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WO2024172163A1 - タンパク質の分泌生産法 - Google Patents

タンパク質の分泌生産法 Download PDF

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WO2024172163A1
WO2024172163A1 PCT/JP2024/005612 JP2024005612W WO2024172163A1 WO 2024172163 A1 WO2024172163 A1 WO 2024172163A1 JP 2024005612 W JP2024005612 W JP 2024005612W WO 2024172163 A1 WO2024172163 A1 WO 2024172163A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
gene
amino acid
acid sequence
signal peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2024/005612
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
悠美 長瀬
吉彦 松田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Priority to JP2025501239A priority Critical patent/JPWO2024172163A1/ja
Priority to CN202480013138.7A priority patent/CN120693407A/zh
Priority to KR1020257030808A priority patent/KR20250151452A/ko
Priority to EP24757002.1A priority patent/EP4667580A1/en
Priority to AU2024221604A priority patent/AU2024221604A1/en
Publication of WO2024172163A1 publication Critical patent/WO2024172163A1/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present invention relates to a method for secretory production of heterologous proteins.
  • Non-Patent Document 1 Bacillus bacteria
  • Non-Patent Document 2 the methanol-utilizing yeast Pichia pastoris
  • Aspergillus filamentous fungi Non-Patent Documents 3 and 4.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 5
  • Non-Patent Document 5 the secretion of proteases such as subtilisin
  • Non-Patent Document 6 the secretion of proteins using signal peptides of cell surface proteins PS1 and PS2 (also called CspB) of coryneform bacteria
  • Patent Document 2 the secretion of fibronectin-binding proteins using the signal peptide of PS2
  • Non-Patent Document 7 Non-Patent Document 7
  • the secretion of protransglutaminase using signal peptides of PS2 (CspB) and SlpA also called CspA
  • Patent Document 3 the secretion of proteins using mutant secretion apparatus
  • Patent Document 4 the secretion of protransglutaminase by mutant strains
  • Patent Document 5 the secretion of protransglutaminase by mutant strains
  • Patent Documents 6 and 7 known techniques for increasing the secretion production of heterologous proteins by coryneform bacteria include reducing the activity of cell surface proteins (Patent Documents 6 and 7), reducing the activity of penicillin-binding proteins (Patent Document 6), enhancing the expression of genes encoding metallopeptidases (Patent Document 7), introducing a mutation into the ribosomal protein S1 gene (Patent Document 8), and expressing a heterologous protein by inserting an amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr between the signal peptide and the heterologous protein (Patent Document 9).
  • Non-Patent Document 8 A common protein secretion pathway is the Sec system, which is widely present in prokaryotes and eukaryotes, but in recent years, a protein secretion pathway completely different from the Sec system has been discovered in the thylakoid membrane of the chloroplasts of plant cells (Non-Patent Document 8).
  • This novel secretion pathway has been named the Tat system (Twin-Arginine Translocation system) because the signal sequences of the proteins secreted through it share a common arginine-arginine sequence (Non-Patent Document 8).
  • Non-Patent Document 9 There have also been reports of secretory production of proteins using Tat system-dependent signal peptides in coryneform bacteria.
  • Malate dehydrogenase is an oxidoreductase that catalyzes the conversion of malate to oxaloacetate and/or the reverse reaction.
  • C. glutamicum has two types of malate dehydrogenase, namely, cytosolic malate dehydrogenase (Mdh) encoded by the mdh gene and transmembrane malate:quinone-oxidoreductase (Mqo) encoded by the mqo gene, and these two types of malate dehydrogenase function in concert.
  • Mqo is responsible for most of the reaction converting malate to oxaloacetate, and Mdh functions only when the concentration of oxaloacetate is low or when the concentration of malate is high.
  • mqo gene-deficient strains cannot grow in minimal medium, but mdh gene-deficient strains grow in the same way as wild-type strains, suggesting that Mqo can compensate for the function of Mdh (Non-Patent Document 10).
  • Non-Patent Document 11 deletion of the mdh gene increases isobutanol production capacity
  • Non-Patent Document 11 enhancement of Mdh activity increases L-amino acid production capacity
  • Patent Document 12 enhancement of Mdh activity increases succinic acid production capacity
  • the objective of the present invention is to develop a new technology for improving the secretion production of heterologous proteins by coryneform bacteria, and to provide a method for the secretion production of heterologous proteins by coryneform bacteria.
  • a method for producing a heterologous protein comprising the steps of: Cultivating a coryneform bacterium having a gene construct for secretory expression of a heterologous protein; and recovering the secreted and produced heterologous protein, the coryneform bacterium has been modified so that activity of an Mdh protein is reduced as compared to a non-modified strain; the genetic construct comprises, in a 5' to 3' direction, a promoter sequence functional in a coryneform bacterium, a nucleic acid sequence encoding a signal peptide functional in a coryneform bacterium, and a nucleic acid sequence encoding a heterologous protein; The method, wherein the heterologous protein is expressed as a fusion protein with the signal peptide.
  • the Mdh protein is a protein described in the following (a), (b), or (c): (a) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:40; (b) a protein comprising an amino acid sequence containing a substitution, deletion, insertion, and/or addition of 1 to 10 amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40, and having malate dehydrogenase activity; (c) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 and having malate dehydrogenase activity.
  • [3] The method (specifically, the method described in [1] or [2]) above, wherein the activity of the Mdh protein is reduced by reducing expression of the mdh gene or by disrupting the mdh gene.
  • [4] The method (specifically, the method described in any of [1] to [3]) above, wherein the activity of the Mdh protein is reduced by deletion of a part or all of the amino acid sequence of the Mdh protein.
  • [5] The method (specifically, the method described in [4]) above, in which at least the site corresponding to positions 313 to 328 of SEQ ID NO: 40 in the amino acid sequence of the Mdh protein is deleted.
  • amino acid residue other than aromatic amino acids and histidine is a lysine residue, an alanine residue, a valine residue, a serine residue, a cysteine residue, a methionine residue, an aspartic acid residue, or an asparagine residue.
  • the method in which the wild-type PhoS protein is a protein described in the following (a), (b), or (c): (a) a protein comprising an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 7; (b) a protein comprising an amino acid sequence including a substitution, deletion, insertion, and/or addition of 1 to 10 amino acid residues in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 7, and having a function as a sensor kinase of the PhoRS system; (c) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7 and having a function as a sensor kinase of the PhoRS system.
  • the method (specifically, the method according to any one of [1] to [11]) wherein the signal peptide is a Tat system-dependent signal peptide.
  • the Tat system-dependent signal peptide is any one signal peptide selected from the group consisting of a TorA signal peptide, a SufI signal peptide, a PhoD signal peptide, a LipA signal peptide, and an IMD signal peptide.
  • the gene construct further comprises, between the nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr and the nucleic acid sequence encoding a heterologous protein, a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence used for enzymatic cleavage.
  • the method (specifically, the method described in any one of [1] to [19]) above, wherein the coryneform bacterium is a bacterium of the genus Corynebacterium.
  • the method (specifically, the method described in [20]) above, wherein the coryneform bacterium is Corynebacterium glutamicum.
  • coryneform bacterium is a modified strain derived from Corynebacterium glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) or a modified strain derived from Corynebacterium glutamicum ATCC 13869.
  • the method (specifically, the method described in any one of [1] to [22]) wherein the coryneform bacterium is a coryneform bacterium in which the number of molecules of a cell surface protein per cell is reduced compared to a non-modified strain.
  • the present invention enables efficient secretion and production of heterologous proteins.
  • the method of the present invention is a method for producing a heterologous protein, comprising culturing a coryneform bacterium having a gene construct for secretory expression of the heterologous protein and recovering the secreted and produced heterologous protein, in which the coryneform bacterium has been modified to reduce the activity of the Mdh protein.
  • Coryneform bacteria used in the method of the present invention are coryneform bacteria having a gene construct for secretion and expression of a heterologous protein, and are coryneform bacteria modified to reduce the activity of Mdh protein.
  • the coryneform bacteria used in the method of the present invention are also referred to as "bacteria of the present invention” or “coryneform bacteria of the present invention”.
  • the gene construct for secretion and expression of a heterologous protein carried by the bacterium of the present invention is also referred to as "gene construct used in the present invention”.
  • the bacterium of the present invention or a strain used to construct the bacterium is also referred to as "host”.
  • Coryneform bacteria capable of secreting and producing a heterologous protein The coryneform bacteria of the present invention have the ability to secrete and produce a heterologous protein.
  • the coryneform bacteria of the present invention have the ability to secrete and produce a heterologous protein based on having at least a gene construct for secreting and expressing a heterologous protein (gene construct used in the present invention).
  • the coryneform bacteria of the present invention may have the ability to secrete and produce a heterologous protein by having a gene construct for secreting and expressing a heterologous protein, or by having a gene construct for secreting and expressing a heterologous protein in combination with other properties. Examples of other properties include modifications that reduce the activity of Mdh protein and other properties as described below.
  • secretion of a protein refers to the transfer of the protein outside the bacterial cell (outside the cell).
  • Examples of “outside the bacterial cell” include in the medium and on the bacterial cell surface. That is, the secreted protein molecule may be present, for example, in the medium, on the bacterial cell surface, or both in the medium and on the bacterial cell surface. That is, "secretion" of a protein is not limited to the case where all of the protein molecules are ultimately placed in a completely free state in the medium, but also includes, for example, the case where all of the protein molecules are present on the bacterial cell surface, or the case where some of the protein molecules are present in the medium and the remaining molecules are present on the bacterial cell surface.
  • the "ability to secrete and produce a heterologous protein” refers to the ability to secrete a heterologous protein into the medium and/or onto the cell surface when the bacterium of the present invention is cultured in a medium, and accumulate the heterologous protein to an extent that it can be recovered from the medium and/or the cell surface.
  • the amount of accumulation may be, for example, in the medium, preferably 10 ⁇ g/L or more, more preferably 1 mg/L or more, particularly preferably 100 mg/L or more, and even more preferably 1 g/L or more.
  • the amount of accumulation may be, for example, in the cell surface, such that when the heterologous protein on the cell surface is recovered and suspended in a liquid of the same volume as the medium, the heterologous protein concentration in the suspension is preferably 10 ⁇ g/L or more, more preferably 1 mg/L or more, and particularly preferably 100 mg/L or more.
  • the "protein" to be secreted and produced is a concept that also includes forms known as peptides, such as oligopeptides and polypeptides.
  • heterologous protein refers to a protein that is exogenous to the coryneform bacterium that expresses and secretes the protein.
  • the heterologous protein may be, for example, a protein derived from a microorganism, a protein derived from a plant, a protein derived from an animal, a protein derived from a virus, or even a protein whose amino acid sequence has been artificially designed.
  • the heterologous protein may be, in particular, a protein derived from a human.
  • the heterologous protein may be a monomeric protein or a multimeric protein.
  • a multimeric protein refers to a protein that can exist as a multimer consisting of two or more subunits.
  • the subunits may be linked by covalent bonds such as disulfide bonds, or by non-covalent bonds such as hydrogen bonds or hydrophobic interactions, or by a combination thereof. It is preferable that the multimer contains one or more intermolecular disulfide bonds.
  • the multimer may be a homomultimer consisting of a single type of subunit, or a heteromultimer consisting of two or more types of subunits.
  • the multimeric protein is a heteromultimer
  • at least one of the subunits constituting the multimer may be a heterologous protein. That is, all of the subunits may be derived from a heterologous species, or only some of the subunits may be derived from a heterologous species.
  • the heterologous protein may be a naturally secreted protein or a naturally non-secreted protein, but is preferably a naturally secreted protein.
  • the heterologous protein may be a naturally secreted protein dependent on the Tat system, or a naturally secreted protein dependent on the Sec system. Specific examples of "heterologous proteins" will be described later.
  • the heterologous protein produced may be of only one type, or of two or more types. Furthermore, when the heterologous protein is a heteromultimer, only one type of subunit may be produced, or of two or more types of subunits.
  • "secreting and producing a heterologous protein” includes not only the secretion and production of all subunits that constitute the heterologous protein of interest, but also the secretion and production of only some of the subunits.
  • Coryneform bacteria are aerobic gram-positive rod-shaped bacteria.
  • Examples of corynebacterium bacteria include bacteria of the genus Corynebacterium, Brevibacterium, and Microbacterium.
  • the advantages of using corynebacterium bacteria include that, compared with filamentous fungi, yeast, Bacillus bacteria, and other bacteria that have been used in the secretion and production of heterologous proteins, very little protein is secreted outside the bacterial cell, which is expected to simplify or omit the purification process when secreting and producing heterologous proteins; they also grow well in simple media containing sugars, ammonia, inorganic salts, and the like, and are excellent in terms of medium cost, culture method, and culture productivity.
  • coryneform bacteria include the following species: Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium crenatum Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) Brevibacterium album Brevibacterium cerinum
  • coryneform bacteria include the following strains: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium crenatum AS1.542 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020 Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC
  • Corynebacterium also includes bacteria that were previously classified as Brevibacterium but have now been integrated into the genus Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)).
  • Corynebacterium stationis also includes bacteria that were previously classified as Corynebacterium ammoniagenes but have now been reclassified as Corynebacterium stationis based on 16S rRNA sequence analysis, etc. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)).
  • strains can be obtained, for example, from the American Type Culture Collection (Address: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). That is, each strain is assigned a registration number, and can be obtained by using this registration number (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is listed in the catalog of the American Type Culture Collection. These strains can also be obtained, for example, from the depository institution where each strain was deposited.
  • C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734), which was isolated as a streptomycin (Sm)-resistant mutant from the wild-type C. glutamicum ATCC 13869, is predicted to have a mutation in a gene controlling functions related to protein secretion compared to its parent strain (wild-type strain), and has an extremely high protein secretion production ability, with the amount accumulated under optimal culture conditions being approximately 2 to 3 times higher, making it an ideal host bacterium (WO2002/081694).
  • AJ12036 was originally deposited as an international deposit at the Microbial Industrial Technology Institute, Agency of Industrial Science and Technology (currently the Patent Organism Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE IPOD), Postal Code: 292-0818, Address: Room 120, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) on March 26, 1984, and has been assigned the deposit number FERM BP-734.
  • Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) was originally deposited as an international deposit at the Microbial Industrial Technology Institute, Agency of Industrial Science and Technology (currently the Patent Organism Depositary Center, National Institute of Technology and Evaluation, Independent Administrative Institution, Postal Code: 292-0818, Address: Room 120, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) on March 13, 1987, and has been assigned the deposit number FERM BP-1539.
  • Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205) was originally deposited as an international deposit on December 24, 1988 at the Microbial Industrial Technology Institute, Agency of Industrial Science and Technology (currently the Patent Organism Deposit Center, National Institute of Technology and Evaluation, Japan; postal code: 292-0818; address: Room 120, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) and has been assigned the deposit number FERM BP-2205.
  • a strain with enhanced protein secretion production ability can be selected using mutation or genetic recombination techniques and used as a host.
  • a strain with enhanced protein secretion production ability can be selected after treatment with ultraviolet light or a chemical mutagen such as N-methyl-N'-nitrosoguanidine.
  • a strain modified so as not to produce cell surface proteins which facilitates purification of the heterologous protein secreted into the medium or on the cell surface.
  • Such modifications can be achieved by introducing a mutation into the coding region of the cell surface protein on the chromosome or into its expression regulatory region by mutation or genetic recombination techniques.
  • An example of a coryneform bacterium modified so as not to produce cell surface proteins is the C. glutamicum YDK010 strain (WO2004/029254), which is a strain of C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) that is defective in the cell surface protein PS2.
  • a coryneform bacterium capable of secreting and producing a heterologous protein can be obtained by introducing and retaining the gene construct used in the present invention in a coryneform bacterium as described above. That is, the bacterium of the present invention may be, for example, a modified strain derived from a coryneform bacterium as described above. Specifically, the bacterium of the present invention may be, for example, a modified strain derived from C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) or a modified strain derived from C. glutamicum ATCC 13869. The modified strain derived from C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) also corresponds to the modified strain derived from C. glutamicum ATCC 13869. The gene construct used in the present invention and the method of introducing the same will be described later.
  • the bacterium of the present invention has been modified to reduce the activity of the Mdh protein. Specifically, the bacterium of the present invention has been modified to reduce the activity of the Mdh protein compared to a non-modified strain. The activity of the Mdh protein may be reduced, for example, compared to C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) or C. glutamicum ATCC 13869. More specifically, the bacterium of the present invention may be modified to reduce the expression of the mdh gene or to disrupt the mdh gene.
  • the ability of the bacterium to secrete and produce a heterologous protein can be improved, i.e., the secretion and production of a heterologous protein by the bacterium can be increased.
  • the bacterium of the present invention can be obtained by modifying a coryneform bacterium having the ability to secrete and produce a heterologous protein so that the activity of the Mdh protein is reduced.
  • the bacterium of the present invention can also be obtained by modifying a coryneform bacterium so that the activity of the Mdh protein is reduced, and then imparting the ability to secrete and produce a heterologous protein.
  • modifications for constructing the bacterium of the present invention can be performed in any order.
  • the strain used for constructing the bacterium of the present invention before being modified to reduce the activity of the Mdh protein may or may not be able to secrete and produce a heterologous protein, assuming that it has a gene construct for secreting and expressing a heterologous protein. That is, the bacterium of the present invention may be, for example, one that has acquired the ability to secrete and produce a heterologous protein by being modified to reduce the activity of the Mdh protein.
  • the bacterium of the present invention may be one obtained from a strain that was unable to secrete and produce a heterologous protein even if it had a gene construct for secreting and expressing a heterologous protein before being modified to reduce the activity of the Mdh protein, and that has become able to secrete and produce a heterologous protein by being modified to reduce the activity of the Mdh protein.
  • the Mdh protein and the mdh gene that encodes it are described below.
  • the Mdh protein is a cytoplasmic malate dehydrogenase (EC 1.1.1.37).
  • “Malate dehydrogenase” refers to a protein (enzyme) that has the activity of catalyzing the reaction of converting malic acid to oxaloacetate in the presence of an electron acceptor, and/or the reaction of converting oxaloacetate to malic acid in the presence of a potential donor. This activity is also called “malate dehydrogenase activity.”
  • electron acceptors include NAD + .
  • Examples of potential donors include NADH.
  • the nucleotide sequences of the mdh genes of coryneform bacteria and the amino acid sequences of the Mdh proteins encoded thereby can be obtained from public databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the nucleotide sequences of the mdh genes of C. glutamicum ATCC 13869 and the amino acid sequences of the Mdh proteins encoded thereby are shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively. That is, the mdh gene may be, for example, a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39.
  • the Mdh protein may be, for example, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40.
  • the mdh gene may be a variant of the mdh gene exemplified above (e.g., a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39) so long as the original function is maintained.
  • the Mdh protein may be a variant of the Mdh protein exemplified above (e.g., a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40) so long as the original function is maintained.
  • Such a variant that maintains the original function may be referred to as a "conservative variant.”
  • the term "mdh gene" is not limited to the mdh gene exemplified above, but includes conservative variants thereof.
  • Mdh protein is not limited to the Mdh protein exemplified above, but includes conservative variants thereof.
  • Conservative variants include, for example, homologs and artificially modified forms of the mdh genes and Mdh proteins exemplified above.
  • “Maintaining the original function” means that the gene or protein variant has a function (e.g., activity or property) corresponding to the function (e.g., activity or property) of the original gene or protein. That is, in the case of the mdh gene, “maintaining the original function” may mean that the gene variant encodes a protein (i.e., Mdh protein) whose original function is maintained. Also, in the case of the Mdh protein, “maintaining the original function” may mean that the protein variant has the function of the Mdh protein (e.g., the function of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40).
  • “maintaining the original function” may mean that the protein variant has malate dehydrogenase activity. That is, “function as the Mdh protein” may specifically be malate dehydrogenase activity.
  • Malate dehydrogenase activity (oxaloacetate direction) can be measured by incubating the enzyme with substrate (malate) in the presence of NAD + and measuring the production of NADH.
  • Mesalate dehydrogenase activity (malate direction) can be measured by incubating the enzyme with substrate (oxaloacetate) in the presence of NADH and measuring the reduction of NADH.
  • Homologs of the mdh gene or homologs of the Mdh protein can be easily obtained from public databases, for example, by BLAST search or FASTA search using the nucleotide sequence of the mdh gene or the amino acid sequence of the Mdh protein as a query sequence.
  • Homologs of the mdh gene can also be obtained, for example, by PCR using the chromosome of a coryneform bacterium as a template and oligonucleotides prepared based on the nucleotide sequences of these known mdh genes as primers.
  • the mdh gene may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of the Mdh protein exemplified above (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40) have been substituted, deleted, inserted, and/or added, so long as the original function is maintained.
  • the above-mentioned "one or several” varies depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically means, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3.
  • substitutions, deletions, insertions, and/or additions of one or several amino acids are conservative mutations that maintain the normal function of the protein.
  • a typical example of a conservative mutation is conservative substitution.
  • a conservative substitution is a mutation in which Phe, Trp, and Tyr are substituted with each other when the substitution site is an aromatic amino acid, Leu, Ile, and Val are substituted with each other when the substitution site is a hydrophobic amino acid, Gln and Asn are substituted with each other when the substitution site is a polar amino acid, Lys, Arg, and His are substituted with each other when the substitution site is a basic amino acid, Asp and Glu are substituted with each other when the substitution site is an acidic amino acid, and Ser and Thr are substituted with each other when the substitution site is an amino acid with a hydroxyl group.
  • substitutions that are considered to be conservative substitutions include substitutions of Ala to Ser or Thr, substitutions of Arg to Gln, His, or Lys, substitutions of Asn to Glu, Gln, Lys, His, or Asp, substitutions of Asp to Asn, Glu, or Gln, substitutions of Cys to Ser or Ala, substitutions of Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp, or Arg, substitutions of Glu to Gly, Asn, Gln, Lys, or Asp, substitutions of Gly to Pro, substitutions of His to Asn, Lys, Gln, Arg, or Tyr, substitutions of Il Examples of substitutions include substitutions of Lys with Leu, Met, Val, or Phe, substitutions of Leu with Ile, Met, Val, or Phe, substitutions of Lys with Asn, Glu, Gln, His, or Arg, substitutions of Met with Ile, Leu, Val, or Phe, substitutions of Phe, substitution
  • the mdh gene may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence that has an identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more to the entire amino acid sequence of the Mdh protein exemplified above (e.g., the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:40), so long as the original function is maintained.
  • the mdh gene may be a DNA that hybridizes under stringent conditions with a probe that can be prepared from a complementary sequence or the same complementary sequence of the base sequence of the mdh gene exemplified above (for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 39), so long as the original function is maintained.
  • Stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • DNAs with high identity for example DNAs with an identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more, hybridize with each other, and DNAs with lower identity do not hybridize with each other, or where washing is performed once, preferably 2 to 3 times, at a salt concentration and temperature equivalent to the washing conditions for normal Southern hybridization, which are 60°C, 1xSSC, 0.1% SDS, preferably 60°C, 0.1xSSC, 0.1% SDS, and more preferably 68°C, 0.1xSSC, 0.1% SDS.
  • a salt concentration and temperature equivalent to the washing conditions for normal Southern hybridization which are 60°C, 1xSSC, 0.1% SDS, preferably 60°C, 0.1xSSC, 0.1% SDS, and more preferably 68°C, 0.1xSSC, 0.1% SDS.
  • the above probe may be, for example, a part of the complementary sequence of a gene.
  • a probe can be prepared by PCR using oligonucleotides prepared based on the base sequence of a known gene as primers and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
  • primers for example, a DNA fragment of about 300 bp in length can be used.
  • washing conditions for hybridization include 50°C, 2xSSC, and 0.1% SDS.
  • the mdh gene may also have a base sequence in which any codon in the base sequence of the mdh gene or a conservative variant thereof exemplified above is replaced with an equivalent codon.
  • gene and protein variants can also be applied mutatis mutandis to any protein, such as the PhoRS protein, cell surface proteins, the Tat secretion system, and the heterologous proteins secreted and produced in the present invention, as well as the genes that encode them.
  • the bacterium of the present invention may have any desired properties as long as it is capable of secreting and producing a heterologous protein.
  • the bacterium of the present invention may have a reduced activity of a cell surface protein (WO2013/065869, WO2013/065772, WO2013/118544, WO2013/062029).
  • the bacterium of the present invention may be modified to reduce the activity of a penicillin-binding protein (WO2013/065869).
  • the bacterium of the present invention may be modified to increase the expression of a gene encoding a metallopeptidase (WO2013/065772).
  • the bacterium of the present invention may be modified to have a mutant ribosomal protein S1 gene (mutant rpsA gene) (WO2013/118544).
  • the bacterium of the present invention may be modified to have a mutant phoS gene (WO2016/171224).
  • the bacterium of the present invention may also be modified to reduce the activity of the RegX3 protein (WO2018/074578).
  • the bacterium of the present invention may also be modified to reduce the activity of the HrrSA system (WO2018/074579).
  • the bacterium of the present invention may also be modified to increase the activity of the Tat secretion apparatus.
  • a mutant phoS gene is also referred to as “having a mutant phoS gene” or “having a mutation in the phoS gene.” Furthermore, “carrying a mutant phoS gene” is also referred to as “having a mutant PhoS protein” or “having a mutation in the PhoS protein.”
  • the phoS gene and the PhoS protein are explained below.
  • the phoS gene is a gene that encodes the PhoS protein, which is a sensor kinase in the PhoRS system.
  • the PhoRS system is one of the two-component regulatory systems that triggers a response to environmental phosphate deficiency.
  • the PhoRS system consists of the sensor kinase PhoS, which is encoded by the phoS gene, and the response regulator PhoR, which is encoded by the phoR gene.
  • a PhoS protein having a "specific mutation” is also referred to as a "mutant PhoS protein” and the gene encoding it as a "mutant phoS gene.”
  • a “mutant phoS gene” is a phoS gene having a "specific mutation.”
  • a PhoS protein not having a “specific mutation” is also referred to as a "wild-type PhoS protein” and the gene encoding it as a "wild-type phoS gene.”
  • a "wild-type phoS gene” is a phoS gene not having a "specific mutation.” Note that the term “wild-type” used here is a convenient description to distinguish it from a "mutant,” and is not limited to those obtained in nature, as long as they do not have a "specific mutation.” A “specific mutation” will be described later.
  • a wild-type phoS gene is the phoS gene of coryneform bacteria.
  • Specific examples of the phoS gene of coryneform bacteria include the phoS genes of C. glutamicum YDK010 strain, C. glutamicum ATCC13032 strain, C. glutamicum ATCC14067 strain, C. callunae, C. crenatum, and C. efficiens.
  • the nucleotide sequence of the phoS gene of C. glutamicum YDK010 strain is shown in SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequences of the wild-type PhoS proteins encoded by these phoS genes are shown in SEQ ID NOs:2 to 7, respectively.
  • the wild-type phoS gene may be a variant of the wild-type phoS gene exemplified above, so long as it does not have a "specific mutation” and maintains its original function.
  • the wild-type PhoS protein may be a variant of the wild-type PhoS protein exemplified above, so long as it does not have a "specific mutation” and maintains its original function.
  • the term "wild-type phoS gene” is not limited to the wild-type phoS gene exemplified above, but includes its conservative variants that do not have a "specific mutation".
  • wild-type PhoS protein is not limited to the wild-type PhoS protein exemplified above, but includes its conservative variants that do not have a "specific mutation".
  • wild-type PhoS protein and variants of the wild-type phoS gene the above description of the Mdh protein and conservative variants of the mdh gene can be applied mutatis mutandis.
  • the wild-type phoS gene may be a gene that encodes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids at one or several positions in the above amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, and/or added, so long as it does not have a "specific mutation" and the original function is maintained.
  • the wild-type phoS gene may be a gene that encodes a protein having an amino acid sequence that has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more identity to the entire above amino acid sequence, so long as it does not have a "specific mutation" and the original function is maintained.
  • maintaining the original function may mean that, in the case of a wild-type PhoS protein, the variant of the protein has the function of a PhoS protein (for example, the function of a protein consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7). Also, “maintaining the original function” may mean that, in the case of a wild-type PhoS protein, the variant of the protein has the function of a sensor kinase of the PhoRS system. That is, the "function as a PhoS protein” may specifically mean the function of a sensor kinase of the PhoRS system.
  • the "function as a sensor kinase of the PhoRS system” may specifically mean the function of conjugating with the PhoR protein, which is a response regulator, to trigger a response to phosphate deficiency in the environment.
  • the “function as a sensor kinase of the PhoRS system” may more specifically mean the function of sensing phosphate deficiency in the environment, being autophosphorylated, and activating the PhoR protein by phosphoryl transfer.
  • PhoS protein variant functions as a sensor kinase for the PhoRS system can be confirmed, for example, by introducing a gene encoding the variant into a phoS gene-deficient strain of a coryneform bacterium and confirming whether or not the responsiveness to phosphate deficiency is complemented. Complementation of the responsiveness to phosphate deficiency can be detected, for example, as an improvement in growth under phosphate-deficient conditions, or as induction of expression of a gene known to be induced under phosphate-deficient conditions (J. Bacteriol., 188, 724-732 (2006)).
  • phoS gene-deficient strains of coryneform bacteria examples include a phoS gene-deficient strain of C. glutamicum YDK010 and a phoS gene-deficient strain of C. glutamicum ATCC13032.
  • the histidine residue that is autophosphorylated is conserved. That is, it is preferable that the conservative mutation occurs in an amino acid residue other than the histidine residue that is autophosphorylated.
  • the "histidine residue that is autophosphorylated” refers to the histidine residue at position 276 of the wild-type PhoS protein.
  • the wild-type PhoS protein has a conserved sequence of, for example, the wild-type PhoS protein exemplified above. That is, it is preferable that the conservative mutation occurs in an amino acid residue that is not conserved in, for example, the wild-type PhoS protein exemplified above.
  • the mutant PhoS protein has a "specific mutation" in the amino acid sequence of the wild-type PhoS protein as described above.
  • the mutant PhoS protein may be identical to the wild-type PhoS protein or its conservative variant exemplified above, except for the "specific mutation".
  • the mutant PhoS protein may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 to 7, except for the "specific mutation”.
  • the mutant PhoS protein may be a protein having an amino acid sequence including one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, and/or additions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 to 7, except for the "specific mutation".
  • the mutant PhoS protein may be a protein having an amino acid sequence that has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 to 7, except for the "specific mutation".
  • the mutant PhoS protein may be a variant of the wild-type PhoS protein exemplified above that has a "specific mutation” and further includes a conservative mutation at a position other than the "specific mutation.”
  • the mutant PhoS protein may be a protein having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 7 that has a "specific mutation” and further includes one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, and/or additions at a position other than the "specific mutation.”
  • the mutant phoS gene is not particularly limited, as long as it encodes a mutant PhoS protein as described above.
  • the "specific mutation” is not particularly limited as long as it changes the amino acid sequence of the wild-type PhoS protein as described above and is effective for the secretory production of a heterologous protein.
  • the "specific mutation” is preferably a mutation that improves the secretion production amount of a heterologous protein.
  • "Improvement of the secretion production amount of a heterologous protein” means that a coryneform bacterium (modified strain) modified to have a mutant phoS gene can secrete and produce a greater amount of a heterologous protein than a non-modified strain.
  • the "non-modified strain” refers to a control strain that does not have a mutation in the phoS gene, i.e., a control strain that does not have a mutant phoS gene, and may be, for example, a wild-type strain or a parent strain.
  • secretion production of a greater amount of a heterologous protein than a non-modified strain is not particularly limited as long as the secretion production amount of the heterologous protein is increased compared to a non-modified strain, but may mean, for example, secretion production of an amount of a heterologous protein that is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more, even more preferably 1.3 times or more, even more preferably 2 times or more, and particularly preferably 5 times or more, of the non-modified strain in terms of the amount accumulated in the medium and/or on the cell surface.
  • "secreting and producing a greater amount of a heterologous protein than a non-modified strain” may mean that the heterologous protein cannot be detected when the unconcentrated culture supernatant of the non-modified strain is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB, but the heterologous protein can be detected when the unconcentrated culture supernatant of the modified strain is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB.
  • “improving the secretory production amount of a heterologous protein” does not necessarily mean improving the secretory production amount of all heterologous proteins, but it is sufficient to improve the secretory production amount of the heterologous protein set as the target for secretory production.
  • “Improving the secretory production amount of a heterologous protein” may specifically mean, for example, improving the secretory production amount of the heterologous protein described in the Examples.
  • Whether or not a certain mutation improves the secretion production of a heterologous protein can be confirmed, for example, by preparing a strain based on a strain belonging to the coryneform bacteria that has been modified to have a gene encoding a PhoS protein having the mutation, quantifying the amount of the heterologous protein secreted when the modified strain is cultured in a medium, and comparing this with the amount of the heterologous protein secreted when the unmodified strain (unmodified strain) is cultured in a medium.
  • the preferred change in amino acid sequence is the substitution of an amino acid residue.
  • the "specific mutation” is preferably a substitution of any amino acid residue in the wild-type PhoS protein with another amino acid residue.
  • the amino acid residue substituted by the "specific mutation” may be one residue, or a combination of two or more residues.
  • the amino acid residue substituted by the "specific mutation” may preferably be an amino acid residue other than the histidine residue that is autophosphorylated.
  • the amino acid residue substituted by the "specific mutation” may more preferably be an amino acid residue in the HisKA domain other than the histidine residue that is autophosphorylated.
  • the "histidine residue that is autophosphorylated” refers to the histidine residue at position 276 of the wild-type PhoS protein.
  • the "HisKA domain” refers to the region consisting of amino acid residues at positions 266 to 330 of the wild-type PhoS protein.
  • the amino acid residue substituted by the "specific mutation” may particularly preferably be the tryptophan residue at position 302 (W302) of the wild-type PhoS protein.
  • the substituted amino acid residues include those other than the original amino acid residues among K (Lys), R (Arg), H (His), A (Ala), V (Val), L (Leu), I (Ile), G (Gly), S (Ser), T (Thr), P (Pro), F (Phe), W (Trp), Y (Tyr), C (Cys), M (Met), D (Asp), E (Glu), N (Asn), and Q (Gln).
  • the substituted amino acid residue can be selected, for example, to improve the secretion production of the heterologous protein.
  • amino acid residue after substitution can be an aromatic amino acid or an amino acid residue other than histidine.
  • amino acid residues other than aromatic amino acids and histidine include K (Lys), R (Arg), A (Ala), V (Val), L (Leu), I (Ile), G (Gly), S (Ser), T (Thr), P (Pro), C (Cys), M (Met), D (Asp), E (Glu), N (Asn), and Q (Gln).
  • amino acid residues other than aromatic amino acids and histidine include K (Lys), A (Ala), V (Val), S (Ser), C (Cys), M (Met), D (Asp), and N (Asn).
  • a "specific mutation” in the phoS gene refers to a mutation in the base sequence that causes the above-mentioned "specific mutation” in the encoded PhoS protein.
  • amino acid residue at position X of the wild-type PhoS protein refers to the amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position X of SEQ ID NO: 2.
  • W302 refers to the amino acid residue corresponding to the tryptophan residue at position 302 of SEQ ID NO: 2.
  • the positions of the above amino acid residues indicate relative positions, and their absolute positions may change due to deletion, insertion, addition, etc. of amino acids.
  • a wild-type PhoS protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the original amino acid residue at position X becomes the amino acid residue at position X-1 or X+1, respectively, counting from the N-terminus, but is considered to be the "amino acid residue at position X of the wild-type PhoS protein".
  • W302 refers to the tryptophan residues at positions 302, 302, 302, 321, 275, and 286, respectively.
  • the "histidine residue at position 276 of the wild-type PhoS protein refers to the histidine residues at positions 276, 276, 276, 295, 249, and 260, respectively.
  • the "region consisting of amino acid residues at positions 266 to 330 of the wild-type PhoS protein (HisKA domain)" refers to the region consisting of amino acid residues at positions 266 to 330, 266 to 330, 266 to 330, 285 to 349, 239 to 303, and 250 to 314, respectively.
  • W302 here is usually a tryptophan residue, but does not have to be a tryptophan residue. In other words, when the wild-type PhoS protein has an amino acid sequence other than the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7, "W302" may not be a tryptophan residue.
  • mutant in which W302 is replaced with a cysteine residue is not limited to mutations in which the tryptophan residue is replaced with a cysteine residue when "W302" is a tryptophan residue, but also includes mutations in which the amino acid residue is replaced with a cysteine residue when "W302” is K (Lys), R (Arg), H (His), A (Ala), V (Val), L (Leu), I (Ile), G (Gly), S (Ser), T (Thr), P (Pro), F (Phe), Y (Tyr), M (Met), D (Asp), E (Glu), N (Asn), or Q (Gln).
  • K Lys
  • R Arg
  • H His
  • A Al
  • L Leu
  • I Ile
  • G Gly
  • S (Ser) S
  • T Thr
  • P Pro
  • F Phe
  • Y (Tyr M (Met), D (Asp), E (Glu), N
  • amino acid sequence of any PhoS protein which amino acid residue corresponds to the amino acid residue at position X in SEQ ID NO:2 can be determined by aligning the amino acid sequence of the PhoS protein with the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. Alignment can be performed, for example, using known gene analysis software. Specific examples of such software include DNASIS manufactured by Hitachi Solutions and GENETYX manufactured by Genetyx (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987).
  • the mutant phoS gene can be obtained, for example, by modifying the wild-type phoS gene so that the encoded PhoS protein has the "specific mutation" described above.
  • the wild-type phoS gene that is the source of the modification can be obtained, for example, by cloning from an organism having a wild-type phoS gene, or by chemical synthesis.
  • the mutant phoS gene can also be obtained without going through the wild-type phoS gene.
  • the mutant phoS gene can be obtained directly by chemical synthesis.
  • the obtained mutant phoS gene can be further modified before use.
  • a desired mutation can be introduced into a desired site in DNA by site-specific mutagenesis.
  • site-specific mutagenesis include a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)) and a method using phages (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • a coryneform bacterium can be modified to have a mutant phoS gene by introducing the mutant phoS gene into the coryneform bacterium.
  • a coryneform bacterium can be modified to have a mutant phoS gene by introducing the above-mentioned "specific mutation" into the phoS gene on the chromosome of the coryneform bacterium.
  • Introduction of a mutation into a gene on a chromosome can be achieved by natural mutation, mutagen treatment, or genetic engineering techniques.
  • the method for introducing the mutant phoS gene into the coryneform bacterium is not particularly limited.
  • the mutant phoS gene may be held in an expressible manner under the control of a promoter that functions in the coryneform bacterium.
  • the promoter may be a promoter derived from the host or a promoter derived from a heterologous species.
  • the promoter may be a promoter specific to the phoS gene or a promoter of another gene.
  • the mutant phoS gene may be present on a vector that replicates autonomously outside the chromosome, such as a plasmid, or may be incorporated into the chromosome.
  • the bacterium of the present invention may have only one copy of the mutant phoS gene, or may have two or more copies.
  • the bacterium of the present invention may have only one type of mutant phoS gene, or may have two or more types of mutant phoS genes.
  • the mutant phoS gene may be introduced in the same manner as the introduction of a gene in a method for increasing gene expression, which will be described later, or the introduction of a gene construct used in the present invention.
  • the bacterium of the present invention may or may not have a wild-type phoS gene, but it is preferable that it does not have one.
  • a coryneform bacterium that does not have a wild-type phoS gene can be obtained by disrupting the wild-type phoS gene on the chromosome.
  • the wild-type phoS gene can be disrupted by known techniques. Specifically, for example, the wild-type phoS gene can be disrupted by deleting part or all of the promoter region and/or coding region of the wild-type phoS gene.
  • the PhoS protein functions in conjunction with the PhoR protein, which is a response regulator, that is, it triggers a response to phosphate deficiency in the environment. Therefore, the bacterium of the present invention has the phoR gene so that the mutant PhoS protein functions.
  • the phoR gene is a gene that encodes the PhoR protein, which is a response regulator of the PhoRS system. "Having the phoR gene” is also referred to as "having the PhoR protein.” Usually, it is sufficient that the PhoR protein inherently possessed by the bacterium of the present invention functions in conjunction with the mutant PhoS protein.
  • an appropriate phoR gene may be introduced into the bacterium of the present invention in addition to or instead of the phoR gene inherently possessed by the bacterium of the present invention.
  • the phoR gene there are no particular limitations on the phoR gene to be introduced, so long as it encodes a PhoR protein that functions in conjunction with the mutant PhoS protein.
  • the phoR gene can be, for example, the phoR gene of coryneform bacteria.
  • Specific examples of the phoR gene of coryneform bacteria include the phoR genes of C. glutamicum YDK010 strain, C. glutamicum ATCC13032 strain, C. glutamicum ATCC14067 strain, C. callunae, C. crenatum, and C. efficiens.
  • the nucleotide sequence of the phoR gene and the amino acid sequence of the PhoR protein of C. glutamicum ATCC13032 strain are shown in SEQ ID NOs: 8 and 9, respectively.
  • the phoR gene may be a variant of the phoR gene exemplified above, so long as the original function is maintained.
  • the PhoR protein may be a variant of the PhoR protein exemplified above, so long as the original function is maintained. That is, the term “phoR gene” includes the phoR gene exemplified above, as well as its conservative variants.
  • the term “PhoR protein” includes the PhoR protein exemplified above, as well as its conservative variants. The above description of the Mdh protein and the conservative variants of the mdh gene can be applied mutatis mutandis to the variants of the PhoR protein and the phoR gene.
  • the phoR gene may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids at one or several positions in the above amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, and/or added, so long as the original function is maintained.
  • the phoR gene may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence that is 80% or more identical to the entire amino acid sequence, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more identical to the entire amino acid sequence, so long as the original function is maintained.
  • “maintaining the original function” may mean that, in the case of the PhoR protein, a variant of the protein has a function as a PhoR protein (for example, a function of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9).
  • “maintaining the original function” may mean that, in the case of the PhoR protein, a variant of the protein has a function as a response regulator of the PhoRS system. That is, the "function as a PhoR protein” may specifically mean a function as a response regulator of the PhoRS system.
  • the "function as a response regulator of the PhoRS system” may specifically mean a function of conjugating with the PhoS protein, which is a sensor kinase, to induce a response to phosphate deficiency in the environment. More specifically, the “function of the PhoRS system as a response regulator” may be a function that is activated by phosphoryl transfer from the autophosphorylated PhoS protein upon sensing phosphate deficiency in the environment, thereby controlling the expression of genes that respond to phosphate deficiency in the environment.
  • a variant of the PhoR protein functions as a response regulator of the PhoRS system can be confirmed, for example, by introducing a gene encoding the variant into a phoR gene-deficient strain of a coryneform bacterium and confirming whether or not the responsiveness to phosphate deficiency is complemented. Complementation of the responsiveness to phosphate deficiency can be detected, for example, as an improvement in growth under phosphate-deficient conditions, or as induction of expression of a gene known to be induced under phosphate-deficient conditions (J. Bacteriol., 188, 724-732 (2006)).
  • Examples of coryneform bacterium strains that can be used are the phoR gene-deficient strain of C. glutamicum YDK010 and the phoR gene-deficient strain of C. glutamicum ATCC13032.
  • the bacterium of the present invention may be one in which the activity of a cell surface protein is reduced. Specifically, the bacterium of the present invention may be one in which the activity of a cell surface protein is reduced compared to a non-modified strain. "Reduction in activity of a cell surface protein” may particularly mean a reduction in the number of molecules of the cell surface protein per cell. The cell surface proteins and the genes encoding them are described below.
  • Cell surface proteins are proteins that make up the cell surface (S-layer) of bacteria and archaea.
  • Examples of cell surface proteins of coryneform bacteria include PS1 and PS2 (CspB) of C. glutamicum (JP Patent Publication 6-502548) and SlpA (CspA) of C. stationis (JP Patent Publication 10-108675). Of these, it is preferable to reduce the activity of the PS2 protein.
  • the nucleotide sequence of the cspB gene of C. glutamicum ATCC13869 and the amino acid sequence of the PS2 protein (CspB protein) encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 10 and 11, respectively.
  • CspB homologues from 28 strains of C. glutamicum have been reported (J Biotechnol., 112, 177-193 (2004)).
  • GenBank accession numbers of these 28 strains of C. glutamicum and their cspB gene homologues in the NCBI database are shown below (the numbers in parentheses indicate the GenBank accession numbers).
  • C. glutamicum ATCC13058 (AY524990) C. glutamicum ATCC13744 (AY524991)
  • glutamicum ATCC14017 AY524993
  • glutamicum ATCC14020 AY525009
  • glutamicum ATCC14067 AY524994
  • glutamicum ATCC14068 (AY525010) C. glutamicum ATCC14747 (AY525011) C. glutamicum ATCC14751 (AY524995) C. glutamicum ATCC14752 (AY524996) C. glutamicum ATCC14915 (AY524997) C. glutamicum ATCC15243 (AY524998) C. glutamicum ATCC15354 (AY524999) C. glutamicum ATCC17965 (AY525000) C. glutamicum ATCC17966 (AY525001) C. glutamicum ATCC19223 (AY525002) C. glutamicum ATCC19240 (AY525012) C. glutamicum ATCC21341 (AY525003) C. glutamicum ATCC21645 (AY525004) C.
  • glutamicum ATCC31808 (AY525013) C. glutamicum ATCC31830 (AY525007) C. glutamicum ATCC31832 (AY525008) C. glutamicum LP-6 (AY525014) C. glutamicum DSM20137 (AY525015) C. glutamicum DSM20598 (AY525016) C. glutamicum DSM46307 (AY525017) C. glutamicum 22220 (AY525005) C. glutamicum 22243 (AY525006)
  • the gene encoding the cell surface protein may be a variant of the gene encoding the cell surface protein exemplified above, so long as the original function is maintained.
  • the cell surface protein may be a variant of the cell surface protein exemplified above, so long as the original function is maintained. That is, for example, the term “cspB gene” includes the cspB gene exemplified above, as well as its conservative variants.
  • the term "CspB protein” includes the CspB protein exemplified above, as well as its conservative variants.
  • the gene encoding the cell surface protein may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids at one or several positions in the above amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, and/or added, so long as the original function is maintained.
  • the gene encoding the cell surface protein may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence that has an identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more to the entire amino acid sequence, so long as the original function is maintained.
  • "the original function is maintained” may mean, for example, that the cell surface protein has a property of increasing the secretion production amount of a heterologous protein when its activity is reduced in a coryneform bacterium compared to a non-modified strain.
  • Non-modified strain refers to a control strain in which the activity of the cell surface protein is not reduced, and may be, for example, a wild-type strain or a parent strain.
  • “Secreting and producing a greater amount of a heterologous protein than a non-modified strain” is not particularly limited as long as the amount of secretion and production of the heterologous protein is increased compared to a non-modified strain, but may mean, for example, secreting and producing an amount of heterologous protein that is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more, even more preferably 1.3 times or more, and particularly preferably 2 times or more of the non-modified strain in terms of the amount accumulated in the medium and/or on the cell surface.
  • "secreting and producing a greater amount of a heterologous protein than a non-modified strain” may also mean that when the culture supernatant of an unconcentrated non-modified strain is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB, the heterologous protein cannot be detected, but when the culture supernatant of an unconcentrated modified strain is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB, the heterologous protein can be detected.
  • Whether or not a certain protein has the property of increasing the amount of secreted heterologous protein produced when its activity is reduced in a coryneform bacterium compared to a non-modified strain can be confirmed by preparing a strain based on a strain belonging to coryneform bacteria that has been modified to reduce the activity of the protein, quantifying the amount of the heterologous protein secreted when the modified strain is cultured in a medium, and comparing this with the amount of the heterologous protein secreted when the unmodified strain (non-modified strain) is cultured in a medium.
  • the activity of a cell surface protein is reduced includes cases where the coryneform bacterium has been modified to reduce the activity of the cell surface protein, and cases where the activity of the cell surface protein is originally reduced in the coryneform bacterium.
  • "When the activity of a cell surface protein is originally reduced in the coryneform bacterium” includes cases where the coryneform bacterium does not originally have a cell surface protein. That is, an example of a coryneform bacterium with reduced activity of a cell surface protein is a coryneform bacterium that does not originally have a cell surface protein.
  • coryneform bacterium does not originally have a cell surface protein
  • the coryneform bacterium does not originally have a gene that codes for a cell surface protein.
  • the coryneform bacterium does not originally have a cell surface protein may mean that the coryneform bacterium does not originally have one or more proteins selected from the cell surface proteins found in other strains of the species to which the coryneform bacterium belongs.
  • C. glutamicum does not naturally have cell surface proteins may mean that the C. glutamicum strain does not naturally have one or more proteins selected from cell surface proteins found in other C.
  • glutamicum strains i.e., PS1 and/or PS2 (CspB).
  • CspB An example of a coryneform bacterium that does not naturally have cell surface proteins is C. glutamicum ATCC 13032, which does not naturally have the cspB gene.
  • the bacterium of the present invention has a protein secretion system.
  • the protein secretion system is not particularly limited as long as it can secrete the heterologous protein of interest.
  • Examples of the protein secretion system include the Sec system (Sec secretion apparatus) and the Tat system (Tat secretion apparatus).
  • the bacterium of the present invention may have an enhanced protein secretion system.
  • the bacterium of the present invention may be modified so that the expression of one or more genes selected from genes encoding the Tat secretion apparatus is increased. In the present invention, such a modification is also referred to as "enhancement of the Tat secretion apparatus". Enhancement of the Tat secretion apparatus is particularly suitable for secreting and producing a heterologous protein using a Tat-dependent signal peptide.
  • a method for increasing the expression of genes encoding the Tat secretion apparatus is described in Japanese Patent No. 4730302.
  • Genes that code for the Tat system secretion apparatus include the tatA gene, the tatB gene, the tatC gene, and the tatE gene.
  • genes encoding the Tat system secretion apparatus include the tatA, tatB, and tatC genes of C. glutamicum.
  • the tatA, tatB, and tatC genes of C. glutamicum ATCC 13032 correspond to the complementary sequences of the sequences from positions 1571065 to 1571382, 1167110 to 1167580, and 1569929 to 1570873, respectively, in the genome sequence registered in the NCBI database as GenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263).
  • the TatA, TatB, and TatC proteins of C are examples of C.
  • the nucleotide sequences of the tatA gene, tatB gene, and tatC gene of C. glutamicum ATCC 13032 and the amino acid sequences of the TatA protein, TatB protein, and TatC protein are shown in SEQ ID NOs: 12 to 17.
  • genes encoding the Tat system secretion apparatus include the tatA, tatB, tatC, and tatE genes of E. coli.
  • the tatA, tatB, tatC, and tatE genes of E. coli K-12 MG1655 correspond to the sequences at positions 4019968-4020237, 4020241-4020756, 4020759-4021535, and 658170-658373, respectively, in the genome sequence registered in the NCBI database as GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990).
  • the gene encoding the Tat system secretion apparatus may be a variant of the gene encoding the Tat system secretion apparatus exemplified above, so long as the original function is maintained.
  • the Tat system secretion apparatus may be a variant of the Tat system secretion apparatus exemplified above, so long as the original function is maintained. That is, for example, the terms "tatA gene”, “tatB gene”, “tatC gene”, and “tatE gene” include the tatA gene, tatB gene, tatC gene, and tatE gene exemplified above, as well as conservative variants thereof.
  • TatA protein examples include the TatA protein, TatB protein, TatC protein, and TatE protein exemplified above, as well as conservative variants thereof.
  • the gene encoding the Tat system secretion apparatus may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids at one or several positions in the above amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, and/or added, so long as the original function is maintained.
  • the gene encoding the Tat system secretion apparatus may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence that has an identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more to the entire amino acid sequence, so long as the original function is maintained.
  • “maintaining the original function” may mean, in the case of the Tat system secretion apparatus, that the protein has a function of secreting a protein to which a Tat system-dependent signal peptide has been added at the N-terminus outside the cell.
  • Methods for reducing protein activity Methods for reducing the activity of proteins such as Mdh proteins are described below.
  • the methods for reducing protein activity described below can also be used to disrupt the wild-type PhoS protein.
  • Non-modified strain here means a control strain that has not been modified to reduce the activity of the target protein. Examples of non-modified strains include wild-type strains and parent strains. Examples of non-modified strains include type strains of each bacterial species. Examples of non-modified strains include the strains exemplified in the explanation of coryneform bacteria.
  • the activity of the protein may be reduced compared to a type strain (i.e., a type strain of the species to which the bacterium of the present invention belongs).
  • the activity of the protein may be reduced compared to C. glutamicum ATCC 13032.
  • the activity of the protein may be reduced compared to C. glutamicum ATCC 13869.
  • the activity of the protein may be decreased compared to C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734).
  • the activity of the protein may be decreased compared to C. glutamicum YDK010 strain.
  • the term "decreased activity of a protein" also includes a case where the activity of the protein is completely lost.
  • the term “decreased activity of a protein” may mean a decrease in the number of molecules of the protein per cell and/or a decrease in the function of the protein per molecule compared to a non-modified strain. That is, the "activity" in the term “decreased activity of a protein” is not limited to the catalytic activity of the protein, but may also mean the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein.
  • the term “number of molecules of a protein per cell” may mean the average number of molecules of the protein per cell.
  • the term “decreased number of molecules of a protein per cell” also includes a case where the protein is completely absent.
  • the function per molecule of a protein is reduced also includes the case where the function per molecule of the protein is completely lost.
  • the degree of reduction in protein activity is not particularly limited as long as the activity of the protein is reduced compared to that of a non-modified strain.
  • the activity of the protein may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of that of a non-modified strain.
  • a modification that reduces the activity of a protein can be achieved, for example, by reducing the expression of the gene that codes for the protein.
  • “Reduced gene expression” means that the expression of the gene is reduced compared to an unmodified strain.
  • “Reduced gene expression” specifically means that the expression level of the gene per cell is reduced compared to an unmodified strain.
  • “Expression level of the gene per cell” may mean the average expression level of the gene per cell.
  • “Reduced gene expression” may more specifically mean that the transcription level (mRNA level) of the gene is reduced and/or the translation level (protein level) of the gene is reduced.
  • “Reduced gene expression” also includes cases where the gene is not expressed at all.
  • “Reduced gene expression” is also referred to as "weakened gene expression.” Gene expression may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of that of an unmodified strain.
  • the reduction in gene expression may be due to, for example, a reduction in transcription efficiency, a reduction in translation efficiency, or a combination of these.
  • the reduction in gene expression can be achieved, for example, by modifying the expression regulatory sequence of the gene.
  • the "expression regulatory sequence" is a general term for sites that affect gene expression, such as promoters, Shine-Dalgarno (SD) sequences (also called ribosome binding sites (RBS)), and spacer regions between the RBS and the start codon.
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding sites
  • the expression regulatory sequence can be determined, for example, using a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX.
  • the expression regulatory sequence is modified preferably by one or more bases, more preferably two or more bases, and particularly preferably three or more bases.
  • the reduction in gene transcription efficiency can be achieved, for example, by replacing the promoter of a gene on a chromosome with a weaker promoter.
  • the "weaker promoter” means a promoter that weakens the transcription of a gene compared to the wild-type promoter that is originally present.
  • An example of a weaker promoter is an inducible promoter. That is, an inducible promoter can function as a weaker promoter under non-inducing conditions (e.g., in the absence of an inducer). A part or all of the expression regulatory sequence may be deleted (deleted).
  • a reduction in gene expression can also be achieved, for example, by manipulating factors involved in expression control.
  • Factors involved in expression control include small molecules (inducers, inhibitors, etc.), proteins (transcription factors, etc.), and nucleic acids (siRNA, etc.) involved in transcription and translation control.
  • a reduction in gene expression can also be achieved, for example, by introducing a mutation into the coding region of the gene that reduces the expression of the gene.
  • the expression of the gene can be reduced by replacing the codons in the coding region of the gene with synonymous codons that are used less frequently in the host.
  • the expression of the gene itself can be reduced by disrupting the gene as described below.
  • Modifications that reduce the activity of a protein can be achieved, for example, by disrupting the gene that codes for the protein. "The gene is disrupted” means that the gene is modified so that it does not produce a protein that functions normally. "Does not produce a protein that functions normally” includes cases where no protein is produced from the gene, and cases where the gene produces a protein with reduced or lost function (e.g. activity or properties) per molecule.
  • the destruction of a gene can be achieved, for example, by deleting (deleting) the gene on a chromosome.
  • Gene deletion refers to the deletion of a part or the entire region of the coding region of a gene.
  • the entire gene may be deleted, including the sequences before and after the coding region of the gene on the chromosome.
  • the sequences before and after the coding region of the gene may include, for example, a gene expression regulatory sequence.
  • the region to be deleted may be any region, such as the N-terminal region (the region that codes for the N-terminal side of the protein), an internal region, or a C-terminal region (the region that codes for the C-terminal side of the protein).
  • the region to be deleted may be, for example, a region that is 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more in length of the entire coding region of the gene.
  • the sequences before and after the region to be deleted do not have the same reading frame. Reading frame mismatches can result in frameshifts downstream of the region to be deleted.
  • Gene disruption can also be achieved, for example, by introducing an amino acid substitution (missense mutation) into the coding region of a gene on a chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), or adding or deleting one or two bases (frameshift mutation) (Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)).
  • Gene disruption can also be achieved, for example, by inserting another base sequence into the coding region of the gene on a chromosome.
  • the insertion site may be in any region of the gene, but the longer the inserted base sequence, the more reliably the gene can be inactivated. It is also preferable that the sequences before and after the insertion site do not match in reading frame. A mismatch in reading frame can cause a frameshift downstream of the insertion site.
  • the destruction of a gene may be carried out so that the amino acid sequence of the encoded protein is deleted (missing).
  • a modification that reduces the activity of a protein can be achieved, for example, by deleting the amino acid sequence of the protein (a part or all of the region of the amino acid sequence), specifically by modifying the gene so that the gene encodes a protein from which the amino acid sequence (a part or all of the region of the amino acid sequence) is deleted.
  • deletion of the amino acid sequence of a protein refers to the deletion of a part or all of the region of the amino acid sequence of a protein.
  • deletion of the amino acid sequence of a protein refers to the disappearance of the original amino acid sequence in the protein, and also includes the case where the original amino acid sequence is changed to a different amino acid sequence. That is, for example, a region that has been changed to a different amino acid sequence by a frameshift may be considered as a deleted region.
  • deletion of the amino acid sequence of a protein typically shortens the full length of the protein, there may be cases where the full length of the protein does not change or is extended. For example, the deletion of a part or all of the region of the coding region of a gene can delete the region coded by the deleted region in the amino acid sequence of the encoded protein.
  • the region coded by the region downstream of the introduction site in the amino acid sequence of the encoded protein can be deleted.
  • the region coded by the frameshift site can be deleted.
  • the position and length of the region deleted in the deletion of an amino acid sequence can be determined mutatis mutandis from the explanation of the position and length of the region deleted in the deletion of a gene.
  • Mdh protein for example, at least 1, 3, 5, 7, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 residues may be deleted from the C-terminus of the amino acid sequence. In the case of Mdh protein, particularly, at least 16 residues from the C-terminus of the amino acid sequence may be deleted.
  • the amino acid sequence from positions 313 to 328 of SEQ ID NO: 40 is the "16 residues at the C-terminus".
  • Mdh protein for example, at least a portion of the amino acid sequence of Mdh protein that corresponds to the above-mentioned C-terminus portion of SEQ ID NO: 40 (for example, the 16 residues at the C-terminus) may be deleted.
  • the position of the "portion corresponding to the above-mentioned C-terminus portion of SEQ ID NO: 40" in any Mdh protein the above explanation regarding the position of the "amino acid residue at position X of wild-type PhoS protein" can be applied mutatis mutandis.
  • the above-mentioned modification of a gene on a chromosome can be achieved, for example, by creating a disrupted gene modified so that it does not produce a protein that functions normally, transforming a host with recombinant DNA containing the disrupted gene, and causing homologous recombination between the disrupted gene and the wild-type gene on the chromosome, thereby replacing the wild-type gene on the chromosome with the disrupted gene.
  • it is easier to manipulate the recombinant DNA if it contains a marker gene according to the host's characteristics such as nutritional requirements.
  • disrupted genes include genes in which part or all of the coding region of a gene has been deleted, genes in which a missense mutation has been introduced, genes in which a nonsense mutation has been introduced, genes in which a frameshift mutation has been introduced, and genes in which an insertion sequence such as a transposon or marker gene has been inserted.
  • a missense mutation has been introduced
  • genes in which a nonsense mutation has been introduced
  • genes in which a frameshift mutation has been introduced
  • an insertion sequence such as a transposon or marker gene has been inserted.
  • a host can be transformed with a linear DNA containing a disrupted gene, with the linear DNA having upstream and downstream sequences of the wild-type gene on the chromosome at both ends, and homologous recombination can be caused upstream and downstream of the wild-type gene, respectively, to replace the wild-type gene with the disrupted gene in one step.
  • homologous recombination can be caused upstream and downstream of the wild-type gene, respectively, to replace the wild-type gene with the disrupted gene in one step.
  • a protein encoded by the disrupted gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein, and its function is reduced or lost.
  • Such gene disruption by gene replacement using homologous recombination has already been established, and there are several methods known as "Red-driven integration" (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc.
  • Red-driven integration method and a ⁇ phage-derived excision system include a method using linear DNA, such as a combination of a method using a plasmid with a temperature-sensitive replication origin and a method using a plasmid capable of conjugation transfer, and a method using a suicide vector that does not have a replication origin that functions in the host (U.S. Pat. No. 6,303,383, JP 05-007491 A).
  • chromosome modification techniques using homologous recombination are not limited to the destruction of target genes, and can be used for any modification of chromosomes, such as modification of expression regulatory sequences.
  • Modifications that reduce the activity of a protein may also be performed, for example, by mutation treatment.
  • mutation treatments include irradiation with X-rays, irradiation with ultraviolet light, and treatment with mutagens such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methanesulfonate (EMS), and methyl methanesulfonate (MMS).
  • MNNG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • MMS methyl methanesulfonate
  • the decrease in protein activity can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the decrease in protein activity can also be confirmed by confirming the decrease in expression of the gene that codes for the protein.
  • the decrease in gene expression can be confirmed by confirming the decrease in the transcription level of the gene or the decrease in the amount of protein expressed from the gene.
  • the reduced amount of gene transcription can be confirmed by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with that of a non-modified strain.
  • Methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, microarrays, and RNA-Seq (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
  • the amount of mRNA may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of that of a non-modified strain.
  • the reduction in the amount of protein can be confirmed by performing SDS-PAGE and checking the intensity of the separated protein bands.
  • the reduction in the amount of protein can also be confirmed by Western blotting using antibodies (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
  • the amount of protein (e.g., number of molecules per cell) may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of that of the unmodified strain.
  • gene disruption can be confirmed by determining the base sequence, restriction enzyme map, or full length of part or all of the gene.
  • the above-mentioned methods for reducing protein activity can be used to reduce the activity of any protein or the expression of any gene.
  • “Gene expression is increased” means that the expression of the gene is increased compared to a non-modified strain.
  • Gene expression is increased specifically means that the expression level of the gene per cell is increased compared to a non-modified strain.
  • “Non-modified strain” here means a control strain that has not been modified to increase the expression of the target gene. Examples of non-modified strains include wild-type strains and parent strains. Examples of non-modified strains specifically include type strains of each bacterial species. Examples of non-modified strains specifically include the strains exemplified in the explanation of coryneform bacteria.
  • gene expression may be increased compared to a type strain (i.e., a type strain of the species to which the bacterium of the present invention belongs).
  • gene expression may be increased compared to C. glutamicum ATCC 13032.
  • gene expression may be increased compared to C. glutamicum ATCC 13869.
  • the expression of the gene may be increased compared to C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734).
  • the expression of the gene may be increased compared to C. glutamicum YDK010 strain.
  • "Expression amount of a gene per cell” may mean the average expression amount of the gene per cell.
  • “Increased gene expression” may mean, more specifically, that the transcription amount (mRNA amount) of the gene increases and/or the translation amount (protein amount) of the gene increases. "Increased gene expression” is also referred to as “enhanced gene expression.” The degree of increase in gene expression is not particularly limited as long as the expression of the gene is increased compared to the unmodified strain. The expression of the gene may be increased preferably by 1.5 times or more, more preferably by 2 times or more, and even more preferably by 3 times or more, compared to the unmodified strain. Furthermore, “increasing gene expression” includes not only increasing the expression level of a target gene in a strain in which the gene is originally expressed, but also expressing the gene in a strain in which the gene is not originally expressed. In other words, “increasing gene expression” also includes, for example, introducing the gene into a strain that does not harbor the target gene and expressing the gene.
  • Increased gene expression can be achieved, for example, by increasing the copy number of the gene.
  • the copy number of a gene can be increased by introducing the gene into a host chromosome.
  • Introduction of a gene into a chromosome can be achieved, for example, by homologous recombination (Miller I, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • Examples of gene introduction methods that utilize homologous recombination include a method using linear DNA such as Red-driven integration (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
  • a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin a method using a conjugatively transferable plasmid, a method using a suicide vector that does not have a replication origin that functions in the host, and a transduction method using a phage.
  • a host is transformed with recombinant DNA containing a target gene, and homologous recombination occurs with a target site on the host chromosome, thereby introducing the gene into the host chromosome.
  • the structure of the recombinant DNA used for homologous recombination is not particularly limited as long as it allows homologous recombination to occur in a desired manner.
  • a host is transformed with linear DNA containing a target gene, and the linear DNA has sequences upstream and downstream of the target site on the chromosome at both ends of the gene, respectively, and homologous recombination occurs upstream and downstream of the target site, respectively, thereby replacing the target site with the gene.
  • the recombinant DNA used for homologous recombination may have a marker gene for selecting a transformant. Only one copy of the gene may be introduced, or two or more copies may be introduced. For example, multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a base sequence that has multiple copies on a chromosome as a target.
  • base sequences that have multiple copies on a chromosome include repetitive DNA sequences and inverted repeats that exist at both ends of a transposon. Homologous recombination may also be performed by targeting an appropriate base sequence on a chromosome, such as a gene that is not necessary for the production of a target substance. Genes can also be randomly introduced into a chromosome using transposons or Mini-Mu (JP Patent Publication 2-109985, US Pat. No. 5,882,888, EP0805867B1). Artificial transposons may also be used as transposons (JP Patent Publication 9-70291). Such chromosome modification techniques using homologous recombination are not limited to the introduction of target genes, and can be used for any modification of chromosomes, such as modification of expression regulatory sequences.
  • the introduction of the target gene into the chromosome can be confirmed by Southern hybridization using a probe with a sequence complementary to all or part of the gene, or by PCR using primers created based on the sequence of the gene.
  • the copy number of a gene can also be increased by introducing a vector containing the gene into a host.
  • a DNA fragment containing a target gene can be linked to a vector that functions in a host to construct an expression vector for the gene, and the host can be transformed with the expression vector to increase the copy number of the gene.
  • a DNA fragment containing a target gene can be obtained, for example, by PCR using the genomic DNA of a microorganism having the target gene as a template.
  • a vector capable of autonomously replicating in the host cell can be used as the vector.
  • the vector is preferably a multicopy vector.
  • the vector preferably has a marker such as an antibiotic resistance gene.
  • the vector may also have a promoter or terminator for expressing the inserted gene.
  • the vector may be, for example, a bacterial plasmid-derived vector, a yeast plasmid-derived vector, a bacteriophage-derived vector, a cosmid, or a phagemid.
  • Specific examples of vectors capable of autonomous replication in coryneform bacteria include pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); and plasmids having drug resistance genes improved from these, pCRY30 (JP Patent Publication No.
  • pVK7 JP Patent Publication No. 10-215883
  • pVK9 US2006-0141588
  • pVC7 JP Patent Publication No. 9-070291
  • pVS7 WO2013/069634
  • promoter that functions in the host.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous promoter.
  • the promoter may be a promoter specific to the gene to be introduced or a promoter of another gene.
  • a promoter that functions in coryneform bacteria as described below, can be used.
  • a terminator for terminating transcription can be placed downstream of the gene.
  • the terminator may be a terminator derived from the host or a terminator derived from a heterologous species.
  • the terminator may be a terminator inherent to the gene to be introduced or a terminator from another gene.
  • each gene When introducing two or more genes, each gene only needs to be retained in the host in an expressible state.
  • the genes may all be retained on a single expression vector, or all may be retained on a chromosome.
  • the genes may also be retained separately on multiple expression vectors, or may be retained separately on a single or multiple expression vectors and on a chromosome. Two or more genes may also be introduced as an operon.
  • the gene to be introduced is not particularly limited as long as it encodes a protein that functions in the host.
  • the gene to be introduced may be a gene derived from the host or a gene derived from a heterologous species.
  • the gene to be introduced may be obtained by PCR, for example, using primers designed based on the base sequence of the gene and a template such as the genomic DNA of an organism having the gene or a plasmid carrying the gene.
  • the gene to be introduced may also be totally synthesized, for example, based on the base sequence of the gene (Gene, 60(1), 115-127 (1987)).
  • the obtained gene may be used as is or after appropriate modification. That is, by modifying the gene, its variant may be obtained. Gene modification may be performed by known techniques.
  • a desired mutation may be introduced into a desired site of DNA by site-directed mutagenesis. That is, for example, a coding region of a gene may be modified by site-directed mutagenesis so that the encoded protein contains substitution, deletion, insertion, and/or addition of amino acid residues at a specific site.
  • Site-directed mutagenesis techniques include PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)) and phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • gene variants can be synthesized in their entirety.
  • Increased gene expression can be achieved by improving gene transcription efficiency.
  • Increasing gene expression can be achieved by improving gene translation efficiency.
  • Gene transcription efficiency and translation efficiency can be improved, for example, by modifying expression regulatory sequences.
  • "Expression regulatory sequence” is a general term for a site that affects gene expression. Examples of expression regulatory sequences include promoters, Shine-Dalgarno (SD) sequences (also called ribosome binding sites (RBS)), and spacer regions between the RBS and the start codon.
  • Expression regulatory sequences can be determined using promoter search vectors or gene analysis software such as GENETYX. These expression regulatory sequences can be modified, for example, by using homologous recombination. Modification techniques using homologous recombination include a method using a temperature-sensitive vector and the Red-driven integration method (WO2005/010175).
  • the transcription efficiency of a gene can be improved, for example, by replacing the promoter of the gene on the chromosome with a stronger promoter.
  • a "stronger promoter” means a promoter that enhances the transcription of the gene more than the wild-type promoter that is originally present. Examples of stronger promoters that can be used in coryneform bacteria include the artificially engineered P54-6 promoter (Appl. Microbiol.
  • the pta, aceA, aceB, adh, and amyE promoters that can be induced in coryneform bacteria by acetate, ethanol, pyruvate, etc.
  • the cspB, SOD, and tuf (EF-Tu) promoters which are strong promoters that are highly expressed in coryneform bacteria (Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.)
  • the lac promoter, the tac promoter, and the trc promoter the lac promoter, the tac promoter, and the trc promoter.
  • a highly active version of a conventional promoter may be obtained by using various reporter genes.
  • promoter activity can be increased by making the -35 and -10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (WO 00/18935).
  • highly active promoters include various tac-like promoters (Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574). Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al.'s paper (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)).
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • Improvement of gene translation efficiency can also be achieved, for example, by modifying codons.
  • the efficiency of gene translation can be improved by replacing rare codons present in the gene with synonymous codons that are used more frequently. That is, the gene to be introduced may be modified to have optimal codons depending on the codon usage frequency of the host to be used. Codon replacement can be performed, for example, by site-directed mutagenesis. Alternatively, gene fragments with replaced codons may be totally synthesized. The frequency of codon usage in various organisms is disclosed in the "Codon Usage Database" (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).
  • Increasing gene expression can also be achieved by amplifying regulators that increase gene expression, or by deleting or weakening regulators that decrease gene expression.
  • the method of transformation is not particularly limited, and any conventionally known method can be used.
  • a method of treating recipient cells with calcium chloride to increase DNA permeability as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162), or a method of preparing competent cells from cells in the growth stage and introducing DNA, as reported for Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1977. Gene 1: 153-167), can be used.
  • recombinant DNA can be introduced into the recipient bacteria by preparing the recipient cells in a protoplast or spheroplast state that readily takes up the recombinant DNA, as is known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeasts (Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933).
  • transformation of coryneform bacteria can be carried out by, for example, the protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985)), the electroporation method (Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)), the electric pulse method (JP Patent Publication 2-207791), etc.
  • Increased gene expression can be confirmed, for example, by confirming increased activity of the protein expressed from the gene. Increased protein activity can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • increased activity of the Tat secretion apparatus can be confirmed, for example, by confirming an increase in the secretory production of a protein having a Tat-dependent signal peptide added to its N-terminus.
  • the secretory production of a protein having a Tat-dependent signal peptide added to its N-terminus is increased, for example, by 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more compared to an unmodified strain.
  • increased gene expression can be confirmed, for example, by confirming an increase in the transcription level of the gene or an increase in the amount of protein expressed from the gene.
  • the increase in the transcription level of a gene can be confirmed by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with that of a non-modified strain such as a wild-type strain or a parent strain.
  • Methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, microarray, and RNA-Seq (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
  • the amount of mRNA (e.g., number of molecules per cell) may be increased, for example, by 1.5-fold or more, 2-fold or more, or 3-fold or more compared to that of a non-modified strain.
  • the increase in protein amount can be confirmed by performing SDS-PAGE and checking the intensity of the separated protein bands.
  • the increase in protein amount can also be confirmed by Western blotting using antibodies (Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)).
  • the amount of protein (e.g., number of molecules per cell) may be increased, for example, by 1.5-fold or more, 2-fold or more, or 3-fold or more compared to the unmodified strain.
  • secretory proteins are generally translated as preproteins (also called prepeptides) or preproproteins (also called prepropeptides), and then processed to become mature proteins.
  • secretory proteins are generally translated as preproteins or preproproteins, and then the prepart, a signal peptide, is cleaved by a protease (generally called a signal peptidase) to convert them into mature proteins or proproteins, and the proprotein is further cleaved by a protease to become a mature protein.
  • a signal peptide is used for the secretory production of heterologous proteins.
  • secretory protein precursors the preproteins and preproproteins of secretory proteins are sometimes collectively referred to as "secretory protein precursors".
  • a “signal peptide” also called a “signal sequence” refers to an amino acid sequence that is present at the N-terminus of a secretory protein precursor and is not usually present in a natural mature protein.
  • the gene construct used in the present invention includes, from the 5' to 3' direction, a promoter sequence that functions in coryneform bacteria, a nucleic acid sequence that encodes a signal peptide that functions in coryneform bacteria, and a nucleic acid sequence that encodes a heterologous protein.
  • the nucleic acid sequence that encodes the signal peptide may be linked downstream of the promoter sequence so that the signal peptide is expressed under the control of the promoter.
  • the nucleic acid sequence that encodes the heterologous protein may be linked downstream of the nucleic acid sequence that encodes the signal peptide so that the heterologous protein is expressed as a fusion protein with the signal peptide.
  • the fusion protein is also called the "fusion protein of the present invention.”
  • the signal peptide and the heterologous protein may or may not be adjacent to each other.
  • the heterologous protein is expressed as a fusion protein with the signal peptide is not limited to the case where the heterologous protein is expressed as a fusion protein with the signal peptide adjacent to the signal peptide, but also includes the case where the heterologous protein is expressed as a fusion protein with the signal peptide via another amino acid sequence.
  • the fusion protein of the present invention may include an insertion sequence between the signal peptide and the heterologous protein, such as an amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr or an amino acid sequence used for enzymatic cleavage.
  • the finally obtained heterologous protein does not need to have a signal peptide.
  • the heterologous protein is expressed as a fusion protein with a signal peptide means that the heterologous protein is sufficient to constitute a fusion protein with a signal peptide when expressed, and the finally obtained heterologous protein does not need to constitute a fusion protein with a signal peptide.
  • a promoter sequence is also called a "promoter".
  • a nucleic acid sequence may be read as a "gene”.
  • a nucleic acid sequence encoding a heterologous protein is also called a "gene encoding a heterologous protein” or a "heterologous protein gene”.
  • nucleic acid sequences include DNA.
  • the gene construct used in the present invention may have a control sequence (operator, SD sequence, terminator, etc.) effective for expressing the fusion protein of the present invention in a coryneform bacterium at an appropriate position so that it can function.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it is a promoter that functions in coryneform bacteria.
  • the promoter may be a promoter derived from coryneform bacteria (e.g., derived from a host) or a promoter derived from a heterologous species.
  • the promoter may be a promoter specific to a heterologous protein gene or a promoter of another gene.
  • a "promoter that functions in coryneform bacteria” refers to a promoter that has promoter activity in coryneform bacteria.
  • heterologous promoters include E. coli-derived promoters such as the tac promoter, lac promoter, trp promoter, and araBAD promoter. Among these, strong promoters such as the tac promoter and inducible promoters such as the araBAD promoter are preferred.
  • promoters derived from coryneform bacteria include the promoters of the genes encoding cell surface proteins PS1, PS2 (also known as CspB), and SlpA (also known as CspA), as well as the promoters of various amino acid biosynthetic genes.
  • promoters of various amino acid biosynthesis genes include the glutamate dehydrogenase gene in the glutamate biosynthesis system, the glutamine synthase gene in the glutamine synthesis system, the aspartokinase gene in the lysine biosynthesis system, the homoserine dehydrogenase gene in the threonine biosynthesis system, the acetohydroxy acid synthase gene in the isoleucine and valine biosynthesis system, the 2-isopropylmalate synthase gene in the leucine biosynthesis system, the glutamate kinase gene in the proline and arginine biosynthesis system, the phosphoribosyl-ATP pyrophosphorylase gene in the histidine biosynthesis system, the deoxyarabinoheptulosonate phosphate (DAHP) synthase gene in the aromatic amino acid biosynthesis system such as tryptophan, tyrosine, and phenylalanine, the phosphoribosyl pyrophosphate
  • promoters that function in coryneform bacteria include stronger promoters that can be used in coryneform bacteria, as described above.
  • promoters may be obtained and used in highly active forms of conventional promoters by using various reporter genes. For example, promoter activity can be increased by making the -35 and -10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (International Publication No. 00/18935). Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in a paper by Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)).
  • the signal peptide used in the present invention is not particularly limited as long as it is a signal peptide that functions in coryneform bacteria.
  • the signal peptide may be a signal peptide derived from coryneform bacteria (e.g., derived from a host) or may be a signal peptide derived from a heterologous species.
  • the signal peptide may be a signal peptide inherent to a heterologous protein or a signal peptide of another protein.
  • a "signal peptide that functions in coryneform bacteria” refers to a peptide that, when linked to the N-terminus of a target protein, enables the coryneform bacteria to secrete the protein. Whether a certain signal peptide functions in coryneform bacteria can be confirmed, for example, by fusing the target protein with the signal peptide, expressing the protein, and confirming whether the protein is secreted.
  • Signal peptides include Tat-dependent signal peptides and Sec-dependent signal peptides.
  • Tat system-dependent signal peptide refers to a signal peptide that is recognized by the Tat system.
  • Tat system-dependent signal peptide may be a peptide that, when linked to the N-terminus of a target protein, causes the protein to be secreted by the Tat system secretion apparatus.
  • Tat-dependent signal peptides include the signal peptide of the E. coli TorA protein (trimethylamine-N-oxide reductase), the signal peptide of the E. coli SufI protein (suppressor of ftsI), the signal peptide of the Bacillus subtilis PhoD protein (phosphodiesterase), the signal peptide of the Bacillus subtilis LipA protein (lipoic acid synthase), and the signal peptide of the Arthrobacter globiformis IMD protein (isomaltodextranase).
  • E. coli TorA protein trimethylamine-N-oxide reductase
  • the signal peptide of the E. coli SufI protein secretor of ftsI
  • the signal peptide of the Bacillus subtilis PhoD protein phosphodiesterase
  • the signal peptide of the Bacillus subtilis LipA protein lipoic acid synthase
  • TorA signal peptide MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (SEQ ID NO: 18)
  • SufI signal peptide MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA (SEQ ID NO: 19)
  • PhoD signal peptide MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQS (SEQ ID NO: 20)
  • LipA signal peptide: MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH SEQ ID NO: 21
  • IMD signal peptide MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA (SEQ ID NO: 22)
  • Tat-dependent signal peptides have a twin-arginine motif.
  • twin-arginine motifs include S/T-R-R-X-F-L-K (SEQ ID NO: 23) and R-R-X-#-# (X: naturally occurring amino acid residue, #: hydrophobic amino acid residue).
  • Sec system-dependent signal peptide refers to a signal peptide that is recognized by the Sec system.
  • the term “Sec system-dependent signal peptide” may be a peptide that, when linked to the N-terminus of a target protein, causes the protein to be secreted by the Sec system secretion apparatus.
  • Sec system-dependent signal peptides include, for example, signal peptides of cell surface proteins of coryneform bacteria.
  • the cell surface proteins of coryneform bacteria are as described above.
  • Examples of cell surface proteins of coryneform bacteria include PS1 and PS2 (CspB) derived from C. glutamicum (JP Patent Publication No. 6-502548), and SlpA (CspA) derived from C. stationis (JP Patent Publication No. 10-108675).
  • the amino acid sequence of the signal peptide of PS1 (PS1 signal peptide) of C. glutamicum is shown in SEQ ID NO: 25
  • the amino acid sequence of the signal peptide of PS2 (CspB) (PS2 signal peptide) of C. glutamicum is shown in SEQ ID NO: 26
  • the amino acid sequence of the signal peptide of SlpA (CspA) of C. stationis is shown in SEQ ID NO: 27.
  • the Tat-dependent signal peptide may be a variant of the above-mentioned Tat-dependent signal peptide, so long as it has a twin-arginine motif and maintains its original function.
  • the Sec-dependent signal peptide may be a variant of the above-mentioned Sec-dependent signal peptide, so long as it maintains its original function.
  • the above-mentioned description of the conservative variants of the Mdh protein and mdh gene may be applied mutatis mutandis to the variants of the signal peptide and the gene encoding it.
  • the signal peptide may be a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of the above-mentioned signal peptide is substituted, deleted, inserted, and/or added.
  • the above-mentioned "one or several" in the variant of the signal peptide specifically means preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 to 2.
  • TorA signal peptide “SufI signal peptide,” “PhoD signal peptide,” “LipA signal peptide,” “IMD signal peptide,” “PS1 signal peptide,” “PS2 signal peptide,” and “SlpA signal peptide” are intended to include the peptides set forth in SEQ ID NOs: 18 to 22 and 25 to 27, respectively, as well as conservative variants thereof.
  • "Maintaining the original function" of a Tat system-dependent signal peptide means that it is recognized by the Tat system, and specifically, when linked to the N-terminus of a target protein, it may have the function of secreting the protein by the Tat system secretion apparatus. Whether a peptide functions as a Tat system-dependent signal peptide can be confirmed, for example, by confirming that the secretory production amount of a protein with the peptide added to its N-terminus is increased by enhancing the Tat system secretion apparatus, or by confirming that the secretory production amount of a protein with the peptide added to its N-terminus is decreased by the deficiency of the Tat system secretion apparatus.
  • "Maintaining the original function" of a Sec system-dependent signal peptide means that it is recognized by the Sec system, and specifically, when linked to the N-terminus of a target protein, it may have the function of secreting the protein by the Sec system secretion apparatus. Whether a peptide functions as a Sec system-dependent signal peptide can be confirmed, for example, by confirming that the secretory production amount of a protein with the peptide added to its N-terminus is increased by enhancing the Sec system secretion apparatus, or by confirming that the secretory production amount of a protein with the peptide added to its N-terminus is decreased by a deficiency in the Sec system secretion apparatus.
  • Signal peptides are generally cleaved by signal peptidase when the translation product is secreted outside the bacterial cell. In other words, the heterologous protein finally obtained does not need to have a signal peptide.
  • the gene encoding the signal peptide can be used in its natural form, but it can also be modified to have optimal codons depending on the codon usage frequency of the host used.
  • a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr may be inserted between the nucleic acid sequence encoding the signal peptide and the nucleic acid sequence encoding the heterologous protein (WO2013/062029).
  • the "amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr" is also referred to as the "insertion sequence used in the present invention.”
  • Examples of the insertion sequence used in the present invention include the amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr described in WO2013/062029.
  • the insertion sequence used in the present invention can be preferably used in combination with a Sec-system dependent signal peptide in particular.
  • the insertion sequence used in the present invention is preferably a sequence consisting of three or more amino acid residues from the N-terminus of the mature protein of the cell surface protein CspB of coryneform bacteria (hereinafter also referred to as "mature CspB” or “mature CspB protein”).
  • "A sequence consisting of three or more amino acid residues from the N-terminus” refers to the amino acid sequence from the first amino acid residue at the N-terminus to the third or more amino acid residues.
  • the cell surface protein CspB of coryneform bacteria is as described above.
  • Specific examples of CspB include CspB from C. glutamicum ATCC13869 and the 28 strains of C. glutamicum listed above, as well as variants thereof.
  • the amino acid sequence of CspB from C. glutamicum ATCC13869 shown in SEQ ID NO:11 the amino acid residues at positions 1 to 30 correspond to the signal peptide, and the amino acid residues at positions 31 to 499 correspond to the mature CspB protein.
  • the amino acid sequence of the mature CspB protein from C. glutamicum ATCC13869 excluding the 30 amino acid residues in the signal peptide portion is shown in SEQ ID NO:28.
  • the amino acid residues at positions 1 to 3 at the N-terminus correspond to Gln-Glu-Thr.
  • the insertion sequence used in the present invention is preferably an amino acid sequence extending from the amino acid residue at position 1 to any of the amino acid residues at positions 3 to 50 of mature CspB. It is more preferable that the insertion sequence used in the present invention is an amino acid sequence extending from the amino acid residue at position 1 to any of the amino acid residues at positions 3 to 8, 17, or 50 of mature CspB. It is particularly preferable that the insertion sequence used in the present invention is an amino acid sequence extending from the amino acid residue at position 1 to any of the amino acid residues at positions 4, 6, 17, or 50 of mature CspB.
  • the insertion sequence used in the present invention is preferably an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences A to H below.
  • A Gln-Glu-Thr
  • B Gln-Glu-Thr-Xaa1
  • C Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2
  • D Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3
  • E an amino acid sequence in which amino acid residues at positions 4 to 7 of mature CspB are added to Gln-Glu-Thr
  • E an amino acid sequence in which amino acid residues at positions 4 to 8 of mature CspB are added to Gln-Glu-Thr
  • G an amino acid sequence in which amino acid residues at positions 4 to 17 of mature CspB are added to Gln-Glu-Thr
  • H an amino acid sequence in which amino acid residues at positions 4 to 50 of mature CspB are added to Gln-Glu-Thr.
  • Xaa1 is Asn, Gly, Thr, Pro, or Ala
  • Xaa2 is Pro, Thr, or Val
  • Xaa3 is Thr or Tyr.
  • amino acid residues at positions 4 to X of mature CspB are added to Gln-Glu-Thr means that amino acid residues at positions 4 to X of the N-terminus of mature CspB are added to Thr of Gln-Glu-Thr.
  • the 1st to 3rd amino acid residues at the N-terminus of mature CspB are Gln-Glu-Thr.
  • amino acid sequence in which amino acid residues at positions 4 to X of mature CspB are added to Gln-Glu-Thr is synonymous with the amino acid sequence consisting of amino acid residues at positions 1 to X of mature CspB.
  • the insertion sequence used in the present invention is preferably an amino acid sequence selected from the group consisting of, for example, Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr (SEQ ID NO: 32), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr (SEQ ID NO: 33), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr (SEQ ID NO: 34), Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr (SEQ ID NO: 35), and Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr (SEQ ID NO: 36).
  • amino acid residue at position X of mature CspB means an amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position X in SEQ ID NO:28.
  • which amino acid residue in the amino acid sequence of any mature CspB is "the amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position X in SEQ ID NO:28” can be determined by aligning the amino acid sequence of any mature CspB with the amino acid sequence of SEQ ID NO:28.
  • Heterologous proteins secreted and produced by the method of the present invention include, for example, physiologically active proteins, receptor proteins, antigenic proteins used as vaccines, enzymes, and any other proteins.
  • enzymes include transglutaminase, protein glutaminase, isomaltodextranase, protease, endopeptidase, exopeptidase, aminopeptidase, carboxypeptidase, collagenase, chitinase, etc.
  • transglutaminase examples include secretory transglutaminases from actinomycetes such as Streptoverticillium mobaraense IFO 13819 (WO01/23591), Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, and Streptomyces lydicus (WO9606931), and filamentous fungi such as Oomycetes (WO9622366).
  • An example of a protein glutaminase is protein glutaminase from Chryseobacterium proteolyticum (WO2005/103278).
  • An example of an isomaltodextranase is isomaltodextranase from Arthrobacter globiformis (WO2005/103278).
  • physiologically active proteins include growth factors, hormones, cytokines, and antibody-related molecules.
  • growth factors include epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), transforming growth factor (TGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), vascular endothelial growth factor (VEGF), granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF).
  • EGF epidermal growth factor
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • TGF transforming growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • G-CSF granulocyte-colony stimulating factor
  • G-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • GM-CSF yte-macrophage-colony stimulating factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • EPO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • aFGF or FGF1 acidic fibroblast growth factor
  • bFGF or FGF2 basic fibroblast growth factor
  • KGF-1 or FGF7 keratinocyte growth factor
  • KGF-2 or FGF10 hepatocyte growth factor
  • hormones include insulin, glucagon, somatostatin, human growth hormone (hGH), parathyroid hormone (PTH), calcitonin, and exenatide.
  • cytokines include interleukins, interferons, and tumor necrosis factors (TNFs).
  • TNFs tumor necrosis factors
  • growth factors, hormones, and cytokines do not need to be strictly distinguished from one another.
  • a physiologically active protein may belong to any one group selected from growth factors, hormones, and cytokines, or may belong to multiple groups selected from these.
  • the physiologically active protein may be the entire protein or a portion thereof.
  • An example of a portion of a protein is a portion having physiological activity.
  • a specific example of a portion having physiological activity is the physiologically active peptide Teriparatide, which consists of the N-terminal 34 amino acid residues of the mature form of parathyroid hormone (PTH).
  • An antibody-related molecule refers to a protein containing a molecular species consisting of a single domain selected from the domains constituting a complete antibody or a combination of two or more domains.
  • the domains constituting a complete antibody include the heavy chain domains VH, CH1, CH2, and CH3, and the light chain domains VL and CL.
  • the antibody-related molecule may be a monomeric protein or a multimeric protein, so long as it contains the above-mentioned molecular species.
  • the antibody-related molecule when the antibody-related molecule is a multimeric protein, it may be a homomultimer consisting of a single type of subunit, or a heteromultimer consisting of two or more types of subunits.
  • antibody-related molecules include complete antibodies, Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fc, dimers consisting of heavy chains (H chains) and light chains (L chains), Fc fusion proteins, heavy chains (H chains), light chains (L chains), single chain Fvs (scFv), sc(Fv) 2 , disulfide-linked Fvs (sdFv), diabodies, and VHH fragments (Nanobody (registered trademark)). More specific examples of antibody-related molecules include trastuzumab, adalimumab, and nivolumab.
  • the receptor protein is not particularly limited, and may be, for example, a receptor protein for a physiologically active protein or other physiologically active substance. Examples of other physiologically active substances include neurotransmitters such as dopamine.
  • the receptor protein may also be an orphan receptor for which the corresponding ligand is not known.
  • the antigen protein used as a vaccine is not particularly limited as long as it is capable of eliciting an immune response, and may be appropriately selected depending on the intended target of the immune response.
  • LFABP liver-type fatty acid-binding protein
  • fluorescent proteins include Green Fluorescent Protein (GFP).
  • Immunoglobulin-binding proteins include Protein A, Protein G, and Protein L.
  • Albumins include human serum albumin.
  • Extracellular proteins include fibronectin, vitronectin, collagen, osteopontin, laminin, and partial sequences thereof.
  • Laminin is a protein with a heterotrimeric structure consisting of an ⁇ chain, a ⁇ chain, and a ⁇ chain.
  • Laminins include mammalian laminins. Mammals include primates such as humans, monkeys, and chimpanzees, rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and various other mammals such as rabbits, horses, cows, sheep, goats, pigs, dogs, and cats. Mammals include humans in particular.
  • Subunit chains of laminins include five types of ⁇ chains ( ⁇ 1 to ⁇ 5), three types of ⁇ chains ( ⁇ 1 to ⁇ 3), and three types of ⁇ chains ( ⁇ 1 to ⁇ 3).
  • Laminins are composed of various isoforms depending on the combination of these subunit chains. Specific examples of laminins include laminin 111, laminin 121, laminin 211, laminin 213, laminin 221, laminin 311, laminin 321, laminin 332, laminin 411, laminin 421, laminin 423, laminin 511, laminin 521, and laminin 523.
  • laminin partial sequences examples include laminin E8, which is an E8 fragment of laminin.
  • laminin E8 is a protein having a heterotrimeric structure consisting of an E8 fragment of the ⁇ chain ( ⁇ chain E8), an E8 fragment of the ⁇ chain ( ⁇ chain E8), and an E8 fragment of the ⁇ chain ( ⁇ chain E8).
  • the subunit chains of laminin E8 i.e., ⁇ chain E8, ⁇ chain E8, and ⁇ chain E8) are collectively referred to as "E8 subunit chains".
  • Examples of the E8 subunit chain include the E8 fragments of the laminin subunit chains exemplified above.
  • Laminin E8 forms various isoforms by combining these E8 subunit chains.
  • laminin E8 examples include laminin 111E8, laminin 121E8, laminin 211E8, laminin 221E8, laminin 332E8, laminin 421E8, laminin 411E8, laminin 511E8, and laminin 521E8.
  • Genes encoding heterologous proteins such as these proteins can be used as is or after appropriate modification. Genes encoding heterologous proteins can be modified, for example, depending on the host used and/or to obtain a desired activity. For example, genes encoding heterologous proteins may be modified so that the amino acid sequence of the encoded heterologous protein includes substitution, deletion, insertion, and/or addition of one or several amino acids.
  • the above description of the Mdh protein and variants of the mdh gene can also be applied mutatis mutandis to the heterologous proteins secreted and produced by the method of the present invention and the genes encoding them.
  • the protein specified by the originating organism is not limited to the protein itself found in the organism, but includes proteins having the amino acid sequence of the protein found in the organism and variants thereof. These variants may or may not be found in the organism. That is, for example, a "human-derived protein” is not limited to the protein itself found in humans, but includes proteins having the amino acid sequence of the protein found in humans and variants thereof.
  • a gene encoding a heterologous protein may have any codon replaced with an equivalent codon.
  • a gene encoding a heterologous protein may be modified to have optimal codons depending on the codon usage frequency of the host used.
  • the gene construct of the present invention may further contain a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence used for enzymatic cleavage between the nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr and the nucleic acid sequence encoding a heterologous protein.
  • the amino acid sequence used for enzymatic cleavage is not particularly limited as long as it is a sequence that is recognized and cleaved by an enzyme that hydrolyzes peptide bonds, and a sequence that can be used may be appropriately selected depending on the amino acid sequence of the target heterologous protein.
  • the nucleic acid sequence that codes for the amino acid sequence used for enzymatic cleavage can be appropriately designed based on the amino acid sequence.
  • the nucleic acid sequence that codes for the amino acid sequence used for enzymatic cleavage can be designed to have optimal codons depending on the codon usage frequency of the host.
  • the amino acid sequence used for enzymatic cleavage is preferably a recognition sequence for a protease with high substrate specificity.
  • Specific examples of such amino acid sequences include the recognition sequences for Factor Xa protease and proTEV protease.
  • the N-terminal region of the heterologous protein finally obtained by the method of the present invention may or may not be identical to the natural protein.
  • the N-terminal region of the heterologous protein finally obtained may have one or several extra amino acids added or deleted compared to the natural protein.
  • the above "one or several” varies depending on the full length and structure of the heterologous protein of interest, but specifically preferably means 1 to 20, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3.
  • the heterologous protein produced by secretion may be a protein with a pro-structure added (proprotein).
  • the heterologous protein produced by secretion is a proprotein
  • the heterologous protein finally obtained may or may not be a proprotein. That is, the proprotein may be cleaved at the pro-structure to become a mature protein. Cleavage can be performed, for example, by a protease.
  • a protease is used, from the viewpoint of the activity of the finally obtained protein, it is generally preferable that the proprotein is cleaved at approximately the same position as the natural protein, and more preferably, the proprotein is cleaved at exactly the same position as the natural protein to obtain a mature protein identical to the natural one.
  • a specific protease that cleaves the proprotein at a position that produces a protein identical to the naturally occurring mature protein is most preferable.
  • the N-terminal region of the finally obtained heterologous protein does not have to be the same as the natural protein.
  • a protein whose N-terminus is one to several amino acids longer or shorter than the natural protein may have more appropriate activity.
  • Proteases that can be used in the present invention include commercially available ones such as Dispase (manufactured by Boehringer Mannheim) as well as ones obtained from culture media of microorganisms, for example, culture media of actinomycetes.
  • proteases can be used in an unpurified state, or may be purified to an appropriate degree of purity as necessary.
  • a mature protein is obtained by cleaving a pro-structure, the inserted amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr is cleaved and removed together with the pro-structure, so that the desired protein can be obtained without locating an amino acid sequence used for enzymatic cleavage after the amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr.
  • the method for introducing the gene construct used in the present invention into a coryneform bacterium is not particularly limited.
  • “Introduction of the gene construct used in the present invention” refers to having the gene construct retained in the host.
  • “Introduction of the gene construct used in the present invention” is not limited to the case where the gene construct constructed in advance is introduced into the host all at once, but also includes the case where at least a heterologous protein gene is introduced into the host and the gene construct is constructed within the host.
  • the gene construct used in the present invention may be present on a vector that replicates autonomously outside the chromosome, such as a plasmid, or may be incorporated into the chromosome.
  • the gene construct used in the present invention can be introduced in the same manner as, for example, the introduction of a gene in the above-mentioned method for increasing gene expression.
  • the introduction of the genetic construct used in the present invention, the reduction in activity of the Mdh protein, and other modifications can be performed in any order.
  • the gene construct used in the present invention can be introduced into a host using, for example, a vector containing the gene construct.
  • the gene construct used in the present invention can be linked to a vector to construct an expression vector for the gene construct, and the host can be transformed with the expression vector to introduce the gene construct into the host.
  • an expression vector for the gene construct used in the present invention can also be constructed by linking a base sequence encoding the fusion protein of the present invention downstream of the promoter.
  • the vectors that can be used in coryneform bacteria are as described above.
  • the gene construct used in the present invention can be introduced onto the host chromosome using a transposon such as an artificial transposon.
  • a transposon such as an artificial transposon.
  • the gene construct used in the present invention is introduced onto the chromosome by homologous recombination or its own transposition ability.
  • the gene construct used in the present invention can also be introduced onto the host chromosome by other introduction methods using homologous recombination. Examples of introduction methods using homologous recombination include methods using linear DNA, a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin, a conjugatively transferable plasmid, or a suicide vector that does not have a replication origin that functions in the host.
  • At least a heterologous protein gene may be introduced onto the chromosome to construct the gene construct used in the present invention on the chromosome.
  • some or all of the components of the gene construct used in the present invention other than the heterologous protein gene may be originally present on the host chromosome.
  • a promoter sequence originally present on the host chromosome and a nucleic acid sequence encoding a signal peptide connected downstream of the promoter sequence can be used as is, and only the gene connected downstream of the nucleic acid sequence encoding the signal peptide can be replaced with a heterologous protein gene of interest, thereby constructing a gene construct for use in the present invention on a chromosome and constructing a bacterium for use in the present invention.
  • Introduction of a part of the gene construct for use in the present invention, such as a heterologous protein gene, into a chromosome can be carried out in the same manner as introduction of the gene construct for use in the present invention into a chromosome.
  • the gene construct and its components (promoter sequence, nucleic acid sequence encoding a signal peptide, nucleic acid sequence encoding a heterologous protein, etc.) used in the present invention can be obtained, for example, by cloning.
  • a heterologous protein gene can be obtained by cloning from an organism having the heterologous protein of interest, and the gene construct used in the present invention can be obtained by modifying the gene, for example by introducing a base sequence encoding a signal peptide or a promoter sequence.
  • the gene construct and its components used in the present invention can also be obtained by chemical synthesis (Gene, 60(1), 115-127 (1987)). The obtained gene construct and its components can be used as is, or with appropriate modifications.
  • the gene constructs for the secretory expression of each protein may be retained in the bacterium of the present invention so that the secretory expression of the target heterologous protein can be achieved.
  • the gene constructs for the secretory expression of each protein may all be retained on a single expression vector, or all may be retained on a chromosome.
  • the gene constructs for the secretory expression of each protein may be retained separately on multiple expression vectors, or may be retained separately on a single or multiple expression vectors and on a chromosome. "When two or more types of proteins are expressed" refers to, for example, when two or more types of heterologous proteins are secreted and produced, or when a heteromultimeric protein is secreted and produced.
  • the method for introducing the gene construct used in the present invention into a coryneform bacterium is not particularly limited, and commonly used methods such as the protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985)), electroporation method (Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)), and electric pulse method (JP Patent Publication No. 2-207791) can be used.
  • the bacteria of the present invention can be cultured according to commonly used methods and conditions.
  • the bacteria of the present invention can be cultured in a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, and inorganic ions.
  • organic micronutrients such as vitamins and amino acids can also be added as necessary.
  • Carbohydrates such as glucose and sucrose, organic acids such as acetic acid, alcohols, and others can be used as carbon sources.
  • Ammonia gas, ammonia water, ammonium salts, and others can be used as nitrogen sources.
  • Calcium ions, magnesium ions, phosphate ions, potassium ions, iron ions, and others can be used as inorganic ions as needed.
  • the culture is carried out under aerobic conditions at an appropriate pH range of 5.0 to 8.5 and 15°C to 37°C for about 1 to 7 days.
  • the culture conditions for L-amino acid production by coryneform bacteria and the conditions described in the secretory production method of proteins using Sec-dependent or Tat-dependent signal peptides can be used (see WO01/23591, WO2005/103278).
  • a promoter inducer can be added to the medium and cultured. By culturing the bacterium of the present invention under such conditions, the target protein is produced in large amounts within the bacterial cells and efficiently secreted outside the bacterial cells.
  • the produced heterologous protein is secreted outside the bacterial cell, so that proteins that are generally lethal when accumulated in large amounts inside the bacterial cell of a microorganism, such as transglutaminase, can be produced continuously without being affected by lethal effects.
  • the protein secreted into the medium by the method of the present invention can be separated and purified from the medium after culture according to a method well known to those skilled in the art.
  • the protein can be separated and purified by known appropriate methods such as salting out, ethanol precipitation, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, medium to high pressure liquid chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, or a combination of these.
  • the culture or culture supernatant may be used as is.
  • the protein secreted onto the bacterial cell surface by the method of the present invention can also be solubilized by a method well known to those skilled in the art, such as increasing the salt concentration or using a surfactant, and then separated and purified in the same manner as when it was secreted into the medium.
  • the protein secreted onto the bacterial cell surface may be used as an immobilized enzyme without being solubilized.
  • Secretion and production of the target heterologous protein can be confirmed by performing SDS-PAGE using the culture supernatant and/or a fraction containing the bacterial cell surface as a sample and confirming the molecular weight of the separated protein band.
  • Secretion and production of the target heterologous protein can also be confirmed by Western blotting using an antibody using the culture supernatant and/or a fraction containing the bacterial cell surface as a sample (Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)).
  • Secretion and production of the target heterologous protein can also be confirmed by detecting the N-terminal amino acid sequence of the target protein using a protein sequencer.
  • Secretion and production of the target heterologous protein can also be confirmed by determining the mass of the target protein using a mass spectrometer. Furthermore, if the heterologous protein of interest is an enzyme or has some measurable physiological activity, secretion and production of the heterologous protein of interest can be confirmed by measuring the enzyme activity or physiological activity of the heterologous protein of interest using the culture supernatant and/or a fraction containing the cell surface as a sample.
  • Example 1 Construction of Corynebacterium glutamicum lacking the malate dehydrogenase gene mdh (1) Construction of vector pBS5T ⁇ 2278 for mdh gene deletion The genome sequence of C. glutamicum ATCC13869 strain and the nucleotide sequence of the mdh gene encoding malate dehydrogenase (hereinafter referred to as Mdh) have already been determined (Genbank Accession No. AP017557, NCBI locus_tag CGBL_0122780). The nucleotide sequence of the mdh gene is shown in ⁇ SEQ ID NO:39>, and the amino acid sequence of Mdh is shown in ⁇ SEQ ID NO:40>.
  • the bands of interest were excised and recovered from the gel using Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
  • the two DNA fragments thus recovered were inserted into the SmaI site of pBS5T described in WO2006/057450 by infusion reaction to obtain the mdh gene-deficient vector pBS5T ⁇ 2278.
  • the infusion reaction was performed using the In-Fusion(R) HD Cloning Kit (Takara Bio) under the reaction conditions recommended by the manufacturer.
  • Example 2 Construction of Corynebacterium glutamicum with a stop codon inserted into the malate dehydrogenase gene mdh (1) Construction of vector pBS5Ts2278 for inserting a stop codon into the mdh gene A strain was obtained in which a stop codon was inserted into the mdh gene by the method described below, thereby modifying the gene so that it encodes a C-terminal deleted Mdh in which the amino acid sequence from position 313 onwards of the 328 residues of Mdh was deleted.
  • the primer ⁇ SEQ ID NO:46> was designed to insert two stop codons (TAGTAG) between GCG encoding Ala at position 312 and AAT encoding Asn at position 313.
  • Pyrobest(R) DNA polymerase (Takara Bio) was used for PCR, and the reaction conditions were in accordance with the protocol recommended by the manufacturer.
  • the amplified DNA fragments of about 1 kbp each were subjected to agarose gel electrophoresis, and the bands of interest were excised and recovered from the gel using Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
  • the two recovered DNA fragments were inserted into the SmaI site of pBS5T described in WO2006/057450 by infusion reaction to obtain pBS5Ts2278, a vector for inserting a stop codon into the mdh gene.
  • the infusion reaction was performed using In-Fusion(R) HD Cloning Kit (Takara Bio), and the reaction conditions were in accordance with the protocol recommended by the manufacturer.
  • Example 3 Secretion and expression of Protein L using mdh gene-deficient Corynebacterium glutamicum
  • the YDK010::phoS(W302C) strain and the YDK010::phoS(W302C) ⁇ 2278 strain obtained in Example 1(2) were transformed with the Protein L secretion and expression plasmid pPK4_CspAss_ProteinL described in Japanese Patent Application No. 2016-206702 to obtain the YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspAss_ProteinL strain and the YDK010::phoS(W302C) ⁇ 2278/pPK4_CspAss_ProteinL strain.
  • Each of the transformants obtained was cultured at 30°C for 72 hours in MMTG liquid medium containing 25 mg/l kanamycin (glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese sulfate pentahydrate 0.03 g, thiamine hydrochloride 0.45 mg, biotin 0.45 mg, DL-methionine 0.15 g, soybean hydrochloric acid hydrolysate (total nitrogen 0.2 g), calcium carbonate 50 g, and water to make 1 L, pH adjusted to 7.0).
  • kanamycin glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese
  • the Protein L band intensity was quantified using the image analysis software Multi Gauge (FUJIFILM), and the average band intensity when Protein L was expressed in the YDK010::phoS(W302C) ⁇ 2278 strain was calculated as a relative value, with the average band intensity when Protein L was expressed in the YDK010::phoS(W302C) strain set at 1.00.
  • the amount of Protein L secreted in the YDK010::phoS(W302C) ⁇ 2278 strain was approximately 2.30-fold higher than that in the YDK010::phoS(W302C) strain (Table 1).
  • the ⁇ mdh mutation (deficiency of the mdh gene) is an effective mutation that improves the secretion amount of Protein L in secretory production using the Sec system CspA secretion signal.
  • Example 4 Secretory expression of Protein L using Corynebacterium glutamicum with a stop codon inserted into the mdh gene
  • the Protein L secretory expression plasmid pPK4_CspAss_ProteinL was used to transform the YDK010::phoS(W302C) strain and the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain obtained in Example 2(2), respectively, to obtain the YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspAss_ProteinL strain and the YDK010::phoS(W302C)::s2278/pPK4_CspAss_ProteinL strain.
  • Each of the transformants obtained was cultured at 30°C for 72 hours in MMTG liquid medium containing 25 mg/l kanamycin (glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese sulfate pentahydrate 0.03 g, thiamine hydrochloride 0.45 mg, biotin 0.45 mg, DL-methionine 0.15 g, soybean hydrochloric acid hydrolysate (total nitrogen 0.2 g), calcium carbonate 50 g, and water to make 1 L, pH adjusted to 7.0).
  • kanamycin glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese
  • the Protein L band intensity was quantified using the image analysis software Multi Gauge (FUJIFILM), and the average band intensity when Protein L was expressed in the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain was calculated as a relative value to the average band intensity when Protein L was expressed in the YDK010::phoS(W302C) strain, which was set at 1.00.
  • the amount of Protein L secreted in the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain was approximately 2.78-fold higher than that of the YDK010::phoS(W302C) strain (Table 2).
  • Example 5 Secretory expression of liver-type fatty acid-binding protein (LFABP) using Corynebacterium glutamicum with a stop codon inserted into the mdh gene
  • LFABP liver-type fatty acid-binding protein
  • pPK4_CspB6Xa-LFABP is a secretory expression plasmid for human liver-type fatty acid-binding protein (hereinafter referred to as LFABP).
  • LFABP human liver-type fatty acid-binding protein
  • pPK4_CspB6Xa-LFABP has a promoter for the cspB gene (PS2 gene) derived from C. glutamicum ATCC13869 strain, and a gene encoding a fusion protein (hereinafter referred to as CspB6Xa-LFABP) of the 30 amino acid residues of the signal peptide of CspB derived from C.
  • glutamicum ATCC13869 strain the N-terminal 6 amino acid residues of the CspB mature protein derived from the same strain, the recognition sequence IEGR of Factor Xa protease, and LFABP, which are linked in an expressible manner downstream of the promoter.
  • Each of the transformants obtained was cultured at 30°C for 72 hours in MMTG liquid medium containing 25 mg/l kanamycin (glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese sulfate pentahydrate 0.03 g, thiamine hydrochloride 0.45 mg, biotin 0.45 mg, DL-methionine 0.15 g, soybean hydrochloric acid hydrolysate (total nitrogen 0.2 g), calcium carbonate 50 g, and water to make 1 L, pH adjusted to 7.0).
  • kanamycin glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese
  • the band intensity of CspB6Xa-LFABP was quantified using the image analysis software Multi Gauge (FUJIFILM), and the average band intensity when CspB6Xa-LFABP was expressed in the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain was calculated as a relative value to the average band intensity when CspB6Xa-LFABP was expressed in the YDK010::phoS(W302C) strain, which was set at 1.00.
  • FUJIFILM image analysis software Multi Gauge
  • disruption of the mdh gene is an effective mutation that improves the secretion amount of CspB6Xa-LFABP in the YDK010::phoS(W302C) strain.
  • Example 6 Secretory expression of protransglutaminase from the Sec secretory pathway using Corynebacterium glutamicum with a stop codon inserted into the mdh gene Using pPKSPTG1 described in WO2001/23591, the YDK010::phoS(W302C) strain and the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain obtained in Example 2(2) were transformed to obtain the YDK010::phoS(W302C)/pPKSPTG1 strain and the YDK010::phoS(W302C)::s2278/pPKSPTG1 strain.
  • pPKSPTG1 is a secretory expression plasmid for protransglutaminase (transglutaminase with a pro structure; hereinafter referred to as PTG) derived from S. mobaraense.
  • pPKSPTG1 has a promoter for the cspB gene (PS2 gene) derived from the C. glutamicum ATCC13869 strain, and a gene encoding a fusion protein of the 25 amino acid residue signal peptide of CspA (SlpA; Genbank Accession No. BAB62413) derived from the C. ammoniagenes ATCC6872 strain and PTG, which is linked downstream of the promoter in an expressible manner.
  • Each of the transformants obtained was cultured at 30°C for 72 hours in MMTG liquid medium containing 25 mg/l kanamycin (glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese sulfate pentahydrate 0.03 g, thiamine hydrochloride 0.45 mg, biotin 0.45 mg, DL-methionine 0.15 g, soybean hydrochloric acid hydrolysate (total nitrogen 0.2 g), calcium carbonate 50 g, and water to make 1 L, pH adjusted to 7.0).
  • kanamycin glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese
  • the PTG band intensity was quantified using the image analysis software Multi Gauge (FUJIFILM), and the average band intensity when PTG was expressed in the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain was calculated as a relative value, with the average band intensity when PTG was expressed in the YDK010::phoS(W302C) strain set at 1.00.
  • the amount of PTG secreted in the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain was approximately 1.86-fold higher than that in the YDK010::phoS(W302C) strain (Table 4).
  • disruption of the mdh gene is an effective mutation that improves secretion levels in the PTG secretion production in the YDK010::phoS(W302C) strain.
  • Example 7 Expression and secretion of protransglutaminase from the Tat secretion pathway using Corynebacterium glutamicum with a stop codon inserted into the mdh gene
  • pPK6_T_PTG described in WO2016/171224
  • the YDK010::phoS(W302C) strain and the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain obtained in Example 2(2) were transformed to obtain the YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_PTG strain and the YDK010::phoS(W302C)::s2278/pPK6_T_PTG strain.
  • pPK6_T_PTG is a co-expression plasmid of the TatABC secretion apparatus and protransglutaminase (transglutaminase with a pro structure; hereinafter referred to as PTG) derived from S. mobaraense.
  • pPK6_T_PTG has a promoter of the cspB gene (PS2 gene) derived from C. glutamicum ATCC13869 strain, and a gene encoding a fusion protein of the TorA signal peptide derived from E. coli and PTG linked in an expressible manner downstream of the promoter.
  • Each of the transformants obtained was cultured at 30°C for 72 hours in MMTG liquid medium containing 25 mg/l kanamycin (glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese sulfate pentahydrate 0.03 g, thiamine hydrochloride 0.45 mg, biotin 0.45 mg, DL-methionine 0.15 g, soybean hydrochloric acid hydrolysate (total nitrogen 0.2 g), calcium carbonate 50 g, and water to make 1 L, pH adjusted to 7.0).
  • kanamycin glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, potassium dihydrogen phosphate 1.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese
  • the PTG band intensity was quantified using the image analysis software Multi Gauge (FUJIFILM), and the average band intensity when PTG was expressed in the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain was calculated as a relative value, with the average band intensity when PTG was expressed in the YDK010::phoS(W302C) strain set at 1.00.
  • the amount of PTG secreted in the YDK010::phoS(W302C)::s2278 strain was approximately 1.83-fold higher than that in the YDK010::phoS(W302C) strain (Table 5).
  • disruption of the mdh gene is an effective mutation that improves secretion levels even in PTG secretion production using the TorA signal sequence in the YDK010::phoS(W302C) strain.
  • disruption of the mdh gene is a mutation that can significantly improve the secretion levels of heterologous proteins not only in the Sec secretion pathway, but also in the Tat secretion pathway.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of the phoS gene of C. glutamicum YDK010
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of the PhoS protein of C. glutamicum YDK010
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence of the PhoS protein of C. glutamicum ATCC 13032
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of the PhoS protein of C. glutamicum ATCC 14067
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of the PhoS protein of C.
  • crenatum SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of the PhoS protein of C. efficiens
  • SEQ ID NO: 8 Nucleotide sequence of the phoR gene of C. glutamicum ATCC 13032
  • SEQ ID NO: 9 Amino acid sequence of the PhoR protein of C. glutamicum ATCC 13032
  • SEQ ID NO: 10 Nucleotide sequence of the cspB gene of C. glutamicum ATCC 13869
  • SEQ ID NO: 11 Amino acid sequence of the PhoS protein of C. glutamicum ATCC
  • SEQ ID NO:12 Nucleotide sequence of the tatA gene of C.
  • glutamicum ATCC 13032 SEQ ID NO:13 Amino acid sequence of the TatA protein of C. glutamicum ATCC 13032 SEQ ID NO:14: Nucleotide sequence of the tatB gene of C. glutamicum ATCC 13032 SEQ ID NO:15: Amino acid sequence of the TatB protein of C. glutamicum ATCC 13032 SEQ ID NO:16: Nucleotide sequence of the tatC gene of C. glutamicum ATCC 13032 SEQ ID NO:17: C.
  • SEQ ID NOs: 29-31 Skipped sequences
  • SEQ ID NOs: 32 to 36 Amino acid sequences of one embodiment of the insertion sequence used in the present invention
  • SEQ ID NO: 37 Recognition sequence of Factor Xa protease
  • SEQ ID NO: 38 Recognition sequence of ProTEV protease
  • SEQ ID NO: 39 Nucleotide sequence of mdh gene of C. glutamicum ATCC 13869
  • SEQ ID NO: 40 Amino acid sequence of Mdh protein of C. glutamicum ATCC 13869
  • SEQ ID NOs: 41 to 48 Primers

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Abstract

コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産を向上させる新規な技術を開発し、異種タンパク質の分泌生産法を提供することを課題とする。異種タンパク質を分泌生産する能力を有し、且つ、Mdhタンパク質の活性が低下するように改変されたコリネ型細菌を培養し、異種タンパク質を分泌生産する。

Description

タンパク質の分泌生産法
　本発明は、異種タンパク質の分泌生産法に関するものである。
　微生物による異種タンパク質の分泌生産としては、これまでに、バチルス属細菌（非特許文献１）、メタノール資化性酵母Pichia pastoris（非特許文献２）、およびAspergillus属糸状菌（非特許文献３、４）等による異種タンパク質の分泌生産が報告されている。
　また、コリネ型細菌により異種タンパク質を分泌生産する試みもなされている。コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産については、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（以後、C. glutamicumと略すことがある）によるヌクレアーゼ（nuclease）やリパーゼ（lipase）の分泌（特許文献１、非特許文献５）、サチライシン等のプロテアーゼの分泌（非特許文献６）、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質PS1やPS2（CspBともいう）のシグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌（特許文献２）、PS2（CspB）のシグナルペプチドを利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌（非特許文献７）、PS2（CspB）やSlpA（CspAともいう）のシグナルペプチドを利用したプロトランスグルタミナーゼの分泌（特許文献３）、変異型分泌装置を利用したタンパク質の分泌（特許文献４）、変異株によるプロトランスグルタミナーゼの分泌（特許文献５）等の報告がある。また、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産量を高める技術として、細胞表層タンパク質の活性を低下させること（特許文献６、７）、ペニシリン結合タンパク質の活性を低下させること（特許文献６）、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献７）、リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に変異を導入すること（特許文献８）、シグナルペプチドと異種タンパク質との間にGln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列を挿入して異種タンパク質を発現させること（特許文献９）等が知られている。
　一般的なタンパク質分泌経路は、原核生物から真核生物まで広く存在するSec系と呼ばれる経路であるが、近年、Sec系とは全く異なるタンパク質分泌経路が植物細胞の葉緑体のチラコイド膜において見出された（非特許文献８）。この新規な分泌経路は、それにより分泌されるタンパク質のシグナル配列にアルギニン－アルギニンの配列が共通して存在していることから（非特許文献８）、Tat系（Twin-Arginine Translocation system）と名付けられた。Sec系ではタンパク質が高次構造を形成する前の状態で分泌されるのに対し、Tat系ではタンパク質は細胞内で高次構造を形成した後に細胞膜を通過して分泌されることが知られている（非特許文献９）。コリネ型細菌においても、Tat系依存シグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌生産の報告がある（特許文献８、１０）。
　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）は、リンゴ酸をオキサロ酢酸に変換する反応および／またはその逆反応を触媒する酸化還元酵素である。他の多くの細菌と同様、C. glutamicumは２種類のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、すなわちmdh遺伝子にコードされる細胞質型のmalate dehydrogenase（Mdh）とmqo遺伝子にコードされる膜貫通型のmalate:quinone-oxidoreductase（Mqo）を持ち、これら２種類のリンゴ酸デヒドロゲナーゼが協調して機能している。通常培養条件では、リンゴ酸をオキサロ酢酸に変換する反応のほとんどをMqoが担っており、Mdhはオキサロ酢酸の濃度が低い時およびリンゴ酸の濃度が高い時のみ機能する。C. glutamicumについて、mqo遺伝子欠損株は最少培地で生育出来ないが、mdh遺伝子欠損株は野生株と同様に生育することから、MqoはMdhの機能を補うことが出来ると考えられている（非特許文献１０）。
　C. glutamicumにおけるmdh遺伝子と物質生産との関係については、以下に示すようないくつかの知見がある。すなわち、mdh遺伝子の欠損によるイソブタノール生産能の上昇（非特許文献１１）、Mdh活性の増強によるＬ－アミノ酸生産能の上昇（特許文献１１）、Mdh活性の増強によるコハク酸生産能の上昇（特許文献１２）が知られている。
　しかしながら、Mdhとコリネ型細菌における異種タンパク質の分泌生産との関係はこれまでに知られていない。
米国特許4965197 特表平6-502548 特許第4320769号 特開平11-169182 特許第4362651号 WO2013/065869 WO2013/065772 WO2013/118544 WO2013/062029 特許第4730302号 特開2003-144161 特許第4760121号
Microbiol. rev., 57, 109-137(1993) Biotechnol., 11, 905-910(1993) Biotechnol., 6, 1419-1422(1988) Biotechnol., 9, 976-981(1991) J. Bacteriol., 174, 1854-1861(1992) Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995) Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997) EMBO J., 14, 2715-2722(1995) J. Biol. Chem., 25;273(52), 34868-74(1998) J. Bacteriol., 182, 6884-6891(2000) Appl. Environ. Microb., 77, 3300-3310(2011)
　本発明は、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産を向上させる新規な技術を開発し、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Mdhタンパク質の活性が低下するようにコリネ型細菌を改変することにより、コリネ型細菌の異種タンパク質の分泌生産能が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のとおり例示できる。
［１］
　異種タンパク質の製造方法であって、
　異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および
　分泌生産された異種タンパク質を回収することを含み、
　前記コリネ型細菌が、Mdhタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
　前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
　前記異種タンパク質が、前記シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
［２］
　前記Mdhタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記（具体的には、［１］に記載の）方法：
（ａ）配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４０に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［３］
　mdh遺伝子の発現を低下させることにより、またはmdh遺伝子を破壊することにより、Mdhタンパク質の活性が低下した、前記（具体的には、［１］または［２］に記載の）方法。
［４］
　Mdhタンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、Mdhタンパク質の活性が低下した、前記（具体的には、［１］～［３］のいずれかに記載の）方法。
［５］
　少なくとも、Mdhタンパク質のアミノ酸配列における、配列番号４０の３１３位～３２８位に相当する部位が欠失した、前記（具体的には、［４］に記載の）方法。
［６］
　少なくとも、Mdhタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端の１６残基が欠失した、前記（具体的には、［４］に記載の）方法。
［７］
　前記欠失が、mdh遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失、mdh遺伝子のコード領域への終止コドンの導入、mdh遺伝子のコード領域におけるフレームシフト、またはそれらの組み合わせにより生じた、前記（具体的には、［４］～［６］のいずれかに記載の）方法。
［８］
　前記コリネ型細菌が、さらに、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されている、前記（具体的には、［１］～［７］のいずれかに記載の）方法。
［９］
　前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号２の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異である、前記（具体的には、［８］に記載の）方法。
［１０］
　前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、前記（具体的には、［９］に記載の）方法。
［１１］
　前記野生型PhoSタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、前記（具体的には、［９］または［１０］に記載の）方法：
（ａ）配列番号２～７のいずれかに示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２～７のいずれかに示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２～７のいずれかに示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質。
［１２］
　前記シグナルペプチドがTat系依存シグナルペプチドである、前記（具体的には、［１］～［１１］のいずれかに記載の）方法。
［１３］
　前記Tat系依存シグナルペプチドが、TorAシグナルペプチド、SufIシグナルペプチド、PhoDシグナルペプチド、LipAシグナルペプチド、およびIMDシグナルペプチドからなる群より選択されるいずれか１つのシグナルペプチドである、前記（具体的には、［１２］に記載の）方法。
［１４］
　前記コリネ型細菌が、さらに、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１種またはそれ以上の遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇するように改変されている、前記（具体的には、［１２］または［１３］に記載の）方法。
［１５］
　前記Tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子からなる、前記（具体的には、［１４］に記載の）方法。
［１６］
　前記シグナルペプチドがSec系依存シグナルペプチドである、前記（具体的には、［１］～［１１］のいずれかに記載の）方法。
［１７］
　前記Sec系依存シグナルペプチドが、PS1シグナルペプチド、PS2シグナルペプチド、およびSlpAシグナルペプチドからなる群より選択されるいずれか１種のシグナルペプチドである、前記（具体的には、［１６］に記載の）方法。
［１８］
　前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記（具体的には、［１］～［１７］のいずれかに記載の）方法。
［１９］
　前記遺伝子構築物が、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記（具体的には、［１８］に記載の）方法。
［２０］
　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、前記（具体的には、［１］～［１９］のいずれかに記載の）方法。
［２１］
　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記（具体的には、［２０］に記載の）方法。
［２２］
　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）に由来する改変株またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869に由来する改変株である、前記（具体的には、［２１］に記載の）方法。
［２３］
　前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が非改変株と比較して低下しているコリネ型細菌である、前記（具体的には、［１］～［２２］のいずれかに記載の）方法。
　本発明により、異種タンパク質を効率よく分泌生産することができる。
C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのmdh遺伝子欠損株でProtein L（CspAのシグナルペプチドを融合したProtein Lの抗体結合ドメイン）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのmdh遺伝子終始コドン挿入株でProtein L（CspAのシグナルペプチドを融合したProtein Lの抗体結合ドメイン）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのmdh遺伝子終始コドン挿入株でCspB6Xa-LFABP（CspBのシグナルペプチド、成熟CspBのN末端配列、およびFactor Xaプロテアーゼ認識配列を融合したLFABP）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのmdh遺伝子終始コドン挿入株でPTG（CspAのシグナルペプチドを融合したプロトランスグルタミナーゼ）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのmdh遺伝子終始コドン挿入株でPTG（TorAシグナルペプチドを融合したプロトランスグルタミナーゼ）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の方法は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、前記コリネ型細菌がMdhタンパク質の活性が低下するように改変されている、方法である。
＜１＞本発明の方法に用いられるコリネ型細菌
　本発明の方法に用いられるコリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌であって、且つ、Mdhタンパク質の活性が低下するように改変されたコリネ型細菌である。なお、本発明の方法に用いられるコリネ型細菌を「本発明の細菌」または「本発明のコリネ型細菌」ともいう。また、本発明の細菌が有する異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を「本発明に用いられる遺伝子構築物」ともいう。また、本発明の細菌またはそれを構築するために用いられる株を「宿主」ともいう。
＜１－１＞異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌
　本発明のコリネ型細菌は、異種タンパク質を分泌生産する能力を有する。本発明のコリネ型細菌は、少なくとも異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物（本発明に用いられる遺伝子構築物）を有することに依拠して、異種タンパク質を分泌生産する能力を有する。本発明のコリネ型細菌は、具体的には、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有することにより、または異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有することと他の性質との組み合わせにより、異種タンパク質を分泌生産する能力を有していてよい。他の性質としては、Mdhタンパク質の活性を低下させる改変や、後述するような他の性質が挙げられる。
　本発明において、タンパク質が「分泌」されるとは、タンパク質が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいう。細菌菌体外（細胞外）としては、培地中や菌体表層が挙げられる。すなわち、分泌されたタンパク質分子は、例えば、培地中に存在していてもよく、菌体表層に存在していてもよく、培地中と菌体表層の両方に存在していてもよい。すなわち、タンパク質が「分泌」されることには、最終的にそのタンパク質の全分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合に限られず、例えば、そのタンパク質の全分子が菌体表層に存在している場合や、そのタンパク質の一部の分子が培地中に存在し、残りの分子が菌体表層に存在している場合も包含される。
　すなわち、本発明において、「異種タンパク質を分泌生産する能力」とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中および／または菌体表層に異種タンパク質を分泌し、培地中および／または菌体表層から回収できる程度に蓄積する能力をいう。蓄積量は、例えば、培地中での蓄積量として、好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上、さらに好ましくは1 g/L以上であってよい。また、蓄積量は、例えば、菌体表層での蓄積量として、菌体表層の異種タンパク質を回収し培地と同量の液体に懸濁した場合に懸濁液中での異種タンパク質濃度が好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上となるような量であってよい。なお、本発明において分泌生産される「タンパク質」とは、オリゴペプチドやポリペプチド等のペプチドと呼ばれる態様をも包含する概念である。
　本発明において、「異種タンパク質」（heterologous protein）とは、同タンパク質を発現および分泌させるコリネ型細菌にとって外来性（exogenous）であるタンパク質をいう。異種タンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。異種タンパク質は、特に、ヒト由来のタンパク質であってもよい。異種タンパク質は、単量体タンパク質（monomeric protein）であってもよく、多量体タンパク質（multimeric protein）であってもよい。多量体タンパク質とは、２またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体において、各サブユニットは、ジスルフィド結合等の共有結合で連結されていてもよく、水素結合や疎水性相互作用等の非共有結合で連結されていてもよく、それらの組み合わせにより連結されていてもよい。多量体においては、１またはそれ以上の分子間ジスルフィド結合が含まれるのが好ましい。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、多量体を構成するサブユニットの内、少なくとも１つのサブユニットが異種タンパク質であればよい。すなわち、全てのサブユニットが異種由来であってもよく、一部のサブユニットのみが異種由来であってもよい。異種タンパク質は、天然で分泌性であるタンパク質であってもよく、天然では非分泌性であるタンパク質であってもよいが、天然で分泌性であるタンパク質であるのが好ましい。また、異種タンパク質は、天然でTat系依存の分泌性タンパク質であってもよく、天然でSec系依存の分泌性タンパク質であってもよい。「異種タンパク質」の具体例は後述する。
　生産される異種タンパク質は、１種類のみであってもよく、２またはそれ以上の種類であってもよい。また、異種タンパク質がヘテロ多量体である場合には、１種類のサブユニットのみが生産されてもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットが生産されてもよい。すなわち、「異種タンパク質を分泌生産する」ことには、目的の異種タンパク質を構成するサブユニットの内、全てのサブユニットを分泌生産する場合に加えて、一部のサブユニットのみを分泌生産する場合も包含される。
　コリネ型細菌は、好気性のグラム陽性桿菌である。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属細菌等が挙げられる。コリネ型細菌を使用することの利点としては、従来異種タンパク質の分泌生産に利用されている糸状菌、酵母、Bacillus属細菌等と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程の簡略化や省略化が期待できること、また、糖、アンモニア、および無機塩等を含有するシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていること、等が挙げられる。
　コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・クレナタム（Corynebacterium crenatum）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
　コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
　なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
　これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
　とりわけ、野生株C. glutamicum ATCC 13869よりストレプトマイシン（Sm）耐性変異株として分離したC. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) は、その親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能を司る遺伝子に変異が存在することが予測され、タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２～３倍と極めて高く、宿主菌として好適である（WO2002/081694）。AJ12036は、昭和59年3月26日に工業技術院　微生物工業技術研究所（現、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（NITE IPOD）、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。
　また、Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) は、昭和62年3月13日に工業技術院　微生物工業技術研究所（現、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-1539が付与されている。また、Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205) は、昭和63年12月24日に工業技術院　微生物工業技術研究所（現、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-2205が付与されている。
　また、上述したようなコリネ型細菌を親株として、突然変異法や遺伝子組換え法を利用してタンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜し、宿主として利用してもよい。例えば、紫外線照射またはN-メチル-N’-ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することができる。
　さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中または菌体表層に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異法または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質のコード領域またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2の欠損株であるC. glutamicum YDK010株（WO2004/029254）が挙げられる。
　異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌は、上述したようなコリネ型細菌に、本発明に用いられる遺伝子構築物を導入し保持させることにより得ることができる。すなわち、本発明の細菌は、例えば、上述したようなコリネ型細菌に由来する改変株であってよい。本発明の細菌は、具体的には、例えば、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）に由来する改変株またはC. glutamicum ATCC 13869に由来する改変株であってもよい。なお、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）に由来する改変株は、C. glutamicum ATCC 13869に由来する改変株にも該当する。本発明に用いられる遺伝子構築物やその導入法については後述する。
＜１－２＞Mdhタンパク質の活性低下
　本発明の細菌は、Mdhタンパク質の活性が低下するように改変されている。本発明の細菌は、具体的には、Mdhタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている。Mdhタンパク質の活性は、例えば、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）またはC. glutamicum ATCC 13869と比較して低下してよい。本発明の細菌は、より具体的には、mdh遺伝子の発現が低下するように、またはmdh遺伝子が破壊されるように、改変されていてよい。Mdhタンパク質の活性が低下するようにコリネ型細菌を改変することにより、同細菌の異種タンパク質を分泌生産する能力を向上させることができる、すなわち、同細菌による異種タンパク質の分泌生産を増大させることができる。
　本発明の細菌は、異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌を、Mdhタンパク質の活性が低下するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、Mdhタンパク質の活性が低下するようにコリネ型細菌を改変した後に、異種タンパク質を分泌生産する能力を付与することによっても得ることができる。本発明において、本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。なお、本発明の細菌の構築に用いられる、Mdhタンパク質の活性が低下するように改変される前の株は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有すると仮定した場合に、異種タンパク質を分泌生産することができてもよく、できなくてもよい。すなわち、本発明の細菌は、例えば、Mdhタンパク質の活性が低下するように改変されたことにより異種タンパク質を分泌生産する能力を獲得したものであってもよい。具体的には、例えば、本発明の細菌は、Mdhタンパク質の活性が低下するように改変される前には異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していても異種タンパク質を分泌生産することができなかった株から得られたものであって、Mdhタンパク質の活性が低下するように改変されることにより異種タンパク質を分泌生産できるようになったものであってもよい。
　以下、Mdhタンパク質およびそれをコードするmdh遺伝子について説明する。Mdhタンパク質は、細胞質型リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（cytoplasmic malate dehydrogenase；EC 1.1.1.37）である。「リンゴ酸デヒドロゲナーゼ」とは、電子受容体の存在下でリンゴ酸をオキサロ酢酸に変換する反応、および／または、電位供与体の存在下でオキサロ酢酸をリンゴ酸に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質（酵素）をいう。同活性を、「リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性」ともいう。電子受容体としては、ＮＡＤ＋が挙げられる。電位供与体としては、ＮＡＤＨが挙げられる。
　コリネ型細菌が有するmdh遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるMdhタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）等の公開データベースから取得できる。C. glutamicum ATCC 13869のmdh遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするMdhタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３９および４０に示す。すなわち、mdh遺伝子は、例えば、配列番号３９に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、Mdhタンパク質は、例えば、配列番号４０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
　mdh遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したmdh遺伝子（例えば配列番号３９に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、Mdhタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したMdhタンパク質（例えば配列番号４０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。本発明において、「mdh遺伝子」という用語は、上記例示したmdh遺伝子に限られず、その保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「Mdhタンパク質」という用語は、上記例示したMdhタンパク質に限られず、その保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したmdh遺伝子やMdhタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
　「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（例えば活性や性質）に対応する機能（例えば活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、mdh遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質（すなわちMdhタンパク質）をコードすることであってよい。また、「元の機能が維持されている」とは、Mdhタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、Mdhタンパク質としての機能（例えば、配列番号４０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の機能）を有することであってよい。また、「元の機能が維持されている」とは、Mdhタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有することであってもよい。すなわち、「Mdhタンパク質としての機能」とは、具体的には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性であってよい。
　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性（オキサロ酢酸生成方向）は、ＮＡＤ＋の存在下で酵素を基質（リンゴ酸）とインキュベートし、ＮＡＤＨの生成を測定することにより、測定できる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性（リンゴ酸生成方向）は、ＮＡＤＨの存在下で酵素を基質（オキサロ酢酸）とインキュベートし、ＮＡＤＨの減少を測定することにより、測定できる。
　以下、保存的バリアントについて例示する。
　mdh遺伝子のホモログまたはMdhタンパク質のホモログは、例えば、上記例示したmdh遺伝子の塩基配列または上記例示したMdhタンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、mdh遺伝子のホモログは、例えば、コリネ型細菌の染色体を鋳型にして、これら公知のmdh遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
　mdh遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したMdhタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号４０に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　また、mdh遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したMdhタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号４０に示すアミノ酸配列）全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　また、mdh遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したmdh遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号３９に示す塩基配列）の相補配列又は同相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いDNA同士、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。
　上記プローブは、例えば、遺伝子の相補配列の一部であってよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。プローブとしては、例えば、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
　また、mdh遺伝子は、上記例示したmdh遺伝子またはその保存的バリアントの塩基配列において、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換した塩基配列を有するものであってもよい。
　なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味する。また、塩基配列間の「同一性」とは、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味する。
　なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、PhoRSタンパク質、細胞表層タンパク質、Tat系分泌装置、本発明において分泌生産される異種タンパク質等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
＜１－３＞その他の性質
　本発明の細菌は、異種タンパク質を分泌生産できる限り、所望の性質を有していてよい。例えば、本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下していてよい（WO2013/065869、WO2013/065772、WO2013/118544、WO2013/062029）。また、本発明の細菌は、ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変されていてよい（WO2013/065869）。また、本発明の細菌は、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変されていてよい（WO2013/065772）。また、本発明の細菌は、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子（変異型rpsA遺伝子）を有するように改変されていてよい（WO2013/118544）。また、本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を有するように改変されていてよい（WO2016/171224）。また、本発明の細菌は、RegX3タンパク質の活性が低下するように改変されていてよい（WO2018/074578）。また、本発明の細菌は、HrrSAシステムの活性が低下するように改変されていてよい（WO2018/074579）。また、本発明の細菌は、Tat系分泌装置の活性が増大するように改変されていてよい。これらの性質または改変は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、利用することができる。
＜１－３－１＞変異型phoS遺伝子の導入
　本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を保持するように改変されていてよい。「変異型phoS遺伝子を保持する」ことを、「変異型phoS遺伝子を有する」または「phoS遺伝子に変異を有する」ともいう。また、「変異型phoS遺伝子を保持する」ことを、「変異型PhoSタンパク質を有する」または「PhoSタンパク質に変異を有する」ともいう。
　以下、phoS遺伝子およびPhoSタンパク質について説明する。phoS遺伝子は、PhoRSシステムのセンサーキナーゼであるPhoSタンパク質をコードする遺伝子である。PhoRSシステムは、二成分制御系の１つであり、環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する。PhoRSシステムは、phoS遺伝子にコードされるセンサーキナーゼPhoSと、phoR遺伝子にコードされるレスポンスレギュレーターPhoRとからなる。
　本発明において、「特定の変異」を有するPhoSタンパク質を「変異型PhoSタンパク質」、それをコードする遺伝子を「変異型phoS遺伝子」ともいう。「変異型phoS遺伝子」は、言い換えると、「特定の変異」を有するphoS遺伝子である。また、本発明において、「特定の変異」を有さないPhoSタンパク質を「野生型PhoSタンパク質」、それをコードする遺伝子を「野生型phoS遺伝子」ともいう。「野生型phoS遺伝子」は、言い換えると、「特定の変異」を有さないphoS遺伝子である。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。「特定の変異」については後述する。
　野生型phoS遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌のphoS遺伝子が挙げられる。コリネ型細菌のphoS遺伝子として、具体的には、例えば、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13032株、C. glutamicum ATCC14067株、C. callunae、C. crenatum、およびC. efficiensのphoS遺伝子が挙げられる。C. glutamicum YDK010株のphoS遺伝子の塩基配列を、配列番号１に示す。また、これらのphoS遺伝子がコードする野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２～７に示す。
　野生型phoS遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型phoS遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、野生型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型PhoSタンパク質のバリアントであってもよい。すなわち、「野生型phoS遺伝子」という用語は、上記例示した野生型phoS遺伝子に限られず、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものを包含するものとする。同様に、「野生型PhoSタンパク質」という用語は、上記例示した野生型PhoSタンパク質に限られず、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものを包含するものとする。野生型PhoSタンパク質および野生型phoS遺伝子のバリアントについては、上述したMdhタンパク質およびmdh遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、野生型phoS遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、野生型phoS遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　なお、「元の機能が維持されている」とは、野生型PhoSタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoSタンパク質としての機能（例えば、配列番号２～７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の機能）を有することであってよい。また、「元の機能が維持されている」とは、野生型PhoSタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有することであってもよい。すなわち、「PhoSタンパク質としての機能」とは、具体的には、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能であってよい。「PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能」とは、具体的には、レスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質と共役して環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する機能であってよい。「PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能」とは、より具体的には、環境中のリン酸欠乏を感知して自己リン酸化され、リン酸基転移によりPhoRタンパク質を活性化させる機能であってもよい。
　PhoSタンパク質のバリアントがPhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するか否かは、例えば、同バリアントをコードする遺伝子をコリネ型細菌のphoS遺伝子の欠損株に導入し、リン酸欠乏に対する応答性が相補されるか否かを確認することにより、確認できる。リン酸欠乏に対する応答性の相補は、例えば、リン酸欠乏条件での生育の向上として、またはリン酸欠乏条件で発現が誘導されることが知られている遺伝子の発現の誘導として、検出できる（J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)）。コリネ型細菌のphoS遺伝子の欠損株としては、例えば、C. glutamicum YDK010株のphoS遺伝子欠損株や、C. glutamicum ATCC13032株のphoS遺伝子欠損株を用いることができる。
　野生型PhoSタンパク質においては、自己リン酸化されるヒスチジン残基が保存されているのが好ましい。すなわち、保存的変異は、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外のアミノ酸残基において生じるのが好ましい。「自己リン酸化されるヒスチジン残基」とは、野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基を指す。また、野生型PhoSタンパク質は、例えば、上記例示した野生型PhoSタンパク質の保存配列を有するのが好ましい。すなわち、保存的変異は、例えば、上記例示した野生型PhoSタンパク質において保存されていないアミノ酸残基において生じるのが好ましい。
　変異型PhoSタンパク質は、上述したような野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「特定の変異」を有する。
　すなわち、言い換えると、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、上記例示した野生型PhoSタンパク質やその保存的バリアントと同一であってよい。具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２～７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２～７に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２～７に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　また、言い換えると、変異型PhoSタンパク質は、上記例示した野生型PhoSタンパク質において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、配列番号２～７に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　変異型phoS遺伝子は、上記のような変異型PhoSタンパク質をコードする限り、特に制限されない。
　以下、変異型PhoSタンパク質が有する「特定の変異」について説明する。
　「特定の変異」は、上述したような野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列が変化するものであって、且つ、異種タンパク質の分泌生産に有効なものであれば特に制限されない。
　「特定の変異」は、異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異であるのが好ましい。「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、変異型phoS遺伝子を有するよう改変されたコリネ型細菌（改変株）が、非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産できることをいう。「非改変株」とは、phoS遺伝子に変異を有さない対照株、すなわち変異型phoS遺伝子を有さない対照株をいい、例えば、野生株または親株であってよい。「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株の、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上、さらに好ましくは２倍以上、特に好ましくは５倍以上の量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。なお、「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、あらゆる異種タンパク質の分泌生産量が向上する必要はなく、分泌生産のターゲットとして設定した異種タンパク質の分泌生産量が向上すれば足りる。「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、具体的には、例えば、実施例に記載の異種タンパク質の分泌生産量を向上させることを意味してもよい。
　ある変異が異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異であるかどうかは、例えば、コリネ型細菌に属する菌株を基に当該変異を有するPhoSタンパク質をコードする遺伝子を有するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。
　アミノ酸配列の変化としては、アミノ酸残基の置換が好ましい。すなわち、「特定の変異」は、野生型PhoSタンパク質のいずれかのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されるものであるのが好ましい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、１残基であってもよく、２残基またはそれ以上の組み合わせであってもよい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、好ましくは、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であってよい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、より好ましくは、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外の、ＨｉｓＫＡドメインのアミノ酸残基であってよい。「自己リン酸化されるヒスチジン残基」とは、野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基を指す。「ＨｉｓＫＡドメイン」とは、野生型PhoSタンパク質の２６６～３３０位のアミノ酸残基からなる領域を指す。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、特に好ましくは、野生型PhoSタンパク質の３０２位のトリプトファン残基（Ｗ３０２）であってよい。
　上記変異において、置換後のアミノ酸残基としては、K（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）の内、元のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。置換後のアミノ酸残基としては、例えば、異種タンパク質の分泌生産量が向上するものを選択することができる。
　Ｗ３０２が置換される場合、置換後のアミノ酸残基としては、芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が挙げられる。「芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基」として、具体的には、K（Lys）、R（Arg）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）が挙げられる。「芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基」として、より具体的には、K（Lys）、A（Ala）、V（Val）、S（Ser）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、N（Asn）が挙げられる。
　なお、phoS遺伝子における「特定の変異」とは、コードするPhoSタンパク質に上記のような「特定の変異」を生じさせる塩基配列上の変異を意味する。
　本発明において、「野生型PhoSタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とは、配列番号２のＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。例えば、「Ｗ３０２」とは、配列番号２の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基を意味する。上記アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその絶対的な位置は前後することがある。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる野生型PhoSタンパク質において、Ｘ位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した、または挿入された場合、元のＸ位のアミノ酸残基は、それぞれ、Ｎ末端から数えてＸ－１番目またはＸ＋１番目のアミノ酸残基となるが、「野生型PhoSタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とみなされる。具体的には、例えば、配列番号２～７に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「Ｗ３０２」とは、それぞれ、３０２位、３０２位、３０２位、３２１位、２７５位、および２８６位のトリプトファン残基を指す。また、配列番号２～７に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基（自己リン酸化されるヒスチジン残基）」とは、それぞれ、２７６位、２７６位、２７６位、２９５位、２４９位、および２６０位のヒスチジン残基を指す。また、また、配列番号２～７に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「野生型PhoSタンパク質の２６６～３３０位のアミノ酸残基からなる領域（ＨｉｓＫＡドメイン）」とは、それぞれ、２６６～３３０位、２６６～３３０位、２６６～３３０位、２８５～３４９位、２３９～３０３位、および２５０～３１４位のアミノ酸残基からなる領域を指す。
　なお、ここでいう「Ｗ３０２」は、通常トリプトファン残基であるが、トリプトファン残基でなくてもよい。すなわち、野生型PhoSタンパク質が配列番号２～７に示すアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有する場合には、「Ｗ３０２」はトリプトファン残基でないことがあり得る。よって、例えば、「Ｗ３０２がシステイン残基に置換される変異」には、「Ｗ３０２」がトリプトファン残基である場合に当該トリプトファン残基がシステイン残基に置換される変異に限られず、「Ｗ３０２」がK（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、Y（Tyr）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、またはQ（Gln）である場合に当該アミノ酸残基がシステイン残基に置換される変異も包含される。他の変異についても同様である。
　任意のPhoSタンパク質のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号２におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のPhoSタンパク質のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
　変異型phoS遺伝子は、例えば、野生型phoS遺伝子を、コードされるPhoSタンパク質が上述した「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変の元になる野生型phoS遺伝子は、例えば、野生型phoS遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型phoS遺伝子は、野生型phoS遺伝子を介さずに取得することもできる。例えば、化学合成により変異型phoS遺伝子を直接取得してもよい。取得した変異型phoS遺伝子は、さらに改変して利用してもよい。
　遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
　以下、変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変する手法について説明する。
　変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変することは、変異型phoS遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより達成できる。また、変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変することは、コリネ型細菌の染色体上のphoS遺伝子に上述した「特定の変異」を導入することによっても達成できる。染色体上の遺伝子への変異導入は、自然変異、変異原処理、または遺伝子工学的手法により達成できる。
　変異型phoS遺伝子をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。本発明の細菌において、変異型phoS遺伝子は、コリネ型細菌で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、phoS遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。本発明の細菌において、変異型phoS遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピー有していてもよい。本発明の細菌は、１種類の変異型phoS遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型phoS遺伝子を有していてもよい。変異型phoS遺伝子の導入は、例えば、後述する、遺伝子の発現を上昇させる手法における遺伝子の導入や、本発明に用いられる遺伝子構築物の導入と同様に行うことができる。
　本発明の細菌は、野生型phoS遺伝子を有していてもよく、有していなくともよいが、有していないのが好ましい。
　野生型phoS遺伝子を有さないコリネ型細菌は、染色体上の野生型phoS遺伝子を破壊することにより取得できる。野生型phoS遺伝子の破壊は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、野生型phoS遺伝子のプロモーター領域および／またはコード領域の一部または全部を欠損させることにより野生型phoS遺伝子を破壊できる。
　また、染色体上の野生型phoS遺伝子を変異型phoS遺伝子で置換することにより、野生型phoS遺伝子を有さず、且つ、変異型phoS遺伝子を有するように改変されたコリネ型細菌を取得できる。このような遺伝子置換を行う方法としては、例えば、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などが挙げられる（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
　PhoSタンパク質は、レスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質と共役して機能する、すなわち環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する。したがって、本発明の細菌は、変異型PhoSタンパク質が機能するよう、phoR遺伝子を有する。phoR遺伝子は、PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質をコードする遺伝子である。「phoR遺伝子を有する」ことを、「PhoRタンパク質を有する」ともいう。通常、本発明の細菌が本来的に有するPhoRタンパク質が変異型PhoSタンパク質と共役して機能すれば足りる。一方、本発明の細菌には、本発明の細菌が本来的に有するphoR遺伝子に加えて、あるいは代えて、適当なphoR遺伝子が導入されていてもよい。導入されるphoR遺伝子は、変異型PhoSタンパク質と共役して機能するPhoRタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。
　phoR遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌のphoR遺伝子が挙げられる。コリネ型細菌のphoR遺伝子として、具体的には、例えば、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13032株、C. glutamicum ATCC14067株、C. callunae、C. crenatum、およびC. efficiensのphoR遺伝子が挙げられる。C. glutamicum ATCC13032株のphoR遺伝子の塩基配列およびPhoRタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８および９に示す。
　phoR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したphoR遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、PhoRタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したPhoRタンパク質のバリアントであってもよい。すなわち、「phoR遺伝子」という用語には、上記例示したphoR遺伝子に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。同様に、「PhoRタンパク質」という用語には、上記例示したPhoRタンパク質に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。PhoRタンパク質およびphoR遺伝子のバリアントについては、上述したMdhタンパク質およびmdh遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、phoR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、phoR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、PhoRタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoRタンパク質としての機能（例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の機能）を有することであってよい。また、「元の機能が維持されている」とは、PhoRタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能を有することであってもよい。すなわち、「PhoRタンパク質としての機能」とは、具体的には、PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能であってよい。「PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能」とは、具体的には、センサーキナーゼであるPhoSタンパク質と共役して環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する機能であってよい。「PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能」とは、より具体的には、環境中のリン酸欠乏を感知して自己リン酸化されたPhoSタンパク質からのリン酸基転移により活性化され、環境中のリン酸欠乏に応答する遺伝子の発現を制御する機能であってもよい。
　PhoRタンパク質のバリアントがPhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能を有するか否かは、例えば、同バリアントをコードする遺伝子をコリネ型細菌のphoR遺伝子の欠損株に導入し、リン酸欠乏に対する応答性が相補されるか否かを確認することにより、確認できる。リン酸欠乏に対する応答性の相補は、例えば、リン酸欠乏条件での生育の向上として、またはリン酸欠乏条件で発現が誘導されることが知られている遺伝子の発現の誘導として、検出できる（J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)）。コリネ型細菌のphoR遺伝子の欠損株としては、例えば、C. glutamicum YDK010株のphoR遺伝子欠損株や、C. glutamicum ATCC13032株のphoR遺伝子欠損株を用いることができる。
＜１－３－２＞細胞表層タンパク質の活性低下
　本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下しているものであってよい。本発明の細菌は、具体的には、細胞表層タンパク質の活性が非改変株と比較して低下しているものであってよい。「細胞表層タンパク質の活性が低下する」とは、特に、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が低下することを意味してもよい。以下に、細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子について説明する。
　細胞表層タンパク質は、細菌や古細菌の細胞表層（Ｓ層）を構成するタンパク質である。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumのPS1およびPS2（CspB）（特表平6-502548）、ならびにC. stationisのSlpA（CspA）（特開平10-108675）が挙げられる。これらの中では、PS2タンパク質の活性を低下させるのが好ましい。
　C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPS2タンパク質（CspBタンパク質）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０および１１に示す。
　また、例えば、28株のC. glutamicumについて、CspBホモログのアミノ酸配列が報告されている（J Biotechnol., 112, 177-193(2004)）。これら28株のC. glutamicumとcspB遺伝子ホモログのＮＣＢＩデータベースのGenBank accessionナンバーを以下に例示する（カッコ内がGenBank accessionナンバーを示す）。
C. glutamicum ATCC13058（AY524990）
C. glutamicum ATCC13744（AY524991）
C. glutamicum ATCC13745（AY524992）
C. glutamicum ATCC14017（AY524993）
C. glutamicum ATCC14020（AY525009）
C. glutamicum ATCC14067（AY524994）
C. glutamicum ATCC14068（AY525010）
C. glutamicum ATCC14747（AY525011）
C. glutamicum ATCC14751（AY524995）
C. glutamicum ATCC14752（AY524996）
C. glutamicum ATCC14915（AY524997）
C. glutamicum ATCC15243（AY524998）
C. glutamicum ATCC15354（AY524999）
C. glutamicum ATCC17965（AY525000）
C. glutamicum ATCC17966（AY525001）
C. glutamicum ATCC19223（AY525002）
C. glutamicum ATCC19240（AY525012）
C. glutamicum ATCC21341（AY525003）
C. glutamicum ATCC21645（AY525004）
C. glutamicum ATCC31808（AY525013）
C. glutamicum ATCC31830（AY525007）
C. glutamicum ATCC31832（AY525008）
C. glutamicum LP-6（AY525014）
C. glutamicum DSM20137（AY525015）
C. glutamicum DSM20598（AY525016）
C. glutamicum DSM46307（AY525017）
C. glutamicum 22220（AY525005）
C. glutamicum 22243（AY525006）
　コリネ型細菌が属する種又は菌株によって、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示した細胞表層タンパク質をコードする遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、細胞表層タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示した細胞表層タンパク質のバリアントであってもよい。すなわち、例えば、「cspB遺伝子」という用語には、上記例示したcspB遺伝子に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。同様に、「CspBタンパク質」という用語には、上記例示したCspBタンパク質に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したMdhタンパク質およびmdh遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、細胞表層タンパク質にあっては、例えば、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有することであってよい。
　「コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質」とは、コリネ型細菌で活性を低下させたときに非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する能力をコリネ型細菌に付与する性質をいう。「非改変株」とは、細胞表層タンパク質の活性が低下していない対照株をいい、例えば、野生株または親株であってよい。「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株の、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上、特に好ましくは２倍以上の量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。
　あるタンパク質がコリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するかどうかは、コリネ型細菌に属する菌株を基にそのタンパク質の活性が低下するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。
　本発明において、「細胞表層タンパク質の活性が低下している」ことには、細胞表層タンパク質の活性が低下するようにコリネ型細菌が改変された場合、および、コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合が包含される。「コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合」には、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合が包含される。すなわち、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌としては、例えば、もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌が挙げられる。「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合」としては、例えば、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質をコードする遺伝子を有さない場合が挙げられる。なお、「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、コリネ型細菌が、当該コリネ型細菌が属する種の他の株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質をもともと有さないことであってよい。例えば、「C. glutamicumがもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、C. glutamicum株が、他のC. glutamicum株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質、すなわち、例えばPS1および／またはPS2（CspB）、をもともと有さないことであってよい。もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌としては、例えば、もともとcspB遺伝子を有さないC. glutamicum ATCC 13032が挙げられる。
＜１－３－３＞タンパク質の分泌系
　本発明の細菌は、タンパク質の分泌系を有する。タンパク質の分泌系は、目的の異種タンパク質を分泌できるものであれば、特に制限されない。タンパク質の分泌系としては、Sec系（Sec系分泌装置）やTat系（Tat系分泌装置）が挙げられる。本発明の細菌は、タンパク質の分泌系が増強されていてもよい。例えば、本発明の細菌は、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されていてもよい。本発明において、このような改変を「Tat系分泌装置の増強」ともいう。Tat系分泌装置の増強は、特に、Tat系依存シグナルペプチドを利用して異種タンパク質を分泌生産する場合に好適である。Tat系分泌装置をコードする遺伝子の発現を上昇させる手法については特許第4730302号に記載されている。
　Tat系分泌装置をコードする遺伝子としては、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子が挙げられる。
　Tat系分泌装置をコードする遺伝子として、具体的には、C. glutamicumのtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子が挙げられる。C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263)として登録されているゲノム配列中、1571065～1571382位の配列の相補配列、1167110～1167580位の配列、および1569929～1570873位の配列の相補配列に相当する。また、C. glutamicum ATCC 13032のTatAタンパク質、TatBタンパク質、およびTatCタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_600707 (version NP_600707.1 GI:19552705、locus_tag=”NCgl1434”)、GenBank accession NP_600350 (version NP_600350.1 GI:19552348、locus_tag=”NCgl1077”)、およびGenBank accession NP_600706 (version NP_600706.1 GI:19552704、locus_tag=”NCgl1433”)として登録されている。C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子の塩基配列ならびにTatAタンパク質、TatBタンパク質、およびTatCタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２～１７に示す。
　また、Tat系分泌装置をコードする遺伝子として、具体的には、E. coliのtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子が挙げられる。E.coli K-12 MG1655のtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4019968～4020237位の配列、4020241～4020756位の配列、4020759～4021535位の配列、658170～658373位の配列に相当する。また、E.coli K-12 MG1655のTatAタンパク質、TatBタンパク質、TatCタンパク質、およびTatEタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418280 (version NP_418280.4 GI:90111653、locus_tag=”b3836”)、GenBank accession YP_026270 (version YP_026270.1 GI:49176428、locus_tag=”b3838”)、GenBank accession NP_418282 (versionNP_418282.1 GI:16131687、locus_tag=”b3839”)、およびGenBank accession NP_415160 (versionNP_415160.1 GI:16128610、locus_tag=”b0627”)として登録されている。
　Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したTat系分泌装置をコードする遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、Tat系分泌装置は、元の機能が維持されている限り、上記例示したTat系分泌装置のバリアントであってもよい。すなわち、例えば、「tatA遺伝子」、「tatB遺伝子」、「tatC遺伝子」、および「tatE遺伝子」という用語には、それぞれ、上記例示したtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。同様に、「TatAタンパク質」、「TatBタンパク質」、「TatCタンパク質」、および「TatEタンパク質」という用語には、それぞれ、上記例示したTatAタンパク質、TatBタンパク質、TatCタンパク質、およびTatEタンパク質に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。Tat系分泌装置およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したMdhタンパク質およびmdh遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、Tat系分泌装置にあっては、Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質を細胞外に分泌する機能を有することであってよい。
＜１－４＞タンパク質の活性を低下させる手法
　以下に、Mdhタンパク質等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。なお、以下に記載するタンパク質の活性を低下させる手法は、野生型PhoSタンパク質の破壊にも利用できる。
　「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、コリネ型細菌の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の細菌が属する種の基準株）と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum YDK010株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。「タンパク質の細胞当たりの分子数」とは、同タンパク質の分子数の細胞当たりの平均値を意味してよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含される。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含される。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子の発現調節配列を改変することにより達成できる。「発現調節配列」とは、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列は、例えば、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部の領域を欠失（欠損）させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（例えば活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が包含される。
　遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子のコード領域の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現調節配列が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１～２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
　遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。タンパク質のアミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
　Mdhタンパク質の場合、例えば、少なくとも、そのアミノ酸配列のＣ末端の１残基、３残基、５残基、７残基、１０残基、１３残基、１４残基、１５残基、１６残基、１７残基、１８残基、または１９残基を欠失させてもよい。Mdhタンパク質の場合、特に、少なくとも、そのアミノ酸配列のＣ末端の１６残基を欠失させてもよい。例えば、配列番号４０に示すMdhタンパク質の場合、配列番号４０の３１３位～３２８位のアミノ酸配列が「Ｃ末端の１６残基」である。また、Mdhタンパク質の場合、例えば、少なくとも、Mdhタンパク質のアミノ酸配列における、配列番号４０の上記Ｃ末端の部位（例えばＣ末端の１６残基）に相当する部位を欠失させてもよい。任意のMdhタンパク質における「配列番号４０の上記Ｃ末端の部位に相当する部位」の位置については、上述した「野生型PhoSタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」の位置についての説明を準用できる。
　染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子が挙げられる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の破壊に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
　上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-Seq等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の量が低下したことの確認は、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの強度を確認することによって行うことができる。また、タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
　上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質の活性低下や任意の遺伝子の発現低下に利用できる。
＜１－５＞遺伝子の発現を上昇させる手法
　以下に、Tat系分泌装置をコードする遺伝子等の遺伝子の発現を上昇させる手法について説明する。
　「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇していることを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して上昇していることを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的の遺伝子の発現が上昇するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、コリネ型細菌の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、遺伝子の発現は、基準株（すなわち本発明の細菌が属する種の基準株）と比較して上昇してよい。また、別の態様において、遺伝子の発現は、C. glutamicum ATCC 13032と比較して上昇してもよい。また、別の態様において、遺伝子の発現は、C. glutamicum ATCC 13869と比較して上昇してもよい。また、別の態様において、遺伝子の発現は、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)と比較して上昇してもよい。また、別の態様において、遺伝子の発現は、C. glutamicum YDK010株と比較して上昇してもよい。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現の上昇の程度は、遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇していれば特に制限されない。遺伝子の発現は、非改変株の、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることも包含される。
　遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
　遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。具体的には、標的遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換し、宿主の染色体上の標的部位と相同組み換えを起こすことにより、該遺伝子を宿主の染色体上に導入することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、標的遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、該遺伝子の両端に染色体上の標的部位の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、標的部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、標的部位を該遺伝子に置換することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を備えていてよい。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する塩基配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する塩基配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な塩基配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP0805867B1）。トランスポゾンとしては、人工トランスポゾンを利用してもよい（特開平9-70291）。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の導入に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。
　染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
　また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；pCRY30（特開平3-210184）；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX（特開平2-72876、米国特許5,185,262号）；pCRY2およびpCRY3（特開平1-191686）；pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844（特開昭58-192900）；pCG1（特開昭57-134500）；pCG2（特開昭58-35197）；pCG4およびpCG11（特開昭57-183799）；pVK7（特開平10-215883）；pVK9（US2006-0141588）；pVC7（特開平9-070291）；pVS7（WO2013/069634）が挙げられる。
　遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に宿主に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、宿主で機能するプロモーターによる制御を受けて発現するように保持されていればよい。プロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、後述するような、コリネ型細菌で機能するプロモーターを利用することができる。
　遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。
　各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８　遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
　また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。
　導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。あるいは、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。
　また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる。相同組み換えを利用した改変手法としては、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）が挙げられる。
　遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnol., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
　遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235）。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
　遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
　また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
　上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
　形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1977. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。コリネ型細菌の形質転換は、具体的には、例えば、プロトプラスト法（Gene, 39, 281-286(1985)）、エレクトロポレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報）等により行うことができる。
　遺伝子の発現が上昇したことは、例えば、同遺伝子から発現するタンパク質の活性が上昇したことを確認することにより確認できる。タンパク質の活性が上昇したことは、同タンパク質の活性を測定することにより確認できる。例えば、Tat系分泌装置の活性が上昇したことは、例えば、Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質の分泌生産量が増大したことを確認することにより確認できる。その場合、Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質の分泌生産量は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。
　また、遺伝子の発現が上昇したことは、例えば、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-Seq等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
　タンパク質の量が上昇したことの確認は、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの強度を確認することによって行うことが出来る。また、タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
　上記した遺伝子の発現を上昇させる手法は、任意の遺伝子の発現増強に利用できる。
＜１－６＞異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物とその導入
　分泌性タンパク質（secretory protein）は、一般に、プレタンパク質（プレペプチドともいう）またはプレプロタンパク質（プレプロペプチドともいう）として翻訳され、その後、プロセッシングにより成熟タンパク質（mature protein）になることが知られている。具体的には、分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質またはプレプロタンパク質として翻訳された後、プレ部分であるシグナルペプチドがプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断されて成熟タンパク質またはプロタンパク質に変換され、プロタンパク質はプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟タンパク質になる。よって、本発明の方法においては、異種タンパク質の分泌生産にシグナルペプチドを利用する。なお、本発明において、分泌型タンパク質のプレタンパク質およびプレプロタンパク質を総称して「分泌型タンパク質前駆体」という場合がある。本発明において、「シグナルペプチド」（「シグナル配列」ともいう）とは、分泌性タンパク質前駆体のN末端に存在し、かつ、通常、天然の成熟タンパク質には存在しないアミノ酸配列をいう。
　本発明に用いられる遺伝子構築物は、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター配列の下流に、同プロモーターによる制御を受けてシグナルペプチドが発現するよう連結されていればよい。異種タンパク質をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、同シグナルペプチドとの融合タンパク質として異種タンパク質が発現するよう連結されていればよい。当該融合タンパク質を「本発明の融合タンパク質」ともいう。なお、本発明の融合タンパク質において、シグナルペプチドと異種タンパク質とは隣接していてもよく、していなくてもよい。すなわち、「異種タンパク質がシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する」とは、異種タンパク質がシグナルペプチドに隣接して同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する場合に限られず、異種タンパク質が他のアミノ酸配列を介してシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する場合も包含される。例えば、後述するように、本発明の融合タンパク質において、シグナルペプチドと異種タンパク質との間には、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列や酵素的切断に使用されるアミノ酸配列等の挿入配列が含まれ得る。また、後述するように、最終的に得られる異種タンパク質はシグナルペプチドを有さなくてよい。すなわち、「異種タンパク質がシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する」とは、異種タンパク質が発現時にシグナルペプチドとの融合タンパク質を構成していれば足り、最終的に得られる異種タンパク質がシグナルペプチドとの融合タンパク質を構成していることを要さない。プロモーター配列を「プロモーター」ともいう。核酸配列は「遺伝子」と読み替えてもよい。例えば、異種タンパク質をコードする核酸配列を「異種タンパク質をコードする遺伝子」または「異種タンパク質遺伝子」ともいう。核酸配列としては、ＤＮＡが挙げられる。また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、コリネ型細菌で本発明の融合タンパク質を発現させるために有効な制御配列（オペレーター、ＳＤ配列、ターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有していてもよい。
　本発明で使用されるプロモーターは、コリネ型細菌で機能するプロモーターである限り特に制限されない。プロモーターは、コリネ型細菌由来（例えば宿主由来）のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、異種タンパク質遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。「コリネ型細菌で機能するプロモーター」とは、コリネ型細菌においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。
　異種由来のプロモーターとして、具体的には、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、およびaraBADプロモーター等のE.coli由来のプロモーターが挙げられる。中でも、tacプロモーター等の強力なプロモーターや、araBADプロモーター等の誘導型のプロモーターが好ましい。
　コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質であるPS1、PS2（CspBともいう）、SlpA（CspAともいう）の遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターが挙げられる。各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターとして、具体的には、例えば、グルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート（PRPP）アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子、およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
　また、コリネ型細菌で機能するプロモーターとしては、上述したような、コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
　本発明で使用されるシグナルペプチドは、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドである限り特に制限されない。シグナルペプチドは、コリネ型細菌由来（例えば宿主由来）のシグナルペプチドであってもよく、異種由来のシグナルペプチドであってもよい。シグナルペプチドは、異種タンパク質の固有のシグナルペプチドであってもよく、他のタンパク質のシグナルペプチドであってもよい。「コリネ型細菌で機能するシグナルペプチド」とは、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、コリネ型細菌が当該タンパク質を分泌することができるペプチドをいう。あるシグナルペプチドがコリネ型細菌で機能するかどうかは、例えば、目的のタンパク質を当該シグナルペプチドと融合させて発現させ、当該タンパク質が分泌されるかを確認することで確認できる。
　シグナルペプチドとしては、Tat系依存シグナルペプチドやSec系依存シグナルペプチドが挙げられる。
　「Tat系依存シグナルペプチド」とは、Tat系によって認識されるシグナルペプチドをいう。「Tat系依存シグナルペプチド」とは、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Tat系分泌装置により当該タンパク質が分泌されるペプチドであってよい。
　Tat系依存シグナルペプチドとしては、例えば、E. coliのTorAタンパク質（トリメチルアミン-N-オキシドレダクターゼ）のシグナルペプチド、E. coliのSufIタンパク質（ftsIのサプレッサー）のシグナルペプチド、Bacillus subtilisのPhoDタンパク質（ホスホジエステラーゼ）のシグナルペプチド、Bacillus subtilisのLipAタンパク質（リポ酸シンターゼ）のシグナルペプチド、Arthrobacter globiformisのIMDタンパク質（イソマルトデキストラナーゼ）のシグナルペプチドが挙げられる。これらのシグナルペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
TorAシグナルペプチド：MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA（配列番号１８）
SufIシグナルペプチド：MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA（配列番号１９）
PhoDシグナルペプチド：MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQS（配列番号２０）
LipAシグナルペプチド：MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH（配列番号２１）
IMDシグナルペプチド：MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA（配列番号２２）
　Tat系依存シグナルペプチドは、ツイン・アルギニンモチーフを有する。ツイン・アルギニンモチーフとしては、例えば、S/T-R-R-X-F-L-K（配列番号２３）やR-R-X-#-#（X：天然に生じる（naturally occurring）アミノ酸残基, #:疎水性アミノ酸残基）が挙げられる。
　「Sec系依存シグナルペプチド」とは、Sec系によって認識されるシグナルペプチドをいう。「Sec系依存シグナルペプチド」とは、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Sec系分泌装置により当該タンパク質が分泌されるペプチドであってよい。
　Sec系依存シグナルペプチドとしては、例えば、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドが挙げられる。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質については、上述の通りである。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumに由来するPS1及びPS2（CspB）（特表平6-502548）、及びC. stationisに由来するSlpA（CspA）（特開平10-108675）が挙げられる。C. glutamicumのPS1のシグナルペプチド（PS1シグナルペプチド）のアミノ酸配列を配列番号２５に、C. glutamicumのPS2（CspB）のシグナルペプチド（PS2シグナルペプチド）のアミノ酸配列を配列番号２６に、C. stationisのSlpA（CspA）のシグナルペプチド（SlpAシグナルペプチド）のアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
　Tat系依存シグナルペプチドは、ツイン・アルギニンモチーフを有し、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示したTat系依存シグナルペプチドのバリアントであってもよい。また、Sec系依存シグナルペプチドは、元の機能が維持されている限り、上記例示したSec系依存シグナルペプチドのバリアントであってもよい。シグナルペプチドおよびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したMdhタンパク質およびmdh遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、シグナルペプチドは、上記例示したシグナルペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。なお、シグナルペプチドのバリアントにおける上記「１又は数個」とは、具体的には、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個を意味する。なお、本発明において、「TorAシグナルペプチド」、「SufIシグナルペプチド」、「PhoDシグナルペプチド」、「LipAシグナルペプチド」、「IMDシグナルペプチド」、「PS1シグナルペプチド」、「PS2シグナルペプチド」、および「SlpAシグナルペプチド」という用語には、それぞれ、配列番号１８～２２および２５～２７に記載のペプチドに加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。
　Tat系依存シグナルペプチドについての「元の機能が維持されている」とは、Tat系によって認識されることをいい、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Tat系分泌装置により当該タンパク質が分泌される機能を有することであってよい。あるペプチドがTat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するかどうかは、例えば、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がTat系分泌装置の増強により増大することを確認することや、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がTat系分泌装置の欠損により減少することを確認することにより確認できる。
　Sec系依存シグナルペプチドについての「元の機能が維持されている」とは、Sec系によって認識されることをいい、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Sec系分泌装置により当該タンパク質が分泌される機能を有することであってよい。あるペプチドがSec系依存シグナルペプチドとしての機能を有するかどうかは、例えば、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がSec系分泌装置の増強により増大することを確認することや、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がSec系分泌装置の欠損により減少することを確認することにより確認できる。
　シグナルペプチドは、一般に、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。すなわち、最終的に得られる異種タンパク質は、シグナルペプチドを有さなくてよい。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
　本発明で用いられる遺伝子構築物においては、シグナルペプチドをコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列が挿入されていてもよい（WO2013/062029）。なお、当該「Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列」を「本発明で用いられる挿入配列」ともいう。本発明で用いられる挿入配列としては、WO2013/062029に記載されたGln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が挙げられる。本発明で用いられる挿入配列は、特に、Sec系依存シグナルペプチドと組み合わせて好適に用いることができる。
　本発明で用いられる挿入配列は、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質CspBの成熟タンパク質（以下、「成熟CspB」または「CspB成熟タンパク質」ともいう）のN末端からの３アミノ酸残基またはそれ以上からなる配列であるのが好ましい。「N末端からの３アミノ酸残基またはそれ以上からなる配列」とは、N末端の１位のアミノ酸残基から、３位またはそれ以上のアミノ酸残基までのアミノ酸配列をいう。
　コリネ型細菌の細胞表層タンパク質CspBについては、上述の通りである。CspBとして、具体的には、例えば、C.glutamicum ATCC13869のCspBや上記例示した28株のC. glutamicumのCspB、およびそれらのバリアントが挙げられる。配列番号１１に示すC.glutamicum ATCC13869のCspBのアミノ酸配列中、１～３０位のアミノ酸残基がシグナルペプチドに相当し、３１～４９９位のアミノ酸残基がCspB成熟タンパク質に相当する。シグナルペプチド部分３０アミノ酸残基を除いた、C.glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２８に示す。なお、C.glutamicum ATCC13869の成熟CspBにおいて、N末端の１～３位のアミノ酸残基がGln-Glu-Thrに相当する。
　本発明で用いられる挿入配列は、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、３～５０位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であるのが好ましい。本発明で用いられる挿入配列は、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、３～８、１７、５０位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であるのがより好ましい。本発明で用いられる挿入配列は、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、４、６、１７、５０位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であるのが特に好ましい。
　本発明で用いられる挿入配列は、例えば、下記Ａ～Ｈのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
（Ａ）Gln-Glu-Thr
（Ｂ）Gln-Glu-Thr-Xaa1
（Ｃ）Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2
（Ｄ）Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3
（Ｅ）Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４～７位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
（Ｆ）Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４～８位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
（Ｇ）Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４～１７位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
（Ｈ）Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４～５０位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
　Ａ～Ｈのアミノ酸配列において、Xaa1はAsn、Gly、Thr、Pro、またはAlaであり、Xaa2はPro、Thr、またはValであり、Xaa3はThrまたはTyrである。また、Ａ～Ｈのアミノ酸配列において、「Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４～Ｘ位のアミノ酸残基が付加された」とは、Gln-Glu-ThrのThrに成熟CspBのN末端の４位からＸ位までのアミノ酸残基が付加されていることを意味する。なお、通常、成熟CspBのN末端の１～３番目のアミノ酸残基はGln-Glu-Thrであり、その場合、「Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４～Ｘ位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列」とは、成熟CspBの１～Ｘ位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と同義である。
　また、本発明で用いられる挿入配列は、具体的には、例えば、Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr（配列番号３２）、Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr（配列番号３３）、Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr（配列番号３４）、Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr（配列番号３５）、およびGln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr（配列番号３６）からなる群より選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
　本発明において、「成熟CspBのＸ位のアミノ酸残基」とは、配列番号２８におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。任意の成熟CspBのアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号２８におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意の成熟CspBのアミノ酸配列と配列番号２８のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。
　本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質としては、例えば、生理活性タンパク質、レセプタータンパク質、ワクチンとして使用される抗原タンパク質、酵素、その他任意のタンパク質が挙げられる。
　酵素としては、例えば、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼ、およびキチナーゼ等が挙げられる。トランスグルタミナーゼとしては、例えば、Streptoverticillium mobaraense IFO 13819（WO01/23591）、Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852、Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776、Streptomyces lydicus（WO9606931）等の放線菌や、Oomycetes（WO9622366）等の糸状菌の分泌型のトランスグルタミナーゼが挙げられる。プロテイングルタミナーゼとしては、例えば、Chryseobacterium proteolyticumのプロテイングルタミナーゼが挙げられる（WO2005/103278）。イソマルトデキストラナーゼとしては、例えば、Arthrobacter globiformisのイソマルトデキストラナーゼが挙げられる（WO2005/103278）。
　生理活性タンパク質としては、例えば、成長因子（増殖因子）、ホルモン、サイトカイン、抗体関連分子が挙げられる。
　成長因子（増殖因子）として、具体的には、例えば、上皮成長因子（Epidermal growth factor；EGF）、インスリン様成長因子-1（Insulin-like growth factor-1；IGF-1）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor；TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor；NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor；BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor；VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor；G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor；PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin；EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin；TPO）、酸性線維芽細胞増殖因子（acidic fibroblast growth factor；aFGFまたはFGF1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；bFGFまたはFGF2）、角質細胞増殖因子（keratinocyte growth factor；KGF-1またはFGF7やKGF-2またはFGF10）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；HGF）が挙げられる。
　ホルモンとして、具体的には、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン（somatostatin）、ヒト成長ホルモン（human growth hormone；hGH）、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）、カルシトニン（calcitonin）、エキセナチド（exenatide）が挙げられる。
　サイトカインとして、具体的には、例えば、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）が挙げられる。
　なお、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインは互いに厳密に区別されなくともよい。例えば、生理活性タンパク質は、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインから選択されるいずれか１つのグループに属するものであってもよく、それらから選択される複数のグループに属するものであってもよい。
　また、生理活性タンパク質は、タンパク質全体であってもよく、その一部であってもよい。タンパク質の一部としては、例えば、生理活性を有する部分が挙げられる。生理活性を有する部分として、具体的には、例えば、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）の成熟体のN末端３４アミノ酸残基からなる生理活性ペプチドTeriparatideが挙げられる。
　抗体関連分子とは、完全抗体を構成するドメインから選択される単一のドメインまたは２もしくはそれ以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質をいう。完全抗体を構成するドメインとしては、重鎖のドメインであるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、ならびに軽鎖のドメインであるＶＬおよびＣＬが挙げられる。抗体関連分子は、上述の分子種を含む限り、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。なお、抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。抗体関連分子として、具体的には、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Ｆｃ融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、ＶＨＨフラグメント（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））が挙げられる。抗体関連分子として、より具体的には、例えば、トラスツズマブ（Trastuzumab）、アダリムマブ（Adalimumab）、ニボルマブ（Nivolumab）が挙げられる。
　レセプタータンパク質は、特に制限されず、例えば、生理活性タンパク質やその他の生理活性物質に対するレセプタータンパク質であってよい。その他の生理活性物質としては、例えば、ドーパミン等の神経伝達物質が挙げられる。また、レセプタータンパク質は、対応するリガンドが知られていないオーファン受容体であってもよい。
　ワクチンとして使用される抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば特に制限されず、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択すればよい。
　また、その他のタンパク質として、Liver-type fatty acid-binding protein（LFABP）、蛍光タンパク質、イムノグロブリン結合タンパク質、アルブミン、細胞外タンパク質が挙げられる。蛍光タンパク質としては、Green Fluorescent Protein（GFP）が挙げられる。イムノグロブリン結合タンパク質としては、Protein A、Protein G、Protein Lが挙げられる。アルブミンとしては、ヒト血清アルブミンが挙げられる。
　細胞外タンパク質としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン、ラミニン、それらの部分配列が挙げられる。ラミニンは、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンとしては、哺乳類のラミニンが挙げられる。哺乳類としては、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等のその他の各種哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、特に、ヒトが挙げられる。ラミニンのサブユニット鎖（すなわち、α鎖、β鎖、およびγ鎖）としては、５種のα鎖（α１～α５）、３種のβ鎖（β１～β３）、３種のγ鎖（γ１～γ３）が挙げられる。ラミニンは、これらサブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンとして、具体的には、例えば、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン211、ラミニン213、ラミニン221、ラミニン311、ラミニン321、ラミニン332、ラミニン411、ラミニン421、ラミニン423、ラミニン511、ラミニン521、ラミニン523が挙げられる。ラミニンの部分配列としては、ラミニンのE8断片であるラミニンE8が挙げられる。ラミニンE8は、具体的には、α鎖のE8断片（α鎖E8）、β鎖のE8断片（β鎖E8）、およびγ鎖のE8断片（γ鎖E8）からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンE8のサブユニット鎖（すなわち、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）を総称して、「E8サブユニット鎖」ともいう。E8サブユニット鎖としては、上記例示したラミニンサブユニット鎖のE8断片が挙げられる。ラミニンE8は、これらE8サブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンE8として、具体的には、例えば、ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、ラミニン221E8、ラミニン332E8、ラミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、ラミニン521E8が挙げられる。
　これらのタンパク質等の異種タンパク質をコードする遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。異種タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、使用する宿主に応じて、および／または望みの活性を得るために、改変することができる。例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子は、コードされる異種タンパク質のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加が含まれるよう改変されてもよい。上述したMdhタンパク質およびmdh遺伝子のバリアントに関する記載は、本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質およびそれをコードする遺伝子にも準用できる。なお、由来する生物種で特定されるタンパク質は、当該生物種において見出されるタンパク質そのものに限られず、当該生物種において見出されるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのバリアントを包含するものとする。それらバリアントは、当該生物種において見出されてもよく、見出されなくてもよい。すなわち、例えば、「ヒト由来タンパク質」とは、ヒトにおいて見出されるタンパク質そのものに限られず、ヒトにおいて見出されるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのバリアントを包含するものとする。また、異種タンパク質をコードする遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてもよい。
　本発明の遺伝子構築物は、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでいてもよい。酵素的切断に使用されるアミノ酸配列を本発明の融合タンパク質に挿入することで、発現した融合タンパク質を酵素的に切断し、目的の異種タンパク質を得ることができる。
　酵素的切断に使用されるアミノ酸配列は、ペプチド結合を加水分解する酵素により認識され切断される配列であれば特に制限されず、目的の異種タンパク質のアミノ酸配列に応じて使用可能な配列を適宜選択すればよい。酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は、同アミノ酸配列に基づいて適宜設計することができる。例えば、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は、宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように設計することができる。
　酵素的切断に使用されるアミノ酸配列は、基質特異性の高いプロテアーゼの認識配列であるのが好ましい。そのようなアミノ酸配列として、具体的には、例えば、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。Factor Xaプロテアーゼはタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg（=IEGR）（配列番号３７）のアミノ酸配列を、proTEVプロテアーゼはタンパク質中のGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln（=ENLYFQ）（配列番号３８）のアミノ酸配列を認識し、各配列のC末端側を特異的に切断する。
　本発明の方法により最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と同一であってもよく、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と比較して、１又は数個のアミノ酸を余分に付加された、あるいは欠失したものであってもよい。なお上記「１又は数個」とは、目的の異種タンパク質の全長や構造等によっても異なるが、具体的には好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　また、分泌生産される異種タンパク質は、プロ構造部が付加したタンパク質（プロタンパク質）であってもよい。分泌生産される異種タンパク質がプロタンパク質である場合、最終的に得られる異種タンパク質はプロタンパク質であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、プロタンパク質はプロ構造部を切断されて成熟タンパク質になってもよい。切断は、例えば、プロテアーゼにより行うことができる。プロテアーゼを使用する場合は、最終的に得られるタンパク質の活性という観点から、プロタンパク質は一般には天然のタンパク質とほぼ同じ位置で切断されることが好ましく、天然のタンパク質と完全に同じ位置で切断され天然のものと同一の成熟タンパク質が得られるのがより好ましい。従って、一般には、天然に生じる成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位置でプロタンパク質を切断する特異的プロテアーゼが最も好ましい。しかしながら、上述の通り、最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、生産される異種タンパク質の種類や使用目的等によっては、天然のタンパク質に比較してN末端がアミノ酸１～数個分長いあるいは短いタンパク質がより適切な活性を有することがある。本発明において使用できるプロテアーゼには、Dispase（ベーリンガーマンハイム社製）のような商業的に入手できるものの他、微生物の培養液、例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。そのようなプロテアーゼは未精製状態で使用することもでき、必要に応じて適当な純度まで精製した後に使用してもよい。なお、プロ構造部を切断して成熟タンパク質を得る場合には、挿入したGln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列はプロ構造部とともに切断除去されるため、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列の後に酵素的切断に使用されるアミノ酸配列を配位せずとも目的のタンパク質を得ることができる。
　本発明に用いられる遺伝子構築物をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。「本発明に用いられる遺伝子構築物の導入」とは、同遺伝子構築物を宿主に保持させることをいう。「本発明に用いられる遺伝子構築物の導入」には、予め構築した同遺伝子構築物を宿主に一括して導入する場合に限られず、少なくとも異種タンパク質遺伝子が宿主に導入され、且つ宿主内で同遺伝子構築物が構築される場合も含まれる。本発明の細菌において、本発明に用いられる遺伝子構築物は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。本発明に用いられる遺伝子構築物の導入は、例えば、上述した、遺伝子の発現を上昇させる手法における遺伝子の導入と同様に行うことができる。なお、本発明の細菌を構築するに当たり、本発明に用いられる遺伝的構築物の導入、Mdhタンパク質の活性の低下、およびその他の改変は、任意の順番で行うことができる。
　本発明に用いられる遺伝子構築物は、例えば、同遺伝子構築物を含むベクターを用いて宿主に導入できる。例えば、本発明に用いられる遺伝子構築物をベクターと連結して同遺伝子構築物の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子構築物を宿主に導入することができる。また、例えば、ベクターがコリネ型細菌で機能するプロモーターを備える場合、当該プロモーターの下流に本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を連結することによっても、本発明に用いられる遺伝子構築物の発現ベクターを構築することができる。ベクターは、コリネ型細菌で自律複製可能なものであれば特に制限されない。コリネ型細菌で利用できるベクターについては上述の通りである。
　また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、例えば、人工トランスポゾン等のトランスポゾンを使用して宿主の染色体上に導入できる。トランスポゾンが使用される場合は、相同組換えまたはそれ自身の転移能によって本発明に用いられる遺伝子構築物が染色体上に導入される。また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、その他、相同組換えを利用する導入法により宿主の染色体上に導入できる。相同組換えを利用する導入法としては、例えば、直鎖状ＤＮＡ、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミド、または宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクター等を用いる方法が挙げられる。また、少なくとも異種タンパク質遺伝子を染色体上に導入し、本発明に用いられる遺伝子構築物を染色体上に構築してもよい。その場合、異種タンパク質遺伝子以外の、本発明に用いられる遺伝子構築物の構成要素の一部または全部は宿主の染色体上にもともと存在するものであってもよい。具体的には、例えば、宿主の染色体上にもともと存在するプロモーター配列と同プロモーター配列の下流に接続されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をそのまま利用し、同シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された遺伝子のみを目的の異種タンパク質遺伝子に置換することによっても、染色体上に本発明に用いられる遺伝子構築物が構築され、本発明の細菌を構築できる。異種タンパク質遺伝子等の、本発明に用いられる遺伝子構築物の一部の染色体への導入は、本発明に用いられる遺伝子構築物の染色体への導入と同様に行うことができる。
　本発明に用いられる遺伝子構築物やその構成要素（プロモーター配列、シグナルペプチドをコードする核酸配列、異種タンパク質をコードする核酸配列、等）は、例えば、クローニングにより取得できる。具体的には、例えば、目的の異種タンパク質を有する生物からのクローニングにより異種タンパク質遺伝子を取得し、シグナルペプチドをコードする塩基配列の導入やプロモーター配列の導入等の改変を行い、本発明に用いられる遺伝子構築物を取得できる。また、本発明に用いられる遺伝子構築物やその構成要素は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子構築物やその構成要素は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。
　なお、２またはそれ以上の種類のタンパク質を発現する場合、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、目的の異種タンパク質の分泌発現が達成できるように本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、例えば、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。「２またはそれ以上の種類のタンパク質を発現する場合」とは、例えば、２またはそれ以上の種類の異種タンパク質が分泌生産される場合や、ヘテロ多量体タンパク質が分泌生産される場合をいう。
　本発明に用いられる遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法（Gene, 39, 281-286(1985)）、エレクトロポレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報）等を使用することができる。
＜２＞異種タンパク質の製造方法
　上記のようにして得られる本発明の細菌を培養し、異種タンパク質を発現させることにより、菌体外に分泌された多量の異種タンパク質が得られる。
　本発明の細菌は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、本発明の細菌は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。
　炭素源としてはグルコースおよびスクロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養はpH5.0～8.5、15℃～37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、１～７日間程度培養する。また、コリネ型細菌のＬ－アミノ酸生産における培養条件や、その他Sec系依存またはTat系依存のシグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌生産法に記載の条件を用いることができる（WO01/23591、WO2005/103278参照）。また、異種タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌される。なお、本発明の方法によれば、生産された異種タンパク質は菌体外に分泌されるため、例えばトランスグルタミナーゼ等の微生物の菌体内で多量に蓄積すると一般に致死的であるタンパク質も、致死的影響を受けることなく連続的に生産できる。
　本発明の方法によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。また、ある場合には、培養物や培養上清をそのまま使用してもよい。本発明の方法によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶化した後に、培地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、例えば固定化酵素として使用してもよい。
　目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの分子量を確認することにより確認できる。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、抗体を用いたウェスタンブロットによって確認できる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、プロテインシークエンサーを用いて目的タンパク質のN末端アミノ酸配列を検出することによって確認できる。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、質量分析計を用いて、目的タンパク質の質量を決定することによって確認できる。また、目的の異種タンパク質が酵素や何らかの測定可能な生理活性を有するものである場合には、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、目的の異種タンパク質の酵素活性または生理活性を測定することにより確認できる。
　以下、非限定的な実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子mdhを欠損させたCorynebacterium glutamicumの構築
（１）mdh遺伝子欠損用ベクターpBS5TΔ2278の構築
　C. glutamicum ATCC13869株のゲノム配列およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（以下、Mdhと表記する）をコードするmdh遺伝子の塩基配列は既に決定されている（Genbank Accession No. AP017557, NCBI locus_tag CGBL_0122780）。mdh遺伝子の塩基配列を<配列番号３９>に、Mdhのアミノ酸配列を<配列番号４０>に示す。
　PurEluteTM Genomic DNA Kit（EdgeBio）を用いて調製したC. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、<配列番号４１>と<配列番号４２>のプライマーを用いてmdh遺伝子の5’側上流約1 kbpを、<配列番号４３>と<配列番号４４>のプライマーを用いてmdh遺伝子の3’側下流約1 kbpの領域を、それぞれPCR法によって増幅した。PCRにはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。増幅したそれぞれ約1 kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いてゲルより回収した。回収した2つのDNA断片を、インフュージョン反応によりWO2006/057450に記載のpBS5TのSmaI部位に挿入することによって、mdh遺伝子欠損用ベクターpBS5TΔ2278を得た。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
（２）YDK010::phoS(W302C)株のmdh遺伝子欠損株の構築
　実施例１（１）で構築したpBS5TΔ2278で、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)株を形質転換した。得られた形質転換体からWO2006/057450に記載の方法に従って菌株の選択を行い、mdh遺伝子が欠損したYDK010::phoS(W302C)Δ2278株を得た。
実施例２：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子mdhに終始コドンを挿入したCorynebacterium glutamicumの構築
（１）mdh遺伝子への終始コドン挿入用ベクターpBS5Ts2278の構築
　以下の方法で、mdh遺伝子に終始コドンを挿入することにより、328残基から成るMdhの313位以降のアミノ酸配列を欠失したC末端欠失型Mdhをコードするように同遺伝子を改変した株を取得した。
　PurEluteTM Genomic DNA Kit（EdgeBio）を用いて調製したC. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、<配列番号４５>と<配列番号４６>のプライマーを用いてMdhの312位のAlaをコードするGCGより5’側上流の約1 kbpを、<配列番号４７>と<配列番号４８>のプライマーを用いてMdhの313位のAsnをコードするAATの3’側下流の約1 kbpの領域を、それぞれPCR法によって増幅した。<配列番号４６>のプライマーは、312位のAlaをコードするGCGと313位のAsnをコードするAATの間に終止コドン2つ（TAGTAG）を挿入して設計した。PCRにはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。増幅したそれぞれ約1 kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いてゲルより回収した。回収した2つのDNA断片を、インフュージョン反応によりWO2006/057450に記載のpBS5TのSmaI部位に挿入することによって、mdh遺伝子への終始コドン挿入用ベクターpBS5Ts2278を得た。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
（２）YDK010::phoS(W302C)株のmdh遺伝子への終始コドン挿入株の構築
　実施例２（１）で構築したpBS5Ts2278で、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)株を形質転換した。得られた形質転換体からWO2006/057450に記載の方法に従って菌株の選択を行い、mdh遺伝子中に終止コドンが挿入されたYDK010::phoS(W302C)::s2278株を得た。
実施例３：mdh遺伝子を欠損させたCorynebacterium glutamicumを用いたProtein Lの分泌発現
　特願2016-206702に記載のProtein Lの分泌発現プラスミドpPK4_CspAss_ProteinLを用いて、YDK010::phoS(W302C)株および実施例１（２）で得られたYDK010::phoS(W302C)Δ2278株のそれぞれを形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspAss_ProteinL株およびYDK010::phoS(W302C)Δ2278/pPK4_CspAss_ProteinL株を得た。
　得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。
　培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清3.0 μlを還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Ruby（Life technologies）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)Δ2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、Protein L分泌量が顕著に向上していた（図１）。
　染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてProtein Lのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)Δ2278株でProtein Lを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010::phoS(W302C)株でProtein Lを発現させた際のバンド強度の平均値を1.00とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)Δ2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、Protein L分泌量が約2.30倍に向上していることが確認された（表１）。
　このことから、Δmdh変異（mdh遺伝子の欠損）は、Sec系のCspA分泌シグナルを用いたProtein L分泌生産において、分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例４：mdh遺伝子に終始コドンを挿入したCorynebacterium glutamicumを用いたProtein Lの分泌発現
　Protein Lの分泌発現プラスミドpPK4_CspAss_ProteinLを用いて、YDK010::phoS(W302C)株および実施例２（２）で得られたYDK010::phoS(W302C)::s2278株のそれぞれを形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspAss_ProteinL株およびYDK010::phoS(W302C)::s2278/pPK4_CspAss_ProteinL株を得た。
　得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。
　培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清3.0 μlを還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Ruby（Life technologies）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)::s2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、Protein L分泌量が顕著に向上していた（図２）。
　染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてProtein Lのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)::s2278株でProtein Lを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010::phoS(W302C)株でProtein Lを発現させた際のバンド強度の平均値を1.00とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)::s2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、Protein L分泌量が約2.78倍に向上していることが確認された（表２）。
　このことから、Δ2278変異（mdh遺伝子の欠損）だけでなく、s2278変異（mdh遺伝子への終始コドンの挿入）も、Sec系のCspA分泌シグナルを用いたProtein L分泌生産において、分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。mdh遺伝子への終止コドン挿入によりmdh遺伝子が破壊され、mdh遺伝子欠損株と同様の形質を示したと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例５：mdh遺伝子に終始コドンを挿入したCorynebacterium glutamicumを用いたLiver-type Fatty acid-binding protein（LFABP）の分泌発現
　WO2016/171224に記載のpPK4_CspB6Xa-LFABPを用いて、YDK010::phoS(W302C)株および実施例２（２）で得られたYDK010::phoS(W302C)::s2278株のそれぞれを形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LFABP株およびYDK010::phoS(W302C)::s2278/pPK4_CspB6Xa-LFABP株を得た。pPK4_CspB6Xa-LFABPは、ヒトのLiver-type fatty acid-binding protein（以下、LFABPと表記する）の分泌発現プラスミドである。pPK4_CspB6Xa-LFABPは、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子（PS2遺伝子）のプロモーター、並びに同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのシグナルペプチド30アミノ酸残基、同株由来のCspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基、Factor Xaプロテアーゼの認識配列IEGR、およびLFABPの融合タンパク質（以下、CspB6Xa-LFABPと表記する）をコードする遺伝子を有する。
　得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。
　培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.0 μlを還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Ruby（Life technologies）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)::s2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、CspB6Xa-LFABP分泌量が向上していた（図３）。
　染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてCspB6Xa-LFABPのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)::s2278株でCspB6Xa-LFABPを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010::phoS(W302C)株でCspB6Xa-LFABPを発現させた際のバンド強度の平均値を1.00とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)::s2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、CspB6Xa-LFABP分泌量が約1.53倍に向上していることが確認された（表３）。
　このことから、mdh遺伝子の破壊は、YDK010::phoS(W302C)株におけるCspB6Xa-LFABP分泌生産においても分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例６：mdh遺伝子に終始コドンを挿入したCorynebacterium glutamicumを用いたSec分泌経路からのプロトランスグルタミナーゼの分泌発現
　WO2001/23591に記載のpPKSPTG1を用いて、YDK010::phoS(W302C)株および実施例２（２）で得られたYDK010::phoS(W302C)::s2278株のそれぞれを形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPKSPTG1株およびYDK010::phoS(W302C)::s2278/pPKSPTG1株を得た。pPKSPTG1は、S. mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ；以下、PTGと表記する）の分泌発現プラスミドである。pPKSPTG1は、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子（PS2遺伝子）のプロモーター、並びに同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes ATCC6872株由来のCspA（SlpA；Genbank Accession No. BAB62413）のシグナルペプチド25アミノ酸残基とPTGの融合タンパク質をコードする遺伝子を有する。
　得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。
　培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Ruby（Life technologies）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)::s2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、PTG分泌量が向上していた（図４）。
　染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてPTGのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)::s2278株でPTGを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010::phoS(W302C)株でPTGを発現させた際のバンド強度の平均値を1.00とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)::s2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、PTG分泌量が約1.86倍に向上していることが確認された（表４）。
　このことから、mdh遺伝子の破壊は、YDK010::phoS(W302C)株におけるPTG分泌生産においても、分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例７：mdh遺伝子に終始コドンを挿入したCorynebacterium glutamicumを用いたTat分泌経路からのプロトランスグルタミナーゼの分泌発現
　WO2016/171224に記載のpPK6_T_PTGを用いて、YDK010::phoS(W302C)株および実施例２（２）で得られたYDK010::phoS(W302C)::s2278株のそれぞれを形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_PTG株およびYDK010::phoS(W302C)::s2278/pPK6_T_PTG株を得た。pPK6_T_PTGは、TatABC分泌装置と、S. mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ；以下、PTGと表記する）の共発現プラスミドである。pPK6_T_PTGは、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子（PS2遺伝子）のプロモーター、並びに同プロモーターの下流に発現可能に連結されたE. coli由来のTorAシグナルペプチドとPTGの融合タンパク質をコードする遺伝子を有する。
　得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。
　培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清1.0 μlを還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Ruby（Life technologies）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)::s2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、PTG分泌量が顕著に向上していた（図５）。
　染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてPTGのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)::s2278株でPTGを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010::phoS(W302C)株でPTGを発現させた際のバンド強度の平均値を1.00とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)::s2278株では、YDK010::phoS(W302C)株と比較して、PTG分泌量が約1.83倍に向上していることが確認された（表５）。
　このことから、mdh遺伝子の破壊は、YDK010::phoS(W302C)株におけるTorAシグナル配列を用いたPTG分泌生産においても、分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。すなわち、mdh遺伝子の破壊は、Sec系分泌経路に限られず、Tat系分泌経路でも、異種タンパク質分泌量を有意に向上できる変異であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
〔配列表の説明〕
配列番号１：C. glutamicum YDK010のphoS遺伝子の塩基配列
配列番号２：C. glutamicum YDK010のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：C. glutamicum ATCC 13032のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：C. glutamicum ATCC 14067のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：C. callunaeのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：C. crenatumのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：C. efficiensのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８：C. glutamicum ATCC 13032のphoR遺伝子の塩基配列
配列番号９：C. glutamicum ATCC 13032のPhoRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：C. glutamicum ATCC 13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号１１：C. glutamicum ATCC 13869のCspBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２：C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子の塩基配列
配列番号１３：C. glutamicum ATCC 13032のTatAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４：C. glutamicum ATCC 13032のtatB遺伝子の塩基配列
配列番号１５：C. glutamicum ATCC 13032のTatBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６：C. glutamicum ATCC 13032のtatC遺伝子の塩基配列
配列番号１７：C. glutamicum ATCC 13032のTatCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１８：TorAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号１９：SufIシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２０：PhoDシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２１：LipAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２２：IMDシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２３：ツイン・アルギニンモチーフのアミノ酸配列
配列番号２４：スキップされた配列（skipped sequence）
配列番号２５：PS1シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２６：PS2シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２７：SlpAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２８：C. glutamicum ATCC 13869のCspB成熟タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９～３１：スキップされた配列（skipped sequence）
配列番号３２～３６：本発明で用いられる挿入配列の一態様のアミノ酸配列
配列番号３７：Factor Xaプロテアーゼの認識配列
配列番号３８：ProTEVプロテアーゼの認識配列
配列番号３９：C. glutamicum ATCC 13869のmdh遺伝子の塩基配列
配列番号４０：C. glutamicum ATCC 13869のMdhタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１～４８：プライマー

Claims (23)

  1. 　異種タンパク質の製造方法であって、
    　異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および
    　分泌生産された異種タンパク質を回収することを含み、
    　前記コリネ型細菌が、Mdhタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
    　前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
    　前記異種タンパク質が、前記シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
  2. 　前記Mdhタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１に記載の方法：
    （ａ）配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号４０に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号４０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  3. 　mdh遺伝子の発現を低下させることにより、またはmdh遺伝子を破壊することにより、Mdhタンパク質の活性が低下した、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　Mdhタンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、Mdhタンパク質の活性が低下した、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　少なくとも、Mdhタンパク質のアミノ酸配列における、配列番号４０の３１３位～３２８位に相当する部位が欠失した、請求項４に記載の方法。
  6. 　少なくとも、Mdhタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端の１６残基が欠失した、請求項４に記載の方法。
  7. 　前記欠失が、mdh遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失、mdh遺伝子のコード領域への終止コドンの導入、mdh遺伝子のコード領域におけるフレームシフト、またはそれらの組み合わせにより生じた、請求項４に記載の方法。
  8. 　前記コリネ型細菌が、さらに、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されている、請求項１または２に記載の方法。
  9. 　前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号２の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記野生型PhoSタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項９に記載の方法：
    （ａ）配列番号２～７のいずれかに示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号２～７のいずれかに示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２～７のいずれかに示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質。
  12. 　前記シグナルペプチドがTat系依存シグナルペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
  13. 　前記Tat系依存シグナルペプチドが、TorAシグナルペプチド、SufIシグナルペプチド、PhoDシグナルペプチド、LipAシグナルペプチド、およびIMDシグナルペプチドからなる群より選択されるいずれか１つのシグナルペプチドである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記コリネ型細菌が、さらに、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１種またはそれ以上の遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇するように改変されている、請求項１２に記載の方法。
  15. 　前記Tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子からなる、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記シグナルペプチドがSec系依存シグナルペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
  17. 　前記Sec系依存シグナルペプチドが、PS1シグナルペプチド、PS2シグナルペプチド、およびSlpAシグナルペプチドからなる群より選択されるいずれか１種のシグナルペプチドである、請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
  19. 　前記遺伝子構築物が、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、請求項１または２に記載の方法。
  21. 　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）に由来する改変株またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869に由来する改変株である、請求項２１に記載の方法。
  23. 　前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が非改変株と比較して低下しているコリネ型細菌である、請求項１または２に記載の方法。
     
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