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WO2024253201A1 - 試料中の標的物質を検出する方法及びそのためのキット - Google Patents

試料中の標的物質を検出する方法及びそのためのキット Download PDF

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WO2024253201A1
WO2024253201A1 PCT/JP2024/020941 JP2024020941W WO2024253201A1 WO 2024253201 A1 WO2024253201 A1 WO 2024253201A1 JP 2024020941 W JP2024020941 W JP 2024020941W WO 2024253201 A1 WO2024253201 A1 WO 2024253201A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
stranded nucleic
specific binding
acid fragment
target substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/020941
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
祐二 久保
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toppan Holdings Inc
Original Assignee
Toppan Holdings Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toppan Holdings Inc filed Critical Toppan Holdings Inc
Publication of WO2024253201A1 publication Critical patent/WO2024253201A1/ja
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Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target substance in a sample and a kit therefor.
  • VUS variable of unknown significance
  • VUS VUS protein synthesized in the cells
  • This type of evaluation method requires a lot of time, effort, and cost.
  • Digital measurement includes digital ELISA and digital PCR.
  • the sample solution is divided into an extremely large number of micro-solutions.
  • the signal from each micro-solution is then binarized, and the number of molecules of the target substance is measured by determining only whether or not the target substance is present.
  • Digital measurement can significantly improve detection sensitivity and quantitation compared to conventional ELISA and real-time PCR methods.
  • Non-Patent Document 1 describes a microwell array having microwells and flow channels for supplying reagents, etc., and describes performing digital ELISA using the microwell array.
  • Patent Document 1 reports a method for detecting proteins using antibodies modified with oligonucleotides, called Proximity Ligation Assay (PLA). This method uses PCR or RCA for detection.
  • PLA Proximity Ligation Assay
  • Patent Document 2 describes a method for detecting protein interactions between two molecules using an antibody modified with an oligonucleotide. This method also uses the PCR method or the RCA method for detection.
  • Non-Patent Document 3 describes a microwell array having microwells and flow channels for supplying reagents, etc., and describes how cells are used to express signal transduction within the microwell array and how phosphorylated proteins are detected. The state of signal transduction is monitored by detecting phosphorylated proteins.
  • Alpha SureFire https://www.perkinelmer.co.jp/assays/tabid/346/Default.aspx, PerkinElmer is an assay system that can detect kinase activity on a cell-based basis without washing procedures. This system detects phosphorylated proteins from cell extracts.
  • reaction solutions that effectively suppress non-specific adsorption to various substances are being investigated. These reaction solutions are called blocking agents.
  • Blocking agents that have traditionally been used are those based on biological proteins such as bovine serum albumin, casein, and gelatin, highly hydrophilic inorganic particles, and polymers containing phosphorylcholine groups.
  • Non-Patent Document 4 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine copolymer (MPC polymer) is used as a blocking agent to prevent non-specific adsorption.
  • MPC polymer 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine copolymer
  • Kan C. W., et al. Isolation and detection of single molecules on paramagnetic beads using sequential fluid flows in microfabricated polymer array assemblies., Lab on a Chip, 12 (5), 977-985, 2012.
  • Mohammed H., et al. Approaches for Assessing and Discovering Protein Interactions in Cancer., Mol Cancer Res, 11 (11), 1295-1302, 2013.
  • Blazek M., et al. Proximity Ligation Assay for High-content Profiling of Cell Signaling Pathways on A Microfluidic Chip., Molecular & Cellular Proteomics 12: 10.1074/mcp.M113.032821, 3898-3907, 2013.
  • Y. Iwasaki, K. Ishihara. Phosphorylcholine-containing polymers for biomedical applications., Anal Bioanal Chem 381, 534-546, 2005.
  • FIG. 1 shows a portion of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction as an example.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • the mutant protein is BRAF
  • VUS unknown clinical significance
  • MEK the substrate of BRAF
  • BRAF the substrate of BRAF
  • upstream stimulation as shown in the left side of Figure 1.
  • BRAF is constitutively active, as shown in the right side of Figure 1, and phosphorylates MEK, the substrate, even in the absence of upstream stimulation.
  • Such BRAF causes cancer.
  • the present invention aims to provide a method for detecting a target substance in a sample and a kit for the same.
  • functional analysis (also called evaluation) of VUS can be performed easily, quickly, and efficiently.
  • a method for detecting a target substance in a sample comprising: incubating a mixture containing the sample, a first specific binding substance for the target substance, which is labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment, and a second specific binding substance for the target substance, which is labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment, so that, if the target substance is present in the sample, a complex containing the target substance, the first specific binding substance, and the second specific binding substance is formed, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment hybridize to form a double-stranded nucleic acid; and detecting the formation of the double-stranded nucleic acid.
  • the method wherein detection of the formation of the double-stranded nucleic acid indicates the presence of the target substance in the sample, and the mixture further comprises 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine copolymer (MPC polymer), or the mixture further comprises casein and a nonionic surfactant.
  • MPC polymer 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine copolymer
  • the MPC polymer is a copolymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and a comonomer having at least one group selected from the group consisting of a hydrophobic group, a hydrophilic group, an anionic group, and a cationic group.
  • [3] The method according to [1] or [2], wherein the concentration of the MPC polymer in the mixture is 0.01 to 0.5% (w/v).
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the mixture is incubated in a well, and the volume of the well is 10 fL to 100 pL.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the first single-stranded nucleic acid fragment and the second single-stranded nucleic acid fragment each have a base length of 10 to 200 bases.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the step of detecting the formation of the double-stranded nucleic acid is carried out by an invasive cleavage assay.
  • a kit for detecting a target substance in a sample comprising: a well array having a plurality of wells; a first specific binding substance for the target substance labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment; a second specific binding substance for the target substance labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment; and a buffer containing an MPC polymer or containing casein and a nonionic surfactant.
  • the kit according to [7] further comprising a sealing liquid for sealing the opening of the well.
  • a method for detecting a target substance in a sample comprising: incubating a mixture containing the sample, a first specific binding substance for the target substance labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment, a second specific binding substance for the target substance labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment, and a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine copolymer, so that a complex containing the target substance, the first specific binding substance, and the second specific binding substance is formed, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment hybridize to form a double-stranded nucleic acid; detecting the formation of said double stranded nucleic acid; A method for detecting a target substance, wherein detection of the formation of the double-stranded nucleic acid indicates the presence of the target substance in the sample.
  • the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine copolymer is a copolymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and a comonomer having at least one group selected from the group consisting of a hydrophobic group, a hydrophilic group, an anionic group, and a cationic group.
  • concentration of the MPC polymer in the mixture is 0.01 to 0.5% (w/v).
  • a method for detecting a target substance in a sample comprising: incubating a mixture containing the sample, a first specific binding substance for the target substance, which is labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment, a second specific binding substance for the target substance, which is labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment, and a buffer containing casein and a nonionic surfactant, so that a complex containing the target substance, the first specific binding substance, and the second specific binding substance is formed, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment hybridize to form a double-stranded nucleic acid; detecting the formation of said double stranded nucleic acid; A method for detecting a target substance, wherein detection of the formation of the double-stranded nucleic acid indicates the presence of the target substance in the sample.
  • [15] The method according to any one of [11] to [14], wherein the mixture is incubated in a well, and the volume of the well is 10 fL to 100 pL.
  • [16] The method according to any one of [11] to [15], wherein the first single-stranded nucleic acid fragment and the second single-stranded nucleic acid fragment each have a base length of 10 to 200 bases.
  • [17] The method according to any one of [11] to [16], wherein the step of detecting the formation of the double-stranded nucleic acid is carried out by invasive cleavage assay.
  • a kit for detecting a target substance in a sample comprising: a well array having a plurality of wells; a first substance that specifically binds to the target substance and is labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment; a second substance that specifically binds to the target substance and is labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment; and a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine copolymer.
  • a kit for detecting a target substance in a sample comprising: a well array having a plurality of wells; a first specific binding substance for the target substance, the first specific binding substance being labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment; a second specific binding substance for the target substance, the second specific binding substance being labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment; and a buffer containing casein and a nonionic surfactant.
  • the kit according to [18] or [19] further comprising a sealing liquid for sealing the opening of the well.
  • kit according to any one of [18] to [20], further comprising a reagent for detecting a double-stranded nucleic acid formed by hybridization of at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment.
  • the present invention provides a method for detecting a target substance in a sample and a kit for the same.
  • the present invention enables functional analysis (evaluation) of VUS to be performed simply, quickly, and efficiently.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating normal and deleterious mutations.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a method for detecting a target substance.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a method for detecting a target substance.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view illustrating a method for detecting a target substance.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view illustrating a method for detecting a target substance.
  • FIG. 7 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 8 is a schematic cross-sectional view illustrating a method for detecting a target substance.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating normal and deleterious mutations.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a method for detecting a target substance.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a method for detecting a
  • FIG. 9 is a schematic cross-sectional view illustrating a method for detecting a target substance.
  • Figure 10 is a schematic diagram illustrating an example of the Invasive Cleavage Assay (ICA) method.
  • FIG. 11 is a schematic diagram illustrating a method for evaluating the activity of a target protein.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 17 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 18 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 19 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 21 is a graph showing the results of Experimental Example 4.
  • the present invention provides a method for detecting a target substance in a sample, the method comprising: incubating a mixture containing the sample, a first specific binding substance for the target substance, which is labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment, and a second specific binding substance for the target substance, which is labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment, so that, if the target substance is present in the sample, a complex containing the target substance, the first specific binding substance, and the second specific binding substance is formed, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment hybridize to form a double-stranded nucleic acid; and detecting the formation of the double-stranded nucleic acid, wherein detection of the formation of the double-stranded nucleic acid indicates the presence of the target substance in the sample
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating the method of this embodiment.
  • FIG. 2 shows an example of detecting a phosphorylated protein 120 as a target substance.
  • a phosphate group is indicated by the symbol 160.
  • step (a) a mixture containing a sample, a first specific binding substance 140 for the target substance 120 labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment 141, and a second specific binding substance 170 for the target substance 120 labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment 171 is incubated.
  • the first specific binding substance 140 and the second specific binding substance 170 recognize different epitopes on the target substance 120.
  • the specific binding substance 170 recognizes a region containing a phosphate group 160 of the phosphorylated protein 120.
  • a complex 900 is formed that contains the target substance 120, the first specific binding substance 140, and the second specific binding substance 170, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment 141 and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment 171 hybridize to form a double-stranded nucleic acid (also called a double-stranded nucleic acid region) 150.
  • a double-stranded nucleic acid also called a double-stranded nucleic acid region
  • step (b) the formation of double-stranded nucleic acid 150 is detected. Detection of the formation of double-stranded nucleic acid 150 indicates the presence of target substance 120 in the sample. The detection of the formation of double-stranded nucleic acid 150 will be described later.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a different aspect of this embodiment.
  • the target substance is a bond between protein 110 and protein 120.
  • step (a) a mixture containing a sample, a first specific binding substance 140 for protein 120 labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment 141, and a second specific binding substance 130 for protein 110 labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment 131 is incubated.
  • a complex 100 is formed that contains the conjugate of protein 110 and protein 120, which is the target substance, a first specific binding substance 140, and a second specific binding substance 130, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment 141 and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment 131 hybridize to form a double-stranded nucleic acid (also called a double-stranded nucleic acid region) 150.
  • a double-stranded nucleic acid also called a double-stranded nucleic acid region
  • step (b) the formation of double-stranded nucleic acid 150 is detected.
  • the detection of the formation of double-stranded nucleic acid 150 indicates the presence of a bound body of protein 110 and protein 120, which are the target substances, in the sample. In other words, the detection of the formation of double-stranded nucleic acid 150 indicates that protein 110 and protein 120 interact with each other.
  • the method of FIG. 3 may be applied when the protein of interest 110 does not bind (i.e., does not interact) with the target protein 120, in which case the formation of the double-stranded nucleic acid 150 is not detected.
  • the detection of the formation of the double-stranded nucleic acid 150 is described below.
  • the time required to detect the target substance can be shortened.
  • the signal-to-noise ratio (sometimes referred to as S/N) can be increased by further including casein and a nonionic surfactant in the mixed solution.
  • the mixed solution contains casein, a nonionic surfactant, and tris(hydroxymethyl)aminomethane, not only can the signal-to-noise ratio (S/N) be increased, but the time required to detect the target substance can also be shortened.
  • S/N signal-to-noise ratio
  • the method of this embodiment allows the activity of mutant proteins to be evaluated easily and quickly.
  • the function of VUS can be analyzed (i.e., evaluated) easily, quickly, and efficiently.
  • MPC polymer is a polymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) that has a phospholipid polar group (also called a phosphorylcholine group) and a methacryloyl group in the molecule.
  • MPC polymer is a polymer that mimics biological membranes, and is considered to have a high level of biocompatibility, such as extremely low interaction with biological components such as proteins and blood cells, and excellent antithrombotic properties.
  • MPC polymer can be copolymerized with various comonomers, and various properties can be imparted depending on the type of comonomer.
  • the MPC polymer may be a copolymer with a comonomer having at least one group selected from the group consisting of a hydrophobic group, a hydrophilic group, an anionic group, and a cationic group.
  • a comonomer having at least one group selected from the group consisting of a hydrophobic group, a hydrophilic group, an anionic group, and a cationic group Commercially available MPC polymers can be used, and specific examples include the Lipidure (registered trademark)-BL series (NOF Corp.).
  • the MPC polymer that can be preferably used is one having a surface tension of 70 to 80 ⁇ 10 ⁇ 3 N/m as measured using a 0.1 wt % aqueous solution at 25° C.
  • the MPC polymer that can be preferably used is one having a kinetic viscosity of 3 cSt or less or 20 to 30 cSt as measured using a 1 wt % aqueous solution at 25° C.
  • the surface tension of a 0.1 wt % aqueous solution of MPC polymer can be measured using a surface tensiometer (e.g., DY-700, manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.).
  • the dynamic viscosity of a 0.1 wt % aqueous solution of MPC polymer can be measured using a viscometer (e.g., Canon-Fenske Inverse Particle Size SF No. 150, manufactured by Shibata Scientific Co., Ltd.).
  • a viscometer e.g., Canon-Fenske Inverse Particle Size SF No. 150, manufactured by Shibata Scientific Co., Ltd.
  • the concentration of the MPC polymer in the mixed solution is preferably 0.01 to 0.5% (w/v), more preferably 0.01 to 0.1% (w/v), and even more preferably 0.01 to 0.05% (w/v).
  • Casein is a type of naturally occurring phosphoprotein found in milk and cheese.
  • concentration of casein in the mixture is preferably about 0.0025 to 1% by mass, and more preferably about 0.01 to 1% by mass.
  • Nonionic surfactants are surfactants that do not contain ionic groups as polar groups, and examples of such surfactants include acetylene glycol surfactants such as ethylene oxide and/or propylene oxide adducts of acetylene glycol (specifically, ethylene oxide and/or propylene oxide adducts such as 2,4,7,9-tetramethyl-5-decyne-4,7-diol, 3,6-dimethyl-4-octyne-3,6-diol, etc.); acetylene alcohol surfactants such as ethylene oxide and/or propylene oxide adducts of acetylene alcohol (specifically, ethylene oxide and/or propylene oxide adducts such as 3,5-dimethyl-1-hexane-3-ol, etc.); polyoxyethylene nonylphenyl ether, polyoxyethylene octylphenyl ether, polyoxyethylene tetrahydrofuran ...
  • the surfactant examples include ether surfactants such as diethylene dodecyl phenyl ether, polyoxyethylene alkyl allyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, and polyoxyalkylene alkyl ether; ester surfactants such as polyoxyethylene oleic acid, polyoxyethylene oleic acid ester, polyoxyethylene distearate ester, sorbitan laurate, sorbitan monostearate, sorbitan monooleate, sorbitan sesquioleate, polyoxyethylene monooleate, and polyoxyethylene stearate; polyether-modified siloxane surfactants such as dimethylpolysiloxane; and other fluorine-containing surfactants such as fluorine alkyl esters and perfluoroalkyl carboxylates.
  • concentration of the nonionic surfactant in the mixture is preferably about 0.0025 to 1% by mass, and
  • Tris(hydroxymethyl)aminomethane is a type of buffer. Tris(hydroxymethyl)aminomethane may be in the form of a salt. An example of a salt of tris(hydroxymethyl)aminomethane is tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride.
  • the concentration of tris(hydroxymethyl)aminomethane in the mixture is preferably about 0.0025 to 1% by mass, and more preferably about 0.01 to 1% by mass.
  • the base length of the first single-stranded nucleic acid fragment 141 may be 10 to 200 bases.
  • the base length of the second single-stranded nucleic acid fragment 171 (131) may also be 10 to 200 bases.
  • the length of the double-stranded nucleic acid 150 formed by hybridization of at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment 141 and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment 171 (131) is preferably about 7 to 30 bases, and may be, for example, 9 bases, 12 bases, or 15 bases.
  • protein 110 may be a protein having a genetic variant of unknown clinical significance (VUS).
  • VUS unknown clinical significance
  • Protein 110 may be, for example, a kinase. More specific target proteins include proteins in intracellular signal transduction pathways, such as BRAF, A-RAF, Raf, MAP3K 4/12, MAP3K11, ASK1, and TAK1.
  • BRAF protein having a genetic variant of unknown clinical significance
  • A-RAF protein having a genetic variant of unknown clinical significance
  • Raf proteins in intracellular signal transduction pathways
  • MAP3K 4/12 proteins in intracellular signal transduction pathways
  • MAP3K11 MAP3K11
  • ASK1 MAP3K11
  • TAK1 TAK1
  • the detection shown in the example of FIG. 2 can be performed in the presence of a kinase (protein 110) having a VUS, and by detecting phosphorylation of protein 120, it is possible to evaluate whether or not the kinase (protein 110) having a VUS is in a constitutively activated state.
  • the method of this embodiment can be carried out by digital measurement.
  • the mixed solution is incubated in a well, and the well preferably constitutes a well array in which multiple wells are arranged.
  • the well array is arranged within a flow path of the fluidic device.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device in which the method of this embodiment can be suitably implemented.
  • the fluidic device 200 includes a substrate 210 and a lid member 220 arranged opposite the substrate 210.
  • the lid member 220 has a convex portion 221, and the tip of the convex portion 221 contacts the substrate 210.
  • the well array 240 is integrally molded with the substrate 210 on one side of the substrate 210 and faces the lid member 220.
  • the well array 240 has a plurality of wells 241.
  • the lid member 220 may be welded or bonded to the substrate 210.
  • the wells 241 open onto the surface of the substrate 210.
  • the wells 241 are microwells with a small volume.
  • the volume of one well 241 may be approximately 10 fL to 100 pL, or 50 fL to 1200 fL.
  • multiple wells 241 of the same shape and size form a well array 240.
  • the same shape and size means that the wells have the same shape and capacity to the extent required for digital measurement, and variations within the range of manufacturing errors are acceptable.
  • the diameter of the wells 241 may be, for example, about 1 to 10 ⁇ m, and the depth of the wells 241 may be, for example, about 1 to 10 ⁇ m.
  • the arrangement of the wells 241 is not particularly limited, and may be, for example, arranged in a triangular lattice pattern, a square lattice pattern, or randomly arranged.
  • a space is formed between the well array 240 and the cover member 220 due to the presence of the convex portion 221.
  • This space constitutes the flow path 230.
  • the flow path 230 functions as a path for transporting a liquid in which the target substance, the protein, the first specific binding substance, the second specific binding substance, etc. are dispersed, and a sealing liquid described below.
  • the height of the flow path 230 (the distance between the surface of the substrate 210 and the surface of the cover member 220 facing the substrate 210) may be, for example, 500 ⁇ m or less, for example, 300 ⁇ m or less, for example, 200 ⁇ m or less, or for example, 100 ⁇ m or less.
  • the protrusion 221 may be molded integrally with the lid member 220.
  • the lid member 220 can be molded into a plate shape having the protrusion 221, for example, by molding a thermoplastic resin fluid using a molding die.
  • the lid member 220 may also be formed with an inlet port 222 and an outlet port 223 for the reagent.
  • the lid member 220 has a protrusion 221
  • the lid member 220 and the substrate 210 are overlapped so that the protrusion 221 contacts the surface of the substrate 210 where the well 241 opens.
  • the space between the lid member 220 and the substrate 210 becomes the flow path 230.
  • the lid member 220 and the substrate 210 may be welded by laser welding or the like.
  • FIG. 7 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • the fluidic device 500 includes a substrate 210 and a wall member 510.
  • the well array 240 is integrally formed with the substrate 210 on one side of the substrate 210.
  • the well array 240 has a plurality of wells 241.
  • the fluidic device 500 differs mainly from the above-described fluidic device 200 in that the fluidic device 500 does not include a cover member 220.
  • the lid member 220 and the protrusion 221 are integrally molded.
  • the lid member 220 and the protrusion 221 may be molded as separate bodies.
  • the well array 240 is integrally molded with the substrate 210 on one side of the substrate 210.
  • the well array does not have to be integrally molded with the substrate 210.
  • the well array 240 molded separately from the fluidic device may be disposed on the substrate 210 of the fluidic device.
  • a resin layer may be laminated on the surface of the substrate 210, and the well array may be formed in the resin layer by etching or the like.
  • the substrate 210 is formed, for example, using a resin.
  • a resin there is no particular limit to the type of resin, but it is preferable that the resin is resistant to reagents and sealing liquid. Furthermore, if the signal to be detected is fluorescence, it is preferable that the resin has little autofluorescence.
  • resins include, but are not limited to, cycloolefin polymers, cycloolefin copolymers, silicone, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyethylene, polyvinyl acetate, fluororesins, and amorphous fluororesins.
  • a plurality of wells 241 may be formed on one surface of the substrate 210 in the thickness direction.
  • Methods for forming wells using resin include injection molding, thermal imprinting, and optical imprinting.
  • a fluororesin may be laminated on the substrate 210 and the fluororesin may be processed by etching or the like to form a well array.
  • CYTOP registered trademark
  • Asahi Glass or the like may be used as the fluororesin.
  • the material of the lid member 220 is preferably a resin with low autofluorescence, and may be, for example, a thermoplastic resin such as a cycloolefin polymer or a cycloolefin copolymer.
  • the lid member 220 may be made of a material that does not transmit light of wavelengths close to the wavelength detected during fluorescent observation of the signal, or may be made of a material that does not transmit light at all.
  • the lid member 220 may be made of a thermoplastic resin to which carbon, metal particles, etc. have been added.
  • the method of this embodiment is a method for detecting a target substance 120 in a sample, and includes a step (a) of incubating a mixture containing the sample, a first specific binding substance 140 for the target substance 120 labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment 141, and a second specific binding substance 170 for the target substance 120 labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment 171, and forming a complex 900 containing the target substance 120, the first specific binding substance 140, and the second specific binding substance 170 when the target substance 120 is present in the sample, and hybridizing at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment 141 and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment 171 to form a double-stranded nucleic acid 150, and a step (b) of detecting the formation of the double-stranded nucleic acid 150, and the detection of the formation of the double-stranded nucleic acid 150 indicates the presence of
  • the method of this embodiment is similar to that of the example in Figure 3, in which the target substance is a conjugate of protein 110 and protein 120, except that a second specific binding substance 130 for protein 110 is used as the second specific binding substance.
  • the mixture further contains an MPC polymer, or further contains casein and a nonionic surfactant. More preferably, the mixture further contains casein, a nonionic surfactant, and tris(hydroxymethyl)aminomethane.
  • the method of this embodiment can shorten the time required to detect a target substance in a sample or increase the signal-to-noise ratio (S/N).
  • the present invention can perform functional analysis (also called evaluation) of VUS simply, quickly, and efficiently.
  • the mixed liquid L210 is introduced from the inlet port 222 of the fluidic device 200 and sent to the flow path 230.
  • the mixed liquid L210 contains an MPC polymer, and is a liquid in which the target substance 120, the first specific binding substance 140, and the second specific binding substance 170 are dispersed, and also contains a reagent for detecting the formation of double-stranded nucleic acid 150.
  • the mixed solution L210 sent to the flow path 230 comes into contact with the well array 240. Then, the mixed solution L210 is contained inside the well 241. As a result, the MPC polymer, the target substance 120, the first specific binding substance 140, the second specific binding substance 170, and a reagent for detecting the formation of the double-stranded nucleic acid 150 are introduced into the well 241.
  • the mixed solution L210 contains a complex 900 containing the target substance 120, the first specific binding substance 140, and the second specific binding substance 170.
  • the number of complexes 900 introduced into one well 241 is not particularly limited, but preferably one or less complexes 900 are introduced into one well 241, i.e., 0 or 1 complex 900. This allows detection of the complexes 900 on a single unit basis, i.e., digital measurement is possible. In addition, it is not necessary for the complexes 900 to be introduced into all wells of the well array.
  • the means for introducing the complex 900 into the well is not particularly limited, and examples include a method in which the complex 900 is allowed to settle in the fluid device (specifically, in the flow channel) by its own weight and distributed to the well.
  • a substance that captures the complex 900 hereinafter, sometimes referred to as a capture material
  • the capture material may be bound to the complex 900 that does not easily settle by its own weight and then delivered. It is also possible to improve the efficiency of introducing the complex 900 into the well by immobilizing the capture material in advance in the well and capturing the delivered complex 900.
  • the step of binding the capture substance to the complex 900 can be performed at any point in the method of this embodiment.
  • this step can be performed by contacting the complex 900 with the capture substance in a sample tube before the step of introducing the complex 900 into the well 241.
  • the capture substance can be introduced into the well 241, and then the complex 900 can be introduced into the well and the capture substance can be contacted with the complex 900 in the well.
  • the capture material is a substance capable of capturing the complex 900.
  • the capture material may be, for example, a conjugate between a solid phase and a substance that specifically binds to the complex 900.
  • the solid phase may be a particle, a membrane, a substrate, or the like.
  • the number of specific binding substances to the complex 900 may be one or more. For example, there may be three, four, or five or more types.
  • the particles are not particularly limited, and examples thereof include polymer particles, magnetic particles, and glass particles.
  • the particles are preferably surface-treated to avoid non-specific adsorption.
  • particles having functional groups such as carboxyl groups on the surface are preferable for immobilizing specific binding substances. More specifically, products such as "Magnosphere LC300" manufactured by JSR Corporation can be used.
  • Examples of the specific binding substance in the first specific binding substance 140, the second specific binding substance 170, and the captured substance include an antibody, an antibody fragment, and an aptamer.
  • Examples of the antibody fragment include Fab, F(ab') 2 , Fab', a single-chain antibody (scFv), a disulfide-stabilized antibody (dsFv), a dimerized V region fragment (diabody), and a peptide containing CDR.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Alternatively, the antibody may be a commercially available antibody.
  • a method for labeling a specific binding substance with a single-stranded nucleic acid fragment includes a method using a crosslinking agent.
  • the single-stranded nucleic acid fragment may be labeled with a specific binding substance via a linker molecule.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polyethylene chains, hydrocarbon chains, and peptides.
  • the single-stranded nucleic acid fragment may be DNA or RNA. It may also include artificial nucleic acids such as BNA and LNA.
  • the method of immobilizing a specific binding substance on the particle surface is not particularly limited, and examples thereof include physical adsorption, chemical bonding, avidin-biotin bonding, and antibody bonding.
  • Physical adsorption methods include methods of immobilizing a specific binding substance on the particle surface by hydrophobic or electrostatic interaction.
  • Chemical bonding methods include methods using a crosslinking agent.
  • the specific binding substance can be immobilized on the particle surface by reacting a crosslinking agent with the carboxyl groups of the specific binding substance to form an active ester, and then reacting the hydroxyl groups with the ester groups. It is also preferable to provide a spacer between the specific binding substance and the particle surface so as not to inhibit the ability of the specific binding substance to recognize target molecules.
  • the complex 900 when the complex 900 is introduced into the well 241 using a capture agent, it is preferable to form a conjugate between the capture agent and the complex 900 under conditions where 0 or 1 complex 900 is captured per capture agent. Furthermore, it is preferable to configure each well 241 so that 0 or 1 capture agent is introduced. This makes digital measurement possible.
  • a complex 900 containing them is formed, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment 141 and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment 171 hybridize to form a double-stranded nucleic acid 150.
  • the formation of the complex 900 may be performed in a sample tube or in a well 241.
  • a step of sealing the opening of the well 241 may be carried out.
  • the method of sealing the opening of the well 241 is not particularly limited as long as it can prevent the liquid contained in one well 241 from mixing with the liquid contained in another well 241, and for example, the opening of the well 241 may be sealed by covering it with a sealing liquid. Alternatively, the opening of the well 241 may be sealed by stacking a plate-like member such as a glass plate on it.
  • sealing liquid L220 is sent from the inlet port 222 of the lid member 220 to the flow path 230 between the substrate 210 and the lid member 220.
  • the sealing liquid L220 sent to the flow path 230 comes into contact with the well array 240.
  • the sealing liquid L220 then pushes away and replaces the reagent liquid L210 sent to the flow path 230 that is not contained in the wells 241.
  • the sealing liquid L220 individually seals each of the multiple wells 241 that contain the mixed liquid L210 containing the target substance 120, and the wells 241 become independent reaction spaces (i.e., microcompartments 242).
  • FIG. 6 shows the state in which all of the wells 241 in the well array 240 have been sealed with sealing liquid L220, forming sealed wells (i.e., microcompartments) 242.
  • lipid bilayer membrane can be formed at the opening of the well 241, and the multiple wells 241 can be individually sealed with the lipid bilayer membrane to form sealed wells 242.
  • lipids that form lipid bilayer membranes include, but are not limited to, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG), mixtures thereof, etc.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPG 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • the sealing liquid is a liquid that can form droplets (also called microdroplets) by individually sealing the liquids introduced into the multiple wells 241 so that they do not mix with each other, and is preferably an oil-based solution, and more preferably an oil.
  • oil fluorine-based oil, silicone-based oil, hydrocarbon-based oil, or a mixture of these oils can be used. More specifically, Sigma's product name "FC-40" can be used.
  • FC-40 (CAS number: 86508-42-1) is a fluorinated aliphatic compound with a specific gravity of 1.85 g/mL at 25°C.
  • the formation of the double-stranded nucleic acid 150 is detected.
  • the formation of the double-stranded nucleic acid 150 is preferably detected using a signal amplification reaction.
  • An example of the signal amplification reaction is the Invasive Cleavage Assay (ICA).
  • the ICA reaction is based on the principle that signal amplification proceeds through a cycle of two reactions: (1) complementary binding between nucleic acids, and (2) recognition and cleavage of the triple-stranded structure by an enzyme.
  • the ICA reaction is less susceptible to reaction cycle inhibition by impurities. Therefore, by using the ICA reaction, the formation of the double-stranded nucleic acid 150 can be detected with high accuracy.
  • the mixed liquid L210 (a liquid containing the MPC polymer, the target substance 120, the first specific binding substance 140, and the second specific binding substance 170) further contains reaction reagents necessary for the ICA reaction.
  • the reaction reagents required for the ICA reaction include ICA reaction reagents such as a flap probe, a flap endonuclease (FEN), and a fluorescent substrate.
  • the flap probe is a nucleic acid fragment designed to hybridize with the first single-stranded nucleic acid fragment 141 or the second single-stranded nucleic acid fragment 171 to form a flap structure with the double-stranded nucleic acid 150.
  • FIG. 10 is a schematic diagram illustrating an example of the ICA method.
  • the ICA method detects double-stranded nucleic acid 150 formed by hybridization of at least a part of a first single-stranded nucleic acid fragment 141 and at least a part of a second single-stranded nucleic acid fragment 171.
  • a flap probe is hybridized to the first single-stranded nucleic acid fragment 141 or the second single-stranded nucleic acid fragment 171.
  • the flap probe 810 hybridizes to the second single-stranded nucleic acid fragment 171.
  • a first flap site 811 is formed.
  • the first flap site 811 is cleaved to generate a nucleic acid fragment 811.
  • the nucleic acid fragment 811 then hybridizes to a fluorescent substrate (i.e., nucleic acid fragment 820) to form a second flap site 821.
  • a fluorescent substance F is bound to the 5' end of the nucleic acid fragment 820, and a quencher Q is bound to a few bases 3' from the 5' end of the nucleic acid fragment 820.
  • FEN is reacted with the second flap site 821
  • the second flap site 821 is cleaved and the nucleic acid fragment 821 is generated.
  • the fluorescent substance F is separated from the quencher Q and a fluorescent signal is generated.
  • the formation of the double-stranded nucleic acid 150 can be detected.
  • the mixed liquid L210 may be a typical liquid used in biochemical analysis performed using a fluid device, and is preferably an aqueous solution.
  • the mixed liquid L210 may contain a surfactant or the like to make it easier to seal the liquid in the well.
  • ICA reaction When an ICA reaction is used to detect the formation of double-stranded nucleic acid 150, if double-stranded nucleic acid 150 is present, fluorescent substance F is released from quenching substance Q by an isothermal enzyme reaction, and a predetermined fluorescent signal is emitted in response to excitation light.
  • the formation of double-stranded nucleic acid 150 can be detected by selecting an appropriate known method depending on the type of signal to be detected. For example, when observing a fluorescent signal, excitation light corresponding to the fluorescent substance is irradiated onto well 242, and the fluorescence emitted by the fluorescent substance is observed. For example, as shown in FIG. 6, a predetermined reaction is carried out within sealed well 242, and the generated signal is observed.
  • well 242R is a well in which a signal was detected
  • well 242 is a well in which a signal was not detected.
  • the mixed liquid L210 is introduced into the fluid device 500.
  • the mixed liquid L210 is a liquid in which the target substance 120, the first specific binding substance 140, and the second specific binding substance 170 are dispersed, and also contains a reagent for detecting the formation of the double-stranded nucleic acid 150.
  • the mixed liquid L210 contains a complex 900 containing the target substance 120, the first specific binding substance 140, and the second specific binding substance 170.
  • the concentration of the complex 900 is preferably adjusted to a concentration such that one or less molecule of the complex 900 is contained per well 241.
  • sealing liquid L220 is introduced into the fluidic device 500.
  • the specific gravity of the sealing liquid L220 is greater than that of the mixed liquid L210. Therefore, the sealing liquid L220 sinks below the mixed liquid L210 that is not contained in the wells 241, and comes into contact with the well array 240.
  • the sealing liquid L220 then individually seals each of the multiple wells 241 that contain the mixed liquid L210 containing the complexes 900, forming independent reaction spaces (i.e., microcompartments 242).
  • well 242R is a well in which a signal was detected
  • well 242 is a well in which a signal was not detected.
  • the method of this embodiment may include a step of synthesizing a kinase (protein 110) having a VUS in a cell-free protein synthesis system, and a step of detecting phosphorylation of protein 120 in the presence of protein 110.
  • the method of this embodiment may include a step of synthesizing a kinase (protein 110) having a VUS in a cell-free protein synthesis system, and a step of detecting binding between protein 110 and protein 120.
  • the protein 110 may be synthesized in a cell-free protein synthesis system, and the formation of the complex 900 may be performed consecutively with the synthesis of the protein 110. This allows the activity of the protein 110 to be evaluated easily and in a short period of time when the protein 110 is a kinase or the like that contains a VUS.
  • a cell-free protein synthesis system is a synthesis system that does not synthesize proteins within cells, but rather synthesizes proteins in vitro from nucleic acid templates using ribosomes, transcription and translation factors, etc., derived from living cells or artificially synthesized.
  • the cell-free protein synthesis system may be a synthesis system that includes a transcription process in addition to the translation process.
  • the nucleic acid that codes for the protein is DNA
  • the cell-free protein synthesis system may contain factors that enable transcription. Examples of factors that enable transcription include, but are not limited to, RNA polymerase and nucleotides, and factors known to those skilled in the art may be used.
  • RNA may be synthesized in advance using DNA encoding a protein as a template, and the RNA may be added to a cell-free protein synthesis system.
  • artificially chemically synthesized RNA may be used.
  • the nucleic acid fragment that serves as a template for cell-free protein synthesis may be a nucleic acid fragment derived from a living organism, a nucleic acid fragment derived from a cultured cell, or a nucleic acid fragment derived from a virus.
  • the nucleic acid fragment may be artificially synthesized based on the results of genetic analysis.
  • Cell-free protein synthesis systems are not particularly limited, and examples include synthesis systems that utilize cell extracts obtained from wheat germ, yeast, insect cells, cultured mammalian cells, rabbit reticulocytes, Escherichia coli, etc.; and synthesis systems that reconstitute factors necessary for translation. Among these, cell-free protein synthesis using a human expression system is preferred.
  • the cell-free protein synthesis system may contain factors involved in translation, such as tRNA, aminoacylated tRNA synthetase, translation initiation factors, translation elongation factors, translation termination factors, etc.
  • adenosine triphosphate may be further contacted with the protein 110, the target substance 120, the first specific binding substance 140, and the second specific binding substance 170. This makes it possible to evaluate whether the target protein is phosphorylated. In other words, it becomes possible to perform a kinase assay.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing an example of the method of this embodiment.
  • the mutant protein is BRAF
  • VUS unknown clinical significance
  • cell-free protein synthesis In FIG. 11, cell-free protein synthesis, kinase assay, antigen-antibody reaction, and ICA reaction are performed consecutively. This allows the activity of the target protein, protein 110, to be evaluated more easily and in a shorter period of time.
  • the effect of an inhibitor can be determined by adding the inhibitor to the reaction system.
  • the method of this embodiment preferably does not include a washing step.
  • a washing step even when protein 110 is synthesized using a cell-free protein synthesis system in the embodiments of Figures 2 and 3, if it is possible to evaluate whether protein 110 binds to protein 120 without including a washing step, the activity evaluation of protein 110 can be performed more simply and in a shorter period of time.
  • the present invention provides a kit for detecting a target substance in a sample, comprising: (i) a well array having a plurality of wells; (ii) a first specific binding substance for the target substance, labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment; (iii) a second specific binding substance for the target substance, labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment; and (iv) a buffer comprising an MPC polymer or comprising casein and a nonionic surfactant.
  • the kit of this embodiment can be used to suitably carry out the method for detecting a target substance in a sample described above.
  • the kit of this embodiment includes a step of incubating a mixture containing a sample, a first specific binding substance for a target substance labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment, and a second specific binding substance for the target substance labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment, so that if the target substance is present in the sample, a complex containing the target substance, the first specific binding substance, and the second specific binding substance is formed, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment hybridize to form a double-stranded nucleic acid, and a step of detecting the formation of the double-stranded nucleic acid, and it can be said that the kit is for use in a method in which the detection of the formation of the double-stranded nucleic acid indicates the presence of the target substance in the sample.
  • the well array may be disposed inside the fluidic device described above.
  • the target substance, the first single-stranded nucleic acid fragment, the first specific binding substance, the second single-stranded nucleic acid fragment, and the second specific binding substance are the same as those described above.
  • the time required to detect the target substance can be shortened.
  • the signal-to-noise ratio (S/N) can be increased by including casein and a nonionic surfactant in the buffer.
  • the buffer contains casein, a nonionic surfactant, and tris(hydroxymethyl)aminomethane, not only can the signal-to-noise ratio (S/N) be increased, but the time required to detect the target substance can also be shortened.
  • S/N signal-to-noise ratio
  • the MPC polymer, casein, nonionic surfactant, and tris(hydroxymethyl)aminomethane are the same as those described above.
  • the kit of this embodiment may further contain ATP. This makes it possible to evaluate whether or not the target protein is phosphorylated. In other words, it makes it possible to perform a kinase assay.
  • the kit of this embodiment may further include a sealing liquid for sealing the openings of the wells of the well array.
  • the sealing liquid is the same as that described above.
  • the kit of this embodiment may further include a reagent for detecting a double-stranded nucleic acid formed by hybridization of at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment.
  • Such reagents include the reagents for the ICA reaction described above, specifically, flap probes, flap endonuclease (FEN), fluorescent substrates, etc.
  • the oligonucleotide DNA1 (5'-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAA-3', SEQ ID NO: 1) was bound to the anti-phosphorylated MEK rabbit polyclonal antibody to obtain a DNA1-modified anti-phosphorylated MEK rabbit polyclonal antibody.
  • an oligonucleotide, DNA2 (5'-GCATGGTTCCAATTTGGGTGAT-3', SEQ ID NO: 2), was bound to the anti-MEK rabbit polyclonal antibody to obtain a DNA2-modified anti-MEK rabbit polyclonal antibody.
  • An antigen-antibody reaction solution was prepared by mixing the reagents shown in Table 1 below.
  • BSA bovine serum albumin
  • TBS Tris-buffered saline
  • Antigen-antibody reaction and ICA reaction The above-mentioned antigen-antibody reaction solution and the above-mentioned ICA reaction solution were mixed and incubated for 60 minutes at 30° C. Then, the mixture was incubated for 60 minutes at 66° C. to carry out the ICA reaction.
  • Figures 12 and 13 are graphs showing the results of the immunoICA reaction.
  • the fluorescence intensity detected by the immunoICA reaction using phosphorylated MEK was taken as the signal (S)
  • the fluorescence intensity detected by the immunoICA reaction using non-phosphorylated MEK was taken as the noise (N)
  • S the fluorescence intensity detected by the immunoICA reaction using phosphorylated MEK
  • N the noise
  • Figure 12 is a graph showing the results of examining the effect of adding MPC polymer on the reaction rate.
  • the vertical axis indicates the time until the S/N ratio reaches its maximum value
  • the horizontal axis indicates the type of MPC polymer added.
  • BL103”, “BL203”, “BL206”, “BL405", “BL802”, “BL1002”, and “BL1003” respectively refer to Lipidure (registered trademark)-BL103, Lipidure (registered trademark)-BL203, Lipidure (registered trademark)-BL206, Lipidure (registered trademark)-BL405, Lipidure (registered trademark)-BL802, Lipidure (registered trademark)-BL1002, and Lipidure (registered trademark)-BL1003 (all NOF Corporation).
  • (-) indicates the results for a sample to which no MPC polymer was added. As a result, it became clear that the time required for the S/N ratio to reach its maximum value could be shortened by adding MPC polymer to the reaction solution.
  • Figure 13 is a graph showing the results of examining the effect of adding MPC polymer on S/N.
  • the vertical axis shows the maximum S/N.
  • the horizontal axis like Figure 12, shows the type of MPC polymer added. As a result, no improvement in S/N was observed even when MPC polymer was added to the reaction solution.
  • Figures 14 and 15 are graphs showing the results of the immunoICA reaction.
  • the fluorescence intensity detected by the immunoICA reaction using phosphorylated MEK was taken as the signal (S)
  • the fluorescence intensity detected by the immunoICA reaction using non-phosphorylated MEK was taken as the noise (N)
  • S the fluorescence intensity detected by the immunoICA reaction using phosphorylated MEK
  • N the noise
  • Figure 14 is a graph showing the results of examining the effect of the type of blocking buffer on the reaction rate.
  • the vertical axis indicates the time until the S/N ratio reaches its maximum value
  • the horizontal axis indicates the type of blocking buffer used.
  • “Solution A” means Can Get Signal buffer solution A (Toyobo)
  • “Solution B” means Can Get Signal buffer solution B (Toyobo).
  • Figure 15 is a graph showing the results of an investigation into the effect of the type of blocking buffer on the S/N ratio.
  • the vertical axis indicates the maximum S/N ratio
  • the horizontal axis like Figure 14, indicates the type of blocking buffer used.
  • the maximum S/N ratio could be increased by using a blocking buffer containing casein and a nonionic surfactant (Can Get Signal buffer solution A or Can Get Signal buffer solution B, both Toyobo) instead of 1% BSA-TBS as the blocking buffer.
  • a blocking buffer containing casein and a nonionic surfactant Can Get Signal buffer solution A or Can Get Signal buffer solution B, both Toyobo
  • Figures 16-17 are graphs showing the results of investigating the effect of adding Lipidure (registered trademark)-BL1002 and Lipidure (registered trademark)-BL1003, respectively, on ICA reactivity.
  • the vertical axis indicates ICA reaction intensity
  • the horizontal axis indicates reaction time.
  • Figure 18 shows the results of a sample to which no MPC polymer was added. As a result, an increase in reaction intensity was observed when MPC polymer was added to the reaction solution.
  • an ICA reaction was carried out by adding the MPC polymer shown in Table 2 or the blocking buffer shown in Table 3.
  • the fluorescence intensity when the target DNA was added was taken as the signal (S), and the fluorescence intensity when the target DNA was not added was taken as the noise (N), and the S/N was calculated.
  • Figure 19 shows the time (unit: seconds) required for the S/N to reach a maximum when the MPC polymer shown in Table 2 or the blocking buffer shown in Table 3 was added.
  • Figure 20 shows the maximum S/N when the MPC polymer shown in Table 2 or the blocking buffer shown in Table 3 was added.
  • PC shows the results of a sample to which the MPC polymer and blocking buffer were not added, for comparison.
  • the oligonucleotide DNA11 (5'-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAA-3', SEQ ID NO: 9) was bound to the anti-phosphorylated MEK rabbit polyclonal antibody to obtain a DNA11-modified anti-phosphorylated MEK rabbit polyclonal antibody.
  • an oligonucleotide, DNA12 (5'-GCATGGTTCCAATTTGGGTGAT-3', SEQ ID NO: 10), was bound to the anti-MEK rabbit polyclonal antibody to obtain a DNA12-modified anti-MEK rabbit polyclonal antibody.
  • Antigen-antibody reaction and ICA reaction The above-mentioned kinase assay and antigen-antibody reaction solution and the above-mentioned ICA reaction solution were mixed and incubated for 60 minutes at 30° C. Then, the mixture was incubated for 60 minutes at 66° C. to carry out the ICA reaction.
  • the blocking buffer concentration was set to 1, containing casein, a nonionic surfactant, and tris(hydroxymethyl)aminomethane, and reaction solutions were prepared with concentrations adjusted to 1/2 and 1/4, and measurements were performed using a real-time PCR device (Qiagen, Rotor-Gene Q).
  • the fluorescence intensity detected by the immuno-ICA reaction using phosphorylated MEK was taken as the signal (S)
  • the fluorescence intensity detected by the immuno-ICA reaction using non-phosphorylated MEK was taken as the noise (N)
  • S/N ratio was calculated.
  • Figure 21 is a graph showing the results of examining the effect of blocking buffer concentration on S/N.
  • the vertical axis shows the maximum S/N
  • the horizontal axis shows the time it takes for the S/N to reach the maximum.
  • the blocking buffer concentration which contains casein, a nonionic surfactant, and tris(hydroxymethyl)aminomethane
  • the maximum S/N ratio (4.3) was reached.
  • the time to reach the maximum S/N ratio was twice as long as that when the blocking buffer concentration was 1/2.
  • the present invention provides a method for detecting a target substance in a sample and a kit for the same.
  • 100,900...complex 110,120...target substance (protein), 160...phosphate group, 130,140,170...specific binding substance, 131,141,171...single-stranded nucleic acid fragment, 150...double-stranded nucleic acid (double-stranded nucleic acid region), 200,500...fluidic device, 210...substrate, 220...cover member, 221...projection, 222...inlet port, 223...exhaust port, 230...channel, 241,242,242R...well (microcompartment), 240...well array, 510...wall member, 810...flap probe, 811,821...flap site (nucleic acid fragment), 820...nucleic acid fragment.

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Abstract

この試料中の標的物質を検出する方法は、試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された第１の特異的結合物質、第２の一本鎖核酸断片で標識された第２の特異的結合物質を含む混合液をインキュベートし、その結果、標的物質、第１の特異的結合物質、及び第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する工程と、二本鎖核酸の形成を検出する工程と、を含み、二本鎖核酸の形成が検出されたことが、試料中に標的物質が存在することを示し、混合液が、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体を更に含むか、又は、混合液が、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を更に含む。

Description

試料中の標的物質を検出する方法及びそのためのキット
　本発明は、試料中の標的物質を検出する方法及びそのためのキットに関する。
　本願は、２０２３年６月９日に日本に出願された特願２０２３－０９５４３６号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　次世代シークエンサーに代表される網羅的な遺伝子解析技術の登場により、多くの遺伝子の変化と疾患発症のメカニズムが明らかになりつつあるが、同時に数多くの臨床的意義不明の遺伝子変異（ｖａｒｉａｎｔｓ　ｏｆ　ｕｎｋｎｏｗｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ：ＶＵＳ、以下「ＶＵＳ」という。）が同定された。
　現在のゲノム医療において、遺伝子解析による診断率や薬剤到達性の低さが問題となっている。この原因の一つとして、ＶＵＳが多数報告されていることが挙げられ、ＶＵＳの意義付けとその評価が急務である。
　ＶＵＳの意義付けとその評価には、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（https://cadd.gs.washington.edu/）スコアやＭｕｔｐｒｅｄ２（https://mutpred.mutdb.org/）スコアをはじめとする各種スコアが算出されており、参照することができる。しかしながら、コンピュータによる予測は、実際の表現型と一致しない場合があるため、病原性を評価するための唯一のエビデンスとして使用することはできない。
　ＶＵＳを実験的に評価する方法の一つとしては、目的遺伝子に変異のあるプラスミドを作製し、細胞に導入してタンパク質を合成して細胞内で合成したタンパク質をリン酸化させ、リン酸化タンパク質を含んだ細胞抽出液をウエスタンブロッティング等で検出することで定性的に評価する方法が確立されている。しかしながら、このような評価方法には多くの時間、労力及びコストを要する。
　従来、タンパク質の定量検出は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等により行われ、核酸の定量はリアルタイムＰＣＲ法等により行われてきた。
　標的物質を精度よく検出する手法として、多数の微小区画内で酵素反応を行う技術が検討されている。これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。デジタル計測には、デジタルＥＬＩＳＡ及びデジタルＰＣＲ等が存在する。
　デジタル計測では、試料溶液を極めて多数の微小溶液に分割する。そして、各微小溶液からの信号を２値化し、標的物質が存在するか否かのみを判別して、標的物質の分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡ及びリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
　例えば、非特許文献１には、微小ウェル及び試薬等を供給する流路を有する微小ウェルアレイが記載されており、当該微小ウェルアレイを用いてデジタルＥＬＩＳＡを行ったことが記載されている。
　特許文献１には、オリゴヌクレオチドを修飾した抗体を用いてタンパク質を検出する方法である、Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（ＰＬＡ）が報告されている。この方法は、検出にＰＣＲ法又はＲＣＡ法を利用している。
　特許文献２には、オリゴヌクレオチドを修飾した抗体を用いて２分子間のタンパク質相互作用を検出する方法が記載されている。この方法も、検出にＰＣＲ法又はＲＣＡ法を利用している。
　非特許文献３には、微小ウェル及び試薬等を供給する流路を有する微小ウェルアレイが記載されており、当該微小ウェルアレイ内で細胞を用いてシグナル伝達を表現し、リン酸化タンパク質の検出を行ったことが記載されている。シグナル伝達の様子を、リン酸化タンパク質を検出することでモニタリングしている。
　Ａｌｐｈａ　ＳｕｒｅＦｉｒｅ（https://www.perkinelmer.co.jp/assays/tabid/346/Default.aspx、パーキンエルマー社）は、洗浄操作なしに、細胞ベースでキナーゼ活性を検出可能なアッセイシステムである。本システムでは、細胞抽出液からリン酸化タンパク質を検出している。
　ＥＬＩＳＡ等により標的物質を感度よく検出するために、各種物質に対する非特異的吸着を効果的に抑制する反応液が検討されている。これらの反応液はブロッキング剤と呼ばれている。
　ブロッキング剤として、従来から、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の生物由来のタンパク質、高親水性無機微粒子及びホスホリルコリン基含有ポリマー等を主成分としたものが用いられている。
　非特許文献４では、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体（ＭＰＣポリマー）が非特異吸着防止のためのブロッキング剤として用いられている。
特開第２０２０－１２２７９９号公報 米国特許第１０，４６５，２３５号明細書
Kan C. W., et al., Isolation and detection of single molecules on paramagnetic beads using sequential fluid flows in microfabricated polymer array assemblies., Lab on a Chip, 12 (5), 977-985, 2012. Mohammed H., et al., Approaches for Assessing and Discovering Protein Interactions in Cancer., Mol Cancer Res, 11 (11), 1295-1302, 2013. Blazek M., et al., Proximity Ligation Assay for High-content Profiling of Cell Signaling Pathways on a Microfluidic Chip., Molecular & Cellular Proteomics 12: 10.1074/mcp.M113.032821, 3898-3907, 2013. Y. Iwasaki, K. Ishihara., Phosphorylcholine-containing polymers for biomedical applications., Anal Bioanal Chem 381, 534-546, 2005.
　生体内には外部の刺激を細胞内に伝達する機構が存在する。その際には様々なタンパク質同士が一時的に結合し、情報を伝達する。この情報伝達システムをシグナル伝達システムといい、刺激を媒介する様々なタンパク質分子が担っている。図１は、一例として、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達の一部を示している。
　図１では、一例として、変異タンパク質がＢＲＡＦである場合に、ＢＲＡＦ遺伝子における臨床的意義不明の遺伝子変異（ＶＵＳ）が「正常変異」である場合、及び、「有害変異」である場合を説明している。ＶＵＳが正常変異である場合、上流からの刺激がない限り、図１左に示すように、ＢＲＡＦの基質であるＭＥＫはリン酸化されない。これに対し、ＶＵＳが有害変異である場合、図１右に示すように、ＢＲＡＦは恒常的に活性化しており、上流からの刺激がなくても、基質であるＭＥＫをリン酸化してしまう。このようなＢＲＡＦは癌の原因となる。
　本発明は、試料中の標的物質を検出する方法及びそのためのキットを提供することを目的とする。本発明によれば、例えば、ＶＵＳを簡便かつ短期間に効率よく機能解析（評価ともいう）することができる。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］試料中の標的物質を検出する方法であって、前記試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を含む混合液をインキュベートし、その結果、前記試料中に前記標的物質が存在した場合に、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質、及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する工程と、前記二本鎖核酸の形成を検出する工程と、を含み、
　前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記試料中に前記標的物質が存在することを示し、前記混合液が、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体（ＭＰＣポリマー）を更に含むか、又は、前記混合液が、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を更に含む、方法。
［２］前記ＭＰＣポリマーが、疎水性基、親水性基、アニオン性基及びカチオン性基からなる群より選択される少なくとも一種の基を有するコモノマーと、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとの共重合体である、［１］に記載の方法。
［３］前記混合液中の前記ＭＰＣポリマーの濃度が０．０１～０．５％（ｗ／ｖ）である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記混合液のインキュベートをウェル中で行い、前記ウェルの容積が１０ｆＬ～１００ｐＬである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片の塩基長が、それぞれ１０～２００塩基である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記二本鎖核酸の形成を検出する工程が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙにより行われる、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］試料中の標的物質を検出するためのキットであって、複数のウェルを有するウェルアレイ、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質、及び、ＭＰＣポリマーを含むか、又は、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を含む、バッファー、を含む、キット。
［８］前記ウェルの開口部を封止する封止液を更に含む、［７］に記載のキット。
［９］前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸を検出する試薬を更に含む、［７］又は［８］に記載のキット。
　本発明は以下の態様を含む。
［１１］試料中の標的物質を検出する方法であって、
　前記試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質と、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質と、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体とを含む混合液をインキュベートし、その結果、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質、及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成することと、
　前記二本鎖核酸の形成を検出することと、を含み、
　前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記試料中に前記標的物質が存在することを示す、標的物質を検出する方法。
［１２］前記２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体が、疎水性基、親水性基、アニオン性基及びカチオン性基からなる群より選択される少なくとも一種の基を有するコモノマーと、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとの共重合体である、［１１］に記載の方法。
［１３］前記混合液中の前記ＭＰＣポリマーの濃度が０．０１～０．５％（ｗ／ｖ）である、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］試料中の標的物質を検出する方法であって、
　前記試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質と、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質と、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を含むバッファーと、を含む混合液をインキュベートし、その結果、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質、及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成することと、
　前記二本鎖核酸の形成を検出することと、を含み、
　前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記試料中に前記標的物質が存在することを示す、標的物質を検出する方法。
［１５］前記混合液のインキュベートをウェル中で行い、前記ウェルの容積が１０ｆＬ～１００ｐＬである、［１１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片の塩基長が、それぞれ１０～２００塩基である、［１１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］　前記二本鎖核酸の形成を検出する工程が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙにより行われる、［１１］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］試料中の標的物質を検出するためのキットであって、複数のウェルを有するウェルアレイと、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質と、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質と、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体とを含む、キット。
［１９］試料中の標的物質を検出するためのキットであって、複数のウェルを有するウェルアレイと、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質と、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質と、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を含むバッファーとを含む、キット。
［２０］前記ウェルの開口部を封止する封止液を更に含む、［１８］又は［１９］に記載のキット。
［２１］前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸を検出する試薬を更に含む、［１８］～［２０］のいずれかに記載のキット。
　本発明によれば、試料中の標的物質を検出する方法及びそのためのキットを提供することができる。本発明によれば、例えば、ＶＵＳを簡便かつ短期間に効率よく機能解析（評価）することができる。
図１は、正常変異及び有害変異を説明する図である。 図２は、標的物質を検出する方法を説明する模式図である。 図３は、標的物質を検出する方法を説明する模式図である。 図４は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図５は、標的物質を検出する方法を説明する模式断面図である。 図６は、標的物質を検出する方法を説明する模式断面図である。 図７は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図８は、標的物質を検出する方法を説明する模式断面図である。 図９は、標的物質を検出する方法を説明する模式断面図である。 図１０は、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）法の一例を説明する模式図である。 図１１は、対象タンパク質の活性を評価する方法を説明する模式図である。 図１２は、実験例１の結果を示すグラフである。 図１３は、実験例１の結果を示すグラフである。 図１４は、実験例２の結果を示すグラフである。 図１５は、実験例２の結果を示すグラフである。 図１６は、実験例３の結果を示すグラフである。 図１７は、実験例３の結果を示すグラフである。 図１８は、実験例３の結果を示すグラフである。 図１９は、実験例３の結果を示すグラフである。 図２０は、実験例３の結果を示すグラフである。 図２１は、実験例４の結果を示すグラフである。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［試料中の標的物質を検出する方法］
　一実施形態において、本発明は、試料中の標的物質を検出する方法であって、前記試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を含む混合液をインキュベートし、その結果、前記試料中に前記標的物質が存在した場合に、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質、及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する工程（ａ）と、前記二本鎖核酸の形成を検出する工程（ｂ）と、を含み、前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記試料中に前記標的物質が存在することを示し、前記混合液が、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体（以下、ＭＰＣポリマーと記載することがある）を更に含むか、又は、前記混合液が、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を更に含む、方法を提供する。
　図２は、本実施形態の方法を説明する模式図である。図２では、標的物質として、リン酸化タンパク質１２０を検出する例を示す。図２中、リン酸基を符号１６０で示す。
　図２に示すように、本実施形態の方法では、まず、工程（ａ）において、試料、第１の一本鎖核酸断片１４１で標識された、標的物質１２０に対する第１の特異的結合物質１４０、第２の一本鎖核酸断片１７１で標識された、標的物質１２０に対する第２の特異的結合物質１７０を含む混合液をインキュベートする。第１の特異的結合物質１４０と、第２の特異的結合物質１７０は、標的物質１２０上の異なるエピトープを認識する。図２の例では、特異的結合物質１７０は、リン酸化タンパク質１２０のリン酸基１６０を含む領域を認識する。
　その結果、試料中に標的物質１２０が存在した場合に、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０、及び第２の特異的結合物質１７０を含む複合体９００が形成され、第１の一本鎖核酸断片１４１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１７１の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸（二本鎖核酸領域ともいう）１５０を形成する。
　続いて、工程（ｂ）において、二本鎖核酸１５０の形成を検出する。二本鎖核酸１５０の形成が検出されることは、試料中に標的物質１２０が存在することを示す。二本鎖核酸１５０の形成の検出については後述する。
　図３は、本実施形態の異なる態様を説明する模式図である。図３の例では、標的物質はタンパク質１１０とタンパク質１２０との結合体である。つまり、図３の例では、タンパク質１１０とタンパク質１２０とが結合する（つまり、相互作用する）か否かを評価することができる。
　図３の例では、まず、工程（ａ）において、試料、第１の一本鎖核酸断片１４１で標識された、タンパク質１２０に対する第１の特異的結合物質１４０、第２の一本鎖核酸断片１３１で標識された、タンパク質１１０に対する第２の特異的結合物質１３０を含む混合液をインキュベートする。
　その結果、試料中にタンパク質１１０とタンパク質１２０との結合体が存在した場合に、標的物質であるタンパク質１１０とタンパク質１２０との結合体、第１の特異的結合物質１４０、及び第２の特異的結合物質１３０を含む複合体１００が形成され、第１の一本鎖核酸断片１４１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸（二本鎖核酸領域ともいう）１５０を形成する。
　続いて、工程（ｂ）において、二本鎖核酸１５０の形成を検出する。二本鎖核酸１５０の形成が検出されることは、試料中に標的物質であるタンパク質１１０とタンパク質１２０との結合体が存在することを示す。すなわち、二本鎖核酸１５０の形成が検出されることは、タンパク質１１０とタンパク質１２０とが相互作用することを示す。
　図３の方法は、対象タンパク質１１０が標的タンパク質１２０と結合しない（つまり、相互作用しない）場合に適用してもよく、その場合には、二本鎖核酸１５０の形成は検出されない。二本鎖核酸１５０の形成の検出については後述する。
　実施例において後述するように、混合液が、ＭＰＣポリマーを更に含むことにより、標的物質の検出に要する時間を短縮することができる。
　また、実施例において後述するように、混合液が、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を更に含むことにより、シグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎと記載することがある）を大きくすることができる。
　また、実施例において後述するように、混合液が、カゼイン、ノニオン系界面活性剤、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む場合には、シグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を大きくするだけでなく、標的物質の検出に要する時間も短縮することができる。
　本実施形態の方法によれば、変異タンパク質の活性評価を簡便かつ短期間に実施することができる。例えば、ＶＵＳを簡便かつ短期間に効率よく機能解析（つまり、評価）することができる。
　ＭＰＣポリマーとは、分子中にリン脂質極性基（ホスホリルコリン基ともいう）とメタクリロイル基とを有する２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）の重合体である。ＭＰＣポリマーは、生体膜を模倣したポリマーであり、タンパク質や血球等の生体成分との相互作用が極めて小さいことや、優れた抗血栓性を有すること等、高度な生体適合性を有すると考えられている。ＭＰＣポリマーは、様々なコモノマーと共重合させることができ、コモノマーの種類により様々な特性を付与することができる。
　ＭＰＣポリマーは、疎水性基、親水性基、アニオン性基及びカチオン性基からなる群より選択される少なくとも一種の基を有するコモノマーとの共重合体であってよい。ＭＰＣポリマーとしては、市販のものを用いることができ、具体的には、例えば、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬシリーズ（日油）が挙げられる。
　ＭＰＣポリマーは、０．１ｗｔ％水溶液を用いて２５℃で測定した表面張力が７０～８０×１０－３Ｎ／ｍであるものを好適に用いることができる。あるいは、ＭＰＣポリマーは、１ｗｔ％水溶液を用いて２５℃で測定した動粘度が、３ｃＳｔ以下又は２０～３０ｃＳｔであるものを好適に用いることができる。
　ＭＰＣポリマーの０．１ｗｔ％水溶液の表面張力は、表面張力計（例えば協和界面科学株式会社製、ＤＹー７００）を用いて測定することができる。
　ＭＰＣポリマーの０．１ｗｔ％水溶液の動粘度は、粘度計（例えば柴田科学株式会社製、キャノン・フェンスケ逆粒径ＳＦ　Ｎｏ．　１５０）を用いて測定することができる。
　本実施形態の方法において、混合液中のＭＰＣポリマーの濃度は０．０１～０．５％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、０．０１～０．０５％（ｗ／ｖ）であることがさらに好ましい。
　カゼインとは、牛乳やチーズに含まれる天然に存在するリンタンパク類の一種である。混合液中のカゼインの濃度は、０．００２５～１質量%程度であることが好ましく、０．０１～１質量％程度であることがより好ましい。
　ノニオン系界面活性剤とは、極性基としてイオン性の基を含まない界面活性剤であり、例えば、アセチレングリコールのエチレンオキサイド及び／又はプロピレンオキサイド付加物等のアセチレングリコール系界面活性剤（具体的には、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７，－ジオール、３，６－ジメチル－４－オクチン－３，６－ジオール等のエチレンオキサイド及び／又はプロピレンオキサイド付加物等）；アセチレンアルコールのエチレンオキサイド及び／又はプロピレンオキサイド付加物等のアセチレンアルコール系界面活性剤（具体的には、３，５－ジメチル－１－ヘキサン－３－オール等のエチレンオキサイド及び／又はプロピレンオキサイド付加物等）；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル等のエーテル系界面活性剤；ポリオキシエチレンオレイン酸、ポリオキシエチレンオレイン酸エステル、ポリオキシエチレンジステアリン酸エステル、ソルビタンラウレート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレート、ポリオキシエチレンモノオレエート、ポリオキシエチレンステアレート等のエステル系界面活性剤；ジメチルポリシロキサン等のポリエーテル変性シロキサン系界面活性剤；その他フッ素アルキルエステル、パーフルオロアルキルカルボン酸塩等の含フッ素系界面活性剤等が挙げられる。混合液中のノニオン系界面活性剤の濃度は、０．００２５～１質量％程度であることが好ましく、０．０１～１質量％程度であることがより好ましい。
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは、緩衝剤の一種である。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは塩であってもよい。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの塩としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩が挙げられる。混合液中のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの濃度は、０．００２５～１質量％程度であることが好ましく、０．０１～１質量％程度であることがより好ましい。
　第１の一本鎖核酸断片１４１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１７１（１３１）の少なくとも一部がハイブリダイズすることができる必要がある観点から、第１の一本鎖核酸断片１４１の塩基長は１０～２００塩基であってもよい。同様に、第２の一本鎖核酸断片１７１（１３１）の塩基長も１０～２００塩基であってもよい。また、第１の一本鎖核酸断片１４１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１７１（１３１）の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸１５０の長さは、７～３０塩基程度であることが好ましく、例えば９塩基であってもよく、１２塩基であってもよく、１５塩基であってもよい。
　図３の例において、タンパク質１１０は、臨床的意義不明の遺伝子変異（ＶＵＳ）を有するタンパク質であってもよい。タンパク質１１０は、例えばキナーゼであってもよい。より具体的な標的タンパク質としては、細胞内シグナル伝達経路のタンパク質が挙げられ、例えば、ＢＲＡＦ、Ａ－ＲＡＦ、Ｒａｆ、ＭＡＰ３Ｋ　４／１２、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＡＳＫ１及びＴＡＫ１等が挙げられる。この場合、ＶＵＳを有するキナーゼが恒常的な活性化状態にあるか否かを、タンパク質１２０と結合する否かにより評価することができる。
　あるいは、図２の例に示す検出を、ＶＵＳを有するキナーゼ（タンパク質１１０）の存在下で行い、タンパク質１２０のリン酸化を検出することにより、ＶＵＳを有するキナーゼ（タンパク質１１０）が恒常的な活性化状態にあるか否かを、評価することもできる。
　本実施形態の方法は、デジタル計測により実施することができる。この場合、混合液のインキュベートをウェル中で行うことが好ましく、ウェルは複数のウェルが配置されたウェルアレイを構成していることが好ましい。また、ウェルアレイは流体デバイスの流路内に配置されていることが好ましい。
　図４は、本実施形態の方法を好適に実施することができる流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図４に示すように、流体デバイス２００は、基板２１０と、基板２１０に対向して配置される蓋部材２２０とを備えている。蓋部材２２０は凸部２２１を有しており、凸部２２１の先端は基板２１０に接している。流体デバイス２００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成型されており、蓋部材２２０と対向している。ウェルアレイ２４０は複数のウェル２４１を有する。蓋部材２２０は、基板２１０に溶着又は接着されていてもよい。
　ウェル２４１は、基板２１０の表面に開口している。ウェル２４１の形状、寸法、及び配置は特に限定されないが、ウェル２４１は容積が小さい微小ウェルであることが好ましい。例えば、１つのウェル２４１の容積は１０ｆＬ～１００ｐＬ程度であってもよく、５０ｆＬ～１２００ｆＬであってもよい。流体デバイス２００では、同形同大の複数のウェル２４１がウェルアレイ２４０を構成している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
　ウェル２４１の直径は例えば１～１０μｍ程度であってもよく、ウェル２４１の深さは例えば１～１０μｍ程度であってもよい。また、ウェル２４１の配置は特に制限されず、例えば三角格子状に整列していてもよいし、正方格子状も整列していてもよいし、ランダムに配置されていてもよい。
　流体デバイス２００では、凸部２２１の存在により、ウェルアレイ２４０と蓋部材２２０との間に空間が形成されている。当該空間は流路２３０を構成している。流路２３０は、標的物質であるタンパク質、第１の特異的結合物質、第２の特異的結合物質等が分散した液体及び後述する封止液を送液するための経路として機能する。流路２３０の形状、構造及び容量等は特に限定されないが、流路２３０の高さ（基板２１０の表面と、蓋部材２２０の基板２１０と対向する面との間の距離）は、例えば５００μｍ以下であってもよいし、例えば３００μｍ以下であってもよいし、例えば２００μｍ以下であってもよいし、例えば１００μｍ以下であってもよい。
　凸部２２１は蓋部材２２０と一体に成形されていてもよい。蓋部材２２０は、例えば、熱可塑性樹脂の流動体を、成形型を用いて成形することで、凸部２２１を有する板状に成形することができる。また、蓋部材２２０には試薬の導入ポート２２２及び排出ポート２２３が形成されていてもよい。
　蓋部材２２０が凸部２２１を有する場合、基板２１０のウェル２４１が開口する面に凸部２２１が接するように、蓋部材２２０と基板２１０とが重ねられる。この結果、蓋部材２２０と基板２１０との間の空間が流路２３０となる。蓋部材２２０と基板２１０とは、レーザー溶着等により溶着されてもよい。
　本実施形態の方法に用いられる流体デバイスは、上述した流体デバイス２００に限られない。図７は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図７に示すように、流体デバイス５００は、基板２１０と、壁部材５１０とを備えている。流体デバイス５００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されている。ウェルアレイ２４０は複数のウェル２４１を有する。流体デバイス５００は、蓋部材２２０を有していない点で上述した流体デバイス２００と主に異なっている。
　上述した流体デバイス２００においては、蓋部材２２０と凸部２２１は一体成形されていた。しかしながら、蓋部材２２０と凸部２２１は別体として成形されていてもよい。
　また、上述した流体デバイス２００及び流体デバイス５００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されていた。しかしながら、ウェルアレイは、基板２１０と一体成形されていなくてもよい。例えば、流体デバイスとは別体として成形されたウェルアレイ２４０を、流体デバイスの基板２１０上に配置してもよい。あるいは、基板２１０の表面に樹脂層を積層し、エッチング等により、樹脂層にウェルアレイを形成してもよい。
　流体デバイスにおいて、基板２１０は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は特に限定されないが、試薬及び封止液に対して耐性のある樹脂であることが好ましい。また、検出するシグナルが蛍光である場合には、自家蛍光が少ない樹脂であることが好ましい。例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、シリコーン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂及びアモルファスフッ素樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。
　基板２１０の板厚方向の一方面に複数のウェル２４１が形成されていてもよい。樹脂を用いたウェルの形成方法としては、射出成形、熱インプリント、光インプリント等が挙げられる。
　あるいは、例えば、基板２１０の上にフッ素樹脂を積層し、当該フッ素樹脂をエッチング等により加工してウェルアレイを形成してもよい。フッ素樹脂としては、例えばＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子）等を用いることができる。
　また、流体デバイスが蓋部材２２０を有する場合、蓋部材２２０の材質は、自家蛍光の少ない樹脂であることが好ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー等の熱可塑性樹脂であってもよい。
　また、蓋部材２２０は、シグナルを蛍光観察する際に検出される波長の近傍の波長の光を透過しない材料から形成されていてもよく、完全に光を透過しない材料から形成されていてもよい。例えば、蓋部材２２０は、カーボンや金属粒子等を添加した熱可塑性樹脂から形成されていてもよい。
　続いて、図４～図６を参照しながら、流体デバイス２００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。ここでは、図２の例のように、標的物質１２０を検出する場合について説明する。
　本実施形態の方法は、試料中の標的物質１２０を検出する方法であり、試料、第１の一本鎖核酸断片１４１で標識された、標的物質１２０に対する第１の特異的結合物質１４０、第２の一本鎖核酸断片１７１で標識された、標的物質１２０に対する第２の特異的結合物質１７０を含む混合液をインキュベートし、その結果、試料中に標的物質１２０が存在した場合に、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０、及び第２の特異的結合物質１７０を含む複合体９００が形成され、第１の一本鎖核酸断片１４１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１７１の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸１５０を形成する工程（ａ）と、二本鎖核酸１５０の形成を検出する工程（ｂ）と、を含み、二本鎖核酸１５０の形成が検出されたことが、試料中に標的物質１２０が存在することを示す方法である。
　本実施形態の方法は、図３の例のように、標的物質が、タンパク質１１０とタンパク質１２０との結合体である場合においても、第２の特異的結合物質として、タンパク質１１０に対する第２の特異的結合物質１３０を用いる点以外は同様である。
　混合液は、ＭＰＣポリマーを更に含むか、又は、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を更に含む。混合液は、カゼイン、ノニオン系界面活性剤、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを更に含むことがより好ましい。
　実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、試料中の標的物質の検出に要する時間を短縮すること、又はシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を大きくすることができる。本発明によれば、例えば、ＶＵＳを簡便かつ短期間に効率よく機能解析（評価ともいう）することができる。
　以下、混合液がＭＰＣポリマーを含む例について説明する。まず、図４に示すように、流体デバイス２００の導入ポート２２２から混合液Ｌ２１０を導入し、流路２３０に送液する。混合液Ｌ２１０は、ＭＰＣポリマーを含み、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０、及び、第２の特異的結合物質１７０が分散した液体であり、二本鎖核酸１５０の形成を検出するための試薬も含む。
　流路２３０に送液された混合液Ｌ２１０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、ウェル２４１の内部に混合液Ｌ２１０が収容される。この結果、ウェル２４１に、ＭＰＣポリマー、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０、及び、第２の特異的結合物質１７０、及び、二本鎖核酸１５０の形成を検出するための試薬が導入される。ここで、試料が標的物質１２０を含む場合には、混合液Ｌ２１０内に、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０及び第２の特異的結合物質１７０を含む複合体９００が含まれている。
　１つのウェル２４１に導入される複合体９００の数は特に制限されないが、好ましくは、１つのウェル２４１に１つ以下、すなわち、０個又は１個の複合体９００が導入される。これにより、複合体９００の検出を１個単位で行うことができ、すなわちデジタル計測が可能となる。また、ウェルアレイの全てのウェルに複合体９００が導入される必要はない。
　複合体９００をウェルに導入する手段は、特に制限されず、例えば、複合体９００を自重により流体デバイス内（具体的には流路内）で沈降させ、ウェルに分配する方法が挙げられる。あるいは、複合体９００を捕捉する物質（以下、捕捉物と記載することがある）を利用し、自重で沈降しにくい複合体９００に捕捉物を結合させて送液してもよく、予めウェルに捕捉物を固定化させておき、送液された複合体９００を捕捉させることで、複合体９００のウェルへの導入効率を向上させることもできる。
　捕捉物を複合体９００に結合させる工程は、本実施形態の方法の任意の時点で行うことができる。例えば、この工程は、ウェル２４１に複合体９００を導入する工程の前に、サンプルチューブ内で複合体９００と捕捉物を接触させることにより行ってもよい。あるいは、捕捉物をウェル２４１に導入した後に、複合体９００をウェルに導入し、ウェル内で捕捉物と複合体９００とを接触させてもよい。
　捕捉物は、複合体９００を捕捉することができる物質である。捕捉物は、例えば、固相と複合体９００に対する特異的結合物質との結合体であってもよい。
　固相としては、粒子、膜及び基板等が挙げられる。また、複合体９００に対する特異的結合物質は１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子及びガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定化するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＣ３００」等を用いることができる。
　第１の特異的結合物質１４０、第２の特異的結合物質１７０、捕捉物における特異的結合物質としては、抗体、抗体断片及びアプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）及びＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
　一本鎖核酸断片で特異的結合物質を標識する方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。一本鎖核酸断片は、リンカーである分子を介して特異的結合物質に標識されてもよい。リンカーとしては、特に限定されず、例えば、ポエリエチレン鎖、炭化水素鎖及びペプチド等が挙げられる。一本鎖核酸断片は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。また、ＢＮＡ及びＬＮＡ等の人工核酸を含んでいてもよい。
　特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、プロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。物理吸着による方法としては、疎水的相互作用又は静電的相互作用により、特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法が挙げられる。化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、特異的結合物質を粒子表面に固定化させることができる。また、特異的結合物質による標的分子の認識能を阻害しないよう、特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサーを設けることが好ましい。
　上述したように、捕捉物を用いて複合体９００をウェル２４１に導入する場合、捕捉物１個に複合体９００が０個又は１個捕捉される条件で捕捉物と複合体９００との結合体を形成することが好ましい。さらに、１つのウェル２４１には、捕捉物が０個又は１個導入されるように構成されることが好ましい。これによりデジタル計測が可能となる。
　標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０及び第２の特異的結合物質１７０を接触させると、これらを含む複合体９００が形成され、第１の一本鎖核酸断片１４１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１７１の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸１５０を形成する。複合体９００の形成は、サンプルチューブ内で行われてもよいし、ウェル２４１内で行われてもよい。
　ウェル２４１に、混合液Ｌ２１０を導入した後、ウェル２４１の開口部を封止する工程を実施してもよい。ウェル２４１の開口部を封止する方法は、あるウェル２４１の内部に収容された液体が、別のウェル２４１の内部に収容された液体と互いに混合しない状態にすることができる限り特に限定されず、例えば、封止液でウェル２４１の開口部を覆うことにより封止してもよい。あるいは、ウェル２４１の開口部にガラス板等の板状部材を積層することにより封止してもよい。
　例えば、図５に示すように、蓋部材２２０の導入ポート２２２から、基板２１０と蓋部材２２０との間の流路２３０に、封止液Ｌ２２０を送液する。流路２３０に送液された封止液Ｌ２２０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、封止液Ｌ２２０は、流路２３０に送液された試薬液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない試薬液Ｌ２１０を押し流して置換する。これにより、封止液Ｌ２２０が、標的物質１２０を含む混合液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、ウェル２４１は独立した反応空間（つまり、微小区画２４２）となる。流路２３０が封止液Ｌ２２０で満たされると、余分な封止液Ｌ２２０は排出ポート２２３から排出される。図６は、ウェルアレイ２４０のウェル２４１の全てが封止液Ｌ２２０で封止され、封止されたウェル（つまり、微小区画）２４２が形成された状態を示す。
　また、混合液Ｌ２１０に脂質を溶解させておき、封止液Ｌ２２０を流路２３０に送液した後、再び脂質を含む液体を送液することにより、ウェル２４１の開口部に脂質二重膜を形成し、当該脂質二重膜によって複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、封止されたウェル２４２を形成することもできる。脂質二重膜を形成する脂質としては、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、これらの混合物等が挙げられるがこれらに限定されない。
　封止液は、複数のウェル２４１に導入された液体同士を互いに混合しないように個別に封止して液滴（微小液滴ともいう）を形成することができる液であり、好ましくは油性溶液であり、より好ましくはオイルである。オイルとしては、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイル又はこれらの混合物等を使用することができる。より具体的には、シグマ社製の商品名「ＦＣ－４０」等を用いることができる。ＦＣ－４０（ＣＡＳ番号：８６５０８－４２－１）はフッ素化脂肪族化合物であり、２５℃における比重が１．８５ｇ／ｍＬである。
　続いて、二本鎖核酸１５０の形成を検出する。二本鎖核酸１５０の形成の検出は、シグナル増幅反応を用いて行うことが好ましい。シグナル増幅反応としては、例えば、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）が挙げられる。
　ＩＣＡ反応は、（１）核酸同士の相補的結合と、（２）酵素による三重鎖構造の認識及び切断との２つの反応のサイクルによってシグナル増幅が進行するという原理に関連する。
　ＩＣＡ反応は、夾雑物による反応サイクル阻害の影響が小さい。したがって、ＩＣＡ反応を用いることにより、前記二本鎖核酸１５０の形成を精度よく検出することができる。シグナル増幅反応にＩＣＡ反応を用いる場合、混合液Ｌ２１０（ＭＰＣポリマー、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０、及び、第２の特異的結合物質１７０を含む液体）は、ＩＣＡ反応に必要な反応試薬を更に含む。
　ＩＣＡ反応に必要な反応試薬としては、フラッププローブ、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）及び蛍光基質等のＩＣＡ反応試薬が挙げられる。フラッププローブは、第１の一本鎖核酸断片１４１又は第２の一本鎖核酸断片１７１にハイブリダイズして二本鎖核酸１５０とフラップ構造を形成するように設計された核酸断片である。
　図１０は、ＩＣＡ法の一例を説明する模式図である。図１０の例では、ＩＣＡ法により、第１の一本鎖核酸断片１４１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１７１の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸１５０を検出する。
　まず、第１の一本鎖核酸断片１４１又は第２の一本鎖核酸断片１７１にフラッププローブをハイブリダイズさせる。図１０の例では、フラッププローブ８１０は、第２の一本鎖核酸断片１７１にハイブリダイズする。その結果、第１フラップ部位８１１が形成される。
　続いて、第１フラップ部位８１１にＦＥＮを反応させると、第１フラップ部位８１１が切断され、核酸断片８１１が生成される。続いて、核酸断片８１１は、蛍光基質（つまり、核酸断片８２０）にハイブリダイズして第２フラップ部位８２１を形成する。
　図１０の例では、核酸断片８２０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、核酸断片８２０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。続いて、第２フラップ部位８２１にＦＥＮを反応させると、第２フラップ部位８２１が切断され、核酸断片８２１が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れ、蛍光シグナルを発生する。この蛍光シグナルを検出することにより、二本鎖核酸１５０の形成を検出することができる。
　混合液Ｌ２１０としては、流体デバイスを用いて行われる生化学分析において使用される一般的な液体を用いることができ、好ましくは水性溶液である。また、混合液Ｌ２１０に界面活性剤等を含ませることにより、ウェル内に液体を封入しやすくしてもよい。
　二本鎖核酸１５０の形成の検出にＩＣＡ反応を用いる場合、二本鎖核酸１５０が存在する場合には、等温反応による酵素反応によって、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。
　二本鎖核酸１５０の形成の検出は、検出するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光をウェル２４２に照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。例えば、図６に示すように、封止されたウェル２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。図６において、ウェル２４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル２４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
　続いて、図７～図９を参照しながら、流体デバイス５００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。ここでは、図２の例のように、標的物質１２０を検出する場合について説明する。本実施形態の方法は、図３の例のように、標的物質が、タンパク質１１０とタンパク質１２０との結合体である場合においても、第２の特異的結合物質として、タンパク質１１０に対する第２の特異的結合物質１３０を用いる点以外は同様である。
　まず、図７に示すように、流体デバイス５００の内部に混合液Ｌ２１０を導入する。混合液Ｌ２１０は、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０、及び、第２の特異的結合物質１７０が分散した液体であり、二本鎖核酸１５０の形成を検出するための試薬も含む。ここで、試料が標的物質１２０を含む場合には、混合液Ｌ２１０内に、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０及び第２の特異的結合物質１７０を含む複合体９００が含まれている。混合液Ｌ２１０において、複合体９００の濃度は、ウェル２４１に１ウェルあたり１分子以下の複合体９００が入る濃度に調整されていることが好ましい。
　続いて、図８に示すように、流体デバイス５００の内部に封止液Ｌ２２０を導入する。封止液Ｌ２２０の比重は混合液Ｌ２１０よりも大きい。このため、封止液Ｌ２２０は、混合液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない混合液Ｌ２１０よりも下に沈み、ウェルアレイ２４０に接する。そして、封止液Ｌ２２０は、複合体９００を含む混合液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、独立した反応空間（つまり微小区画２４２）となる。
　続いて、図９に示すように、ウェル２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。図９中、ウェル２４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル２４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
　図２及び図３に示す態様において、本実施形態の方法は、無細胞タンパク質合成系によりＶＵＳを有するキナーゼ（タンパク質１１０）を合成する工程と、タンパク質１１０の存在下で、タンパク質１２０のリン酸化を検出する工程と、を含んでいてもよい。あるいは、図３に示す態様において、本実施形態の方法は、無細胞タンパク質合成系によりＶＵＳを有するキナーゼ（タンパク質１１０）を合成する工程と、タンパク質１１０と、タンパク質１２０との結合を検出する工程と、を含んでいてもよい。
　すなわち、タンパク質１１０を無細胞タンパク質合成系により合成し、複合体９００の形成を、タンパク質１１０の合成と連続的に行ってもよい。これにより、タンパク質１１０がＶＵＳを含むキナーゼ等である場合に、タンパク質１１０の活性評価を簡便かつ短期間に実施することができる。
　無細胞タンパク質合成系とは、細胞内でタンパク質を合成するのではなく、生細胞由来又は人工的に合成された、リボソームや転写・翻訳因子等を用いて、鋳型である核酸からタンパク質をインビトロで合成する合成系をいう。
　無細胞タンパク質合成系は、翻訳の過程に加えて、転写の過程を含む合成系であってもよい。タンパク質をコードする核酸がＤＮＡである場合、ＤＮＡを転写することによって、タンパク質をコードするＲＮＡを合成する必要がある。この場合、無細胞タンパク質合成系は、転写を可能にする因子を含んでいてもよい。転写を可能にする因子としては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチド等が挙げられるが、これに限定されず、当業者に公知の因子を用いることができる。
　あるいは、予め、タンパク質をコードするＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成し、そのＲＮＡを、無細胞タンパク質合成系に添加してもよい。あるいは、人工的に化学合成されたＲＮＡを用いてもよい。
　無細胞タンパク質合成の鋳型となる核酸断片は、生体由来の核酸断片であってもよく、培養細胞由来の核酸断片であってもよく、ウイルス由来の核酸断片であってもよい。あるいは、核酸断片は、遺伝子解析結果に基づいて人工的に合成したものであってもよい。
　無細胞タンパク質合成系としては、特に限定されず、例えば、コムギ胚芽、酵母、昆虫細胞、哺乳類培養細胞、ウサギ網状赤血球又は大腸菌等から得られた細胞抽出液を利用した合成系；及び翻訳に必要な因子を再構成した合成系等が挙げられる。なかでも、ヒト発現系無細胞タンパク質合成が好ましい。
　無細胞タンパク質合成系は、翻訳に関わる因子として、例えば、ｔＲＮＡ、アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、翻訳終結因子等を含んでいてもよい。
　上記の工程において、タンパク質１１０、標的物質１２０、第１の特異的結合物質１４０、及び、第２の特異的結合物質１７０に、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を更に接触させてもよい。これにより、標的タンパク質がリン酸化されるか否かを評価することが可能になる。すなわち、キナーゼアッセイを行うことが可能になる。
　図１１は、本実施形態の方法の一例を示す模式図である。ここでは、一例として、変異タンパク質がＢＲＡＦである場合に、ＢＲＡＦ遺伝子における臨床的意義不明の遺伝子変異（ＶＵＳ）が、恒常的な活性化状態をもたらすものであるか否かを判定している。
　図１１では、無細胞タンパク質合成、キナーゼアッセイ、抗原抗体反応、ＩＣＡ反応を連続的に行う。これにより、標的タンパク質であるタンパク質１１０の活性評価をより簡便かつ短期間に実施することができる。また、例えば、反応系に阻害剤を加えることで、阻害剤の効果を判定することもできる。
　本実施形態の方法は、洗浄工程を含まないことが好ましい。特に、図２及び図３の態様においてタンパク質１１０を無細胞タンパク質合成系により合成する場合においても、洗浄工程を含むことなく、タンパク質１１０がタンパク質１２０と結合する否かを評価することができれば、タンパク質１１０の活性評価を更に簡便かつ短期間に実施することができる。
［キット］
　一実施形態において、本発明は、試料中の標的物質を検出するためのキットであって、（ｉ）複数のウェルを有するウェルアレイ、（ｉｉ）第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、（ｉｉｉ）第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質、及び、（ｉｖ）ＭＰＣポリマーを含むか、又は、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を含む、バッファー、を含む、キットを提供する。
　本実施形態のキットにより、上述した、試料中の標的物質を検出する方法を好適に実施することができる。
　したがって、本実施形態のキットは、試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、標的物質に対する第１の特異的結合物質、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を含む混合液をインキュベートし、その結果、前記試料中に前記標的物質が存在した場合に、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質、及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する工程と、前記二本鎖核酸の形成を検出する工程と、を含み、前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記試料中に前記標的物質が存在することを示す方法に用いるためのものであるということもできる。
　ウェルアレイは、上述した流体デバイスの内部に配置されていてもよい。また、本実施形態のキットにおいて、標的物質質、第１の一本鎖核酸断片、第１の特異的結合物質、第２の一本鎖核酸断片、第２の特異的結合物質については上述したものと同様である。
　実施例において後述するように、バッファーが、ＭＰＣポリマーを含むことにより、標的物質の検出に要する時間を短縮することができる。
　また、実施例において後述するように、バッファーが、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を含むことにより、シグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を大きくすることができる。
　また、実施例において後述するように、バッファーが、カゼイン、ノニオン系界面活性剤、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む場合には、シグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を大きくするだけでなく、標的物質の検出に要する時間も短縮することができる。
　ＭＰＣポリマー、カゼイン、ノニオン系界面活性剤及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンについては上述したものと同様である。
　本実施形態のキットは、ＡＴＰを更に含んでいてもよい。これにより、標的タンパク質がリン酸化されるか否かを評価することが可能になる。すなわち、キナーゼアッセイを行うことが可能になる。
　本実施形態のキットは、ウェルアレイのウェルの開口部を封止する封止液を更に含んでいてもよい。封止液については、上述したものと同様である。
　本実施形態のキットは、第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸を検出する試薬を更に含んでいてもよい。
　このような試薬としては、上述したＩＣＡ反応用の試薬が挙げられ、具体的には、フラッププローブ、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）及び蛍光基質等が挙げられる。
［材料及び方法］
（抗体へのオリゴヌクレオチド修飾）
　抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲーションツール（製品名「ｏＹｏ－Ｌｉｎｋ抗体ラベリング試薬」、フナコシ社）を用いて、抗リン酸化ＭＥＫウサギポリクローナル抗体（抗ｐＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／２２１）ウサギ抗体、セルシグナリングテクノロジー社）、抗ＭＥＫウサギモノクローナル抗体（抗ＭＥＫ１／２ウサギ抗体、セルシグナリングテクノロジー社）に、それぞれ異なるオリゴヌクレオチド（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社）を結合させた。具体的には、上記の抗リン酸化ＭＥＫウサギポリクローナル抗体に、オリゴヌクレオチドである、ＤＮＡ１（5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAA-3’、配列番号１）を結合させ、ＤＮＡ１修飾抗リン酸化ＭＥＫウサギポリクローナル抗体を得た。また、抗ＭＥＫウサギポリクローナル抗体に、オリゴヌクレオチドである、ＤＮＡ２（5’-GCATGGTTCCAATTTGGGTGAT-3’、配列番号２）を結合させ、ＤＮＡ２修飾抗ＭＥＫウサギポリクローナル抗体を得た。
（抗原抗体反応液の調製）
　下記表１に記載の試薬を混合し、抗原抗体反応液を調製した。表１中、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを示し、「ＴＢＳ」はトリス緩衝生理食塩水を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ＭＰＣポリマーの検討）
　上述した抗原抗体反応液に、７種類のＭＰＣポリマーを、終濃度０．５％（ｗ／ｖ）となるようにそれぞれ添加した。使用したＭＰＣポリマーを下記表２に示す。表２中、表面張力は、０．１ｗｔ％水溶液を用いて２５℃で測定した値であり、動粘度は１ｗｔ％水溶液を用いて２５℃で測定した値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（ブロッキングバッファーの検討）
　ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ－ＴＢＳ）の代わりに、下記表３に示す市販のブロッキングバッファーを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（ＩＣＡ反応液の調製）
　上述した抗体に修飾したオリゴヌクレオチドを用いてＩＣＡ反応を行うためのＩＣＡ反応液を調製した。下記表４にＩＣＡ反応液の組成を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（抗原抗体反応及びＩＣＡ反応）
　上述した抗原抗体反応液及び上述したＩＣＡ反応液を混合し、３０℃で６０分間インキュベートした。続いて、６６℃で６０分間インキュベートし、ＩＣＡ反応を行った。
［実験例１］
（ＭＰＣポリマーの検討）
　上述した抗原抗体反応液（ＭＰＣポリマー含有）１０μＬと上述したＩＣＡ反応液１０μＬを混合し、３０℃で６０分間インキュベートした。続いて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　Ｑ（キアゲン社）を用いて６６℃で６０分間インキュベートし、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光を検出した。以下、この反応を「イムノＩＣＡ反応」という場合がある。
　図１２及び図１３は、イムノＩＣＡ反応の結果を示すグラフである。リン酸化ＭＥＫを用いたイムノＩＣＡ反応により検出された蛍光強度をシグナル（Ｓ）とし、非リン酸化ＭＥＫを用いたイムノＩＣＡ反応により検出された蛍光強度をノイズ（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎを算出した。
　図１２は、ＭＰＣポリマーの添加が、反応速度に及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。図１２中、縦軸はＳ／Ｎが最大値になるまでの時間を示し、横軸は添加したＭＰＣポリマーの種類を示す。「ＢＬ１０３」、「ＢＬ２０３」、「ＢＬ２０６」、「ＢＬ４０５」、「ＢＬ８０２」、「ＢＬ１００２」、「ＢＬ１００３」は、それぞれ、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ１０３、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ２０３、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ２０６、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ４０５、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ８０２、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ１００２、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ１００３（いずれも日油）を意味する。また、（－）は、比較のために、ＭＰＣポリマーを添加しなかった試料の結果を示す。その結果、反応液にＭＰＣポリマーを添加することにより、Ｓ／Ｎが最大値になるまでの時間を短縮できることが明らかとなった。
　図１３は、ＭＰＣポリマーの添加が、Ｓ／Ｎに及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。図１３中、縦軸はＳ／Ｎの最大値を示す。また、横軸は図１２と同様であり、添加したＭＰＣポリマーの種類を示す。その結果、反応液にＭＰＣポリマーを添加しても、Ｓ／Ｎの改善は認められなかった。
［実験例２］
（ブロッキングバッファーの検討）
　ブロッキングバッファーの種類を上述したものに変更した抗原抗体反応液１０μＬと、上述したＩＣＡ反応液１０μＬを混合し、３０℃で６０分間インキュベートした。続いて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　Ｑ（キアゲン社）を用いて６６℃で６０分間インキュベートし、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光を検出した。
　図１４及び図１５は、イムノＩＣＡ反応の結果を示すグラフである。リン酸化ＭＥＫを用いたイムノＩＣＡ反応により検出された蛍光強度をシグナル（Ｓ）とし、非リン酸化ＭＥＫを用いたイムノＩＣＡ反応により検出された蛍光強度をノイズ（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎを算出した。
　図１４は、ブロッキングバッファーの種類が、反応速度に及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。図１４中、縦軸はＳ／Ｎが最大値になるまでの時間を示し、横軸は使用したブロッキングバッファーの種類を示す。「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ」はＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ（東洋紡）を意味し、「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂ」はＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂ（東洋紡）を意味する。その結果、ブロッキングバッファーとして、１％ＢＳＡ－ＴＢＳの代わりに、カゼイン、ノニオン系界面活性剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含むブロッキングバッファー（Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ）を使用することにより、Ｓ／Ｎが最大値になるまでの時間を大きく短縮できることが明らかとなった。
　図１５は、ブロッキングバッファーの種類が、Ｓ／Ｎに及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。図１５中、縦軸はＳ／Ｎの最大値を示す、また、横軸は図１４と同様であり、使用したブロッキングバッファーの種類を示す。その結果、ブロッキングバッファーとして、１％ＢＳＡ－ＴＢＳの代わりに、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を含むブロッキングバッファー（Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ、又は、Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂ、いずれも東洋紡）を使用することにより、Ｓ／Ｎの最大値を大きくできることが明らかとなった。
　［実験例３］
（ＩＣＡ反応に対するＭＰＣポリマーの影響）
　表５に示す組成のＩＣＡ反応液にＭＰＣポリマーとしてＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ１００２又はＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ１００３（いずれも日油）をそれぞれ終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）、０．０５質量％（ｗ／ｖ）、又は０．０１質量％（ｗ／ｖ）となるよう添加し、６６℃で６０分間インキュベートし、ＩＣＡ反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図１６～１７は、それぞれＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ１００２及びＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）－ＢＬ１００３の添加が、ＩＣＡ反応性に及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。図１６～１７中、縦軸はＩＣＡ反応強度を示す。横軸は反応時間を示す。また、図１８は、比較のためにＭＰＣポリマーを添加しなかった試料の結果を示す。その結果、反応液にＭＰＣポリマーを添加すると反応強度の上昇が認められた。
　また、同一の条件下で、表２に示すＭＰＣポリマー又は表３に示すブロッキングバッファーを添加してＩＣＡ反応を行った。標的ＤＮＡを添加した場合の蛍光強度をシグナル（Ｓ）とし、標的ＤＮＡを添加しなかった場合の蛍光強度をノイズ（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎを算出した。図１９は、表２に示すＭＰＣポリマー又は表３に示すブロッキングバッファーを添加した場合のＳ／Ｎが最大に達するまでに要した時間（単位：秒）を示す。図２０は、表２に示すＭＰＣポリマー又は表３に示すブロッキングバッファーを添加した場合のＳ／Ｎの最大値を示す。図１９～２０において、ＰＣは、比較のためにＭＰＣポリマー及びブロッキングバッファーを添加しなかった試料の結果を示す。
　ＰＣと比較して、ＭＰＣポリマー又は表３に示すブロッキングバッファーを添加した場合は、Ｓ／Ｎの最大値、Ｓ／Ｎが最大に達するまでに要した時間のいずれも同程度、又は劣る結果となった。従って、ＭＰＣポリマー又は表３に示すブロッキングバッファーを添加は、ＩＣＡ反応を向上するのではなく、イムノＩＣＡの反応性を向上していることが示唆された。
　［実験例４］
（ＩＣＡ反応に対するブロッキングバッファーの影響）
　表３に示す、カゼイン、ノニオン系界面活性剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含むブロッキングバッファーを添加した場合の、バッファー濃度が与える反応性への影響を確認した。具体的には、ＥＬＩＳＡ反応の抗原抗体反応条件下で、複合体を形成させ、ＩＣＡ反応を行った。
（抗体へのオリゴヌクレオチド修飾）
　抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲーションツール（製品名「ｏＹｏ－Ｌｉｎｋ抗体ラベリング試薬」、フナコシ社）を用いて、抗リン酸化ＭＥＫウサギポリクローナル抗体（抗ｐＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／２２１）ウサギ抗体、セルシグナリングテクノロジー社）、抗ＭＥＫウサギモノクローナル抗体（抗ＭＥＫ１／２ウサギ抗体、セルシグナリングテクノロジー社）に、それぞれ異なるオリゴヌクレオチド（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社）を結合させた。具体的には、上記の抗リン酸化ＭＥＫウサギポリクローナル抗体に、オリゴヌクレオチドである、ＤＮＡ１１（5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAA-3’、配列番号９）を結合させ、ＤＮＡ１１修飾抗リン酸化ＭＥＫウサギポリクローナル抗体を得た。また、抗ＭＥＫウサギポリクローナル抗体に、オリゴヌクレオチドである、ＤＮＡ１２（5’-GCATGGTTCCAATTTGGGTGAT-3’、配列番号１０）を結合させ、ＤＮＡ１２修飾抗ＭＥＫウサギポリクローナル抗体を得た。
　（キナーゼアッセイ及び抗原抗体反応液の調製）
　下記表６に記載の試薬を混合し、１０μＬの抗原抗体反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（ＩＣＡ反応液の調製）
　上述した抗体に修飾したオリゴヌクレオチドを用いてＩＣＡ反応を行うためのＩＣＡ反応液を調製した。下記表７にＩＣＡ反応液の組成を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（抗原抗体反応及びＩＣＡ反応）
　上述したキナーゼアッセイ及び抗原抗体反応液及び上述したＩＣＡ反応液を混合し、３０℃で６０分間インキュベートした。続いて、６６℃で６０分間インキュベートし、ＩＣＡ反応を行った。
　カゼイン、ノニオン系界面活性剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含むブロッキングバッファー濃度を１とし、濃度が１／２及び１／４に調整した反応液を調製し、リアルタイムＰＣＲ装置（Ｑｉａｇｅｎ社製、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　Ｑ）を用いて測定を行った。リン酸化ＭＥＫを用いたイムノＩＣＡ反応により検出された蛍光強度をシグナル（Ｓ）とし、非リン酸化ＭＥＫを用いたイムノＩＣＡ反応により検出された蛍光強度をノイズ（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎを算出した。
　図２１は、ブロッキングバッファー濃度が、Ｓ／Ｎに及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。図２１中、縦軸はＳ／Ｎの最大値を示し、横軸はＳ／Ｎが最大値になるまでの時間を示す。
　カゼイン、ノニオン系界面活性剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含むブロッキングバッファー濃度が１/２の時、Ｓ／Ｎの最大値が最大（４．３）となった。しかしながら、Ｓ／Ｎの最大値に到達するまでの時間が×１の条件に対して２倍になった。
　本発明によれば、試料中の標的物質を検出する方法及びそのためのキットを提供することができる。
　１００，９００…複合体、１１０，１２０…標的物質（タンパク質）、１６０…リン酸基、１３０，１４０，１７０…特異的結合物質、１３１，１４１，１７１…一本鎖核酸断片、１５０…二本鎖核酸（二本鎖核酸領域）、２００，５００…流体デバイス、２１０…基板、２２０…蓋部材、２２１…凸部、２２２…導入ポート、２２３…排出ポート、２３０…流路、２４１，２４２，２４２Ｒ…ウェル（微小区画）、２４０…ウェルアレイ、５１０…壁部材、８１０…フラッププローブ、８１１，８２１…フラップ部位（核酸断片）、８２０…核酸断片。

Claims (9)

  1. 　試料中の標的物質を検出する方法であって、
    　前記試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を含む混合液をインキュベートし、その結果、前記試料中に前記標的物質が存在した場合に、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質、及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する工程と、
    　前記二本鎖核酸の形成を検出する工程と、を含み、
    　前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記試料中に前記標的物質が存在することを示し、
    　前記混合液が、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体を更に含むか、又は、
    　前記混合液が、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を更に含む、方法。
  2. 　前記２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体が、疎水性基、親水性基、アニオン性基及びカチオン性基からなる群より選択される少なくとも一種の基を有するコモノマーと２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの共重合体である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記混合液中の前記２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体の濃度が０．０１～０．５％（ｗ／ｖ）である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記混合液のインキュベートをウェル中で行い、前記ウェルの容積が１０ｆＬ～１００ｐＬである、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片の塩基長が、それぞれ１０～２００塩基である、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記二本鎖核酸の形成を検出する工程が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙにより行われる、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　試料中の標的物質を検出するためのキットであって、
    　複数のウェルを有するウェルアレイ、
    　第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、
    　第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質、及び、
    　２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体を含むか、又は、カゼイン及びノニオン系界面活性剤を含む、バッファー、
    　を含む、キット。
  8. 　前記ウェルの開口部を封止する封止液を更に含む、請求項７に記載のキット。
  9. 　前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸を検出する試薬を更に含む、請求項７又は８に記載のキット。
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