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WO2024143555A1 - 細胞分化度の調節方法 - Google Patents

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WO2024143555A1
WO2024143555A1 PCT/JP2023/047341 JP2023047341W WO2024143555A1 WO 2024143555 A1 WO2024143555 A1 WO 2024143555A1 JP 2023047341 W JP2023047341 W JP 2023047341W WO 2024143555 A1 WO2024143555 A1 WO 2024143555A1
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WO
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cells
differentiation
cell
gene
degree
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PCT/JP2023/047341
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English (en)
French (fr)
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直也 ▲高▼山
スーディップ クマール ポール
彰宏 中島
イジン リュウ
壮 中村
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Chiba University NUC
Kyoto University NUC
Original Assignee
Chiba University NUC
Kyoto University NUC
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Publication date
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Priority to JP2024567994A priority patent/JPWO2024143555A1/ja
Priority to CN202380089354.5A priority patent/CN120641558A/zh
Priority to AU2023415203A priority patent/AU2023415203A1/en
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • Non-Patent Documents 1 and 2 In methods using hematopoietic progenitor cells derived from umbilical cord blood or bone marrow blood, neutrophils, macrophages, etc. can be obtained by adding growth factors (see Non-Patent Documents 1 and 2), but the proliferation of umbilical cord blood and bone marrow blood itself is limited and there is a large difference between lots, making it difficult to prepare large quantities of cells of uniform quality.
  • Non-Patent Documents 3 to 7 the maximum number of cells in a 250 mL culture system is 10 8 (see Non-Patent Document 8). From the viewpoints of both drug screening and cell therapy, the number of cells is significantly insufficient with conventional techniques, and it is essential to develop a more efficient induction method.
  • the present invention aims to provide a novel method for regulating cell differentiation in order to establish a stable production system for cells such as mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, and lymphocytes, neutrophils, macrophages, basophils, and dendritic cells.
  • cells such as mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, and lymphocytes, neutrophils, macrophages, basophils, and dendritic cells.
  • the degree of cell differentiation can be regulated by forcibly expressing the MYC family genes and the BMI1 gene in mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, and lymphocytes with any degree of differentiation, as well as in megakaryocytes and bone marrow cells with a high degree of differentiation, and thus completed the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • [1] (i) mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, and lymphocytes having any degree of differentiation, and (ii) megakaryocytes and myelocytes having a high degree of differentiation
  • the method includes a step of forcibly expressing a MYC family gene and a BMI1 gene.
  • a method for regulating the degree of cell differentiation [2] The method according to [1], wherein the cells are mesenchymal stem cells having any degree of differentiation.
  • [3] The method according to [1] or [2], wherein the cells are mesenchymal stem cells that do not express the CD90 cell surface marker.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the cells are mesenchymal stem cells expressing the cell surface marker CD90.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the cells are vascular endothelial cells having any degree of differentiation.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the cells are smooth muscle cells having any degree of differentiation.
  • [7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the cells are vascular smooth muscle cells having any degree of differentiation.
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the cells are vascular smooth muscle cells that express a cell surface marker, CD140b, KDR, or CD34.
  • step 1 further comprises forcibly expressing the BCL-XL gene in bone marrow cells having a high degree of differentiation.
  • step 3 further comprises suppressing forced expression of the BCL-XL gene in the cells obtained in step 2.
  • step 1 further comprises suppressing expression of CDKN1A gene and/or p53 gene, or a function of an expression product thereof, in bone marrow cells having a high degree of differentiation.
  • mesenchymal stem cells with a high degree of differentiation (CD90-/CD73+, or CD90-/CD105+) can account for around 90% of live cells. Furthermore, when the degree of differentiation of mesenchymal stem cells decreases, the expression of the cell surface marker CD90 increases. That is, mesenchymal stem cells having a low degree of differentiation express the cell surface marker CD90, and may also express the cell surface markers CD73 and CD105.
  • vascular smooth muscle cells may be obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells such as iPS cells or ES cells of mammals such as humans, and are induced during the process of inducing a net-like structure from ES cells or iPS cells.
  • vascular smooth muscle cells can be obtained by isolating CD34-/VEGFR(KDR)+ vascular smooth muscle progenitor cells contained in the net-like structure using a cell sorter and continuing to culture them.
  • Induction of neural crest cells can be confirmed by subjecting the cultured cells to flow cytometry analysis to detect the appearance of cells with the cell surface marker expression pattern characteristic of neural crest cells, as described below, or by subjecting the cells to a colony formation assay to confirm that they have the ability to differentiate into neural crest cells.
  • Neural crest cells can differentiate into neurons, osteoblasts, chondrocytes, myoblasts, Schwann cells, glial cells, teeth, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, melanocytes, etc.
  • Lymphocytes are a type of white blood cell, and can be classified into natural killer cells, B cells, T cells, and the like.
  • Lymphocytes can be characterized by the expression of cell surface markers such as CD45, CD56, and CD19.
  • CD45 is a cell surface marker expressed by all blood cells except red blood cells and platelets
  • CD56 is a cell surface marker characteristic of natural killer cells
  • CD19 is a cell surface marker characteristic of B cells.
  • natural killer cells are characterized by the expression of CD45 and CD56
  • B cells are characterized by the expression of CD45 and CD19.
  • Megakaryocytes refer to cells capable of producing platelets, and may also be called erythroid progenitor cells (megakaryocyte-erythrocyte progenitors: MEPs). Megakaryocytes may be CD41a-positive, CD41b-positive, or CD42b-positive cells.
  • Megakaryocytes may be obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells such as iPS cells or ES cells using methods well known to those skilled in the art.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells or ES cells
  • hematopoietic progenitor cells contained in a net-like structure induced from pluripotent stem cells such as human ES cells or iPS cells can be isolated using a cell sorter and cultured under megakaryocyte-inducing conditions (on feeder cells in the presence of TPO, SCF, and heparin) to obtain megakaryocytes (WO 2008/041370, Takayama Blood 2008, 111(11):5298-5306).
  • MYC and BMI1 can be forcibly expressed in hematopoietic progenitor cells contained in a net-like structure induced from pluripotent stem cells such as human ES cells or iPS cells, and immortalized megakaryocytes can be obtained by culturing them under megakaryocyte-inducing conditions (on feeder cells, in the presence of TPO, SCF, and heparin), and mature megakaryocytes can be obtained by stopping the expression of MYC and BMI1 in these immortalized megakaryocytes (WO 2011/034073).
  • Megakaryocytes are a type of blood cell and can be derived from bone marrow cells (hematopoietic stem cells), etc.
  • Hematopoietic stem cells can differentiate into hematopoietic progenitor cells, which can differentiate into blood cells such as red blood cells, granulocytes, monocytes, macrophages, megakaryocytes, and platelets.
  • granulocytes include myelocytes, promyelocytes, metamyelocytes, myeloblasts, band cells, and segmented cells (neutrophils, eosinophils, basophils, etc.).
  • the "megakaryocyte precursor cells” may be megakaryocyte-erythroid precursor cells (MEPs).
  • Megakaryocytes can be characterized by expression of cell surface markers, e.g., CD41 and CD42b, in flow cytometric analysis.
  • cell surface markers e.g., CD41 and CD42b
  • the degree of differentiation of megakaryocytes can be characterized by the cell surface marker expression pattern. For example, as the degree of differentiation of megakaryocytes increases, the expression of cell surface markers CD41 and CD42b increases. That is, megakaryocytes with a high degree of differentiation may express cell surface markers CD41 and CD42b. Megakaryocytes with a high degree of differentiation may be megakaryocytes with CD41+/CD42b+ in flow cytometry analysis. Furthermore, as the degree of differentiation of megakaryocytes decreases, the expression of cell surface marker CD42b decreases. That is, megakaryocytes with a low degree of differentiation may be CD41+ and may not express cell surface marker CD42b. Megakaryocytes with a low degree of differentiation may be megakaryocytes with CD41+/CD42b-.
  • Induction of myelocytes can be confirmed by subjecting the cultured cells to flow cytometry analysis to detect the appearance of cells with the cell surface marker expression pattern characteristic of myelocytes described below, or by subjecting the cells to a colony formation assay to confirm that they have the ability to differentiate into myelocytes.
  • Myelocytes are a type of blood cell and can be derived from bone marrow cells (hematopoietic stem cells), etc.
  • Hematopoietic stem cells can differentiate into hematopoietic progenitor cells, which can differentiate into blood cells such as red blood cells, granulocytes, monocytes, macrophages, megakaryocytes, and platelets.
  • granulocytes include myelocytes, promyelocytes, metamyelocytes, myeloblasts, band cells, and segmented cells (neutrophils, eosinophils, basophils, etc.).
  • the "differentiated myeloid cells” may be myelocytes, segmented nucleocytes (neutrophils, eosinophils, basophils, etc.), monocytes, macrophages, etc.
  • Myeloid cells can be characterized by expression of cell surface markers, e.g., CD11b, CD43, CD16, and CD14, in flow cytometric analysis.
  • cell surface markers e.g., CD11b, CD43, CD16, and CD14
  • the method for regulating the degree of differentiation of a cell may further include a step of extracting (isolating or purifying) cells having a particular desired degree of differentiation.
  • the extraction of cells at a particular degree of differentiation may be carried out before or after the forced expression of the MYC family gene and the BMI1 gene.
  • this extraction process may be performed before forced expression of the MYC family genes and the BMI1 gene, and the MYC family genes and the BMI1 gene may be forced expression in the extracted cells of a particular degree of differentiation (e.g., cells with a high degree of differentiation).
  • a cell population containing cells with a desired specific degree of differentiation e.g., cells with a low degree of differentiation
  • cells with a desired specific degree of differentiation e.g., cells with a low degree of differentiation
  • MYC family genes and BMI1 genes may be forcibly expressed in the extracted cells with a specific degree of differentiation.
  • the cells to be extracted are only a single type of mesenchymal stem cells, only vascular endothelial cells, or only smooth muscle cells, but a cell population containing a mixture of two or more of these types of cells may also be used.
  • Examples of cells to be extracted include mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, lymphocytes, megakaryocytes, bone marrow cells, etc. Extraction of the target cells can be performed by methods well known to those skilled in the art, such as flow cytometry analysis, panning, magnetic beads, etc., using an antibody against a cell surface marker that is specifically expressed (or not expressed) in the cell.
  • Extraction of mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, lymphocytes, megakaryocytes, and bone marrow cells can be performed by isolating cells that satisfy the above-mentioned cell surface marker expression pattern.
  • the target cells can be isolated so that the percentage of the target cells contained in the cell population after the extraction operation is, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more (e.g., 100%).
  • Single cells of the target cells may be isolated.
  • the method of regulating the degree of cell differentiation of the present invention may further comprise a step of forcibly expressing the BCL-XL gene in mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, lymphocytes, and megakaryocytes and myelocytes having a desired degree of differentiation.
  • a step of forcibly expressing the BCL-XL gene in mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, lymphocytes, and megakaryocytes and myelocytes having a desired degree of differentiation By expressing the BCL-XL gene in addition to the MYC family genes and the BMI1 gene, it is expected that the regulation of the degree of cell differentiation to a low degree of differentiation can be further promoted.
  • the period of the forced expression of the BCL-XL gene can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the BCL-XL gene is a gene that has the function of suppressing cell apoptosis.
  • the forced expression of the MYC family gene, the BMI1 gene, and/or the BCL-XL gene may be carried out simultaneously or sequentially.
  • a MYC family gene and a BMI1 gene may be forcedly expressed, followed by forced expression of a BCL-XL gene, to obtain cells whose differentiation degree has been adjusted to a low level.
  • a MYC family gene, a BMI1 gene, and a BCL-XL gene may be forcedly expressed simultaneously to obtain cells whose differentiation degree has been adjusted to a low level.
  • genes such as MYC family genes, BMI1 gene, and BCL-XL gene are forcibly expressed in cells
  • any method known to those skilled in the art may be used.
  • the genes may be introduced into cells and expressed using a gene introduction system using a viral vector such as lentivirus, retrovirus, or Sendai virus, or a non-viral vector such as a plasmid vector or an episomal vector.
  • a viral vector such as lentivirus, retrovirus, or Sendai virus
  • a non-viral vector such as a plasmid vector or an episomal vector.
  • a method of non-virally incorporating a target gene into the genome of a cell using a transposon, establishing a stable expression cell line, and then removing the unnecessary introduced gene by transposonase may also be used.
  • differentiation of the pluripotent stem cell into the target cell may be induced from the pluripotent stem cell (e.g., an ES cell, an iPS cell) into which an expression cassette of a desired gene (e.g., a MYC family gene and a BMI1 gene, and optionally further a BCL-XL gene) has been previously incorporated, while forcibly expressing the gene.
  • a desired gene e.g., a MYC family gene and a BMI1 gene, and optionally further a BCL-XL gene
  • the gene may be operably linked downstream of a suitable promoter, which may be inserted into a gene transfer vector and introduced into a cell to express the target gene.
  • the promoter may be an exogenous promoter.
  • the "endogenous" promoter of a gene means a promoter that is naturally linked to the gene in the genome
  • the "exogenous” promoter of a gene means a promoter that is artificially placed in the vicinity of the gene by genetic manipulation (i.e., molecular biological techniques) so that the transcription of the gene is directed by the operably linked promoter.
  • "operably” linked means that the promoter and the target gene are linked so that the target gene is controlled in cis by the promoter and the desired expression of the target gene is realized.
  • the exogenous promoter may be a constitutive promoter or a regulatable promoter. Examples of constitutive promoters include CMV promoter, EF1 promoter, and ubiquitin promoter.
  • the target gene can be inducibly expressed by control such as by adding a drug.
  • control such as by adding a drug.
  • a person skilled in the art can easily select an appropriate system to realize the desired expression control of the MYC family gene, the BMI1 gene, the BCL-XL gene, etc.
  • a commercially available kit or the like may be used.
  • the target genes for expression control, MYC family gene, the BMI1 gene, and the BCL-XL gene may be inserted into separate vectors or may be inserted into the same vector.
  • the MYC family genes, BMI1 gene, and BCL-XL gene promote the regulation of cell differentiation to a low degree of differentiation, but may inhibit the terminal differentiation of differentiated cells (e.g., adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, macrophages, dendritic cells, neutrophils, erythrocytes), so the expression of these genes may be suppressed before the terminal differentiation process begins.
  • differentiated cells e.g., adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, macrophages, dendritic cells, neutrophils, erythrocytes
  • Inhibition of the expression of MYC family genes, BMI1 gene, BCL-XL gene, etc. in cells may be achieved, for example, by removing the drug or the like that releases the induction of expression by a drug-inducible expression system using the aforementioned regulatable promoter.
  • the introduced MYC family genes, BMI1 gene, BCL-XL gene, etc. may be removed using a Cre/lox system or the like to inhibit the expression of these genes.
  • Commercially available kits, etc. may also be used as appropriate to inhibit the expression of MYC family genes, BMI1 gene, BCL-XL gene, etc.
  • the method of regulating the degree of cell differentiation according to the present invention may comprise the step of suppressing the expression of at least one of the CDKN1A gene and the p53 gene, or the function of its expression product, in mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, and lymphocytes having any degree of differentiation, as well as in megakaryocytes and bone marrow cells having a high degree of differentiation.
  • expression is used as a concept including transcription and translation, and inhibiting expression may include inhibition at the transcription level and inhibition at the translation level.
  • suppressing the expression of the CDKN1A gene and/or p53 gene, or the function of the expression product thereof is expected to further improve the regulation of the degree of cell differentiation (regulation to a low degree of differentiation).
  • siRNA is typically a double-stranded oligo-RNA consisting of an RNA having a sequence complementary to the nucleotide sequence or a partial sequence of the mRNA of a target gene and its complementary strand.
  • the length of siRNA is usually about 19 to 30 bases, preferably about 21 to 25 bases.
  • the nucleotide sequence of these RNAs can be appropriately designed by those skilled in the art based on the sequence information of the gene whose expression is to be suppressed.
  • shRNA can also be used instead of siRNA.
  • Antisense nucleic acid refers to a nucleic acid that contains a nucleotide sequence capable of specifically hybridizing with a target mRNA (mature mRNA or initial transcription product) under physiological conditions in a cell expressing the target mRNA, and that, in the hybridized state, is capable of inhibiting the translation of a polypeptide encoded by the target mRNA.
  • Antisense nucleic acids are generally single-stranded nucleic acids that are 10 to 100 bases long, preferably 15 to 30 bases long.
  • the type of antisense nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a chimera of DNA and RNA.
  • the nucleotide sequence of an antisense nucleic acid can be appropriately designed by a person skilled in the art based on the sequence information of the gene whose expression is to be suppressed.
  • the target cell may be transfected with an expression vector (e.g., a viral vector) of an expression-inhibiting nucleic acid for a desired gene (e.g., CDKN1A gene, p53 gene), or the target cell may be induced from a pluripotent stem cell (e.g., ES cell, iPS cell) into which an expression cassette of an expression-inhibiting nucleic acid for a desired gene (e.g., CDKN1A gene, p53 gene) has been incorporated in advance, and the siRNA, shRNA or antisense nucleic acid may be forced to be expressed at that stage.
  • an expression vector e.g., a viral vector
  • an expression-inhibiting nucleic acid for a desired gene e.g., CDKN1A gene, p53 gene
  • a pluripotent stem cell e.g., ES cell, iPS cell
  • an expression cassette of an expression-inhibiting nucleic acid for a desired gene
  • the expression-inhibiting nucleic acid may be forced to be expressed, and differentiation from the pluripotent stem cell into a target cell may be induced.
  • a pluripotent stem cell e.g., ES cell, iPS cell
  • an expression cassette of an expression-inhibiting nucleic acid for a desired gene e.g., CDKN1A gene, p53 gene
  • constitutive promoters include polIII promoters such as U6 promoter, H1 promoter, tRNA promoter, retroviral LTR promoter, adenovirus VA1 promoter, 5S rRNA promoter, 7SK RNA promoter, and 7SL RNA promoter, when expressing relatively small RNA such as siRNA or shRNA.
  • the nucleic acid encoding the expression-inhibiting nucleic acid for the CDKN1A gene and the nucleic acid encoding the expression-inhibiting nucleic acid for the p53 gene may be inserted into separate expression vectors or into the same expression vector.
  • a MYC family gene e.g., c-Myc gene
  • BMI1 gene e.g., BMI1 gene
  • BCL-XL gene e.g., BMI1 gene
  • BMI1 gene e.g., BMI1 gene
  • BCL-XL gene e.g., BMI1 gene
  • BMI1 gene e.g., BMI1 gene
  • BCL-XL gene e.g., BMI1 gene, and BCL-XL gene
  • sequence shown in SEQ ID NO:1 is the following sequence. atgcccctca acgttagctt caccaacagg aactatgacc tcgactacga ctcggtgcag ccgtatttct actgcgacga ggaggagaac ttctaccagc agcagcagca gagcgagctg cagcccccgg cga ggatatctgg aagaaattcg agctgctgcc caccccgcccc ctgtcccta gccgcctcccta gccgccgctcccta gcgcgctccctctacgttgcggt cacacccttc tcttcgggggt cacaccctc tcttcggg gagacaa
  • a cDNA consisting of a sequence substantially identical to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is a DNA consisting of a sequence in which one or more, for example 1 to 10, preferably several, for example 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2 bases in the sequence shown in SEQ ID NO:2 have been deleted, substituted, or added, and the protein encoded by this DNA inhibits the cell cycle.
  • a homolog of the CDKN1A gene is a gene whose cDNA sequence is substantially identical to, for example, the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • a cDNA substantially identical to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is a DNA having an identity of about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, for example, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, and even more preferably about 90% or more, for example, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, and most preferably about 99% or more, to the DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 4, or a DNA capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA or RNA having a sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a protein encoded by these DNAs inhibits the cell cycle.
  • the sequence shown in SEQ ID NO:4 is the following sequence. atgtggggag tattcaggag acagacaact cactcgtcaa atcctccct tcctggccaa caaagctgct gcaaccacag ggatttcttc tgttcaggcg ccatgtcaga accggctggg gatgtccgtc agaacccatg cggcagcaag gcctgccgcc gcc gcc gcc gccgg cccagtggac agcgagcagc tgagccgcga ctgtgatgcg ctaatggcgg gctgcatcca ggaggccccaccgag acaccactgg agggtgactt cgctgagcaccactgg agggt
  • the p53 gene is a gene whose cDNA sequence is substantially identical to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • a cDNA substantially identical to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is a DNA having an identity of about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, for example, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, and even more preferably 90% or more, for example, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, and most preferably about 99% or more, to the DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 5, or a DNA capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA having a sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a protein encoded by the DNA suppresses cancer.
  • stringent conditions refer to hybridization conditions that can be easily determined by one of skill in the art, and are generally empirical experimental conditions that depend on the base length of the nucleic acid, washing temperature, and salt concentration. In general, the longer the base, the higher the temperature for proper annealing, and the shorter the base, the lower the temperature. Hybridization generally depends on the ability of complementary strands to reanneal in an environment slightly below their melting point.
  • low stringency conditions include washing the filter after hybridization in a 0.1x SSC, 0.1% SDS solution at temperatures between 37°C and 42°C.
  • High stringency conditions include washing the filter at 65°C in 5x SSC and 0.1% SDS.
  • the method for producing mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neural crest cells, lymphocytes, megakaryocytes, or myelocyte precursor cells according to this embodiment includes a step of culturing the cells obtained by the method for regulating the degree of cell differentiation according to this embodiment described above (culturing step).
  • Precursor cells refers to cells in the process of differentiation from cells capable of proliferation to differentiated cells, which are the final differentiated form.
  • the type of the fourth exogenous promoter may be the same as or different from the first exogenous promoter and/or the second exogenous promoter, but preferably the first, second and fourth exogenous promoters are the same type of promoter.
  • the MYC family genes, the BMI1 gene and the BCL-XL gene can be expressed synchronously, and the expression can be suppressed synchronously.
  • the first, second and fourth exogenous promoters are preferably the same regulatable promoter (e.g., drug-responsive promoter), and more preferably all are tetracycline-responsive promoters.
  • ⁇ Cytokine 1 X-VIVO10 + 10% BSA + 50ng/ml human Flt3 + 50ng/ml human SCF + 20ng/ml IL-7 + 20ng/ml IL-15
  • ⁇ Cytokine 2 X-VIVO10 + 10% BSA + 50ng/ml human Flt3 + 50ng/ml human SCF + 20ng/ml IL-7 + 20ng/ml IL-15 + 20ng/ml IL-2 + 50ng/ml TPO
  • ⁇ Cytokine 3 X-VIVO10 + 10% BSA + 50ng/ml human Flt3 + 50ng/ml human SCF + 20ng/ml IL-7 + 20ng/ml IL-15 + 20ng/ml IL-2 + 50ng/ml TPO + 10pg/ml GM-CSF + 250pg/ml G-CSF + 50pg/ml IL-6 ⁇ Cytokine 4: Day 0-9: X-VI
  • Example 7-3 Co-culture of immortalized vascular endothelial cells or recombinant DLL4 with iPS cell-derived human hematopoietic stem cells
  • the immortalized vascular endothelial cells used in this test were vascular endothelial cells whose proliferation was improved by introducing MBX according to Example 2, which were then cultured for 7 days in a dox-off condition to obtain mature vascular endothelial cells, and then irradiated to stop the proliferation. 1 ml of 0.1% gelatin was added to the wells of a 6-well plate and incubated for 30 minutes at 37°C.
  • a doxycycline-inducible c-MYC+BMI1+BCLXL (MBX) viral vector was added, and doxycycline was further added at 1 ⁇ g/ml, and all were cultured at 37°C and 5.0% CO 2 . Thereafter, the culture was continued while replacing half of the medium every 2 to 3 days. After that, the cells were stained with CD45-BV421 and CD19-PC7, which are cell surface markers for B cells, and CD45+/CD19+ cells were analyzed with FACS Canto II (FIG. 33).
  • vascular endothelial cells were seeded at 2-3 x 10 ⁇ 5 cells/well in basal medium (IMDM + 15% FBS + 10 ⁇ g/ml human insulin + 5.5 ⁇ g/ml transferrin + 5 ng/ml sodium selenium + 2 mM L-glutamine + 0.45 mM ⁇ -monothioglycerol + 50 ⁇ l/ml ascorbic acid + 20 ng/ml VEGF) and cultured at 37°C and CO 2 5.0%.
  • basal medium IMDM + 15% FBS + 10 ⁇ g/ml human insulin + 5.5 ⁇ g/ml transferrin + 5 ng/ml sodium selenium + 2 mM L-glutamine + 0.45 mM ⁇ -monothioglycerol + 50 ⁇ l/ml ascorbic acid + 20 ng/ml VEGF
  • iPS-derived human hematopoietic stem cells were seeded in basal medium for iPS cell-derived hematopoietic progenitor cells (IMDM + 15% FBS + 10 ⁇ g/ml human insulin + 5.5 ⁇ g/ml transferrin + 5 ng/ml sodium selenium + 2 mM L-glutamine + 0.45 mM ⁇ -monothioglycerol + 50 ⁇ l/ml ascorbic acid + 50 ng/ml human Flt3L + 50 ng/ml human SCF + 20 ng/ml IL-7 + 20 ng/ml IL-15).
  • Doxycycline-inducible c-MYC+BMI1+BCLXL (MBX) viral vector was added, and doxycycline was further added at 1 ⁇ g/ml, and all were cultured at 37°C and CO 2 5.0%.
  • IL-3 was administered at 20 ng/ml only for the first week. After that, the culture was continued while replacing half of the medium every 2 to 3 days. Then, the cells were stained with CD45-BV421, CD56-FITC, and CD19-PC7, and CD45+/CD56+ cells and CD45+/CD19+ cells were analyzed with FACS Canto II ( Figure 34).
  • CD45-BV421 and CD56-FITC are cell surface markers for natural killer cells
  • CD45-BV421 and CD19-PC7 are cell surface markers for B cells. The composition of each medium used for culture is shown below.
  • the percentages of the CD45+/CD56+ cell population and the CD45+/CD19+ cell population were higher when ECs were co-cultured with imsenescent vascular endothelial cells (im EC) than when ECs were not co-cultured with imsenescent vascular endothelial cells (feeder free).
  • co-culturing with imaging vascular endothelial cells can promote the differentiation of hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells into natural killer cells or B cells, and also promote the differentiation of hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells into lymphocyte progenitor cells, which are intermediate cells prior to differentiation into natural killer cells or B cells.

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Abstract

本発明は、（ｉ）任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、並びに（ｉｉ）高分化度を有する巨核球、及び骨髄球からなる群から選択される細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、細胞分化度の調節方法に関する。

Description

細胞分化度の調節方法
　本発明は広く、細胞分化度の調節方法等に関する。
　中胚葉由来の組織である骨、血管、心筋胞等は、間葉系幹細胞から各系列の前駆細胞を経由して分化する。間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などの中胚葉由来の組織を産生する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は、骨髄や、脂肪、歯髄等の組織に存在する。また、末梢の血液細胞は、造血幹細胞から各系列の造血前駆細胞を経由して分化する。骨髄系共通前駆細胞は、血小板、赤血球、さらにリンパ球以外の白血球細胞（好中球、マクロファージ、好塩基球、樹状細胞など）を産生する造血前駆細胞である。定常状態では骨髄中に存在するが、外傷時や感染時などに必要に応じて分化し、成熟血液細胞を供給する。産生される好中球、マクロファージ、好塩基球、樹状細胞などは、自然免疫の主役であり、各種病原生物からの防御、腫瘍や変性した自己の細胞の排除、アレルギー反応、急性、慢性炎症に寄与する。
　これらの細胞は、炎症・アレルギーに対する薬剤のスクリーニング、体内異物を除去するための細胞療法のソースとして期待される。従来の技術では、臍帯血、骨髄血、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞などから、試験管内で分化誘導する方法が取られてきたが、いずれの手技も煩雑であり、また大量の細胞を準備することが困難である。
Jie Z, Zhang Y, Wang C, Shen B, Guan X, Ren Z, et al. Large-scale ex vivo generation of human neutrophils from cord blood CD34+ cells. PLoS One. 2017;12(3). Caux C, Vanbervliet B, Massacrier C, Dezutter-Dambuyant C, De Saint-Vis B, Jacquet C, et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNFα. J Exp Med. 1996;184(2):695-706. Lachmann N, Ackermann M, Frenzel E, Liebhaber S, Brennig S, Happle C, et al. Large-scale hematopoietic differentiation of human induced pluripotent stem cells provides granulocytes or macrophages for cell replacement therapies. Stem Cell Reports. 2015; Hiramoto T, Ebihara Y, Mizoguchi Y, Nakamura K, Yamaguchi K, Ueno K, et al. Wnt3a stimulates maturation of impaired neutrophils developed from severe congenital neutropenia patient-derived pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(8):3023-8. Sweeney CL, Teng R, Wang H, Merling RK, Lee J, Choi U, et al. Molecular Analysis of Neutrophil Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells Delineates the Kinetics of Key Regulators of Hematopoiesis. Stem Cells. 2016;34(6):1513-26. Takata K, Kozaki T, Lee CZW, Thion MS, Otsuka M, Lim S, et al. Induced-Pluripotent-Stem-Cell-Derived Primitive Macrophages Provide a Platform for Modeling Tissue-Resident Macrophage Differentiation and Function. Immunity. 2017;47(1):183-198.e6. Cao X, Yakala GK, van den Hil FE, Cochrane A, Mummery CL, Orlova V V. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 2019;12(6):1282-97. Ackermann M, Kempf H, Hetzel M, Hesse C, Hashtchin AR, Brinkert K, et al. Bioreactor-based mass production of human iPSC-derived macrophages enables immunotherapies against bacterial airway infections. Nat Commun. 2018;9(1). Combination of immortalization and inducible death strategies to generate a human mesenchymal stromal cell line with controlled survival. Bourgine P, Le Magnen C, Pigeot S, Geurts J, Scherberich A, Martin I. Stem Cell Res. 2014 Mar;12(2):584-98
　臍帯血、骨髄血由来造血前駆細胞を用いた手法では、増殖因子を加えることで、好中球、マクロファージなどが得られるが（非特許文献１、２参照）、臍帯血、骨髄血自体の増殖が有限であり、且つロット差が大きく、均一な質の細胞を大量に準備することが困難である。
　ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を用いた手法では、ＥＳ／ｉＰＳ細胞自体はほぼ無限に増殖可能であるが、分化誘導法が煩雑であり、且つ、血液細胞への誘導効率が悪く、臨床応用レベルでの大量供給は困難である（非特許文献３～７参照）。例えば報告されているヒトｉＰＳ細胞からのマクロファージ分化では、２５０ｍＬの培養系で、１０８細胞が限度である（非特許文献８参照）。薬剤スクリーニング、細胞療法いずれの観点からも従来の技術では、細胞数が大幅に不足しており、より効率の良い誘導法の開発が必須である。
　骨髄球系の不死化細胞株としては、白血病患者から培養により低確率で樹立した細胞株は存在するが、白血病変異遺伝子が恒常的に発現した細胞であり、正常分化が不可能であり、成熟細胞を用いて行う薬剤スクリーニングは不可能である。また、ガン化のリスクがあり、細胞療法のソースとしては使用できない。
　間葉系幹細胞系の不死化細胞株としては、ヒト骨髄由来間葉系間質細胞からhTERTを強制発現させることで作製した細胞株は存在するが（非特許文献９）、骨髄穿刺が必要であり、侵襲性の問題がある。当該論文では、任意の分化段階のＭＳＣを若返らせる（より未分化の状態にする）という記載はなく、前駆細胞へ若返らせる能力の有無については示されていない。
　かかる事情に鑑み、本発明は、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、好中球、マクロファージ、好塩基球、樹状細胞などの細胞の安定した産生系の確立のために、新規な細胞分化の調節方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、並びに高分化度を有する巨核球、及び骨髄球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させることで、細胞分化度を調節できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本願発明は以下の発明を包含する。
［１］
　（ｉ）任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、並びに
　（ｉｉ）高分化度を有する巨核球、及び骨髄球
からなる群から選択される細胞において、
ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、
細胞分化度の調節方法。
［２］
　前記細胞が、任意の分化度を有する間葉系幹細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現しない間葉系幹細胞である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　前記細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　前記細胞が、任意の分化度を有する血管内皮細胞である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記細胞が、任意の分化度を有する平滑筋細胞である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
　前記細胞が、任意の分化度を有する血管平滑筋細胞である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
　前記細胞が、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、又はＣＤ３４の細胞表面マーカーを発現する血管平滑筋細胞である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
　前記細胞が、任意の分化度を有する神経堤細胞である、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
　前記細胞が、任意の分化度を有するリンパ球である、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
　前記細胞が、ＣＤ４１及びＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーを発現する巨核球である、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
　前記細胞が、ＣＤ１４及びＣＤ１１ｂの細胞表面マーカーを発現する骨髄球である、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
　ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程をさらに含む、［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びＰ５３遺伝子の少なくともいずれかの発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
　［１］～［１６］のいずれかに記載の方法で得られた細胞を培養する工程を含む、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の前駆細胞の製造方法。
［１８］
　［１］～［１６］のいずれかに記載の方法で得られた細胞を分化する工程を含む、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の分化細胞の製造方法。
［１９］
　［１］～［１８］のいずれかに記載の方法で得られた細胞。
［２０］
　［１］～［１８］のいずれかに記載の方法で得られた細胞を含む、医薬組成物。
［２１］
　［１９］に記載の細胞、又は［２０］に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
［２２］
　ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含む、
　（ｉ）任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、並びに
　（ｉｉ）高分化度を有する巨核球、及び骨髄球
からなる群から選択される細胞用の、細胞分化調節剤。
［２３］
　以下の工程を含む、マクロファージを製造する方法：
１）高分化度を有する骨髄球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程、
２）工程１で得られた細胞を培養し、増殖させる工程、
３）工程２で得られた細胞におけるＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現を抑制し、マクロファージ分化条件下で更に培養することにより、マクロファージへの分化及び成熟を促進する工程。
［２４］
　工程１が、高分化度を有する骨髄球において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させることをさらに含む、［２３］に記載の方法。
［２５］
　工程３が、工程２で得られた細胞におけるＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現を抑制することを更に含む、［２３］又は［２４］に記載の方法。
［２６］
　工程１が、高分化度を有する骨髄球において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制することを更に含む、［２３］～［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］
　任意の分化度を有する間葉系幹細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する間葉系幹細胞の製造方法。
［２８］
　任意の分化度を有する間葉系幹細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現しない間葉系幹細胞である、［２７］に記載の製造方法。
［２９］
　任意の分化度を有する間葉系幹細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞である、［２７］又は［２８］に記載の製造方法。
［３０］
　増殖能を有する間葉系幹細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現する、［２７］～［２９］のいずれか１項に記載の製造方法。
［３１］
　任意の分化度を有する血管内皮細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する血管内皮細胞の製造方法。
［３２］
　任意の分化度を有する平滑筋細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する平滑筋細胞の製造方法。
［３３］
　任意の分化度を有する平滑筋細胞が、血管平滑筋細胞である、［３２］に記載の製造方法。
［３４］
　血管平滑筋細胞が、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、又はＣＤ３４の細胞表面マーカーを発現する血管平滑筋細胞である、［３３］に記載の製造方法。
［３５］
　任意の分化度を有する神経堤細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する神経堤細胞の製造方法。
［３６］
　任意の分化度を有するリンパ球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有するリンパ球の製造方法。
［３７］
　ＣＤ４１及びＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーを発現する巨核球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する巨核球の製造方法。
［３８］
　ＣＤ１４及びＣＤ１１ｂの細胞表面マーカーを発現するマクロファージにおいて、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有するマクロファージの製造方法。
［３９］
　不老化血管内皮細胞、及び、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞を共培養する工程を含む、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞の、リンパ球細胞又はリンパ球前駆細胞への分化を促進する方法。
［４０］
　リンパ球細胞が、ＣＤ４５及びＣＤ５６、又は、ＣＤ１９及びＣＤ４５の細胞表面マーカーを発現する、［３９］に記載の方法。
［４１］
　リンパ球細胞が、ナチュラルキラー細胞又はB細胞である、［３９］又は［４０］に記載の方法。
［４２］
　造血幹細胞又は造血前駆細胞が、臍帯血又はｉＰＳ細胞由来である、［３９］～［４１］のいずれかに記載の方法。
［４３］
　不老化血管内皮細胞がＮｏｔｃｈリガンドを発現している、［３９］～［４２］のいずれかに記載の方法。
［４４］
　ＮｏｔｃｈリガンドがＤＬＬ４及び／又はＪａｇｇｅｄ　１である、［４３］に記載の方法。
　本発明によれば、任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、並びに高分化度を有する巨核球、及び骨髄球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させることで、細胞分化度を調節することが可能になる。
　本発明によれば、さまざまなｉＰＳ細胞から高効率に間葉系、巨核球系、又は骨髄球系の不死化細胞株に誘導可能であることから異物特異的抗原を標的としたレセプター導入したｉＰＳ細胞、標的細胞への細胞毒性を強める遺伝子改変をしたｉＰＳ細胞、免疫拒絶反応を抑えたＨＬＡ　ｎｕｌｌ　ｉＰＳ細胞、遺伝性疾患ｉＰＳ細胞を用いることで、より生理的であり、薬剤スクリーニング、細胞療法、双方で優位性が期待できる。
図１は、間葉系幹細胞の細胞増殖性の評価結果を示す。 図２は、間葉系幹細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図３は、間葉系幹細胞をＣＤ９０－細胞とＣＤ９０＋細胞に分離し、ＭＢを強制発現して培養したときのフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図４は、間葉系幹細胞の細胞増殖性をＤｏｘ　ｏｎ時とＤｏｘ　ｏｆｆ時で比較した結果を示す。 図５は、間葉系幹細胞のＤｏｘ　ｏｎ時及びＤｏｘ　ｏｆｆ時のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図６は、間葉系幹細胞の終末分化誘導の結果を示す。 図７は、血管内皮細胞の細胞増殖性の評価結果を示す。 図８は、血管内皮細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図９は、血管内皮細胞の形態観察の結果を示す。 図１０は、血管内皮細胞の免疫染色の結果を示す。 図１１は、血管内皮細胞のマーカー発現の結果を示す。 図１２は、血管平滑筋細胞の細胞増殖性の評価結果を示す。 図１３は、血管平滑筋細胞の免疫染色の結果を示す。 図１４は、血管平滑筋細胞を前駆細胞リプログラミングする実験の模式図を示す。 図１５は、図１４の実験における、血管平滑筋細胞の形態観察の結果を示す。 図１６は、図１４の実験における、血管平滑筋細胞の細胞増殖性の評価結果を示す。 図１７－１は、図１４の実験における、血管平滑筋細胞のフローサイトメトリー解析（ＣＤ１４０ｂ）の結果を示す。 図１７－２は、図１４の実験における、血管平滑筋細胞のフローサイトメトリー解析（ＫＤＲ）の結果を示す。 図１７－３は、図１４の実験における、血管平滑筋細胞のフローサイトメトリー解析（ＣＤ３４）の結果を示す。 図１８は、図１４の実験における、血管平滑筋細胞の免疫染色の結果を示す。 図１９は、神経堤細胞の形態観察の結果を示す。 図２０は、神経堤細胞の細胞増殖性の評価結果を示す。 図２１は、神経堤細胞のフローサイトメトリー解析（ＣＤ２７１）の結果を示す。 図２２は、神経堤細胞のフローサイトメトリー解析（ＣＤ２７１）の結果を示す。 図２３は、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎコーティングが神経堤細胞に与える影響の評価結果を示す。 図２４は、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋細胞の細胞増殖性の評価結果を示す。 図２５は、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図２６は、ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋細胞の細胞増殖性の評価結果を示す。 図２７は、ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図２８は、巨核球および骨髄球（マクロファージ）の細胞増殖性の評価結果およびフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図２９は、ｄｏｘ　ｏｎにした不老化血管内皮細胞、ｄｏｘ　ｏｆｆにした不老化血管内皮細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、及びヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＰＣＡ（主成分分析）の結果を示す。 図３０は、ｄｏｘ　ｏｎにした不老化血管内皮細胞、ｄｏｘ　ｏｆｆにした不老化血管内皮細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、及びヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の、ＤＬＬ４及びＪａｇｇｅｄ　１の発現解析の結果を示す。 図３１は、不老化血管内皮細胞とＣＤ３４陽性臍帯血細胞とを共培養した場合の、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図３２は、不老化血管内皮細胞とＣＤ３４陽性臍帯血細胞とを共培養した場合の、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋細胞の細胞増殖性の評価結果を示す。 図３３は、ｉＰＳ細胞由来ヒト造血幹細胞を不老化血管内皮細胞又は遺伝子組換え型ＤＬＬ４と共培養した場合の、ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図３４は、ＩＬ－３を投与して、不老化血管内皮細胞とｉＰＳ細胞由来ヒト造血幹細胞とを共培養した場合の、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
　本実施形態に係る細胞分化度の調節方法は、任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、高分化度を有する巨核球、骨髄球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の発現量を変動させる（例、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の発現を抑制する）工程を含む。任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、高分化度を有する巨核球、骨髄球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させることにより、強制発現させる前と比較して、低分化度の細胞（間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、骨髄球）を得ることができる。高分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、骨髄球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させることにより、強制発現前と比較して、低分化度の細胞（間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、骨髄球）を得ることができる。低分化度の細胞は増殖能を有し得る。また、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現により得られた低分化度の細胞（間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、骨髄球）におけるＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の発現を抑制することにより、該発現抑制前と比較して、高分化度の細胞（間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、骨髄球）を得ることができる。
　「分化度」または「細胞分化度」という場合、細胞の分化のレベルや程度、成熟の度合いを意味する。
　細胞分化度は、細胞表面マーカーの発現量や程度に基づいて判断されてもよい。例えば、細胞が発現する細胞表面マーカーの発現量を検出して、分化度を判断してもよい。
　細胞分化度は、相対的に判断されてもよい。例えば、ある細胞の分化過程において、ある分化度を有する細胞と、当該細胞とは異なる分化度を有する細胞とがある場合に、両細胞が有する分化度を比較して、相対的に低分化度を有する細胞であるか、相対的に高分化度を有する細胞であるか、が判断されてもよい。細胞の分化度が相対的に判断される場合において、分化度の判断は、細胞表面マーカーの発現の量や程度に基づいてなされてもよい。
　本実施形態において、「任意の分化度を有する」又は「高分化度を有する」細胞は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から誘導することにより製造してもよく、本発明の細胞分化度を調節する方法により製造してもよい。
　本実施形態において、細胞分化度の調節は、細胞増殖（性）の向上であってもよく、細胞増殖の低下であってもよく、細胞増殖の向上及び低下を含んでいてもよい。すなわち、細胞増殖の低下は、細胞分化度を高分化度とする調節であり得て、細胞増殖の向上は、細胞分化度を低分化度とする調節であり得る。
１－１．間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）
　「間葉系幹細胞」とは、間葉系に属する細胞への分化能を有する幹細胞をいう。間葉系幹細胞には、脂肪間質細胞や、脂肪幹細胞を含んでよい。
　間葉系幹細胞は、当業者に周知の方法によりｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得てもよい。例えば、Ｆｕｋｕｔａら（ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１４，９（１２）：ｅ１１２２９１）の報告に従い、ｉＰＳ細胞を、マトリジェルコートした培養皿上で、ＳＢ－４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１存在下で培養することにより、神経堤細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔ　Ｃｅｌｌ：ＮＣＣ）を誘導し、そのＮＣＣを、フィブロネクチンコートした培養皿上で、ＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＳＢ－４３１５４２を含む培地中で培養することにより、ＮＣＣを増幅し、さらに、そのＮＣＣを、フィブロネクチンコートした培養皿上で、１０％ＦＢＳ及びＦＧＦ２を含む培地中で培養することにより、ＭＳＣを誘導することができる。
　間葉系幹細胞が誘導されたことは、培養した細胞をフローサイトメトリー解析に付して、後述の間葉系幹細胞に特徴的な細胞表面マーカー発現パターンを有する細胞の出現を検出するか、コロニー形成アッセイに付して、間葉系幹細胞の分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。
　間葉系幹細胞は、血管内皮細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、骨髄間質細胞、腱細胞、肝細胞、胆管上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、リンパ管内皮細胞等へと分化することができる。
　本実施形態において、「間葉系幹細胞の前駆細胞」とは、骨血管内皮細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、骨髄間質細胞、腱細胞、肝細胞、胆管上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、リンパ管内皮細胞からなる群から選択される細胞の前駆細胞であってもよい。
　本実施形態において、「間葉系幹細胞の分化細胞」は、血管内皮細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、骨髄間質細胞、腱細胞、肝細胞、胆管上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、リンパ管内皮細胞からなる群から選択される細胞であってもよい。
　間葉系幹細胞は、例えば、ＣＤ９０、ＣＤ７３、及びＣＤ１０５の細胞表面マーカーの発現により特徴付けることができる。
　間葉系幹細胞は、フローサイトメトリー解析において、細胞表面マーカー発現パターンによりその分化度を特徴付けることができる。例えば、間葉系幹細胞は、分化度が高まると、ＣＤ９０の細胞表面マーカーの発現が減少する。すなわち、高分化度を有する間葉系幹細胞は、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現しておらず、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の細胞表面マーカーを発現していてもよい。一態様において、高分化度を有する間葉系幹細胞は、フローサイトメトリー解析において、ＣＤ９０－、ＣＤ９０－／ＣＤ７３＋、又はＣＤ９０－／ＣＤ１０５＋の間葉系幹細胞である。ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞からの間葉系幹細胞の樹立から、継代を重ねると、徐々に分化が進んで幹細胞性（増殖性）が低下し、１０継代を超えると、高分化度を有する間葉系幹細胞（ＣＤ９０－／ＣＤ７３＋、又はＣＤ９０－／ＣＤ１０５＋）は生細胞の９０％前後となり得る。また、間葉系幹細胞は、分化度が低まると、ＣＤ９０の細胞表面マーカーの発現が増加する。すなわち、低分化度を有する間葉系幹細胞は、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現しており、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の細胞表面マーカーを発現していてもよい。一態様において、低分化度を有する間葉系幹細胞は、フローサイトメトリー解析において、ＣＤ９０＋、ＣＤ９０＋／ＣＤ７３＋、又はＣＤ９０＋／ＣＤ１０５＋の間葉系幹細胞である。別の態様において、低分化度を有する間葉系幹細胞は、フローサイトメトリー解析において、ＣＤ９０－／ＣＤ７３＋、又はＣＤ９０－／ＣＤ１０５＋の分画が生細胞の１０％以上の検出を有しない間葉系幹細胞であってもよい。
１－２．血管内皮細胞
　「血管内皮細胞」とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞をいう。血管内皮細胞のうち、血液細胞に分化する能力を持つ胎児期の細胞を、造血性内皮細胞という。
　生体における造血メカニズムには、幹細胞に由来する血液細胞が供給される造血メカニズムの他に、血管内皮細胞の発生により血液細胞が供給される造血メカニズムが知られている。
　血管内皮細胞は、ＶＥ－カドヘリン（ＶＥ－ｃａｄ）陽性、ＣＤ４１陽性、ＣＸＣＲ４陽性の細胞であり得る。血管内皮細胞は、例えば、ＥＳ細胞、又はｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞由来の細胞であってもよく、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からネット様構造物を誘導する過程で、誘導される。
　ネット様構造物をヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等のヒト多能性幹細胞から調製するために適した細胞の培養条件は、用いる多能性幹細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子及びサプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ネット様構造物を効率的に形成させるために、ＶＥＧＦを０～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ程度加えるのがよい。培養の環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、例えば、５％ＣＯ２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、多能性幹細胞の種類や誘導条件によって異なるが、一般的には、多能性幹細胞をフィーダー細胞（例、１０Ｔ１／２細胞）上に播いてから、７日後くらいまでに造血内皮細胞を含む細胞塊が形成され、１４～１６日後くらいまでに、血管内皮前駆細胞や造血前駆細胞を含むネット様構造物が形成される。
　形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、血管内皮前駆細胞や造血前駆細胞が濃縮された状態で存在している。細胞塊に含まれる造血内皮細胞やネット様構造物の内部に存在する血管内皮前駆細胞や造血前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナー等）に通すことにより、分離することができる。そして、ＣＤ３４＋血管内皮前駆細胞をセルソーターで単離し、ＶＥＧＦ存在下で引き続き培養を継続することにより、血管内皮細胞を得ることができる。
　血管内皮細胞が誘導されたことは、培養した細胞をフローサイトメトリー解析に付して、後述の血管内皮細胞に特徴的な細胞表面マーカー発現パターンを有する細胞の出現を検出するか、コロニー形成アッセイに付して、血管内皮細胞の分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。
　血管内皮細胞は、例えば、ＶＥ－ｃａｄ、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６等の細胞表面マーカーの発現により特徴付けることができる。
　血管内皮細胞は、フローサイトメトリー解析において、細胞表面マーカー発現パターンによりその分化度を特徴付けることができる。例えば、血管内皮細胞は、分化度が高まると、ＶＥ－ｃａｄ、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６等の細胞表面マーカーの発現が増加する。すなわち、高分化度を有する血管内皮細胞は、ＶＥ－ｃａｄ、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６等の細胞表面マーカーを発現していてもよい。一態様において、高分化度を有する血管内皮細胞は、フローサイトメトリー解析において、ＶＥ－ｃａｄ＋／ＣＤ３１＋の血管内皮細胞であってもよく、ＣＤ１０５及びＣＤ１４６からなる群から選択される１又は２の細胞表面マーカーを更に発現していてもよく、好ましくは、ＶＥ－ｃａｄ＋／ＣＤ３１＋／ＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋である。また、血管内皮細胞は、分化度が低まると、ＶＥ－ｃａｄ、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６等の細胞表面マーカーの発現が減少する。すなわち、低分化度を有する血管内皮細胞は、ＶＥ－ｃａｄ、ＣＤ３１、ＣＤ１０５及びＣＤ１４６からなる群から選択される１、２、３又は４の細胞表面マーカーを発現していなくてもよい。一態様において、低分化度を有する血管内皮細胞は、フローサイトメトリー解析において、ＶＥ－ｃａｄ＋／ＣＤ３１＋であってもよく、ＣＤ１０５及びＣＤ１４６からなる群から選択される１又は２の細胞表面マーカーを発現しない血管内皮細胞であってもよい。
１－３．平滑筋細胞
　「平滑筋細胞」とは、平滑筋を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞（例えば、平滑筋前駆細胞、平滑筋幹細胞など）をいう。また、「平滑筋細胞」とは、例えば、血管平滑筋細胞、消化管平滑筋細胞、膀胱平滑筋細胞、子宮平滑筋細胞等であってもよい。
　平滑筋細胞の中でも、血管平滑筋細胞は、ヒト等の哺乳動物のｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得てもよく、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からネット様構造物を誘導する過程で、誘導される。ネット様構造物に含まれるＣＤ３４－／ＶＥＧＦＲ（ＫＤＲ）＋血管平滑筋前駆細胞をセルソーターで単離し、引き続き培養を継続することにより、血管平滑筋細胞を得ることができる。血管平滑筋細胞が得られたことは、培養した細胞をフローサイトメトリー解析に付して、後述の血管平滑筋細胞に特徴的な細胞表面マーカー発現パターンを有する細胞の出現を検出するか、コロニー形成アッセイに付して、血管内皮細胞の分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。
　平滑筋細胞は、間葉系幹細胞、神経堤細胞、骨髄細胞等に由来し得る。平滑筋細胞は、分化型平滑筋細胞と脱分化型平滑筋細胞が知られる。分化型平滑筋細胞と脱分化型平滑筋細胞は、当業者に周知の遺伝子発現パターンにより確認することができる。
　本実施形態において、「平滑筋細胞の前駆細胞」とは、前述した間葉系幹細胞の前駆細胞であってもよい。本実施形態において、「平滑筋細胞の分化細胞」とは、分化型平滑筋細胞又は脱分化型平滑筋細胞であってもよい。
　平滑筋細胞は、例えば、ＶＥＧＦＲ（ＫＤＲ）、Ｃａｌｐｏｎｉｎ、及びαＳＭＡのマーカーの発現により特徴付けることができる。
　平滑筋細胞は、上述のマーカーの発現パターンによりその分化度を特徴付けることができる。例えば、血管平滑筋細胞は、分化度が高まると、Ｃａｌｐｏｎｉｎ、αＳＭＡ等のマーカーの発現が増加する。すなわち、高分化度を有する血管平滑筋細胞は、Ｃａｌｐｏｎｉｎ、αＳＭＡ等のマーカーを発現していてもよい。一態様において、高分化度を有する血管平滑筋細胞は、フローサイトメトリー解析において、Ｃａｌｐｏｎｉｎ＋／αＳＭＡ＋の血管平滑筋細胞であってもよく、Ｃａｌｐｏｎｉｎ及び／又はαＳＭＡのマーカーを更に発現していてもよい。
　平滑筋細胞は、上記マーカーの他、当業者に周知の細胞表面マーカーの発現によっても特徴付けることができるが、平滑筋細胞の中でも、血管平滑筋細胞は、例えばＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、ＣＤ３４等の細胞表面マーカーの発現により特徴付けることができる。
　血管平滑筋細胞は、フローサイトメトリー解析において、細胞表面マーカー発現パターンによりその分化度を特徴付けることができる。例えば、血管平滑筋細胞は、分化度が高まると、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、ＣＤ３４等の細胞表面マーカーの発現が増加する。すなわち、高分化度を有する血管平滑筋細胞は、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、ＣＤ３４等の細胞表面マーカーを発現していてもよい。一態様において、高分化度を有する血管平滑筋細胞は、フローサイトメトリー解析において、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、及びＣＤ３４からなる群から選択される１、２又は３の細胞表面マーカーを更に発現していてもよい。また、血管平滑筋細胞は、分化度が低まると、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、ＣＤ３４等の細胞表面マーカーの発現が減少する。すなわち、低分化度を有する血管平滑筋細胞は、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、及びＣＤ３４からなる群から選択される１、２又は３の細胞表面マーカーを発現していなくてもよい。一態様において、低分化度を有する血管平滑筋細胞は、フローサイトメトリー解析において、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、及びＣＤ３４からなる群から選択される１、２又は３の細胞表面マーカーを発現しない血管平滑筋細胞であってもよい。
１－４．神経堤細胞
　神経堤細胞とは、遊走性の幹細胞であり、発生の過程で一時的に生じる神経堤という細胞集団由来の細胞のことをいう。
　神経堤細胞は、当業者に周知の方法によりｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得てもよい。例えば、Ｆｕｋｕｔａら（ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１４，９（１２）：ｅ１１２２９１）の報告に従い、ｉＰＳ細胞を、マトリジェルコートした培養皿上で、ＳＢ－４３１５４２等のＡＬＫ５阻害剤及びＣＨＩＲ９９０２１等のＧＳＫ３阻害剤存在下で培養することにより、神経堤細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔ　Ｃｅｌｌ：ＮＣＣ）を誘導することができる。また、神経堤細胞の培養において、細胞の固定や成長を促進するために、培養皿やｗｅｌｌ等をＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングしてもよい。神経堤細胞の培養において、細胞の成長を促進するために、培地にＥＧＦやＦＧＦ２等の成長因子を加えてもよい。一態様において、ＳＢ－４３１５４２等のＡＬＫ５阻害剤、ＥＧＦ及びＦＧＦ２を含む培地中で神経堤細胞を培養する。
　神経堤細胞が誘導されたことは、培養した細胞をフローサイトメトリー解析に付して、後述の神経堤細胞に特徴的な細胞表面マーカー発現パターンを有する細胞の出現を検出するか、コロニー形成アッセイに付して、神経堤細胞の分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。
　神経堤細胞は、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、シュワン細胞、グリア細胞、歯、骨格筋細胞、平滑筋細胞、メラニン細胞等へと分化することができる。
　本実施形態において、「神経堤細胞の前駆細胞」とは、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、シュワン細胞、グリア細胞、歯、骨格筋細胞、平滑筋細胞、及びメラニン細胞からなる群から選択される細胞の前駆細胞であってよい。
　神経堤細胞は、例えば、ＣＤ２７１等の細胞表面マーカーの発現により特徴付けることができる。
　神経堤細胞は、フローサイトメトリー解析において、細胞表面マーカー発現パターンによりその分化度を特徴付けることができる。例えば、神経堤細胞は、分化度が高まると、ＣＤ２７１等の細胞表面マーカーの発現が減少する。すなわち、高分化度を有する神経堤細胞は、ＣＤ２７１等の細胞表面マーカーを発現しない神経堤細胞であってもよい。また、神経堤細胞は、分化度が低まると、ＣＤ２７１等の細胞表面マーカーの発現が増加する。すなわち、低分化度を有する神経堤細胞は、ＣＤ２７１等の細胞表面マーカーを発現する神経堤細胞であってよく、高分化度を有する神経堤細胞よりも、更にＣＤ２７１等の細胞表面マーカーを発現する神経堤細胞であってよい。
　培養における、培養皿やｗｅｌｌ等のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎによるコーティングの有無は、神経堤細胞の増殖や、ＣＤ２７１等の細胞表面マーカーの発現に影響しなくてもよい。
１－５．リンパ球
　リンパ球とは、白血球の一種であり、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞等に分類することができる。
　リンパ球は、当業者に周知の方法により、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞等から分化誘導して得ることができる。リンパ球を分化誘導する際、不老化血管内皮細胞をフィーダー細胞として多能性幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞等と共培養したり、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、Ｊａｇｇｅｄ　１等のＮｏｔｃｈ　リガンドで、多能性幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞等をコーティングしたりすることで、より高効率で、リンパ球を分化誘導することができる。また、リンパ球の分化誘導は、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ７等のサイトカイン存在下で実施することが好ましい。
　従って、本実施形態は、不老化血管内皮細胞、及び、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞を共培養する工程を含む、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞の、リンパ球細胞又はリンパ球前駆細胞への分化を促進する方法、をも提供する。
　該不死化血管内皮細胞は、本発明の細胞分化度の調節方法において、血管内皮細胞に、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子（並びに、任意的にＢＣＬ－Ｘ１遺伝子）を強制発現させることにより得られる増殖能を有する血管内皮細胞であり得る。該増殖能を有する血管内皮細胞は、強制発現させる前と比較して低分化度の細胞であり得る。該増殖能を有する血管内皮細胞における強制発現したＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子（並びに、任意的にＢＣＬ－Ｘ１遺伝子）を停止させて分化誘導した成熟血管内皮細胞も、不死化血管内皮細胞に包含される。
　細胞の分化には、Ｎｏｔｃｈと、Ｎｏｔｃｈ　リガンド（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ４（以下、ＤＬＬ４）やＪａｇｇｅｄ　１等）との相互作用によって伝達されるＮｏｔｃｈシグナルが必要であることが知られているが、上記共培養に用いる不老化血管内皮細胞は、Ｎｏｔｃｈ　リガンド、例えば、ＤＬＬ４及び／又はＪａｇｇｅｄ　１を発現していてもよい。不老化血管内皮細胞が、ｎｏｔｃｈシグナル伝達に必要な、ＤＬＬ４及び／又はＪａｇｇｅｄ　１を発現することで、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞の、リンパ球細胞又はリンパ球前駆細胞への分化を促進することができる。不老化血管内皮細胞がＤＬＬ４及び／又はＪａｇｇｅｄ　１を発現することで、広く様々な細胞への分化を促進することができるため、本実施形態の方法は、不老化血管内皮細胞、及び、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞を共培養する工程を含む、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞の、任意の細胞への分化を促進する方法であってもよい。
　共培養に用いるｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞は、予め所望の遺伝子（例、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子、任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の発現カセットを組み込んだものであってよく、当該遺伝子を強制発現させながら、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞から、対象細胞への分化を誘導してもよい。その場合、不老化した対象細胞を分化誘導することができる。
　共培養に用いる造血幹細胞又は造血前駆細胞は、生物から採取されたもの、例えば臍帯血、骨髄、末梢血由来であってよく、また、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から誘導されたものであってよい。
　ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から誘導したネット様構造物に造血前駆細胞が含まれるので、該ネット様構造物を造血幹細胞又は造血前駆細胞として共培養に付してもよい。
　共培養に用いる不老化血管内皮細胞は、本実施形態に係る細胞分化度の調節方法で分化度が調節されることで不老化した細胞であってよい。また、共培養に用いる不老化血管内皮細胞は、マイトマイシンＣ等の抗生物質やガンマ線等の放射線照射により増殖しないよう処理した細胞であっても、処理されていない細胞であってもよい。
　共培養の条件は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞や、不老化血管内皮細胞の状態等に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、培養温度は約３５℃～約４２℃、約３６℃～約４０℃、又は約３７℃～約３９℃とすることができ、二酸化炭素濃度は例えば５％ＣＯ２、酸素濃度は例えば２０％Ｏ２とすることができる。静置培養であっても、振とう培養であってもよい。振とう培養の場合の振とう速度も特に限定されず、例えば、１０ｒｐｍ～２００ｒｐｍ、３０ｒｐｍ～１５０ｒｐｍ等とすることができる。培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、ＴＰＯを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）培地であってもよい。この場合、ＩＭＤＭ培地はさらにＳＣＦを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。さらに、ホルボールエステル（例えば、ホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート；ＰＭＡ）を加えてもよい。また、培地は、血清又は血漿を含有していてもよく、あるいは無血清でもよい。血清を用いる場合は、ヒト血清が好ましい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、脂質、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの１つ以上の物質も含有してもよい。サイトカインとしては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、各種ＴＰＯ様作用物質、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、ＩＴＳ（インスリンートランスフェリンーセレナイト）サプリメント、ＡＤＡＭ（Ａ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｎｄ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤等が例示される。
　一態様において、Ｆｌｔ３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む組み合わせをサイトカインとして添加する。該組み合わせは、更にＩＬ－３を含んでいてもよい。一態様において、ＩＬ－３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で、不老化血管内皮細胞、及び、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞を共培養し、次にＦｌｔ３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で、共培養を継続する。継続培養用の培地は、ＩＬ－３を含まなくてもよい。
　また、培地に不老化血管内皮細胞、及び、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞を添加する順番は、任意であってよく、不老化血管内皮細胞を先に添加してもよく、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞を先に添加してもよい。培地で培養している不老化血管内皮細胞に、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞を添加することで共培養してもよく、培地で培養しているｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞に、不老化血管内皮細胞を添加することで共培養してもよい。共培養は、ウェルプレート等で培養する二次元培養であってよく、生体内に近い環境での三次元培養であってもよい。
　不老化血管内皮細胞と共培養することで、不老化血管内皮細胞と共培養しない場合や、遺伝子変異型ＤＬＬ４と共培養した場合よりも、対象細胞への分化を高効率で、誘導することが可能になる。すなわち、不老化血管内皮細胞と共培養した場合の方が、より多くの数及び／又は割合の対象細胞を分化誘導することが可能になる。
　リンパ球細胞又はリンパ球前駆細胞が誘導されたことは、培養した細胞をフローサイトメトリー解析に付して、後述のリンパ球に特徴的な細胞表面マーカー発現パターンを有する細胞の出現を検出するか、コロニー形成アッセイに付して、リンパ球の分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。
　リンパ球は、造血幹細胞や、リンパ球前駆細胞等に由来し得る。
　本実施形態において、「リンパ球前駆細胞」とは、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞からなる群から選択される細胞の前駆細胞であってよい。
　リンパ球は、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１９等の細胞表面マーカーの発現により特徴付けることができる。ＣＤ４５は、赤血球や血小板以外の全ての血球が発現している細胞表面マーカーであり、ＣＤ５６は、ナチュラルキラー細胞に特徴的な細胞表面マーカーであり、ＣＤ１９は、Ｂ細胞に特徴的な細胞表面マーカーである。例えば、ナチュラルキラー細胞はＣＤ４５及びＣＤ５６を発現していることを特徴とし、Ｂ細胞はＣＤ４５及びＣＤ１９を発現していることを特徴とする。
　リンパ球は、フローサイトメトリー解析において、細胞表面マーカー発現パターンによりその分化度を特徴付けることができる。例えば、リンパ球は、分化度が高まると、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１９等の細胞表面マーカーの発現が減少する。すなわち、リンパ球の分化度が高まると、フローサイトメトリー解析において、ＣＤ４５及びＣＤ５６の細胞表面マーカーの発現が確認されなくてもよく、ＣＤ４５及びＣＤ１９の細胞表面マーカーの発現が確認されなくてもよく、ＣＤ４５、ＣＤ５６及びＣＤ１９の細胞表面マーカーの発現が確認されなくてもよい。また、リンパ球は、分化度が低くなると、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ１９等の細胞表面マーカーの発現が増加する。すなわち、リンパ球の分化度が低くなると、ＣＤ４５、ＣＤ５６、及びＣＤ１９からなる群から選択される１、２又は３の細胞表面マーカーを発現する細胞の数が増加する。
１－６．巨核球
　「巨核球」とは、血小板を産生し得る細胞を意味し、赤血球系前駆細胞（Ｍｅｇａｃａｒｙｏｃｙｔｅ－ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＭＥＰ）と呼ばれる場合もある。巨核球は、ＣＤ４１ａ陽性、ＣＤ４１ｂ陽性、ＣＤ４２ｂ陽性の細胞であり得る。
　巨核球は、当業者に周知の方法によりｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得てもよい。例えば、ヒトＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から誘導したネット様構造物に含まれる造血前駆細胞をセルソーターで単離し、巨核球誘導条件（フィーダー細胞上で、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＨｅｐａｒｉｎ存在下）で培養することにより、巨核球を得ることができる（国際公開第２００８／０４１３７０号、Ｔａｋａｙａｍａ　Ｂｌｏｏｄ　２００８，１１１（１１）：５２９８－５３０６）。或いは、ヒトＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から誘導したネット様構造物に含まれる造血前駆細胞に、ＭＹＣ及びＢＭＩ１を強制発現し、巨核球誘導条件（フィーダー細胞上で、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＨｅｐａｒｉｎ存在下）で培養することにより、不死化巨核球を得て、この不死化巨核球のＭＹＣ及びＢＭＩ１の発現を止めることにより、成熟した巨核球を得ることができる（国際公開第２０１１／０３４０７３号）。
　巨核球が誘導されたことは、コロニー形成アッセイに付して、巨核球の分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。
　巨核球は、血液細胞の一種であり、骨髄細胞（造血幹細胞）等に由来し得る。造血幹細胞は、造血前駆細胞へと分化することができ、造血前駆細胞は、赤血球、顆粒球、単球やマクロファージ、巨核球や血小板等の血液細胞へと分化することができる。顆粒球としては、骨髄球、前骨髄球、後骨髄球、骨髄芽球、桿状核球、分葉核球（好中球、好酸球、好塩基球等）等が挙げられる。
　本実施形態において、「巨核球の前駆細胞」とは、巨核球・赤芽球前駆細胞（ＭＥＰ）であってもよい。
　本実施形態において、「巨核球の分化細胞」とは、巨核球、血小板等であってもよい。
　巨核球は、フローサイトメトリー解析において、例えば、ＣＤ４１、及びＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーの発現により特徴付けることができる。
　巨核球は、フローサイトメトリー解析において、細胞表面マーカー発現パターンによりその分化度を特徴付けることができる。例えば、巨核球は、分化度が高まると、ＣＤ４１及びＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーの発現が増加する。すなわち、高分化度を有する巨核球は、ＣＤ４１及びＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーの発現をしていてもよい。高分化度を有する巨核球は、フローサイトメトリー解析において、ＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋の巨核球であってもよい。また、巨核球は、分化度が低まると、ＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーの発現が減少する。すなわち、低分化度を有する巨核球は、ＣＤ４１＋であり、ＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーを発現していなくてもよい。低分化度を有する巨核球は、ＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ－の巨核球であってもよい。
１－７．骨髄球
　「骨髄球」とは、好酸球、単球、好中球および好塩基球を生成しうる細胞をいう。
　骨髄球は、骨髄中の造血幹細胞から成熟して血液中の細胞成分である好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球等の白血球、赤血球、血小板等が産生される過程で得ることができる。骨髄球は、当業者に周知の方法によりｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得てもよい。
　骨髄球が誘導されたことは、培養した細胞をフローサイトメトリー解析に付して、後述の骨髄球に特徴的な細胞表面マーカー発現パターンを有する細胞の出現を検出するか、コロニー形成アッセイに付して、骨髄球の分化能力を有することを確認することにより、確かめることができる。
　骨髄球は、血液細胞の一種であり、骨髄細胞（造血幹細胞）等に由来し得る。造血幹細胞は、造血前駆細胞へと分化することができ、造血前駆細胞は、赤血球、顆粒球、単球やマクロファージ、巨核球や血小板等の血液細胞へと分化することができる。顆粒球としては、骨髄球、前骨髄球、後骨髄球、骨髄芽球、桿状核球、分葉核球（好中球、好酸球、好塩基球等）等が挙げられる。
　本実施形態において、「骨髄球の前駆細胞」とは、顆粒球・マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）であってもよい。
　本実施形態において、「骨髄球の分化細胞」とは、骨髄球、分葉核球（好中球、好酸球、好塩基球等）、単球、マクロファージ等であってもよい。
　骨髄球は、フローサイトメトリー解析において、例えば、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ１６、及びＣＤ１４の細胞表面マーカーの発現により特徴付けることができる。
　骨髄球は、フローサイトメトリー解析において、上述の細胞表面マーカー発現パターンによりその分化度を特徴付けることができる。例えば、マクロファージは、分化度が高まると、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４の細胞表面マーカーの発現が増加する。すなわち、高分化度を有するマクロファージは、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４の細胞表面マーカーの発現をしていてもよい。高分化度を有するマクロファージは、フローサイトメトリー解析において、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋のマクロファージであってもよい。また、マクロファージは、分化度が低まると、ＣＤ１１ｂ＋の細胞表面マーカーの発現が減少する。すなわち、低分化度を有するマクロファージは、ＣＤ１４＋であり、ＣＤ１１ｂの細胞表面マーカーを発現していなくてもよい。低分化度を有するマクロファージは、ＣＤ１１ｂ－／ＣＤ１４＋のマクロファージであってもよい。
２．抽出する工程
　細胞分化度の調節方法においては、所望の特定の分化度の細胞を抽出（単離又は精製）する工程をさらに含んでいてもよい。
　特定の分化度の細胞の抽出は、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる前に行ってもよく、後に行ってもよい。
　一態様において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる前にこの抽出工程を行い、抽出した特定の分化度の細胞（例えば、高分化度の細胞）において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させてもよい。
　別の態様において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させた、所望の特定の分化度の細胞（例えば、低分化度の細胞）を含む細胞集団を調製し、その後当該細胞集団から、所望の特定の分化度の細胞（例えば、低分化度の細胞）を抽出する。当該抽出した特定の分化度の細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させてもよい。目的とする細胞を抽出し、抽出された細胞に対して、本発明の方法を適用することにより、あるいは本発明の方法を適用した細胞集団から、目的とする細胞を抽出して、当該細胞を継続して培養することにより、目的の細胞種を効率よく増殖させることができる。抽出する細胞は、抽出した細胞種の増殖性を効率的に向上させる観点から、間葉系幹細胞の単一種の細胞のみとすることや、血管内皮細胞のみとすることや、平滑筋細胞のみとすること等が好ましいが、これらの２種以上の細胞が混合した細胞集団としてもよい。
　抽出する細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、骨髄球等を挙げることができる。目的とする細胞の抽出は、当該細胞に特異的に発現している（又は発現していない）細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、フローサイトメトリー解析、パニング、磁気ビーズ等の当業者に周知の方法により行うことができる。間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、骨髄球の抽出は、上述の細胞表面マーカー発現パターンを満足する細胞を単離することにより行うことができる。
　抽出操作後の細胞集団に含まれる目的とする細胞の割合が、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）となるように、目的とする細胞の単離を行うことができる。目的とする細胞のシングルセルを単離してもよい。
３．ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子
　本発明の細胞分化度を調節する方法は、任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、高分化度を有する巨核球、骨髄球において、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程をさらに含んでいてもよい。ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子に加えて、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を発現させることにより、細胞分化度を低分化度とする調節の更なる促進が期待できる。
　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の上記強制発現の期間は当業者が適宜決定することができる。
　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する遺伝子である。
　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、及び／又はＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。
　例えば、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子を強制発現させ、続いてＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させて、細胞分化度を低分化度に調節した細胞を得てもよい。また、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子とＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を同時に強制発現させて、細胞分化度を低分化度に調節した細胞を得てもよい。細胞分化度を低分化度に維持する場合には、培養期間中、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子に加えてＢＣＬ－ＸＬの強制発現を維持することが好ましい。
　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の遺伝子を細胞内で強制発現させる場合、当業者において周知のいかなる方法により実施してもよい。例えば、遺伝子を、レンチウイルスやレトロウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやプラスミドベクター、エピソーマルベクター等の非ウイルスベクターによる遺伝子導入システムを利用して、細胞内に導入し、発現させてもよい。トランスポゾンを用いて非ウイルス的に、目的遺伝子を細胞のゲノムに組み込み、安定発現細胞株を樹立した後に、不要となった導入遺伝子をトランスポゾネースにより除去する方法（例、ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステム）を用いてもよい。
　対象細胞に、所望の遺伝子（例、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子、任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の発現ベクター（例、ウイルスベクター）をトランスフェクトしてもよいし、予め所望の遺伝子（例、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子、任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）から対象細胞を誘導し、その段階で当該遺伝子を強制発現させてもよい。或いは、予め所望の遺伝子（例、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子、任意的に更にＢＣＬ－ＸＬ遺伝子）の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）において、当該遺伝子を強制発現させながら、該多能性幹細胞から、対象細胞への分化を誘導してもよい。遺伝子導入ベクターにより遺伝子発現を行う場合、適当なプロモーターの下流に該遺伝子を作用可能に連結し、これを遺伝子導入ベクターに挿入して、細胞内に導入して目的遺伝子を発現させてもよい。
　該プロモーターは外来性プロモーターであり得る。本明細書中、遺伝子の「内在性」プロモーターとは、ゲノム中における該遺伝子と自然な状態で連結されているプロモーターを意味し、遺伝子の「外来性」プロモーターとは、遺伝操作（すなわち分子生物学的技法）によって、人為的に該遺伝子の近位に、該遺伝子の転写が、作用可能に連結されているプロモーターによって指示されるように配置されているものを意味する。ここで、「作用可能」に連結するとは、該プロモーターによって目的遺伝子がシスに支配され、目的遺伝子の所望の発現が実現されるようにプロモーターと目的遺伝子を連結することを意味する。外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得る。恒常的プロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ユビキチンプロモーターなどを挙げることができる。調節性プロモーターとは、誘導可能又は抑制解除可能なプロモーターを意味し、リプレッサー又はインデューサーのいずれか一方と結合することのできる、プロモーターと共に働くＤＮＡ配列を有するプロモーターを指す。プロモーターが誘導されるか或いは抑制解除されると「オンの状態」になり、プロモーターが誘導されないか或いは抑制解除されていない状態では、プロモーターは「オフの状態」となる。調節性プロモーターの例としては、テトラサイクリン反応性プロモーター、ステロイド反応性プロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの薬剤反応性プロモーターを挙げることができる。テトラサイクリン反応性プロモーターとは、テトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ））の存在または非存在によって可逆的に制御される、既知の調節性プロモーターである。テトラサイクリン反応性プロモーターは、内部にテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）が配置されたプロモーターであり、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）タンパク質又はテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）のＴＲＥへの結合により、活性化される（即ち、目的タンパク質の発現を誘導する）プロモーターである。ｒｔＴＡタンパク質はＤｏｘ存在下でＴＲＥに結合し、一方ｔＴＡタンパク質はＤｏｘ非存在下でＴＲＥに結合して、ＴＲＥ配列の下流のプロモーターと機能的に連結された目的遺伝子の発現を誘導する。テトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、テトラサイクリン反応性プロモーターと機能的に連結された該遺伝子と、ｒｔＴＡ又はｔＴＡタンパク質とが導入された細胞を、Ｄｏｘ存在下で培養することにより、Ｄｏｘ依存的に該遺伝子の発現を誘導又は抑制することができる。外来性プロモーターは、好ましくは調節性プロモーターである。調節性プロモーターを用いることにより、例えば、薬剤添加などの制御により目的遺伝子を誘導的に発現させることもできる。このような薬剤による遺伝子発現システムは、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の所望の発現制御を実現するために、当業者において、適当なシステムを容易に選択することができる。このような発現を行うために、市販のキットなどを使用してもよい。また、発現制御の目的遺伝子であるＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、それぞれ別々のベクターに挿入してもよいし、同一のベクターに挿入してもよい。
　ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、細胞分化度の低分化度への調節を促進するが、分化細胞（例、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、赤血球）の終末分化を阻害し得るために、終末分化工程に入る前にこれら遺伝子の発現を抑制してもよい。細胞内のこれら遺伝子発現を抑制することにより、機能的でより成熟した分化細胞（例、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、巨核球、血小板、マクロファージ、樹状細胞、好中球、赤血球、巨核球）が誘導されやすくなる。
　細胞内におけるＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の発現の抑制は、例えば、前述の調節性プロモーターを用いた薬剤誘導的な発現システムによる発現の誘導を、薬剤等の除去により解除することで達成してもよい。あるいは、導入したＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等をＣｒｅ／ｌｏｘシステムなどを使用して除去し、これらの遺伝子の発現を抑制的に制御してもよい。ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子等の発現を抑制的に調節するために、市販のキット等を適宜使用することもできる。
　上記各遺伝子の強制発現及びその解除（抑制）のためにＴｅｔ－ｏｎ（登録商標）又はＴｅｔ－ｏｆｆ（登録商標）システムのような市販の薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いてもよい。この場合、強制発現させる工程においては、対応する薬剤、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを培地に含有させ、これらを培地から除くことによって強制発現を抑制してもよい。薬剤（例えば、ドキシサイクリン）応答性の遺伝子発現誘導システムを用いる場合、当該薬剤誘導性に細胞（任意の分化度を有する間葉系幹細胞等）を長期間安定増殖させることが可能であり、任意のタイミングで培地から当該薬剤を除去するだけで、増殖を抑制すると同時に、所望の分化細胞を大量に準備可能である。あるいは、温度感受性の遺伝子発現制御システムや、光感受性の遺伝子発現制御システムを用いてもよい。
　遺伝子の強制発現及び強制発現の解除（抑制）は、国際公開第２０１１／０３４０７３号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１２／０２３８０２３号、国際公開第２０１２／１５７５８６号（上掲）及び米国特許出願公開第２０１４／０１２７８１５号、国際公開第２０１４／１２３２４２号及び米国特許出願公開第２０１６／０００２５９９号、又はＮａｋａｍｕｒａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　１４，　５３５－５４８，　２０１４に記載された方法、その他の公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。また、国際公開第２０１５／０４６２２９号、 国際公開第２０１６／１２５３６４号、又は国際公開第２０２０／０４５６５１号、その他の公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。
４．ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子
　本発明に係る細胞分化度を調節する方法は、任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、並びに高分化度を有する巨核球、及び骨髄球において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びｐ５３遺伝子の少なくともいずれかの発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程を含んでいてもよい。
　ここで、発現とは、転写及び翻訳を含む概念で用いられ、発現を阻害するという場合、転写レベルで阻害することも翻訳レベルで阻害することも含みうる。本発明の方法において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制することにより、細胞分化度の調節（低分化度への調節）の更なる向上が期待できる。
　ＣＤＫＮ１Ａ（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１Ａ）遺伝子は細胞周期の阻害因子ｐ２１をコードしており、癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の下流遺伝子としても知られている。活性化したｐ５３タンパク質は転写因子として働き、ｐ５３下流遺伝子群の発現を増加させる。そのため、本明細書で使用する場合、「遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する」とは、対象の遺伝子の発現やその発現産物（例えば、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の場合にはｐ２１）の機能を直接抑制することによって達成してもよいし、対象の遺伝子の上流にある遺伝子の発現やそれらの発現産物の機能を制御することで達成することもできる。ただし、本明細書においては、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する場合、その対象となるＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の上流遺伝子の中に、ｐ５３遺伝子、更にはｐ５３遺伝子の上流にある別の癌抑制遺伝子であるＩＮＫ４Ａ遺伝子及びＡＲＦ遺伝子は含まれない。
　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のみならず、ｐ５３遺伝子の発現、あるいはそれらの発現産物の機能を抑制することが好ましい。
　上記各遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、既知の方法により行うことができ、例えば、各遺伝子の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸（「発現抑制核酸」という。）、又はこれらの発現抑制核酸を発現し得る発現ベクターなどの、種々の分子を細胞に導入することにより行うことができる。あるいは、それ以外の技術、例えばゲノム編集技術などを利用し、遺伝子をノックダウンしてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを利用して遺伝子をノックダウンする場合、その遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと、ｄＣａｓのような不活化Ｃａｓとリプレッサードメインの融合タンパク質などが用いられる。
　ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列又はその部分配列と相補的な配列を有するＲＮＡとその相補鎖からなる２本鎖オリゴＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの長さは、哺乳動物細胞に用いられる場合、通常１９～３０塩基程度、好ましくは２１塩基～２５塩基程度である。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列は、発現が抑制される遺伝子の配列情報により当業者が適宜設計することができる。ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡを使用することもできる。
　アンチセンス核酸とは、標的ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で標的ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、かつハイブリダイズした状態で標的ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸を意味する。アンチセンス核酸は、一般的には１０塩基長～１００塩基長、好ましくは１５塩基長～３０塩基長の一本鎖核酸である。アンチセンス核酸の種類は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。アンチセンス核酸のヌクレオチド配列は、発現が抑制される遺伝子の配列情報により当業者が適宜設計することができる。
　上記の技術に加え、各遺伝子の発現を抑制することが知られている化合物を使用することもできる。例えば、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を抑制する化合物として、ＵＣ２２８８、ブチロラクトンＩ、ＬＬＷ１０、ソラフェニブ、ステリグマトシスチンなどのｐ２１阻害剤が知られている。また、ｐ５３阻害剤としては、ピフィスリンα、ナトリン－３、ＲｅＡＣｐ５３、ＲＧ７３８８などが知られている。
　あるいは、遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制のために、公知の技術を用いて対象の遺伝子をノックアウトしてもよい。遺伝子のノックアウトとは、遺伝子の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように破壊又は変異されていることを意味する。遺伝子は、ゲノム上の一つの対立遺伝子が機能しないように破壊又は変異されていてもよい。また、複数の対立遺伝子が破壊又は変異されていてもよい。ノックアウトは、既知の方法により行うことができ、例えば、標的遺伝子との間で遺伝的組換えが起こるように作られたＤＮＡコンストラクトを細胞に導入することによりノックアウトする方法や、ＴＡＬＥＮやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどのゲノム編集技術を利用して、塩基の挿入、欠失、置換導入によりノックアウトする方法が挙げられる。
　その他、各遺伝子の転写及び転写産物を抑制する化合物、又は産生されたタンパクの標的タンパクとの結合阻害剤（ｐ５３結合阻害：ピフィスリンα、ナトリン－３、ＲｅＡＣｐ５３、ＲＧ７３８８等；ｐ２１結合阻害：ＵＣ２２８８、ブチロラクトンＩ、ＬＬＷ１０、ソラフェニブ、ステリグマトシスチン等）などを使用してもよい。
　遺伝子の発現又はその発現産物の機能の抑制は、上述の方法により行うことができる。
　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現の抑制は、好ましくは、各遺伝子に対する発現抑制核酸を発現する発現ベクターを細胞に導入することにより行う。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子等の遺伝子に対する発現抑制核酸を細胞内で強制発現させる場合、当業者において周知のいかなる方法により実施してもよいが、例えば、該発現抑制核酸をコードする核酸を、レンチウイルスやレトロウイルスなどのウイルスベクターやプラスミドベクター、エピソーマルベクター等の非ウイルスベクターによる遺伝子導入システムを利用して、細胞内に導入し、発現させてもよい。トランスポゾンを用いて非ウイルス的に、発現抑制核酸をコードする核酸を細胞のゲノムに組み込み、発現抑制核酸の安定発現細胞株を樹立した後に、不要となった導入核酸をトランスポゾネースにより除去する方法（例、ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステム）を用いることもまた好ましい。対象細胞に、所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現ベクター（例、ウイルスベクター）をトランスフェクトしてもよいし、予め所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）から対象細胞を誘導し、その段階で当該ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンス核酸を強制発現させてもよい。或いは、予め所望の遺伝子（例、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子）に対する発現抑制核酸の発現カセットを組み込んだ多能性幹細胞（例、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）において、当該発現抑制核酸を強制発現させながら、該多能性幹細胞から、対象細胞への分化を誘導してもよい。発現ベクターを用いて細胞内で発現抑制核酸の発現を行う場合、適当なプロモーターの下流に該発現抑制核酸をコードする核酸（例、ＤＮＡ）を作用可能に連結し、これを発現ベクターに挿入して、細胞内に導入して目的とする発現抑制核酸を発現させてもよい。該プロモーターは外来性プロモーターであり得る。外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは恒常的プロモーターである。恒常的プロモーターの例としては、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ等の比較的小さいＲＮＡを発現する場合、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーター、５Ｓ　ｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ　ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ　ＲＮＡプロモーター等のｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いることが好ましい。ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸と、ｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸は、それぞれ別々の発現ベクターに挿入してもよいし、同一の発現ベクターに挿入してもよい。
　本実施形態において、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能の抑制は、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、又はＢＣＬ－ＸＬ遺伝子のいずれかの強制発現と同時であってもよいが、好ましくはＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の強制発現と同時か、あるいは例えば細胞増殖の低下が確認された後に実施することができる。一例として、ある時点の細胞増殖率を直近の細胞増殖率と比較し（例えば、一週間ごとに細胞の増殖を確認したとして、ある週の細胞増殖率をその一週間前の増殖率と比較して）、増殖率が１／２以下になった状態が確認された後に実施することができる。細胞増殖の低下は、限定することを意図するものではないが、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現直後から約３０日後、約４０日後、約５０日後、約６０日後、約７０日後、約８０日後、又は約９０日後まで見られる。一態様において、対象細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させ、これと並行して、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。一態様において、対象細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）、ＢＭＩ１遺伝子、及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させ、これと並行して、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及び／又はｐ５３遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する。
５．ホモログ
　本明細書で使用する場合のＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子等の各遺伝子は、それらの公知の核酸配列、例えばｃＤＮＡ配列でコードされるものを意味する。各遺伝子には、公知の核酸配列の相同性に基づいて同定されるホモログも含まれ得る。「ホモログ」とは、遺伝子のｃＤＮＡ配列が、その遺伝子の核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。
　ＭＹＣファミリー遺伝子のうち、ｃ－ＭＹＣ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号１で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。あるいは、配列番号１で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号１で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。ｃ－ＭＹＣ遺伝子は、不安定化ドメイン（ＤＤ）と融合させたｃ－ＭＹＣをコードする遺伝子であってもよい。不安定化ドメインは、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ社またはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入して用いることができる。
　配列番号１で示される配列は、以下の配列である。
atgcccctca  acgttagctt  caccaacagg  aactatgacc  tcgactacga  ctcggtgcag  ccgtatttct  actgcgacga  ggaggagaac  ttctaccagc  agcagcagca  gagcgagctg  cagcccccgg  cgcccagcga  ggatatctgg  aagaaattcg  agctgctgcc  caccccgccc  ctgtccccta  gccgccgctc  cgggctctgc  tcgccctcct  acgttgcggt  cacacccttc  tcccttcggg  gagacaacga  cggcggtggc  gggagcttct  ccacggccga  ccagctggag  atggtgaccg  agctgctggg  aggagacatg  gtgaaccaga  gtttcatctg  cgacccggac  gacgagacct  tcatcaaaaa  catcatcatc  caggactgta  tgtggagcgg  cttctcggcc  gccgccaagc  tcgtctcaga  gaagctggcc  tcctaccagg  ctgcgcgcaa  agacagcggc  agcccgaacc  ccgcccgcgg  ccacagcgtc  tgctccacct  ccagcttgta  cctgcaggat  ctgagcgccg  ccgctcagag  tgcatcgacc  cctcggtggt  cttcccctac  cctctcaacg  acagcagctc  gcccaagtcc  tgcgcctcgc  aagactccag  cgccttctct  ccgtcctcgg  attctctgct  ctcctcgacg  gagtcctccc  cgcagggcag  ccccgagccc  ctggtgctcc  atgaggagac  accgcccacc  accagcagcg  actctgagga  ggaacaagaa  gatgaggaag  aaatcgatgt  tgtttctgtg  gaaaagaggc  aggctcctgg  caaaaggtca  gagtctggat  caccttctgc  tggaggccac  agcaaacctc  ctcacagccc  actggtcctc  aagaggtgcc  acgtctccac  acatcagcac  aactacgcag  cgcctccctc  cactcggaag  gactatcctg  ctgccaagag  ggtcaagttg  gacagtgtca  gagtcctgag  acagatcagc  aacaaccgaa  aatgcaccag  ccccaggtcc  tcggacaccg  aggagaatgt  caagaggcga  acacacaacg  tcttggagcg  ccagaggagg  aacgagctaa  aacggagctt  ttttgccctg  cgtgaccaga  tcccggagtt  ggaaaacaat  gaaaaggccc  ccaaggtagt  tatccttaaa  aaagccacag  catacatcct  gtccgtccaa  gcagaggagc  aaaagctcat  ttctgaagag  gacttgttgc  ggaaacgacg  agaacagttg  aaacacaaac  ttgaacagct  acggaactct  tgtgcgtaa   
　ＢＭＩ１遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号２で示される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号２で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。あるいは、配列番号２で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号２で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。
　配列番号２で示される配列は、以下の配列である。
atgcatcgaa  caacgagaat  caagatcact  gagctaaatc  cccacctgat  gtgtgtgctt  tgtggagggt  acttcattga  tgccacaacc  ataatagaat  gtctacattc  cttctgtaaa  acgtgtattg  ttcgttacct  ggagaccagc  aagtattgtc  ctatttgtga  tgtccaagtt  cacaagacca  gaccactact  gaatataagg  tcagataaaa  ctctccaaga  tattgtatac  aaattagttc  cagggctttt  caaaaatgaa  atgaagagaa  gaagggattt  ttatgcagct  catccttctg  ctgatgctgc  caatggctct  aatgaagata  gaggagaggt  tgcagatgaa  gataagagaa  ttataactga  tgatgagata  ataagcttat  ccattgaatt  ctttgaccag  aacagattgg  atcggaaagt  aaacaaagac  aaagagaaat  ctaaggagga  ggtgaatgat  aaaagatact  tacgatgccc  agcagcaatg  actgtgatgc  acttaagaaa  gtttctcaga  agtaaaatgg  acatacctaa  tactttccag  attgatgtca  tgtatgagga  ggaaccttta  aaggattatt  atacactaat  ggatattgcc  tacatttata  cctggagaag  gaatggtcca  cttccattga  aatacagagt  tcgacctact  tgtaaaagaa  tgaagatcag  tcaccagaga  gatggactga  caaatgctgg  agaactggaa  agtgactctg  ggagtgacaa  ggccaacagc  ccagcaggag  gtattccctc  cacctcttct  tgtttgccta  gccccagtac  tccagtgcag  tctcctcatc  cacagtttcc  tcacatttcc  agtactatga  atggaaccag  caacagcccc  agcggtaacc  accaatcttc  ttttgccaat  agacctcgaa  aatcatcagt  aaatgggtca  tcagcaactt  cttctggttg  a
　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号３で示される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号３で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。あるいは、配列番号３で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号３で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。
　配列番号３で示される配列は、以下の配列である。
atgtctcaga  gcaaccggga  gctggtggtt  gactttctct  cctacaagct  ttcccagaaa  ggatacagct  ggagtcagtt  tagtgatgtg  gaagagaaca  ggactgaggc  cccagaaggg  actgaatcgg  agatggagac  ccccagtgcc  atcaatggca  acccatcctg  gcacctggca  gacagccccg  cggtgaatgg  agccactggc  cacagcagca  gtttggatgc  ccgggaggtg  atccccatgg  cagcagtaaa  gcaagcgctg  agggaggcag  gcgacgagtt  tgaactgcgg  taccggcggg  cattcagtga  cctgacatcc  cagctccaca  tcaccccagg  gacagcatat  cagagctttg  aacaggtagt  gaatgaactc  ttccgggatg  gggtaaactg  gggtcgcatt  gtggcctttt  tctccttcgg  cggggcactg  tgcgtggaaa  gcgtagacaa  ggagatgcag  gtattggtga  gtcggatcgc  agcttggatg  gccacttacc  tgaatgacca  cctagagcct  tggatccagg  agaacggcgg  ctgggatact  tttgtggaac  tctatgggaa  caatgcagca  gccgagagcc  gaaagggcca  ggaacgcttc  aaccgctggt  tcctgacggg  catgactgtg  gccggcgtgg  ttctgctggg  ctcactcttc  agtcggaaat  ga
　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子のホモログとは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号４で示される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号４で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。あるいは、配列番号４で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号４で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、細胞周期を阻害するもののことである。
　配列番号４で示される配列は、以下の配列である。
atgtggggag  tattcaggag  acagacaact  cactcgtcaa  atcctcccct  tcctggccaa  caaagctgct  gcaaccacag  ggatttcttc  tgttcaggcg  ccatgtcaga  accggctggg  gatgtccgtc  agaacccatg  cggcagcaag  gcctgccgcc  gcctcttcgg  cccagtggac  agcgagcagc  tgagccgcga  ctgtgatgcg  ctaatggcgg  gctgcatcca  ggaggcccgt  gagcgatgga  acttcgactt  tgtcaccgag  acaccactgg  agggtgactt  cgcctgggag  cgtgtgcggg  gccttggcct  gcccaagctc  taccttccca  cggggccccg  gcgaggccgg  gatgagttgg  gaggaggcag  gcggcctggc  acctcacctg  ctctgctgca  ggggacagca  gaggaagacc  atgtggacct  gtcactgtct  tgtacccttg  tgcctcgctc  aggggagcag  gctgaagggt  ccccaggtgg  acctggagac  tctcagggtc  gaaaacggcg  gcagaccagc  atgacagatt  tctaccactc  caaacgccgg  ctgatcttct  ccaagaggaa  gccctaa     
　ｐ５３遺伝子とは、そのｃＤＮＡ配列が、例えば、配列番号５で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号５で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号５で示される配列からなるＤＮＡと、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、よりさらに好ましくは９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ、若しくは、配列番号５で示される核酸配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡであって、そのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。あるいは、配列番号５で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるｃＤＮＡとは、配列番号５で示される配列中の１又は複数個、例えば１～１０個、好ましくは数個、例えば１～５個、１～４個、１～３個、１～２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列からなるＤＮＡであって、これらのＤＮＡによってコードされるタンパク質が、癌を抑制するもののことである。
　配列番号５で示される配列は、以下の配列である。
atggaggagc  cgcagtcaga  tcctagcgtc  gagccccctc  tgagtcagga  aacattttca  gacctatgga  aactacttcc  tgaaaacaac  gttctgtccc  ccttgccgtc  ccaagcaatg  gatgatttga  tgctgtcccc  ggacgatatt  gaacaatggt  tcactgaaga  cccaggtcca  gatgaagctc  ccagaatgcc  agaggctgct  ccccccgtgg  cccctgcacc  agcagctcct  acaccggcgg  cccctgcacc  agccccctcc  tggcccctgt  catcttctgt  cccttcccag  aaaacctacc  agggcagcta  cggtttccgt  ctgggcttct  tgcattctgg  gacagccaag  tctgtgactt  gcacgtactc  ccctgccctc  aacaagatgt  tttgccaact  ggccaagacc  tgccctgtgc  agctgtgggt  tgattccaca  cccccgcccg  gcacccgcgt  ccgcgccatg  gccatctaca  agcagtcaca  gcacatgacg  gaggttgtga  ggcgctgccc  ccaccatgag  cgctgctcag  atagcgatgg  tctggcccct  cctcagcatc  ttatccgagt  ggaaggaaat  ttgcgtgtgg  agtatttgga  tgacagaaac  acttttcgac  atagtgtggt  ggtgccctat  gagccgcctg  aggttggctc  tgactgtacc  accatccact  acaactacat  gtgtaacagt  tcctgcatgg  gcggcatgaa  ccggaggccc  atcctcacca  tcatcacact  ggaagactcc  agtggtaatc  tactgggacg  gaacagcttt  gaggtgcgtg  tttgtgcctg  tcctgggaga  gaccggcgca  cagaggaaga  gaatctccgc  aagaaagggg  agcctcacca  cgagctgccc  ccagggagca  ctaagcgagc  actgcccaac  aacaccagct  cctctcccca  gccaaagaag  aaaccactgg  atggagaata  tttcaccctt  cagatccgtg  ggcgtgagcg  cttcgagatg  ttccgagagc  tgaatgaggc  cttggaactc  aaggatgccc  aggctgggaa  ggagccaggg  gggagcaggg  ctcactccag  ccacctgaag  tccaaaaagg  gtcagtctac  ctcccgccat  aaaaaactca  tgttcaagac  agaagggcct  gactcagact  ga           
　ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーションの条件のことであり、一般的に核酸の塩基長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、塩基が長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、塩基が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。
　具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃～４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
６．培養する工程
　本実施形態に係る間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の前駆細胞を製造する方法は、上述した本実施形態に係る細胞分化度の調節方法で得られた細胞を培養する工程（培養工程）を含む。
　「前駆細胞」とは、増殖能を有する細胞から最終の分化形態である分化細胞への分化過程における細胞を意味する。
　細胞の培養条件は、細胞の種類やその状態に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、培養温度は約３５℃～約４２℃、約３６℃～約４０℃、又は約３７℃～約３９℃とすることができ、二酸化炭素濃度は例えば５％ＣＯ2、酸素濃度は例えば２０％Ｏ2とすることができる。静置培養であっても、振とう培養であってもよい。振とう培養の場合の振とう速度も特に限定されず、例えば、１０ｒｐｍ～２００ｒｐｍ、３０ｒｐｍ～１５０ｒｐｍ等とすることができる。
　培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、ＴＰＯを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）培地であってもよい。この場合、ＩＭＤＭ培地はさらにＳＣＦを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。さらに、ホルボールエステル（例えば、ホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセタート；ＰＭＡ）を加えてもよい。
　細胞を培養する工程は、フィーダー細胞の存在下又は不在下で実施することができる。本明細書において、「フィーダー細胞」とは、増殖又は分化させようとしている標的細胞の培養に必要な環境を整えるために、標的細胞と共培養される細胞をいう。フィーダー細胞は、標的細胞と識別できる細胞である限り、同種由来の細胞であっても異種由来の細胞であってもよい。フィーダー細胞は、抗生物質やガンマ線により増殖しないよう処理した細胞であっても、処理されていない細胞であってもよい。
　培地は、血清又は血漿を含有していてもよく、あるいは無血清でもよい。血清を用いる場合は、ヒト血清が好ましい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、脂質、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの１つ以上の物質も含有してもよい。サイトカインとしては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、各種ＴＰＯ様作用物質、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、ＩＴＳ（インスリンートランスフェリンーセレナイト）サプリメント、ＡＤＡＭ（Ａ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｎｄ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤などが例示される。
７．分化する工程
　本実施形態に係る間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の分化細胞を製造する方法は、上述した本実施形態に係る細胞分化度の調節方法で得られた細胞を分化する工程（分化工程）を含む。
　「分化細胞」とは、増殖能を有する細胞からの分化過程における細胞、又はその最終の分化形態である細胞を意味する。
　分化する工程は、分化させる細胞の種類に応じた培養条件で培養することにより、実施することができ、上述した培養する工程についての説明を参照してよい。
８．細胞
　本発明は、第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子を有する、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、若しくは骨髄球、又はこれらの前駆細胞若しくは分化細胞（以下、本発明の細胞）を提供する。
　ＭＹＣファミリー遺伝子は、好ましくはｃ－ＭＹＣである。第１の外来性プロモーター及び第２の外来性プロモーターは、独立して、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、調節性プロモーターである。調節性プロモーターは、好ましくは薬剤反応性プロモーターであり、より好ましくは、テトラサイクリン反応性プロモーターである。第１の外来性プロモーターと第２の外来性プロモーターの種類は、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一の種類のプロモーターである。同一の種類のプロモーターを用いることにより、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子を同期的に発現させることができ、また同期的に発現を抑制することができる。第１の外来性プロモーターと第２の外来性プロモーターは、好ましくは、同一の調節性プロモーター（例、薬剤反応性プロモーター）であり、より好ましくは共にテトラサイクリン反応性プロモーターである。第１の外来性プロモーターと第２の外来性プロモーターとは、それぞれ独立して、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子と作用可能に連結されていてもよいし、１つの外来性プロモーターに、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子とが作用可能に連結されていてもよい。この場合、ＭＹＣファミリー遺伝子とＢＭＩ１遺伝子とは、ＩＲＥＳ等の介在配列を介して連結されることにより、１つの外来性プロモーターの制御下で、バイシストロニックな発現が可能となる。第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子は、本発明の細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、本発明の細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子及び第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子は、本発明の細胞のゲノムに組み込まれている。
　第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、テトラサイクリン依存的な発現制御を可能とするため、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有することが好ましい。第３の外来性プロモーターは、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、恒常的プロモーターである。第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、本発明の細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、本発明の細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子は、本発明の細胞のゲノムに組み込まれている。
　本発明の細胞は、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球が増殖し得る条件下で培養した場合に、インビトロでこれらの細胞の増殖を促進し得る量のＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子）及びＢＭＩ１遺伝子を発現する。インビトロでこれらの細胞の増殖を促進し得る量のＭＹＣファミリー遺伝子（例、ｃ－Ｍｙｃ）及びＢＭＩ１遺伝子とは、当該量のＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を発現するこれらの細胞の増殖速度が、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を発現していないことを除いてはこれらの細胞と同様に作成した間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球と比較して、有意に上昇するようなＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の量を意味する。
　増殖能力を増強する観点から、本発明の細胞は、第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を更に有していてもよい。該細胞を第４の外来性プロモーターが作動する条件下で培養すると、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子が発現し、本発明の細胞の増殖が更に促進されることが期待できる。第４の外来性プロモーターは、独立して、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、調節性プロモーターである。調節性プロモーターは、好ましくは薬剤反応性プロモーターであり、より好ましくは、テトラサイクリン反応性プロモーターである。第４の外来性プロモーターの種類は、第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、第１、第２及び第４の外来性プロモーターは、同一の種類のプロモーターである。同一の種類のプロモーターを用いることにより、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を同期的に発現させることができ、また同期的に発現を抑制することができる。第１、第２及び第４の外来性プロモーターは、好ましくは、同一の調節性プロモーター（例、薬剤反応性プロモーター）であり、より好ましくは全てテトラサイクリン反応性プロモーターである。第４の外来性プロモーターは、第１及び第２の外来性プロモーターと独立して、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子と作用可能に連結されていてもよいし、第１の外来性プロモーターにＭＹＣファミリー遺伝子とＢＣＬ－ＸＬ遺伝子とが作用可能に連結されていてもよいし、第２の外来性プロモーターにＢＭＩ１遺伝子とＢＣＬ－ＸＬ遺伝子とが作用可能に連結されていてもよいし、１つの外来性プロモーターに、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＢＭＩ１遺伝子及びＢＣＬ－ＸＬ遺伝子が作用可能に連結されていてもよい。複数の遺伝子をＲＥＳ等の介在配列を介して連結することにより、１つの外来性プロモーターの制御下で、バイシストロニックな発現が可能となる。第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、本発明の細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、本発明の細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよい。好ましくは、第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子は、本発明の細胞のゲノムに組み込まれている。
　増殖能力を増強する観点から、本発明の細胞は、第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸（例、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸）をコードする核酸、及び／又は第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸を更に有していてもよい。該細胞を第５の外来性プロモーター、及び／又は第６の外来性プロモーターが作動する条件下で培養すると、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸、及び／又はｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸が発現し、本発明の細胞の増殖が更に促進されることが期待できる。第５の外来性プロモーター及び第６の外来性プロモーターは、独立して、恒常的プロモーター又は調節性プロモーターであり得るが、好ましくは、恒常的プロモーターである。恒常的プロモーターは、好ましくは、Ｈ１プロモーター等のｐｏｌＩＩＩ系プロモーターである。第５の外来性プロモーターの種類は、第６の外来性プロモーターと同一であっても異なっていてもよい。第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸は、本発明の細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、本発明の細胞内に導入された発現ベクター中に存在してもよいが、好ましくは、本発明の細胞のゲノムに組み込まれている。
　一態様において、本発明の細胞は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、及び
第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子
を有する、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、若しくは骨髄球、又はこれらの前駆細胞である。第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。
　一態様において、本発明の細胞は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、
第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び
第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸
を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、若しくは骨髄球、又はこれらの前駆細胞である。第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。
　一態様において、本発明の細胞は、
第１の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＭＹＣファミリー遺伝子、
第２の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＭＩ１遺伝子、
第４の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＢＣＬ－ＸＬ遺伝子
第５の外来性プロモーターと作用可能に連結されたＣＤＫＮ１Ａ遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸、及び
第６の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｐ５３遺伝子に対する発現抑制核酸をコードする核酸
を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、若しくは骨髄球、又はこれらの前駆細胞である。第１の外来性プロモーター及び／又は第２の外来性プロモーターとしてテトラサイクリン反応性プロモーターを用いる場合、本発明の細胞は、第３の外来性プロモーターと作用可能に連結されたｒｔＴＡ遺伝子又はｔＴＡ遺伝子を更に有していてもよい。
　本発明の細胞は、上述した本発明の任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、若しくはリンパ球、又は高分化度を有する巨核球、若しくは骨髄球の分化度を調節する方法、又は間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の前駆細胞を製造する方法により得ることができる。
　また、本発明は、上記本発明の細胞を含む細胞集団（本発明の細胞集団という。）を提供する。該細胞集団は、上記本発明の細胞を豊富に含み、該細胞集団全体に含まれる本発明の細胞の割合は、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。このような本発明の細胞を豊富に含む細胞集団は、上記本発明の方法を適用した細胞集団から、目的とする特定の分化度（例、高分化度、低分化度）を有する細胞（間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、若しくは骨髄球、又はこれらの前駆細胞）を、抽出することにより得ることができる。好ましい態様において、本発明の細胞集団は、特定の分化度（例、高分化度、低分化度）を有する本発明の細胞を豊富に含む。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は間葉系幹細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は血管内皮細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は平滑筋細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は神経堤細胞である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞はリンパ球である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は巨核球である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。一態様において、細胞集団全体に含まれる本発明の細胞（該細胞は骨髄球である）の割合が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上（例、１００％）である。このように特定の分化段階（例、高分化度、低分化度）にある本発明の細胞を豊富に含む細胞集団は、上記本発明の方法の方法を適用した細胞集団から、目的とする分化段階の細胞を、該分化段階の細胞に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター等で単離・抽出することにより得ることができる。
　本発明の細胞、及び本発明の細胞集団は、上述した本発明の任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、若しくはリンパ球、又は高分化度を有する巨核球、若しくは骨髄球の分化度を調節する方法、又は間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の前駆細胞を製造する方法により得ることができる。
９．細胞調製物
　また、本発明は、上記本発明の細胞集団を含む細胞調製物（本発明の細胞調製物という。）を提供する。本発明の細胞調製物は、上記本発明の細胞集団を、適切な生理的水溶液（例、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、液体培地）で懸濁することにより調整することができる。該生理的水溶液には、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸リドカイン、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム等）等を配合してもよい。該細胞調製物中には、細胞濃度が、例えば１．０×１０１～１．０×１０１２細胞／ｍＬとなるように、上記本発明の細胞集団を懸濁する。
　細胞調製物中に含まれる本発明の細胞又は細胞集団の種類に応じ、該細胞の増殖に適したサイトカインの生み合わせを、該細胞調製物に添加してもよい。例えば、間葉系幹細胞を含む細胞調製物の場合、ｂＦＧＦを該細胞調製物に添加することができる。血管内皮細胞を含む細胞調製物の場合、ＶＥＧＦを該細胞調製物に添加することができる。平滑筋細胞を含む細胞調製物の場合、ＶＥＧＦを該細胞調製物に添加することができる。神経堤細胞を含む細胞調製物の場合、ＳＢ－４３１５４２等のＡＬＫ５阻害剤及びＣＨＩＲ９９０２１等のＧＳＫ３阻害剤を該細胞調製物に添加することができる。或いは、神経堤細胞を含む細胞調製物の場合、ＳＢ－４３１５４２等のＡＬＫ５阻害剤、ＥＧＦ及びＦＧＦ２を該細胞調製物に添加してもよい。リンパ球を含む細胞調製物の場合、ＩＬ－３を該細胞調製物に添加することができる。巨核球を含む細胞調製物の場合、ＴＰＯ及びＳＣＦを該細胞調製物に添加することができる。
１０．細胞分化度調節剤
　本実施形態に係る細胞分化度調節剤は、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含み、任意に、ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含み、或いはＣＤＫＮ１Ａ遺伝子又はｐ５３遺伝子の発現又はその発現産物の機能を抑制する分子を有効成分として含む。
１１．医薬組成物
　本実施形態に係る医薬組成物は、本発明の細胞分化度を調節する方法、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の前駆細胞又は分化細胞を製造する方法で得られた細胞を含む。
１２．治療又は予防方法
　本実施形態に係る治療又は予防方法は、本発明の細胞分化度を調節する方法、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の前駆細胞又は分化細胞を製造する方法で得られた細胞、又は該細胞を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
実施例１－１：間葉系幹細胞
　Ｆｕｋｕｔａら（ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１４，９（１２）：ｅ１１２２９１）の報告に従い、ｉＰＳ細胞から、Ｍａｔｒｉｇｅｌ　ｃｏａｔｉｎｇ培養皿上で、ＳＢ－４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１存在下で、培養７日で、Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔ　Ｃｅｌｌ　（ＮＣＣ）を誘導した。その後、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｃ　ｃｏａｔｉｎｇ培養皿で、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＳＢ－４３１５４２を含む培地に変更し、ＮＣＣの増幅をおこなった。さらに、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｃ　ｃｏａｔｉｎｇ培養皿で、１０％ＦＢＳ、ＦＧＦ２を含む培地に変更し、ＭＳＣを誘導した。
　ＭＳＣを誘導後、１ヶ月経過した９継代目の細胞に対して、以下に示すウイルスベクターのいずれかをそれぞれ感染させた。
・Ｃｏｎｔｒｏｌ（感染なし、または空のウイルスベクター）
・ｃ－ＭＹＣのみ
・ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１（ＭＢ）
・ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ（ＭＢＸ）
・ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ＋ｓｈｐ５３
・ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ＋ｓｈｐ５３＋ｓｈｐ２１
・ｓｈｐ５３（ｐ５３ＫＤ）
・ｓｈｐ２１（ｐ２１ＫＤ）
　ｉＰＳ－ＭＳＣの基本培地は、ａｌｆａ　ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを用いた。
　ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＢＣＬＸＬの強制発現ベクターはｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅで発現を誘導するシステム（ｄｏｘ　ｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、感染直後より培養液中にｄｏｃｙｃｙｃｌｉｎｅ　１μｇ／ｍｌを添加し、生細胞数をカウントした。結果を図１に示す。図１に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ（感染なし、または空のウイルスベクター）は徐々に増殖が止まった。ｐ５３ＫＤでは、一過性の増殖が得られるが、同様に徐々に増殖が停止した。また、ｃ－ＭＹＣのみの強制発現、および、ｐ２１ＫＤではＣｏｎｔｒｏｌ条件よりも早期に増殖がストップした。一方、ＭＢを含む組み合わせ（ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１、ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ、ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ＋ｓｈｐ５３、ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ＋ｓｈｐ５３＋ｓｈｐ２１）では、感染後６０日を越えても、指数関数的に増殖することが確認された。
　また、間葉系幹細胞の代表的なマーカーである、ＣＤ９０－ＦＩＴＣ、ＣＤ７３－ＰＥ、ＣＤ１０５－ＡＰＣで染色し、フローサイトメーターにて解析した。結果を図２に示す。興味深いことに、ＣＤ９０＋／ＣＤ７３＋／ＣＤ１０５＋の細胞集団の割合は、Ｃｎｔｒｏｌ群では減少したが、ＭＢ及びＭＢＸ群では増加していた。Ｃｎｔｒｏｌ群にはＣＤ９０＋の細胞集団とＣＤ９０－の細胞集団が認められた。ＣＤ９０は、間葉系幹細胞の代表的なマーカーで、間葉系幹細胞からの終末分化が進み、幹細胞性が失われるとともにＣＤ９０の発現が失われる。これらの結果から、Ｃｎｔｒｏｌ群では、継代とともに幹細胞性が徐々に失われて終末分化が進んだ間葉系幹細胞（ＣＤ９０－）が出現するが、ＭＢ及びＭＢＸ群では、幹細胞性が維持されて、より未分化な間葉系幹細胞（ＣＤ９０＋）が大部分を占めたことが示唆された。
　また、９継代目の分化細胞（ＣＤ９０－）を含む細胞集団を、ＣＤ９０抗体で染色後、ＣＤ９０＋分画とＣＤ９０－分画に分けて純化し、感染なしをＣｏｎｔｒｏｌとして、ＭＢ感染後、両群にｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ　１μｇ／ｍＬを加え培養し、感染１４及び２１日目にフローサイトメトリー解析に付した。結果を図３に及び図５示す。
　感染２１日目にＦＡＣＳでＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３を解析したところ、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、ＣＤ９０＋純化群では、１３％がＣＤ９０＋を保持したが、ほとんどがＣＤ９０－分化細胞となっていた。また、ＣＤ９０－純化群では、ほとんどがＣＤ９０－分化細胞であった。ＣＤ９０＋分画はＣＤ９０＋分画とＣＤ９０－分画を生じさせるが、ＣＤ９０－分画はＣＤ９０＋分画を生み出さないことから、ＣＤ９０＋分画がヒエラルキーの上流に位置することが示唆された。一方、ＭＢ群では、ＣＤ９０＋純化群、ＣＤ９０－純化群、両群とも、ほとんどの細胞集団がＣＤ９０＋を発現していた。ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１強制発現により、ＣＤ９０＋分画からもＣＤ９０－分画からもＣＤ９０＋ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋分画が生み出されたことから、ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１により、終末分化が進んだ間葉系幹細胞（ＣＤ９０－）が、より未分化な間葉系幹細胞（ＣＤ９０＋）に変換されたことが示された（間葉系幹細胞の前駆細胞への若返り、前駆細胞リプログラミング）。
　また、Ｄｏｘ　ｏｆｆにすることで、ＭＢまたはＭＢＸの発現をオフにすると、増殖速度が緩やか（Ｄｏｘ　ｏｎの１／２～１／３程度の速度）になり、徐々にＣＤ９０発現を失っていく（分化していく）ことを確認した（図４）。ＭＢＸの導入は、ＭＳＣをＰａｓｓａｇｅ　０のあたりまで若返らせた。
実施例１－２：軟骨細胞・骨芽細胞・脂肪細胞への分化誘導
　実施例１－１に準じてｉＰＳ由来ＭＳＣにＭＢ又はＭＢＸを強制発現することにより樹立した増殖能を有するＭＳＣ（不老化ＭＳＣ）を脂肪細胞、骨芽細胞、及び軟骨細胞へ分化誘導し、各系列への分をヒト骨髄由来ＭＳＣと比較した。脂肪細胞分化は、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｇｉｂｃｏ（ｃａｔ：Ａ１００７００１）で行い、ＨＣＳ（Ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｅｎｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）ＬｉｐｉｄＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ　ｎｅｕｔｒａｌ　ｌｉｐｉｄ　ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ））Ｃａｔ：Ｈ３４４７５で染色することにより確認した。骨芽細胞分化は、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｇｉｂｃｏ（ｃａｔ：Ａ１００７００１）で行い、Ａｌｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ　Ｓ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　ｓｃｉｅｎ　ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃８６７８で染色することにより確認した。軟骨細胞分化は、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｇｉｂｃｏ（ｃａｔ：Ａ１００７２０１）で行い、Ａｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ　ｓｔａｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｐＨ＝２．５（Ｓｉｇｍａ）ｃａｔ：Ａ３１５７で染色することにより確認した。結果を図６に示す。
　その結果、いずれの系列への分化も、ヒト骨髄由来ＭＳＣと同等であったことから、増殖能を有するＭＳＣは生体内ＭＳＣと同等の分化能力を有することが示された。
実施例２：血管内皮細胞
　Ｔａｋａｙａｍａ　Ｂｌｏｏｄ　２００８，１１１（１１）：５２９８－５３０６；Ｔａｋａｙａｍａ　ＪＥＭ　２０１０，２０７（１３）：２８１７－２８３０の手法を用いて、１０Ｔ１／２細胞との共培養、２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ存在下により、ヒトｉＰＳ細胞から血管前駆細胞を誘導し、１０～１１日目にＣＤ３４＋血管内皮細胞前駆細胞をＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩでソートし、Ｄｏｘ－ｏｎ　ｃ－ＭＹＣ／Ｄｏｘ－ｏｎ　ＢＭＩ１／Ｄｏｘ－ｏｎ　ＢＣＬ－ＸＬレンチウイルスベクターを感染させ、１μｇ／ｍｌ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、１００ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ存在下で培養を継続し、細胞数をカウントした。ｄｏｘ　ｏｎではコントロール（ウイルス感染なし）と比較し、細胞増殖が有意に上昇した（図７）。また、ｄｏｘ　ｏｎの状態、及び７日間ｄｏｘ　ｏｆｆとして、成熟させた状態で、細胞表面マーカーＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎの免疫染色をおこなった。
　その結果、ｄｏｘ　ｏｆｆとした細胞は、よりＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎの発現が上昇し、血管内皮細胞へ分化していることが確認できた（図８～１０）。
　さらに、ｑＰＣＲを用いて、ヒトｉＰＳ、ｉｍＶＥＣ－ｄｏｘ　ｏｎ、ｉｍＶＥＣ－ｄｏｘ　ｏｆｆ、ＨＡＥＣ（ｈｕｍａｎ　ａｏｒｔｉｃ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ：ヒト動脈血管内皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ　ｕｎｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ：ヒト臍帯由来静脈内皮細胞）における血管内皮細胞の分化マーカーＥＮＧ（ＣＤ１０５）、ＭＣＡＭ（ＣＤ１４６）、ＰＥＣＡＭ１の遺伝子発現を評価した。
　その結果、ヒトｉｍＶＥＣをｄｏｘ　ｏｆｆとして得られた細胞は、ＨＡＥＣやＨＵＶＥＣと同レベルで、血管内皮細胞の分化マーカーを発現していることが確認できた（図１１）。
実施例３：血管平滑筋細胞
　Ｔａｋａｙａｍａ　Ｂｌｏｏｄ　２００８，１１１（１１）：５２９８－５３０６；Ｔａｋａｙａｍａ　ＪＥＭ　２０１０，２０７（１３）：２８１７－２８３０の手法を用いて、１０Ｔ１／２細胞との共培養、２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ存在下により、ヒトｉＰＳ細胞から血管前駆細胞を誘導し、１０～１１日目にＣＤ３４－／ＶＥＧＦＲ＜ＫＤＲ＞＋　血管平滑筋前駆細胞を、ＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩでソートし、Ｄｏｘ－ｏｎ　ｃ－ＭＹＣ／Ｄｏｘ－ｏｎ　ＢＭＩ１／Ｄｏｘ－ｏｎ　ＢＣＬ－ＸＬ　レンチウイルスベクターを感染させ、１μｇ／ｍｌ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ存在下で培養を継続し、細胞数をカウントした。ｄｏｘ　ｏｎではコントロール（ウイルス感染なし）と比較し、細胞増殖が有意に上昇した（図１２）。
　また、培養２６日目（ｄｏｘ　ｏｎの前駆細胞段階）、および、２２日目から１週間ｄｏｘ　ｏｆｆとした細胞（ｄａｙ　２９）を平滑筋の分化マーカーである、Ｃａｌｐｏｎｉｎ，αＳＭＡの免疫染色を行った。
　その結果、ｄｏｘ　ｏｆｆの細胞では、血管平滑筋分化マーカーの発現が増強していることが確認できた（図１３）。
　ＭＢＸ導入により増殖性を向上させた不老化血管平滑筋細胞をｄｏｘ　ｏｆｆ（ＭＢＸ　ｏｆｆ）として、３日目にＰＤＧＦＲ２－ＡＰＣ抗体とインキュベーションした後ＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩで解析し、ＰＤＧＦＲ２＋未分化血管平滑筋細胞と、ＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞とにそれぞれｓｏｒｔｉｎｇして純化した（図１４）。その後再び１μｇ／ｍｌ　Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを加えた群、そのままｄｏｘ　ｏｆｆを継続した群に分けて、形態観察、細胞数カウント、ＦＡＣＳによる細胞表面マーカー（ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、及びＣＤ３４）の確認を行った。すなわち、以下の計４グループについて試験を行った。
Ｉ）　　ＰＤＧＦＲ２＋未分化血管平滑筋細胞＋ｄｏｘ　ｏｎ
ＩＩ）　ＰＤＧＦＲ２＋未分化血管平滑筋細胞　ｄｏｘ　ｏｆｆ
ＩＩＩ）ＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞＋ｄｏｘ　ｏｎ
ＩＶ）　ＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞　ｄｏｘ　ｏｆｆ
　ｓｏｒｔｉｎｇして５日後のグループＩ）～ＩＶ）の形態観察の結果を図１５に、細胞数をカウントした結果を図１６に、細胞表面マーカーの発現を確認した結果を図１７－１～１７－３に示した。図１６、及び図１７－１～１７－３の結果から、ｄｏｘ　ｏｎにしたグループＩ）ＰＤＧＦＲ２＋未分化血管平滑筋細胞＋ｄｏｘ　ｏｎ、及びグループＩＩＩ）ＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞＋ｄｏｘ　ｏｎのどちらも、ｄｏｘ　ｏｆｆにしたグループＩＩ）ＰＤＧＦＲ２＋未分化血管平滑筋細胞　ｄｏｘ　ｏｆｆ、及びグループＩＶ）ＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞　ｄｏｘ　ｏｆｆと比べて、表面マーカーであるＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、及びＣＤ３４の発現が低く抑えられ、また、細胞数の増殖速度が増大したことから、細胞が未分化血管平滑筋細胞の状態に戻ったことが示された。この結果から、ＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞にＭＢＸを強制発現すると、増殖能を有する未分化血管平滑筋細胞（血管平滑筋細胞前駆細胞、ＰＤＧＦＲ２＋）へ戻ることが示唆された（前駆細胞リプログラミング）。一方、ＭＢＸを発現する未分化血管平滑筋細胞（血管平滑筋細胞前駆細胞、ＰＤＧＦＲ２＋）のＭＢＸ発現を停止すると、成熟した血管平滑筋細胞（ＰＤＧＦＲ２－）へと分化することが示唆された。
　また、ｓｏｒｔｉｎｇした後、２８日間ｄｏｘ　ｏｎの状態で培養し、２９日目から１週間ｄｏｘ　ｏｆｆとした、ＰＤＧＦＲ２＋未分化血管平滑筋細胞及びＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞を、平滑筋の分化マーカーである、Ｃａｌｐｏｎｉｎ、及びαＳＭＡで免疫染色を行った。
　その結果、ＰＤＧＦＲ２＋未分化血管平滑筋細胞及びＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞のどちらにおいても、平滑筋分化マーカーの発現が増強していることが確認できた（図１８）。ＭＢＸを強制発現した（前駆細胞リプログラミングした）ＰＤＧＦＲ２－分化血管平滑筋細胞においても、平滑筋分化マーカーの発現が増強したことから、前駆細胞リプログラミングした後も、良好な分化能力を保持していることが示唆された。
実施例４：神経堤細胞
　Ｆｕｋｕｔａら（ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１４，９（１２）：ｅ１１２２９１）の報告に従い、ｉＰＳ細胞から、Ｍａｔｒｉｇｅｌ　ｃｏａｔｉｎｇ培養皿上で、ＳＢ－４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１存在下で、培養７日で、神経堤細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔ　Ｃｅｌｌ、ＮＣＣ）を誘導した。その後、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＳＢ－４３１５４２を添加したＣＤＭｉ培地（Ｆ－１２　ｗ，ＢＳＡ，ＣＤ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｌｉｐｉｄ，Ａｐｏ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，１－Ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ，及びＰ／Ｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｕｌｉｎを添加したＩＭＤＭ培地を基に、ＣＤＭｉ培地を作製した）からなるＮＣＣ培地に変更し、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｉｎｇ培養皿上で、ＮＣＣの増幅を行った。
　培養したＮＣＣに、ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１（ＭＢ）レンチウイルスベクター又はｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ（ＭＢＸ）レンチウイルスベクターを感染させ、１μｇ／ｍｌ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ存在下で培養を継続し、形態観察、細胞数カウント、及びＦＡＣＳによる表面マーカー（ＣＤ２７１）の確認を行った（図１９～２３）。
　ｓｏｒｔｉｎｇして１０日後のグループＣｏｎｔｒｏｌ群（感染なし、または空のウイルスベクター）、ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１（ＭＢ）レンチウイルスベクター、又はｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ（ＭＢＸ）レンチウイルスベクターを感染させたＮＣＣの形態観察の結果を図１９に示した。また、図２０に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群は徐々に細胞の増殖が止まった一方で、ｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１（ＭＢ）レンチウイルスベクター又はｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ（ＭＢＸ）レンチウイルスベクターを感染させたＮＣＣでは、指数関数的に細胞が増殖することが確認された。
　また、神経堤細胞の細胞表面マーカーであるＣＤ２７１の発現を、フローサイトメーターにて解析した。結果を図Ｆ及びＧに示す。神経堤細胞の終末分化が進み、幹細胞性が失われるとともにＣＤ２７１の発現が失われる。Ｃｎｔｒｏｌ群では継代数が上がるにつれてＣＤ２７１の発現が減少した一方で（図２１）、ＭＢ及びＭＢＸ群では発現が回復した（図２２）。これらの結果から、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、継代とともに幹細胞性が徐々に失われて終末分化が進むが、ＭＢ及びＭＢＸ群では、幹細胞性が維持されて、未分化ＮＣＣを維持することが示唆された。
　さらにまた、培養皿のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎによるコーティングの有無は、ＭＢ及びＭＢＸ群の細胞数、及びＣＤ２７１の発現に影響をほとんど及ぼさないことが確認された（図２３）。
実施例５：リンパ球
　６ｗｅｌｌプレートのｗｅｌｌに０．１％　ｇｅｌａｔｉｎ　１ｍｌ／ｗｅｌｌを入れ、３０分間３７℃でインキュベートした。Ｇｅｌａｔｉｎを取り除き、不老化血管内皮細胞を２～３×１０＾５　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで、基本培地（ＩＭＤＭ＋１５％　ＦＢＳ＋１０μｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ　　．５μｇ／ｍｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ＋５ｎｇ／ｍｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ＋２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋０．４５ｍＭ　α－ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５０μｌ／ｍｌ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ）で播種した。本試験で使用した不死化血管内皮細胞は、実施例２に従い、ＭＢＸ導入で増殖性を向上させた血管内皮細胞を、ｄｏｘ　ｏｆｆで７日間培養して得られた成熟させ、放射線照射して増殖を止めた血管内皮細胞である。３７℃、ＣＯ２　５．０％で培養した。翌日に培地を除去し、ｉＰＳ由来のヒト造血幹細胞　１×１０＾５　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌをｉＰＳ細胞由来造血前駆細胞用基本培地（ＩＭＤＭ＋１５％　ＦＢＳ＋１０μｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ＋５．５μｇ／ｍｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ＋５ｎｇ／ｍｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ＋２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋０．４５ｍＭ　α－ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５０μｌ／ｍｌ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３Ｌ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５）で播種した。同日に、ドキシサイクリン誘導性のｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ（ＭＢＸ）ウイルスベクターを加え、さらにＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを１μｇ／ｍｌで添加した。サイトカイン濃度はｈＦｌｔ３Ｌ　５０ｎｇ／ｍｌ＋ｈＳＣＦ　５０ｎｇ／ｍｌ＋ＩＬ－７　２０ｎｇ／ｍｌ＋ＩＬ－１５　２０ｎｇ／ｍｌを基本とし、ＩＬ－３添加群では、さらに最初の２週間のみＩＬ－３を２０ｎｇ／ｍｌで投与し、全て３７℃、ＣＯ２　５．０％で培養した。以後２～３日毎に培地を半分交換しながら培養した。また、ＣＤ４５－ＢＶ４２１、ＣＤ５６－ＦＩＴＣ、及びＣＤ１９－ＰＣ７で染色し、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞及びＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞についてＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩにて解析した（図２４～２７）。ＣＤ４５－ＢＶ４２１及びＣＤ５６－ＦＩＴＣはナチュラルキラー細胞の細胞表面マーカーであり、ＣＤ４５－ＢＶ４２１及びＣＤ１９－ＰＣ７はＢ細胞の細胞表面マーカーである。
　図２４に示すように、全体の細胞数、及びＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞数は、ＭＢＸ（＋）＋ＩＬ－３群では２カ月以上にわたって指数関数的に増加したが、ＭＢＸ（－）群（感染なし、または空のウイルスベクター）では培養５０日目以降、徐々に増加が止まった。ＭＢＸ（＋）群は、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞の増殖が乏しかったので、３８日で培養を中止した。
　また、図２５に示すように、ＭＢＸ（－）群ではＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞集団の割合が培養３０日目で８９．９％、ｄａｙ６４で３２．９％と減少し、一方で、ＭＢＸ（＋）＋ＩＬ－３群ではｄａｙ３０で５５．９％、ｄａｙ６６で６９．２％と、６６日を過ぎても５０％以上の高い割合で細胞集団が確認された。
　よって、ＭＢＸ（＋）＋ＩＬ－３群では、高い増殖能を有するＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞を得ることができ、不老化ナチュラルキラー細胞を高効率に多く作製することに成功した。
　また、図２６及び２７に示すように、ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞集団も出現し、ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞数は、ＭＢＸ（＋）＋ＩＬ－３群では２カ月以上にわたって指数関数的に増加したが、ＭＢＸ（－）群（感染なし、または空のウイルスベクター）では培養５０日目以降、徐々に増加が止まった。ＭＢＸ（＋）群は、ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞の増殖が乏しかったので、３８日で培養を中止した。
　よって、ＭＢＸ（＋）＋ＩＬ－３群では、高い増殖能を有するＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞を得ることができ、不老化Ｂ細胞を高効率に多く作製することに成功した。
　以上の結果から、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬＸＬ（ＭＢＸ）を強制発現し、ＩＬ－３を添加して培養することで、不老化ナチュラルキラー細胞や不老化Ｂ細胞等の、不老化リンパ球細胞を得ることができることができた。
実施例６：骨髄球・巨核球
　すでにＭＢＸ導入により増殖性を向上させたヒトｉＰＳ細胞から誘導した巨核球、骨髄球で実験を行った。培養には基礎培地としてＩＭＤＭ＋を用いた。さらに巨核球は、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＴＰＯで、骨髄球は、Ｍ－ＣＳＦ　５０ｎｇ／ｍＬ，ＧＭ－ＣＳＦ　５０ｎｇ／ｍＬ，Ｇ－ＣＳＦ　２５ｎｇ／ｍＬ，ＩＬ－３　２５ｎｇ／ｍＬ，ＳＣＦ　２５ｎｇ／ｍＬ，ＴＰＯ　５ｎｇ／ｍＬでそれぞれ培養を行った。
巨核球
　ｄｏｘ　ｏｆｆ（ＭＢＸ　ｏｆｆ）として、３日目にＦＡＣＳ　ａｒｉａＩＩＩでＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ－未分化巨核球と、ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋分化巨核球をそれぞれ、ｓｏｒｔｉｎｇして純化した後、再び１μｇ／ｍｌ　Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを加えた群、そのままｄｏｘ　ｏｆｆを継続した群に分けて、細胞数カウント、ＦＡＣＳによる表面マーカーの確認を行った。すなわち、以下の計４グループについて試験を行った。
Ｉ）　　ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ－未分化巨核球＋ｄｏｘ　ｏｎ
ＩＩ）　ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ－未分化巨核球　ｄｏｘ　ｏｆｆ
ＩＩＩ）ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋分化巨核球＋ｄｏｘ　ｏｎ
ＩＶ）　ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋分化巨核球　ｄｏｘ　ｏｆｆ
　結果を図２８上に示す。グループＩ）ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ－未分化巨核球＋ｄｏｘ　ｏｎ、グループＩＩＩ）ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋分化巨核球＋ｄｏｘ　ｏｎのどちらも、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ＋群では、細胞が指数関数的に増殖し、また全ての細胞が、ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ－未分化巨核球の状態に戻った。一方、ｄｏｘ　ｏｆｆにしたグループＩＩ）ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ－未分化巨核球　ｄｏｘ　ｏｆｆ、グループＩＶ）ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋分化巨核球　ｄｏｘ　ｏｆｆでは、細胞増殖が停止し、ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋分化巨核球となった。この結果から、分化巨核球（ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋）にＭＢＸを強制発現すると、増殖能を有する未分化巨核球（巨核球前駆細胞、ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ－）へ戻ることが示唆された（前駆細胞リプログラミング）。一方、ＭＢＸを発現する未分化巨核球（巨核球前駆細胞、ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ－）のＭＢＸ発現を停止すると、増殖能を失い、成熟した巨核球（ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋）へと分化することが示唆された。
骨髄球
　ｄｏｘ　ｏｆｆ（ＭＢＸ　ｏｆｆ）として、３日目にＦＡＣＳ　ａｒｉａＩＩＩでＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ－未分化マクロファージと、ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋分化マクロファージをそれぞれ、ｓｏｒｔｉｎｇして純化した後、再び１μｇ／ｍｌ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを加えた群、そのままｄｏｘ　ｏｆｆを継続した群に分けて、細胞数カウント、ＦＡＣＳによる表面マーカーの確認を行った。すなわち、以下の計４グループについて試験を行った。
Ｉ）　　ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ－未分化マクロファージ＋ｄｏｘ　ｏｎ
ＩＩ）　ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ－未分化マクロファージｄｏｘ　ｏｆｆ
ＩＩＩ）ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋分化マクロファージ＋ｄｏｘ　ｏｎ
ＩＶ）　ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋分化マクロファージｄｏｘ　ｏｆｆ
　結果を図２８下に示す。グループＩ）ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ－未分化マクロファージ＋ｄｏｘ　ｏｎ、グループＩＩＩ）ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋分化マクロファージ＋ｄｏｘ　ｏｎのどちらも、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ＋群では、細胞が指数関数的に増殖し、また全ての細胞が、ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ－未分化マクロファージの状態に戻った。
　一方、ｄｏｘ　ｏｆｆにしたグループＩＩ）ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ－未分化マクロファージｄｏｘ　ｏｆｆ、グループＩＶ）ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋分化マクロファージｄｏｘ　ｏｆｆでは、細胞増殖が停止し、ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋分化マクロファージとなった。この結果から、分化マクロファージ（ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋）にＭＢＸを強制発現すると、増殖能を有する未分化マクロファージ（ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ－）へ戻ることが示唆された（前駆細胞リプログラミング）。一方、ＭＢＸを発現する未分化マクロファージ（ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ－）のＭＢＸ発現を停止すると、増殖能を失い、成熟したマクロファージ（ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋）へと分化することが示唆された。
実施例７―１：不老化血管内皮細胞との共培養
　Ｎｏｔｃｈと、Ｎｏｔｃｈ　リガンド（Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ４（以下、ＤＬＬ４）やＪａｇｇｅｄ　１等）との相互作用によって伝達されるｎｏｔｃｈシグナルが、細胞の分化に必要であることが知られている。
　また、ｄｏｘ　ｏｎにした不老化血管内皮細胞、ｄｏｘ　ｏｆｆにした不老化血管内皮細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、及びヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対しＰＣＡ（主成分分析）を行った結果、ｄｏｘ　ｏｆｆにした不老化血管内皮細胞の主成分は、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）及びヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の主成分と類似していることが分かった（図２９）。さらに、ｄｏｘ　ｏｆｆにした不老化血管内皮細胞では、ｄｏｘ　ｏｎにした不老化血管内皮細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、及びヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と比べて、ＤＬＬ４及びＪａｇｇｅｄ　１が強く発現していることが分かった（図３０）。
　そこで、造血幹細胞又は造血前駆細胞からリンパ球への分化に、不老化血管内皮細胞が与える影響を調べた。
実施例７―２：不老化血管内皮細胞と、ＣＤ３４陽性臍帯血細胞との共培養
　本試験で使用した不死化血管内皮細胞は、実施例２に従い、ＭＢＸ導入で増殖性を向上させた血管内皮細胞を、ｄｏｘ　ｏｆｆで７日間培養して得られた成熟させ、放射線照射して増殖を止めた血管内皮細胞である。
　６ｗｅｌｌプレートのｗｅｌｌに０．１％　ｇｅｌａｔｉｎ　１ｍｌ／ｗｅｌｌを入れ、３０分間３７℃でインキュベートした。Ｇｅｌａｔｉｎを取り除き、不老化血管内皮細胞を２－３×１０＾５　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで、基本培地で播種し、３７℃、ＣＯ２　５．０％で培養した。翌日、培地を除去し、ＣＤ３４陽性臍帯血細胞　５×１０＾３　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌをＣＤ３４陽性臍帯血細胞由来造血前駆細胞用基本培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１０＋１０％　ＢＳＡ）で播種した。また不老化血管内皮細胞を播種していないｗｅｌｌ（コントロール、ｆｅｅｄｅｒ　ｆｒｅｅ）にもＣＤ３４陽性臍帯血細胞　５×１０＾３　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌをＣＤ３４陽性臍帯血細胞由来造血前駆細胞用基本培地で播種した。サイトカインの条件はＣｙｔｏｋｉｎｅ１～４の４種類を用意し、全て３７℃、ＣＯ２　５．０％で培養した。以後２－３日毎に培地を半分交換しながら培養し、培養２４日目にナチュラルキラー細胞の細胞表面マーカーであるＣＤ４５－ＢＶ４２１及びＣＤ５６－ＦＩＴＣで染色し、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞についてＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩで解析した（図３１～３２）。Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１～４の条件を以下に示す。
・Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１：
Ｘ－ＶＩＶＯ１０＋１０％　ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５
・Ｃｙｔｏｋｉｎｅ２：
Ｘ－ＶＩＶＯ１０＋１０％　ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－２＋５０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ
・Ｃｙｔｏｋｉｎｅ３：
Ｘ－ＶＩＶＯ１０＋１０％　ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－２＋５０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ＋１０ｐｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ＋２５０ｐｇ／ｍｌ　Ｇ－ＣＳＦ＋５０ｐｇ／ｍｌ　ＩＬ－６
・Ｃｙｔｏｋｉｎｅ４：
ｄａｙ０－９；Ｘ－ＶＩＶＯ１０＋１０％　ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋５０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ＋１０ｐｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ＋２５０ｐｇ／ｍｌ　Ｇ－ＣＳＦ＋５０ｐｇ／ｍｌ　ＩＬ－６
ｄａｙ９－１４；Ｘ－ＶＩＶＯ１０＋１０％　ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５＋１０ｐｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ＋２５０ｐｇ／ｍｌ　Ｇ－ＣＳＦ＋５０ｐｇ／ｍｌ　ＩＬ－６
ｄａｙ１４－；Ｘ－ＶＩＶＯ１０＋１０％　ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－２＋１０ｐｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ＋２５０ｐｇ／ｍｌ　Ｇ－ＣＳＦ＋５０ｐｇ／ｍｌ　ＩＬ－６
　図３１に示すように、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１～４の全ての条件で、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞集団が出現し、また、不老化血管内皮細胞と共培養しなかった場合（ｆｅｅｄｅｒ　ｆｒｅｅ）よりも、不老化血管内皮細胞と共培養した場合（ｉｍ　ＥＣ）の方が、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞集団の割合が高かった。
　また、図３２に示すように、細胞の絶対数に注目しても、同じサイトカイン条件で培養した細胞同士を比べると（例えば、ｉｍ　ＥＣ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ３とｆｅｅｄｅｒ　ｆｒｅｅ　ｃｙｔｋｉｎｅ２）、不老化血管内皮細胞と共培養した方が、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋細胞の数が多かった。
　以上の結果から、不老化血管内皮細胞と一緒に共培養することで、造血幹細胞又は造血前駆細胞のナチュラルキラー細胞への分化を促進できることが分かった。また、ナチュラルキラー細胞へ分化する前の中間体であるリンパ球前駆細胞への分化を促進できることが分かった。
実施例７―３：不老化血管内皮細胞又は遺伝子組換え型ＤＬＬ４と、ｉＰＳ細胞由来ヒト造血幹細胞との共培養
　本試験で使用した不死化血管内皮細胞は、実施例２に従い、ＭＢＸ導入で増殖性を向上させた血管内皮細胞を、ｄｏｘ　ｏｆｆで７日間培養して得られた成熟させ、放射線照射して増殖を止めた血管内皮細胞である。
　６ｗｅｌｌプレートのｗｅｌｌに０．１％　ｇｅｌａｔｉｎ　１ｍｌ／ｗｅｌｌを入れ、３０分間３７℃でインキュベートした。Ｇｅｌａｔｉｎを取り除き、不老化血管内皮細胞を２～３×１０＾５　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで、基本培地（ＩＭＤＭ＋１５％　ＦＢＳ＋１０μｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ＋５．５μｇ／ｍｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ＋５ｎｇ／ｍｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ＋２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋０．４５ｍＭ　α－ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５０μｌ／ｍｌ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ）で播種し、３７℃、ＣＯ２　５．０％で培養した。また別ｗｅｌｌで遺伝子組換え型ＤＬＬ４を播種し、４℃で冷蔵した。翌日、培地を除去し、ｉＰＳ由来のヒト造血幹細胞　８．４×１０＾４　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌをｉＰＳ細胞由来造血前駆細胞用基本培地（ＩＭＤＭ＋１５％　ＦＢＳ＋１０μｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ＋５．５μｇ／ｍｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ＋５ｎｇ／ｍｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ＋２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋０．４５ｍＭ　α－ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５０μｌ／ｍｌ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ＋１０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３Ｌ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ）で播種した。ドキシサイクリン誘導性のｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ（ＭＢＸ）ウイルスベクターを加え、さらにＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを１μｇ／ｍｌで添加し、全て３７℃、ＣＯ２　５．０％で培養した。以後２～３日毎に培地を半分交換しながら培養した。その後、Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるＣＤ４５－ＢＶ４２１及びＣＤ１９－ＰＣ７で染色し、ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞についてＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩで解析した（図３３）。
　図３３に示すように、遺伝子組換え型ＤＬＬ４と共培養した場合よりも、不老化血管内皮細胞と共培養した場合（ｉｍ　ＥＣ）の方が、ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞集団の割合及び細胞の絶対数が大きかった。よって、不老化血管内皮細胞は、ＤＬＬ４以外にも、Ｊａｇｇｅｄ　１等の他のＮｏｔｃｈ　リガンドも高発現している可能性が考えられた。
　以上の結果から、遺伝子組換え型ＤＬＬ４と共培養するよりも、不老化血管内皮細胞と一緒に共培養する方が、造血幹細胞又は造血前駆細胞のＢ細胞等のリンパ球系細胞への分化をさらに促進できることが分かった。また、Ｂ細胞へ分化する前の中間体であるリンパ球前駆細胞への分化をさらに促進できることが分かった。
実施例７－４：ＩＬ－３を投与した、不老化血管内皮細胞と、ｉＰＳ細胞由来ヒト造血幹細胞との共培養
　本試験で使用した不死化血管内皮細胞は、実施例２に従い、ＭＢＸ導入で増殖性を向上させた血管内皮細胞を、ｄｏｘ　ｏｆｆで７日間培養して得られた成熟させ、放射線照射して増殖を止めた血管内皮細胞である。
　６ｗｅｌｌプレートのｗｅｌｌに０．１％　ｇｅｌａｔｉｎ　１ｍｌ／ｗｅｌｌを入れ、３０分間３７℃でインキュベートした。Ｇｅｌａｔｉｎを取り除き、不老化血管内皮細胞を２～３×１０＾５　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで、基本培地（ＩＭＤＭ＋１５％　ＦＢＳ＋１０μｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ＋５．５μｇ／ｍｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ＋５ｎｇ／ｍｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ＋２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋０．４５ｍＭ　α－ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５０μｌ／ｍｌ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ）で播種し、３７℃、ＣＯ２　５．０％で培養した。翌日、培地を除去し、ｉＰＳ由来のヒト造血幹細胞　８．４×１０＾４　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌをｉＰＳ細胞由来造血前駆細胞用基本培地（ＩＭＤＭ＋１５％　ＦＢＳ＋１０μｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ＋５．５μｇ／ｍｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ＋５ｎｇ／ｍｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ＋２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋０．４５ｍＭ　α－ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ＋５０μｌ／ｍｌ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３Ｌ＋５０ｎｇ／ｍｌ　ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７＋２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－１５）で播種した。ドキシサイクリン誘導性のｃ－ＭＹＣ＋ＢＭＩ１＋ＢＣＬＸＬ（ＭＢＸ）ウイルスベクターを加え、さらにＤｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを１μｇ／ｍｌで添加し、全て３７℃、ＣＯ２　５．０％で培養した。最初の１週間のみＩＬ－３を２０ｎｇ／ｍｌで投与した。以後２～３日毎に培地を半分交換しながら培養した。その後、ＣＤ４５－ＢＶ４２１、ＣＤ５６－ＦＩＴＣ、及びＣＤ１９－ＰＣ７で染色し、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞及びＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞についてＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩで解析した（図３４）。ＣＤ４５－ＢＶ４２１及びＣＤ５６－ＦＩＴＣはナチュラルキラー細胞の細胞表面マーカーであり、ＣＤ４５－ＢＶ４２１及びＣＤ１９－ＰＣ７はＢ細胞の細胞表面マーカーである。培養に用いた各培地の組成は以下に示す。
　図３４に示すように、不老化血管内皮細胞と共培養しなかった場合（ｆｅｅｄｅｒ　ｆｒｅｅ）よりも、不老化血管内皮細胞と共培養した場合（ｉｍ　ＥＣ）の方が、ＣＤ４５＋／ＣＤ５６＋の細胞集団及びＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋の細胞集団の割合が高かった。
　以上の結果から、不老化血管内皮細胞と一緒に共培養することで、造血幹細胞又は造血前駆細胞のナチュラルキラー細胞又はＢ細胞への分化を促進できることが分かった。また、ナチュラルキラー細胞又はＢ細胞へ分化する前の中間体であるリンパ球前駆細胞への分化を促進できることが分かった。

Claims (40)

  1. 　（ｉ）任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、並びに
    　（ｉｉ）高分化度を有する巨核球、及び骨髄球
    からなる群から選択される細胞において、
    ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、
    細胞分化度の調節方法。
  2. 　前記細胞が、任意の分化度を有する間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現しない間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記細胞が、任意の分化度を有する血管内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記細胞が、任意の分化度を有する平滑筋細胞である、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記細胞が、任意の分化度を有する血管平滑筋細胞である、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記細胞が、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、又はＣＤ３４の細胞表面マーカーを発現する血管平滑筋細胞である、請求項１に記載の方法。
  9. 　前記細胞が、任意の分化度を有する神経堤細胞である、請求項１に記載の方法。
  10. 　前記細胞が、任意の分化度を有するリンパ球である、請求項１に記載の方法。
  11. 　前記細胞が、ＣＤ４１及びＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーを発現する巨核球である、請求項１に記載の方法。
  12. 　前記細胞が、ＣＤ１４及びＣＤ１１ｂの細胞表面マーカーを発現する骨髄球である、請求項１に記載の方法。
  13. 　ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  14. 　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子を強制発現させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  15. 　ＢＣＬ－ＸＬ遺伝子の発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  16. 　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子及びＰ５３遺伝子の少なくともいずれかの発現、又はその発現産物の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  17. 　請求項１に記載の方法で得られた細胞を培養する工程を含む、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の前駆細胞の製造方法。
  18. 　請求項１に記載の方法で得られた細胞を分化する工程を含む、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、リンパ球、巨核球、又は骨髄球の分化細胞の製造方法。
  19. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法で得られた細胞。
  20. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法で得られた細胞を含む、医薬組成物。
  21. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法で得られた細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
  22. 　ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる分子を有効成分として含む、
    　（ｉ）任意の分化度を有する間葉系幹細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経堤細胞、及びリンパ球、並びに
    　（ｉｉ）高分化度を有する巨核球、及び骨髄球
    からなる群から選択される細胞用の、細胞分化調節剤。
  23. 　任意の分化度を有する間葉系幹細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する間葉系幹細胞の製造方法。
  24. 　任意の分化度を有する間葉系幹細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現しない間葉系幹細胞である、請求項２３に記載の製造方法。
  25. 　任意の分化度を有する間葉系幹細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞である、請求項２３に記載の製造方法。
  26. 　増殖能を有する間葉系幹細胞が、ＣＤ９０の細胞表面マーカーを発現する、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の製造方法。
  27. 　任意の分化度を有する血管内皮細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する血管内皮細胞の製造方法。
  28. 　任意の分化度を有する平滑筋細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する平滑筋細胞の製造方法。
  29. 　任意の分化度を有する平滑筋細胞が、血管平滑筋細胞である、請求項２８に記載の製造方法。
  30. 　血管平滑筋細胞が、ＣＤ１４０ｂ、ＫＤＲ、又はＣＤ３４の細胞表面マーカーを発現する血管平滑筋細胞である、請求項２９に記載の製造方法。
  31. 　任意の分化度を有する神経堤細胞において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する神経堤細胞の製造方法。
  32. 　任意の分化度を有するリンパ球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有するリンパ球の製造方法。
  33. 　ＣＤ４１及びＣＤ４２ｂの細胞表面マーカーを発現する巨核球において、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有する巨核球の製造方法。
  34. 　ＣＤ１４及びＣＤ１１ｂの細胞表面マーカーを発現するマクロファージにおいて、ＭＹＣファミリー遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を強制発現させる工程を含む、増殖能を有するマクロファージの製造方法。
  35. 　不老化血管内皮細胞、及び、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞を共培養する工程を含む、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞又は造血前駆細胞の、リンパ球細胞又はリンパ球前駆細胞への分化を促進する方法。
  36. 　リンパ球細胞が、ＣＤ４５及びＣＤ５６、又は、ＣＤ１９及びＣＤ４５の細胞表面マーカーを発現する、請求項３５に記載の方法。
  37. 　リンパ球細胞が、ナチュラルキラー細胞又はB細胞である、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 　造血幹細胞又は造血前駆細胞が、臍帯血又はｉＰＳ細胞由来である、請求項３５又は３６に記載の方法。
  39. 　不老化血管内皮細胞がＮｏｔｃｈリガンドを発現している、請求項３５又は３６に記載の方法。
  40. 　ＮｏｔｃｈリガンドがＤＬＬ４及び／又はＪａｇｇｅｄ　１である、請求項３９に記載の方法。
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