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WO2024171859A1 - ｐＨ応答性リン脂質 - Google Patents

ｐＨ応答性リン脂質 Download PDF

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Publication number
WO2024171859A1
WO2024171859A1 PCT/JP2024/003597 JP2024003597W WO2024171859A1 WO 2024171859 A1 WO2024171859 A1 WO 2024171859A1 JP 2024003597 W JP2024003597 W JP 2024003597W WO 2024171859 A1 WO2024171859 A1 WO 2024171859A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phospholipid
lipid
acid
present
hydrocarbon group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2024/003597
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
知浩 浅井
朋之 ▲高▼下
尚文 深田
典之 前田
寿夫 黒崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nippon Fine Chemical Co Ltd
University of Shizuoka
Original Assignee
Nippon Fine Chemical Co Ltd
University of Shizuoka
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Fine Chemical Co Ltd, University of Shizuoka filed Critical Nippon Fine Chemical Co Ltd
Priority to JP2025501065A priority Critical patent/JPWO2024171859A5/ja
Priority to AU2024223474A priority patent/AU2024223474A1/en
Priority to CN202480012689.1A priority patent/CN120712274A/zh
Priority to KR1020257028167A priority patent/KR20250149697A/ko
Priority to EP24756709.2A priority patent/EP4667475A1/en
Publication of WO2024171859A1 publication Critical patent/WO2024171859A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars

Definitions

  • the present invention relates to pH-responsive phospholipids.
  • mRNA messenger RNA
  • RNA As a delivery system for drugs such as RNA, it is known that the drug is administered in a state where it is encapsulated in lipid particles.
  • positively charged lipids are usually used to cause electrostatic interactions, which raises concerns about cytotoxicity (Patent Document 1).
  • cytotoxicity can be reduced when the lipid particles do not have a positive charge at the pH of body fluids (usually in the neutral range).
  • the present invention aims to provide lipid particles that are not positively charged at the pH of body fluids (usually in the neutral range) and that are capable of more efficiently exerting the effects of an encapsulated drug, and lipids for forming the lipid particles.
  • a further aim of the present invention is to provide lipid particles that are capable of more efficiently encapsulating a drug and/or have a size suitable for more efficiently delivering the drug, and lipids for forming the lipid particles.
  • phospholipids represented by general formula (1) can form lipid particles that are not positively charged at the pH of body fluids (usually in the neutral range) and that allow the encapsulated drug to exert its effects more efficiently.
  • the present invention encompasses the following aspects:
  • R1 and R2 may be the same or different and each represent a chain hydrocarbon group.
  • R3 , R4 , and R5 may be the same or different and each represent a hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms.
  • m represents 1 or 2
  • n represents 1 or 2
  • p represents a natural number from 1 to 3.
  • the phospholipid according to item 1, wherein R 3 , R 4 and R 5 are the same or different and each represent a hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms. 3.
  • the lipid particle according to item 8 which encapsulates a drug.
  • the lipid particle according to item 9 wherein the drug is a polynucleotide.
  • the lipid particle according to item 10, wherein the polynucleotide is messenger RNA. 12.
  • a method for producing lipid particles comprising a step of mixing the alcohol solution according to item 15 or 16 with an acidic aqueous solution containing a water-soluble drug. 18.
  • a medicine comprising the lipid particle according to any one of items 8 to 14.
  • the present invention provides lipid particles that are not positively charged at the pH of body fluids (usually in the neutral range) and that allow the encapsulated drug to exert its effect more efficiently, as well as lipids for forming the lipid particles.
  • This allows the drug (e.g., polynucleotides such as mRNA) to exert its effect more efficiently while further reducing cytotoxicity.
  • FIG. 1 shows the results of a luciferase expression test, and is a diagram showing the results of imaging using Examples 3 and 4.
  • FIG. 1 shows the results of a luciferase expression test, and is a graph of the total amount of luminescence in Examples 3 and 4.
  • FIG. 1 shows the results of a luciferase expression test, and is a diagram showing the results of imaging using Comparative Examples 2 and 3.
  • FIG. 1 shows the results of a luciferase expression test, and is a graph showing the total amount of luminescence in Comparative Examples 2 and 3.
  • FIG. 1 shows the particle size distribution of the lipid particle solution produced in Example 5.
  • FIG. 13 is a graph showing the particle size distribution of the lipid particle solution produced in Comparative Example 4.
  • 1 shows the results of evaluating the in vivo distribution of lipid particles 4 hours after administration of a lipid particle solution, including the heart, lungs, liver, kidneys, spleen, left thigh muscle, plasma, right subiliac lymph node (A), and left subiliac lymph node (B).
  • 1 shows the results of evaluating the in vivo distribution of lipid particles 24 hours after administration of a lipid particle solution, including the heart, lungs, liver, kidneys, spleen, left thigh muscle, plasma, right subiliac lymph node (A), and left subiliac lymph node (B).
  • This is a diagram obtained by deleting the left thigh muscle, right subiliac lymph node (A), and left subiliac lymph node (B) from FIG.
  • Phospholipids in one aspect, the present invention relates to a phospholipid represented by the general formula (1):
  • R 1 and R 2 may be the same or different and represent a chain hydrocarbon group; R 3 , R 4 and R 5 may be the same or different and represent a hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms; m is 1 or 2, n is 1 or 2, and p is a natural number from 1 to 3) (sometimes referred to as "the phospholipid of the present invention” in this specification). This will be explained below.
  • R1 and R2 may be the same or different and are not particularly limited as long as they are chain hydrocarbon groups, and include both linear and branched chains.
  • the number of carbon atoms in the chain hydrocarbon group is not particularly limited as long as it is a number capable of forming lipid particles, and is, for example, 4 to 30, preferably 8 to 26, more preferably 12 to 24, even more preferably 14 to 20, and even more preferably 15 to 19.
  • the chain hydrocarbon group includes both saturated chain hydrocarbon groups and unsaturated hydrocarbon groups, but is preferably an unsaturated chain hydrocarbon group, more preferably an unsaturated chain hydrocarbon group containing a double bond, and even more preferably an unsaturated chain hydrocarbon group having only one double bond.
  • chain hydrocarbon groups include butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, 9-pentadecenyl, hexadecyl, heptadecyl, cis-9-heptadecenyl, 11-heptadecenyl, cis,cis-9,12-heptadecadienyl, 9,12,15-heptadecanthrienyl, 6,9,12-heptadecanthrienyl, 9,11,13-heptadecanthrienyl, nonadecyl, 8,11-nonadecadienyl, 5,8,11-nonadecatrienyl, 5,8,11,14-nonadecatetraenyl, henicosyl, tricosyl, cis-15-tri
  • R 1 and R 2 are unsaturated chain hydrocarbon group, and it is more preferable that both are unsaturated chain hydrocarbon groups.
  • R 3 , R 4 and R 5 are the same or different and are hydrocarbon groups having 1 to 5 carbon atoms.
  • the hydrocarbon group is a monovalent hydrocarbon group and is not particularly limited as long as it has 1 to 5 carbon atoms.
  • the monovalent hydrogen group is preferably a chain hydrocarbon group, and more preferably an alkyl group.
  • the number of carbon atoms in the hydrocarbon group is preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and even more preferably 1.
  • Examples of the hydrocarbon group include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, etc., and among these, methyl is preferred.
  • R 3 , R 4 and R 5 are methyl groups, and it is more preferable that all of them are methyl groups.
  • m is preferably 2.
  • n is preferably 2.
  • n and n are preferably both 2.
  • p is preferably 1 or 2. From the viewpoint of cytotoxicity, p is more preferably 1.
  • the phospholipids of the present invention can be synthesized in a variety of ways.
  • the compounds of the present invention can be synthesized according to the following reaction scheme:
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , m, n, and p are the same as above.
  • the compound can be synthesized according to or analogously thereto.
  • the amount of the compound represented by general formula (B) used is preferably 1 to 20 moles, and more preferably 5 to 10 moles, per mole of the compound represented by general formula (A) from the viewpoint of yield, etc.
  • the amount of phospholipase D used is preferably 100 to 1500 U, more preferably 300 to 700 U, per mole of the compound represented by general formula (A).
  • 1 U is defined as the amount of enzyme (1 micromole per minute) that can convert 1 micromole ( ⁇ mol) of substrate per minute under optimal conditions (temperature of 30°C, acidity at which the chemical reaction proceeds most).
  • This reaction is carried out in the presence of a solvent.
  • a solvent there are no particular limitations on the solvent as long as it is a solvent that can exert the activity of phospholipase D.
  • various buffer solutions are suitably used.
  • As a buffer solution an acetate buffer solution is preferable.
  • the pH of the solvent is preferably 4 to 7, more preferably 5 to 6.
  • the reaction system may contain various organic solvents (e.g., ethyl acetate, etc.) to dissolve the compound represented by general formula (A).
  • This reaction is typically carried out by mixing an organic solvent solution of a compound represented by general formula (A) with an aqueous solvent solution of a compound represented by general formula (B) and adding phospholipase D thereto.
  • additives can also be used in this reaction as long as they do not significantly impair the progress of the reaction.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which phospholipase D can exert its activity, and is usually 20 to 50°C, preferably 35 to 45°C.
  • the reaction time is not particularly limited as long as it is a time during which phospholipase D can exert its activity, and is usually 2 to 150 hours, preferably 8 to 100 hours, and more preferably 12 to 24 hours.
  • the solvent is distilled off, and the product can be isolated and purified by a conventional method such as chromatography, recrystallization, etc.
  • the structure of the product can be identified by elemental analysis, MS (FD-MS) analysis, IR analysis, 1 H-NMR, 13 C-NMR, etc.
  • ionized lipids have been developed and made into nanoparticles to improve the safety of lipid nanoparticles.
  • Ionized lipids are acidic and positively charged, and the change in effective charge at that time is 0 ⁇ +1.
  • the change in effective charge of the phospholipids (charge-reversible lipids) of the present invention can be in the range of -1 to +2, which is a different perspective.
  • the phospholipids of the present invention are ionized even under neutral conditions, and may have different physicochemical properties from ionized lipids.
  • the lipids of the present invention can also behave as amphipathic lipids even under neutral conditions, and therefore can be expected to have higher stability and higher safety.
  • lipid particles that do not have a positive charge at the pH of body fluids (usually in the neutral range) and that are capable of more efficiently exerting the effects of the encapsulated drug.
  • the phospholipids of the present invention can achieve the effects of the present invention even if they are phospholipid salts.
  • Such phospholipid salts which are salts of the phospholipids of the present invention, are also part of the present invention.
  • matters described as phospholipids are a concept that also includes phospholipid salts.
  • Lipid Particles One aspect of the present invention relates to lipid particles (sometimes referred to as “lipid particles of the present invention” herein) containing the phospholipid of the present invention (sometimes referred to as “phospholipid A” herein). This will be described below.
  • the lipid particles of the present invention are not particularly limited as long as they contain the phospholipid of the present invention as a particle-constituting lipid.
  • the phospholipid of the present invention contained in the lipid particles may be one type alone or a combination of two or more types.
  • Examples of the lipid particles of the present invention include particles in which an amphipathic lipid including the phospholipid of the present invention constitutes an outer layer, and the lipid is arranged with the hydrophilic portion facing outward.
  • the particles include particles whose outer layer is made of a lipid monolayer membrane and particles whose outer layer is made of a lipid bilayer membrane, preferably particles whose outer layer is made of a lipid monolayer membrane, and more preferably particles in which amphipathic lipids are arranged in the lipid monolayer membrane of the outer layer with the hydrophilic portion facing outward.
  • the inner layer of the particle may be made of a uniform phase of an aqueous phase or an oil phase, but preferably contains one or more reverse micelles.
  • the particle size of the lipid particles of the present invention is not particularly limited.
  • the particle size is preferably nano-sized, specifically, for example, 10 to 700 nm, preferably 20 to 500 nm, more preferably 30 to 250 nm, even more preferably 30 to 150 nm, even more preferably 40 to 120 nm, and particularly preferably 50 to 100 nm.
  • the lipid particles of the present invention do not have a positive charge at the pH of body fluids (usually in the neutral range). More specifically, the lipid particles of the present invention have a zeta potential in a Tris-HCl buffer solution of pH 7.4 of -80 to -1 mV, -50 to -1 mV, -40 to -1 mV, or -30 to -1 mV.
  • the lipid particles of the present invention may contain other lipids as particle-constituting lipids in addition to the phospholipids of the present invention.
  • Specific examples of lipids include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, etc.
  • phospholipids include phosphatidylcholines such as dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, dilinoleoylphosphatidylcholine, myristoylpalmitoylphosphatidylcholine, myristoylstearoylphosphatidylcholine, and palmitoylstearoylphosphatidylcholine; dilauroylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol, dilinoleoylphosphatidylglycerol, myristoyl
  • PEG polyethylene glycol
  • glycolipids include glyceroglycolipids such as diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, and glycosyl diglyceride; sphingoglycolipids such as galactosylcerebroside and ganglioside; stearyl glucoside, esterified stearyl glycoside, etc.
  • sterols include cholesterol, cholesteryl hemisuccinate, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol, phytosterol, stigmasterol, zymosterol, ergosterol, sitosterol, campesterol, and brassicasterol.
  • the sterols since the sterols have the effect of stabilizing the liposome membrane and regulating the fluidity of the liposome membrane, it is desirable that they are included as constituent lipids of the liposome membrane.
  • saturated or unsaturated fatty acids include saturated or unsaturated fatty acids having 10 to 22 carbon atoms, such as decanoic acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, eicosapentaenoic acid, docosanoic acid, and docosahexaenoic acid.
  • the above lipids may be used alone or in combination of two or more.
  • the lipid particles of the present invention preferably contain a phospholipid other than the phospholipids of the present invention (sometimes referred to as "phospholipid B" in this specification) and a sterol.
  • Phospholipid B preferably has a saturated chain hydrocarbon group.
  • Phospholipid B is preferably phosphatidylcholine, and more preferably dipalmitoylphosphatidylcholine.
  • the sterol is preferably cholesterol.
  • the content is, for example, 15 to 100 moles, preferably 30 to 70 moles, more preferably 40 to 60 moles, and even more preferably 45 to 55 moles, per 100 moles of the phospholipid of the present invention.
  • the content is, for example, 5 to 70 moles, preferably 5 to 40 moles, more preferably 5 to 30 moles, and even more preferably 10 to 15 moles, per 100 moles of the phospholipid of the present invention.
  • the content thereof is, for example, 30 to 200 moles, preferably 60 to 140 moles, more preferably 80 to 120 moles, even more preferably 90 to 110 moles, and even more preferably 95 to 105 moles, per 100 moles of the phospholipid of the present invention.
  • the content of phospholipid B is, for example, 10 to 100 moles, preferably 10 to 70 moles, more preferably 15 to 40 moles, and even more preferably 20 to 30 moles, per 100 moles of sterol.
  • the content is, for example, 10 to 100 moles, preferably 10 to 70 moles, more preferably 15 to 40 moles, and even more preferably 20 to 30 moles, per 100 moles of the phospholipid of the present invention.
  • the total content of the phospholipids of the present invention and other lipids (in a preferred embodiment, phospholipid B and sterols) that are blended as necessary is, for example, 40 to 160 moles, preferably 50 to 150 moles, more preferably 60 to 140 moles, even more preferably 70 to 130 moles, and even more preferably 80 to 125 moles, per 100 moles of lipids constituting the lipid particles of the present invention.
  • a portion of the phospholipid may be modified with a water-soluble polymer such as PEG.
  • the content of the PEG-modified phospholipid is, for example, 0 to 50 mol, preferably 0 to 30 mol, more preferably 0 to 20 mol, and even more preferably 0 to 15 mol, per 100 mol of lipid constituting the lipid particles of the present invention.
  • the lipid particles of the present invention do not need to be modified with PEG lipid, i.e., they do not need to contain PEG lipid.
  • the lipid particles of the present invention preferably encapsulate a drug.
  • the drug is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides, peptides, proteins, sugars, low molecular weight compounds, etc.
  • the drug is preferably negatively charged and water-soluble.
  • polynucleotides can be preferably used.
  • the target diseases of the drug are not particularly limited, and examples thereof include infectious diseases (particularly suitable for use as a vaccine against infectious diseases), cancer (particularly solid cancers), etc.
  • the polynucleotide is not particularly limited as long as it can function as a drug, but examples include mRNA, siRNA, miRNA, antisense nucleic acid, expression vectors thereof, protein expression vectors, nucleic acids for genome editing (e.g., guide RNA, Cas protein expression vector, TALEN expression vector, etc.), nucleic acid vaccines, etc.
  • mRNA messenger RNA
  • the mRNA used in the present invention encompasses both modified and unmodified RNA.
  • the mRNA may include one or more coding and non-coding regions.
  • the mRNA may be purified from natural sources, produced using a recombinant expression system and optionally purified, chemically synthesized, etc. If appropriate, for example in the case of chemically synthesized molecules, the mRNA may include nucleoside analogs, e.g., analogs having chemically modified bases or sugars, backbone modifications, etc.
  • the mRNA sequence is shown in the 5' to 3' direction unless otherwise specified.
  • the mRNA is comprised of natural nucleosides (e.g., adenosine, guanosine, cytidine, uridine), nucleoside analogs (e.g., 2-aminoadenosine, 2-thiothymidine, inosine, pyrrolo-pyrimidine, 3-methyladenosine, 5-methylcytidine, C-5 propynyl-cytidine, C-5 propynyl-uridine, 2-aminoadenosine, C5-bromouridine, C5-fluorouridine, C5-iodouridine, C5-propynyl-uridine, C5-propynyl-cytidine, C5-methyl ...
  • natural nucleosides e.g., adenosine, guanosine, cytidine, uridine
  • the mRNA used in the present invention may contain one or more non-standard nucleotide residues.
  • Non-standard nucleotide residues may include, for example, 5-methyl-cytidine ("5mC"), pseudouridine (“ ⁇ U”), and/or 2-thio-uridine (“2sU”).
  • 5mC 5-methyl-cytidine
  • ⁇ U pseudouridine
  • 2sU 2-thio-uridine
  • Such residues and incorporation into the mRNA may be achieved by known methods.
  • the mRNA may be RNA defined as RNA in which 25% of the U residues are 2-thio-uridine and 25% of the C residues are 5-methylcytidine.
  • the RNA may be used by known methods.
  • the presence of non-standard nucleotide residues may improve the stability and/or reduce the immunogenicity of the mRNA compared to a control mRNA having the same sequence but containing only standard residues.
  • the mRNA may include one or more non-standard nucleotide residues selected from isocytosine, pseudoisocytosine, 5-bromouracil, 5-propynyluracil, 6-aminopurine, 2-aminopurine, inosine, diaminopurine, and 2-chloro-6-aminopurine cytosine, and combinations of these modifications and other nucleobase modifications. Certain embodiments may further include additional modifications to the furanose ring or nucleobase.
  • Additional modifications include, for example, sugar modifications or substitutions (e.g., one or more 2'-O-alkyl modifications, locked nucleic acids (LNAs)).
  • the RNA may be complexed or hybridized to additional polynucleotides and/or peptide polynucleotides (PNAs).
  • PNAs polypeptide polynucleotides
  • such modifications include, but are not limited to, 2'-deoxy-2'-fluoro, 2'-O-methyl, 2'-O-methoxyethyl, and 2'-deoxy modifications.
  • any of these modifications may be present in 0-100% of the nucleotides, e.g., 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, greater than 95% or 100% of the constituent nucleotides.
  • the drug is preferably contained in the inner layer of the lipid particle of the present invention.
  • the drug is preferably contained within a reverse micelle in the inner layer.
  • the weight ratio of the lipid constituting the lipid particle of the present invention to the drug is, for example, 0 to 500, preferably 0 to 300, more preferably 0 to 100, even more preferably 5 to 50, even more preferably 10 to 40, and particularly preferably 15 to 35, when the drug is a polynucleotide such as mRNA.
  • the lipid particles of the present invention may contain other components in addition to those mentioned above.
  • other components include membrane stabilizers, charged substances, antioxidants, membrane proteins, polyethylene glycol (PEG), antibodies, peptides, sugar chains, etc.
  • Antioxidants can be included to prevent oxidation of the membrane, and are used as necessary as a component of the membrane.
  • antioxidants used as components of the membrane include butylated hydroxytoluene, propyl gallate, tocopherol, tocopherol acetate, concentrated mixed tocopherols, vitamin E, ascorbic acid, L-ascorbic acid stearate, ascorbic acid palmitate, sodium bisulfite, sodium sulfite, sodium edetate, erythorbic acid, citric acid, etc.
  • Membrane proteins can be included to add functionality to the membrane or to stabilize the membrane structure, and are used as membrane components as necessary.
  • membrane proteins include surface membrane proteins, integral membrane proteins, albumin, and recombinant albumin.
  • the content of other components is, for example, 20% or less, preferably 10% or less, relative to 100% by mass of the lipid particle solution containing the lipid particles of the present invention.
  • the lipid particles of the present invention can be produced according to or in accordance with a known method for producing lipid particles.
  • the lipid particles of the present invention can be preferably produced by a method including a step (step 1) of mixing an alcohol solution containing the phospholipid of the present invention with an acidic aqueous solution containing a water-soluble drug.
  • the alcohol that is the solvent of the alcohol solution is not particularly limited as long as it is an alcohol that can dissolve phospholipids.
  • the alcohol is preferably ethanol or butanol, more preferably ethanol or t-butanol, and more preferably ethanol.
  • An acidic aqueous solution usually contains an acid in addition to the water-soluble drug and water as a solvent.
  • acids include organic acids and inorganic acids, and preferably organic acids.
  • organic acids include maleic acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, folic acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid, pyruvic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, ketoglutaric acid, adipic acid, lactic acid, tartaric acid, fumaric acid, oxaloacetic acid, malic acid, isocitrate, citric acid, benzoic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, hemimellitic acid, trimellitic acid, trimesic acid, mellophanic acid, prenitic acid, pyromellitic acid, mellitic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid,
  • inorganic acids examples include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid, boric acid, boronic acid, hydrofluoric acid, hypochlorous acid, chlorous acid, chloric acid, perchloric acid, hypobromous acid, bromous acid, bromic acid, perbromic acid, hypoiodous acid, iodous acid, iodic acid, periodic acid, phosphorous acid, phosphoric acid, polyphosphoric acid, chromic acid, permanganic acid, and amberlyst.
  • the acids may be used alone or in combination of two or more.
  • the pH of the acidic aqueous solution is preferably 3 to 5.
  • the mixing ratio of the acidic aqueous solution to the alcoholic solution is, for example, 1.5 to 10, preferably 2 to 8, more preferably 3 to 7, even more preferably 3.5 to 5.5, and even more preferably 4 to 5.
  • the mixing is not particularly limited as long as the phospholipid of the present invention and the drug are in a form that allows mixing, but is usually carried out using a reaction system that uses a microchannel. In such cases, various conditions can be adjusted appropriately depending on the reaction system.
  • the present invention relates to a pharmaceutical (sometimes referred to as the "pharmaceutical of the present invention" in this specification) containing the lipid particles of the present invention encapsulating a drug.
  • a pharmaceutical sometimes referred to as the "pharmaceutical of the present invention” in this specification
  • the lipid particles of the present invention encapsulating a drug can also be used as a reagent.
  • the lipid particles of the present invention can exert the effects of drugs (e.g., polynucleotides such as mRNA) more efficiently while further reducing cytotoxicity. Therefore, the lipid particles of the present invention can be suitably used as drug carriers.
  • drugs e.g., polynucleotides such as mRNA
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical of the present invention can be about 0.0001 parts by weight to 100 parts by weight, assuming that the pharmaceutical of the present invention as a whole is 100 parts by weight.
  • the administration form of the pharmaceutical of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, and it can be administered to mammals, including humans, by either oral administration or parenteral administration (e.g., intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration, topical administration).
  • parenteral administration e.g., intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration, topical administration.
  • the preferred administration form is parenteral administration.
  • Dosage forms for oral administration and parenteral administration and their manufacturing methods are well known to those skilled in the art, and can be manufactured in accordance with conventional methods by mixing the active ingredient with a pharma- ceutically acceptable carrier, etc.
  • Dosage forms for parenteral administration include injectable preparations (e.g., drip injections, intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections), topical preparations (e.g., ointments, poultices, lotions), suppositories, inhalants, eye preparations, eye ointments, nasal drops, ear drops, liposomes, etc.
  • injectable preparations are prepared by dissolving the lipid particles of the present invention in distilled water for injection, and solubilizing agents, buffers, pH adjusters, isotonicity agents, soothing agents, preservatives, stabilizers, etc. can be added as necessary.
  • the pharmaceutical can also be a freeze-dried preparation for preparation when needed.
  • the medicine of the present invention may further contain other drugs that are effective in treating or preventing diseases.
  • the medicine of the present invention may also contain ingredients such as bactericides, anti-inflammatory agents, cell activators, vitamins, and amino acids, as necessary.
  • the carriers used in the formulation of the pharmaceutical of the present invention may include excipients, binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavorings, and odorants commonly used in the relevant technical field, as well as stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, pH adjusters, preservatives, antioxidants, bulking agents, wetting agents, surface activators, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, soothing agents, etc., as necessary.
  • the dosage of the pharmaceutical of the present invention can be determined by a clinician based on various factors, such as the route of administration, the type of disease, the severity of symptoms, the age, sex, and body weight of the patient, the severity of the disease, pharmacological knowledge such as pharmacokinetic and toxicological characteristics, whether or not a drug delivery system is used, and whether or not the pharmaceutical is administered as part of a combination of other drugs.
  • the dosage of the pharmaceutical of the present invention can be, for example, about 1 ⁇ g/kg (body weight) to 10 g/kg (body weight) per day.
  • the administration schedule of the pharmaceutical of the present invention can also be determined taking into account the same factors as the dosage. For example, the above daily dosage can be administered once a day to once a month.
  • Dioleoylphosphatidylcholine (1.5 g) was dissolved in ethyl acetate (18.2 g) at 40°C, and then amine-containing acetate buffer (7.9 g) in which phospholipase D (2.8 mg, Asahi Kasei Pharma) was dissolved and ethyl acetate (12.0 g) were added, and the mixture was stirred at 40°C for 19 hours.
  • Ethyl acetate, toluene, methanol, and an aqueous solution of sodium chloride were added to the obtained solution, and the mixture was stirred and allowed to stand. The organic layer was separated, and the organic layer was washed with an aqueous solution of sodium chloride and methanol.
  • the solvent was removed from the obtained organic layer by distillation under reduced pressure to obtain a crude product.
  • the obtained crude product was dissolved in ethyl acetate (7.5 mL) while heating. After cooling to room temperature, 4M hydrogen chloride/ethyl acetate (1.4 mL) was added. Acetone (35.0 mL) was then added dropwise, and the mixture was stirred for 25 minutes while cooling in an ice bath. The resulting suspension was filtered, the solid was washed with acetone, and then vacuum dried to obtain a solid. THF (13.0 mL) was added to the resulting solid, and the mixture was stirred. Acetone (33.0 mL) was further added dropwise, and the mixture was cooled in an ice bath. The resulting suspension was filtered, and the solid was washed with acetone, and then vacuum dried to obtain compound a (0.35 g).
  • Example 2 Preparation of lipid particle solution
  • Compound a synthesized in Example 1, dipalmitoyl phosphatidylcholine, and cholesterol were added to ethanol in a molar ratio of 45:10:45 to prepare an alcohol solution of phospholipids (lipid concentration: 0.99 mM).
  • Gaussia luciferase mRNA or firefly luciferase mRNA was added to 1 mM sodium citrate/citric acid aqueous solution (pH 4.5) to prepare an acidic mRNA aqueous solution.
  • lipid particle solution Preparation of lipid particle solution A lipid particle solution was prepared in the same manner as in Example 2, except that dioleoylglycerophosphate-diethylenediamine (DOP-DEDA) was used instead of compound a.
  • DOP-DEDA dioleoylglycerophosphate-diethylenediamine
  • Example 2 and Comparative Example 1 were evaluated under the following measurement conditions.
  • the lipid particle solution was diluted with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) or 1 mM sodium citrate/citric acid aqueous solution (pH 4.5), and then the ⁇ potential was measured using a Litesizer 500.
  • Example 3 Preparation of lipid particle solution A lipid particle solution was prepared using firefly luciferase mRNA in the same manner as in Example 2. Furthermore, the prepared lipid particle solution was ultrafiltered with Amicon Ultra-4 (Millipore) to concentrate the lipid particle solution (final mRNA concentration: 25 ng/ ⁇ L). After concentration, sucrose was added to the lipid particle solution so that the final sucrose concentration was 0.3 M, and the lipid particle solution of Example 3 was produced.
  • Amicon Ultra-4 Micropore
  • Example 4 Preparation of lipid particle solution
  • Compound a dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, and dimyristoyl glycerol-polyethylene glycol 2000 were added to ethanol in a molar ratio of 45:10:45:1.5 to prepare an alcoholic lipid solution (lipid concentration: 0.99 mM).
  • mRNA was added to 1 mM sodium citrate/citric acid aqueous solution (pH 4.5) to prepare an acidic mRNA aqueous solution.
  • pH 4.5 sodium citrate/citric acid aqueous solution
  • the lipid particle solution was prepared by dialysis against ultrapure water at 4°C for 8 hours.
  • lipid particle solution (equivalent to 1.25 ⁇ g of mRNA) was intramuscularly administered to the left thigh muscle of each mouse (BALB/c, female, 6 weeks old). 4, 6, 8, and 24 hours after administration of the lipid particle solution, the expression effect of luciferase was evaluated using IVIS Lumina System (manufactured by Xenogen). 10 minutes before imaging, D-luciferin potassium salt (manufactured by BioVision) 150 mg/kg body weight was administered intraperitoneally to confirm the results of luminescence. Furthermore, the administration site was used as the region of interest, and the total luminescence was quantified.
  • the imaging results for Examples 3 and 4 are shown in Figure 1, and a graph of the total amount of light emitted is shown in Figure 2.
  • the imaging results for Comparative Examples 2 and 3 are shown in Figure 3, and a graph of the total amount of light emitted is shown in Figure 4.
  • Example 5 Preparation of Lipid Particle Solution
  • a lipid particle solution was prepared using firefly luciferase mRNA.
  • Example 6 [ 3H ] Cholesteryl hexadecyl ether dissolved in toluene was removed by vacuum distillation, and then dissolved in ethanol. The obtained solution was mixed with a phospholipid solution in which compound a, dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, and dimyristoyl glycerol-polyethylene glycol 2000 were dissolved in ethanol at a molar ratio of 45:10:45:1.5 to prepare an alcoholic lipid solution. In addition, OVA mRNA was added to 50 mM acetate buffer (pH 5.0) to prepare an acidic mRNA aqueous solution.
  • Example 7 A lipid particle solution was prepared in the same manner as in Example 6, except that instead of the phospholipid solution in which compound A, dipalmitoylphosphatidylcholine, cholesterol, and dimyristoylglycerol-polyethylene glycol 2000 were dissolved in ethanol in a molar ratio of 45:10:45:1.5, a phospholipid solution in which compound A, dipalmitoylphosphatidylcholine, and cholesterol were dissolved in ethanol in a molar ratio of 45:10:45 was used.
  • Example 5 A lipid particle solution was prepared in the same manner as in Example 6, except that DOP-DEDA was used instead of compound a in Example 6.
  • SM-102, distearoylphosphatidylcholine, cholesterol, and dimyristoylglycerol-polyethylene glycol 2000 were added to ethanol in a molar ratio of 50:10:38.5:1.5 to prepare an alcoholic lipid solution (lipid concentration: 0.99 mM).
  • OVA mRNA was added to 6.25 mM acetate buffer (pH 5.0) to prepare an acidic mRNA aqueous solution.
  • the lipid particle solution containing lipid particles was produced by ultrafiltration at 4°C with RNase-free water to remove ethanol.
  • lipid particle solution 50 ⁇ L of lipid particle solution was intramuscularly administered to the left thigh muscle of each mouse (C57BL/6J, female, 6 weeks old).
  • blood was removed under isoflurane anesthesia, and each organ (heart, lung, liver, kidney, spleen, left thigh muscle, plasma, right subiliac lymph node (A), left subiliac lymph node (B)) was removed and weighed.
  • the liver was cut to about 100 mg.
  • the blood was transferred to a tube and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. After centrifugation, 100 ⁇ L of serum was used as a measurement sample.

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Abstract

本発明は、体液のｐＨ（通常は、中性域）において正電荷を有さず、且つ内包する薬物のより効率的な効果発現が可能な脂質粒子、及び該脂質粒子を形成するための脂質を提供する。　本発明は、一般式（１） （式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、鎖式炭化水素基を示す。Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、炭素数１～５の炭化水素基を示す。ｍは１又は２を示し、ｎは１又は２示し、ｐは１～３の自然数を示す。） で表されるリン脂質を提供する。

Description

ｐＨ応答性リン脂質
　本発明は、ｐＨ応答性リン脂質に関する。
　近年、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、魅力的な医薬品シーズとして大きな期待を集めている。外部から投与したｍＲＮＡが生体内で本来の活性を示すには極めて高度なデリバリーシステムを必要とする。これは、ＲＮＡが速やかに酵素分解を受けることや細胞膜をほとんど通過しないことなどに起因する。そのため、ｍＲＮＡ医薬品の実用化には、必然的にデリバリーシステムの開発が伴う。
　ＲＮＡ等の薬物のデリバリーシステムとしては、薬物を脂質粒子に封入した状態で投与することが知られている。ただ、負電荷を有する核酸を投与する場合、通常は、静電的相互作用を起こすべく正電荷を有する脂質が用いられるので、細胞毒性の懸念があった（特許文献１）。
特開２０１６－０２３１４７号公報
　本発明者は、体液のｐＨ（通常は、中性域）において正電荷を有さない脂質粒子である場合に、細胞毒性を低減できることに着目した。
　本発明は、体液のｐＨ（通常は、中性域）において正電荷を有さず、且つ内包する薬物のより効率的な効果発現が可能な脂質粒子、及び該脂質粒子を形成するための脂質を提供することを課題とする。本発明は、さらに、薬物をより効率的に内封でき、且つ／或いは薬物のより効率的な送達に適したサイズを有する脂質粒子、及び該脂質粒子を形成するための脂質を提供することも課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、一般式（１）で表わされるリン脂質が、体液のｐＨ（通常は、中性域）において正電荷を有さず、且つ内包する薬物のより効率的な効果発現が可能な脂質粒子を形成できることを見出した。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
１．一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、鎖式炭化水素基を示す。Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、炭素数１～５の炭化水素基を示す。ｍは１又は２を示し、ｎは１又は２示し、ｐは１～３の自然数を示す。）
で表されるリン脂質。
２．Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、炭素数１～３の炭化水素基を示す、項１に記載のリン脂質。
３．ｍ及びｎが２である、項１又は２に記載のリン脂質。
４．ｐが１である、項１～３のいずれかに記載のリン脂質。
５．Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１２～２４の鎖式炭化水素基を示す項１～４のいずれかに記載のリン脂質。
６．鎖式炭化水素基が不飽和鎖式炭化水素基である、項１～５のいずれかに記載のリン脂質。
７．項１～６のいずれかに記載のリン脂質の塩である、リン脂質塩。
８．項１～６のいずれかに記載のリン脂質（リン脂質Ａ）を含有する、脂質粒子。
９．薬物を内包する、項８に記載の脂質粒子。
１０．薬物がポリヌクレオチドである、項９に記載の脂質粒子。
１１．ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡである、項１０に記載の脂質粒子。
１２．ステロールを含有する、項８～１１のいずれかに記載の脂質粒子。
１３．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含まない、項８～１２のいずれかに記載の脂質粒子。
１４．更に、前記リン脂質Ａ以外のリン脂質（リン脂質Ｂ）を含有する、項８～１３のいずれかに記載の脂質粒子。
１５－１．項１～６のいずれかに記載のリン脂質を含有する、アルコール溶液。
１５－２．項７に記載のリン脂質塩を含有する、アルコール溶液。
１６．アルコール溶液中のアルコールがエタノールである、項１５に記載のアルコール溶液。
１７．項１５又は１６に記載のアルコール溶液と水溶性薬物を含有する酸性水溶液とを混合する工程を含む、脂質粒子の製造方法。
１８．項８～１４のいずれかに記載の脂質粒子を含有する、医薬。
　本発明によれば、体液のｐＨ（通常は、中性域）において正電荷を有さず、且つ内包する薬物のより効率的な効果発現が可能な脂質粒子、及び該脂質粒子を形成するための脂質を提供することができる。これにより、細胞毒性をより低減しつつも、より効率的に薬物（例えば、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド）の効果を発揮することができる。
ルシフェラーゼ発現試験の結果を示す図であり、実施例３及び４を用いたイメージングの結果を示す図である。 ルシフェラーゼ発現試験の結果を示す図であり、実施例３及び４の総発光量のグラフを示す図である。 ルシフェラーゼ発現試験の結果を示す図であり、比較例２及び３を用いたイメージングの結果を示す図である。 ルシフェラーゼ発現試験の結果を示す図であり、比較例２及び３の総発光量のグラフを示す図である。 実施例５で製造された脂質粒子溶液の粒子径分布を示す図である。 比較例４で製造された脂質粒子溶液の粒子径分布を示す図である。 脂質粒子溶液の投与から４時間後の脂質粒子の生体内分布の評価結果を示す図である。心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、左大腿筋、血漿、右腸骨下リンパ節（Ａ）、左腸骨下リンパ節（Ｂ）での分布の評価結果を示す。 脂質粒子溶液の投与から２４時間後の脂質粒子の生体内分布の評価結果を示す図である。心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、左大腿筋、血漿、右腸骨下リンパ節（Ａ）、左腸骨下リンパ節（Ｂ）での分布の評価結果を示す。 図７から、左大腿筋、右腸骨下リンパ節（Ａ）、左腸骨下リンパ節（Ｂ）を削除し、縦軸の数値を変更した図である。 図８から、左大腿筋、右腸骨下リンパ節（Ａ）、左腸骨下リンパ節（Ｂ）を削除し、縦軸の数値を変更した図である。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。また、本明細書中において、「～」で表される数値範囲の下限上限は「以上以下」を意味する（例えば、α～βならば、α以上β以下である）。
　１．リン脂質
　本発明は、その一態様として、一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、鎖式炭化水素基を示す。Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、炭素数１～５の炭化水素基を示す。ｍは１又は２を示し、ｎは１又は２示し、ｐは１～３の自然数を示す。）で表されるリン脂質（本明細書において、「本発明のリン脂質」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　一般式（１）中、Ｒ１又はＲ２は、同一又は異なって、鎖式炭化水素基である限り特に制限されず、直鎖状及び分岐鎖状のいずれのものも包含する。鎖式炭化水素基の炭素数は、脂質粒子を形成可能な数である限り特に制限されないが、例えば４～３０、好ましくは８～２６、より好ましくは１２～２４、さらに好ましくは１４～２０、よりさらに好ましくは１５～１９である。鎖式炭化水素基は、飽和鎖式炭化水素基及び不飽和炭化水素基の何れも包含するが、好ましくは不飽和鎖式炭化水素基であり、より好ましくは二重結合を含む不飽和鎖式炭化水素基であり、さらに好ましくは二重結合を１つのみ有する不飽和鎖式炭化水素基である。鎖式炭化水素基としては、例えばブチル、ペンチル、へキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、９－ペンタデセニル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、ｃｉｓ－９－ヘプタデセニル、１１－ヘプタデセニル、ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－ヘプタデカジエニル、９，１２，１５－ヘプタデカントリエニル、６，９，１２－ヘプタデカントリエニル、９，１１，１３－ヘプタデカントリエニル、ノナデシル、８，１１－ノナデカジエニル、５，８，１１－ノナデカトリエニル、５，８，１１，１４－ノナデカテトラエニル、ヘンイコシル、トリコシル、ｃｉｓ－１５－トリコセニル、ペンタコシル、ヘプタコシル、ノナコシル等が挙げられる。
　一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が不飽和鎖式炭化水素基であることが好ましく、両方が不飽和鎖式炭化水素基であることがより好ましい。
　一般式（１）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、炭素数１～５の炭化水素基である。上記炭化水素基は、一価の炭化水素基であり、炭素数が１～５である限り特に制限されない。当該単価水素基は、好ましくは鎖式炭化水素基であり、より好ましくはアルキル基である。炭化水素基の炭素数は、好ましくは１～３、より好ましくは１～２、更に好ましくは１である。上記炭化水素基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル等が挙げられ、中でも、メチルが好ましい。
　一般式（１）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも一つがメチル基であることが好ましく、すべてがメチル基であることがより好ましい。
　ｍは、好ましくは２である。
　ｎは、好ましくは２である。
　ｍ及びｎは、好ましくは共に２である。
　ｐは、好ましくは１又は２である。細胞毒性の観点からは、ｐは、より好ましくは１である。
　本発明のリン脂質は、様々な方法で合成することができる。本発明の化合物は、例えば以下の反応式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｍ、ｎ、及びｐは前記に同じである。］
に従って又は準じて合成することができる。
　本反応では、一般式（Ａ）で表される化合物と一般式（Ｂ）で表される化合物とを、ホスホリパーゼＤの存在下で反応させることで、一般式（１）で表される化合物を得ることができる。
　一般式（Ｂ）で表される化合物の使用量は、収率等の観点から、一般式（Ａ）で表される化合物１モルに対して、１～２０モルが好ましく、５～１０モルがより好ましい。
　ホスホリパーゼＤの使用量は、収率等の観点から、一般式（Ａ）で表される化合物１モルに対して、１００～１５００　Ｕが好ましく、３００～７００　Ｕがより好ましい。なお、１　Ｕは、至適条件下（温度３０℃で、最も化学反応が進む酸性度）で毎分１マイクロモル（μｍｏｌ）の基質を変化されることができる酵素量（１マイクロモル毎分）と定義される。
　本反応は、溶媒の存在下で行われる。溶媒としては、ホスホリパーゼＤの活性を発揮できる溶媒である限り特に制限されない。溶媒としては、各種緩衝液が好適に使用される。緩衝液としては、好ましくは酢酸緩衝液が挙げられる。溶媒のｐＨは、好ましくは４～７、より好ましくは５～６である。本反応系においては、上記水系溶媒の他にも、一般式（Ａ）で表される化合物を溶解させるために各種有機溶媒（例えば、酢酸エチル等）を含んでいてもよい。
　本反応は、典型的には、一般式（Ａ）で表される化合物の有機溶媒溶液と一般式（Ｂ）で表される化合物の水系溶媒溶液とを混合し、そこへホスホリパーゼＤを添加することにより行われる。
　本反応においては、上記成分以外にも、反応の進行を著しく損なわない範囲で、適宜添加剤を使用することもできる。
　反応温度は、ホスホリパーゼＤの活性を発揮できる温度である限り特に制限されず、通常２０～５０℃、好ましくは３５～４５℃である。
　反応時間は、ホスホリパーゼＤの活性を発揮できる時間である限り特に制限されず、通常２時間～１５０時間、好ましくは８時間～１００時間、より好ましくは１２時間～２４時間である。
　反応終了後、溶媒を留去し、生成物をクロマトグラフィー法、再結晶法等の通常の方法で単離し、精製することができる。また、生成物の構造は、元素分析、ＭＳ（ＦＤ－ＭＳ）分析、ＩＲ分析、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ等により同定することができる。
　近年、脂質ナノ粒子の安全性を高めるため、イオン化脂質が開発され、ナノ粒子化されている。イオン化脂質は酸性で正に荷電するが、そのときの実効電荷の変化は０→＋１である。一方、本発明のリン脂質（ｃｈａｒｇｅ－ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ脂質）の実効電荷の変化は、－１～＋２の範囲であり得、着眼点が異なる。本発明のリン脂質は中性条件下でもイオン化はしており、イオン化脂質とは物理化学的性質が異なり得る。本発明の脂質は、中性条件下でも両親媒性脂質としてふるまうことも可能であり、それ故により高い安定性とより高い安全性が期待できる。
　本発明のリン脂質を用いることにより、体液のｐＨ（通常は、中性域）において正電荷を有さず、且つ内包する薬物のより効率的な効果発現が可能な脂質粒子を形成することができる。
　本発明のリン脂質は、リン脂質塩であっても本発明の効果を奏することができる。このような、本発明のリン脂質の塩であるリン脂質塩も本発明の一つである。本明細書において、リン脂質として説明する事項は、リン脂質塩も包含する概念である。
　２．脂質粒子
　本発明は、その一態様として、本発明のリン脂質（本明細書において、「リン脂質Ａ」と示すこともある。）を含有する、脂質粒子（本明細書において、「本発明の脂質粒子」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　本発明の脂質粒子は、粒子構成脂質として本発明のリン脂質が含まれる粒子である限り特に制限されない。脂質粒子に含まれる本発明のリン脂質は１種単独でもよいし、２種以上の組み合わせであってもよい。本発明の脂質粒子としては、例えば本発明のリン脂質を含む両親媒性の脂質が外層を構成し、且つ該脂質が親水性部分を外側に向けて並んでいる粒子が挙げられる。該粒子としては、例えば外層が脂質一重膜からなる粒子、外層が脂質二重膜からなる粒子が挙げられ、好ましくは外層が脂質一重膜からなる粒子が挙げられ、より好ましくは外層の脂質一重膜において両親媒性脂質が親水性部分を外側に向けて並んでいる粒子が挙げられる。粒子の内層は、水相又は油相の均一な相からなるものでもよいが、１又は複数の逆ミセルを含むことが好ましい。
　本発明の脂質粒子の粒子径は、特に制限されない。該粒子径は、好ましくはナノサイズであり、具体的には例えば１０～７００ｎｍ、好ましくは２０～５００ｎｍ、より好ましくは３０～２５０ｎｍ、さらに好ましくは３０～１５０ｎｍ、よりさらに好ましくは４０～１２０ｎｍ、特に好ましくは５０～１００ｎｍである。
　本発明の脂質粒子は、体液のｐＨ（通常は、中性域）において正電荷を有さない。より具体的には、本発明の脂質粒子は、ｐＨ７．４のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中におけるゼータ電位が、－８０～－１ｍＶ、－５０～－１ｍＶ、－４０～－１ｍＶ、－３０～－１ｍＶである。
　本発明の脂質粒子は、本発明のリン脂質以外に、粒子構成脂質として、他の脂質を含み得る。脂質の具体例としては、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が例示される。
　リン脂質の具体例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルパルミトイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルステアロイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリン；カルジオリピン；卵黄レシチン；大豆レシチン；及びこれらの水素添加物等が例示される。これらは、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」とも示す。）等の水溶性高分子で修飾されたものであってもよいが、特に、水溶性高分子がＰＥＧの場合、ＰＥＧで修飾されていなくてもタンパク質発現を示すことができる観点から、ＰＥＧ脂質で修飾されていない（ＰＥＧ脂質を含まない）ことが好ましい。
　糖脂質の具体例としては、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質；ステアリルグルコシド、エステル化ステアリルグリコシド等が例示される。
　ステロールの具体例としては、コレステロール、コレステリルヘミスクシネート、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール、フィトステロール、スチグマステロール、チモステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等が例示される。特に、当該ステロールには、リポソーム膜を安定化させたり、リポソーム膜の流動性を調節したりする作用があるため、リポソーム膜の構成脂質として含まれていることが望ましい。
　飽和又は不飽和の脂肪酸の具体例としては、デカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサン酸、ドコサヘキサエン酸等の炭素数１０～２２の飽和又は不飽和の脂肪酸が例示される。
　上記脂質は、１種単独で使用してもよいが、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　本発明の脂質粒子は、好ましくは本発明のリン脂質以外のリン脂質（本明細書において、「リン脂質Ｂ」と示すこともある）とステロールとを含む。リン脂質Ｂは飽和鎖式炭化水素基を有することが好ましい。リン脂質Ｂとしては、好ましくはホスファチジルコリンが挙げられ、特に好ましくはジパルミトイルホスファチジルコリンが挙げられる。ステロールとしては、好ましくはコレステロールが挙げられる。
　本発明の脂質粒子がリン脂質Ｂを含有する場合、その含有量は、本発明のリン脂質１００モルに対して、例えば１５～１００モル、好ましくは３０～７０モル、より好ましくは４０～６０モル、さらに好ましくは４５～５５モルである。或いは、その含有量は、本発明のリン脂質１００モルに対して、例えば５～７０モル、好ましくは５～４０モル、より好ましくは５～３０モル、さらに好ましくは１０～１５モルである。
　本発明の脂質粒子がステロールを含有する場合、その含有量は、本発明のリン脂質１００モルに対して、例えば３０～２００モル、好ましくは６０～１４０モル、より好ましくは８０～１２０モル、さらに好ましくは９０～１１０モル、よりさらに好ましくは９５～１０５モルである。
　本発明の脂質粒子がリン脂質Ｂ及びステロールを含有する場合、リン脂質Ｂの含有量は、ステロール１００モルに対して、例えば１０～１００モル、好ましくは１０～７０モル、より好ましくは１５～４０モル、さらに好ましくは２０～３０モルである。或いは、その含有量は、本発明のリン脂質１００モルに対して、例えば１０～１００モル、好ましくは１０～７０モル、より好ましくは１５～４０モル、さらに好ましくは２０～３０モルである。
　本発明のリン脂質と必要に応じて配合される他の脂質（好ましい態様においては、リン脂質Ｂ及びステロール）との合計含有量は、本発明の脂質粒子構成脂質１００モルに対して、例えば４０～１６０モル、好ましくは５０～１５０モル、より好ましくは６０～１４０モル、さらに好ましくは７０～１３０モル、よりさらに好ましくは８０～１２５モルである。
　本発明の脂質粒子においては、リン脂質の一部がＰＥＧ等の水溶性高分子で修飾されていてもよい。ＰＥＧ修飾されたリン脂質の含有量は、本発明の脂質粒子構成脂質１００モルに対して、例えば０～５０モル、好ましくは０～３０モル、より好ましくは０～２０モル、さらに好ましくは０～１５モルである。ただし、ＰＥＧで修飾されていなくてもタンパク質発現を示すことができる観点から、本発明の脂質粒子は、ＰＥＧ脂質で修飾する必要がなく、すなわち、ＰＥＧ脂質を含んでいる必要がない。
　本発明の脂質粒子は、好ましくは薬物を内包する。薬物としては、特に制限されず、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、糖、低分子化合物等が挙げられる。薬物は、負電荷を有するものが好ましく、また水溶性のものが好ましい。このような薬物としては、ポリヌクレオチドを好適に採用できる。薬物の対象疾患としては、特に制限されないが、例えば感染症（特に、感染症に対するワクチンとして好適に使用できる。）、がん（特に、固形がん）等が挙げられる。
　ポリヌクレオチドとしては、薬物としての機能を発揮し得るものである限り特に制限されないが、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、これらの発現ベクターや、タンパク質の発現ベクター、ゲノム編集用核酸（例えばガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質発現ベクター、ＴＡＬＥＮ発現ベクター等）、核酸ワクチン等が挙げられる。
　上記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合について説明する。本明細書において、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを示す。本発明において用いられるｍＲＮＡは、修飾及び非修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは、１つまたは複数のコード領域及び非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、天然源から精製すること、組み換え発現系を用いて生成し任意により精製すること、化学的に合成することなどが可能である。適切であれば、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、ヌクレオシド類似体、例えば、化学修飾した塩基または糖、主鎖修飾などを有する類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、特に指定のない限り、５’から３’の方向に示される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン及び２－チオシチジン）、化学的修飾塩基、生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、インターカレーション塩基、修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース）並びに／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。
　本発明において用いられるｍＲＮＡは、１つまたは複数の非標準的なヌクレオチド残基を含んでいてもよい。非標準的なヌクレオチド残基には、例えば、５－メチル－シチジン（「５ｍＣ」）、プソイドウリジン（「ΨＵ」）及び／または２－チオ－ウリジン（「２ｓＵ」）を挙げることができる。このような残基及びｍＲＮＡへの組み込みは、公知の方法により行うことができる。ｍＲＮＡは、Ｕ残基の２５％が２－チオ－ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５－メチルシチジンであるＲＮＡとして定義されるＲＮＡであってよい。上記ＲＮＡは、公知の方法により使用することができる。非標準的なヌクレオチド残基が存在すると、ｍＲＮＡは、同じ配列を有するが、標準的な残基しか含まない対照ｍＲＮＡと比べて、安定性が向上し、かつ／または免疫原性が低下し得る。さらなる実施形態において、ｍＲＮＡは、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンシトシン並びにこれらの修飾の組み合わせ並びに他の核酸塩基修飾から選択される、１つまたは複数の非標準的なヌクレオチド残基を含み得る。ある特定の実施形態は、フラノース環または核酸塩基への追加の修飾をさらに含み得る。追加の修飾は、例えば、糖の修飾または置換（例えば、１つまたは複数の２’－Ｏ－アルキル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ））が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、さらなるポリヌクレオチド及び／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体を形成してもよいし、ハイブリダイズしてもよい。糖修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾である実施形態において、こうした修飾としては、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾及び２’－デオキシ修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、これらの修飾のいずれかは、個別にまたは組み合わせで、ヌクレオチドの０～１００％、例えば、構成ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％超または１００％で存在してよい。
　薬物は、本発明の脂質粒子の内層に含まれることが好ましい。薬物がポリヌクレオチドである場合、薬物は、内層における逆ミセル内に含まれることが好ましい。
　本発明の脂質粒子構成脂質と薬物との重量比（本発明の脂質粒子構成脂質／薬物、ｗｔ／ｗｔ）は、例えば薬物がｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドである場合、例えば０～５００、好ましくは０～３００、より好ましくは０～１００、さらに好ましくは５～５０、よりさらに好ましくは１０～４０、特に好ましくは１５～３５である。
　本発明の脂質粒子は、上記以外にも他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば膜安定化剤、荷電物質、抗酸化剤、膜タンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、抗体、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。
　抗酸化剤は、膜の酸化防止のために含有させることができ、膜の構成成分として必要に応じて使用される。膜の構成成分として使用される抗酸化剤としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、トコフェロール、酢酸トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ビタミンＥ、アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステル、パルミチン酸アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、クエン酸等が例示される。
　膜タンパク質は、膜への機能付加又は膜の構造安定化を目的として含有させることができ、膜構成成分として必要に応じて使用される。膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質、アルブミン、組換えアルブミン等が挙げられる。
　他の成分の含有量は、本発明の脂質粒子を含有する脂質粒子溶液１００質量％に対して、例えば２０％以下、好ましくは１０％以下である。
　本発明の脂質粒子は、脂質粒子の公知の製造方法に従って又は準じて製造することができる。本発明の脂質粒子は、好適には、本発明のリン脂質を含有するアルコール溶液と、水溶性薬物を含有する酸性水溶液とを混合する工程（工程１）を含む方法によって、製造することができる。
　アルコール溶液の溶媒であるアルコールとしては、リン脂質を溶解可能なアルコールである限り特に制限されない。溶解性の観点から、アルコールとしては、エタノール、ブタノールが好ましく、エタノール、ｔ－ブタノールがより好ましく、エタノールがより好ましい。
　酸性水溶液は、水溶性薬物と、溶媒である水の他に、通常は酸が含まれる。酸としては、例えば有機酸及び無機酸が挙げられ、好ましくは有機酸が挙げられる。有機酸としては、例えば、マレイン酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、葉酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、ケトグルタル酸、アジピン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、イソクエン酸、クエン酸、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ヘミメリト酸、トリメリト酸、トリメシン酸、メロファン酸、プレーニト酸、ピロメリト酸、メリト酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、ｐ－トルエンスルフィン酸、ベンゼンスルフィン酸等が挙げられ、好ましくはクエン酸が挙げられる。無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、ボロン酸、フッ化水素酸、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、次亜臭素酸、亜臭素酸、臭素酸、過臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜ヨウ素酸、ヨウ素酸、過ヨウ素酸、亜リン酸、リン酸、ポリリン酸、クロム酸、過マンガン酸、アンバーリストが挙げられる。酸は１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　酸性水溶液のｐＨは、好ましくは３～５である。
　酸性水溶液とアルコール溶液との混合比（酸性水溶液／アルコール溶液、ｖ／ｖ）は、例えば１．５～１０、好ましくは２～８、より好ましくは３～７、さらに好ましくは３．５～５．５、よりさらに好ましくは４～５である。
　混合は、本発明のリン脂質と薬物とが混合可能な態様である限り特に制限されないが、通常は、マイクロ流路を用いた反応系を用いて実施する。その場合、各種条件は、該反応系に応じて適宜調整することができる。
　３．脂質粒子の用途
　本発明は、その一態様として、薬物を内包する本発明の脂質粒子を含有する、医薬（本明細書において、「本発明の医薬」と示すこともある。）に関する。また、薬物を内包する本発明の脂質粒子は、試薬としても利用することができる。
　本発明の脂質粒子は、細胞毒性をより低減しつつも、より効率的に薬物（例えば、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド）の効果を発揮することができる。このため、本発明の脂質粒子は、薬物のキャリアとして好適に利用することができる。
　本発明の医薬中の有効成分（＝薬物）の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重等を考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の医薬中の有効成分の含量は、本発明の医薬全体を１００重量部として０．０００１重量部～１００重量部程度とすることができる。
　本発明の医薬の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与である。経口投与および非経口投与のための剤形ならびにその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
　非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、本発明の脂質粒子を注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤等を添加することができる。医薬は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
　本発明の医薬は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の医薬は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸等の成分を配合することもできる。
　本発明の医薬の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を用いることができる。
　本発明の医薬の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができる。本発明の医薬の投与量は、例えば、一日当たりで、１μｇ／ｋｇ（体重）～１０ｇ／ｋｇ（体重）程度とすることができる。本発明の医薬の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の１日当たりの投与量で、１日～１月に１回投与することができる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
（実施例１）
２－［２－［（ジメチルアミノ）エチル］メチルアミノ］エチル　１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（化合物ａ）の合成
　下記の合成方法により、以下の化学式で示される化合物ａを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　２－［［２－（ジメチルアミノ）エチル］メチルアミノ］エタノール（５．０ｇ）および塩化ナトリウム（６．２ｇ）を酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、３１．６ｇ）に溶解させた後、撹拌しながら酢酸（４．８ｇ）を添加することで、アミン入り酢酸緩衝液を得た。ジオレオイルホスファチジルコリン（１．５ｇ）を酢酸エチル（１８．２ｇ）に４０℃で溶解させた後、ホスホリパーゼＤ（２．８ｍｇ、旭化成ファーマ社製）を溶解させたアミン入り酢酸緩衝液（７．９ｇ）および酢酸エチル（１２．０ｇ）を添加し、４０℃下で１９時間撹拌した。得られた溶液に酢酸エチル、トルエン、メタノール及び塩化ナトリウム水溶液を加えて撹拌した後、静置した。有機層を分離後、その有機層を塩化ナトリウム水溶液およびメタノールを用いて洗浄した。得られた有機層から溶媒を減圧留去することで粗体を得た。得られた粗体を酢酸エチル（７．５ｍＬ）に加温しながら溶解させた。室温まで放冷した後、４Ｍ塩化水素／酢酸エチル（１．４ｍＬ）を添加した。続いてアセトン（３５．０ｍＬ）を滴下し、氷浴下で冷却しながら２５分間撹拌した。得られた懸濁液を濾過し、固形分をアセトンで洗浄後、真空乾燥させることで固体を得た。得られた固体にＴＨＦ（１３．０ｍＬ）を加えて撹拌した。さらにアセトン（３３．０ｍＬ）を滴下後、氷浴下で冷却した。得られた懸濁液を濾過し、固形分をアセトンで洗浄後、真空乾燥させることで化合物ａ（０．３５ｇ）を得た。
質量分析（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋＝８３０
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、溶媒ＣＤＣｌ３）：δ＝５．３８－５．２４（ｍ，５Ｈ），４．５２－４．３９（ｍ，２Ｈ），４．３８－４．３５（ｍ，１Ｈ），４．１８－３．８８（ｍ，７Ｈ），３．７０－３．６０（ｍ，２Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ），３．０２（ｓ，６Ｈ），２．３６－２．２７（ｍ，４Ｈ），２．０２－１．９８（ｍ，８Ｈ），１．６４－１．５４（ｍ，４Ｈ），１．４０－０．９１（ｍ，４０Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６Ｈ）．
　得られたリン脂質を用いて、以下のようにして特性を評価した。
（実施例２）
脂質粒子溶液の製造
　実施例１で合成した化合物ａ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びコレステロールを４５：１０：４５のモル比でエタノールに添加して、リン脂質のアルコール溶液を調製した（脂質濃度：０．９９ｍＭ）。また、ガウシアルシフェラーゼｍＲＮＡまたはホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを１ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸水溶液（ｐＨ４．５）に添加して、ｍＲＮＡ酸性水溶液を調製した。これら２つの溶液を、Ｓｔａｔｉｃ型マイクロミキサー（株式会社ＹＭＣ製）を用いて、脂質溶液とｍＲＮＡ溶液とをそれぞれ１：４．２５の体積比で、２５℃で急速混合した（ｍＲＮＡ：脂質＝１：３０ｗｔ／ｗｔ）。超純水で４℃、８時間透析することで、脂質粒子を含有する脂質粒子溶液を製造した。
（比較例１）
脂質粒子溶液の製造
　化合物ａに代えて、ｄｉｏｌｅｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＤＯＰ－ＤＥＤＡ）を用いた以外は、実施例２と同様にして、脂質粒子溶液を製造した。
　実施例２及び比較例１について、以下の測定条件により特性を評価した。
［脂質粒子の平均粒子径の測定］　
　実施例２及び比較例１で得られた脂質粒子溶液をＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒで希釈した後、Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ　５００（Ａｎｔｏｎ　Ｐａａｒ社製）を用いて脂質粒子の平均粒子径を測定した。
［ζ電位の測定］　
　脂質粒子溶液を１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）または１ ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸水溶液（ｐＨ４．５）で希釈した後、Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ　５００を用いてζ電位を測定した。
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（実施例３）
脂質粒子溶液の製造
　実施例２と同様にして、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて脂質粒子溶液を調製した。さらに、調製した脂質粒子溶液をアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ）－４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で限外濾過し、脂質粒子溶液を濃縮した（最終的なｍＲＮＡ濃度：２５ｎｇ／μＬ）。濃縮後、脂質粒子溶液に最終スクロース濃度が０．３Ｍとなるようにスクロースを添加して、実施例３の脂質粒子溶液を製造した。
（実施例４）
脂質粒子溶液の製造
　化合物ａ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、及び、ジミリストイルグリセロール－ポリエチレングリコール２０００を４５：１０：４５：１．５のモル比でエタノールに添加して、脂質のアルコール溶液を調製した（脂質濃度：０．９９ｍＭ）。また、ｍＲＮＡを１ ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸水溶液（ｐＨ４．５）に添加して、ｍＲＮＡ酸性水溶液を調製した。これら２つの溶液を、Ｓｔａｔｉｃ型マイクロミキサー（ＹＭＣ製）を用いて、脂質溶液とｍＲＮＡ溶液をそれぞれ１：４．２５の体積比で、２５℃で急速混合した（ｍＲＮＡ：脂質＝１：３０ｗｔ／ｗｔ）。超純水で４℃、８時間透析して、脂質粒子溶液を製造した。
（比較例２）
脂質粒子溶液の製造
　化合物ａに代えてＤＯＰ－ＤＥＤＡを用い、実施例２と同様にして、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて脂質粒子溶液を調製した。
（比較例３）
脂質粒子溶液の製造
　化合物ａに代えて、ＤＯＰ－ＤＥＤＡを用いた以外は実施例４と同様にして、脂質粒子溶液を製造した。
　実施例３、４及び比較例２、３について、以下の測定条件により特性を評価した。
［ルシフェラーゼ発現試験］
　脂質粒子溶液５０μＬ（ｍＲＮＡ １．２５μｇ相当）をそれぞれマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌性、６週齢）の左大腿筋に筋肉内投与した。脂質粒子溶液の投与から４、６、８、２４時間後、ルシフェラーゼの発現効果をＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を用いて評価した。イメージング１０分前にＤ－ルシフェリンカリウム塩（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）１５０ｍｇ／ｋｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔを腹腔内投与して、発光の結果を確認した。さらに、投与部位を関心領域として、総発光量を定量した。
　実施例３及び４を用いたそれぞれのイメージングの結果を図１に示し、総発光量のグラフを図２に示す。比較例２及び３を用いたそれぞれのイメージングの結果を図３に示し、総発光量のグラフを図４に示す。
　図１及び２の結果から、化合物ａを用いた実施例３及び４は、ルシフェラーゼ発現が確認された。すなわち、本発明のリン脂質を用いた脂質粒子溶液では、ルシフェラーゼ発現がＰＥＧ脂質の有無に依存しないことが分かった。
　これに対し、図３及び４の結果から、ＤＯＰ－ＤＥＤＡを用いており、脂質粒子溶液がＰＥＧを含有しない比較例２ではルシフェラーゼ発現が見られなかった。また、ＤＯＰ－ＤＥＤＡを用いており、脂質粒子溶液がＰＥＧを含有する比較例３ではルシフェラーゼ発現が確認された。本発明のリン脂質を用いない脂質粒子溶液では、ルシフェラーゼ発現がＰＥＧ脂質の有無に依存することが分かった。
（実施例５）
脂質粒子溶液の製造
　実施例２と同様にして、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて、脂質粒子溶液を製造した。
（比較例４）
脂質粒子溶液の製造
　ＡＬＣ－０３１５、ジステアロイルホスファチジルコリン及びコレステロールを４６.３：９.４：４２.７のモル比でエタノールに添加して、脂質のアルコール溶液を調製した（脂質濃度：０．９９ｍＭ）。また、ＨｉＢｉＴ　ｍＲＮＡを１ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸水溶液（ｐＨ４．５）に添加して、ｍＲＮＡ酸性水溶液を調製した。これら２つの溶液を、Ｓｔａｔｉｃ型マイクロミキサー（株式会社ＹＭＣ製）を用いて、脂質溶液とｍＲＮＡ溶液とをそれぞれ１：３の体積比で、２５℃で急速混合した（ｍＲＮＡ：脂質＝１：２５．５ｗｔ／ｗｔ）。超純水で４℃、８時間透析することで、脂質粒子を含有する脂質粒子溶液を製造した。
［脂質粒子の粒子径分布の測定］
　実施例５及び比較例４で製造された脂質粒子溶液をＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒで希釈した後、Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ５００（Ａｎｔｏｎ　Ｐａａｒ社製）を用いて脂質粒子の粒子径を測定した。結果を図５及び６に示す。
　図５及び６の結果から、化合物ａを用いた実施例５では、シャープな粒子径分布を示す脂質粒子が形成されていることが分かった。また、ＡＬＣ－０３１５を用いた比較例４では、大きな粒子径の脂質粒子も形成されていた。すなわち、本発明のリン脂質を用いた脂質粒子溶液では、ＰＥＧ脂質がなくとも、均一な粒子径の脂質粒子が製造できることが分かった。
（実施例６）
　トルエンに溶解した[３Ｈ]コレステリルヘキサデシルエーテルのトルエンを減圧留去した後、エタノールに溶解させた。得られた溶液と、化合物ａ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、及び、ジミリストイルグリセロール－ポリエチレングリコール２０００を４５：１０：４５：１．５のモル比でエタノールに溶解させたリン脂質溶液とを混合して、脂質のアルコール溶液を調製した。また、ＯＶＡ　ｍＲＮＡを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に添加して、ｍＲＮＡ酸性水溶液を調製した。これら２つの溶液を、Ｓｔａｔｉｃ型マイクロミキサー（株式会社ＹＭＣ製）を用いて、脂質溶液とｍＲＮＡ溶液とをそれぞれ１：４．２５の体積比で、２５℃の条件で急速混合した（ｍＲＮＡ：脂質＝１：３０ｗｔ／ｗｔ）。ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒで４℃の条件で限外濾過してエタノールを除去することで、脂質粒子を含有する脂質粒子溶液を製造した。
（実施例７）
　実施例６の、化合物a、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、及び、ジミリストイルグリセロール－ポリエチレングリコール２０００を４５：１０：４５：１．５のモル比でエタノールに溶解させたリン脂質溶液に代えて、化合物ａ、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び、コレステロールを４５：１０：４５のモル比でエタノールに溶解させたリン脂質溶液を用いた以外は実施例６と同様にして、脂質粒子溶液を製造した。
（比較例５）
　実施例６の化合物ａに代えて、ＤＯＰ－ＤＥＤＡを用いた以外は実施例６と同様にして、脂質粒子溶液を調製した。
（比較例６）
　ＳＭ－１０２、ジステアロイルホスファチジルコリン、コレステロール、及び、ジミリストイルグリセロール－ポリエチレングリコール２０００を５０：１０：３８．５：１．５のモル比でエタノールに添加して、脂質のアルコール溶液を調製した（脂質濃度：０．９９ｍＭ）。また、ＯＶＡ　ｍＲＮＡを６．２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に添加して、ｍＲＮＡ酸性水溶液を調製した。これら２つの溶液を、Ｓｔａｔｉｃ型マイクロミキサー（株式会社ＹＭＣ製）を用いて、脂質溶液とｍＲＮＡ溶液とをそれぞれ１：４．２５の体積比で、２５℃の条件で急速混合した（ｍＲＮＡ：脂質＝１：１９．３５ｗｔ／ｗｔ）。ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒで４℃、限外濾過してエタノールを除去することで、脂質粒子を含有する脂質粒子溶液を製造した。
［脂質粒子の生体内分布の評価］
　脂質粒子溶液５０μＬをそれぞれマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雌性、６週齢）の左大腿筋に筋肉内投与した。脂質粒子溶液の投与から４時間、又は、２４時間後、イソフルラン麻酔下脱血し、さらに各臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、左大腿筋、血漿、右腸骨下リンパ節（Ａ）、左腸骨下リンパ節（Ｂ））を摘出し、重量を測定した。肝臓は１００ｍｇ程度となるように切断した。血液はチューブに移し、３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃の条件で遠心をした。遠心後、血清１００μＬを測定用サンプルとした。各臓器や血清をバイアルに入れ、Ｓｏｌｖａｂｌｅ溶液１ｍＬを加え、５０℃インキュベーター内で一晩放置した。脱色剤として過酸化水素水、消泡剤として２－プロパノールをそれぞれ１ｍＬずつ加え、数時間放置した。Ｈｉｏｎｉｃ　Ｆｌｏｕｒ１０ｍＬを入れて振盪させた後、１時間暗所にて放置した。次いで、サンプルの放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ－８０００、Ａｌｏｋａ社製）を用いて測定した。図７及び８に、４時間、及び、２４時間の時点で測定した結果を示す。また、参考のために、図９及び１０として、図７及び８から、左大腿筋、右腸骨下リンパ節（Ａ）、左腸骨下リンパ節（Ｂ）を削除し、縦軸の数値を変更した図を示す。

Claims (18)

  1. 　一般式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、鎖式炭化水素基を示す。Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、炭素数１～５の炭化水素基を示す。ｍは１又は２を示し、ｎは１又は２示し、ｐは１～３の自然数を示す。）
    で表されるリン脂質。
  2. 　Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、炭素数１～３の炭化水素基を示す、請求項１に記載のリン脂質。
  3. 　ｍ及びｎが２である、請求項１又は２に記載のリン脂質。
  4. 　ｐが１である、請求項１又は２に記載のリン脂質。
  5. 　Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１２～２４の鎖式炭化水素基を示す請求項１又は２に記載のリン脂質。
  6. 　鎖式炭化水素基が不飽和鎖式炭化水素基である、請求項１又は２に記載のリン脂質。
  7. 　請求項１に記載のリン脂質の塩である、リン脂質塩。
  8. 　請求項１に記載のリン脂質（リン脂質Ａ）を含有する、脂質粒子。
  9. 　薬物を内包する、請求項８に記載の脂質粒子。
  10. 　薬物がポリヌクレオチドである、請求項９に記載の脂質粒子。
  11. 　ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡである、請求項１０に記載の脂質粒子。
  12. 　ステロールを含有する、請求項８に記載の脂質粒子。
  13. 　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含まない、請求項８に記載の脂質粒子。
  14. 　更に、前記リン脂質Ａ以外のリン脂質（リン脂質Ｂ）を含有する、請求項８に記載の脂質粒子。
  15. 　請求項１に記載のリン脂質を含有する、アルコール溶液。
  16. 　アルコール溶液中のアルコールがエタノールである、請求項１５に記載のアルコール溶液。
  17. 　請求項１５に記載のアルコール溶液と水溶性薬物を含有する酸性水溶液とを混合する工程を含む、脂質粒子の製造方法。
  18. 　請求項８に記載の脂質粒子を含有する、医薬。
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