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WO2024190905A1 - Ｈｐｖ特異的細胞傷害性ｔ細胞のｔ細胞受容体又はその機能的断片 - Google Patents

Ｈｐｖ特異的細胞傷害性ｔ細胞のｔ細胞受容体又はその機能的断片 Download PDF

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WO2024190905A1
WO2024190905A1 PCT/JP2024/010248 JP2024010248W WO2024190905A1 WO 2024190905 A1 WO2024190905 A1 WO 2024190905A1 JP 2024010248 W JP2024010248 W JP 2024010248W WO 2024190905 A1 WO2024190905 A1 WO 2024190905A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
acid sequence
amino acid
seq
hpv16e6
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/010248
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
美樹 安藤
翠 石井
純 安藤
啓光 中内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo Medical and Dental University NUC
Juntendo Educational Foundation
Original Assignee
Tokyo Medical and Dental University NUC
Juntendo Educational Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Medical and Dental University NUC, Juntendo Educational Foundation filed Critical Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority to CN202480018336.2A priority Critical patent/CN120787234A/zh
Priority to KR1020257030311A priority patent/KR20250158024A/ko
Publication of WO2024190905A1 publication Critical patent/WO2024190905A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a T cell receptor for HPV-specific cytotoxic T cells, a functional fragment thereof, and uses thereof.
  • High-risk human papillomavirus is present in 99% of cases of cervical cancer, with HPV16 accounting for 50-60% and HPV18 accounting for approximately 20%.
  • prophylactic HPV vaccines can prevent early infection with high-risk HPV types, these vaccines are not effective against established cancer.
  • total hysterectomy is indicated, which leads to loss of fertility despite ovarian preservation and increases the long-term risk of cardiovascular disease.
  • Metastatic and recurrent cervical cancer is generally incurable. It is also highly resistant to chemotherapy, especially in young women (Non-Patent Document 1).
  • Cervical cancer cells constitutively express the E6 and E7 oncoproteins, contributors to tumorigenesis and cancer cell survival, making E6 and E7 attractive therapeutic targets.
  • the objective of the present invention is to clone the T cell receptor of HPV-specific cytotoxic T cells and provide a T cell receptor or a functional fragment thereof that has an excellent antitumor effect.
  • the present inventors induced peripheral blood HPV16E6-CTL targeting the HPV16 E6 antigen of cervical cancer from healthy donors at a cell processing center, performed single cell cloning, established T-iPS cells, edited the HLA genome using CRISPR/Cas9 technology, carefully excluded off-target effects, and created a master cell bank to serve as the raw material for clinical rejT cells. Then, induced differentiation of HPV16E6-rejT.
  • the present inventors have succeeded in inducing HPV16E6-rejT, which contains a very large amount of tissue resident memory T cells, and have demonstrated that the binding of the surface antigen CD103 of tissue resident memory T cells with E-cadherin expressed in cervical cancer cells increases the production of cytocidal proteins, and increases antigen binding, resulting in a strong antitumor effect.
  • HPV16E6-rejT which is abundant in tissue resident memory T cells
  • TCR T cell receptor
  • a T cell receptor for HPV16E6-specific cytotoxic T cells having an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence resulting from the substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence, and a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence resulting from the substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence.
  • T cell receptor or a functional fragment thereof according to any of [1] to [6], further comprising an ⁇ chain J region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence resulting from the substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence, and a ⁇ chain J region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 or an amino acid sequence resulting from the substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence.
  • the iPS cell according to [11] which is an HPV16E6-specific cytotoxic T-iPS cell.
  • a vector comprising DNA of the T cell receptor or a functional fragment thereof described in any one of [1] to [8].
  • a pharmaceutical composition comprising HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells having the T cell receptor or a functional fragment thereof according to any one of [1] to [8].
  • the pharmaceutical composition according to [14] which is a pharmaceutical composition for treating cervical cancer.
  • a cellular pharmaceutical comprising HPV16E6-specific cytotoxic T cells having the T cell receptor or a functional fragment thereof according to any one of [1] to [8].
  • the cellular pharmaceutical described in [16] which is a cellular pharmaceutical for treating cervical cancer.
  • HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells having the T cell receptor or a functional fragment thereof according to any one of [1] to [8] for the manufacture of a therapeutic agent for cervical cancer.
  • HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells characterized in that they contain tissue-resident memory T cells.
  • a pharmaceutical composition comprising HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells, characterized in that the composition comprises tissue-resident memory T cells.
  • a cellular pharmaceutical comprising HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells, characterized in that the cellular pharmaceutical comprises tissue-resident memory T cells.
  • HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells characterized in that they comprise T cells whose surface antigen is CD3+, CD8+, CD62L-, CCR7-, CD103+ or CD69+.
  • a pharmaceutical composition comprising HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells, characterized in that the composition comprises T cells whose surface antigen is CD3+, CD8+, CD62L-, CCR7-, CD103+ or CD69+.
  • a cellular medicine comprising HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells, characterized in that the medicine comprises T cells whose surface antigen is CD3+, CD8+, CD62L-, CCR7-, CD103+ or CD69+.
  • HPV-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells having the T cell receptor of the HPV16E6 antigen-specific cytotoxic T cells of the present invention or a functional fragment thereof are useful as therapeutic agents for cervical cancer.
  • HPV16E6 tetramer staining after PBMC peptide stimulation are shown.
  • the results of HPV16E6 tetramer staining after single cell cloning are shown.
  • the results of HPV16E6 tetramer staining of HPV16E6-rejT are shown.
  • the results show that HPV16E6-rejT exhibits strong antigen recognition and cell-killing effect against cervical cancer cell lines (SiHa, SKGIIIa).
  • HPV16E6-rejT shows high expression of Granzyme B and Perforin compared with HPV16E6-CTL clones.
  • HLA-edited HPV16E6-rejT shows an overwhelmingly higher proportion of tissue-resident memory T cells compared to HPV16E6-CTL clones. It has been shown that cervical cancer cells highly express the epithelial marker E-cadherin. 1 shows the amino acid sequences of the ⁇ -chain and ⁇ -chain of the T cell receptor of HPV16E6-specific cytotoxic T cells. 1 shows the nucleotide sequence encoding the amino acid sequences of the ⁇ and ⁇ chains of the T cell receptor of HPV16E6-specific cytotoxic T cells.
  • One aspect of the present invention is a T cell receptor for HPV16E6-specific cytotoxic T cells, or a functional fragment thereof, characterized in having an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 or an amino acid sequence resulting from the amino acid sequence by substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids, and a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8 or an amino acid sequence resulting from the amino acid sequence by substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids.
  • Another aspect of the present invention is a T cell receptor of HPV16E6-specific cytotoxic T cells or a functional fragment thereof, characterized in having an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; an ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; and a ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence.
  • Another aspect of the present invention is a T cell receptor of HPV16E6-specific cytotoxic T cells or a functional fragment thereof, characterized in that it has an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; an ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; an ⁇ chain V region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; a ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 or an amino acid sequence
  • T cell receptor of HPV16E6-specific cytotoxic T cells or a functional fragment thereof comprising an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; an ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; an ⁇ chain J region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence; and an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence.
  • a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence
  • a ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence
  • a ⁇ chain V region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:7 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence
  • a ⁇ chain J region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence.
  • HPV is a type of virus that belongs to the papillomavirus family and is deeply involved in the development of cervical cancer.
  • HPV16 is detected in 50-60% of cervical cancer cases.
  • E6 and E7 are said to be deeply involved in the development of cervical cancer.
  • TCRs T cell receptors
  • TCRs are responsible for the antigen recognition function of T cells and are composed of proteins such as ⁇ chains, ⁇ chains, ⁇ chains, and ⁇ chains.
  • a heterodimer of TCR ⁇ chain protein (TCR ⁇ ) and TCR ⁇ chain protein (TCR ⁇ ), or a heterodimer of ⁇ and ⁇ chains forms TCR together with the CD3 complex (including ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ ), CD4, or CD8 as an auxiliary molecule.
  • TCR ⁇ and TCR ⁇ have a variable region (V region + J region) and a constant region (C region).
  • the V region in the variable region contains a complementarity determining region (CDR).
  • TCR can be characterized by the amino acid sequence of the V region (including the CDR region) or the V region and J region in TCR ⁇ and TCR ⁇ .
  • the TCR of the present invention is characterized by having an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 or an amino acid sequence resulting from the amino acid sequence by substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids, and a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8 or an amino acid sequence resulting from the amino acid sequence by substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids.
  • the amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to the amino acid sequence may be an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence, more preferably an amino acid sequence having 97% or more identity with the amino acid sequence, and even more preferably an amino acid sequence having 99% or more identity with the amino acid sequence.
  • the TCR of the present invention preferably has an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3, and a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8.
  • the TCR of the present invention preferably further comprises an ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 or an amino acid sequence resulting from the amino acid sequence by substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids, and a ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 or an amino acid sequence resulting from the amino acid sequence by substitution, deletion or addition of 1 to 3 amino acids.
  • the amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to the amino acid sequence may be an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence, more preferably an amino acid sequence having 97% or more identity with the amino acid sequence, and even more preferably an amino acid sequence having 99% or more identity with the amino acid sequence.
  • the TCR of the present invention has an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, an ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and a ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the TCR of the present invention has, in addition to the ⁇ chain CDR3 region, the ⁇ chain L region, the ⁇ chain CDR3 region, and the ⁇ chain L region, an ⁇ chain V region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence, and a ⁇ chain V region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence.
  • amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to the amino acid sequence may be an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence, more preferably an amino acid sequence having 97% or more identity with the amino acid sequence, and even more preferably an amino acid sequence having 99% or more identity with the amino acid sequence.
  • the TCR of the present invention has an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, an ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, an ⁇ chain V region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, a ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a ⁇ chain V region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the TCR of the present invention has, in addition to the ⁇ chain CDR3 region, the ⁇ chain L region, the ⁇ chain CDR3 region, the ⁇ chain V region, the ⁇ chain L region, and the ⁇ chain V region, an ⁇ chain J region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence, and a ⁇ chain J region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to said amino acid sequence.
  • amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 3 amino acids to the amino acid sequence may be an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence, more preferably an amino acid sequence having 97% or more identity with the amino acid sequence, and even more preferably an amino acid sequence having 99% or more identity with the amino acid sequence.
  • the TCR of the present invention has an ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, an ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, an ⁇ chain V region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, an ⁇ chain J region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a ⁇ chain CDR3 region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, a ⁇ chain L region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, a ⁇ chain V region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a ⁇ chain J region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • Functional fragments of the TCR of the present invention include polypeptides having the ⁇ chain CDR3 region and the ⁇ chain CDR3 region, polypeptides having the ⁇ chain CDR3 region, the ⁇ chain L region, the ⁇ chain CDR3 region, and the ⁇ chain L region, polypeptides having the ⁇ chain CDR3 region, the ⁇ chain L region, the ⁇ chain V region, the ⁇ chain CDR3 region, the ⁇ chain L region, and the ⁇ chain V region, polypeptides having the ⁇ chain CDR3 region, the ⁇ chain L region, the ⁇ chain V region, the ⁇ chain J region, the ⁇ chain CDR3 region, the ⁇ chain L region, the ⁇ chain V region, and the ⁇ chain J region, and combinations of these polypeptides.
  • the TCR of the present invention can be obtained, for example, by inducing HPV16E6-specific cytotoxic T cells from peripheral blood of a patient or a healthy individual, and then performing single cell cloning to establish an HPV16E6-specific cytotoxic T cell clone.
  • the subjects may be either healthy individuals or cervical cancer patients.
  • the T cells induced to T-iPS cells are preferably T cells having HPV16E6 specificity.
  • T cells expressing CD3 and CD8, specifically CTLs which are CD8 positive cells can be mentioned.
  • T cells expressing CD3 and CD4, specifically T cells which are CD4 positive cells can be mentioned.
  • the antigen specificity in T cells is brought about by antigen-specific rearranged TCR genes. From the viewpoint of production efficiency, it is preferable to use antigen-specific CD8 positive T cells as human T cells induced to T-iPS cells in order to obtain antigen-specific CD8 positive cells, although this is not particularly limited. In addition, when performing immunotherapy, it is preferable that human T cells differentiated from iPS cells have the same or substantially the same antigen specificity as human T cells induced to iPS cells. In addition, T cells that induce T-iPS cells also include T cells without antigen specificity. Specific examples include genetically modified T cells such as CAR T cells or TCR-T cells.
  • T cells can be isolated, for example, from human tissues by known methods.
  • human tissues include tissues containing the T cells, such as peripheral blood, lymph nodes, bone marrow, thymus, spleen, umbilical cord blood, and diseased tissue.
  • peripheral blood is preferred from the viewpoints of low invasiveness to humans and ease of preparation.
  • Tumor-infiltrating lymphocytes TILs
  • Known methods for isolating human T cells include, for example, magnetic selection using magnetic beads for cell separation, flow cytometry using antibodies against cell surface markers such as CD4 or CD8 and a cell sorter, and activated T cell induction methods using anti-CD3 antibodies and anti-CD28 antibodies.
  • the desired T cells can be isolated using the secretion of cytokines, the expression of functional molecules, or signal molecules such as PD-1 as indicators.
  • cytotoxic T cells CTLs
  • TTLs can be isolated using the secretion or production of granzymes and perforins as indicators.
  • T cells with the desired antigen specificity can be purified from human tissues using a polymerized MHC (major histocompatibility complex) bound to the desired antigen (e.g., "MHC tetramer” or "Pro5 (registered trademark) MHC class I pentamer”).
  • the genes introduced to convert T cells into iPS cells are preferably a combination of at least four types of genes from among (a) the Oct3/4 gene, (b) the c-Myc gene, (c) the Sox2 gene, (d) the Klf4 gene, (e) the NANOG gene, and (f) the LIN28 gene.
  • the method for introducing the gene group into T cells is not particularly limited, and any known method can be appropriately selected and used.
  • the nucleic acid e.g., cDNA, RNA
  • the expression vector can be introduced into cells by infection, lipofection, liposome, electroporation, calcium phosphate coprecipitation, DEAE-dextran, microinjection, or electroporation.
  • Stealth RNA expression vectors are vectors designed to avoid vector entry into chromosomes and to continuously and stably express genes in the cytoplasm, not in the nucleus. They can be used to introduce large genes of 13,000 base pairs or more, or to simultaneously introduce 10 genes, without damaging cells, and can be removed when the introduced gene is not needed. They have stealth properties that prevent cells from recognizing the vector as a foreign body.
  • RNA expression vectors include complexes that do not activate innate immune structures and that consist of a minus single-stranded RNA (A) containing any of the RNA sequences (1) to (8) below, a single-stranded RNA-binding protein (B), and an RNA-dependent RNA polymerase.
  • A minus single-stranded RNA
  • B single-stranded RNA-binding protein
  • RNA sequence for the group of genes (2) a human mRNA-derived RNA sequence constituting a non-coding region; (3) a transcription initiation signal sequence recognized by the RNA-dependent RNA synthetase; (4) a transcription termination signal sequence recognized by the RNA-dependent RNA synthetase; (5) an RNA sequence including a replication origin recognized by the RNA-dependent RNA synthetase; (6) an RNA sequence encoding the RNA-dependent RNA synthetase; (7) An RNA sequence encoding a protein that regulates the activity of the RNA-dependent RNA synthetase. (8) An RNA sequence encoding the single-stranded RNA-binding protein.
  • the T cells are preferably stimulated and activated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody in the presence of interleukin-2 (IL-2) or interleukin-7 (IL-7) and interleukin-15 (IL-15) before the introduction of the group of genes, and may be stimulated and activated with at least one substance selected from the group consisting of phytohemagglutinin (PHA), interleukin-2 (IL-2), alloantigen-expressing cells, anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, CD3 and CD28 agonists.
  • PHA phytohemagglutinin
  • IL-2 interleukin-2
  • alloantigen-expressing cells anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, CD3 and CD28 agonists.
  • Such stimulation can be performed, for example, by adding PHA, IL-2, anti-CD3 antibody and/or anti-CD28 antibody, etc.
  • the anti-CD3 and anti-CD28 antibodies may be bound to magnetic beads, and instead of adding these antibodies to the medium, the T cells may be stimulated by culturing them for a certain period of time on a culture dish with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies bound to the surface.
  • the T cells e.g., human T cells
  • the T cells may be stimulated by adding an antigen peptide recognized by the T cells (e.g., human T cells) to the medium together with feeder cells.
  • the concentration of PHA added to the culture medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 100 ⁇ g/mL.
  • concentration of IL-2 added to the culture medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 200 ng/mL.
  • the concentrations of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody added to the culture medium are not particularly limited, but are preferably 1 to 10 times the culture volume of the T cells.
  • the concentrations of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody bound to the surface of the culture dish are not particularly limited, but the concentration at the time of coating is preferably 0.1 to 100 ⁇ g/mL, preferably 1 to 100 ⁇ g/mL, for anti-CD3 antibody and 0.1 to 10 ⁇ g/mL for anti-CD28 antibody.
  • the culture period for such stimulation is not particularly limited as long as it is a period sufficient to provide such stimulation to the T cells and to proliferate the T cells to the number of cells required for the introduction of the four genes. It is usually 2 to 7 days, but from the viewpoint of gene introduction efficiency, it is preferably 3 to 5 days. It is preferable to infect the T cells by mixing them with the vector in a 15 mL tube, or to culture them on a culture dish coated with Retronectin from the viewpoint of increasing gene introduction efficiency.
  • a medium for culturing the T cells and adding PHA, IL-2, anti-CD3 antibody, and/or anti-CD28 antibody, etc. a known medium suitable for culturing the T cells, more specifically, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, AIM V TM medium, and NS-A2 containing other cytokines and human serum, can be used.
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute
  • amino acids necessary for culturing e.g., L-glutamine
  • antibiotics e.g., streptomycin, penicillin
  • IL-7 and IL-15 may be added to the medium instead of IL-2.
  • concentration of IL-7 and IL-15 added is 1 to 100 ng/mL.
  • the conditions when or after introducing the four genes into the T cells there are no particular limitations on the conditions when or after introducing the four genes into the T cells, but it is preferable to culture the T cells into which the four genes have been introduced under feeder-free conditions.
  • Examples include a solution of iMatrix-511, which is a laminin 511E8 fragment, or wells coated with vitronectin. They can also be established by culturing under feeder cell conditions.
  • feeder cells include mouse embryonic fibroblasts (MEF), STO cells, and SNL cells whose cell division has been stopped by irradiation or antibiotic treatment.
  • iPS cell medium from the next day. After that, it is preferable to replace the medium by half every other day, gradually replacing the T cell medium with iPS medium.
  • a known medium suitable for culturing T cells with a medium suitable for culturing iPS cells as the T cells transition to iPS cells.
  • a known medium can be appropriately selected and used as a medium suitable for culturing such iPS cells.
  • feeder cells such as MEF cells, Dulbecco's modified Eagle medium/F12 medium (human iPS cell medium) containing knockout serum substitute, L-glutamine, non-essential amino acids, 2-mercaptoethanol, b-FGF, etc. is preferable.
  • the T-iPS cells thus obtained can be selected by appropriately selecting a known method.
  • One such known method is, for example, a method of selecting by observing the morphology of ES cell/iPS cell-like colonies under a microscope.
  • the properties are often similar, so a method can be used in which all established colonies are passaged as is without selecting each colony of T-iPS cells.
  • the cells selected in this manner are T-iPS cells by, for example, detecting the expression of undifferentiated cell-specific markers (ALP, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, etc.) in the selected cells by immunostaining, RT-PCR, etc., or by transplanting the selected cells into mice and observing the formation of teratomas. It can also be confirmed that the cells selected in this manner are derived from the T cells by detecting the state of TCR gene rearrangement by RT-PCR.
  • the time to select and recover these cells is preferably 10 to 40 days, preferably 14 to 28 days, after the gene group including the four genes is introduced into the T cells.
  • the culture environment is preferably 5% CO2 , 35 to 38°C, more preferably 37°C, unless otherwise specified above.
  • HPV16E6-specific CTL cells are induced to differentiate from the established T-iPS cells.
  • a method for inducing redifferentiation a method in which T-iPS cells are differentiated into CD8+ single positive T cells is preferable, and a method in which T-iPS cells are differentiated into CD4/CD8 double negative T cells and then the CD4/CD8 double negative T cells are differentiated into CD8+ single positive T cells is more preferable.
  • the cells by differentiating T-iPS cells into CD4/CD8 double negative cells, stimulating the CD4/CD8 double negative cells by adding a substance that stimulates the T cell receptor, and then differentiating the CD4/CD8 double negative cells whose T cell receptors have been stimulated into CD8 single positive T cells in the presence of cytokines IL-7 and IL-15.
  • T-iPS cells To differentiate T-iPS cells into CD4/CD8 double negative cells, it is preferable to culture T-iPS cells on feeder cells (preferably mouse stromal cells) in a medium containing cytokines, serum (e.g., fetal bovine serum (FBS)), insulin, transferrin, sodium selenite, L-glutamine, ⁇ -monothioglycerol, ascorbic acid, and the like.
  • the stromal cells used are preferably OP9 cells or 10T1/2 cells (C3H10T1/2 cells) that have been treated with radiation, etc.
  • the cytokine added to the medium is preferably at least one cytokine selected from the group consisting of VEGF, SCF, TPO, and FLT3L, and more preferably VEGF, SCF and TPO, or VEGF, SCF and FLT3L.
  • the medium include X-VIVO medium, Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM medium), ⁇ -MEM, and DMEM, with IMDM medium being preferred in terms of facilitating the formation of T-iPS sacs (sac-shaped structures containing hematopoietic progenitor cells).
  • the culture period of the T-iPS cells is preferably 8 to 14 days, more preferably 10 to 14 days, from the start of the culture of the T-iPS cells.
  • the culture environment is not particularly limited, but is preferably 5% CO 2 , 35 to 38° C., more preferably 37° C. In addition, it is more preferred to culture the cells for about one week under low oxygen concentration conditions (oxygen concentration: for example, 5 to 20%).
  • T-iPS cells In order to differentiate T-iPS cells into CD4/CD8 double negative cells, it is preferable to further culture the cells contained in the T-iPS sac on feeder cells (preferably stromal cells, more preferably human stromal cells) in a medium containing cytokines and serum (e.g., FBS), etc., using a cytokine-coated well under feeder-free conditions.
  • feeder cells preferably stromal cells, more preferably human stromal cells
  • a medium containing cytokines and serum e.g., FBS
  • the cells present inside the T-iPS sac can be separated, for example, by passing them through a sterilized sieve-like device (e.g., a cell strainer, etc.).
  • the stromal cells used in this culture are preferably OP9-DL1 cells, OP9-DL4 cells, 10T1/2/DL4 cells, or 10T1/2/DL1 cells that have been treated with radiation or the like.
  • cytokines added to the medium include IL-7, FLT3L, VEGF, SCF, TPO, IL-2, and IL-15.
  • media include ⁇ -MEM medium, DMEM medium, and IMDM medium, with ⁇ -MEM medium being preferred.
  • the medium may also contain amino acids (e.g., L-glutamine) and antibiotics (e.g., streptomycin and penicillin) necessary for culture.
  • the culture period of the cells contained in the T-iPS sac is preferably the period until the T cell receptor (TCR) is expressed on the cell surface of the CD4/CD8 double negative cells obtained by differentiation in this manner, and is preferably 14 to 28 days from the start of culture of the cells contained in the T-iPS sac.
  • TCR T cell receptor
  • T cell receptors TCR
  • CD4/CD8 double negative cells T cell receptors
  • further rearrangement of the TCRA gene can be suppressed by stimulating CD4/CD8 double negative cells derived from T-iPS cells via the TCR expressed on the cell surface, and as a result, the frequency of T cells with the same TCR gene rearrangement pattern as the original human T cell can be extremely increased in the CD8 single positive cells obtained by redifferentiation.
  • a preferred method for stimulating the T cell receptor of CD4/CD8 double negative cells derived from T-iPS cells is to contact the T-iPS cell-derived CD4/CD8 double negative cells with at least one substance selected from the group consisting of anti-CD3 antibodies, anti-CD28 antibodies, antigen peptides that specifically bind to the human T cells from which the T-iPS cells were derived, cells expressing a complex with HLA that exhibits restriction to the T cell receptor, and MHC multimers to which the antigen peptide is bound.
  • a more preferred method is to contact the cells expressing a specific peptide/HLA complex.
  • a more preferred method is to contact the cells with an antibody or reagent.
  • the contact can be achieved, for example, by adding PHA or the like to the medium and culturing the T cells for a certain period of time.
  • the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody may be bound to magnetic beads or the like, and instead of adding these antibodies to the medium, the T cells may be stimulated by culturing them for a certain period of time on a culture dish with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody bound to the surface.
  • the antigen peptide may be added to the medium together with the feeder cells to stimulate the T cells.
  • the concentration of PHA added to the culture medium to stimulate the TCR of CD4/CD8 double negative cells is preferably 1 to 100 ⁇ g/ml.
  • the concentrations of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies added to the culture medium are preferably 1 to 10 times the culture volume of the T cells.
  • the concentrations of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies bound to the surface of the culture dish to stimulate the TCR of CD4/CD8 double negative cells are preferably 0.1 to 100 ⁇ g/ml for anti-CD3 antibodies and 0.1 to 10 ⁇ g/ml for anti-CD28 antibodies at the time of coating.
  • the culture period of the cells contained in the T-iPS sac preferably includes the period required for the expression of T cell receptors (TCR) on the cell surface of the CD4/CD8 double negative cells thus differentiated, and is preferably 7 to 29 days from the start of culture of the cells contained in the T-iPS sac.
  • the culture environment is preferably 5% CO2 , 35 to 38°C, more preferably 37°C.
  • the CD4/CD8 double negative cells in order to differentiate CD4/CD8 double negative cells whose T cell receptors have been stimulated into CD8 single positive cells, it is preferable to culture the CD4/CD8 double negative cells in a medium containing cytokines, serum (e.g., human serum), and the like.
  • the cytokines added to the medium may be any cytokine capable of differentiating CD4/CD8 double negative cells into CD8 single positive cells, and examples of such cytokines include IL-7 and IL-15. Of these, it is preferable to add IL-7 and IL-15 in combination, from the viewpoint of selecting the CD8 lineage and facilitating the generation of memory CD8+ T cells in the differentiation into CD8 single positive cells.
  • the concentrations of IL-7 and IL-15 added are preferably 1 to 20 ng/ml.
  • the medium include RPMI-1640 medium, X-VIVO medium, DMEM medium, and ⁇ -MEM medium, with RPMI-1640 medium or X-VIVO medium being preferred.
  • the medium may also contain amino acids necessary for culture (e.g., L-glutamine), antibiotics (e.g., streptomycin, penicillin), and cytokines other than IL-7, IL-15, etc.
  • the CD4/CD8 double negative cells may be co-cultured with feeder cells.
  • the feeder cells are preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Such PBMCs are preferably in an allogeneic (allogeneic) relationship with the CD4/CD8 double negative cells. From the viewpoint of continuously stimulating the TCR and continuously suppressing further rearrangement of the TCR, it is more preferable to use peripheral blood mononuclear cells that present an antigen peptide that specifically binds to the human T cells that are the source of the CD4/CD8 double negative cells.
  • the culture period for differentiating the CD4/CD8 double negative cells into CD8 single positive cells is preferably 2 to 4 weeks, and the culture environment is preferably 5% CO 2 , 35 to 38°C, more preferably 37°C.
  • the CD8 single positive cells induced to differentiate in this way are derived from T-iPS cells and from the T cells that gave rise to the T-iPS cells, for example, by detecting the state of TCR gene rearrangement using genomic PCR.
  • the CD8 single positive cells thus obtained can be isolated by appropriately selecting a known method.
  • One such known method is flow cytometry using an antibody against the CD8 cell surface marker and a cell sorter.
  • the CD8 single positive cells obtained by the present invention do not express PD-1, but express CCR7 along with CD27 and CD28, which are representative of the phenotype of central memory T cells, and also have longer telomeres compared to the original T cells, giving them a high self-renewal ability. Therefore, according to the present invention, it is possible to produce CD8 single positive T cells that have the same TCR gene rearrangement pattern as the original T cells, do not express PD-1, and express CD27, CD28, and CCR7. Furthermore, T cells collected from humans differ from the obtained T cells in that they express PD-1 and have a low proportion of juvenile memory phenotypes.
  • the cells may be stimulated every 1 to 2 weeks.
  • Such stimulation may include contact with at least one substance selected from the group consisting of anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, IL-2, IL-7, IL-15, an antigen recognized by the CD8 single positive cells, an MHC multimer to which the antigen is bound, a feeder cell in an allo-relationship with the CD8 single positive cells, and a feeder cell in an auto-relationship with the CD8 single positive cells.
  • MHC pentamers MHC tetramers, etc. are used to confirm that they retain the same antigen specificity as the original peripheral blood-derived CTLs. Furthermore, TCR sequence analysis was performed to identify TCR ⁇ .
  • HPV16E6-specific cytotoxic T cells can also be produced by genetic recombination using a gene encoding the TCR of the present invention. That is, for example, the gene encoding the TCR of the present invention may be introduced into host T cells, and cells having HPV16E6-specific cytotoxicity may be selected. To introduce the gene encoding the TCR into host T cells, it is preferable to incorporate the gene into various viral vectors. The selection of cells having HPV16E6-specific cytotoxicity may be performed by confirming the above-mentioned HPV16E6-specific cytotoxic activity, or by detecting the ability to produce cytokines such as IFN- ⁇ .
  • the obtained HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells are useful as a pharmaceutical composition or a cellular medicine.
  • the obtained HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells have excellent HPV-specific cytotoxic activity and are therefore useful as therapeutic agents, particularly for cervical cancer.
  • the HPV16E6-specific cytotoxic T cells of the present invention the HPV16E6-specific cytotoxic T cells rich in tissue-resident memory T cells have particularly excellent HPV-specific cytotoxic activity, and are therefore useful as a therapeutic agent for cervical cancer.
  • HPV16E6-specific cytotoxic T cells rich in tissue-resident memory T cells increase the production of cytocidal proteins by binding to the surface antigen CD103 of tissue-resident memory T cells and E-cadherin expressed in cervical cancer cells, and thus increase antigen binding, thereby exerting a strong antitumor effect.
  • the presence of abundant tissue-resident memory T cells can be confirmed by multiple staining with dye-tagged antibodies that recognize CD3, CD8, CD62L, CCR7, CD103, and CD69, followed by flow cytometry.
  • tissue-resident memory T cells being CD62L-, CCR7-, CD103+, or CD69+, and more preferably CD3+, CD8+ T cells being CD62L-, CCR7-, CD103+, and CD69+.
  • the proportion of tissue-resident memory T cells is preferably at least 30%, more preferably 50% or more, even more preferably 60% or more, and even more preferably 70% or more.
  • Another aspect of the present invention is a composition for treating cervical cancer, comprising HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells having the above-mentioned T cell receptor or a functional fragment thereof.
  • Another aspect of the present invention is use of HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells having the T cell receptor or a functional fragment thereof for the production of a therapeutic agent for cervical cancer.
  • Another aspect of the present invention is an HPV16E6-specific cytotoxic T cell or T-iPS cell having the T cell receptor or a functional fragment thereof for treating cervical cancer.
  • a further aspect of the present invention is a method for treating cervical cancer, comprising administering HPV16E6-specific cytotoxic T cells or T-iPS cells having the above-mentioned T cell receptor or a functional fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharma- ceutical acceptable carrier in addition to the T cells of the present invention.
  • a pharma- ceutical acceptable carrier examples include physiological saline and Ringer's solution.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain known pharma- ceutical acceptable additives such as preservatives and colorants, if necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably in the form of an injection, and more preferably an injection for T cell infusion therapy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably used for infusion of T cells to a cervical cancer patient at intervals of several weeks.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is also useful for treating HPV 16-infected cells and HPV 16-positive cells, and is particularly useful for treating cancers caused by HPV 16 infection, such as anal cancer, pharynx cancer, vulva cancer, and penis cancer, in addition to cervical cancer.
  • Example 1 Establishment of T-iPS cells from HPV16E6-specific CTL clones using Sendai virus vectors.
  • A) SeV6 factor vector ((a) Oct3/4 gene, (b) c-Myc gene, (c) Sox2 gene, (d) Klf4 gene, (e) NANOG gene, and (f) LIN28 gene).
  • Figures 1 to 3 show the results of tetramer staining of HPV16E6-CTL induced from peripheral blood, the established HPV16E6-specific CTL clone, and HPV16E6-CTL derived from iPS cells (HPV16E6-rejT).
  • Example 2 Cytotoxicity Test The cytotoxic activity of HLA-edited HPV16 E6-rejT and HPV16E6-specific CTL clones against cervical cancer cell lines (SiHa, SKGIIIa) was compared by chromium release assay. As shown in Figure 4, when HPV16 E6 antigen peptide was added to the target cervical cancer cell lines (SiHa, SKGIIIa), cytotoxic activity was observed not only in HLA-edited HPV16 E6-rejT but also in the original peripheral blood-derived CTL. However, when HPV16 E6 antigen peptide was not added, cytotoxic activity was observed only in HLA-edited HPV16 E6-rejT. This confirmed the strong antigen recognition and cytocidal effect of HLA-edited HPV16 E6-rejT against cervical cancer cell lines (SiHa, SKGIIIa).
  • HLA-edited HPV16E6-rejT Characteristics of HLA-edited HPV16E6-rejT To confirm the proportion of tissue-resident memory T cells of HLA-edited HPV16E6-rejT, they were multiplex stained with CD3, CD8, CD62L, CCR7, CD27, CD103, and CD69 and measured by flow cytometry. As shown in FIG. 6, it was revealed that the HLA-edited HPV16E6-rejT had an overwhelmingly higher proportion of tissue-resident memory T cells than the HPV16E6-specific CTL clone.
  • cervical cancer cells (SiHa, SKGIIIa, C aski) highly express E-cadherin, which is an epithelial marker, and that the HLA-edited HPV16E6-rejT of the present invention, which is rich in tissue-resident memory T cells, increases the production of cytocidal proteins by binding the surface antigen CD103 of tissue-resident memory T cells to E-cadherin expressed in cervical cancer cells, thereby increasing antigen binding and exerting a strong antitumor effect.
  • Example 3 The results of the analysis of the TCR sequence are shown in FIG. 8 (amino acid sequence) and FIG. 9 (base sequence).

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Abstract

ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体をクローニングし、優れた抗腫瘍効果を有するＴ細胞受容体又はその機能的断片を提供する。　配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域を有する、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片。

Description

ＨＰＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片
　本発明は、ＨＰＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体、その機能的断片、及びその利用に関する。
　子宮頸癌は９９％の症例に高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を保有しており、ＨＰＶ１６が５０～６０％を占め、ＨＰＶ１８が約２０％を占めている。
　予防的ＨＰＶワクチンは高リスク型ＨＰＶによる初期感染を予防できるが、これらのワクチンは確立された癌に対しては有効ではない。早期では子宮全摘出術が適応となり、卵巣保存を行っても妊孕性を喪失させ、心血管疾患の長期リスクを増大させる。転移性及び再発した子宮頸癌は一般に治癒不能である。また、特に若年女性では、化学療法にきわめて抵抗性である（非特許文献１）。
　このように、子宮頸がんの多くはＨＰＶ感染が原因で発症する難治性のがんで進行期には有効な治療法がなく、新規治療開発が必須である。
　子宮頸癌細胞はＥ６及びＥ７腫瘍タンパク質（腫瘍形成および癌細胞生存への寄与因子）を構成的に発現するため、Ｅ６及びＥ７は魅力的な治療標的である。
公益社団法人日本産科婦人科学会ホームページ
　本発明の課題は、ＨＰＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体をクローニングし、優れた抗腫瘍効果を有するＴ細胞受容体又はその機能的断片を提供することにある。
　そこで本発明者は、子宮頸がんのＨＰＶ１６　Ｅ６抗原をターゲットにした末梢血ＨＰＶ１６Ｅ６－ＣＴＬを健常人ドナーよりセルプロセッシングセンターで誘導後、シングルセルクローニングを行い、その後Ｔ－ｉＰＳ細胞を樹立してＨＬＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術でゲノム編集後、オフターゲット効果を慎重に除外した後にマスターセルバンクを作製し、臨床用ｒｅｊＴ細胞の原材料とした。その後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴを分化誘導した。
　さらに本発明者は、組織常在性メモリーＴ細胞（Ｔｉｓｓｕｅ　ｒｅｓｉｄｅｎｔ　ｍｅｍｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ）を非常に多く含むＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴの誘導に成功し、組織常在性メモリーＴ細胞の表面抗原ＣＤ１０３と子宮頸がん細胞に発現するＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎとの結合により殺細胞蛋白の産生が増加し、抗原結合が増加して強力な抗腫瘍効果を発揮することを証明した。この組織常在性メモリーＴ細胞の豊富なＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴをレパトア解析することにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の全配列を確認し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の発明［１］～［２６］を提供するものである。
［１］配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域を有する、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［２］配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域を有する、［１］記載のＴ細胞受容体又はその機能性断片。
［３］さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域を有する、［１］又は［２］記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［４］さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域を有する、［１］又は［２］記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［５］さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［６］さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［７］さらに配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有する、［１］～［６］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［８］さらに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有する、［１］～［６］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有する細胞。
［１０］ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞である［９］記載の細胞。
［１１］［１］～［８］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するｉＰＳ細胞。
［１２］ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ－ｉＰＳ細胞である［１１］記載のｉＰＳ細胞。
［１３］［１］～［８］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片のＤＮＡを含むベクター。
［１４］［１］～［８］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含有する、医薬組成物。
［１５］子宮頸がん治療用医薬組成物である［１４］記載の医薬組成物。
［１６］［１］～［８］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞を含有する、細胞性医薬品。
［１７］子宮頸がん治療用細胞性医薬品である［１６］記載の細胞性医薬品。
［１８］［１］～［８］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞の、子宮頸がん治療薬製造のための使用。
［１９］子宮頸がんを治療するための、［１］～［８］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞。
［２０］［１］～［８］のいずれかに記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を投与することを特徴とする、子宮頸がんの治療方法。
［２１］組織常在性メモリーＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞。
［２２］組織常在性メモリーＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含む医薬組成物。
［２３］組織常在性メモリーＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含む細胞性医薬品。
［２４］表面抗原がＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ１０３＋又はＣＤ６９＋であるＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞。
［２５］表面抗原がＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ１０３＋又はＣＤ６９＋であるＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含む医薬組成物。
［２６］表面抗原がＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ１０３＋又はＣＤ６９＋であるＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含む細胞性医薬品。
　本発明のＨＰＶ１６Ｅ６抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞は、子宮頸がん治療薬として有用である。
ＰＢＭＣペプチド刺激後のＨＰＶ１６Ｅ６テトラマー染色結果を示す。 シングルセルクローニング後のＨＰＶ１６Ｅ６テトラマー染色結果を示す。 ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴのＨＰＶ１６Ｅ６テトラマー染色結果を示す。 ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴの子宮頸がん細胞株（ＳｉＨａ、ＳＫＧＩＩＩａ）に対する強力な抗原認識と殺細胞効果を示す。 ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴは、ＨＰＶ１６Ｅ６－ＣＴＬ　ｃｌｏｎｅと比較し、Ｇｒａｎｚｙｍｅ　Ｂ，Ｐｅｒｆｏｒｉｎを高発現することを示す。 ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴは、ＨＰＶ１６Ｅ６－ＣＴＬ　ｃｌｏｎｅと比較し組織常在性メモリーＴ細胞の割合が圧倒的に多いことを示す。 子宮頸がん細胞は上皮性マーカーであるＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎを高発現することを示す。 ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体のα鎖及びβ鎖のアミノ酸配列を示す。 ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体のα鎖及びβ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
　本発明の一態様は、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域とを有することを特徴とする。
　また、本発明の他の一態様は、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域とを有することを特徴とする。
　また、本発明の他の一態様は、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域と、配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域とを有することを特徴とする。
　また、本発明の他の一態様は、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片であって、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域と、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域と、配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域と、配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域とを有することを特徴とする。
　ＨＰＶは、パピローマウイルス科に属するウイルスの一種であり、子宮頸がんの発症に深く関与している。ＨＰＶには、多くの種類があるが、子宮頸がんの発症に関わる高リスク型ＨＰＶのうち、ＨＰＶ１６は子宮頸がんの５０～６０％から検出されている。ＨＰＶ遺伝子のうちＥ６とＥ７が子宮頸がんの発症に深く関与しているといわれている。
　Ｔ細胞受容体（以下、ＴＣＲという）は、Ｔ細胞の抗原認識機能を担うものであり、α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖などのタンパク質から構成される。このうち、ＴＣＲα鎖タンパク質（ＴＣＲα）とＴＣＲβ鎖タンパク質（ＴＣＲβ）とのヘテロ二量体、又はγとδ鎖とのヘテロ二量体が、補助分子としてのＣＤ３複合体（γ、δ、ε、ζを含む）、ＣＤ４又はＣＤ８などと一緒になってＴＣＲを形成している。
　ＴＣＲα及びＴＣＲβは、可変領域（Ｖ領域＋Ｊ領域）及び定常領域（Ｃ領域）を有している。なお、可変領域中のＶ領域には相補性決定領域（ＣＤＲ）が存在する。従って、ＴＣＲは、ＴＣＲα及びＴＣＲβ中のＶ領域（ＣＤＲ領域を含む）、又はＶ領域及びＪ領域のアミノ酸配列によって特徴づけることができる。
　本発明のＴＣＲは、前記のように、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域とを有することを特徴とする。
　ここで、当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、当該アミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのがより好ましく、当該アミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのがさらに好ましい。
　本発明のＴＣＲとしては、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域とを有するのが好ましい。
　本発明のＴＣＲは、前記α鎖ＣＤＲ３領域と前記β鎖ＣＤＲ３領域に加えて、さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域と、配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域とを有することが好ましい。
　ここで、当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、当該アミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのがより好ましく、当該アミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのがさらに好ましい。
　本発明のＴＣＲとしては、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域とを有することがより好ましい。
　本発明のＴＣＲは、前記α鎖ＣＤＲ３領域と、前記α鎖Ｌ領域と、前記β鎖ＣＤＲ３領域と、前記β鎖Ｌ領域に加えて、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有することがより好ましい。
　ここで、当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、当該アミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのがより好ましく、当該アミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのがさらに好ましい。
　本発明のＴＣＲは、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域と、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域と、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域とを有することがより好ましい。
　本発明のＴＣＲは、前記のα鎖ＣＤＲ３領域と、前記α鎖Ｌ領域と、前記β鎖ＣＤＲ３領域と、前記α鎖Ｖ領域と、前記β鎖Ｌ領域と、前記β鎖Ｖ領域に加えて、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有することがより好ましい。
　ここで、当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、当該アミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのがより好ましく、当該アミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるのがさらに好ましい。
　本発明のＴＣＲは、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域と、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域と、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域と、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域と、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域と、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域とを有することがより好ましい。
　本発明のＴＣＲの機能的断片としては、前記α鎖ＣＤＲ３領域及び前記β鎖ＣＤＲ３領域を有するポリペプチド、前記α鎖ＣＤＲ３領域、前記α鎖Ｌ領域、前記β鎖ＣＤＲ３領域、及び前記β鎖Ｌ領域を有するポリペプチド、前記α鎖ＣＤＲ３領域、前記α鎖Ｌ領域、前記α鎖Ｖ領域、前記β鎖ＣＤＲ３領域、前記β鎖Ｌ領域、及び前記β鎖Ｖ領域を有するポリペプチド、前記α鎖ＣＤＲ３領域、前記α鎖Ｌ領域、前記α鎖Ｖ領域、前記α鎖Ｊ領域、前記β鎖ＣＤＲ３領域、前記β鎖Ｌ領域、前記β鎖Ｖ領域、及び前記β鎖Ｊ領域を有するポリペプチド、これらのポリペプチドの結合体などが挙げられる。
　本発明のＴＣＲは、例えば、患者又は健常人末梢血からＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導後、シングルセルクローニングを行い、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンを樹立することにより得られる。
　末梢血からＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するには、健常人であっても、子宮頸がん患者であってもよい。
　本発明においてＴ－ｉＰＳ細胞に誘導されるＴ細胞は、ＨＰＶ１６Ｅ６特異性を有するＴ細胞が好ましい。例えば、ＣＤ３及びＣＤ８が発現しているＴ細胞であり、具体的にはＣＤ８陽性細胞であるＣＴＬが挙げられる。また、例えばＣＤ３及びＣＤ４が発現しているＴ細胞であり、具体的にはＣＤ４陽性細胞であるＴ細胞が挙げられる。なお、Ｔ細胞における抗原特異性は、抗原特異的な、再構成されたＴＣＲ遺伝子によりもたらされる。なお、製造効率の観点からは、特にこれに限定されないが、抗原特異的ＣＤ８陽性細胞を得るためには、Ｔ－ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞としては、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いることが好ましい。また、免疫療法を実施する場合、ｉＰＳ細胞から分化させるヒトＴ細胞は、ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞と抗原特異性が同一または実質的に同一であることが好ましい。また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を誘導するＴ細胞として、抗原特異性のないＴ細胞も含まれる。具体的にはＣＡＲＴ細胞もしくはＴＣＲ－Ｔ細胞など遺伝子改変Ｔ細胞が挙げられる。
　このようなＴ細胞は、例えばヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血が好ましい。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を分離する際には腫瘍組織もしくは末梢血から分離することができる。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、細胞分離用磁気ビーズなどを用いる磁気セレクション、ＣＤ４又はＣＤ８等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリー、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体を用いる活性化Ｔ細胞誘導法などが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現、又はＰＤ－１などのシグナル分子を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を単離することが出来る。さらに、抗原特異性を有するＴ細胞を含むヒトの組織より単離する場合には、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を多量体化させたもの（例えば、「ＭＨＣテトラマー」、「プロ５（登録商標）ＭＨＣ　クラスＩペンタマー」）を用いて、ヒトの組織より所望の抗原特異性を有するＴ細胞を精製することができる。
　本発明において、Ｔ細胞をｉＰＳ細胞にするために導入される遺伝子は、（ａ）Ｏｃｔ３／４遺伝子、（ｂ）ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、（ｃ）Ｓｏｘ２遺伝子、（ｄ）Ｋｌｆ４遺伝子、（ｅ）ＮＡＮＯＧ遺伝子、及び（ｆ）ＬＩＮ２８遺伝子などのうち少なくとも４種類の遺伝子の組み合わせが好ましい。
　本発明において、Ｔ細胞に前記遺伝子群を導入する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記遺伝子群をコードする核酸の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、前記遺伝子群をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を、Ｔ細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法にて細胞に導入することができる。
　このような発現ベクターのうち、前記遺伝子群を含むステルス型ＲＮＡ発現ベクターを用いるのが、がん化の危険性の低減、導入効率の点から、より好ましい。
　ステルス型ＲＮＡ発現ベクターとは、ベクターが染色体に入ることを回避し、核内ではなく細胞質内で、持続的で安定して遺伝子が発現するように設計されたベクターである。１万３０００塩基対以上の大きな遺伝子の導入や、１０個の遺伝子の同時導入もでき、細胞に傷害を与えず、導入遺伝子が不要な時には除去が可能で、細胞がベクターを異物として認識できないステルス性を持っている。
　このようなステルス型ＲＮＡ発現ベクターとしては、下記（１）～（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素からなり、自然免疫構造を活性化させない複合体が挙げられる。
（１）前記遺伝子群に対するＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成するヒトｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードするＲＮＡ配列、
（７）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列。
　また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を樹立する際には、前記Ｔ細胞は、前記遺伝子群の導入前に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）もしくはインターロイキン－７（ＩＬ－７）及びインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましく、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、同種抗原発現細胞、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ２８抗体、ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１の物質によって刺激して活性化してもよい。かかる刺激は、例えば、培地中に、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）が認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
　かかる刺激を前記Ｔ細胞に与えるために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては特に制限はないが、１～１００μｇ／ｍＬであることが好ましい。また、培地中に添加するＩＬ－２の濃度としては特に制限はないが、１～２００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。さらに、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、かかる刺激を前記Ｔ細胞に与えるために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１～１００μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍＬであることが好ましい。
　また、かかる刺激を行うための培養期間は、前記Ｔ細胞に対してかかる刺激を与えるのに十分な期間であって、前記４遺伝子の導入に必要な細胞数までＴ細胞を増殖しうる期間であれば特に制限はないが、通常２～７日間であるが、遺伝子導入効率の観点から、好ましくは３～５日間である。１５ｍＬチューブ内でＴ細胞とベクターを混合することにより感染させる、もしくは遺伝子導入効率を上げるという観点から、レトロネクチンがコートしてある培養ディッシュ上にて培養することが好ましい。
　前記Ｔ細胞を培養し、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加する培地としては、例えば、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地、より具体的には、他のサイトカイン類、ヒト血清を含む、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、ＡＩＭ　ＶTM　ｍｅｄｉｕｍ、ＮＳ－Ａ２を用いることができる。培地には、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。また、ＩＬ－２のかわりに培地にＩＬ－７及びＩＬ－１５を添加することも好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては特に制限はないが、それぞれ１～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
　また、前記Ｔ細胞に前記４遺伝子を導入する際、又はその後の条件としては特に制限はないが、前記４遺伝子を導入した前記Ｔ細胞は、フィーダーフリー条件下で培養するのが好ましい。例えば、ラミニン５１１Ｅ８断片であるｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液もしくはビトロネクチンでコーティングされたウェルなどが挙げられる。フィーダー細胞条件下での培養でも樹立可能であり、フィーダー細胞としては例えば、放射線の照射や抗生物質処理により細胞分裂を停止させたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。
　さらに、前記Ｔ細胞からＴ－ｉＰＳ細胞に誘導する過程において、翌日からｉＰＳ細胞の培地を添加しておくことが好ましい。その後は１日おきに半量ずつ培地交換を行い、徐々にＴ細胞培地からｉＰＳ培地に置換するのが好ましい。
　また、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞への移行に合わせて、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地から、ｉＰＳ細胞の培養に適した培地に徐々に置換していきながら培養することが好ましい。かかるｉＰＳ細胞の培養に適した培地としては、公知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ｉＭａｔｒｉｘコーティングした場合にはＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎもしくはビトロネクチンでコーティングした場合にはＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８　Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＥＦ細胞などのフィーダー細胞上ではノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、及びｂ－ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（ヒトｉＰＳ細胞培地）が望ましい。
　このようにして得られたＴ－ｉＰＳ細胞の選択は、公知の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞様コロニーの形態を顕微鏡下にて観察して選択する方法が挙げられる。一方でシングルセルであるＣＴＬクローンから樹立したＴ－ｉＰＳの場合、性質が似ていることが多いため、Ｔ－ｉＰＳ細胞の各コロニーを選択せず、樹立できたコロニーを全てそのまま継代する方法もある。
　このようにして選択された細胞がＴ－ｉＰＳ細胞であるということの確認は、例えば、選択された細胞における未分化細胞特異的マーカー（ＡＬＰ、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、及びＴｒａ－１－８１等）の発現を免疫染色やＲＴ－ＰＣＲ等によって検出する方法や、選択された細胞をマウスに移植して、そのテラトーマ形成を観察する方法により行うことができる。また、このようにして選択された細胞が前記Ｔ細胞由来であることの確認は、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をＲＴ―ＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
　これらの細胞を選択して回収する時期は、コロニーの生育状態を観察しながら、回収するのが好ましい。概ね、前記４遺伝子を含む遺伝子群を前記Ｔ細胞に導入してから１０～４０日、好ましくは１４日～２８日である。培養環境としては、上記にて特に断りのない限り、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
　次に、樹立したＴ－ｉＰＳ細胞からＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＴＬ細胞を分化誘導する。
　この再分化誘導方法としては、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ８＋シングルポジティブＴ細胞に分化させる方法が好ましく、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞に分化させ、次いで当該ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞をＣＤ８＋シングルポジティブＴ細胞に分化させる方法がより好ましい。
　更には、特許第６１６４７４６号公報記載のように、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させ、Ｔ細胞受容体を刺激する物質を添加してＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に刺激を与え、次いでＴ細胞受容体に刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５のサイトカインの存在下でＣＤ８シングルポジティブＴ細胞に分化させることにより得るのが好ましい。
　Ｔ－ｉＰＳ細胞をＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させるには、Ｔ－ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞（好ましくはマウスストローマ細胞）上で、サイトカイン、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、α－モノチオグリセロール、アスコルビン酸等を含有する培地中にて培養することが好ましい。
　用いるストローマ細胞としては、放射線照射等の処理を施したＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）であることが好ましい。培地に添加されるサイトカインは、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ３Ｌ群から選択される少なくとも１種のサイトカインであることが好ましく、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＴＰＯ、又は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌであることがより好ましい。
　また、培地としては、例えば、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭが挙げられるが、Ｔ－ｉＰＳサック（造血前駆細胞を含有する袋状の構造物）を形成させやすくする点から、ＩＭＤＭ培地が好ましい。このＴ－ｉＰＳ細胞の培養期間としては、Ｔ－ｉＰＳ細胞の培養を開始してから好ましくは８～１４日間、より好ましくは１０～１４日間である。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。また、低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５～２０％）下にて１週間程度培養することがより好ましい。
　Ｔ－ｉＰＳ細胞をＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させるために、さらに、前記のＴ－ｉＰＳサックに含まれている細胞を、サイトカインや血清（例えば、ＦＢＳ）等を含有する培地中にて、フィーダー細胞（好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞）上で培養することが好ましいが、フィーダーフリーの条件下でサイトカインコートのｗｅｌｌを使用する。Ｔ－ｉＰＳサックの内部に存在する細胞は、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この培養に用いるストローマ細胞としては、ｎｏｔｃｈシグナルを介して、Ｔ細胞への分化誘導を行うという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９－ＤＬ１細胞、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ１細胞であることが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５が挙げられる。培地としては、例えば、α－ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地が挙げられるが、α－ＭＥＭ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７及びＦＬＴ３Ｌ以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。
　このＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養期間としては、このようにして分化して得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現するまでの期間であることが好ましく、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから１４～２８日間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
　なお、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現しているか否かは、抗ＴＣＲαβ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価することができる。
　抗原特異性を有するヒトＣＤ８シングルポジティブ細胞の製造方法においては、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞を、該細胞表面上に発現しているＴＣＲを介して刺激することにより、ＴＣＲＡ遺伝子の更なる再構成を抑制することができ、ひいては、再分化して得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞において、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を極めて高くすることができる。
　Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える方法としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったヒトＴ細胞が特異的に結合する抗原ペプチド、前記Ｔ細胞受容体に対し拘束性を示すＨＬＡとの複合体を発現する細胞、及び該抗原ペプチドを結合させたＭＨＣ多量体からなる群から選択される少なくとも１の物質とＴ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞とを接触させる方法が好ましく、生理的な刺激を与える観点からは、特異ペプチド／ＨＬＡ複合体発現細胞を接触させる方法がより好ましい。また、刺激の均一性を重視する観点からは、抗体や試薬を接触させる方法がより好ましい。
　接触させる方法は、例えば、培地中に、ＰＨＡ等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴＣＲを刺激するために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては、１～１００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴＣＲを刺激するために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
　このＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養期間としては、このようにして分化して得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現するのに必要な期間を含むことが好ましく、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから７～２９日間であることが好ましい。培養環境としては、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
　本発明において、Ｔ細胞受容体に刺激を与えたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させるために、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞は、サイトカインや血清（例えば、ヒト血清）等を含有する培地中にて培養することが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させることができるものであればよく、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５が挙げられる。これらの中では、ＣＤ８シングルポジティブ細胞への分化において、ＣＤ８系譜を選択させ、かつメモリー型ＣＤ８＋Ｔ細胞生成が生じ易くさせるという観点では、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を組み合わせて添加することが好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては、１～２０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。培地としては、例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、ＤＭＥＭ培地、α－ＭＥＭ培地が挙げられるが、ＲＰＭＩ－１６４０培地又はＸ－ＶＩＶＯ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等以外のサイトカインが添加してあってもよい。
　かかる培養においては、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をフィーダー細胞と共培養してもよい。フィーダー細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）であることが好ましい。かかるＰＢＭＣとして、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞とはアロ（同種異系）の関係にあることが好ましい。また、ＴＣＲを刺激し続け、ＴＣＲの更なる再構成を抑制し続けるという観点から、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の元となったヒトＴ細胞が特異的に結合する抗原ペプチドを提示する末梢血単核球細胞を用いることがより好ましい。
　このＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させるための培養期間としては、２～４週間であることが好ましい。培養環境としては、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
　このように分化誘導されたＣＤ８シングルポジティブ細胞が、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来であり、また該Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったＴ細胞由来であることの確認は、例えば、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
　また、このようにして得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞は、公知の手法を適宜選択して単離することができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＣＤ８の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。例えば、ＣＤ８シングルポジティブ細胞の場合は、ＣＤ８シングルポジティブ細胞の元となったＴ細胞が認識する抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体（例えば、ＭＨＣテトラマー）を用いて精製する方法を採用することもできる。
　また、本発明により得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞は、ＰＤ－１は発現していないのに対し、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７が発現しており、またテロメアも元となったＴ細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。従って、本発明によれば、元のＴ細胞と同一のＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＣＤ８シングルポジティブＴ細胞であって、ＰＤ－１を発現せず、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＣＲ７を発現する細胞を製造することができる。そして、ヒトから採取したＴ細胞は、ＰＤ－１を発現し、幼若なメモリーフェノタイプの割合は少ない点で、得られたＴ細胞とは異なる。
　このようにして得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞を維持するために、１～２週間毎に、当該細胞に刺激を与えてもよい。かかる刺激としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、当該ＣＤ８シングルポジティブ細胞が認識する抗原、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体、当該ＣＤ８シングルポジティブ細胞とアロの関係にあるフィーダー細胞及び当該ＣＤ８シングルポジティブ細胞とオートの関係にあるフィーダー細胞からなる群から選択される少なくとも１の物質との接触が挙げられる。
　得られたｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞が、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害活性を有するか否かの確認は、ＭＨＣペンタマー、ＭＨＣテトラマーなどを用いてもとの末梢血由来ＣＴＬと同一の抗原特異性を保持していることを確認する。更にＴＣＲ配列解析を行いＴＣＲαβを同定した。
　また、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のＴＣＲをコードする遺伝子を用いて、遺伝子組み換えによって製造することもできる。すなわち、例えば、本発明のＴＣＲをコードする遺伝子を宿主Ｔ細胞に導入し、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性を有する細胞を選択すればよい。宿主Ｔ細胞にＴＣＲをコードする遺伝子を導入するには、種々のウイルスベクターに当該遺伝子を組み込むのが好ましい。
　ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性を有する細胞の選択は、前記のＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害活性の確認でもよいし、ＩＦＮ－γなどのサイトカインの産生能の検出でもよい。
　得られたＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞は、医薬組成物又は細胞性医薬品として有用である。
　得られたＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞は、優れたＨＰＶ特異的細胞傷害活性を有するので、特に子宮頸がんの治療薬として有用である。
　本発明のＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のうち、組織常在性メモリーＴ細胞を豊富に含むＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞が、特に優れたＨＰＶ特異的細胞傷害活性を有するので、子宮頸がんの治療薬として有用である。組織常在性メモリーＴ細胞を豊富に含むＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、組織常在性メモリーＴ細胞の表面抗原ＣＤ１０３と子宮頸がん細胞に発現するＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎとの結合により殺細胞蛋白の産生が増加し、抗原結合が増加して強力な抗腫瘍効果を発揮することを確認した。
　組織常在性メモリーＴ細胞を豊富に含むことは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ１０３、ＣＤ６９を認識する色素付きの抗体で多重染色してフローサイトメトリーにより確認することができる。ここで、豊富に含むとは、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋であるＴ細胞がＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ１０３＋もしくはＣＤ６９＋であることをいい、より好ましくはＣＤ３＋、ＣＤ８＋であるＴ細胞がＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ１０３＋およびＣＤ６９＋であることをいう。組織常在性メモリーＴ細胞の割合としては、少なくとも３０％以上含むことが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、６０％以上であることがさらに好ましく、７０％以上含むことがよりさらに好ましい。
　本発明の他の一態様は、前記のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含有する、子宮頸がん治療薬組成物である。
　また、本発明の他の一態様は、前記のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞の、子宮頸がん治療薬製造のための使用である。
　また、本発明の他の一態様は、子宮頸がんを治療するための、前記のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞である。
　さらに本発明の一態様は、前記のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を投与することを特徴とする、子宮頸がんの治療方法である。
　本発明の医薬組成物は、本発明のＴ細胞に加えて、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。そのような担体の例として、生理食塩水、リンゲル液などが挙げられる。さらに本発明の医薬組成物は、必要に応じて、保存剤、着色剤などの公知の薬学的に許容される添加物を含むことができる。
　本発明の医薬組成物の形態は、注射剤が好ましく、Ｔ細胞輸注療法用の注射剤が好ましい。本発明の医薬組成物は、子宮頸がん患者に対し、数週間間隔で、Ｔ細胞輸注するのが好ましい。
　さらに本発明の医薬組成物は、ＨＰＶ１６感染細胞、ＨＰＶ１６陽性細胞の治療にも有用である。特にＨＰＶ１６感染による癌として、子宮頸がん以外に、肛門、咽頭、外陰、陰茎などの癌の治療に有用である。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
　ＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＴＬクローンよりセンダイウイルスベクターを用いてＴ－ｉＰＳ細胞の樹立。
１）健常人末梢血より末梢血単核球を分離後、抗原提示目的に樹状細胞を誘導した。７日後、誘導した樹状細胞に抗原ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ６　４９－５７，Ａ２４０２）を添加し末梢血単核球と共培養開始した。約８～１０日後にＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＴＬ検出のため、ＣＴＬをＭＨＣテトラマーで染色後、フローサイトメトリーにてテトラマー陽性率を確認した。ＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＴＬを確認後、シングルセルソート又はテトラマー／ＰＥビーズセレクション後限界希釈法を行った。
２）約３～６週間後立ち上がったコロニーのテトラマー染色を行い、フローサイトメトリーでＣＴＬクローン樹立の確認をした。樹立確認後ＣＴＬクローンをＣＤ３／２８刺激後、以下のＡ）ベクターを用い遺伝子導入した。ｉＭａｔｒｉｘでコートした６ｗｅｌｌプレートに遺伝子導入後のＣＴＬを移動し、ＣＴＬメディウムを培地としてＣＯ2インキュベーターで培養開始した。
　Ａ）ＳｅＶ６因子ベクター（（ａ）Ｏｃｔ３／４遺伝子、（ｂ）ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、（ｃ）Ｓｏｘ２遺伝子、（ｄ）Ｋｌｆ４遺伝子、（ｅ）ＮＡＮＯＧ遺伝子、及び（ｆ）ＬＩＮ２８遺伝子）
３）ＳｅＶ遺伝子導入翌日、ｉＰＳメディウム（ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎ）を等量加え、その後は１日おきに半量ずつＳｔｅｍ　ＦｉｔＡＫ０３Ｎに置換した。
４）７日後にＴ－ｉＰＳ細胞のコロニーが観察でき、その後コロニーピックアップして拡大培養を行なった。
５）樹立したＴ－ｉＰＳ細胞のＨＬＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術でゲノム編集後、オフターゲット効果を慎重に除外した後にマスターセルバンクを作製した。
６）その後ｉＰＳ細胞由来　ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ　ＨＰＶ１６Ｅ６－ＣＴＬ（ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴ）を分化誘導した。
７）細胞傷害性試験を行うと元の末梢血ＣＴＬより強力に腫瘍細胞に抗原特異的細胞傷害活性を示すことができた。
　図１～図３に末梢血から誘導したＨＰＶ１６Ｅ６－ＣＴＬと樹立したＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＴＬクローン、更にｉＰＳ細胞由来ＨＰＶ１６Ｅ６－ＣＴＬ（ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴ）のテトラマー染色結果を示す。
実施例２
１）細胞傷害性試験
　ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６　Ｅ６－ｒｅｊＴとＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＴＬクローンの子宮頸がん細胞株（ＳｉＨａ、ＳＫＧＩＩＩａ）に対する細胞傷害活性をクロム放出試験によって比較した。
　図４に示すように、標的となる子宮頸がん細胞株（ＳｉＨａ、ＳＫＧＩＩＩａ）にＨＰＶ１６　Ｅ６抗原ペプチドを添加した場合はＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６　Ｅ６－ｒｅｊＴに加え元の末梢血由来ＣＴＬも細胞傷害活性を認めた。しかし、ＨＰＶ１６　Ｅ６抗原ペプチドを添加しなかった場合はＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６　Ｅ６－ｒｅｊＴのみに細胞傷害活性を認めた。これにより、ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６　Ｅ６－ｒｅｊＴの子宮頸がん細胞株（ＳｉＨａ、ＳＫＧＩＩＩａ）に対する強力な抗原認識と殺細胞効果が確認された。
２）ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴの特性評価
　ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴの細胞傷害性タンパク質の発現を確認するためにＧｒａｎｚｙｍｅ　Ｂ，Ｐｅｒｆｏｒｉｎの細胞内染色を行い、フローサイトメトリーで測定した。
　図５に示すように、ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴは、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＴＬクローンと比較し、Ｇｒａｎｚｙｍｅ　Ｂ，Ｐｅｒｆｏｒｉｎを高発現することが明らかになった。
３）ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴの特性
　ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴの組織常在性メモリーＴ細胞の割合を確認するためにＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ１０３、ＣＤ６９で多重染色してフローサイトメトリーにより測定した。
　図６に示すように、ＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴは、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＴＬクローンと比較し組織常在性メモリーＴ細胞の割合が圧倒的に多いことが明らかとなった。
４）子宮頸がん細胞が、上皮性マーカーであるＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎを高発現すること
　子宮頸がん細胞（ＳｉＨａ、ＳＫＧＩＩＩａ、Ｃ　ａｓｋｉ）が、上皮性マーカーであるＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎを発現することを確認するために、表面抗原を色素付きの抗体で染色しフローサイトメトリーにより測定した。
　図７に示すように、子宮頸がん細胞（ＳｉＨａ、ＳＫＧＩＩＩａ、Ｃ　ａｓｋｉ）は上皮性マーカーであるＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎを高発現することがわかり、本発明の組織常在性メモリーＴ細胞を豊富に含むＨＬＡ編集後ＨＰＶ１６Ｅ６－ｒｅｊＴは、組織常在性メモリーＴ細胞の表面抗原ＣＤ１０３と子宮頸がん細胞に発現するＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎとの結合により殺細胞蛋白の産生が増加し、抗原結合が増加して強力な抗腫瘍効果を発揮することがわかった。
実施例３
　ＴＣＲ配列の解析結果を、図８（アミノ酸配列）及び図９（塩基配列）に示す。

Claims (26)

  1. 　配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域を有する、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
  2. 　配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるα鎖ＣＤＲ３領域、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖ＣＤＲ３領域を有する、請求項１に記載のＴ細胞受容体又はその機能性断片。
  3. 　さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域を有する、請求項１に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
  4. 　さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｌ領域、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｌ領域を有する、請求項１に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
  5. 　さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有する、請求項１に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
  6. 　さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｖ領域を有する、請求項１に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
  7. 　さらに配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるα鎖Ｊ領域、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加してなるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有する、請求項１に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
  8. 　さらに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα鎖Ｖ領域、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖Ｊ領域を有する、請求項１に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片。
  9. 　請求項１～８のいずれか1項に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有する細胞。
  10. 　ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞である請求項９記載の細胞。
  11. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するｉＰＳ細胞。
  12. 　ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ－ｉＰＳ細胞である請求項１１記載のｉＰＳ細胞。
  13. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片のＤＮＡを含むベクター。
  14. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含有する、医薬組成物。
  15. 　子宮頸がん治療用医薬組成物である請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞を含有する、細胞性医薬品。
  17. 　子宮頸がん治療用細胞性医薬品である請求項１６に記載の細胞性医薬品。
  18. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞の、子宮頸がん治療薬製造のための使用。
  19. 　子宮頸がんを治療するための、請求項１～８のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞。
  20. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体又はその機能的断片を有するＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を投与することを特徴とする、子宮頸がんの治療方法。
  21. 　組織常在性メモリーＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞。
  22. 　組織常在性メモリーＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含む医薬組成物。
  23. 　組織常在性メモリーＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含む細胞性医薬品。
  24. 　表面抗原がＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ１０３＋又はＣＤ６９＋であるＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞。
  25. 　表面抗原がＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ１０３＋又はＣＤ６９＋であるＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含む医薬組成物。
  26. 　表面抗原がＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ１０３＋又はＣＤ６９＋であるＴ細胞を含むことを特徴とする、ＨＰＶ１６Ｅ６特異的細胞傷害性Ｔ細胞又はＴ－ｉＰＳ細胞を含む細胞性医薬品。
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HONDA, TADAHIRO ET AL.: "Sustainable Tumor-Suppressive Effect of iPSC-Derived Rejuvenated T Cells Targeting Cervical Cancers", MOL. THER., vol. 28, no. 11, 2020, pages 2394 - 2405, XP093007416, DOI: 10.1016/j.ymthe.2020.07.004 *

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