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WO2024157925A1 - リボソーマルｒｎａ由来の逆転写の抑制 - Google Patents

リボソーマルｒｎａ由来の逆転写の抑制 Download PDF

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WO2024157925A1
WO2024157925A1 PCT/JP2024/001631 JP2024001631W WO2024157925A1 WO 2024157925 A1 WO2024157925 A1 WO 2024157925A1 JP 2024001631 W JP2024001631 W JP 2024001631W WO 2024157925 A1 WO2024157925 A1 WO 2024157925A1
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WO
WIPO (PCT)
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reverse transcription
rna
polymer
dna
group
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2024/001631
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English (en)
French (fr)
Inventor
貴成 武田
哲太郎 林
愛 二階堂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyobo Co Ltd
RIKEN
Original Assignee
Toyobo Co Ltd
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyobo Co Ltd, RIKEN filed Critical Toyobo Co Ltd
Priority to JP2024573040A priority Critical patent/JPWO2024157925A1/ja
Priority to CN202480008982.0A priority patent/CN120584195A/zh
Priority to EP24747253.3A priority patent/EP4656735A1/en
Publication of WO2024157925A1 publication Critical patent/WO2024157925A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to the production and amplification of nucleic acids by suppressing reverse transcription from ribosomal RNA.
  • the present invention relates to compositions and methods useful for the production and amplification of nucleic acids from ribonucleic acid (RNA) templates, specifically, compositions and methods for producing and amplifying nucleic acids by reverse transcription reactions using specific polymers.
  • the compositions and methods of the present invention are used, for example, for suppressing reverse transcription of ribosomal RNA, i.e., for suppressing DNA synthesis from ribosomal RNA.
  • Ribosomal RNA is said to account for approximately 80 to 90 percent of RNA in living organisms.
  • this reverse transcription reaction if ribosomal RNA, which accounts for the majority of RNA in living organisms, is reverse transcribed and amplified, noise will be generated in the expression analysis of the RNA that is originally intended to be reverse transcribed and amplified.
  • new technologies such as the RT-RamDA method, which can obtain a large amount of nucleic acid amplification product using RNA as a template, have been developed (see Patent Document 1).
  • RNA as a template In the RT-RamDA method and other methods that can obtain a large amount of nucleic acid amplification product using RNA as a template, once the reverse transcription reaction of ribosomal RNA occurs, it undergoes isothermal linear amplification by strand displacement reaction, which relatively reduces the amount of RNA to be analyzed, which has a large impact. For this reason, it is desirable to suppress DNA synthesis derived from ribosomal RNA in nucleic acid analysis methods that involve reverse transcription reaction.
  • Patent Document 2 a method for suppressing reverse transcription of ribosomal RNA in a reverse transcription reaction from a template RNA using a specific nucleic acid polymer.
  • Patent Document 2 the development of a more useful method for suppressing reverse transcription from ribosomal RNA is desired.
  • One objective is to provide a means for inhibiting reverse transcription of ribosomal RNA.
  • Item 1 A method for synthesizing DNA by reverse transcription of a template RNA, comprising the steps of: suppressing DNA synthesis derived from ribosomal RNA by making a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of a sulfate group, a sulfone group, and salt-type groups thereof present in a reverse transcription reaction solution at a concentration of 10 pg/ ⁇ L or more.
  • Item 2. The method according to item 1, wherein the polymer comprises at least one selected from the group consisting of sulfated glycosaminoglycan, polyvinyl sulfonic acid, and salts thereof.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the concentration of the polymer in a reverse transcription reaction solution is 10 pg/ ⁇ L or more and 1 ⁇ g/ ⁇ L or less.
  • Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the reverse transcription is carried out using a random primer.
  • Item 6. Item 6. The method according to Item 5, wherein the base sequence of the random primer is not completely complementary to the base sequence of the ribosomal RNA.
  • Item 7. Item 7.
  • a composition for inhibiting reverse transcription of ribosomal RNA comprising a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of a sulfate group, a sulfone group, and a salt type group thereof, and used in an amount such that the concentration of the polymer in a reverse transcription reaction solution is 10 pg/ ⁇ L or more.
  • a reverse transcription reaction composition for preparing a reverse transcription reaction product for next-generation sequencing comprising 10 pg/ ⁇ L or more of a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of a sulfate group, a sulfone group, and a salt-type group thereof.
  • Item 11. The composition according to item 9 or 10, wherein the reverse transcription is carried out by an RT-PCR method or an RT-RamDA method.
  • the present invention makes it possible to inhibit reverse transcription of ribosomal RNA or inhibit DNA synthesis derived from ribosomal RNA.
  • rRNA ribosomal RNA
  • reverse transcription from abundant rRNA can be inhibited by allowing a template RNA, a reverse transcriptase, and a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of sulfate, sulfone, and salt-type groups thereof to coexist during reverse transcription reaction.
  • a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of sulfate, sulfone, and salt-type groups thereof competitively inhibits the binding between a primer and rRNA, and inhibits reverse transcription of abundant rRNA by reverse transcriptase due at least in part to this property.
  • the polymer having at least one functional group selected from the group consisting of sulfate group, sulfone group (sometimes referred to as "sulfonic acid group”), and salt type groups thereof is not particularly limited as long as it is a polymer having a side chain of the functional group in the basic skeleton.
  • salt type groups of sulfate group/sulfone group include -O-SO 3 - M + /-SO 3 - M + (M + is an alkali metal ion such as sodium ion or potassium ion, or NR 4 + , each R is independently H or a hydrocarbon group which may be optionally substituted, and two or three R may form a ring together with the adjacent N).
  • the polymer having sulfate group/sulfonate group also includes a polymer in which -O-SO 3 - /-SO 3 - in the side chain is crosslinked by a polyvalent cation (for example, an alkaline earth metal ion such as calcium ion).
  • a polyvalent cation for example, an alkaline earth metal ion such as calcium ion.
  • the polymer having at least one functional group selected from the group consisting of sulfate groups, sulfone groups, and salt groups thereof preferably includes at least one selected from polymers having sulfate groups and/or salt groups thereof, and polymers having sulfone groups and/or salt groups thereof, and more preferably includes at least one selected from sulfated glycosaminoglycans, polyvinyl sulfonic acid, and derivatives thereof, and salts thereof. These may be synthesized, extracted from natural products, or commercially available.
  • the sulfated glycosaminoglycan is not particularly limited, and any type can be used.
  • the glycosaminoglycan is preferably a polysaccharide having a repeating unit of a disaccharide of an amino sugar and uronic acid or galactose.
  • the amino sugar include glucosamine and galactosamine.
  • the amino sugar may be an N-acetylated product.
  • Examples of the uronic acid include glucuronic acid, iduronic acid, and galacturonic acid.
  • the sulfated glycosaminoglycan is preferably a glycosaminoglycan having one, two, three, or four sulfate groups per disaccharide repeating unit.
  • the sulfate group is preferably substituted for a hydroxy group and/or an amino group on the amino sugar and/or the uronic acid or galactose.
  • examples of the sulfated glycosaminoglycan include those shown in the table below.
  • a sulfated glycosaminoglycan and/or a salt thereof can form a proteoglycan by binding to a protein.
  • a glycosaminoglycan having a sulfate group and/or a salt thereof may have a structure similar to that of a proteoglycan.
  • the sulfated glycosaminoglycan and/or its salt preferably contains at least one selected from the group consisting of heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, and derivatives thereof, and salts thereof, more preferably contains at least one selected from heparin, chondroitin sulfate, and derivatives thereof, and salts thereof, and even more preferably contains at least one selected from heparin, chondroitin sulfate C, and derivatives thereof, and salts thereof.
  • Polyvinyl sulfonic acid is not particularly limited as long as it is a polymer containing vinyl sulfonic acid (also called ethylene sulfonic acid) as a structural unit, and any type can be used.
  • Polyvinyl sulfonic acid may be a homopolymer of vinyl sulfonic acid or a copolymer containing structural units other than vinyl sulfonic acid (for example, structural units such as (meth)acrylic acid, (meth)acrylic acid ester, (meth)acrylic acid amide, (meth)acrylonitrile), but is preferably a polymer containing 50 mol% or more of vinyl sulfonic acid structural units, more preferably a polymer containing 70 mol% or more of vinyl sulfonic acid structural units, even more preferably a polymer containing 90 mol% or more of vinyl sulfonic acid structural units, and even more preferably a homopolymer of vinyl sulfonic acid.
  • derivative refers to a polymer that retains the basic skeleton of the original polymer but has a partially modified structure. Modifications include, for example, oxidation, reduction, atom substitution, and introduction of functional groups.
  • the above-mentioned “salt” is not particularly limited, but is preferably an amine salt, an alkali metal salt, an alkaline earth metal salt, etc.
  • the amine salt includes a salt having a cation represented by NR 4 + (each R is independently H or a hydrocarbon group which may be optionally substituted, and two or three R may form a ring together with the adjacent N), and examples of such salts include ammonium salt, monomethylammonium salt, monoethylammonium salt, dimethylammonium salt, diethylammonium salt, trimethylammonium salt, triethylammonium salt, tetramethylammonium salt, pyridinium salt, etc.
  • the above-mentioned "salt” is more preferably an ammonium salt, sodium salt, potassium salt, calcium salt, etc.
  • the salt may also be a hydrate salt.
  • the weight average molecular weight of the polymer having at least one functional group selected from the group consisting of sulfate groups, sulfone groups, and salt-type groups thereof is not particularly limited, but is, for example, 5,000 or more, preferably 10,000 or more, and more preferably 20,000, and may be 50,000 or more or 100,000 or more.
  • the upper limit of the weight average molecular weight of the polymer is not limited as long as the effects of the present invention are achieved, but is, for example, 5,000,000 or less, preferably 1,000,000 or less, and may be 500,000 or less.
  • the weight average molecular weight can be measured by a conventional method using gel permeation chromatography (GPC) and calculated as the pullulan equivalent weight average molecular weight from a calibration curve prepared in advance using standard pullulan (see, for example, U.S. Patent Application Publication No. 2020/190266, the entirety of which is incorporated herein by reference).
  • GPC gel permeation chromatography
  • the number of repetitions (or the average) of the disaccharide structural unit of an amino sugar and uronic acid or galactose in a sulfated glycosaminoglycan, or the number of repetitions (or the average) of the structural unit of vinyl sulfonic acid (or ethylene sulfonic acid) contained in polyvinyl sulfonic acid is not particularly limited, but may be, for example, 20 or more, preferably 30 or more, more preferably 40 or more, and even more preferably 50 or more, and may be, for example, 100 or more, 150 or more.
  • the number of repetitions (or the average) of the structural units may be, for example, 5,000 or less, 4,000 or less, 3,000 or less, 1,000 or less, or 500 or less.
  • the repetitions may be continuous or discontinuous, and are preferably continuous.
  • the method for synthesizing DNA by reverse transcription of template RNA is not particularly limited, and various conventionally known methods can be adopted.
  • the method typically includes a step of incubating a reverse transcription reaction composition (or a reverse transcription reaction solution) containing a protein having reverse transcription activity such as a reverse transcriptase.
  • the reverse transcription reaction composition contains, for example, a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of a sulfate group, a sulfone group, and a salt group thereof, a template RNA, a primer, deoxyribonucleotides, and a reverse transcriptase.
  • the reverse transcription reaction composition may also contain other components such as a DNA polymerase, as desired.
  • the concentration of the polymer may be, for example, 10 pg/ ⁇ L or more, preferably 15 pg/ ⁇ L, 20 pg/ ⁇ L, 50 pg/ ⁇ L or more, 100 pg/ ⁇ L or more, 1 ng/ ⁇ L or more, or 10 ng/ ⁇ L or more, from the viewpoint of suppressing reverse transcription of rRNA and suppressing DNA synthesis derived from rRNA.
  • the concentration of the polymer may be, for example, 1 ⁇ g/ ⁇ L or less, preferably 100 ng/ ⁇ L or less, more preferably 20 ng/ ⁇ L or less, from the viewpoint of not excessively suppressing DNA synthesis derived from target RNA other than rRNA, and may be, for example, 10 ng/ ⁇ L or less, 5 ng/ ⁇ L or less, 3 ng/ ⁇ L or less, 2.5 ng/ ⁇ L or less, 2 ng/ ⁇ L or less, 1 ng/ ⁇ L or less, or less than 1 ng/ ⁇ L.
  • the concentration of the polymer in the reverse transcription reaction solution is preferably adjusted to be relatively low, and may be, for example, 2 ng/ ⁇ L or less, preferably 1 ng/ ⁇ L or less, 500 pg/ ⁇ L or less, 200 pg/ ⁇ L or less, 100 pg/ ⁇ L or less, or 50 pg/ ⁇ L or less.
  • the concentration of the polymer in the reverse transcription reaction solution is not particularly limited, but it is preferably adjusted to, for example, 10 pg/ ⁇ L or 15 pg/ ⁇ L or more.
  • the concentration of the polymer in the reverse transcription reaction solution is preferably adjusted to be relatively high, and may be, for example, 100 pg/ ⁇ L or more, preferably 200 pg/ ⁇ L or more or 500 pg/ ⁇ L or more, more preferably 1 ng/ ⁇ L or more, 2 ng/ ⁇ L or more, or 10 ng/ ⁇ L or more.
  • the upper limit of the concentration of the polymer in the reverse transcription reaction solution is not particularly limited, but it is preferably adjusted to be, for example, 100 ng/ ⁇ L or less
  • the template RNA may be any RNA, such as RNA extracted from tissues or cells, or RNA that has been further purified after extraction from tissues or cells (e.g., purified RNA that has been treated by any purification means known in the art, such as ethanol precipitation or column purification), but it is preferable to use RNA extracted from cells.
  • RNA extracted from cells is usually inevitably contaminated with rRNA in addition to the mRNA that serves as the template RNA, but since reverse transcription of rRNA is suppressed in the presence of a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of sulfate groups, sulfone groups, and salt groups thereof, the template RNA can be specifically reverse transcribed even if the RNA extracted from cells is used as the template RNA as it is. In other words, the step of removing rRNA from the RNA extracted from cells can be omitted.
  • the type of cells from which RNA is extracted is not particularly limited, and any type of cells may be used. The number of cells can be appropriately adjusted using a cell sorter.
  • RNA extracted from a small number of cells can also be used.
  • Methods for extracting RNA from cells typically include a step of lysing the cells using a cell lysis composition that contains a cell lysis agent.
  • cell lysing agents include surfactants and chaotropic agents.
  • Surfactants include anionic surfactants (e.g., sodium dodecyl sulfate, sodium cholate, sodium deoxycholate), cationic surfactants (e.g., cetyltrimethylammonium bromide), nonionic surfactants (e.g., octylphenol ethoxylate, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate), and zwitterionic surfactants (e.g., 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid).
  • anionic surfactants e.g., sodium dodecyl sulfate, sodium cholate, sodium deoxycholate
  • cationic surfactants e.g., cetyltrimethylammonium bromide
  • nonionic surfactants e.g., octylphenol ethoxylate, polyoxyethylene la
  • Cell lysing agents are usually dissolved in water (preferably nuclease-free water) and used in the form of an aqueous solution.
  • the cell lysis composition may include a protease (eg, protease K), an RNase inhibitor, or a combination of two or more thereof.
  • the cell lysis composition may or may not contain a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of a sulfate group, a sulfone group, and a salt type group thereof.
  • RNA extracted from cells using a cell lysis composition containing the polymer is used as template RNA, the polymer does not need to be added separately to the reverse transcription reaction composition. Details of the cell lysis composition are described in, for example, U.S.
  • RNA including rRNA
  • concentration of RNA is, for example, 1 to 10,000 pg/ ⁇ L, preferably 10 to 1,000 pg/ ⁇ L, and more preferably 1 to 100 pg/ ⁇ L.
  • the primer may be a primer specific to the template RNA, an oligo dT primer, a random primer, or a combination of two or more of these.
  • an oligo dT primer or a random primer tends to anneal to any RNA more easily than a primer specific to a particular sequence, and is more likely to induce DNA synthesis from rRNA. According to the present invention, even when such an oligo dT primer or a random primer is used, DNA synthesis from rRNA can be effectively suppressed.
  • the present invention is useful when performing a reverse transcription reaction using an oligo dT primer and/or a random primer, and is particularly useful when performing a reverse transcription reaction using a combination of an oligo dT primer and a random primer.
  • the molar ratio of the oligo dT primer to the random primer is, for example, 1:5 to 1:15, preferably 1:8 to 1:12.
  • random primers include completely random primers and NSR (Not So Random) primers.
  • a completely random primer is a mixture of primers having various base sequences, each of which is a completely random base sequence.
  • a completely random primer may include a sequence that is completely identical (or completely complementary) to an rRNA sequence.
  • completely random primers examples include completely random pentamers, completely random hexamers, completely random heptamers, completely random octamers, and combinations thereof.
  • a completely random hexamer may be a mixture of all possible base sequences ( 4-6 types) with four types of nucleotides (A, T, C, G).
  • the NSR primer is a complete random primer from which a primer having a sequence completely complementary to an rRNA sequence has been removed. Examples of the rRNA sequence to be removed include 18S rRNA sequences, 28S rRNA sequences, 12S rRNA sequences, 16S rRNA sequences, and combinations thereof.
  • the NSR primer may be, for example, a completely random hexamer excluding hexamers having sequences completely complementary to rRNA sequences.
  • a primer set such as a completely random pentamer, a completely random heptamer, or a completely random octamer excluding those having sequences completely complementary to rRNA sequences may be used as the NSR primer.
  • NSR primers it is possible to improve the sensitivity in analyzing mRNA and the like. Details of NSR primers are described in, for example, 1) Amour et al., Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis, Nature Methods, Vol. 6, No. 9, 2009, pp.
  • NSR primer is designed so that its base sequence is not completely complementary to the base sequence of rRNA, some primers can bind to rRNA, and the reverse transcription product may contain DNA derived from rRNA mixed with DNA derived from the template RNA.
  • the length of the primer is, for example, 5 bases or more, preferably 6 bases or more, from the viewpoint of annealing, and, for example, 30 bases or less, preferably 25 bases or less, more preferably 20 bases or less, from the viewpoint of synthesis.
  • the concentration of the primer is not particularly limited, but is, for example, 1 to 10 ⁇ M, preferably 2 to 6 ⁇ M, and more preferably 3 to 5 ⁇ M.
  • deoxyribonucleotide As deoxyribonucleotide , deoxyribonucleoside triphosphate is preferred.As deoxyribonucleotide triphosphate, for example, deoxycytidine triphosphate (dCTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxythymidine triphosphate (dTTP), deoxyuridine triphosphate (dUTP), their derivatives, and combinations of two or more of them can be mentioned.Among these, the mixture of dCTP, dGTP, dATP, and dTTP, the mixture of dCTP, dGTP, dATP, and dUTP, the mixture of dCTP, dGTP, dATP, dTTP, and dUTP, etc. are preferred.
  • Reverse Transcriptase Reverse transcriptase refers to any protein (enzyme) having reverse transcription activity (RNA-dependent DNA polymerase activity), and is not particularly limited, but a polymerase exhibiting reverse transcriptase activity is preferred.
  • the reverse transcriptase is preferably one having low RNase H activity or no RNase H activity.
  • Examples of reverse transcriptase include Avian Myeloblastosis Virus reverse transcriptase (AMV-RT), Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT), Human Immunovirus reverse transcriptase (HIV-RT), EIRV-RT, RAV2-RT, C. hydrogenogormans DNA polymerase, rTth DNA polymerase, SuperScript I, SuperScript II, mutants thereof, and derivatives thereof. Of these, MMLV-RT is preferred.
  • the DNA polymerase reverse transcription reaction composition may or may not contain the following DNA polymerase: Taq, Tbr, Tfl, Tru, Tth, Tli, Tac, Tne, Tma, Tih, Tfi, Pfu, Pwo, Kod, Bst, Sac, Sso, Poc, Pab, Mth, Pho, ES4, VENT(TM), DEEPVENT(TM), variants thereof
  • the reverse transcription reaction composition may contain an RNase inhibitor.
  • the RNase inhibitor is not particularly limited, and examples thereof include proteins derived from human placenta, rat lung, or pig liver.
  • the reverse transcription reaction composition may contain additives, such as buffers, salts, and combinations of two or more of these.
  • the buffer include Tris, Tricine, Bis-Tricine, Hepes, Mops, Tes, Taps, Pipes, Caps, and combinations of two or more of these.
  • the buffer is usually dissolved in water (preferably nuclease-free water) and used in the form of an aqueous solution.
  • salts include chlorides (e.g., lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, manganese chloride), acetates (e.g., lithium acetate, sodium acetate, potassium acetate, magnesium acetate, manganese acetate), sulfates (e.g., potassium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate), and combinations of two or more of these.
  • chlorides e.g., lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, manganese chloride
  • acetates e.g., lithium acetate, sodium acetate, potassium acetate, magnesium acetate, manganese acetate
  • sulfates e.g., potassium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate
  • the incubation conditions of the reverse transcription reaction composition are not particularly limited as long as the reverse transcription of the template RNA proceeds, and any conditions known in the art can be adopted.
  • the incubation temperature is, for example, 30 to 65° C., preferably 35 to 60° C.
  • the incubation time is, for example, 5 to 120 minutes, preferably 10 to 60 minutes.
  • the RT-RamDA method is a method for amplifying nucleic acids, which includes a step of incubating a mixture containing template RNA, a primer, a DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme, RNase H minus type reverse transcriptase, and a substrate.
  • a complementary strand DNA (cDNA) of the template RNA is synthesized by the RNA-dependent DNA polymerase activity of RNase H minus type reverse transcriptase, the cDNA strand of the hybrid strand of RNA and cDNA is randomly cleaved by DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme, and the cleavage site serves as a starting point, where the 3' side cDNA strand is peeled off from the RNA by the strand displacement activity of RNase H minus type reverse transcriptase, and a new cDNA strand is synthesized at the part peeled off by RNase H minus type reverse transcriptase.
  • Details of the RT-RamDA method are described in, for example, U.S. Patent Application Publication No. 2017/0275685 (the entirety of which is incorporated herein by reference).
  • the reverse transcription reaction composition contains a DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand-degrading enzyme.
  • the DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme is preferably an enzyme that has the activity of cleaving the DNA strand in an RNA-DNA hybrid strand.
  • a double-strand-specific DNA degrading enzyme or a non-specific DNA degrading enzyme can be used as the enzyme.
  • the double-strand-specific degrading enzyme (also referred to as double-strand-specific nuclease; DSN) may be an enzyme derived from a prokaryote or eukaryote, but preferably, a double-strand-specific DNA degrading enzyme derived from a crustacean or a modified form thereof may be used. Specific examples include the following.
  • the double-strand-specific DNA enzyme is preferably an enzyme that has DNA degradation activity even at temperatures below 60° C. Among the above, shrimp-derived double-strand-specific DNA enzyme or a modified form thereof is preferred.
  • dsDNase ArcticZymes
  • Hl-dsDNase ArcticZymes
  • dsDNase Thermo Scientific
  • Micromp DNase affymetrix
  • Atlantis dsDNase Zymo Research
  • Thermolabile Nuclease Roche
  • Non-specific DNA degrading enzyme is an enzyme that has the activity of cleaving the DNA strand of an RNA-DNA hybrid chain, but does not substantially have the activity of cleaving the RNA strand of an RNA-DNA hybrid chain or single-stranded RNA, and preferably has a lower activity of cleaving single-stranded DNA compared to the activity of cleaving the DNA strand of an RNA-DNA hybrid chain.
  • the non-specific DNA degrading enzyme is preferably an enzyme that has DNA degrading activity even at temperatures below 60°C.
  • a commercially available product can be used, for example, DNase I (manufactured by Thermo Fisher, DNase I), etc.
  • non-specific DNA degrading enzyme an enzyme derived from a prokaryote or eukaryote can be used, but preferably a mammalian non-specific DNA degrading enzyme or a modified product thereof, and more preferably a bovine non-specific DNA degrading enzyme or a modified product thereof can be used.
  • the above-mentioned modified form refers to an enzyme obtained by modifying a naturally occurring amino acid sequence. Specifically, it is an enzyme consisting of an amino acid sequence that has 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more) sequence identity with a naturally occurring amino acid sequence, as well as an enzyme consisting of an amino acid sequence in which one or several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids have been deleted, substituted, and/or added in the naturally occurring amino acid sequence.
  • the reverse transcription reaction composition may contain a single-stranded DNA binding protein.
  • the single-stranded DNA binding protein is usually used together with a DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme.
  • Examples of single-stranded DNA binding proteins include T4 gene 32 protein, RecA, SSB (Single-Stranded DNA Binding Protein), and combinations of two or more of these.
  • the reverse transcription reaction composition may be incubated under isothermal conditions or under thermocycle conditions.
  • Isothermal Conditions When incubation is performed under isothermal conditions, it can be performed at a predetermined temperature between 25° C. and less than 50° C., preferably between 30 and 45° C., more preferably between 35 and 40° C., for example, at 37° C. for a predetermined time (for example, 5 to 180 minutes, preferably 10 to 150 minutes). Incubation at a predetermined temperature between 25° C. or higher and less than 50° C. may be performed in two or more stages. For example, incubation may be performed for 5 to 15 minutes at a predetermined temperature between 25° C.
  • incubation may be performed at a predetermined temperature between 50° C. and less than 100° C., for example.
  • Incubation at a predetermined temperature between 50° C. and less than 100° C. may be performed in two or more stages. For example, incubation may be performed at a predetermined temperature between 50° C. and less than 80° C. for 5 to 15 minutes, and then at a predetermined temperature between 80° C. and 90° C. for 5 to 15 minutes.
  • a predetermined temperature T1 e.g., 25°C
  • a predetermined temperature T2 e.g., 37°C
  • a predetermined time at T1 e.g., 1 to 3 minutes, for example, 2 minutes
  • a predetermined time at T2 e.g., 1 to 3 minutes, for example, 2 minutes
  • a predetermined time at T2 e.g., 1 to 3 minutes, for example, 2 minutes
  • incubation may be performed for a predetermined time (e.g., 5 to 15 minutes) at a predetermined temperature between 25°C and less than 30°C, then for a predetermined time (e.g., 5 to 15 minutes) at a predetermined temperature between 30°C and less than 35°C, and then for a predetermined time (e.g., 1 to 5 minutes) at a predetermined temperature between 35°C and less than 50°C.
  • the mixture may be incubated at a predetermined temperature between 50° C. and less than 80° C. for a predetermined time (e.g., 5 to 15 minutes), and then at a predetermined temperature between 80° C. and 90° C. for a predetermined time (e.g., 5 to 15 minutes).
  • the reverse transcription reaction composition can be incubated under the conditions described in 2-2. After that, the reverse transcriptase may be inactivated as necessary.
  • the method for inactivating reverse transcription is not particularly limited, but may be, for example, a method of incubation at 90 to 100° C. for a predetermined time (for example, 1 to 10 minutes).
  • the method for synthesizing DNA by reverse transcription of a template RNA includes a step of amplifying the DNA contained in the incubated reverse transcription reaction composition (also called the reverse transcription product).
  • the step of amplifying the DNA typically includes a step of incubating the DNA amplification composition under thermal cycle conditions.
  • the composition for DNA amplification may contain the reverse transcription product as it is, or may contain the reverse transcription product diluted with water, preferably nuclease-free water, for example, so that the mass of the reverse transcription product becomes 1/20 to 1/30.
  • the DNA amplification composition contains, in addition to the reverse transcription product, for example, a primer, deoxyribonucleotides, and DNA polymerase.
  • the reverse transcription reaction composition described in 2-1 above contains components necessary for a DNA amplification reaction, such as DNA polymerase
  • the reverse transcription reaction composition can be a DNA amplification composition as it is, and the two compositions can be referred to interchangeably.
  • a primer forward primer, reverse primer
  • DNA including DNA reverse transcribed from RNA
  • the deoxyribonucleotides and DNA polymerase that can be used are the same as those described in 2-1. (3) and (5) above.
  • the composition for DNA amplification may contain an anti-DNA polymerase antibody, a reaction buffer, a metal ion (such as magnesium ion), a fluorescent dye, a fluorescently labeled probe, or a combination of two or more of these.
  • Incubation under thermal cycle conditions may be performed by repeating, for example, 10 to 50 cycles, more preferably 15 to 40 cycles, of a cycle consisting of a predetermined temperature between 80°C and less than 100°C for a predetermined time (e.g., 10 to 30 seconds) and a predetermined temperature between 50 to 70°C for a predetermined time (e.g., 30 seconds to 2 minutes).
  • a predetermined temperature between 80°C and less than 100°C for a predetermined time (e.g., 10 to 30 seconds) and a predetermined temperature between 50 to 70°C for a predetermined time (e.g., 30 seconds to 2 minutes).
  • the method for inhibiting rRNA-derived DNA synthesis using a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of sulfate groups, sulfone groups, and salt-type groups thereof typically includes a step of reverse transcribing template RNA under conditions in which the polymer is present at a concentration of 10 pg/ ⁇ L or more. This step allows the template RNA to be specifically reverse transcribed, DNA derived from the template RNA to be specifically synthesized, and DNA synthesis derived from rRNA to be inhibited.
  • the rRNA is preferably 18S rRNA, 28S rRNA, 12S rRNA, 16S rRNA, or a combination of two or more of these.
  • the conditions for reverse transcription are as described in 2-1. to 2-4. above.
  • compositions for inhibiting reverse transcription of rRNA contains a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of sulfate group, sulfone group, and salt group thereof.
  • the reverse transcription of rRNA is not particularly limited as long as it is reverse transcription of an RNA sample containing at least rRNA, and may be reverse transcription of an RNA sample containing template RNA and rRNA.
  • the RNA sample containing template RNA and rRNA may be RNA extracted from cells or tissues, RNA further purified after extraction treatment from cells or tissues, etc., but is preferably RNA extracted from cells.
  • the RNA may be the same as that described in 2-1. (1) above.
  • the conditions for reverse transcription may be, for example, the same as those described in 2-2. to 2-4. above.
  • the composition for suppressing reverse transcription of rRNA may contain, in addition to the above polymer, the components described in 2-1, 2-2, and 2-3 above (particularly, the components necessary for reverse transcription).
  • the composition for inhibiting reverse transcription of rRNA may be in the form of a mixture of each component, or in the form of a kit containing each component separately.
  • a reverse transcription reaction composition for preparing a reverse transcription reaction product used in next-generation sequencing contains a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of the above-mentioned sulfate group, sulfone group, and salt-type groups thereof.
  • Next-generation sequencing typically refers to a sequencing technique that can simultaneously perform a huge number of sequencing reactions, from millions to billions. Examples of next-generation sequencing include a method of performing sequence analysis in parallel using amplification techniques such as emulsion PCR and bridge PCR, and high-sensitivity detection techniques such as single-molecule observation.
  • the next-generation sequencing device is not particularly limited, but includes, for example, MiSeq, HiSeq, NovaSeq (Illumina), Genetic Analyzer V2.0, Ion Proton (Thermo Fisher Scientific), MinION, PromethION (Nanopore), etc.
  • Next-generation sequencing is described, for example, in U.S. Patent Application Publication No. 2014/178438 (the entirety of which is incorporated herein by reference). According to the present invention, it is possible to effectively suppress reverse transcription reaction products from rRNA that may become noise in large-scale gene expression analysis such as next-generation sequencing. In NGS analysis, the number of reads obtained in one analysis is often limited, and it is important to reduce the number of useless rRNA-derived DNA reads.
  • the reverse transcription reaction product from an RNA sample that may contain rRNA prepared according to the present invention is suitable for next-generation sequencing.
  • the RNA sample that may contain rRNA may be an RNA sample containing template RNA and rRNA.
  • the RNA sample containing template RNA and rRNA may be RNA extracted from cells or tissues, RNA further purified after extraction processing from cells or tissues, etc., but is preferably RNA extracted from cells.
  • This RNA can be the same as that described in 2-1. (1) above.
  • the conditions for reverse transcription may be, for example, the same as those described in 2-2. to 2-4. above.
  • the reverse transcription reaction composition for preparing a reverse transcription reaction product to be used in next-generation sequencing may contain, in addition to the above polymer, the components described in 2-1, 2-2, and 2-3 above (particularly, the components necessary for reverse transcription).
  • the reverse transcription reaction composition for preparing a reverse transcription reaction product to be used in next-generation sequencing may be in the form of a mixture of each component, or in the form of a kit containing each component separately.
  • Example 1 Evaluation of inhibition of rRNA-derived DNA synthesis by heparin, chondroitin sulfate, and hyaluronic acid in RT-PCR method 1
  • the following test was performed to confirm the amount of DNA synthesis derived from ribosomal RNA in the presence of heparin sodium (glycosaminoglycan having a sulfate group), chondroitin sulfate C sodium (glycosaminoglycan having a sulfate group), or sodium hyaluronate (glycosaminoglycan having neither sulfate group, sulfone group, nor these salt-type groups) in RT-PCR.
  • the nucleic acid fragment sample used in this example was 1 ng of RNA purified from HeLa S3 cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • the components contained in the sample solution used in this example for the reverse transcription reaction of 10 pg of RNA and their final concentrations in the sample solution are shown in the following Table 1.
  • the NSR primer (hexamer) was synthesized using Sigma custom oligos and mixed to obtain the primer composition described in Ozsolak et al., Digital transcriptome profiling from attomole-level RNA samples, Genome Research, Vol. 20, 2010, pp. 519-525.
  • a reverse transcription reaction was carried out using a sample solution prepared by adding purified RNA to the above composition. This reaction was carried out at 37°C for 30 minutes, then at 50°C for 5 minutes, and then at 95°C for 5 minutes to synthesize single-stranded cDNA. The DNA amounts were then compared using the following quantitative polymerase chain reaction (qPCR).
  • the reverse transcription reaction solution was diluted with nuclease free water (Qiagen), and 1/25 of the diluted solution was used for the qPCR reaction.
  • the qPCR was performed using StepOne Plus (Life Technologies) under the following conditions.
  • the qPCR reaction solution [20 ⁇ L (THUNDERBIRDTM SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.), 6 pmol forward primer, 6 pmol reverse primer, 2 ⁇ L diluted reverse transcription reaction solution, nuclease free water] was treated at 95° C. for 1 minute to activate the enzyme, and then 40 cycles of denaturation at 95° C. for 15 seconds and extension reaction at 60° C. for 1 minute were performed.
  • qPCR was performed using a CFX96 real-time PCR analysis system, and the threshold RFU was set to 100.
  • RNA messenger RNA
  • ACTB messenger RNA
  • 18S ribosomal RNA RNA18S were used as target genes.
  • ACTB mRNA
  • Forward primer CGCGAGAAGATGACCCAGAT
  • Reverse primer GCCAGAGGCGTACAGGGGATA
  • RNA18S ribosomal RNA
  • Forward primer GATGGTAGTCGCCGTGCC
  • Reverse primer GCCTGCTGCCTTCCTTGG
  • the average Ct value (added) when each polymer was added at various concentrations was subtracted from the average Ct value (no addition) when no polymer was added to calculate the ⁇ Ct value (added minus no addition).
  • the results for ACTB are shown in Table 2, and the results for RNA18S are shown in Table 3.
  • the ⁇ Ct value was calculated by subtracting the ⁇ Ct value of ACTB from the ⁇ Ct value of RNA18S, and whether reverse transcription was specifically inhibited in RNA18S was evaluated. The results are shown in Table 4.
  • Example 2 Evaluation of inhibition of rRNA-derived DNA synthesis by heparin in RT-PCR method 2
  • the following test was performed to confirm whether the reduction in the amount of DNA synthesis derived from ribosomal RNA by a polymer having at least one functional group selected from the group consisting of a sulfate group, a sulfone group, and their salt groups, as seen in Example 1, occurs even when a random primer is used.
  • Each polymer was added to the sample solution at a concentration of 2 pg/ ⁇ L or 20 pg/ ⁇ L, and single-stranded cDNA was synthesized by reverse transcription.
  • the nucleic acid fragment sample used in this example was 1 ng of RNA purified from HeLa S3 cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • the components contained in the sample solution used in this example for the reverse transcription reaction of 10 pg of RNA and their final concentrations in the sample solution are shown in Table 5 below.
  • a reverse transcription reaction was carried out using a sample solution prepared by adding purified RNA to the above composition. This reaction was carried out at 37°C for 30 minutes, then at 50°C for 5 minutes, and then at 95°C for 5 minutes to synthesize single-stranded cDNA. The DNA amounts were then compared using the following quantitative polymerase chain reaction (qPCR).
  • the reverse transcription reaction solution was diluted with nuclease free water (Qiagen), and 1/25 of the diluted solution was used for the qPCR reaction.
  • the qPCR was performed using StepOne Plus (Life Technologies) under the following conditions.
  • the qPCR reaction solution [20 ⁇ L (THUNDERBIRDTM SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.), 6 pmol forward primer, 6 pmol reverse primer, 2 ⁇ L diluted reverse transcription reaction solution, nuclease free water] was treated at 95° C. for 1 minute to activate the enzyme, and then 40 cycles of denaturation at 95° C. for 15 seconds and extension reaction at 60° C. for 1 minute were performed.
  • qPCR was performed using a CFX96 real-time PCR analysis system, and the threshold RFU was set to 100.
  • RNA messenger RNA
  • ACTB messenger RNA
  • 18S ribosomal RNA RNA18S were used as target genes.
  • the primers for each gene were the same as those used in Example 1.
  • the average Ct value (with addition) when the polymer was not added was subtracted from the average Ct value (with addition) when the polymer was added at various concentrations to calculate the ⁇ Ct value (with addition - without addition).
  • the results for ACTB are shown in Table 6, and the results for RNA18S are shown in Table 7.
  • the ⁇ Ct value was calculated by subtracting the ⁇ Ct value of ACTB from the ⁇ Ct value of RNA18S, and whether reverse transcription was specifically inhibited in RNA18S was evaluated. The results are shown in Table 8.
  • Example 3 Evaluation of inhibition of rRNA-derived DNA synthesis by chondroitin sulfate and hyaluronic acid in RT-PCR method 3
  • sodium chondroitin sulfate sodium chondroitin sulfate C
  • sodium hyaluronate was used as a glycosaminoglycan having no sulfate group, sulfone group, or salt group for comparison.
  • the nucleic acid fragment sample used in this example was 1 ng of RNA purified from HeLa S3 cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • the components contained in the sample solution used in this example for the reverse transcription reaction of 10 pg of RNA and their final concentrations in the sample solution are shown in Table 9 below.
  • a reverse transcription reaction was carried out using a sample solution prepared by adding purified RNA to the above composition. This reaction was carried out at 37°C for 30 minutes, then at 50°C for 5 minutes, and then at 95°C for 5 minutes to synthesize single-stranded cDNA. The DNA amounts were then compared using the following quantitative polymerase chain reaction (qPCR).
  • the reverse transcription reaction solution was diluted with nuclease free water (Qiagen), and 1/25 of the diluted solution was used for the qPCR reaction.
  • the qPCR was performed using StepOne Plus (Life Technologies) under the following conditions.
  • the qPCR reaction solution [20 ⁇ L (THUNDERBIRDTM SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.), 6 pmol forward primer, 6 pmol reverse primer, 2 ⁇ L diluted reverse transcription reaction solution, nuclease free water] was treated at 95° C. for 1 minute to activate the enzyme, and then 40 cycles of denaturation at 95° C. for 15 seconds and extension reaction at 60° C. for 1 minute were performed.
  • qPCR was performed using a CFX96 real-time PCR analysis system, and the threshold RFU was set to 100.
  • RNA messenger RNA
  • ACTB messenger RNA
  • 18S ribosomal RNA RNA18S were used as target genes.
  • the primers for each gene were the same as those used in Example 1.
  • RNA18S which is ribosomal RNA
  • ACTB which is mRNA
  • Example 4 Evaluation of inhibition of rRNA-derived DNA synthesis by polyvinyl sulfonate in RT-PCR
  • PVSA sodium polyvinyl sulfonate
  • PVSA was added to the sample solution at a concentration of 20 pg/ ⁇ L to 20 ng/ ⁇ L or without addition, and single-stranded cDNA was synthesized by reverse transcription reaction.
  • the nucleic acid fragment sample used in this example was 1 ng of RNA purified from HeLa S3 cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • the NSR primer (hexamer) was synthesized using Sigma custom oligos and mixed to obtain the primer composition described in Ozsolak et al., Digital transcriptome profiling from attomole-level RNA samples, Genome Research, Vol. 20, 2010, pp. 519-525.
  • the reaction volume was 9 ⁇ L.
  • the components contained in the sample solution used in this example for the reverse transcription reaction of 10 pg of RNA and their final concentrations in the sample solution are shown in Table 13 below.
  • a reverse transcription reaction was carried out using a sample solution prepared by adding purified RNA to the above composition. This reaction was carried out at 37°C for 30 minutes, then at 50°C for 5 minutes, and then at 95°C for 5 minutes to synthesize single-stranded cDNA. The DNA amounts were then compared using the following quantitative polymerase chain reaction (qPCR).
  • the reverse transcription reaction solution was diluted with nuclease free water (Qiagen), and 1/25 of the diluted solution was used for the qPCR reaction.
  • the qPCR was performed using StepOne Plus (Life Technologies) under the following conditions.
  • the qPCR reaction solution [20 ⁇ L (THUNDERBIRDTM SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.), 6 pmol forward primer, 6 pmol reverse primer, 2 ⁇ L diluted reverse transcription reaction solution, nuclease free water] was treated at 95° C. for 1 minute to activate the enzyme, and then 40 cycles of denaturation at 95° C. for 15 seconds and extension reaction at 60° C. for 1 minute were performed.
  • qPCR was performed using a CFX96 real-time PCR analysis system, and the threshold RFU was set to 100.
  • RNA messenger RNA
  • ACTB messenger RNA
  • 18S ribosomal RNA RNA18S were used as target genes.
  • the primers used for each gene were the same as those used in Example 1.
  • RNA18S a ribosomal RNA
  • ACTB an mRNA
  • Example 5 Inhibition of ribosomal RNA-derived DNA synthesis by heparin in the RT-RamDA method
  • the following test was carried out for the purpose of confirming the amount of ribosomal RNA-derived DNA synthesis by sodium heparin in the RT-RamDA method.
  • Sodium heparin was added to the sample solution, single-stranded cDNA was synthesized by the RT-RamDA method, and then a library was prepared and the ribosomal RNA ratio was calculated by NGS analysis.
  • the nucleic acid fragment sample used in this example was 10 pg of RNA purified from NIH3T3 cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • the components contained in the sample solution used in this example to subject 10 pg of this RNA to the RT-RamDA method and their final concentrations in the sample solution are shown in Table 17 below.
  • the NSR primer (hexamer) was synthesized using Sigma custom oligos and mixed to obtain the primer composition described in Ozsolak et al., Digital transcriptome profiling from attomole-level RNA samples, Genome Research, Vol. 20, 2010, pp. 519-525.
  • the reaction solution volume was 9 ⁇ L.
  • the RT-RamDA method was carried out using a sample solution prepared by adding purified RNA to the above composition, at 25°C for 10 minutes, 30°C for 10 minutes, 37°C for 30 minutes, 50°C for 5 minutes, and 85°C for 5 minutes. Then, 9 ⁇ L of the obtained cDNA solution was used to generate double-stranded cDNA using the 2nd strand synthesis buffer, 2nd strand synthesis enzyme, and 2nd strand synthesis primer mix of GenNext (registered trademark) RamDA-seq (registered trademark) Single Cell Kit (Toyobo Co., Ltd.).
  • a library was prepared using Nexteta (illumina Co., Ltd.), and NGS (next-generation sequencing) was performed by MiSeq (illumina Co., Ltd.) using MiSeq Reagent Kit v3 (150 Cycles) (illumina Co., Ltd.).
  • the procedure was according to the instruction manual.
  • the analysis was performed using illumina Basespace (Illumina), and the proportion of ribosomal RNA in the reads was calculated according to the procedure in the instruction manual. The results are shown in Table 18.
  • the Number of Reads in Table 18 is the total number of reads obtained.
  • %Total Aligned indicates the percentage of reads that matched the reference genome (UCSC mm10) containing ribosomal RNA among the total reads, and %Abundant indicates the percentage of ribosomal RNA.
  • %Abundant/%Total Aligned indicates the percentage of ribosomal RNA among the reads that matched the reference genome.

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Abstract

リボソーマルＲＮＡの逆転写を抑制するための組成物及び方法を提供する。 本発明のリボソーマルＲＮＡの逆転写を抑制するための組成物は、硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを含有し、逆転写反応液中における該ポリマー濃度が１０ｐｇ／μＬ以上となるような量で用いられることを特徴とする。

Description

リボソーマルＲＮＡ由来の逆転写の抑制
　本発明は、リボソーマルＲＮＡ由来の逆転写を抑制した核酸の生成及び増幅に関する。例えば、本発明はリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型からの核酸の生成及び増幅のために有用な組成物及び方法、具体的には、特定のポリマーを用いて、逆転写反応による核酸の生成及び増幅を行うための組成物及び方法に関する。本発明の組成物及び方法は、例えば、リボソーマルＲＮＡの逆転写抑制のため、即ちリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成抑制のために使用される。
　リボソーマルＲＮＡは、生体内ＲＮＡの約８～９割を占めるともいわれる。遺伝子発現量の解析では通常、発現しているＲＮＡを逆転写反応によりｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡに基づき遺伝子解析を行うことが一般的である。この逆転写反応の際に、生体内ＲＮＡの大半を占めるリボソーマルＲＮＡが逆転写され増幅されると、本来、逆転写して増幅させたいＲＮＡの発現解析においてノイズを発生させる。また近年では、ＲＮＡを鋳型として大量の核酸増幅産物を得ることができるＲＴ－ＲａｍＤＡ法などの新たな技術が開発されている（特許文献１参照）。このようにＲＮＡを鋳型として大量の核酸増幅産物を得ることができるＲＴ－ＲａｍＤＡ法等において、リボソーマルＲＮＡの逆転写反応が一旦起こってしまうと、それが鎖置換反応で等温線形増幅するために、解析を望むＲＮＡの量が相対的に減少することとなり影響が大きい。このため、逆転写反応を行う核酸解析法においてリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制することが望まれている。
　これまでに、特定の核酸ポリマーを用いて、鋳型ＲＮＡからの逆転写反応においてリボソーマルＲＮＡの逆転写を抑制する方法が検討されている（特許文献２）。しかし、更なる有用なリボソーマルＲＮＡからの逆転写抑制方法の開発が望まれている。
国際公開第２０１６／０５２６１９号 国際公開第２０２０／１８４５５１号
　リボソーマルＲＮＡの逆転写を抑制するための手段の提供が１つの目的である。
　本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法において、硫酸基（－Ｏ－ＳＯ３Ｈ）、スルホン基（－ＳＯ３Ｈ）、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを所定濃度以上で用いると、リボソーマルＲＮＡの逆転写を抑制し、リボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制することができることを見出した。本発明者らは、当該知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明の完成に至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
項１．
　鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法において、逆転写反応液中に硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを１０ｐｇ／μＬ以上の濃度で存在させることにより、リボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制する方法。
項２．
　前記ポリマーが、硫酸化グルコサミノグリカン、ポリビニルスルホン酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種を含む、項１に記載の方法。
項３．
　前記ポリマーが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種を含む、項１又は２に記載の方法。
項４．
　逆転写反応液中の前記ポリマーの濃度が、１０ｐｇ／μＬ以上かつ１μｇ／μＬ以下である、項１～３のいずれかに記載の方法。
項５．
　前記逆転写が、ランダムプライマーを用いて行われる、項１～４のいずれかに記載の方法。
項６．
　前記ランダムプライマーの塩基配列が、リボソーマルＲＮＡの塩基配列と完全に相補的でない、項５に記載の方法。
項７．
　前記逆転写が、ＲＴ－ＰＣＲ法又はＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる、項１～６のいずれかに記載の方法。
項８．
　前記鋳型ＲＮＡが細胞から抽出されたＲＮＡである、項１～７のいずれかに記載の方法。
項９．
　硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを含有し、逆転写反応液における該ポリマー濃度が１０ｐｇ／μＬ以上となるような量で用いられる、リボソーマルＲＮＡの逆転写を抑制するための組成物。
項１０．
　硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを１０ｐｇ／μＬ以上含有する、次世代シーケンシング用の逆転写反応物を調製するための逆転写反応組成物。
項１１．
　前記逆転写が、ＲＴ－ＰＣＲ法又はＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる、項９又は１０に記載の組成物。
項１２．
　キットの形態である、項９～１１のいずれかに記載の組成物。
　本発明により、リボソーマルＲＮＡの逆転写を抑制、又はリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制することができる。
＜鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法において、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）由来のＤＮＡ合成を抑制する方法＞
１．硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーによるアバンダントなｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成の抑制
　本発明では、逆転写反応の際に鋳型ＲＮＡと、逆転写酵素と、硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーとを共存させることで、アバンダントなｒＲＮＡからの逆転写を抑制することができる。これにより、逆転写反応後の産物において標的となるＲＮＡ由来のＤＮＡの割合を高くすることができる。理論によって拘束されるわけではないが、硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーは、プライマーとｒＲＮＡとの間の結合を競合的に阻害し、この性質に少なくとも一部起因して逆転写酵素によるアバンダントなｒＲＮＡの逆転写を抑制すると考えられる。
　硫酸基、スルホン基（「スルホン酸基」と称する場合もある）、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーとしては、基本骨格に前記官能基の側鎖を持つポリマーであれば特に限定されない。硫酸基／スルホン基の塩型基（硫酸塩基／スルホン酸塩基）としては、例えば、－Ｏ－ＳＯ３ －Ｍ＋／－ＳＯ３ －Ｍ＋（Ｍ＋は、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどのアルカリ金属イオン、又は、ＮＲ４ ＋であり、各Ｒは独立してＨ又は任意に置換されていてもよい炭化水素基であり、２個又は３個のＲは隣接するＮと共に環を形成していてもよい）等が挙げられる。また、硫酸塩基／スルホン酸塩基を持つポリマー（硫酸基／スルホン基を持つポリマーの塩）には、多価カチオン（例えば、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン）により側鎖の－Ｏ－ＳＯ３ －／－ＳＯ３ －が架橋している形態のポリマーも含む。一実施形態において、硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーは、硫酸基及び／又はその塩型基を持つポリマー、並びに、スルホン基及び／又はその塩型基を持つポリマーから選択される少なくとも一種を含むことが好ましく、硫酸化グリコサミノグリカン、ポリビニルスルホン酸、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩から選択される少なくとも一種を含むことがより好ましい。これらは、合成して製造したものを使用してもよいし、天然物から抽出したものを使用してもよいし、市販のものを使用してもよい。
　硫酸化グリコサミノグリカンとしては特に限定されず、いかなる種類であっても利用することができる。グリコサミノグリカンは、アミノ糖とウロン酸又はガラクトースとの二糖の繰り返し単位を有する多糖であることが好ましい。アミノ糖としては、例えばグルコサミン、ガラクトサミンなどが挙げられる。アミノ糖はＮ－アセチル化物であってもよい。ウロン酸としては、例えばグルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸などが挙げられる。硫酸化グリコサミノグリカンは、２糖の繰り返し単位あたり１、２、３、又は４個の硫酸基を有するグリコサミノグリカンであることが好ましい。硫酸基は、アミノ糖、及び／又は、ウロン酸若しくはガラクトース上のヒドロキシ基及び／又はアミノ基に置換していることが好ましい。硫酸化グリコサミノグリカンとしては、例えば、下表に示すものが挙げられる。
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　硫酸化グリコサミノグリカン及び／又はその塩はタンパク質と結合することにより、プロテオグリカンを構成し得る。本発明の効果を奏する限り、硫酸基及び／又はその塩型基を持つグリコサミノグリカンとして、プロテオグリカンのような構造を有するものを使用してもよい。
　より一層効果的にｒＲＮＡの逆転写を抑制又はｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制できるという観点から、硫酸化グリコサミノグリカン及び／又はその塩は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種を含むことが好ましく、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩より選択される少なくとも一種を含むことがより好ましく、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ｃ、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩より選択される少なくとも一種を含むことがさらに好ましい。
　ポリビニルスルホン酸は、ビニルスルホン酸（又はエチレンスルホン酸ともいう）を構成単位として含むポリマーであれば特に限定されず、いかなる種類であっても利用することができる。ポリビニルスルホン酸は、ビニルスルホン酸のホモポリマーであっても、ビニルスルホン酸以外の構成単位（例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸アミド、（メタ）アクリロニトリルなどの構成単位）を含むコポリマーであってもよいが、好ましくはビニルスルホン酸の構成単位を５０モル％以上含むポリマーであり、より好ましくはビニルスルホン酸の構成単位を７０モル％以上含むポリマーであり、さらに好ましくはビニルスルホン酸の構成単位を９０モル％以上含むポリマーであり、さらにより好ましくはビニルスルホン酸のホモポリマーである。
　上記「誘導体」は、元のポリマーの基本骨格を保持しつつ、構造の一部が改変されたものをいう。改変には、例えば、酸化、還元、原子の置換、官能基の導入などが含まれる。
　上記「塩」としては、特に限定されないが、アミン塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などが好ましい。アミン塩には、ＮＲ４ ＋（各Ｒは独立してＨ又は任意に置換されていてもよい炭化水素基であり、２個又は３個のＲは隣接するＮと共に環を形成していてもよい）で表されるカチオンを有する塩が含まれ、そのような塩としては、例えば、アンモニウム塩、モノメチルアンモニウム塩、モノエチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩などが挙げられる。上記「塩」としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などがより好ましい。また、塩は水和物塩であってもよい。
　硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーの重量平均分子量は特に制限されないが、例えば５，０００以上、好ましくは１０，０００以上、さらに好ましくは２０，０００であり、５０，０００以上、１００，０００以上であってもよい。また前記ポリマーの重量平均分子量の上限は、本発明の効果を奏する限り限定されないが、例えば５，０００，０００以下、好ましくは１，０００，０００以下であることが好ましく、５００，０００以下であってもよい。
　重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いる従来の方法により測定され、標準プルランで予め作成した検量線からプルラン換算重量平均分子量として算出することができる（例えば、米国特許出願公開公報2020／190266参照（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる））。
　硫酸化グリコサミノグリカンにおけるアミノ糖とウロン酸又はガラクトースとの二糖の構成単位の繰り返しの数（又はその平均）、或いは、ポリビニルスルホン酸に含まれるビニルスルホン酸（又はエチレンスルホン酸）の構成単位の繰り返しの数（又はその平均）は特に制限されないが、例えば２０個以上、好ましくは３０個以上、より好ましくは４０個以上、更に好ましくは５０個以上であり、例えば１００個以上、１５０個以上であってもよい。また、前記構成単位の繰り返しの数（又はその平均）は、例えば５０００個以下、４０００個以下、３０００個以下、１０００個以下、５００個以下であり得る。繰り返しは連続であっても断続であってもよく、好ましくは連続である。
２．鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法
　鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法は、特に制限されず、従来より公知の各種の方法を採用することができる。当該方法は、典型的には、逆転写酵素等の逆転写活性を有するタンパク質を含む逆転写反応組成物（又は逆転写反応液）をインキュベーションする工程を含む。
２－１．逆転写反応組成物
　逆転写反応組成物は、例えば、上記硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマー、鋳型ＲＮＡ、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及び逆転写酵素を含む。また、逆転写反応組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ等の他の成分等も任意に含み得る。
　逆転写反応組成物において、上記ポリマーの濃度は、ｒＲＮＡの逆転写を抑制し、ｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制する点から、例えば、１０ｐｇ／μＬ以上、好ましくは１５ｐｇ／μＬ、２０ｐｇ／μＬ、５０ｐｇ／μＬ以上、１００ｐｇ／μＬ以上、１ｎｇ／μＬ以上、又は１０ｎｇ／μＬ以上であり得る。また、上記ポリマーの濃度は、ｒＲＮＡ以外の標的ＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制しすぎないという観点から、例えば、１μｇ／μＬ以下、好ましくは１００ｎｇ／μＬ以下、より好ましくは２０ｎｇ／μＬ以下であり、例えば１０ｎｇ／μＬ以下、５ｎｇ／μＬ以下、３ｎｇ／μＬ以下、２．５ｎｇ／μＬ以下、２ｎｇ／μＬ以下、１ｎｇ／μＬ以下、又は１ｎｇ／μＬ未満であってもよい。
　一つの実施形態において、硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーとして硫酸化グリコサミノグリカン及び／又はその塩を用いる場合、逆転写反応液中における当該ポリマーの濃度が比較的低くなるように調整されていることが好ましく、例えば、２ｎｇ／μＬ以下、好ましくは１ｎｇ／μＬ以下、５００ｐｇ／μＬ以下、２００ｐｇ／μＬ以下、１００ｐｇ／μＬ以下、又は５０ｐｇ／μＬ以下であり得る。また、逆転写反応液中における当該ポリマーの濃度の下限値は特に限定されないが、例えば、１０ｐｇ／μＬ又は１５ｐｇ／μＬ以上となるように調整されていることが好ましい。
　別の実施形態において、硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーとしてポリビニルスルホン酸及び／又はその塩を用いる場合、逆転写反応液中における当該ポリマーの濃度が比較的高くなるように調整されていることが好ましく、例えば、１００ｐｇ／μＬ以上、好ましくは２００ｐｇ／μＬ以上又は５００ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは１ｎｇ／μＬ以上、２ｎｇ／μＬ以上、又は１０ｎｇ／μＬ以上であり得る。また、逆転写反応液中における当該ポリマーの濃度の上限値は特に限定されないが、例えば、１００ｎｇ／μＬ以下となるように調整されていることが好ましい。
（１）鋳型ＲＮＡ
　鋳型ＲＮＡとしては、組織や細胞から抽出されたＲＮＡ、組織や細胞からの抽出処理後に更に精製されたＲＮＡ（例えば、エタノール沈殿、カラム精製等の当該分野で公知の任意の精製手段により処理された精製ＲＮＡ）等の任意のＲＮＡであり得るが、なかでも細胞から抽出されたＲＮＡを用いることが好ましい。細胞から抽出されたＲＮＡは、通常、鋳型ＲＮＡとなるｍＲＮＡ等の他にｒＲＮＡが不可避的に混入するが、上記硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーの存在下ではｒＲＮＡの逆転写が抑制されるため、細胞から抽出されたＲＮＡをそのまま鋳型ＲＮＡとして使用しても、鋳型ＲＮＡを特異的に逆転写することができる。すなわち、細胞から抽出されたＲＮＡからｒＲＮＡを除去する工程を省略することができる。
　ＲＮＡを抽出する細胞の種類は特に制限されず、いかなる種類の細胞であってもよい。細胞の個数は、セルソーターにより適宜調整することができる。例えば、少数（例えば１～１００個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１又は２個、より好ましくは１個）の細胞から抽出されたＲＮＡを使用することもできる。
　細胞からＲＮＡを抽出する方法は、通常、細胞溶解剤を含む細胞溶解用組成物を用いて、細胞を溶解する工程を含む。
　細胞溶解剤としては、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤などが挙げられる。界面活性剤には、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ノニオン性界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及び両イオン性界面活性剤（例えば、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸）が含まれる。カオトロピック剤としては、例えば、尿素、過塩素酸リチウム塩などのリチウム塩が挙げられる。細胞溶解剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
　細胞溶解用組成物は、プロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＫ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、これら２種以上の組合せを含んでいてもよい。
　細胞溶解用組成物は、上記硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを含んでいても含んでいなくてもよい。上記ポリマーを含む細胞溶解用組成物を用いて細胞から抽出したＲＮＡを鋳型ＲＮＡとして使用する場合、逆転写反応組成物には、別途上記ポリマーを添加しなくてもよい。
　細胞溶解用組成物の詳細については、米国特許出願公開公報2011／0111463（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）等に記載されている。
　逆転写反応組成物において、ＲＮＡ（ｒＲＮＡを含む）の濃度は、例えば１～１００００ｐｇ／μＬ、好ましくは１０～１０００ｐｇ／μＬ、より好ましくは１～１００ｐｇ／μＬである。
（２）プライマー
　プライマーとしては、鋳型ＲＮＡに対する特異的なプライマー、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、オリゴｄＴプライマーやランダムプライマーは、特定の配列に特異的なプライマーよりも、任意のＲＮＡにアニールし易い傾向があり、ｒＲＮＡからのＤＮＡ合成を誘発しやすい。本発明によれば、このようなオリゴｄＴプライマーやランダムプライマーを用いる場合であっても、ｒＲＮＡからのＤＮＡ合成を効果的に抑制することができる。かかる観点から、本発明は、オリゴｄＴプライマー及び／又はランダムプライマーを用いる逆転写反応を行う場合に有益であり、オリゴｄＴプライマー及びランダムプライマーの組合せを用いて逆転写反応を行う場合に特に有益である。オリゴｄＴプライマーとランダムプライマーのモル比は、例えば１：５～１：１５、好ましくは１：８～１：１２である。
　ランダムプライマーとしては、例えば、完全ランダムプライマー、ＮＳＲ（Not So Random）プライマーが挙げられる。
　完全ランダムプライマーとは、種々の塩基配列を有するプライマーの混合物であり、各塩基配列は完全にランダムな塩基配列である。完全ランダムプライマーは、ｒＲＮＡ配列と完全に一致する（又は完全に相補的な）配列を含み得る。完全ランダムプライマーとしては、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘキサマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマー、これらの組合せなどが例示できる。例えば、完全ランダムヘキサマーは、４種類のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）で可能な全ての塩基配列（４６種類）の混合物であってもよい。
　ＮＳＲプライマーとは、完全ランダムプライマーから、ｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するプライマーを除去したものである。除去するｒＲＮＡ配列としては、例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列、２８Ｓ ｒＲＮＡ配列、１２Ｓ ｒＲＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列、これらの組合せが挙げられる。
　ＮＳＲプライマーとしては、例えば、完全ランダムヘキサマーからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するヘキサマーを除外したものが挙げられる。また、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマーなどのプライマーセットからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するものを除外したものをＮＳＲプライマーとすることもできる。
　このようなＮＳＲプライマーを使うことにより、mRNA等を解析して感度を改善させることができる。
　ＮＳＲプライマーの詳細については、1) Amour et al., Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis, Nature Methods, Vol. 6, No. 9, 2009, pp. 647-649、2) Ozsolak et al., Digital transcriptome profiling from attomole-levelRNA samples, Genome Research, Vol. 20, 2010, pp. 519-525、3) 米国特許出願公開公報2010／0029511（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
　ＮＳＲプライマーは、その塩基配列がｒＲＮＡの塩基配列と完全に相補的でないように設計されているものの、一部のプライマーはｒＲＮＡと結合し得、逆転写産物には、鋳型ＲＮＡ由来のＤＮＡにｒＲＮＡ由来のＤＮＡが混入し得る。しかし、上記硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを用いることにより、ｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制できる。
　プライマーの長さは、アニーリングの観点から、例えば５塩基以上、好ましくは６塩基以上であり、合成の観点から、例えば３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２０塩基以下である。
　逆転写反応組成物において、プライマーの濃度は、特に制限されないが、例えば１～１０μＭ、好ましくは２～６μＭ、より好ましくは３～５μＭである。
（３）デオキシリボヌクレオチド
　デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが好ましい。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとしては、例えば、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、これらの誘導体、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物等が好ましい。
（４）逆転写酵素
　逆転写酵素は、逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）を有する任意のタンパク質（酵素）をいい、特に制限されないが、逆転写酵素活性を示すポリメラーゼが好ましい。また、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低いか、又はＲＮａｓｅ Ｈ活性がないものが好ましい。逆転写酵素の例としては、例えば、トリ骨髄芽球ウイルス(Avian Myeloblastosis Virus)逆転写酵素(AMV-RT)、モロニーネズミ白血病ウイルス(Moloney Murine Leukemia Virus)逆転写酵素(MMLV-RT)、ヒト免疫ウイルス(Human Immunovirus)逆転写酵素(HIV-RT)、EIRV-RT、RAV2-RT、C.ヒドロゲノホルマンス(C.hydrogenogormans)DNAポリメラーゼ、rTthDNAポリメラーゼ、スーパースクリプト(SuperScript)I、スーパースクリプト(SuperScript)II、これらの変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、MMLV-RTが好ましい。
（５）ＤＮＡポリメラーゼ
　逆転写反応組成物は、下記のＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよいし、含まなくてもよい：
Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、これらの変異体
（６）ＲＮａｓｅ阻害剤
　逆転写反応組成物は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、例えば、ヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質が挙げられる。
（７）添加剤
　逆転写反応組成物は、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、これら２種以上の組合せが挙げられる。
　緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、ギャプス（Ｃａｐｓ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
　塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
２－２．インキュベーション
　逆転写反応組成物のインキュベーションの条件は、鋳型ＲＮＡの逆転写が進行する限り特に制限されず、当該分野において知られている、いずれの条件も採用することができる。インキュベーションの温度は、例えば３０～６５℃、好ましくは３５～６０℃である。インキュベーションの時間は、例えば５～１２０分、好ましくは１０～６０分である。
２－３．鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法（ＲＴ－ＲａｍＤＡ法とも言う）において行われる場合
　ＲＴ－ＲａｍＤＡ法とは、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ　Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、ＲＮａｓｅ　Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖をＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素により無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ　Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ　Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法の詳細については、米国特許出願公開公報2017／0275685（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
　鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる場合、逆転写反応組成物は、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素を含む。
　ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素は、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素であることが好ましい。当該酵素としては、例えば、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、非特異的ＤＮＡ分解酵素を使用することができる。
　二本鎖特異的分解酵素（二本鎖特異的ヌクレアーゼ；ＤＳＮとも言う）は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、甲殻類由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。具体的な例としては、以下のものが挙げられる。
・ Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
・ Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ｄｓＤＮａｓｅ
・ Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
・ その他のＤＳＮホモログ
　二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。上記の中では、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体が好ましい。
　二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、dsDNase（ArcticZymes社）、Hl-dsDNase（ArcticZymes社）、dsDNase（Thermo scientific社）、Shrimp DNase、Recombinant（affymetrix社）、Atlantis dsDNase（Zymo Research社）、Thermolabile Nuclease（Roche社）などを挙げることができる。
　非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さず、好ましくは、一本鎖ＤＮＡを切断する活性がＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性に比較して低くなる酵素を挙げることができる。非特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。このような非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することもでき、例えば、ＤＮａｓｅＩ（Thermo Fisher社製、DNaseI）等を用いることが可能である。　非特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体、より好ましくはウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。
　上記改変体とは、天然由来のアミノ酸配列を改変することによって得られる酵素を意味する。具体的には、天然由来のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる酵素、並びに天然由来のアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなる酵素である。
　鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる場合、逆転写反応組成物は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含んでいてもよい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、通常、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素とともに使用される。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、Ｔ４ジーン３２プロテイン、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ（Single-Stranded DNA Binding Protein）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
　鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる場合、逆転写反応組成物のインキュベーションは、等温条件で行ってもよいし、熱サイクル条件で行ってもよい。
（１）等温条件
　インキュベーションを等温条件で行う場合、例えば２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度、好ましくは３０～４５℃の間の所定の温度、より好ましくは３５～４０℃の間の所定の温度、例えば３７℃で所定の時間（例えば５～１８０分、好ましくは１０～１５０分）行うことができる。
　２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは、２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～６０分）インキュベーションしてもよい。
　２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションの後、例えば５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でインキュベーションしてもよい。５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で５～１５分インキュベーションしてもよい。
（２）熱サイクル条件
　インキュベーションを熱サイクル条件で行う場合、例えば２０℃以上３０℃未満の間の所定の温度Ｔ１（例えば２５℃）と３０～４５℃の間の所定の温度Ｔ２（例えば３７℃）とを組み合わせて、Ｔ１で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とＴ２で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～４０サイクル、より好ましくは１５～３５サイクル繰り返して行ってもよい。なお、上記の熱サイクルに先立って、例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１～５分）インキュベーションしてもよい。また、上記の熱サイクルの後、例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）インキュベーションしてもよい。
２－４．鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＰＣＲ法において行われる場合
　鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＰＣＲ法において行われる場合、逆転写反応組成物のインキュベーションは、２－２．に記載された条件で行うことができ、その後、必要に応じて逆転写酵素を失活してもよい。逆転写の失活方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、９０～１００℃で所定時間（例えば１～１０分）インキュベーションする方法であってもよい。
　鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＰＣＲ法において行われる場合、鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法は、上記インキュベーションされた逆転写反応組成物（逆転写産物とも言う）に含まれるＤＮＡを増幅する工程を含む。ＤＮＡを増幅する工程は、典型的には、ＤＮＡ増幅用組成物を熱サイクル条件でインキュベーションする工程を含む。
　ＤＮＡ増幅用組成物には、逆転写産物をそのまま含有させてもよく、逆転写産物を水、好ましくはヌクレアーゼフリー水で希釈したものを含有させてもよい。例えば逆転写産物の質量が１／２０～１／３０になるように希釈してもよい。
　ＤＮＡ増幅用組成物は、逆転写産物に加えて、例えば、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。また、上記２－１．に記載した逆転写反応組成物がＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ増幅反応に必要な成分を含んでいる場合には、その逆転写反応組成物はそのままＤＮＡ増幅用組成物となり得、両組成物は相互に互換可能に呼称され得る。
　プライマーとしては、ＤＮＡ（ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを含む）に対して特異的なプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）が好ましい。
　デオキシリボヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼは、上記２－１．（３）及び（５）に記載したものと同様のものを使用することができる。
　ＤＮＡ増幅用組成物は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン（マグネシウムイオンなど）、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら２種以上の組合せを含んでいてもよい。
　熱サイクル条件でのインキュベーションは、例えば８０℃以上１００℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１０～３０秒）と５０～７０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば３０秒～２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～５０サイクル、より好ましくは１５～４０サイクル繰り返して行ってもよい。
３．硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを用いてｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制する方法
　上記硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを用いてｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制する方法は、典型的には、１０ｐｇ／μＬ以上の濃度で上記ポリマーが存在する条件下で鋳型ＲＮＡを逆転写する工程を含む。この工程により、鋳型ＲＮＡが特異的に逆転写され、鋳型ＲＮＡ由来のＤＮＡを特異的に合成でき、ｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制することができる。ｒＲＮＡは、好ましくは、１８Ｓ ｒＲＮＡ、２８Ｓ ｒＲＮＡ、１２Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡ、又はこれら２種以上の組合せである。逆転写の条件は、上記２－１．～２－４．に記載したとおりである。
＜ｒＲＮＡの逆転写を抑制するための組成物＞
　ｒＲＮＡの逆転写を抑制するための組成物は、上記硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを含有する。ｒＲＮＡの逆転写は、少なくともｒＲＮＡを含むＲＮＡ試料の逆転写であれば、特に制限されず、鋳型ＲＮＡ及びｒＲＮＡを含むＲＮＡ試料の逆転写であってもよい。鋳型ＲＮＡ及びｒＲＮＡを含むＲＮＡ試料は、細胞や組織から抽出されたＲＮＡ、細胞や組織からの抽出処理後に更に精製されたＲＮＡ等であってもよいが、好ましくは細胞から抽出されたＲＮＡである。このＲＮＡは、上記２－１．（１）に記載したものと同様のものを使用することができる。
　逆転写の条件は、例えば、上記２－２．～２－４．に記載した条件と同様の条件を採用することができる。
　ｒＲＮＡの逆転写を抑制するための組成物は、上記ポリマーに加え、上記２－１．、２－２．、及び２－３．に記載したような成分（特に、逆転写に必要な成分）を含んでいてもよい。
　ｒＲＮＡの逆転写を抑制するための組成物は、各成分の混合物の形態であってもよく、各成分を別々に備えたキットの形態であってもよい。
＜次世代シーケンシングに用いる逆転写反応物を調製するための逆転写反応組成物＞
　次世代シーケンシング（ＮＧＳ解析：ｎｅｘｔ―ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、次世代シーケンサー解析等ともいう）に用いる逆転写反応物を調製するための逆転写反応組成物は、上記硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを含有する。次世代シーケンシングとは、典型的には、数百万から数十億もの膨大なシーケンシング反応を同時に実施できる配列決定技術をいう。次世代シーケンシングとしては、例えば、エマルジョンＰＣＲやブリッジＰＣＲ等の増幅技術や１分子観察等の高感度検出技術を用いて並列的に配列解析する方法が挙げられる。次世代シーケンシングを行う装置（シークエンサー）としては、特に限定されないが、例えば、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ、ＮｏｖａＳｅｑ（イルミナ社）；Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｖ２．０、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）；ＭｉｎＩＯＮ、ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ（ナノポア社）等が挙げられる。次世代シーケンシングについては、例えば米国特許出願公開公報2014／178438（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）等に記載されている。
　本発明によれば、次世代シーケンシング等の大量の遺伝子発現解析においてノイズとなり得るｒＲＮＡからの逆転写反応物を効果的に抑制することが可能となる。ＮＧＳ解析では、１回の解析で得られるリード数に限りがあることが多く、無駄なｒＲＮＡ由来のＤＮＡのリードを減らすことが重要である。本発明によれば、解析を意図しないｒＲＮＡ由来のＤＮＡのリードを減らすことができ、有用なリード数（ｒＲＮＡ以外のリード数：遺伝子情報量）を増加させることできるので優れており、更にはＮＧＳ解析回数を減らすことも繋がりうるのでコスト面でも有益である。従って、本発明に従って調製された、ｒＲＮＡを含み得るＲＮＡ試料からの逆転写反応物は、次世代シーケンシングに供するのに好適である。ｒＲＮＡを含み得るＲＮＡ試料は、鋳型ＲＮＡ及びｒＲＮＡを含むＲＮＡ試料であってもよい。鋳型ＲＮＡ及びｒＲＮＡを含むＲＮＡ試料は、細胞や組織から抽出されたＲＮＡ、細胞や組織からの抽出処理後に更に精製されたＲＮＡ等であってもよいが、好ましくは細胞から抽出されたＲＮＡである。このＲＮＡは、上記２－１．（１）に記載したものと同様のものを使用することができる。
　逆転写の条件は、例えば、上記２－２．～２－４．に記載した条件と同様の条件を採用することができる。
　次世代シーケンシングに用いる逆転写反応物を調製するための逆転写反応組成物は、上記ポリマーに加え、上記２－１．、２－２．、及び２－３．に記載したような成分（特に、逆転写に必要な成分）を含んでいてもよい。
　次世代シーケンシングに用いる逆転写反応物を調製するための逆転写反応組成物は、各成分の混合物の形態であってもよく、各成分を別々に備えたキットの形態であってもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＲＴ－ＰＣＲ法におけるヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸によるｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成抑制の評価１
　本実施例では、ＲＴ－ＰＣＲ法においてヘパリンナトリウム（硫酸塩基を持つグリコサミノグリカン）、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（硫酸塩基を持つグリコサミノグリカン）、又はヒアルロン酸ナトリウム（硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基のいずれも持たないグリコサミノグリカン）が存在する場合のリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量を確認する目的で、以下の試験を行った。
　サンプル溶液に各ポリマーを添加なしか、２ｐｇ／μＬ～２ｎｇ／μＬの所定の濃度で添加し、逆転写反応により１本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ）にて、各ポリマーの添加によるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量への影響について解析を行った。具体的には、以下の手法によりｎ＝３の解析を行った。
　本実施例で用いる核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ　Ｓ３細胞よりＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１ｎｇを用いた。
　このＲＮＡ１０ｐｇの逆転写反応のために、本実施例で使用したサンプル溶液に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表１に示す。なお、ＮＳＲプライマー（ヘキサマー）は、Sigma社カスタムオリゴにて合成し、Ozsolak et al., Digital transcriptome profiling from attomole-levelRNA samples, Genome Research, Vol. 20, 2010, pp. 519-525に記載されたプライマー組成となるように混合して用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　精製ＲＮＡを上記組成に添加したサンプル溶液を用いて、逆転写反応を行った。この反応は３７℃３０分間反応させ、次いで５０℃５分間反応させた後、９５℃５分間反応を行うことで１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
　その後、以下の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にてＤＮＡ量の比較を行った。
　逆転写反応液をｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で希釈し、１／２５量をｑＰＣＲ反応に用いた。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
　ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μＬ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ　（東洋紡株式会社）、６ｐｍｏｌ　フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ　リバースプライマー、２μＬ　希釈逆転写反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。ｑＰＣＲはＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ解析システムを用いて行い、閾値はＲＦＵを１００に設定した。
　融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
　標的遺伝子としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるＡＣＴＢ及び１８Ｓ　リボソーマルＲＮＡであるＲＮＡ１８Ｓを使用した。
　各遺伝子のプライマーは、以下のとおりである。
　ＡＣＴＢ（ｍＲＮＡ）
　フォワードプライマー：ＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴ（配列番号１）
　リバースプライマー：ＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡ（配列番号２）
　ＲＮＡ１８Ｓ（リボソーマルＲＮＡ）
　フォワードプライマー：ＧＡＴＧＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣ（配列番号３）
　リバースプライマー：ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧ（配列番号４）
　解析結果のＣｔ値を用い、各ポリマーを諸濃度で添加した場合の平均Ｃｔ値（添加あり）から、ポリマーを添加していない場合の平均Ｃｔ値（添加なし）を引いたΔＣｔ値（添加あり－添加なし）を算出した。ＡＣＴＢの結果を表２に、ＲＮＡ１８Ｓの結果を表３に示す。さらにＲＮＡ１８ＳのΔＣｔ値から、ＡＣＴＢのΔＣｔ値を引くことによりΔΔＣｔ値を算出し、ＲＮＡ１８Ｓ特異的に逆転写を阻害しているか評価した。この結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ヘパリンナトリウム又はコンドロイチン硫酸ナトリウムを所定量以上添加した場合に、その添加量に概ね比例して、ｍＲＮＡであるＡＣＴＢにおけるΔＣｔ値に比べて、リボソーマルＲＮＡであるＲＮＡ１８ＳにおけるΔＣｔ値のほうが大きくなった。しかしこの効果は、ヘパリンナトリウム又はコンドロイチン硫酸ナトリウムの量が２ｐｇ／μＬと少ない場合には認められなかった。このことから、所定量以上のヘパリンナトリウム又はコンドロイチン硫酸ナトリウムの添加により、リボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量が低減することが確認された。またヒアルロン酸ナトリウムでは濃度依存的なΔＣｔ値およびΔΔＣｔ値の変化は認められなかった。
実施例２：ＲＴ－ＰＣＲ法におけるヘパリンによるｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成抑制の評価２
　本実施例では、実施例１で見られた、硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーによるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量の低減が、ランダムプライマーを用いた場合でも起こるのか確認する目的で、以下の試験を行った。
　サンプル溶液に各ポリマーを添加なしか、２ｐｇ／μＬ又は２０ｐｇ／μＬ濃度で添加し、逆転写反応により１本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ）にて、各ポリマーの添加によるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量の解析を行った。具体的には、以下の手法によりｎ＝２の解析を行った。
　本実施例で用いる核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ　Ｓ３細胞よりＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１ｎｇを用いた。
　このＲＮＡ１０ｐｇの逆転写反応のために、本実施例で使用したサンプル溶液に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　精製ＲＮＡを上記組成に添加したサンプル溶液を用いて、逆転写反応を行った。この反応は３７℃３０分間反応させ、次いで５０℃５分間反応させた後、９５℃５分間反応を行うことで１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
　その後、以下の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にてＤＮＡ量の比較を行った。
　逆転写反応液をｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で希釈し、１／２５量をｑＰＣＲ反応に用いた。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
　ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μＬ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ　（東洋紡株式会社）、６ｐｍｏｌ　フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ　リバースプライマー、２μＬ　希釈逆転写反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。ｑＰＣＲはＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ解析システムを用いて行い、閾値はＲＦＵを１００に設定した。
　融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
　標的遺伝子としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるＡＣＴＢ及び１８Ｓ　リボソーマルＲＮＡであるＲＮＡ１８Ｓを使用した。
　各遺伝子のプライマーは、実施例１と同じものを用いた。
　解析結果のＣｔ値を用い、ポリマーを諸濃度で添加した場合の平均Ｃｔ値（添加あり）から、ポリマーを添加していない場合の平均Ｃｔ値（添加なし）を引いたΔＣｔ値（添加あり－添加なし）を算出した。ＡＣＴＢの結果を表６に、ＲＮＡ１８Ｓの結果を表７に示す。さらにＲＮＡ１８ＳのΔＣｔ値から、ＡＣＴＢのΔＣｔ値を引くことによりΔΔＣｔ値を算出し、ＲＮＡ１８Ｓ特異的に逆転写を阻害しているか評価した。この結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ランダムプライマーを用いた場合であっても、２０ｐｇ／μＬのヘパリンナトリウムを共存させることで、ｍＲＮＡであるＡＣＴＢにおけるΔＣｔ値に比べて、リボソーマルＲＮＡであるＲＮＡ１８ＳにおけるΔＣｔ値のほうが大きくなった。このことから、所定量以上のヘパリンナトリウムの添加によりリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量が低減することが確認された。
実施例３：ＲＴ－ＰＣＲ法におけるコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸によるｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成抑制の評価３
　本実施例では、実施例２で見られた、ランダムプライマーを用いた場合に得られる効果が、他のポリマーを用いた場合でも得られるのか確認する目的で、以下の試験を行った。　本試験例では、硫酸塩基を持つグリコサミノグリカンとしてコンドロイチン硫酸ナトリウム（コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム）を使用し、また、比較のために硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基のいずれも持たないグリコサミノグリカンとしてヒアルロン酸ナトリウムを使用した。サンプル溶液に各ポリマーを添加なしか、５０ｎｇ／μＬ又は８００ｎｇ／μＬの濃度で添加し、逆転写反応により１本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ）にて、各ポリマーの添加によるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量の解析を行った。具体的には、以下の手法によりｎ＝２の解析を行った。
　本実施例で用いる核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ　Ｓ３細胞よりＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１ｎｇを用いた。
　このＲＮＡ１０ｐｇの逆転写反応のために、本実施例で使用したサンプル溶液に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　精製ＲＮＡを上記組成に添加したサンプル溶液を用いて、逆転写反応を行った。この反応は３７℃３０分間反応させ、次いで５０℃５分間反応させた後、９５℃５分間反応を行うことで１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
　その後、以下の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にてＤＮＡ量の比較を行った。
　逆転写反応液をｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で希釈し、１／２５量をｑＰＣＲ反応に用いた。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
　ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μＬ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ　（東洋紡株式会社）、６ｐｍｏｌ　フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ　リバースプライマー、２μＬ　希釈逆転写反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。ｑＰＣＲはＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ解析システムを用いて行い、閾値はＲＦＵを１００に設定した。
　融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
　標的遺伝子としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるＡＣＴＢ及び１８Ｓ　リボソーマルＲＮＡであるＲＮＡ１８Ｓを使用した。
　各遺伝子のプライマーは、実施例１と同じものを用いた。
　解析結果のＣｔ値を用い、各ポリマーを諸濃度で添加した場合の平均Ｃｔ値（添加あり）から、ポリマーを添加していない場合の平均Ｃｔ値（添加なし）を引いたΔＣｔ値（添加あり－添加なし）を算出した。ＡＣＴＢの結果を表１０に、ＲＮＡ１８Ｓの結果を表１１に示す。さらにＲＮＡ１８ＳのΔＣｔ値から、ＡＣＴＢのΔＣｔ値を引くことによりΔΔＣｔ値を算出し、ＲＮＡ１８Ｓ特異的に逆転写を阻害しているか評価した。この結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　実施例２の結果と同様に、ランダムプライマーを用いる場合であっても、コンドロイチン硫酸ナトリウムの添加量に比例して、ｍＲＮＡであるＡＣＴＢにおけるΔＣｔ値に比べて、リボソーマルＲＮＡであるＲＮＡ１８ＳにおけるΔＣｔ値のほうが大きくなった。このことから、所定量以上のコンドロイチン硫酸ナトリウムの添加によりリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量が低減することが確認された。一方、硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基のいずれも持たないヒアルロン酸ナトリウムでは８００ｎｇ／μＬの終濃度であってもΔＣｔ値およびΔΔＣｔ値の有意な変化は認められなかった。
実施例４：ＲＴ－ＰＣＲ法におけるポリビニルスルホン酸によるｒＲＮＡ由来のＤＮＡ合成抑制の評価
　本実施例では、ＲＴ－ＰＣＲ法におけるポリビニルスルホン酸（ＰＶＳＡ）ナトリウム（スルホン酸塩基を持つポリマー）によるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量を確認する目的で、以下の試験を行った。
　サンプル溶液にＰＶＳＡを添加なしか、２０ｐｇ／μＬ～２０ｎｇ／μＬの濃度で添加し、逆転写反応により１本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ）にて、各ポリマーの添加によるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量の解析を行った。具体的には、以下の手法によりｎ＝３の解析を行った。
　本実施例で用いる核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ　Ｓ３細胞よりＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１ｎｇを用いた。なお、ＮＳＲプライマー（ヘキサマー）は、Sigma社カスタムオリゴにて合成し、Ozsolak et al., Digital transcriptome profiling from attomole-levelRNA samples, Genome Research, Vol. 20, 2010, pp. 519-525に記載されたプライマー組成となるように混合して用いた。反応液量は９μＬとした。
　このＲＮＡ１０ｐｇの逆転写反応のために、本実施例で使用したサンプル溶液に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　精製ＲＮＡを上記組成に添加したサンプル溶液を用いて、逆転写反応を行った。この反応は３７℃３０分間反応させ、次いで５０℃５分間反応させた後、９５℃５分間反応を行うことで１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
　その後、以下の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にてＤＮＡ量の比較を行った。
　逆転写反応液をｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で希釈し、１／２５量をｑＰＣＲ反応に用いた。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
　ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μＬ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ　（東洋紡株式会社）、６ｐｍｏｌ　フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ　リバースプライマー、２μＬ　希釈逆転写反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。ｑＰＣＲはCFX96リアルタイムPCR解析システムを用いて行い、閾値はＲＦＵを１００に設定した。
　融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
　標的遺伝子としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるＡＣＴＢ及び１８Ｓ　リボソーマルＲＮＡであるＲＮＡ１８Ｓを使用した。
　各遺伝子のプライマーは、実施例１と同じものを用いた。
　解析結果のＣｔ値を用い、各ポリマーを諸濃度で添加した場合の平均Ｃｔ値（添加あり）から、ポリマーを添加していない場合の平均Ｃｔ値（添加なし）を引いたΔＣｔ値（添加あり－添加なし）を算出した。ＡＣＴＢの結果を表１４に、ＲＮＡ１８Ｓの結果を表１５に示す。さらにＲＮＡ１８ＳのΔＣｔ値から、ＡＣＴＢのΔＣｔ値を引くことによりΔΔＣｔ値を算出し、ＲＮＡ１８Ｓ特異的に逆転写を阻害しているか評価した。この結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　ＰＶＳＡナトリウムの添加量に比例して、ｍＲＮＡであるＡＣＴＢにおけるΔＣｔ値に比べて、リボソーマルＲＮＡであるＲＮＡ１８ＳにおけるΔＣｔ値が大きくなった。またこの結果はランダムプライマーであってもＮＳＲプライマーであっても認められ、ランダムプライマーで特に強かった。このことから、ＰＶＳＡナトリウムの添加によりリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量が低減することが確認された。
実施例５：ＲＴ－ＲａｍＤＡ法におけるヘパリンによるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成抑制
　本実施例では、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法におけるヘパリンナトリウムによるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成量を確認する目的で、以下の試験を行った。
　サンプル溶液にヘパリンナトリウムを添加し、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法により１本鎖ｃＤＮＡの合成を行った後、ライブラリー調製を行い、ＮＧＳ解析によってリボソーマルＲＮＡ率を算出した。具体的には、以下の手法により行った。
　本実施例で用いる核酸断片サンプルは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１０ｐｇを用いた。
　このＲＮＡ１０ｐｇをＲＴ－ＲａｍＤＡ法に供するために、本実施例で使用したサンプル溶液に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表１７に示す。なお、ＮＳＲプライマー（ヘキサマー）は、Sigma社カスタムオリゴにて合成し、Ozsolak et al., Digital transcriptome profiling from attomole-levelRNA samples, Genome Research, Vol. 20, 2010, pp. 519-525に記載されたプライマー組成となるように混合して用いた。反応液量は９μＬとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　精製ＲＮＡを上記組成に添加したサンプル溶液を用いて、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行った。この方法では２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃３０分、５０℃５分、及び８５℃５分で反応を行った。
　その後、得られたｃＤＮＡ溶液９μＬを用いてＧｅｎＮｅｘｔ（登録商標）ＲａｍＤＡ－ｓｅｑ（登録商標）　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（東洋紡株式会社）の２ｎｄ　ｓｔｒａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ、２ｎｄ　ｓｔｒａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｅｎｚｙｍｅ、及び２ｎｄ　ｓｔｒａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘを用いて２本鎖ｃＤＮＡを生成した。その後Ｎｅｘｔｅｔａ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてライブラリーを調製し、ＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｖ３（１５０　Ｃｙｃｌｅｓ）（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてＭｉＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）によりＮＧＳ（次世代シーケンシング）を実施した。手順は取扱い説明書に従った。解析はｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｂａｓｅｓｐａｃｅ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用い、リード中のリボソーマルＲＮＡの割合を算出した。手順は取扱い説明書に従った。
　その結果を表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表１８のＮｕｍｂｅｒ　ｏｆ　Ｒｅａｄｓは得られた総リードの数である。％Ｔｏｔａｌ　Ａｌｉｇｎｅｄは総リード中のリボソーマルＲＮＡを含むリファレンスゲノム（ＵＣＳＣ　ｍｍ１０）と一致したリードの割合を示しており、％ＡｂｕｎｄａｎｔはリボソーマルＲＮＡの割合を示す。％Ａｂｕｎｄａｎｔ／％Ｔｏｔａｌ　Ａｌｉｇｎｅｄはリファレンスゲノムと一致したリード中のリボソーマルＲＮＡの割合を示す。
　ヘパリンナトリウムを添加した条件では添加していない条件に比べ、％Ａｂｕｎｄａｎｔ／％Ｔｏｔａｌ　Ａｌｉｇｎｅｄの割合が低下しており、リボソーマルＲＮＡの割合が減少している。
　よって、ヘパリンナトリウムなどの硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーによるリボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成の抑制は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法およびＮＧＳ解析においても利用できることが確認された。

Claims (12)

  1. 　鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法において、逆転写反応液中に硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを１０ｐｇ／μＬ以上の濃度で存在させることにより、リボソーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ合成を抑制する方法。
  2. 　前記ポリマーが、硫酸化グルコサミノグリカン、ポリビニルスルホン酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ポリマーが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　逆転写反応液中の前記ポリマーの濃度が、１０ｐｇ／μＬかつ１μｇ／μＬ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記逆転写が、ランダムプライマーを用いて行われる、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記ランダムプライマーの塩基配列が、リボソーマルＲＮＡの塩基配列と完全に相補的でない、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記逆転写が、ＲＴ－ＰＣＲ法又はＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 　前記鋳型ＲＮＡが細胞から抽出されたＲＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 　硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを含有し、逆転写反応液における該ポリマー濃度が１０ｐｇ／μＬ以上となるような量で用いられる、リボソーマルＲＮＡの逆転写を抑制するための組成物。
  10. 　硫酸基、スルホン基、及びこれらの塩型基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を持つポリマーを１０ｐｇ／μＬ以上含有する、次世代シーケンシング用の逆転写反応物を調製するための逆転写反応組成物。
  11. 　前記逆転写が、ＲＴ－ＰＣＲ法又はＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる、請求項９又は１０に記載の組成物。
  12. 　キットの形態である、請求項９又は１０に記載の組成物。
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