[go: up one dir, main page]

WO2024242069A1 - 神経堤細胞の製造方法 - Google Patents

神経堤細胞の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024242069A1
WO2024242069A1 PCT/JP2024/018417 JP2024018417W WO2024242069A1 WO 2024242069 A1 WO2024242069 A1 WO 2024242069A1 JP 2024018417 W JP2024018417 W JP 2024018417W WO 2024242069 A1 WO2024242069 A1 WO 2024242069A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
ncc
induction
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/018417
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真 池谷
総太 本池
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University NUC filed Critical Kyoto University NUC
Publication of WO2024242069A1 publication Critical patent/WO2024242069A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing neural crest cells. More specifically, the present invention relates to a method for producing neural crest cells, which includes a step of performing suspension culture of pluripotent stem cells under specific conditions, and uses of neural crest cells obtained by the method.
  • Neural crest cells are cells that arise between the neuroectoderm and epidermal ectoderm when the neural tube is formed from the neural plate in early development. They have the multipotency and ability to self-proliferate, allowing them to differentiate into many types of cells, such as neurons, glial cells, mesenchymal stromal cells, bone cells, chondrocytes, corneal cells, and pigment cells. Such multipotency and ability to self-proliferate demonstrate the usefulness of NCCs as a cellular medicine for regenerative medicine, and there is a demand for technology to efficiently induce NCCs.
  • Non-Patent Document 1 describes that human pluripotent stem cells seeded on Matrigel are subjected to neural priming for three days, followed by a neural crest (NC) induction process for five days, thereby inducing NCCs.
  • Non-Patent Document 2 describes that human pluripotent stem cells are subjected to adhesion culture for seven days in a medium containing BMP4 and SB431542, thereby inducing NCCs, and that the NCCs induced in this manner are cultured for 23 days in a medium containing CHIR99021, SB431542, SAG, EGF, FGF2, and DMH1, thereby inducing ectodermal chondrogenic cells (ECCs).
  • ECCs ectodermal chondrogenic cells
  • Non-Patent Document 3 a method of inducing NCCs that have lost the ability to differentiate into neural cells by culturing pluripotent stem cells in a medium containing SB431542 and CHIR99021 under xeno-free conditions for 10 days to obtain NCCs, and then culturing the NCCs in a medium containing SB431542, EGF, and bFGF to obtain adherent cells.
  • the present inventors have also succeeded in expanding NCCs that have retained the ability to differentiate into neural cells by culturing NCCs induced to differentiate from pluripotent stem cells in a medium containing a GSK-3 ⁇ inhibitor at a concentration that shows an effect equivalent to that of CHIR99021 at a concentration of more than 1 ⁇ M (Patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide a method for inducing neural crest cells from pluripotent stem cells in a shorter period of time, preferably under xeno-free conditions.
  • the inventors focused on suspension culture while researching methods for inducing bone organoids from pluripotent stem cells. Therefore, in the first step of the induction process from pluripotent stem cells to neural crest cells (NCCs), they searched for a method that could induce NCCs from pluripotent stem cells by suspension culture, rather than the conventional adhesion culture. As a result of intensive research, they found that NCCs could be stably and efficiently induced under xeno-free conditions by short-term suspension culture of pluripotent stem cells in a medium containing an ALK inhibitor and bone morphogenetic protein to form circular cell clusters, and then culturing in a medium containing an ALK inhibitor and a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • the present inventors have verified the differentiation ability of NCC obtained by the above-mentioned suspension culture. As a result, they have found that, like conventional NCC, they can be induced to differentiate into peripheral nerve cells, melanoblasts, and mesenchymal stem cells, and that the efficiency of these differentiation inductions is very high. Furthermore, NCC obtained by suspension culture can be induced to differentiate into first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal (PA1-EM) cells, but there have been no reports of successful induction of differentiation of NCC into PA1-EM cells in vitro, which was very surprising. It is also possible to induce bone organoids from PA1-EM cells, and the bone organoids can be transplanted into a living body to efficiently repair bone defects. The present inventors have conducted further research based on these findings, and have completed the present invention.
  • PA1-EM first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal
  • a method for producing neural crest cells from pluripotent stem cells comprising: (1) a step of suspension culturing pluripotent stem cells in a medium containing an ALK inhibitor and a bone morphogenetic protein; and (2) a step of suspension culturing pluripotent stem cells in a medium containing an ALK inhibitor and a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • a method comprising: [2-1] The method according to [1], wherein the step (2) includes a step of performing shaking culture and/or stirring culture.
  • the step (1) includes a step of performing shaking culture and/or stirring culture.
  • [3-1] The method according to any one of [1] to [2-2], wherein the culture period in the step (1) is 6 hours to 5 days.
  • [3-2] The method according to any one of [1] to [3-1], wherein the culture period in the step (1) is 6 hours to 3 days.
  • [3-3] The method according to any one of [1] to [3-2], wherein the culture period in the step (1) is 1 to 3 days.
  • [4-1] The method according to any one of [1] to [3-3], wherein the culture period in the step (2) is 1 day to 6 days.
  • [4-2] The method according to any one of [1] to [4-1], wherein the culture period in the step (2) is 1 to 4 days.
  • [4-3] The method according to any one of [1] to [4-2], wherein the culture period in the step (2) is 1 to 3 days.
  • [4-4] The method according to any one of [1] to [4-3], wherein the culture period in the steps (1) and (2) is 2 to 5 days.
  • [4-5] The method according to any one of [1] to [4-4], wherein the culture period in the step (1) is 1 day, and the culture period in the step (2) is 3 days.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4-5], comprising, prior to the step (1), a step of suspension-culturing pluripotent stem cells in a medium containing a ROCK inhibitor.
  • [6-1] The method according to any one of [1] to [5], wherein at least one of the bone morphogenetic proteins used in the step (1) is selected from the group consisting of BMP4, BMP2 and BMP7.
  • [6-2] The method according to any one of [1] to [6-1], wherein at least one of the ALK inhibitors used in the step (2) is SB431542 or A-83-01.
  • [6-3] The method according to any one of [1] to [6-2], wherein the pluripotent stem cells are derived from a patient with a disease (e.g., osteogenesis imperfecta).
  • a disease e.g., osteogenesis imperfecta
  • [7] The method according to any one of [1] to [6-3], wherein at least one of the steps (1) and (2) is a step of culturing cells under xeno-free conditions and/or feeder-free conditions.
  • [8-1] The method according to any one of [1] to [7], wherein the pluripotent stem cells are induced pluripotent stem cells.
  • [8-2] The method according to any one of [1] to [8-1], wherein the pluripotent stem cells are of human origin.
  • [8-3] The method according to [8-2], wherein the pluripotent stem cells are derived from a patient with a disease (e.g., osteogenesis imperfecta).
  • a neural crest cell obtained by the method according to any one of [1] to [8-3].
  • a neural crest cell having all of the following characteristics (A) to (C): (A) Derived from a pluripotent stem cell; (B) Expressing one or more genes selected from CD271, SOX10, TFAP2A and PAX3; (C) Having the ability to differentiate into first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal cells. [11-1] A neural crest cell described in [10], having at least any of the following characteristics (D) to (F): (D) having the ability to differentiate into melanoblasts; (E) having the ability to differentiate into neural cells; and (F) having the ability to differentiate into mesenchymal stem cells.
  • a method for producing a differentiated cell or an organoid, comprising a step of inducing differentiation of a neural crest cell according to any one of [9] to [11-4].
  • the differentiated cells are selected from the group consisting of mesenchymal cells, neural cells, and melanoblasts.
  • the mesenchymal cells are selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal cells, bone precursor cells, osteoblasts, osteocytes, chondrocytes, myoblasts, odontogenic mesenchymal cells, and smooth muscle cells.
  • the organoid is a bone organoid.
  • [16-1] The method according to [15], wherein the bone organoid is a jawbone organoid.
  • the differentiation-inducing step is a step of culturing neural crest cells in a medium containing endothelin and fibroblast growth factor, and the differentiated cells obtained by the culture are first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal cells.
  • [17-3] The method according to [17-1] or [17-2], wherein at least one of the fibroblast growth factors is FGF-8.
  • [18-1] The method according to any one of [17-1] to [17-3], wherein the medium further contains a bone morphogenetic protein.
  • [18-2] The method according to [18-1], wherein at least one of the bone morphogenetic proteins is BMP4.
  • a differentiated cell or organoid obtained by the method according to any one of [12] to [18-2].
  • [20-1] A first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal cell having all of the following characteristics (a) to (c): (a) derived from neural crest cells that do not express HOX; (b) expressing DLX5, PRRX1 and TWIST1; and (c) responding to epithelial signals and capable of inducing patterning.
  • [20-2] A cell described in [20-1], in which the neural crest cells that do not express HOX are derived from pluripotent stem cells.
  • [20-4] The cell according to any one of [20-1] to [20-3], wherein the pluripotent stem cell is of human origin.
  • [20-5] The cell according to [20-4], wherein the pluripotent stem cell is derived from a patient with a disease (e.g., osteogenesis imperfecta).
  • a transplantation therapy agent comprising the differentiated cell or organoid according to any one of [19] to [20-5].
  • a method for screening a therapeutic or preventive agent for a disease comprising culturing the differentiated cell or organoid according to any one of [19] to [20-5] in the presence or absence of a test substance.
  • a method for treating or preventing tissue damage or disease comprising administering or transplanting an effective amount of the differentiated cell or organoid according to any one of [19] to [20-5] to a subject.
  • the differentiated cell or organoid according to any one of [19] to [20-5] for use in treating or preventing tissue damage or disease.
  • neural crest cells can be produced from pluripotent stem cells in a short period of time with high efficiency. Because NCC can be produced with high efficiency, cell sorting is no longer necessary, which contributes to reducing development costs and ultimately the cost of clinical application. Furthermore, not only can differentiated cells such as nerve cells, melanoblasts, and mesenchymal stem cells be produced with high efficiency from the NCC obtained by the present invention, but it is also possible to produce first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal cells, which have not been reported previously, making a significant contribution to medicine, particularly regenerative medicine in the field of oral surgery.
  • FIG. 1 Schematic diagram of the method for inducing NCC clusters from iPS cells and micrographs of cell clusters on days 1 (D1), 2 (D2), and 5 (D5) after the start of culture.
  • D1 Micrograph of cell clumps induced under 3D conditions from the 1231A3 iPS cell line. Cell clumps with uniform morphology and diameters of approximately 500 ⁇ m were induced.
  • B The cell clumps were dispersed into single cells using Accutase, and the rate of strongly CD271 positive cells was analyzed by flow cytometry. Strongly CD271 positive cells could be induced with high efficiency.
  • C Histological image of fluorescent immunostaining of the cell clumps.
  • the majority of the cells within the cell clumps were composed of CD271 and SOX10 positive NCCs. Changes in CD271 and SOX10 expression over time from seeding of iPS cells to obtaining NCC clusters. From day 4 of induction (day 2 from the start of culture in a medium containing SB431542 (hereinafter sometimes abbreviated as "SB”) and CHIR99021 (hereinafter sometimes abbreviated as "CHIR”)), SOX10- and CD271-positive NCCs began to appear.
  • SB SB
  • CHIR99021 hereinafter sometimes abbreviated as "CHIR”
  • Non-Patent Document 3 Comparison of NCC-related gene expression in NCC induced under conventional 2D (adherent culture) conditions (Non-Patent Document 3) (outline of induction method is shown at the top of the figure) and 3D-induced NCC clusters (outline of induction method is shown in the center of the figure) using reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR). All NCC-related genes (NGFR, SOX10, TFAP2A, PAX3) were expressed to the same extent, and the pluripotent cell marker POU5F1 (Oct4) disappeared.
  • NCC-related genes TFAP2A and PAX3
  • neural plate border marker genes DLX5 and MSX2
  • RT-qPCR RT-qPCR in cell clumps on each day from day 0 (D0) to day 5 (D5) after the start of cell culture, and in cell clumps (D5 271H and 2D 271H) in which strongly CD271 positive cells were selected by flow cytometry. It was shown that neural plate border-related markers were elevated at D3, and that D5 cells expressed NCC-related genes to approximately the same extent as D5 271H cells and 2D 271H cells.
  • NCC-related genes NGFR, SOX10
  • Oct4 pluripotent cell marker Oct4
  • RT-qPCR cell clumps on each day from day 0 (D0) to day 5 (D5) after the start of cell culture, and in cell clumps (D5 271H and 2D 271H) in which strongly CD271 positive cells were selected by flow cytometry. It was shown that D5 cells expressed similar levels of NCC-related genes to D5 271H cells, and also to 2D 271H cells.
  • SB and BMP action step the duration of the action step (hereinafter “SB and BMP action step") was varied, and the rate of strongly CD271 positive cells was measured by flow cytometry (the period of shaking culture was fixed).
  • A When the action time of SB and BMP4 was set to 1 day, NCCs were induced with high efficiency.
  • SB and BMP4 When SB and BMP4 were not applied, a clear decrease in the rate of strongly CD271 positive cells was observed. When the action time of SB and BMP4 was extended, a decrease in the rate of strongly CD271 positive cells was observed.
  • Shaking culture was performed from the beginning of the NCC induction process.
  • the rate of strongly CD271 positive cells was measured by flow cytometry under each condition in Figure 12.
  • SB BMP4 6h When examined by flow cytometry on the 5th day after the action of SB and BMP4 for 6 hours (SB BMP4 6h) or 12 hours (SB BMP4 12h), it was shown that the efficiency of NCC induction was reduced compared to when SB and BMP4 were administered for 1 day (SB BMP4 D1).
  • SB BMP4 D1 The results of measuring the rate of strongly CD271 positive cells by flow cytometry for each condition in Figure 12.
  • the percentage of strongly CD271 positive cells was measured by flow cytometry when the duration of SB and CHIR treatment was extended.
  • the percentage of strongly CD271 positive cells decreased in a time-dependent manner as the overall culture period was extended.
  • the rate of strongly CD271 positive cells was measured by flow cytometry for each condition in Figure 12.
  • NCCs were able to be induced on the 5th day when SB and BMP4 were applied for 6 hours (SB BMP4 6h) and 12 hours (SB BMP4 12h). However, when applied for 12 hours, induction of NCCs was as efficient as when SB and BMP4 were applied for 1 day (SB BMP4 D1).
  • CD271 NCC marker
  • E-Cadherin epithelial cell marker
  • FIG. 1 shows an outline of a method that is preferable in terms of NCC induction efficiency when shaking culture is performed from the start of the SB and BMP4 action steps.
  • Peripheral nerve cells and melanoblasts were induced from NCC clusters, and differentiation was confirmed by fluorescent immunostaining.
  • A Peripheral nerve cells were induced from NCC clusters. Peripherin-positive peripheral nerve cells were induced with high efficiency.
  • B Melanoblasts were induced from NCC clusters. MITF-positive melanoblasts were induced with high efficiency.
  • HOXA2, HOXA3 Expression of HOX genes (HOXA2, HOXA3) was confirmed by RT-qPCR. RA-stimulated NCC clusters highly expressed HOX genes, whereas no HOX gene expression was observed in unstimulated NCC clusters.
  • A Microscopic images of NCC clusters and induced PA1-EM cell clusters. The size of the clusters increased due to proliferation of internal cells.
  • FIG. 36 Schematic diagram of induction method to verify the best combination of Fgf8, Edn-1, and BMP4 for PA1-EM cell induction.
  • the expression levels of DLX, PRRX1, and TWIST1 were measured by RT-qPCR under each condition in Figure 36.
  • Edn-1 is essential for DLX5 expression
  • the expression levels of DLX5, PRRX1, and TWIST1 indicate that adding Fgf8, Edn-1, and BMP4 to the medium is the optimal condition for PA1-EM cell induction.
  • FIG. 41 Schematic diagram of the method for inducing jaw bone-like tissue from distal-abral oral cells. Osteoprogenitor cells were induced by inducing osteogenic differentiation in PA1-EM cell clusters induced to distal-abdominal cells.
  • A Increased expression of osteoprogenitor cell markers SP7, RUNX2, and DLX5 was confirmed.
  • B At this induction stage, no increase in expression was confirmed for the early osteoblast marker ALPL and the immature osteocyte marker E11/gp38. Following the induction shown in Figure 41, two-stage osteogenic differentiation induction was performed. Further increases in the expression of osteoprogenitor cell markers SP7, RUNX2, and DLX5 were confirmed.
  • the osteocyte-like cells formed a three-dimensional network with surrounding cells within the bone matrix.
  • the human jawbone-like tissue in Figure 44 was transplanted into a 1.6 mm bone defect created in the mandibular ramus of the right mandibular angle of the lower jaw of an immunodeficient NSG mouse, and micro-CT images were taken immediately after transplantation, and at 1, 2, 3, and 4 weeks to examine the regenerative effect of the jawbone-like tissue.
  • the transplanted jawbone-like tissue sealing of the defect due to mineral deposition was confirmed as early as 3 weeks after transplantation. Efficient induction of HOX-negative NCCs from 3D-cultured iPSCs.
  • NCCs head neural crest cells
  • PA1-3 pharyngeal arches 1-3.
  • NCC markers SOX10, NGFR, TFAP2A, RHOB, PAX3
  • POU5F1 pluripotent stem cell marker
  • RT-qPCR real-time quantitative PCR
  • b Flow cytometry analysis of NCC marker (CD271) in day 5 aggregates. Results are expressed as mean ⁇ standard error (six biologically independent experiments). Stepwise differentiation of iPSCs to NCCs via ectodermal lineages. a; RNA-seq analysis of 1231A3 iPSCs (d0), day 1-5 aggregates, CD271 high+ NCCs sorted from day 5 aggregates (d5 271H), and CD271 high+ NCCs sorted from a conventional two-dimensional (2D) protocol (2D 271H) (Non-Patent Document 3).
  • 2D two-dimensional
  • Heatmaps show gene expression levels of pluripotent stem cell (PSC) markers, ectodermal lineage (neurectoderm (NE), neural plate border (NPB), neural crest cells (NCC), and epidermal ectoderm (SE)) markers, primitive streak (PS) markers, presomitic mesoderm (PSM) markers, lateral plate mesoderm (LPM) markers, and endoderm (END) markers.
  • PSC pluripotent stem cell
  • NE neuropotent stem cell
  • NPB neural plate border
  • SE epidermal ectoderm
  • SE epidermal ectoderm
  • PS primitive streak
  • PSM presomitic mesoderm
  • LPM lateral plate mesoderm
  • END endoderm
  • SOST mature osteocyte markers
  • b Safranin O/Fast Green staining and immunofluorescent staining for COLX in mdEM and clusters at day 38. Nuclei were stained with DAPI. Aggregates after chondrogenic induction served as positive controls for Safranin O and COLX expression.
  • HE staining and tricolor immunofluorescence staining for DLX2, DLX5, and HAND2 in mdEM and jawbone-like organoids generated from Ff-1 14s04 iPSCs (a), HLA-KO Ff-I 14s04 iPSCs (b), and Ff-I 01s04 (c) iPSCs. Nuclei were stained with DAPI. n 3 from three biologically independent experiments. Dashed boxes are enlarged to the right. Representative data are shown. Scale bar, 100 ⁇ m. Jaw-like organoids form bone tissue composed of human bone matrix proteins.
  • HE staining e
  • Azan staining e
  • triple-color immunofluorescence staining for human COLI, OCN, OPN (f), and human vimentin (g) in serial sections (decalcified specimens) of transplanted tissues 4 weeks after transplantation.
  • Nuclei were stained with DAPI (f, g).
  • n 8. Dashed boxes are enlarged to the right (e, g).
  • Black arrows indicate the edge of the defect (e).
  • White and light grey arrows indicate donor human and host mouse cells, respectively (g).
  • Scale bars 200 ⁇ m (e, f), 100 ⁇ m (g). h; Immunofluorescent staining for human vimentin in the transplanted tissue (decalcified specimen).
  • OI-iPSC-derived mdEM and bone tissue formed under the kidney capsule of NSG mice Characterization of OI-iPSC-derived mdEM and bone tissue formed under the kidney capsule of NSG mice.
  • a Tricolor immunofluorescence staining for DLX2, DLX5, and HAND2 in OI-iPSC- and resOI-iPSC-derived mdEM (d9). Scale bar, 100 ⁇ m.
  • b Von Kossa and Safranin O/Fast Green staining, and immunofluorescence staining for human COLI and human OPN in OI-iPSC- and resOI-iPSC-derived bone tissue formed under the kidney capsule of NSG mice. Nuclei were stained with DAPI.
  • n 3. Scale bar, 200 ⁇ m.
  • b Immunostaining results for smooth muscle markers. Nuclei were stained with DAPI. High expression of Calponin and TAGLN was confirmed 10 days after smooth muscle cell induction.
  • c Gene expression analysis of smooth muscle markers by RT-qPCR. High expression of smooth muscle markers (ACTA2, CNN1, TAGLN) and mature smooth muscle marker (MYH11) was confirmed 10 days after smooth muscle cell induction.
  • pluripotent stem cells refer to stem cells that can differentiate into tissues and cells with various different morphologies and functions in the body, and have the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, and ectoderm).
  • pluripotent stem cells used in the present invention include induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer (ntES cells), multipotent germline stem cells (mGS cells), and embryonic germline stem cells (EG cells), with iPS cells (more preferably human iPS cells) being preferred.
  • the pluripotent stem cells are ES cells or any cells derived from a human embryo, the cells may be cells produced by destroying an embryo or cells produced without destroying an embryo, but from an ethical point of view, cells produced without destroying an embryo are preferable.
  • nt ES cells are ES cells derived from cloned embryos produced by nuclear transfer technology and have almost the same properties as ES cells derived from fertilized eggs (Wakayama T. et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; Byrne J. et al. (2007), Nature, 450:497-502).
  • nt ES (nuclear transfer ES) cells are ES cells established from the inner cell mass of blastocysts derived from cloned embryos obtained by replacing the nucleus of an unfertilized egg with the nucleus of a somatic cell.
  • Nanog-iPSCs established by selecting using the expression of Nanog as an indicator after introducing the above four factors (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.); and iPSCs created by a method that does not include c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106), iPSCs established by introducing six factors using a virus-free method (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.), etc.
  • induced pluripotent stem cells established by introducing four factors, OCT3/4, SOX2, NANOG, and LIN28, created by Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), induced pluripotent stem cells created by Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), and induced pluripotent stem cells created by Sakurada et al. (JP Patent Publication No. 2008-307007) can also be used.
  • the induced pluripotent stem cells used in the method for producing NCC of the present invention may be cells derived from patients with a genetic disease (e.g., osteogenesis imperfecta).
  • a genetic disease e.g., osteogenesis imperfecta
  • Cells induced to differentiate from pluripotent stem cells derived from patients with a genetic disease can serve as disease models that reflect the pathology of the disease, and are therefore suitable for screening therapeutic or preventive drugs for the disease.
  • pluripotent stem cells derived from patients with a genetic disease can be differentiated into the desired cells or organoids after gene repair by genome editing using the CRISPR-Cas system, etc., and the cells can be used as a therapeutic drug for the disease.
  • mGS cells are pluripotent stem cells derived from the testis and are the source of spermatogenesis. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into cells of various lineages, and have properties such as the ability to produce chimeric mice when transplanted into mouse blastocysts (Kanatsu-Shinohara M. et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; Shinohara K. et al. (2004), Cell, 119:1001-1012).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • EG cells are established from primordial germ cells during the fetal period and have pluripotency similar to that of ES cells. They can be established by culturing primordial germ cells in the presence of substances such as LIF, bFGF, and stem cell factor (Matsui Y. et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551).
  • the species from which the pluripotent stem cells are derived is not particularly limited, and may be, for example, cells from rodents such as rats, mice, hamsters, and guinea pigs; lagomorphs such as rabbits; ungulates such as pigs, cows, goats, and sheep; felines such as dogs and cats; and primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees.
  • the preferred species is human.
  • cell clump refers to a structure in which cells aggregate together to form a cluster, and is also called a cell aggregate.
  • a neural crest cell (NCC) cluster refers to a cell clump that contains neural crest cells, but typically refers to a cell clump that contains mainly neural crest cells (e.g., at a ratio of 60% or more, 70% or more, or 80% or more).
  • PA1-EM first pharyngeal arch ectodermal mesenchyme
  • Bone morphogenetic proteins are secreted signaling molecules belonging to the TGF- ⁇ superfamily.
  • Examples of bone morphogenetic proteins used in step (1) of the NCC production method of the present invention include BMP2, BMP3, BMP3b, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, BMP10, BMP11, BMP12, BMP13, BMP14, BMP15, BMP16, BMP17, and BMP18, with BMP4, BMP2, and BMP7 being preferred. Two or more types of BMPs may be used in combination.
  • the concentration of BMP in the medium is adjusted appropriately depending on the type of BMP added, but is typically 1 to 50 ng/mL, preferably 2 to 30 ng/mL, and more preferably 2.5 to 10 ng/mL.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitors used in step (2) of the NCC production method of the present invention include, for example, CHIR98014 (2-[[2-[(5-nitro-6-aminopyridin-2-yl)amino]ethyl]amino]-4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1H-imidazol-1-yl)pyrimidine), CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]nicotinonitrile), CP21R7 ( 3-(3-amino-phenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-pyrrole-2,5-dione), LY2090314 (3-[9-Fluoro-1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperid
  • antisense oligonucleotides and siRNAs against GSK-3 ⁇ mRNA antibodies that bind to GSK-3 ⁇ , dominant negative GSK-3 ⁇ mutants, etc. can also be used as GSK-3 ⁇ inhibitors, and these are commercially available or can be synthesized according to known methods.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor in the medium is appropriately adjusted depending on the type of GSK-3 ⁇ inhibitor added, and is, for example, 0.01 to 20 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M.
  • the concentration is typically 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 0.5 to 2 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M.
  • the culture period can be shortened (e.g., FIG. 20), and by including a shaking culture step in step (2), the efficiency of induction into NCC can be improved (FIG. 9). Therefore, it is preferable that at least one of steps (1) and (2) includes a shaking culture step. Shaking culture may be performed throughout the entire period of each step, or only for a portion of the period.
  • stirred culture may be performed instead of or in addition to shaking culture.
  • Stirred culture can be performed in a culture device equipped with a stirrer or stirring blades (e.g., a bioreactor, etc.). The rotation speed of the stirrer or stirring blades when performing stirred culture is typically 10 to 100 rpm.
  • the culture period in step (1) of the method for producing NCC of the present invention is typically 3 hours to 7 days, and from the viewpoint of the efficiency of induction into NCC, 6 hours to 6 days is preferable, 6 hours to 5 days is more preferable, 12 hours to 4 days is even more preferable, and 1 day to 3 days is even more preferable.
  • the period of step (1) can be shortened, and for example, the culture period can be 6 hours to 3 days, 6 hours to 2 days, 12 hours to 1 day, etc.
  • the culture period in step (2) of the method for producing NCC of the present invention is typically 12 hours to 5 days, and from the viewpoint of the efficiency of induction into NCC, 1 day to 6 days is preferable, 1 day to 4 days is more preferable, 2 days to 3 days is even more preferable, and 1 day to 3 days is even more preferable.
  • the period can be appropriately changed depending on the period of step (1) of the method for producing NCC of the present invention, the presence or absence of shaking culture and/or agitation culture, etc.
  • the culture period for steps (1) and (2) of the method for producing NCC of the present invention is typically 1 to 6 days, preferably 2 to 5 days, and more preferably 3 to 4 days.
  • the period can be appropriately changed depending on the period of step (1) of the method for producing NCC of the present invention, the presence or absence of shaking culture and/or agitation culture, etc.
  • a step of suspension culture of pluripotent stem cells in a medium containing a ROCK inhibitor may be carried out. This allows cell clumps of pluripotent stem cells to be formed.
  • a step of preparing cell clumps of pluripotent stem cells may be carried out.
  • the period of this step is not particularly limited, but is typically 12 hours to 3 days, and preferably 1 day. Therefore, when the method for producing NCC of the present invention includes a step of forming cell clumps of pluripotent stem cells, the period of the method for producing NCC of the present invention is typically 2 days to 7 days, preferably 3 days to 6 days, and more preferably 4 days to 5 days.
  • ROCK inhibitors used in the present invention are not particularly limited as long as they are capable of suppressing the function of Rho-kinase (ROCK).
  • examples of such inhibitors include Y-27632 (see, for example, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284 (2000)), fasudil/HA1077 (see, for example, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), SR3677 (see, for example, Feng Y et al., J Med Chem.
  • ROCK inhibitors include antisense nucleic acids against ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids (e.g., siRNAs), dominant-negative mutants, and expression vectors thereof.
  • RNA interference-inducing nucleic acids e.g., siRNAs
  • other known low molecular weight compounds and their salts or derivatives can also be used as ROCK inhibitors (see, for example, U.S. Patent Application Publication Nos. 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508, 2004/0002507, 2003/0125344, 2003/0087919, and International Publication Nos. 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976, and 2004/039796).
  • Y-27632 is preferred.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the ROCK inhibitor used, but for example, when Y-27632 or a salt thereof (e.g., Y-27632 dihydrochloride, etc.) is used, the concentration is typically 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 5 ⁇ M to 20 ⁇ M, and even more preferably 10 ⁇ M.
  • NCCs may be selected (or isolated, concentrated, or purified) from the NCC clusters obtained in step (2) of the NCC production method of the present invention using the expression of NCC markers (e.g., high expression of CD271, etc.) as an indicator.
  • NCCs can be selected using any known method, such as labeling cells with an antibody against an NCC marker such as CD271 and selecting them using flow cytometry or mass cytometry, magnetic cell separation, or an affinity column with an immobilized desired antigen.
  • cells may be cultured under feeder-free and/or xeno-free conditions.
  • all steps may be performed under feeder-free and xeno-free conditions.
  • cells may be cultured under feeder-free and/or xeno-free conditions.
  • feeder-free refers to a medium or culture condition that does not contain other cell types (i.e., feeder cells) that play a supporting role and are used to prepare the culture conditions for the cells to be cultured.
  • xeno-free refers to a medium or culture condition that does not contain components derived from organisms different from the organism species of the cells to be cultured.
  • RPMI-1640 medium EagleMEM (EMEM), Dulbecco's modified MEM, Glasgow's MEM (GMEM), ⁇ -MEM, 199 medium, IMDM, DMEM, Hybridoma Serum free medium, KnockOut TM DMEM, Advanced TM medium (e.g., Advanced MEM, Advanced RPMI, Advanced DMEM/F-12), Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, DMEM/F-12, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz's L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymouth's Medium (e.g., Waymouth's Examples of suitable medium include, but are not limited
  • the medium may contain one or more serum substitutes, such as, for example, Knockout Serum Replacement (KSR), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), albumin, transferrin, apotransferrin, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, and may also contain one or more substances, such as lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, growth factors, small molecules, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, selenate, progesterone, and putrescine.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • albumin transferrin
  • apotransferrin fatty acids
  • insulin insulin
  • collagen precursors insulin
  • trace elements 2-mercaptoethanol
  • 2-mercaptoethanol 3'-thiolgly
  • step (2) of the method for producing an NCC of the present invention an NCC derived from a pluripotent stem cell is obtained.
  • an NCC obtained (or obtained) by the method for producing an NCC of the present invention (hereinafter, sometimes referred to as "NCC of the present invention") is also provided.
  • the NCC of the present invention typically has all of the following characteristics (A) to (C).
  • C having the ability to differentiate into PA1-EM cells (at least mandibular PA1-EM cells).
  • the present invention also provides an NCC having all of the above characteristics (A) to (C), and preferably further having at least one (preferably all) of the above characteristics (D) to (F).
  • an NCC may be obtained by the method for producing an NCC of the present invention, or may be obtained by another method.
  • the above NCC may also be referred to as the "NCC of the present invention.”
  • the terms "expressing” or “positive” a gene are used to mean at least "production of mRNA encoded by the gene," but preferably also “production of protein encoded by the mRNA.” Therefore, if the production of mRNA encoded by the gene is detected at least by the method described in the Examples below (RT-qPCR), the gene can be said to be expressed. On the other hand, if the production of mRNA encoded by the gene is not detected (i.e., below the detection limit) by the method described in the Examples below (RT-qPCR), is at background levels, or is 1/100th or less of the positive control, the gene can be said to be not expressed or to be negative.
  • High expression includes high expression (also referred to as “strong positive”).
  • High expression may be expressed as High or Bright.
  • CD271 highly expressing cells may be expressed as CD271 High+ cells or CD271 Bright+ cells.
  • High expression can be determined based on a chart obtained by flow cytometry. The position on the chart may vary depending on the voltage setting of the instrument, the sensitivity setting, the antibody clone used, the staining conditions, the dye used, etc., but a person skilled in the art can appropriately draw a line so as not to separate a cell population recognized as a group in the obtained chart.
  • PA1-EM cells are divided into maxillary PA1-EM (mxEM) and mandibular PA1-EM (mdEX), and unless otherwise specified in this specification, PA-EM includes both maxillary PA1-EM and mandibular PA-EM, although mandibular PA1-EM in particular is often intended.
  • the cells obtained by the differentiation induction method of the present invention may be undifferentiated cells such as stem cells or precursor cells, or may be terminally differentiated cells.
  • undifferentiated cells may be used as a term that includes both undifferentiated cells and terminally differentiated cells.
  • undifferentiated cells refers to cells that have not reached terminal differentiation in the cell lineage, and examples of undifferentiated cells include stem cells and precursor cells excluding pluripotent stem cells.
  • stem cells or precursor cells include neural stem cells, glial precursor cells, melanocyte stem cells, melanoblasts, mesenchymal stem cells, first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal cells, cardiac stem cells, vascular endothelial precursor cells, vascular pericytes, skeletal muscle stem cells, adipose stem cells, bone precursor cells, osteoblasts, chondroblasts, etc.
  • the bone organoid may exhibit a phenotype of a bone disease (e.g., osteogenesis imperfecta).
  • bone organoids have a bone matrix, osteocytes contained in the bone matrix, and a layer of osteoblasts surrounding the bone matrix.
  • Bone organoids typically have a three-dimensional network formed by bone cells connecting to each other through proteins related to the cytoskeleton, such as F-actin, and have the ability to repair the defect when transplanted into a bone defect.
  • the "bone matrix” is an accumulation of substances produced by bone cells and secreted outside the cells, such as calcium phosphate, which contains proteins such as osteocalcin, osteopontin, osteonectin, and collagen.
  • NCCs may be expanded. Expansion can be carried out, for example, by the method described in Patent Document 1. Specifically, the expansion can be carried out by floating culture of neural crest cells in a medium containing a GSK-3 ⁇ inhibitor and basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor used for the expansion of NCCs can be the same as that used in the method for producing NCCs of the present invention, and is preferably SB431542.
  • the bFGF (also called FGF-2) used for the expansion of NCCs can be a commercially available product from Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., etc.
  • the medium used for the expansion may contain an ALK inhibitor or EGF (Epidermal Growth Factor).
  • the ALK inhibitor can be the same as that used in the method for producing NCCs of the present invention.
  • MSCs can also be obtained by culturing neural crest cells in a mesenchymal stem cell proliferation medium for about 14 days by adhesion culture.
  • a mesenchymal stem cell proliferation medium for about 14 days by adhesion culture.
  • a basal medium containing bovine serum e.g., ⁇ MEM medium, etc.
  • a commercially available xeno-free mesenchymal stem cell proliferation medium is preferred.
  • chondrocyte differentiation induction medium examples include a basal medium (e.g., DMEM/F12) containing 1% (v/v) ITS+premix, 0.17 mM AA2P, 0.35 mM proline, 0.1 mM dexamethasone, 0.15% (v/v) glucose, 1 mM sodium pyruvate, 2 mM GlutaMAX, 40 ng/ml PDGF-BB, 100 ng/mL TGF- ⁇ 3, 10 ng/ml BMP4, and 1% (v/v) FBS, and a commercially available xeno-free chondrocyte differentiation induction medium (e.g., MSCgo TM Chondrogenic XF (Sartorius)).
  • a basal medium e.g., DMEM/F12
  • ITS+premix 0.17 mM AA2P
  • 0.35 mM proline 0.35 mM proline
  • differentiation method into chondrocytes include a method in which 5 ⁇ l of mesenchymal stem cell suspension is spotted on a fibronectin-coated plate and cultured for 1 hour, and 1 ml of the above differentiation induction medium is added after 1 hour, and the cells are cultured for 14 days.
  • the differentiation of chondrocytes may be confirmed by Alcian blue staining.
  • Neural progenitor cells and neurons can also be obtained by seeding NCCs into a low cell adhesion culture vessel (e.g., 96-well V-bottom ultra-low adhesion culture plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)) and culturing them for approximately 14 days in a basal medium (e.g., Neurobasal medium, etc.) supplemented with B27 Supplement, N-2 supplement, L-glutamine, BDNF, GDNF, NT-3, and NGF, or by culturing NCCs by adhesion culture in a basal medium (e.g., DMEM/F12, etc.) supplemented with N-2 Supplement, BDNF, GDNF, NT-3, and NGF for approximately 14 days.
  • a basal medium e.g., Neurobasal medium, etc.
  • a basal medium e.g., Neurobasal medium, etc.
  • N-2 e.g., L-glutamine
  • PA1-EM cell induction mandibular PA1-EM cells from the NCCs of the present invention
  • a medium e.g., StemFit Basic03 medium
  • the endothelin used for PA1-EM cell induction may be any of endothelin-1 (Edn-1), endothelin-2 (Edn-2), and endothelin-3 (Edn-3), with Edn-1 being preferred. These endothelins may also be used in combination.
  • the concentration of endothelin in the medium can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the endothelin used, but for example, when Edn-1 is used, it is typically 1 to 500 nM, preferably 10 to 300 nM, and more preferably 20 to 100 nM (e.g., 50 nM).
  • maxillary PA1-EM cells can also be induced by using an Edn-1 inhibitor instead of endothelin in the PA1-EM cell induction method, or by culturing NCCs without including any of Edn-1, Edn-2, and Edn-3 in the medium (in the absence of these substances).
  • Fibroblast growth factors (FGFs) used for PA1-EM cell induction can be commercially available products from Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., etc. Twenty-two types of FGFs are known in humans, and any can be used as long as they function as a cell growth factor, but in the case of the induction of PA1-EM cells from NCCs of the present invention, FGF-8 is preferred. In humans, FFG-8a, FGF-8b, FGF-8e, and FGF-8F are known as isoforms that have the function of FGF-8, and any of them can be used, but FGF-8b is preferred. Two or more types of FGFs may be used in combination.
  • the concentration of FGF in the culture medium can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the FGF used, but for example, when FGF-8 is used, it is typically 1 to 500 ng/ml, preferably 10 to 300 ng/ml, and more preferably 50 to 200 ng/ml (e.g., 100 ng/ml).
  • the medium used during PA1-EM cell induction contains BMP.
  • BMP include BMP2, BMP3, BMP3b, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, BMP10, BMP11, BMP12, BMP13, BMP14, BMP15, BMP16, BMP17, and BMP18, with BMP4, BMP2, and BMP7 being preferred, and BMP4 being particularly preferred.
  • BMP2 BMP3, BMP3b, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, BMP10, BMP11, BMP12, BMP13, BMP14, BMP15, BMP16, BMP17, and BMP18, with BMP4, BMP2, and BMP7 being preferred, and BMP4 being particularly preferred.
  • BMP4 is particularly preferred.
  • Two or more types of BMP may be used in combination.
  • a PA1-EM cell (hereinafter also referred to as "the PA1-EM cell of the present invention").
  • the PA1-EM cell is a mandibular PA-EM cell, and typically has all of the following characteristics (a) to (c): (a) derived from neural crest cells that do not express HOX; (b) expressing DLX5, PRRX1 and TWIST1; (c) responding to epithelial signals and capable of inducing patterning.
  • the PA1-EM cells may be obtained by the PA1-EM cell induction method described above, or may be obtained by another method.
  • the PA1-EM cells of the present invention may further have the characteristic (d) of having actin filaments (also called "F-actin” or "actin stress fibers”).
  • PA1-EM cells having the above characteristics (a) and (c), as well as the characteristic (b') of expressing POU3F3 and CYP26A1 (and may further have the above characteristic (d)) can be said to be maxillary PA-EM cells.
  • the PA1-EM cells of the present invention are typically in the form of a cell cluster.
  • the PA1-EM cell cluster has a surface region (surface zone), a central region (central zone), and an intermediate region (intermediate zone) located between the surface zone and the central zone.
  • the central zone may contain DLX2 single positive cells
  • the intermediate zone may contain DLX2 + DLX5 + cells
  • the surface zone may contain DLX2 + DLX5 + HAND2 + cells.
  • a cell cluster (mandibular PA1-EM cell cluster) which includes a central zone containing DLX2 single positive cells, an intermediate zone containing DLX2 + DLX5 + cells, and a surface zone containing DLX2 + DLX5 + HAND2 + cells.
  • not expressing HOX means that at least HOXA2 and HOXA3 are not expressed. Cells that do not express HOX can typically be produced by producing the NCC of the present invention.
  • epithelial signal means an epithelial signal expressed in the first pharyngeal arch that develops temporarily during the fetal stage of vertebrates.
  • major epithelial signals include a combination of Fgf8 and Sonic hedgehog (Shh), which is a proximal-oral signal, a combination of Shh and BMP4, a combination of Fgf8 and Shh, and a combination of Edn-1 and BMP4, which are distal-oral signals, a combination of Edn-1 and BMP4, which is a distal-aboral signal, and End-1, which is a proximal-aboral signal (see also Figure 39A).
  • Shh Sonic hedgehog
  • BMP4 a combination of Fgf8 and Shh
  • Edn-1 and BMP4 which are distal-oral signals
  • Edn-1 and BMP4 which is a distal-aboral signal
  • End-1 which is a proximal-aboral signal
  • actin filaments are filamentous polymers formed by the polymerization of multiple globular actins (G-actins), and the presence of actin filaments can be confirmed by phalloidin staining as described below.
  • the NCC used in the production of the PA1-EM cells of the present invention is not particularly limited.
  • a method for producing PA1-EM cells which includes a step of inducing differentiation of NCC (in one embodiment, NCC cultured under two-dimensional conditions) into PA1-EM cells in the presence of an actin filament formation inhibitor.
  • actin filament formation inhibitors used in the present invention include Y-27632, cytochalasin A, cytochalasin B, cytochalasin C, cytochalasin D, cytochalasin E, latrunculin A, latrunculin B, wiscostatin, BDM, latrunculin, and chaetoglobosin A.
  • concentration of the actin filament formation inhibitor in the medium can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the actin filament formation inhibitor used.
  • the concentration is typically 0.5 ⁇ M to 500 ⁇ M, preferably 2 ⁇ M to 200 ⁇ M, and more preferably 10 ⁇ M to 100 ⁇ M (50 ⁇ M in one embodiment).
  • Two or more types of actin filament formation inhibitors may be used in combination.
  • PA1-EM cells for example, by culturing PA1-EM cells for about 3 days in a basal medium (e.g., StemFit Basic03 medium, etc.) supplemented with Fgf8b, SAG, BQ-123, and LDN193189, if the cells express PAX9 and LHX8, it can be evaluated that the PA1-EM cells respond to epithelial signals on the proximal-oral side and that patterning can be induced.
  • a basal medium e.g., StemFit Basic03 medium, etc.
  • PA1-EM cells for example, by culturing PA1-EM cells for about 3 days in a basal medium (e.g., StemFit Basic03 medium, etc.) supplemented with Fgf2, Endothelin-1, and BMP4, if the cells express GSC and MSX2, it can be evaluated that the PA1-EM cells respond to epithelial signals on the distal-abral side and that patterning can be induced.
  • a basal medium e.g., StemFit Basic03 medium, etc.
  • Fgf2 Fgf2, Endothelin-1, and BMP4
  • proximal-oral side cells induced in this manner that express PAX9 and LHX8, as well as the distal-contra-oral side cells that express GSC and MSX2 can be further induced to differentiate.
  • odontogenic mesenchymal cells can be induced by culturing the proximal-oral side cells for about 4 days in a basal medium (e.g., Basic03, etc.) supplemented with FGF8b, SAG, CHIR99021, and activin A (R&D). Since odontogenic mesenchymal cells can be the starting cells for dentin, which constitutes the main part of teeth, the PA1-EM cells and odontogenic mesenchymal cells of the present invention may also be useful in tooth regeneration.
  • the above step (III) is carried out by subjecting the bone precursor cells to suspension culture in a bone cell differentiation induction medium (e.g., MSCgo TM Osteogenic XF Medium, etc.) for 20 to 30 days.
  • a bone cell differentiation induction medium e.g., MSCgo TM Osteogenic XF Medium, etc.
  • the medium may be replaced with another bone cell differentiation-inducing medium (e.g., StemFit Basic03 medium containing dexamethasone (usually used at 1/10 of the concentration used in osteoblast induction), ⁇ -glycerophosphate, and ascorbic acid) during the process (e.g., somewhere between 10th and 20th days from the start of the step (III), somewhere between 6th and 10th days, etc.).
  • another bone cell differentiation-inducing medium e.g., StemFit Basic03 medium containing dexamethasone (usually used at 1/10 of the concentration used in osteoblast induction), ⁇ -glycerophosphate, and
  • the first half of the process is aimed at inducing differentiation mainly into osteoblasts and osteocytes
  • the second half of the process is aimed at maturation of osteocytes.
  • This can suppress the occurrence of dead cells in the maturation of osteocytes.
  • the medium when the medium is replaced with another bone cell differentiation-inducing medium during the process (III), the medium may be replaced with another medium (e.g., the bone cell differentiation-inducing medium used at the beginning of the step (III)) several days after the replacement (e.g., 6th to 10th days). Specific methods are outlined in FIG. 40 and FIG. 59, but the present invention is not limited to these methods.
  • the bone organoids produced by the above method may be further matured.
  • the bone organoids may be transplanted into a living body such as a mammal (e.g., transplanted under the renal capsule).
  • transplanting the bone organoids into a living body allows the formation of calcifications and dense bone tissue, and the bone tissue can mature into bone organoids in which a dense network of donor bone cells is formed inside the bone tissue.
  • Bone organoids can also be produced using MSCs by the method described in WO 2020/226043. Specifically, bone organoids can be produced by growing MSCs in adhesion culture to form a sheet (cell sheet), detaching the cell sheet from the culture vessel, and then performing suspension culture on the cell sheet to obtain a three-dimensional mesenchymal stem cell cluster, and culturing the cell cluster embedded in a gel using a bone differentiation induction medium.
  • the gel is preferably a gel whose main component is polysaccharide, and for example, Vitrogel (The Well Bioscience) can be used.
  • Neural organoids can be produced by culturing cell clumps containing neural precursor cells induced from NCCs in a suspension culture medium for inducing neural differentiation. By continuing to culture the cell clumps under the suspension culture conditions, neural organoids can be induced in a self-organizing manner.
  • Examples of such neuronal differentiation-inducing media include basal media (e.g., N2 medium, etc.) containing a Wnt signal inhibitor and an ALK inhibitor.
  • Wnt signal inhibitors examples include DKK1 protein, sclerostin, IWR-1e, IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, C59, ICG-001, FH535, WIKI4, KYO2111, PNU-74654, XAV939, and derivatives thereof.
  • ALK inhibitors include those similar to those mentioned above.
  • Culture vessels used for adhesion culture include those whose surfaces have been artificially treated to improve adhesion to cells (e.g., coating with basement membrane preparations, fibronectin, laminin or fragments thereof, entactin, collagen, gelatin, synthemax, vitronectin, or other extracellular matrices, or with polymers such as polylysine and polyornithine, or surface treatments such as positive charge treatment).
  • culture vessels coated with fibronectin are preferred.
  • the differentiation induction method of the present invention may involve culturing under feeder-free conditions and/or xeno-free conditions for all or part of the period. From the perspective of clinical use, it is preferable that the differentiation induction method of the present invention is carried out under feeder-free and xeno-free conditions for the entire period.
  • the differentiation induction method of the present invention may include a step of recovering the obtained target cells or organoids.
  • the recovered cells may be cryopreserved using a cell cryopreservation solution.
  • the cells recovered in the container may be counted using a cell counter, or may be labeled with an antibody against a cell surface marker and selected by flow cytometry, mass cytometry, magnetic cell separation, or the like.
  • a cell or organoid obtained by the differentiation induction method of the present invention (hereinafter, also referred to as the “differentiated cell or organoid of the present invention") is provided.
  • the culture conditions and methods such as suspension culture, shaking culture, and agitation culture, the method for selecting the target cells, additives to the medium, specific examples and definitions of the culture vessels, etc., in the differentiation induction method of the present invention are all those described in "1. Method for producing neural crest cells" above.
  • the differentiated cells or organoids of the present invention can be suitably used in regenerative medicine, and therefore, in another embodiment, a transplantation therapy agent (hereinafter, sometimes referred to as the "transplantation therapy agent of the present invention") containing the differentiated cells or organoids of the present invention is provided.
  • a transplantation therapy agent hereinafter, sometimes referred to as the "transplantation therapy agent of the present invention"
  • the present invention also includes a method for treating or preventing damage (including defects) or disease of tissues (e.g., bone tissue, cartilage tissue, adipose tissue, muscle tissue (e.g., skeletal muscle tissue, etc.), in which an effective amount of the differentiated cells or organoids of the present invention is administered or transplanted into a mammalian subject of treatment (e.g., human, mouse, rat, monkey, cow, horse, pig, dog, etc.).
  • a mammalian subject of treatment e.g., human, mouse, rat, monkey, cow, horse, pig, dog, etc.
  • treatment of tissue damage also includes regeneration of damaged tissue. Regeneration of damaged tissue includes not only complete tissue regeneration, but also cases in which a tissue-like structure is formed. For example, in the case of bone tissue, it is not necessary to determine whether the regenerated site is bone tissue in a CT (Computed Tomography) examination.
  • CT Computer Tomography
  • the transplantation therapy agent of the present invention can be administered or transplanted into a living body of a subject in need thereof.
  • the transplantation is preferably performed in a region of the living body where the differentiated cells or organoids of the present invention can be fixed at a certain position, for example, subcutaneously, intraperitoneally, peritoneal epithelium, bone tissue (e.g., jaw bone tissue, etc.), cartilage tissue, omentum, adipose tissue, muscle tissue, or under the capsule of each organ such as the pancreas or kidney.
  • the cells or organoids to be transplanted only need to be administered in a therapeutically effective amount, which may vary depending on factors such as the age, weight, size of the transplant site, and severity of the disease of the transplant subject, and are not particularly limited, but can be, for example, about 10 x 10 4 cells to 10 x 10 11 cells.
  • the purpose of transplanting the differentiated cells or organoids of the present invention into a living body may be to directly regenerate damaged tissue, or to obtain an indirect effect (e.g., paracrine effect, etc.) due to factors secreted by the differentiated cells or organoids of the present invention.
  • Mesenchymal stem cells can be effective in treating diseases such as acute myocardial infarction, stroke, multiple system atrophy (MSA), graft-versus-host disease, Crohn's disease, ischemic cardiomyopathy, and spinal cord injury.
  • Melanoblasts and melanocytes can be effective in treating diseases such as oculocutaneous albinism and pigmentation disorders such as vitiligo vulgaris.
  • Bone cells and bone organoids can be effective in treating diseases such as intractable fractures, periodontitis, or extensive bone defects after osteotomy.
  • Neural progenitor cells, neural cells, or neural organoids can be effective in treating diseases such as cerebrovascular disorders, brain injuries, spinal cord injuries, and neurodegenerative diseases.
  • the differentiated cells or organoids of the present invention are used as transplantation therapy agents, it is desirable to use cells or organoids derived from iPS cells established from somatic cells with the same or substantially the same HLA genotype of the recipient individual, from the viewpoint of preventing rejection reactions.
  • substantially the same means that the HLA genotype matches the transplanted cells to such an extent that immune reactions can be suppressed with immunosuppressants, for example, somatic cells with HLA types that match the three loci HLA-A, HLA-B, and HLA-DR, or four loci including HLA-C. If sufficient cells cannot be obtained due to age, constitution, etc., they can also be transplanted in a state where they are embedded in capsules such as polyethylene glycol or silicone, or in porous containers, to avoid rejection reactions.
  • the differentiated cells or organoids of the present invention are manufactured as parenteral preparations such as injections, suspensions, or drops by mixing with a medicamentically acceptable carrier according to conventional methods.
  • a method for manufacturing a transplantation therapy agent which includes a step of formulating the differentiated cells or organoids of the present invention.
  • Such a method may include a step of preparing the differentiated cells or organoids of the present invention.
  • it may also include a step of preserving the differentiated cells or organoids of the present invention.
  • pharma- ceutically acceptable carriers examples include aqueous solutions for injection, such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • aqueous solutions for injection such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • the cells of the present invention may be mixed with, for example, buffers (e.g., phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (e.g., benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (e.g., human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants, etc.
  • buffers e.g., phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents e.g., benzalkon
  • the transplantation therapy agent of the present invention is provided in a frozen state under conditions normally used for cryopreservation of cells, and can be thawed when needed.
  • it may further contain serum or a substitute thereof, an organic solvent (e.g., DMSO), etc.
  • an organic solvent e.g., DMSO
  • the concentration of serum or a substitute thereof is not particularly limited, but may be about 1 to about 30% (v/v), preferably about 5 to about 20% (v/v).
  • the concentration of the organic solvent is not particularly limited, but may be 0 to about 50% (v/v), preferably about 5 to about 20% (v/v).
  • the differentiated cells or organoids of the present invention can also be used in a method for screening candidate drugs that are useful for treating or preventing tissue damage or disease.
  • a method for screening therapeutic or preventive drugs for disease comprising a step of culturing the differentiated cells or organoids of the present invention in the presence or absence of a test substance.
  • tissue damage or disease include those similar to the above-mentioned tissue damage or disease that is the therapeutic target of the transplantation therapy agent of the present invention.
  • the differentiated cells or organoids used for screening may also exhibit a phenotype of a disease, for example, a bone disease such as osteogenesis imperfecta. In such a case, candidate drugs can also be screened based on the change in the phenotype.
  • Test substances used in screening methods include, for example, cell extracts, cell culture supernatants, microbial fermentation products, extracts derived from marine organisms, plant extracts, purified or crude proteins, peptides, non-peptide compounds, synthetic low molecular weight compounds, and natural compounds.
  • test substances can also be obtained using any of the many approaches in combinatorial library methods known in the art, including (1) biological libraries, (2) synthetic library methods using deconvolution, (3) "one-bead one-compound” library methods, and (4) synthetic library methods using affinity chromatography selection. While the biological library method using affinity chromatography selection is limited to peptide libraries, the other four approaches are applicable to small molecule libraries of peptides, non-peptide oligomers, or compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145-67). Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-13; Erb et al.
  • Example 1 Induction of NCC clusters ⁇ Maintenance culture of human iPS cells> Human iPS cells (1231A3 line, Ff-I 14s04 line, Ff-I 14s04 HLA-KO line, iPS cell line derived from an osteogenesis imperfecta patient) generated using episomal vectors were cultured on culture plates coated with iMatrix-511 (Nippi) using StemFit AK03N medium (Ajinomoto). Medium was changed every 2 days.
  • FIG. 1 An outline of the method for inducing iPS cells into NCC clusters (three-dimensional (3D) NCC induction method) is shown in Figure 1. Specifically, the procedure was as follows. Maintained human iPS cells (1231A3 line (xeno-free cell line for research)) were dispersed into single cells using Accutase (Innovative Cell Technologies), then suspended in a culture medium containing StemFit Basic03 (AK03N minus bFGF) (Ajinomoto) and 10 ⁇ M Y-27632 (FUJIFILM Wako), and seeded at 1.0 ⁇ 10 4 cells/100 ⁇ l/well on a 96-well V-bottom ultra-low attachment culture plate (Sumitomo Bakelite).
  • AK03N minus bFGF StemFit Basic03
  • FUJIFILM Wako 10 ⁇ M Y-27632
  • the plate was centrifuged at 1200 rpm for 3 min to allow the cells to aggregate on the bottom of the plate. After culturing for one day, the cells aggregated and formed cell clusters. Next, the cell clumps were cultured for 1 day in a culture medium containing StemFit Basic03 medium supplemented with 10 ⁇ M SB431542 (Selleck) and 10 ng/mL BMP4 (R&D Systems) (this corresponds to steps D1 to D2 in Figure 1, and may be referred to below as the "SB and BMP action step").
  • the cell clumps were transferred one by one to a 48-well low-attachment culture plate (Iwaki), and cultured at 120 rpm in a culture medium containing StemFit Basic03 medium supplemented with 10 ⁇ M SB431542 and 1 ⁇ M CHIR99021 (Axon Medchem) for 3 days using a shaking culture vessel (CS-LR (TAITEC)) (corresponding to steps D2 to D3 in Figure 1, hereinafter sometimes referred to as the "NCC induction step").
  • CS-LR shaking culture vessel
  • the percentage of CD271 positive cells in the obtained cell clumps was measured by flow cytometry.
  • the cell clumps were dispersed into single cells using Accutase (Innovative Cell Technologies), and then CD271 antibody (BD Biosciences, 560326) was allowed to act in an antibody dilution solution diluted 200-fold with FACS buffer (PBS containing 0.1% human serum) at 4°C for 60 minutes. An isotype control was provided to remove non-specific background signals.
  • the cells after antibody action were filtered through a 35 ⁇ m filter (Falcon) and analyzed by flow cytometry using FACS AriaII (BD Biosciences) to measure the percentage of strongly CD271 positive cells.
  • FCM data was visualized using FlowJo software (BD Biosciences). Flow cytometry showed that the cell clumps contained a very high percentage of strongly CD271 positive cells, as high as 94.6% ( Figure 2B).
  • the expression of CD271, SOX10, and PAX6 was confirmed for the cell clusters by immunostaining.
  • the cell clusters were fixed with 4% paraformaldehyde-phosphate buffer and embedded in Tissue-Tek OCT compound (Sakura Finetech Japan). They were sliced thinly using a cryostat (Leica) to prepare 12 ⁇ m-thick frozen sections. After washing the sections with PBS, they were permeabilized with 3% TritonX-100 (Sigma) at room temperature for 15 minutes. They were blocked with Blocking one Histo (Nacalai Tesque) at room temperature for 1 hour.
  • CD271 antibody Advanced Targeting System, AB-N07
  • SOX10 antibody R&D, AF2864
  • PAX6 antibody abcam, ab195945
  • AB-N07 Advanced Targeting System
  • SOX10 antibody R&D, AF2864
  • PAX6 antibody abcam, ab195945
  • Primary antibodies were allowed to react for 3 hours at room temperature in an antibody dilution solution diluted 200-fold with Can Get Signal TM immunostain Solution B.
  • Nuclear staining was performed with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Dojindo Laboratories) for 10 minutes at room temperature.
  • DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
  • VECTASHIELD (registered trademark) The samples were mounted in Antifade Mounting Medium (VECTOR LABORATORIES). The fluorescent signals of the samples were observed using a confocal laser microscope Olympus FV3000 (Olympus). Immunostaining showed that the inside of the cell clusters was mainly composed of NCCs that were CD271 and SOX10 positive and PAX6 negative ( Figure 2C). Furthermore, the expression of CD271, SOX10, and PAX6 was confirmed by immunostaining for the cell clusters on each day from day 1 (D1) to day 5 (D5) after the start of cell culture. From D4 (2 days after the start of the NCC induction process), SOX10 and CD271 positive NCCs appeared, and the proportion of NCCs increased at D5 ( Figure 3).
  • NCCs produced by conventional method top of Figure 4
  • adherent culture two-dimensional (2D) NCC induction method
  • 2D NCC induction method iPS cells were cultured for 10 days in a culture medium containing 10 ⁇ M SB431542 and 1 ⁇ M CHIR99021 using 6 wells coated with iMatrix-511, and NCCs were isolated from the resulting NCC clusters by selecting strongly CD271 positive cells using flow cytometry (the resulting NCCs are abbreviated as "2D iNCC" or "2D 271H”).
  • NCCs were also isolated from the D5 NCC clusters by selecting strongly CD271 positive cells using flow cytometry (the resulting NCCs are abbreviated as "3D iNCC” or "D5 271H”) (center of Figure 4).
  • NCC-related genes NGFR, SOX10, TFAP2A, and PAX3
  • POU5F1 pluripotent cell marker POU5F1
  • RT-qPCR RT-qPCR for each NCC.
  • total RNA from the cell clusters was collected using RNeasy Mini Kit (Qiagen), and genomic DNA was removed using DNase-one Kit (Qiagen).
  • Reverse transcription was performed using PrimeScript RT Master Mix (Takara) to synthesize single-stranded cDNA from 500 ng total RNA.
  • the cDNA was combined with Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO), and RT-qPCR was performed using StepOnePlus TM Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
  • NCC-related genes was observed to be comparable in both 2D iNCC and 3D iNCC, and it was shown that the expression of the pluripotent cell marker POU5F1 disappeared in both NCCs ( Figure 4, bottom).
  • the primers used in RT-qPCR were the same as those listed in Supplementary Table 2 of Non-Patent Document 3.
  • NCC-related genes NGFR, SOX10, TFAP2A, and PAX3
  • neural plate border marker genes DLX5 and MSX2
  • the pluripotent cell marker Oct4 were measured by RT-qPCR for cell aggregates (no selection of CD271-high expressing cells) on each day from day 0 (D0) to day 5 (D5) after the start of cell culture, as well as D5 271H and 2D 271H.
  • Figures 5 shows that neural plate border-related markers increased one day after switching from the SB and BMP treatment process to the NCC induction process (D3).
  • Figures 5 and 6 show that D5 cells express NCC-related genes to approximately the same extent as D5 271H cells, and that they also express NCC-related genes to approximately the same extent as 2D 271H cells.
  • the primers used in RT-qPCR the base sequences of the primers other than those listed in Supplementary Table 2 of Non-Patent Document 3 are shown in Table 1.
  • Table 1 also lists the base sequences of the primers used in examples other than this one (in the table, Fw indicates the forward primer and Rev indicates the reverse primer).
  • NCC clusters were also obtained (Figure 8).
  • the number of cells seeded and the concentration of BMP4 were adjusted for each cell line. Specifically, the Ff-I 14s04 line and the Ff-I 14s04 HLA-KO line were seeded at 3.0 ⁇ 10 3 cells/100 ⁇ l/well, and the BMP4 concentration was set to 2.5 ng/mL.
  • the iPS cell line derived from a patient with osteogenesis imperfecta was seeded at 2.0 ⁇ 10 3 cells/100 ⁇ l/well, and the BMP4 concentration was set to 2.5 ng/mL.
  • the culture was performed under the same conditions as the 3D NCC induction method. Specifically, the following procedure was performed. iPS cells were cultured in a culture medium containing 10 ⁇ M SB431542 and 1 ⁇ M CHIR99021 for 4 days (SB CHIR D4 in Figure 9) using 6-well plates coated with iMatrix-511, or the cells were cultured in a culture medium containing 10 ⁇ M SB431542 and 10 ng/mL BMP4 for 1 day, and then in a culture medium containing 10 ⁇ M SB431542 and 1 ⁇ M CHIR99021 for 3 days (SB BMP4 D1 SB CHIR D3 in Figure 9) to obtain cell clumps.
  • Example 2 Verification of culture conditions for induction of NCC clusters ⁇ Verification of SB and BMP action process 1>
  • the duration of SB431542 and BMP4 action was varied to examine the variation in the rate of strongly CD271 positive cells by flow cytometry.
  • the expression patterns of the genes CD271 (NCC marker), PAX6 (neurectoderm marker), and E-Cadherin (epithelial cell marker) were examined by immunostaining. In this case, the period of shaking culture was fixed. The results are shown in Figures 10 and 11.
  • FIG. 13 shows that when the SB and BMP application process was performed for 6 hours (SB BMP4 6h) or 12 hours (SB BMP4 12h), and then verified by flow cytometry on the 5th day, the NCC induction efficiency was lower than when the SB and BMP application process was performed for 1 day (SB BMP4 D1). This is presumably because not only NCC but also neuroectoderm was induced simultaneously due to the short duration of the SB and BMP application process.
  • FIG. 14 shows that the NCC induction effect was high when the SB and BMP action steps were performed for 2 days (SB BMP4 D2) or 3 days (SB BMP4 D3) and then verified by flow cytometry on the 5th day.
  • FIG. 15 shows that when the culture period was extended to 7 days, CD271 expression in the entire cell population decreased regardless of the duration of the SB and BMP action steps. This is presumably because differentiation of NCC into other cells progresses between the 5th and 7th days of induction.
  • the results of RT-qPCR also showed that the expression level of NGFR (CD271) decreased after the 5th day of culture (FIG. 16).
  • Figure 17 shows an example of a method pattern that is preferable in terms of NCC induction efficiency for the SB and BMP action steps.
  • Example 3 Verification of differentiation potential of NCC The differentiation potential of the NCC obtained in Example 1 (the NCC induction method of the present invention) was verified. An overview is shown in Figure 24. Specifically, the differentiation potential of the NCC induced in Example 1 into peripheral nerve cells, melanoblasts, mesenchymal stem cells, and first pharyngeal arch ectodermal mesenchymal cells was verified.
  • FIG. 25A An outline of this induction method is shown in FIG. 25A. Specifically, the method was carried out as follows.
  • the NCC clumps obtained in Example 1 were transferred to a 96-well U-bottom ultra-low adhesion culture plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and cultured for 14 days in an induction medium containing Neurobasal medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) supplemented with B27 supplement (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), N-2 supplement (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), 2 mM L-glutamine (FUJIFILM Wako Co., Ltd.), 10 ng/mL BDNF (FUJIFILM Wako Co., Ltd.), GDNF (FUJIFILM Wako Co., Ltd.), NT-3 (FUJIFILM Wako Co.
  • the NCC clusters obtained in Example 1 were transferred to a 96-well U-bottom ultra-low adhesion culture plate (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and cultured for 6 days in induction medium containing StemFit Basic03 medium, 1 ⁇ M CHIR99021, 25 ng/mL BMP4, and 100 nM Endothelin-3 (TOCRIS). The medium was replaced on the third day of induction. Fluorescent immunostaining of MITF, a melanoblast marker, showed that the cells were differentiated into melanoblasts (Figure 26B).
  • the second passage NCC was dispersed into single cells using Accutase, suspended in a culture medium containing 10 ⁇ M SB431542, 20 ng/mL Egf, and Fgf2 in StemFit Basic03 medium, and seeded on a fibronectin-coated culture plate at a cell concentration of 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2.
  • the medium was replaced with PRIME-XV MSC Expansion XSFM medium (Irvine Scientific) to start MSC induction.
  • the cells were passaged every 4 days using Accutase, seeded on a culture plate at a density of 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , and cultured.
  • the expression of human MSC markers (CD105, CD90, CD73, CD44) was confirmed using flow cytometry, and it was shown that they had differentiated into MSCs ( Figure 28).
  • first pharyngeal arch ectomesenchymal cells from NCC clusters detach from the dorsal protuberance of the neural tube and then migrate and differentiate into various organs in the developing embryo during neurogenesis, such as the first pharyngeal arch ectomesenchyme (PA1), second pharyngeal arch ectomesenchyme (PA2), third pharyngeal arch (PA3), frontonasal process (FNP), etc.
  • PA1-EM first pharyngeal arch ectomesenchyme
  • the characteristics of PA1-EM are outlined in Figure 29.
  • HOX gene expression in the NCC clusters must be negative. Therefore, HOX gene expression was confirmed by RT-qPCR for the NCC clusters obtained in Example 1.
  • NCC clusters in which HOX gene expression was induced by stimulation with retinoic acid (RA) were prepared. An overview of each method is shown in Figure 30A. HOX gene-positive NCC clusters were induced by culturing the cells in a medium containing 1.0 ⁇ M RA from the fourth day of induction. Specifically, the following procedure was followed.
  • NCC-related genes NGFR, SOX10
  • RT-qPCR The expression levels of NCC-related genes were the same even after RA stimulation ( Figure 30B).
  • HOX genes HOXA2, HOXA3
  • Fig. 8 shows the factors necessary for cell survival and proliferation, Edn-1 (Endothelin-1) as a factor necessary for mandibular selection, and BMP4 as a factor necessary for distal induction.
  • Edn-1 Endothelin-1
  • BMP4 BMP4 as a factor necessary for distal induction.
  • NCC clusters were cultured in an induction medium consisting of StemFit Basic03 medium supplemented with 50 nM Endothelin-1 (Sigma), 100 ng/mL Fgf8b (FUJIFILM Wako), and 2.5 ng/mL BMP4 for 4 days in a shaking culture vessel.
  • Fluorescent immunostaining images for DLX5 also showed that the induced ectomesenchymal cells highly expressed DLX5, reproducing the genetic characteristics of PA1-EM cells.
  • PA1-EM cells were also successfully induced from iPS cell lines from patients with osteogenesis imperfecta ( Figure 33).
  • NCCs were HOX negative for PA1-EM cell induction.
  • PA1-EM cell induction was performed using NCCs induced without RA treatment (HOX(+) NCCs) and NCCs induced by RA treatment to express the HOX gene (HOX(-) NCCs).
  • HOX(+) NCCs NCCs induced without RA treatment
  • HOX(-) NCCs NCCs induced by RA treatment to express the HOX gene
  • Example 4 Verification of the ability of PA1-EM cell clusters to induce patterning in the first pharyngeal arch ⁇ Induction into cells on the proximal-oral side of the first pharyngeal arch> It is known that patterning of PA1-EM cells is induced in response to epithelial signals (FIG. 39A). Therefore, we verified whether the PA1-EM cells obtained by the above-mentioned method have the ability to induce patterning in the first pharyngeal arch. The PA1-EM cell clusters were induced to become cells on the proximal-oral side (molar tooth forming region) of the first pharyngeal arch. An outline of the induction method is shown in FIG. 38. Specifically, the following procedure was performed.
  • the PA1-EM cell clusters obtained in Example 3 were transferred to a 96-well U-bottom ultra-low attachment culture plate. To induce cells on the proximal-oral side of the first pharyngeal arch, the PA1-EM cell clusters were cultured for 3 days in an induction medium containing 100 ng/mL Fgf8b, 400 nM SAG (Selleck), 1.0 ⁇ M BQ-123 (Selleck), and 0.5 ⁇ M LDN193189 (TOCRIS) in StemFit Basic03 medium.
  • an induction medium containing 100 ng/mL Fgf8b, 400 nM SAG (Selleck), 1.0 ⁇ M BQ-123 (Selleck), and 0.5 ⁇ M LDN193189 (TOCRIS) in StemFit Basic03 medium.
  • RT-qPCR was performed for the proximal-oral markers PAX9 and LHX8 of the first pharyngeal arch, and the induction of the proximal-oral cells of the first pharyngeal arch was confirmed ( Figure 39B).
  • the base sequences of the primers used for RT-qPCR are shown in Table 1.
  • the PA1-EM cell clusters were induced to become cells on the distal-abdominal side of the first pharyngeal arch (the jaw bone ossification origin region).
  • the outline of the induction method is shown in the lower part of FIG. 38.
  • the PA1-EM cell clusters obtained in Example 3 were cultured for 3 days in an induction medium containing StemFit Basic03 medium, 20 ng/mL Fgf2, 50 nM Endothelin-1, and 10 ng/mL BMP4.
  • RT-qPCR was performed for GSC and MSX2, which are markers for the distal-abdominal side of the first pharyngeal arch, and induction of cells on the distal-abdominal side of the first pharyngeal arch was confirmed (FIG. 39C).
  • Example 5 Induction into jawbone-like tissue and transplantation of said tissue into mice ⁇ Induction of jawbone-like tissue from jawbone ossification origin cells>
  • the PA1-EM cell cluster obtained in Example 3 was subjected to stepwise osteogenic differentiation induction to induce jawbone-like tissue.
  • the outline of the induction method is shown in FIG. 40. Specifically, the PA1-EM cell cluster was first cultured for 3 days in an induction medium containing 20 ng/mL Egf, Fgf2, 50 ng/mL BMP2, 3 ⁇ M CHIR99021, and 400 nM SAG in StemFit Basic03 medium, and induced into osteoprogenitor cells.
  • RT-qPCR for osteoprogenitor cell markers SP7, RUNX2, and DLX5 confirmed the induction of osteoprogenitor cells (FIG. 41A).
  • RT-qPCR for the early osteoblast marker ALPL and the immature osteocyte marker E11/gp38 showed that differentiation had not progressed to osteoblasts or osteocytes (FIG. 41B).
  • the cell aggregates were cultured in MSCgo Osteogenic SF,XF (Sartorius) for 16 days, and then cultured for 8 days in osteogenic differentiation-inducing medium consisting of StemFit Basic03 medium supplemented with 10 nM dexamethasone (Sigma), 10 mM ⁇ -glycerophosphate (Sigma), and 50 ⁇ g/ml ascorbic acid (Sigma).
  • osteogenic differentiation-inducing medium consisting of StemFit Basic03 medium supplemented with 10 nM dexamethasone (Sigma), 10 mM ⁇ -glycerophosphate (Sigma), and 50 ⁇ g/ml ascorbic acid (Sigma).
  • RT-qPCR was performed for the osteoblast marker ALPL and the osteocyte markers E11/gp38, DMP1, PHEX, and SOST, confirming the induction of bone differentiation (Figure 43).
  • the resulting jawbone-like tissue was histologically observed by Alizarin Red staining ( Figure 44A) and HE staining ( Figure 44B).
  • fluorescent immunostaining for F-actin was performed and the formation of a bone cell network inside the jaw bone-like tissue was confirmed (Figure 44C).
  • iPSCs Human induced pluripotent stem cells reprogrammed with episomal vectors were maintained under feeder-free and xeno-free conditions as previously reported (Nakagawa, M. et al. Nakagawa, M. et al. A novel efficient feeder-Free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 1-7 (2014)).
  • iPSCs were cultured on cell culture plates coated with iMatrix-511 (human laminin 511 E8 fragment; Nippi, Tokyo, Japan) in StemFit AK03N medium (Ajinomoto, Tokyo, Japan).
  • the cells When they reached approximately 80% confluence, usually every 4–5 days, the cells were detached and dissociated into single cells using Accutase (Innovative Cell Technologies, CA, USA). After centrifugation, the cells were resuspended in StemFit AK03N supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 (ROCK inhibitor; Fujifilm Wako, Tokyo, Japan) and seeded onto culture plates coated with iMatrix-511. The next day, the medium was replaced with fresh StemFit AK03N without Y-27632. Thereafter, the medium was replaced every 2 days until the next passage.
  • ROCK inhibitor Fujifilm Wako, Tokyo, Japan
  • HLA-I 14s04 HLA homozygous iPSCs
  • Ff-I 01s04 HLA homozygous iPSCs
  • Ff-14s04 with knockout of human leukocyte antigen (HLA)-A, B and CIITA genes
  • HLA-KO Ff-I 14s04 clone Ff-I 14s04-AB II-KO-13
  • iPSCs derived from an osteogenesis imperfecta (OI) patient OI-iPSC: clone OI08-12, showing a point mutation in the splicing donor site of intron 32 of COLIA1 (c.2235+1G>A) and classified as silence type III
  • OI-iPSCs with rescued mutations resOI-iPSCs
  • iPSCs were detached from the culture dish using Accutase and dissociated into single cells. These cells were rapidly reaggregated in 100 ⁇ l of StemFit Basic03 (equivalent to AK03N without bFGF, Ajinomoto) supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 in 96-well V-bottom ultra-low cell attachment plates (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • the cell concentrations employed for aggregation culture were as follows: 1231A3 (1.0 ⁇ 104 cells/well), Ff-1 14s04, HLA-KO Ff-1 14s04, Ff-1 014s04, OI-iPSC, and resOI-iPSC (3.0 ⁇ 103 cells/well). Cell numbers were measured using a Countess II FL (Thermo Fisher Scientific, Tokyo, Japan). Aggregation was promoted by centrifugation at 1200 rpm for 3 min (day 0). For induction of neural crest cells (NCCs), these cell aggregates were maintained in a 37°C incubator with 5% CO2 .
  • NCCs neural crest cells
  • the culture medium was replaced with 150 ⁇ l of StemFit Basic03 containing 10 ⁇ M SB431542 (TGF- ⁇ inhibitor; Fujifilm Wako) and BMP4 (R&D Systems, MN, USA) (1231A3, Ff-I 14s04, HLA-KO Ff-I 14s04 (10 ng/ml); Ff-I 01s04, OI-iPSCs, resOI-iPSCs (2.5 ng/ml)).
  • TGF- ⁇ inhibitor Fujifilm Wako
  • BMP4 R&D Systems, MN, USA
  • HOX-negative NCC induction aggregates were cultured from day 4 to day 5 without changing the medium.
  • day 4 aggregates were cultured from day 4 to day 5 in 250 ⁇ l of StemFit Basic03 containing 10 ⁇ M SB431542, 1 ⁇ M CHIR99021, and 10 nM all-trans retinoic acid (RA) (Fujifilm Wako).
  • 1231A3 iPSCs were aggregated in medium containing 10 ⁇ M Y-27632 in 96-well V-bottom ultra-low cell attachment plates (10,000 cells/well). After 24 h (day 1), the culture medium was replaced with StemFit Basic03 containing 10 ⁇ M SB431542 and 1 ⁇ M CHIR99021 with or without BMP4 to evaluate whether BMP4 treatment affects NCC induction efficiency. After 24 h, the aggregates were transferred to 48-well plates and cultured in medium containing 10 ⁇ M SB and 1 ⁇ M CHIR on an orbital shaker at 120 rpm from days 2 to 5.
  • day 1 aggregates were cultured in medium containing 10 ⁇ M SB and 10 ng/ml BMP4 for 2 days and then transferred to 48-well plates and cultured in medium containing 10 ⁇ M SB and 1 ⁇ M CHIR on an orbital shaker at 120 rpm from days 3 to 5.
  • Non-Patent Document 3 In 2D conditions, NCCs were induced from 1231A3 iPSCs according to a previously established protocol (Non-Patent Document 3). Briefly, iPSCs were seeded on iMatrix-511-coated culture plates at a density of 3.6 ⁇ 103 cells/ cm2 in StemFit AK03N medium and maintained in the medium for 4 days. For NCC induction, cells were cultured in StemFit Basic03 supplemented with 10 ⁇ M SB431542 and 1 ⁇ M CHIR99021 for 10 days, with medium changes every 2 days.
  • NCC clusters Day 5 NCC clumps were transferred to 96-well U-bottom ultra-low cell attachment plates (Sumitomo Bakelite).
  • NCC clusters were cultured in Neurobasal medium (Thermo Fisher Scientific) supplemented with B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), N-2 supplement (Thermo Fisher Scientific), 2 mM L-glutamine (FUJIFILM Wako), and 10 ng/ml each of BDNF, GDNF, NT-3 and NGF (Fujifilm Wako) for 14 days, with medium changes every 3 days. Differentiation was confirmed by immunostaining with anti-peripherin and anti-class III ⁇ -tubulin antibodies.
  • NCC clusters were cultured in Stemfit Basic03 supplemented with 1 ⁇ M CHIR99021, 25 ng/ml BMP4, and 100 nM endothelin-3 (TOCRIS, Bristol, UK) for 6 days with medium changes every 3 days. Differentiation was confirmed by immunostaining with anti-MITF antibody.
  • NCC clumps were first dissociated into single cells with Accutase and seeded on fibronectin-coated plates (Millipore, Darmstadt, Germany) at a density of 1.0 ⁇ 104 cells/ cm2 .
  • Cells were cultured in StemFit Basic03 supplemented with 10 ⁇ M SB431542, 20 ng/ml each of EGF (Fujifilm Wako) and FGF2 (Fujifilm Wako). Medium was changed every 3 days and cells were passaged before reaching subconfluence.
  • Expanded cells (passage 2 (PN2)) were seeded on fibronectin-coated plates at a density of 1.0 ⁇ 104 cells/ cm2 in StemFit Basic03 supplemented with 10 ⁇ M SB431542, 20 ng/ml each of EGF and FGF2. After 24 hours, the medium was replaced with PRIME-XV MSC Expansion XSFM medium (FUJIFILM Irvine Scientific). Passage was performed every 3 or 4 days. At PN2, MSC differentiation was confirmed by FACS analysis using human MSC markers (positive markers: CD105, CD90, CD73, CD44, CD29; negative markers: CD45, CD34, HLA-DR).
  • Non-Patent Document 3 To confirm the differentiation potential of the induced MSC-like cells, osteogenic induction, chondrogenic induction, and adipogenic induction were performed, and the cells were stained with alizarin red, alcian blue, and oil red O, respectively, as previously reported (Non-Patent Document 3).
  • HOX-negative NCC clumps were cultured in 350 ⁇ l of StemFit Basic03 supplemented with 100 ng/ml FGF8b (Fujifilm Wako), 50 nM endothelin-1 (PEPTIDE INSTITUTE, Osaka, Japan), and 2.5 ng/ml BMP4 on an orbital shaker at 120 rpm from day 5 to day 9.
  • NCC clusters were cultured in 350 ⁇ l StemFit Basic03 supplemented with 100 ng/ml FGF8b and 10 ⁇ M BQ-123 (endothelin A receptor antagonist; Selleck, Tokyo, Japan) on an orbital shaker at 120 rpm from days 5 to 12, with medium replaced on day 9.
  • BQ-123 endothelin A receptor antagonist
  • RA-treated NCCs were cultured in 350 ⁇ l StemFit Basic03 supplemented with 100 ng/ml FGF8b, 50 nM endothelin-1, and 2.5 ng/ml BMP4 on an orbital shaker at 120 rpm from day 5 to day 9.
  • CD271 high+ sorted NCCs were seeded on fibronectin-coated plates at a density of 1.0 ⁇ 104 cells/ cm2 and cultured in StemFit Basic03 supplemented with 100 ng/ml FGF8b, 50 nM endothelin-1, and 2.5 ng/ml BMP4 for 4 days.
  • CD271 high+ sorted NCCs were rapidly aggregated in 100 ⁇ l StemFit Basic03 supplemented with 100 ng/ml FGF8b, 50 nM endothelin-1, and 2.5 ng/ml BMP4 at a density of 1.0 ⁇ 104 cells/well in 96-well V-bottom ultra-low cell attachment plates and cultured for 4 days.
  • ⁇ Induction of mdEM derivatives The mdEM aggregates (day 9) were transferred to 96-well U-bottom ultra-low cell attachment plates (Sumitomo Bakelite).
  • mdEM aggregates were cultured in 200 ⁇ l StemFit Basic03 supplemented with 50 nM endothelin-1, 20 ng/ml FGF2, and 25 ng/ml BMP4 from days 9 to 13, with medium replaced on day 11.
  • proximal oral domain cells were cultured in 200 ⁇ l StemFit Basic03 supplemented with 100 ng/ml FGF8b, 400 nM SAG (Smoothened Agonist, Selleck), 10 ⁇ M BQ-123, and 500 nM LDN193189 (ALK2/3 inhibitor, TOCRIS) from days 9 to 13, with the medium replaced on day 11. Then, for dental mesenchymal induction, the proximal oral domain induction medium was replaced with 200 ⁇ l StemFit Basic03 supplemented with 100 ng/ml FGF8b, 400 nM SAG, 3 ⁇ M CHIR99021, and 30 ng/ml Activin A (R&D). Dental mesenchymal induction was carried out from day 13 to day 17, and the medium was changed on day 15.
  • StemFit Basic03 supplemented with 100 ng/ml FGF8b, 400 nM SAG (Smoothened Agonist, Selleck), 10 ⁇ M BQ-123,
  • mdEM aggregates (day 9) were transferred to 96-well U-bottom ultra-low cell attachment plates.
  • mdEM were cultured for 3 days in 200 ⁇ l StemFit Basic03 supplemented with 20 ng/ml EGF and FGF2, 50 ng/ml BMP2 (R&D), 3 ⁇ M CHIR99021, and 400 nM SAG.
  • differentiation medium was replaced with 200 ⁇ l MSCgo Osteogenic Differentiation Medium (SARTORIUS, Gottingen, Germany) and clusters were cultured for 7 days.
  • the differentiation medium was replaced with 200 ⁇ l of StemFit Basic03 supplemented with 10 mM ⁇ -glycerophosphate disodium salt hydrate (Sigma, MO, USA), 250 ⁇ M L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate (Sigma), 100 nM dexamethasone (Sigma), 50 ng/ml BMP2 (R&D), 3 ⁇ M CHIR99021, and 400 nM SAG, and the clusters were cultured for 7 days. From day 26 to day 38, the clusters were cultured in MSCgo Osteogenic Differentiation Medium, and the medium was changed every 2 days.
  • ⁇ Chondogenesis induction in mdEM> To induce chondrogenic differentiation in 3D conditions, mdEM aggregates (day 9) were transferred to 96-well U-bottom ultra-low cell attachment plates and cultured for 21 days in MSCgo Chondrogenic XF (SARTORIUS). Chondrogenic differentiation was confirmed by Safranin O/Fast Green staining and immunofluorescence analysis using anti-COLX antibody.
  • FIG. 69 An outline of this induction method is shown in FIG. 69. Specifically, the method was carried out in the following procedure.
  • the NCC clumps obtained in Example 1 were dispersed into single cells using Accutase, and strongly CD271 positive cells were selected by flow cytometry.
  • the selected cells were suspended in a culture solution containing 10 ⁇ M SB431542, 20 ng/mL Egf (FUJIFILM Wako), and Fgf2 (FUJIFILM Wako) in StemFit Basic03 medium, and then seeded on a fibronectin-coated culture plate at a cell concentration of 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , and the cells were cultured for 5 days.
  • the NCCs were dispersed into single cells using Accutase, suspended in a culture solution containing 2 ng/ml TGF- ⁇ 1 and 50 nM Endothelin-1 in StemFit Basic03 medium, and seeded on a fibronectin-coated culture plate at a cell concentration of 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , and induction of differentiation into smooth muscle cells was started.
  • the cells were passaged every 4 days using Accutase, seeded on a culture plate at 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , and cultured. On day 10 of smooth muscle cell induction culture, the expression of smooth muscle markers was confirmed by immunostaining and RT-qPCR.
  • Flow cytometry analysis and cell sorting was performed using BD FACSAria II_v1.87 (BD Biosciences, NJ, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Cell aggregates or 2D cultured cells were dissociated using Accutase, washed with FACS buffer (PBS with 1% human serum albumin) and filtered through a 35 ⁇ m filter (Corning, NY, USA). Cells were then pelleted by centrifugation (1200 rpm, 3 min, 4 °C) and resuspended in FACS buffer containing the appropriate antibody, followed by incubation at 4 °C for 60 min. Isotype controls were included in all experiments to eliminate nonspecific background signals.
  • RT-qPCR Real-time quantitative PCR
  • QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System and StepOnePlus Real-Time PCR System_v2.3 Applied Biosystems, MA, USA
  • THUNDERBIRD Next SYBR qPCR Mix TOYOBO, Osaka, Japan
  • SYBR signal detection deaturation at 95°C, 3 s; annealing at 60°C, 30 s; extension at 72°C, 30 s.
  • a final step to generate a dissociation curve was performed at the end of each qPCR run.
  • RNA-seq analysis To perform RNA-seq analysis, total RNA was extracted using RNeasy Micro Kit and treated with RNase-Free DNase Set to remove genomic DNA contamination. 10 ng of total RNA was then reverse transcribed to generate single-stranded cDNA using SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). For Ion AmpliSeq Transcriptome-targeted NGS library construction, we utilized the Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Panel, Chef-Ready Kit (Thermo Fisher Scientific), and Ion Chef (Thermo Fisher Scientific) instrument according to the manufacturer's protocol. Briefly, a reverse transcription master mix was prepared by combining 5X VILO Reaction Mix and 10X SuperScript III Enzyme Mix.
  • the mixture was then aliquoted into reaction plates, and 10 ng of total RNA was added to each.
  • the plate was loaded into a thermal cycler and incubated at 42°C for 30 min, followed by 85°C for 5 min, followed by a 10°C hold.
  • Ion AmpliSeq Chef Solutions DL8 cartridge Ion AmpliSeq Chef Reagents DL8 cartridge
  • Ion AmpliSeq Tip Cartridge L8 cartridge Ion AmpliSeq Tip Cartridge L8, PCR Frame Seal, IonCode 96 Well PCR Plate, PCR Plate Frame, Empty Tip Cartridge L8, and Enrichment Cartridge.
  • the IonCode 96 Well PCR Plate used for the reverse transcription reaction contained an IonCode barcode adapter.
  • a tube containing the Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Panel was inserted into the Ion AmpliSeq Chef Reagents DL8 cartridge.
  • Multiplex PCR was performed in an Ion Chef thermal cycler with 13 cycles of 16-min annealing/extension reactions. Subsequent steps included primer digestion with FUPA reagent, ligation of IonCode barcode adapters, library purification using magnetic beads, homogenization of library concentrations, and mixing in a single tube.
  • GSEA Gene set enrichment analysis based on Gene Ontology (GO) terms was performed using the integrated Differential Expression and Pathway analysis (iDEP) software (Ge, S. X., Son, E. W. & Yao, R. BMC Bioinformatics 19, 1-24 (2016)) (version 9.6).
  • F-CHP 5-FAM-conjugated collagen hybridizing peptide
  • ⁇ Cell viability> To assess cell viability, cell aggregates were assessed using the Cyto3D Live-Dead Assay Kit (TheWell BIOSCIENCE, NJ, USA) according to the manufacturer's instructions. Briefly, 2 ⁇ L of Cyto3D reagent was added to each well, and then the aggregates were incubated at 37°C for 15 min. Fluorescent signals were observed using a fluorescent microscope. To identify apoptotic cells, the sectioned samples were subjected to Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling (TUNEL) staining (DeadEnd Fluorometric TUNEL System; Promega, WI, USA) according to the manufacturer's instructions. Nuclei were counterstained with DAPI, and fluorescent signals were visualized using a confocal microscope. TUNEL-positive cells were quantified using ImageJ_v1.54f software (NIH, MD, USA).
  • mice were euthanized with CO2 , and the transplanted tissues were retrieved after micro-computed tomography (microCT) scanning.
  • microCT micro-computed tomography
  • ⁇ Micro-CT analysis> Before euthanasia, the kidney region and jaw bone were scanned using a micro-CT system (inspeXio SMX-100CT; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) with the following parameters: voxel size 30 ⁇ m, tube voltage 60 kV, tube current 0.2 mA, and exposure time 480 ms. The resolution of the CT slices was 1024 ⁇ 1024 pixels. Bone morphometrics were analyzed using 3D imaging software (TRI/3D-BON-FCS; Ratoc Systems Engineering, Osaka, Japan) according to the manufacturer's instructions. The CT values of each tissue were converted to tissue mineral density (TMD) using a calibration curve based on a phantom of known density scanned under the same conditions.
  • TMD tissue mineral density
  • mice Four weeks after implantation of the jawbone-like organoids, the mice were euthanized after micro-CT image scanning, and both the kidneys and jawbone were harvested. The specimens were fixed in 4% PFA at 4°C for 24 hours, followed by a 7-day decalcification period (except for von Kossa staining). The specimens were subsequently dehydrated using graded ethanol, cleared using Histo-clear, and embedded in paraffin. The specimens were sectioned into serial slices of 8 ⁇ m thickness, and the jawbone samples were cut in the coronal plane.
  • HE staining, Azan staining, and TRAP staining were performed according to standard protocols and observed under an optical microscope. Quantitative evaluation of bone cells and Azan red stained areas was performed using ImageJ software.
  • deparaffinized sections were permeabilized with 0.3% Triton-X-100 in PBS for 20 min at room temperature and then treated with LAB solution (Polyscience, IL, USA) for 15 min at room temperature for antigen activation. Sections were then blocked with blocking solution 2 for 1 h at room temperature and incubated overnight at 4°C with primary antibodies diluted in antibody working solution.
  • LAB solution Polyscience, IL, USA
  • sections were blocked using blocking solution 2 for 1 h at room temperature and incubated overnight at 4°C with primary antibodies diluted in antibody working solution.
  • MOM Mouse on Mouse
  • Sections were then incubated with secondary antibodies diluted in antibody working solution for 4 h at room temperature.
  • Phalloidin staining was performed on frozen sections to visualize F-actin filaments. Fixed and decalcified specimens were embedded in Tissue-Tek O.C.T compound and 20 ⁇ m thick sections were cut. Sections were washed with PBS, permeabilized with 0.3% Triton-X-100 in PBS for 20 min at room temperature, blocked with blocking solution 2 for 1 h at room temperature and then incubated overnight at 4°C with Alexa Fluor 594 phalloidin (Thermo Fisher Scientific) and primary antibodies diluted in antibody working solution. After incubation, sections were exposed to secondary antibodies diluted in Alexa Fluor 594 phalloidin and antibody working solution for 4 h at room temperature. Nuclei were counterstained with DAPI.
  • Example 6 Induction of human iPSCs to HOX-negative NCCs under 3D conditions
  • a 3D culture system conducive to targeted induction of HOX-negative NCCs
  • Fig. 46a We attempted to adapt the induction protocol in our previous study to 3D cultured iPSCs.
  • dissociated human 1231A3 iPSCs feeder-free and xeno-free iPSC line
  • were aggregated on 96-well V-bottom ultra-low cell attachment plates in medium containing ROCK inhibitor Y-27632 Fig.
  • RNA sequencing (RNA-seq) analysis revealed a gradual transition of the cell populations from iPSC (day 0) to NCC (day 5) through the neural plate border cell state (Fig. 49a). Consistent with these findings, SOX10 and CD271 protein were detected after 4 days of induction (Fig. 49b).
  • NCC clusters treated with retinoic acid (RA) to induce posterior fates as a positive control (Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J. & Studer, L. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013); Fattahi, F. et al. Nature 531, 105-109 (2016)) (Fig. 51a-c) and performed qPCR analysis.
  • Regular NCC clusters showed minimal expression of HOX genes (HOXA1, HOXA2, HOXB2, HOXA3) (Rothstein, M., Bhattacharya, D. & Simoes-Costa, M. Dev. Biol.
  • Example 7 Generation of mdEM from HOX-negative NCC clusters.
  • the intra-arch polarity of PA1 ectodermal mesenchyme along the proximal-distal axis is characterized by Dlx and Hand genes (Minoux, M. & Rijli, F. M. Development vol. 137 2605-2621 (2010); Depew, M. J., Lufkin, T. & Rubenstein, J. L. R. Science (80-. ). 298, 381-385 (2002); Selleri, L. & Rijli, F. M. Nature Reviews Genetics vol. 24 610-626 (2023)) ( Figure 52a).
  • Dlx2 is expressed in both maxillary ectodermal mesenchyme (mxEM) and mdEM, whereas Dlx5 expression is restricted to mdEM and Hand2 is further restricted towards the distal end.
  • mxEM maxillary ectodermal mesenchyme
  • Hand2 is further restricted towards the distal end.
  • Fgf8 which is important for survival and proliferation of PA1 ectodermal mesenchyme, is detected throughout the nascent PA1 ectoderm (Creuzet, S., Schuler, B., Couly, G. & Le Douarin, N. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
  • Endothelin-1 (Edn1) is secreted exclusively from the mandibular process and drives PA1 ectomesenchyme toward an mdEM fate through activation of Dlx5 and subsequent Hand2 (Sato, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 18806-18811 (2008)).
  • Bmp4 promotes distal mandibular development (Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F. & Crump, J. G. Development 138, 5147-5156 (2011); Alexander, C. et al. Development 138, 5135-5146 (2011); Tucker, A. S., Khamis, A. Al & Sharpe, P. T. Dev. Dyn. 212, 533-539 (1998)).
  • FGF8 and EDN1 were tested. We observed that FGF8 was significant by downregulating the NCC marker SOX10 and upregulating the early mesenchymal markers TWIST1 and PRRX1 (Soo, K. et al. Dev.
  • the aggregates contained DLX2 single positive cells in the central zone, DLX2 + DLX5 + cells in the intermediate zone, and DLX2 + DLX5 + HAND2 + cells in the superficial zone, suggesting that FEDB generated mdEMs that recapitulated the proximal-distal patterning of embryonic mdEMs (Fig. 52f, g).
  • NCC clusters were treated with a combination of FGF8 and BQ-123 (also called FQ), an antagonist of endothelin A receptor (EDNRA) (Minoux, M. & Rijli, F. M. Development vol. 137 2605-2621 (2010)) (Fig. 52h). Immunostaining revealed differentiation into ectomesenchyme, albeit relatively less than FEDB (Fig. 52i). EDN1 inhibition significantly increased the expression of maxillary ectomesenchyme markers (POU3F3, CYP26A1) (Jeong, J. et al. Development 135, 2905-2916 (2008)), but not mdEM markers (Fig. 52j, k).
  • RA-treated NCCs differentiated into ectodermal mesenchyme, but showed minimal expression of DLX5 and a significant increase in HOX genes (HOXB2, HOXB4) (Fig. 52m, n), confirming that early positional information in NCCs influences patterning pathways.
  • Example 8 Summary of regional patterning at later stages using mdEM To confirm developmentally accurate derivation of mdEM, we investigated whether mdEM exhibits detailed regional patterning characteristic of later stages of development. At later stages, epithelial domains are further subdivided along proximal, distal, ventral, and oral axes, characterized by expression of Fgf8, Bmp4, Edn-1, and Shh, respectively (Xu, J. et al. Elife 8, 1-26 (2019); Vincentz, J. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 7563-7568 (2016); Neubuser, A., Peters, H., Balling, R. & Martin, G. R.
  • mdEM aggregates were transferred to 96-well U-bottom ultra-low cell attachment plates.
  • mdEM aggregates were cultured in various induction media containing BMP4 (Figure 56a).
  • HAND1 key distal cap marker
  • HAND2, GATA3, DKK1 distal markers
  • BMP4 concentrations 25 ng/ml.
  • FGF8 was replaced with FGF2, and conditions termed BMP4 high , EDN1, FGF2 low were employed for distal cap induction (Figure 55c).
  • mdEM aggregates were cultured in various induction media containing FGF8 and the Hedgehog signaling agonist SAG (Fig. 56c).
  • This combination effectively induced proximal oral-related genes (FOXF1, GLI1, PITX1, GBX2, BARX1, PAX9, LHX6).
  • these genes were upregulated when the opposing regional signals EDN1 and BMP4 were inhibited by BQ-123 and LDN193189 (LDN). Therefore, the condition of FGF8, SAG, BQ-123, and LDN was selected for induction of the proximal oral domain (Fig. 55c).
  • mdEM Treatment of the proximal oral domain mdEM with FGF8, SHH, CHIR, and ACTIVIN-A (also called FSCA) resulted in the expression of dental mesenchymal markers represented by TFAP2B, TFAP2A, LHX6, and PAX9 (Jing, J. et al. Nat. Commun. 13, (2022)) (Fig. 57b, 58a).
  • Gene Ontology (GO) analysis revealed a significant enrichment of genes related to "Odontogenesis” and "Odontogenesis of dentin-containing tooth” in induction from NCC (Fig. 58b).
  • mdEM successfully exhibited regional patterning similar to fetal mandible, indicating developmentally faithful mdEM induction.
  • Example 9 Creation of jawbone-like organoids from mdEM Unlike mesodermally derived bones, which form primarily by endochondral ossification, the mandible undergoes primarily intramembranous processes (Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B. & Longaker, M. T. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 696-711 (2020); Parada, C. & Chai, Y. Curr. Top. Dev. Biol. 115, 31-58 (2015)). In this process, mdEM condense and directly differentiate into osteoblasts (Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B. & Longaker, M. T. Nat.
  • SOST a mature osteocyte marker
  • Fig. 59e a mature osteocyte marker
  • Fig. 60b RNA-seq analysis
  • Fig. 60c chondrogenic markers
  • HOX gene expression remained negligible
  • Example 10 Transplantation of jawbone-like organoids induces bone regeneration in an immunodeficient mouse jaw defect model
  • three clusters of these organoids were directly transplanted into a 2.0 mm diameter mandibular defect in NSG mice (Fig. 64a, b).
  • micro-CT analysis revealed a significant increase in the amount of mineralized tissue in the transplanted group compared to the group without the graft (Fig. 64c, d, Fig. 65). Histological examination using HE staining and Azan staining demonstrated that although new bone formation was observed in some of the groups without the graft, the bone tissue in the transplanted group closely resembled the mature structure of the host's original bone (Fig.
  • OI In Vitro Disease Modeling Using Jaw Bone-Like Organoids Derived from OI-iPSCs
  • OI is an inherited bone disease characterized by bone matrix fragility, usually due to defects in COLI synthesis and processing (Van Dijk, F. S. & Sillence, D. O. Am. J. Med. Genet. Part A 164, 1470-1481 (2014)).
  • diagnosis of OI focuses mainly on long bones of mesodermal origin, with minimal attention paid to the jawbone.
  • the severity of bone fragility may involve bone cell-bone matrix interactions, there is limited understanding of the role of bone cells in the development of OI (Pathak, J. L., Bravenboer, N. & Klein-Nulend, J. Front. Endocrinol. (Lausanne). 11, 1-14 (2020)). Therefore, we investigated the utility of jawbone-like organoids in the histological analysis of OI.
  • mdEM were derived from OI-iPSCs obtained from a patient with an autosomal dominant mutation in COLIA1 (Fig. 66a) along with resOI-iPSCs (Kawai, S. et al. Nat. Biomed. Eng. 3, 558-570 (2019)).
  • COLIA1 COLIA1
  • resOI-iPSCs Kawai, S. et al. Nat. Biomed. Eng. 3, 558-570 (2019)
  • Fig. 67a three days after osteogenic induction, early COLI production was observed in both OI-iPSC and resOI-iPSC-derived aggregates (Fig. 67a).
  • collagen secreted from OI-iPSC-derived aggregates stained positive for collagen hybridizing peptide (CHP), indicating the generation of misfolded triple-helical strands.
  • CHP collagen hybridizing peptide
  • OI-organoids and resOI-organoids were then transplanted under the renal capsule of NSG mice.
  • Micro-CT analysis after 4 weeks revealed that OI-organoids produced less and lower mineralized tissue compared to resOI-organoids (Fig. 67d, f).
  • Histological analysis demonstrated that OI-organoids formed immature bone tissue stained with Azan blue, with numerous osteocytes exhibiting features similar to the typical features of OI bone (Mahr, M. et al. Int. J. Mol. Sci. 22, (2021)) (Fig. 67e, g; Fig. 66b). These osteocytes were partially apoptotic (Fig. 67h, j).
  • Example 12 Induction of NCC clusters into smooth muscle cells
  • scaffold stiffness may affect the direction of NCC differentiation. Indeed, mechanical forces have been identified as important for NCC migration and differentiation (Canales Coutino, B. & Mayor, R. Dev. Cell 57, 1792-1801 (2022); Zhu, Y. et al. J. Cell. Physiol. 234, 7569-7578 (2019)).
  • mandibular processes requires 3D mesenchymal intercalation guided by actomyosin polarity (Tao, H. et al. Nat. Commun. 10, 1-18 (2019)).
  • the induced cell clusters highly expressed the smooth muscle markers Calponin, TAGLN, ACTA2, CNN1, and TAGLN, as well as the mature smooth muscle marker MYH11. Therefore, it was demonstrated that the NCC clusters of the present invention have the ability to differentiate into smooth muscle cells.
  • neural crest cells can be produced efficiently in a short period of time, making cell sorting unnecessary, which contributes to reducing development costs and ultimately costs in clinical application.
  • the neural crest cells produced by the present invention are extremely useful as starting cells for producing differentiated cells such as mesenchymal stem cells and melanocytes, and organoids such as bone organoids.
  • the differentiated cells and organoids obtained by the present invention can be used for the regeneration of damaged tissues, and are particularly useful in regenerative medicine.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、多能性幹細胞から神経堤細胞を製造する方法であって、（１）多能性幹細胞を、ALK阻害剤および骨形成タンパク質を含む培地中で浮遊培養する工程、ならびに（２）ALK阻害剤およびGSK-3β阻害剤を含む培地中で浮遊培養する工程、を含む、方法を提供する。

Description

神経堤細胞の製造方法
　本発明は神経堤細胞の製造方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞由来を特定の条件下で浮遊培養する工程を含む、神経堤細胞の製造方法および該方法により得られた神経堤細胞の用途などに関する。
　神経堤細胞（Neural Crest Cell: NCC）は、発生初期において神経板から神経管が形成される際に神経外胚葉と表皮外胚葉の間から発生する細胞であり、神経細胞、グリア細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞及び色素細胞などの多くの種類の細胞へ分化する多能性（multipotency）と自己増殖能とを有する細胞である。このような多能性（multipotency）及び自己増殖能は、再生医療用の細胞医薬としてのNCCの有用性を示すものであり、NCCを効率的に誘導させる技術が求められている。
　非特許文献１には、マトリゲル上に播種したヒト多能性幹細胞に対して３日間神経プライミング（Neural Priming）を行った後に、５日間神経堤(NC)誘導工程を行うことで、NCCを誘導できることが記載されている。また、非特許文献２には、ヒト多能性幹細胞を、BMP4、SB431542を含む培地中で７日間接着培養を行うことで、NCCを誘導できること、このようにして誘導したNCCを、CHIR99021、SB431542、SAG、EGF、FGF2およびDMH1を含む培地中で23日間培養することで、外胚葉性軟骨形成細胞（ectodermal chondrogenic cell; ECC）を誘導できることが記載されている。
　本発明者らは以前、多能性幹細胞を、ゼノフリー条件下でSB431542およびCHIR99021を含む培地中で10日間接着培養を行うことでNCCを得た後、該NCCを、SB431542、EGF、およびbFGFを含む培地中で接着細胞を行うことにより、神経細胞への分化能を喪失したNCCを誘導する方法を報告している（非特許文献３）。一方で、本発明者らは、多能性幹細胞から分化誘導したNCCを、1μMを超える濃度のCHIR99021が示す効果と同等の効果を示す濃度のGSK-3β阻害剤を含む培地中で培養することにより、多分化能を保持したNCCを拡大培養することにも成功している（特許文献１）。
国際公開第2019/107485号
Kreitzer F.R. et al., Am J Stem Cells, 2(2):119-131 (2013) Shen L. et al., NPJ Regen Med, 7(1):69 (2022) Kamiya D. et al., NPJ Regen Med, 7(1):47 (2022)
　しかしながら、上記の従来の方法では、多能性幹細胞から神経堤細胞への分化誘導に最短でも７日間要しており、またゼノフリー条件下での誘導では、神経堤細胞の誘導に１０日間要していた。従って、本発明の課題は、多能性幹細胞から、より短期間で、好ましくはゼノフリー条件下で神経堤細胞を誘導できる方法を提供することである。
　本発明者らは、多能性幹細胞から骨オルガノイドの誘導方法の研究を進める中で、浮遊培養に着目した。そこで、最初の工程である多能性幹細胞から神経堤細胞（NCC）への誘導過程において、従来行われていた接着培養ではなく、浮遊培養により多能性幹細胞からNCCを誘導できる方法の探索を行った。鋭意研究を行った結果、多能性幹細胞を、ALK阻害剤および骨形成タンパク質を含む培地中で短期間浮遊培養して円形状の細胞集塊を形成させ、次いでALK阻害剤およびGSK-3β阻害剤を含む培地中で培養を行うことで、ゼノフリー条件下でNCCを安定して高効率で誘導できることを見出した。さらに驚くべきことに、ALK阻害剤および骨形成タンパク質を含む培地中での培養開始からわずか４日間（多能性幹細胞の集塊を形成させる工程を含めても５日間）でNCCを誘導することに成功した。また、培養途中で振とう培養を行うことで、NCCへの誘導効率を向上させること、さらには培養期間を短縮することにも成功した。
　本発明者らは、上述の浮遊培養により得られたNCCの分化能を検証した。その結果、従来のNCCと同様に、末梢神経細胞、メラノブラスト、間葉系幹細胞に分化誘導できること、さらにはこれらの分化誘導効率が非常に高いことを見出した。さらに、浮遊培養により得られたNCCは、第一咽頭弓外胚葉性間葉(PA1-EM)細胞への分化誘導が可能であったが、今までインビトロでNCCからPA1-EM細胞へと分化誘導することに成功した報告はなされておらず、非常に驚くべきことであった。PA1-EM細胞から、骨オルガノイドへの誘導も可能であり、該骨オルガノイドは、生体内に移植することにより、骨欠損部を効率よく修復することも可能であった。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下のとおりのものである。
［１］　多能性幹細胞から神経堤細胞を製造する方法であって、
　（１）多能性幹細胞を、ALK阻害剤および骨形成タンパク質を含む培地中で浮遊培養する工程、ならびに
　（２）ALK阻害剤およびGSK-3β阻害剤を含む培地中で浮遊培養する工程、
を含む、方法。
［２－１］　前記工程（２）が、振とう培養および／または撹拌培養を行う工程を含む、［１］に記載の方法。
［２－２］　前記工程（１）が、振とう培養および／または撹拌培養を行う工程を含む、［１］または［２－１］に記載の方法。
［３－１］　前記工程（１）の培養期間が６時間～５日間である、［１］～［２－２］のいずれか１つに記載の方法。
［３－２］　前記工程（１）の培養期間が６時間～３日間である、［１］～［３－１］のいずれか１つに記載の方法。
［３－３］　前記工程（１）の培養期間が１日間～３日間である、［１］～［３－２］のいずれか１つに記載の方法。
［４－１］　前記工程（２）の培養期間が１日間～６日間である、［１］～［３－３］のいずれか１つに記載の方法。
［４－２］　前記工程（２）の培養期間が１日間～４日間である、［１］～［４－１］のいずれか１つに記載の方法。
［４－３］　前記工程（２）の培養期間が１日間～３日間である、［１］～［４－２］のいずれか１つに記載の方法。
［４－４］　前記工程（１）および（２）の培養期間が２日間～５日間である、［１］～［４－３］のいずれか１つに記載の方法。
［４－５］　前記工程（１）の培養期間が１日間であり、工程（２）の培養期間が３日間である、［１］～［４－４］のいずれか１つに記載の方法。
［５］　前記工程（１）の前に、ROCK阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、［１］～［４－５］のいずれか１つに記載の方法。
［６－１］　前記工程（１）で用いる骨形成タンパク質の少なくとも１つがBMP4、BMP2およびBMP7からなる群から選択される、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［６－２］　前記工程（２）で用いるALK阻害剤の少なくとも１つがSB431542またはA-83-01である、［１］～［６－１］のいずれか１つに記載の方法。
［６－３］　多能性幹細胞が疾患（例えば、骨形成不全症）患者由来である、［１］～［６－２］のいずれか１つに記載の方法。
［７］　前記工程（１）および（２）の少なくともいずれか１つの工程が、ゼノフリー条件下および／またはフィーダーフリー条件下で細胞を培養する工程である、［１］～［６－３］のいずれか１つに記載の方法。
［８－１］　前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［８－２］　多能性幹細胞がヒト由来である、［１］～［８－１］のいずれか１つに記載の方法。
［８－３］　多能性幹細胞が疾患（例えば、骨形成不全症）患者由来である、［８－２］に記載の方法。
［９］　［１］～［８－３］のいずれか１つに記載の方法で得られる神経堤細胞。
［１０］　下記の特徴（Ａ）～（Ｃ）を全て有する神経堤細胞。
　（Ａ） 多能性幹細胞由来である
　（Ｂ） CD271、SOX10、TFAP2AおよびPAX3から選ばれる１以上の遺伝子を発現している
　（Ｃ） 第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞への分化能を有する
［１１－１］　下記の特徴（Ｄ）～（Ｆ）の少なくともいずれかを有する、［１０］に記載の神経堤細胞。
　（Ｄ） メラノブラストへの分化能を有する
　（Ｅ） 神経細胞への分化能を有する
　（Ｆ） 間葉系幹細胞への分化能を有する
［１１－２］　多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１０］または［１１－１］に記載の細胞。
［１１－３］　多能性幹細胞がヒト由来である、［１０］～［１１－２］のいずれか１つに記載の細胞。
［１１－４］　多能性幹細胞が疾患（例えば、骨形成不全症）患者由来である、［１１－３］に記載の細胞。
［１２］　［９］～［１１－４］のいずれか１つに記載の神経堤細胞を分化誘導させる工程を含む、分化細胞またはオルガノイドの製造方法。
［１３］　前記分化細胞が間葉系細胞、神経細胞およびメラノブラストからなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１４］　前記間葉系細胞が間葉系幹細胞、第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞、骨前駆細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、歯原性間葉細胞および平滑筋細胞からなる群から選択される、［１３］に記載の方法。
［１５］　前記オルガノイドが骨オルガノイドである、［１２］に記載の方法。
［１６－１］　骨オルガノイドが顎骨オルガノイドである、［１５］に記載の方法。
［１６－２］　骨オルガノイドが骨疾患（例えば、骨形成不全症）の表現型を示す、［１５］または［１６－１］に記載の方法。
［１７－１］　前記分化誘導させる工程が、エンドセリンおよび線維芽細胞増殖因子を含む培地中で神経堤細胞を培養する工程であって、該培養により得られる分化細胞が第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞である、［１２］に記載の方法。
［１７－２］　前記エンドセリンの少なくとも１つがエンドセリン-1である、［１７－１］に記載の方法。
［１７－３］　前記線維芽細胞増殖因子の少なくとも１つがFGF-8である、［１７－１］または［１７－２］に記載の方法。
［１８－１］　前記培地がさらに骨形成タンパク質を含む、［１７－１］～［１７－３］のいずれか１つに記載の方法。
［１８－２］　骨形成タンパク質の少なくとも１つがBMP4である、［１８－１］に記載の方法。
［１９］　［１２］～［１８－２］のいずれか１つに記載の方法で得られる分化細胞またはオルガノイド。
［２０－１］　下記の特徴（ａ）～（ｃ)を全て有する第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞。
　（ａ） HOXを発現していない神経堤細胞由来である
　（ｂ） DLX5、PRRX1およびTWIST1を発現している
　（ｃ） 上皮シグナルに反応し、パターニングが誘導可能である
［２０－２］　HOXを発現していない神経堤細胞が多能性幹細胞に由来する、［２０－１］に記載の細胞。
［２０－３］　多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［２０－１］または［２０－２］に記載の細胞。
［２０－４］　多能性幹細胞がヒト由来である、［２０－１］～［２０－３］のいずれか１つに記載の細胞。
［２０－５］　多能性幹細胞が疾患（例えば、骨形成不全症）患者由来である、［２０－４］に記載の細胞。
［２１］　［１９］～［２０－５］のいずれか１つに記載の分化細胞またはオルガノイドを含有してなる、移植療法剤。
［２２］　被験物質の存在下または非存在下で、［１９］～［２０－５］のいずれか１つに記載の分化細胞またはオルガノイドを培養する工程を含む、疾患の治療または予防薬のスクリーニング方法。
［２３］　組織の損傷または疾患を治療または予防するための［２１］に記載の移植療法剤。
［２４］　［１９］～［２０－５］のいずれか１つに記載の分化細胞またはオルガノイドの有効量を対象に投与または移植することを含む、組織の損傷または疾患の治療または予防方法。
［２５］　組織の損傷または疾患の治療または予防における使用のための［１９］～［２０－５］のいずれか１つに記載の分化細胞またはオルガノイド。
［２６］　組織の損傷または疾患の治療または予防薬の製造における［１９］～［２０－５］のいずれか１つに記載の分化細胞またはオルガノイドの使用。
　本発明によれば、多能性幹細胞から、短期間かつ高効率で神経堤細胞（NCC）を製造することができる。高効率にNCCを製造できることから、セルソーティングを行うことも必須ではなくなるため、開発費の削減、ひいては臨床応用の際のコストダウンに資する。さらに、本発明により得られたNCCから、神経細胞、メラノブラスト、間葉系幹細胞などの分化細胞を高効率で製造することができるだけでなく、従来報告がなかった第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞を製造することも可能となり、医療、特に口腔外科分野の再生医療に大きく寄与するものである。
iPS細胞からNCC集塊への誘導方法の概要図および培養開始から１日目（D1）、2日目(D2)および5日目(D5)における、細胞集塊の顕微鏡写真。 (A)1231A3 iPS細胞株から3次元条件下で誘導された細胞集塊の顕微鏡写真。直径500μm程度の均一な形態の細胞集塊を誘導することができた。(B)細胞集塊をAccutaseにてシングルセルに分散させ、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率の解析を行った結果。CD271強陽性細胞を高効率に誘導することが可能であった。(C)細胞集塊の蛍光免疫染色の組織像。細胞集塊内部の細胞の大部分はCD271とSOX10陽性のNCCから構成されていた。 iPS細胞播種後からNCC集塊が得られるまでのCD271およびSOX10発現の経時変化。誘導4日目(SB431542（以下、「SB」と略すことがある。）およびCHIR99021（以下、「CHIR」と略すことがある。）を含む培地での培養開始から2日目)から、SOX10およびCD271陽性のNCCが出現し始めた。 従来の2D（接着培養）条件下に誘導されたNCC(非特許文献３)（誘導方法の概要を図の上に示す）と3D誘導NCC集塊（誘導方法の概要を図の中央に示す）のNCC関連遺伝子発現を逆転写定量PCR（RT-qPCR）にて比較した結果。NCC関連遺伝子(NGFR、SOX10、TFAP2A、PAX3)はいずれも同程度の発現を認め、多能性細胞マーカーPOU5F1（Oct4）は消失した。 細胞培養開始から0日目（D0）～5日目（D5）までの各日数における細胞集塊、ならびにCD271強陽性細胞をフローサイトメトリーにて選別した細胞集塊（D5 271Hおよび2D 271H）のNCC関連遺伝子（TFAP2AおよびPAX3）および神経板境界（Neural plate border）マーカー遺伝子（DLX5およびMSX2）の発現レベルをRT-qPCRにて比較した結果。D3において、神経板境界関連マーカーが上昇していること、D5の細胞は、D5 271Hの細胞とほぼ同程度のNCC関連遺伝子を発現していること、ならびに2D 271Hの細胞ともほぼ同程度のNCC関連遺伝子を発現していることが示された。 細胞培養開始から0日目（D0）～5日目（D5）までの各日数における細胞集塊、ならびにCD271強陽性細胞をフローサイトメトリーにて選別した細胞集塊（D5 271Hおよび2D 271H）のNCC関連遺伝子（NGFR、SOX10）および多能性細胞マーカーOct4の発現レベルをRT-qPCRにて比較した結果。D5の細胞は、D5 271Hの細胞はほぼ同程度のNCC関連遺伝子を発現していること、ならびに2D 271Hの細胞ともほぼ同程度のNCC関連遺伝子を発現していることが示された。 BMP4をBMP2もしくはBMP7に変更した場合、またはSB431542を他のTGF-beta/Smad阻害剤であるA-83-01に変更した場合のCD271強陽性細胞率の変化をフローサイトメトリーで確認した(BMP4、BMP2、BMP7: 10ng/ml；SB431542: 10 μM；A-83-01: 1.0 μM)。いずれの条件においても、高効率にCD271強陽性のNCCを誘導することが可能であった。 1231A3株以外のiPS細胞株(Ff-I 14s04株、Ff-I 14s04 HLA-KO株、骨形成不全症患者由来iPS細胞株)からも同様に3次元条件下にNCCが誘導できるか検討した。(A)誘導された細胞集塊の顕微鏡写真。いずれの細胞株においても細胞集塊を得ることができた。(B)フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率の解析を行った結果。いずれの細胞株においてもCD271強陽性細胞を高効率に誘導することが可能であった。(C)細胞集塊の蛍光免疫染色の組織像。細胞集塊内部の細胞の大部分はCD271とSOX10陽性のNCCから構成されていた。 従来法(2D NCC誘導法)において、接着培養と浮遊培養との相違点以外は3D NCC誘導法と同じ条件下で培養を行った。その結果、2D NCC誘導法では、CD271高発現細胞がほとんど誘導されないことが示された（上）。また、上述の3D NCC誘導法において、振とう培養を行うことで、NCCの誘導効率が向上することが示された（下）。 SBおよびBMP4の至適作用期間を探索するため、作用工程（以下、「SBおよびBMPの作用工程」）期間を変動させ、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率を測定した(振とう培養の期間は固定)。(A)SBおよびBMP4の作用時間を1日間とした場合、高効率にNCCが誘導された。(B)SBおよびBMP4を作用させなかった場合、CD271強陽性細胞率の明らかな低下が認められた。SBおよびBMP4の作用時間を延長した場合、CD271強陽性細胞率の低下が認められた。 図１０の各条件に対して、CD271(NCC)、PAX6(神経外胚葉)、E-Cadherin(上皮細胞)の蛍光免疫染色を行った。(A)SBおよびBMP4の作用時間を1日間とした場合、高効率にCD271強陽性のNCCが誘導され、PAX6とE-Cadherin陽性の細胞は誘導されなかった。(B)SBおよびBMP4を作用させなかった場合、PAX6陽性の神経外胚葉の誘導が認められた。(C)SBおよびBMP4の作用時間を延長した場合、細胞集塊周囲にE-Cadherin陽性の上皮細胞の誘導が認められた。 SBおよびBMP4の作用時間を変動させてNCC誘導を行った場合の各誘導方法の概要図。振とう培養は、NCC誘導工程の最初から行った。 図１２の各条件に対し、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率を測定した結果。SBおよびBMP4の作用を6時間（SB BMP4 6h）または12時間（SB BMP4 12h）行った後、5日目にフローサイトメトリーにより検証した場合には、SBおよびBMP4の作用時間を1日間とした場合（SB BMP4 D1）と比較して、NCC誘導効率が低下することが示された。 図１２の各条件に対し、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率を測定した結果。SBおよびBMP4の作用を2日間（SB BMP4 D2）または3日間（SB BMP4 D3）行った後、5日目にフローサイトメトリーにより検証した場合には、いずれもNCC誘導効果が高いことが示された。一方で、SBおよびBMP4を作用させずに5日目にフローサイトメトリーにより検証した場合には、NCC誘導効果が低いことが示された。 図１２の各条件に対し、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率を測定した結果。SBおよびBMP4の作用を6時間（SB BMP4 6h）、12時間（SB BMP4 12h）、1日間（SB BMP4 D1）、2日間（SB BMP4 D2）、3日間（SB BMP4 D3）、4日間（SB BMP4 D4）または7日間（SB BMP4 D6）行った後、7日目にフローサイトメトリーにより検証した場合には、いずれの方法においても、5日目に検証した場合と比較して、細胞集団全体のCD271発現が低下することが示された。 図１２の各条件に対し、NGFRの発現レベルをRT-qPCRで測定した結果。RT-qPCRの結果からも、培養5日目を過ぎると、NGFR(CD271)の発現レベルが低下することが示された。 SBおよびBMP4の作用時間に関して、NCC誘導効率の点から好ましい方法のパターン。 SBおよびCHIRの作用時間を延長した場合のCD271強陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。全体の培養期間を延長すると、CD271強陽性細胞率が時間依存的に低下した。 振とう培養をSB431542およびBMP4の作用期間の最初から行った場合の各誘導方法の概要図。 図１２の各条件に対し、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率を測定した結果。SBおよびBMP4の作用工程の開始から振とう培養をすると、SBおよびBMP4の作用時間が6時間の場合（SB BMP4 6h）および12時間の場合（SB BMP4 12h）いずれも、5日目にNCCを誘導することができたが、12時間の場合は、SBおよびBMP4の作用時間が1日間の場合（SB BMP4 D1）と同程度の高効率なNCCへの誘導が示された。 図１２の各条件に対し、免疫染色による、CD271(NCCマーカー)およびE-Cadherin(上皮細胞マーカー)の各遺伝子の発現パターンの検証結果。SBおよびBMP4の作用時間が1日間または2日間であった場合には、5日目に細胞集塊の周囲に上皮細胞が認められた。 図１２の各条件に対し、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率を測定した結果。NCC誘導工程を7日間または10日間に延長した場合には、いずれもCD271強陽性細胞率が低下することが示された。 SBおよびBMP4の作用工程開始時から振とう培養を行った場合に、NCC誘導効率の点から好ましい方法の概要図。 3D NCC誘導法により得られたNCCの各細胞への分化誘導の概要図。 3D NCC誘導法により得られたNCCから末梢神経細胞への誘導方法（A）およびメラノブラストへの誘導方法(B)の概要図。 NCC集塊から抹消神経細胞誘導とメラノブラスト誘導を行い、蛍光免疫染色にて分化の確認を行った。(A)NCC集塊から抹消神経細胞の誘導を行った。Peripherin陽性の抹消神経細胞が高効率に誘導された。(B)NCC集塊からメラノブラストの誘導を行った。MITF陽性のメラノブラストが高効率に誘導された。 3D NCC誘導法により得られたNCCから間葉系幹細胞への誘導方法の概要図。 NCC集塊をAccutaseを用いて分散させ、培養プレートに播種後、MSCの誘導を行った。MSCマーカーのCD105、CD90、CD73およびCD44はいずれも高発現を示した。 第一咽頭弓外胚葉性間葉（First pharyngeal arch ectomesenchyme; PA1-EM)細胞の特徴の概要図。 3D NCC誘導法により得られたNCC集塊について、RT-qPCRにてHOX遺伝子発現を確認した。ポジティブコントロールとして、レチノイン酸(Retinoic acid, RA)刺激を行うことで、HOX遺伝子発現を誘導したNCC集塊を用意した。(A)HOX遺伝子陽性NCC集塊の誘導方法。誘導4日目から1.0μM RAを添加した。(B)NCC関連遺伝子(NGFR、SOX10)の発現をRT-qPCRで確認した。RA刺激を行ってもNCC関連遺伝子の発現量は同等であった。(C)HOX遺伝子(HOXA2、HOXA3)の発現をRT-qPCRで確認した。RA刺激を行ったNCC集塊はHOX遺伝子を高発現したのに対して、未刺激のNCC集塊ではHOX遺伝子の発現は認められなかった。 3D NCC誘導法により得られたNCCからPA1-EM細胞への誘導方法の概要図。 NCC集塊からPA1-EM細胞の誘導を行い、TWIST1とDLX5の蛍光免疫染色にてPA1-EM細胞の誘導を確認した。(A)NCC集塊と誘導されたPA1-EM細胞集塊の顕微鏡画像。内部の細胞が増殖することで、集塊のサイズが大きくなった。(B)SOX10とTWIST1の蛍光免疫染色像。PA1-EM細胞誘導によってSOX10発現の明らかな現象が認められ、TWIST1陽性の外胚葉性間葉に分化していることが確認された。(C)DLX5の蛍光免疫染色像。誘導された外胚葉性間葉はDLX5を高発現しており、PA1-EMの遺伝子的特徴を再現していた。 骨形成不全症患者iPS細胞株からPA1-EM細胞への誘導を行い、DLX5の蛍光染色にてPA1-EM細胞の誘導を確認した。 HOX（-） NCC(「-」および「-」は陰性を示す。以下同様。)およびHOX（+） NCC(「+」および「+」は陽性を示す。以下同様。)の誘導方法の概要図（上）。各誘導方法により得られたPA1-EM細胞において、HOXB2およびDLX5の発現をRT-qPCRにより確認した。HOX（+） NCCを用いてPA1-EM細胞誘導を行った細胞では、DLX5の発現の上昇は認められなかった（下）。 2D NCC誘導法により得られたNCCから、PA1-EM細胞の誘導方法の概要図。得られた細胞では、PRRX1の発現が著しく低く、DLX5の発現も低いことが示された。 PA1-EM細胞誘導におけるFgf8、Edn-1およびBMP4のベストな組み合わせを検証するための誘導法の概要図。 図３６の各条件に対し、DLX、PRRX1およびTWIST1の発現レベルをRT-qPCRで測定した結果。DLX5の発現にはEdn-1が必須であること、DLX5、PRRX1、TWIST1の発現レベルから、Fgf8、Edn-1およびBMP4をすべて培地に加える条件がPA1-EM細胞誘導の最適な条件であることが示された。 PA1-EM細胞から近位-口腔側（大臼歯形成領域)細胞への誘導方法（上）および遠位-反口腔側（顎骨骨化起始領域）細胞への誘導方法(下)の概要図。 誘導されたDLX5およびTWIST1陽性のPA1-EM細胞に第一咽頭弓の上皮シグナルを反応させることで、第一咽頭弓のパターニングを再現し、各領域に特徴的な遺伝子パターンを誘導することができるか検討した。(A)第一咽頭弓の上皮シグナルの配置と、近位-口腔側と遠位-反口腔側に誘導される遺伝位パターン。(B)近位-口腔側への誘導によってPAX9およびLHX8を高発現した。(C)遠位-反口腔側への誘導によってGSCおよびMSX2を高発現した。 遠位-反口腔側細胞から顎骨様組織への誘導方法の概要図。 遠位-反口腔側細胞に誘導したPA1-EM細胞集塊に骨分化誘導を施すことで、骨前駆細胞を誘導した。(A)骨前駆細胞マーカーのSP7、RUNX2およびDLX5の発現上昇が確認された。(B)この誘導段階では早期骨芽細胞マーカーALPLと未熟骨細胞マーカーのE11/gp38に発現上昇は確認されなかった。 図４１の誘導に続いて、2段階の骨分化誘導を行った。骨前駆細胞マーカーのSP7、RUNX2およびDLX5のさらなる発現上昇が確認された。 図４１の誘導に続いて、2段階の骨分化誘導を行った。骨芽細胞マーカーのALPLと骨細胞マーカーのE11/gp38、DMP1、PHEXおよびSOSTの明らかな発現上昇が確認された。 上述の骨分化誘導で得られた顎骨様組織の組織像。(A)非脱灰切片のアリザリンレッド染色像。アリザリンレッドにて染色されるミネラルの沈着が確認された。(B)脱灰切片のHE染色像。細胞集塊内部にエオジン好染色性の骨基質と周囲を取り囲む骨芽細胞様細胞、骨基質内に埋まった骨細胞様細胞からなる顎骨様組織が確認された。(C)骨基質内に埋まった骨細胞様細胞のF-actinの免疫染色像。骨細胞様細胞は骨基質内で周囲の細胞と3次元的なネットワークを形成していた。 図４４のヒト顎骨様組織を免疫不全動物であるNSGマウスの下顎の右側顎角部下顎枝に形成した1.6mm骨欠損に移植し、移植直後、1週、2週、3週、4週でマイクロCT撮影を行い、顎骨様組織の顎骨再生効果を検討した。顎骨様組織を移植したものでは、移植後3週の早期にて、ミネラルの沈着による欠損部の封鎖が確認された。 3D培養したiPSCからHOX陰性NCCへの効率的な誘導。a；胚の前後軸に沿った頭部神経堤細胞（NCC）の領域指定(regional specification)を示す概略図。PA1-3、咽頭弓1-3。b；三次元(3D)培養系におけるiPSCからNCCへの分化戦略。d0-5、0～5日目。Y、Y-27632；SB、SB431542(TGF-β阻害剤)；CHIR、CHIR99021(GSK-3β阻害剤)。c；最適化培養における1、2、および5日目の1231A3凝集塊の明視野画像。スケールバー：100 μm。d；5日目の凝集塊の連続切片におけるSOX10およびCD271、ならびにTFAP2Aについての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。破線のボックスを右側に拡大した。生物学的に独立した11回の実験からのn=34。スケールバー、100 μm。e；5日目の凝集塊におけるNCCマーカー（CD271）発現のフローサイトメトリー分析（濃い灰色）。アイソタイプコントロールを淡い灰色で表示した。結果を平均 ± 標準誤差として表示した。6回の生物学的に独立した実験。f；5日目の凝集塊におけるTFAP2AおよびE-カドヘリン（ECAD、白色）、PAX6、ならびにOCT3/4についての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。スケールバー、100 μm。g；リアルタイム定量的PCR（RT-qPCR）分析によるNCCマーカー（SOX10、NGFR、TFAP2A、RHOB、PAX3）および多能性幹細胞マーカー（POU5F1）の遺伝子発現分析。GAPDHを参照コントロールとして使用して遺伝子発現レベルを定量化し、iPSC(d0)、5日目の凝集塊(d5)、5日目の凝集塊から選別したCD271high+ NCC(d5 271H)、および従来の2次元(2D)プロトコルから選別したCD271high+ NCC(2D 271H)の間で比較した遺伝子発現レベル。データはd0の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。h、i；末梢神経細胞誘導後の凝集塊におけるペリフェリン（PRPH）およびクラスIII β-チューブリン（TUBB3）（h）、およびメラノブラスト誘導後の凝集塊におけるMITFについての免疫蛍光染色（i）。核はDAPIで染色した。破線のボックスを右側に拡大した。拡大画像は、15の共焦点光学セクション(ステップサイズ、0.5 μm)のZスタック投影を表す(h)。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、100 μm。j、k；RT-qPCRによるNCCマーカー（NGFR、SOX10）（j）およびHOX遺伝子（HOXA1、HOXA2、HOXB2、HOXA3）（k）の遺伝子発現解析。遺伝子発現レベルを、参照コントロールとしてGAPDHを使用して定量化し、iPSC(d0)、5日目の凝集塊(d5)、およびレチノイン酸(RA)で処理した5日目の凝集塊(RA+ d5)間で比較した。データはiPSC(d0)の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。g、j、k；一元配置分散分析(one-way ANOVA)による、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。N.D、未定。ns、有意差なし。c～f、h、i；代表的なデータを示す。 3D培養におけるNCC誘導効率に対するBMP4処理期間の影響。a、d：NCC誘導効率に対するBMP4処理期間の影響を試験する実験の概要。凝集塊を、BMP4なし(-)(a)またはBMP4ありで2日間処理した(d)。SB、SB431542；CHIR、CHIR99021。b、e；5日目の凝集塊におけるNCCマーカー（CD271）発現のフローサイトメトリー分析（濃い灰色）。アイソタイプコントロールを淡い灰色で表示した。BMP4非存在(-)では、CD271high+ 細胞集団が減少した(b)。c、f；5日目の凝集塊におけるPAX6、ECAD（白色）、およびCD271の明視野画像および免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。BMP4非存在(-)では、CD271high+ NCCだけでなく、望ましくないPAX6+ 神経外胚葉も誘導された(c)。反対に、BMP4（2日間）条件では、凝集塊の表面にE-カドヘリン(ECAD)+ 細胞が誘導された（f）。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、100 μm。b、c、e、f；代表的なデータを示す。 さまざまなiPSC株からNCCへの高効率な誘導。A；さまざまなiPSC株(Ff-14s04、ヒト白血球抗原(HLA)-A、BおよびCIITA遺伝子がノックアウトされたFf-14s04(HLA-KO Ff-I 14s04)、Ff-I 01s04、骨形成不全症(OI)患者由来のiPSC(OI-iPSC)、ならびに変異がレスキューされたOI-iPSC(resOI-iPSC)))から作製した凝集塊におけるSOX10、CD271、およびPAX6についての三色免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。代表的なデータを示す。スケールバー、100 μm。b；5日目の凝集塊におけるNCCマーカー（CD271）のフローサイトメトリー分析。結果を平均 ± 標準誤差として表示した(6回の生物学的に独立した実験)。 外胚葉系列を経由したiPSCからNCCへの段階的分化。a；1231A3 iPSC（d0）、1～5日目の凝集塊、5日目の凝集塊から選別されたCD271high+ NCC（d5 271H）、および従来の二次元（2D）プロトコルから選別されたCD271high+ NCC（2D 271H）（非特許文献３)のRNA-seq分析。ヒートマップは、多能性幹細胞(PSC)マーカー、外胚葉系列(神経外胚葉(NE)、神経板境界(NPB)、神経堤細胞(NCC)、および表皮外胚葉(SE))マーカー、原条(PS)マーカー、前体節中胚葉(PSM)マーカー、側板中胚葉(LPM)マーカー、および内胚葉(END)マーカーの遺伝子発現レベルを示す。log2(Transcripts Per Million (TPM) + 1)の値を遺伝子発現の評価に使用した。b；1～5日目の凝集塊におけるSOX10およびCD271についての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。代表的なデータを示す。スケールバー、100 μm。 NCC集塊からMSCへの誘導。a；間葉系幹/間質細胞（MSC）の分化戦略。b；MSC誘導（PN2）における細胞の明視野画像。スケールバー、200 μm。c；MSC誘導（PN2）における細胞のMSC関連表面マーカーのフローサイトメトリー分析。MSC誘導(PN2)(濃い灰色)とアイソタイプコントロール(薄い灰色)。MSC誘導(PN2)における細胞は、CD105、CD90、CD73、CD44、およびCD29が陽性であり、CD45、CD34、およびHLA-DRが陰性であった(3回の生物学的に独立した実験)。d；MSCの分化特性。骨形成系統、軟骨形成系統、脂肪生成系統への分化は、それぞれアリザリンレッド、アルシアンブルー、オイルレッドO染色によって確認した(2回の生物学的に独立した実験)。スケールバー、100 μm。b～d；代表的なデータを示す。 iPSCからHOX陽性NCC集塊の誘導。a；後方（posterior）PAに定着するHOX陽性NCCの概略モデル。b；HOX陽性NCCの分化戦略。c；RA処理5日目凝集塊（RA+ d5）におけるSOX10、CD271、およびPAX6についての三色免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。代表的なデータを示す。スケールバー、100 μm。RA+ d5における多数の細胞がCD271+SOX10+ NCCに分化した。d；1231A3 iPSC（d0）、RAで処理していない5日目の凝集塊（d5）、5日目の凝集塊から選別されたCD271high+ NCC（d5 271H）、およびRA+ d5のRNA-seq分析における、領域マーカーである、前脳（FB）遺伝子、中脳（MB）遺伝子、中脳後脳境界（MHB）遺伝子、後脳（HB）遺伝子、および脊髄（SC）遺伝子、の発現レベルを示すヒートマップ。 HOX陰性NCC集塊のmdEMへの指向性分化。a；胚の近位-遠位（P-D）軸に沿ったNCC由来の咽頭弓外胚葉性間葉の領域指定を示す概略モデル。mdEM、下顎突起外胚葉性間葉（mandibular prominence ectomesenchyme）。b；RT-qPCRによる共通のPA1外胚葉性間葉マーカー（DLX1、DLX2）、mdEMマーカー（DLX5、DLX3、GSC）、および遠位領域マーカー（HAND2）の遺伝子発現解析。遺伝子発現レベルは、参照コントロールとしてGAPDHを使用して定量化し、1231A3 iPSC(d0)、5日目のNCC集塊(d5)、ならびにFGF8、エンドセリン-1(EDN1)、およびBMP4の組み合わせで4日間処理したd5（d9）間で比較した。データはd0の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。c；NCC集塊からmdEMへの分化戦略。d；d5（上パネル）およびFEDB（FGF8、EDN1、およびBMP4の組み合わせ）で4日間処理したd5（d5+FEDB）（下パネル）における明視野画像、ならびにSOX10およびTWIST1についての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、100 μm。e；d5およびd5+FEDBのファロイジン染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、50 μm。f；d5+FEDBにおけるDLX2、DLX5、およびHAND2についての三色免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。下のパネルは、上のパネルの白い破線のボックスの拡大図を示す。8回の生物学的に独立した実験からのn = 15。白い点線の円、DLX5が弱く、HAND2が陰性の領域。白色の点線、HAND2陰性領域。スケールバー、100 μm。g；P-D軸に沿った胚のPA1および誘導されたmdEMの領域指定を示す概略モデル。h；上顎突起外胚葉性間葉（mxEM; mandibular prominence ectomesenchyme）およびmdEMの分岐に対するEDN1シグナルの影響を調べるための戦略を示す概略モデル。i；FGF8およびBQ-123で7日間処理した5日目（d5+FQ）におけるSOX10およびTWIST1についての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。スケールバー、100 μm。j、k；RT-qPCRによるmdEMマーカー（DLX5）（j）およびmxEMマーカー（POU3F3、CYP26A1）（k）の遺伝子発現分析。参照コントロールとしてGAPDHを使用して遺伝子発現レベルを定量化し、d0、d5、d5+FEDB、およびd5+FQ間で比較した。データはd0(j)またはd5(k)の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。l；mdEM分化における初期のA-P同一性の重要性を調べるための戦略を示す概略モデル。m：FEDBで4日間処理したRA+ d5におけるSOX10およびTWIST1についての免疫蛍光染色（RA+ d5+FEDB）。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。スケールバー、100 μm。n；mdEMマーカー(DLX5)およびHOX遺伝子(HOXB2、HOXB4)の遺伝子発現解析。参照コントロールとしてGAPDHを使用して遺伝子発現レベルを定量化し、d5、d5+FEDB、RA+ d5、およびRA+ d5+FEDB間で比較した。データはd5の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。b、j、k、n；一元配置ANOVAによる、*P < 0.05、***P < 0.001。ns、有意差なし。d～f、i、m；代表的なデータを示す。 RT-qPCRによるNCCマーカー（SOX10）および初期咽頭弓間葉マーカー（TWIST1、PRRX1）の遺伝子発現解析。遺伝子発現レベルを、参照コントロールとしてGAPDHを使用して定量化し、1231A3 iPSC(d0)、5日目のNCC集塊(d5)、およびFGF8、エンドセリン-1(EDN1)、およびBMP4の組み合わせで4日間処理したd5(d9)間で比較した。データはiPSC(d0)の値を1.0として正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。一元配置ANOVAによる、***P < 0.001。 NCC集塊からmdEMへの選択的誘導。a～c；1231A3 iPSC（d0）、NCC集塊（d5）、およびmdEM（d9）のRNA-seq分析。多能性幹細胞(PSC)マーカー、神経堤細胞(NCC)マーカー、パン-外胚葉性間葉(pan-ectomesenchyme)(EM)マーカー、下顎外胚葉性間葉組織(mdEM)マーカー、および上顎外胚葉性間葉組織(mxEM)マーカー；メラノサイトマーカー、グリアマーカー、感覚神経細胞マーカー、および自律神経細胞マーカー(b)；HOX遺伝子(c)の遺伝子発現レベルを示すヒートマップ(a)。log2(Transcripts Per Million（TPM) + 1)の値を遺伝子発現の評価に使用した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。 mdEMは、下顎突起における遠位キャップ（distal cap）と近位口腔側ドメイン（proximal-oral domain）の領域パターニング（regional patterning）を再現する。a、b；下顎突起における主要な咽頭上皮シグナル（a）およびmdEMの領域パターニング（b）の概略図。点線は冠状断面に相当する。c；mdEMから遠位キャップおよび近位口腔側ドメインを誘導するための戦略。LDN、LDN193189。d、e、f；1231A3 mdEM（d9、上のパネル）、および遠位キャップ（d13、中央のパネル）または近位口腔側ドメイン（d13、下のパネル）への誘導後の凝集塊における、明視野画像、ならびにDLX5（d）、HAND1およびGATA3（e）、HAND2（e）、FOXF1およびPITX1（f）についての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、100 μm。dでは、破線のボックスを右側に拡大した。g；RT-qPCRによる、遠位キャップマーカー（HAND1）、遠位領域マーカー（HAND2、GATA3、DKK1）、近位口腔側ドメイン関連遺伝子（FOXF1、PITX1、GBX2、BARX1）の遺伝子発現分析。参照コントロールとしてGAPDHを使用して遺伝子発現レベルを定量化し、d5、d9、およびd13(遠位キャップまたは近位口腔側ドメイン)凝集塊間で比較した。データはd5の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。一元配置一元配置ANOVAによる、*P < 0.05、***P < 0.001。ns、有意差なし。d～f；代表的なデータを示す。 遠位キャップおよび近位口腔側（臼歯）ドメイン誘導のための最適化プロトコルの研究。a；RT-qPCRによる、遠位キャップマーカー（HAND1）および他の遠位領域マーカー（HAND2、GATA3、DKK1）の遺伝子発現解析。参照コントロールとしてGAPDHを使用して遺伝子発現レベルを定量化し、1231A3 NCC集塊(d5)、mdEM(d9)、およびFGF8(20および100 ng/ml)またはFGF2(20 ng/ml)、EDN1(50 nM)、およびBMP4(2.5および25 ng/ml)のさまざまな組み合わせで4日間培養したmdEM(d13)間で比較した。データはiPSC(d0)の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。b；5日目から9日目まで、FGF8またはFGF2(20 ng/ml)、EDN1(50 nM)、およびBMP4(25 ng/ml)を用いて培養したmdEMの細胞生存率分析。生細胞および死細胞を、LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kitを使用して区別した。TUNEL染色によりアポトーシス細胞を検出した。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。代表的なデータを示す。スケールバー、100 μm。c；近位口腔側（臼歯）ドメイン関連マーカー（FOXF1、GLI1、PITX1、GBX2、BARX1、PAX9、LHX6）の遺伝子発現解析。遺伝子発現レベルを、参照コントロールとしてGAPDHを使用して定量し、NCC集塊(d5)、mdEM(d9)、およびFGF8(100 ng/ml)、SAG(400 nM)、BQ-123(BQ)(10 μM)、LDN193189(LDN)(500 nM)、EDN1(50 nM)、およびBMP4（2.5 ng/ml）のさまざまな組み合わせで4日間培養したmdEM(d13)間で比較した。データはiPSC(d0)の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。a、c；一元配置ANOVAによる、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。 ns、有意差なし。 mdEMは、下顎突起の領域パターニングを再現する。1231A3 iPSC由来のNCC集塊(d5)、mdEM(d9)、遠位キャップ(d13)、および近位口腔側ドメイン(d13)のRNA-seq分析。外胚葉性間葉(EM)、mdEM、反口側ドメイン（aboral domain）、遠位ドメイン、口腔側ドメイン、近位ドメイン、歯間葉(dental mesenchyme)マーカーの遺伝子発現レベルを視覚化したヒートマップ。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。遺伝子発現レベルの評価に使用されるZスコア。 近位口腔側ドメインのmdEMから歯間葉の誘導。a；歯間葉誘導後17日目の凝集塊における、明視野画像ならびにTFAP2BおよびLHX6、TFAP2AおよびPAX9についての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。破線のボックスは右に拡大した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。代表的なデータを示す。スケールバー、100 μm。b；NCC集塊（d5）および歯間葉（d17）のRNA-seq分析。遺伝子セットのエンリッチメント解析（Gene-Set Enrichment Analysis）(GSEA)。生物学的プロセスのGO用語に基づく上位15の濃縮された(活性化されたおよび抑制された)経路を示す。事前にランク付けした遺伝子リストは、-log10(adj. p値)に倍率変化の方向（direction of the fold-change）を乗算することによって作成した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。NES、正規化されたエンリッチメントスコア。 顎骨様オルガノイドの作製と特性評価。a；mdEMから顎骨様オルガノイドへの段階的誘導戦略。β-gly、β-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物；AA、アスコルビン酸 2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物；DEX、デキサメタゾン。b；1231A3由来のd38クラスターの画像。スケールバー、1.0 mm。c；骨形成誘導中のクラスターにおけるアルカリホスファターゼ（ALP）活性とカルシウム含有量のモニタリング。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。d；d38クラスターの連続切片におけるアリザリンレッドおよびフォンコッサ染色。破線のボックスを右側に拡大した（アリザリンレッド、n = 12；フォンコッサ、n = 6（3回の生物学的に独立した実験より）)。スケールバー、100 μm。e；RT-qPCRによる成熟骨細胞マーカー（SOST）の遺伝子発現解析。遺伝子発現レベルを、参照コントロールとして18s rRNAを使用して定量化し、骨形成誘導中にクラスター間で比較した。データはd9の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。f；d38クラスター(脱灰標本)の連続切片におけるヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色、およびアザン（Azan）染色。12回の生物学的に独立した実験からのn = 52。スケールバー、100 μm。g；d38の組織（脱灰標本）におけるCOLI、OCN、およびOPNの三色免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 9。スケールバー、100 μm。h～k；d38の組織（脱灰標本）におけるSP7およびALPL（h）、PDPN（i）、PHEX（j）、SOST（k）の免疫蛍光染色。核およびF-アクチンはそれぞれDAPIとファロイジンで染色した。画像は、40個の共焦点光学セクション(ステップサイズ、0.5 μm)のZスタック投影を表す(i-k)。h、n = 6；i、n = 12；j、n = 6；k、n = 6(4回の生物学的に独立した実験から)。スケールバー、25 μm。l；作製した顎骨様オルガノイドの概略モデル。m；顎骨様オルガノイド移植後4週間のNSGマウスの腎臓の画像。n；移植後4週間の腎領域の3D再構成マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)画像。破線の円は、異所性の石灰化組織を示す。スケールバー、1.0 mm。n = 6。o；移植組織の連続切片におけるHE染色およびアザン（脱灰標本）染色。n = 6。 スケールバー、100 μm。p；移植組織（脱灰標本）におけるヒトビメンチンについての免疫蛍光染色。核およびF-アクチンはそれぞれDAPIとファロイジンで染色した。画像は、40個の共焦点光学セクションのZスタック投影を表す(ステップサイズ、0.5 μm)。n = 6。スケールバー、25 μm。c、e；一元配置ANOVAによる、*P < 0.05、***P < 0.001。ns、有意差なし。b、d、f-k、m-p；代表的なデータを示す。 mdEMから骨形成系統への指向性分化。a；RT-qPCRによる、骨基質タンパク質（COLIA1、OPN、IBSP）、骨芽細胞マーカー（SP7、RUNX2、ALP、DLX5）、初期骨細胞マーカー（CAPG、PDPN、DMP1、PHEX）、および成熟骨細胞マーカー（MEPE、TNFSF11、MMP13）の遺伝子発現解析。遺伝子発現レベルを、参照コントロールとして18s rRNAを使用して定量化し、1231A3 iPSC由来のmdEM(d9)および骨形成誘導の各時点間で比較した。データはd9の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差を表す。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。一元配置ANOVAによる、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。ns、有意差なし。b～d；1231A3 NCC集塊（d5）、mdEM（d9）、および38日目のクラスター（d38）のRNA-seq分析。骨基質タンパク質、骨芽細胞、初期骨細胞、成熟骨細胞(b)；軟骨形成マーカー(c)；およびHOX遺伝子(d)の遺伝子発現レベルを視覚化したヒートマップ。log2(TPM + 1)の値を使用して遺伝子発現レベルを評価した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 2。 mdEMは徐々に骨基質（骨マトリックス）を生成し、骨形成細胞に分化する。a；1231A3 iPSC由来のmdEM（d9）および骨形成誘導の各時点における、COLIについての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。スケールバー、100 μm。b；mdEMおよび38日目のクラスターにおける、サフラニンO/ファストグリーン染色およびCOLXについての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。軟骨形成誘導後の凝集塊は、サフラニンOおよびCOLX発現のポジティブコントロールとして機能した。c、d；mdEMおよび骨形成誘導の各時点における、SP7（c）、PDPNおよびPHEX（d）についての免疫蛍光染色。Fアクチンはファロイジンで染色した(d)。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。a～d；代表的なデータを示す。スケールバー。 100 μm(a-c)、25 μm(d)。 mdEMを経由した複数のiPSC株からのmdEMおよび顎骨様オルガノイドの作製。a～c；Ff-1 14s04 iPSC(a)、HLA-KO Ff-I 14s04 iPSC(b)、およびFf-I 01s04 (c) iPSCから作製したmdEMおよび顎骨様オルガノイドにおける、HE染色ならびにDLX2、DLX5、およびHAND2についての三色免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。 破線のボックスを右側に拡大した。代表的なデータを示す。スケールバー、100 μm。 顎骨様オルガノイドは、ヒトの骨基質タンパク質から構成される骨組織を形成する。a；NSGマウス腎被膜下に形成された骨様組織における、フォンコッサ染色、HE染色、アザン染色、およびサフラニンO/ファストグリーン染色およびCD31についての免疫蛍光染色（n = 6）。核はDAPIで染色した。スケールバー、50 μm(CD31)、200 μm(その他)。b；骨様組織におけるヒト骨基質タンパク質（ヒトCOLI、OCN、OPN）についての三色免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。n = 6。a、b；代表的なデータを示す。スケールバー、200 μm。 顎骨様オルガノイドの移植は顎骨の形成を促進する。a；NSGマウスの下顎骨欠損への顎骨様オルガノイド(d38)移植の概略図。b；移植片を有さない、または3つの顎骨様オルガノイドを有する下顎骨欠損を示す画像。点線は下顎骨の境界を示す。c；移植後4週間の下顎骨欠損の単一断面および3D再構成マイクロCT画像。n = 8。スケールバー、1.0 mm。d；移植後４週間の欠損部において新たに形成された石灰化組織の体積の定量化。n = 8。両側スチューデントt検定による***P < 0.001。e-g；移植後4週間の移植組織の連続切片(脱灰標本)における、HE染色(e)、アザン染色(e)、ならびにヒトCOLI、OCN、OPN(f)、およびヒトビメンチン(g)についての三色免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した(f、g)。n = 8。破線のボックスを右側に拡大した(e、g)。黒い矢印は欠陥のへりを示す(e)。白色と淡い灰色の矢印は、それぞれドナーのヒト細胞と宿主のマウス細胞を示す(g)。スケールバー、200 μm（e、f）、100 μm（g）。h；移植組織（脱灰標本）におけるヒトビメンチンについての免疫蛍光染色。核とF-アクチンはそれぞれDAPIとファロイジンで染色した。n = 6。画像は、40個の共焦点光学セクションのZスタック投影を表す(ステップサイズ、0.5 μm)。スケールバー、50 μm。i；移植組織における酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色。n = 6。スケールバー、100μm。b、c、e～i；代表的なデータを示す。 移植された顎骨様オルガノイドによる顎骨の再生。移植片を有さない顎骨（左パネル）および顎骨様オルガノイド移植を行った顎骨（右パネル）の個々のマイクロCTスキャン画像。n = 8/グループ。 NSGマウス腎被膜下に形成されたOI-iPSC由来のmdEMおよび骨組織の特性評価。a；OI-iPSCおよびresOI-iPSC由来のmdEM(d9)における、DLX2、DLX5、およびHAND2についての三色免疫蛍光染色。スケールバー、100 μm。b；NSGマウスの腎被膜下に形成されたOI-iPSCおよびresOI-iPSC由来の骨組織におけるフォンコッサ染色およびサフラニンO/ファストグリーン染色、ならびにヒトCOLIおよびヒトOPNについての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。n = 3。スケールバー、200 μm。a、b；代表的なデータを示す。 骨形成不全症（OI）の疾患表現型の再現。a；3日間の骨形成誘導後のOI-iPSCおよびresOI-iPSC由来の凝集塊におけるCOLIおよびコラーゲンハイブリダイジングペプチド（Collagen Hybridizing Peptide）（CHP）についての免疫蛍光染色。核はDAPIで染色した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、25 μm。b；d38のOI-顎骨様オルガノイドおよびresOI-顎骨様オルガノイド（脱灰標本）の連続切片におけるHE染色およびアザン染色。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、100 μm。c；OI-オルガノイドおよびresOI-オルガノイド（脱灰標本）のファロイジン染色。核はDAPIで染色した。画像は、40個の共焦点光学セクションのZスタック投影を表す(ステップサイズ、0.5 μm)。破線のボックスを右側に拡大した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、25 μm。d；OI-オルガノイドまたはresOI-オルガノイド移植後4週間のNSGマウスの腎臓領域における異所性石灰化組織の3D再構成マイクロCT画像。e；移植組織（脱灰標本）のHE染色およびアザン染色。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。スケールバー、100 μm。f；OI-オルガノイドおよびresOI-オルガノイド移植群における石灰化組織の体積および組織ミネラル密度(TMD)の定量化。g；骨細胞およびアザンレッド染色領域の定量化。h；OI-オルガノイドおよびresOI-オルガノイド移植群における移植組織のTUNEL染色（脱灰標本）。n = 6。破線のボックスを拡大したものを次に示す。スケールバー、50 μm。i；移植組織(脱灰標本)におけるヒトビメンチンについての免疫蛍光染色。核とF-アクチンはそれぞれDAPIとファロイジンで染色した。画像は、40個の共焦点光学セクションのZスタック投影を表す(ステップサイズ、0.5 μm)。n = 6。スケールバー、25 μm。j；TUNEL陽性アポトーシス細胞の定量化。k；骨細胞樹状突起数の定量分析。f、g、j、k；両側スチューデントt検定による、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。a～e、h、i；代表的なデータを示す。 NCCからmdEMへの分化。a；2D培養NCCからmdEMへの誘導戦略の概略図。b；RT-qPCRによる、初期間葉マーカー（TWIST1、PRRX1）およびmdEMマーカー（DLX5、HAND2）の遺伝子発現解析。参照コントロールとしてGAPDHを使用して遺伝子発現レベルを定量化し、1231A3 iPSC由来の5日目のNCC集塊(d5)、FEDBで処理したd5(d5+FEDB)、従来の2Dプロトコル(2D 271H)（非特許文献３）から選別したCD271high+ NCC、および2D 培養でFEDB処理した2D 271H(2D 271H+FEDB)の間で比較した。データはd5の値に対して正規化した。値は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 6。2D 271H+FEDBは、初期間葉マーカーとmdEMマーカーの両方をほとんど発現しなかった。c；d5、d5+FEDB、2D 271H、および2D 271H+FEDBのRNA-seq分析。平滑筋細胞関連遺伝子の発現レベルを可視化したヒートマップ。log2(TPM + 1)の値を使用して遺伝子発現レベルを評価した。d；播種後1日目または4日目の2D 271H+FEDBにおける、明視野画像、ならびにDLX5、αSMA、カルポニン1、TAGLNに対する免疫細胞化学。核はDAPIで染色した。2D 271H+FEDBは平滑筋細胞マーカーを発現した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。代表的なデータを示す。スケールバー、100 μm。e；RT-qPCRによる、EDNRAおよび初期咽頭弓間葉マーカー（TWIST1、PRRX1）およびmdEMマーカー（DLX5、HAND2）の遺伝子発現分析。遺伝子発現レベルは、GAPDHを参照コントロールとして用いて定量化し、2D培養においてFEDB（+0、10、20、50ng/ml Y-27632）で処理した2D 271Hとの間で比較した。データはd5+FEDBの値に対して正規化した。結果は平均 ± 標準誤差として表示した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。Y-27632処理によるアクチンストレスファイバー形成の阻害により、3D培養ほどではないものの、2D培養細胞におけるmdEMマーカーの発現が大幅に回復した。f；明視野イメージングと細胞生存率分析。スフェア形成を促進するために、2D 271Hを、96ウェルV底超低細胞接着プレートのFEDB培地中で凝集させた。4日後、細胞スフェロイド内の細胞生存率をLIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kitを使用して分析した。FEDB下でのNCCのスフェロイド培養は、重篤な細胞アポトーシスを誘導した。3回の生物学的に独立した実験からのn = 3。b、e；一元配置ANOVAによる、***P < 0.001。ns、有意差なし。d、f；代表的なデータを示す。スケールバー、200 μm。 NCC集塊から平滑筋細胞への誘導。a；誘導方法の概要図。b；平滑筋マーカーの免疫染色結果。核はDAPIで染色した。平滑筋細胞誘導後10日目にCalponin、TAGLNが高発現することが確認された。ｃ；RT-qPCRによる、平滑筋マーカーの遺伝子発現分析。平滑筋細胞誘導後10日に平滑筋マーカー(ACTA2、CNN1、TAGLN)および成熟期平滑筋マーカー(MYH11)が高発現することが確認された。 mdEMを経由したヒトiPSCから顎骨様オルガノイド作製の概略モデル。図に示すように、mdEMおよび顎骨様オルガノイドは、胚形成中のシグナル伝達環境によって誘導され、段階的にヒトiPSCから生成された。最初の1日間のSB/BMP4処理、その後のSB/CHIR処理により、iPSC凝集塊からHOX陰性NCC集塊が効果的に誘導された(0～5日目)。一過性のRA処理により、HOX陽性の後方NCC集塊が誘導された。5日目から9日目まで、FGF8、EDN1、およびBMP4の組み合わせにより、HOX陰性NCC集塊がmdEMに誘導され、胚のmdEMの近位-遠位パターンを再現した。mdEMまたはmxEMの領域同一性（regional identity）は、EDN1シグナル活性を調整することによって修飾された。HOX陽性NCC集塊はmdEMに分化しなかったが、これにより初期NCC位置同一性（positional identity）の重要性が強調される。mdEMは、外因性の下顎上皮シグナル（FGF8、SAG、EDN1、BMP4）に応答して後期の領域パターニングを示し、遠位キャップと近位口腔側臼歯ドメインに分岐する。9-38日目まで、骨形成条件下で、mdEMは、自己生成した石灰化骨基質に埋め込まれた骨芽細胞およびネットワークを形成する骨細胞からなる顎骨様オルガノイドを形成した。PA1-3、咽頭弓1-3；mx、上顎突起；mxEM、mx外胚葉性間葉；md、下顎突起；mdEM、md外胚葉性間葉；SB、SB431542(TGF-β阻害剤)；CHIR、CHIR99021(GSK-3β阻害剤)；RA、レチノイン酸；BQ-123(エンドセリンA受容体(EDNRA)アンタゴニスト)；LDN、LDN193189（BMP阻害剤)；SAG(ヘッジホッグシグナル伝達アゴニスト)。
１．神経堤細胞の製法
　本発明は、多能性幹細胞から、神経堤細胞（NCC）を製造する方法を提供する。具体的には、かかる方法は、
　（１）多能性幹細胞を、ALK阻害剤および骨形成タンパク質を含む培地中で浮遊培養する工程、ならびに
　（２）ALK阻害剤およびGSK-3β阻害剤を含む培地中で浮遊培養する工程、
を含む（以下、「本発明のNCCの製法」と称することがある）。
　「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、生体の種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のどの系統の細胞にも分化し得る能力を有する幹細胞を指す。本発明に用いる多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（nuclear transfer Embryonic stem cell：ntES細胞）、多能性生殖幹細胞（multipotent germline stem cell）（「mGS細胞」）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）が挙げられるが、好ましくはiPS細胞(より好ましくはヒトiPS細胞)である。上記多能性幹細胞がES細胞またはヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、倫理的な観点からは、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
　ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ES細胞は、マウスで1981年に発見され（M.J. Evans and M.H. Kaufman（1981）, Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された（J.A. Thomson et al.（1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al.（1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A. Thomson et al.（1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall（1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。あるいは、ES細胞は、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて樹立することもできるし（Chung Y. et al. (2008), Cell Stem Cell 2: 113-117）、発生停止した胚を用いて樹立することもできる（Zhang X. et al. (2006), Stem Cells 24: 2669-2676.）。
　nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（Wakayama T. et al.（2001）, Science, 292:740-743; S. Wakayama et al.（2005）, Biol. Reprod., 72:932-936; Byrne J. et al.（2007）, Nature, 450:497-502）。即ち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES（nuclear transfer ES）細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（Cibelli J.B. et al.（1998）, Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（2008）, 実験医学, 26巻, 5号（増刊）, 47～52頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
　本発明で用いるES細胞株としては、マウスES細胞であれば、例えば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞株であれば、例えば、ウィスコンシン大学、NIH、理研、京都大学、国立成育医療研究センターおよびCellartis社などが樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。具体的には、例えば、ヒトES細胞株としては、ESI Bio社が分譲するCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WiCell Researchが分譲するH1株、H9株等、理研が分譲するKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株などが挙げられる。
　iPS細胞は、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞である。現在、iPS細胞にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPSC（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPSC（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPSC（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）等も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許文献（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性幹細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学の253G1株、253G4株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1383D2株、1383D6株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等が挙げられ、1231A3株が好ましい。
　本発明のNCCの製法で用いる人工多能性幹細胞は、遺伝性疾患（例えば、骨形成不全症患者など）の患者由来の細胞であってもよい。遺伝性疾患の患者由来の多能性幹細胞から分化誘導させた細胞は、該疾患の病態を反映する疾患モデルとなり得るため、該疾患の治療または予防薬のスクリーニングなどに適している。あるいは、遺伝性疾患の患者由来の多能性幹細胞に対して、CRISPR-Casシステムなどを用いたゲノム編集により遺伝子を修復した上で目的の細胞またはオルガノイドへと分化させることで、該細胞を該疾患の治療薬として用いることも可能となる。実際に、下述の実施例において、骨形成異常の原因となるCOLIA1の点変異をレスキューした多能性幹細胞から誘導した骨オルガノイドでは、骨形成異常が認められないことが示された。
　mGS細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質を有する（Kanatsu-Shinohara M. et al.（2003）Biol. Reprod., 69:612-616; Shinohara K. et al.（2004）, Cell, 119:1001-1012）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF））を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（2008）, 実験医学, 26巻, 5号（増刊）, 41～46頁, 羊土社（東京、日本））。
　EG細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞である。LIF、bFGF、幹細胞因子（stem cell factor）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立し得る（Matsui Y. et al.（1992）, Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al.（1992）, Nature, 359:550-551）。
　多能性幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってよい。好ましい由来種は、ヒトである。
　本明細書において、「細胞集塊」とは、細胞同士が凝集して塊になった構造体を意味し、細胞凝集塊とも呼ばれる。また、神経堤細胞（NCC）集塊とは、神経堤細胞を含む細胞集塊を意味するが、典型的には、主として（例えば、60％以上、70%以上または80%以上の割合で）神経堤細胞が含まれる細胞集塊を意味する。また、他の細胞種の細胞集塊（例えば、第一咽頭弓外胚葉性間葉（PA1-EM)細胞集塊など）についても、同様である。
　本明細書において、「ALK阻害剤」とは、ALK（activin receptor-like kinase）ファミリーに属する受容体に対する阻害活性を有する物質を意味する。ALKは、I型TGFβ受容体とも呼ばれ、Smad(R-Smad)の活性化を主としたシグナル伝達を介して細胞増殖、細胞分化、細胞死などを制御する。II型TGFβ受容体を形成したものが二量体を形成し、該二量体が２分子のI型TGFβ受容体会合することでヘテロ四量体が形成される。ヘテロ四量体の形成により、II型TGFβ受容体がI型TGFβ受容体をリン酸化し、該リン酸化によりI型TGFβ受容体のキナーゼ活性が誘起され、下流のSmadがリン酸化される。
　本発明で用いる「ALK阻害剤」は、上記シグナル伝達のいずれかの段階を阻害できるものであれば特に限定されず、例えば、TGFβとその受容体の結合を阻害する物質、II型TGFβ受容体によるI型TGFβ受容体のリン酸化を阻害する物質、リン酸化I型TGFβ受容体によるSmad（例：Smad2、Smad3等）のリン酸化を阻害する物質などが挙げられる。ヒトにおいては、ALKとしてALK-1、ALK-2、ALK-3、ALK-4、ALK-5、ALK-6およびALK-7が知られているが、本発明で用いるALK阻害剤としては、特にALK-5に対する阻害剤（「TGFβ阻害剤」とも称する。）が好ましい。
　本発明のNCCの製法の工程（１）または（２）で用いるALK阻害剤としては、例えば、SB431542（4-(5-ベンゾール[1,3]ジオキソール-5-イル-4-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル)-ベンズアミド, 4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド, 4-[4-(3,4-メチレンジオキシフェニル)-5-(2-ピリジル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド）、A-83-01（3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1-フェニルチオカルバモイル-4-キノリン-4-イルピラゾール）、LDN193189（4-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline）、GW788388（4-[4-[3-(ピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピリジン-2-イル]-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)ベンズアミド）、SM16（4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-bicyclo[2.2.2]octane-1-carboxamide）、IN-1130（3-[[5-(6-Methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]-benzamide）、GW6604（2-Phenyl-4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridine）、SB505124（2-(5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-2-tert-ブチル-3H-イミダゾール-4-イル)-6-メチルピリジン）などが挙げられる。なかでも、SB431542およびA-83-01が好ましい。ALK阻害剤は、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明のNCCの製法の工程（１）または（２）において、培地中のALK阻害剤の濃度は、添加するALK阻害剤の種類によって適宜調整されるが、典型的には0.1～50 μM、好ましくは1～40 μM、より好ましくは5～20 μMである。SB431542を用いる場合、培地中での濃度は、典型的には1～40 μM、好ましくは5～20 μM、より好ましくは10 μMである。A-83-01を用いる場合、培地中での濃度は、典型的には0.01～10 μM、好ましくは0.1～4 μM、より好ましくは0.5～2 μM、さらに好ましくは1 μMである。
　骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein; BMP）は、TGF-βスーパーファミリーに属する分泌型シグナル伝達分子である。本発明のNCCの製法の工程（１）で用いる骨形成タンパク質としては、例えば、BMP2、BMP3、BMP3b、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP10、BMP11、BMP12、BMP13、BMP14、BMP15、BMP16、BMP17、BMP18などが挙げられるが、なかでもBMP4、BMP2およびBMP7が好ましい。BMPは、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明のNCCの製法の工程（１）において、培地中のBMPの濃度は、添加するBMPの種類によって適宜調整されるが、典型的には1～50 ng/mL、好ましくは2～30 ng/mL、より好ましくは2.5～10 ng/mLである。
　本明細書において、「GSK-3β阻害剤」とは、GSK-3β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β）に対する阻害活性を有する物質を意味する。GSK3（グリコーゲンシンターゼキナーゼ3）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。GSK3にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いる「GSK-3β阻害剤」は、GSK-3β阻害活性を有すれば特に限定されず、GSK-3β阻害活性と合わせてGSK-3α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
　本発明のNCCの製法の工程(２）で用いるGSK-3β阻害剤としては、例えば、CHIR98014（2-[[2-[(5-ニトロ-6-アミノピリジン-2-イル)アミノ]エチル]アミノ]-4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(1H－イミダゾール-1-イル)ピリミジン）、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]ニコチノニトリル）、CP21R7（3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-ピロール-2,5-ジオン）、LY2090314（3-[9-Fluoro-1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)pyrrolo[3,2,1-jk][1,4]benzodiazepin-7-yl]-4-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-1h-pyrrole-2,5-dione）、TDZD-8(4-ベンジル-2-メチル-1，2，4-チアジアゾリジン-3，5-ジオン）、SB216763(3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2，5-ジオン）、TWS-119(3-[6-(3-アミノフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イルオキシ]フェノール)、ケンパウロン（Kenpaullone）、1-アザケンパウロン（Azakenpaullone）、SB415286(3-[(3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル)アミノ]-4-(2-ニトロフェニル)-1H-ピロール-2，5-ジオン)、AR-AO144-18（1-[(4-methoxyphenyl)methyl]-3-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea）、CT99021、CT20026、BIO（(2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-オキシム）、BIO-アセトキシム、ピリドカルバゾール-シクロペンタジエニルルテニウム複合体、OTDZT、アルファ-4-ジブロモアセトフェノン、リチウムなどが挙げられる。これらは、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、GSK-3βのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、GSK-3βに結合する抗体、ドミナントネガティブGSK-3β変異体等もGSK-3β阻害剤として使用することができ、これらは商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　本発明のNCCの製法の工程（２）において、培地中のGSK-3β阻害剤の濃度は、添加するGSK-3β阻害剤の種類によって適宜調整されるが、例えば0.01～20 μM、好ましくは0.1～10 μMである。例えば、CHIR99021を用いる場合、典型的には0.1～10μM、好ましくは0.5～2μM、より好ましくは1μMである。
　下述の実施例で示される通り、本発明のNCCの製法の工程（１）に振とう培養する工程を含めることで、培養期間を短縮することができ（例えば、図２０）、また工程（２）に振とう培養する工程を含めることで、NCCへの誘導効率が向上することが示された（図９）。よって、前記工程（１）および（２）の工程の少なくともいずれかの工程が、振とう培養を行う工程を含むことが好ましい。振とう培養は、各工程の全期間に亘って行ってもよく、一部の期間のみであってもよい。
　振とう培養は、振とう装置（シェーカー）を用いて行うことができる。前記培養装置は、旋回式（オービタル）振とう装置であってもよく、往復式振とう装置であってもよく、８の字振とう装置であってもよく、これらの振とう方式を適宜切り替える機能を有する振とう装置であってもよい。また、振とうの方向も、水平方向であっても、垂直方向であってもよいが、典型的には水平方向である。振とう速度は、特に制限されず、通常50～450 rpmの範囲とするが、好ましくは、100～200 rpm（一態様において、120 rpm）の範囲とする。
　いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、振とう培養によりNCCへの誘導効率が向上した理由の１つとしては、振とうすることで、細胞集塊への培地サプリメントの浸透が促進されたためであると推測される。よって、このような目的を達成できる他の方式、例えば撹拌培養、によっても、同様にNCCへの誘導効率が向上すると推測される。よって、振とう培養に代えて、あるいは振とう培養と併せて、撹拌培養を行ってもよい。撹拌培養は、攪拌子または撹拌翼を備えた培養装置（例えば、バイオリアクターなど）により行うことができる。撹拌培養を行う際の攪拌子または撹拌翼の回転速度としては、典型的には、10～100 rpmである。
　本発明のNCCの製法の工程（１）の培養期間は、典型的には、３時間～７日間であり、NCCへの誘導効率の観点からは、６時間～６日間が好ましく、６時間～５日間がより好ましく、１２時間～４日間がさらに好ましく、１日間～３日間がさらにより好ましい。また、振とう培養および／または撹拌培養を行う場合には、工程（１）の期間を短縮することもでき、例えば、培養期間を、６時間～３日間、６時間～２日間、１２時間～１日間などとすることができる。
　本発明のNCCの製法の工程（２）の培養期間は、典型的には、１２時間～５日間であり、NCCへの誘導効率の観点からは、１日間～６日間が好ましく、１日間～４日間がより好ましく、２日間～３日間がさらに好ましく、１日間～３日間がさらにより好ましい。前記期間は、本発明のNCCの製法の工程（１）の期間や、振とう培養および／または撹拌培養の有無などにより適宜変更することができる。
　また、本発明のNCCの製法の工程（１）および（２）の培養期間（工程（１）と（２）の合計培養期間）は、典型的には、１日間～６日間であり、２日間～５日間が好ましく、３日間～４日間がより好ましい。前記期間は、本発明のNCCの製法の工程（１）の期間や、振とう培養および／または撹拌培養の有無などにより適宜変更することができる。
　本発明のNCCの製法の工程（１）の前に、ROCK阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を行ってもよい。これにより、多能性幹細胞の細胞集塊を形成させることができる。また、かかる工程に代えて、多能性幹細胞の細胞集塊を準備する工程を行ってもよい。かかる工程の期間は、特に限定されないが、典型的には１２時間～３日間であり、好ましくは1日間である。よって、本発明のNCCの製法が前記多能性幹細胞の細胞集塊を形成させる工程を含む場合には、本発明のNCCの製法の期間は、典型的には、２日間～７日間であり、３日間～６日間が好ましく、４日間～５日間がより好ましい。
　本発明で用いるROCK阻害剤としては、Rho-キナーゼ(ROCK)の機能を抑制できる限り特に限定されないが、例えば、Y-27632（例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、ファスジル/HA1077（例えば、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、SR3677（例えば、Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645(2008)参照）、GSK269962（例えば、Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007)またはWO2005/037197参照）、GSK429286A、H1152（例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例えば、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）、チアゾビビンおよびそれらの塩または誘導体などが挙げられる。他のROCK阻害剤としては、ROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例えば、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターなども挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物およびその塩または誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。中でも、Y-27632が好ましい。ROCK阻害剤は、１種のみ用いてもよく、２種以上用いてもよい。ROCK阻害剤の培地中の濃度は、使用するROCK阻害剤に応じて当業者により適宜選択可能であるが、例えば、Y-27632またはその塩（例：Y-27632二塩酸塩等）を用いる場合、典型的には0.1μMから100μM、好ましくは1μMから50μM、さらに好ましくは5μMから20μM、さらにより好ましくは10μMである。
　また、本発明のNCCの製法の工程（２）で得られたNCC集塊から、NCCマーカーの発現（例えば、CD271高発現等）を指標として、NCCを選別（単離、濃縮または精製とも換言できる。）してもよい。NCCの選別は、公知の方法を適宜用いることができ、例えば、CD271などのNCCマーカーに対する抗体により細胞を標識し、フローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて選別する方法などが挙げられる。
　本発明のNCCの製法における細胞の培養密度は、細胞が増殖できる限り特に限定されない。典型的には１．０×１０１～１．０×１０９細胞／ｍｌ、好ましくは１．０×１０２～１．０×１０８細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０３～１．０×１０７細胞／ｍｌ、さらに好ましくは１．０×１０３～１．０×１０６細胞／ｍｌ（例えば、２．０×１０４細胞／ｍｌ、３．０×１０４細胞／ｍｌ、１．０×１０５細胞／ｍｌなど）である。
　本発明のNCCの製法の工程（１）および工程（２）の少なくともいずれか１つの工程では、フィーダーフリー条件下および／またはゼノフリー条件下で細胞を培養してもよい。本発明のNCCの製法では、全行程をフィーダーフリーかつゼノフリー条件下で行ってもよい。また、本発明のNCCの製法の工程（１）および（２）以外の任意の工程においても、フィーダーフリー条件下および／またはゼノフリー条件下で細胞を培養してもよい。本明細書において、「フィーダーフリー」とは、培養対象の細胞の培養条件を整えるために用いる、補助役を果たす他の細胞種（即ち、フィーダー細胞）を含まない培地または培養条件を意味する。また、「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物由来の成分を含まない培地または培養条件を意味する。
　本発明のNCCの製法で用いる基礎培地としては、特に限定されないが、StemFit（登録商標） AK02培地（味の素株式会社）、StemFit（登録商標） AK03培地（味の素株式会社）、StemFit（登録商標） Basic03培地、CTS（登録商標） KnockOut SR XenoFree Medium(Gibco)、mTeSR1培地、TeSR1培地（Stem Cell Technologies）、Iscove’s modified Dulbecco’s medium（GEヘルスケア社）、Improved MEM（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）などが挙げられる。中でも、StemFit（登録商標） AK03培地が好ましい。これらの培地は、フィーダーフリーかつゼノフリー条件下での培養に用いることもできる。また、RPMI-1640培地、EagleMEM(EMEM)、ダルベッコ改変MEM、Glasgow’s MEM（GMEM）、α-MEM、199培地、IMDM、DMEM、Hybridoma Serum free培地、KnockOutTM DMEM、Advanced TM培地（例：Advanced MEM、Advanced RPMI、Advanced DMEM/F-12）、Ham’s Medium F-12、Ham’s Medium F-10、Ham’s Medium F12K、DMEM/F-12、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy’s 5A、Leibovitz’s L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth’s Medium（例：Waymouth’s MB752/1）、CMRL培地（例：CMRL-1066）、Williams’ medium E、Brinster’s BMOC-3 Medium、E8 Medium、StemPro 34、MesenPRO RS（以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ReproFF2、Primate ES Cell Medium、ReproStem（以上リプロセル株式会社）、ProculAD（ロート製薬株式会社）、MSCBM-CD、MSCGM-CD（以上Lonza社）、EX-CELL302培地（SAFC社）またはEX-CELL-CD-CHO（SAFC社）、ReproMedTM iPSC Medium（リプロセル株式会社）およびこれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
　必要に応じて、培地は、例えば、Knockout Serum Replacement(KSR)、N2 supplement（Invitrogen）、B27 supplement（Invitrogen）、アルブミン、トランスフェリン、アポトランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよく、また、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、セレン酸、プロゲステロンおよびプトレシンなどの1つ以上の物質も含有してもよい。
　本明細書において、「浮遊培養」とは、細胞または細胞集塊が培養液に浮遊して存在する状態を維持する条件で行われる培養、即ち細胞または細胞集塊と培養容器との間に強固な細胞－基質間結合（cell-substratum junction）を作らせない条件での培養を意味する。また、浮遊培養を行う場合、典型的には、浮遊培養の前後の細胞は細胞集塊の形態である。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養容器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養容器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。さらに、浮遊培養用の容器としてバイオリアクターが例示される。これらの培養容器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例：細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。これらの培養容器のウェル底形状は、特に制限されず、例えば、平底、U字型、V字型のものが挙げられる。本発明のNCCの製法の工程（１）では、好ましくはV字型のもの（例：96 well V-bottom 超低接着培養プレート(住友ベークライト社製)等）が用いられ、本発明のNCCの製法の工程（２）では、好ましくは平底のもの（例：48 well 低接着培養プレート(Iwaki社製)等）が用いられる。
　培養温度は、特に制限されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　NCCは、発生学的には、発生初期において神経板から神経管が形成される際に神経外胚葉と表皮外胚葉の間から発生する細胞であり、神経細胞、グリア細胞、間葉系幹細胞、骨細胞、軟骨細胞およびメラノサイトなどの多くの種類の細胞へ分化する多能性（multipotency）と自己増殖能とを有する細胞である。本明細書において、「神経堤細胞（NCC）」とは、CD271（NGFR）、SOX10、TFAP2AおよびPAX3から選ばれる１以上の遺伝子発現している細胞（４つすべて発現していることが望ましい）であり、典型的には、NCCはCD271強陽性である。
　本発明のNCCの製法の工程（２）により、多能性幹細胞由来のNCCが得られる。従って、本発明の別の態様において、本発明のNCCの製法で得られる（または得られた）NCC（以下、「本発明のNCC」と称することがある）も提供される。本発明のNCCは、典型的には、下記の特徴（Ａ）～（Ｃ）を全て有する。
　（Ａ） 多能性幹細胞由来である
　（Ｂ） CD271、SOX10、TFAP2AおよびPAX3から選ばれる１以上（好ましくは全て）の遺伝子を発現している
　（Ｃ） PA1-EM細胞（少なくとも下顎のPA1-EM細胞）への分化能を有する
　また、本発明のNCCは、さらに、下記の特徴（Ｄ）～（Ｆ）の少なくともいずれか（好ましくは全て）を有する。
　（Ｄ） メラノブラストへの分化能を有する
　（Ｅ） 神経細胞への分化能を有する
　（Ｆ） 間葉系幹細胞への分化能を有する
　また、別の態様において、本発明により、上記特徴（Ａ）～（Ｃ）を全て有し、好ましくは、さらに上記特徴（Ｄ）～（Ｆ）の少なくともいずれか（好ましくは全て）を有するNCCも提供される。かかるNCCは、本発明のNCCの製法により得られるものであってもよく、別の方法により得られるものであってもよい。また、以下では、前記NCCも、「本発明のNCC」と称することがある。
　本明細書において、遺伝子を「発現している」または「陽性」とは、特に断らない限り、少なくとも「遺伝子にコードされたmRNAの産生」を含む意味で用いられるが、好ましくは、さらに「mRNAにコードされたタンパク質の産生」を含む意味で用いられる。したがって、遺伝子にコードされたmRNAの産生が少なくとも後述の実施例に記載の方法（RT-qPCR）で検出された場合には、遺伝子が発現しているといえる。一方で、遺伝子にコードされたmRNAの産生が後述の実施例に記載の方法（RT-qPCR）で検出されない（即ち、検出限界未満）場合、バックグラウンドレベルの場合、あるいはポジティブコントロールに対して100分の１以下の場合には、遺伝子が発現していないあるいは陰性といえる。
　本明細書において、「陽性」には、高発現性である場合（「強陽性」とも称する。）が含まれる。高発現性であることは、High、Brightと表されることがある。例えば、CD271高発現細胞は、CD271High+ 細胞又はCD271Bright+ 細胞と表されることがある。高発現性は、フローサイトメトリー法により得られるチャートに基づき、判断することができる。チャートに現れる位置は、機器の電圧設定、感度設定、使用抗体クローン、染色条件、使用色素等により変動することがあるが、当業者であれば、得られたチャートにおいて一群と認められる細胞集団を切り分けないように適宜線引きすることができる。
　また、PA1-EM細胞などの各種細胞（目的の細胞）への分化能を有するとは、任意の方法によりNCCから目的の細胞が得られることを意味する。PA1-EM細胞は、上顎のPA1-EM（mxEM）と下顎のPA1-EM（mdEX）とに区別されるが、本明細書において、特に断らない限り、PA-EMには、上顎のPA1-EMおよび下顎のPA-EMの両方が包含されるが、特に下顎のPA1-EMを意図する場合が多い。
２．分化誘導法および該方法で得られる分化細胞またはオルガノイド
　上述のとおり、本発明のNCCは、様々な細胞への分化能を有する。従って、別の態様において、本発明のNCCを分化誘導させる工程を含む、分化細胞またはオルガノイドの製造方法（以下、「本発明の分化誘導法」と称する場合がある。）、並びに該方法で得られる（または得られた）分化細胞またはオルガノイドが提供される。
　本発明の分化誘導法により得られる細胞は、幹細胞や前駆細胞などの未分化細胞であってもよく、最終分化細胞であってもよい。以下で、未分化細胞と最終分化細胞の両方を包含する用語として、「分化細胞」との用語を用いることがある。本明細書において、「未分化細胞」とは、細胞系譜において、最終分化に至っていない細胞を意味し、未分化細胞としては、例えば、多能性幹細胞を除く幹細胞、前駆細胞などが挙げられる。幹細胞または前駆細胞としては、例えば、神経幹細胞、グリア前駆細胞、色素幹細胞、メラノブラスト、間葉系幹細胞、第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞、心筋幹細胞、血管内皮前駆細胞、血管周皮細胞、骨格筋幹細胞、脂肪幹細胞、骨前駆細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞などが挙げられる。
　本明細書において、「最終分化細胞」とは、細胞系譜において、最終分化に至った細胞を意味し、最終分化細胞としては、特に限定されないが、例えば、神経細胞、グリア細胞、メラノサイト、脂肪細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞などが挙げられる。
　また、本明細書において、「オルガノイド」とは、複数種の細胞を含む構造体を意味し、典型的には、生体内の臓器と類似した構造及び機能を有する。本発明の分化誘導法により得られるオルガノイドとして、例えば、神経オルガノイド（例：大脳皮質オルガノイド、小脳オルガノイド、脊髄オルガノイド、中脳オルガノイド、脈絡叢オルガノイド、海馬オルガノイド、視床下部オルガノイド、脳下垂体前葉オルガノイド、大脳基底核オルガノイド、網膜オルガノイド等）、軟骨オルガノイド（「軟骨様組織体」とも称する。）、心臓オルガノイド、骨オルガノイド（「骨様組織体」とも称する。）、骨格筋オルガノイドドなどが挙げられるが、一実施態様において、顎骨オルガノイド（「顎骨様組織体」とも称する。）などの骨オルガノイドである。
　骨オルガノイドは、軟骨性骨（cartilage bone）のオルガノイドであってもよく、膜性骨（membranous bone）のオルガノイドであってよいが、好ましくは、NCCに由来する骨（例：前蝶形骨、篩骨、膜性骨等）のオルガノイドであり、なかでも膜性骨のオルガノイドがより好ましい。膜性骨としては、例えば、前頭骨、頭頂骨、側頭骨、後頭骨、顎骨（上顎骨および下顎骨）などが挙げられるが、中でも顎骨（特に、下顎骨）が好ましい。また、本明細書において、下顎骨のオルガノイドは、DLX5陽性のPA1-EM細胞に由来するオルガノイドを意味する。下述の実施例において、骨形成異常の原因となるCOLIA1の点変異を有する多能性幹細胞から誘導した骨オルガノイドでは、骨形成異常の表現型が認められた。よって、骨オルガノイドは、骨疾患（例えば、骨形成不全症）の表現型を示すものであってもよい。
　ある構造体がオルガノイドであるかどうかは、例えば、必要に応じて染色（例：アリザリンレッド染色、HE染色、アザン染色等）を行ったサンプルを顕微鏡観察により層構造形成の有無を確認することや、マーカータンパク質の発現を調べることにより確認することができる。具体的には、骨オルガノイドは、骨基質と、骨基質に内包された骨細胞と、骨基質を取り巻く骨芽細胞の層を有する。骨オルガノイドは、典型的には、F-actin等の細胞骨格に関わるタンパク質により、骨細胞同士が互いに接続することで形成された三次元的ネットワークが認められ、また骨欠損部に移植した場合に、該欠損部の修復能を有する。また、「骨基質」とは、骨細胞によって産生されて細胞外に分泌された物質が蓄積したものであり、例えば、リン酸カルシウム等であって、オステオカルシンやオステオポンチン、オステオネクチン、コラーゲン等のタンパク質を含むものである。
　大脳皮質オルガノイドは、Foxg1が全体に発現したドーム状の神経上皮を有し、また該神経上皮は層構造を有する。前記構造において、典型的には、上皮の内側にPax6、Sox2陽のventricular zoneに相当する神経前駆細胞の層が、その外側に、Reelin/Carletinin陽性のCajal Retzius細胞からなる第1層や、Ctip2/Tbr1陽性のdeep layerなどが認められる。
　NCCから、神経前駆細胞、神経細胞、グリア細胞、間葉系幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、歯原性間葉細胞、平滑筋細胞、角膜内皮細胞、メラノブラスト、メラノサイトなどの細胞を製造することもできる。例えば、これらの細胞への分化誘導は、下述の実施例で記載した方法や、Fukuta M. et al., PLoS One, 2014, 9(12): e112291、Horikiri T. et al., PLoS One, 2017, 12(1): e0170342、非特許文献３に記載の方法などにより行うことができる。培養後に、細胞の表面抗原やマーカー遺伝子の発現についてフローサイトメトリー解析や免疫染色解析を行い、目的の細胞への分化を確認してもよい。また、本明細書において、「間葉系幹細胞」とは、自己複製能を有し、少なくとも骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞への分化能を有する細胞を意味する。
　本発明の一実施態様において、本発明の分化誘導法により得られる細胞やオルガノイド（目的の細胞またはオルガノイド）は、間葉系細胞（例えば、間葉系幹細胞、第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞、骨前駆細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、歯原性間葉細胞、平滑筋細胞など）、神経細胞、メラノブラストまたは骨オルガノイド（例えば、顎骨オルガノイド）である。
　本発明の分化誘導法を行う前に、NCCを拡大培養してもよい。拡大培養は、例えば、特許文献１に記載の方法などにより行うことができる。具体的には、GSK-3β阻害剤及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含む培地中で神経堤細胞を浮遊培養することにより行うことができる。NCCの拡大培養に用いるGSK-3β阻害剤は、本発明のNCCの製法で用いるものと同様のものを用いることができるが、好ましくはSB431542である。NCCの拡大培養に用いるbFGF(FGF-2とも呼ばれる)は、富士フィルム和光純薬株式会社等の市販されているものを使用することができる。その他、拡大培養に用いる培地には、ALK阻害剤やEGF（Epidermal Growth Factor；上皮成長因子）が含まれていてもよい。ALK阻害剤は、本発明のNCCの製法で用いるものと同様のものを用いることができる。
　神経堤細胞を、間葉系幹細胞増殖培地中で接着培養により約14日間培養することで、MSCを得ることもできる。かかる培地としては、培養により、本発明のNCCをMSCに分化誘導できるものであれば特に限定されず、ウシ血清を含む基礎培地（例えば、αMEM培地など）などを用いてもよいが、市販のゼノフリーの間葉系幹細胞増殖培地が好ましい。市販のゼノフリーの間葉系幹細胞増殖培地としては、例えば、PRIME-XV MSC Expansion XSFM（Irvine Scientific社）、Cellartis（登録商標） MSC Xeno-Free Culture Medium（タカラバイオ株式会社）、MSC NutriStem（登録商標） XF培地（ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社）などが挙げられる。
　また、MSCを、目的の細胞の分化誘導に適した培地中で培養することで、分化細胞を製造することもできる。例えば、骨細胞分化誘導培地としては、10%FBS、0.1μM dexa-methasone、50μg/ml ascorbic acidおよび10mM β-glycerophosphateを含む基礎培地（例えば、αMEM）や、市販のゼノフリーの骨細胞分化誘導培地（例えば、MSCgoTM Osteogenic XF Medium(Sartorius社）、MSCgoTM Rapid Osteogenic Differentiation Medium(Sartorius社）)などが挙げられる。骨細胞への分化方法は、具体的には、例えば、間葉系幹細胞をゼラチンでコーティングした12ウェルプレートに4×104個播種し、上記骨細胞分化誘導培地で30日間培養する方法などが挙げられる。アリザニンレッド染色により石灰化ノジュールを検出し、骨細胞への分化を確認してもよい。
　軟骨細胞分化誘導培地としては、1％（v/v）ITS+プレミックス、0.17 mM AA2P、0.35 mMプロリン、0.1 mMデキサメタゾン、0.15％（v/v）グルコース、1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM GlutaMAX、40 ng/ml PDGF-BB、100 ng /mL TGF-β3、10 ng/ml BMP4、および1% (v/v) FBSを含む基礎培地（例えば、DMEM/F12）や、市販のゼノフリーの軟骨細胞分化誘導培地（例えば、MSCgoTM Chondrogenic XF(Sartorius社）)などが挙げられる。軟骨細胞への分化方法は、具体的には、例えば、フィブロネクチンでコーティングしたプレートに間葉系幹細胞懸濁液5μlをスポットし1時間培養し、1時間後に1mlの上記の分化誘導培地を加えて、14日間培養する方法などが挙げられる。アルシアンブルー染色により軟骨細胞の分化を確認してもよい。
　脂肪細胞分化誘導培地としては、60 μM インドメタシン、0.5 mM IBMX、0.5 μM ヒドロコルチゾンを含む基礎培地や、市販のゼノフリーの脂肪細胞分化誘導培地（例えば、hMSC - Human Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium (Lonza）、MSCgoTM Adipogenic XF(Sartorius社）)などが挙げられる。脂肪細胞の分化方法は、具体的には、例えば、間葉系幹細胞をゼラチンでコーティングしたプレートに4×104個播種し、上記骨細胞分化誘導培地で32日間培養する方法などが挙げられる。オイルレッドO染色により脂肪細胞の分化を確認してもよい。
　また、NCCを、低細胞接着性培養容器（例：96 well V-bottom 超低接着培養プレート(住友ベークライト社製)等）に播種し、B27 Supplement、N-2 supplement、L-glutamine、BDNF、GDNF、NT-3、NGFを添加した基礎培地（例：Neurobasal medium等）で約14日間培養すること、あるいはNCCを、N-2 Supplement、BDNF、GDNF、NT-3、NGFを添加した基礎培地（例：DMEM/F12等）中で接着培養により約14日間培養することで、神経前駆細胞および神経細胞を得ることができる。
　NCCからメラノブラストへの誘導は、例えば、Mica et al., Cell Reports, 2013; 3(4):1140-1152、Callahan et al., J. Vis Exp, 2016; (109): e53806などにも記載されている。これらの方法をそのまま用いてもよいが、下述の実施例で示される通り、接着培養を浮遊培養へと代えることで、高効率でメラノブラストへと分化誘導できる。具体的には、NCC集塊を、低細胞接着性培養容器に播種し、CHIR99021、BMP4、エンドセリン-3（Endothelin-3）を加えた基礎培地（例：StemFit Basic03培地等）で約6日間培養することで、メラノブラストを得ることができる。
　NCCまたはMSCから、平滑筋細胞を誘導することもできる。かかる方法として、例えば、NCCを間葉系幹細胞増殖培地中で約5日接着培養し、その後約5日間平滑筋細胞誘導培地で接着培養することで、平滑筋細胞を得る方法などが挙げられる。平滑筋細胞誘導培地としては、例えば、TGF-β1およびエンドセリン-1を加えた基礎培地（例：StemFit Basic03培地等）などが挙げられる。
　本発明のNCCから下顎のPA1-EM細胞への誘導（以下、「PA1-EM細胞誘導」とも称する。）は、例えば、エンドセリンおよび線維芽細胞増殖因子を含む培地（例えば、StemFit Basic03培地）中でNCCを培養することにより行うことができる。PA1-EM細胞誘導に用いるエンドセリンとしては、エンドセリン-1（Edn-1）、エンドセリン-2（Edn-2）、およびエンドセリン-3（Edn-3）のいずれを用いてよいが、好ましくはEdn-1である。これらエンドセリンを組み合わせて用いてもよい。エンドセリンの培地中の濃度は、使用するエンドセリンに応じて当業者により適宜選択可能であるが、例えば、Edn-1を用いる場合、典型的には1～500 nM、好ましくは10～300 nM、より好ましくは20～100 nM（例えば、50 nM）である。一方で、PA1-EM細胞誘導方法において、エンドセリンに代えてEdn-1阻害剤を用いることで、あるいは培地中にEdn-1、Edn-2およびEdn-3のいずれも含めずに（これらの物質非存在下で）NCCを培養することで、上顎のPA1-EM細胞を誘導することもできる。本発明で用いるEdn-1阻害剤は、少なくともEnd-1のエンドセリンA受容体への結合を阻害できるものであればよく、例えば、BQ-123、ボセンタン、テゾセンタン、ダルセンタン、アトラセンタン、シタクセンタンなどが挙げられる。Edn-1阻害剤の培地中の濃度は、使用するEdn-1阻害剤に応じて当業者により適宜選択可能であるが、例えば、BQ-123を用いる場合、典型的には0.1 μM～100 μM、好ましくは1 μM～50 μM、さらに好ましくは5 μMから20 μM（例えば、10 μM）である。Edn-1阻害剤は、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　PA1-EM細胞誘導の際には、浮遊培養を行うことが好ましく、さらには、振とう培養および／または撹拌培養を行うことも好ましい。PA1-EM細胞誘導の培養期間も、PA1-EM細胞が得られる限り特に限定されないが、典型的には、３日間～６日間であるが、振とう培養の有無等により適宜変更することができる。
　PA1-EM細胞誘導に用いる線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factors；FGF）は、富士フィルム和光純薬株式会社等の市販されているものを使用することができる。FGFは、ヒトでは22種類知られており、細胞の増殖因子として機能するものであればいずれも用いることができるが、本発明のNCCからPA1-EM細胞への誘導の場合には、好ましくはFGF-8である。ヒトにおいて、FGF-8の機能を有するアイソフォームとして、FFG-8a、FGF-8b、FGF-8e、FGF-8Fが知られており、いずれを用いてもよいが、好ましくはFGF-8bである。FGFは、２種以上を組み合わせて用いてもよい。FGFの培地中の濃度は、使用するFGFに応じて当業者により適宜選択可能であるが、例えば、FGF-8を用いる場合、典型的には1～500 ng/ml、好ましくは10～300 ng/ml、より好ましくは50～200 ng/ml（例えば、100 ng/ml）である。
　後述の実施例で示される通り、PA1-EM細胞誘導の際にBMPを用いることで、PA1-EM細胞への誘導効率が向上することが示された。よって、PA1-EM細胞誘導の際の培地には、BMPが含まれていることが好ましい。BMPとしては、例えば、BMP2、BMP3、BMP3b、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP10、BMP11、BMP12、BMP13、BMP14、BMP15、BMP16、BMP17、BMP18などが挙げられるが、なかでもBMP4、BMP2およびBMP7が好ましく、特にBMP4が好ましい。BMPは、２種以上を組み合わせて用いてもよい。BMPの培地中の濃度は、添加するBMPの種類によって適宜調整されるが、例えば、BMP4を用いる場合、典型的には1～50 ng/mL、好ましくは2～30 ng/mL、より好ましくは2.5～10 ng/mLである。
　本発明のさらに別の態様において、PA1-EM細胞（以下、「本発明のPA1-EM細胞」とも称する。）も提供される。前記PA1-EM細胞は、下顎のPA-EM細胞であり、典型的には、下記の特徴（ａ）～（ｃ)を全て有する。
　（ａ） HOXを発現していない神経堤細胞由来である
　（ｂ） DLX5、PRRX1およびTWIST1を発現している
　（ｃ） 上皮シグナルに反応し、パターニングが誘導可能である
　前記PA1-EM細胞は、上記PA1-EM細胞誘導方法により得られるものであってもよく、別の方法により得られるものであってもよい。また、本発明のPA1-EM細胞は、さらに特徴（ｄ）アクチンフィラメント（「F-アクチン」、または「アクチンストレスファイバー」とも称される。）を有する、との特徴を有し得る。上記特徴（ａ）、（ｃ）、ならびに特徴（ｂ’） POU3F3およびCYP26A1を発現している、を有する（さらに上記特徴（ｄ）を有していてもよい）PA1-EM細胞は、上顎のPA-EM細胞といえる。
　本発明のPA1-EM細胞は、典型的には、細胞集塊の形態である。一態様において、PA1-EM細胞集塊は、表面の領域（表面ゾーン）、中心の領域（中心ゾーン）と、表面ゾーンおよび中心ゾーンの間に位置する中間の領域（中間ゾーン）を有する。かかる中心ゾーンには、DLX2単一陽性の細胞が、中間ゾーンにはDLX2+ DLX5+ 細胞が、表面ゾーンにはDLX2+ DLX5+ HAND2+ 細胞が含まれ得る。よって、本発明の別の一態様において、DLX2単一陽性の細胞を含む中心ゾーン、DLX2+ DLX5+ 細胞を含む中間ゾーン、DLX2+ DLX5+ HAND2+ 細胞を含む表面ゾーンを含む細胞集塊（下顎のPA1-EM細胞集塊）が提供される。
　上記特徴（ａ）において、「HOXを発現していない」とは、少なくともHOXA2およびHOXA3を発現していないことを意味する。HOXを発現していない細胞は、典型的には、本発明のNCCの製造により製造することができる。また、上記特徴（ｃ）において、「上皮シグナル」とは、脊椎動物の胎仔期に一時的に発生する第一咽頭弓で発現する上皮シグナルを意味する。上皮シグナルの主要なものとして、具体的には、近位-口腔側のシグナルである、Fgf8とソニック・ヘッジホッグ（Shh）の組合せ、遠位-口腔側のシグナルである、ShhとBMP4の組合せ、Fgf8とShhの組合せ、およびEdn-1とBMP4の組合せ、遠位-反口腔側のシグナルである、Edn-1とBMP4の組合せ、近位-反口腔側のシグナルである、End-1などが挙げられる（図３９Ａも参照のこと）。「上皮シグナルに反応し、パターニングが誘導可能」とは、上記各上皮シグナルに応じて、PA1-EM細胞が特異的な遺伝子を発現するようになることを意味しており、例えば、近位-口腔側のシグナルであるFgf8とShhにより、PA1-EM細胞がPAX9、LHX8などの遺伝子を発現するようになり、また遠位-反口腔側のシグナルである、Edn-1およびBMP4により、PA1-EM細胞がGSC、MSX2などの遺伝子を発現するようになる。上記特徴（ｄ）において、アクチンフィラメントは、球形(globular)アクチン（G-アクチン）が多数重合した糸状(filamentous)の重合体であり、アクチンフィラメントの存在は、下述のファロイジン染色により確認することができる。
　下述の実施例で示される通り、本発明のNCCだけでなく、従来の二次元での培養方法により得られたNCCも、アクチンフィラメントの形成の阻害することで、効率よくPA1-EM細胞へと誘導できる。よって、本発明のPA1-EM細胞の製造に用いるNCCは、特に限定されない。また、別の態様において、NCC（一態様において、二次元条件下で培養されたNCC）をアクチンフィラメント形成阻害剤の存在下でPA1-EM細胞へと分化誘導する工程を含む、PA1-EM細胞の製造方法も提供される。PA1-EM細胞へと分化誘導する具体的な方法は、上述の
本発明のNCCから下顎のPA1-EM細胞への誘導方法に関する記載が全て援用される。
　本発明で用いるアクチンフィラメント形成阻害剤としては、例えば、Y-27632、サイトカラシンA、サイトカラシンB、サイトカラシンC、サイトカラシンD、サイトカラシンE、ラトルンクリンA、ラトルンクリンB、ウィスコスタチン、BDM、ラトルンキュリン、Chaetoglobosin Aなどが挙げられる。アクチンフィラメント形成阻害剤の培地中の濃度は、使用するアクチンフィラメント形成阻害剤に応じて当業者により適宜選択可能であるが、例えば、Y-27632またはその塩（例：Y-27632二塩酸塩等）を用いる場合、典型的には0.5 μM～500μM、好ましくは2 μM～200 μM、さらに好ましくは 10μM～100μM（一態様において、50 μM）である。アクチンフィラメント形成阻害剤は、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　より具体的には、例えば、PA1-EM細胞を、Fgf8b、SAG、BQ-123、LDN193189を添加した基礎培地（例：StemFit Basic03培地等）で約3日間培養することで、細胞がPAX9およびLHX8を発現する場合には、該PA1-EM細胞は近位-口腔側の上皮シグナルに応答し、パターニングが誘導可能であったと評価することができる。また、例えば、PA1-EM細胞を、Fgf2、Endothelin-1、BMP4を添加した基礎培地（例：StemFit Basic03培地等）で約3日間培養することで、細胞がGSCおよびMSX2を発現する場合には、該PA1-EM細胞は遠位-反口腔側の上皮シグナルに応答し、パターニングが誘導可能であったと評価することができる。
　また、このように誘導したPAX9およびLHX8を発現する近位-口腔側細胞、ならびにGSCおよびMSX2を発現する遠位-反口腔側細胞をさらに分化誘導することもできる。例えば、近位-口腔側細胞を、FGF8b、SAG、CHIR99021、およびアクチビン A(R&D)を添加した基礎培地（例：Basic03等）で約4日間培養することなどにより、歯原性間葉細胞を誘導することもできる。歯原性間葉細胞は、歯の主体をなす象牙質の出発細胞となり得るため、本発明のPA1-EM細胞および歯原性間葉細胞は、歯の再生においても有用であり得る。
　骨オルガノイドは、例えば、（Ｉ）本発明のPA1-EM細胞から、上記方法により、遠位-反口腔側細胞を誘導し、(ＩＩ)該遠位-反口腔側から骨前駆細胞を誘導し、(ＩＩＩ)該骨前駆細胞から骨オルガノイドを誘導する工程などにより、製造することができる。上記工程（ＩＩ）は、例えば、遠位-反口腔側細胞を、骨前駆細胞誘導培地（例えば、Egf、Fgf2、BMP2、CHIR99021、SAGを添加したStemFit Basic03培地等）で２日間～４日間浮遊培養することなどにより行われる。上記工程（ＩＩＩ）は、該骨前駆細胞を骨細胞分化誘導培地中（例えば、MSCgoTM Osteogenic XF Mediumなど）で２０日間～３０日間浮遊培養することにより行われる。工程（ＩＩＩ）は、途中で（例えば、工程（ＩＩＩ）開始から１０日目～２０日目のどこかで、６日目～１０日目のどこかで、など）培地を他の骨細胞分化誘導培地（例えば、デキサメタゾン（通常では、骨芽細胞誘導時に使用する濃度の1/10で用いる）、βグリセロフォスフェートおよびアスコルビン酸を含むStemFit Basic03培地等）に交換してもよい。この場合において、典型的には、前半の工程は、主に骨芽細胞および骨細胞への分化誘導を目的としており、後半の工程は、骨細胞の成熟を目的とする。これにより、骨細胞の成熟における死細胞の発生が抑制され得る。また、工程（ＩＩＩ）の途中で他の骨細胞分化誘導培地に培地を交換した場合に、交換後数日目（例えば、６日目～１０日目）に、さらに別の培地（例えば、工程（ＩＩＩ）の最初で用いた骨細胞分化誘導培地など）に培地を交換してもよい。具体的な方法の概要を図４０および図５９に示すが、これらの方法に限定されるものではない。
　また、上記の方法により製造された骨オルガノイドは、さらに成熟させてもよい。かかる方法として、例えば、哺乳動物などの生体に移植する（例えば、腎被膜下などに移植する）方法などが挙げられる。後述の実施例で示されるとおり、骨オルガノイドを生体に移植することで、石灰化物の形成、密な骨組織の形成が認められ、さらに骨組織内部にはドナーの骨細胞の密なネットワーク形成が認められる骨オルガノイドへと成熟することが可能である。
　また、骨オルガノイドは、MSCを用いて、WO 2020/226043に記載の方法により製造することもできる。具体的には、MSCを接着培養により増殖させてシート状（細胞シート）にし、当該細胞シートを培養容器から剥離した後に、細胞シートを浮遊培養して立体的な間葉系幹細胞集塊を得て、当該細胞集塊をゲルに包埋した状態で骨分化誘導培地を用いて培養することで、骨オルガノイドを製造することができる。かかる方法では、ゲルとして、多糖を主成分とするゲルであることが好ましく、例えば、Vitrogel（The Well Bioscience社）を用いることができる。
　NCCから誘導した神経前駆細胞を含む細胞集塊を、神経細胞分化誘導培地で浮遊培養することで、神経オルガノイドを製造することができる。前記浮遊培養条件下で細胞集塊の培養を続けることで、神経オルガノイドは自己組織化的に誘導され得る。かかる神経細胞分化誘導培地として、例えば、Wntシグナルの阻害剤およびALK阻害剤を含む基礎培地（例：N2培地等）が挙げられる。Wntシグナル阻害剤としては、例えば、DKK1タンパク質、スクレロスチン、IWR-1e、IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、C59、ICG-001、FH535、WIKI4、KYO2111、PNU-74654、XAV939、これらの誘導体などが挙げられる。ALK阻害剤については、上述のものと同様のものが挙げられる。
　接着培養を行う際に用いられる培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例：基底膜調製物、フィブロネクチン、ラミニンまたはその断片、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、シンセマックス、ビトロネクチン等の細胞外マトリクス等、または、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、または、正電荷処理等の表面加工）されたものが挙げられる。中でも、フィブロネクチンでコーティングされた培養容器が好ましい。
　本発明の分化誘導法は、全部または一部の期間、フィーダーフリー条件下および／またはゼノフリー条件下での培養であってもよい。臨床での使用の観点からは、本発明の分化誘導法は、全期間がフィーダーフリーかつゼノフリー条件下で行われることが好ましい。
　本発明の分化誘導法は、得られた目的の細胞またはオルガノイドを回収する工程を含んでいてもよい。回収した細胞は、細胞凍結保存液を用いて凍結保存してもよい。また、容器に回収した細胞は、セルカンターにてセルカウントを行ってもよく、細胞の表面マーカーに対する抗体により標識し、フローサイトメトリーやマスサイトメトリー、磁気細胞分離法などにより選別してもよい。
　また、別の態様において、本発明の分化誘導法により得られた細胞またはオルガノイド（以下、「本発明の分化細胞またはオルガノイド」とも称することがある。）が提供される。
　本発明の分化誘導法における、浮遊培養、振とう培養や撹拌培養などの培養条件や培養方法、目的細胞の選別方法、培地への添加物、培養容器の具体例や定義等は、上記「１．神経堤細胞の製法」で記載した内容がすべて援用される。
３．分化細胞またはオルガノイドの用途
　本発明の分化細胞またはオルガノイドは、再生医療に好適に用いることができるため、別の態様において、本発明の分化細胞またはオルガノイドを含有してなる、移植療法剤（以下、「本発明の移植療法剤」と称することがある。）が提供される。また、本発明の分化細胞またはオルガノイドの有効量を、治療の対象とする哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）に投与または移植する、組織（例えば、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織（例：骨格筋組織等）など）の損傷（欠損も含まれる）または疾患の治療または予防方法も、本発明に包含される。また、「組織の損傷の治療」には、損傷した組織の再生も包含される。損傷した組織の再生には、完全な組織の再生だけでなく、組織様構造が形成されている場合も含まれる。例えば、骨組織の場合に、CT（Computed Tomography）検査において再生された部位が骨組織であるかを判定することまでは要しない。
　本発明の移植療法剤は、それを必要とする対象に生体内に投与または移植して用いることができる。移植は、本発明の分化細胞またはオルガノイドを一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、皮下、腹腔内、腹膜上皮、骨組織（例：顎骨組織等）、軟骨組織、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。移植される細胞またはオルガノイドは、治療上有効量を投与すればよく、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、10×104細胞～10×1011細胞程度とすることができる。
　本発明の分化細胞またはオルガノイドの生体への移植の目的は、損傷した組織の直接的な再生を目的としたものでも、あるいは本発明の分化細胞またはオルガノイドが分泌する因子による間接的な効果（例えば、パラクリン効果など）を目的としたものであってもよい。間葉系幹細胞は、例えば、急性心筋梗塞、脳卒中、多系統萎縮症（MSA）、移植片対宿主病、クローン病、虚血性心筋症、脊髄損傷などの疾患に対して治療効果を発揮し得る。メラノブラストやメラノサイトは、たとえば、眼皮膚白皮症（アルビニズム）、尋常性白斑などの色素異常症などの疾患に対して治療効果を発揮し得る。骨細胞や骨オルガノイドは、例えば、難治骨折、歯周炎または骨摘出術後の広範囲骨欠損症例などの疾患に対して治療効果を発揮し得る。また、神経前駆細胞、神経細胞または神経オルガノイドは、例えば、脳血管障害、脳損傷、脊髄損傷、神経変性疾患などの疾患に対して治療効果を発揮し得る。
　本発明の分化細胞またはオルガノイドを、移植療法剤として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞から樹立したiPS細胞に由来する細胞またはオルガノイドを用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座或いはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞などである。年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコーンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。
　本発明の分化細胞またはオルガノイドは、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。従って、一態様において、本発明の分化細胞またはオルガノイドを製剤化する工程を含む、移植療法剤の製法も提供される。かかる製法は、本発明の分化細胞またはオルガノイドを準備する工程を含んでいてもよい。さらに、本発明の分化細胞またはオルガノイドを保存する工程を含むこともできる。
　当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の細胞は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。
　本発明の移植療法剤は、細胞の凍結保存に通常使用される条件で凍結保存された状態で提供され、用時融解して用いることもできる。その場合、血清若しくはその代替物、有機溶剤（例、DMSO）等をさらに含んでいてもよい。この場合、血清若しくはその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが約1～約30%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが0～約50%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。
　また、本発明の分化細胞またはオルガノイドは、組織の損傷または疾患の治療または予防に有用な薬剤である候補薬剤をスクリーニングする方法にも用いることができる。よって、本発明のさらに別の態様において、被験物質の存在下または非存在下で、本発明の分化細胞またはオルガノイドを培養する工程を含む、疾患の治療または予防薬のスクリーニング方法が提供される。かかる組織の損傷または疾患としては、本発明の移植療法剤の治療目的となる上記の組織の損傷または疾患と同様のものが挙げられる。また、スクリーニングに用いる分化細胞またはオルガノイドは、疾患、例えば骨形成不全症などの骨疾患、の表現型を示ものであってもよい。かかる場合に、該表現型の変化に基づき、候補薬剤のスクリーニングを行うこともできる。
　スクリーニング法に用いる被験物質としては、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。
　上記被験物質はまた、（1）生物学的ライブラリー、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam（1997）Anticancer Drug Des. 12:145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al.（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-13; Erb et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-6; Zuckermann et al.（1994）J. Med. Chem. 37:2678-85; Cho et al.（1993）Science 261:1303-5; Carell et al.（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al.（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; Gallop et al.（1994）J. Med. Chem. 37:1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten（1992）Bio/Techniques 13:412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam（1991）Nature 354:82-4）、チップ（Fodor（1993）Nature 364:555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al.（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith（1990）Science 249:386-90; Devlin（1990）Science 249:404-6; Cwirla et al.（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-82; Felici（1991）J. Mol. Biol. 222:301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１：NCC集塊の誘導
＜ヒトiPS細胞の維持培養＞
　エピゾーマルベクターを用いて作製したヒトiPS細胞 (1231A3株, Ff-I 14s04株, Ff-I 14s04 HLA-KO株, 骨形成不全症患者由来iPS細胞株)を、iMatrix-511 (Nippi社製)コートした培養プレート上でStemFit AK03N培地 (Ajinomoto社製)を用いて培養した。培地交換は2日毎に行った。
＜iPS細胞からNCC集塊への誘導＞
　iPS細胞からNCC集塊への誘導方法(三次元（3D） NCC誘導法)の概要を、図１に示す。具体的には、次の手順で行った。維持培養したヒトiPS細胞(1231A3株(研究用ゼノフリー細胞株))をAccutase(Innovative Cell Technologies社製)を用いてシングルセルに分散した後、StemFit Basic03 (AK03NからbFGFを引いたもの)(Ajinomoto社製)に10 μM Y-27632(FUJIFILM Wako社製)を加えた培養液に懸濁し、96 well V-bottom 超低接着培養プレート(住友ベークライト社製)に1.0×104cells/100μl/wellとなるよう播種した。これを1200rpmで3min遠心し、プレート底に細胞を集合させた。これを1日培養すると、細胞は凝集し、細胞集塊を形成した。次にStemFit Basic03 培地に10 μM SB431542 (Selleck社製)と10 ng/mL BMP4 (R&D Systems社製)を加えた培養液で細胞集塊を1日間培養した（図１のD1～D2の工程に該当し、以下では「SBおよびBMP作用工程」と称することがある。）。その後、細胞集塊を１塊ずつ48 well 低接着培養プレート(Iwaki社製)に移し、StemFit Basic03培地に10 μM SB431542と1 μM CHIR99021(Axon Medchem社製)を加えた培養液中で振とう培養容器（CS-LR（TAITEC製）による振とう培養（120rpm）を3日間行った（図１のD2～D3の工程に該当し、以下では「NCC誘導工程」と称することがある。）。その結果、直径500μm程度の球状の細胞集塊が得られた（図１、図２Ａ、図３、図８Ａ）。
＜NCCの特性解析＞
　得られた細胞集塊について、フローサイトメトリーによりCD271陽性細胞の割合を測定した。まず、細胞集塊をAccutase(Innovative Cell Technologies社製)を用いてシングルセルに分散した後、CD271抗体(BD Biosciences社製, 560326)をFACSバッファー(0.1% ヒト血清含有PBS)で200倍希釈した抗体希釈液中で4℃ 60分間作用させた。非特異的バックグラウンドシグナルの除去のためアイソタイプコントロールを設けた。抗体作用後の細胞を35 μm フィルター(Falcon社製)でフィルタリングしたものをFACS AriaII (BD Biosciences社製)にてフローサイトメトリー解析し、CD271強陽性細胞の割合を測定した。FCMデータはFlowJo software (BD Biosciences社製)で画像化した。フローサイトメトリーの結果、細胞集塊には、94.6%もの非常に高い割合でCD271強陽性細胞が含まれることが示された（図２Ｂ）。
　次に、細胞集塊について、免疫染色によりCD271、SOX10およびPAX6の発現を確認した。まず、細胞集塊を4％ パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液にて固定したものを、Tissue-Tek OCT compound(サクラファインテックジャパン社製)に包埋した。クライオスタット(ライカ社製)にて薄切し、12 μm厚の凍結切片を作製した。切片はPBS洗浄後、3% TritonX-100(Sigma社製)を用いて透過処理を室温で15分間行った。Blocking one Histo(ナカライテスク社製)を用いて室温で1時間ブロッキング処理を行った。CD271抗体(Advanced Targeting System社製, AB-N07)、SOX10抗体(R＆D社製, AF2864)、PAX6抗体(abcam社製, ab195945)をCan Get SignalTM immunostain SolutionB(TOYOBO社製)で200倍希釈した抗体希釈液中で4℃一晩作用させた。2次抗体をCan Get SignalTM immunostain SolutionBで200倍希釈した抗体希釈液中で室温3時間作用させた。核染色として、4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(同仁化学研究所製)を室温10分間作用させた。VECTASHIELD（登録商標） Antifade Mounting Medium(VECTOR LABORATORIES社製)にて封入を行った。サンプルの蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡Olympus FV3000(Olympus社製)にて観察した。免疫染色の結果、細胞集塊内部は、CD271およびSOX10陽性であり、PAX6陰性のNCCで主として構成されていることが示された（図２Ｃ）。また、細胞培養開始から1日目（D1）～5日目（D5）までの各日数における細胞集塊について、免疫染色によりCD271、SOX10およびPAX6の発現を確認した。D4(NCC誘導工程開始から2日経過後)から、SOX10およびCD271陽性のNCCが出現し、D5でそのNCCの割合が上昇することが示された（図３）。
　従来法（図４上）により、接着培養により製造したNCC(二次元（2D） NCC誘導法)との遺伝子発現パターンを比較した。2D NCC誘導法では、iPS細胞を、iMatrix-511でコーティングした6wellを用いて、10 μM SB431542および1 μM CHIR99021を含む培養液中でiPS細胞を10日間培養し、得られたNCC集塊から、CD271強陽性細胞をフローサイトメトリーにて選別することでNCCを単離した（得られたNCCを「2D iNCC」または「2D 271H」と略記する）。また、3D NCC誘導法の場合にも、D5のNCC集塊から、CD271強陽性細胞をフローサイトメトリーにて選別することでNCCを単離した（得られたNCCを「3D iNCC」または「D5 271H」と略記する）（図４中央）。
　次いで、各NCCについて、NCC関連遺伝子（NGFR、SOX10、TFAP2AおよびPAX3）ならびに多能性細胞マーカーPOU5F1（Oct4）の遺伝子の発現レベルを、RT-qPCRにより測定した。まず、細胞集塊のTotal RNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen社製)で回収し、DNase-one Kit(Qiagen社製)にてゲノムDNAの除去を行った。PrimeScript RT Master Mix(Takara社製)を用いて逆転写反応を行い、500 ng Total RNAからsingle-stranded cDNAを合成した。cDNAをThunderbird SYBR qPCR Mix(TOYOBO社製)と合わせ、StepOnePlusTM Real-Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いてRT-qPCR測定を行った。NCC関連遺伝子は、2D iNCCおよび3D iNCCいずれにおいても同程度の発現が認められ、またいずれのNCCも多能性細胞マーカーPOU5F1の発現は消失することが示された（図４下）。RT-qPCRで用いたプライマーは、非特許文献３のSupplementary Table 2に記載のものと同じである。
　また、細胞培養開始から0日目（D0）～5日目（D5）までの各日数における細胞集塊（いずれもCD271高発現細胞の選別はしていない)、ならびにD5 271Hおよび2D 271Hについて、RT-qPCRによりNCC関連遺伝子（NGFR、SOX10、TFAP2AおよびPAX3）、神経板境界（Neural plate border）マーカー遺伝子（DLX5およびMSX2）、ならびに多能性細胞マーカーOct4の発現レベルを測定した。結果を図５および６に示す。図５より、SBおよびBMP作用工程からNCC誘導工程に切り替えてから１日経過後（D3）において、神経板境界関連マーカーが上昇することが示された。図５および６より、D5の細胞は、D5 271Hの細胞はほぼ同程度のNCC関連遺伝子を発現していること、ならびに2D 271Hの細胞ともほぼ同程度のNCC関連遺伝子を発現していることが示された。RT-qPCRで用いたプライマーのうち、非特許文献３のSupplementary Table 2に記載のもの以外のプライマーの塩基配列を表１に示す。表１には、本実施例以外の実施例で用いたプライマーの塩基配列も記載している（表中、Fwはフォワードプライマーを示し、Revはリバースプライマーを示す）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　骨形成タンパク質として、BMP4の代わりにBMP2(R&D Systems社製)またはBMP7(R&D Systems社製)を10 ng/mLで用いた場合にも、同様にNCC集塊が得られた（図７）。さらに、ALK阻害剤として、SB431542の代わりにA-83-01 (TOCRIS社製)を1.0 μMで用いた場合にも、同様にNCC集塊が得られた（図７）。
　また、1231A3株以外のiPS細胞株（Ff-I 14s04株とFf-I 14s04 HLA-KO株および骨形成不全症患者由来iPS細胞株）を用いた場合にも、同様にNCC集塊が得られた（図８）。この際、細胞株毎に播種細胞数とBMP4の濃度を調整した。具体的には、Ff-I 14s04株とFf-I 14s04 HLA-KO株は3.0×103cells/100μl/wellで播種し、BMP4濃度は2.5 ng/mLに設定した。骨形成不全症患者由来iPS細胞株は2.0×103cells/100μl/wellで播種し、BMP4濃度は2.5 ng/mLに設定した。
　従来法において、接着培養と浮遊培養との相違点以外は3D NCC誘導法と同じ条件下で培養を行った。具体的には、次の手順で行った。iPS細胞を、iMatrix-511でコーティングした6wellを用いて、10 μM SB431542および1 μM CHIR99021を含む培養液中でiPS細胞を4日間培養（図９のSB CHIR D4）するか、あるいは10 μM SB431542および10 ng/mL BMP4を含む培養液中でiPS細胞を1日間培養した後、10 μM SB431542および1 μM CHIR99021を含む培養液中で該細胞を3日間培養する（図９のSB BMP4 D1 SB CHIR D3）ことで、細胞集塊を得た。得られた細胞集塊をフローサイトメトリーにより解析した結果、いずれの細胞集塊もCD271高発現細胞がほとんど含まれていないことが示された。また、上述の3D NCC誘導法において、振とう培養のNCCの誘導効率への影響を評価した。その結果、振とう培養を行わない場合でもCD271高発現NCCが高効率で得られたが（87.0%）、NCC誘導工程を振とう培養により行うことにより、CD271高発現NCCの効率がさらに向上することが示された（図９下）。
実施例２：NCC集塊誘導のための培養条件の検証
<SBおよびBMP作用工程の検証１>
　SBおよびBMP作用工程の至適作用期間を探索するため、SB431542およびBMP4の作用期間を変動させることで、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率の変動を検証した。また、免疫染色により、CD271(NCCマーカー)、PAX6(神経外胚葉マーカー)およびE-Cadherin(上皮細胞マーカー)の各遺伝子の発現パターンを検証した。この際、振とう培養の期間は固定した。結果を図１０および１１に示す。図１０より、SBおよびBMP作用工程を1日間とした場合、高効率にNCCが誘導されるが（A）、SBおよびBMP作用工程を行わなかった場合ならびにSBおよびBMP作用工程を延長した（2日間行った）場合には、CD271強陽性細胞率の低下が認められた（BおよびC）。図１１より、SBおよびBMP作用工程を1日間とした場合、高効率にCD271強陽性のNCCが誘導される一方で、PAX6とE-Cadherin陽性の細胞は誘導されなかった（A）。また、SBおよびBMP作用工程を行わなかった場合には、PAX6陽性の神経外胚葉の誘導が認められ(B)、またSBおよびBMP作用工程を延長した（2日間行った）場合には、細胞集塊周囲にE-Cadherin陽性の上皮細胞の誘導が認められた。
<SBおよびBMP作用工程の検証２>
　SB431542およびBMP4の作用期間を変動させ、さらに最大で10日間培養させることで、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率の変動を検証した。また、RT-qPCRにより、CD271(NGFR)の遺伝子の発現レベルを測定した。この際、振とう培養は、NCC誘導工程開始時から行った。iPS細胞からNCC集塊への誘導方法の概要を、図１２に示す。結果を図１３～１６に示す。図１３より、SBおよびBMP作用工程を6時間（SB BMP4 6h）または12時間（SB BMP4 12h）行った後、5日目にフローサイトメトリーにより検証した場合には、SBおよびBMP作用工程を1日間とした場合（SB BMP4 D1）と比較して、NCC誘導効率が低下することが示された。これは、SBおよびBMP作用工程の期間が短いために、NCCだけでなく神経外胚葉も同時に誘導されたためであると推測される。また、図１４より、SBおよびBMP作用工程を2日間（SB BMP4 D2）または3日間（SB BMP4 D3）行った後、5日目にフローサイトメトリーにより検証した場合には、いずれもNCC誘導効果が高いことが示された。一方で、SBおよびBMP作用工程を行わずに5日目にフローサイトメトリーにより検証した場合には、NCC誘導効果が低いことが示された。図１５より、培養期間を7日まで延長した場合には、SBおよびBMP作用工程の期間に関わらず、細胞集団全体のCD271発現が低下することが示された。これは、誘導5日から7日までの間に、NCCの他細胞への分化が進行するためと推測される。また、RT-qPCRの結果でも、培養5日目を過ぎると、NGFR(CD271)の発現レベルが低下することが示された（図１６）。
　以上より、SBおよびBMP作用工程に関して、NCC誘導効率の点から好ましい方法のパターンを図１７に例示する。
<NCC誘導工程の検証>
　次に、NCC誘導工程の至適作用期間を探索した。NCC誘導期間を、3日間から5日間または8日間に延長した場合において、CD271強陽性細胞率をフローサイトメトリーにて検証した。その結果、NCC誘導期間を延長すると、CD271強陽性細胞率が時間依存的に低下することが示された（図１８）。
<振とう培養の検証＞
　最後に、振とう培養によるNCC誘導効率の影響を検証した。SBおよびBMP作用工程開始時から振とう培養を開始し、培養5日目、7日目および10日目において、フローサイトメトリーにてCD271強陽性細胞率を測定した。また、免疫染色により、CD271(NCCマーカー)およびE-Cadherin(上皮細胞マーカー)の各遺伝子の発現パターンを検証した。この際、BMP作用期間は、6時間、12時間、1日間または2日間とした。iPS細胞からNCC集塊への誘導方法の概要を、図１９に示す。また、結果を図２０～２２に示す。図２０より、SBおよびBMP作用工程の開始から振とう培養をすると、SBおよびBMP作用工程が6時間の場合（SB BMP4 6h）および12時間の場合（SB BMP4 12h）いずれも、5日目にNCCを誘導することができたが、12時間の場合は、SBおよびBMP作用工程が1日間の場合（SB BMP4 D1）と同程度の高効率なNCCへの誘導が示された。しかしながら、免疫染色より、SBおよびBMP作用工程を1日間または2日間行った場合には、5日目に細胞集塊の周囲に上皮細胞が認められた（図２１）。さらに、NCC誘導工程を7日間または10日間に延長した場合には、いずれもCD271強陽性細胞率が低下することが示された（図２２）。
　以上より、SBおよびBMP作用工程開始時から振とう培養を行った場合に、NCC誘導効率の点から好ましい方法の概要を図２３に例示する。
実施例３：NCCの分化能の検証
　実施例１（本発明のNCC誘導法）で得られたNCCの分化能を検証した。概要を図２４に示す。具体的には、実施例１で誘導したNCCについて、末梢神経細胞、メラノブラスト、間葉系幹細胞および第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞への分化能を検証した。
＜NCC集塊から末梢神経細胞への誘導＞
　本誘導方法の概要を図２５Ａに示す。具体的には、次の手順で行った。実施例１で得られたNCC集塊を96 well U-bottom 超低接着培養プレート(住友ベークライト社製)に移し、Neurobasal medium (Thermo Fisher Scientific社製) にB27 supplement (Thermo Fisher Scientific社製)、N-2 supplement (Thermo Fisher Scientific社製)、2 mM L-glutamine (FUJIFILM Wako社製)、10 ng/mL BDNF (FUJIFILM Wako社製)、GDNF (FUJIFILM Wako社製)、NT-3 (FUJIFILM Wako社製)、NGF (FUJIFILM Wako社製)を加えた誘導培地で14日間培養した。培地交換は3日毎に行った。末梢神経細胞マーカーであるPeripherinの蛍光免疫染色で確認したところ、末梢神経細胞へと分化できていることが示された（図２６Ａ）。
＜NCC集塊からメラノブラストへの誘導＞
　接着培養により得られたNCCから、メラノブラストへの誘導方法は知られているが（例えば、Mica et al., Cell Reports, 2013; 3(4):1140-1152、Callahan et al., J. Vis Exp, 2016; (109): e53806など）、これらの方法では死細胞が多く発生し、誘導効率にばらつきがありまた誘導効率も十分とはいえない。そこで、実施例１で得られたNCC集塊から、浮遊培養によりメラノブラストへの分化誘導できるか否かを検証した。本誘導方法の概要を図２５Ｂに示す。具体的には、次の手順で行った。実施例１で得られたNCC集塊を96 well U-bottom 超低接着培養プレート(住友ベークライト社製)に移し、StemFit Basic03培地に 1 μM CHIR99021, 25 ng/mL BMP4、100 nM Endothelin-3 (TOCRIS社製)を加えた誘導培地で6日間培養した。培地交換は誘導3日目に行った。メラノブラストマーカーであるMITFの蛍光免疫染色で確認したところ、メラノブラストへと分化できていることが示された（図２６Ｂ）。
＜NCC集塊から間葉系幹細胞(MSC)への誘導＞
　本誘導方法の概要を図２７に示す。具体的には、次の手順で行った。実施例１で得られたNCC集塊をAccutaseにてシングルセルに分散させ、CD271強陽性細胞をフローサイトメトリーにて選別した。選別した細胞をStemFit Basic03培地に10 μM SB431542、20 ng/mL Egf(FUJIFILM Wako社製)、Fgf2(FUJIFILM Wako社製)を加えた培養液に懸濁後、フィブロネクチンコーティング培養プレートに1 × 104 cells/cm2の細胞濃度で播種し、細胞を培養した。培地交換は3日毎に行った。その後、第二継代のNCCをAccutaseにてシングルセルに分散させ、StemFit Basic03培地に10 μM SB431542、20 ng/mL Egf、Fgf2を加えた培養液に懸濁し、フィブロネクチンコーティング培養プレートに1 × 104 cells/cm2の細胞濃度で播種した。播種1日後にPRIME-XV MSC Expansion XSFM medium (Irvine Scientific社製)で培地交換し、MSC誘導を開始した。4日毎にAccutaseを用いて継代を行い、1 × 104 cells/cm2となるように培養プレートに播種し、細胞を培養した。MSC誘導培養14日目にフローサイトメトリーを用いて、ヒトMSCマーカー(CD105、CD90、CD73、CD44)の発現を確認したところ、MSCへと分化できていることが示された（図２８）。
＜NCC集塊から第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞への誘導＞
　脊椎動物の発生において、NCCは神経管の背側隆起から剥離し、その後、神経形成中に発生中の胚内で様々な器官（例えば、第一咽頭弓（First pharyngeal arch ectomesenchyme）（PA1）、第二咽頭弓（Second pharyngeal arch ectomesenchyme）（PA2）、第三咽頭弓（Third pharyngeal arch ectomesenchyme）（PA3）、前頭鼻隆起（Frontonasal process; FNP）など）に遊走および分化する。しかしながら、NCCからin vitroで第一咽頭弓外胚葉性間葉（PA1-EM）細胞への選択的な誘導を達成した報告はされていない。PA1-EMの特徴を、図２９に概説する。
　NCC集塊からPA1-EM細胞を誘導するためには、NCC集塊のHOX遺伝子発現がネガティブである必要があるため、まず、実施例１で得られたNCC集塊について、RT-qPCRにてHOX遺伝子発現を確認した。ポジティブコントロールとして、レチノイン酸(Retinoic acid; RA)刺激を行うことで、HOX遺伝子発現を誘導したNCC集塊を用意した。各方法の概要を図３０Ａに示す。HOX遺伝子陽性NCC集塊の誘導は、誘導4日目から1.0μM RAを含む培地で細胞を培養することにより行った。具体的には、次の手順で行った。NCC集塊の誘導4日目から、StemFit Basic03 培地に10 μM SB431542、1 μM CHIR99021および1.0μM RA(Sigma社製)を加えた培養液で1日間培養することで、FOX遺伝子陽性NCC集塊を誘導した。NCC集塊におけるNCC関連遺伝子(NGFR、SOX10)の発現をRT-qPCRで確認した。RA刺激を行ってもNCC関連遺伝子の発現量は同等であった（図３０Ｂ）。次に、NCC集塊におけるHOX遺伝子（HOXA2、HOXA3）の発現をRT-qPCRで確認した。RA刺激を行ったNCC集塊では、HOX遺伝子の高発現が認められたが、RA未刺激のNCC集塊では、HOX遺伝子の発現は認められなかった（図３０Ｃ）。RT-qPCRで用いたプライマーのうち、非特許文献３のSupplementary Table 2に記載のもの以外のプライマーの塩基配列を表１に示す。
　次に、NCC集塊からPA1-EM細胞の誘導を行った。誘導方法の概要を図３１に示す。Fig8は、細胞の生存と増殖に必要な因子、Edn-1（Endothelin-1）は下顎選択に必要な因子、BMP4は遠位誘導に必要な因子として培地中に加えた。具体的には、次の手順で行った。NCC集塊を、StemFit Basic03培地に50 nM Endothelin-1 (Sigma社製)、100 ng/mL Fgf8b (FUJIFILM Wako社製)、2.5 ng/mL BMP4を加えた誘導培地中で、振とう培養容器による振とう培養を4日間行った。PA1-EM細胞への誘導を、形態および早期間葉系細胞マーカーのTWIST1と第一咽頭弓下顎突起外胚葉性間葉マーカーのDLX5に対する蛍光免疫染色で確認した。結果を図３２に示す。顕微鏡写真より、NCC集塊から誘導されたPA1-EM細胞集塊では、内部の細胞が増殖することで、集塊のサイズが大きくなることが示された（A）。SOX10およびTWIST1に対する蛍光免疫染色像より、PA1-EM細胞への誘導によってSOX10発現の明らかな減少が認められ、TWIST1陽性の外胚葉性間葉細胞に分化していることが確認された（B）。また、DLX5に対する蛍光免疫染色像より、誘導された外胚葉性間葉細胞はDLX5を高発現しており、該細胞はPA1-EM細胞の遺伝子的特徴を再現していることが示された。また、骨形成不全症患者iPS細胞株からも、同様にPA1-EM細胞を誘導することに成功した（図３３）。
　さらに、PA1-EM細胞誘導におけるNCCが、HOXネガティブであることの必要性の確認を行った。RA処理を行わずに誘導したNCC（HOX（+） NCC）と、RA処理を行ってHOX遺伝子を発現させたNCC（HOX（-） NCC）のそれぞれについて、PA1-EM細胞誘導を行った。各方法の概要を図３４上に示す。各PA1-EM細胞において、HOXB2およびDLX5の発現レベルをRT-qPCRにより測定した。その結果、HOX遺伝子を発現させたNCCを用いてPA1-EM細胞誘導を行った細胞では、DLX5の発現の上昇は認められなかった（図３４下）。また、接着培養(2D)により得られたNCCについても、同様の添加物存在下でPA1-EM細胞誘導を行ったところ、PRRX1の発現が著しく低く、DLX5の発現も低いことが示された（図３５上）。本方法の概要を図３５下に示す。このことから、PA1-EMの高効率な誘導には、浮遊培養(3D)により得られたNCCを出発とすることが重要であることが示された。RT-qPCRで用いたプライマーの塩基配列を、表１に示す。
＜NCC集塊からPA-EM細胞誘導における培養条件の検証＞
　PA1-EM細胞誘導におけるFgf8、EdnおよびBMP4のベストな組み合わせをRT-qPCRで検証した。Fgf8については、培地に添加しない場合には明らかな細胞死が誘発されたため、いずれの条件においても添加した。各方法の概要を図３６に示す。また、各方法により得られた細胞における、DLX、PRRX1およびTWIST1の発現レベルを図３７に示す。図３７より、DLX5の発現にはEdn-1が必須であることが示され、この結果は既報の動物実験の現象を再現するものであった。また、DLX5、PRRX1、TWIST1の発現レベルから、Fgf8、Edn-1およびBMP4をすべて培地に加える条件がPA1-EM細胞誘導の最適な条件であることが示された。RT-qPCRで用いたプライマーの塩基配列を、表１に示す。
実施例４：PA1-EM細胞集塊の第一咽頭弓内パターニング誘導能の検証
＜第一咽頭弓の近位-口腔側細胞への誘導＞
　PA1-EM細胞は、上皮シグナルに応答して、パターニングが誘導されることが知られている（図３９Ａ）。そこで、上述の方法により得られたPA1-EM細胞が第一咽頭弓内パターニング誘導能を有しているか否かを検証した。PA1-EM細胞集塊を、第一咽頭弓の近位-口腔側(大臼歯形成領域)細胞へと誘導させた。誘導方法の概要を図３８上に示す。具体的には、次の手順で行った。実施例３で得られたPA1-EM細胞集塊を、96 well U-bottom 超低接着培養プレートに移した。第一咽頭弓の近位-口腔側細胞への誘導のため、PA1-EM細胞集塊をStemFit Basic03培地に100 ng/mL Fgf8b、400 nM SAG (Selleck社製)、1.0 μM BQ-123 (Selleck社製)、0.5μM LDN193189 (TOCRIS社製)を加えた誘導培地で3日間培養した。第一咽頭弓の近位-口腔側マーカーであるPAX9およびLHX8についてRT-qPCRを行ったところ、第一咽頭弓の近位-口腔側細胞の誘導が確認された（図３９Ｂ）。RT-qPCRで用いたプライマーの塩基配列を、表１に示す。
＜第一咽頭弓の遠位-反口腔側細胞への誘導＞
　PA1-EM細胞集塊を、第一咽頭弓の遠位-反口腔側(顎骨骨化起始領域)細胞へと誘導させた。誘導方法の概要を図３８下に示す。具体的には、実施例３で得られたPA1-EM細胞集塊を、StemFit Basic03培地に20 ng/mL Fgf2、50 nM Endothelin-1、10 ng/mL BMP4を加えた誘導培地で3日間培養した。第一咽頭弓の遠位-反口腔側マーカーであるGSCおよびMSX2についてRT-qPCRを行ったところ、第一咽頭弓の遠位-反口腔側細胞の誘導が確認された（図３９Ｃ）。
実施例５：顎骨様組織体への誘導および該組織体のマウスへの移植
＜顎骨骨化起始領域細胞から顎骨様組織体への誘導＞
　実施例３で得られたPA1-EM細胞集塊に段階的な骨分化誘導を施し、顎骨様組織体を誘導した。誘導方法の概要を図４０に示す。具体的には、まず、PA1-EM細胞集塊を、StemFit Basic03培地に20 ng/mL Egf、Fgf2、50 ng/mL BMP2、3 μM CHIR99021、400 nM SAGを加えた誘導培地で3日間培養し、骨前駆細胞への誘導を行った。骨前駆細胞マーカーのSP7、RUNX2、DLX5に対するRT-qPCRで行ったところ、骨前駆細胞の誘導が確認された（図４１Ａ）。また、早期骨芽細胞マーカーALPLと未熟骨細胞マーカーのE11/gp38に対するRT-qPCRで行うことで、骨芽細胞や骨細胞までは分化が進行していないことが示された（図４１Ｂ）。
　次に、顎骨様組織誘導のため、細胞集塊をMSCgo Osteogenic SF,XF (Sartorius社製)にて16日間培養し、その後、StemFit Basic03培地に10 nMデキサメタゾン (Sigma社製)、10 mM βグリセロフォスフェート (Sigma社製)、50 μg/mlのアスコルビン酸(Sigma社製)を加えた骨分化誘導培地で8日間培養した。その結果、骨前駆細胞マーカーのSP7、RUNX2およびDLX5にはさらに発現上昇が確認された（図４２）。また、骨芽細胞マーカーのALPLと骨細胞マーカーのE11/gp38、DMP1、PHEX、SOSTに対するRT-qPCRを行ったところ、骨分化の誘導が確認された（図４３）。得られた顎骨様組織に対して、アリザリンレッド染色（図４４Ａ）とHE染色（図４４Ｂ）にて組織学的観察を行った。また、F-actinに対する蛍光免疫染色を行い、顎骨様組織内部の骨細胞ネットワーク形成を確認した（図４４Ｃ）。
＜顎骨様組織の免疫不全マウス顎骨欠損への移植＞
　得られた顎骨様組織を顎骨欠損部に移植することによる顎骨再生効果を検討するため、免疫不全NSGマウス顎骨欠損モデルを用いて、その効果を評価した。具体的には、NSGマウスの顎骨の右側顎角部下顎枝にラウンドバーを用いて、直径1.6mmの骨欠損を作製した。骨欠損が導入された顎骨のイメージおよびマイクロCT画像を図４５上に示す。その後、欠損部に2個の顎骨様組織を、人工足場材料を用いることなく直接移植した。移植直後、1週、2週、3週、4週で経時的なマイクロCT撮影を行い、欠損部の再生を観察した（図４５下）。その結果、移植後4週間後には、顎骨欠損部の大部分に骨様構造が形成されていることが示された。
　以下の実施例では、次の手順に従い実験を行った。
＜ヒトiPSCの培養及び維持＞
　エピソーマルベクターで初期化したヒト人工多能性幹細胞（iPSC）を、既報（Nakagawa, M. et al. Nakagawa, M. et al. A novel efficient feeder-Free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 1-7 (2014)）のように、フィーダーフリーおよびゼノフリー条件下で維持した。iPSCを、StemFit AK03N培地(味の素、東京、日本)中のiMatrix-511(ヒトラミニン511 E8フラグメント；ニッピ、東京、日本)でコーティングした細胞培養プレート上で培養した。約80% コンフルエントに達したら、通常4～5日毎に、Accutase (Innovative Cell Technologies、カリフォルニア州、米国)を使用して細胞を剥離し、シングルセルに解離した。遠心分離後、細胞を10 μM Y-27632(ROCK阻害剤；富士フィルム和光、東京、日本)を補充したStemFit AK03Nに再懸濁し、iMatrix-511でコーティングした培養プレートに播種した。翌日、培地をY-27632不含の新鮮なStemFit AK03Nに交換した。その後、次の継代まで培地を2日毎に交換した。以下の実施例では、次のヒトiPSC株を利用した：京都大学iPS細胞研究財団により提供された、1231A3、HLAホモ接合性iPSC(Ff-I 14s04、Ff-I 01s04)；ヒト白血球抗原(HLA)-A、BおよびCIITA遺伝子がノックアウトされたFf-14s04(HLA-KO Ff-I 14s04: クローンFf-I 14s04-AB II-KO-13)、；骨形成不全症（OI）患者由来のiPSC（OI-iPSC：クローンOI08-12、COLIA1のイントロン32のスプライシングドナー部位に点変異を示し（c.2235+1G>A）、サイレンスタイプIIIに分類される。）；変異がレスキューされたOI-iPSC（resOI-iPSC）(Kawai, S. et al. Nat. Biomed. Eng. 3, 558-570 (2019))。
＜三次元(3D)条件でのiPSCからNCCへの誘導＞
　凝集培養を開始するために、Accutaseを使用してiPSCを培養皿から剥離し、シングルセルに解離した。これらの細胞を、96ウェルV底超低細胞接着プレート(住友ベークライト株式会社、東京、日本)内で10 μM Y-27632を添加した100 μlのStemFit Basic03(bFGF不含のAK03Nに相当、味の素)中で速やかに再凝集させた。凝集培養に採用した細胞濃度は以下の通りであった：1231A3（1.0×104 細胞/ウェル）、Ff-1 14s04、HLA-KO Ff-1 14s04、Ff-1 014s04、OI-iPSC、およびresOI-iPSC（3.0×103 細胞/ウェル)。細胞数を、Countess II FL(Thermo Fisher Scientific、東京、日本)を使用して測定した。1200 rpmで３分間の遠心分離により凝集を促進した（0日目）。神経堤細胞(NCC)の誘導のため、これらの細胞凝集塊を5% CO2を含む37℃のインキュベーター内で維持した。24時間後（1日目）、培養培地を10 μM SB431542（TGF-β阻害剤；富士フィルム和光）およびBMP4（R&D Systems、ミネソタ州、米国）(1231A3、Ff-I 14s04、HLA-KO Ff-I 14s04 (10 ng/ml)；Ff-I 01s04、OI-iPSCs、resOI-iPSCs (2.5 ng/ml))を含む150 μlのStemFit Basic03に交換した。さらに24時間後（2日目）、凝集塊を個別に回収し、48ウェルの非コーティングプレート（IWAKI、東京、日本）に移し、2日目から4日目までオービタルシェーカー（CS-LR；TAITEC、埼玉、日本）（120 rpm）上で、10 μM SB431542および1 μM CHIR99021（GSK-3β阻害剤、Axon Medchem、バージニア州、米国）を含む250 μlのStemFit Basic03中で培養した。
　HOX陰性NCC誘導の場合、4日目から5日目まで凝集塊は培地を交換せずに培養した。HOX陽性NCC誘導の場合、4日目の凝集塊を10 μM SB431542、1 μM CHIR99021、および10 nM オールトランスレチノイン酸(RA)(富士フィルムワコー)を含む250 μlのStemFit Basic03を用いて4日目から5日目まで培養した。
　NCC誘導に対するBMP4処理期間の影響を調査するために、1231A3 iPSCを96ウェルV底超低細胞接着プレート(10000細胞/ウェル)内の10 μM Y-27632を含む培地中で凝集させた。24時間後（1日目）、BMP4処理がNCC誘導効率に影響を与えるかどうかを評価するために、培養培地を、10 μM SB431542および1 μM CHIR99021を含み、BMP4を含むまたは含まないStemFit Basic03に交換した。24時間後、凝集塊を48ウェルプレートに移し、10 μM SBおよび1 μM CHIRを含む培地中で、2日目から5日目までオービタルシェーカー上で120 rpmで培養した。延長したBMP4処理がNCC誘導効率に影響するかどうかを試験するために、1日目の凝集塊を10 μM SBおよび10 ng/ml BMP4を含む培地で2日間培養し、次いで48ウェルプレートに移し、10 μM SBおよび1 μM CHIRを含む培地中で、3日目から5日目までオービタルシェーカー上で120 rpmで培養した。
＜二次元(2D)条件でのiPSCからNCCへの誘導＞
　2D条件では、以前確立されたプロトコル（非特許文献３）に従って、1231A3 iPSCからNCCを誘導した。簡潔に説明すると、iPSCをiMatrix-511でコーティングした培養プレート上に、StemFit AK03N培地中で3.6 × 103 細胞/cm2 の密度で播種し、4日間培地中で維持した。NCC誘導のために、細胞を10μM SB431542および1μM CHIR99021を補充したStemFit Basic03中で10日間培養し、2日毎に培地を交換した。
＜NCC集塊の分化＞
　5日目のNCC集塊を96ウェルU底超低細胞接着プレート(住友ベークライト)に移した。
　末梢神経細胞分化のために、NCC集塊を、B27サプリメント(Thermo Fisher Scientific)、N-2 サプリメント(Thermo Fisher Scientific)、2 mM L-グルタミン(FUJIFILM Wako)、および各10 ng/mlのBDNF、GDNF、NT-3およびNGF(富士フィルム和光)を添加したNeurobasal 培地(Thermo Fisher Scientific)中で14日間培養し、3日毎に培地を交換した。分化は、抗ペリフェリン抗体および抗クラスIII β-チューブリン抗体を用いた免疫染色によって確認した。
　メラノブラストの分化のために、NCC集塊を、1 μM CHIR99021、25 ng/ml BMP4、および100 nM エンドセリン-3（TOCRIS、ブリストル、英国）を補充したStemfit Basic03中で6日間培養し、3日毎に培地を交換した。分化は、抗MITF抗体を用いた免疫染色によって確認した。
　間葉系幹/間質細胞(MSC)分化のため、NCC集塊を最初にAccutaseでシングルセルに解離し、フィブロネクチンでコーティングしたプレート(Millipore、ダルムシュタット、ドイツ)に1.0 × 104 細胞/cm2 の密度で播種した。細胞を、10 μM SB431542、各20ng/mlのEGF（富士フィルム和光）およびFGF2（富士フィルム和光）を添加したStemFit Basic03で培養した。培地を3日毎に交換し、サブコンフルエントに達する前に細胞を継代した。増殖した細胞（継代数2（PN2））を、10 μM SB431542、各20 ng/mlのEGFおよびFGF2を添加したStemFit Basic03中で1.0 × 104 細胞/cm2の密度で、フィブロネクチンでコーティングしたプレートに播種した。24時間後、培地をPRIME-XV MSC Expansion XSFM培地(FUJIFILM Irvine Scientific)に交換した。継代は3日または4日毎に実施した。PN2では、MSCの分化は、ヒトMSCマーカー（陽性マーカー：CD105、CD90、CD73、CD44、CD29；陰性マーカー：CD45、CD34、HLA-DR）を用いたFACS分析によって確認した。誘導されたMSC様細胞の分化能を確認するために、骨形成誘導、軟骨形成誘導、および脂肪細胞誘導(adipogenic induction)を行い、既報（非特許文献３）のように細胞をそれぞれアリザリンレッド、アルシアンブルー、およびオイルレッドOで染色した。
＜HOX陰性NCC集塊からmdEMへの誘導＞
　下顎突起外胚葉性間葉（mdEM）の誘導を開始するために、HOX陰性NCC集塊（5日目）を、100 ng/ml FGF8b（富士フィルム和光）、50 nM エンドセリン-1（PEPTIDE INSTITUTE、大阪、日本）、および2.5 ng/ml BMP4を補充した350 μlのStemFit Basic03中で、5日目から9日目までオービタルシェーカー上で120 rpmで培養した。
　上顎突起外胚葉性間葉（mxEM）およびmdEMの分岐に対するEDN1シグナル伝達の影響を評価するために、NCC集塊を100 ng/ml FGF8bおよび10 μM BQ-123（エンドセリンA受容体アンタゴニスト；Selleck、東京、日本）を添加した350μlのStemFit Basic03中で、5日目から12日目までオービタルシェーカー上で120 rpmで培養し、9日目に培地を交換した。
　mdEM分化におけるNCCの初期の前後(A-P)同一性の重要性を調査するために、RAで処理したNCCを、100 ng/ml FGF8b、50 nM エンドセリン-1、および2.5 ng/ml BMP4を補充した350 μlのStemFit Basic03で、5日目から9日目までオービタルシェーカー上で120 rpmで培養した。
　2D誘導NCCに対する、2D条件下でのFGF8、EDN1、およびBMP4の効果を評価するために、CD271high+ で選別したNCCをフィブロネクチンでコーティングしたプレートに1.0 × 104 細胞/cm2 の密度で播種し、100 ng/ml FGF8b、50 nM エンドセリン-1、および 2.5 ng/ml BMP4を補充したStemFit Basic03で4日間培養した。
　3Dのセッティングで2D NCCに対するFGF8、EDN1、およびBMP4の効果を調べるために、CD271high+ で選別したNCCを、96ウェルV底超低細胞接着プレートに1.0 × 104細胞/ウェルの密度で、100 ng/ml FGF8b、50 nM エンドセリン-1、および2.5 ng/ml BMP4を補充した100 μlのStemFit Basic03中で急速に凝集させ、4日間培養した。
＜mdEM誘導体の誘導＞
　mdEM凝集塊（9日目）を96ウェルU底超低細胞接着プレート（住友ベークライト）に移した。
　遠位キャップドメインの誘導のため、mdEM凝集塊を50 nM エンドセリン-1、20 ng/ml FGF2、および25 ng/ml BMP4を補充した200 μlのStemFit Basic03 で9日目から13日目まで培養し、11日目に培地を交換した。
　近位口腔側ドメインの誘導のために、100 ng/ml FGF8b、400 nM SAG (Smoothened Agonist、Selleck)、10 μM BQ-123、および500 nM LDN193189(ALK2/3阻害剤、TOCRIS）を補充した200 μlのStemFit Basic03中で9日目から13日目まで培養し、11日目に培地を交換した。その後、歯間葉誘導のために、近位口腔側ドメイン誘導培地を、100 ng/ml FGF8b、400 nM SAG、3 μM CHIR99021、および30 ng/ml アクチビン A(R&D)を補充した200 μlのStemFit Basic03に置換した。歯間葉誘導を13日目から17日目まで行い、15日目に培地を交換した。
＜mdEMから顎骨様オルガノイドの作製＞
　mdEM凝集塊(9日目)を96ウェルU底超低細胞接着プレートに移した。mdEMを、20 ng/mlのEGFおよびFGF2、50 ng/ml BMP2 (R&D)、3 μM CHIR99021、および400 nM SAGを補充した200 μlのStemFit Basic03で3日間培養した。12日目に、分化培地を200μlのMSCgo Osteogenic Differentiation Medium （SARTORIUS、ゲッティンゲン、ドイツ)に置換し、クラスターを7日間培養した。19日目に、分化培地を、10 mM β-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物（Sigma、ミズーリ州、米国）、250 μM L-アスコルビン酸2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物（Sigma)、100 nM デキサメタゾン(Sigma)、50 ng/ml BMP2(R&D)、3 μM CHIR99021、および400 nM SAGを補充した200 μlのStemFit Basic03に置換し、クラスターを7日間培養した。26日目から38日目まで、クラスターをMSCgo Osteogenic Differentiation Mediumで培養し、培地を2日毎に交換した。
＜mdEMの軟骨形成誘導＞
　3D条件で軟骨形成分化を誘導するために、mdEM凝集塊(9日目)を96ウェルU底超低細胞接着プレートに移し、MSCgo Chondrogenic XF(SARTORIUS)で21日間培養した。軟骨形成分化は、サフラニンO/ファストグリーン染色および抗COLX抗体を用いた免疫蛍光分析によって確認した。
＜NCC集塊から平滑筋細胞への誘導＞
　本誘導方法の概要を図６９に示す。具体的には、次の手順で行った。実施例１で得られたNCC集塊をAccutaseにてシングルセルに分散させ、CD271強陽性細胞をフローサイトメトリーにて選別した。選別した細胞をStemFit Basic03培地に10 μM SB431542、20 ng/mL Egf(FUJIFILM Wako社製)、Fgf2(FUJIFILM Wako社製)を加えた培養液に懸濁後、フィブロネクチンコーティング培養プレートに1 × 104 cells/cm2の細胞濃度で播種し、細胞を5日間培養した。その後、NCCをAccutaseにてシングルセルに分散させ、StemFit Basic03培地に2 ng/ml TGF-β1、50 nM Endothelin-1を加えた培養液に懸濁し、フィブロネクチンコーティング培養プレートに1 × 104 cells/cm2の細胞濃度で播種し、平滑筋細胞への分化誘導を開始した。4日毎にAccutaseを用いて継代を行い、1 × 104 cells/cm2となるように培養プレートに播種し、細胞を培養した。平滑筋細胞誘導培養10日目に、免疫染色およびRT-qPCRにより、平滑筋マーカーの発現を確認した。
＜フローサイトメトリー分析及び細胞選別＞
　フローサイトメトリーは、製造元の説明書に従って、BD FACSAria II_v1.87 (BD Biosciences、ニュージャージー州、米国)を使用して行った。細胞凝集塊または2D培養細胞を Accutaseを使用して解離し、FACSバッファー(1% ヒト血清アルブミンを含むPBS)で洗浄し、35 μmフィルター(Corning、ニューヨーク州、米国)を通して濾過した。次いで、細胞を遠心分離（1200 rpm、3分、4℃）によってペレット化し、適切な抗体を含むFACS緩衝液に再懸濁し、続いて4℃で60分間インキュベートした。非特異的なバックグラウンドシグナルを除去するために、アイソタイプコントロールをすべての実験に含めた。抗体反応後、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、ペレット化し、再度洗浄した。最後に、細胞をFACSバッファーに再懸濁し、フィルターを通して回収した。フローサイトメトリーとソーティングをBD FACSAria IIで行った。得られたデータを、FACSDiva_v9.0.1を使用して収集し、FlowJo_v10.8.1ソフトウェア(BD Biosciences)を使用して分析した。使用した抗体の詳細を表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜リアルタイム定量PCR分析＞
　細胞凝集塊または2D培養細胞をRLT Plus Bufferで溶解することにより、RNAを抽出した。RNeasy Micro Kit(QIAGEN、フェンロー、オランダ)を使用して全RNAを精製し、RNase-Free DNase Set(QIAGEN)で処理してゲノムDNAを除去した。続いて、製造元の説明書に従って、SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen、マサチューセッツ州、米国)を使用して、0.5 μgの全RNAを一本鎖cDNAに逆転写した。リアルタイム定量PCR(RT-qPCR)は、THUNDERBIRD Next SYBR qPCR Mix(TOYOBO、大阪、日本)および遺伝子特異的プライマーを使用して、QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus Real-Time PCR System_v2.3(Applied Biosystems、マサチューセッツ州、米国)で行った。サイクリングパラメータは次のとおりであった：最初の変性（95℃、1分）、その後の45サイクルの増幅およびSYBRシグナル検出（95℃での変性、3秒；60℃でのアニーリング、30秒；72℃での伸長、30秒)。各qPCR実行の最後に解離曲線を生成する最終ステップが行われた。データを2-ΔΔCt 法を使用して分析し、GraphPad Prism 9_v9.5.1 softwareを使用して視覚化した。用いたプライマーの配列の一例として、上記表１に記載のもの、非特許文献３のSupplementary Table 2に記載のものが挙げられる。それ以外の配列は、公知のものを使用した。
＜RNA-seq分析＞
　RNA-seq分析を実行するには、RNeasy Micro Kitを使用して全RNAを抽出し、RNase-Free DNase Setで処理してゲノムDNAのコンタミネーションを除去した。続いて、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)を使用して、10 ngの全RNAを逆転写させて一本鎖cDNAを作製した。Ion AmpliSeq Transcriptomeを標的としたNGSライブラリーの構築のため、メーカーのプロトコルに従って、Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Panel、Chef-Ready Kit(Thermo Fisher Scientific)、およびIon Chef (Thermo Fisher Scientific)装置を利用した。簡潔に説明すると、5X VILO Reaction Mixと10X SuperScript III Enzyme Mixとを組み合わせて逆転写マスターミックスを調製した。次に、混合物を反応プレートに等分し、それぞれに10 ngの全RNAを加えた。プレートをサーマルサイクラーにローディングし、42℃で30分間、続いて85℃で5分間インキュベートし、その後10℃で保持した。
　Ion Chef装置でのライブラリーの調製中に、次の消耗品およびカートリッジを装填した：Ion AmpliSeq Chef Solutions DL8 cartridge、Ion AmpliSeq Chef Reagents DL8 cartridge、Ion AmpliSeq Tip Cartridge L8、PCR Frame Seal、IonCode 96 Well PCR Plate、PCR Plate Frame、Empty Tip Cartridge L8、およびEnrichment Cartridge。特に、逆転写反応に使用されるIonCode 96 Well PCR Plateには、IonCode barcode adapterが含まれていた。さらに、Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Panelを含むチューブを、Ion AmpliSeq Chef Reagents DL8 cartridgeに挿入した。マルチプレックスPCRは、Ion Chef内のサーマルサイクラーで、16分間のアニーリング／伸長反応を13サイクル行って実行した。その後のステップには、FUPA試薬によるプライマーの消化、IonCode barcode adapterのライゲーション、磁気ビーズを使用したライブラリーの精製、ライブラリー濃度の均一化、単一チューブ内での混合が含まれていた。
　ライブラリーの調製に続いて、Ion Chefは、テンプレートの調製とIon 540 Chip KitへのISPビーズのローディングを容易にした。NGSシーケンシングを、Ion GeneStudio S5 Prime sequencer(Thermo Fisher Scientific)を使用して実行した。AmpliSeq RNA Pluginを利用してリード数を計算し、有意に発現差のある（p ≦ 0.05）遺伝子を検出するための正規化用の「DESeq2」パッケージを有するR studio_v2023.06.1+524 softwareを使用してデータ分析を実行した(Love, M. I., Huber, W. & Anders, S. Genome Biol. 15, 1-21 (2014))。差次的発現遺伝子(DEG)を、ペアワイズ比較により、偽発見率(FDR) < 0.05で同定した。遺伝子オントロジー(GO)用語に基づく遺伝子セットのエンリッチメント解析（GSEA)を、組み込まれたDifferential Expression and Pathway analysis (iDEP) software(Ge, S. X., Son, E. W. & Yao, R. BMC Bioinformatics 19, 1-24 (2018))(バージョン9.6)を使用して行った。
＜免疫細胞化学＞
　ディッシュ上で培養した細胞を、4% パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて室温(RT)で30分間固定し、PBS中の0.3% Triton-X-100(Sigma)で、室温で15分間透過処理を行った。続いて、細胞をBlocking One溶液（ナカライテスク、京都、日本）を用いて室温で1時間処理し、次いで10％（v/v）Blocking Oneを含むPBS-T（0.1％Tween-20 (Sigma)を含むPBS）で希釈した一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。この後、細胞を10% Blocking Oneを含むPBS-Tで希釈した二次抗体とともに室温で2時間インキュベートした。その後、核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(1:5000；DOJINDO、熊本、日本)を用いて室温で15分間対比染色した。PBS洗浄後、蛍光顕微鏡(BZ-X800、Keyence、大阪、日本)を使用して蛍光シグナルを観察した。使用した一次抗体と二次抗体を表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜アリザリンレッド及びフォンコッサ染色＞
　固定したサンプルをパラフィンに包埋し、厚さ8 μmのスライスに切片化した。アリザリンレッド染色は、1% アリザリンレッド(MUTO PURE CHEMICALS CO., LTD、東京、日本)とともに室温で3分間切片をインキュベートすることによって行った。フォンコッサ染色は、提供されたマニュアルに従って、Calcium stain Kit（改良型フォンコッサ；ScyTek Laboratory, Inc.、ユタ州、米国）を使用して実施した。骨形成の能力を、光学顕微鏡を使用して評価した。
＜in vitroサンプルの組織学的分析＞
　細胞凝集塊およびクラスターを4% PFAを用いて室温で3時間固定した(26日目と38日目のサンプルは6時間固定した)。アリザリンレッドおよびフォンコッサ染色の場合を除き、骨形成誘導を受けたサンプル（19～38日目）をDecalcifying Solution B（富士フィルムワコー）を用いて室温で一晩脱灰した。ヘマトキシリン－エオシン(HE)染色、アザン染色、およびサフラニンO/ファストグリーン染色のため、サンプルを段階的エタノールで脱水し、Histo-clear (National Diagnostics、ジョージア州、米国)で透明にし、パラフィンに包埋した。次いで、厚さ8 μmの切片を作成し、標準プロトコルを使用して染色し、続いて光学顕微鏡で観察した。
　免疫蛍光分析のため、脱灰サンプルをTissue-Tek O.C.T compound(Sakura Finetek、東京、日本)に包埋し、クライオスタット(CM1950；Leica、東京、日本)を使用して厚さ20 μmの切片を得た。これらの切片をPBSで洗浄し、PBS中の0.3% Triton-X-100を用いて室温で20分間透過処理し、次いでBlocking One Histo solution(ナカライテスク)を用いて室温で1時間処理した。抗体ワーキング溶液（Can Get Signal Immunostain solution B；TOYOBO）で希釈した一次抗体を切片とともに4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、抗体ワーキング溶液で希釈した二次抗体とともに室温で4時間切片をインキュベートした。15分間のDAPIの対比染色とPBS洗浄の後、切片をVECTASHIELD mounting Medium (Vector、カリフォルニア州、米国)にマウントし、共焦点顕微鏡(FV3000、オリンパス、東京、日本)に供した。共焦点イメージングデータを、FV31S-SW software(Olympus)を使用して分析した。使用した一次抗体と二次抗体を表3に示す。
　変性したCOLIを視覚化するために、5-FAMがコンジュゲートしたコラーゲンハイブリダイジングペプチド(F-CHP)(3Helix, Inc.、ユタ州、米国)を製造元の説明書に従って使用した。凍結切片をblocking solution 2で処理し、PBS溶液中の15 μM F-CHPとともに4℃で一晩インキュベートし、次いで前述のように二次抗体およびDAPIとともにインキュベートした。蛍光シグナルを、共焦点顕微鏡を使用して検出した。
＜細胞生存率＞
　細胞生存率を評価するために、製造元の説明書に従ってCyto3D Live-Dead Assay Kit(TheWell BIOSCIENCE、ニュージャージー州、米国)を使用して細胞凝集塊を評価した。簡潔に説明すると、2 μLのCyto3D reagentを各ウェルに添加し、次いで凝集塊を37℃で15分間インキュベートした。蛍光シグナルを、蛍光顕微鏡を使用して観察した。アポトーシス細胞を同定するために、製造元の説明書に従って、切片化したサンプルをTerminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling (TUNEL)染色(DeadEnd Fluorometric TUNEL System；Promega、ウィスコンシン州、米国)に供した。核をDAPIで対比染色し、共焦点顕微鏡を使用して蛍光シグナルを視覚化した。TUNEL陽性細胞を、ImageJ_v1.54f software(NIH、メリーランド州、米国)を使用して定量化した。
＜移植＞
　腎被膜下への顎骨様オルガノイド移植のため、8週齢のオスのNOD/Scid/IL2Rγ(NSG)マウスをレシピエントとして使用した。塩酸メデトミジン（0.3 mg/kg）、ミダゾラム（4 mg/kg）、および酒石酸ブトルファノール（5 mg/kg）の組み合わせを腹腔内注射してマウスを麻酔した。手術部位の皮膚の剃毛と消毒の後、顎骨様オルガノイド（38日目：1231A3、OI-iPSC、resOI-iPSC由来）を、人工材料を使用せずに各マウスの腎被膜の下に移植した（n = 6/グループ）。切開部を5-0 モノフィラメント縫合糸(Bearmedic、茨城、日本)で閉じた。移植後4週間でマウスをCO2で安楽死させ、マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)スキャン後に移植組織を回収した。
　顎骨欠損への顎骨様オルガノイド移植では、12週齢のオスのNSGマウスをレシピエントとして採用した。10 mmの皮膚切開を行って右半顎を露出させた後、丸鋼バーを備えたマイクロエンジン(VOLVER i7；NAKANISHI、栃木、日本)を使用して下顎角に直径 2 mmの円形欠損を作製した。図64に示すように、3つの顎骨様オルガノイド（38日目：1231A3由来）を、人工材料を使用せずに各欠損に移植した（n = 8/グループ）。筋肉と皮膚を5-0モノフィラメント縫合糸で縫合した。手術後、通常の食餌に移行する前に、マウスには2週間柔らかい食餌を与えた。移植後4週間で下顎の骨を採取し、マイクロCTでスキャンした。
＜マイクロCT解析＞
　安楽死の前に、次のパラメータでマイクロCTシステム(inspeXio SMX-100CT；島津製作所、京都、日本)を使用して腎臓領域と顎骨をスキャンした：ボクセルサイズ 30 μm、管電圧 60 kV、管電流 0.2 mA、および露光時間 480 ミリ秒。CTスライスの解像度は1024 × 1024ピクセルであった。骨形態計測（Bone morphometrics）は、製造元の説明書に従って3Dイメージングソフトウェア(TRI/3D-BON-FCS；ラトックシステムエンジニアリング、大阪、日本)を使用して分析した。同じ条件下でスキャンされた既知の密度のファントムに基づく検量線を使用して、各組織のCT値を組織ミネラル密度(TMD)に変換した。
＜in vivoサンプルの組織学的分析＞
　顎骨様オルガノイドの移植から4週間後、マイクロCT画像スキャン後にマウスを安楽死させ、腎臓と顎骨の両方を採取した。標本を4% PFA中で、4℃で24時間固定し、その後7日間の脱灰期間を設けた(フォンコッサ染色を除く)。続いて、標本を、段階的エタノールを使用して脱水し、Histo-clearを用いて透明化し、パラフィンに包埋した。標本を厚さ8 μmの連続スライスに切片化し、顎骨サンプルを前額面で切断した。
　HE染色、アザン染色、およびTRAP染色(TRAP/ALP染色キット；富士フィルムワコー)を標準プロトコルに従って行い、光学顕微鏡で観察した。骨細胞およびアザンレッド染色領域の定量的評価を、ImageJ softwareを使用して行った。
　免疫蛍光分析では、脱パラフィン化切片をPBS中の0.3% Triton-X-100を用いて室温で20分間透過処理し、続いて抗原活性化のため、LAB solution(Polyscience、イリノイ州、米国)を用いて室温で15分間処理した。続いて、切片をblocking solution 2を用いて室温で1時間ブロッキングし、抗体ワーキング溶液で希釈した一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。ヒトOCNに対するマウス抗体のため、Mouse on Mouse (MOM) kit(ReadyProbes Mouse-on-Mouse IgG Blocking Solution (30X)；Invitrogen)を使用して切片をブロッキングした。その後、切片を抗体ワーキング溶液で希釈した二次抗体とともに室温で4時間インキュベートした。組織の自己蛍光を除去するために、切片をVector TrueVIEW Autofluorescent Quenching kit(Vector)を用いて室温で5分間処理した。DAPIで対比染色した後、切片をマウントし、共焦点顕微鏡を使用して蛍光シグナルを検出した。使用した一次抗体と二次抗体の詳細を表3に示した。
　F-アクチンフィラメントを視覚化するために、凍結切片でファロイジン染色を行った。固定および脱灰した標本をTissue-Tek O.C.T compoundに包埋し、厚さ20 μmの切片を切り出した。切片をPBSで洗浄し、PBS中の0.3% Triton-X-100を用いて室温で20分間透過処理し、blocking solution 2を用いて室温で1時間ブロックし、次にAlexa Fluor 594 phalloidin(Thermo Fisher Scientific)および抗体ワーキング溶液中で希釈した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、切片をAlexa Fluor 594 phalloidinおよび抗体ワーキング溶液で希釈した二次抗体に室温で4時間曝露した。核をDAPIで対比染色した。
＜骨細胞の3D解析＞
　ファロイジン染色した骨細胞の樹状突起の3D構造を視覚化するために、共焦点顕微鏡を使用して40個の光学的連続Z軸切片(ステップサイズ 0.5 μm)を取得し、IMARIS_v9.7.2 software(Oxford Instruments、オックスフォードシャー州、英国)を使用して再構成した。IMARISのFilament Tracer機能を用いて3D画像を回転させながら、骨細胞あたりの樹状突起の数を計測した。スポットの直径は1 μmに設定した。測定は、標本ごとにランダムに選択された10個の骨細胞に対して行った。
＜統計＞
　統計分析はGraphPad Prism 9 softwareを使用して行い、結果は平均値 ± 平均値の標準誤差（s.e.m.）として表示した。Tukey-Kramer事後検定を用いた一元配置分散分析(ANOVA)を使用して複数のグループを比較し、両側スチューデントのt検定を2つのグループ間の比較に使用した。生物学的複製数は図の凡例に示した。P値が0.05未満のものを統計的に有意であるとみなした。
＜研究の承認＞
　ヒト被験者に関する実験プロトコルは、京都大学医学部および医学研究科の倫理委員会、および滋賀県立小児保健医療センターの倫理委員会の承認を受た。すべてのドナーから書面によるインフォームドコンセントを得た。マウスに関するすべての手順は、京都大学の動物実験規則（プロトコル番号：16-73、22-155、24-225）に厳密に従って実施した。
実施例６：3D条件でのヒトiPSCからHOX陰性NCCへの誘導
　iPSCから顎骨オルガノイドを作製するための段階的誘導プロトコルを確立するために、本発明者らの最初の焦点は、HOX陰性NCCの標的誘導に資する3D培養システムの開発にあった（図46a）。本発明者らは、従前の研究における誘導プロトコルを3D培養iPSCに適応させることを試みた。まず、解離したヒト1231A3 iPSC(フィーダーフリーおよびゼノフリーのiPSC株)を、ROCK阻害剤であるY-27632を含む培地中で、96ウェルV底超低細胞接着プレート上に凝集させ(図46b、c）、（栄養素の吸収を高めるため）振とう条件下で、SB/CHIRとともに4日間培養した（図47a）。これらの凝集塊内で、望ましくないPAX6+ 神経外胚葉とともに、CD271high+ NCCの誘導が観察された(図47b、c)。神経外胚葉の誘導を軽減するために、SB/CHIR培養の前に凝集塊をBMP4(Marchant, L., Linker, C., Ruiz, P., Guerrero, N. & Mayor, R. Dev. Biol. 198, 319-329 (1998))の処理に供した（図47d）。過剰なBMP4シグナル伝達は凝集塊表面にE-カドヘリン(ECAD)+ 細胞を誘導したが（図47e、f）、1日間のBMP4処理によりSOX10+ CD271+ TFAP2A+ NCCを効果的に誘導した（図46b～d）。フローサイトメトリー分析により、TFAP2A+ ECAD+ 非神経外胚葉、PAX6+ 神経外胚葉、およびOCT3/4+ 未分化iPSCが最小レベルで観察されると共に（図46f）、CD271high+ NCCの濃縮（94.9±1.9％）が確認された（図46e）。NCC誘導の高い効率は、Ff-I 14s04、HLA-KO Ff-I 14s04、Ff-I 01s04、骨形成不全症(OI)患者由来iPSC(OI-iPSC；クローン OI08-12など)（Kawai, S. et al. Nat. Biomed. Eng. 3, 558-570 (2019)）、および変異がレスキューされたOI-iPSCを含む、異なるiPSCクローン間で一貫していたが、これは各細胞株の初期細胞密度とBMP4濃度を調整することによって達成さた（図48）。qPCR分析により、5日目の凝集塊（d5 271H）から選別されたCD271high+ 細胞は、既報の2Dプロトコル（非特許文献３）（2D 271H）のものと同等のレベルでNCCマーカー（SOX10、NGFR、TFAP2A、RHOB、PAX3）を発現することが実証され（図46g）、両方の細胞集団において多能性細胞マーカーであるPOU5F1は下方制御されていた。RNAシーケンシング（RNA-seq）分析により、神経板境界細胞状態（neural plate border cell state）を通過して、iPSC（0日目）からNCC（5日目）への細胞集団の段階的な移行が明らかになった（図49a）。これらの知見と一致して、4日間の誘導後にSOX10およびCD271タンパク質が検出された（図49b）。さらに、凝集塊のNCC誘導体への分化能は、クラスIII β-チューブリン（TUBB3）+ およびペリフェリン（PRPH）+ 末梢神経細胞（図46h）、MITF+ メラノブラスト（図46i）、および間葉系幹／間質細胞（MSC）への誘導によって確認された（図50）。
　NCC集塊のA-P軸同一性を評価するために、ポジティブコントロールとして後方運命（posterior fates）を誘導するためにレチノイン酸（RA）で処理した凝集塊を調製し(Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J. & Studer, L. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013)；Fattahi, F. et al. Nature 531, 105-109 (2016))（図51a～c）、qPCR分析を行った。通常のNCC集塊は、RAで処理したNCC集塊と比較してHOX遺伝子（HOXA1、HOXA2、HOXB2、HOXA3）(Rothstein, M., Bhattacharya, D. & Simoes-Costa, M. Dev. Biol. 444, S170-S180 (2018))の発現が最小限であり（図46j、k）、RNA-seq分析によりこれらの結果が確認された（図51d）。さらに、通常のNCC集塊は中脳および中脳-後脳境界マーカーを発現したが、前脳および脊髄領域マーカーは発現しなかった。これらの知見は、ヒトiPSCからHOX陰性の中脳-前後脳NCCへの誘導における本発明の3D培養システムの効率の良さを実証している。
実施例７：HOX陰性NCC集塊からmdEMの作製
　近位-遠位軸に沿ったPA1外胚葉性間葉の弓内極性（intra-arch polarity）は、Dlx遺伝子とHand遺伝子によって特徴付けられる(Minoux, M. & Rijli, F. M. Development vol. 137 2605-2621 (2010)；Depew, M. J., Lufkin, T. & Rubenstein, J. L. R. Science (80-. ). 298, 381-385 (2002)；Selleri, L. & Rijli, F. M. Nature Reviews Genetics vol. 24 610-626 (2023))（図52a）。Dlx2は上顎外胚葉性間葉(mxEM)とmdEMの両方で発現するが、Dlx5の発現はmdEMに限定され、Hand2は遠位端に向かってさらに制限される。HOX陰性NCCを、他のNCC誘導体ではなくmdEMに選択的に誘導するために、PA1の発生における上皮シグナルを調査した。PA1外胚葉間葉の生存と増殖に重要なFgf8は、発生期のPA1外胚葉全体で検出される(Creuzet, S., Schuler, B., Couly, G. & Le Douarin, N. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4843-4847 (2004)；Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L. R., Bishop, J. M. & Martin, G. R. Genes Dev. 13, 3136-3148 (1999))。エンドセリン-1(Edn1)は、下顎突起から独占的に分泌され、Dlx5とそれに続くHand2の活性化を通じてPA1外胚葉性間葉をmdEM運命に向けて駆動する(Sato, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 18806-18811 (2008))。さらに、Bmp4は遠位下顎の発生を促進する(Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F. & Crump, J. G. Development 138, 5147-5156 (2011)；Alexander, C. et al. Development 138, 5135-5146 (2011)；Tucker, A. S., Khamis, A. Al & Sharpe, P. T. Dev. Dyn. 212, 533-539 (1998))。最適な条件を決定するために、FGF8とEDN1の組み合わせ効果を試験した。FGF8がNCCマーカーであるSOX10の下方制御と、初期間葉マーカーであるTWIST1およびPRRX1(Soo, K. et al. Dev. Biol. 247, 251-270 (2002)；Doufexi, A. El & Mina, M. Dev. Dyn. 237, 3115-3127 (2008))の上方制御により重要であることが観察された（図53）。FGF8とEDN1の組み合わせは、共通のPA1外胚葉性間葉マーカー（DLX1、DLX2）およびmdEMマーカー（DLX5、DLX3、GSC）を誘導し、BMP4を追加することでこれらの遺伝子をさらに上方制御し、遠位マーカーであるHAND2を活性化した（図52b）。RNA-seq分析によりこれらの結果が確認され、メラノサイトマーカー、感覚神経細胞マーカー、自律神経細胞マーカー、およびグリア細胞マーカーの誘導が最小限であることが明らかとなった(図54)。HOX遺伝子の発現が低いことは、他の弓（arch）では誘導されないことを示していた。したがって、FEDBと呼ばれるこれらの経路の三重活性化をさらなる実験に採用した（図52c）。
　免疫染色により、FEDB条件が、SOX10+ NCCを、アクチンストレスファイバー形成を特徴とする間葉系の遊走形態（mesenchymal migratory morphology）を有するTWIST1+ 外胚葉性間葉(Lamouille, S., Xu, J. & Derynck, R. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 178-196 (2014))へと効果的に駆動されることが実証された（図52d、e）。特に、凝集塊には中心ゾーンにDLX2単一陽性の細胞、中間ゾーンにDLX2+ DLX5+ 細胞、表面ゾーンにDLX2+ DLX5+ HAND2+ 細胞が含まれており、これはFEDBにより胚のmdEMの近位-遠位パターニングを再現するmdEMが生成されたことを示唆している(図52f、g)。
　mxEMおよびmdEMの分岐に対するEDN1シグナルの影響をさらに解明するために、NCC集塊をFGF8とエンドセリンA受容体(EDNRA)(Minoux, M. & Rijli, F. M. Development vol. 137 2605-2621 (2010))のアンタゴニストであるBQ-123(FQとも称される)との組み合わせで処理した(図52h）。免疫染色により、FEDBよりも比較的少ないとはいえ、外胚葉性間葉への分化が明らかとなった（図52i）。EDN1阻害により、上顎外胚葉性間葉マーカー（POU3F3、CYP26A1）(Jeong, J. et al. Development 135, 2905-2916 (2008))の発現が顕著に増加したが、mdEMマーカーの発現は増加しなかった（図52j、k）。これらの知見は、Edn-1シグナル伝達が上顎と下顎の選択に重要であることを示唆している。
　mdEM分化における初期のA-P同一性の重要性を調べるために、RA処理後の後方化（posteriorized）NCCをFEDBとともに培養した（図52l）。RAで処理したNCCは外胚葉性間葉に分化したが、DLX5の発現は最小限であり、HOX遺伝子（HOXB2、HOXB4）の有意な増加を示し（図52m、n）、NCCの初期位置情報がパターニング経路に影響を与えることが確認された。
実施例８：mdEMを使用した後期段階の領域パターニングの要約
　発生的に正確なmdEMの誘導を確認するために、mdEMが発生の後期段階に特徴的な詳細な領域パターニングを示すかどうかを調査した。後期では、上皮ドメインは、それぞれFgf8、Bmp4、Edn-1、およびShhの発現によって特徴付けられる、近位、遠位、腹側、および口腔側軸に沿ってさらに細分化される(Xu, J. et al. Elife 8, 1-26 (2019)；Vincentz, J. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 7563-7568 (2016)；Neubuser, A., Peters, H., Balling, R. & Martin, G. R. Cell 90, 247-255 (1997))（図55a）。特に、Bmp4シグナル伝達はmdEMを遠位キャップドメインに指向する(Vincentz, J. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 7563-7568 (2016)；Barron, F. et al. Development 138, 2249-2259 (2011))（図55a、b）。反対に、Shhシグナル伝達は歯の発生に関与する口腔側ドメインを指定する(Cobourne, M. T. & Sharpe, P. T. Arch. Oral Biol. 48, 1-14 (2003))。さらに、近位-遠位軸に沿ったFgf8とBmp4間の拮抗的相互作用は、それぞれ臼歯と切歯の指定に関与している(Neubuser, A., Peters, H., Balling, R. & Martin, G. R. Cell 90, 247-255 (1997))。したがって、mdEMを2つの異なるドメイン、即ち遠位キャップと近位口腔側臼歯ドメインに分離することを目的とした。
　mdEM凝集塊を96ウェルU底超低細胞接着プレートに移した。遠位キャップの誘導では、BMP4を含むさまざまな誘導培地でmdEM凝集塊を培養した(図56a)。特に、BMP4濃度の上昇（25 ng/ml）に応じて、他の遠位マーカー（HAND2、GATA3、DKK1）と並んで、主要な遠位キャップマーカーであるHAND1の顕著な上方制御が観察された。これらの遺伝子は、アポトーシス細胞の増加にもかかわらず、近位シグナルであるFGF8のレベルの低下によりさらに活性化された（図54b）。細胞生存率を高めるために、FGF8をFGF2に置換し、遠位キャップ誘導のためBMP4high、EDN1、FGF2low と称される条件を採用した（図55c）。免疫染色により、DLX5の発現の減少（図54d）と、マウスの遠位キャップに類似した外側ゾーンでのHAND1(Vincentz, J. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 7563-7568 (2016))の明確な検出（図54e）が明らかとなった。HAND2およびGATA3の発現も明確に観察された。
　近位口腔側ドメインの誘導のため、mdEM凝集塊をFGF8およびヘッジホッグシグナル伝達アゴニストであるSAGを含むさまざまな誘導培地で培養した（図56c）。この組み合わせは、近位口腔側関連遺伝子(FOXF1、GLI1、PITX1、GBX2、BARX1、PAX9、LHX6)を効果的に誘導した。さらに、これらの遺伝子は、反対の領域シグナルであるEDN1およびBMP4がBQ-123およびLDN193189(LDN)によって阻害される場合に上方制御された。したがって、近位口腔側ドメインの誘導には、FGF8、SAG、BQ-123、LDNの条件を選択した（図55c）。免疫染色により、DLX5の発現が維持され、FOXF1およびPITX1が明確に検出されたことが明らかとなった。重要なことに、これらのマーカー発現パターンは、遠位キャップおよび臼歯ドメインの誘導の間で相互に排他的であった（図55d-f）。qPCRおよびRNA-seq分析により、これらの知見が確認された(図55g、図57a)。
　最後に、近位口腔側ドメインであるmdEMの歯原性分化能を評価した。歯間葉の分化には、Shh、Fgf8、Wnt、およびアクチビンなどの歯上皮からのシグナル伝達が必要である(Neubuser, A., Peters, H., Balling, R. & Martin, G. R. Cell 90, 247-255 (1997)；Prochazka, J. et al. Dev. Cell 35, 713-724 (2015)；Yu, T. & Klein, O. D. Dev. 147, (2020)；Zhang, Y. D., Chen, Z., Song, Y. Q., Liu, C. & Chen, Y. P. Cell Res. 15, 301-316 (2005))。近位口腔側ドメインmdEMをFGF8、SHH、CHIR、およびACTIVIN-A（FSCAとも称される）で処理すると、TFAP2B、TFAP2A、LHX6、およびPAX9で表される歯間葉マーカー(Jing, J. et al. Nat. Commun. 13, (2022))が発現した（図57b、58a）。遺伝子オントロジー（GO）分析により、NCCからの誘導における「歯形成（Odontogenesis）」および「象牙質含有歯の歯形成（Odontogenesis of dentin-containing tooth）」に関連する遺伝子が顕著に濃縮されていることが明らかとなった（図58b）。要約すると、mdEMは胎児の下顎骨と同様の領域パターニングを示すことに成功し、発生的に忠実なmdEM誘導が示された。
実施例９：mdEMから顎骨様オルガノイドの作製
　主に軟骨内骨化によって形成される中胚葉由来の骨とは異なり、下顎骨は主に膜内プロセス（intramembranous process）を受ける(Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B. & Longaker, M. T. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 696-711 (2020)；Parada, C. & Chai, Y. Curr. Top. Dev. Biol. 115, 31-58 (2015))。このプロセスでは、mdEMが凝縮し、骨芽細胞に直接分化する(Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B. & Longaker, M. T. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 696-711 (2020))。このプロセスを模倣するために、凝縮した細胞構造を有する誘導したmdEM凝集塊を、3D培養用に最適化されたゼノフリーの骨形成誘導培地で直接培養した（図59a）。38日目までに、直径1.0～1.5 mmの白いクラスターが得られた（図59b）。ALP活性およびカルシウム含有量が有意に増加した(図59c)。さらに、石灰化組織の形成が、アリザリンレッドおよびフォンコッサ染色によって証明された（図59d）。qPCR分析により、骨芽細胞マーカーの発現が26日目にピークとなり、骨基質タンパク質および骨細胞マーカーが38日目まで増加し続けることが示された（図60a）。特に、成熟骨細胞マーカーであるSOSTは、19日目以降に明らかな上方制御を示し(図59e)、これはRNA-seq分析によって裏付けられた(図60b)。反対に、軟骨形成マーカーは有意に上方制御されず（図60c）、HOX遺伝子発現はわずかなままであり（図60d）、誘導体における位置情報の維持が確認された。
　脱灰標本の組織学的分析により、エオジン好性の親和性（eosinophilic affinity）とアザンレッドで染色された緻密なマトリックスを備えた骨様組織が明らかとなった（図59f）。さらに、主要な骨基質タンパク質であるCOLIがマトリックス内で豊富に発現され、非コラーゲン性骨タンパク質であるOCNおよびOPNも検出された（図59g、図61a）。サフラニンO染色およびCOLXについての免疫染色により、わずかな軟骨形成分化が生じていることが示された(図61b)。
　続いて、骨様組織における細胞の特徴を調べた。SP7+ 骨形成系列は12日目に出現し、分化の間増加した(図61c)。細胞形態は線維芽細胞から樹状細胞に徐々に変化し、誘導の26日後にPDPN+ PHEX+ 初期骨細胞が表面積の周囲で検出された（図61d）。38日目までに、立方体形状のALP+ SP7+ 骨芽細胞が組織の表層に並び（図59h）、顕著な数の細胞が表面から内部領域まで伸びる樹状突起を有するPDPN+ PHEX+ 初期骨細胞に分化した（図59i、j)。特に、骨基質内では、SOST+ 成熟骨細胞が3Dの樹状ネットワークを形成した（図59k）。要約すると、本アプローチにより、mdEM凝集塊から顎骨様オルガノイドが生成され、石灰化骨基質に埋め込まれた3Dネットワークを形成した骨細胞が再現された（図59l）。mdEMによる顎骨様オルガノイドの生成は、他のiPSCクローンを使用して再現された（図62）。
　in vivoでは、血管新生に続いて下顎骨の石灰化と成熟が進行する(Vesela, B., Svandova, E., Bobek, J., Lesot, H. & Matalova, E. Front. Physiol. 10, 1-8 (2019))。本発明者らは、本発明の顎骨様オルガノイドが血管新生前の顎骨発生の初期段階を表すと仮説を立てた。これらのオルガノイドがより成熟した骨組織を形成する可能性を評価するために、NOD/Scid/IL2Rγ(NSG)マウスの毛細血管が豊富な腎被膜の下にオルガノイドを移植した。移植後4週間で、腎被膜の下に白い組織が観察された(図59m)。マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）分析により、高度に石灰化された組織が明らかとなった（図59n）。組織学的分析により、脈管構造および成熟した骨組織の形成が確認された（図59o、図63a）。軟骨形成はほとんど観察されなかった。さらに、組織はヒト骨基質と密な樹状突起を有するヒトビメンチン陽性ドナー細胞で構成されていた（図59p、図63b）。これらの知見は、顎骨様オルガノイドが生体内で成熟したヒト骨組織に発達する能力を有することを実証している。
実施例１０：顎骨様オルガノイドの移植による、免疫不全マウス顎骨欠損モデルにおける骨再生の誘導
　顎骨様オルガノイドの再生可能性を評価するために、これらのオルガノイドの3つのクラスターをNSGマウスの直径2.0 mmの下顎顎骨欠損に直接移植した（図64a、b）。移植後4週間で、マイクロCT分析により、移植片を有さないグループと比較して、移植されたグループの石灰化組織の量が有意に増加していることが明らかとなった（図64c、d、図65）。HE染色およびアザン染色を使用した組織学的試験により、移植片を有さないグループでは新しい骨形成が観察されるものもあったが、移植されたグループの骨組織は宿主の元の骨の成熟した構造によく似ていることが実証された（図64e）。ヒトCOLI、OCN、およびOPNに対する特異的な抗体を用いた免疫染色により、顎骨様オルガノイドに由来するドナーヒト細胞によって分泌される骨基質タンパク質の存在が確認され、骨再生へのオルガノイドの寄与がさらに確認された（図64f）。さらに、骨基質内では、ビメンチン陽性のドナーヒト骨細胞とビメンチン陰性の宿主のマウス骨細胞の両方が樹状細胞ネットワークを形成し（図64g、h）、新たに形成された骨に沿って酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）陽性の破骨細胞が観察され、活発な骨再構築が示された（図64i）。これらの知見から、移植された顎骨様オルガノイドが、ドナー細胞からの直接的な寄与と宿主の骨形成の間接的な刺激の両方を含む、骨形成の成功を通じて骨再生を促進することが総合的に示唆される。
実施例１１：OI-iPSC由来の顎骨様オルガノイドを使用した、in vitro疾患モデリング
　OIは、骨基質の脆弱性を特徴とする遺伝性の骨疾患であり、通常はCOLIの合成とプロセシングの異常に起因する(Van Dijk, F. S. & Sillence, D. O. Am. J. Med. Genet. Part A 164, 1470-1481 (2014))。現在、OIの診断は主に中胚葉由来の長骨に焦点を当てており、顎骨には最小限の注意しか払われていない。さらに、骨脆弱性の重症度には骨細胞と骨基質の相互作用が関与している可能性があるが、OIの発症における骨細胞の役割の理解は限られている(Pathak, J. L., Bravenboer, N. & Klein-Nulend, J. Front. Endocrinol. (Lausanne). 11, 1-14 (2020))。したがって、OIの組織学的分析における顎骨様オルガノイドの有用性を調査した。
　最初に、mdEMを、resOI-iPSC（Kawai, S. et al. Nat. Biomed. Eng. 3, 558-570 (2019)）とともに、COLIA1の常染色体優性変異を有する患者から得られたOI-iPSCから誘導した（図66a）。骨形成誘導の3日後、OI-iPSCおよびresOI-iPSC由来の凝集塊の両方で初期のCOLI産生が観察された（図67a）。特に、OI-iPSC由来の凝集塊から分泌されたコラーゲンは、コラーゲンハイブリダイジングペプチド(CHP)に対して陽性に染色され、ミスフォールディングされた三重らせん鎖の生成が示された。38日目までに、OI-iPSC由来の顎骨様オルガノイド（OIオルガノイド）では、骨細胞樹状突起の形成が破壊と共に（図67c）、アザンブルーで染色された未熟骨基質が明らかであった（図67b）。これらの異常な特徴は、resOI-iPSC由来のオルガノイドでは修正された（図67a-c）。
　続いて、OI-オルガノイドおよびresOI-オルガノイドをNSGマウスの腎被膜下に移植した。4週間後のマイクロCT分析により、OI-オルガノイドはresOI-オルガノイドと比較して生成する石灰化組織が少なく、より低いことが明らかとなった（図67d、f）。組織学的分析により、OI-オルガノイドがアザンブルーで染色された未熟骨組織を形成し、多数の骨細胞がOI骨の典型的な特徴(Mahr, M. et al. Int. J. Mol. Sci. 22, (2021))に類似する特徴を示すことが実証された（図67e、g、図66b）。これらの骨細胞は部分的にアポトーシスを起こしていた（図67h、j）。反対に、resOI-オルガノイドはこれらの異常な特徴からの回復を示した。さらに、骨細胞の3Dネットワーク形成はOIでは配向が乱れ、resOIと比較して樹状突起の数が有意に減少し（図67i、k）、これらから骨細胞と骨の異常な相互作用が示唆された。これらの知見は、顎骨様オルガノイドとOI-iPSCの組み合わせにより、OIの表現型を再現することに成功したことを示している。
実施例１２：NCC集塊から平滑筋細胞への誘導
　本発明者らは、足場の剛性がNCC分化の方向に影響を与え得るとの仮説を立てた。実際、機械的な力はNCCの遊走と分化にとって重要であることが同定されている(Canales Coutino, B. & Mayor, R. Dev. Cell 57, 1792-1801 (2022)；Zhu, Y. et al. J. Cell. Physiol. 234, 7569-7578 (2019))。さらに、マウスの胎仔では、下顎突起の形成には、アクトミオシンの極性によって導かれる3Dの間葉挿入が必要である(Tao, H. et al. Nat. Commun. 10, 1-18 (2019))。興味深いことに、2D培養でFEDBで処理されたNCCは、mdEMマーカーの上方制御なしに平滑筋細胞マーカーを発現した（図68a～d）。さらに、Y-27632処理によるアクチンストレスファイバー形成の阻害は、3D培養で観察される程度ではないものの、2D培養細胞におけるEDNRAおよびmdEMマーカーの発現を実質的に回復させた（図68e）。反対に、FEDB誘導下でのNCCのスフェロイド培養は、重大な細胞アポトーシスを引き起こした（図68f）。これらの予備的な知見は、本発明の凝集培養がmdEMの分化に適切な剛性をNCCに提供し得ることを示唆している。
　次に、NCC集塊から平滑筋細胞への分化誘導を行った。誘導された細胞凝集塊は、平滑筋マーカーであるCalponin、TAGLN、ACTA2、CNN1、TAGLNが高発現しており、また成熟期平滑筋マーカーであるMYH11も高発現していた。従って、本発明のNCC集塊は、平滑筋細胞への分化能を有することが示された。
　本発明によれば、短期間で高効率に神経堤細胞を製造できることから、セルソーティングを行うことも必須ではなくなるため、開発費の削減、ひいては臨床応用の際のコストダウンに資する。また、本発明により製造された神経堤細胞は、間葉系幹細胞およびメラノサイトなどの分化細胞や、骨オルガノイドなどのオルガノイドを製造するための出発細胞として非常に有用である。また、本発明により得られた分化細胞やオルガノイドは、損傷した組織の再生などに用いることができ、特に再生医療において有用である。さらに、本発明により得られた神経堤細胞から、従来報告がなかった第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞を製造することも可能となり、特に口腔外科分野の再生医療に大きく寄与するものである。
　本出願は、日本で出願された特願２０２３－０８２９６４（出願日：２０２３年５月１９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (22)

  1. 　多能性幹細胞から神経堤細胞を製造する方法であって、
    　（１）多能性幹細胞を、ALK阻害剤および骨形成タンパク質を含む培地中で浮遊培養する工程、ならびに
    　（２）ALK阻害剤およびGSK-3β阻害剤を含む培地中で浮遊培養する工程、
    を含む、方法。
  2. 　前記工程（２）が、振とう培養および／または撹拌培養を行う工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（１）の培養期間が６時間～５日間である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記工程（２）の培養期間が１日間～６日間である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記工程（１）の前に、ROCK阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記工程（１）で用いる骨形成タンパク質の少なくとも１つがBMP4、BMP2およびBMP7からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記工程（１）および（２）の少なくともいずれか１つの工程が、ゼノフリー条件下および／またはフィーダーフリー条件下で細胞を培養する工程である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法で得られる神経堤細胞。
  10. 　下記の特徴（Ａ）～（Ｃ）を全て有する神経堤細胞。
    　（Ａ） 多能性幹細胞由来である
    　（Ｂ） CD271、SOX10、TFAP2AおよびPAX3から選ばれる１以上の遺伝子を発現している
    　（Ｃ） 第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞への分化能を有する
  11. 　下記の特徴（Ｄ）～（Ｆ）の少なくともいずれかを有する、請求項１０に記載の神経堤細胞。
    　（Ｄ） メラノブラストへの分化能を有する
    　（Ｅ） 神経細胞への分化能を有する
    　（Ｆ） 間葉系幹細胞への分化能を有する
  12. 　請求項９～１１のいずれか１項に記載の神経堤細胞を分化誘導させる工程を含む、分化細胞またはオルガノイドの製造方法。
  13. 　前記分化細胞が間葉系細胞、神経細胞およびメラノブラストからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記間葉系細胞が間葉系幹細胞、第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞、骨前駆細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、歯原性間葉細胞および平滑筋細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記オルガノイドが骨オルガノイドである、請求項１２に記載の方法。
  16. 　骨オルガノイドが顎骨オルガノイドである、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記分化誘導させる工程が、エンドセリンおよび線維芽細胞増殖因子を含む培地中で神経堤細胞を培養する工程であって、該培養により得られる分化細胞が第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞である、請求項１２に記載の方法。
  18. 　前記培地がさらに骨形成タンパク質を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 　請求項１２～１８のいずれか１項に記載の方法で得られる分化細胞またはオルガノイド。
  20. 　下記の特徴（ａ）～（ｃ)を全て有する第一咽頭弓外胚葉性間葉細胞。
    　（ａ） HOXを発現していない神経堤細胞由来である
    　（ｂ） DLX5、PRRX1およびTWIST1を発現している
    　（ｃ） 上皮シグナルに反応し、パターニングが誘導可能である
  21. 　請求項１９または２０に記載の分化細胞またはオルガノイドを含有してなる、移植療法剤。
  22. 　被験物質の存在下または非存在下で、請求項１９または２０に記載の分化細胞またはオルガノイドを培養する工程を含む、組織の損傷または疾患の治療または予防薬のスクリーニング方法。

     
PCT/JP2024/018417 2023-05-19 2024-05-17 神経堤細胞の製造方法 Pending WO2024242069A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023-082964 2023-05-19
JP2023082964 2023-05-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024242069A1 true WO2024242069A1 (ja) 2024-11-28

Family

ID=93589896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/018417 Pending WO2024242069A1 (ja) 2023-05-19 2024-05-17 神経堤細胞の製造方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024242069A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010140698A1 (ja) * 2009-06-03 2010-12-09 国立大学法人東北大学 多能性幹細胞からの神経堤細胞群の分化誘導方法
WO2016039317A1 (ja) * 2014-09-08 2016-03-17 国立研究開発法人理化学研究所 小脳前駆組織の製造方法
WO2016086052A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 International Stem Cell Corporation Derivation of nueral crest stem cells and uses thereof
WO2018199142A1 (ja) * 2017-04-27 2018-11-01 国立大学法人京都大学 神経堤細胞および交感神経細胞の製造方法
WO2019107485A1 (ja) * 2017-11-30 2019-06-06 国立大学法人京都大学 細胞の培養方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010140698A1 (ja) * 2009-06-03 2010-12-09 国立大学法人東北大学 多能性幹細胞からの神経堤細胞群の分化誘導方法
WO2016039317A1 (ja) * 2014-09-08 2016-03-17 国立研究開発法人理化学研究所 小脳前駆組織の製造方法
WO2016086052A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 International Stem Cell Corporation Derivation of nueral crest stem cells and uses thereof
WO2018199142A1 (ja) * 2017-04-27 2018-11-01 国立大学法人京都大学 神経堤細胞および交感神経細胞の製造方法
WO2019107485A1 (ja) * 2017-11-30 2019-06-06 国立大学法人京都大学 細胞の培養方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAMIYA DAISUKE, TAKENAKA-NINAGAWA NANA, MOTOIKE SOUTA, KAJIYA MIKIHITO, AKABOSHI TEPPEI, ZHAO CHENGZHU, SHIBATA MITSUAKI, SENDA SH: "Induction of functional xeno-free MSCs from human iPSCs via a neural crest cell lineage", NPJ REGENERATIVE MEDICINE, vol. 7, no. 1, XP093242222, ISSN: 2057-3995, DOI: 10.1038/s41536-022-00241-8 *
SHEN PEI, CHEN LU, ZHANG DAHE, XIA SIMO, LV ZHUMAN, ZOU DUOHONG, ZHANG ZHIYUAN, YANG CHI, LI WENLIN: "Rapid induction and long-term self-renewal of neural crest-derived ectodermal chondrogenic cells from hPSCs", NPJ REGENERATIVE MEDICINE, vol. 7, no. 1, XP093242220, ISSN: 2057-3995, DOI: 10.1038/s41536-022-00265-0 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240076630A1 (en) Methods for generating neural tissue and uses thereof
US12077778B2 (en) Methods of generating human inner ear sensory epithelia and sensory neurons
JP2022088579A (ja) 神経組織の製造方法
US20250250540A1 (en) Method for differentiation of ocular cells and use thereof
CN108884441B (zh) 集落形成培养基及其用途
JP2017504311A (ja) 網膜色素上皮細胞を生成する方法
CN113474451B (zh) 来自人多能干细胞的背源性少突胶质祖细胞
JP2018531031A6 (ja) ヒト内耳感覚上皮および感覚ニューロンを生成する方法
JP2020517283A (ja) 二分化または多分化オルガノイド
JP2008099662A (ja) 幹細胞の培養方法
WO2017183732A1 (ja) 網膜組織の製造法
US20230174929A1 (en) Method for generating mesoderm and/or endothelial colony forming cell-like cells having in vivo blood vessel forming capacity
KR102368751B1 (ko) 모양체 주연부 간세포의 제조 방법
JPWO2020100481A1 (ja) 脳オルガノイドの製造方法
AU2017357072A1 (en) Stem cell derived schwann cells
CN114729329A (zh) Lbm、cpc、opc、它们的制备和质量控制方法、试剂盒、移植材料和疾病模型
JPWO2019054515A1 (ja) 背側化シグナル伝達物質又は腹側化シグナル伝達物質による錐体視細胞又は桿体視細胞の増加方法
JP7376760B2 (ja) 多能性幹細胞から各種細胞への段階的製造方法
US12460183B2 (en) Mature cardiomyocyte compositions
Xiong et al. Recapitulation of endochondral ossification by hPSC-derived SOX9+ sclerotomal progenitors
US20250032551A1 (en) Method for producing neural crest cells specialized for differentiation into mesenchymal lineage
JP7421049B2 (ja) 糸球体ポドサイトの誘導方法、及び該誘導方法を用いた多能性幹細胞からのポドサイトの製造方法
JP7737672B2 (ja) 下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離法
Motoike et al. Jawbone-like organoids generated from human pluripotent stem cells
WO2024242069A1 (ja) 神経堤細胞の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24811076

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2025522392

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A