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WO2024253228A1 - 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2024253228A1
WO2024253228A1 PCT/KR2023/007920 KR2023007920W WO2024253228A1 WO 2024253228 A1 WO2024253228 A1 WO 2024253228A1 KR 2023007920 W KR2023007920 W KR 2023007920W WO 2024253228 A1 WO2024253228 A1 WO 2024253228A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
muscle
pharmaceutical composition
anion
cachexia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2023/007920
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
배철민
윤민혁
조영준
조혜미
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MetafinesCoLtd
Original Assignee
MetafinesCoLtd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MetafinesCoLtd filed Critical MetafinesCoLtd
Priority to PCT/KR2023/007920 priority Critical patent/WO2024253228A1/ko
Publication of WO2024253228A1 publication Critical patent/WO2024253228A1/ko
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Pending legal-status Critical Current

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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/16—Inorganic salts, minerals or trace elements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
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    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/375—Ascorbic acid, i.e. vitamin C; Salts thereof
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    • A61K33/06—Aluminium, calcium or magnesium; Compounds thereof, e.g. clay
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cachexia and muscle loss, which comprises a calcium-based ionic compound as an active ingredient, and a food composition comprising the active ingredient.
  • Cachexia is a complex syndrome caused by diseases such as cancer, tuberculosis, diabetes, AIDS, chronic obstructive pulmonary disease, multiple sclerosis, congestive heart failure, hemophilia, hypopituitarism, or liver cirrhosis. Cachexia is not curable or has a low rate of recovery with nutritional supplementation alone, and causes loss of appetite or persistent muscle wasting, leading to debility or death.
  • cachexia The prevalence of cachexia is approximately 10% in patients with heart failure, but more than 50% in cancer patients. About 70% of patients with gastrointestinal cancer show cachexia symptoms, and more than 80% of patients with terminal cancer, regardless of the type of cancer, are known to show cachexia symptoms.
  • Treatment methods for cancer are divided into surgery, radiotherapy, and chemotherapy. In the terminal stage, when invasive treatment becomes difficult, radiotherapy or chemotherapy is applied, which lowers the patient's nutritional status and immune function, causing cachexia to develop or worsen at an increased rate.
  • the mortality rate of cachexia in chronic obstructive pulmonary disease patients is approximately 20%, and that of heart failure patients is approximately 30%, whereas the mortality rate of cachexia in cancer patients is up to 80%. Therefore, the importance of treating cachexia is as much as that of the underlying disease.
  • the present invention takes into account the occurrence and aggravation mechanisms of muscle loss, which is a major symptom of cachexia, and, taking into account that cachexia is a multifactorial disease, aims to provide an effective ingredient that acts in a multimodal manner and a composition containing the same for preventing or treating cachexia and muscle loss.
  • the present invention aims to provide a food composition containing the effective ingredient.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cachexia and muscle loss, comprising an ionic compound, wherein the ionic compound comprises a calcium cation, a first anion, and a second anion, wherein the first anion and the second anion are different from each other and are each independently an anion of ascorbic acid, dichloroacetic acid, a branched-chain amino acid, or a derivative thereof.
  • the branched-chain amino acid may be at least one selected from the group consisting of Leucine, Isoleucine, and Valine.
  • the above pharmaceutical composition may be administered at a dosage of 20 to 4800 mg/kg/day of the ionic compound.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable aqueous solvent, and the degree of dissociation of the ionic compound may be from 1 to 50%.
  • the pharmaceutical composition may further comprise one or more active agents selected from the group consisting of appetite stimulants, anticancer agents, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antifungal agents, antiviral agents, immunomodulators, steroidal agents, anticoagulants, anticonvulsants, antidepressants, antioxidants and vitamins.
  • active agents selected from the group consisting of appetite stimulants, anticancer agents, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antifungal agents, antiviral agents, immunomodulators, steroidal agents, anticoagulants, anticonvulsants, antidepressants, antioxidants and vitamins.
  • the above pharmaceutical composition may further comprise one or more selected from pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as a solution, powder, oral preparation, injection, infusion, aerosol, tablet, capsule, pill, depot or suppository.
  • the above pharmaceutical composition can be administered orally, intravenously, subcutaneously, intramuscularly or mucosally.
  • the above cachexia and muscle wasting may be caused by cancer, tuberculosis, diabetes, AIDS, chronic obstructive pulmonary disease, multiple sclerosis, congestive heart failure, hemophilia, hypopituitarism, or cirrhosis.
  • the above cancer may be selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, colon cancer, stomach cancer, liver cancer, brain cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone marrow cancer, lymphoma, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, kidney cancer and melanoma.
  • the above muscle loss may be caused by sarcopenia, atony, muscular atrophy, muscular dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, or myasthenia gravis.
  • Another aspect of the present invention provides a food composition
  • a food composition comprising an ionic compound, wherein the ionic compound comprises a calcium cation, a first anion, and a second anion, wherein the first anion and the second anion are different from each other and are each independently an anion of ascorbic acid, dichloroacetic acid, a branched-chain amino acid, or a derivative thereof.
  • the above food composition may be a health functional food.
  • composition according to the present invention provides a multimodal effect of preventing, improving or treating cachexia and muscle loss by simultaneously suppressing (1) catabolism by energy metabolism, (2) disruption of muscle homeostasis, and (3) muscle loss by inflammatory factors.
  • the composition can suppress appetite reduction in a subject of administration, maintain or increase body weight, reduce body weight change, reduce or increase muscle loss, and improve muscle function according to the multimodal method.
  • Figure 1 shows the results of a cytotoxicity test on C2C12 cells before differentiation of (a) the calcium salt of Manufacturing Example 1, (b) the calcium salt of Manufacturing Example 2, and (c) the calcium salt of Manufacturing Example 3.
  • Figure 2 shows the results of a cytotoxicity experiment on C2C12 cells after differentiation of (a) the calcium salt of Manufacturing Example 1, (b) the calcium salt of Manufacturing Example 2, and (c) the calcium salt of Manufacturing Example 3.
  • Figure 3(a) is a crystal violet staining image of the myotubes of the normal control group (UCM), (b) is a cancer cell culture medium-treated group (CCM), and (c) is the result of measuring the myotube diameters of (a) and (b) using Image J.
  • Figure 4 shows the Western blot results of markers associated with muscle degradation and differentiation in the normal control group (UCM) and cancer cell culture medium-treated group (CCM).
  • Figure 5 is a graph showing the relative expression levels of (a) MuRF-1, (b) Atrogin-1, (c) MyHC, and (d) Myogenin from the Western blot results of Figure 4.
  • Figure 6 is a graph showing (a) the Western blot results and (b) the relative expression level of the target marker PDK-4 according to the calcium salt treatment concentration of Manufacturing Example 1.
  • Figure 7 is a graph showing (a) the Western blot results and (b) the relative expression level of the target marker Calpain 3 according to the calcium salt treatment concentration of Manufacturing Example 1.
  • Figure 8 shows the Western blot results of the target marker according to the concentration of calcium salt treatment in Manufacturing Example 2.
  • Figure 9 is a graph showing the relative expression levels of target markers (a) Calpain 3, (b) PDK-4, and (c) GDF-15 from the Western blot results of Figure 8.
  • Figure 10 shows the Western blot results of the target marker according to the concentration of calcium salt treatment in Manufacturing Example 3.
  • Figure 11 is a graph showing the relative expression levels of target markers (a) Calpain 3, (b) PDK-4, and (c) GDF-15 from the Western blot results of Figure 10.
  • Figure 12 is a graph showing (a) the Western blot result and (b) the relative expression level of the target marker PDK-4 when the myotube cells were treated with cancer cell culture medium (CCM), (c) the Western blot result and (d) the relative expression level of the target marker Calpain 3, and (e) the Western blot result and (f) the relative expression level of the target marker GDF-15.
  • CCM cancer cell culture medium
  • Figure 13(a) is a crystal violet staining image of the C2C12 cell line of the normal control group (UCM),
  • (b) is an image of the group treated with WY-14643, a PDK-4 activator, and
  • (c) is the result of measuring the myotube diameters of (a) and (b) using Image J.
  • Figure 14 is a graph showing (a) the Western blot results and (b) the relative expression levels of target markers (PDK-4, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin) in the normal control group (UCM) and WY-14643 treatment group used in Figure 13.
  • target markers PDK-4, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin
  • Figure 15(a) is a crystal violet staining image of C2C12 cell line as a normal control group (UCM)
  • UCM normal control group
  • (b) is an image of the group transfected with scrambled siRNA as a vehicle control group
  • (c) is an image of the group transfected with Calpain 3 siRNA
  • (d) is the result of measuring the myotube diameters of (a) to (c) using Image J.
  • Figure 16 is a graph showing (a) Western blot results and (b) relative expression levels of target markers (Calpain 3, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin) in the normal control group (UCM), vehicle control group (scrambled siRNA), and Calpain 3 siRNA treatment group used in Figure 15.
  • target markers Calpain 3, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin
  • UCM normal control group
  • vehicle control group scrmbled siRNA
  • Figure 17(a) is a crystal violet staining image of C2C12 cell lines of a normal control group (UCM), a cancer cell culture medium-treated group (CCM), and an experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1 in CCM, and (b) is the result of measuring the myotube diameter of (a) using Image J.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium-treated group
  • Asc-Ca-DCA calcium salt
  • Figure 18 shows the Western blot results of C2C12 cell lines in the normal control group (UCM), cancer cell culture medium treatment group (CCM), and experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Preparation Example 1 in CCM.
  • Figure 19 is a graph showing the relative expression levels of target markers (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, and (d) Myogenin from the Western blot results of Figure 18.
  • Figure 20 shows the Western blot results of C2C12 cell lines in the normal control group (UCM), cancer cell culture medium treatment group (CCM), and experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-Leu) of Preparation Example 2 in CCM.
  • Figure 21 is a graph showing the relative expression levels of target markers (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, and (d) Myogenin from the Western blot results of Figure 20.
  • Figure 22 shows the Western blot results of C2C12 cell lines in the normal control group (UCM), cancer cell culture medium treatment group (CCM), and experimental group treated with calcium salt (DCA-Ca-Leu) of Preparation Example 3 in CCM.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium treatment group
  • DCA-Ca-Leu calcium salt
  • Figure 23 is a graph showing the relative expression levels of target markers (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, and (d) Myogenin from the Western blot results of Figure 22.
  • Figure 24(a) is a crystal violet staining image of C2C12 cell lines of a normal control group (UCM), a cancer cell culture medium treatment group (CCM), an experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Preparation Example 1 in CCM, a group treated with ascorbic acid (Asc) in CCM, a group treated with dichloroacetic acid (DCA) in CCM, and a group treated with a combination of ascorbic acid and dichloroacetic acid in CCM, and (b) is the result of measuring the myotube diameter of each group in (a) using Image J.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium treatment group
  • Asc-Ca-DCA calcium salt
  • Figure 25 shows the Western blot results for MuRF1, Atrogin1, MyHC, and Myogenin as target markers in the treatment group of Figure 24.
  • Figure 26 is a graph showing the relative expression levels of (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, and (d) Myogenin from the Western blot results of Figure 25.
  • Figure 27 shows the Western blot results for Calpain 3, PDK-4, and GDF-15 as target markers in the treatment group of Figure 24.
  • Figure 28 is a graph showing the relative expression levels of (a) Calpain 3, (b) PDK-4, and (c) GDF-15 from the Western blot results of Figure 27.
  • Figure 29 shows the results of Western blot for MuRF1, Atrogin1, MyHC, and Myogenin as target markers in the normal control group (UCM), cancer cell culture medium treatment group (CCM), experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-Leu) of Preparation Example 2 in CCM, group treated with ascorbic acid (Asc) in CCM, group treated with leucine (Leu) in CCM, and group treated with a combination of ascorbic acid and leucine in CCM.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium treatment group
  • Asc-Ca-Leu experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-Leu) of Preparation Example 2 in CCM
  • group treated with ascorbic acid (Asc) in CCM group treated with leucine (Leu) in CCM
  • Leu leucine
  • Figure 30 is a graph showing the relative expression levels of (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, and (d) Myogenin from the Western blot results of Figure 29.
  • Figure 31 shows the results of Western blot for Calpain 3, PDK-4, and GDF-15 as target markers in the normal control group (UCM), cancer cell culture medium treatment group (CCM), experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-Leu) of Preparation Example 2 in CCM, group treated with ascorbic acid (Asc) in CCM, group treated with leucine (Leu) in CCM, and group treated with a combination of ascorbic acid and leucine in CCM.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium treatment group
  • Asc-Ca-Leu experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-Leu) of Preparation Example 2 in CCM
  • group treated with ascorbic acid (Asc) in CCM group treated with leucine (Leu) in CCM
  • group treated with a combination of ascorbic acid and leucine in CCM group treated with a combination of ascorbic acid and leucine in CCM.
  • Figure 32 is a graph showing the relative expression levels of (a) Calpain 3, (b) PDK-4, and (c) GDF-15 from the Western blot results of Figure 31.
  • Figure 33 shows the results of Western blot for MuRF1, Atrogin1, MyHC, and Myogenin as target markers in the normal control group (UCM), cancer cell culture medium treatment group (CCM), experimental group treated with calcium salt (DCA-Ca-Leu) of Preparation Example 3 in CCM, group treated with dichloroacetic acid (DCA) in CCM, group treated with leucine (Leu) in CCM, and group treated with a combination of dichloroacetic acid and leucine in CCM.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium treatment group
  • DCA-Ca-Leu calcium salt
  • DCA dichloroacetic acid
  • Leu leucine
  • Figure 34 is a graph showing the relative expression levels of (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, and (d) Myogenin from the Western blot results of Figure 33.
  • Figure 35 shows the results of Western blot for Calpain 3, PDK-4, and GDF-15 as target markers in the normal control group (UCM), cancer cell culture medium treatment group (CCM), experimental group treated with calcium salt (DCA-Ca-Leu) of Preparation Example 3 in CCM, group treated with dichloroacetic acid (DCA) in CCM, group treated with leucine (Leu) in CCM, and group treated with a combination of dichloroacetic acid and leucine in CCM.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium treatment group
  • DCA-Ca-Leu calcium salt
  • DCA dichloroacetic acid
  • Leu leucine
  • Figure 36 is a graph showing the relative expression levels of (a) Calpain 3, (b) PDK-4, and (c) GDF-15 from the Western blot results of Figure 35.
  • Figure 37 is (a) a crystal violet staining image of the root canal of a normal control group (UCM), a cancer cell culture medium-treated group (CCM), and an experimental group treated with dexamethasone (Dex) in UCM, and (b) is the result of measuring the root canal diameter size of (a) using Image J.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium-treated group
  • Dex dexamethasone
  • Figure 38 shows the results of Western blot for MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, Calpain 3, PDK-4, and GDF-15 as target markers in the normal control group (UCM), cancer cell culture medium treatment group (CCM), and experimental group treated with dexamethasone (Dex) in UCM.
  • UCM normal control group
  • CCM cancer cell culture medium treatment group
  • Dex dexamethasone
  • Figure 39 shows the results of Western blot for MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, Calpain 3, PDK-4, and GDF-15 as target markers in the normal control group (UCM), the experimental group treated with dexamethasone in UCM (Dex), and the experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Preparation Example 1 in Dex.
  • Figure 40 is a graph showing the relative expression levels of (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin, (e) Calpain 3, (f) PDK-4, and (g) GDF-15 from the Western blot results of Figure 39.
  • Figure 41 shows the results of Western blot for MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, Calpain 3, PDK-4, and GDF-15 as target markers in the normal control group (UCM), the experimental group treated with dexamethasone in UCM (Dex), and the experimental group treated with calcium salt (Asc-Ca-Leu) of Preparation Example 2 in Dex.
  • Figure 42 is a graph showing the relative expression levels of (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin, (e) Calpain 3, (f) PDK-4, and (g) GDF-15 from the Western blot results of Figure 41.
  • Figure 43 shows the results of Western blot for MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, Calpain 3, PDK-4, and GDF-15 as target markers in the normal control group (UCM), the experimental group treated with dexamethasone in UCM (Dex), and the experimental group treated with calcium salt of Preparation Example 3 (DCA-Ca-Leu) in Dex.
  • Figure 44 is a graph showing the relative expression levels of (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin, (e) Calpain 3, (f) PDK-4, and (g) GDF-15 from the Western blot results of Figure 43.
  • G1 represents a normal control group
  • G2 represents an excipient control group
  • G3 represents an oral administration group of megestrol (125 mpk)
  • G4 represents an oral administration group of Manufacturing Example 1 (200 mpk)
  • G5 represents an intravenous administration group of Manufacturing Example 1 (100 mpk)
  • G6 represents an intravenous administration group of Manufacturing Example 1 (200 mpk).
  • Figure 45 shows the Western blot results for MuRF1, Atrogin1, MyHC, and Myogenin as target markers in mouse muscle tissue.
  • Figure 46 is a graph showing the relative expression levels of (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, and (d) Myogenin from the Western blot results of Figure 45.
  • Figure 47 is a graph showing the results of Western blot for Calpain 3 and PDK-4 as target markers in mouse muscle tissue, and the relative expression levels of (b) Calpain 3 and (c) PDK-4 from the Western blot results.
  • Figure 48 is a graph showing the concentrations of (a) IL-1 ⁇ and (b) lactic acid measured in mouse blood.
  • Figure 49 is a graph showing the weight loss inhibition effect in mice (a) over time and (b) according to the experimental group.
  • Figures 50 (a) to (f) are images showing cross-sections of the gastrocnemius of mice in experimental groups G1 to G6, respectively, and (g) is a graph that organizes the cross-sectional areas from (a) to (f).
  • Figures 51 (a) to (f) are images showing cross-sections of the quadriceps of mice in experimental groups G1 to G6, respectively, and (g) is a graph that organizes the cross-sectional areas from (a) to (f).
  • Figures 52 (a) to (f) are images showing cross-sections of the soleus of mice in experimental groups G1 to G6, respectively, and (g) is a graph that organizes the cross-sectional areas from (a) to (f).
  • Figure 53(a) shows the results of the Rotarod-treadmill test of mice, and (b) shows the results of the Wire hanging test of mice.
  • the terms “about” and “substantially” are used to mean a range of or approximation to a numerical value or degree, taking into account inherent manufacturing and material tolerances, and are used to prevent infringers from unfairly utilizing the disclosure, which mentions exact or absolute numbers provided to aid understanding of the present invention.
  • subject as used herein may mean a mammal exhibiting one or more of the symptoms of cachexia and muscle wasting.
  • treatment means any act of administering to a subject a composition according to one embodiment of the present invention to improve or benefit at least one of the symptoms of cachexia and muscle wasting.
  • One specific example of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cachexia and muscle wasting, comprising an ionic compound, wherein the ionic compound comprises a calcium cation, a first anion, and a second anion, wherein the first anion and the second anion are different from each other and are each independently an anion of ascorbic acid, dichloroacetic acid, a branched-chain amino acid, or a derivative thereof.
  • an ionic compound refers to a compound in which ions having opposite charges form an ionic bond due to an electrostatic force, and can exhibit electrical neutrality.
  • the ionic compound may be a compound in which two anions selected from the group consisting of anions of ascorbic acid, dichloroacetic acid, branched-chain amino acids, and derivatives thereof are ionically bonded to both sides of a Ca2 + ion (calcium ion).
  • the ionic compound may be a compound in which two different anions selected from the anions of ascorbic acid, dichloroacetic acid, and branched-chain amino acids are ionically bonded to both sides of a calcium ion.
  • the ionic compound may include a calcium salt of ascorbic acid and dichloroacetic acid; a calcium salt of ascorbic acid and a branched-chain amino acid; a calcium salt of dichloroacetic acid and a branched-chain amino acid.
  • the branched-chain amino acid may include at least one selected from the group consisting of leucine, isoleucine, and valine.
  • the branched-chain amino acid may contribute to the synthesis and conversion of proteins.
  • the branched-chain amino acid may be leucine.
  • the ionic compound may include a calcium salt of ascorbic acid and leucine, or a calcium salt of dichloroacetic acid and leucine.
  • the above ionic compound provides the following three mechanisms for cachexia and muscle wasting simultaneously, thereby providing preventive, ameliorating or therapeutic effects on cachexia and muscle wasting, which are multifactorial diseases:
  • a pharmaceutical composition containing the above ionic compound can prevent weight loss caused by unnecessary energy consumption by inhibiting catabolism due to energy metabolism.
  • cancer cells can perform energy metabolism through oxidative phosphorylation that requires oxygen and glycolysis that does not use oxygen.
  • cancer cells mainly use glycolysis to survive in a hypoxic environment where normal cells cannot survive, and the cell death control process that starts from mitochondria is deactivated.
  • glycolysis of cancer cells is promoted, glycogen is broken down into lactic acid in the liver. Lactic acid can be converted to pyruvate by lactate dehydrogenase (LDH), and pyruvate is converted to oxaloacetate and malate, and then to phosphoenolpyruvate (PEP) by phosphoenolpyruvate carboxykinase.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • Fructose-1,6-biphosphate is produced from phosphoenolpyruvate, which is then converted to fructose-6-phosphate, which is then converted to glucose via glucose-6-phosphate.
  • the above series of processes is called gluconeogenesis, and a total of 4 ATP and 2 GTP are required to produce one glucose molecule.
  • the enhancement of glycolysis in cancer cells induces enhancement of gluconeogenesis, which leads to unnecessary energy waste in the body and causes weight loss.
  • Ascorbic acid contained in the above ionic compound is a substance widely known as vitamin C.
  • Ascorbic acid has excellent electron donating ability, so it not only has excellent antioxidant action, removal of active oxygen, and anti-aging ability, but can also act as a coenzyme for various enzymes in the body.
  • ascorbic acid can act as a coenzyme for an enzyme called prolyl hydroxylase.
  • Prolyl hydroxylase can be activated by ascorbic acid to hydroxylate and remove the proline residue of the HIF-1 ⁇ protein.
  • HIF-1 ⁇ protein is a subunit of the heterodimer HIF-1 (hypoxia inducible factor-1), and is involved in controlling energy metabolism and angiogenesis. Since cancer cells consume a lot of energy and nearby oxygen, they require oxygen supply through the angiogenic function of HIF-1 ⁇ protein. Therefore, the decrease in HIF-1 ⁇ protein due to the administration of ascorbic acid creates an environment unfavorable to the growth of cancer cells, thereby providing an inhibitory effect on tumor growth, and at the same time, by inhibiting the mechanism of gluconeogenesis, it can prevent weight loss by reducing unnecessary energy consumption.
  • Dichloroacetic acid (DCA) contained in the above ionic compound is known to have a therapeutic effect on metabolic diseases caused by mitochondrial abnormalities when provided in the form of a salt.
  • DCA Dichloroacetic acid
  • cancer cells are in a state where pyruvate cannot be converted into acetyl-CoA because HIF-1, a hypoxia-inducible factor, promotes the expression of pyruvate dehydrogenase kinase (PDK).
  • PDK pyruvate dehydrogenase kinase
  • Sodium dichloroacetate can activate oxidative phosphorylation in mitochondria by increasing the activity of pyruvate dehydrogenase (PDH) through inhibition of pyruvate dehydrogenase kinase (PDK), thereby converting pyruvate into acetyl-CoA.
  • the provision of dichloroacetate through administration of the above ionic compound can inhibit the process through oxidative phosphorylation activity in the mitochondria of cancer cells, thereby inhibiting lactate release and gluconeogenesis, and can also induce apoptotic cell death of cancer cells. This process can be referred to as mitochondrial reforming, which allows cancer cells to perform normal mitochondria functions.
  • the above ionic compound can inhibit gluconeogenesis and reduce blood glucose concentration through inhibition of cancer cell growth and changes in the environment surrounding the cancer through mitochondrial reforming, thereby inhibiting weight loss.
  • Leucine a type of branched-chain amino acid included in the above ionic compound, is an essential amino acid used in protein biosynthesis, and must be supplied through diet because it is not synthesized in the body.
  • Leucine is known to be involved in muscle protein synthesis, including skeletal muscle, and acts as an important regulatory factor in translation initiation during protein synthesis.
  • leucine can act on the insulin signaling pathway.
  • leucine can act on pancreatic cells to directly promote insulin secretion or inhibit the secretion of glucagon, thereby reducing blood glucose concentration. Insulin can activate the insulin receptor and activate the Akt signaling protein through the insulin signaling pathway.
  • Akt activates the TSC1/2 complex
  • the TSC1/2 complex can activate mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1), which controls protein synthesis, thereby activating protein synthesis.
  • mTORC1 mimmalian target of rapamycin complex 1
  • the insulin signaling pathway fails to sufficiently activate the Akt signaling protein, which in turn inactivates mTORC1.
  • Leucine together with insulin, participates in mTORC1 activity to regulate blood glucose concentration and contribute to protein synthesis.
  • mTORC1 interacts with metabolic proteins such as AMPK, and leucine can participate in the activity of AMPK to induce GLUT4 membrane movement and help the intracellular uptake of glucose.
  • the ionic compound activates the blood glucose reduction mechanism through the supply of leucine, and contributes to protein synthesis, thereby suppressing weight loss.
  • Calcium ions contained in the above ionic compound can affect the calcium homeostasis of cancer cells and induce cancer cell death. Specifically, calcium accumulates in the mitochondria of cancer cells upon administration of the pharmaceutical composition, and excessive active oxygen is generated in the cancer cells, which can lead to apoptosis-induced cell death. Calcium ions can form a direct bond with ⁇ -KGDC (ketoglutarate dehydrogenase complex) and act as a regulatory factor for the TCA cycle.
  • the above ionic compound excessively increases the calcium ion concentration in cancer cells through the supply of calcium, which can induce metabolic disorders in mitochondria through the activity of endonuclease and protease, thereby promoting the release of cytochrome c. Release of cytochrome c activates caspase-9, which in turn activates caspases 3 and 7, leading to apoptosis of cancer cells.
  • a pharmaceutical composition comprising the above ionic compound can act as a multimodal preventive or therapeutic agent for cachexia and muscle loss, whereby the calcium ion and the first anion and the second anion selected from the above-mentioned anions comprehensively contribute to at least one of apoptosis of cancer cells, reduction of unnecessary energy consumption, activation of a mechanism for lowering blood glucose, and activation of protein synthesis.
  • the effect of treatment with a pharmaceutical composition containing the above ionic compound can be evaluated by checking the expression level of PDK as a target marker.
  • the expression level of PDK-4 (PDK4) in a subject suffering from cachexia or muscle loss may be shown to decrease.
  • a decrease in the expression level of PDK-4 indicates activation of oxidative phosphorylation in mitochondria, and may imply a decrease in unnecessary metabolism in the body and a decrease in blood glucose concentration.
  • a pharmaceutical composition containing the above ionic compound can maintain muscle homeostasis and prevent a decrease in muscle mass.
  • Loss of muscle mass refers to a decrease in the size of muscle cells and muscle tissue that occurs in a number of catabolic conditions, including abnormalities in related genes, hormonal imbalances, severe injuries, sepsis, cancer, and aging.
  • Ascorbic acid contained in the above ionic compound can reduce the expression level of GDF15 (growth differentiation factor 15, GDF-15), which is an indicator related to cachexia.
  • GDF15 growth differentiation factor 15, GDF-15
  • GDF15 is known as a marker related to obesity and diabetes, but recently, as it has been found that the GDF15 level is higher in cachexia patients compared to healthy people in clinical trials, the expression of GDF15 is attracting attention as being related to cachexia. Since the GDF15 level can increase by HIF-1, the decrease in HIF-1 due to the administration of ascorbic acid can reduce the expression level of GDF15, thereby providing a preventive or therapeutic effect for cachexia.
  • dichloroacetic acid contained in the above ionic compound can normalize (reforming) the mechanism of mitochondria, thereby reducing the expression level of GDF, and when administered together with ascorbic acid, can induce a synergistic effect for the preventive or therapeutic effect for cachexia.
  • Dichloroacetic acid contained in the above ionic compound can inhibit the gluconeogenesis process through a decrease in blood glucose concentration.
  • the exact mechanism of muscle mass loss has not been identified, but the Cori cycle is thought to be involved.
  • lactic acid can be produced through the process, and the lactic acid can move to the liver to produce glucose through gluconeogenesis, which can then be supplied to muscle cells and used as an energy source.
  • the gluconeogenesis process causes unnecessary energy waste and muscle loss.
  • Dichloroacetic acid can also inhibit the mechanism of the Cori cycle to provide a muscle loss prevention effect.
  • PDK-4 may be overexpressed compared to normal tissues and cells.
  • Dichloroacetic acid along with the above-mentioned metabolic regulation function, can provide a preventive or therapeutic effect on muscle loss by lowering the expression level of overexpressed PDK-4 that appears specifically in muscles when muscle loss occurs.
  • mitochondrial dysfunction acts as a major mediating mechanism for the correlation.
  • Mitochondrial dysfunction can be caused by defects in the internal electron transport system or damage to mitochondria due to oxidative stress, and the expression level of GDF15 can increase as the inflammatory response due to oxidative stress increases.
  • Dichloroacetate can improve mitochondrial dysfunction through mitochondrial reforming, thereby reducing the expression level of GDF15.
  • dichloroacetate can affect PGC-1 ⁇ and activate AMPK (AMP-activated protein kinase) which is mechanistically related to PGC-1 ⁇ , thereby regulating the energy status and metabolism within the cell.
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • dichloroacetate affects the mitochondrial remodeling mechanism linked to PDK and PDH and factors acting on energy metabolism and mitochondrial function, thereby contributing to the normalization of mitochondrial function in a complex manner, thereby reducing the expression level of GDF15, which can provide a preventive or therapeutic effect on diseases related to cachexia and muscle loss.
  • leucine can provide protein synthesis and cell growth effects by participating in the IGF-1/PI3K/Akt mechanism related to muscle synthesis.
  • Insulin-like growth factor-1 IGF-1
  • IGF-1 is a hormone with a similar structure to insulin, and is involved in the growth, maintenance, and metabolism of the body. IGF-1 contributes to mTORC1 activation through the PI3K/Akt signaling pathway.
  • Leucine can activate mTORC1 through the insulin transmission pathway and the IGF/PI3K/Akt mechanism, thereby reducing blood glucose concentration and activating protein synthesis.
  • Calpain 3 is a type of calcium-dependent non-lysosomal cysteine protease, and it is known that a decrease in its expression amount causes muscle loss. Calpain 3 controls the structure of proteins within tissues or fibroblasts, and plays an important role in the growth and shape maintenance of muscle fibers.
  • calpain 3 Genetic mutations associated with calpain 3 can cause muscle diseases such as Duchenne muscular dystrophy, which causes a deficiency of dystrophin, a protein within muscle fibers, resulting in loss of muscle strength and motor ability, and limb girdle muscular dystrophy (LGMD), which causes muscle weakness due to degeneration of muscle tissue and damage to muscle fibers.
  • the above ionic compound can provide a preventive or therapeutic effect for the above disease by increasing the expression amount of calpain 3, a marker that directly affects muscle-related diseases as well as cachexia and muscle loss through the supply of calcium.
  • leucine contained in the above ionic compound can increase the expression of calpain 3 through the activation of mTORC1, and when administered together with calcium ions, can induce a synergistic effect for the preventive or therapeutic effect of cachexia and muscle loss.
  • a pharmaceutical composition comprising the above ionic compound can act as a multimodal preventive or therapeutic agent for cachexia and muscle loss, whereby the calcium ion and the first anion and the second anion selected from the above-mentioned anions comprehensively contribute to at least one of regulating the expression level of a muscle loss-related marker, reducing blood glucose concentration, and activating protein synthesis.
  • the effect of treatment with a pharmaceutical composition containing the above ionic compound can be evaluated by checking at least one of the expression levels of GDF15, PDK-4, and calpain 3 as target markers.
  • GDF15 is known to express a mechanism to suppress appetite and control body weight by transmitting signals to the nervous system through a receptor called GFRAL (GDNF Family Receptor Alpha-Like).
  • GFRAL GDNF Family Receptor Alpha-Like
  • the appetite suppression mechanism of GDF15-GFRAL can be divided into the following three stages: first, the expression of GDF15 increases due to the aforementioned mitochondrial dysfunction; second, the increased GDF15 specifically binds to GFRAL and transmits signals to a specific part of the brainstem including the NTS (Nucleus Tractus Solitarius); and third, various neurotransmitters are regulated in the brainstem that received the signals, thereby suppressing appetite. Ascorbic acid and/or dichloroacetic acid included in the above ionic compound can provide a fundamental therapeutic effect on appetite suppression by reducing the expression level of GDF15, which is the first step as the starting point of the above mechanism.
  • the expression level of PDK-4 in a subject suffering from cachexia or muscle loss may be shown to decrease.
  • Calpain 3 may affect the mechanism related to muscle protein decomposition by calcium, and may affect muscle loss by affecting c-FLIP (Caspase-8 Long Isoform), a protein involved in the apoptosis process. Calpain 3 is expressed in muscle cells and may inhibit the decomposition of c-FLIP, thereby inhibiting the function of caspase-8. Inhibition of caspase-8 leads to inhibition of apoptosis, thereby preventing muscle loss and maintaining the structural stability of muscle cells. Calpain 3 may prevent muscle loss through interaction with myostatin, a protein involved in muscle loss, as well as c-FLIP. The ionic compound may provide a preventive effect against muscle loss by increasing the expression level of calpain 3.
  • c-FLIP Caspase-8 Long Isoform
  • a pharmaceutical composition containing the above ionic compound can prevent a decrease in muscle mass caused by an inflammatory factor.
  • Proinflammatory cytokines can be identified regardless of the type of cancer and are known to be the main cause of muscle loss. Specifically, inflammatory factors such as tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), and interleukin-6 (IL-6) can induce cachexia and muscle loss.
  • tumor necrosis factor can activate the ubiquitin-proteasome system (UPS), which degrades proteins present in the cytoplasm, thereby promoting muscle protein degradation, and can damage muscle cells by increasing oxidants, or reduce the expression of stress proteins, thereby reducing the production and regeneration of muscle proteins.
  • UPS ubiquitin-proteasome system
  • Ascorbic acid contained in the above ionic compound suppresses the secretion of inflammatory cytokines and simultaneously acts as a low-toxicity metabolic anticancer agent that directly inhibits the growth of cancer cells, thereby providing a preventive or therapeutic effect on cachexia and muscle loss induced by inflammatory factors.
  • Ascorbic acid can suppress the secretion of cytokines by inhibiting NF- ⁇ B and COX2, which are representative factors mediating and regulating inflammatory responses.
  • NF- ⁇ B and COX2 are representative factors mediating and regulating inflammatory responses.
  • ascorbic acid can suppress the secretion of cytokines by inhibiting the signal transduction pathway of NF- ⁇ B.
  • Ascorbic acid's inhibition of the NF- ⁇ B signal transduction pathway can also prevent muscle loss by inhibiting the mechanism of GDF15.
  • COX cyclooxygenase catalyzes the conversion of prostaglandin, a major mediator of inflammatory responses, into arachidonic acid, and COX1 is expressed at a constant level in the body and produces prostaglandin, which is essential for the expansion of blood vessels, maintenance of blood flow, and protection of the gastric mucosa.
  • COX2 is hardly expressed in normal tissues, but is induced by inflammatory factors, cell growth factors, tumor-promoting factors, etc. to instantly produce a large amount of prostaglandins and cause various inflammatory reactions.
  • COX2 is overexpressed in cancer cells, promoting the proliferation and metastasis of cancer cells and inhibiting cell death. Ascorbic acid can prevent the worsening of cachexia and muscle loss by inhibiting the mechanism of COX2.
  • Dichloroacetic acid contained in the above ionic compound can reduce the release of lactic acid in the body, thereby reducing the expression of cytokines.
  • Lactic acid can regulate signal transduction pathways that regulate the expression of several enzymes involved in cytokines and other immune responses through the activation of NF- ⁇ B and HIF-1.
  • the above ionic compound can prevent the decrease in protein production by supplying dichloroacetic acid to suppress the mechanism of cytokines through the reduction in the release of lactic acid.
  • Leucine a type of branched-chain amino acid contained in the above ionic compound, can prevent muscle loss by inhibiting the secretion of inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor, IL-6 and IFN ⁇ . Leucine can inhibit the secretion of cytokines by inhibiting the phosphorylation level of NF- ⁇ B.
  • the above ionic compound can supply leucine to inhibit the mechanism of cytokines and prevent the decrease in protein production.
  • a pharmaceutical composition comprising the above ionic compound can act as a multimodal preventive or therapeutic agent for cachexia and muscle wasting by inhibiting the secretion of inflammatory cytokines by the first anion and the second anion.
  • the effect of treatment with a pharmaceutical composition containing the ionic compound can be evaluated by checking at least one of the expression level of GDF15, the expression level of cytokine, and the amount of lactic acid in blood as target markers.
  • the expression level of GDF15 in a subject suffering from cachexia or muscle loss may be shown to decrease.
  • the expression level of cytokine in a subject suffering from cachexia or muscle loss may be shown to decrease.
  • the pharmaceutical composition containing the ionic compound is administered, the amount of lactic acid in the blood of a subject suffering from cachexia or muscle loss may be shown to decrease.
  • the above ionic compound can be provided at a dosage of 20 to 4800 mg/kg/day.
  • the dosage of the ionic compound can be 500 mg/kg/day or more and 4500 mg/kg/day or less, 1000 mg/kg/day or more and 4000 mg/kg/day or less, 1500 mg/kg/day or more and 3500 mg/kg/day or less, or 2000 mg/kg/day or more and 3000 mg/kg/day or less.
  • the dosage of the ionic compound can be 20 mg/kg/day or more and 2000 mg/kg/day or less.
  • an effective preventive or therapeutic effect on cachexia and muscle loss can be provided without cytotoxicity.
  • a more specific dosage of the ionic compound within the above-described range may be determined depending on the type of the ionic compound, the age, weight, health, sex, sensitivity to the ionic compound of the subject, the administration time of the pharmaceutical composition, the administration route, the excretion rate, the treatment period, or the type and amount of drugs used simultaneously.
  • the frequency of administration of the above ionic compound may be once a day, but is not limited thereto.
  • the dosage within the above-described range may be divided and administered multiple times.
  • the pharmaceutical composition may further comprise the ionic compound and a pharmaceutically acceptable aqueous solvent.
  • the aqueous solvent may be, but is not limited to, distilled water, saline solution, an injection solution, or a buffer solution.
  • the pharmaceutical composition may be a composition for oral administration, and may be prepared by adding 20 to 4,800 mg of the ionic compound to 1 mL of distilled water.
  • the pharmaceutical composition for oral administration can be prepared by adding 160 mg of an ionic compound including a calcium cation, an ascorbic acid anion, and a dichloroacetic acid anion to 1 mL of distilled water.
  • the pharmaceutical composition for oral administration can be prepared by adding 200 mg of an ionic compound including a calcium cation, an ascorbic acid anion, and an anion of a branched-chain amino acid to 1 mL of distilled water.
  • the pharmaceutical composition for oral administration can be prepared by adding 480 mg of an ionic compound including a calcium cation, a dichloroacetic acid anion, and an anion of a branched-chain amino acid to 1 mL of distilled water.
  • the pharmaceutical composition may be a composition for intravenous administration, and may be prepared by adding 20 to 4800 mg of the ionic compound to 1 mL of an injection solution.
  • the pharmaceutical composition for intravenous administration can be prepared by adding 80 mg of an ionic compound containing a calcium cation, an ascorbic acid anion, and a dichloroacetic acid anion to 1 mL of an injection solution.
  • the pharmaceutical composition for intravenous administration can be prepared by adding 100 mg of an ionic compound including a calcium cation, an ascorbic acid anion, and an anion of a branched-chain amino acid to 1 mL of an injection solution.
  • the pharmaceutical composition for oral administration can be prepared by adding 240 mg of an ionic compound including a calcium cation, a dichloroacetic acid anion, and an anion of a branched-chain amino acid to 1 mL of an injection solution.
  • the ionic compound can be mixed with the aqueous solvent so that at least a portion of the ionic bonds can be dissociated.
  • the degree of dissociation of the ionic compound can be 1 to 50%.
  • the ionic compound can maintain its chemical structure without being dissociated by at least 1% or more in the pharmaceutical composition, and can maintain the chemical structure even after being administered to a subject to provide the multimodal effect described above.
  • the pharmaceutical composition comprising the ionic compound can include the ionic compound dissociated in the aqueous solvent and the ionic compound dispersed in the aqueous solvent without being dissociated.
  • the pharmaceutical composition can be superior in the preventive or therapeutic effect on cachexia and muscle loss compared to an aqueous solution containing the same content of cations and anions that can be included in the ionic compound of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may include the ionic compound and one or more pharmaceutically acceptable active agents.
  • the active agents may include, but are not limited to, an appetite stimulant, an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, an antibacterial agent, an antifungal agent, an antiviral agent, an immunomodulator, a steroid agent, an anticoagulant, an anticonvulsant, an antidepressant, an antioxidant, and a vitamin. That is, the ionic compound may be used in combination with the active agent.
  • the appetite stimulant may be, but is not limited to, megestrol, cyproheptadine, dronabinol, or metoclopramide.
  • the anticancer drugs include Imatinib, 5-FU (5-Florouracil), Irinotecan, Sunitinib, Oxaliplatin, Cisplatin, Paclitaxel, Lapatinib, Trastuzumab (Herceptin), Gefitinib, Erlotinib, Methotrexate, Carboplatin, Docetaxel, Everolimus, Sorafenib, Carbonic anhydrase inhibitors, Monocarboxylate transporter inhibitors, Pumpro Pembrolizumab, atezolizumab, a PD-1 family anticancer agent, Nivolumab, a PARP-1 (Poly(ADP-ribose) polymerase 1) inhibitor, a PARP-2 (Poly(ADP-ribose) polymerase 2) inhibitor, Olaparib, Rucaparib, Niraparib, Bevacizumab, or a VEGF inhibitor, but is not limited thereto.
  • Imatinib 5-FU (5-
  • the anticancer agent may be a PT family anticancer agent, such as oxaliplatin, cisplatin, or carboplatin.
  • the PT family anticancer agent is known to increase the GDF15 level in a subject and induce cachexia depending on use.
  • a pharmaceutical composition containing the above ionic compound, when used in combination with the PT series anticancer agent, can suppress weight loss and appetite loss, which are side effects of the anticancer agent, while maintaining activity against tumor cells as an inherent effect of the anticancer agent.
  • the anti-inflammatory agent may be an NSAID such as, but not limited to, salicylic acid, ibuprofen, dexibuprofen, naproxen, ketoprofen, indomethacin, diclofenac, piroxicam, or meloxicam.
  • an NSAID such as, but not limited to, salicylic acid, ibuprofen, dexibuprofen, naproxen, ketoprofen, indomethacin, diclofenac, piroxicam, or meloxicam.
  • the antimicrobial agent may be, but is not limited to, benzylpenicillin, ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, or tetracycline.
  • the antifungal agent may be, but is not limited to, nystatin, amphotericin B, or trichomycin.
  • the antiviral agent may be, but is not limited to, oseltamivir, acyclovir, ganciclovir, sofosbuvir, or remdesivir.
  • the immunomodulator may be, but is not limited to, adalimumab, infliximab, etanercept, or cyclosporine.
  • the steroid agent may be, but is not limited to, hydrocortisone, prednisone, triamcinolone or fluticasone.
  • the active agents may further include anticoagulants such as warfarin, heparin; anticonvulsants such as carbamazepine, phenytoin; antidepressants such as selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors (SNRIs); antioxidants such as coenzyme Q10, alpha lipoic acid; vitamins such as vitamins A, B, C, D, E.
  • anticoagulants such as warfarin, heparin
  • anticonvulsants such as carbamazepine, phenytoin
  • antidepressants such as selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors (SNRIs)
  • antioxidants such as coenzyme Q10, alpha lipoic acid
  • vitamins such as vitamins A, B, C, D, E.
  • the pharmaceutical composition may include one or more selected from pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents.
  • the carriers, excipients and diluents may be, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the carriers, excipients and diluents may be included within a range capable of securing an effective concentration of the ionic compound.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as a solution, powder, oral preparation, injection, infusion, aerosol, tablet, capsule, pill, depot, or suppository.
  • the pharmaceutical composition may further include fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, excipients, etc. as additives necessary for formulation.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, or mucosally.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or intravenously.
  • the pharmaceutical composition may be formulated into the aforementioned liquid, oral, etc., when administered orally, and may be formulated into the aforementioned injection, infusion, etc., when administered intravenously.
  • the cachexia and muscle loss may be caused by causes such as cancer, tuberculosis, diabetes, AIDS, chronic obstructive pulmonary disease, multiple sclerosis, congestive heart failure, hemophilia, hypopituitarism or liver cirrhosis.
  • the cachexia and muscle loss may be caused by cancer.
  • the cancer may be selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, colon cancer, stomach cancer, liver cancer, brain cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone marrow cancer, lymphoma, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, kidney cancer and melanoma.
  • the pharmaceutical composition provides a multimodal preventive or therapeutic effect for cachexia and muscle loss caused by the above causes.
  • the above muscle loss may be caused by causes such as sarcopenia, atony, muscular atrophy, muscular dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis or myasthenia gravis.
  • the pharmaceutical composition provides a multimodal preventive or therapeutic effect on muscle loss caused by the above causes.
  • Another specific example of the present invention provides a food composition
  • a food composition comprising an ionic compound, wherein the ionic compound comprises a calcium cation, a first anion, and a second anion, wherein the first anion and the second anion are different from each other and are each independently an anion of ascorbic acid, dichloroacetic acid, a branched-chain amino acid, or a derivative thereof.
  • the ionic compound is replaced by the description of the preceding specific example.
  • the above food composition may be a health functional food.
  • Functional health foods can be referred to as food for special health use (FoSHU), and refer to foods that are processed to effectively exhibit bioregulatory functions in addition to providing nutrition, or foods that can exhibit medical effects.
  • the functional health foods can be provided in various forms, such as processed foods such as canned foods and retort foods, or tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills.
  • the food composition may further include food additives that may be commonly used.
  • the food composition may include preservatives, antioxidants, colorants, coloring agents, seasonings, sweeteners, flavorings, leavening agents, emulsifiers, thickeners, film-forming agents, gum-forming agents, antifoaming agents, and the like.
  • An ascorbic acid solution was prepared by dissolving 176 mg of ascorbic acid in 125 mL of distilled water at room temperature.
  • a dichloroacetic acid solution was prepared by dissolving 129 mg of dichloroacetic acid in 125 mL of distilled water. The ascorbic acid solution was slowly added to the dichloroacetic acid solution and stirred.
  • 105 mg of calcium carbonate (CaCO 3 ) was slowly added to the mixed solution and stirred at room temperature for 30 minutes, and then the reaction temperature was gradually increased to 60°C and stirred until CO 2 was no longer generated.
  • the mixture was dried using a rotary evaporator and a vacuum oven, unreacted substances were removed with diethyl ether, and then filtered, dried, and pulverized to obtain powdered ascorbic acid and calcium salt of dichloroacetic acid. All of the above processes were performed under a nitrogen atmosphere, and the calcium salt was referred to as Asc-Ca-DCA or DCA-Ca-Asc.
  • C2C12 cells were seeded at 1.0 x 10 4 cells/well in a 96-well plate and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day.
  • FBS fetal bovine serum
  • the calcium salts of Preparation Examples 1 to 3 were added to each well at eight predetermined concentrations, diluted by half each, and cytotoxicity was confirmed.
  • MTT solution was treated and cultured in a dark incubator for 3 hours. After removing the supernatant, 100 ⁇ l of DMSO was treated per well, and cytotoxicity was confirmed by measuring the optical density (OD) at 560 nm.
  • OD optical density
  • the calcium salt of Manufacturing Example 1 exhibited toxicity such that cell viability decreased by about 50% from a treatment concentration of 1000 ⁇ M.
  • the calcium salt of Manufacturing Example 2 exhibited toxicity such that cell viability decreased by about 50% from a treatment concentration of 100 ⁇ M.
  • the calcium salt of Manufacturing Example 3 did not exhibit toxicity up to a treatment concentration of 1200 ⁇ M.
  • C2C12 cells were seeded at 1.5 x 10 4 cells/well in a 96-well plate and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days.
  • the calcium salts of Preparation Examples 1 to 3 were added to each well at eight predetermined concentrations, diluted by half, and cytotoxicity was confirmed. After culturing for 72 hours, MTT solution was treated and cultured in a dark incubator for 3 hours. After removing the supernatant, 100 ⁇ l of DMSO was treated per well, and cytotoxicity was confirmed by measuring the OD at 560 nm. The above experiment was repeated three times, and the cell viability is shown in Fig. 2 (a) to (c).
  • the calcium salt of Manufacturing Example 1 exhibited toxicity such that cell viability decreased by about 50% from a treatment concentration of 500 ⁇ M.
  • the calcium salt of Manufacturing Example 2 exhibited toxicity such that cell viability decreased by about 50% from a treatment concentration of 500 ⁇ M.
  • the calcium salt of Manufacturing Example 3 exhibited no toxicity up to a treatment concentration of 1200 ⁇ M.
  • Mouse myogenic cell line C2C12 was seeded at 4.0 x 10 5 cells/well in 6-well plates and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the cells were washed with DPBS and the medium was replaced with differentiation medium (DMEM) containing 2% horse serum and cultured for 3 days.
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM differentiation medium
  • Mouse colon cancer cell line CT26 was seeded at 2.0 x 10 6 cells/well in 100-mm culture plates and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for 48 h. The medium was replaced with serum-free medium, and the medium was collected after 24 h. The collected medium was centrifuged (1500 rpm, 3 min) to remove cell debris and finally collected using a 0.22- ⁇ m filter.
  • FBS fetal bovine serum
  • Fig. 3 (a) is an image of the normal control (unconditioned medium; UCM), and (b) is an image of the CCM.
  • the scale bars inserted in Figs. 3 (a) and (b) indicate a horizontal length of 50 ⁇ m.
  • the myotube diameter was measured with Image J and is shown in Fig. 3 (c). Referring to Fig. 3, a decrease in myotube cells was confirmed in the CCM.
  • markers associated with muscle degradation and differentiation, MuRF1, Atrogin1, MyHC, and Myogenin, included in the treatment group (CCM) and the normal control group (UCM) were analyzed via Western blot, and the results are shown in Fig. 4, and the relative expression levels (fold change; FC) for each marker are shown in Fig. 5 (a) to (d).
  • the diameter of the myotubes in the treatment group (CCM) was reduced to approximately 50% of the normal control group (UCM).
  • the expression of muscle degradation markers MuRF1 and Atrogin1 was confirmed to have increased, and the expression of muscle differentiation markers MyHC and Myogenin was confirmed to have decreased.
  • C2C12 cells were seeded in 6-well plates at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days. After confirming that the cells had differentiated, the differentiation medium and cancer cell culture medium (CCM) were mixed in a 1:1 ratio and treated to form a control group, and simultaneously, the calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1 was added at three predetermined concentrations to set up a test group. After culturing for 72 hours, the cells were harvested and analyzed for the target marker PDK-4 by Western blotting, which is summarized in Fig. 6.
  • FBS fetal bovine serum
  • Figure 6(a) is a Western blot result
  • Figure 6(b) is a graph summarizing the PDK-4 expression level from the Western blot result.
  • the PDK-4 expression level increased in the control group (CCM) treated only with cancer cell culture medium, but it was confirmed that the expression was suppressed by treatment with Asc-Ca-DCA.
  • Figure 7(a) is a Western blot result
  • Figure 7(b) is a graph summarizing the expression level of Calpain 3 from the Western blot result.
  • the expression level of Calpain 3 decreased in the control group (CCM) treated only with cancer cell culture medium, but it was confirmed that the decrease in expression was suppressed by treatment with Asc-Ca-DCA.
  • Figure 8 is a Western blot result
  • Figure 9 is a graph summarizing (a) the expression level of Calpain 3, (b) the expression level of PDK-4, and (c) the expression level of GDF-15 from the Western blot result.
  • the expression level of Calpain 3 decreased in the control group (CCM) treated only with cancer cell culture medium, but it was confirmed that the decrease in expression was suppressed by the treatment of Asc-Ca-Leu.
  • Figures 9(b) and (c) the expression levels of PDK-4 and GDF-15 increased in the control group (CCM) treated only with cancer cell culture medium, but it was confirmed that the increase in expression was suppressed by the treatment of Asc-Ca-Leu.
  • Fig. 10 is a Western blot result
  • Fig. 11 is a graph summarizing (a) the expression level of Calpain 3, (b) the expression level of PDK-4, and (c) the expression level of GDF-15 from the Western blot result.
  • the expression level of Calpain 3 decreased in the control group (CCM) treated only with cancer cell culture medium, but it was confirmed that the decrease in expression was suppressed by treatment with DCA-Ca-Leu.
  • Figs. 11(b) and (c) the expression levels of PDK-4 and GDF-15 increased in the control group (CCM) treated only with cancer cell culture medium, but it was confirmed that the increase in expression was suppressed by treatment with DCA-Ca-Leu.
  • PDK-4 a target gene of Forkhead box protein O (FOXO), which is closely related to energy metabolism among the worsening mechanisms of cancer-induced cachexia and is a key gene in the muscle cell protein degradation mechanism, is known to be overexpressed when the subject shows cachexia symptoms.
  • FXO Forkhead box protein O
  • C2C12 cells were seeded in 6-well plates at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days. After differentiation was confirmed, the differentiation medium and cancer cell culture medium (CCM) were mixed in a 1:1 ratio and cultured for 72 hours. The cells were harvested and analyzed by Western blotting, which is summarized in Fig. 12 (a) and (b).
  • FBS fetal bovine serum
  • Calpain 3 known to be underexpressed in muscle in the cancer cachexia condition
  • GDF-15 known to be overexpressed in muscle in the cancer cachexia condition
  • target markers PDK-4 and Calpain 3 are overexpressed and underexpressed, respectively, in cancer cachexia.
  • cancer cachexia was induced in a situation where the expression level of PDK-4 was increased, and whether the changes in muscle degradation and differentiation markers were the same as in the cachexia condition.
  • C2C12 cells were seeded in 6-well plates at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day.
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days to establish a normal control group, and at the same time, WY-14643, an activator of PDK-4, was treated at a concentration of 50 ⁇ M to establish a test group. After culturing for 72 hours, the cells were stained with crystal violet staining, and each image is shown in Fig. 13.
  • FIG. 13 (a) is an image of the normal control group (UCM), and (b) is an image of the activator-treated group (WY-14643).
  • the scale bars inserted in Fig. 13 (a) and (b) represent 50 ⁇ m in horizontal length.
  • the diameter of the myotubes was measured using Image J and is shown in Fig. 13(c). Referring to Fig. 13, it was confirmed that when treated with WY-14643, a PDK-4 activator, the diameter of myotube cells decreased, inducing a state similar to cancer cachexia.
  • Fig. 14 (a) and (b). Referring to Fig. 14, it was confirmed that PDK-4, MuRF1, and Atrogin1 were overexpressed, and MyHC and Myogenin were underexpressed in the activator WY-14643-treated group, inducing a state similar to cancer cachexia.
  • C2C12 cells were seeded in 6-well plates at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day.
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days to set a normal control group, and simultaneously transfected with 100 nM each of Calpain 3 siRNA and vehicle control scrambled siRNA.
  • the transfection was performed using LipofectamineTM 3000 (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's protocol. After culturing for 72 hours, the cells were stained with crystal violet staining, and each image is shown in Figure 15.
  • Figure 15 (a) is an image of the normal control group (UCM),
  • (b) is an image of the vehicle control group (scrambled siRNA), and
  • (c) is an image of the Calpain 3 siRNA treatment group.
  • the scale bars inserted in Figures 15 (a) to (c) represent 50 ⁇ m in horizontal length.
  • the myotube diameter was measured using Image J and is shown in Figure 15 (d). Referring to Figure 15, it was confirmed that the myotube diameter decreased with statistical significance compared to the control group under the Calpain 3 knockdown condition by Calpain 3 siRNA transfection, confirming that it was induced in a state similar to cancer cachexia.
  • the calcium salt of Manufacturing Example 1 was mixed with DMSO and added to 200 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, containing 6 ⁇ M EDTA, and 10 ⁇ M hematin) (the concentration of DMSO in the final buffer solution was 1%). At this time, the concentration of the calcium salt contained in the buffer solution was 10 ⁇ M.
  • 34 U/ml of human recombinant cyclooxygenase COX-2 expressed in insect Sf21 cells as an enzyme was further added to the buffer solution, and the pre-reaction was performed at 25°C for 15 minutes. Additionally, 3 ⁇ M of arachidonic acid and 100 ⁇ M of Ampliflu Red were further added, and the reaction was performed at 25°C for 3 minutes. The amount of Resofurin produced during the reaction process was measured by spectrofluorimetry at 535 nm/590 nm, and the inhibitory effect on COX2 was confirmed by comparison with the calcium salt untreated group.
  • C2C12 cells were seeded at 4.0 x 10 5 cells/well in a 6-well plate and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the medium was replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days. After confirming that the cells had differentiated, the differentiation medium and cancer cell culture medium (CCM) were mixed in a 1:1 ratio and treated to form a control group, and at the same time, the calcium salt of Manufacturing Example 1 was added at three predetermined concentrations to set up a test group. After culturing for 72 hours, the cells were stained with crystal violet staining, and each image is summarized in Fig. 17(a). The scale bar inserted in Fig. 17(a) represents a horizontal length of 50 ⁇ m. The myotube diameter was measured using Image J from the image, and the change in myotube cell diameter is summarized in Fig. 17(b).
  • FBS fetal bovine serum
  • the diameter of myotube cells treated with cancer cell culture medium (CCM) to create cancer cachexia conditions decreased by approximately 50% compared to the normal control group (UCM), and in the test group treated with calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1, the decrease in myotube cell diameter was statistically significantly suppressed from 10 ⁇ M or higher.
  • CCM cancer cell culture medium
  • Asc-Ca-DCA calcium salt
  • C2C12 cells were seeded in a 6-well plate at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day.
  • FBS fetal bovine serum
  • the differentiation medium and cancer cell culture medium were mixed in a 1:1 ratio and treated to form a control group, and at the same time, the calcium salts of Manufacturing Examples 1 to 3 were treated at a preset concentration to set the test group.
  • the cells were harvested and analyzed by Western blotting, and the results are summarized in Fig. 18 (Manufacturing Example 1), Fig. 20 (Manufacturing Example 2), and Fig. 22 (Manufacturing Example 3).
  • Fig. 19 markers related to muscle breakdown and differentiation, MuRF1, Atrogin1, MyHC, and Myogenin, included in each experimental group were analyzed through Western blotting, and the relative expression levels of each marker are shown in Fig. 19 (Preparation Example 1), Fig. 21 (Preparation Example 2), and Fig. 23 (Preparation Example 3).
  • the muscle degradation markers MuRF1 and Atrogin1 were suppressed from increasing their expression due to cancer cell culture medium (CCM) by the calcium salt treatment of Preparation Examples 1 to 3, respectively, and the muscle differentiation markers MyHC and Myogenin were suppressed from decreasing their expression due to cancer cell culture medium (CCM).
  • C2C12 cells were seeded at 4.0 x 10 5 cells/well in a 6-well plate and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the medium was replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days. After confirming that the cells had differentiated, the differentiation medium and cancer cell culture medium (CCM) were mixed in a 1:1 ratio and treated to form a control group, and at the same time, the calcium salt (Asc-Ca-DCA), ascorbic acid, dichloroacetic acid, and a combination of ascorbic acid and dichloroacetic acid of Manufacturing Example 1 were treated at set concentrations to set the test group.
  • FBS fetal bovine serum
  • Fig. 24(a) After culturing for 72 hours, the image stained with crystal violet staining is summarized in Fig. 24(a).
  • the scale bar inserted in Fig. 24 (a) represents 50 ⁇ m in horizontal length.
  • the above image was used to measure the diameter of the myotubes using Image J, and the change in the diameter of the myotube cells was confirmed, which is shown in Figure 24(b).
  • C2C12 cells were seeded in 6-well plates at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days. After confirming that the cells had differentiated, the differentiation medium and cancer cell culture medium (CCM) were mixed in a 1:1 ratio and treated to form a control group, and at the same time, the calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1, ascorbic acid, dichloroacetic acid, and a combination of ascorbic acid and dichloroacetic acid were treated at set concentrations to set the test group. After culturing for 72 hours, the cells were harvested and subjected to Western blot analysis, which is summarized in Figs. 25 and 27.
  • FBS fetal bovine serum
  • markers associated with muscle breakdown and differentiation were analyzed through Western blot, and the relative expression levels of each marker are shown in Figures 26 and 28.
  • the muscle degradation markers MuRF1 and Atrogin1 showed an excellent effect of suppressing the increase in expression in the calcium salt (Asc-Ca-DCA) treatment group of Manufacturing Example 1 compared to the other experimental groups, and the muscle differentiation markers MyHC and Myogenin showed an excellent effect of suppressing the decrease in expression in the calcium salt treatment group of Manufacturing Example 1 compared to the other experimental groups.
  • the calcium salt treatment group of Manufacturing Example 1 showed a higher expression level of Calpain 3 compared to the other experimental groups, and the expression of PDK-4 and GDF-15 was suppressed.
  • test groups were set by treating the calcium salt (Asc-Ca-Leu), ascorbic acid, leucine, and the group combining ascorbic acid and leucine in Manufacturing Example 2 at set concentrations. After culturing for 72 hours, the cells were harvested and subjected to Western blot analysis, and the results are summarized in Figs. 29 and 31.
  • markers associated with muscle breakdown and differentiation were analyzed through Western blot, and the relative expression levels of each marker are shown in Figures 30 and 32.
  • the muscle degradation markers MuRF1 and Atrogin1 showed an excellent effect of suppressing the increase in expression in the calcium salt (Asc-Ca-Leu) treatment group of Manufacturing Example 2 compared to the other experimental groups, and the muscle differentiation markers MyHC and Myogenin showed an excellent effect of suppressing the decrease in expression in the calcium salt treatment group of Manufacturing Example 2 compared to the other experimental groups.
  • the calcium salt treatment group of Manufacturing Example 2 showed a higher expression of Calpain 3 compared to the other experimental groups, and the expression of PDK-4 and GDF-15 was suppressed.
  • the experiment was performed in the same manner as Experimental Example 9-2, except that the test groups were set by treating the calcium salt (DCA-Ca-Leu), dichloroacetic acid, leucine, and the group combining dichloroacetic acid and leucine in Manufacturing Example 3 at set concentrations. After culturing for 72 hours, the cells were harvested and subjected to Western blot analysis, and the results are summarized in Figs. 33 and 35.
  • markers associated with muscle breakdown and differentiation were analyzed through Western blot, and the relative expression levels of each marker are shown in Figures 34 and 36.
  • the muscle degradation markers MuRF1 and Atrogin1 showed an excellent effect of suppressing the increase in expression in the calcium salt (DCA-Ca-Leu) treatment group of Manufacturing Example 3 compared to the other experimental groups, and the muscle differentiation markers MyHC and Myogenin showed an excellent effect of suppressing the decrease in expression in the calcium salt treatment group of Manufacturing Example 3 compared to the other experimental groups.
  • the calcium salt treatment group of Manufacturing Example 3 showed a higher expression of Calpain 3 compared to the other experimental groups, and the expression of PDK-4 and GDF-15 was suppressed.
  • C2C12 cells were seeded in 6-well plates at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days. After confirming that the cells had differentiated, dexamethasone (Dex) was treated at a set concentration to set the experimental group. After culturing for 72 hours, the image stained with crystal violet staining is summarized in Fig. 37(a). The scale bar inserted in Fig. 37(a) represents a horizontal length of 50 ⁇ m. The image was used to measure the myotube diameter using Image J to confirm the change in myotube cell diameter, which is shown in Fig. 37(b).
  • FBS fetal bovine serum
  • C2C12 cells were seeded in 6-well plates at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days. After differentiation was confirmed, the normal control group (UCM) was treated with 1 ⁇ M dexamethasone and cultured for 72 hours. The cells were harvested and subjected to Western blotting for related markers, which are shown in Figure 38.
  • FBS fetal bovine serum
  • C2C12 cells were seeded in 6-well plates at 4.0 x 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37°C and 5% CO 2 for one day. When the cell density reached approximately 80%, the cells were replaced with differentiation medium and cultured for 3 more days. After differentiation was confirmed, dexamethasone was treated at 1 ⁇ M and the calcium salts of Manufacturing Examples 1 to 3 were treated at the set concentrations to set the experimental groups. After culturing for 72 hours, the cells were harvested and analyzed by Western blotting, and the results are summarized in Fig. 39 (Manufacturing Example 1), Fig. 41 (Manufacturing Example 2), and Fig. 43 (Manufacturing Example 3).
  • FBS fetal bovine serum
  • Fig. 40 markers related to muscle breakdown and differentiation, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, and Calpain 3, PDK-4, and GDF-15, included in each experimental group, were analyzed through Western blotting, and the relative expression levels of each marker are shown in Fig. 40 (Preparation Example 1), Fig. 42 (Preparation Example 2), and Fig. 44 (Preparation Example 3).
  • Asc-Ca-DCA IV PO PK parameters 200 mg/kg 200 mg/kg 500 mg/kg 2000 mg/kg (1000 mg/kg, BID) 1 day 6 days 1 day 6 days 1 day 6 days 1 day 6 days AUC last ( ⁇ g ⁇ h/mL) 19.77 7.98 38.78 34.62 353.65 147.85 889.77 575.25
  • C max ( ⁇ g/mL) 30.24 2.70 23.91 6.26 66.44 21.28 130.92 77.20 T max (h) 0.25 0.00 0.50 0.00 1.50 0.00 1.75 0.00 t 1/2 (h) 0.27 2.72 0.59 2.72 4.14 5.58 5.64 3.11
  • the blood concentration of calcium salt was well analyzed regardless of the administration route and concentration in the test groups administered with Manufacturing Example 1, so that specific values for pharmacodynamic factors could be confirmed. From this, it can be judged that the calcium salt according to Manufacturing Example can be maintained in the subject's body for a certain period of time and provide the multimodal effect described above.
  • a syngeneic model was created by subcutaneously transplanting CT26 mouse colon cancer cell line into Balb/c mice, and then the calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1 was administered for a total of 21 days.
  • the mice were sacrificed, and at autopsy, the quadriceps skeletal muscle was extracted, the tissue was pulverized, and proteins were extracted using RIPA lysis buffer, and the results were analyzed by Western blot, which is summarized in Figure 45.
  • G1 is a normal control group without tumor
  • G2 is a vehicle control group that administered only vehicle (water for injection or saline) to the cachexia model
  • G3 is a megestrol oral administration group (125 mpk) that administered megestrol to the cachexia model
  • G4 is a Preparation Example 1 oral administration group (200 mpk) that administered Preparation Example 1 to the cachexia model
  • G5 is a Preparation Example 1 intravenous administration group (100 mpk) that administered Preparation Example 1 to the cachexia model
  • G6 is a Preparation Example 1 intravenous administration group (200 mpk) that administered Preparation Example 1 to the cachexia model.
  • G4 to G6 treated with Manufacturing Example 1 showed decreased expression levels of muscle degradation markers MuRF1 and Atrogin1 and increased expression levels of muscle differentiation markers MyHC and Myogenin, compared to G2, the excipient control group.
  • G4 to G6 treated with Manufacturing Example 1 showed excellent effects of decreasing Atrogin1 expression and increasing Myogenin expression compared to G3, the cachexia treatment group treated with megestrol, and similar effects of regulating MuRF1 and MyHC expression.
  • a syngeneic model was created by subcutaneously transplanting CT26 mouse colon cancer cell line into Balb/c mice, and then the calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1 was administered for a total of 21 days.
  • the mice were sacrificed, and at autopsy, the quadriceps skeletal muscle was extracted, and after tissue pulverization, proteins were extracted using RIPA lysis buffer, and the results of Western blot analysis were summarized in Figure 47(a).
  • G1 is the normal control group
  • G2 is the excipient control group
  • G3 is the megestrol oral administration group (125 mpk)
  • G4 is the manufacturing example 1 oral administration group (200 mpk)
  • G5 is the manufacturing example 1 intravenous administration group (100 mpk)
  • G6 is the manufacturing example 1 intravenous administration group (200 mpk).
  • a syngeneic model was created by subcutaneously transplanting CT26 mouse colon cancer cell line into Balb/c mice, and then the calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1 was administered for a total of 21 days. The mice were sacrificed, and the serum collected at autopsy was used to analyze IL-1 ⁇ and lactic acid, and the results are summarized in Fig. 48(a) and (b).
  • G1 is the normal control group
  • G2 is the excipient control group
  • G3 is the oral megestrol administration group (125 mpk)
  • G4 is the oral administration group of Manufacturing Example 1 (200 mpk)
  • G5 is the intravenous administration group of Manufacturing Example 1 (100 mpk)
  • G6 is the intravenous administration group of Manufacturing Example 1 (200 mpk).
  • G4 to G6 treated with Manufacturing Example 1 were confirmed to have decreased IL-1 ⁇ and lactic acid compared to G2, the excipient control group.
  • the cachexia treatment group, megestrol, G4 to G6 were confirmed to have similar levels of IL-1 ⁇ and lactic acid reduction effects.
  • a syngeneic model was created by subcutaneously transplanting the CT26 mouse colon cancer cell line into Balb/c mice, and then the calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1 was administered for a total of 21 days.
  • the body weight change was analyzed and summarized in Figures 49(a) and (b).
  • G1 is the normal control group
  • G2 is the excipient control group
  • G3 is the oral megestrol administration group (125 mpk)
  • G4 is the oral administration group of Manufacturing Example 1 (200 mpk)
  • G5 is the intravenous administration group of Manufacturing Example 1 (100 mpk)
  • G6 is the intravenous administration group of Manufacturing Example 1 (200 mpk).
  • the body weight loss rate of the excipient control group G2 compared to the normal control group G1 on the 17th day was approximately 8.4%, and on the 20th day it was approximately 13.3% (p ⁇ 0.01 or p ⁇ 0.0001).
  • the body weight increased by approximately 6% on the 17th day and 13% on the 20th day compared to G2 (p ⁇ 0.05).
  • a syngeneic model was created by subcutaneously transplanting CT26 mouse colon cancer cell line into Balb/c mice, and then the calcium salt (Asc-Ca-DCA) of Manufacturing Example 1 was administered for a total of 21 days.
  • the mice were sacrificed, and three types of skeletal muscles (gastrocnemius, quadriceps, soleus) were extracted at the time of autopsy and subjected to histopathological analysis.
  • Cross-sectional images of muscle tissue were obtained, and the area of the cross-section (muscle fiber cross-sectional area; CSA) was measured, and the results are summarized in Figs. 50 to 52.
  • G1 is a normal control group
  • G2 is a vehicle control group
  • G3 is a megestrol oral administration group (125 mpk)
  • G4 is a manufacturing example 1 oral administration group (200 mpk)
  • G5 is a manufacturing example 1 intravenous administration group (100 mpk)
  • G6 is a manufacturing example 1 intravenous administration group (200 mpk).
  • the scale bars inserted in (a) to (f) of Figures 50 to 52 represent 100 ⁇ m in horizontal length.
  • G4 to G6 treated with Manufacturing Example 1 showed an increased muscle tissue cross-sectional area compared to the excipient control group G2 and a similar level to the group G3 treated with megestrol, a cachexia treatment agent.
  • a syngeneic model was created by subcutaneously transplanting CT26 mouse colon cancer cell line into Balb/c mice, and a Rotarod latency test was performed once a week before and after administration of the test substance. The animal was carefully placed on a Rotarod-treadmill (JD-A-07RA5, B.S Technolab Inc., Korea), and the rotation speed was increased at regular intervals from 4 rpm to 40 rpm while measuring for 300 seconds, and the results are summarized in Fig. 53(a).
  • the excipient control group G2 showed a value that was reduced by about 23% compared to the normal control group G1, while G6 showed a value that was improved by about 24% compared to G2.
  • G4 to G6 showed values improved by 5 to 10% compared to the excipient control group G2, and showed levels similar to those of the positive control group G3 administered with megestrol.

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Abstract

본 발명은 이온 화합물은 칼슘 양이온, 제1 음이온 및 제2 음이온을 포함하고, 상기 제1 음이온 및 상기 제2 음이온은 서로 상이한 것이며, 각각 독립적으로 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 분지쇄 아미노산 또는 이들의 유도체의 음이온인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.

Description

악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 칼슘 기반의 이온 화합물을 유효 성분으로 포함하는 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과, 상기 유효 성분을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
악액질(cachexia)은 암, 결핵, 당뇨, 에이즈, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 혈우병, 하수체기능저하증(hypopituitarism) 또는 간경화와 같은 질병에 의해 유발되는 복합 증후군이다. 악액질은 영양 보충만으로 회복되지 않거나 회복율이 낮으며, 식욕 감퇴나 지속적인 근손실을 유발하여 쇠약 상태 또는 사망에 이르게 한다.
악액질의 유병률은 심부전 환자에서 대략 10% 수준이나, 암 환자에게서는 50% 이상으로 나타난다. 소화기암(gastrointestinal cancer) 환자의 약 70%에서 악액질 증상이 나타나며, 암의 종류와 무관하게 말기암 환자의 80% 이상에서 악액질 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 암의 치료 방법은 외과적 수술, 방사선 치료 및 화학 요법으로 구분되는데, 침습적 치료가 어려워지는 말기 단계에서는 방사선 치료나 화학 요법을 적용함에 따라 환자의 영양 상태와 면역 기능이 저하되어 악액질이 발병하거나 악화 속도가 증가하게 된다. 만성 폐쇄성 폐질환 환자의 악액질 사망률은 대략 20%, 심부전 환자의 사망률은 대략 30%인데 비해, 암 환자의 악액질 사망률은 최대 80%에 이르기 때문에 원인 질병의 치료만큼 악액질의 치료의 중요성이 주목받고 있다.
악액질의 정확한 발생 메커니즘이 규명되지 않았기 때문에, 기존에는 악액질 치료를 위해 영양 공급량을 늘리거나, 메게스트롤 아세테이트와 같은 식욕 증강제를 사용하는 치료법이 적용되었다. 그러나, 상기 치료법은 일시적으로 체중이 증가하였다가 다시 감소하거나, 체중 증가에도 불구하고 신체 능력이 개선되지 못하는 문제가 있었으며, 장기 사용시 발기부전, 자궁출혈, 혈전색전증, 부종, 고혈당증, 부신기능저하, 고혈압과 같은 부작용이 나타나는 한계가 있었다. 이에 따라, 악액질과 근손실의 메커니즘 이해를 바탕으로 한 완전히 새로운 치료 방법에 대한 접근이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 악액질의 주요 증상인 근손실의 발생 및 악화 메커니즘을 고려하여, 악액질이 다인성 질환(multifactorial disease)임에 착안하여 다중모달 방식(multimodal)으로 작용하는 유효 성분과 이를 포함하는 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유효 성분을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면은 이온 화합물을 포함하는 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 이온 화합물은 칼슘 양이온, 제1 음이온 및 제2 음이온을 포함하고, 상기 제1 음이온 및 상기 제2 음이온은 서로 상이한 것이며, 각각 독립적으로 아스코빅산(Ascorbic acid), 다이클로로아세트산(Dichloroacetic acid), 분지쇄 아미노산(Branched-chain amino acid) 또는 이들의 유도체의 음이온인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 분지쇄 아미노산은 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine) 및 발린(Valine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 이온 화합물이 20 내지 4800 mg/kg/일의 투여량으로 투여되는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 수성 용매를 더 포함하고, 상기 이온 화합물의 해리도가 1 내지 50%일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 식욕증진제, 항암제, 염증완화제, 항균제, 항진균제, 항바이러스제, 면역조절제, 스테로이드제, 항응고제, 항경련제, 항우울제, 항산화제 및 비타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 액제, 산제, 경구제, 주사제, 수액제, 에어로졸, 정제, 캡슐제, 환제, 데포제 또는 좌제로 제형화될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여, 정맥 내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여 또는 점막 투여될 수 있다.
상기 악액질 및 근손실은 암, 결핵, 당뇨, 에이즈, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 혈우병, 하수체기능저하증(hypopituitarism) 또는 간경화에 의해 유발될 수 있다.
상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 간암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 신장암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 근손실은 노인성근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 근무력증(myasthenia gravis)에 의해 유발될 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은 이온 화합물을 포함하는 식품 조성물로서, 상기 이온 화합물은 칼슘 양이온, 제1 음이온 및 제2 음이온을 포함하고, 상기 제1 음이온 및 상기 제2 음이온은 서로 상이한 것이며, 각각 독립적으로 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 분지쇄 아미노산 또는 이들의 유도체의 음이온인, 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 (1) 에너지 대사에 의한 이화 작용(catabolism), (2) 근육 항상성(muscle homeostasis)의 붕괴, 및 (3) 염증 인자에 의한 근손실을 동시에 억제하는 다중모달 방식의 악액질 및 근손실 예방, 개선 또는 치료 효과를 제공한다.
상기 조성물은 상기 다중모달 방식에 따라 투여 대상의 식욕 저하를 억제하거나, 체중을 유지 또는 증진하거나, 체중 변화량을 저감시킬 수 있고, 근손실을 저감하거나 증가시킬 수 있고, 근육의 기능을 개선할 수 있다.
도 1은 (a) 제조예 1의 칼슘염, (b) 제조예 2의 칼슘염, (c) 제조예 3의 칼슘염의 C2C12 분화 전 세포에 대한 세포 독성 실험 결과이다.
도 2는 (a) 제조예 1의 칼슘염, (b) 제조예 2의 칼슘염, (c) 제조예 3의 칼슘염의 C2C12 분화 후 세포에 대한 세포 독성 실험 결과이다.
도 3(a)는 정상 대조군(UCM), (b)는 암 세포 배양 배지 처리군(CCM)의 근관의 크리스탈 바이올렛 염색 이미지이며, (c)는 Image J로 상기 (a), (b)의 근관 직경을 측정한 결과이다.
도 4는 정상 대조군(UCM)과 암 세포 배양 배지 처리군(CCM)에 포함된 근육 분해 및 분화에 연관된 마커의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 5는 도 4의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) MuRF-1, (b) Atrogin-1, (c) MyHC, (d) Myogenin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 제조예 1의 칼슘염 처리 농도에 따른 타겟 마커 PDK-4의 (a) 웨스턴 블랏 결과, (b) 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 제조예 1의 칼슘염 처리 농도에 따른 타겟 마커 Calpain 3의 (a) 웨스턴 블랏 결과, (b) 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 제조예 2의 칼슘염 처리 농도에 따른 타겟 마커의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 9는 도 8의 웨스턴 블랏 결과로부터 타겟 마커인 (a) Calpain 3, (b) PDK-4, (c) GDF-15의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 제조예 3의 칼슘염 처리 농도에 따른 타겟 마커의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 11은 도 10의 웨스턴 블랏 결과로부터 타겟 마커인 (a) Calpain 3, (b) PDK-4, (c) GDF-15의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 근관 세포에 암 세포 배양 배지를 처리하였을 때(CCM) 타겟 마커 PDK-4의 (a) 웨스턴 블랏 결과, (b) 상대적 발현량을 나타낸 그래프, 타겟 마커 Calpain 3의 (c) 웨스턴 블랏 결과, (d) 상대적 발현량을 나타낸 그래프, 타겟 마커 GDF-15의 (e) 웨스턴 블랏 결과, (f) 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13(a)는 정상 대조군(UCM)의 C2C12 세포주 크리스탈 바이올렛 염색 이미지이고, (b)는 PDK-4 활성제인 WY-14643 처리군의 이미지이며, (c)는 Image J로 상기 (a) 및 (b)의 근관 직경을 측정한 결과이다.
도 14는 도 13에서 사용한 정상 대조군(UCM)과 WY-14643 처리군에서 타겟 마커들(PDK-4, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin)의 (a) 웨스턴 블랏 결과, (b) 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 15(a)는 정상 대조군(UCM)의 C2C12 세포주 크리스탈 바이올렛 염색 이미지이고, (b)는 vehicle 대조군으로서 scrambled siRNA로 형질주입한 군의 이미지이며, (c)는 Calpain 3 siRNA로 형질주입한 군의 이미지이며, (d)는 Image J로 상기 (a) 내지 (c)의 근관 직경을 측정한 결과이다.
도 16은 도 15에서 사용한 정상 대조군(UCM), vehicle 대조군(scrambled siRNA) 및 Calpain 3 siRNA 처리군에서 타겟 마커들(Calpain 3, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin)의 (a) 웨스턴 블랏 결과, (b) 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 17(a)는 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM)과 CCM에 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 처리한 실험군의 C2C12 세포주 크리스탈 바이올렛 염색 이미지이고, (b)는 Image J로 상기 (a)의 근관 직경을 측정한 결과이다.
도 18은 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM)과 CCM에 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 처리한 실험군의 C2C12 세포주의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 19는 도 18의 웨스턴 블랏 결과로부터 타겟 마커인 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 20은 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM)과 CCM에 제조예 2의 칼슘염(Asc-Ca-Leu)을 처리한 실험군의 C2C12 세포주의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 21은 도 20의 웨스턴 블랏 결과로부터 타겟 마커인 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 22는 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM)과 CCM에 제조예 3의 칼슘염(DCA-Ca-Leu)을 처리한 실험군의 C2C12 세포주의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 23은 도 22의 웨스턴 블랏 결과로부터 타겟 마커인 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 24(a)는 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM), CCM에 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 처리한 실험군, CCM에 아스코빅산(Asc) 처리군, CCM에 다이클로로아세트산(DCA) 처리군, CCM에 아스코빅산 및 다이클로로아세트산 조합 처리군의 C2C12 세포주 크리스탈 바이올렛 염색 이미지이고, (b)는 Image J로 상기 (a)의 각 군의 근관 직경을 측정한 결과이다.
도 25는 도 24의 처리군에서 타겟 마커로서 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 26은 도 25의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 27은 도 24의 처리군에서 타겟 마커로서 Calpain 3, PDK-4, GDF-15에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 28은 도 27의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) Calpain 3, (b) PDK-4, (c) GDF-15의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 29는 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM), CCM에 제조예 2의 칼슘염(Asc-Ca-Leu)을 처리한 실험군, CCM에 아스코빅산(Asc) 처리군, CCM에 류신(Leu) 처리군, CCM에 아스코빅산 및 류신 조합 처리군에서 타겟 마커로서 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 30은 도 29의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 31은 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM), CCM에 제조예 2의 칼슘염(Asc-Ca-Leu)을 처리한 실험군, CCM에 아스코빅산(Asc) 처리군, CCM에 류신(Leu) 처리군, CCM에 아스코빅산 및 류신 조합 처리군에서 타겟 마커로서 Calpain 3, PDK-4, GDF-15에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 32는 도 31의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) Calpain 3, (b) PDK-4, (c) GDF-15의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 33은 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM), CCM에 제조예 3의 칼슘염(DCA-Ca-Leu)을 처리한 실험군, CCM에 다이클로로아세트산(DCA) 처리군, CCM에 류신(Leu) 처리군, CCM에 다이클로로아세트산 및 류신 조합 처리군에서 타겟 마커로서 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 34는 도 33의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 35는 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM), CCM에 제조예 3의 칼슘염(DCA-Ca-Leu)을 처리한 실험군, CCM에 다이클로로아세트산(DCA) 처리군, CCM에 류신(Leu) 처리군, CCM에 다이클로로아세트산 및 류신 조합 처리군에서 타겟 마커로서 Calpain 3, PDK-4, GDF-15에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 36은 도 35의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) Calpain 3, (b) PDK-4, (c) GDF-15의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 37은 (a) 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM), UCM에 덱사메타손(Dex)을 처리한 실험군의 근관 크리스탈 바이올렛 염색 이미지이고, (b)는 Image J로 상기 (a)의 근관 직경 사이즈를 측정한 결과이다.
도 38은 정상 대조군(UCM), 암 세포 배양 배지 처리군(CCM), UCM에 덱사메타손(Dex)을 처리한 실험군에서 타겟 마커로서 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, Calpain 3, PDK-4, GDF-15에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 39는 정상 대조군(UCM), UCM에 덱사메타손을 처리한 실험군(Dex) 및 Dex에 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 처리한 실험군에서 타겟 마커로서 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, Calpain 3, PDK-4, GDF-15에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 40은 도 39의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin, (e) Calpain 3, (f) PDK-4, (g) GDF-15의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 41은 정상 대조군(UCM), UCM에 덱사메타손을 처리한 실험군(Dex) 및 Dex에 제조예 2의 칼슘염(Asc-Ca-Leu)을 처리한 실험군에서 타겟 마커로서 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, Calpain 3, PDK-4, GDF-15에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 42은 도 41의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin, (e) Calpain 3, (f) PDK-4, (g) GDF-15의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 43은 정상 대조군(UCM), UCM에 덱사메타손을 처리한 실험군(Dex) 및 Dex에 제조예 3의 칼슘염(DCA-Ca-Leu)을 처리한 실험군에서 타겟 마커로서 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin, Calpain 3, PDK-4, GDF-15에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 44는 도 43의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin, (e) Calpain 3, (f) PDK-4, (g) GDF-15의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
하기 도 45 내지 도 53에서 G1은 정상 대조군, G2는 부형제 대조군, G3는 메게스트롤 경구 투여군(125 mpk), G4는 제조예 1 경구 투여군(200 mpk), G5는 제조예 1 정맥 투여군(100 mpk), G6는 제조예 1 정맥 투여군(200 mpk)을 의미한다.
도 45는 마우스의 근육 조직에서 타겟 마커로 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 46은 도 45의 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) MuRF1, (b) Atrogin1, (c) MyHC, (d) Myogenin의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 47은 마우스 근육 조직에서 타겟 마커로 Calpain 3, PDK-4에 대한 웨스턴 블랏 결과이며, 상기 웨스턴 블랏 결과로부터 (b) Calpain 3, (c) PDK-4의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 48은 마우스 혈액에서 측정된 (a) IL-1β, (b) 젖산의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 49는 마우스의 체중 감소 억제 효과를 (a) 시간 경과, (b) 실험군에 따라 나타낸 그래프이다.
도 50의 (a) 내지 (f)는 각각 실험군 G1 내지 G6의 마우스의 gastrocnemius의 횡단면을 나타낸 이미지이며, (g)는 상기 (a) 내지 (f)로부터 단면적을 정리한 그래프이다.
도 51의 (a) 내지 (f)는 각각 실험군 G1 내지 G6의 마우스의 quadriceps의 횡단면을 나타낸 이미지이며, (g)는 상기 (a) 내지 (f)로부터 단면적을 정리한 그래프이다.
도 52의 (a) 내지 (f)는 각각 실험군 G1 내지 G6의 마우스의 soleus의 횡단면을 나타낸 이미지이며, (g)는 상기 (a) 내지 (f)로부터 단면적을 정리한 그래프이다.
도 53(a)는 마우스의 Rotarod-treadmill 시험 결과이며, (b)는 마우스의 Wire hanging 시험 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 각 구성을 보다 상세히 설명하나, 이는 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명의 권리범위가 다음 내용에 의해 제한되지 아니한다.
본 명세서에 사용된 "포함한다"는 용어는 본 발명에 유용한 재료, 조성물, 장치, 및 방법들을 나열할 때 사용되며 그 나열된 예에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "약", "실질적으로"는 고유한 제조 및 물질 허용 오차를 감안하여, 그 수치나 정도의 범주 또는 이에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용된 "대상"이라는 용어는 악액질과 근손실 중 어느 하나 이상의 증상을 나타내는 포유동물을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "치료"이라는 용어는 본 발명의 일 구체례에 따른 조성물을 대상에 투여하여 악액질과 근손실 중 어느 하나 이상의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 구체례는 이온 화합물을 포함하는 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 이온 화합물은 칼슘 양이온, 제1 음이온 및 제2 음이온을 포함하고, 상기 제1 음이온 및 상기 제2 음이온은 서로 상이한 것이며, 각각 독립적으로 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 분지쇄 아미노산 또는 이들의 유도체의 음이온인 것을 제공한다.
이온 화합물은 정전기력에 의해 서로 반대 전하를 갖는 이온들이 이온 결합을 형성한 화합물을 의미하며, 전기적인 중성을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 상기 이온 화합물은 Ca2+ 이온(칼슘 이온)의 양쪽에 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 분지쇄 아미노산 및 이들의 유도체의 음이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개의 음이온이 각각 이온 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이온 화합물은 칼슘 이온의 양쪽에 아스코빅산, 다이클로로아세트산 및 분지쇄 아미노산의 음이온으로부터 선택되는 서로 상이한 두 개의 음이온이 이온 결합된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 이온 화합물은 아스코빅산과 다이클로로아세트산의 칼슘염; 아스코빅산과 분지쇄 아미노산의 칼슘염; 다이클로로아세트산과 분지쇄 아미노산의 칼슘염을 포함할 수 있다.
상기 분지쇄 아미노산(Branched-chain amino acid; BCAA)은 류신, 이소류신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 분지쇄 아미노산은 단백질의 합성과 전환에 기여할 수 있다. 바람직하게는 상기 분지쇄 아미노산은 류신일 수 있다. 예를 들어, 상기 이온 화합물은 아스코빅산과 류신의 칼슘염, 다이클로로아세트산과 류신의 칼슘염을 포함할 수 있다.
상기 이온 화합물은 악액질 및 근손실에 관한 다음 세 가지의 메커니즘을 동시에 제공하여, 다인성 질환인 악액질 및 근손실에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 제공한다:
(1) 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 에너지 대사에 의한 이화 작용을 억제하여, 불필요한 에너지 소비에 의한 체중 감소를 방지할 수 있다.
예를 들어, 악액질 및 근손실의 원인이 되는 암의 경우, 암 세포는 산소를 필요로 하는 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)와 산소를 사용하지 않는 해당작용(glycolysis)을 통해 에너지 대사를 수행할 수 있다. 특히, 암세포는 해당작용을 주로 이용하여 정상적인 세포가 생존할 수 없는 저산소(hypoxia) 환경에서도 생존하며, 미토콘드리아로부터 시작되는 세포사멸 조절 과정이 비활성화된다. 암 세포의 해당작용이 항진되면 간에서 글리코겐이 젖산(lactic acid)으로 분해된다. 젖산은 젖산탈수소효소(LDH)에 의해 피루브산으로 변환될 수 있으며, 피루브산은 옥살로아세트산 및 말산을 거쳐, 포스포에놀피루브산 카르복실인산화효소에 의해 포스포에놀피루브산(PEP)로 전환된다. 포스포에놀피루브산으로부터 프럭토스-1,6-바이포스페이트(fructose-1,6-biphosphate)가 생성되며, 프럭토스-1,6-바이포스페이트는 프럭토스-6-포스페이트(fructose-6-phosphate)로 전환된 후, 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)를 거쳐 포도당(glucose)으로 전환된다. 상기 일련의 과정을 포도당 신생 합성(gluconeogenesis)으로 지칭하며, 포도당 1 분자를 생성하는 데에 총 4 ATP 및 2 GTP가 소요된다. 결과적으로 암 세포의 해당작용 항진은 포도당 신생 합성의 항진을 유발하여 체내 불필요한 에너지 낭비로 이어져 체중 감소의 원인이 된다.
상기 이온 화합물에 포함된 아스코빅산(L-ascorbic acid; Asc)은 비타민 C로 널리 알려진 물질로, 발견 초기에는 괴혈병(scurvy)의 예방 및 치료예 사용되었으나, 강력한 환원력과 특정한 신경전달물질의 생산에 관여하는 등 다른 기능이 밝혀지면서 제약, 식품, 화장품 등 다양한 분야에 활용되고 있다. 아스코빅산은 전자 공여 능력이 우수하여 항산화 작용과 활성산소의 제거, 노화 예방 능력이 우수할 뿐만 아니라 체내에서 다양한 효소의 조효소로 작용할 수 있다. 특히, 아스코빅산은 프롤릴 하이드록실라제(prolyl hydroxylase)라는 효소에 대해 조효소로 작용할 수 있다. 프롤릴 하이드록실라제는 아스코빅산에 의해 활성화되어 HIF-1α 단백질의 프폴린 잔기를 수산화시켜 제거할 수 있다. HIF-1α 단백질은 이형질복합체(heterodimer)인 HIF-1(hypoxia inducible factor-1)를 구성하는 소단위체(subunit)로, 에너지 대사와 신생혈관 형성의 제어에 관여한다. 암 세포는 에너지와 인근의 산소를 많이 소모하기 때문에, HIF-1α 단백질의 혈관 신생 기능을 통한 산소 공급을 필요로 한다. 따라서, 아스코빅산의 투여에 따른 HIF-1α 단백질의 감소는 암 세포의 성장에 불리한 환경을 만들어 종양 성장에 대한 억제 효과를 제공함과 동시에, 포도당 신생 합성의 메커니즘을 억제하여 불필요한 에너지 소모를 줄임으로써 체중 감소를 방지할 수 있게 된다.
상기 이온 화합물에 포함된 다이클로로아세트산(dichloroacetic acid; DCA)은 염의 형태로 제공될 때 미토콘드리아 이상에 의한 대사성 질환에 대한 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 암 세포는 저산소 유도인자인 HIF-1이 피루브산 탈수소효소 키나아제(PDK)의 발현을 항진하고 있기 때문에, 피루브산이 아세틸-CoA로 변환되지 못하는 상태이다. 다이클로로아세트산 나트륨은 피루브산 탈수소효소 키나아제(PDK) 저해를 통해 피루브산 탈수소효소(PDH)의 활성을 높여 피루브산이 아세틸-CoA로 변환되도록하여, 미토콘드리아 내에서 산화적 인산화를 활성화할 수 있다. 상기 이온 화합물의 투여를 통한 다이클로로아세트산염의 제공은 암 세포의 미토콘드리아에서의 산화적 인산화 활성을 통해 해당과정을 억제하여 젖산 방출과 포도당 신생 합성을 억제할 분만 아니라, 암 세포의 세포사멸(apoptotic cell death)을 유도할 수 있다. 이러한 과정은 암 세포에서 미토콘드리아의 정상 기능을 수행하도록 하는 미토콘드리아 리포밍(mitochondrial reforming)으로 지칭할 수 있다. 상기 이온 화합물은 미토콘드리아 리포밍을 통해 암 세포의 성장 억제와 암 주변 환경의 변화를 통해 포도당 신생 합성을 억제하고 혈중 포도당 농도를 감소시켜 체중 감소를 억제할 수 있게 된다.
상기 이온 화합물에 포함된 분지쇄 아미노산의 일종으로서 류신(leucine, Leu)은 단백질의 생합성에 사용되는 필수 아미노산의 일종으로, 체내에서 합성되지 않아 식이로 공급받아야 한다. 류신은 골격근을 포함한 근육 단백질 합성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 단백질 합성시 번역 개시에 중요한 조절 인자로 작용한다. 특히, 류신은 인슐린 신호 전달 경로에 작용할 수 있다. 구체적으로, 류신은 췌장 세포에 작용하여 인슐린 분비를 직접적으로 촉진하거나, 글루카곤(glucagon)의 분비를 억제하여 혈중 포도당 농도를 감소시킬 수 있다. 인슐린은 인슐린 수용체를 활성화시키고, 인슐린 신호전달 경로를 통해 Akt 신호전달 단백질을 활성화시킬 수 있다. 활성화된 Akt는 TSC1/2 복합체를 활성화시키며, TSC1/2 복합체는 단백질 합성을 제어하는 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)을 활성화시켜 단백질 합성을 활성화할 수 있다. 인슐린 저항성 (insulin resistance)이 발생하면 인슐린 신호전달 경로는 Akt 신호전달 단백질을 충분히 활성화시키지 못해 mTORC1 또한 비활성화된다. 류신은 인슐린과 함께 mTORC1 활성에 관여하여 혈중 포도당의 농도를 조절함과 동시에 단백질 합성에 기여하게 된다. mTORC1은 AMPK와 같은 대사 관련 단백질과 상호작용하는데, 류신은 AMPK의 활성에 관여하여 GLUT4의 세포막 이동을 유도하고 포도당의 세포 내 흡수를 도울 수 있다. 상기 이온 화합물은 류신의 공급을 통해 혈중 포도당 감소 메커니즘을 활성화하고, 단백질 합성에 기여하여 체중 감소를 억제할 수 있게 된다.
상기 이온 화합물에 포함된 칼슘 이온은 암 세포의 칼슘 항상성에 영향을 주어 암 세포사멸을 유발할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물의 투여에 따라 암 세포 내 미토콘드리아에 칼슘이 축적되고, 암 세포 내 과량의 활성 산소가 발생하여 세포 자멸사(apoptosis)에 의한 세포사멸(apoptotic cell death)이 될 수 있다. 칼슘 이온은 α-KGDC(ketoglutarate dehydrogenase complex)와 직접적인 결합을 형성하여 TCA 회로에 대한 조절 인자로 작용할 수 있다. 상기 이온 화합물은 칼슘의 공급을 통해 암 세포 내 칼슘 이온 농도를 과도하게 증가시키며, 이는 엔도뉴클레아제(endonuclease)와 프로테아제(protease)의 활성을 통해 미토콘드리아의 대사 장애를 유발하여 시토크롬 c(cytochrome c)의 방출을 촉진할 수 있다. 시토크롬 c의 방출은 카스파아제-9(caspase-9)를 활성화하고 카스파아제 3과 7 또한 활성화되어 암 세포의 자멸사가 일어나게 된다.
상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 칼슘 이온과 전술한 음이온 중에 선택되는 제1 음이온 및 제2 음이온이 암 세포의 자멸사, 불필요한 에너지 소비 감소, 혈중 포도당 감소 메커니즘의 활성화, 단백질 합성 활성화 중 하나 이상에 대해 복합적으로 기여하여, 악액질 및 근손실에 대한 다중모달 예방 또는 치료제로 작용할 수 있다.
상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 처리에 따른 효과는 타겟 마커로서 PDK의 발현량을 확인하여 평가할 수 있다. 구체적으로, 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하였을 때, 악액질 또는 근손실을 겪는 대상에서의 PDK-4(PDK4) 발현량이 감소하는 것으로 나타날 수 있다. PDK-4 발현량의 감소는 미토콘드리아 내 산화적 인산화의 활성화를 의미하며, 체내 불필요한 대사의 감소와 혈중 포도당 농도의 감소를 내포할 수 있다.
(2) 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 근육 항상성을 유지하여, 근육량의 감소를 방지할 수 있다.
근육량의 감소는 관련 유전자의 이상, 호르몬 불균형, 심한 부상, 패혈증, 암 및 노화로 인한 여러 가지 이화 상태(catabolic condition)에서 발생하는 근육세포와 근조직의 크기 감소를 의미한다.
상기 이온 화합물에 포함된 아스코빅산은 악액질에 관련된 지표인 GDF15(growth differentiation factor 15, GDF-15)의 발현량을 감소시킬 수 있다. GDF15는 비만, 당뇨에 관련된 마커로 알려졌으나, 최근에는 임상에서 악액질 환자의 경우 건강한 사람 대비 GDF15 수치가 높다는 것이 밝혀지면서 GDF15의 발현이 악액질과 연관되어 있는 것으로 주목받고 있다. HIF-1에 의해 GDF15 수치가 증가할 수 있어, 아스코빅산의 투여에 따른 HIF-1의 감소는 GDF15의 발현량을 감소시켜 악액질의 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 또한, 상기 이온 화합물에 포함된 다이클로로아세트산은 미토콘드리아의 메커니즘을 정상화(reforming)시킬 수 있어, GDF의 발현량을 감소시킬 수 있으며, 아스코빅산과 함께 투여되는 경우 악액질의 예방 또는 치료 효과에 대한 상승 효과를 유발할 수 있다.
상기 이온 화합물에 포함된 다이클로로아세트산은 혈중 포도당 농도 감소를 통한 포도당 신생 합성 과정을 억제할 수 있다. 근육량 감소의 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않았지만, 코리 회로(Cori-cycle)가 이에 연관된 것으로 여겨지고 있다. 근육 세포에서 혐기적인 포도당 분해가 일어나면 해당 과정을 통해 젖산이 생성될 수 있으며, 젖산은 간으로 이동하여 포도당 신생 합성에 의해 포도당이 생성되어 다시 근육 세포에 공급되어 에너지원으로 활용될 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 포도당 신생 합성 과정은 불필요한 에너지 낭비 및 근육 손실을 유발하게 된다. 다이클로로아세트산염은 코리 회로의 메커니즘 또한 억제하여 근육 손실 예방 효과를 제공할 수 있다. 근육량 감소를 보이는 동물의 근육 조직 및 근관 세포에서는 정상 조직 및 세포 대비 PDK-4가 과발현되어 있을 수 있다. 다이클로로아세트산염은 전술한 대사 조절 기능과 함께 근육 손실시 근육 내에서 특이적으로 나타나는 과발현된 PDK-4의 발현량을 낮추어 근육 손실에 대한 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다.
또한, 전술한 것과 같이 근육의 감소와 GDF15의 발현량에 연관성이 있는 것으로 알려져 있는데, 상기 연관성에 대해 미토콘드리아의 기능 이상이 주요 매개 기전으로 작용하는 것으로 확인된다. 미토콘드리아의 기능 장애는 내부 전자 전달계의 결함이나 산화 스트레스에 의한 미토콘드리아의 손상에 의해 유발될 수 있으며, 산화 스트레스에 의한 염증 반응이 증가함에 따라 GDF15의 발현량이 증가할 수 있다. 다이클로로아세트산염은 미토콘드리아의 리포밍을 통해 미토콘드리아의 기능 장애를 개선하여 GDF15의 발현량을 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 미토콘드리아의 기능에 관련된 전사 인자로서 PGC-1α는 세포의 에너지 대사를 조절하는데, 다이클로로아세트산염은 상기 PGC-1α에 영향을 주고, 상기 PGC-1α에 기전적으로 연관된 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시켜 세포 내 에너지 상태와 대사를 조절할 수 있다. 이처럼 다이클로로아세트산염은 PDK, PDH와 연계된 미토콘드리아 리포밍 기전과 에너지 대사 및 미토콘드리아 기능에 작용하는 인자들에 영향을 주어 복합적으로 미토콘드리아 기능 정상화에 기여하며, 이를 통해 GDF15 발현량을 감소시켜 악액질 및 근육 감소와 관련된 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다.
상기 이온 화합물에 포함된 분지쇄 아미노산의 일종으로서 류신은 근육 합성에 관련된 IGF-1/PI3K/Akt 메커니즘에 관여하여 단백질의 합성과 세포 성장 효과를 제공할 수 있다. 인슐린 유사 성장인자-1(insulin like growth factor-1; IGF-1)는 인슐린과 유사한 부자 구조를 갖는 호르몬으로, 신체의 성장, 유지 및 대사에 관여한다. IGF-1은 PI3K/Akt 신호 전달 경로를 통해 mTORC1 활성화에 기여한다. 류신은 인슐린 전달 경로와 IGF/PI3K/Akt 메커니즘을 통해 mTORC1을 활성화시켜, 혈중 포도당 농도를 감소시키고 단백질 합성을 활성화시킬 수 있다.
상기 이온 화합물에 포함된 칼슘 이온은 근육 발현에 연관된 칼페인 3(calpain 3)의 발현량을 증가시켜 근육의 구조와 기능을 향상시킬 수 있다. 칼페인 3 은 칼슘 의존성이 있는 비-리소좀 시스테인 프로테아제의 일종으로 발현량이 적어지면 근육의 손실을 유발하는 것으로 알려져 있다. 칼페인 3은 조직 또는 섬유 아세포 내에서 단백질의 구조를 제어하고, 근육 섬유의 성장과 형상 유지에 중요한 역할을 한다. 칼페인 3에 연관된 유전자 변이는 근육 섬유 내의 단백질인 디스트로핀 (dystrophin)의 결핍을 야기하여 근육의 힘과 운동 능력을 상실하는 Duchenne 근육 이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 근육 조직의 변성과 근육 섬유의 손상으로 근력이 약화되는 지대 근디스트로피 (Limb girdle muscular dystrophy, LGMD)과 같은 근육 질환을 야기할 수 있다. 상기 이온 화합물은 칼슘의 공급을 통해 악액질 및 근손실 뿐만 아니라 근육 관련 질환에 직접적인 영향을 주는 마커인 칼페인 3의 발현량을 증가시켜 상기 질환의 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 또한, 상기 이온 화합물에 포함된 류신은 mTORC1의 활성화를 통해 칼페인 3의 발현을 증가시킬 수 있으며, 칼슘 이온과 함께 투여되는 경우 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료 효과에 대한 상승 효과를 유발할 수 있다.
상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 칼슘 이온과 전술한 음이온 중에 선택되는 제1 음이온 및 제2 음이온이 근육 손실 관련 마커의 발현량 조절, 혈중 포도당 농도의 감소, 단백질 합성의 활성화 중 하나 이상에 대해 복합적으로 기여하여, 악액질 및 근손실에 대한 다중모달 예방 또는 치료제로 작용할 수 있다.
상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 처리에 따른 효과는 타겟 마커로서 GDF15의 발현량, PDK-4의 발현량, 칼페인 3의 발현량 중 하나 이상을 확인하여 평가할 수 있다.
구체적으로, 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하였을 때, 악액질 또는 근손실을 겪는 대상에서의 GDF15의 발현량이 감소하는 것으로 나타날 수 있다. GDF15는 GFRAL(GDNF Family Receptor Alpha-Like)라는 수용체를 통해 신경계로 신호를 전달하여, 식욕을 억제하고 체중을 조절하는 기전을 발현하는 것으로 알려져 있다. GDF15-GFRAL의 식욕 억제 기전은 다음 세 단계로 구분할 수 있는데, 첫 번째로 전술한 미토콘드리아의 기능 장애로 인한 GDF15의 발현 증가, 두 번째로 증가된 GDF15가 GFRAL에 특이적으로 결합하여 NTS(Nucleus Tractus Solitarius)를 포함하는 뇌간(brainstem)의 특정 부위로 신호를 전달하며, 세 번째로, 상기 신호를 전달받은 뇌간에서 다양한 신경전달물질을 조절하고 식욕을 억제하게 된다. 상기 이온 화합물에 포함되는 아스코빅산 및/또는 다이클로로아세트산은 상기 기전의 시발점으로서 첫 번째 단계인 GDF15의 발현량을 감소시켜 식욕 억제에 대한 근본적인 치료 효과를 제공할 수 있다.
구체적으로, 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하였을 때, 악액질 또는 근손실을 겪는 대상에서의 PDK-4의 발현량이 감소하는 것으로 나타날 수 있다.
구체적으로, 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하였을 때, 악액질 또는 근손실을 겪는 대상에서의 칼페인 3의 발현량이 증가하는 것으로 나타날 수 있다. 칼페인 3는 칼슘에 의한 근육 단백질 분해와 관련된 기전에 영향을 줄 수 있으며, 세포사멸(apoptosis) 과정에 관련된 단백질인 c-FLIP(Caspase-8 Long Isoform)에 영향을 주어 근육 감소에 영향을 줄 수 있다. 칼페인 3는 근육세포에서 발현되어 c-FLIP의 분해를 억제하여, caspase-8의 기능을 억제할 수 있다. caspase-8의 억제는 세포사멸의 억제로 이어져 근육의 감소를 방지하고 근육 세포의 구조적 안정성을 유지할 수 있다. 칼페인 3은 c-FLIP뿐 아니라 근육의 감소와 관련된 단백질인 미오스타틴(myostatin)과의 상호작용을 통해 근육 감소를 예방할 수 있다. 상기 이온 화합물은 칼페인 3의 발현량 증가를 통해 근손실에 대한 예방 효과를 제공할 수 있다.
(3) 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 염증 인자에 의한 근육량의 감소를 방지할 수 있다.
염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)은 암의 종류에 무관하게 확인될 수 있으며, 근육 감소에 대한 주 원인으로 알려져 있다. 구체적으로, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터루킨-1β(interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6(IL-6)와 같은 염증 인자들이 악액질 및 근손실을 유발할 수 있다. 예를 들어, 종양 괴사 인자는 세포질에 존재하는 단백질을 분해하는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system; UPS)을 활성화하여 근육 단백질 분해를 촉진하며, 산화물을 증가시켜 근육 세포를 손상시키거나, 스트레스 단백질의 발현을 감소시켜 근육 단백질의 생성과 재생을 감소시킬 수 있다.
상기 이온 화합물에 포함된 아스코빅산은 염증성 사이토카인 분비를 억제시키며, 암 세포 성장을 직접적으로 저해하는 저독성 대사항암제의 역할을 동시에 수행하여, 염증 인자에 의해 유발되는 악액질 및 근손실에 대한 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 아스코빅산은 염증 반응을 매개하고 조절하는 대표적인 인자인 NF-κB와 COX2를 억제하여 사이토카인의 분비를 억제할 수 있다. 구체적으로, 아스코빅산은 NF-κB의 신호 전달 경로를 억제하여 사이토카인의 분비를 억제할 수 있다. 아스코빅산의 NF-κB의 신호 전달 경로 억제는 GDF15의 메커니즘 또한 억제하여 근육 감소를 예방할 수 있다. COX(cyclooxygenase)는 염증 반응의 주요 매개물인 프로스타글란딘의 아라키돈산으로의 전환을 촉매하는데, COX1은 체내에서 일정한 수준으로 발현되어 혈관의 확장, 혈류량 유지, 위 점막의 보호에 필수적인 프로스타글란딘을 생성한다. 이에 비해, COX2는 정상 조직에서 거의 발현되지 않다가 염증성 인자, 세포 성장 인자, 종양 촉진 인자 등에 의해 유도되어 다량의 프로스타글란딘을 순간적으로 생성하여 각종 염증 반응을 일으킨다. COX2는 암 세포에서 과다 발현되어 암 세포의 증식 및 전이를 촉진하고 세포 사멸을 억제하는데, 아스코빅산은 COX2의 메커니즘을 억제하여 악액질의 악화와 근손실을 방지할 수 있다.
상기 이온 화합물에 포함된 다이클로로아세트산은 체내 젖산의 방출을 감소시켜, 사이토카인의 발현을 감소시킬 수 있다. 젖산은 NF-κB 및 HIF-1의 활성화를 통해 사이토카인 및 기타 면역 반응에 관여하는 여러 효소들의 발현을 조절하는 신호 전달 경로를 조절할 수 있다. 상기 이온 화합물은 다이클로로아세트산을 공급하여 젖산의 방출 감소를 통해 사이토카인의 메커니즘을 억제하여 단백질 생성 저하를 방지할 수 있다.
상기 이온 화합물에 포함된 분지쇄 아미노산의 일종으로서 류신은 염증성 사이토카인인 종양 괴사 인자, IL-6 및 IFNγ의 분비를 억제하여, 근육 감소를 예방할 수 있다. 류신은 NF-κB의 인산화 수준을 억제하여, 사이토카인의 분비를 억제할 수 있다. 상기 이온 화합물은 류신을 공급하여 사이토카인의 메커니즘을 억제하여 단백질 생성 저하를 방지할 수 있다.
상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 제1 음이온 및 제2 음이온이 염증성 사이토카인의 분비를 억제하여, 악액질 및 근손실에 대한 다중모달 예방 또는 치료제로 작용할 수 있다.
상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 처리에 따른 효과는 타겟마커로서 GDF15의 발현량, 사이토카인의 발현량, 혈액 내 젖산의 양 중 하나 이상을 확인하여 평가할 수 있다. 구체적으로, 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하였을 때, 악액질 또는 근손실을 겪는 대상에서의 GDF15의 발현량이 감소하는 것으로 나타날 수 있다. 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하였을 때, 악액질 또는 근손실을 겪는 대상에서의 사이토카인의 발현량이 감소하는 것으로 나타날 수 있다. 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하였을 때, 악액질 또는 근손실을 겪는 대상의 혈액에서 젖산의 양이 감소하는 것으로 나타날 수 있다.
상기 이온 화합물은 20 내지 4800 mg/kg/일의 투여량으로 제공될 수 있다. 구체적으로, 상기 이온 화합물의 투여량은 500 mg/kg/일 이상 4500 mg/kg/일 이하, 1000 mg/kg/일 이상 4000 mg/kg/일 이하, 1500 mg/kg/일 이상 3500 mg/kg/일 이하 또는 2000 mg/kg/일 이상 3000 mg/kg/일 이하일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이온 화합물의 투여량은 20 mg/kg/일 이상 2000 mg/kg/일 이하일 수 있다. 상술한 이온 화합물의 투여량 범위에서 세포 독성 없이 악액질 및 근손실에 대한 유효한 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 상술한 범위에서 상기 이온 화합물의 보다 구체적인 투여량은 상기 이온 화합물의 종류, 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 상기 이온 화합물에 대한 민감도, 상기 약학적 조성물의 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간 또는 동시에 사용되는 약물의 종류와 양에 따라 결정될 수 있다.
상기 이온 화합물의 투여 빈도는 1일 1회 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상술한 범위의 투여량을 분할하여 복수 회 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 이온 화합물과 약학적으로 허용되는 수성 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 수성 용매는 증류수, 식염수, 주사액 또는 버퍼 용액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 약학적 조성물은 경구 투여용 조성물일 수 있으며, 상기 이온 화합물 20 내지 4800 mg을 증류수 1 mL에 투입하여 제조할 수 있다.
일 구체례로서, 상기 경구 투여용 약학적 조성물은 칼슘 양이온, 아스코빅산 음이온 및 다이클로로아세트산 음이온을 포함하는 이온 화합물 160 mg을 증류수 1 mL에 투입하여 제조할 수 있다.
일 구체례로서, 상기 경구 투여용 약학적 조성물은 칼슘 양이온, 아스코빅산 음이온 및 분지쇄 아미노산의 음이온을 포함하는 이온 화합물 200 mg을 증류수 1 mL에 투입하여 제조할 수 있다.
일 구체례로서, 상기 경구 투여용 약학적 조성물은 칼슘 양이온, 다이클로로아세트산 음이온 및 분지쇄 아미노산의 음이온을 포함하는 이온 화합물 480 mg을 증류수 1 mL에 투입하여 제조할 수 있다.
예를 들어, 상기 약학적 조성물은 정맥 투여용 조성물일 수 있으며, 상기 이온 화합물 20 내지 4800 mg을 주사액 1 mL에 투입하여 제조할 수 있다.
일 구체례로서, 상기 정맥 투여용 약학적 조성물은 칼슘 양이온, 아스코빅산 음이온 및 다이클로로아세트산 음이온을 포함하는 이온 화합물 80 mg을 주사액 1 mL에 투입하여 제조할 수 있다.
일 구체례로서, 상기 정맥 투여용 약학적 조성물은 칼슘 양이온, 아스코빅산 음이온 및 분지쇄 아미노산의 음이온을 포함하는 이온 화합물 100 mg을 주사액 1 mL에 투입하여 제조할 수 있다.
일 구체례로서, 상기 경구 투여용 약학적 조성물은 칼슘 양이온, 다이클로로아세트산 음이온 및 분지쇄 아미노산의 음이온을 포함하는 이온 화합물 240 mg을 주사액 1 mL에 투입하여 제조할 수 있다.
상기 이온 화합물은 상기 수성 용매와 혼합되어 이온 결합의 적어도 일부가 해리될 수 있다. 상기 이온 화합물의 해리도는 1 내지 50%일 수 있다. 상기 이온 화합물은 상기 약학적 조성물 내에서 적어도 1% 이상 해리되지 않고 그 화학적 구조를 유지할 수 있으며, 대상에 투여된 이후에도 상기 화학적 구조를 유지하여 전술한 다중모달 방식의 효과를 제공할 수 있다. 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 상기 수성 용매에 해리된 이온 화합물과, 해리되지 않고 상기 수성 용매에 분산된 이온 화합물을 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 본 발명의 이온 화합물에 포함될 수 있는 양이온과 음이온이 동일한 함량으로 포함된 수용액 대비 악액질 및 근손실에 대한 예방 또는 치료 효과가 우수할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 이온 화합물과 약학적으로 허용되는 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 활성제는 식욕증진제, 항암제, 염증완화제, 항균제, 항진균제, 항바이러스제, 면역조절제, 스테로이드제, 항응고제, 항경련제, 항우울제, 항산화제 및 비타민을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기 이온 화합물은 상기 활성제와 함께 병용하여 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 식욕증진제는 메게스트롤(megestrol), 사이프로헵타딘(cyproheptadine), 드로나비놀(dronabinol) 또는 메토클로프라마이드(metoclopramide)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 항암제는 이매티닙(Imatinib), 5-FU(5-Florouracil), 이리노테칸(Irinotecan), 서니티닙(Sunitinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 시스플라틴(Cisplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 라파티닙(Lapatinib), 트라스트주맵(Trastuzumab, Herceptin), 제피티닙(Gefitinib), 에를로티닙(Erlotinib), 메토트렉세이트(Methotrexate), 카보플라틴(Carboplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 에버롤리무스(Everolimus), 소라페닙(Sorafenib), 카르보닉 언하이드라제(carbonic anhydrase)의 억제제, 모노카르복실레이트 트랜스포터(monocarboxylate transporter)의 억제제, 펌브로 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), PD-1계열 항암제, 니볼루맙(Nivolumab), PARP-1(Poly(ADP-ribose) polymerase 1)의 억제제, PARP-2(Poly(ADP-ribose) polymerase 2)의 억제제, 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 니라파립(Niraparib), 베바시주맙(Bevacizumab) 또는 VEGF 억제제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 항암제는 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카보플라틴 등 PT 계열 항암제일 수 있다. 상기 PT 계열 항암제는 사용에 따라 대상에서 GDF15 수치를 증가시키며 악액질을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 이온 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 상기 PT 계열 항암제와 병용하였을 때, 상기 항암제의 부작용인 체중 감소 및 식욕 저하는 억제하면서 항암제 고유의 효과로서 종양 세포에 대한 활성을 유지할 수 있다.
예를 들어, 상기 염증완화제는 살리실산(salicyclid acid), 이부프로펜(ibuprofen), 덱시부프로펜(dexibuprofen), 나프록센(naproxen), 케토프로펜(ketoprofen), 인도메타신(indomethacin), 디클로페낙(diclofenac), 피록시캄(piroxicam) 또는 멜록시캄(meloxicam)과 같은 NSAID일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 항균제는 벤질페니실린(benzylpenicillin), 암피실린(ampicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 테트라사이클린(tetracycline)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 항진균제는 나이스타틴(nystatin), 암포테리신 B(amphotericin B) 또는 트리코마이신(trichomycin)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 항바이러스제는 오셀타미비르(oseltamivir), 아시클로버(acyclovir), 간시클로버(ganciclovir), 소포스부비르(sofosbuvir) 또는 렘데시비르(remdesivir)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 면역조절제는 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 에타너셉트(etanercept) 또는 사이클로스포린(cyclosporine)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 스테로이드제는 히드로코티손(hydrocortisone), 프레드니손(prednisone), 트리암시놀론(triamcinolone) 또는 플루티카손(fluticasone)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이외에도, 상기 활성제는 와파린(warfarin), 헤파린(heparin)과 같은 항응고제; 카바마제핀(carbamazepine), 페니토인(phenytoin)과 같은 항경련제; 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRIs), 세로토닌-노르에피네프린 재흡수 억제제(SNRIs)와 같은 항우울제; 코엔자임 q10, 리포산(alpha lipoic acid)과 같은 항산화제; 비타민 A, B, C, D, E와 같은 비타민을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 담체, 부형제, 및 희석제는 상기 이온 화합물의 유효 농도를 확보할 수 있는 범위 내로 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 액제, 산제, 경구제, 주사제, 수액제, 에어로졸, 정제, 캡슐제, 환제, 데포제 또는 좌제로 제형화될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 제형화에 필요한 첨가제로서 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 부형제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여, 정맥 내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여 또는 점막 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 약학적 조성물은 경구 투여되거나 정맥 내 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여시 전술한 액제, 경구제 등으로 제형화 될 수 있으며, 정맥 투여시 전술한 주사제, 수액제 등으로 제형화될 수 있다.
상기 악액질 및 근손실은 암, 결핵, 당뇨, 에이즈, 만성 폐쇄성 폐질환, 다발성 경화증, 울혈성 심부전, 혈우병, 하수체기능저하증 또는 간경화와 같은 원인에 의해 유발될 수 있다. 바람직하게는 상기 악액질 및 근손실은 암에 의해 유발되는 것일 수 있다. 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 간암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 신장암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 상기 원인에 의해 유발되는 악액질 및 근손실에 대해 다중모달 방식에 의한 예방 또는 치료 효과를 제공한다.
상기 근손실은 노인성근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 근무력증(myasthenia gravis)과 같은 원인에 의해 유발되는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 상기 원인에 의해 유발되는 근손실에 대해 다중모달 방식에 의한 예방 또는 치료 효과를 제공한다.
본 발명의 다른 일 구체례는 이온 화합물을 포함하는 식품 조성물로서, 상기 이온 화합물은 칼슘 양이온, 제1 음이온 및 제2 음이온을 포함하고, 상기 제1 음이온 및 상기 제2 음이온은 서로 상이한 것이며, 각각 독립적으로 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 분지쇄 아미노산 또는 이들의 유도체의 음이온인 것을 제공한다. 상기 식품 조성물에 있어서, 상기 이온 화합물은 앞선 구체례의 설명으로 갈음한다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품일 수 있다.
건강기능성 식품(functional food)은 특정보건용 식품(food for special health use; FoSHU)로 지칭할 수 있으며, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공되거나 의학적인 효능을 나타낼 수 있는 식품을 의미한다. 예를 들어, 상기 건강기능성 식품은 통조림, 레토르트 등의 가공 식품 또는 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제공될 수 있다.
상기 식품 조성물은 통상적으로 사용될 수 있는 식품 첨가물을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 식품 조성물은 방부제, 산화방지제, 착색제, 발색제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 유화제, 증점제, 피막제, 검기초제, 소포제 등을 포함할 수 있다.
이하에서는, 구체적인 제조예, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 제조예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명이 하기 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 아스코빅산과 다이클로로아세트산의 칼슘염 제조
상온에서 아스코빅산 176 mg을 증류수 125 mL에 용해하여 아스코빅산 용액을 준비하였다. 다이클로로아세트산 129 mg을 증류수 125 mL에 용해하여 다이클로로아세트산 용액을 준비하였다. 다이클로로아세트산 용액에 아스코빅산 용액을 서서히 첨가하며 교반하였다. 상기 혼합 용액에 탄산칼슘(CaCO3) 105 mg을 천천히 첨가하며 상온에서 30 분 동안 교반한 후, 반응온도를 60℃까지 서서히 올려가며 CO2가 더 이상 발생하지 않을 때까지 교반하였다. 회전증발 농축기(Rotary evaporator)와 진공오븐으로 건조하고, 디에틸에터(Diethyl ether)로 미반응 물질을 제거한 뒤 여과, 건조 및 분쇄하여 분말상의 아스코빅산과 다이클로로아세트산의 칼슘염을 수득하였다. 상기 모든 과정은 질소 분위기 하에 실행하였으며, 상기 칼슘염을 Asc-Ca-DCA 또는 DCA-Ca-Asc로 지칭하였다.
제조예 2. 아스코빅산과 류신의 칼슘염 제조
상온에서 둥근 플라스크에 아스코빅산 1000 mg과 류신 745 mg을 증류수 15 mL에 용해하고 10분 동안 교반하여 아스코빅산과 류신의 혼합 용액을 준비하였다. 상기 혼합 용액에 탄산칼슘(CaCO3) 568 mg을 천천히 첨가하며 상온에서 30분 동안 교반한 후, 반응온도를 60℃까지 서서히 올려가며 CO2가 더 이상 발생하지 않을 때까지 교반하였다. 회전증발 농축기와 진공오븐으로 농축 및 건조하고, 디에틸에터로 미반응 물질을 제거한 뒤 여과, 건조 및 분쇄하여 분말상의 아스코빅산과 류신의 칼슘염을 수득하였다. 상기 모든 과정은 질소 분위기 하에 실행하였으며, 상기 칼슘염을 Asc-Ca-Leu 또는 Leu-Ca-Asc로 지칭하였다.
제조예 3. 다이클로로아세트산과 류신의 칼슘염 제조
상온에서 둥근 플라스크에 다이클로로아세트산 1000 mg과 류신 1018 mg을 증류수 15 mL에 용해하고 10분 동안 교반하여 아스코빅산과 류신의 혼합 용액을 준비하였다. 상기 혼합 용액에 탄산칼슘(CaCO3) 777 mg을 천천히 첨가하며 상온에서 30분 동안 교반한 후, 반응온도를 60℃까지 서서히 올려가며 CO2가 더 이상 발생하지 않을 때까지 교반하였다. 회전증발 농축기와 진공오븐으로 농축 및 건조하고, 디에틸에터로 미반응 물질을 제거한 뒤 여과, 건조 및 분쇄하여 분말상의 다이클로로아세트산과 류신의 칼슘염을 수득하였다. 상기 모든 과정은 질소 분위기 하에 실행하였으며, 상기 칼슘염을 DCA-Ca-Leu 또는 Leu-Ca-DCA로 지칭하였다.
실험예 1-1 내지 1-2. 이온 화합물의 세포 독성 확인
실험예 1-1. C2C12 분화 전 세포(근원 세포)에 대한 세포 독성 확인
C2C12 세포주를 96-웰 플레이트에 1.0 x 104 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 70% 수준이 되면 제조예 1 내지 3의 칼슘염을 각각 미리 정한 8 가지 농도별로 각 웰에 첨가하고, 1/2씩 희석하여 세포 독성을 확인하였다. 72시간 배양한 뒤, MTT 용액을 처리하고 3시간 동안 어두운 인큐베이터에서 배양하였다. 상등액을 제거한 뒤, DMSO를 웰 당 100 ㎕씩 처리하고 OD(optical density)를 560nm에서 측정하여 세포 독성을 확인하였다. 상기 실험은 3회 반복 수행하였으며, 세포 생존율을 도 1의 (a) 내지 (c)에 나타내었다.
도 1의 (a)을 참조하면, 제조예 1의 칼슘염은 처리 농도 1000 μM부터 세포 생존율이 약 50% 감소하는 독성을 나타내었다. 도 1의 (b)을 참조하면, 제조예 2의 칼슘염은 처리 농도 100 μM부터 세포 생존율이 약 50% 감소하는 독성을 나타내었다. 도 1의 (c)을 참조하면, 제조예 3의 칼슘염은 처리 농도 1200 μM까지 독성을 나타내지 않았다.
실험예 1-2. C2C12 분화 후 세포(근관 세포)에 대한 세포 독성 확인
C2C12 세포주를 96-웰 플레이트에 1.5 x 104 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하고, 제조예 1 내지 3의 칼슘염을 각각 미리 정한 8 가지 농도별로 각 웰에 첨가하고, 1/2씩 희석하여 세포 독성을 확인하였다. 72시간 배양한 뒤, MTT 용액을 처리하고 3시간 동안 어두운 인큐베이터에서 배양하였다. 상등액을 제거한 뒤, DMSO를 웰 당 100 ㎕씩 처리하고 OD를 560nm에서 측정하여 세포 독성을 확인하였다. 상기 실험은 3회 반복 수행하였으며, 세포 생존율을 도 2의 (a) 내지 (c)에 나타내었다.
도 2의 (a)를 참조하면, 제조예 1의 칼슘염은 처리 농도 500 μM부터 세포 생존율이 약 50% 감소하는 독성을 나타내었다. 도 2의 (b)을 참조하면, 제조예 2의 칼슘염은 처리 농도 500 μM부터 세포 생존율이 약 50% 감소하는 독성을 나타내었다. 도 2의 (c)을 참조하면, 제조예 3의 칼슘염은 처리 농도 1200 μM까지 독성을 나타내지 않았다.
실험예 2-1 내지 2-3. 악액질 상태의 세포 모델 제조
실험예 2-1. 마우스 근원 세포주(C2C12)의 분화 조건 확인
마우스 근원세포주 C2C12를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 세포들을 DPBS로 세척한 뒤 배지를 2% 말혈청(horse serum)이 포함된 분화 배지(DMEM)로 교체하여 3일간 배양하였다.
실험예 2-2. 암 세포 배양 배지(cancer-cell conditioned medium; CCM) 준비
마우스 대장암세포주 CT26을 100-mm 배양 플레이트에 2.0 x 106 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 48시간 배양하였다. 그 후 무혈청 배지 (serum-free medium)로 교체한 후 24시간 뒤 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 원심분리기(1500rpm, 3min)를 이용하여 세포 잔해(debris)를 제거하고 0.22-㎛ 필터를 이용하여 최종 수거하였다.
실험예 2-3. 악액질 상태의 세포 모델 제작
분화 배지로 교체하여 근관 세포로의 분화가 진행된 C2C12에 분화 배지와 준비해둔 암세포 배양 배지(CCM)을 1:1 비율로 섞어 처리한 후 72시간 배양하였다. 정상 대조군과의 근관 직경의 사이즈 비교를 위해 크리스탈 바이올렛 염색법 (crystal violet staining)으로 염색을 진행하여 각각의 이미지를 확인하여 도 3에 나타내었다. 도 3의 (a)는 정상 대조군(unconditioned medium; UCM)의 이미지이며, (b)는 CCM의 이미지이다. 도 3의 (a) 및 (b)에 삽입된 스케일바(scale bar)는 가로 길이 50 ㎛을 나타낸다. 상기 염색 후 Image J로 근관 직경을 측정하여 도 3(c)에 나타냈다. 도 3을 참조하면 CCM에서 근관 세포의 감소가 확인되었다.
이어서, 처리군(CCM)과 정상 대조군(UCM)에 포함된 근육 분해 및 분화에 연관된 마커인 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin을 웨스턴 블랏을 통해 분석 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내고, 마커별 상대적 발현량(폴드 체인지; FC)을 도 5의 (a) 내지 (d)에 나타내었다.
도 3(c)를 참조하면, 처리군(CCM)에서 근관의 직경은 정상 대조군(UCM)의 약 50% 수준으로 감소하였다. 도 5의 (a) 내지 (d)를 참조하면, 근육 분해 마커인 MuRF1와 Atrogin1의 발현은 증가하였고, 근육 분화 마커인 MyHC와 Myogenin의 발현은 감소한 것으로 확인되었다.
실험예 3-1 내지 3-2. 제조예 1의 칼슘염 처리에 따른 타겟 마커의 발현 확인
실험예 3-1. PDK-4의 발현량 변화 확인
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 세포를 확인한 후 분화 배지와 암 세포 배양 배지(CCM)를 1:1 비율로 섞어 처리하여 대조군을 형성하고, 동시에 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 미리 정한 3 가지 농도로 첨가하여 시험군을 설정하였다. 72시간 배양한 뒤, 세포를 수거하여 웨스턴 블랏으로 타겟 마커인 PDK-4를 분석하여 도 6에 정리하였다.
도 6(a)는 웨스턴 블랏 결과이며, 도 6(b)는 웨스턴 블랏 결과로부터 PDK-4 발현량을 정리한 그래프이다. 도 6을 참조하면, 암 세포 배양 배지만 처리된 대조군(CCM)에서는 PDK-4 발현량이 증가하였으나, Asc-Ca-DCA의 처리에 따라 발현이 억제되는 것으로 확인되었다.
실험예 3-2. Calpain 3 발현량 변화 확인
웨스턴 블랏의 타겟 마커로서 Calpain 3을 분석한 것을 제외하고는 상기 실험예 3-1과 같은 방법으로 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 정리하였다.
도 7(a)는 웨스턴 블랏 결과이며, 도 7(b)는 웨스턴 블랏 결과로부터 Calpain 3의 발현량을 정리한 그래프이다. 도 7을 참조하면, 암 세포 배양 배지만 처리된 대조군(CCM)에서는 Calpain 3의 발현량이 감소하였으나, Asc-Ca-DCA의 처리에 따라 발현 감소가 억제되는 것으로 확인되었다.
실험예 4-1 내지 4-3. 제조예 2의 칼슘염 처리에 따른 타겟 마커의 발현 확인
실험예 4-1. Calpain 3의 발현량 변화 확인
제조예 2의 칼슘염을 사용한 것을 제외하고는, 실험예 3-1과 같은 방법으로 타겟 마커인 Calpain 3를 분석하여 도 8 및 도 9에 정리하였다.
실험예 4-2. PDK-4의 발현량 변화 확인
웨스턴 블랏의 타겟 마커로서 PDK-4를 분석한 것을 제외하고는, 실험예 4-1과 같은 방법으로 분석하여 도 8 및 도 9에 정리하였다.
실험예 4-3. GDF-15의 발현량 변화 확인
웨스턴 블랏의 타겟 마커로서 GDF-15를 분석한 것을 제외하고는, 실험예 4-1과 같은 방법으로 분석하여 도 8 및 도 9에 정리하였다.
도 8은 웨스턴 블랏 결과이며, 도 9는 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) Calpain 3의 발현량, (b) PDK-4의 발현량, (c) GDF-15의 발현량을 정리한 그래프이다. 도 9(a)를 참조하면, 암 세포 배양 배지만 처리된 대조군(CCM)에서는 Calpain 3의 발현량이 감소하였으나, Asc-Ca-Leu의 처리에 따라 발현 감소가 억제되는 것으로 확인되었다. 도 9(b) 및 (c)를 참조하면, 암 세포 배양 배지만 처리된 대조군(CCM)에서는 PDK-4와 GDF-15의 발현량이 증가하였으나, Asc-Ca-Leu의 처리에 따라 발현 증가가 억제되는 것으로 확인되었다.
실험예 5-1 내지 5-3. 제조예 3의 칼슘염 처리에 따른 타겟 마커의 발현 확인
실험예 5-1. Calpain 3의 발현량 변화 확인
제조예 3의 칼슘염을 사용한 것을 제외하고는, 실험예 3-1과 같은 방법으로 타겟 마커인 Calpain 3를 분석하여 도 10 및 도 11에 정리하였다.
실험예 5-2. PDK-4의 발현량 변화 확인
웨스턴 블랏의 타겟 마커로서 PDK-4를 분석한 것을 제외하고는, 실험예 3-1과 같은 방법으로 분석하여 도 10 및 도 11에 정리하였다.
실험예 5-3. GDF-15의 발현량 변화 확인
웨스턴 블랏의 타겟 마커로서 GDF-15를 분석한 것을 제외하고는, 실험예 4-1과 같은 방법으로 분석하여 도 10 및 도 11에 정리하였다.
도 10은 웨스턴 블랏 결과이며, 도 11는 웨스턴 블랏 결과로부터 (a) Calpain 3의 발현량, (b) PDK-4의 발현량, (c) GDF-15의 발현량을 정리한 그래프이다. 도 11(a)를 참조하면, 암 세포 배양 배지만 처리된 대조군(CCM)에서는 Calpain 3의 발현량이 감소하였으나, DCA-Ca-Leu의 처리에 따라 발현 감소가 억제되는 것으로 확인되었다. 도 11(b) 및 (c)를 참조하면, 암 세포 배양 배지만 처리된 대조군(CCM)에서는 PDK-4와 GDF-15의 발현량이 증가하였으나, DCA-Ca-Leu의 처리에 따라 발현 증가가 억제되는 것으로 확인되었다.
실험예 6-1 내지 6-2. 타겟 마커의 연관성과 악액질 유도 효과 확인
실험예 6-1. C2C12 근관 세포에서 암 세포 배양 배지(CCM)의 처리에 따른 타겟 마커 변화 확인
암 유래 악액질의 악화 기전 중 에너지 대사와 밀접한 관련이 있고 근육 세포 단백질 분해 관련 기전의 핵심인 Forkhead box protein O(FOXO)의 타겟 유전자인 PDK-4는 대상이 악액질 증상을 나타낼 때 과발현되어 있는 것으로 알려져 있다. 근관 세포에 암 세포 배양 배지(CCM)을 처리하여 암 악액질 상황을 만들었을 때 PDK-4의 발현이 정상 대조군 대비 증가하는지 여부를 확인하였다.
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 것을 확인한 후, 분화 배지와 암 세포 배양 배지(CCM)를 1:1 비율로 섞어 처리하고 72시간 배양한 뒤, 세포를 수거하여 웨스턴 블랏을 통해 분석하여 도 12의 (a) 및 (b)에 정리하였다.
동일한 방법으로 암 악액질 상황에서 근육 내 발현이 저발현되어 있는 것으로 알려진 Calpain 3에 대해서도 웨스턴 블랏을 통해 분석하여 도 12의 (c) 및 (d)에 정리하였다. 동일한 방법으로 암 악액질 상황에서 근육 내 발현이 과발현되어 있는 것으로 알려진 GDF-15에 대해서도 웨스턴 블랏을 통해 분석하여 도 12의 (e) 및 (f)에 정리하였다.
실험예 6-2. 타겟 마커 발현의 변화에 따른 암 악액질 유도 확인
타겟 마커인 PDK-4와 Calpain 3의 경우, 암 악액질 상황에서 각각 과발현, 저발현 되어 있다고 알려져 있다. PDK-4의 발현량을 증가시킨 상황에서 암 악액질 상태가 유도되는지 확인하고, 근육 분해 및 분화 마커의 변화가 악액질 상태에서와 동일한지 확인하였다.
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하여 정상 대조군을 설정하고, 동시에 PDK-4의 활성제인 WY-14643을 50 μM의 농도로 처리하여 시험군을 설정하였다. 72시간 배양한 뒤, 크리스탈 바이올렛 염색법으로 세포를 염색하여 각각의 이미지를 도 13에 나타내었다. 도 13의 (a)는 정상 대조군(UCM)의 이미지이며, (b)는 활성제 처리한 이미지(WY-14643)이다. 도 13의 (a) 및 (b)에 삽입된 스케일바는 가로 길이 50 ㎛을 나타낸다. 상기 염색 후 Image J로 근관 직경을 측정하여 도 13(c)에 나타냈다. 도 13을 참조하면 PDK-4 활성제인 WY-14643 처리시 근관 세포의 직경이 감소하여 암 악액질과 유사한 상태로 유도됨을 확인하였다.
이어서, 정상 대조군(UCM)과 활성제 처리군(WY-14643)에서 PDK-4, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 분석하여 그 결과를 도 14의 (a) 및 (b)에 나타내었다. 도 14를 참조하면, 활성제인 WY-14643 처리군에서 PDK-4, MuRF1 및 Atrogin1은 과발현되었고, MyHC 및 Myogenin은 저발현되어 암 악액질과 유사한 상태로 유도됨을 확인하였다.
실험예 6-3. 타겟 마커 발현의 변화에 따른 암 악액질 유도 확인
Calpain 3의 발현량을 감소시킨 상황에서 암 악액질 상태가 유도되는지 확인하고, 근육 분해 및 분화 마커의 변화가 악액질 상태에서와 동일한지 확인하였다.
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하여 정상 대조군을 설정하고, 동시에 Calpain 3 siRNA와 vehicle 대조군인 scrambled siRNA를 각각 100 nM씩 처리하여 형질주입(transfection)하였다. 상기 형질주입은 lipofectamine™ 3000(Thermo Fisher Scientific)을 이용하고, 제조사 프로토콜에 따랐다. 72 시간 동안 배양한 뒤, 크리스탈 바이올렛 염색법으로 세포를 염색하여 각각의 이미지를 도 15에 나타내었다. 도 15의 (a)는 정상 대조군(UCM)의 이미지이며, (b)는 vehicle 대조군(scrambled siRNA)의 이미지이며, (c)는 Calpain 3 siRNA 처리군의 이미지이다. 도 15의 (a) 내지 (c)에 삽입된 스케일바는 가로 길이 50 ㎛을 나타낸다. 상기 염색 후 Image J로 근관 직경을 측정하여 도 15(d)에 나타냈다. 도 15를 참조하면 Calpain 3 siRNA 형질주입에 의한 Calpain 3 넉다운(knockdown) 조건에서 근관 직경은 대조군과 비교하여 통계적 유의성을 나타내며 감소함을 확인하여 암 악액질과 유사한 상태로 유도됨을 확인하였다.
이어서, 정상 대조군(UCM)과 vehicle 대조군(scrambled siRNA)과 Calpain 3 siRNA 처리군에서 Calpain 3, MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 분석하여 그 결과를 도 16의 (a) 및 (b)에 나타내었다. 도 16을 참조하면, Calpain 3 siRNA 형질주입에 따라 Calpain 3 발현량이 감소하고, MuRF1 및 Atrogin1은 과발현되었고, MyHC 및 Myogenin은 저발현되어 암 악액질과 유사한 상태로 유도됨을 확인하였다.
실험예 7. 제조예 1의 칼슘염의 COX2 억제 효과 확인
제조예 1의 칼슘염을 DMSO와 혼합하고, 200 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0, EDTA 6 μM, hematin 10 μM 포함)에 투입하였다(최종 버퍼액에서 DMSO의 농도 1%). 이때 상기 버퍼액에 포함된 칼슘염의 농도는 10 μM가 되도록 하였다. 상기 버퍼액에 효소로서 곤충 Sf21 세포에서 발현된 인간 재조합 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase COX-2) 34 U/ml를 더 투입하여 25℃에서 15분 동안 사전 반응시켰다. 추가로 아라키돈산 3 μM과 Ampliflu Red 100 μM을 더 투입하여 25℃에서 3분 동안 반응시켰다. 상기 반응 과정에서 생성된 Resofurin의 양을 535 nm/590 nm에서 스펙트로 형광법으로 측정하고 칼슘염 미처리군과 비교하여, COX2에 대한 억제 효과를 확인하였다.
제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)은 COX2에 대해 74%의 억제 효과를 갖는 것으로 확인되어, 악액질 및 근손실에 대한 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있을 것으로 판단되었다.
실험예 8-1 내지 8-2. 제조예의 칼슘염의 C2C12 근관 분화 감소 억제 효과 확인
실험예 8-1. C2C12 근관 세포의 직경 측정
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 세포를 확인 후 분화 배지와 암 세포 배양 배지(CCM)를 1:1 비율로 섞어 처리하여 대조군을 형성하고, 동시에 제조예 1의 칼슘염을 미리 정한 3 가지 농도로 첨가하여 시험군을 설정하였다. 72시간 배양한 뒤, 크리스탈 바이올렛 염색법으로 염색하여 각각의 이미지를 도 17(a)에 정리하였다. 도 17의 (a)에 삽입된 스케일바는 가로 길이 50 ㎛을 나타낸다. 상기 이미지로부터 Image J로 근관 직경을 측정하여 근관 세포 직경의 변화를 도 17(b)에 정리하였다.
도 17을 참조하면, 암 세포 배양 배지(CCM)를 처리하여 암 악액질 조건을 만든 근관 세포의 직경은 정상 대조군(UCM) 대비 약 50% 수준 감소하였고, 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 처리한 시험군의 경우 10 μM 이상부터 통계학적으로 유의하게 근관 세포의 직경 감소가 억제되었다.
실험예 8-2. C2C12 근관 세포의 분해 및 분화 마커 확인
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 세포를 확인한 후 분화 배지와 암 세포 배양 배지(CCM)를 1:1 비율로 섞어 처리하여 대조군을 형성하고, 동시에 제조예 1 내지 3의 칼슘염을 미리 설정한 농도에 맞게 처리하여 시험군을 설정하였다. 72시간 배양한 뒤, 세포를 수거하여 웨스턴 블랏으로 분석하여 도 18(제조예 1), 도 20(제조예 2) 및 도 22(제조예 3)에 정리하였다.
이어서, 각 실험군에 포함된 근육 분해 및 분화에 연관된 마커인 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin을 웨스턴 블랏을 통해 분석 수행하여 마커별 상대적 발현량을 도 19(제조예 1), 도 21(제조예 2) 및 도 23(제조예 3)에 나타내었다.
도 18 내지 23을 참조하면, 근육 분해 마커인 MuRF1과 Atrogin1은 각각 제조예 1 내지 3의 칼슘염 처리에 의해 암 세포 배양 배지(CCM)로 인한 발현 증가가 억제되었고, 근육 분화 마커인 MyHC, Myogenin은 암 세포 배양 배지(CCM)로 인한 발현 감소가 억제되었다.
실험예 9-1 내지 9-3. 제조예의 칼슘염과 아스코빅산, 다이클로로아세트산 및 아스코빅산과 다이클로로아세트산 조합의 효과 비교
실험예 9-1. C2C12 근관 세포의 직경 측정
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 세포를 확인 후 분화 배지와 암 세포 배양 배지(CCM)를 1:1 비율로 섞어 처리하여 대조군을 형성하고, 동시에 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA), 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 그리고 아스코빅산과 다이클로로아세트산을 조합한 군을 설정한 농도에 맞게 처리하여 시험군을 설정하였다. 72시간 배양한 뒤, 크리스탈 바이올렛 염색법으로 염색한 이미지를 도 24(a)에 정리하였다. 도 24의 (a)에 삽입된 스케일바는 가로 길이 50 ㎛을 나타낸다. 상기 이미지를 Image J로 근관 직경을 측정하여 근관 세포 직경의 변화를 확인하여 도 24(b)에 나타내었다.
도 24를 참조하면, 암 세포 배양 배지(CCM) 대비 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 아스코빅산과 다이클로로아세트산 조합 처리시 근관 세포의 직경이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나, 상기 제조예 1의 칼슘염 처리시에는 정상 대조군(UCM)과 유사한 수준까지 증가하는 것으로 확인되었다.
실험예 9-2. C2C12 근관 세포의 분해 및 분화 마커 확인
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 세포를 확인한 후 분화 배지와 암 세포 배양 배지(CCM)를 1:1 비율로 섞어 처리하여 대조군을 형성하고, 동시에 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA), 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 그리고 아스코빅산과 다이클로로아세트산을 조합한 군을 설정한 농도에 맞게 처리하여 시험군을 설정하였다. 72시간 배양한 뒤, 세포를 수거하여 웨스턴 블랏 분석하여 도 25 및 도 27에 정리하였다.
이어서, 각 실험군에 포함된 근육 분해 및 분화에 연관된 마커인 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin과 Calpain 3, PDK-4 및 GDF-15를 웨스턴 블랏을 통해 분석 수행하여 마커별 상대적 발현량을 도 26 및 도 28에 나타내었다.
도 25 내지 28을 참조하면, 근육 분해 마커인 MuRF1과 Atrogin1은 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA) 처리군이 다른 실험군 대비 발현 증가 억제 효과가 우수하였고, 근육 분화 마커인 MyHC, Myogenin은 제조예 1의 칼슘염 처리군이 다른 실험군 대비 발현 감소 억제 효과가 우수하였다. 상기 제조예 1의 칼슘염 처리군은 다른 실험군 대비 Calpain 3 발현량이 높게 나타났고, PDK-4와 GDF-15는 발현이 억제되었다.
실험예 9-3. C2C12 근관 세포의 분해 및 분화 마커 확인
제조예 2의 칼슘염(Asc-Ca-Leu), 아스코빅산, 류신, 그리고 아스코빅산과 류신을 조합한 군을 설정한 농도에 맞게 처리하여 시험군을 설정한 것을 제외하고는 상기 실험예 9-2와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 72시간 배양한 뒤, 세포를 수거하여 웨스턴 블랏 분석하여 도 29 및 도 31에 정리하였다.
이어서, 각 실험군에 포함된 근육 분해 및 분화에 연관된 마커인 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin과 Calpain 3, PDK-4 및 GDF-15를 웨스턴 블랏을 통해 분석 수행하여 마커별 상대적 발현량을 도 30 및 도 32에 나타내었다.
도 29 내지 32를 참조하면, 근육 분해 마커인 MuRF1과 Atrogin1은 제조예 2의 칼슘염(Asc-Ca-Leu) 처리군이 다른 실험군 대비 발현 증가 억제 효과가 우수하였고, 근육 분화 마커인 MyHC, Myogenin은 제조예 2의 칼슘염 처리군이 다른 실험군 대비 발현 감소 억제 효과가 우수하였다. 상기 제조예 2의 칼슘염 처리군은 다른 실험군 대비 Calpain 3 발현량이 높게 나타났고, PDK-4와 GDF-15는 발현이 억제되었다.
실험예 9-4. C2C12 근관 세포의 분해 및 분화 마커 확인
제조예 3의 칼슘염(DCA-Ca-Leu), 다이클로로아세트산, 류신, 그리고 다이클로로아세트산과 류신을 조합한 군을 설정한 농도에 맞게 처리하여 시험군을 설정한 것을 제외하고는 상기 실험예 9-2와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 72시간 배양한 뒤, 세포를 수거하여 웨스턴 블랏 분석하여 도 33 및 도 35에 정리하였다.
이어서, 각 실험군에 포함된 근육 분해 및 분화에 연관된 마커인 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin과 Calpain 3, PDK-4 및 GDF-15를 웨스턴 블랏을 통해 분석 수행하여 마커별 상대적 발현량을 도 34 및 도 36에 나타내었다.
도 33 내지 36을 참조하면, 근육 분해 마커인 MuRF1과 Atrogin1은 제조예 3의 칼슘염(DCA-Ca-Leu) 처리군이 다른 실험군 대비 발현 증가 억제 효과가 우수하였고, 근육 분화 마커인 MyHC, Myogenin은 제조예 3의 칼슘염 처리군이 다른 실험군 대비 발현 감소 억제 효과가 우수하였다. 상기 제조예 3의 칼슘염 처리군은 다른 실험군 대비 Calpain 3 발현량이 높게 나타났고, PDK-4와 GDF-15는 발현이 억제되었다.
실험예 10-1 내지 10-3. 근감소증(sarcopenia)에 대한 제조예의 칼슘염의 효과
실험예 10-1. sarcopenia 세포 모델 제조
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 세포를 확인 후 덱사메타손(Dexamethasone; Dex)을 설정한 농도에 맞게 처리하여 실험군을 설정하였다. 72시간 배양한 뒤, 크리스탈 바이올렛 염색법으로 염색한 이미지를 도 37(a)에 정리하였다. 도 37의 (a)에 삽입된 스케일바는 가로 길이 50 ㎛을 나타낸다. 상기 이미지를 Image J로 근관 직경을 측정하여 근관 세포 직경의 변화를 확인하여 도 37(b)에 나타내었다.
도 37을 참조하면 덱사메타손의 처리 농도 1 μM부터 근관 직경의 감소가 확인되었다. 상기 농도 이상에서는 1 μM 농도 처리군과 통계적 유의적 차이가 확인되지 않아, 덱사메타손의 처리 농도 1 μM을 실험 조건으로 확립하였다.
실험예 10-2. sarcopenia 세포 모델에서 타겟 마커 변화 확인
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 것을 확인한 후, 정상대조군(UCM)에 덱사메타손을 1 μM 처리하여72시간 배양한 뒤, 세포를 수거하여 관련 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행하여 도 38에 나타내었다.
도 38의 분석 결과, 덱사메타손 처리군에서 근육 분해 마커인 MuRF1과 Atrogin1의 발현량이 증가하였고, 근육 분화 마커인 MyHC, Myogenin의 발현량이 감소하여, 덱사메타손 처리시 근 감소와 함께 관련 마커들의 발현이 변화함을 확인하였다. 또한, 덱사메타손 처리군에서 PDK4의 발현 증가, Calpain 3의 발현 감소, GDF15의 발현 증가를 확인함으로써 상기 타겟 마커들이 sarcopenia 모델에서도 주요 기전에 연관됨을 확인하였다.
실험예 10-3. 제조예의 칼슘염의 효과 확인
C2C12 세포주를 6-웰 플레이트에 4.0 x 105 cells/well로 분주한 뒤, 10% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 하루동안 배양하였다. 세포 밀도가 약 80% 수준이 되면 분화 배지로 교체 후 3일간 더 배양하였다. 분화가 이루어진 것을 확인한 후, 덱사메타손을 1 μM 처리하고, 제조예 1 내지 3의 칼슘염을 설정한 농도로 처리하여 실험군을 설정하였다. 72시간 배양한 뒤, 세포를 수거하여 웨스턴 블랏으로 분석하여 도 39(제조예 1), 도 41(제조예 2) 및 도 43(제조예 3)에 정리하였다.
이어서, 각 실험군에 포함된 근육 분해 및 분화에 연관된 마커인 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin과 Calpain 3, PDK-4, GDF-15를웨스턴 블랏을 통해 분석 수행하여 마커별 상대적 발현량을 도 40(제조예 1), 도 42(제조예 2) 및 도 44(제조예 3)에 나타내었다.
도 39 내지 44를 참조하면, 근육 분해 마커인 MuRF1과 Atrogin1은 각각 제조예 1 내지 3의 칼슘염 처리에 의해 덱사메타손 처리로 인한 발현 증가가 억제되었고, 근육 분화 마커인 MyHC, Myogenin은 덱사메타손 처리로 인한 발현 감소가 억제되었다. 또한 제조예 1 내지 3의 칼슘염 처리군에서 PDK-4의 발현 감소, Calpain 3의 발현 증가, GDF15의 발현 감소가 확인되었다.
실험예 11. 흰 쥐(SD rat)에서 정맥 투여(IV) 및 경구 투여(PO)에 따른 혈중 약물 농도 및 약물동태학적(pharmacokinetics) 인자 확인
총 6일 동안 흰 쥐에 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 정맥 투여(200 mg/kg, 1일 1회) 또는 경구 투여(200, 500 mg/kg, 1일 1회 또는 1000 mg/kg 1일 2회)하였다. 상기 흰 쥐에서 개체별로 투여 후 경과 시간(0 내지 48시간)에 따른 혈액을 채혈하여 원심 분리 후 얻어진 혈장을 LC/MS/MS 분석법을 통해 투여된 약물의 혈중 농도 및 이에 따른 약물동태학적 인자(PK parameter)를 분석하여 하기 표 1에 정리하였다.
Asc-Ca-DCA IV PO
PK
parameters		 200 mg/kg 200 mg/kg 500 mg/kg 2000 mg/kg
(1000 mg/kg, BID)
1일 6일 1일 6일 1일 6일 1일 6일
AUClast
(㎍·h/mL)		 19.77 7.98 38.78 34.62 353.65 147.85 889.77 575.25
Cmax(㎍/mL) 30.24 2.70 23.91 6.26 66.44 21.28 130.92 77.20
Tmax(h) 0.25 0.00 0.50 0.00 1.50 0.00 1.75 0.00
t1/2(h) 0.27 2.72 0.59 2.72 4.14 5.58 5.64 3.11
상기 표 1을 참조하면, 제조예 1을 투여한 시험군들에서 투여 경로 및 농도에 무관하게 칼슘염의 혈중 농도가 잘 분석되어, 약물동태학적 인자에 대한 구체적인 수치가 확인될 수 있었다. 이로부터, 제조예에 따른 칼슘염은 대상의 체내에서도 일정 기간 유지되며 전술한 다중모달 방식의 효과를 제공할 수 있을 것으로 판단할 수 있다.
실험예 12-1 내지 12-6. 마우스에 대한 in vivo 테스트
실험예 12-1. 마우스 근육 조직에서의 근육 분해 또는 분화 마커 확인
Balb/c 마우스에 CT26 마우스 대장암 세포주를 피하 이식하여, syngeneic 모델을 제작한 후 총 21일간 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 투여하였다. 상기 마우스를 희생하고, 부검 시 Quadriceps 골격근을 적출하여 조직 분쇄 후 RIPA lysis buffer 통해 단백질들을 추출하여 웨스턴 블랏 분석하여 도 45에 정리하였다.
이어서, 각 실험군에 포함된 근육 분해 및 분화에 연관된 마커인 MuRF1, Atrogin1, MyHC, Myogenin을 웨스턴 블랏을 통해 분석 수행하여 마커별 상대적 발현량을 도 46(a) 내지 (d)에 나타내었다.
도 45 및 46에서 G1은 종양이 없는 정상 대조군, G2는 악액질 모델에 부형제(주사용수 또는 식염수)만을 투여한 부형제 대조군, G3는 악액질 모델에 메게스트롤을 투여한, 메게스트롤 경구 투여군(125 mpk), G4는 악액질 모델에 제조예 1을 투여한, 제조예 1 경구 투여군(200 mpk), G5는 악액질 모델에 제조예 1을 투여한, 제조예 1 정맥 투여군(100 mpk), G6는 악액질 모델에 제조예 1을 투여한, 제조예 1 정맥 투여군(200 mpk)이다.
도 45 및 46을 참조하면, 제조예 1을 처리한 G4 내지 G6은 부형제 대조군 G2에 비해, 근육 분해 마커인 MuRF1, Atrogin1의 발현량은 감소하고, 근육 분화 마커인 MyHC, Myogenin의 발현량은 증가한 것으로 확인되었다. 제조예 1을 처리한 G4 내지 G6는 악액질 치료제인 메게스테롤 처리군 G3 대비 Atrogin1 발현량 감소 효과와 Myogenin 발현 증가 효과는 우수하고, MuRF1과 MyHC 발현 조절 효과는 유사한 수준으로 확인되었다.
실험예 12-2. 마우스 근육 조직에서의 타겟 마커 확인
Balb/c 마우스에 CT26 마우스 대장암 세포주를 피하 이식하여, syngeneic 모델을 제작한 후 총 21일간 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 투여하였다. 상기 마우스를 희생하고, 부검 시 Quadriceps 골격근을 적출하여 조직 분쇄 후 RIPA lysis buffer 통해 단백질들을 추출하고 웨스턴 블랏 분석하여 도 47(a)에 정리하였다.
이어서, 각 실험군에 포함된 Calpain 3과 PDK-4를 웨스턴 블랏을 통해 분석 수행하여 마커별 상대적 발현량을 도 47(b) 및 (c)에 나타내었다.
도 47에서 G1은 정상 대조군, G2는 부형제 대조군, G3는 메게스트롤 경구 투여군(125 mpk), G4는 제조예 1 경구 투여군(200 mpk), G5는 제조예 1 정맥 투여군(100 mpk), G6는 제조예 1 정맥 투여군(200 mpk)이다.
도 47을 참조하면, 제조예 1을 처리한 G4 내지 G6은 부형제 대조군 G2에 비해 Calpain 3의 발현량은 증가하고, PDK-4의 발현량은 감소한 것으로 확인되었다. 악액질 치료제인 메게스테롤 처리군 G3와 비교하였을 때 정맥 투여한 G6는 Calpain 3 발현량 증가 효과가 우수하였고, G4 내지 G6는 PDK-4 발현량 감소 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
실험예 12-3. 마우스 혈액에서 사이토카인 및 젖산 측정
Balb/c 마우스에 CT26 마우스 대장암 세포주를 피하 이식하여, syngeneic 모델을 제작한 후 총 21일간 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 투여하였다. 상기 마우스를 희생하고, 부검 시 채취한 혈청을 이용하여 IL-1β와 젖산을 분석하여 그 결과를 도 48(a) 및 (b)에 정리하였다.
도 48에서 G1은 정상 대조군, G2는 부형제 대조군, G3는 메게스트롤 경구 투여군(125 mpk), G4는 제조예 1 경구 투여군(200 mpk), G5는 제조예 1 정맥 투여군(100 mpk), G6는 제조예 1 정맥 투여군(200 mpk)이다.
도 48을 참조하면, 제조예 1을 처리한 G4 내지 G6은 부형제 대조군 G2에 비해 IL-1β와 젖산 모두 감소한 것으로 확인되었다. 악액질 치료제인 메게스테롤 처리군 G3와 비교하였을 때 G4 내지 G6는 IL-1β와 젖산 감소 효과가 유사한 수준으로 확인되었다.
실험예 12-4. 암 악액질 동물모델에서 제조예 1의 칼슘염 처리에 의한 체중 감소 억제 효과 확인
Balb/c 마우스에 CT26 마우스 대장암 세포주를 피하 이식하여, syngeneic 모델을 제작한 후 총 21일간 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 투여하며 체중 변화량을 분석하여 도 49(a) 및 (b)에 정리하였다.
도 49에서 G1은 정상 대조군, G2는 부형제 대조군, G3는 메게스트롤 경구 투여군(125 mpk), G4는 제조예 1 경구 투여군(200 mpk), G5는 제조예 1 정맥 투여군(100 mpk), G6는 제조예 1 정맥 투여군(200 mpk)이다.
도 49를 참조하면, 17일차에 정상 대조군 G1 대비 부형제 대조군 G2의 체중 감소율은 약 8.4%, 20일차에 약 13.3%로 나타났다(p < 0.01 or p < 0.0001). G6의 경우 17일차에 약 6%, 20일차에 13% 수준으로, G2 대비 체중이 증가한 것으로 나타났다(p < 0.05).
실험예 12-5. 제조예 1의 칼슘염 처리에 의한 마우스 근육 조직의 병리학적 분석
Balb/c 마우스에 CT26 마우스 대장암 세포주를 피하 이식하여, syngeneic 모델을 제작한 후 총 21일간 제조예 1의 칼슘염(Asc-Ca-DCA)을 투여하였다. 상기 마우스를 희생하고, 부검 시 3 종류의 골격근(gastrocnemius, quadriceps, soleus)을 적출하여 조직병리학적 분석을 진행하였다. 근육 조직의 횡단면 이미지를 얻고, 상기 횡단면의 면적(muscle fiber cross-sectional area; CSA)을 측정하여 그 결과를 도 50 내지 52에 정리하였다.
도 50 내지 52에서 G1은 정상 대조군, G2는 부형제 대조군, G3는 메게스트롤 경구 투여군(125 mpk), G4는 제조예 1 경구 투여군(200 mpk), G5는 제조예 1 정맥 투여군(100 mpk), G6는 제조예 1 정맥 투여군(200 mpk)이다. 도 50 내지 52의 (a) 내지 (f)에 삽입된 스케일바는 가로 길이 100 ㎛을 나타낸다.
도 50 내지 52를 참조하면, 제조예 1을 처리한 G4 내지 G6은 부형제 대조군 G2에 비해 근육 조직 횡단면 면적이 증가하고, 악액질 치료제인 메게스테롤 처리군 G3와 유사한 수준을 나타내는 것으로 확인되었다.
실험예 12-6. 제조예 1의 칼슘염 처리에 의한 마우스 행동평가적 분석
Balb/c 마우스에 CT26 마우스 대장암 세포주를 피하 이식하여, syngeneic 모델을 제작한 후, 시험물질 투여 전, 시험물질 투여 후 주 1회 Rotarod latency test를 실시하였다. Rotarod-treadmill (JD-A-07RA5, B.S Technolab Inc., Korea) 에 동물을 조심스럽게 위치하게 한 후, 회전 속도를 4 rpm에서 40 rpm까지 일정한 간격으로 증가시키면서 300 초간 측정하여 도 53(a)에 정리하였다.
이와 함께 주 1 회 Wire hanging test도 실시하였고, 동물을 와이어 케이지 상단에 놓은 다음 뒤집어서 홈 케이지 위에 매달아 놓고 동물이 떨어질 때까지의 대기 시간을 기록하여 도 53(b)에 정리하였다.
도 53(a)를 참조하면, Rotarod-treadmill 시험에서 정상 대조군 G1 대비 부형제 대조군 G2는 약 23% 감소된 수치를 나타낸 데에 비해, G6는 G2 대비 약 24% 향상된 수치를 나타내었다.
도 53(b)를 참조하면, Wire hanging 시험에서 G4 내지 G6는 부형제 대조군 G2 대비 5 내지 10% 향상된 수치를 나타냈으며, 양성 대조 물질인 메게스테롤 투여군 G3와 유사한 수준을 나타냈다.

Claims (13)

  1. 이온 화합물을 포함하는 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 이온 화합물은 칼슘 양이온, 제1 음이온 및 제2 음이온을 포함하고,
    상기 제1 음이온 및 상기 제2 음이온은 서로 상이한 것이며, 각각 독립적으로 아스코빅산(Ascorbic acid), 다이클로로아세트산(Dichloroacetic acid), 분지쇄 아미노산(Branched-chain amino acid; BCAA) 또는 이들의 유도체의 음이온인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분지쇄 아미노산은 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine) 및 발린(Valine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 이온 화합물이 20 내지 4800 mg/kg/일의 투여량으로 투여되는 것인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 수성 용매를 더 포함하고,
    상기 이온 화합물의 해리도는 1 내지 50%인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    식욕증진제, 항암제, 염증완화제, 항균제, 항진균제, 항바이러스제, 면역조절제, 스테로이드제, 항응고제, 항경련제, 항우울제, 항산화제 및 비타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성제를 더 포함하는 것인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 액제, 산제, 경구제, 주사제, 수액제, 에어로졸, 정제, 캡슐제, 환제, 데포제 또는 좌제로 제형화되는 것인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 경구 투여, 정맥 내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여 또는 점막 투여되는 것인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 악액질 및 근손실은 암, 결핵, 당뇨, 에이즈, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 혈우병, 하수체기능저하증(hypopituitarism) 또는 간경화에 의해 유발되는 것인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 간암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 신장암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 근손실은 노인성근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 근무력증(myasthenia gravis)에 의해 유발되는 것인, 악액질 및 근손실의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 이온 화합물을 포함하는 식품 조성물로서,
    상기 이온 화합물은 칼슘 양이온, 제1 음이온 및 제2 음이온을 포함하고,
    상기 제1 음이온 및 상기 제2 음이온은 서로 상이한 것이며, 각각 독립적으로 아스코빅산, 다이클로로아세트산, 분지쇄 아미노산 또는 이들의 유도체의 음이온인, 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 건강기능성 식품인, 식품 조성물.
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