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WO2024166983A1 - 神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬、およびそれを用いた生体試料の分析方法 - Google Patents

神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬、およびそれを用いた生体試料の分析方法 Download PDF

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WO2024166983A1
WO2024166983A1 PCT/JP2024/004375 JP2024004375W WO2024166983A1 WO 2024166983 A1 WO2024166983 A1 WO 2024166983A1 JP 2024004375 W JP2024004375 W JP 2024004375W WO 2024166983 A1 WO2024166983 A1 WO 2024166983A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
neuroblastoma
minimal residual
expression levels
residual disease
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2024/004375
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
範行 西村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kobe University NUC
Original Assignee
Kobe University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kobe University NUC filed Critical Kobe University NUC
Publication of WO2024166983A1 publication Critical patent/WO2024166983A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a genetic marker for evaluating minimal residual disease in neuroblastoma and its use. More specifically, the present invention relates to a reagent used for evaluating minimal residual disease in neuroblastoma and a method for analyzing biological samples using the same.
  • Neuroblastoma is an intractable childhood cancer derived from neural crest cells, accounting for approximately 10% of childhood cancers. This is the second most common cancer after brain tumors. Neuroblastoma also accounts for approximately 15% of childhood cancer deaths. Neuroblastoma is classified into low, intermediate, and high risk groups using five prognostic factors (disease stage, pathology, age, MYCN amplification, and DNA ploidy), with over 50% of patients classified as high risk. More than 50% of high risk patients experience recurrence.
  • MRD minimal residual disease
  • CRMP1, DBH, DDC, GAP43, ISL1, PHOX2B and TH are genetic markers that are highly capable of detecting minimal residual disease in neuroblastoma on their own, and by combining these seven genetic markers with the reference gene HPRT1, they have developed a method for evaluating minimal residual disease in neuroblastoma that is both clinically applicable and suppresses false negatives (Non-Patent Document 1, Patent Document 1, Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 five gene markers, CHGA, DCX, DDC, PHOX2B, and TH, used in combination with reference genes B2M, GAPDH, HPRT1, and SDHA
  • Non-Patent Document 3 three gene markers, PHOX2B, TH, and DCX
  • B4GALNT1, CCND1, ISL1, and PHOX2B using the B4GALNT1 enzyme that synthesizes GD2, a therapeutic target molecule for neuroblastoma
  • Non-Patent Document 4 Four gene markers, B, TH, and ELAV4 (Non-Patent Document 5), three gene markers, B4GALNT1, TH, and DDC (Non-Patent Document 6), and five gene markers, CHRNA3, DDC, GAP43, PHOX2B, and TH
  • POSTN POSTN
  • PRR three gene markers
  • the seven gene markers already discovered by the present inventors were selected because they are highly capable of detecting minimal residual disease in neuroblastoma on their own, but there is room for further consideration regarding the performance of combining multiple gene markers. Since a variety of MRD markers for neuroblastoma have been reported, if testing efficiency is not a concern, it is sufficient to simply increase the number of markers to be combined. However, in order to further improve accuracy while ensuring testing efficiency that takes into account applicability to actual clinical practice, a new combination of MRD markers for neuroblastoma is required.
  • the present invention aims to provide a reagent that utilizes a new combination of neuroblastoma MRD markers that can improve the accuracy of evaluating minimal residual disease in neuroblastoma, and a method for analyzing biological samples using the same.
  • the inventor selected two specific types (i.e., HPRT1 and HMBS) as reference genes, while narrowing down the primary candidates consisting of 20 neuroblastoma MRD gene markers that were narrowed down independently to a secondary candidate consisting of 14 gene markers according to the expression levels in the independently selected specimens, and further narrowing down to three combinations of gene markers that satisfy four independently determined conditions, and finally selected from these a combination of six gene markers with high accuracy (i.e., B4GALNT1, CHRNA3, CRMP1, DBH, PHOX2B, and TH).
  • the inventor unexpectedly found that by using these six neuroblastoma MRD gene markers in combination with two reference genes, it is possible to evaluate minimal residual disease of neuroblastoma with a high degree of accuracy that could not be expected from the technical level of the technical field.
  • the present invention was completed based on this finding and through further investigation.
  • the present invention includes a reagent for evaluating minimal residual disease of neuroblastoma and a method for analyzing biological samples using the same, as described below.
  • a reagent for evaluating minimal residual disease of neuroblastoma comprising a primer pair capable of amplifying gene markers for minimal residual disease of neuroblastoma consisting of B4GALNT1, CHRNA3, CRMP1, DBH, PHOX2B, and TH and reference genes consisting of HPRT1 and HMBS by a nucleic acid amplification method.
  • the above-mentioned genetic markers respectively described as B4GALNT1, CHRNA3, CRMP1, DBH, PHOX2B, and TH, and the reference genes consisting of HPRT1 and HMBS, each comprise a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 and SEQ ID NOs: 7 and 8 described below, and a nucleotide sequence having at least 70% homology to the polynucleotide and functionally equivalent to the polynucleotide.
  • the present invention uses only six gene markers for minimal residual disease of neuroblastoma, it can evaluate minimal residual disease of neuroblastoma with high accuracy.
  • Item 2 The reagent according to Item 1, which is used in the analysis of a sample collected from a neuroblastoma patient after the end of consolidation therapy.
  • Item 3 The reagent according to Item 1 or 2, which is used for a bone marrow specimen.
  • the reagent of the present invention when applied to the above-mentioned specimen, enables more accurate evaluation of the occurrence of minimal residual disease of neuroblastoma.
  • Item 4 The reagent according to any one of Items 1 to 3, further comprising a probe capable of hybridizing to each of the genetic marker and the reference gene under stringent conditions. This allows the genetic markers and the reference genes to be detected by hybridizing the probes.
  • the present invention uses only six gene markers for minimal residual disease of neuroblastoma, it can evaluate minimal residual disease of neuroblastoma with high
  • Item 6 The analysis method according to Item 5, wherein the evaluation value based on the expression levels A1 to A6 of the genetic markers is derived by weighting each of the expression levels A1 to A6 of the genetic markers by taking into account statistical values B1 to B6 of the expression levels of each of the genetic markers in a control to obtain weighted expression levels AB1 to AB6, and further by taking the geometric mean or sum of the weighted expression levels AB1 to AB6.
  • the sensitivity and specificity of the analysis for minimal residual disease of neuroblastoma can be improved overall.
  • Item 7 The method for analyzing a biological sample according to Item 5 or 6, wherein the nucleic acid amplification method in the measurement step is digital PCR.
  • the nucleic acid amplification method in the measurement step is digital PCR.
  • Item 8 The method for analyzing a biological sample according to any one of Items 5 to 7, wherein in the measuring step, the genetic marker and the reference gene are simultaneously nucleic acid amplified using a same nucleic acid amplifier. Since the present invention uses only eight types of gene markers and reference genes for minimal residual disease of neuroblastoma in total, simultaneous analysis using the same nucleic acid amplification device achieves excellent testing efficiency.
  • the reagent of the present invention and the method for analyzing biological samples using the same can improve the accuracy of evaluating minimal residual disease in neuroblastoma by utilizing a new combination of MRD markers for neuroblastoma.
  • the reagent of the present invention is used for evaluating minimal residual disease of neuroblastoma, and includes polynucleotide molecules used as primer pairs capable of amplifying six kinds of predetermined gene markers and two kinds of predetermined reference genes by nucleic acid amplification.
  • the reagent may further include polynucleotide molecules used as probes capable of hybridizing with each of the predetermined gene markers and the predetermined reference genes under stringent conditions.
  • the term "polynucleotide molecule” is used to include DNA, RNA, and PNA (peptide nucleic acid).
  • the polynucleotide molecule is DNA or RNA.
  • the genetic markers for minimal residual disease of neuroblastoma in the present invention consist of six types: a gene derived from the MES group and the ADRN group described as B4GALNT1, a gene derived from the ADRN group described as CHRNA3, a gene derived from the ADRN group described as CRMP1, a gene derived from the ADRN group described as DBH, a gene derived from the ADRN group described as PHOX2B, and a gene derived from the ADRN group described as TH (hereinafter, simply referred to as B4GALNT1, CHRNA3, CRMP1, DBH, PHOX2B, and TH, respectively).
  • the genetic markers of the present invention are a combination of only six genetic markers, but when used in combination with a specified reference gene, they can detect minimal residual disease of neuroblastoma with high accuracy.
  • This number of six genetic markers is a number that can be used to simultaneously amplify genes in many nucleic acid amplification devices, even when combined with two of the specified reference genes, making it easy to apply to clinical practice.
  • - B4GALNT1 Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyltransferase 1
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • -CHRNA3 Cholinergic receptor nicotinic alpha 3 subunit
  • - CRMP1 collapsin response mediator protein 1
  • - DBH dopamine ⁇ -hydroxylase
  • - PHOX2B paired-like homeobox 2b
  • nucleotide sequences encoding the genetic markers of the present invention include: As the sequence of B4GALNT1, the sequence represented by SEQ ID NO: 1; As the sequence of CHRNA3, the sequence represented by SEQ ID NO: 2; As the sequence of CRMP1, the sequence represented by SEQ ID NO: 3, As the sequence of DBH, a sequence represented by SEQ ID NO: 4, An example of the PHOX2B sequence is the sequence shown in SEQ ID NO:5, and an example of the TH sequence is the sequence shown in SEQ ID NO:6.
  • the nucleotide sequence encoding the genetic marker of the present invention may have homology to the above sequences, so long as it is an indicator of minimal residual disease of neuroblastoma.
  • it may be composed of a polynucleotide that has at least 70% homology to the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:6 above, and is functionally equivalent.
  • the sequence homology of such polynucleotides is more preferably 75% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Functionally equivalent means a function in which the expression level increases in the presence of minimal residual disease of neuroblastoma equivalent to that of the specific polynucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 described above.
  • Functional equivalence can be easily determined, for example, by measuring the expression level of the polynucleotide using the probe or primer described below, determining the correlation between the expression level and minimal residual disease of neuroblastoma using known statistical methods, and comparing it with the expression level of the specific polynucleotide described above.
  • the homology of the above-mentioned nucleotide sequences can be determined by known methods (the same applies below).
  • a specific example of such a method is the BLAST algorithm by Karlin and Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877 (1993)].
  • BLASTN or BLASTX has been developed [Altschul et al. J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990)], which can also be used in the present invention.
  • Another preferred method is a method using genetic information processing software GENETYX (manufactured by Genetics).
  • GENETYX genetic information processing software
  • homology analysis can be performed using the Lipman-Pearson method, which can be advantageously used in determining homology in the present invention.
  • the expression levels of the six gene markers mentioned above increase when the level of minimal residual disease of neuroblastoma increases. In other words, the expression levels correlate with the occurrence level of minimal residual disease of neuroblastoma. Therefore, by measuring the expression levels of all six gene markers together with the expression levels of a specific reference gene using the polynucleotide molecules described below, minimal residual disease of neuroblastoma can be evaluated based on the obtained expression levels.
  • the reference genes in the present invention are a gene designated as HPRT1 and a gene designated as HMBS (hereinafter, simply referred to as HPRT1 and HMBS, respectively). These reference genes show stable expression in both bone marrow and peripheral blood in both neuroblastoma patients and healthy adults, with little variation in expression levels.
  • - HPRT1 hyperxanthine phosphoribosyltransferase 1
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • - HMBS hydroxymethylbilane synthase
  • nucleotide sequences encoding the reference genes include: An example of the sequence of HPRT1 is the sequence shown in SEQ ID NO:7, and an example of the sequence of HMBS is the sequence shown in SEQ ID NO:8.
  • the nucleotide sequence encoding the reference gene may have homology to the above sequence, so long as it serves as an endogenous control.
  • it may be composed of a polynucleotide that has at least 70% homology to the above nucleotide sequence and is functionally equivalent to each of the above genes.
  • the sequence homology of such a polynucleotide is more preferably 75% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • Functionally equivalent means that the expression level varies little in both bone marrow and peripheral blood in both neuroblastoma patient groups and healthy adult groups, equivalent to the specific polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and 8 described above.
  • Functional equivalence can be easily determined, for example, by measuring the expression level of the polynucleotide using the probe or primer described below, determining the expression level and the correlation between the expression level and minimal residual disease of neuroblastoma using known statistical methods, and comparing it with those of the specific polynucleotide described above.
  • the primer pair in the present invention is a pair of polynucleotide molecules capable of amplifying nucleotide sequences encoding the above-mentioned genetic markers and reference genes, respectively.
  • the reagent of the present invention includes a total of six primer pairs for each of the six genetic markers B4GALNT1, CHRNA3, CRMP1, DBH, PHOX2B, and TH, and a total of two primer pairs for each of the two reference genes HPRT1 and HMBS.
  • Such a primer pair includes a sense primer and an antisense primer designed to amplify the nucleotide sequences encoding the above-mentioned genetic marker and reference gene, respectively.
  • the antisense primer is a polynucleotide molecule that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide to be amplified
  • the sense primer is a polynucleotide molecule that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the polynucleotide to be amplified.
  • Stringent conditions refer to incubation for 4 hours to overnight at 50°C to 65°C in 6xSSC (1xSSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0) containing 0.5% SDS, 5x Denhartz's (0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400) and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA.
  • primer pairs can be designed by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the region to be amplified.
  • one primer of the primer pair can have the sequence of the 5'-end portion of the nucleotide sequence of the region to be amplified
  • the other primer can have the sequence of the 5'-end portion of the nucleotide sequence of the complementary strand of the region to be amplified.
  • the length and specific sequence of the primers are not particularly limited and can be determined appropriately by a person skilled in the art.
  • the primers can be designed to have Tm values that provide consistent annealing temperature conditions for simultaneous measurement of multiple, preferably all, of the six genetic markers and two reference genes.
  • the length of the primer can be set, for example, to 18 to 30 nucleotides, preferably 18 to 26 nucleotides.
  • primers include, for example, the following.
  • Primer for B4GALNT1 5'- TGA AAG CAG CCT CAT GTC C-3' (sense) (SEQ ID NO: 9) 5'- CAA CTC AAC AGG CAA CTA CAA C-3' (antisense) (SEQ ID NO: 10)
  • Primer for CHRNA3 5'- CCT CCC CAG TGT ACT TGA GT -3' (sense) (SEQ ID NO: 11) 5'- GGA AGC CAG ACA TTG TGC T -3' (antisense) (SEQ ID NO: 12)
  • Primer for CRMP1 5'- TGG CTT CAA TGG TCT TCA CTC -3' (sense) (SEQ ID NO: 13) 5'-CAT CAA AGG TGG ACG GAT CA -3' (antisense) (SEQ ID NO: 14)
  • the primer may further include an additional sequence suitable for detection of the target to be amplified (specifically, a sequence not complementary to genomic DNA), such as a linker sequence.
  • the primer may also be labeled with a suitable labeling agent, such as a radioisotope (e.g., 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, etc.), an enzyme (e.g., ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), a fluorescent substance (e.g., fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, Cy3, Cy5, etc.), a luminescent substance (e.g., luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.), etc.
  • a radioisotope e.g., 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, etc.
  • an enzyme
  • the primers can be dissolved in water or a suitable buffer solution (e.g., TE buffer, Tris-HCl buffer, etc.) to a suitable concentration (e.g., 1 ⁇ M to 50 ⁇ M at a concentration of 2 ⁇ to 20 ⁇ ) either separately or in a mixed state as long as the function of each primer is not impaired, and stored at approximately ⁇ 20° C.
  • a suitable buffer solution e.g., TE buffer, Tris-HCl buffer, etc.
  • a suitable concentration e.g., 1 ⁇ M to 50 ⁇ M at a concentration of 2 ⁇ to 20 ⁇
  • the probe that may be included in the reagent of the present invention is a polynucleotide molecule that can detect the sequences encoding the above-mentioned genetic markers and reference genes, or their complementary sequences.
  • the probe can be a polynucleotide molecule that can hybridize under stringent conditions with the polynucleotides constituting the above-mentioned genetic markers or their complementary sequences.
  • Stringent conditions refer to incubation for 4 hours to overnight at 50°C to 65°C in 6xSSC (1xSSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0) containing 0.5% SDS, 5x Denhartz's (0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400) and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA.
  • a polynucleotide molecule hybridizes specifically to a genetic marker or a reference gene under stringent conditions, and does not hybridize to polynucleotide molecules other than the genetic marker or the reference gene.
  • polynucleotide molecule that hybridizes to the genetic marker or reference gene in the present invention does not need to be completely complementary to the genetic marker or its reference gene as long as the specific hybridization is possible, but preferably contains all or a part of the sequence of the polynucleotide molecule complementary to the genetic marker or its reference gene.
  • the probes of the present invention may be prepared as synthetic oligonucleotides using a commercially available oligonucleotide synthesizer or the like, or may be prepared as double-stranded DNA fragments obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the length of the probe in the present invention may be, for example, 18 to 30 nucleotides, preferably 18 to 26 nucleotides.
  • the probe of the present invention may be labeled with an appropriate labeling agent, for example, a radioisotope (e.g., 125I , 131I , 3H , 14C , etc.), an enzyme (e.g., ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), a fluorescent substance (e.g., carboxyfluorescein, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, Cy3, Cy5, VIC, etc.), a luminescent substance (e.g., luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.), a quencher (e.g., TAMRA, Black Hole, IowaBlack, BlackBerry, ZEM, TAO), etc.
  • a radioisotope e.g., 125I , 131I , 3H , 14C
  • the probe of the present invention preferably includes at least a label with a 5'-end fluorescent substance and a label with a 3'-end quencher. More specifically, the probe of the present invention may be configured as a single quencher probe labeled with one 5'-end fluorescent substance and one 3'-end quencher (e.g., TAMRA, Black Hole, Iowa Black, BlackBerry, etc.), or may be configured as a double quencher probe in which one internal quencher (e.g., ZEM, TAO, etc.) is incorporated between one 5'-end fluorescent substance and one 3'-end quencher (e.g., TAMRA, Black Hole, Iowa Black, BlackBerry, etc.).
  • the reagent of the present invention may contain, in addition to the components listed above as the primer or the components listed above as the primer and the probe, one or more other components selected from a base, additives for stabilizing the primer and/or the probe, components necessary for nucleic acid amplification (water, buffer, nucleic acid synthesizing enzyme, nucleic acid synthesis substrate, etc.), and a label (the label may be contained when the primer and/or the probe are contained in an unlabeled form).
  • the other components may be formulated in the form of a composition by being mixed with each of the above-mentioned primers and probes, or may form a kit item in the form of an individual package of the above-mentioned primers, probes, and other components.
  • a specific method for using the reagent of the present invention is as described in "2. Method for analyzing biological samples for evaluating minimal residual disease of neuroblastoma.”
  • the method for analyzing a biological sample of the present invention includes a measuring step of measuring the expression levels of the six kinds of gene markers and the two kinds of reference genes in a biological sample by a nucleic acid amplification method using the reagent described in the above "1.
  • Reagent for evaluating minimal residual disease of neuroblastoma and an evaluation step of evaluating whether the evaluation value based on the expression level of the gene marker is equal to or higher than a cutoff value set with reference to the quantitative value in a healthy person, and is characterized in that when the expression level is correlated (positively correlated) with the occurrence level of minimal residual disease of neuroblastoma and the evaluation value is equal to or higher than the cutoff value in the evaluation step, the minimal residual disease of neuroblastoma in the biological sample is determined to be positive.
  • the biological sample may be derived from a neuroblastoma patient.
  • the time of collection of the biological sample is selected from any time after the initial diagnosis (initial consultation) of the patient that requires a diagnosis of minimal residual disease of neuroblastoma.
  • the progression that a neuroblastoma patient who is suitable for systemic therapy (chemotherapy) may undergo after the initial consultation includes induction therapy, consolidation therapy, maintenance therapy, treatment-free observation, diagnosis of recurrence, and salvage therapy.
  • consolidation therapy high-dose chemotherapy, autologous peripheral blood stem cell transplantation, surgery, and radiation therapy may be performed in this order.
  • timing of biological sample collection include, for newly diagnosed patients, the time of diagnosis (initial consultation), the time of completion of induction therapy, the time of completion of consolidation therapy (the time of completion of high-dose chemotherapy or the time of completion of all treatments constituting consolidation therapy), the time of completion of maintenance therapy, and treatment-free follow-up, and for recurrent patients, the time of diagnosis (diagnosis of recurrence) and the time of completion of salvage therapy.
  • the present invention may be applied to only one of these collection times, or to multiple of these collection times.
  • a particularly preferred example of the timing of biological sample collection is after the completion of consolidation therapy for newly diagnosed patients, specifically, the time of completion of consolidation therapy and/or after the completion of consolidation therapy and before the time of recurrence diagnosis (more specifically, the time of completion of maintenance therapy and/or treatment-free follow-up).
  • the neuroblastoma patient is preferably an intermediate-risk or high-risk patient with a high risk of recurrence.
  • the analysis method of the present invention is preferably used to predict the prognosis of intermediate-risk or high-risk neuroblastoma patients with a high risk of recurrence, and is particularly preferably used to predict the prognosis of newly diagnosed high-risk neuroblastoma patients at the end of consolidation therapy.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it contains the subject's nucleic acid, and can be appropriately selected depending on the type of detection method used.
  • the biological sample can be a biological tissue collected from the subject, specifically a bone marrow specimen or a peripheral blood specimen, etc., preferably a nucleic acid sample of RNA (e.g., total RNA, mRNA, etc.) prepared from a bone marrow specimen according to a standard method.
  • the nucleic acid amplification method may be a normal PCR method, a real-time PCR method, a digital PCR method, or the like.
  • the nucleic acid amplification method may be a digital PCR method.
  • the use of digital PCR is particularly suitable for detecting minimal residual lesions of neuroblastoma in that it can detect even samples with low expression levels of gene markers with high sensitivity.
  • digital PCR is also preferable in that it can accurately detect minimal residual lesions of neuroblastoma with little variation in measurement results even if the analysis subject, analysis time, analysis equipment, protocol (reaction time, reaction temperature, etc.), etc. are different. Therefore, the use of digital PCR is also preferable in terms of high versatility and high reliability in the evaluation of minimal residual lesions of neuroblastoma.
  • a large starting sample is first divided into multiple smaller partial volume samples (split samples).
  • the split samples are prepared to contain, on average, a single copy of the target. Digitality is achieved by having zero (negative) or one (positive) polynucleotide molecule present in the split sample. By counting the positives in the split samples, the starting copy number of the target in the starting sample can be estimated. Therefore, digital PCR makes it possible to quantify the target even if the target is at a low concentration in the biological sample. Note that multiple serial dilutions of the starting sample can be used to adjust the split samples to the appropriate concentration for achieving digitality, and the volume can be determined according to the PCR device used. In this way, the expression level of the gene marker to be amplified (target) can be quantified.
  • the digital PCR is preferably a droplet-based digital droplet PCR (ddPCR).
  • the ddPCR method specifically includes a droplet generation step, a PCR amplification step, a detection step, and an analysis step.
  • a droplet generation step a plurality of droplets containing reagents required for nucleic acid amplification are generated.
  • the droplets or a sample having a larger reaction volume in which the droplets are contained
  • thermal cycling conditions suitable for amplifying the target are subjected to thermal cycling conditions suitable for amplifying the target.
  • droplets (or a sample having a larger reaction volume in which the droplets are contained) that contain PCR products are identified from droplets (or a sample having a larger reaction volume in which the droplets are contained) that do not contain PCR products.
  • the expression level of the target gene marker is derived.
  • the measurement step may include a step of hybridizing the probe described in "1-4. Probe” of "1. Reagents for assessing minimal residual disease of neuroblastoma” above to the nucleic acid in the biological sample. This allows the detection of the amplification product to be performed based on the label. For example, when a probe containing at least a 5'-end fluorescent substance label and a 3'-end quencher label is used, the probe hybridizes to the genetic marker, and when the extension reaction from the primer reaches the hybridization region, the 5'-end fluorescent substance is released by the action of the polymerase. The released fluorescent substance emits fluorescence when released from the quenching action of the quencher, and the expression level of the genetic marker is derived based on the fluorescence intensity.
  • the evaluation value based on the expression level of the genetic marker for minimal residual disease of neuroblastoma is evaluated as to whether it is equal to or greater than a cutoff value set with reference to the quantitative value in healthy individuals, and if it is equal to or greater than the cutoff value, the biological sample is judged to be positive for minimal residual disease of neuroblastoma.
  • the expression levels of the gene markers for minimal residual disease of neuroblastoma are not particularly limited, and can be determined according to known methods for diagnosing diseases using disease gene markers. Specifically, the expression levels of each of the six gene markers for minimal residual disease of neuroblastoma (hereinafter, these expression levels are referred to as "A1" to "A6", respectively) can be quantified as the amount of transcription to mRNA (i.e., copy number).
  • the expression levels A1 to A6 of each of the six gene markers may be absolute copy numbers, or may be relative amounts to the copy number of the reference gene (i.e., the value obtained by dividing the copy number of each of the six gene markers by the copy number of the reference gene).
  • the expression levels A1 to A6 of each of the six genetic markers are the relative amounts of the expression levels of each of the six genetic markers to the expression level of the reference gene. Furthermore, from the viewpoint of making it easier to handle the analytical values, it is preferable that the relative amounts are values obtained by dividing the copy number of each of the six genetic markers by the copy number of the reference gene and multiplying the result by 10,000.
  • the expression level (copy number) of the reference gene can be the average value of the expression levels of two reference genes.
  • Examples of the average value include the arithmetic mean value (i.e., the arithmetic mean value of the expression levels of the two reference genes) and the geometric mean value (i.e., the geometric mean value of the expression levels of the two reference genes), but in the present invention, it is more preferable to use the geometric mean value.
  • the method for determining the evaluation value based on the expression level is not particularly limited, and can be based on a known method for evaluating the occurrence of minimal residual disease of neuroblastoma using a gene marker panel for minimal residual disease of neuroblastoma and a reference gene.
  • the evaluation value based on the expression level may be the sum or average (more specifically, the arithmetic mean or geometric mean) of the expression levels described above in "2-2-1.
  • Expression level obtained for the six types of genetic markers, or the sum or average (more specifically, the arithmetic mean or geometric mean) of the values obtained by correcting the expression levels described above in "2-2-1.
  • Expression level obtained for the six types of genetic markers using a known method.
  • the evaluation value based on the expression level is preferably the sum or average (more specifically, the arithmetic mean or geometric mean) of the values (weighted expression levels AB1 to AB6 below) obtained by correcting the expression levels described above in "2-2-1.
  • Expression level for the six types of gene markers using the following method. The evaluation value based on the expression level in this case is described in detail below.
  • controls The six genetic markers have different expression patterns in healthy controls (hereinafter simply referred to as "controls”. Specifically, in the statistics of the expression levels of the six genetic markers in controls (n>100) (expression levels obtained in the same manner as in "2-2-1. Expression levels of genetic markers” above, preferably expression levels obtained based on digital PCR), when the expression levels are arranged from the smallest to the largest and divided into 100 equal parts, the percentile at which the genetic markers are first detected and the expression levels of the genetic markers vary for each marker.
  • CRMP1 is detected at a relatively low percentile (e.g., about the 6th percentile), while DBH is detected at a relatively high percentile (e.g., about the 52nd percentile), and when comparing the expression levels at higher percentiles (e.g., about the 90th percentile), CRMP1 has a much higher expression level than DBH.
  • the six genetic markers have different weights, or levels of importance (or, in other words, different levels of unimportance).
  • CRMP1 which is relatively easy to detect in controls and has a relatively large amount of detection, can be said to have a lower level of importance (i.e., a higher level of unimportance).
  • differences in importance i.e., differences in unimportance
  • Expression levels of gene markers by taking into account the statistical values of the expression levels of each of the six gene markers in the control (hereinafter, these statistical values corresponding to each of the six gene markers are referred to as "B1" to "B6") as a method of correcting the expression levels.
  • the expression levels A1 to A6 of the six gene markers are corrected by the statistical values B1 to B6, which are values indicating their non-importance, to obtain weighted expression levels (hereinafter, these weighted expression levels corresponding to each of the expression levels A1 to A6 are referred to as "AB1" to "AB6").
  • AB1 weighted expression levels corresponding to each of the expression levels A1 to A6
  • AB6 weighted expression levels
  • the statistical values B1 to B6 can be either the expression level at a fixed percentile (i.e., one of the percentiles at which all six genetic markers are detected in the control, which is one specific percentile commonly adopted for all six genetic markers), or the expression level at a variable percentile (i.e., the percentile that indicates the expression level closest to the cutoff value for the presence or absence of minimal residual disease of neuroblastoma in the expression levels of each of the six genetic markers in the control, which is set to correspond to each of the six genetic markers).
  • a fixed percentile i.e., one of the percentiles at which all six genetic markers are detected in the control, which is one specific percentile commonly adopted for all six genetic markers
  • the expression level at a variable percentile i.e., the percentile that indicates the expression level closest to the cutoff value for the presence or absence of minimal residual disease of neuroblastoma in the expression levels of each of the six genetic markers in the control, which is set to correspond to each of the six genetic markers.
  • the weighting method for obtaining the weighted expression levels AB1 to AB6 includes a method of weighting by division and a method of weighting by subtraction.
  • weighting by division When weighting is performed by division, specifically, the expression amounts A1 to A6 are divided by the statistical values B1 to B6 to obtain weighted expression amounts AB1 to AB6.
  • the weighted expression amount AB1 is obtained as ⁇ A1/B1 ⁇
  • the weighted expression amount AB2 is obtained as ⁇ A2/B2 ⁇
  • ... the weighted expression amount AB6 is obtained as ⁇ A6/B6 ⁇ .
  • the statistical values B1 to B6 are not 0, either the expression amount at the percentile or the expression amount at the variable percentile can be used.
  • weighting by subtraction When weighting is performed by subtraction, specifically, the statistical values B1 to B6 are subtracted from the expression amounts A1 to A6, respectively, to obtain the weighted expression amounts AB1 to AB6.
  • the weighted expression amount AB1 is obtained as ⁇ A1-B1 ⁇
  • the weighted expression amount AB2 as ⁇ A2-B2 ⁇
  • ... the weighted expression amount AB6 as ⁇ A6-B6 ⁇ .
  • the statistical values B1 to B6 either the expression amount at a fixed percentile or the expression amount at a variable percentile can be used.
  • the weighted expression amount is set to 1. For example, if ⁇ A1-B1 ⁇ >1, ⁇ A2-B2 ⁇ 1, ..., ⁇ A6-B6 ⁇ >1, the weighted expression amount AB1 is ⁇ A1-B1 ⁇ , the weighted expression amount AB2 is 1, ..., the weighted expression amount AB6 is ⁇ A6-B6 ⁇ .
  • the weighted expression amount is set to 0. For example, if ⁇ A1-B1 ⁇ >0, ⁇ A2-B2 ⁇ 0, ..., ⁇ A6-B6 ⁇ >0, then the weighted expression amount AB1 is ⁇ A1-B1 ⁇ , the weighted expression amount AB2 is 0, ..., the weighted expression amount AB6 is ⁇ A6-B6 ⁇ .
  • the cutoff value of the expression level of the gene marker can be set by a known statistical method with reference to the evaluation value empirically collected by measuring in advance by the above-mentioned method.
  • Specific methods for setting the cutoff value include, for example, a method of deriving the expression level of the gene marker in the control cells as ⁇ average value of the expression level of the gene marker in the control cells ⁇ n ⁇ standard deviation ⁇ , and ROC (Receiver Operating Characteristic) analysis, and preferably ROC analysis.
  • B4GALNT1 SEQ ID NO: 1
  • CHRNA3 SEQ ID NO: 2
  • CRMP1 SEQ ID NO: 3
  • DBH SEQ ID NO: 4
  • PHOX2B SEQ ID NO: 5
  • TH SEQ ID NO: 6
  • HPRT1 SEQ ID NO: 7
  • HMBS SEQ ID NO: 8
  • the following samples were selected for screening: 4 parental NB cell lines (BE(2)-C, SY-5Y, NB69, IMR32), 4 sphere NB cell lines (BE(2)-C, SY-5Y, NB69, IMR32), 4 bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC), 4 umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSC), 10 control bone marrow samples, and 10 control peripheral blood samples.
  • 4 parental NB cell lines (BE(2)-C, SY-5Y, NB69, IMR32)
  • 4 sphere NB cell lines BE(2)-C, SY-5Y, NB69, IMR32
  • BM-MSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • UC-MSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • 10 control bone marrow samples 4 control peripheral blood samples.
  • the expression levels in the screening samples were measured, and the genes with high expression levels in the control bone marrow, control peripheral blood, and low expression levels in the Sphere NB cell line were narrowed down.
  • the expression levels of the gene markers for minimal residual disease of neuroblastoma were derived as the relative expression levels of the gene markers to the expression levels of the reference genes.
  • the geometric mean of the expression levels of the two references determined in [1] was used as the expression level of the reference genes (the same applies below). As a result, CCND1, UCHL1, CHGB, STMN2, SNAP91, and ST8SIA2 were excluded, and the remaining 14 gene markers were selected as secondary candidates.
  • the expression levels of 14 secondary candidate gene markers were measured in a cohort of 16 bone marrow samples (9 recurrent and 7 non-recurrent samples; 1 sample per patient) collected at the end of consolidation therapy, and from all combinations (6,475 combinations) of 1 to 6 genes selected from the 14 gene markers, 83 combinations were selected that yielded an AUC (point estimate) of >0.8 and an AUC lower limit (lower confidence interval limit) of >0.7. From these, 70 combinations were selected that included B4GALNT1 but did not include GAP43, and from these, 43 combinations were selected that included DBH and PHOX2B/TH and allowed the setting of a cutoff with a specificity of >80% and a sensitivity of >50%.
  • the expression levels of candidate gene markers for minimal residual disease in neuroblastoma were measured in a cohort of 57 bone marrow samples (comprising 7 recurrent and 50 non-recurrent samples; multiple samples per patient) taken after the end of consolidation therapy and before diagnosis of recurrence (specifically, at the end of maintenance therapy and during treatment-free follow-up, etc.) for 43 combinations of candidate gene markers (NB-mRNAs), and the following three combinations enabling highly accurate diagnosis were selected.
  • RNA concentration was measured using a Nanodrop 2000 spectrophotometer (ThermoFisher Scientific), and the quality and integrity of total RNA was evaluated using a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). 4) cDNA was synthesized from 1.0 ⁇ g of total RNA whose quality had been evaluated using a QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen), and diluted with TE buffer to a total volume of 80 ⁇ l.
  • Qiagen QuantiTect Reverse Transcription kit
  • Droplets of the reaction solution were generated using a QX200 Droplet Generator (Bio-Rad Laboratories), and each cDNA was amplified using a C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories).
  • the thermal cycling conditions were a pre-cycle of 95°C for 10 minutes, 40 cycles of 94°C for 30 seconds and 56°C for 1 minute 30 seconds, and a post-cycling of 98°C for 10 minutes.
  • the temperature increase rate was 2°C/second.
  • droplets were measured with a QX200 Droplet Reader (Bio-Rad) and target copy numbers were analyzed by QuantaSoft (version 1.6.6, Bio-Rad).
  • the expression level of each gene marker in the sample was calculated as the copy number (copies per sample) from the copy number of the gene marker (copies per well) and the copy number of the reference gene (copies per well) using the following formula.
  • the copy number of the reference gene is the geometric mean of the copy number of HPRT1 and the copy number of HMBS.
  • the expression levels A1 to A6 of each gene marker in the sample were obtained as the relative expression level (relative copy number) to the reference gene.
  • AUC was derived in the same manner as above for the 16 bone marrow specimen cohort (consisting of 9 recurrent specimens and 7 non-recurrent specimens. One specimen per patient) collected at the end of consolidation therapy used in Example 1 shown in [4] of Test Example 2, except that the combination of gene markers was changed to that shown in Table 3.
  • the combinations of gene markers used in Comparative Examples 1 to 9 shown in Table 3 are combinations of gene markers reported in previous reports (Non-Patent Documents 1, 9, 7, 2, 5, 4, 6, 3), or combinations excluding those not included in the 14 gene markers related to the secondary candidates selected in [2] of Test Example 1 (specifically, CCND1, DCX, and ELAV4, which were determined to deteriorate performance when narrowing down to the secondary candidates). The results are shown in Table 3.
  • the AUCs for the combinations of genetic markers in Comparative Examples 1 to 9 were in the range of 0.587 to 0.786, and their superiority or inferiority was unrelated to the number of markers constituting the combination.
  • the AUC for the combination of six genetic markers of the present invention was dramatically improved to 0.937, and the degree of improvement was so remarkable that it far exceeded the level that could be expected from the current state of the art.
  • SEQ ID Nos:9 to 24 are primers, and SEQ ID Nos:25 to 32 are probes.

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Abstract

神経芽腫の微小残存病変の評価における正確性を向上できる、神経芽腫のＭＲＤマーカーの新たな組み合わせを利用する試薬及びそれを用いた生体試料の分析方法を提供する。本発明の試薬は、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーと、ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳからなるレファレンス遺伝子と、を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられ、神経芽腫の微小残存病変の評価における正確性を向上できる。

Description

神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬、およびそれを用いた生体試料の分析方法
　本発明は、神経芽腫の微小残存病変を評価するための遺伝子マーカーおよびその使用に関する。より具体的には、本発明は、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬、およびそれを用いた生体試料の分析方法に関する。
　神経芽腫は、神経堤細胞由来の難治性小児がんであり、小児がんの約１０％を占める。これは、脳腫瘍に次いで高い頻度である。また神経芽腫は、小児がん死亡原因の約１５％を占める。神経芽腫は、５つの予後因子（病期、病理、年齢、ＭＹＣＮ増幅、ＤＮＡプロイディー）を用いて、低・中間・高リスク群に分類されるが、５０％を超える患者が高リスク群に分類される。そして、高リスク群患者の５０％超で再発する。
　したがって、神経芽腫の予後改善、特に高リスク群患者の予後改善には、再発の起源と考えられる微小残存病変（ＭＲＤ）を正しく評価することが不可欠である。腫瘍細胞にのみに検出される遺伝子が同定されていない神経芽腫では、正常細胞に比して腫瘍細胞で高発現するいくつかの遺伝子をマーカーとすることで、ＭＲＤの検出が試みられてきた。
　本発明者は、単独で神経芽腫の微小残存病変の検出能力が高い遺伝子マーカーとして、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ及びＴＨを見出し、これら７種の遺伝子マーカーとレファレンス遺伝子ＨＰＲＴ１とを組み合わせることで、偽陰性の抑制と臨床適用性とを両立した神経芽腫の微小残存病変の評価法を開発した（非特許文献１、特許文献１、特許文献２）。
　また、神経芽腫のＭＲＤマーカーとしては他にも様々なものが報告されており、例えば、ＣＨＧＡ、ＤＣＸ、ＤＤＣ、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの５種の遺伝子マーカーであって、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、及びＳＤＨＡのレファレンス遺伝子と組み合わせて用いられるもの（非特許文献２）；ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＨ、及びＤＣＸの３種の遺伝子マーカー（非特許文献３）；神経芽腫の治療標的分子ＧＤ２の合成酵素Ｂ４ＧＡＬＮＴ１を利用した、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＣＮＤ１、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂの４種の遺伝子マーカー（非特許文献４）、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＨ、及びＥＬＡＶ４の４種の遺伝子マーカー（非特許文献５）、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＴＨ、ＤＤＣの３種の遺伝子マーカー（非特許文献６）、並びに、ＣＨＲＮＡ３、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの５種の遺伝子マーカー（非特許文献７）；神経芽腫のＭＥＳ群固有のＰＯＳＴＮ、ＰＲＲＸ１及びＦＭＯ３の３種の遺伝子マーカー（非特許文献８）；その他遺伝子マーカーＣＨＧＢ、ＳＮＡＰ９１、ＳＴＭＮ２（非特許文献７）ＧＡＢＲＢ３、ＫＩＦ１Ａ（非特許文献９）ＳＴ８ＳＩＡ２（非特許文献１０）、ＵＣＨＬ１（非特許文献１１）等が報告されている。
J Mol Diagn 22: 236-246, 2020. Clin Cancer Res 23: 5374-5383, 2017. J Pathol 216: 245-252, 2008. J Clin Oncol 33: 755-763, 2015. Pediatr Blood Cancer 369: e27354, 2018. Int J Cancer 123: 2849-2855, 2008. Clin Chem 55: 1316-1326, 2009. JCO Precision Oncology 3: 1-11, 2019. Clin Cancer Res 14: 7020-7027, 2008. Int J Cancer 119: 152-156, 2006. Clin Cancer Res 6: 551-558, 2000.
国際公開第２０１８／１２３７６４号 国際公開第２０２１／００６３４５号
　本発明者によってすでに見出された７種の遺伝子マーカーは、それら自体単独で神経芽腫の微小残存病変の検出能力が高い遺伝子マーカーが選択されているが、複数の遺伝子マーカーを組合せることによる性能については検討の余地がある。神経芽腫のＭＲＤマーカーとしては様々なものが報告されているため、検査効率を度外視するならば、組み合わせるマーカーの数を単に増やせばよい。しかしながら、実臨床への適用性を考慮した検査効率を確保しつつ、より一層正確性を改善するためには、神経芽腫のＭＲＤマーカーの新たな組み合わせが要される。
　そこで、本発明は、神経芽腫の微小残存病変の評価における正確性を向上できる、神経芽腫のＭＲＤマーカーの新たな組み合わせを利用する試薬及びそれを用いた生体試料の分析方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、レファレンス遺伝子として特定の２種（つまり、ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳ）を選択する一方で、独自に絞り込んだ２０種の神経芽腫のＭＲＤ遺伝子マーカーからなる一次候補を、独自に選択した検体での発現量に応じて１４種の遺伝子マーカーからなる二次候補に絞り込み、さらに、独自に定めた４つの条件を満たす３通りの遺伝子マーカーの組み合わせに絞り込み、最後に、これらの中から正確性の高い６種からなる遺伝子マーカーの組み合わせ（つまり、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨ）を選択した。さらに、これら６種の神経芽腫のＭＲＤの遺伝子マーカーと、２種のレファレンス遺伝子とを組み合わせて用いることで、当該技術分野の技術水準からはおおよそ期待し得なかったほどの高い正確性をもって神経芽腫の微小残存病変を評価できることを、予期せず見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成したものである。
　本発明は、以下に掲げる通り、神経芽腫の微小残存病変を評価するための試薬と、それを用いた生体試料の分析方法と、を含む。
項１．　Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーと、ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳからなるレファレンス遺伝子と、を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬。
　上述のＢ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨとしてそれぞれ記載される遺伝子マーカー、並びにＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳからなるレファレンス遺伝子は、それぞれ、後述の配列番号１～６及び配列番号７，８で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドと少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり且つ当該ポリヌクレオチドと機能的に同等なものとを含む。
　本発明で用いる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーはわずか６個でありながら、神経芽腫の微小残存病変を正確性高く評価できる。
項２．　地固め療法終了時以降における神経芽腫患者から採取した試料の分析に用いられる、項１に記載の試薬。
　本発明の試薬は、上述の患者に適用することで、神経芽腫の微小残存病変の発生をより正確に評価することができるため、より正確な予後を予測できる。
項３．　骨髄検体に対して用いられる、項１又は２に記載の試薬。
　本発明の試薬は、上述の検体に適用することで、神経芽腫の微小残存病変の発生をより正確に評価することができる。
項４．　前記遺伝子マーカー及び前記レファレンス遺伝子それぞれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含む、項１～３のいずれかに記載の試薬。
　これによって、プローブをハイブリダイズさせることで遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子を検出することができる。
項５．　Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー、並びにＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳからなるレファレンス遺伝子の、生体試料中における発現量を、項１～４のいずれかに記載の試薬を用いて核酸増幅法により測定する測定工程と、
　前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６に基づく評価値が、健常者における定量値を参照して設定されるカットオフ値以上か否かを評価する評価工程とを含み、
　前記発現量が神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関し、
　前記評価工程において、前記評価値が前記カットオフ値以上である場合に、前記生体試料の神経芽腫の微小残存病変を陽性と判定する、生体試料の分析方法。
　本発明で用いる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーはわずか６個でありながら、神経芽腫の微小残存病変を正確性高く評価できる。
項６．　前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６に基づく評価値が、前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６の各々に対し、コントロールにおける前記遺伝子マーカー各々の発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ６を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６を取得し、さらに、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の幾何平均又は総和をとることにより導出される、項５に記載の分析方法。
　この場合、神経芽腫の微小残存病変における分析の感度及び特異度を総合的に向上できる。
項７．　前記測定工程における前記核酸増幅法がデジタルＰＣＲである、項５又は６に記載の生体試料の分析方法。
　この場合、遺伝子発現量がより少ない検体であっても感度よく神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。また、異なる分析主体、分析時期、分析機器、プロトコル（反応時間、反応温度等）等であっても測定結果のばらつきを少なくすることができ、正確に神経芽腫の微小残存病変を検出することができる。
項８．　前記測定工程において、同一の核酸増幅装置を用いて前記遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子を同時に核酸増幅する、項５～７のいずれかに記載の生体試料の分析方法。
　本発明で用いる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子は合計でわずか８種であるため、同一の核酸増幅装置を用いて同時に分析することで、優れた検査効率が奏される。
　本発明の試薬及びそれを用いた生体試料の分析方法は、神経芽腫のＭＲＤマーカーの新たな組み合わせを利用することで、神経芽腫の微小残存病変の評価における正確性を向上できる。
［１．神経芽腫の微小残存病変を評価するための試薬］
　本発明の試薬は神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられるものであり、６種の所定の遺伝子マーカー及び２種の所定のレファレンス遺伝子を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアとして用いられるポリヌクレオチド分子を含む。また、プライマーペアとして用いられるポリヌクレオチド分子に加えて、所定の遺伝子マーカー及び所定のレファレンス遺伝子それぞれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブとして用いられるポリヌクレオチド分子をさらに含んでもよい。なお、本明細書において、ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい態様によれば、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。
［１－１．神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー］
　本発明における神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１として記載されるＭＥＳ群及びＡＤＲＮ群由来の遺伝子、ＣＨＲＮＡ３として記載されるＡＤＲＮ群由来の遺伝子、ＣＲＭＰ１として記載されるＡＤＲＮ群由来の遺伝子、ＤＢＨとして記載されるＡＤＲＮ群由来の遺伝子、ＰＨＯＸ２Ｂとして記載されるＡＤＲＮ群由来の遺伝子、及びＴＨとして記載されるＡＤＲＮ群由来の遺伝子（以下、それぞれ単に、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨと記載する。）の６種からなる。
　本発明における遺伝子マーカーは、わずか６個の遺伝子マーカーの組み合わせでありながら、所定のレファレンス遺伝子と組み合わされて用いられることで、神経芽腫の微小残存病変を高い正確性で検出することができる。この６個という遺伝子マーカー数は、所定のレファレンス遺伝子の２個と組み合わせても、多くの核酸増幅装置において同時に遺伝子増幅できる数であるため、臨床への適用も容易である。
　本発明における遺伝子マーカーそれぞれの配列情報の詳細は、公知のデータベースにおいて取得することができる。たとえば;
・Ｂ４ＧＡＬＮＴ１（Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyltransferase 1）として、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_001478に相当するもの及びそのアイソフォーム、
・ＣＨＲＮＡ３（cholinergic receptor nicotinic alpha 3 subunit）として、同アクセッション番号NR_000743に相当するもの及びそのアイソフォーム、
・ＣＲＭＰ１(collapsin response mediator protein 1)として、同アクセッション番号NM_001313に相当するもの及びそのアイソフォーム、
・ＤＢＨ(dopamine β-hydroxylase)として、同アクセッション番号NM_000787に相当するもの及びそのアイソフォームとして可能性のあるもの、
・ＰＨＯＸ２Ｂ(paired-like homeobox 2b)として、同アクセッション番号NM_003924に相当するもの及びそのアイソフォームとして可能性のあるもの、及び
・ＴＨ(tyrosine hydroxylase)として、同アクセッション番号NM_199293に相当するもの及びそのアイソフォームが挙げられる。
　本発明における遺伝子マーカーをコードする具体的なヌクレオチド配列としては；
・Ｂ４ＧＡＬＮＴ１の配列として、配列番号１で表される配列、
・ＣＨＲＮＡ３の配列として、配列番号２で表される配列、
・ＣＲＭＰ１の配列として、配列番号３で表される配列、
・ＤＢＨの配列として、配列番号４で表される配列、
・ＰＨＯＸ２Ｂの配列として、配列番号５で表される配列、及び
・ＴＨの配列として、配列番号６で表される配列が挙げられる。
　本発明における遺伝子マーカーをコードするヌクレオチド配列は、神経芽腫の微小残存病変の指標となる限り、上記の配列と相同性を有するものであってもよい。好ましくは、上述の配列番号１から配列番号６でそれぞれ表されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ機能的に同等なポリヌクレオチドからなってよい。このようなポリヌクレオチドの配列相同性は、より好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
　なお、機能的に同等とは、上述の配列番号１～６でそれぞれ表されるヌクレオチド配列を有する特定のポリヌクレオチドと同等に、神経芽腫の微小残存病変が存在する場合に発現量が増加する機能をいう。機能同等性は、たとえば、後述するプローブまたはプライマーを用い、ポリヌクレオチドの発現量を測定し、当該発現量と神経芽腫の微小残存病変との相関を公知の統計手法により決定し、上述の特定のポリヌクレオチドの発現量と比較することにより容易に決定することができる。
　また、上述のヌクレオチド配列の相同性は、公知の手法によって決定できる（以下においても同様）。このような手法の具体例としては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３－５８７７（１９９３）〕等が挙げられる。また、このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されており〔Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３－４１０（１９９０）〕、本発明においても利用することができる。さらに、他の好ましい手法としては、遺伝情報処理ソフトウェア ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）を用いる手法が挙げられる。ＧＥＮＥＴＹＸを用いる場合には、ＢＬＡＳＴによる解析のほかにＬｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法によるホモロジー解析を行うことができ、本発明における相同性決定において有利に利用することができる。
　上述の６種の遺伝子マーカーは、神経芽腫の微小残存病変のレベルが増加する場合に発現量が増加する。つまり、当該発現量と神経芽腫の微小残存病変の発生レベルとが相関する。したがって、後述するポリヌクレオチド分子を用い、これら６種の遺伝子マーカー全ての発現量を所定のレファレンス遺伝子の発現量とともに測定することで、得られた発現量に基づいて神経芽腫の微小残存病変を評価することができる。
［１－２．レファレンス遺伝子］
　本発明におけるレファレンス遺伝子は、ＨＰＲＴ１として記載される遺伝子、及びＨＭＢＳとして記載される遺伝子（以下、それぞれ単に、ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳと記載する。）である。これらのレファレンス遺伝子は、神経芽腫患者群及び健常成人群のいずれにおいても、骨髄及び末梢血の両方で発現量のばらつきが少ないため安定した発現を示す。
　レファレンス遺伝子の配列情報の詳細は、公知のデータベースにおいて取得することができる。たとえば；
・ＨＰＲＴ１(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)として、アメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_000194に相当するもの及びそのアイソフォームとして可能性のあるもの、及び
・ＨＭＢＳ（Hydroxymethylbilane synthase）として、同データベースにおけるアクセッション番号NM_000190に相当するもの、及びそのアイソフォームが挙げられる。
　レファレンス遺伝子をコードする具体的なヌクレオチド配列としては；
・ＨＰＲＴ１の配列として、配列番号７で表される配列、及び
・ＨＭＢＳの配列として、配列番号８で表される配列が挙げられる。
　レファレンス遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、内在性コントロールとなる限り、上記の配列と相同性を有するものであってもよい。好ましくは、上述のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ上述の遺伝子それぞれと機能的に同等なポリヌクレオチドからなってよい。このようなポリヌクレオチドの配列相同性は、より好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
　なお、機能的に同等とは、上述の配列番号７，８で表されるヌクレオチド配列を有する特定のポリヌクレオチドと同等に、神経芽腫患者群及び健常成人群のいずれにおいても、骨髄及び末梢血の両方で発現量のばらつきが少ないものである。機能同等性は、たとえば、後述するプローブまたはプライマーを用い、ポリヌクレオチドの発現量を測定し、当該発現量、および、当該発現量と神経芽腫の微小残存病変との相関を公知の統計手法により決定し、上述の特定のポリヌクレオチドのそれらと比較することにより容易に決定することができる。
［１－３．プライマーペア］
　本発明におけるプライマーペアは、上述の遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子それぞれをコードするヌクレオチド配列を増幅しうる一対のポリヌクレオチド分子である。本発明の試薬には、６種の遺伝子マーカーＢ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨそれぞれに対する合計６対のプライマーペアと、２種のレファレンス遺伝子ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳそれぞれに対する合計２対のプライマーペアとが含まれる。
　このようなプライマーペアは、上述の遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子それぞれをコードするヌクレオチド配列を増幅できるように設計されたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、増幅対象のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子であり、センスプライマーは、増幅対象のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子である。
　ストリンジェントな条件とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　具体的なプライマーペアの設計は、増幅対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜行うことができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
　プライマーの長さ及び具体的配列は特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。たとえば、６種の遺伝子マーカー及び２種のレファレンス遺伝子のうち複数、好ましくは全部の同時測定のために、アニーリング温度条件が揃うＴｍ値となるよう設計することができる。
　プライマーの長さは、たとえば１８ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下、好ましくは１８ヌクレオチド以上２６ヌクレオチド以下に設定できる。
　プライマーの具体的配列としては、たとえば以下が挙げられる。
・Ｂ４ＧＡＬＮＴ１に対するプライマー
　　5'- TGA AAG CAG CCT CAT GTC C -3' (sense)　（配列番号９）
　　5'- CAA CTC AAC AGG CAA CTA CAA C -3' (antisense)　（配列番号１０）
・ＣＨＲＮＡ３に対するプライマー
　　5'- CCT CCC CAG TGT ACT TGA GT -3' (sense)　（配列番号１１）
　　5'- GGA AGC CAG ACA TTG TGC T -3' (antisense)　（配列番号１２）
・ＣＲＭＰ１に対するプライマー
　　5'- TGG CTT CAA TGG TCT TCA CTC -3' (sense)　（配列番号１３）
　　5'- CAT CAA AGG TGG ACG GAT CA -3' (antisense)　（配列番号１４）
・ＤＢＨに対するプライマー
　　5'- CAC TGT GAC CAC CTT TCT CC -3' (sense)　（配列番号１５）
　　5'- CTT CAT CCT CAC TGG CTA CTG -3' (antisense)　（配列番号１６）
・ＰＨＯＸ２Ｂに対するプライマー
　　5'- CTC CTG CTT GCG AAA CTT G -3' (sense)　（配列番号１７）
　　5'- CTC ACT ACC CCG ACA TCT ACA -3' (antisense)　（配列番号１８）
・ＴＨに対するプライマー
　　5'- GGT CTC TAG ATG GTG GAT TTT GG -3' (sense)　（配列番号１９）
　　5'- TGC TAA ACC TGC TCT TCT CC -3' (antisense)　（配列番号２０）
・ＨＰＲＴ１に対するプライマー
　　5'- GCG ATG TCA ATA GGA CTC CAG -3' (sense)　（配列番号２１）
　　5'- TTG TTG TAG GAT ATG CCC TTG A -3' (antisense)　（配列番号２２）
・ＨＭＢＳに対するプライマー
　　5'- AGG GTA CGA GGC TTT CAA TG -3' (sense)　（配列番号２３）
　　5'- CAT GTC TGG TAA CGG CAA TG -3' (antisense)　（配列番号２４）
　プライマーは、増幅対象の検出に適した付加的配列（具体的にはゲノムDNAと相補的でない配列）、例えばリンカー配列をさらに含んでいてもよい。また、プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（たとえば、125I、131I、3H、14Cなど）、酵素（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、蛍光物質（たとえば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など）、発光物質（たとえば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）などで標識されていてもよい。さらに、プライマーは、各々別個に、または各々の機能を損なわなければ混合した状態で、水または適当な緩衝液（たとえば、TEバッファー、Tris-HClバッファーなど）中に適当な濃度（たとえば、2×以上20×以下の濃度で1μM以上50μM以下など）となるように溶解し、約-20℃で保存することができる。
［１－４．プローブ］
　本発明の試薬に含まれてよいプローブは、上述の遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子それぞれをコードする配列またはその相補鎖配列を検出しうるポリヌクレオチド分子である。具体的には、プローブとして、上述の遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドまたはその相補鎖なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズうるポリヌクレオチド分子を用いることができる。
　ストリンジェントな条件とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ハイブリダイズにおいては、ポリヌクレオチド分子がストリンジェントな条件下で遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子に特異的にハイブリダイズし、且つ、遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子以外のポリヌクレオチド分子にはハイブリダイズしない。
　また、本発明における遺伝子マーカーまたはレファレンス遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチド分子は、上記特異的なハイブリダイズが可能であれば、その遺伝子マーカーまたはそのレファレンス遺伝子に対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、その遺伝子マーカーまたはそのレファレンス遺伝子に相補的なポリヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んで構成される。
　本発明におけるプローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
　本発明におけるプローブの鎖長は、たとえば１８ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下、好ましくは１８ヌクレオチド以上２６ヌクレオチド以下であってよい。
　本発明におけるプローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（たとえば、125I、131I、3H、14Cなど）、酵素（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、蛍光物質（たとえば、カルボキシフルオレセイン、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネート、Cy3、Cy5、VICなど）、発光物質（たとえば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、クエンチャー（例えば、TAMRA、ブラックホール、IowaBlack、BlackBerry、ZEM、TAO）などで標識されていてもよい。
　本発明におけるプローブは、少なくとも５’末端蛍光物質による標識と３’末端クエンチャーとによる標識とを含むことが好ましい。より具体的には、本発明におけるプローブは、１個の５’末端蛍光物質と１個の３’末端クエンチャー（例えば、TAMRA、ブラックホール、IowaBlack、BlackBerryなど）とで標識された、シングルクエンチャープローブとして構成されてもよいし、１個の５’末端蛍光物質と１個の３’末端クエンチャー（例えば、TAMRA、ブラックホール、IowaBlack、BlackBerryなど）との間に、１個の内部クエンチャー（例えば、ZEM、TAO等）が組み込まれたダブルクエンチャープローブとして構成されてもよい。
［１－５．他の成分］
　本発明の試薬は、上述のプライマーとして挙げた成分、またはプライマーおよびプローブとして挙げた成分に加え、他の成分として、基剤；プライマー及び／又はプローブの安定化等を目的とする添加物；核酸増幅に必要な成分（水、緩衝剤、核酸合成酵素、核酸合成基質等）；並びに標識（当該標識は、プライマー及び／又はプローブが非標識の態様で含まれている場合に含まれ得る）から選ばれる１または複数の成分を含んでよい。他の成分は、上述のプライマー及びプローブのそれぞれとともに配合されて組成物の形態で製剤化されていてもよいし、上述のプライマー、プローブ及び他の成分がそれぞれ個装された形態のキットアイテムをなしていてもよい。
［１－６．使用方法］
　本発明の試薬の具体的な使用方法は、「２．神経芽腫の微小残存病変を評価するための生体試料の分析方法」に記載の通りである。
［２．神経芽腫の微小残存病変を評価するための生体試料の分析方法］
　本発明における６種の遺伝子マーカーは、２種のレファレンス遺伝子の組み合わせで使用されることで、神経芽腫の微小残存病変を正確に評価できる。したがって、本発明の生体試料の分析方法は、６種の遺伝子マーカー及び２種のレファレンス遺伝子の、生体試料中における発現量を、上記「１．神経芽腫の微小残存病変を評価するための試薬」に記載の試薬を用いて核酸増幅法により測定する測定工程と、前記遺伝子マーカーの発現量に基づく評価値が、健常者における定量値を参照して設定されるカットオフ値以上か否かを評価する評価工程とを含み、前記発現量が神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関（正の相関）し、且つ、前記評価工程において、前記評価値が前記カットオフ値以上である場合に、前記生体試料の神経芽腫の微小残存病変を陽性と判定することを特徴とする。
［２－１．測定工程］
　測定工程においては、上記「１．神経芽腫の微小残存病変を評価するための試薬」の「１－１．神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー」で述べた神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー、及び「１－２．レファレンス遺伝子」で述べたレファレンス遺伝子の、生体試料中における発現量を、核酸増幅法により測定する。具体的には、生体試料中に含まれる核酸を鋳型として、上記「１．神経芽腫の微小残存病変を評価するための試薬」の「１－３．プライマーペア」で述べたプライマーペアを用いて核酸増幅を行い、得られた増幅産物の発現量を測定する。
　生体試料は、神経芽腫患者に由来する試料であってよい。生体試料の採取時期については、初発患者の診断（初診）時以降における、神経芽腫の微小残存病変の診断を要する任意の時期から選択される。ここで、全身療法（化学療法）が適応となる神経芽腫患者が初診後にたどり得る経過としては、緩解導入療法、地固め療法、維持療法、無治療経過観察、再発診断、及び救済療法が挙げられる。地固め療法では、大量化学療法、自家末梢血幹細胞移植、外科手術、及び放射線療法がこの順で行われ得る。
　従って、生体試料の具体的な採取時期としては、初発患者の、診断（初診）時、寛解導入療法終了時、地固め療法終了時（大量化学療法終了時、又は、地固め療法を構成する全ての治療終了時）、維持療法終了時、及び無治療経過観察時等、並びに、再発患者の、診断（再発診断）時及び救済療法終了時等が挙げられる。本発明は、これらの採取時期のいずれかの時期のみに適用してもよいし、これらの採取時期のうち複数の時期に適用してもよい。本発明において、生体試料の採取時期の特に好ましい例は、初発患者の地固め療法終了時以降であり、具体的には、地固め療法終了時、及び／又は、地固め療法終了時よりも後、且つ再発診断時よりも前（より具体的には、維持療法終了時及び／又は無治療経過観察時）である。
　また、神経芽腫患者は、再発リスクの高い中間リスク又は高リスク患者であることが好ましい。つまり、本発明の分析方法は、再発リスクの高い中間リスク又は高リスク神経芽腫患者の予後予測に用いられることが好ましく、特に初発の高リスク神経芽腫患者の地固め療法終了時における予後予測に用いられることが好ましい。
　生体試料は、被験者の核酸を含む試料であれば特に限定されず、使用する検出方法の種類に応じて適宜選択することができる。たとえば、生体試料としては、被験者から採取された生体組織、具体的には、骨髄検体または末梢血検体等、好ましくは骨髄検体から常法に従って調製した、ＲＮＡ（例えば、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）の核酸試料が挙げられる。
　核酸増幅法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、通常のＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法等を用いることができる。好ましくは、核酸増幅法としてデジタルＰＣＲ法を用いることができる。神経芽腫の微小残存病変の正確な評価のより好ましい達成は、極めて微量な遺伝子マーカーの発現を検出することによってなされるが、デジタルＰＣＲを用いることは、遺伝子マーカーの発現量が少ない検体であっても感度よく検出することができる点で神経芽腫の微小残存病変の検出に特に適している。それだけでなく、デジタルＰＣＲは、分析主体、分析時期、分析機器、プロトコル（反応時間、反応温度等）等が異なっても測定結果のばらつきが少なく、正確に神経芽腫の微小残存病変を検出することもできる点でも好ましい。したがって、デジタルＰＣＲを用いることは、神経芽腫の微小残存病変の評価において汎用性の高さおよび信頼性の高さ等の点でも好ましい。
　デジタルＰＣＲでは、まず、大きな容量の開始試料が複数のより小さな部分容量の試料（分割試料）に分割される。当該分割試料は、平均で単一コピーの標的を含むように調製される。このように分割試料中に存在するポリヌクレオチド分子が０分子（陰性）または１分子（陽性）となることにより、デジタル性が達成される。分割試料における陽性を計数することにより、開始試料中の標的の開始コピー数を推定することができる。従って、デジタルＰＣＲでは、生体試料中の標的が低い濃度であっても、標的の定量が可能となる。なお、分割試料をデジタル性が達成される適正濃度とするためには、開始試料の複数連続希釈法を用いることができ、その容量は用いるＰＣＲ装置に応じて決定することができる。このようにして、増幅対象（標的）である遺伝子マーカーの発現量を定量することができる。
　デジタルＰＣＲとしては、好ましくは、液滴ベースのデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が挙げられる。ｄｄＰＣＲ法は、具体的には、液滴生成工程、ＰＣＲ増幅工程、検出工程、及び分析工程を含む。液滴生成工程では、核酸増幅に必要な試薬を含む複数の液滴を生成する。ＰＣＲ増幅工程ではそれらの液滴（または当該液滴が入っているより大きな反応体積を有する試料）を標的の増幅に適切な熱サイクリング条件に付す。検出工程では、ＰＣＲ産物を含む液滴（又は当該液滴が入っているより大きな反応体積を有する試料）と含まない液滴（又は当該液滴が入っているより大きな反応体積を有する試料）との特定を行う。分析工程では、標的である遺伝子マーカーの発現量を導出する。
　さらに、測定工程においては、上記「１．神経芽腫の微小残存病変を評価するための試薬」の「１－４．プローブ」で述べたプローブを生体試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を含んでもよい。これにより、増幅産物の検出を標識に基づいて行うことができる。例えば、少なくとも５’末端蛍光物質による標識と３’末端クエンチャーとによる標識とを含むプローブを用いる場合、遺伝子マーカーにプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にポリメラーゼの作用によって５’末端蛍光物質が遊離する。遊離した蛍光物質はクエンチャーの消光作用から開放されることで蛍光を発し、蛍光強度に基づいて遺伝子マーカーの発現量を導出する。
［２－２．評価工程］
　評価工程では、神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーの発現量に基づく評価値が、健常者における定量値を参照して設定されるカットオフ値以上か否かを評価し、前記カットオフ値以上である場合に、前記生体試料の神経芽腫の微小残存病変を陽性と判定する。
［２－２－１．遺伝子マーカーの発現量］
　神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーの発現量の取り扱いについては特に限定されず、疾患遺伝子マーカーを用いて疾患を診断する公知の方法に準じることができる。具体的には、神経芽腫の微小残存病変の６種の遺伝子マーカーそれぞれの発現量（以下において、これらの発現量を、それぞれ、「Ａ１」～「Ａ６」と記載する。）は、ｍＲＮＡへの転写量（つまりコピー数）として定量化することができる。６種の遺伝子マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ６は、絶対コピー数であってもよいし、レファレンス遺伝子のコピー数に対する相対量（つまり、６種の遺伝子マーカーそれぞれのコピー数をレファレンス遺伝子のコピー数で除した値）であってもよい。
　本発明において、より正確な分析を行う観点からは、６種の遺伝子マーカーそれぞれの発現量Ａ１～Ａ６は、レファレンス遺伝子の発現量に対する６種の遺伝子マーカーそれぞれの発現量の相対量であることが好ましい。更に分析値の取扱いを容易にする観点から、当該相対量は、６種の遺伝子マーカーそれぞれのコピー数をレファレンス遺伝子のコピー数で除し且つ１０，０００を乗じて得た値であることが好ましい。
　なお、レファレンス遺伝子の発現量（コピー数）としては、２種のレファレンス遺伝子の発現量の平均値を用いることができる。当該平均値としては、算術平均値（つまり２種のレファレンス遺伝子の発現量の相加平均値）及び幾何平均値（つまり２種のレファレンス遺伝子の発現量数の相乗平均値）が挙げられるが、本発明においては幾何平均値を用いることがより好ましい。
［２－２－２．発現量に基づく評価値］
　発現量に基づく評価値の求め方についても特に限定されず、神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーパネル及びレファレンス遺伝子を用いて神経芽腫の微小残存病変の発生を評価する公知の方法に準じることができる。
　例えば、発現量に基づく評価値としては、６種の遺伝子マーカーについて得られる上記「２－２－１．発現量」で述べた発現量の、総和又は平均値（より具体的には算術平均値又は幾何平均値）であってもよいし、６種の遺伝子マーカーについて得られる上記「２－２－１．発現量」で述べた発現量を公知の方法で補正した値の、総和又は平均値（より具体的には算術平均値又は幾何平均値）であってもよい。
　本発明においては、発現量に基づく評価値として、６種の遺伝子マーカーについて得られる上記「２－２－１．発現量」で述べた発現量を以下の方法で補正した値（以下の重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６）の、総和又は平均値（より具体的には算術平均値又は幾何平均値）であることが好ましい。以下、この場合の発現量に基づく評価値について詳述する。
（重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６）
　６種の遺伝子マーカーは、健常コントロール（以下、単に「コントロール」と記載する。）における発現態様がそれぞれに異なる。具体的には、コントロール（ｎ＞１００）における６種の遺伝子マーカーの発現量（上記「２－２－１．遺伝子マーカーの発現量」と同様にして得られる発現量であり、好ましくはデジタルＰＣＲに基づいて得られる発現量である。）の統計において、発現量を小さい方からで並べて１００等分すると、遺伝子マーカーが初めて検出されるパーセンタイル及び遺伝子マーカーの発現量が、それぞれのマーカーで様々に異なる。例えば、６種の遺伝子マーカーのうちＣＲＭＰ１とＤＢＨとを挙げると、ＣＲＭＰ１は比較的低いパーセンタイル（例えば６パーセンタイル程度）から検出される一方でＤＢＨは比較的高いパーセンタイル（例えば５２パーセンタイル程度）から検出され、より高いパーセンタイル（例えば９０パーセンタイル程度）における発現量を比較するとＤＢＨよりＣＲＭＰ１の方ではるかに発現量が高い。
　つまり、上記のコントロールにおける６種の遺伝子マーカー各々の発現量の統計に鑑みると、６種の遺伝子マーカーはそれぞれに重みつまり重要度が異なっている（さらに言い換えると非重要度が異なっている）といえる。例えば、ＣＲＭＰ１とＤＢＨとを比較すると、コントロールにおいて比較的検出されやすく検出量も比較的大きいＣＲＭＰ１の方で重要度がより低い（つまり非重要度がより高い）といえる。このような重要度の違い（つまり非重要度の違い）は、６種の遺伝子マーカーそれぞれの間で存在する。
　このため、本発明においては、神経芽腫の微小残存病変における分析の感度及び特異度を総合的に向上させる観点から、発現量の補正の方法として、上記「２－２－１．遺伝子マーカーの発現量」で述べた６種の遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６の各々に対し、コントロールにおける前記６種の遺伝子マーカー各々の発現量の統計学的数値（以下において、６種の遺伝子マーカー各々に対応するこれらの統計学的数値を、それぞれ、「Ｂ１」～「Ｂ６」と記載する。）を加味した重み付けを行うことが好ましい。このような重み付けを行うことで、６種の遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６が、それらの非重要度を意味する数値である統計学的数値Ｂ１～Ｂ６それぞれにより補正され、重み付き発現量（以下において、発現量Ａ１～Ａ６各々に対応するこれらの重み付き発現量を、「ＡＢ１」～「ＡＢ６」と記載する。）が得られる。（この重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の幾何平均又は総和を、発現量に基づく評価値として得ることができる。）
　なお、コントロールにおける遺伝子マーカー各々の発現量の統計学的数値を加味した重み付けを行う方法の詳細は、特許文献２（国際公開第２０２１／００６３４５号）で述べられている通りであり、本発明において当該統計学的数値Ｂ１～Ｂ６の具体例及び重み付けの方法は、当該公報の記載に準じる。
　つまり、当該統計学的数値Ｂ１～Ｂ６としては、固定パーセンタイル（つまり、コントロールにおいて６種の遺伝子マーカー全てが検出されるパーセンタイルのうちのいずれかであって、６種の遺伝子マーカー全てに対して共通して採用される１個の特定のパーセンタイル）における発現量、又は可変パーセンタイル（つまり、コントロールにおける６種の遺伝子マーカー各々の発現量において、神経芽腫の微小残存病変の有無に関するカットオフ値に最も近い発現量を示すパーセンタイルであって、６種の遺伝子マーカー各々に対応するよう設定されるパーセンタイル）における発現量を用いることができる。
　また、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６を得る重み付けの方法としては、除法により重み付けを行う方法と、減法により重み付けを行う方法とが挙げられる。
（除法による重み付け）
　除法により重み付けを行う場合、具体的には、発現量Ａ１～Ａ６各々を統計学的数値Ｂ１～Ｂ６で除して、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６を得る。例えば、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１／Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は｛Ａ２／Ｂ２｝、・・・、重み付き発現量ＡＢ６は｛Ａ６／Ｂ６｝として得られる。統計学的数値Ｂ１～Ｂ６は、いずれも０でないことを条件として、上記のパーセンタイルにおける発現量及び可変パーセンタイルにおける発現量のいずれも用いることができる。
（減法による重み付け）
　減法により重み付けを行う場合、具体的には、発現量Ａ１～Ａ６各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ６を差し引いて、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６を得る。例えば、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１－Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は｛Ａ２－Ｂ２｝、・・・、重み付き発現量ＡＢ６は｛Ａ６－Ｂ６｝として得られる。統計学的数値Ｂ１～Ｂ６としては、固定パーセンタイルにおける発現量及び可変パーセンタイルにおける発現量のいずれも用いることができる。
　発現量に基づく評価値を、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の幾何平均として得る場合については、発現量Ａ１～Ａ６各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ６を差し引いた結果１未満となるものがある場合、その重み付き発現量は１とする。例えば、｛Ａ１－Ｂ１｝＞１、｛Ａ２－Ｂ２｝＜１、・・・、｛Ａ６－Ｂ６｝＞１である場合、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１－Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は１、・・・重み付き発現量ＡＢ６は｛Ａ６－Ｂ６｝となる。また、発現量に基づく評価値を、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の総和として得る場合については、発現量Ａ１～Ａ６各々から統計学的数値Ｂ１～Ｂ６を差し引いた結果負の数値となるものがある場合、その重み付き発現量は０とする。例えば、｛Ａ１－Ｂ１｝＞０、｛Ａ２－Ｂ２｝＜０、・・・、｛Ａ６－Ｂ６｝＞０である場合、重み付き発現量ＡＢ１は｛Ａ１－Ｂ１｝、重み付き発現量ＡＢ２は０、・・・重み付き発現量ＡＢ６は｛Ａ６－Ｂ６｝となる。
（発現量に基づく評価値）
　発現量に基づく評価値が、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の幾何平均である場合、減法により重み付けを行った場合の当該評価値は、｛Π［ｉ＝１→６］（Ａｉ－Ｂｉ）｝1/6（但し、Ａｉ－Ｂｉ＜１の場合、Ａｉ－Ｂｉ＝１とする。）で表される。
　発現量に基づく評価値が、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の総和である場合、減法により重み付けを行った場合の当該評価値は、Σ［ｋ＝１→６］（Ａｋ－Ｂｋ）（但し、Ａｋ－Ｂｋ＜０の場合、Ａｋ－Ｂｋ＝０とする。）で表され、また、除法により重み付けを行った場合の当該評価値は、Σ［ｋ＝１→６］（Ａｋ／Ｂｋ）で表される。
　本発明においては、発現量に基づく評価値として、発現量Ａ１～Ａ６各々を統計学的数値Ｂ１～Ｂ６で除することで重み付けして得られる重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の総和、つまりΣ［ｋ＝１→６］（Ａｋ／Ｂｋ）であることが特に好ましい。
［２－２－３．カットオフ値］
　遺伝子マーカーの発現量のカットオフ値は、上述の手法により予め測定することで経験的に収集した評価値を参照し、公知の統計手法により設定することができる。カットオフ値の具体的な設定手法としては、たとえば、｛対照細胞における遺伝子マーカーの発現量の平均値±ｎ×標準偏差｝として導出する方法、ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic)分析法などが挙げられ、好ましくはＲＯＣ分析法が挙げられる。
　以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。以下の実施例では、神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーとして、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１（配列番号１）、ＣＨＲＮＡ３（配列番号２）、ＣＲＭＰ１（配列番号３）、ＤＢＨ（配列番号４）、ＰＨＯＸ２Ｂ（配列番号５）、及びＴＨ（配列番号６）を用い、レファレンス遺伝子として、ＨＰＲＴ１（配列番号７）及びＨＭＢＳ（配列番号８）を用いた。
［試験例１］神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子の決定
［１］レファレンス遺伝子の決定
　レファレンス遺伝子の候補として、ＧＵＳＢ、ＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、ＴＢＰを選択した。このうち、レファレンス遺伝子として上手く働かないＧＵＳＢを除外した。残りの３種のレファレンス遺伝子について、コントロール骨髄１０検体及びコントロール末梢血１０検体における発現量を測定し、いずれの検体でも発現量の変化が少なく安定的な発現を示したＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳを、レファレンス遺伝子として決定した。
［２］神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーの決定
　神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーの一次候補として、非特許文献１、特許文献１及び特許文献２で用いられた７種の遺伝子マーカー（ＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＨ）と、２種の間葉系マーカー（ＰＯＳＴＮ、ＰＲＲＸ１）と、１種のＧＤ２合成酵素マーカー（Ｂ４ＧＡＬＮＴ１）と、非特許文献２で用いられた遺伝子マーカーのうちの１種（ＣＨＧＡ）、その他既報の遺伝子マーカーの内の９種（ＣＣＮＤ１、ＣＨＧＢ、ＣＨＲＮＡ３、ＧＡＢＲＢ３、ＫＩＦ１Ａ、ＳＮＡＰ９１、ＳＴ８ＳＩＡ２、ＳＴＭＮ２、ＵＣＨＬ１）からなる２０種のマーカーを選択した。
　スクリーニング用サンプルとして、Ｐａｒｅｎｔａｌ　ＮＢ細胞株（ＢＥ（２）－Ｃ、ＳＹ－５Ｙ、ＮＢ６９、ＩＭＲ３２）４検体、Ｓｐｈｅｒｅ　ＮＢ細胞株（ＢＥ（２）－Ｃ、ＳＹ－５Ｙ、ＮＢ６９、ＩＭＲ３２）４検体、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）４検体、臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）４検体、コントロール骨髄１０検体、及びコントロール末梢血１０検体を選択した。
　スクリーニング用サンプルにおける発現量を測定し、コントロール骨髄における発現量の多い遺伝子、コントロール末梢血における発現量の多い遺伝子、Ｓｐｈｅｒｅ　ＮＢ細胞株における発現量の少ない遺伝子を絞り込んだ。なお、神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーの発現量は、レファレンス遺伝子の発現量に対する遺伝子マーカーの発現量の相対量として導出した。さらに、レファレンス遺伝子の発現量としては、［１］で決定した２つのレファレンスの発現量の幾何平均値を用いた（以下においても同様）。その結果、ＣＣＮＤ１、ＵＣＨＬ１、ＣＨＧＢ、ＳＴＭＮ２、ＳＮＡＰ９１、ＳＴ８ＳＩＡ２を除外し、それ以外の１４種の遺伝子マーカーを二次候補として選択した。
　地固め療法終了時に採取した骨髄１６検体コホート（再発９検体及び非再発７検体からなる。１患者１検体。）における二次候補の１４種の遺伝子マーカーの発現量を測定し、当該１４種の遺伝子マーカーから１～６個の任意の数の遺伝子を選ぶ全ての組み合わせ（６４７５通り）から、ＡＵＣ（点推定値）＞０．８且つＡＵＣの下限値（信頼区間下限値）＞０．７となるマーカーの組み合わせ（８３通り）を選出し、そこから、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１を含み且つＧＡＰ４３を含まないマーカーの組み合わせ（７０通り）を選出し、そこから、ＤＢＨ及びＰＨＯＸ２Ｂ／ＴＨを含むマーカーの組み合わせ、且つ、特異度＞８０％、感度＞５０％となるカットオフを設定可能なマーカーの組み合わせ（４３通り）を選出した。
　４３通りの遺伝子マーカー候補（ＮＢ－ｍＲＮＡｓ）の組み合わせについて、地固め療法終了時よりも後、再発診断時より前（具体的には、維持療法終了時及び無治療経過観察時等）に採取した骨髄５７検体コホート（再発７検体及び非再発５０検体からなる。１患者複数検体。）における神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー候補の発現量を測定し、正確性の高い診断が可能な以下の３通りの組み合わせを選出した。
　結果、最も正確性の高い診断が可能なＢ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨの６種からなる遺伝子マーカーの組み合わせを選出した。
［試験例２］６種の遺伝子マーカーの臨床性能
［１］プライマー及びプローブの設計
　６種の遺伝子マーカー及び２種のレファレンス遺伝子それぞれについて、以下に示すプライマー及びプローブ（ダブルクエンチャープローブ）を設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［２］遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６のデジタルＰＣＲ測定
１）抗凝固剤（EDTAまたはヘパリン）を含む検体（骨髄検体又は末梢血検体）2 ml～5 mlから、モノ・ポリ分離溶液（DSファーマバイオメディカル社製）を用いて有核細胞を遠心分離した。
２）得られた有核細胞から、TRIZOL PLUS RNA Purification kit（ライフテクノロジー社製）を用いてtotal RNAを抽出し、使用するまで－８０℃で保存した。
３）Nanodrop 2000分光光度計（ThermoFisher Scientific社）によってRNA濃度を測定し、Total RNAの品質について、2100 Bioanalyzer（アジレントテクノロジー社製）を用いてその完全性を評価した。
４）品質を評価したtotal RNA 1.0 μgからQuantiTect Reverse Transcription kit（キアジェン社製）を用いてcDNAを合成し、total 80μlとなるようにTE bufferで希釈した。
５）QX200 Droplet Digital PCR System（バイオラッド社製）を用いて、６種の遺伝子マーカー全てを１回の操作で同時にddPCR（デジタルＰＣＲ）反応に供し、それぞれの遺伝子マーカーの発現量の解析を行った。
　　鋳型cDNA 1.0 μl(total RNA 12.5 ng相当)、2 x ddPCR Supermix for Probes（バイオラッド）10μl、Sense primer(x 20、IDT社製) 1.0 μl、Antisense primer(x 20、IDT社製) 1.0 μl、Probe(x 20、IDT社製) 1.0 μlを含む全量20 μlの反応液を調製した。
　　QX200 Droplet Generator (バイオラッド社製)を用いて反応液のドロップレットを作製し、各cDNAをC1000 Touch Thermal Cycler（バイオラッド社製）で増幅した。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間の予備サイクル、９４℃で３０秒及び５６℃１分３０秒を１サイクルとして４０サイクル、及び９８℃で１０分間のポストサイクリングであった。温度上昇速度は２℃／秒であった。
　　ddPCR増幅後、液滴をQX200 Droplet Reader(バイオラッド社製)で測定し、標的コピー数をQuantaSoft（バージョン1.6.6、バイオラッド社製）によって分析した。非テンプレート対照（ＮＴＣ）反応を用い、陽性および陰性液滴集団のカットオフ値を手動で設定した。全ＲＮＡの量およびｃＤＮＡ合成効率の違いを補正するために、標的コピー数を、レファレンス遺伝子ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳを用いて標準化した（下記項目６）参照）。
　　なお、再現性のあるddPCR反応を確実にするために、１滴あたり最低０．０４５コピーのＨＰＲＴ１　ｍＲＮＡが得られたｃＤＮＡのみを選択し、選択したｃＤＮＡをさらに２～８倍希釈して１滴あたり最大０．４５コピーとなるように調整した。結果として、ddPCR反応は、神経芽腫患者およびコントロールからのすべての試料について２～３回繰り返された。この研究は、デジタルMIQEガイドラインに従って実施された。
６）サンプルの各遺伝子マーカーの発現量として、遺伝子マーカーのコピー数(copies per well)とレファレンス遺伝子のコピー数(copies per well)とから以下の式によりコピー数(Copies per sample)を算出した。なお、以下の式において、レファレンス遺伝子のコピー数は、ＨＰＲＴ１のコピー数及びＨＭＢＳのコピー数の幾何平均である。つまり、サンプルの各遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６を、レファレンス遺伝子に対する相対発現量（相対コピー数；relative copy number）として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
［３］発現量に基づく評価値
　発現量に基づく評価値として、発現量Ａ１～Ａ６各々を統計学的数値Ｂ１～Ｂ６で除することで重み付けして得られる重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の総和、つまりΣ［ｋ＝１→６］（Ａｋ／Ｂｋ）を用いた。統計学的数値Ｂ１～Ｂ６としては、骨髄検体における発現量Ａ１～Ａ６に重み付けする場合は、コントロール骨髄１０１検体において上記［２］の方法でデジタルＰＣＲ測定された発現量を小さい方から並べて１００等分したうちの、９０パーセンタイルにおける発現量を用い、末梢血検体における発現量Ａ１～Ａ６に重み付けする場合は、コントロール末梢血１０５検体において上記［２］の方法でデジタルＰＣＲ測定された発現量を小さい方からで並べて１００等分したうちの、９０パーセンタイルにおける発現量を用いた。
［４］骨髄検体の分析（実施例１）
　地固め療法終了時に採取した骨髄１６検体コホート（再発９検体及び非再発７検体からなる。１患者１検体。）に対して、上記［１］のプリマー及びプローブを用いて６種の遺伝子マーカーの発現量を上記［２］の方法で測定し、上記［３］の評価値を導出した。カットオフ値は３．５とし、６種の遺伝子マーカーの臨床性能を試験した。その結果、ＡＵＣは０．９３７（９５％ＣＩは０．８２１－１．０００）であった。さらに、カプラン・マイヤープロットによる３年イベントフリー生存率（ＥＦＳ）は、ＭＲＤ≧３．５が０％、ＭＲＤ＜３．５が６３．６％（ｐ＝０．００６１５）であり、３年全生存率（ＯＳ）は、ＭＲＤ≧３．５が２６．７％、ＭＲＤ＜３．５が９０．０％（ｐ＝０．０００４０９）であった。
［５］末梢血検体の分析（実施例２）
　地固め療法終了時に採取した骨髄５検体コホート（再発３検体及び非再発２検体からなる。１患者１検体。）に対して、上記［１］のプリマー及びプローブを用いて６種の遺伝子マーカーの発現量を上記［２］の方法で測定し、上記［３］の評価値を導出した。カットオフ値は１．５とし、６種の遺伝子マーカーの臨床性能を試験した。その結果、ＡＵＣは０．８３３（９５％ＣＩは０．３７１－１．０００）であった。
［試験例３］
　試験例２の［４］に示す実施例１で用いた、地固め療法終了時に採取した骨髄１６検体コホート（再発９検体及び非再発７検体からなる。１患者１検体。）に対して、遺伝子マーカーの組み合わせを表３に示すものに変更したことを除いて、同様にＡＵＣを導出した。なお、表３に示す比較例１～９で用いた遺伝子マーカーの組み合わせは、既報（非特許文献１，９，７，２，５，４，６，３）において報告された遺伝子マーカーの組み合わせ、又は、当該組み合わせから試験例１の［２］で選出された二次候補に係る１４種の遺伝子マーカーに含まれていないもの（具体的には、二次候補への絞り込み時に性能を悪くすると判断した、ＣＣＮＤ１、ＤＣＸ、及びＥＬＡＶ４）を除いた組み合わせである。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３に示す通り、比較例１～９の遺伝子マーカーの組み合わせによるＡＵＣは、０．５８７～０．７８６の範囲にとどまり、その優劣は、組み合わせを構成するマーカー数とは無関係であった。一方で、本発明の６種の遺伝子マーカーの組み合わせによるＡＵＣは、０．９３７と飛躍的に向上し、その向上の程度も、当該技術水準から期待できる程度をはるかに超えるほどに顕著であった。
［配列表フリーテキスト］
　配列番号９～２４はプライマーであり、配列番号２５～３２はプローブである。

Claims (8)

  1. 　Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーと、ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳからなるレファレンス遺伝子と、を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬。
  2. 　地固め療法終了時以降における神経芽腫患者から採取した生体試料に対して用いられる、請求項１に記載の試薬。
  3. 　骨髄検体に対して用いられる、請求項１に記載の試薬。
  4. 　前記遺伝子マーカー及び前記レファレンス遺伝子それぞれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含む、請求項１に記載の試薬。
  5. 　Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー、並びにＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳからなるレファレンス遺伝子の、生体試料中における発現量を、請求項１に記載の試薬を用いて核酸増幅法により測定する測定工程と、
    　前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６に基づく評価値が、健常者における定量値を参照して設定されるカットオフ値以上か否かを評価する評価工程とを含み、
    　前記発現量が神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関し、
    　前記評価工程において、前記評価値が前記カットオフ値以上である場合に、前記生体試料の神経芽腫の微小残存病変を陽性と判定する、生体試料の分析方法。
  6. 　前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６に基づく評価値が、前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６の各々に対し、コントロールにおける前記遺伝子マーカー各々の発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ６を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６を取得し、さらに、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の幾何平均又は総和をとることにより導出される、請求項５に記載の分析方法。
  7. 　前記測定工程における前記核酸増幅法がデジタルＰＣＲである、請求項５に記載の生体試料の分析方法。
  8. 　前記測定工程において、同一の核酸増幅装置を用いて前記遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子を同時に核酸増幅する、請求項５に記載の生体試料の分析方法。
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