성능 비교. 총 6단계로 구성된 Neutral Release 프로토콜을 사용하여 엑소좀의 자동 분리 성능을 테스트하고, 이를 11단계의 수동 분리와 비교했다. 이를 위해, 시그마 혈청에 PC-3 세포주의 엑소좀을 스파이킹 (spiking)하여 테스트 샘플 (10 μg PC-3 exosomes/mL Sigma serum)을 준비했다. 일반적으로 CD63+ 엑소좀 아집단을 분리하는 과정에서, 엑소좀 샘플은 자성 비드에 탈착 가능하게 부착된 항-CD63 항체와 반응한다 (도 25의 (A)의 IV 단계 참조). 그런 다음, 후속 엑소좀 결합률 분석을 위해 미결합된 엑소좀 샘플을 수집하였다. 수집된 일부를 원래 샘플과 함께 항-CD63 항체를 포획 및 탐지로 이용한 동종 샌드위치 면역 분석을 통해 동시에 분석했다. 각 실험은 각 분리 조건에서 다섯 번 반복되었다. 원래 샘플 대비 미결합 샘플에 대한 신호로부터 (도 27의 (A)의 막대 차트 참조) 결합된 엑소좀의 비율을 백분율로 변환하여 산출하였다 (점선으로 표시됨). 자동 분리 조건에서의 결합 부분 (94.3 ~ 95.2%)은 거의 수동 조건(93.2 ~ 95.3%)과 동일했다.

분리가 완료된 후, 액상으로 회수된 엑소좀 아집단은 CD9에 대한 포획 항체와 CD81에 대한 탐지 항체를 사용하는 다운스트림 면역 분석에 샘플로 사용하였다(도 27의 (B) 참조). 5번의 반복 실험 결과 평균값은 자동 분리가 상당히 적은 단계로 이루어짐에도 불구하고 수동 분리에 비해 엑소좀의 회수율에 영향을 미치지 않음을 보여준다.

이질성 변화 정량화. 엑소좀 이질성 변화 모델 (도 17 참조)을 검증하기 위해, 양성 전립선 상피 세포주인 RWPE-1에서 생산된 엑소좀을 사용하여 실험을 수행했다. 다양한 임상 표본을 모방하기 위해서, RWPE-1 엑소좀을 다양한 비율로 시그마 혈청 풀에 첨가하였다. 이 비율은 질병 진행의 여러 단계에서 수집된 대량 모집단 샘플을 대표한다. 도 20에 도시된 바와 같이, 마커 선택을 위한 'scheme'에 따라, 벌크 엑소좀 샘플을 1회 및 2회 분리하여 각각 엑소좀 아집단 및 그 하부집단을 제조했다. 다음, 미리 지정된 검출 마커를 표적으로 삼아 엑소좀의 각 개체군 크기인 'D+T' 및 'T'를 측정하여 정량화하였다 (도 28의 (A) 및 (B) 참조). 그 결과를 보면, 신호 레벨이 전반적으로 RWPE-1 엑소좀 용량에 비례하는 반응 패턴을 나타냈다.

'D+T'와 'T'의 하부집단의 크기를 나타내는 두 신호는 각각 도 23에 나타낸 바와 같이 이질성 변화 지표인 R1 ~ R3 및 R1c ~ R3c를 결정하기 위해 사용했다. 그 결과를 R 지표 및 Rc 지표의 역수를 사용하여 플로팅하였다 (도 28의 (C) 참조). 플롯은 동일한 스톱오버 사이트를 기반으로 한 한쌍의 2개 지표 (도 20의 (A) 참조), 예를 들어 1/R1과 1/R1c가 유사한 반응 수준과 패턴을 보이는 것으로 나타났다. 각 스톱오버 사이트에 따른 세 쌍의 지표는 반응 및 분포와 관련하여 상당히 다른 패턴을 보였다. 이는 이질성 변화가 스톱오버 사이트에 대해 의존적임을 나타내는 것이다.

엑소좀의 세포 기원 추적. 엑소좀 이질성 변화 기반 세포 기원을 추적하기 위해, 암 특성과 관련된 다양한 세포주에서 수집한 엑소좀 샘플을 분석하는 실험을 수행했다. 대조군으로서 정상 전립선 세포주 RWPE-1 외에 2개의 서로 다른 전립선 암 세포주인 LNCaP 및 PC3에서 엑소좀을 생산했다. 이러한 엑소좀을 다양한 희석 비율로 혈청에 첨가하여 벌크 엑소좀 샘플을 준비했다. 그 다음, 도 23에 표시된 실험설계에 따라 각 엑소좀 샘플에 대해 R1 ~ R3 및 R1c ~ R3c 등 총 6개의 지표를 산출했다.

각 세포주 엑소좀에 대해서, 1/R 지표 및 1/Rc 지표의 값을 쌍으로 엑소좀 농도에 따라 플로팅하였다 (도 29 참조). 서로 다른 세포주 간의 3쌍의 지표를 비교할 때, 세 번째 쌍인 1/R3 및 1/R3c은 농도 응답에서 명확한 차이를 나타냈다. RWPE-1 엑소좀 (도 29의 (A) 참조)에 비해 LNCaP 엑소좀에 대한 반응은 유의미하게 증가하였으며 (도 29의 (B) 참조), PC3 엑소좀에 대한 반응은 유의미하게 감소하였다 (도 29의 (C) 참조). 이는 스톱오버 사이트 3에서의 국소적 이질성 변화가 엑소좀 공급원에 따라 민감하게 변한다는 것을 나타낸다. 반면에, 서로 다른 세포주에 대한 첫 번째 및 두 번째 지표 쌍의 변화는 미미하였다. 전반적으로, 국소적 엑소좀 이질성 변화 지표는 암 특성과 관련하여 세포 기원을 명확하게 구별하며, 암 세포 추적을 위한 추가 임상 샘플 테스트에 대한 가능성을 제시하였다.

4-3. 임상적 적용: 암세포 추적

성능제어 요소. 이질성 변화 지표인 R 및 Rc가 건강인과 다양한 암 환자의 임상 샘플 그룹을 구별하는 데 유용한지 조사하였다. 특히 'T'에 접근할 때 시계 방향 (route 1) 또는 반시계 방향 (route 2)을 결정하는 경로 의존성 (route dependency)에 중점을 두고 각 scheme을 시험했다(도 20 참조). 두 가지 다른 샘플 그룹을 분류하는 데 있어서 2가지 경로의 성능을 테스트하고 비교했다. 건강인과 다양한 암 환자 (전립선 암, 악성 흑색종 또는 대장 암)의 24개 샘플 (각 그룹당 6개)을 전술한 프로토콜에 따라 분석하여 1/R 및 1/Rc 지표 값을 결정했다. 추가로, LNCaP 엑소좀을 표준 샘플로 사용하여 스케일링을 통해 실험 간의 변이를 보정했다.

각 경로에 대해, 3개의 이질성 지표 중 2개를 사용하여 각각 3개의 X-Y 그래프를 작성하였다. 각 그래프에서 83.3%의 특이도 (6개의 건강한 샘플 중 5개를 정확히 진단)를 나타내도록 각 축에 단일 컷오프 라인을 설정했다 (도 30의 (A) 및 (B) 참조). 이러한 조건 하에서, 각 이질성 지표에 대해 18개의 양성 샘플 (각 암 종류당 6개의 샘플)에 대한 분해능을 결정하였다. Route 1의 경우 좋은 분해능을 나타낸 순서로 1/R3 > 1/R1 = 1/R2 이고, route 2의 경우, 좋은 분해능을 나타낸 순서는 1/R3c > 1/R2c > 1/R1c 이며, 위음성 (false negative, FN) 비율은 route 1의 경우보다 route 2의 경우가 유의미하게 낮았다 (각 플롯에서 표시된 FN 값 참조). 각 route에 대한 결과에서 일관되게 지표 R3 또는 R3c가 최상의 분해능을 나타냈다. 이는 스톱오버 사이트로서 CD9+CD81+ 하부집단 내에서 CD63이 세 번째 마커로 측정되었을 때이다. 스톱오버 사이트에 대한 의존성을 확인하기 위해 각 경로에 따라 수집된 데이터를 추가로 재배열하여 스톱오버 사이트에 대한 지표의 분류 성능을 조사했다 (도 30의 (C) 참조). 예상한 바와 같이, CD63를 세 번째 마커로 하고, CD9+CD81+ 하부집단을 기반으로 하는 스톱오버 사이트 3에서 최고의 성능 (18개의 양성 샘플 중 1개의 FN만 표시됨)이 나타났다. 이러한 결과를 통해 성능을 제어하는 매개변수를 다음과 같이 결정할 수 있었다. 1) 세 번째 마커에 대한 접근 방향: route 2 > route 1, 및 2) 마커에 접근하는 입구로서의 스톱오버 사이트: 사이트 3 > 사이트 2 > 사이트 1. 여기서, 분해능은 암 종류에 상관없이 일관되었다.

스톱오버 사이트에 대한 성능 평가. 이질성 지표의 분류 성능을 평가하기 위해서, 전립선 암을 중심으로 한 단일 암 샘플을 사용하여 스톱오버 사이트의 역할을 확인했다. 임상 샘플 (건강인 및 전립선 암 환자 각각 12개의 혈청 샘플)을 테스트하고, 그 결과를 각 스톱오버 사이트에 대해 플로팅하였다 (도 31 참조). 각 스톱오버 사이트에 대해, 특이적인 포획 항체 및 탐지 항체를 순차적으로 반응시키는 샌드위치 면역 분석을 실시하여 이중 마커 영역, [D+T]를 정량화하고, 상기 항체 쌍을 역순으로 반응시켜 [D+T]c를 결정하였다. 이렇게 정량화된 값들을 그래프 상에 플로팅하였다 ('Doubles'; 도 31의 (A) 참조). 세 번째 마커에 대해서는 동일한 스톱오버 사이트 'D+T'를 통해 시계 방향 ([T]) 또는 반시계 방향 ([T]c)으로 접근하여 정량화하였다 ('Triples'; 도 31의 (B) 참조). 마지막으로, 이질성 지표를 상기에서 정량화한 값의 비율 ('[D+T]'/'T')로 산출하고, 위에서와 같이 LNCaP 엑소좀을 표준 샘플로 사용하여 스케일링한 후, 각 스톱오버 사이트 별로 1/R, _Scaled 및 1/Rc, _Scaled 지표 쌍에 대해 플로팅하였다 ('Doubles/Triples (1/R)'; 도 31의 (C) 참조).

도 31의 (A)의 'Doubles' 플롯을 살펴보면, 스톱오버 사이트에 관계없이 거의 선형으로 배열되는 샘플 분포를 나타내는데, 이는 'D+T'를 측정하는 기존 샌드위치 면역분석이 서로 다른 엑소좀 기원 세포를 구별하지 못한다는 것을 의미한다. 그러나 도 31의 (B)의 'Triples' 플롯은 3개의 스톱오버 사이트에 따라, 샘플별로 서로 다른 분포를 보이고 있다. 샘플은 스톱오버 사이트 1에 대해서는 선형적으로 분포되는 반면, 스톱오버 사이트 2 및 3에 대해서는 상대적으로 대각선을 기준으로 위쪽 또는 아래쪽으로 분산되어 있다.

또한, 각각의 임상 샘플에 대해 LNCaP 엑소좀 샘플을 기준으로 스케일링된 엑소좀 이질성 변화 지표 1/R 및 1/Rc를 산출하고 해당 스톱오버 사이트에 대해 그 지표들 (예: 1/R1, _Scaled 대비 1/R1c, _Scaled)을 플로팅하였다 (도 31의 (C) 참조). 그 결과, 사용된 스톱오버 사이트에 관계없이 대부분의 정상 샘플 (12개 샘플 중 9 ~ 10개)이 클러스터를 형성하였으며, 암 샘플은 정상 클러스터에서 떨어져 있거나 주변에 분포하여 100%의 민감도를 나타냈다. 정상 샘플 클러스터에 대한 암 샘플의 분포 방향은 스톱오버 사이트에 따라 고유하게 서로 다른 분류 패턴을 나타냈다.

샘플 분류 주요 요인. 선형 관계에 있는 하부집단 [D+T] 대 [D+T]c 플롯은 샘플 그룹을 분류하기에 적합하지 않고, 이는 하부집단 마커 농도만으로 충분히 샘플 그룹을 분류할 수 없다는 것을 시사한다 (도 32의 (A) 참조). 반면에, 이중 마커 양성 하부집단 'D+T'에 대한 세 번째 마커 양성 하부집단 'T'의 비율은 샘플 분류에 중요한 요소가 될 수 있다 (도 32의 (B) 참조). 이는 질병 발병에 따라 세 번째 마커의 비율이 변할 수 있다는 것을, 즉 국소적 이질성 변화가 다를 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 세 번째 마커를 포함하는 하부집단 자체가 질병 바이오마커로 작용할 수 있음을 알 수 있다.

4-4. 특정 암 검출에 대한 개념 확장

추가적인 하부집단 마커. 다양한 암을 감지하기 위한 최적의 단일 지표는 도 30 및 도 31에서 알 수 있듯이 1/R3c로 보인다. 그러나 샘플이 양성으로 측정될 때 실제로 발생한 특정 암을 찾는 데 문제가 될 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 전립선 암과 같은 단일 암을 나타낼 수 있는 추가적인 하부집단 마커를 탐색했다. 다양한 엑소좀 마커들은 암 샘플과 건강인 샘플을 구별할 수 있는 가능성을 가지고 있다.

예비 실험에서, CD151, CD82, Tetraspanin 8 (TSPAN8), CD147 및 EpCAM과 같은 여러 마커들을 검토했다. 이 후보들 중에서 면역분석을 통해 'D+T' 영역에서 감지 가능한 세 번째 마커로서, CD151 및 TSPAN8이 적합한 것으로 나타났다 (도 33 참조).

세 번째 마커로서 CD81에 대한 국소적 이질성 변화 플롯에서, 컷오프 라인이 특징적인 패턴을 나타냈는데, 이 패턴은 암 샘플의 국소적 변화가 정상 샘플에 비해 X 및 Y 축 모두에서 증가하거나 감소한다 (도 33의 (A) 참조). 이러한 이질성 변화의 특징적인 패턴으로 인해, 정상 샘플들은 제한된 영역에 뚜렷한 클러스터를 형성했고, 전립선 암 샘플들은 그 클러스터 경계 외부에 분산되어 분포했다. 결과적으로, 두 개의 샘플 그룹을 구별하기 위해 그래프에 이중 교차 컷오프 라인을 설정하였다. 반면에, 다른 두 마커인 CD151 및 TSPAN8의 국소적 변화 플롯에서는 각 그래프에서 서로 다른 그룹의 샘플이 대각선 형태로 분포되었다 (도 33의 (B) 및 (C) 참조). 이러한 경우에는 일반적으로 관찰되는 것처럼 두 샘플 그룹은 단일 교차 컷오프 라인으로 분리된다. 이질성 변화에 있어 이러한 변화는 지정된 각 하부집단을 기반으로 한 세 번째 마커의 국소적 조성이 고유하게 다를 수 있으며, 이는 질병 발생 또는 진행에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.

CD81은 국소적 이질성 변화를 측정하는 데 사용된 표적 마커로서, 엑소좀의 표면에 존재한다. 종양 미세환경에서의 CD81+ 엑소좀의 존재는 종양 성장, 혈관 신생 및 침습과 같은 암 진행의 여러 측면과 관련되어 있으며, 암 세포와 주변 기질 세포 간의 소통을 중재한다. 테트라스라닌 (tetraspanin) 계열의 막 단백질 (transmembrane protein)인 CD151 및 TSPAN8는 엑소좀의 구성 요소로서, 암 개시 세포 (cancer-initiating cell)와 주변 환경 간의 상호작용을 촉진시킨다. CD151은 암 진행 및 전이에서의 잠재적인 역할을 하는 것으로 주목받고 있다. TSPAN8 또한 대조군 샘플에 비해 전립선 암에서 풍부하게 발현되는 것으로 보고되고 있다. 암 관련한 각 마커의 역할은 그 마커의 국소적 이질성 변화를 기반으로 하는 본 발명에 따른 분석 결과에 의해 추가로 뒷받침될 수 있다.

예비 실험 결과, 세 번째 마커로서 CD151은 스톱오버 사이트 1에서 CD81만큼 우수한 성능을 나타낼 뿐만 아니라 CD81보다 간단한 분류 패턴을 제공한다 (도 33의 (A)와 (B) 비교). 동일 조건하에서 서로 다른 임상 샘플에 대해 3개의 스톱오버 사이트 각각에서 CD151을 표적으로 하는 동일한 테스트를 수행하였다 (비교를 위해 스케일링 적용하지 않음; 도 34의 (A) 참조). 건강인과 전립선 암 환자의 두 그룹 샘플 (각 그룹 12개 샘플)은 스톱오버 사이트 1을 사용할 때 만족스럽게 구별되어 87.5%의 분해능을 나타냈다 (컷오프 라인을 기준으로 24개 샘플 중 21개를 구별함). 그러나 스톱오버 사이트 2 및 3은 CD151을 검출하기 위해 사용되는 면역 분석에서 극히 낮은 신호 때문에 의도한 목적으로 활용하기 어려웠다 (도 34의 (B)에서 광학 밀도 (OD; optical density)가 0.1 미만인 원래 데이터 (raw data) 참조). 참고로, OD <0.1 의 낮은 신호로 인해 LNCaP 표준 신호에 변동이 심하게 발생했기 때문에, CD151 이질성 변화를 결정할 때 LNCaP 기반 스케일링을 적용하지 않았다 (도 35 참조).

전임상 실험. 건강인 샘플 및 전립선 암 샘플 (각각 18개 샘플) 그룹을 사용하여, 스톱오버 사이트 1에서 세 번째 마커로서 CD151에 대한 전임상 실험을 수행했다. 샘플들은 동일한 조건하에 분리되고 분석되었다. 예비 실험에서 얻은 것과 동일한 컷오프 라인을 기준으로 플로팅하고 분해능을 평가하였다 (도 36의 (A) 및 도 37의 (A) 참조). 여기서, 총 36개 샘플 중 31개를 구별하는 86.1%의 분해능를 나타냈는데, 이는 미리 지정된 스톱오버 사이트에서 세 번째 마커인 CD151의 성능을 일관되게 보여주는 것이다.

다양한 암 세포에 대한 세 번째 마커로서 CD151의 추적 능력을 평가하기 위해, 악성 흑색종 및 대장암 환자로부터 제공된 2개 암 샘플 그룹 (각각 12개의 샘플)을 추가로 취득했다. 추가적인 암 샘플에 대해 측정된 1/R 및 1/Rc 지표 값을 전립선 암 데이터와 함께 플로팅하였다 (도 36의 (B) 및 도37의 (A)도 참조). 여기서, 두 가지 추가적인 암 그룹이 모두 정상 그룹과 동일한 영역에 분포되므로, 전립선 암 샘플과 구별할 수 있음을 나타낸다. 악성 흑색종과 전립선 암 사이의 분해능은 90% (30개 샘플 중 27개 구별)이었으며, 대장암과 전립선 암 사이의 분해능은 83.3% (30개 샘플 중 25개 구별)이었다. 두 지표를 결합한 매개 변수, 즉 '1/R + 1/R1c' 에 대한 다른 샘플 그룹의 데이터를 동시에 비교함으로써, 특정한 방식으로 전립선 암이 감지되었음을 확인하였다 (도 36의 (C) 및 도 37의 (A) 참조). Receiver operating characteristic curve 분석 결과, 곡선 아래 면적 (AUC)이 0.880로 나타나, 전립선 암 샘플을 정상인 샘플은 물론 다른 암 샘플로부터 강력하게 식별할 수 있음을 알 수 있다 (도 38 참조).

5. 논의

본 발명은 스톱오버 사이트 (특정 이중 마커를 공통으로 가지는 엑소좀 차아집단 영역)라는 개념을 사용하여 특정 엑소좀 하부집단 내에서 세 번째 마커의 국소 이질성 변화를 측정하는 새로운 접근 방식을 제안한다. 이러한 접근 방식은 액체생검을 위한 대안적인 알고리즘을 제공한다 (도 32 참조). 도 31의 (C)에 나타난 바와 같이, 정상 그룹 샘플 내의 이질성 변화는 암 그룹 내의 이질성 변화보다 현저하게 적다. 이는 건강인 샘플에서 엑소좀 조성이 안정적임을 나타낸다. 반면에 암 그룹에서 관찰되는 높은 이질성은 암 세포로부터의 새로운 엑소좀의 생성이나 활성 면역 반응을 반영한다.

국소 엑소좀 이질성 변화에 기반한 진단 접근법은 표적 마커의 농도를 중심으로 하는 종래 방법과 차이가 있다. 종래 방법에 따르면, 벌크 엑소좀 내에서 실질적인 이질성 변화로 인해 표적 마커 농도가 크게 달라질 수 있다. 엑소좀을 차아집단 수준으로 순차적으로 분리하면, 이러한 변화를 완화할 수 있으며, 이는 암 진단을 위한 바이오마커를 발견하는 실용적인 방법으로 활용될 수 있다. 분리 마커로 사용되는 테트라스파닌 (tetraspanin)은 인간 혈청 및 혈장에서 엑소좀 아집단을 구별하는 역할을 한다. 따라서 테트라스파닌 마커 기반 분리를 통해 엑소좀의 이질성을 제어하는 것은 조기 암 검출을 위한 바이오마커로서 엑소좀을 활용하는 데 필수적이다.

CD9, CD63 및 CD81 등과 같이 팬 엑소좀 테트라스파닌으로 정의되는 스톱오버 사이트는 돌연변이 검출의 진입로 역할을 한다. 하부집단 수준에서 이러한 마커들의 다양한 조합은 종양 성장, 혈관 신생 및 침습에 영향을 주는 것으로 일반적으로 알려져 있지만, 암 종류에 따라 변화될 수 있다. 국소적 이질성 변화 측면에서 스톱오버 사이트의 역할을 정의하기에 다소 복잡한 측면이 있음에도 불구하고, 본 발명을 통해 스톱오버 사이트는 암 특이적인 패턴을 식별할 수 있는 고유한 특성이 밝혀졌다 (도 37 및 도 39 참조).

본 발명에 따른 스톱오버 사이트의 주요 특성 및 이를 이용한 진단 성능은 아래와 같다. 첫째, 스톱오버 사이트 2 (CD63+CD81+)에서 CD9를 세 번째 마커로 사용하여 두 1/R2 및 1/R2c 지표의 비율에 기반한 컷오프 매개 변수를 사용하면 전립선 암과 대장암을 정상 샘플과 구별하는 데 우수한 성능을 나타내는데, 그 분해능이 93.3%에 달한다 (30개 샘플 중 28개; 도 37의 (B) 참조). 다만, 이 방법은 악성 흑색종 샘플을 정상 샘플과 구별하지 못했다. 스톱오버 사이트 3 (CD9+CD81+)에서는 단일 지표인 1/R3c를 사용하여 전립선과 악성 흑색종 샘플을 정상 샘플과 구별할 수 있었고, 이때 분해능은 93.3%였다 (30개 샘플 중 28개; 도 37의 (C) 참조). 그러나 대장암을 선택적으로 감지할 수 없었다. 따라서 상기 두 스톱오버 사이트에서의 결과를 상호 확인함으로써 개별 지점의 선택성 부족을 보완할 수 있다.

스톱오버 사이트 1 (CD9+CD63+)에서, 팬 엑소좀 테트라스파닌들만으로는 샘플 분포의 방향이 매우 다양하기 때문에 암 샘플을 선택적으로 검출하는 데 부족했다 (도 30의 (C) 참조). 그러나 특정 다른 암 마커들은 특정한 암 검출에 대한 가능성을 보여주었다. 특히, CD151은 전립선 암 샘플을 대장암, 악성 흑색종 및 건강인 샘플들과 구별할 수 있는 유효한 세 번째 마커로 평가된다 (도 37의 (A) 참조). 플롯의 각 축을 따라 2개의 지표를 결합하고, 이를 단일 컷오프 매개 변수로 사용함으로써 전립선 암에 대한 분해능을 88.3% (60개 샘플 중 53개)까지 달성하였다.

테트라스파닌 계열의 CD151은 전립선 암을 포함한 다양한 암과 관련이 있다. CD151 발현은 정상 전립선 조직에 비해 전립선 암 세포에서 상승한다. CD151 레벨의 상승은 보다 공격적인 형태의 전립선 암 및 가혹한 임상 결과와 관련이 있다. 초기에는 전립선 암의 공격성과 전이 가능성에 대한 바이오마커로 간주되었으나, 최근 연구에서는 CD151이 전립선 암 진행의 억제 인자로 작용할 수 있음을 시사하고 있다. 이러한 불일치의 여러 요인 중 하나로 CD151 하부집단 및 그들의 기능에 대한 의존성을 들 수 있다. 이러한 가설은 CD9+CD63+ 하부집단 내에서 세 번째 마커로서 CD151이 전립선 암을 다른 암과 선택적으로 구별하는 이유를 설명한다 (도 37의 (A) 참조). 또한, CD151과 같은 마커가 특정 하부집단 상호 작용에 따라 다양한 암 유형에서 종양 성장과 침습에 다르게 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

위의 가설을 뒷받침하기 위해, 스톱오버 사이트 1, 즉 CD9+CD63+ 하부집단에서 CD151 증감이 전립선 조직 특이적 그리고 암 발생 관련 여부 테스트를 진행했다. 본 실험에서 매개 변수 1/R1 및 1/R1c로 측정된 스톱오버 사이트 1의 CD151 이질성 변화, 특히 1/R1c가 정상 전립선 조직 유래 세포주 (RWPE-1)에서 추출한 엑소좀의 농도에 비례하여 증가한다는 사실을 발견했다 (도 40의 (A) 참조). 더욱이, 전립선 암 세포주 (LNCaP)의 엑소좀을 샘플로 사용할 때 그 이질성 변화가 상당히 증폭되었다. LNCaP은 림프절 전이성 병변에서 유래한 인간 전립선 암 세포주로서, 돌연변이 된 안드로겐 수용체 (androgen receptor)를 발현하는데, 이는 전립선 조직 특성이 유지된다는 것을 나타낸다. 반면, 골 전이로부터 유래한 인간 전립선 암 세포주인 PC3의 엑소좀에서 측정할 때에 이러한 증가 반응은 전혀 나타나지 않았다. LNCaP와는 달리, PC3 세포는 안드로겐 수용체나 전립선 특이 항원 (PSA)을 발현하지 않으므로, 전형적인 전립선 조직 특성이 상실되었음을 나타낸다. 이러한 결과들은 특히 1/R1c 지표가 전립선 조직으로부터 유래한 엑소좀에 강하게 반응하며, 해당 조직 내에서의 암 발생에 대해서는 훨씬 더 반응한다는 것을 나타낸다. 그러나 다른 조직에서 전이가 발생할 경우 이러한 반응은 완전히 사라질 수 있다.

그 다음으로, 암 발생 유무에 관계없이 전립선 이외의 신장 및 대장 등의 조직으로부터 유래한 엑소좀에 대한 1/R1 지표의 반응을 테스트했다. 배아 신장 (HEK293) 및 암화된 대장 (HT29)과 같은 조직의 엑소좀에 대한 반응은 용량에 반비례하는 것으로 나타났다 (도 40의 (B) 참조). HT29은 대장암 환자에서 유래한 인간 대장 선암종 세포주이다. 그러나 HCT116의 엑소좀에서는 어느 정도 농도에 비례하여 증가하는 반응이 관찰되었지만, 농도응답 패턴은 RWPE-1 만큼 일관되지 않았다. HCT116은 높은 종양 발생 가능성으로 인해 일반적으로 공격성 대장암 모델로 사용되는 인간 대장암 세포주이다.

전립선 암과 CD9 및 CD63 양성 엑소좀 하부집단 간의 관련성을 광범위하게 조사하였다. CD9 및 CD63는 엑소좀 표면에 발견되는 테트라스파닌으로, 각각 전립선 암 생물학의 독특한 측면과 관련이 있다. CD9 및 CD63양성 엑소좀은 건강인에 비해 전립선 암 환자의 순환계 또는 체액에서 증가하는데, 이는 암 진행과 전이에 관여함을 시사한다. CD9+CD63+ 엑소좀과 CD151 간의 상호 작용에 대한 직접적인 보고는 없지만, 이러한 마커들의 개별 역할을 이해함으로써 그들의 잠재적 상호 작용과 질병 진행에 대한 포괄적인 영향을 밝힐 수 있을 것으로 기대된다.

특정 엑소좀 차아집단 내에서 세 번째 마커의 조성을 측정함으로써, 국소적 엑소좀 이질성 변화에 초점을 맞춘 혁신적인 암 진단 알고리즘을 도입할 수 있다. 팬 엑소좀 테트라스파닌 CD9, CD63 및 CD81은 순차적 분리에 사용되어, 그 안에 있는 고유 표적 마커를 정량화하기 위한 기초를 형성한다. 하부집단 수준에서 이들 3가지 마커의 다양한 조합은 종양 성장, 혈관 신생 및 침습과의 공통 연관성에도 불구하고, 암에 대한 서로 다른 선택성을 나타낸다 (도 39 참조). 예를 들어, CD81이 포함된 스톱오버 사이트는 돌연변이 검출을 위한 진입점으로 작용할 수 있으며, 세 번째 마커는 조직 유형이나 면역 반응 메커니즘을 나타낼 수 있다 (도 37의 (B) 및 (C) 참조). 결과적으로, 엑소좀 스톱오버 사이트, 즉 특정 엑소좀 하부집단은 바이오마커로 사용될 수 있다.

6. 결론

본 발명은 혈청과 같은 체액 샘플에서 엑소좀 표면 단백질 마커에 중점을 두고 하부집단 수준에서 국소 이질성 변화를 모니터링하는 새롭고 재현 가능한 암 감지 방법을 제공한다. 본 발명은 정상 상태와 비교할 때에, 암화로 인한 것과 같은 세포변성 효과 (cytopathic effect)가 엑소좀 조성에 변화를 가져온다는 점에 기반한다. 이러한 변화는 특정 엑소좀 차아집단 내의 세 번째 마커에서 파생된 지표를 사용하여 정량화할 수 있다. 본 발명은 CD9, CD63 및 CD81과 같은 팬 엑소좀 테트라스파닌의 조합으로 정의된 "스톱오버 사이트"를 사용하며, 이는 돌연변이 패턴을 분석하고 암 특이적인 마커를 식별하는 진입점으로 작용한다. 특정한 테트라스파닌 조합은 서로 다른 종양에 대해 다양한 수준의 선택성을 제공하므로, 본 발명에 따른 진단 방법은 매우 유용하게 활용될 수 있다. 이 방법은 하부집단별 이질성에 중점을 둔 접근 방식으로, 종래 액체생검 기술에 대한 혁신적인 대안이 될 수 있고, 조기 암 검진에 크게 활용될 수 있다. 본 발명은 특정 표적 암과 조직에 중점을 두어 암 진단의 정확도를 향상시키는데 활용될 수 있다. 초기에는 전립선 암에 중점을 두었지만, 본 발명은 다양한 종류의 암에 대해 광범위하게 적용될 수 있다. 이러한 혁신적인 모델은 다양한 암 유형에 대한 다목적 진단 기술을 제공하는 동시에 이질성의 복잡성을 효과적으로 해결하여 조기 암 진단에 대한 패러다임 전환을 가져올 것이다.

이상 본 발명을 구체적인 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속한 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

본 발명은 엑소좀 모집단으로부터 분리 마커에 대한 엑소좀 아집단, 차아집단 또는 그 이하의 하부집단을 고수율 및 원래의 상태로 분리 및 회수하여 액체생검 샘플을 제조하고, 액체생검 샘플을 분리 마커 외 다른 2가지 표면 마커를 포획 및 탐지 마커로 이용하여 동일 삼중 마커를 탑재한 엑소좀을 분석하는 액체생검 방법으로 산업상 이용가능성이 인정된다.

Claims

(a) 인간 체내의 다수 세포로부터 각각 분비된 이종의 엑소좀을 함유하는 엑소좀 모집단 샘플로부터, 제1 표면 마커를 공통으로 가지는 제1 타겟 엑소좀을 하위집단으로 분리하고 회수하여, 엑소좀 하부집단을 포함하는 엑소좀 액체생검 샘플을 준비하는 단계;

(b) 상기 엑소좀 하부집단에 속하고 제2 표면 마커를 공통으로 가지는 제2 타겟 엑소좀의 제3 표면 마커에 대한 정량적 신호를 측정하여, 삼중 마커 신호를 획득하는 단계;

(c) 상기 제1 타겟 엑소좀의 제2 표면 마커에 대한 정량적 신호를 측정하여 획득한 이중 마커 신호와 상기 삼중 마커 신호의 측정값 비율로써 국소적 엑소좀 이질성 지표를 산출하는 단계; 및

(d) 산출된 상기 엑소좀 이질성 지표를 기반으로, 상기 엑소좀 액체생검 샘플을 분석하는 단계;를 포함하는 액체생검.
청구항 1에 있어서,

정상인군 및 특정 질환의 환자군 각각의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 순차적으로 수행하여, 상기 정상인군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표, 및 상기 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 각각 산출하고,

상기 (d) 단계에서, 각각 산출된 상기 정상인군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표와 상기 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 대비하여, 상기 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커를 선별하는 액체생검.
청구항 2에 있어서,

질환 검진 대상자의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 바이오마커의 선별에 수행된 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 반복 수행하여 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 산출하고,

상기 (d) 단계에서, 산출된 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표와 상기 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 대비하여, 상기 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성하는 액체생검.
청구항 1에 있어서,

상기 엑소좀 모집단 샘플 내 상기 이종의 엑소좀이 가지는 3개의 표면 마커 중, 어느 하나를 상기 제1 표면 마커로 선택하고, 다른 하나를 상기 제2 표면 마커로 선택하며, 나머지 하나를 상기 제3 표면 마커로 선택하는 총 6개의 선택 경로 중에 적어도 하나 이상을 선택하고, 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 순차적으로 반복 수행하여,

N (N은 1 이상이고 6 이하인 자연수)개의 상기 엑소좀 이질성 지표를 산출하는 액체생검.
청구항 4에 있어서,

정상인군 및 특정 질환의 환자군 각각의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표, 및 상기 환자군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표를 각각 산출하고,

상기 (d) 단계에서, 각각 산출된 상기 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표와 상기 환자군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표를 기반으로, 상기 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커의 선택 경로를 선별하는 액체생검.
청구항 5에 있어서,

상기 (d) 단계에서, 상기 정상인군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표, 및 상기 환자군에 대한 N 개의 상기 엑소좀 이질성 지표에 대한 사칙연산 또는 함수화를 통해 신규 지표를 각각 생성하고, 생성된 상기 신규 지표를 기반으로, 상기 환자군의 특정 질환과 관련된 바이오마커의 선택 경로를 선별하는 액체생검.
청구항 5에 있어서,

질환 검진 대상자의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 반복 수행하여 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 산출하고,

상기 (d) 단계에서, 산출된 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표와 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 산출된 상기 환자군에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 대비하여, 상기 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성하는 액체생검.
청구항 6에 있어서,

질환 검진 대상자의 상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로, 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 상기 (a) 단계부터 상기 (c) 단계를 반복 수행하여 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 엑소좀 이질성 지표를 산출하고,

상기 (d) 단계에서, 산출된 상기 질환 검진 대상자에 대한 상기 신규 지표와 상기 바이오마커의 선택 경로 선별에 수행된 선택 경로에 따라 산출된 상기 환자군에 대한 상기 신규 지표를 대비하여, 상기 질환 검진 대상자에 대한 질환 검진 정보를 생성하는 액체생검.
청구항 1에 있어서,

상기 (a) 단계는,

상기 제1 표면 마커와 특이적으로 결합하는 제1 특이결합소재를, 제1 가역적 링커를 이용해, 고상 (solid state)의 고정 부재에 결합시키는 단계;

상기 엑소좀 모집단 샘플과, 상기 고정 부재에 결합된 상기 제1 특이결합소재를 반응시켜, 다수의 상기 제1 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 상기 제1 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 아집단을 분리하는 단계; 및

포획된 상기 제1 타겟 엑소좀이 상기 고정 부재에서 분리되도록, 상기 제1 가역적 링커를 해리시켜, 상기 엑소좀 아집단을 회수하는 단계;를 포함하는 액체생검.
청구항 9에 있어서,

상기 엑소좀 아집단을 분리하는 단계, 및 상기 엑소좀 아집단을 회수하는 단계 사이에,

자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 제1 타겟 엑소좀이 포획된 상기 고정 부재를 농축하는 단계;를 더 포함하는 액체생검.
청구항 9에 있어서,

상기 (a) 단계는,

상기 엑소좀 아집단 내의 상기 제2 타겟 엑소좀이 가지는 상기 제2 표면 마커와 특이적으로 결합하는 제2 특이결합소재를, 상기 고정 부재에 결합시키는 단계; 및

회수된 상기 엑소좀 아집단을 함유하는 엑소좀 아집단 샘플과, 상기 고정 부재에 결합된 상기 제2 특이결합소재를 반응시켜, 다수의 상기 제2 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 상기 제2 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 차아집단을 분리하는 단계;를 포함하는 액체생검.
청구항 11에 있어서,

상기 제2 특이결합소재를 상기 고정 부재에 결합시키는 단계에서, 상기 제2 특이결합소재가 제2 가역적 링커에 의해 상기 고정 부재에 결합되고,

포획된 상기 제2 타겟 엑소좀이 상기 고정 부재에서 분리되도록, 상기 제2 가역적 링커를 해리시켜, 상기 엑소좀 차아집단을 회수하는 단계;를 더 포함하는 액체생검.
청구항 12에 있어서,

상기 엑소좀 차아집단을 분리하는 단계, 및 상기 엑소좀 차아집단을 회수하는 단계 사이에,

자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 제2 타겟 엑소좀이 포획된 상기 고정 부재를 농축하는 단계;를 더 포함하는 액체생검.
청구항 1에 있어서,

상기 이중 마커 신호는,

상기 엑소좀 모집단 샘플을 대상으로 측정되는 액체생검.