WO2024191230A1

WO2024191230A1 - Method for constructing and culturing hair follicle organoids, and hair drug screening method using same, and hair transplant material

Info

Publication number: WO2024191230A1
Application number: PCT/KR2024/003368
Authority: WO
Inventors: 강경선; 김민지
Original assignee: Kangstem Biotech Co Ltd
Current assignee: Kangstem Biotech Co Ltd
Priority date: 2023-03-16
Filing date: 2024-03-18
Publication date: 2024-09-19
Anticipated expiration: 2025-09-16

Abstract

The present invention relates to a technology for constructing and culturing hair follicle organoids for hair drug screening methods and production of hair transplant materials. More specifically, in the present invention, hair follicles were isolated from existing skin organoids derived from human induced pluripotent stem cells and cultured on collagen- and Matrigel-coated culture inserts to observe hair follicle growth and degeneration. The transplantation of the cultured hair follicles into the skin resulted in the growth of new hair, confirming a potential use of the hair follicle organoids as hair transplant materials. A hair loss-mimic model was generated on the basis of observing reductions in hair follicle length, damage to hair papilla cell aggregates, decreased expression of WNT3A or β-catenin, and increased expression of DKK-1 or TGF-β2 according to treatment of the hair follicle organoids with alopecia-inducing factors. Through the observation, the organoid is expected to find wide applications such as screening methods for hair growth promoters, alopecia preventatives, alopecia mitigators, or alopecia treatments, and screening methods for cosmetic compositions for promoting hair growth, preventing alopecia, or mitigating alopecia.

Description

Method for producing and culturing hair follicle organoids and method for screening hair drugs using the same and hair transplant material

본 발명은 모낭 오가노이드 제작 및 배양방법과 이를 이용한 모발 약물 스크리닝 방법 및 모발 이식 소재를 제공한다.The present invention provides a method for producing and culturing hair follicle organoids, a method for screening hair drugs using the same, and a hair transplant material.

사람의 모발은 인간의 외모의 가장 중요한 측면 중 하나로 간주된다. 사람의 모발은 피부 및 두피를 보호하는 일차적인 역할뿐만 아니라, 사회적 및 성적 의사소통에 있어서 고유의 역할을 하므로 매우 중요하다. 탈모(alopecia)는 정상적으로 모발이 존재해야 하는 부위에 모발이 없는 상태를 말하거나 성장을 멈춘 모발이 자연스럽게 빠지는 현상을 의미하며, 일반적으로는 두피의 성모(굵고 검은 머리털)가 빠지는 것을 의미한다. 모발은 보통 하루에 50~100개 이상 정도가 빠지며, 머리가 빠지는 숫자가 많을수록 탈모증이라고 정의한다.Human hair is considered one of the most important aspects of human appearance. Human hair is very important because it not only plays a primary role in protecting the skin and scalp, but also plays a unique role in social and sexual communication. Alopecia refers to the absence of hair in areas where hair should normally exist, or refers to the phenomenon of hair that has stopped growing falling out naturally, and generally refers to the loss of terminal hair (thick, black hair) on the scalp. Hair usually falls out at a rate of 50 to 100 hairs per day, and the greater the number of hairs lost, the more alopecia is defined.

국내에서도 탈모 관련 많은 연구들이 진행되고 있고, 최근에는 육모 및 탈모 기전에 관여하는 많은 조절 인자들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재 시중에 유통되고 있는 발모 관련 제품들은 다양하고 많으나, 대부분 탈모 방지 및 발모 효과가 미비하거나 일시적이어서 사용자의 요구를 충족하지 못하고 있다. 또한, 상기 제품의 효능이나 안전성에 관한 근거 자료 또한 미흡하고, 상기 제품의 사용을 중단할 시에는 다시 탈모증이 재발되거나 성기능 장애가 발생하는 등 심각한 부작용 등이 보고되면서 사용에 어려움을 겪고 있는 실정이다.Many studies on hair loss are being conducted in Korea, and recently, research on many regulatory factors involved in hair growth and hair loss mechanisms is being actively conducted. Currently, there are many and various hair growth products on the market, but most of them have insufficient or temporary hair loss prevention and hair growth effects, which do not meet the needs of users. In addition, there is insufficient evidence on the efficacy or safety of the products, and serious side effects such as hair loss recurrence or sexual dysfunction when the use of the products is discontinued are reported, making it difficult to use them.

탈모를 극복하기 위해 치료제 개발 외에도 모발이식을 고려할 수 있는데, 모발이식은 모발(털)이 거의 없는 사람들에게 적용하여 모발을 인공적으로 심어줌으로서 모발로 인한 스트레스나 사회적응력 등이 저하되는 것을 방지하고 무엇보다도 모발이식자의 정신적인 건강에 도움을 주고자 하는데 목적이 있다.In addition to developing treatments to overcome hair loss, hair transplantation can be considered. Hair transplantation is applied to people with little hair to artificially implant hair, thereby preventing stress or decline in social adaptability due to hair, and above all, it aims to help the mental health of hair transplant recipients.

이러한 모발이식은 생모를 이식하는 방법과 인공모발을 이식하는 방법이 있으며, 생모이식의 경우에는 자신의 모발 일부를 채취하여 모발이 없는 부위에 모근(모낭)을 이식함으로서 차후 모발이 성장할 수 있도록 하는 것이다.These hair transplant methods include the method of transplanting natural hair and the method of transplanting artificial hair. In the case of natural hair transplant, some of the patient's own hair is collected and the hair root (hair follicle) is transplanted to an area without hair so that hair can grow in the future.

이러한 생모이식은 모근을 하나씩 분리한 후 이식할 자리에 이식함으로써 출혈이 적고 흉터가 거의 없을 뿐만 아니라 성장할 모발의 방향이나 위치결정이 자유로운 장점을 가지고 있으나, 모근을 한 개씩 분리하여 시술하기 때문에 상당한 시간이 걸리며 분리에 따른 통증 및 염증 등의 부작용이 나타날 수 있음은 물론 상당한 경험을 요하는 단점을 갖는다.This type of hair transplant has the advantage of less bleeding and scarring as the hair roots are separated one by one and then transplanted to the desired location, and it also allows freedom in determining the direction and location of the hair to grow. However, since the procedure is performed by separating the hair roots one by one, it takes a considerable amount of time and can cause side effects such as pain and inflammation due to separation, and it also has the disadvantage of requiring considerable experience.

특히, 생모 이식의 경우에는 이식할 모발을 자신의 것을 이용하기 때문에 모발(털)이 부족한 모발이식자의 특징을 고려하면, 많은 수의 모근을 채취하기가 곤란하여 광범위한 이식이 힘들고, 이식할 모발이 부족한 경우가 발생하여 자가 모발 이식의 한계를 갖고 있었다. 또한, 뽑은 모발은 보관 등이 곤란하여 실시간에 걸쳐 바로 모발이식을 해야하는 시간적인 한계도 있었다.In particular, in the case of hair transplantation, since the hair to be transplanted is one's own, considering the characteristics of hair transplant patients who lack hair, it is difficult to extract a large number of hair roots, making it difficult to transplant in large areas, and there are cases where there is a shortage of hair to be transplanted, which has limitations in autologous hair transplantation. In addition, plucked hair is difficult to store, etc., so there is also a time limit for having to transplant hair in real time.

따라서, 보다 실제 모낭과 유사한 구조를 갖고 기능을 모사하여 모낭 이식 소재로 사용할 수 있으며, 발모제 또는 탈모 예방제, 탈모 완화제 및 탈모 치료제의 후보물질을 찾기 위한 스크리닝 방법 또는 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 스크리닝 방법의 개발이 필요한 실정이다. Therefore, there is a need to develop a screening method for finding a candidate substance for a hair growth agent, hair loss prevention agent, hair loss relief agent, or hair loss treatment agent, or a screening method for a cosmetic composition for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss relief that can be used as a hair follicle transplant material by simulating the function and having a structure more similar to an actual hair follicle.

본 발명의 목적은 하기의 단계를 포함하는 모낭 오가노이드 제조방법을 제공하는 데에 있다:An object of the present invention is to provide a method for producing hair follicle organoids comprising the following steps:

(1) 피부 오가노이드로부터 모낭을 분리하는 단계; 및 (2) 상기 분리된 모낭을 공기-액체 계면에서 배양하는 단계.(1) a step of isolating hair follicles from skin organoids; and (2) a step of culturing the isolated hair follicles at an air-liquid interface.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 모낭 오가노이드를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a hair follicle organoid manufactured by the above manufacturing method.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 모낭 오가노이드를 포함하는 모발 이식 소재를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a hair transplant material comprising the hair follicle organoid.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 스트립 형태의 모낭 오가노이드 제조방법을 제공하는 데에 있다: Another object of the present invention is to provide a method for producing hair follicle organoids in a strip form comprising the following steps:

(1) 피부 오가노이드를 평면으로 잘라 펼친 후 수직으로 절단하는 단계; 및 (2) 상기 절단된 피부 오가노이드를 공기-액체 계면에서 배양하는 단계.(1) a step of cutting the skin organoid flat and spreading it out, and then cutting it vertically; and (2) a step of culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a hair follicle organoid in a strip shape manufactured by the above manufacturing method.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 포함하는 모발 이식 소재를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a hair transplant material comprising the strip-shaped hair follicle organoid.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드 제조방법을 제공하는 데에 있다: Another object of the present invention is to provide a method for producing a hair follicle organoid model simulating hair loss, comprising the following steps:

(1) 피부 오가노이드로부터 모낭을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모낭을 공기-액체 계면에서 배양하여 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (3) 상기 모낭 오가노이드에 탈모 유발 요인을 처리하는 단계.(1) a step of isolating hair follicles from skin organoids; (2) a step of culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface to produce hair follicle organoids; and (3) a step of treating the hair follicle organoids with a hair loss-inducing factor.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제작된 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a hair follicle organoid model simulating hair loss produced by the above-mentioned manufacturing method.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드 제조방법을 제공하는 데에 있다: Another object of the present invention is to provide a method for producing a hair follicle organoid in the form of a hair loss simulating model strip, comprising the following steps:

(1) 피부 오가노이드를 평면으로 잘라 펼친 후 수직으로 절단하는 단계; (2) 상기 절단된 피부 오가노이드를 공기-액체 계면에서 배양하여 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (3) 상기 스트립 형태의 모낭 오가노이드에 탈모 유발 요인을 처리하는 단계.(1) a step of cutting the skin organoid flat and spreading it out, and then cutting it vertically; (2) a step of culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface to produce a strip-shaped hair follicle organoid; and (3) a step of treating the strip-shaped hair follicle organoid with a hair loss-inducing factor.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제작된 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a hair follicle organoid in the form of a strip of a hair loss simulating model manufactured by the above-mentioned manufacturing method.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다: Another object of the present invention is to provide a method for screening a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent or hair loss treatment agent comprising the following steps:

(1) 피부 오가노이드로부터 모낭을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모낭을 공기-액체 계면에서 배양하여 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; (3) 상기 모낭 오가노이드에 탈모 유발 요인을 처리하여 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (4) 상기 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드에 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of isolating hair follicles from skin organoids; (2) a step of culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface to produce hair follicle organoids; (3) a step of treating the hair follicle organoids with a hair loss-inducing factor to produce hair follicle organoids simulating alopecia model; and (4) a step of treating the hair follicle organoids simulating alopecia model with a hair growth promoter, a hair loss preventive agent, a hair loss alleviator, or a hair loss treatment candidate.

(1) 피부 오가노이드를 평면으로 잘라 펼친 후 수직으로 절단하는 단계; (2) 상기 절단된 피부 오가노이드를 공기-액체 계면에서 배양하여 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; (3) 상기 스트립 형태의 모낭 오가노이드에 탈모 유발 요인을 처리하여 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (4) 상기 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드에 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of cutting a skin organoid flat and spreading it out, and then cutting it vertically; (2) a step of culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface to produce a strip-shaped hair follicle organoid; (3) a step of treating the strip-shaped hair follicle organoid with a hair loss-inducing factor to produce a hair follicle organoid in a strip-shaped hair loss simulating model; and (4) a step of treating the hair follicle organoid in a strip-shaped hair loss simulating model with a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss alleviation agent, or hair loss treatment candidate.

(1) 피부 오가노이드로부터 모낭을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모낭을 공기-액체 계면에서 배양하여 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (3) 상기 모낭 오가노이드에 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of isolating hair follicles from skin organoids; (2) a step of culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface to produce hair follicle organoids; and (3) a step of treating the hair follicle organoids with a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent, or hair loss treatment candidate.

(1) 피부 오가노이드를 평면으로 잘라 펼친 후 수직으로 절단하는 단계; (2) 상기 절단된 피부 오가노이드를 공기-액체 계면에서 배양하여 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (3) 상기 스트립 형태의 모낭 오가노이드에 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of cutting and spreading the skin organoid flat and then cutting it vertically; (2) a step of culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface to produce a strip-shaped hair follicle organoid; and (3) a step of treating the strip-shaped hair follicle organoid with a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent, or hair loss treatment candidate.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다:Another object of the present invention is to provide a method for screening a cosmetic composition for promoting hair growth, preventing hair loss, or alleviating hair loss, comprising the following steps:

(1) 피부 오가노이드로부터 모낭을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모낭을 공기-액체 계면에서 배양하여 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; (3) 상기 모낭 오가노이드에 탈모 유발 요인을 처리하여 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및(4) 상기 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드에 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of isolating hair follicles from skin organoids; (2) a step of culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface to produce hair follicle organoids; (3) a step of treating the hair follicle organoids with a hair loss-inducing factor to produce hair follicle organoids simulating alopecia model; and (4) a step of treating the hair follicle organoids simulating alopecia model with a cosmetic composition candidate for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss alleviation.

(1) 피부 오가노이드를 평면으로 잘라 펼친 후 수직으로 절단하는 단계; (2) 상기 절단된 피부 오가노이드를 공기-액체 계면에서 배양하여 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; (3) 상기 스트립 형태의 모낭 오가노이드에 탈모 유발 요인을 처리하여 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (4) 상기 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드에 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of cutting a skin organoid flat and spreading it out, and then cutting it vertically; (2) a step of culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface to produce a strip-shaped hair follicle organoid; (3) a step of treating the strip-shaped hair follicle organoid with a hair loss-inducing factor to produce a hair loss-simulating model strip-shaped hair follicle organoid; and (4) a step of treating the hair loss-simulating model strip-shaped hair follicle organoid with a candidate cosmetic composition for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss alleviation.

(1) 피부 오가노이드로부터 모낭을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모낭을 공기-액체 계면에서 배양하여 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (3) 상기 모낭 오가노이드에 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of isolating hair follicles from skin organoids; (2) a step of culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface to produce hair follicle organoids; and (3) a step of treating the hair follicle organoids with a candidate cosmetic composition for promoting hair growth, preventing hair loss, or alleviating hair loss.

(1) 피부 오가노이드를 평면으로 잘라 펼친 후 수직으로 절단하는 단계; (2) 상기 절단된 피부 오가노이드를 공기-액체 계면에서 배양하여 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (3) 상기 스트립 형태의 모낭 오가노이드에 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of cutting and spreading the skin organoid flat and then cutting it vertically; (2) a step of culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface to produce a strip-shaped hair follicle organoid; and (3) a step of treating the strip-shaped hair follicle organoid with a candidate cosmetic composition for promoting hair growth, preventing hair loss, or alleviating hair loss.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 모낭 오가노이드 제조방법을 제공한다: To achieve the above purpose, the present invention provides a method for producing hair follicle organoids comprising the following steps:

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 모낭 오가노이드를 제공한다.In addition, the present invention provides a hair follicle organoid manufactured by the above manufacturing method.

또한, 본 발명은 상기 모낭 오가노이드를 포함하는 모발 이식 소재를 제공한다.In addition, the present invention provides a hair transplant material comprising the hair follicle organoid.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 스트립 형태의 모낭 오가노이드 제조방법을 제공한다: In addition, the present invention provides a method for producing a hair follicle organoid in a strip form, comprising the following steps:

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제공한다.In addition, the present invention provides a strip-shaped hair follicle organoid manufactured by the above-mentioned manufacturing method.

또한, 본 발명은 상기 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 포함하는 모발 이식 소재를 제공한다.In addition, the present invention provides a hair transplant material including the hair follicle organoid in the form of a strip.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드 제조방법을 제공한다: In addition, the present invention provides a method for producing a hair loss model hair follicle organoid comprising the following steps:

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제작된 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드를 제공한다.In addition, the present invention provides a hair follicle organoid model mimicking hair loss produced by the above-mentioned manufacturing method.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드 제조방법을 제공한다: In addition, the present invention provides a method for producing a hair follicle organoid in the form of a hair loss mimicking model strip, comprising the following steps:

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제작된 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제공한다.In addition, the present invention provides a hair follicle organoid in the form of a hair loss simulating model strip manufactured by the above manufacturing method.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 스크리닝 방법을 제공한다: In addition, the present invention provides a method for screening a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent or hair loss treatment agent comprising the following steps:

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for screening a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent or hair loss treatment agent comprising the following steps:

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 스크리닝 방법을 제공한다: In addition, the present invention provides a method for screening a hair growth promoter, hair loss preventive agent, hair loss alleviator or hair loss treatment agent comprising the following steps:

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 스크리닝 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for screening a cosmetic composition for promoting hair growth, preventing hair loss, or alleviating hair loss, comprising the following steps:

(1) 피부 오가노이드로부터 모낭을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 모낭을 공기-액체 계면에서 배양하여 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; (3) 상기 모낭 오가노이드에 탈모 유발 요인을 처리하여 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드를 제작하는 단계; 및 (4) 상기 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드에 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 후보물질을 처리하는 단계.(1) a step of isolating hair follicles from skin organoids; (2) a step of culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface to produce hair follicle organoids; (3) a step of treating the hair follicle organoids with a hair loss-inducing factor to produce hair follicle organoids simulating alopecia model; and (4) a step of treating the hair follicle organoids simulating alopecia model with a cosmetic composition candidate for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss alleviation.

본 발명은 모발 약물 스크리닝 방법 및 모발 이식 소재 제작을 위한 모낭 오가노이드 제작 및 배양기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 인간 유도만능줄기세포주를 이용한 기존의 피부 오가노이드에서 모낭을 모항기에 분리하고 이를 콜라겐 및 마트리겔로 코팅된 배양 삽입물 위에서 배양하여 모낭의 성장과 퇴화를 확인하였으며, 배양된 모낭을 피부에 이식한 결과 새로운 모발이 성장함을 확인하여 모발 이식 소재로서 활용할 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a method for screening hair drugs and a technique for producing and culturing hair follicle organoids for producing hair transplant material. More specifically, hair follicles are separated from the hair stage in an existing skin organoid using a human induced pluripotent stem cell line, and cultured on a culture insert coated with collagen and matrigel to confirm the growth and degeneration of the hair follicles. As a result of transplanting the cultured hair follicles to the skin, it was confirmed that new hairs grow, and thus it is expected that the present invention can be utilized as a hair transplant material.

또한, 본 발명의 모낭 오가노이드에 탈모 유발 요인 처리에 따라, 모낭의 길이 감소, 모유두세포 응집체 손상, WNT3A 또는 β-catenin의 발현 감소, DKK-1 또는 TGF-β2의 발현 증가를 확인하여 탈모 모사 모델을 생성한바, 이를 통해 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제 스크리닝 방법 또는 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물 스크리닝 방법 등으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다. In addition, by treating the hair follicle organoid of the present invention with a hair loss inducing factor, a decrease in the length of the hair follicle, damage to the hair papilla cell aggregates, a decrease in the expression of WNT3A or β-catenin, and an increase in the expression of DKK-1 or TGF-β2 were confirmed, thereby creating a hair loss mimicry model. Therefore, it is expected that this can be utilized as a method for screening hair growth promoters, hair loss preventers, hair loss alleviators, or hair loss treatment agents, or a method for screening cosmetic compositions for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss alleviation.

도 1은 인간 유도만능줄기 세포주를 사용한 피부 오가노이드의 발생 및 모낭의 발생을 확인한 것이다. Figure 1 shows the development of skin organoids and hair follicles using human induced pluripotent stem cell lines.

도 2는 제작한 피부 오가노이드에서 나타나는 모낭의 구조적 특성을 확인한 것이다. Figure 2 confirms the structural characteristics of hair follicles appearing in the fabricated skin organoids.

도 3은 모원기(hair germ) 또는 모항기(hair peg) 시기의 모낭을 확인한 것이다. Figure 3 shows a hair follicle in the hair germ or hair peg stage.

도 4는 제작한 피부 오가노이드에서 모원기(hair germ) 또는 모항기(hair peg) 시기의 모낭을 분리하여 배양결과를 확인한 것이다. Figure 4 shows the culture results of hair follicles isolated from the fabricated skin organoids at the hair germ or hair peg stage.

도 5는 배양 삽입물 위 코팅 지지체인 인공 세포 외 기질을 여러 조건(콜라겐 단독, 마트리겔 단독, 콜라겐과 마트리겔 혼합)으로 제작 후 모낭을 공기-액체 계면 배양한 결과이다. Figure 5 shows the results of air-liquid interface culture of hair follicles after producing an artificial extracellular matrix, which is a coating support on a culture insert, under various conditions (collagen alone, matrigel alone, collagen and matrigel mixture).

도 6은 DKK-1, β-catenin, CD34 유전자들의 발현변화를 관찰하여 모낭의 성장과 퇴화를 확인한 것이다. Figure 6 shows the growth and degeneration of hair follicles confirmed by observing changes in the expression of DKK-1, β-catenin, and CD34 genes.

도 7은 모낭 오가노이드의 생체내 이식결과를 확인한 것이다. Figure 7 shows the results of in vivo transplantation of hair follicle organoids.

도 8은 모낭 오가노이드에 디하이드로테스토스테론(DHT)과 미녹시딜(MXD)을 처리해 모유두세포 응집체 부분의 경계, 모낭의 길이, 유전자 WNT3A 및 β-catenin의 발현변화를 확인한 것이다.Figure 8 shows the changes in the boundary of the hair papilla cell aggregates, the length of the hair follicles, and the expression of the WNT3A and β-catenin genes by treating the hair follicle organoids with dihydrotestosterone (DHT) and minoxidil (MXD).

도 9는 스트립 형태의 모낭 오가노이드의 세포사멸, 세포증식 여부와 탈모 유발 호르몬의 처리에 따른 모낭 및 모발의 길이 변화를 확인한 것이다.Figure 9 shows the changes in the length of hair follicles and hair according to the presence or absence of cell death and cell proliferation in strip-shaped hair follicle organoids and treatment with hair loss-inducing hormones.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 모낭 오가노이드 제조방법을 제공한다: (1) 피부 오가노이드로부터 모낭을 분리하는 단계; 및 (2) 상기 분리된 모낭을 공기-액체 계면에서 배양하는 단계.The present invention provides a method for producing a hair follicle organoid comprising the following steps: (1) a step of isolating a hair follicle from a skin organoid; and (2) a step of culturing the isolated hair follicle at an air-liquid interface.

상기 (1) 단계의 피부 오가노이드는 하기의 단계를 포함하여 제조될 수 있다:The skin organoid of step (1) above can be manufactured by including the following steps:

(a) 만능성 줄기세포 유래 오가노이드를 Wnt 작용제의 존재 하에 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 배양물을 피부 오가노이드 성숙용 배지에서 40일 이상 배양하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 배양물을 절단하여 공기-액체 계면에서 배양.(a) culturing pluripotent stem cell-derived organoids in the presence of a Wnt agonist; (b) culturing the culture of step (a) in a medium for maturation of skin organoids for 40 days or more; and (c) cutting the culture of step (b) and culturing it at an air-liquid interface.

상기 Wnt 작용제는 만능성 줄기세포의 배양 5 내지 7일차에 첨가될 수 있다. The above Wnt agonist can be added on days 5 to 7 of culturing pluripotent stem cells.

상기 Wnt 작용제는 CHIR-99021일 수 있다. The above Wnt agonist may be CHIR-99021.

상기 피부 오가노이드는 KRT5(Keratin 5), KRT10, KRT15, KRT17, 로리크린(Loricrin), 필라그린(Filaggrin), SOX2(SRY-Box Transcription Factor 2) 및 멜란-A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 발현할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The above skin organoid can express one or more selected from the group consisting of KRT5 (Keratin 5), KRT10, KRT15, KRT17, Loricrin, Filaggrin, SOX2 (SRY-Box Transcription Factor 2), and Melan-A, but is not limited thereto.

상기 (1) 단계의 모낭은 진피초, 외측모근초, 내측모근초, 모유두세포, 모모세포, 벌지 구역 및 피지선으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The hair follicle of the above step (1) may include at least one selected from the group consisting of a dermal sheath, an outer root sheath, an inner root sheath, a hair papilla cell, a hair follicle cell, a bulge area, and a sebaceous gland, but is not limited thereto.

상기 (1) 단계의 모낭은 모원기(hair germ) 또는 모항기(hair peg) 시기에 분리할 수 있다.The hair follicles in the above step (1) can be separated at the hair germ or hair peg stage.

상기 모원기는 피부 오가노이드 형성 후 60일 내지 80일 내에 형성될 수 있고, 바람직하게는 70일 내지 80일 내에 형성될 수 있다.The above-mentioned primordial cells can be formed within 60 to 80 days after the formation of skin organoids, and preferably within 70 to 80 days.

상기 모항기는 피부 오가노이드 형성 후 80일 내지 100일 내에 형성될 수 있고, 바람직하게는 90일 내지 100일 내에 형성될 수 있다.The above-mentioned parent organ can be formed within 80 to 100 days after the formation of the skin organoid, and preferably within 90 to 100 days.

상기 (1) 단계의 분리는 미세 절제술을 이용하여 분리될 수 있다.The separation in step (1) above can be achieved using microdissection.

상기 (2) 단계의 배양은 배양 삽입물상에서 배양할 수 있다. The culture in step (2) above can be cultured on a culture insert.

상기 배양 삽입물은 콜라겐 및 마트리겔; 또는 콜라겐으로 코팅될 수 있다.The above culture insert may be coated with collagen and matrigel; or collagen.

상기 콜라겐 및 마트리겔은 1:10 내지 10:1 비율일 수 있고, 바람직하게는 1:1 내지 3:1일 수 있다. The above collagen and matrigel may be in a ratio of 1:10 to 10:1, preferably 1:1 to 3:1.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 모낭 오가노이드를 제공한다. In addition, the present invention provides a hair follicle organoid manufactured by the above manufacturing method.

상기 모낭 오가노이드는 KRT5(Keratin 5), KRT10, KRT15, KRT17, 로리크린(Loricrin), 필라그린(Filaggrin), SOX2(SRY-Box Transcription Factor 2) 및 멜란-A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 발현할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The above hair follicle organoid can express one or more selected from the group consisting of KRT5 (Keratin 5), KRT10, KRT15, KRT17, Loricrin, Filaggrin, SOX2 (SRY-Box Transcription Factor 2), and Melan-A, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 모낭 오가노이드를 포함하는 모발 이식 소재를 제공한다. In addition, the present invention provides a hair transplant material comprising the hair follicle organoid.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 스트립 형태의 모낭 오가노이드 제조방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for producing a hair follicle organoid in a strip form, comprising the following steps:

상기 (1)단계의 절단은 피부 오가노이드 내 모낭이 모원기(hair germ) 또는 모항기(hair peg) 시기일 때 이루어 질 수 있다. The amputation in step (1) above can be performed when the hair follicle in the skin organoid is in the hair germ or hair peg stage.

상기 (1) 단계의 절단은 펼쳐진 피부 오가노이드를 1mm 내지 3mm 간격으로 절단할 수 있다.The cutting in step (1) above can cut the spread skin organoid at intervals of 1 mm to 3 mm.

상기 스트립 형태의 모낭 오가노이드는 KRT5(Keratin 5), KRT10, KRT15, KRT17, 로리크린(Loricrin), 필라그린(Filaggrin), SOX2(SRY-Box Transcription Factor 2) 및 멜란-A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 발현할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The above-mentioned strip-shaped hair follicle organoids can express one or more selected from the group consisting of KRT5 (Keratin 5), KRT10, KRT15, KRT17, Loricrin, Filaggrin, SOX2 (SRY-Box Transcription Factor 2), and Melan-A, but are not limited thereto.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드 제조방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for producing a hair loss model hair follicle organoid comprising the following steps:

상기 탈모는 호르몬의 불균형 또는 자외선에 의한 것일 수 있다.The above hair loss may be caused by hormonal imbalance or ultraviolet rays.

상기 호르몬은 디하이드로테스토스테론 (DHT), 테스토스테론, 갑상선 호르몬 또는 코티솔일 수 있다.The hormones may be dihydrotestosterone (DHT), testosterone, thyroid hormones, or cortisol.

상기 갑상선 호르몬은 티로신(tyrosine)일 수 있다. The above thyroid hormone may be tyrosine.

상기 (3)단계의 탈모 유발 요인은 남성 호르몬, 스트레스 호르몬 또는 자외선일 수 있다.The hair loss causing factors in step (3) above may be male hormones, stress hormones, or ultraviolet rays.

상기 호르몬은 디하이드로테스토스테론 (dihydrotestosterone), 테스토스테론 또는 갑상선 호르몬일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. The above hormones may be, but are not limited to, dihydrotestosterone, testosterone, or thyroid hormones.

상기 스트레스 호르몬은 코티솔(cortisol)일 수 있다. The stress hormone may be cortisol.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제작된 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드을 제공한다. In addition, the present invention provides a hair follicle organoid model simulating hair loss produced by the above-mentioned manufacturing method.

상기 탈모 모사 모델 모낭 오가노이드는 하기 특징으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 특징을 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:The above hair loss mimicry model hair follicle organoid may have one or more characteristics selected from the group consisting of the following characteristics, but is not limited thereto:

1) 모낭의 길이 감소; 2) 모유두세포 응집체 손상; 3) WNT3A 또는 β-catenin의 발현 감소; 또는 4) DKK-1 또는 TGF-β2의 발현 증가.1) reduction in hair follicle length; 2) damage to hair papilla cell aggregates; 3) decreased expression of WNT3A or β-catenin; or 4) increased expression of DKK-1 or TGF-β2.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드 제조방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for producing a hair follicle organoid in the form of a hair loss mimicking model strip, comprising the following steps:

상기 (3) 단계의 탈모 유발 요인은 남성 호르몬, 스트레스 호르몬 또는 자외선일 수 있다.The hair loss causing factors in the above step (3) may be male hormones, stress hormones, or ultraviolet rays.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제작된 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드를 제공한다. In addition, the present invention provides a hair follicle organoid in the form of a hair loss simulating model strip manufactured by the above manufacturing method.

상기 탈모 모사 모델 스트립 형태의 모낭 오가노이드는 하기 특징으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 특징을 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:The above hair follicle organoid in the form of a strip of a hair loss mimicking model may have one or more characteristics selected from the group consisting of the following characteristics, but is not limited thereto:

상기 (4) 단계의 후보물질 처리 후 WNT3A 또는 β-catenin의 발현이 증가하거나 DKK-1 또는 TGF-β2의 발현이 감소하는 경우 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제라고 판단하는 단계를 포함할 수 있다. If the expression of WNT3A or β-catenin increases or the expression of DKK-1 or TGF-β2 decreases after treatment with the candidate substance in step (4) above, a step of determining that the agent is a hair growth promoter, hair loss preventer, hair loss alleviator, or hair loss treatment agent may be included.

상기 (4) 단계의 후보물질 처리 후 WNT3A 또는 β-catenin의 발현이 증가하거나 DKK-1 또는 TGF-β2의 발현이 감소하는 경우 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제라고 판단하는 단계를 포함할 수 있다.If the expression of WNT3A or β-catenin increases or the expression of DKK-1 or TGF-β2 decreases after treatment with the candidate substance in step (4) above, a step of determining that the agent is a hair growth promoter, hair loss preventer, hair loss alleviator, or hair loss treatment agent may be included.

상기 (3) 단계의 후보물질 처리 후 WNT3A 또는 β-catenin의 발현이 증가하거나 DKK-1 또는 TGF-β2의 발현이 감소하는 경우 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제라고 판단하는 단계를 포함할 수 있다.If the expression of WNT3A or β-catenin increases or the expression of DKK-1 or TGF-β2 decreases after treatment with the candidate substance in step (3) above, a step of determining that the agent is a hair growth promoter, hair loss preventer, hair loss alleviator, or hair loss treatment agent may be included.

상기 (3) 단계의 후보물질 처리 후 WNT3A 또는 β-catenin의 발현이 증가하거나 DKK-1 또는 TGF-β2의 발현이 감소하는 경우 발모 촉진제, 탈모 예방제, 탈모 완화제 또는 탈모 치료제라고 판단하는 단계를 포함할 수 있다. If the expression of WNT3A or β-catenin increases or the expression of DKK-1 or TGF-β2 decreases after treatment with the candidate substance in step (3) above, a step of determining that the agent is a hair growth promoter, hair loss preventer, hair loss alleviator, or hair loss treatment agent may be included.

상기 (4) 단계의 후보물질 처리 후 WNT3A 또는 β-catenin의 발현이 증가하거나 DKK-1 또는 TGF-β2의 발현이 감소하는 경우 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물이라고 판단하는 단계를 포함할 수 있다.A step may be included for determining that the cosmetic composition is for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss alleviation if, after treatment with the candidate substance of step (4), the expression of WNT3A or β-catenin increases or the expression of DKK-1 or TGF-β2 decreases.

상기 (3) 단계의 후보물질 처리 후 WNT3A 또는 β-catenin의 발현이 증가하거나 DKK-1 또는 TGF-β2의 발현이 감소하는 경우 발모 촉진, 탈모 예방 또는 탈모 완화용 화장료 조성물이라고 판단하는 단계를 포함할 수 있다.A step may be included for determining that the cosmetic composition is for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss alleviation when the expression of WNT3A or β-catenin increases or the expression of DKK-1 or TGF-β2 decreases after treatment with the candidate substance in step (3) above.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, in order to help understand the present invention, examples and the like will be given to explain in detail. However, the following examples and the like only illustrate the content of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples and the like. The examples and the like of the present invention are provided to more completely explain the present invention to a person having average knowledge in the art.

<실시 예 1> 인간 유도만능 줄기세포 유래 피부 오가노이드 제작<Example 1> Production of skin organoids derived from human induced pluripotent stem cells

1. 인간 유도만능줄기세포의 배양1. Culturing of human induced pluripotent stem cells

인간 유도만능줄기세포주 (iPSC; CMC3, CMC11)는 Y-27632 (10 μM) 가 보충된 Essential 8 (Gibo) 배양액에 Vitronectin(ThermoFisher) 코팅된 배양접시 위에 배양하였다. 배양액은 매일 교체하였으며 약 4일을 주기로 ReLeSR (Stem Cell Technology)를 이용하여 계대 배양하였다. Human induced pluripotent stem cell lines (iPSC; CMC3, CMC11) were cultured on Vitronectin (ThermoFisher)-coated culture dishes in Essential 8 (Gibo) medium supplemented with Y-27632 (10 μM). The medium was changed daily, and passaged every 4 days using ReLeSR (Stem Cell Technology).

2. 인간 유도만능 줄기세포주를 사용한 피부 오가노이드 분화 방법2. Method for differentiating skin organoids using human induced pluripotent stem cell lines

인간 유도만능 줄기세포주를 이용한 기존의 피부 오가노이드 분화 프로토콜이 개시된 문헌 및 특허 (Jung, S. et al. Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes. iScience, 25(10), 105150(2022), METHOD FOR CONSTRUCTION OF ATOPIC DERMATITS MODEL BY USING PLURIPOTENT STEM CELL-DERIVED SKIN ORGANOID, PCT/KR2021/014810 (2021.10. 21.)) 을 참고하여 피부 오가노이드를 배양하였다. 인간 유도만능줄기세포에서 1) 배아체를 배양하는 단계, 2) 비신경 외배엽으로 분화 유도하는 단계 3) 두개골 신경능선 유사세포로 분화 유도 및 Wnt 신호 활성화 단계를 거처 피부 오가노이드를 배양하였다 (도 1A).Skin organoids were cultured with reference to literature and patents (Jung, S. et al. Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes. iScience, 25(10), 105150(2022), METHOD FOR CONSTRUCTION OF ATOPIC DERMATITS MODEL BY USING PLURIPOTENT STEM CELL-DERIVED SKIN ORGANOID, PCT/KR2021/014810 (2021.10. 21.)) that disclose existing skin organoid differentiation protocols using human induced pluripotent stem cell lines. Skin organoids were cultured from human induced pluripotent stem cells through the following steps: 1) culturing embryoid bodies, 2) inducing differentiation into non-neural ectoderm, and 3) inducing differentiation into cranial neural crest-like cells and activating Wnt signals (Fig. 1A).

피부 오가노이드에서 모낭은 1mm²의 면적 당 약 10개의 모낭이 발생한 것을 확인하였다. (보통 1개의 구형의 피부 오가노이드에서 대략 4만 5천개의 동일한 모낭이 발생) (도 1B). In skin organoids, hair follicles were confirmed to develop at a rate of approximately 10 hair follicles per 1 ^mm2 area (typically, approximately 45,000 identical hair follicles develop from one spherical skin organoid) (Fig. 1B).

3. 피부 오가노이드 모낭의 특성 검증3. Verification of the characteristics of skin organoid hair follicles

제작한 피부 오가노이드에서 나타나는 모낭의 구조적 특성을 검증하기 위해 H&E 및 면역 형광 염색을 진행한 결과 모낭의 미세 구조인 진피초, 외측모근초, 내측모근초, 모유두세포, 모모세포, 벌지 구역, 피지선 모두 확인하였다 (도 2).To verify the structural characteristics of the hair follicles in the fabricated skin organoids, H&E and immunofluorescence staining were performed, and the microstructure of the hair follicles, including the dermal sheath, outer root sheath, inner root sheath, hair papilla cells, hair follicle cells, bulge zone, and sebaceous glands, were all confirmed (Fig. 2).

<실시 예 2> 인간 유도만능줄기세포 유래 피부 오가노이드에서의 모낭 분리 및 배양<Example 2> Isolation and culture of hair follicles from human induced pluripotent stem cell-derived skin organoids

1. 미세 절제술 (Microdissection)을 통한 분리 및 배양1. Isolation and culture through microdissection

인간 유도만능줄기세포 유래 피부 오가노이드에서 모낭은 표피층, 진피층으로부터 분리되었다. 먼저, 피부 오가노이드에서 모낭은 매우 작은 크기로 존재하기 때문에 손상 없이 모낭을 수득하는 미세 절제 기술이 개발되었다.Hair follicles were isolated from the epidermal and dermal layers in human-induced pluripotent stem cell-derived skin organoids. First, a microdissection technique was developed to obtain hair follicles without damage, since hair follicles exist in very small sizes in skin organoids.

피부 오가노이드를 조직 배양 플레이트로 옮기고 Spring Micro-Scissor을 이용하여 피부 오가노이드를 절단하고 포셉을 사용하여 표적 조직을 표피층과 진피층으로부터 분리하였다. 모낭과 피부층 (표피층 및 진피층)의 콜라겐 섬유에 고도로 박혀 있고, 단단히 붙어 있는 경향이 있기 때문에 마이크로 니들로 조심스럽게 떼어냈다. 분리한 모낭을 다른 세포로부터의 오염을 피하기 위해 배양 배지로 세척 후 콜라겐으로 3D로 코팅된 트랜스 웰 배양 삽입물 위에 공기에 노출되게 배양하였다.The skin organoids were transferred to a tissue culture plate, and the skin organoids were cut using a Spring Micro-Scissor, and the target tissue was separated from the epidermal layer and dermal layer using forceps. Because the hair follicles are highly embedded in the collagen fibers of the hair follicles and the skin layers (epidermal layer and dermal layer) and tend to be tightly adhered, they were carefully removed with a microneedle. The isolated hair follicles were washed with culture medium to avoid contamination from other cells, and then cultured on transwell culture inserts coated with collagen in 3D, exposed to the air.

분리 적정기간을 최적화하기 위해 모원기 (hair germ, 표피가 두꺼워지고 밑으로 돌출되고, hair placode 밑으로 진피 섬유아세포가 응축된 단계 (도 3A)), 모항기(hair peg, 끝이 둥근 기둥 형태로 길어지며, 진피 섬유아세포는 전구 모양 같은 모유두 세포를 형성하며 오목한 근위부 끝은 응축된 세포를 감싸기 시작하는 단계 (도 3B)) 시기의 단계별로 모낭을 분리하였다. 모원기 (hair germ) 시기에 분리할 경우 완벽하게 표피층과 진피층의 분리가 어려워 배양 시 표피층과 진피층이 재생되는 결과를 얻었다. 또한 모항기 (hair peg) 이전의 모낭을 분리하여 배양할 경우 모낭의 상단 부분에 새로운 모낭들이 형성되는 것을 확인하였다. 반면 모항기 (Hair peg) 이상의 단계의 모낭을 분리 시 타 조직의 개입 없이 완벽한 구조의 모낭에서 모발이 생장 되는 것을 확인하였다. 분리 시기는 모원기의 경우 피부 오가노이드 형성 후 60일 내지 80일 내에 형성되는 것이며, 모항기의 경우 80일 내지 100일 내에 형성되는 것을 분리하였다 (도 4A, 4B).To optimize the isolation period, hair follicles were isolated by stage: hair germ (the stage where the epidermis thickens and protrudes downward, and dermal fibroblasts condense under the hair placode (Fig. 3A)) and hair peg (the stage where the hair grows into a rounded columnar shape, and dermal fibroblasts form bulb-like hair papilla cells, and the concave proximal end begins to surround the condensed cells (Fig. 3B)). When isolated at the hair germ stage, it was difficult to completely separate the epidermal and dermal layers, and thus, the epidermal and dermal layers were regenerated during culture. In addition, when hair follicles before the hair peg stage were isolated and cultured, new hair follicles were formed at the upper part of the hair follicles. On the other hand, when hair follicles at the hair peg stage or higher were isolated, hair was confirmed to grow from perfectly structured hair follicles without the intervention of other tissues. The isolation period was 60 to 80 days after the formation of skin organoids in the case of the parental stage, and 80 to 100 days after the formation of skin organoids in the parental stage (Figures 4A and 4B).

모항기(Hair peg) 이상 단계의 모낭을 분리하여 체외에서 배양하였을 때 모낭의 미세 구조 분화를 검증하기 위해 H&E 및 면역 형광 염색을 통해 확인하였다 (도 4C).When hair follicles at the hair peg stage or higher were isolated and cultured in vitro, the fine structural differentiation of the hair follicles was verified using H&E and immunofluorescence staining (Fig. 4C).

2. 모낭 배양 지지체 조건 최적화2. Optimization of hair follicle culture support conditions

모낭을 배양하기 위해 사용되는 트랜스 웰 배양 삽입물 위 코팅 지지체인 인공 세포 외 기질을 여러 조건으로 제작 후 모낭을 공기-액체 계면 배양하였다. 콜라겐 단독, 마트리겔 단독, 콜라겐과 마트리겔을 포함한 세포 외 기질 혼합물 위에서 모원기(hair germ) 이상의 단계의 모낭을 분리 배양하였다. After fabricating an artificial extracellular matrix, which is a coating support on a transwell culture insert used to culture hair follicles, under various conditions, hair follicles were cultured at the air-liquid interface. Hair follicles at the hair germ stage or higher were isolated and cultured on collagen alone, Matrigel alone, and an extracellular matrix mixture containing collagen and Matrigel.

그 결과 콜라겐 단독 조건에서 배양하였을 때 모낭이 생장하는 것을 확인할 수 있었지만 콜라겐과 마트리겔을 포함한 세포 외 기질을 혼합한 조건보다 모발로의 분화와 생장 속도가 느린 것을 확인하였으며, 마트리겔 단독에서 모낭을 배양하였을 때 서로 응집되어 배양에 실패한 것을 확인할 수 있었다. 최종적으로 콜라겐 또는 콜라겐과 마트리겔을 혼합(콜라겐과 마트리겔 혼합 배양에서 콜라겐 : 마트리겔= 3:1 내지 1:1 비율)한 세포 외 기질에서 가장 모낭과 모발의 생장 속도가 증진된 것을 확인하였다(도 5A). 또한 콜라겐과 마트리겔을 포함한 세포 외 기질 혼합물 위에서 모낭을 체외 배양으로 60일 이상 배양이 가능하며 80일 이후부터는 모낭의 성장이 멈추는 것을 확인하였다(도 5B).As a result, it was confirmed that hair follicles grew when cultured under collagen-only conditions, but the differentiation into hair and growth rate were slower than under conditions where the extracellular matrix including collagen and matrigel was mixed. In addition, it was confirmed that the hair follicles clumped together and failed to be cultured when cultured under matrigel alone. Finally, it was confirmed that the growth rate of hair follicles and hair was the most enhanced in an extracellular matrix containing collagen or a mixture of collagen and matrigel (collagen: matrigel = 3:1 to 1:1 ratio in collagen and matrigel mixed culture) (Fig. 5A). In addition, it was confirmed that hair follicles could be cultured in vitro for more than 60 days on an extracellular matrix mixture including collagen and matrigel, and that hair follicle growth stopped after 80 days (Fig. 5B).

모낭 배양 후 10일 이내, 30~50일, 60일 이상의 모낭을 분류하여 모발의 성장 유발 및 저해와 관련된 유전자의 발현을 quantitative PCR을 통해 확인하였다. 탈모 유발 사이토카인인 DKK-1 유전자 발현은 60일 이상의 모낭에서 현저하게 증가하였고, 모발 성장에 관여하는 유전자인 β-catenin 과 모낭 줄기세포의 주요 마커인 CD34 의 발현은 감소하였다. 이를 통해 체외 배양 조건에서도 모낭의 성장과 퇴화를 확인할 수 있음을 알 수 있었다 (도 6).Within 10 days after hair follicle culture, hair follicles aged 30 to 50 days, and over 60 days were classified, and the expression of genes related to hair growth induction and inhibition was confirmed through quantitative PCR. The expression of the DKK-1 gene, a hair loss-inducing cytokine, was significantly increased in hair follicles aged 60 days or more, while the expression of β-catenin, a gene involved in hair growth, and CD34, a major marker of hair follicle stem cells, decreased. This suggests that hair follicle growth and regression can be confirmed even under in vitro culture conditions (Fig. 6).

<실시 예 3> 이식시 생체 내 모낭 성장 확인<Example 3> Confirmation of hair follicle growth in vivo during transplantation

이식을 위한 모낭은 체외 배양 이후 모낭의 형태학적 구조가 모구, 모근부로 구별 가능하며, 벌지 부분으로의 분화가 확연하게 진행되고 모발이 생성되기 시작할 시기의 모낭을 사용하였다 (도 7A).Hair follicles for transplantation were used when the morphological structure of the hair follicles could be distinguished into the hair bulb and hair root parts after in vitro culture, differentiation into the bulge part was clearly progressing, and hair began to be produced (Figure 7A).

6주령의 Balb/c nu/nu 마우스 피부에 20G의 주사 바늘로 표면에 거의 평행하고 수직으로 약 0.5mm, 수평으로 2.5mm로 얕은 찔림 상처를 낸 후 모낭 오가노이드를 상처 부위에 피부 내 이식하였다. 이를 통해 이식 소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다.A shallow puncture wound was made on the skin of 6-week-old Balb/c nu/nu mice with a 20G needle, approximately 0.5 mm vertically and 2.5 mm horizontally, almost parallel to the surface, and hair follicle organoids were transplanted intradermally into the wound site. This was done to confirm the possibility of the organoids as a transplant material.

그 결과 1차적으로 1주일 안으로 기존의 모발이 사라진 후 약 1달 후 에 새로운 모발이 확인되었다. 모낭 오가노이드의 멜라닌 세포의 유무에 따라 흰색 또는 검은색 모발의 성장이 확인되었다 (도 7B, 7C). As a result, existing hair primarily disappeared within a week, and new hair was confirmed about a month later. Depending on the presence or absence of melanocytes in the hair follicle organoids, growth of white or black hair was confirmed (Fig. 7B, 7C).

H&E 염색과 인간 핵 항원 항체를 이용한 면역형광염색을 통해 해당 모발이 마우스가 아닌 인간 유래 모발임을 확인하였다(도 7D). 이는 제작한 모낭 오가노이드가 이식 후에도 모발 마우스의 피부층을 뚫고 모발이 성장했다는 점에서 의의가 있고, 모낭 오가노이드가 잠재적인 모발 이식 소재로서의 기능을 할 수 있음을 알 수 있었다. H&E staining and immunofluorescence staining using human nuclear antigen antibodies confirmed that the hairs were human-derived hairs, not mouse-derived hairs (Fig. 7D). This is significant in that the hair follicle organoids produced after transplantation grew hairs through the skin layer of hair-bearing mice, and it was found that hair follicle organoids can function as potential hair transplantation materials.

<실시 예 4> 약물 스크리닝의 가능성 확인<Example 4> Confirmation of the possibility of drug screening

탈모 촉진 및 탈모증상 완화 효능 평가 방법은 주로 동물실험을 통해 진행되고 있으며, 체외 시험법은 아직 확립되어 있지 않은 상태이고, 기존에 알려진 체외 시험법은 모낭유두세포에 처리하는 등 모낭의 성장 및 형태를 평가하고 신호 전달 메커니즘을 연구하는데 한계가 존재하였다.The evaluation of the efficacy of hair loss promotion and alleviation of hair loss symptoms is mainly conducted through animal experiments, and in vitro test methods have not yet been established. Existing known in vitro test methods have limitations in evaluating the growth and morphology of hair follicles and studying signal transmission mechanisms, such as by treating hair follicle papilla cells.

본 발명에서의 모낭은 성장에 따라 모낭의 형태학적, 유전자 발현 등의 변화가 확인되었기 때문에 여러 유효 물질의 평가가 가능하다고 판단되었다.In the present invention, since the morphological and gene expression changes of the hair follicles were confirmed according to growth, it was determined that evaluation of various effective substances was possible.

유효 물질 평가의 가능성을 확인하기 위해 모낭에 작용해 탈모를 일으키는 호르몬으로 잘 알려진 물질 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)를 10^-5M을 처치한 군과 DHT와 동시에 발모 효과로 알려진 미녹시딜(minoxidil, MXD)을 10uM 농도로 10일간 처치하였다.To confirm the possibility of evaluating effective substances, a group was treated with 10 ^-5 M dihydrotestosterone (DHT), a hormone well known to act on hair follicles and cause hair loss, and a group was treated with 10 uM minoxidil (MXD), known for its hair growth effect, at the same time as DHT, for 10 days.

그 결과, 형태학적으로 DHT 단독 처치 군에서는 모낭의 길이가 짧고 모유두세포 응집체 부분의 경계가 흐려지며 손상을 입었으며, MXD 동시 처치군은 DHT 단독 군보다 모낭의 길이가 길고 모유두세포 응집체 부분의 경계가 뚜렷하며 상대적으로 손상의 정도가 감소하였다(도 8A).As a result, in terms of morphology, in the DHT only treatment group, the length of the hair follicles was shorter, the border of the hair papilla cell aggregates was blurred, and the hair follicles were damaged, while in the MXD co-treatment group, the length of the hair follicles was longer, the border of the hair papilla cell aggregates was clearer, and the degree of damage was relatively reduced compared to the DHT only group (Fig. 8A).

quantitative PCR을 통해 모낭의 성장 촉진 또는 억제 관련 유전자의 발현을 확인하였다. 그 결과, DHT 단독 군에서는 대조군에 비해 모낭의 성장을 촉진 시키는데 관여하는 WNT3A, β-catenin 의 발현은 감소한 반면 MXD 동시 처치 군에서는 유의미하게 증가하였다. 또한 DHT 단독 군에서는 대조군에 비해 모낭의 성장을 억제 시키는데 관여하는 DKK-1, TGF-β2의 발현이 현저하게 증가하였고, MXD 동시 처치 군에서는 유의미하게 감소하였다. 모낭 오가노이드에서 DHT에 의해 탈모와 유사한 반응이 일어날 수 있으며, MXD에 의해 탈모 증상이 완화되었음을 확인하였다(도 8B).The expression of genes related to the promotion or inhibition of hair follicle growth was confirmed through quantitative PCR. As a result, in the DHT only group, the expression of WNT3A and β-catenin, which are involved in the promotion of hair follicle growth, decreased compared to the control group, whereas it significantly increased in the MXD co-treatment group. In addition, in the DHT only group, the expression of DKK-1 and TGF-β2, which are involved in the inhibition of hair follicle growth, significantly increased compared to the control group, whereas it significantly decreased in the MXD co-treatment group. It was confirmed that a reaction similar to hair loss can occur in hair follicle organoids due to DHT, and that hair loss symptoms were alleviated by MXD (Fig. 8B).

남성 호르몬 이외에도 탈모를 유발시킬 수 있는 요인 (자외선 또는 스트레스 호르몬)도 탈모 유사 모델을 제작하여 발모 촉진제, 탈모 예방제 또는 탈모 치료제를 위한 유효 물질을 평가할 수 있다. In addition to male hormones, factors that can cause hair loss (ultraviolet rays or stress hormones) can also be used to create a hair loss model to evaluate effective substances for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss treatment.

유효 물질과 탈모 유발 물질의 처리 순서에 따라 약물 스크리닝의 대상이 다양해질 수 있는데, 유효 물질을 선 처리시 탈모 예방 및 보호 효과, 후 처리시 발모 및 치료 효과 확인이 가능할 것이고, 이에 국한되지 않고 여러 물질들을 정상 모낭 오가노이드에 단독 처리하였을 경우에도 해당 물질이 모낭 성장 억제 또는 촉진 효과 확인이 가능한 플랫폼으로 사용 가능하다.Depending on the order of treatment of the effective substance and the hair loss-causing substance, the target of drug screening can be diverse. When the effective substance is treated first, it will be possible to confirm the hair loss prevention and protection effect, and when the substance is treated later, the hair growth and treatment effect. Not limited to this, even when various substances are treated alone to normal hair follicle organoids, the substance can be used as a platform to confirm the hair follicle growth inhibition or promotion effect.

따라서 이를 통해 확인된 물질의 효능을 해당 모낭을 통해 평가할 수 있음을 확인함으로서 다른 유효 물질의 평가도 가능하다는 것을 알 수 있었으며, 다수의 모낭에서의 약물에 대한 효과를 평가하기 위해서는 단일 모낭뿐만 아니라 스트립 형태의 모낭 오가노이드로 활용 가능함을 알 수 있었다.Therefore, by confirming that the efficacy of the substance confirmed through this can be evaluated through the corresponding hair follicle, it was found that evaluation of other effective substances is also possible, and it was found that not only a single hair follicle but also a strip-shaped hair follicle organoid can be utilized to evaluate the effect of a drug on multiple hair follicles.

모원기 60일 내지 80일 내에 형성되는 시기 또는 모항기 80일 내지 100 내에 형성되는 시기에 구형의 피부 오가노이드를 평면으로 잘라 펼친 후 수직으로 1mm 간격으로 절단하였다.The spherical skin organoids were cut flat and spread out during the period of formation between 60 and 80 days from the maternal stage or between 80 and 100 days from the maternal stage, and then cut vertically at 1 mm intervals.

트랜스 웰 배양 삽입물 위 코팅 지지체인 콜라겐 단독 또는 콜라겐과 마트리겔 1:10 내지 10:1 비율로 혼합한 인공 세포 외 기질 위에 절단한 단면이 아래, 위로 향하도록 한 후 공기-액체 계면 배양하였다. The cut sections were placed face down and upward on an artificial extracellular matrix coated with a support on top of a transwell culture insert, either collagen alone or a mixture of collagen and Matrigel in a ratio of 1:10 to 10:1, and then cultured at the air-liquid interface.

이렇게 배양한 모낭 스트립을 면역형광염색을 통해 세포사멸 (Cleaved Caspase-3), 세포 증식 (Ki-67)을 확인하였을 때 세포 사멸 없이 증식이 가능하다는 것을 확인하였다 (도 9A).When the hair follicle strips cultured in this manner were stained for apoptosis (Cleaved Caspase-3) and cell proliferation (Ki-67) using immunofluorescence staining, it was confirmed that proliferation was possible without cell death (Figure 9A).

스트립 형태의 모낭 오가노이드로 배양 3일 이후부터 탈모 유발 호르몬(DHT) 처리시 모낭 및 모발의 길이가 감소하고 성장이 억제됨을 관찰하였다. 또한 모낭이 위축되었으며 모유두세포와 모방이 분리되기 시작한 것을 확인하였다 (도 9B, 9C).After 3 days of culture in the strip-shaped hair follicle organoids, we observed that the length of hair follicles and hair was reduced and growth was inhibited when treated with hair loss-inducing hormone (DHT). In addition, we confirmed that the hair follicles atrophied and the hair papilla cells and hair shafts began to separate (Fig. 9B, 9C).

이를 통해, 스트립 형태의 모낭 오가노이드 역시 발모 촉진제, 탈모 예방제 또는 탈모 치료제를 위한 유효 물질을 평가할 수 있음을 알 수 있었다. Through this, it was found that strip-shaped hair follicle organoids can also be evaluated as effective substances for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss treatment.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The above description of the present invention is for illustrative purposes only, and those skilled in the art will understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical idea or essential characteristics of the present invention. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the claims set forth below, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalent concepts should be interpreted as being included in the scope of the present invention.

Claims

A method for producing a hair follicle organoid comprising the following steps:

(1) a step of isolating hair follicles from skin organoids; and

(2) A step of culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface.

In the first paragraph,

The skin organoid of the above step (1) is characterized by a method for producing a hair follicle organoid, which comprises the following steps:

(a) a step of culturing pluripotent stem cell-derived organoids in the presence of a Wnt agonist;

(b) a step of culturing the culture of step (a) in a medium for maturing skin organoids for 40 days or more; and

(c) A step of cutting the culture of step (b) and culturing it at the air-liquid interface.

In the second paragraph,

A method for producing hair follicle organoids, characterized in that the Wnt agonist is added on the 5th to 7th day of culturing pluripotent stem cells.

In the first paragraph,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the skin organoid expresses at least one selected from the group consisting of KRT5 (Keratin 5), KRT10, KRT15, KRT17, Loricrin, Filaggrin, SOX2 (SRY-Box Transcription Factor 2), and Melan-A.

In the first paragraph,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the hair follicle of the step (1) above includes at least one selected from the group consisting of a dermal sheath, an outer hair root sheath, an inner hair root sheath, a hair papilla cell, a hair follicle cell, a bulge area, and a sebaceous gland.

In the first paragraph,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the hair follicle of the step (1) is separated at the hair germ or hair peg stage.

In Article 6,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the above hair follicle is formed within 60 to 80 days after the formation of a skin organoid.

In Article 6,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the above-mentioned parent organoid is formed within 80 to 100 days after the formation of a skin organoid.

In the first paragraph,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the separation in step (1) is performed using microdissection.

In the first paragraph,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the culture in step (2) above is performed on a culture insert.

In Article 10,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the culture insert is coated with collagen and matrigel; or collagen.

In Article 11,

A method for producing a hair follicle organoid, characterized in that the collagen and matrigel are in a ratio of 1:10 to 10:1.

A hair follicle organoid manufactured by the manufacturing method of claim 1.

A hair transplant material comprising a hair follicle organoid of claim 13.

A method for producing a hair follicle organoid in the form of a strip, comprising the following steps:

(1) a step of cutting the skin organoid flat and spreading it out, and then cutting it vertically; and

(2) A step of culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface.

In Article 15,

The skin organoid of the above step (1) is characterized by a method for producing a hair follicle organoid in a strip shape, which comprises the following steps:

In Article 15,

A method for producing a strip-shaped hair follicle organoid, characterized in that the cutting in step (1) is performed when the hair follicle in the skin organoid is in the hair germ or hair peg stage.

In Article 15,

A method for producing a hair follicle organoid in a strip shape, characterized in that the cutting in step (1) above cuts the spread skin organoid at intervals of 1 mm to 3 mm.

A strip-shaped hair follicle organoid manufactured by the manufacturing method of Article 15.

A hair transplant material comprising a strip-shaped hair follicle organoid of claim 19.

A method for producing a hair follicle organoid model mimicking alopecia comprising the following steps:

(1) A step of isolating hair follicles from skin organoids;

(2) a step of producing hair follicle organoids by culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface; and

(3) A step of treating the hair follicle organoid with a hair loss-inducing factor.

In Article 21,

A method for producing a hair follicle organoid model simulating hair loss, characterized in that the hair loss inducing factor of step (3) above is a male hormone, stress hormone or ultraviolet rays.

In Article 22,

A method for producing a hair follicle organoid model simulating hair loss, characterized in that the hormone is dihydrotestosterone, testosterone or thyroid hormone.

In Article 22,

A method for producing a hair follicle organoid model mimicking alopecia, characterized in that the stress hormone is cortisol.

A hair follicle organoid model mimicking alopecia produced by the manufacturing method of Article 21.

In Article 25,

The above hair follicle organoid model hair loss mimicry model is characterized by having at least one characteristic selected from the group consisting of the following characteristics:

1) reduction in hair follicle length; 2) damage to hair papilla cell aggregates; 3) decreased expression of WNT3A or β-catenin; or 4) increased expression of DKK-1 or TGF-β2.

A method for producing a hair follicle organoid in the form of a strip model simulating hair loss, comprising the following steps:

(1) A step of cutting the skin organoid flat and spreading it out, then cutting it vertically;

(2) a step of producing a strip-shaped hair follicle organoid by culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface; and

(3) A step of treating a hair loss-inducing factor to the above strip-shaped hair follicle organoid.

A hair follicle organoid in the form of a strip of a hair loss-simulating model manufactured by the manufacturing method of Article 27.

A method for screening for a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent or hair loss treatment agent comprising the following steps:

(1) A step of isolating hair follicles from skin organoids;

(2) A step of producing hair follicle organoids by culturing the separated hair follicles at an air-liquid interface;

(3) a step of producing a hair follicle organoid simulating alopecia model by treating the hair follicle organoid with a hair loss inducing factor; and

(4) A step of treating the hair follicle organoid of the above hair loss simulation model with a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent, or hair loss treatment candidate.

In Article 29,

A method for screening a hair growth promoter, hair loss preventer, hair loss alleviator or hair loss treatment agent, including a step of determining that the agent is a hair growth promoter, hair loss preventer, hair loss alleviator or hair loss treatment agent if the expression of WNT3A or β-catenin increases or the expression of DKK-1 or TGF-β2 decreases after treatment with the candidate substance of step (4) above.

(2) A step of producing a strip-shaped hair follicle organoid by culturing the cut skin organoid at an air-liquid interface;

(3) a step of producing a hair follicle organoid in the form of a strip by treating a hair loss-inducing factor to the strip-shaped hair follicle organoid; and

(4) A step of treating the hair follicle organoid in the form of a strip of the hair loss simulating model with a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent, or hair loss treatment candidate.

In Article 31,

(1) A step of isolating hair follicles from skin organoids;

(3) A step of treating the hair follicle organoid with a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent, or hair loss treatment candidate.

In Article 33,

A method for screening a hair growth promoter, hair loss preventer, hair loss alleviator or hair loss treatment agent, including a step of determining that the agent is a hair growth promoter, hair loss preventer, hair loss alleviator or hair loss treatment agent if the expression of WNT3A or β-catenin increases or the expression of DKK-1 or TGF-β2 decreases after treatment with the candidate substance of step (3) above.

(3) A step of treating the strip-shaped hair follicle organoid with a hair growth promoter, hair loss prevention agent, hair loss relief agent, or hair loss treatment candidate.

In Article 35,

A method for screening a cosmetic composition for promoting hair growth, preventing hair loss or alleviating hair loss, comprising the following steps:

(1) A step of isolating hair follicles from skin organoids;

(4) A step of treating the hair follicle organoid of the above hair loss simulating model with a cosmetic composition candidate for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss alleviation.

(4) A step of treating a candidate substance of a cosmetic composition for promoting hair growth, preventing hair loss, or alleviating hair loss to the hair follicle organoid in the form of a strip of the hair loss simulating model.

(1) A step of isolating hair follicles from skin organoids;

(3) A step of treating the hair follicle organoid with a candidate cosmetic composition for promoting hair growth, preventing hair loss, or alleviating hair loss.

(3) A step of treating the strip-shaped hair follicle organoid with a cosmetic composition candidate for hair growth promotion, hair loss prevention, or hair loss alleviation.