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WO2024247787A1 - 即時に固化可能なハイドロゲル - Google Patents

即時に固化可能なハイドロゲル Download PDF

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Publication number
WO2024247787A1
WO2024247787A1 PCT/JP2024/018504 JP2024018504W WO2024247787A1 WO 2024247787 A1 WO2024247787 A1 WO 2024247787A1 JP 2024018504 W JP2024018504 W JP 2024018504W WO 2024247787 A1 WO2024247787 A1 WO 2024247787A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hydrogel
polymer
peg
polypeptide
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/018504
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
崇匡 酒井
昇平 石川
宏幸 鎌田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Gellycle Co Ltd
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Gellycle Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC, Gellycle Co Ltd filed Critical University of Tokyo NUC
Publication of WO2024247787A1 publication Critical patent/WO2024247787A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
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    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a tissue adhesive hydrogel that can be instantly solidified by spraying or the like, and a kit for forming the hydrogel.
  • Hydrogel is a polymeric material composed of cross-linked polymers and water. It is used as a scaffolding material for cells because it is highly permeable to molecules necessary for living cells, such as salts and proteins.
  • the polymers that make up the scaffolding material for such hydrogels can be naturally occurring collagen, gelatin, fibrinogen/thrombin, polysaccharides, or synthetic polymers such as poly(acrylamide) and poly(ethylene glycol) (PEG) (for example, Non-Patent Document 1).
  • Alginate is also a material that gels quickly, but in general, alginate gel does not exhibit cell adhesiveness and is not suitable as a scaffolding material for cell adhesion.
  • Gelatin has been widely studied as an artificial extracellular matrix (ECM) because its high water solubility and cell adhesion properties make it suitable for cell-related manipulations (e.g., Non-Patent Document 2).
  • ECM extracellular matrix
  • Gelatin is also characterized by the fact that the risk of contamination with unknown viruses is minimized compared to other protein-derived products by applying rigorous chemical and physical treatments during the manufacturing process.
  • the present invention aims to provide a hydrogel material that can be gelled in situ in a short time using a general-purpose means such as spraying, and that has cytocompatibility and tissue adhesiveness.
  • the inventors have conducted extensive research to solve the above problems and have found that by forming a hydrogel having two types of network structures, a first polymer network in which the same type of polymer having a polyethylene glycol (PEG) backbone is crosslinked, and a second polymer network in which a different type of polymer, a polypeptide and a PEG backbone polymer, is crosslinked, a material that solidifies in a short time and has cytocompatibility and tissue adhesiveness can be provided.
  • the inventors have found that by supporting (encapsulating) cells such as stem cells in such a hydrogel, it can be suitably used as a scaffold for cell adhesion, and that a hydrogel composition containing desired cells can be effectively fixed to a target biological tissue. Based on these findings, the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a hydrogel, a scaffold for cell adhesion containing the hydrogel, and a gel composition in which cells are supported on the hydrogel, ⁇ 1>
  • a hydrogel comprising a first polymer network in which two or more types of polymers (PEG-A) having a polyethylene glycol backbone are chemically crosslinked with each other, and a second polymer network in which a polypeptide and a polymer (PEG-B) having a polyethylene glycol backbone are chemically crosslinked;
  • PEG-A polymer network
  • PEG-B polymer having a polyethylene glycol backbone are chemically crosslinked
  • the present invention relates to a kit including a raw polymer solution for forming the hydrogel, specifically, ⁇ 14> A kit for rapidly preparing a hydrogel, the kit comprising: a solution X containing polymers A and B; and a solution Y containing a polypeptide and a polymer C, which are separately stored;
  • the polymer A is a polymer having a polyethylene glycol backbone capable of being chemically crosslinked with the polypeptide;
  • the polymers B and C are a combination of polymers having polyethylene glycol backbones capable of being chemically crosslinked with each other;
  • the present invention provides a novel hydrogel that solidifies in situ in a short time and has cytocompatibility and tissue adhesiveness.
  • the hydrogel of the present invention typically solidifies almost instantly within a few seconds when sprayed onto the surface of a living body, while maintaining excellent cell adhesiveness derived from the polypeptide component in the gel.
  • the hydrogel by carrying cells such as stem cells in the hydrogel, it can be used favorably as a scaffold for cell adhesion, and can also effectively immobilize desired cells in the target biological tissue. Since it solidifies almost instantly after being applied to the biological tissue by spraying or the like, it does not flow out before gelling as with conventional gel materials, and can be applied to affected areas with complex shapes or inclined surfaces.
  • the hydrogel is protein permeable, and allows cells carried (encapsulated) in the gel to survive stably for a long period of time.
  • FIG. 1(A) is a photograph and a schematic diagram of the structure of a hydrogel (GP) composed of gelatin and PEG-NHS
  • FIG. 1(B) is a graph showing the gelation time of Comparative Examples 16, 17, and 18
  • FIG. 1(C) is a graph showing the change over time in the storage modulus (G') and loss modulus (G") of Comparative Example 17.
  • FIG. 2(A) is a photograph and a schematic diagram of the structure of a hydrogel (PP) composed of PEG-SH and PEG-MA
  • FIG. 2(B) is a graph showing the gelation time of Reference Examples 1, 2, 3, and 4
  • FIG. 2(c) is a graph showing the change over time in the storage modulus (G') and loss modulus (G") of Reference Example 3.
  • FIG. 3(A) is a photograph and a schematic diagram of the structure of a hydrogel (GP/PP) consisting of gelatin/PEG-SH and PEG-NHS/PEG-MA;
  • FIG. 3(B) is a graph showing the change over time in the storage modulus (G') and loss modulus (G") of Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the elastic modulus (G′) of the hydrogels of Comparative Example 17, Reference Example 3, and Example 3.
  • FIG. 5 is a set of images showing the process of forming the hydrogel of Example 3 using a sprayer.
  • FIG. 6 shows representative photographs (left) of GP/PP(ester) in a collagenase solution and an alkaline aqueous solution, which is the hydrolyzable version of the hydrogel of Example 3, and a graph (right) showing the swelling degree (Q) of the hydrogel.
  • Figure 7 shows a glass plate with a collagen casing fixed to it (top left), a schematic diagram of the chemical reaction at the interface between the GP hydrogel and the collagen casing (top right), and a schematic diagram of a test piece subjected to a lap shear test (bottom).
  • FIG. 1 shows representative photographs (left) of GP/PP(ester) in a collagenase solution and an alkaline aqueous solution, which is the hydrolyzable version of the hydrogel of Example 3, and a graph (right) showing the swelling degree (Q) of the hydrogel.
  • Figure 7 shows a glass plate with a collagen casing fixed to it (top left), a schematic diagram of the chemical reaction at the interface between the GP hydrogel
  • FIG. 8 shows a representative photograph of a test piece set in a tensile testing machine (left), a graph showing a typical relationship between lap shear strength and displacement (center), and a graph showing the lap shear strength at break of each hydrogel (right).
  • Figure 9 (A) shows an apparatus for simultaneously spraying human mesenchymal stem cells (hMSCs) and hydrogel components (left) and a fluorescent image of hMSCs encapsulated in the hydrogel (right; scale bar indicates 100 ⁇ m);
  • Figure 9 (B) is a graph showing the survival rate of hMSCs cultured in each hydrogel.
  • FIG 10 shows the experimental procedure in which fluorescein isothiocyanate-labeled bovine serum albumin (BSA-FITC) was added to the culture medium (left panel); and a fluorescent image of hMSCs cultured with BSA-FITC (right panel: 200x and 400x indicate magnifications. Scale bar indicates 40 ⁇ m).
  • BSA-FITC fluorescein isothiocyanate-labeled bovine serum albumin
  • the hydrogel of the present invention is characterized by having the following two types of network structures: i) a first polymer network in which two or more types of polymers (PEG-A) having a polyethylene glycol (PEG) backbone are chemically crosslinked to each other; and ii) a second polymer network in which a polypeptide and a polymer (PEG-B) having a polyethylene glycol backbone are chemically crosslinked to each other.
  • PEG-A polyethylene glycol
  • PEG-B polyethylene glycol
  • the first polymer network is a network structure formed by crosslinking polymers each having a PEG backbone
  • the second polymer network is a network structure formed by crosslinking a polypeptide molecule with a heterogeneous polymer, a PEG polymer.
  • gel generally refers to a dispersion system of polymers that have high viscosity and have lost fluidity, and is in a state in which the storage modulus G' and the loss modulus G" have a relationship of G' ⁇ G", and is typically a substance with a three-dimensional network structure.
  • a hydrogel refers to a state in which the gel contains a solvent such as water inside. Preferably, the solvent is water.
  • the hydrogel of the present invention preferably has a gelation time of 10 seconds or less, and more preferably in the range of 1 to 10 seconds.
  • the hydrogel of the present invention gels in a short time and solidifies almost instantly, so that the pre-gelled solution does not flow out or to the surrounding area as in the case of conventional gel materials, and can be applied to affected areas having complex shapes or inclined surfaces.
  • Such gelation time can be further adjusted mainly by appropriately setting the polymer concentration, pH, and ionic strength in the polymer solution.
  • the solvent contained in the hydrogel of the present invention is typically water, but in some cases it can be a mixed solvent containing a small amount of alcohol such as ethanol or other organic solvent.
  • the pH of the solvent contained in the hydrogel is in the range of 6.5 to 11.5, more preferably in the range of 7.0 to 10.5, and preferably in the range of 7.0 to 8.5.
  • PEG Polymer Both PEG-A and PEG-B in the hydrogel of the present invention are polymers having a polyethylene glycol backbone.
  • the "polymer having a polyethylene glycol backbone” (hereinafter, may be simply referred to as "PEG polymer") is typically a polymer type having a plurality of branches of a polyethylene glycol backbone, and for example, di-, tri-, tetra- or octa-branched polyethylene glycol is preferred.
  • a gel consisting of a tetra-branched polyethylene glycol backbone is generally known as a Tetra-PEG gel, and a meshwork network is constructed by an AB type cross-end coupling reaction between two kinds of tetra-branched polymers each having an electrophilic functional group such as an active ester structure and a nucleophilic functional group such as an amino group at the end (Matsunaga et al., Macromolecules, Vol. 42, No. 4, pp. 1344-1351, 2009).
  • Tetra-PEG gel can be easily prepared on-site by simply mixing two polymer solutions, and the gelation time can be controlled by adjusting the pH and ionic strength during gel preparation.
  • gels with PEG as the main component are also highly biocompatible.
  • the first polymer network is a three-dimensional mesh structure formed by chemically crosslinking two or more types of PEG polymers (PEG-A) with each other.
  • the PEG polymers (PEG-A) forming the first polymer network include a first polymer having a total of two or more nucleophilic functional groups at the side chains or ends, and a second polymer having a total of two or more electrophilic functional groups at the side chains or ends.
  • a gel is formed by crosslinking such nucleophilic functional groups and electrophilic functional groups.
  • the total number of nucleophilic functional groups and electrophilic functional groups is preferably five or more. It is even more preferable that these functional groups are present at the ends.
  • nucleophilic functional groups examples include thiol groups (sulfhydryl groups) (-SH) and amino groups, and those skilled in the art can use any known nucleophilic functional group as appropriate.
  • the nucleophilic functional group is a -SH group.
  • the nucleophilic functional groups may be the same or different, but it is preferable that they are the same. By using the same functional groups, the reactivity with the electrophilic functional groups that form crosslinks is uniform, making it easier to obtain a gel with a uniform three-dimensional structure.
  • the electrophilic functional group a functional group that can be attacked by a nucleophilic functional group can be used.
  • functional groups include a maleimide group, an N-hydroxy-succinimidyl (NHS) group, a succinimidyl carbonate group, a sulfosuccinimidyl group, a phthalimidyl group, an imidazoyl group, an acryloyl group, a nitrophenyl group, -CO 2 PhNO 2 (Ph represents an o-, m-, or p-phenylene group), and other known electrophilic functional groups can be appropriately used by those skilled in the art.
  • the electrophilic functional group is a maleimide group, an N-hydroxysuccinimidyl (NHS) group, or a succinimidyl carbonate group.
  • a maleimide group is particularly preferred as the electrophilic functional group
  • an amino group an N-hydroxysuccinimidyl (NHS) group or a succinimidyl carbonate group is particularly preferred as the electrophilic functional group.
  • the electrophilic functional groups may be the same or different, but are preferably the same, since the reactivity with the nucleophilic functional groups that form crosslinks is uniform, making it easier to obtain a gel having a uniform three-dimensional structure.
  • the method of crosslinking for hydrogel formation is not limited to the reaction between the nucleophilic functional group and the electrophilic functional group described above, and a person skilled in the art may select other known chemically crosslinkable pairs.
  • the first polymer network can have a bond that can be dissociated by hydrolysis or the like. That is, the first polymer network can have a cleavable site selected from the group consisting of an ester bond, a thioester bond, a disulfide bond, a phosphate ester bond, a sulfonate ester bond, and combinations thereof.
  • the cleavable site can be a linker portion that connects the polyethylene glycol backbone to the above-mentioned nucleophilic/electrophilic functional group. Alternatively, it can be present at the crosslinking position between PEG-A.
  • the PEG polymer (PEG-B) that forms the second polymer network is similar to the PEG-A in that it has a polyethylene glycol backbone.
  • the PEG-B forms the second polymer network by chemically crosslinking with the polypeptide.
  • the PEG-B has a total of two or more electrophilic functional groups at the side chains or ends that can react with amino groups present in the polypeptide molecule to form amide bonds or urethane bonds.
  • the types of such electrophilic functional groups are as described above.
  • PEG-A and PEG-B each independently have a weight average molecular weight (Mw) in the range of 1x10 3 to 1x10 5 , preferably in the range of 0.5x10 4 to 5x10 4 , and more preferably in the range of 1x10 4 to 2x10 4 .
  • Mw weight average molecular weight
  • a non-limiting specific example of a preferred PEG polymer having a nucleophilic functional group at its terminal is a compound represented by the following formula (I) having four branches of a polyethylene glycol backbone and a thiol group at its terminal.
  • R 11 to R 14 are the same or different and each represents a C 1 -C 7 alkylene group, a C 2 -C 7 alkenylene group, -NH-R 15 -, -CO-R 15 -, -R 16 -O-R 17 -, -R 16 -NH-R 17 -, -R 16 -CO 2 -R 17 -, -R 16 -CO 2 -NH-R 17 -, -R 16 -CO-R 17 -, or -R 16 -CO-NH-R 17 -, where R 15 represents a C 1 -C 7 alkylene group, R 16 represents a C 1 -C 3 alkylene group, and R 17 represents a C 1 -C 5 alkylene group.
  • n 11 to n 14 may be the same or different. The closer the values of n 11 to n 14 are, the more uniform the three-dimensional structure can be, and the higher the strength. Therefore, in order to obtain a gel with high strength, it is preferable that they are the same. If the values of n 11 to n 14 are too high, the strength of the gel will be weak, and if the values of n 11 to n 14 are too low, the gel will not easily form due to the steric hindrance of the compound. Therefore, n 11 to n 14 may be an integer value of 5 to 600, preferably 25 to 250, more preferably 50 to 120, and even more preferably 110 to 120.
  • R 11 to R 14 are linker moieties connecting the functional group and the core portion.
  • R 11 to R 14 may be the same or different, but are preferably the same in order to produce a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
  • R 11 to R 14 represent a C 1 -C 7 alkylene group, a C 2 -C 7 alkenylene group, -NH-R 15 -, -CO-R 15 -, -R 16 -O-R 17 -, -R 16 -NH-R 17 -, -R 16 -CO 2 -R 17 -, -R 16 -CO 2 -NH-R 17 -, -R 16 -CO-R 17 -, or -R 16 -CO-NH-R 17 -.
  • R 15 represents a C 1 -C 7 alkylene group
  • R 16 represents a C 1 -C 3 alkylene group
  • R 17 represents a C 1 -C 5 alkylene group.
  • C 1 -C 7 alkylene group refers to an alkylene group having 1 to 7 carbon atoms which may have branches, and refers to a linear C 1 -C 7 alkylene group or a C 2 -C 7 alkylene group having one or more branches (having 2 to 7 carbon atoms including the branches).
  • Examples of C 1 -C 7 alkylene groups are a methylene group, an ethylene group, a propylene group, and a butylene group.
  • C1 - C7 alkylene groups include -CH2- , -( CH2 ) 2- , -( CH2 ) 3- , -CH( CH3 )-, -( CH2 ) 3- , -(CH( CH3 )) 2- , -( CH2 ) 2 -CH( CH3 ) - , -( CH2 ) 3 -CH( CH3 )-, -( CH2 ) 2 -CH( C2H5 )-, -( CH2 ) 6- , -( CH2 ) 2 -C (C2H5 ) 2- , and -( CH2 ) 3C ( CH3 ) 2CH2- .
  • C 2 -C 7 alkenylene group refers to a branched or linear alkenylene group having 2 to 7 carbon atoms and one or more double bonds in the chain, and examples of such groups include divalent groups having double bonds formed by removing 2 to 5 hydrogen atoms from adjacent carbon atoms of the alkylene group.
  • preferred non-limiting examples of the polymer having an electrophilic functional group at its terminal include, for example, a compound represented by the following formula (II) having four branches of a polyethylene glycol backbone and an N-hydroxy-succinimidyl (NHS) group at its terminal.
  • n 21 to n 24 may be the same or different. The closer the values of n 21 to n 24 are, the more uniform the gel can be in a three-dimensional structure and the stronger it is, and it is preferable that they are the same. If the values of n 21 to n 24 are too high, the strength of the gel will be weak, and if the values of n 21 to n 24 are too low, the gel will not easily form due to the steric hindrance of the compound. For this reason, n 21 to n 24 may be an integer value of 5 to 600, preferably 25 to 250, more preferably 50 to 120, and even more preferably 110 to 120.
  • R 21 to R 24 are linker moieties connecting the functional group and the core portion.
  • R 21 to R 24 may be the same or different, but are preferably the same in order to produce a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
  • R 21 to R 24 are the same or different and represent a C 1 -C 7 alkylene group, a C 2 -C 7 alkenylene group, -NH-R 25 -, -CO-R 25 -, -R 26 -O- R 27 - , -R 26 -NH - R 27 -, -R 26 -CO 2 -NH - R 27 -, -R 26 -CO-R 27 -, or -R 26 -CO-NH-R 27 -.
  • R 25 represents a C 1 -C 7 alkylene group
  • R 26 represents a C 1 -C 3 alkylene group
  • R 27 represents a C 1 -C 5 alkylene group.
  • the alkylene group and the alkenylene group may have one or more optional substituents.
  • substituents include, but are not limited to, an alkoxy group, a halogen atom (which may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom), an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, an acyl group, or an aryl group.
  • an alkyl group has two or more substituents, they may be the same or different. The same applies to the alkyl portion of other substituents that contain an alkyl portion (e.g., an alkyloxy group or an aralkyl group).
  • a functional group when defined as "optionally having a substituent", the type of the substituent, the substitution position, and the number of the substituent are not particularly limited, and when two or more substituents are present, they may be the same or different.
  • the substituent include, but are not limited to, an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a halogen atom, a sulfo group, an amino group, an alkoxycarbonyl group, and an oxo group. These substituents may further have a substituent.
  • the content of PEG-A in the hydrogel is preferably 10 g/L or more, more preferably 20 g/L.
  • the content of PEG-B in the hydrogel is preferably 5 g/L or more, more preferably 15 g/L or more.
  • the total content of PEG-A and PEG-B in the hydrogel is preferably 15 g/L or more, more preferably 25 g/L or more, and even more preferably 35 g/L or more.
  • the hydrogel of the present invention contains a polypeptide for forming a second polymer network by chemical crosslinking with the PEG-B.
  • a polypeptide for forming a second polymer network by chemical crosslinking with the PEG-B.
  • an amino group present in the polypeptide molecule reacts with an electrophilic functional group present in a side chain or end of PEG-B to form a bond, thereby chemically crosslinking the polypeptide and PEG-B.
  • the polypeptide imparts cell adhesiveness and the like to the hydrogel.
  • the polypeptide can be a natural or artificial product derived from a living organism, and can be, for example, one or more selected from the group consisting of gelatin, collagen, albumin, laminin, fibrinogen, elastin, fibronectin, or derivatives thereof. These include collagen peptides, which are proteins obtained by hydrolyzing collagen, or substances obtained by chemically modifying collagen. Preferably, the polypeptide is gelatin or a derivative thereof.
  • the concentration of the polypeptide in the second polymer network is preferably in the range of 10 g/L or more and 120 g/L or less in the hydrogel.
  • the concentration of the polypeptide in the entire hydrogel is 10 g/L or more and the concentration of PEG-B is 15 g/L or more, and in a more preferred embodiment, the concentration of the polypeptide in the entire hydrogel is 20 g/L or more and the concentration of PEG-B is 30 g/L or more.
  • the present invention relates to a scaffold material for cell adhesion comprising the above-mentioned hydrogel.
  • the hydrogel of the present invention has excellent protein permeability, and allows cells supported (encapsulated) in the gel to survive stably for a long period of time.
  • the present invention also relates to a gel composition in which cells are supported (encapsulated) in a hydrogel.
  • a gel composition is useful, for example, for effectively immobilizing desired cells in a target biological tissue.
  • the hydrogel of the present invention has a very short gelation time and solidifies almost instantly after the raw polymer solution is applied to the biological tissue by spraying or the like, so it does not flow out before gelling as with conventional gel materials and can be applied to affected areas with complex shapes or inclined surfaces.
  • the cells contained in the gel composition of the present invention are not particularly limited and can be used for a wide variety of cells. There are no particular limitations on the type of cells, and they can be selected appropriately depending on the purpose. All cells can be used regardless of taxonomic classification, for example, eukaryotic cells, prokaryotic cells, multicellular organism cells, or unicellular organism cells. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • eukaryotic cells include animal cells, insect cells, plant cells, fungi, etc. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • adhesive cells There are no particular limitations on the adhesive cells, and they can be selected appropriately depending on the purpose, and examples of such cells include differentiated cells and undifferentiated cells. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • differentiated cells include somatic stem cells, hepatocytes, which are parenchymal cells of the liver; stellate cells; Kupffer cells; vascular endothelial cells; endothelial cells such as meatal endothelial cells and corneal endothelial cells; fibroblasts; osteoblasts; osteoclasts; periodontal ligament-derived cells; epidermal cells such as epidermal keratinocytes; tracheal epithelial cells; digestive tract epithelial cells; cervical epithelial cells; epithelial cells such as corneal epithelial cells; mammary gland cells; pericytes; muscle cells such as smooth muscle cells and cardiac muscle cells; kidney cells; pancreatic islet cells of Langerhans; nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells; chondrocytes; bone cells.
  • somatic stem cells such as epidermal keratinocytes; tracheal epithelial cells; digestive tract epithelial cells; cervical epithelial cells; epit
  • the adhesive cells may be primary cells directly collected from tissues or organs, or may be cells that have been passaged for several generations. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • undifferentiated cells include pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and mesenchymal stem cells that have multi-differentiation ability; unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells that have unidifferentiation ability; and induced pluripotent stem cells (iPS cells). These may be used alone or in combination of two or more types.
  • Examples of prokaryotic cells include eubacteria and archaea. Somatic stem cells are preferable.
  • Kit The present invention further relates to a kit for quickly preparing the above-mentioned hydrogel.
  • the kit of the present invention stores separately solution X containing polymers A and B, and solution Y containing a polypeptide and polymer C.
  • these solutions X and Y store separately polymers B and C, which are PEG polymers that form the first polymer network, and the polypeptide and polymer A that form the second polymer network.
  • the polymer A is a polymer having a polyethylene glycol backbone capable of chemically crosslinking with the polypeptide;
  • the polymers B and C are a combination of polymers having polyethylene glycol skeletons that can be chemically crosslinked with each other,
  • Polymers B and C correspond to the first and second polymers in the above-mentioned PEG-A, and their preferred embodiments have already been described.
  • polymer A corresponds to the above-mentioned PEG-B.
  • polypeptide contained in solution Y corresponds to the above-mentioned polypeptide that forms the second polymer network.
  • the concentration of polymer A in solution X is in the range of 10 to 240 g/L, preferably in the range of 20 to 120 g/L, and more preferably in the range of 30 to 90 g/L.
  • the concentration of polypeptide in solution Y is in the range of 20 to 120 g/L, preferably in the range of 20 to 80 g/L, and more preferably in the range of 20 to 60 g/L.
  • concentrations of polymer B and polymer C in solutions X and Y are in the range of 10 to 240 g/L, preferably in the range of 20 to 150 g/L, more preferably in the range of 20 to 100 g/L, and even more preferably in the range of 20 to 60 g/L. As long as the concentrations of polymers B and C are within the above range, they may be the same or different, but it is preferable that they are the same.
  • Solutions X and Y are adjusted so that the pH of the mixture obtained by mixing these solutions is in a range acceptable to cells (pH 5.3 or higher), preferably in the range of 6.5 to 11.5, more preferably in the range of 7.0 to 10.5, and even more preferably in the range of 7.0 to 8.5. In a typical embodiment, it is preferable that both solutions X and Y are within these pH ranges.
  • the pH of solutions X and Y can be adjusted using a pH buffer known in the art.
  • the pH can be adjusted to the above range by using a citrate-phosphate buffer (CPB) and changing the mixing ratio of citric acid and disodium hydrogen phosphate.
  • CPB citrate-phosphate buffer
  • solutions X and Y is water, but in some cases it can be a mixed solvent containing alcohols such as ethanol or other organic solvents.
  • solutions X and Y are aqueous solutions in which water is the sole solvent.
  • the volumes of solutions X and Y in the kit of the present invention can be adjusted as appropriate depending on the area and structural complexity of the biological tissue or site to which they are applied, but are typically in the range of 0.1 to 20 mL, and preferably 1 to 10 mL, respectively.
  • the reaction rate of the polymer B and the polymer C is in the range of 60% to 100%. By keeping it within this range, it is possible to adjust the gelation time, etc. as desired.
  • a two-liquid mixing syringe such as that disclosed in International Publication WO2007/083522 can be used.
  • the temperature of the two liquids during mixing is not particularly limited, and may be a temperature at which each polymer is dissolved and each liquid has fluidity.
  • the temperatures of the two liquids may be different, but it is preferable that the temperatures are the same since the two liquids are more easily mixed.
  • the kit of the present invention may also include a means for spraying solutions X and Y onto a predetermined area using a sprayer.
  • a means may be a sprayer that stores solutions X and Y separately.
  • Any sprayer known in the art may be used as appropriate, and is preferably a medical sprayer. Therefore, such a sprayer may be used as the container in the kit of the present invention, and in that case, one aspect of the present invention may be a medical device, preferably a sprayer, that stores solutions X and Y.
  • PEG polyethylene glycol
  • SINOPEG Biotech Co., Ltd. Flujian, China.
  • D-PBS(-) PBS
  • Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM
  • penicillin/streptomycin PS
  • trypsin-EDTA 0.05%)
  • FBS fetal bovine serum
  • LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit Calcein Blue AM
  • Calcein Blue AM Calcein Blue AM
  • -Cellstain® -PI solution and fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin (FITC-BSA) were purchased from Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA).
  • Collagenase from Clostridium histolyticum was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
  • Sodium hydroxide (NaOH) was purchased from Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Tokyo, Japan).
  • Blue ink Waterman Mysterious Blue Ink
  • Cyanoacrylate adhesive was purchased from Toagosei Co., Ltd. (Tokyo, Japan).
  • a 0.22 ⁇ m filter (Minisart, RC15-AC, Sartorius AG, Göttingen, Germany), a rheometer (MCR 301, Anton Paar GmbH, North Ryde, Australia), a tensile tester (Autograph AG-X plus, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan), a fluorescence microscope (BZ-X710, Keyence Corp., Osaka, Japan), and a confocal laser scanning microscope (CLSM, LSM 800, Carl Zeiss AG, Jena, Germany) were used in the experiments.
  • Polymer solution A is a solution containing gelatin and 4-branched polyethylene glycol having an SH group at its terminal (PEG-SH)
  • polymer solution B is a solution containing 4-branched polyethylene glycol having an N-hydroxysuccinimide group at its terminal (PEG-NHS) and 4-branched polyethylene glycol having a maleimide group at its terminal (PEG-MA).
  • gelatin and PEG-NHS (these are referred to as “GP pair”) can form a hydrogel (GP gel) by crosslinking with each other
  • PEG-SH and PEG-MA (these are referred to as “PP pair”) can also form another hydrogel (PP gel) by crosslinking with each other.
  • the two prepared polymer solutions A and B were mixed in a volume ratio of 1:1 and a gelation test was carried out.
  • the mixed gelling solution was poured into a glass vial, and the gelling point was determined as the point at which the fluidity was lost when the vial was tilted, and the time required to reach this point was observed as the gelling time "t gel ".
  • the storage modulus (G′) and loss modulus (G′′) were measured as follows. Polymer solution A was placed on the bottom plate of the rheometer, and an equal amount of polymer solution B was added. The measurement plate (PP25, diameter 3 mm) installed on the top of the rheometer was set at a position 0.3 mm from the bottom plate. The experimental parameters used were a temperature of 25 °C, a shear amplitude of 1%, and an oscillation frequency of 1.0 Hz. The changes in the storage modulus (G′) and loss modulus (G′′) of the gelled solution were measured over time.
  • Shear modulus was measured by the following procedure: Polymer solution A was poured into a silicone mold (diameter 35 mm, height 1 mm) and mixed with an equal amount of polymer solution B. After 24 h of incubation at 25 °C, the formed hydrogel was gently removed from the mold and placed on the bottom plate of the rheometer. A measuring plate (PP25) was placed close to the sample until a force of 1.5 N was detected. G′ was measured at 25 °C with strains from 0.1 to 10% and an angular frequency of 10 Hz.
  • PP hydrogel may be a promising carrier for the delivery of GP hydrogel, which has a slow hydrogel formation by itself.
  • the GP/PP(ester) hydrogel was immersed in a collagenase solution, the enzyme reaction was stopped with neutral PBS, and the hydrogel was immersed in an alkaline aqueous solution (NaOH).
  • an alkaline aqueous solution NaOH
  • the equilibrium swelling degree (Q) increased with time, whereas in PBS, Q remained almost constant.
  • Q increased rapidly and then disappeared macroscopically. This is because when the GP network was cut in the first collagenase step, the balance between osmotic pressure and restoring force was disrupted, and Q increased (i.e., swelling due to degradation).
  • the PP (ester)-derived PEG network did not change in the collagenase environment, resulting in a finite degree of Q and maintaining the solidity of the hydrogel.
  • the hydrolyzable esters in the PP (ester) network were cleaved, again disrupting the balance between osmotic pressure and restoring force, and Q increased. Finally, the entire network structure of the hydrogel was lost and disappeared macroscopically.
  • hydrogels with GP networks can be instantly formed in situ by spraying, even though the polymer solution maintains a neutral pH.
  • the formed hydrogels were completely degraded when both the GP and PP networks were cleaved.
  • the GP network was digested by collagenase, which is ubiquitously expressed in vivo, and the PP (ester) network was hydrolyzed under physiological conditions. Therefore, the hydrogels of the present invention are biodegradable in vivo.
  • the lap shear strength is expressed as F/S ini , where F is the applied force and S ini is the initial bond area of 10.4 cm2
  • the lap shear strength at break is expressed as F max /S ini , where F max is the maximum applied force and S ini is 10.4 cm2 .
  • the PP hydrogel did not show significant lap shear strength, which is due to the fact that animal-derived collagen does not contain cysteine residues (i.e., maleimide-reactive sulfhydryl groups) and the reaction between maleimide groups and amino groups is only effective under alkaline conditions.
  • cysteine residues i.e., maleimide-reactive sulfhydryl groups
  • a significant increase in lap shear strength versus displacement was observed in the two groups containing GP hydrogel. This strongly suggests that the NHS groups reacted with gelatin to form a polymer network within the GP hydrogel and formed chemical bonds with the amino groups on the surface of the collagen casing. This result is consistent with previous studies that identified hydrogels composed of gelatin and PEG-NHS that adhere to biological tissues.
  • the GP/PP hydrogel of the present invention showed similar lap shear strength to the GP hydrogel. Considering that no adhesion was observed in the PP hydrogel, it is believed that a portion of the PP hydrogel formed crosslinks with the collagen casing of the GP/PP hydrogel. These results indicate that by forming both GP hydrogel and PP hydrogel, it is possible to obtain both the instant solidification properties derived from PP hydrogel and the tissue adhesion properties derived from GP hydrogel.
  • hMSCs (passage 2) were cultured in 10 mL DMEM (10% FBS and 1% PS) in a 10 cm dish (Corning Inc., Corning, NY, USA) at 37°C under 5% CO2 for 1 week. The medium was changed every 2–3 days to ensure nutrient supply. Polymer solutions A and B were sterilized using a 0.22 ⁇ m filter, and a sprayer (MIS Spray Applicator, Medmix AG, Baar, Switzerland) was disinfected with 70% ethanol and then washed with DMEM. hMSCs (passage 3) were suspended in polymer solution A at a cell density of 5.0 ⁇ 105 cells/mL.
  • Solution A and solution B containing the suspended cells were loaded separately into 5 mL syringes and sprayed into each well of a 12-well cell culture plate.
  • the sprayed solution was incubated at 37°C under 5% CO2 for 30 min to obtain a hydrogel.
  • the final hydrogel volume and cell number were 1 mL and 2.5 ⁇ 105 cells, respectively.
  • the prepared hydrogel was immersed in 2 mL of DMEM and incubated for 1 week. The medium was changed every 2–3 days.
  • DMEM containing 1 ⁇ M calcein AM and 2 ⁇ M ethidium homodimer was prepared according to the manufacturer's protocol. hMSCs were incubated in the hydrogels for 0, 4, and 7 days, and then further incubated in the DMEM prepared here at 37°C and 5% CO2 for 10 min from each time point. The hydrogels were then washed three times with PBS. The cells encapsulated in the hydrogels were observed under a fluorescent microscope, and the numbers of live and dead cells were counted using Image J software, and cell viability was calculated as the ratio of live cells to total cells.
  • the same culture system was also used to test cell-encapsulated PP hydrogels.
  • the cells were spherical immediately after preparation, but unlike GP hydrogels, they remained spherical until the 7th day.
  • a slight decrease in cell viability was also observed. This may be due to anoikis (apoptotic cell death caused by insufficient cell-matrix interactions), as hMSCs were unable to adhere or extend on pure PEG hydrogels.
  • cell viability was over 80%, suggesting that the crosslinking reaction of PP hydrogels was not highly cytotoxic and that PP hydrogels are a promising carrier material for GP hydrogels.
  • the cell viability of the GP/PP (ester) hydrogel of the present invention was comparable to that of GP hydrogel alone (>90%), and the cell morphology on day 7 was similar to that of GP hydrogel, with some cells elongating in both cases. These results indicate that the cytocompatibility and cell adhesiveness of GP hydrogel are maintained even when it contains PP hydrogel components.
  • bovine serum albumin labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) was added to the culture medium (i.e., outside the hydrogel) ( Figure 10, left). This compound is known to pass through the cell membrane and enter the cytoplasm by endocytosis.
  • BSA bovine serum albumin
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • DMEM containing 2 ⁇ M calcein blue and 2 ⁇ M PI was prepared.
  • FITC-BSA was added to the prepared DMEM at 0.1 g/L.
  • Cell-encapsulated GP/PP hydrogels were prepared and incubated in DMEM containing FITC-BSA for 30 min, then in DMEM containing calcein blue and PI for 10 min at 37°C under 5 % CO2. The hydrogels were then washed three times with PBS and observed by CLSM.
  • the results are shown in the right panel of Figure 10.
  • the cytoplasm turned green in cross-sectional images of cells taken with a confocal microscope, indicating that the BSA diffused into the hydrogel and reached the cytoplasm of the encapsulated cells.
  • BSA is a protein with a molecular weight of approximately 66 kDa, it is believed that other proteins with similar or lower molecular weights can freely pass through the hydrogel.
  • Such excellent permeability is important for cell medicine, not only for cell survival, but also for therapeutic effects to be obtained from proteins secreted by cells such as hMSCs.

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Abstract

【課題】　噴霧等の汎用的な手段を用いてin situにおいて短時間でゲル化することができ、細胞適合性及び組織接着性を有するハイドロゲル材料を提供することを課題とする。 【解決手段】　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）骨格を有する同種のポリマーが架橋した第１の高分子ネットワークと、ポリペプチドとＰＥＧ骨格ポリマーという異種のポリマーが架橋した第２の高分子ネットワークという２種のネットワーク構造を有するハイドロゲルを形成することで、短時間で固化しつつ、かつ細胞適合性及び組織接着性を有する材料が提供できることを見出した。

Description

即時に固化可能なハイドロゲル
　本発明は、噴霧等により即時に固化可能な組織接着性のハイドロゲル、及び当該ハイドロゲルを形成するためのキットに関する。
　ハイドロゲルは、架橋ポリマーと水で構成される高分子材料であり、塩やタンパク質など生細胞に必要な分子に対する透過性が高いため、細胞の足場材料として用いられている。かかるハイドロゲルの足場材料を構成するポリマーとしては、天然に存在するコラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン/トロンビン、多糖類、或いはポリ(アクリルアミド)やポリ(エチレングリコール) (ＰＥＧ)などの合成ポリマーを用いることができる（例えば、非特許文献１）。速やかにゲル化する材料としてアルギン酸も存在する、一般に、アルギン酸ゲルは細胞接着性を示さず、細胞接着用足場材として適切ではない。
　ゼラチンは、その高い水溶性と細胞接着特性は細胞関連の操作に適しているため、人工細胞外マトリックス(ＥＣＭ)として広く研究されている（例えば、非特許文献２）。ゼラチンは、製造過程で厳格な化学的および物理的処理を適用することによって、他のタンパク質由来製品と比較して、未知のウイルスによる汚染のリスクが最小限に抑えられることも特徴である。
　ゼラチンをゲル化させるために、合成ポリマーによってゼラチン中のリジン残基を架橋させる手法が試みられているが、従来は、ゲル化時間が中性のｐＨ領域では数分程度要するため、ｉｎ ｓｉｔｕでＥＣＭ用ゲルを形成させることは困難であった。このような遅いゲル化の場合には、ゲル化溶液が固化する前に外部に流出するため、複雑な形状や傾斜面を有する生体組織の表面にハイドロゲルを形成することはできなかった。したがって、生細胞にとって理想的な条件である中性ｐＨ環境において短時間でゲル化することができ、かつ細胞適合性及び組織接着性の両方を満たすハイドロゲル材料の開発は、未だ達成できていない。
Asadiら、Mater. Chem. Phys. 2020, 242, 122528. Suら、Biotechnol. Lett. 2015, 37 (11), 2139-2145.
　そこで、本発明は、噴霧等の汎用的な手段を用いてin situにおいて短時間でゲル化することができ、細胞適合性及び組織接着性を有するハイドロゲル材料を提供することを課題とする。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）骨格を有する同種のポリマーが架橋した第１の高分子ネットワークと、ポリペプチドとＰＥＧ骨格ポリマーという異種のポリマーが架橋した第２の高分子ネットワークという２種のネットワーク構造を有するハイドロゲルを形成することで、短時間で固化しつつ、かつ細胞適合性及び組織接着性を有する材料が提供できることを見出した。また、かかるハイドロゲル中に幹細胞等の細胞を担持（封入）させることで、細胞接着用足場材として好適に用いることができるとともに、標的とする生体組織に所望の細胞を含むハイドロゲル組成物を効果的に固定化することができることも見出した。これらの知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、一態様において、ハイドロゲル、当該ハイドロゲルを含む細胞接着用足場材、及び当該ハイドロゲルに細胞を担持させたゲル組成物に関し、
＜１＞ポリエチレングリコール骨格を有する２種類以上のポリマー（ＰＥＧ－Ａ）が互いに化学架橋されてなる第１の高分子ネットワークと、ポリペプチドとポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ｂ）が化学架橋されてなる第２の高分子ネットワークとを含む、ハイドロゲル；
＜２＞１０秒以内の範囲のゲル化時間を有し、前記ゲル化時間は、貯蔵弾性率Ｇ′と損失弾性率Ｇ″が、Ｇ′＝Ｇ″となるまでに要する時間である、上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜３＞前記第２の高分子ネットワークにおける前記ポリペプチドの濃度が、前記ハイドロゲル中１０ｇ／Ｌ以上かつ１２０ｇ／Ｌ以下である、上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜４＞前記ハイドロゲル中におけるポリエチレングリコール骨格を有するポリマーの総含有量（ＰＥＧ－Ａ及びＰＥＧ－Ｂ）が、１５ｇ／Ｌ以上である、上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜５＞前記第１の高分子ネットワークが、エステル結合、チオエステル結合、ジスルフィド結合、リン酸エステル結合、スルホン酸エステル結合、及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される開裂可能部位を有する、上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜６＞前記第１の高分子ネットワークにおける前記ポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ａ）が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基を有する第１のポリマーと、側鎖又は末端に合計２以上の求電子性官能基を有する第２のポリマーを含む、上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜７＞前記第２の高分子ネットワークにおける前記ポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ｂ）が、前記ポリペプチドの分子内に存在するアミノ基と反応してアミド結合またはウレタン結合を形成可能な合計２以上の求電子性官能基を側鎖又は末端に有する、上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜８＞前記ポリペプチドが、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、フィブリノーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、又はそれらの誘導体よりなる群から選択される１以上である、上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜９＞前記ハイドロゲル中の前記ポリペプチドの濃度が１０ｇ／Ｌ以上であり、かつ、前記第２の高分子ネットワークにおける前記ポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ｂ）の濃度が１５ｇ／Ｌ以上である、上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜１０＞ハイドロゲルに含まれる溶媒のｐＨが、６．５～１１．５の範囲である、請上記＜１＞に記載のハイドロゲル；
＜１１＞上記＜１＞～＜１０＞のいずれかに記載のハイドロゲルを含む、細胞接着用足場材料；
＜１２＞上記＜１＞～＜１０＞のいずれかに記載のハイドロゲル中に細胞を担持させた、ゲル組成物；及び
＜１３＞前記細胞が、体性幹細胞である、上記＜１１＞に記載のゲル組成物を提供するものである。
　別の態様において、本発明は、上記ハイドロゲルを形成するための原料ポリマー溶液を含むキットに関し、具体的には、
＜１４＞ハイドロゲルを迅速に調製するためのキットであって、ポリマーＡ及びＢを含む溶液Ｘと、ポリペプチドとポリマーＣを含む溶液Ｙとを別個に格納しており、前記ポリマーＡは、前記ポリペプチドと化学架橋可能なポリエチレングリコール骨格を有するポリマーであり、前記ポリマーＢ及びＣは、互いに化学架橋可能なポリエチレングリコール骨格を有するポリマーの組合せであり、前記溶液ＸとＹを混合することで得られるハイドロゲルのゲル化時間が、１０秒以内であり、ここで、前記ゲル化時間は、貯蔵弾性率Ｇ′と損失弾性率Ｇ″が、Ｇ′＝Ｇ″となるまでに要する時間である、キット；
＜１５＞前記ポリマーＡが、前記ポリペプチドの分子内に存在するアミノ基と反応してアミド結合またはウレタン結合を形成可能な合計２以上の求電子性官能基を側鎖又は末端に有する、上記＜１４＞に記載のキット；
＜１６＞前記ポリマーＢ及びＣが、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基を有するポリマーと、側鎖又は末端に合計２以上の求電子性官能基を有するポリマーの組合せである、上記＜１４＞に記載のキット；
＜１７＞前記溶液Ｙにおける前記ポリペプチドが、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、フィブリノーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、又はそれらの誘導体よりなる群から選択される１以上である、上記＜１４＞に記載のキット；
＜１８＞前記ポリマーＢと前記ポリマーＣの反応率が、６０％～１００％の範囲である、上記＜１４＞に記載のキット；
＜１９＞前記溶液Ｘ及びＹを噴霧器により所定領域に噴霧するための、上記＜１４＞に記載のキット；及び
＜２０＞前記溶液Ｘ及びＹが、それぞれ別個の噴霧器に格納されている、上記＜１４＞に記載のキット
を提供するものである。
　本発明によれば、ｉｎ－ｓｉｔｕにおいて短時間で固化しつつ、かつ細胞適合性及び組織接着性を有する新規ハイドロゲルを提供することができる。本発明のハイドロゲルは、典型的には、生体表面に噴霧することにより数秒以内にほぼ瞬時に固化するとともに、ゲル中のポリペプチド成分に由来する優れた細胞接着性を維持するものである。
　また、かかるハイドロゲル中に幹細胞等の細胞を担持させることで、細胞接着用足場材として好適に用いることができるとともに、標的とする生体組織に所望の細胞を効果的に固定化することもできる。当該生体組織に噴霧等により塗布した後にほぼ瞬時に固化するため、従来のゲル材料のようにゲル化前に流れ出ることがなく、複雑な形状や傾斜面を有する患部に適用することができる。当該ハイドロゲルは、タンパク質透過性を有し、ゲル中に担持（封入）された細胞を、長期間安定に生存させることができる。
図１（Ａ）は、ゼラチンとPEG-NHSからなるハイドロゲル(GP)の写真と構造の模式図であり；図１（Ｂ）は、比較例16、17、18のゲル化時間を示すグラフであり；図１（Ｃ）は、比較例17の貯蔵弾性率(G′)と損失弾性率(G″)の経時変化を示すグラフである。 図２（Ａ）は、PEG-SHとPEG-MAからなるハイドロゲル(PP)の写真と構造の模式図であり；図２（Ｂ）は、参考例1、2、3、4のゲル化時間を示すグラフであり；図２（ｃ）は、参考例3の貯蔵弾性率(G′)と損失弾性率(G″)の経時変化を示すグラフである。 図３（Ａ）は、Gelatin/PEG-SHとPEG-NHS/PEG-MAからなるハイドロゲル(GP/PP)の写真と構造の模式図であり；図３（Ｂ）は、実施例3の貯蔵弾性率(G′)と損失弾性率(G″)の経時変化を示すグラフである。 図４は、比較例17、参考例3、実施例3のハイドロゲルの弾性率(G′)を示すグラフである。 図５は、実施例3のハイドロゲルを噴霧器で形成させた過程を示す画像である。 図６は、実施例3のハイドロゲルを加水分解性にしたGP/PP(ester)のコラゲナーゼ溶液およびアルカリ水溶液中での代表写真（左図）と、ハイドロゲルの膨潤度（Q）を示すグラフ（右図）である。 図７は、コラーゲンケーシングを固定したガラス板（左上図）、GPハイドロゲルとコラーゲンケーシングの界面での化学反応の模式図（右上図）、ラップシアー試験を行った試験片の模式図（下図）である。 図８は、引張試験機にセットした試験片の代表写真（左図）、ラップシアー強度と変位の代表的な関係を示すグラフ（中央図）、各ハイドロゲルの破断時のラップシアー強度を示すグラフ（右）である。 図９（Ａ）は、ヒト間葉系幹細胞（hMSCs）とハイドロゲル成分を同時に噴霧する装置（左図）と、ハイドロゲルに内包されたhMSCsの蛍光画像（右図：スケールバーは100μmを示す）であり；図９（Ｂ）は、各ハイドロゲル中で培養したhMSCsの生存率を示すグラフである。 図１０は、フルオレセインイソチオシアネートで標識したウシ血清アルブミン（BSA-FITC）を培養液に添加した実験手順（左図）；及び、BSA-FITCで培養したhMSCの蛍光画像（右図：200×と400×は拡大率を示す。スケールバーは40μmを示す）である。
　以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
１．本発明のハイドロゲル
　本発明のハイドロゲルは、以下の２種のネットワーク構造を有することを特徴とする：
ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）骨格を有する２種類以上のポリマー（ＰＥＧ－Ａ）が互いに化学架橋されてなる第１の高分子ネットワーク；及び
ｉｉ）ポリペプチドとポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ｂ）が化学架橋されてなる第２の高分子ネットワーク。
　すなわち、第１の高分子ネットワークは、互いにＰＥＧ骨格を有するポリマー同士が架橋して形成されたネットワーク構造であり、一方、第２の高分子ネットワークは、ポリペプチド分子と、ＰＥＧポリマーという異種のポリマーが架橋して形成されたネットワーク構造である。これにより、ポリペプチド成分に由来する細胞適合性及び組織接着性を保持しながら、従来技術の課題であったゲル化時間の短縮及び短時間での固化を達成したものである。
　本明細書中において、「ゲル」とは、一般に、高粘度で流動性を失った高分子の分散系であり、貯蔵弾性率Ｇ′と損失弾性率Ｇ″においてＧ′≧Ｇ″の関係性を有する状態をいい、典型的には３次元の網目構造を有する物質である。ハイドロゲルは、当該ゲルが水等の溶媒を内部に含んだ状態をいう。好ましくは、溶媒は水である。
　本発明のハイドロゲルは、好ましくは、１０秒以内、より好ましくは、１～１０秒の範囲のゲル化時間を有する。本発明のハイドロゲル、短時間でゲル化し、ほぼ瞬時に固化するため、従来のゲル材料のようにゲル化前の溶液が外部又は周辺部に流れ出ることがなく、複雑な形状や傾斜面を有する患部に適用することができる。ここで、「ゲル化時間」とは、原料ポリマーを含む溶液を混合してからゲル化に至るまでの時間であり、貯蔵弾性率Ｇ′と損失弾性率Ｇ″が、Ｇ′＝Ｇ″となるまでに要する時間である。かかるゲル化時間は、主として、ポリマー溶液におけるポリマー濃度やｐＨ、イオン強度を適宜設定することでさらに調節することができる。
　上述のように、本発明のハイドロゲル中に含まれる溶媒は、典型的には水であるが、場合によっては、微量のエタノールなどのアルコール類やその他の有機溶媒を含む混合溶媒とすることもできる。また、ハイドロゲルに含まれる溶媒のｐＨは、６．５～１１．５の範囲、より好ましくは７．０～１０．５の範囲、好ましくは、７．０～８．５の範囲である。
１－１　ＰＥＧポリマー
　本発明のハイドロゲルにおけるＰＥＧ－Ａ及びＰＥＧ－Ｂは、いずれもポリエチレングリコール骨格を有するポリマーである。「ポリエチレングリコール骨格を有するポリマー」（以下、単に「ＰＥＧポリマー」と記載する場合がある。）は、代表的には、複数のポリエチレングリコール骨格の分岐を有するポリマー種が挙げられ、例えば、２分岐、３分岐、４分岐又は８分岐のポリエチレングリコールが好ましい。特に、４分岐型のポリエチレングリコール骨格よりなるゲルは、一般に、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧゲルとして知られており、それぞれ末端に活性エステル構造等の求電子性の官能基とアミノ基等の求核性の官能基を有する２種の４分岐ポリマー間のＡＢ型クロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークが構築される（Ｍａｔｓｕｎａｇａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｖｏｌ.４２、Ｎｏ.４、ｐｐ.１３４４－１３５１、２００９）。また、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧゲルは各ポリマー溶液の単純な二液混合で簡便にその場で作製可能であり、ゲル調製時のｐＨやイオン強度を調節することでゲル化時間を制御することも可能である。そして、ＰＥＧを主成分とするゲルは、生体適合性にも優れている。
　第１の高分子ネットワークは、２種類以上のＰＥＧポリマー（ＰＥＧ－Ａ）が、互いに化学架橋して、３次元網目構造が形成されたものである。典型的には、第１の高分子ネットワークを形成するＰＥＧポリマー（ＰＥＧ－Ａ）は、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基を有する第１のポリマーと、側鎖又は末端に合計２以上の求電子性官能基を有する第２のポリマーを含む。かかる求核性官能基と求電子性官能基が架橋することによりゲルが形成される。ここで、求核性官能基と求電子性官能基の合計は、５以上であることが好ましい。これらの官能基は、末端に存在することがさらに好ましい。
　求核性官能基としては、チオール基（スルフヒドリル基）（－ＳＨ）、アミノ基などを挙げることができ、当業者であれば公知の求核性官能基を適宜用いることができる。好ましくは、求核性官能基は－ＳＨ基である。求核性官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋結合を形成することとなる求電子性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
　求電子性官能基としては、求核性官能基によって攻撃されうる官能基を用いることができる。このような官能基としては、マレイミド基、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、炭酸スクシンイミジル基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、ニトロフェニル基、－ＣＯ２ＰｈＮＯ２(Ｐｈは、ｏ－、ｍ－、又はｐ－フェニレン基を示す)などを挙げることができ、当業者であればその他の公知の求電子性官能基を適宜用いることができる。好ましくは、求電子性官能基はマレイミド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）基または炭酸スクシンイミジル基である。求核性官能基がチオール基である場合は、マレイミド基が求電子性官能基として特に好ましく、求核性官能基がアミノ基である場合は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）基または炭酸スクシンイミジル基が求電子性官能基として特に好ましい。求電子性官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋結合を形成することとなる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
　ハイドロゲル形成に係る架橋形成の方法は前記の求核性官能基と求電子性官能基間の反応に限定されず、当業者であればその他の公知の化学架橋可能なペアを選択することもできる。
　好ましい態様において、第１の高分子ネットワークは、加水分解等により解列可能な結合を有することができる。すなわち、第１の高分子ネットワークは、エステル結合、チオエステル結合、ジスルフィド結合、リン酸エステル結合、スルホン酸エステル結合、及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される開裂可能部位を有することができる。開裂可能部位は、ポリエチレングリコール骨格と上記の求核性／求電子性官能基を連結するリンカー部分であることができる。或いは、ＰＥＧ－Ａ間の架橋位置に存在することもできる。
　第２の高分子ネットワークを形成するＰＥＧポリマー（ＰＥＧ－Ｂ）も、ポリエチレングリコール骨格を有するという点で、上記ＰＥＧ－Ａと同様である。当該ＰＥＧ－Ｂは、ポリペプチドと化学架橋することで第２の高分子ネットワークを形成する。したがって、典型的には、ＰＥＧ－Ｂは、前記ポリペプチドの分子内に存在するアミノ基と反応してアミド結合またはウレタン結合を形成可能な合計２以上の求電子性官能基を側鎖又は末端に有する。かかる求電子性官能基の種類は、上述のとおりである。
　ＰＥＧ－Ａ及びＰＥＧ－Ｂは、それぞれ独立に、１ｘ１０３～１ｘ１０５の範囲、好ましくは、０．５ｘ１０４～５ｘ１０４の範囲、より好ましくは１ｘ１０４～２ｘ１０４の範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。
　末端に求核性官能基を有するＰＥＧポリマー（すなわち、ＰＥＧ－Ａの第１のポリマー）として好ましい非限定的な具体例には、例えば、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有し、末端にチオール基を有する下記式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　式（Ｉ）中、Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒ１５－、－ＣＯ－Ｒ１５－、－Ｒ１６－Ｏ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＮＨ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ２－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ－Ｒ１７－、又は－Ｒ１６－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ１７－を示し、ここで、Ｒ１５はＣ１－Ｃ７アルキレン基を示し、Ｒ１６はＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し、Ｒ１７はＣ１－Ｃ５アルキレン基を示す。）
　ｎ１１～ｎ１４は、それぞれ同一でも又は異なってもよい。ｎ１１～ｎ１４の値が近いほど、均一な立体構造をとることができ、高強度となる。このため、高強度のゲルを得るためには、同一であることが好ましい。ｎ１１～ｎ１４の値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、ｎ１１～ｎ１４の値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、ｎ１１～ｎ１４は、５～６００の整数値が挙げられ、２５～２５０が好ましく、５０～１２０がさらに好ましく、１１０～１２０であればさらに好ましい。
　上記式（Ｉ）中、Ｒ１１～Ｒ１４は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ同一でも異なってもよいが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。Ｒ１１～Ｒ１４は、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒ１５－、－ＣＯ－Ｒ１５－、－Ｒ１６－Ｏ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＮＨ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ２－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ－Ｒ１７－、又は－Ｒ１６－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ１７－を示す。ここで、Ｒ１５はＣ１－Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１－Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１－Ｃ５アルキレン基を示す。
　ここで、「Ｃ１－Ｃ７アルキレン基」とは、分岐を有してもよい炭素数が１以上７以下のアルキレン基を意味し、直鎖Ｃ１－Ｃ７アルキレン基又は１つ又は２つ以上の分岐を有するＣ２－Ｃ７アルキレン基（分岐を含めた炭素数が２以上７以下）を意味する。Ｃ１－Ｃ７アルキレン基の例は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基である。Ｃ１－Ｃ７アルキレン基の例は、－ＣＨ2－、－(ＣＨ2)2－、－(ＣＨ2)3－、－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)3－、－(ＣＨ(ＣＨ3))2－、－(ＣＨ2)2－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)3－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)2－ＣＨ(Ｃ2Ｈ5)－、－(ＣＨ2)6－、－(ＣＨ２)2－Ｃ(Ｃ2Ｈ5)2－、及び－(ＣＨ2)3Ｃ(ＣＨ3)2ＣＨ2－などが挙げられる。
　「Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基」とは、鎖中に１個若しくは２個以上の二重結合を有する状又は分枝鎖状の炭素原子数２～７個のアルケニレン基であり、例えば、前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の２～５個を除いてできる二重結合を有する２価基が挙げられる。
　一方、末端に求電子性官能基を有するポリマー（すなわち、ＰＥＧ－Ａにおける第２のポリマー；又はＰＥＧ－Ｂ）として好ましい非限定的な具体例には、例えば、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有し、末端にＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基を有する下記式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記式（ＩＩ）中、ｎ２１～ｎ２４は、それぞれ同一でも又は異なってもよい。ｎ２１～ｎ２４の値は近いほど、ゲルは均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一である方が好ましい。ｎ２１～ｎ２４の値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、ｎ２１～ｎ２４の値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、ｎ２１～ｎ２４は、５～６００の整数値が挙げられ、２５～２５０が好ましく、５０～１２０がさらに好ましく、１１０～１２０であればさらに好ましい。
　上記式（ＩＩ）中、Ｒ２１～Ｒ２４は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ２１～Ｒ２４は、それぞれ同一でも異なってもよいが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式（ＩＩ）中、Ｒ２１～Ｒ２４は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒ２５－、－ＣＯ－Ｒ２５－、－Ｒ２６－Ｏ－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＮＨ－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＣＯ２－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＣＯ－Ｒ２７－、又は－Ｒ２６－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ２７－を示す。ここで、Ｒ２５はＣ１－Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ２６はＣ１－Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ２７はＣ１－Ｃ５アルキレン基を示す。
　本明細書において、アルキレン基及びアルケニレン基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
　また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。
　ハイドロゲル中におけるＰＥＧ－Ａの含有量は、好ましくは、１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌである。ハイドロゲル中におけるＰＥＧ－Ｂの含有量は、好ましくは、５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１５ｇ／Ｌ以上である。
　したがって、ハイドロゲル中におけるＰＥＧ－Ａ及びＰＥＧ－Ｂの総含有量は、好ましくは、１５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは３５ｇ／Ｌ以上である。
１－２　ポリペプチド
　上述のように、本発明のハイドロゲルは、上記ＰＥＧ－Ｂとの化学架橋により第２の高分子ネットワークを形成するためのポリペプチドを含む。典型的には、ポリペプチドの分子内に存在するアミノ基が、ＰＥＧ－Ｂの側鎖又は末端に存在する求電子性官能基と反応して結合を形成することで、ポリペプチドとＰＥＧ－Ｂとが化学架橋する。当該ポリペプチドは、ハイドロゲルに細胞接着性等を付与するものである。
　前記ポリペプチドは、生体由来の天然物又は人工物であることができるが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、フィブリノーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、又はそれらの誘導体よりなる群から選択される１種以上を挙げることができる。これらには、コラーゲンを加水分解して得られるタンパク質であるコラーゲンペプチドや、或いは、コラーゲンを化学修飾した物質などが含まれる。好ましくは、ポリペプチドは、ゼラチン又はその誘導体である。
　第２の高分子ネットワークにおけるポリペプチドの濃度は、ハイドロゲル中において、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上であり、かつ１２０ｇ／Ｌ以下の範囲とすることができる。
　第２の高分子ネットワークにおけるポリペプチドとＰＥＧ－Ｂの比率について、好ましい態様では、ハイドロゲル全体中のポリペプチドの濃度が１０ｇ／Ｌ以上であり、かつ、ＰＥＧ－Ｂの濃度が１５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましい態様では、ハイドロゲル全体中のポリペプチドの濃度が２０ｇ／Ｌ以上であり、かつ、ＰＥＧ－Ｂの濃度が３０ｇ／Ｌ以上であることができる。
２．ゲル組成物
　別の態様において、本発明は、上述のハイドロゲルを含む細胞接着用足場材料に関する。後述の実施例で示すように、本発明のハイドロゲルは、優れたタンパク質透過性を有し、ゲル中に担持（封入）された細胞を、長期間安定に生存させることができる。
　また、本発明は、ハイドゲル中に細胞を担持（封入）させたゲル組成物にも関する。かかるゲル組成物は、例えば、標的とする生体組織に所望の細胞を効果的に固定化ために有用である。上述のように、本発明のハイドロゲルは非常に短いゲル化時間を有し、原料ポリマー溶液を生体組織に噴霧等により塗布した後にほぼ瞬時に固化するため、従来のゲル材料のようにゲル化前に流れ出ることがなく、複雑な形状や傾斜面を有する患部に適用することができる。
　本発明のゲル組成物に含まれる細胞は、特に限定されることなく、広い種類の細胞に用いることができる。細胞は、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。分化した細胞としては、例えば、体性幹細胞や、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。好ましくは、体性幹細胞である。
３．キット
　さらに、本発明は、上述のハイドロゲルを迅速に調整するためのキットにも関する。
　本発明のキットは、ポリマーＡ及びＢを含む溶液Ｘと、ポリペプチドとポリマーＣを含む溶液Ｙとを別個に格納している。すなわち、これら溶液ＸとＹは、上記第１の高分子ネットワークを形成するＰＥＧポリマーであるポリマーＢとＣ、及び上記第２の高分子ネットワークを形成するポリペプチドとポリマーＡをそれぞれ別個に格納するものである。そして、これら溶液ＸとＹを混合することで、各ポリマー間の架橋が進行し、これら高分子ネットワークを有するハイドロゲルが形成されることとなる。
　より具体的には、本発明のキットにおいて
・前記ポリマーＡは、前記ポリペプチと化学架橋可能なポリエチレングリコール骨格を有するポリマーであり；
・前記ポリマーＢ及びＣは、互いに化学架橋可能なポリエチレングリコール骨格を有するポリマーの組合せであり、
・前記溶液ＡとＢを混合することで得られるハイドロゲルのゲル化時間が、１０秒以内、好ましくは１～１０秒の範囲であり、ここで、前記ゲル化時間は、貯蔵弾性率Ｇ′と損失弾性率Ｇ″が、Ｇ′＝Ｇ″となるまでに要する時間である。
　ポリマーＢ及びＣは、上述のＰＥＧ－Ａにおける第１のポリマー及び第２のポリマーに対応するものであり、それらの好ましい態様については、既に述べたとおりである。
　また、ポリマーＡは、上述のＰＥＧ－Ｂに対応するものである。また、溶液Ｙに含まれるポリペプチドは、上述の第２の高分子ネットワークを形成するポリペプチドに対応するものである。これらの好ましい態様についても、既に述べたとおりである。
　溶液Ｘ中におけるポリマーＡの濃度は、１０～２４０ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは、２０～１２０ｇ／Ｌの範囲、より好ましくは３０～９０ｇ／Ｌの範囲である。また、溶液Ｙにおけるポリペプチドの濃度は、２０～１２０ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは、２０～８０ｇ／Ｌの範囲、より好ましくは２０～６０ｇ／Ｌの範囲である。
　溶液Ｘ及びＹ中におけるポリマーＢ及びポリマーＣの濃度は、それぞれ１０～２４０ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは、２０～１５０ｇ／Ｌの範囲、より好ましくは２０～１００ｇ／Ｌの範囲であり、さらに好ましくは２０～６０ ｇ／Ｌの範囲である。ポリマーＢ及びＣの濃度は、上記の範囲を満たす限り、それぞれ同一でも異なっていてもよいが、同一の濃度であることが好ましい。
　溶液Ｘ及びＹは、これらの溶液を混合して得られる混合液のｐＨが細胞にとって許容可能な領域（ｐＨ５．３以上）になるように調整され、好ましくはｐＨが６．５～１１．５の範囲、より好ましくは７．０～１０．５の範囲、さらに好ましくは７．０～８．５となるように調整される。典型的な態様では、溶液Ｘ及びＹの両方がこれらのｐＨの範囲内であることが好ましい。
　溶液Ｘ及びＹのｐＨは、当該技術分野において公知のｐＨ緩衝剤を用いることができる。例えば、クエン酸－リン酸バッファー（ＣＰＢ）を用い、クエン酸とリン酸水素二ナトリウムの混合比を変えることで、ｐＨを上述の範囲に調節することができる。
　溶液Ｘ及びＹにおける溶媒は、水であるが、場合によっては、エタノールなどのアルコール類やその他の有機溶媒を含む混合溶媒とすることもできる。好ましくは、溶液Ｘ及びＹは、水を単独溶媒とする水溶液である。
　本発明のキットにおける溶液Ｘ及びＹの容量は、それらが適用される生体組織や部位の面積や構造の複雑さなどに応じて適宜調節することができるが、典型的には、それぞれ０．１～２０ｍLの範囲、好ましくは、１～１０ｍLである。
　好ましい態様において、前記ポリマーＢと前記ポリマーＣの反応率が、６０％～１００％の範囲である。かかる範囲内とすることによって、所望のゲル化時間等の調整を行うことができる。
　溶液Ｘ及びＹを滴下により混合する手段としては、例えば、国際公開ＷＯ２００７／０８３５２２号公報に開示されたような二液混合シリンジを用いて行うことができる。混合時の二液の温度は、特に限定されず、各ポリマーがそれぞれ溶解され、それぞれの液が流動性を有する状態の温度であればよい。例えば、二液の温度は異なってもよいが、温度が同じである方が、二液が混合されやすいので好ましい。
　また、本発明のキットは、溶液Ｘ及びＹを噴霧器により所定領域に噴霧するための手段を備えるものであってもよい。かかる手段としては、溶液Ｘ及びＹをそれぞれ別個に格納した噴霧器を用いることができる。噴霧器は、当該技術分野において公知のものを適宜用いることができ、好ましくは医療用噴霧器である。したがって、本発明のキットにおける容器としてかかる噴霧器を用いることができ、その場合、本発明の一態様としては、溶液Ｘ及びＹを格納した医療機器、好ましくは噴霧器であることができる。　
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
材料：
ブタ皮膚由来のゼラチン(APAT、Mw= 60 kg/mol)およびウシ皮膚由来のコラーゲンケーシングは、Nippi Inc.(東京、日本)から購入した。N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、マレイミド(MA)、又はチオール(SH)基で末端官能化されたMw= 10 kg/mol の４分岐ポリエチレングリコール(PEG) (それぞれPEG-NHS、PEG-MA、およびPEG-SH）は、SINOPEG Biotech Co., Ltd.（福建省、中国）から購入した。D-PBS(-) (PBS)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ペニシリン/ストレプトマイシン(PS)、トリプシン-EDTA(0.05%)、ウシ胎児血清(FBS)、LIVE/DEAD（登録商標） 生存率/細胞毒性キット、カルセインブルーAM、-CellstainR-PI溶液、およびフルオレセインイソチオシアネート結合ウシ血清アルブミン(FITC-BSA)は、Thermo Fisher Scientific Inc.(米国マサチューセッツ州ウォルサム)から購入した。Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼは、Sigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ州、米国)から購入した。水酸化ナトリウム(NaOH)は富士フイルム和光純薬株式会社(東京、日本)から購入した。ハイドロゲル成分を視覚化するための青色インク(ウォーターマンミステリアスブルー インク)は、ウォーターマンペンカンパニー(米国ニューヨーク州ニューヨーク)から購入した。シアノアクリレート接着剤は東亞合成株式会社(東京、日本)から購入した。
装置：
0.22 μmフィルター(Minisart、RC15-AC、Sartorius AG、ゲッティンゲン、ドイツ)、レオメーター(MCR 301、Anton Paar GmbH、ノースライド、オーストラリア)、引張試験機(Autograph AG-X plus、島津製作所、京都、日本）、蛍光顕微鏡（BZ-X710、Keyence Corp.、大阪、日本）、および共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM、LSM 800、Carl Zeiss AG、イエナ、ドイツ）を実験に用いた。
１．ポリマー溶液の調製及びゲル化工程
　ポリマー溶液Ａ及びＢとして、以下の表１に示す濃度のポリマー成分をＰＢＳに溶解し、各種ポリマー溶液を調製した。ポリマー溶液Ａは、ゼラチンと末端にＳＨ基を有する４分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＳＨ）を含む溶液であり、ポリマー溶液Ｂは、末端にＮ－ヒドロキシスクシンイミド基を有する４分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＮＨＳ）及び末端にマレイミド基を有する４分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＭＡ）を含む溶液である。ここで、ゼラチンとＰＥＧ－ＮＨＳ（これらを「ＧＰペア」という。）は相互に架橋することでハイドロゲル（ＧＰゲル）を形成することができ、ＰＥＧ－ＳＨとＰＥＧ－ＭＡ（これらを「ＰＰペア」という。）も相互に架橋することで別のハイドロゲル（ＰＰゲル）を形成することができる。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　調製したポリマー溶液Ａ及びＢの２つの溶液を１：１の体積比で混合し、ゲル化試験を行った。混合したゲル化溶液をガラスバイアルに注ぎ、バイアルを傾けたときに流動性が失われた時点をゲル化点とし、この点に到達するのに必要な時間をゲル化時間「ｔｇｅｌ」として観測した。
　その結果、表１に示すように、実施例１～１１では、数秒以内という短時間でゲルが形成された。一方で、比較例１～４、１８ではゲルの形成が見られなかった。また、比較例５～１７では、ゲルの形成は見られたものの、ゲル化に１分以上を要し、場合によって、混合後に白濁が見られた。
２．ゲルの形成挙動の検証
　次いで、ポリマー溶液Ａ及びＢを混合した場合のゲルの形成挙動を検証した。
＜レオロジー特性評価＞
　貯蔵弾性率(G′)と損失弾性率(G″)は、以下の手順で測定した。ポリマー溶液Aをレオメーターの底板に置き、同量のポリマー溶液Bを加えた。レオメーターの上部に設置された測定プレート(PP25、直径3 mm)を底部プレートから0.3 mmの位置にセットした。実験パラメータは、温度25°C、せん断振幅1%、振動周波数1.0 Hzを用いた。ゲル化溶液の貯蔵弾性率(G′)と損失弾性率(G″)の変化を経時的に測定した。
＜せん断弾性率＞
　せん断弾性率は、以下の手順で測定した。ポリマー溶液Aをシリコーン型(直径35 mm、高さ1 mm)に注ぎ、等量のポリマー溶液Bと混合した。25℃で24時間インキュベートした後、形成されたハイドロゲルを型から静かに取り出し、レオメーターの底板の上に置いた。1.5 Nの力が検出されるまで、測定プレート(PP25)をサンプルの近くに配置した。G′を、25°Cで0.1 ～ 10%のひずみおよび角周波数10 Hzで測定した。
　まず、本質的に固化が遅いＧＰペアのハイドロゲル形成能力を確認するために、中性リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて、80 g/Lゼラチン溶液と120 g/L PEG-NHS 溶液を別々に調製した（比較例１６）。これら２つの溶液を 1:1 の体積比で混合し、GP成分の濃度(ＣＧＰ) = 100 g/Lとした。ゼラチンとPEG-NHSの間に耐加水分解性のアミド結合が形成され、混合溶液は時間の経過とともに固化した（図１（Ａ））。さらに、CGPを変化させながらバイアル傾斜法によりtgel値を取得した(図１（Ｂ）)。より高いCGPでは、より短いtgel持続時間を達成できることが示された。ただし、高濃度では細胞毒性が懸念されるため、この要因を軽減するべく、比較的低濃度(CGP= 50 g/L)を代表例として選択した（比較例１７）。一方、比較例１８のＣＧＰ＝ ２５ｇ／Ｌではゲル化は起こらなかった。これはおそらく濃度が低すぎたためと考えられる。より定量的な結果を得るために、代表的なGPハイドロゲルの動的粘弾性を測定した(図１（Ｃ）)。最初の数分間は、貯蔵弾性率(G′)＜損失弾性率(G″)であることが明らかで、材料が固化するまでに数分かかり、この間に傾斜面に塗布するとそこから流れ落ちてしまうことが示された。その後、時間の経過とともに関係はG′ > G″に逆転し、ゲル化が確認された。
　次に、もう一方のペアである、比較的ゲル化時間が短いＰＰペアのゲル化挙動を検証した（参考例１～４）。各PEGをPBS中で別々に調製し、その後、２つの溶液を混合して、GPと同様のハイドロゲルを形成した(図２（Ａ）)。ここでは、スルフヒドリル基とマレイミド基の間にチオエーテル結合が形成された。表１の参考例１～４に記載した異なる濃度(CPP)でtgel値を取得した。CPP≧ 10 g/Lで5秒以内の固化を観察した(図1E)。CPP ≧10 g/Lでのゲル化は困難であった。次に、代表的なＰＰハイドロゲルの動的粘弾性を測定した(図1F)。ゲル化点（すなわち、Ｇ′とＧ″との間のクロスオーバー）に急速に到達し、中性ｐＨでは架橋反応が極めて速いことが示された。したがって、PPハイドロゲルは、それ自体ではハイドロゲルの形成が遅いGPハイドロゲルの送達のための有望なキャリアとなる可能性がある。
　次に、実施例３のポリマー溶液を混合した場合(図３（Ａ）)には、瞬間的な凝固が観察された。また、動的粘弾性測定を行うと、混合直後にG′ > G″の関係が観察された（図３（ｂ）)。この観察されたPPハイドロゲル様プロファイルは、PP成分の架橋がGP成分の存在によって阻害されなかったことを示している。さらに、数分後にはG′の大幅な増加が観察された。このG′の増加はGPハイドロゲルでも観察されたことを考慮すると、GPネットワークが、単一PEGネットワーク内に相互侵入ネットワーク（IPN：interpenetrating network）として、時間の経過とともに形成されたと考えられる。また、ゲル化後の平衡G′値は、:GPおよびPP成分由来のハイドロゲル(GP/PPハイドロゲル) > GPハイドロゲル > PPハイドロゲルの順となった(図４)。
　この結果は、第1と第2のIPNが物理的に絡み合い、それによって複合材料の弾性率が各コンポーネント単独の弾性率よりも増加したことを意味する。したがって、これら２種のポリマー溶液を、噴霧器を用いて所定の箇所に噴霧すると、瞬時に固化することが示唆された(図５)。そのため、実施例１～１１のポリマー溶液を付与することで、対象組織の形状に関わらず、ゲル材料を流れ出すことなく塗布することができる。
３．ハイドロゲルの分解挙動の測定
　IPNの存在を確認するために、PEG-MAを加水分解性エステル部分を持つPEG-MA(ester)に置き換えた修飾GP/PPハイドロゲル(以下、GP/PP(ester)ハイドロゲルと呼ぶ)を使用して段階的な分解試験を行った（図６）。GP/PP(ester)ハイドロゲルを試験する前に、GPおよびPP(ester)ハイドロゲルをそれぞれコラゲナーゼおよびアルカリ水溶液に浸漬して、これらの溶液によるハイドロゲルの分解を確認した(図６)。
　次に、GP/PP(ester) ハイドロゲルをコラゲナーゼ溶液に浸し、中性PBSで酵素反応を停止し、ハイドロゲルをアルカリ水溶液(NaOH)に浸した。図６右図に示すように、コラゲナーゼ溶液では、平衡膨潤度(Q)は時間に依存して増加したが、PBSではQはほぼ一定であった。次のアルカリ水溶液のステップでは、Qが急激に増加し、その後巨視的に消失した。これは、最初のコラゲナーゼステップでGPネットワークが切断されたときに、浸透圧と復元力のバランスが崩れ、Qが増加したためである（つまり、分解による膨潤）。
　対照的に、図６右図に示すように、PP(ester)由来のPEGネットワークはコラゲナーゼ環境では変化せず、結果としてQの程度が有限になり、ハイドロゲルとしての固体性が維持された。アルカリ水溶液中では、PP(ester)ネットワークに存在する加水分解性エステルが切断され、浸透圧と復元力のバランスが再び崩れ、Qが上昇した。最終的に、ハイドロゲルのネットワーク構造全体が失われ、肉眼的に消失した。
　また、ハイドロゲルをアルカリ水溶液に浸し、次PBS、最後にコラゲナーゼに浸す実験も行った。アルカリ水溶液では時間に応じてQが増加し、中性PBSでは安定したQが観察され、コラゲナーゼ溶液ではQが急速に減少し、最終的にはハイドロゲルが消失することが観察された。これは、加水分解性PP(ester)ネットワークが最初のアルカリ溶液で切断され、GPネットワークがハイドロゲルを固体として維持し、その後のコラゲナーゼ溶液がゼラチンを酵素的に消化して、ゲルが消失するという上記ハイドロゲルのパターンとは対照的である。Qの低下を伴うこの分解挙動は、外側の溶液中の酵素濃度が比較的高いために、ポリマーネットワークの切断がハイドロゲルの表面から優先的に起こる場合に観察されるものである。これらの結果は、GP/PP(ester)ハイドロゲルがGPおよびPP(ester)ネットワークに由来するIPN構造を有することを示している。
　これらの結果は、ポリマー溶液が中性pHを維持しているにもかかわらず、噴霧によってin situでGPネットワークを備えたハイドロゲルを瞬時に形成し得ることを示すものである。形成されたハイドロゲルは、GPネットワークとPPネットワークの両方が切断されると完全に分解された。GPネットワークは生体内で普遍的に発現するコラゲナーゼによって消化され、PP(ester)ネットワークは生理学的条件下で加水分解された。したがって、本発明のハイドロゲルは生体内において生分解性を有する。
４．細胞接着性の評価
　本発明のハイドロゲルの組織接着特性を明らかにするために、コラーゲンケーシング上のハイドロゲルのラップシアー強度を評価した。
　具体的な手順を図７に示す。展開したコラーゲンケーシングをシアノアクリレート接着剤でガラス基板に事前に固定した。コラーゲンケーシングを備えた２つの同一の基板を準備し、コラーゲンケーシングの間にハイドロゲルを適用した。次に、引張試験機で試験片を引っ張り、ラップシアー強度対変位を取得し、破断時のラップシアー強度を算出した（図８）。
　ここで、ラップシアー強度は、Ｆ／Ｓｉｎｉで表され、式中、Ｆは与えられた力であり、Ｓｉｎｉは10.4 cm2の初期接着面積である。また、破断時のラップシアー強度は、Ｆｍａｘ／Ｓｉｎｉで表され、式中、Ｆｍａｘは与えられた最大の力であり、Ｓｉｎｉは10.4 cm2である。
　図８右図に示すように、ＰＰハイドロゲルは顕著なラップシアー強度を示さなかったが、これは、動物由来コラーゲンにはシステイン残基(すなわち、マレイミド反応性のスルフヒドリル基)が含まれていないこと、マレイミド基とアミノ基の間の反応がアルカリ条件下でのみ有効であることによるものである。ＰＰハイドロゲルとは対照的に、ＧＰハイドロゲルを含む２つのグループでは、変位に対するラップシアー強度の大幅な増加が観察された。これは、ＮＨＳ基がゼラチンと反応してＧＰハイドロゲル内にポリマーネットワークを形成し、コラーゲンケーシングの表面のアミノ基と化学結合を形成したことを強く示唆している。この結果は、生体組織に接着するゼラチンとPEG-NHSで構成されるハイドロゲルを特定した過去の研究と一致する。本発明のＧＰ/ＰＰハイドロゲルは、ＧＰハイドロゲルと類似のラップシアー強度を示した。ＰＰハイドロゲルでは接着が観察されなかったことを考慮すると、ＰＰハイドロゲルの一部が ＧＰ/ＰＰハイドロゲルのコラーゲケーシングと架橋を形成したものと考えられる。これらの結果は、ＧＰハイドロゲルとＰＰハイドロゲルを両方形成させることで、ＰＰハイドロゲルに由来する瞬間凝固特性とＧＰハイドロゲルに由来する組織接着特性の双方が得られることを示すものである。
５．ハイドロゲルへの細胞の封入
　本発明のハイドロゲルの細胞適合性を評価するために、ヒト間葉系幹細胞(ｈＭＳＣ)をハイドロゲルに封入し、通常の培地で培養し、細胞の形態を観察した(図９（Ａ）)。また、得られた蛍光画像から生細胞の割合を算出した(図９（Ｂ）)。具体的な実験手順は、以下のとおりである。
　＜噴霧により形成したハイドロゲルでの細胞培養＞
　ｈＭＳＣ(継代2)を、10 cmディッシュ(Corning Inc.、Corning、NY、USA) を用い、10 mL DMEM (10% FBSおよび1% PS)中で、37°C、5% CO2雰囲気下で １週間培養した。栄養供給を確保するために培地を2～3日ごとに交換した。ポリマー溶液AおよびBは0.22 μmフィルターを使用して滅菌し、噴霧器(MIS Spray Applicator、Medmix AG、バール、スイス)は70%エタノールで消毒し、その後DMEMで洗浄した。hMSC (継代3)を 5.0 × 105細胞/mLの細胞密度でポリマー溶液Aに懸濁した。細胞を懸濁した溶液Aと溶液Bを別々に5 mLシリンジに充填し、12ウェル細胞培養プレートの各ウェルに噴霧した。噴霧された溶液を５％ＣＯ２下、３７℃で３０分間インキュベートして、ハイドロゲルを得た。最終的なハイドロゲルの体積と細胞数は、それぞれ1 mLと2.5 × 105細胞であった。調製したハイドロゲルを2 mLのDMEMに浸漬し、1週間インキュベートした。培地は２～３日ごとに交換した。
＜細胞形態及び生存率の観察＞
　1μMのカルセインAMおよび2μMのエチジウムホモダイマーを含むDMEMを製造業者のプロトコールに従って調製した。hMSCをハイドロゲル中で0、4および7日間インキュベートした後、ここで調製したDMEM中で37℃および5% CO2で10分間、各時点からさらにインキュベートした。次いで、ハイドロゲルをＰＢＳで３回洗浄した。ハイドロゲルに封入された細胞を蛍光顕微鏡で観察し、生細胞と死細胞の数をImage Jソフトウェアを使用して計数し、細胞生存率を全細胞に対する生細胞の比率として計算した。
　図９に示すように、細胞封入ＧＰハイドロゲルの場合には、0日目にはすべての細胞が球状だったが、3日目には一部の細胞が伸長し、7日目には伸長した細胞の割合がさらに増加した。高い細胞生存率(>90%)は、噴霧によるせん断応力が影響を受けなかったことを示している。形態学的変化および細胞生存率は、過去に報告されたゼラチンおよびPEGハイドロゲルのものと同様であり、この細胞培養プロトコールの妥当性が確認された。
　同じ培養系で細胞封入ＰＰハイドロゲルについても検証した結果、ＧＰハイドロゲルと同様に、細胞は調製直後は球状であったが、ＧＰハイドロゲルとは異なり、7日目まで球状のままであった。また、細胞生存率のわずかな減少も観察された。hMSCは純粋なPEGハイドロゲルでは接着または伸長できないため、これはアノイキス(不十分な細胞-マトリックス相互作用によって引き起こされるアポトーシス細胞死)によるものである可能性が考えられる。一方、細胞生存率は80%を超えており、ＰＰハイドロゲルの架橋反応は細胞毒性が高くなく、ＧＰハイドロゲルの担体材料として有望であることが示唆された。
　本発明のＧＰ／ＰＰ(ester)ハイドロゲルの細胞生存率は、ＧＰハイドロゲル単独の細胞生存率(>90%)に匹敵し、7日目の細胞の形態はGPハイドロゲルの形態と同様であり、どちらの場合も一部の細胞は伸長していた。これらの結果は、ＰＰハイドロゲル成分が含まれていてもＧＰハイドロゲルの細胞適合性と細胞接着性が維持されることを示している。
　次いで、ＧＰ／ＰＰ(ester)ハイドロゲルの物質透過性を評価した。このアッセイでは、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)で標識したウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を培地(つまり、ハイドロゲルの外側)に添加した（図１０左図）。この化合物はエンドサイトーシスによって細胞膜を通過して細胞質に入ることが知られているためである。具体的な手順は以下のとおりである。
　2μMのカルセインブルーと2μMのPIを含むDMEMを調製した。さらに、調製したDMEMにFITC-BSAを0.1g/Lで添加した。細胞封入GP/PPハイドロゲルを調製し、FITC-BSAを含むDMEMで30分間インキュベートし、次にカルセインブルーおよびPIを含むDMEMで10分間、37℃、5% CO2下でインキュベートした。次いで、ハイドロゲルをＰＢＳで３回洗浄し、ＣＬＳＭによって観察した。
　得られた結果を図１０右図に示す。ＢＳＡの添加後、共焦点顕微鏡で得られた細胞の断面画像では細胞質が緑色に変化した。これは、ＢＳＡがハイドロゲル内に拡散し、封入された細胞の細胞質に到達したことを示している。ＢＳＡは分子量約６６ｋＤａのタンパク質であるため、同様の分子量又はより低い分子量の他のタンパク質であれば、ハイドロゲルを自由に通過できると考えられる。かかる優れた透過性は、細胞の生存だけでなく、ｈＭＳＣなどの細胞によって分泌されるタンパク質から治療効果が得られるため、細胞医学にとって重要である。
　以上の結果は、1)組織接着性ゼラチン/ＰＥＧハイドロゲルと2)瞬間的に固化するＰＥＧハイドロゲルの２つの成分を含むハイドロゲルが、噴霧により瞬時に固化させることができ、優れた細胞接着性を示すことを実証するものである。また、本発明のハイドロゲルにはヒト間葉系幹細胞(ｈＭＳＣ)を封入することができ、ハイドロゲル内で優れた細胞生存率(>90%)を示した。さらに、ハイドロゲルはタンパク質に対して透過性があることが示された。すなわち、本発明のハイドロゲルが、種々の生体組織に対して、有益なタンパク質を分泌する細胞を固定化でき、細胞医学の分野における基本的なツールとなる可能性があることが実証された。

Claims (20)

  1. 　ポリエチレングリコール骨格を有する２種類以上のポリマー（ＰＥＧ－Ａ）が互いに化学架橋されてなる第１の高分子ネットワークと、ポリペプチドとポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ｂ）が化学架橋されてなる第２の高分子ネットワークとを含む、ハイドロゲル。
  2. 　１０秒以内の範囲のゲル化時間を有し、前記ゲル化時間は、貯蔵弾性率Ｇ′と損失弾性率Ｇ″が、Ｇ′＝Ｇ″となるまでに要する時間である、請求項１に記載のハイドロゲル。
  3. 　前記第２の高分子ネットワークにおける前記ポリペプチドの濃度が、前記ハイドロゲル中１０ｇ／Ｌ以上かつ１２０ｇ／Ｌ以下である、請求項１に記載のハイドロゲル。
  4. 　前記ハイドロゲル中におけるポリエチレングリコール骨格を有するポリマーの総含有量（ＰＥＧ－Ａ及びＰＥＧ－Ｂ）が、１５ｇ／Ｌ以上である、請求項１に記載のハイドロゲル。
  5. 　前記第１の高分子ネットワークが、エステル結合、チオエステル結合、ジスルフィド結合、リン酸エステル結合、スルホン酸エステル結合、及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される開裂可能部位を有する、請求項１に記載のハイドロゲル。
  6. 　前記第１の高分子ネットワークにおける前記ポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ａ）が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基を有する第１のポリマーと、側鎖又は末端に合計２以上の求電子性官能基を有する第２のポリマーを含む、請求項１に記載のハイドロゲル。
  7. 　前記第２の高分子ネットワークにおける前記ポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ｂ）が、前記ポリペプチドの分子内に存在するアミノ基と反応してアミド結合またはウレタン結合を形成可能な合計２以上の求電子性官能基を側鎖又は末端に有する、請求項１に記載のハイドロゲル。
  8. 　前記ポリペプチドが、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、フィブリノーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、又はそれらの誘導体よりなる群から選択される１以上である、請求項１に記載のハイドロゲル。
  9. 　前記ハイドロゲル中の前記ポリペプチドの濃度が１０ｇ／Ｌ以上であり、かつ、前記第２の高分子ネットワークにおける前記ポリエチレングリコール骨格を有するポリマー（ＰＥＧ－Ｂ）の濃度が１５ｇ／Ｌ以上である、請求項１に記載のハイドロゲル。
  10. 　ハイドロゲルに含まれる溶媒のｐＨが、６．５～１１．５の範囲である、請求項１に記載のハイドロゲル。
  11. 　請求項１～１０のいずれかに記載のハイドロゲルを含む、細胞接着用足場材料。
  12. 　請求項１～１０のいずれかに記載のハイドゲル中に細胞を担持させた、ゲル組成物。
  13. 　前記細胞が、体性幹細胞である、請求項１２に記載のゲル組成物。
  14. 　ハイドロゲルを迅速に調製するためのキットであって、
    　ポリマーＡ及びＢを含む溶液Ｘと、ポリペプチドとポリマーＣを含む溶液Ｙとを別個に格納しており、
    　前記ポリマーＡは、前記ポリペプチドと化学架橋可能なポリエチレングリコール骨格を有するポリマーであり、
    　前記ポリマーＢ及びＣは、互いに化学架橋可能なポリエチレングリコール骨格を有するポリマーの組合せであり、
    　前記溶液ＸとＹを混合することで得られるハイドロゲルのゲル化時間が、１０秒以内であり、ここで、前記ゲル化時間は、貯蔵弾性率Ｇ′と損失弾性率Ｇ″が、Ｇ′＝Ｇ″となるまでに要する時間である、キット。
  15. 　前記ポリマーＡが、前記ポリペプチドの分子内に存在するアミノ基と反応してアミド結合またはウレタン結合を形成可能な合計２以上の求電子性官能基を側鎖又は末端に有する、請求項１４に記載のキット。
  16. 　前記ポリマーＢ及びＣが、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基を有するポリマーと、側鎖又は末端に合計２以上の求電子性官能基を有するポリマーの組合せである、請求項１４に記載のキット。
  17. 　前記溶液Ｙにおける前記ポリペプチドが、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、フィブリノーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、又はそれらの誘導体よりなる群から選択される１以上である、請求項１４に記載のキット。
  18. 　前記ポリマーＢと前記ポリマーＣの反応率が、６０％～１００％の範囲である、請求項１４に記載のキット。
  19. 　前記溶液Ｘ及びＹを噴霧器により所定領域に噴霧するための、請求項１４に記載のキット。
  20. 　前記溶液Ｘ及びＹが、それぞれ別個の噴霧器に格納されている、請求項１４に記載のキット。
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