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WO2024024583A1 - 次世代シーケンサー解析等のための断片化及びタグメント化方法 - Google Patents

次世代シーケンサー解析等のための断片化及びタグメント化方法 Download PDF

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Publication number
WO2024024583A1
WO2024024583A1 PCT/JP2023/026339 JP2023026339W WO2024024583A1 WO 2024024583 A1 WO2024024583 A1 WO 2024024583A1 JP 2023026339 W JP2023026339 W JP 2023026339W WO 2024024583 A1 WO2024024583 A1 WO 2024024583A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
adapter
sequence
double
stranded dna
tagment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/026339
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
貴成 武田
哲大 小林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyobo Co Ltd
Original Assignee
Toyobo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyobo Co Ltd filed Critical Toyobo Co Ltd
Priority to EP23846314.5A priority Critical patent/EP4570971A1/en
Priority to CN202380055698.4A priority patent/CN119654454A/zh
Priority to JP2024537625A priority patent/JPWO2024024583A1/ja
Publication of WO2024024583A1 publication Critical patent/WO2024024583A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
    • C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
    • C12Q2523/125—Bisulfite(s)

Definitions

  • the present invention relates to a method for generating a double-stranded DNA library, etc.
  • next-generation sequencer NGS
  • various preprocessing techniques such as fragmentation of double-stranded DNA and tagment addition for this analysis have been developed.
  • two types of transposomes are formed by adding a first tagment sequence or a second tagment sequence to a recombinant enzyme such as transposase, and these two types of transposomes randomly fragment the target double-stranded DNA.
  • tags and tagments There are known methods for creating tags and tagments.
  • two types of transposomes randomly bind to the ends of the target double-stranded DNA, which reduces the theoretical yield by half, and also makes it difficult to retain strand information, making it difficult for bisulfite sequence analysis. There are problems such as unavailability.
  • RNA sequence analysis methods that retain strand information, that is, from which strand of genomic DNA forming a double strand RNA is transcribed.
  • strand information By using strand information, it becomes possible not only to analyze non-coding genes such as antisense RNA, but also to more accurately quantify the expression of overlapping genes. Therefore, methods of fragmentation and tagment addition for retaining strand information are being developed. For example, after fragmentation, a method of adding a Y-shaped adapter (Patent Document 1), fragmentation with transposase, tagmentation of only the 5' end with the first tagment sequence, and then heat treatment of the adapter on the 3' end, etc. Methods have been reported so far, such as removing the tag and replacing the second tagment sequence (Patent Document 2 and Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently fragmenting and tagmenting double-stranded DNA using simple procedures.
  • a method for generating a double-stranded DNA library having different tagment sequences on the 5' end and 3' end comprising the following steps (i) to (iii): (i) (a) a first adapter comprising a first tagment sequence and a first transposon terminal sequence; (b) a second adapter comprising a second transposon terminal sequence having a complementary base sequence to at least a portion of the first transposon terminal sequence; (c) Fragmenting the double-stranded DNA with a transposome containing transposase and transferring either one of the first adapter and the second adapter to the 5' end or 3' end of the double-stranded DNA.
  • step (ii) a step of linking as a chain; (ii) a step of linking an additional oligo containing a second tagment sequence to the second adapter, and (iii) a non-transferred portion of the first adapter and the second adapter that is not linked to the double-stranded DNA. ligating a strand adapter to the 5' end and 3' end of the double-stranded DNA to which the transferred strand adapter was not linked in step (i); wherein said step (ii) is performed before, after, or simultaneously with said step (iii).
  • the first adapter includes a first tagment sequence on the 5' end side of the first transposon terminal sequence, and becomes a transferred strand that is linked to the 5' end of the double-stranded DNA by transposase. , the method described in Section 1.
  • the additional oligo includes a base sequence complementary to a part of the base sequence of the first adapter.
  • the transposase is a highly active Tn5 transposase
  • the first and second transposon terminal sequences are Tn5-type transposon terminal sequences.
  • step (iii) The method according to any one of Items 1 to 4, wherein in step (ii), the additional oligo is ligated to the second adapter using DNA ligase.
  • step (iii) Any one of Items 1 to 5, wherein in step (iii), an adapter of a non-transferred strand that is not connected to the double-stranded DNA is ligated to the double-stranded DNA using a DNA polymerase and a DNA ligase. The method described in.
  • the adapter of the non-transferred strand that is not linked to the double-stranded DNA is a second adapter whose 5' end side is phosphorylated, and the second adapter is connected to the two adapters.
  • step (i) a first adapter is linked as a transferred strand to the 5' end of the double-stranded DNA, and in step (ii), an additional oligo whose 5' end is phosphorylated is added. 8. The method according to any one of Items 1 to 7, wherein ligates to the 3' end of the second adapter.
  • step (i) a first adapter is linked as a transferred strand to the 5' end of the double-stranded DNA, and in step (ii), the OH group on the 3' end side is modified.
  • double-stranded DNA can be efficiently fragmented using a simpler procedure than conventional methods, and tags with different sequences can be added to the 5' and 3' ends.
  • tags with different sequences can be added to the 5' and 3' ends.
  • the method of the present invention there is no need to prepare two different types of transposomes.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of one embodiment of the invention. After adding a first adapter having a first tagment sequence and a first transposon terminal sequence and a second adapter having a second transposon terminal sequence to the double-stranded DNA by a tagmentase such as transposase, a second adapter is added to the double-stranded DNA. Linking an additional oligo having a tagment sequence to a second adapter, and linking an adapter that is not linked (covalently bonded) to the double-stranded DNA (non-transferred strand, the second adapter in this figure) to the double-stranded DNA.
  • a tagmentase such as transposase
  • FIG. 2 shows one embodiment of the present invention, a first adapter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, a second adapter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 3 a first adapter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 4 a second adapter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 5 shows a base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • FIG. 3 shows one embodiment of the present invention, which includes a first adapter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, a second adapter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the case in which the base sequence length of the first adapter and the second adapter is shorter than that of the example in FIG. 2.
  • FIG. 4 shows one embodiment of the present invention, which includes a first adapter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, a second adapter consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the first tagment sequence in the first adapter and the second tagment sequence in the additional oligo are not arranged at the ends, and the first and second tagment sequences are is an example of forming a cyclic structure).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of electrophoresis of the library product (adapter 2) in Example 1.
  • the pattern of the library product was confirmed using MultiNA, a microchip electrophoresis device for DNA/RNA analysis manufactured by SHIMADZU.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of electrophoresis of the library product (adapter 3) in Example 2.
  • the pattern of the library product was confirmed using MultiNA, a microchip electrophoresis device for DNA/RNA analysis manufactured by SHIMADZU.
  • the present invention provides a method for generating a double-stranded DNA library having different tagment sequences at the 5' end and 3' end using a simpler procedure than conventional methods.
  • double-stranded DNA is fragmented by a first adapter containing a first tagment sequence, a second adapter, and a transposome containing transposase, and then the second adapter contains a second tagment sequence.
  • the method of the present invention enables fragmentation and addition of tagment sequences, which are necessary in sequence analysis including NGS. Furthermore, in the tagmentation of the present invention, different tagment sequences are added to the 5' end and 3' end, making it possible, for example, to prepare a double-stranded DNA library while preserving strand information. can.
  • Generate a double-stranded DNA library (i) (a) a first adapter comprising a first tagment sequence and a first transposon terminal sequence; (b) a second adapter comprising a second transposon terminal sequence having a complementary base sequence to at least a portion of the first transposon terminal sequence; (c) Fragment the double-stranded DNA with a transposome containing transposase, and place either one of the first adapter and the second adapter as a transferred strand at the 5' end or 3' end of the double-stranded DNA.
  • step (ii) a step of linking an additional oligo containing the second tagment sequence to the second adapter; and (iii) a step of linking an additional oligo containing the second tagment sequence to the second adapter;
  • step (ii) a step of linking an additional oligo containing the second tagment sequence to the second adapter;
  • step (iii) a step of linking an additional oligo containing the second tagment sequence to the second adapter;
  • step (iii) is not limited, and step (ii) may be performed before step (iii), or step (ii) may be performed before step (ii).
  • iii) may be performed, or step (ii) and step (iii) may be performed simultaneously.
  • double-stranded DNA is fragmented by a transposome containing the above-mentioned (a), (b), and (c), and the 5' end or 3' end of the double-stranded DNA is fragmented.
  • a first adapter or a second adapter is connected to the end as a transferred strand.
  • the end to which the transferred strand is linked may be either the 5' end or the 3' end, but in one embodiment, the first adapter or the second adapter is linked to the 5' end as the transferred strand. is preferable, and it is preferable to link the first adapter as a transferred strand to the 5' end.
  • a transposome containing (a) a first adapter and (b) a second adapter is used along with (c) a transposase.
  • the first adapter (a) constituting the transposome of the present invention is a polynucleotide that includes at least a first tagment sequence and a first transposon terminal sequence.
  • the first adapter may have one or more arbitrary lengths (for example, a length of about 5 to 30 bp, preferably a length of about 7 to 25 bp, more preferably a length of about 7 to 25 bp).
  • first adapter may include a base sequence (with a length of approximately 15 to 20 bp) (herein also referred to as "arbitrary sequence of the first adapter", etc.).
  • This optional sequence of the first adapter may be present between the first tagment sequence and the first transposon terminal sequence, and/or adjacent to the first tagment sequence and different from the first transposon terminal sequence. It may be present on the opposite side (for example, when the first adapter is linked to the 5' end as a transferred strand, on the 5' end side of the first tagment sequence).
  • the arbitrary sequence of the first adapter is designed to bind complementary to a part (other than the second tagment sequence) of the additional oligo described below (preferably, the arbitrary sequence of the first adapter is (designed to complementarily bind with a part of the first transposon terminal sequence and with a part of the additional oligo (other than the second tagment sequence) described below), and the additional oligo and the second adapter It functions to make it easier to connect.
  • the arbitrary sequence of the first adapter is also referred to as a "sequence complementary to the additional oligo."
  • the first tagment sequence region and the first transposon terminal sequence region do not necessarily need to be clearly distinguished; Some of the sequences may overlap.
  • the second adapter (b) constituting the transposome of the present invention is a polynucleotide that includes at least the second transposon terminal sequence, and preferably consists of the second transposon terminal sequence.
  • the second transposon terminal sequence preferably has a base sequence that is complementary to at least a portion of the first transposon terminal sequence.
  • the first transposon terminal sequence contained in the first adapter and the second transposon terminal sequence contained in the second adapter contain mutually complementary base sequences, so that the first adapter and the second adapter Fragmented double strands that form a double strand in at least a part of the region (preferably the end region that is ultimately transferred to the fragmented double stranded DNA) through complementary base sequences. It can be easily added to the ends of DNA.
  • the first tagment sequence contained in the first adapter and the second tagment sequence linked to the second adapter are not particularly limited, but it is preferable that the two tagment sequences, the first and second, are not complementary.
  • the identity between the base sequence that is the reverse complement of the first tagment sequence and the base sequence of the second tagment sequence is preferably 70% or less, more preferably 60% or less. , more preferably 50% or less.
  • the lower limit of the identity between the base sequence that is the reverse complementary strand of the first tagment sequence and the base sequence of the second tagment sequence is not particularly limited, but preferably exceeds 0%, and is preferably 1% or more. It is preferable that Sequence identity can be determined using programs such as Blast, Clustal W, etc.
  • both ends of the double-stranded DNA are The first and second tagment sequences attached to each can be more clearly identified, and the 5' end and 3' end of the double-stranded DNA to which the first or second tagment sequences have been added can be easily distinguished. Become.
  • the first adapter particularly a region other than the first tagment sequence, preferably an arbitrary sequence region of the first adapter and/or a partial region of the first transposon terminal sequence
  • Several bases complementary to the base sequence of the additional oligo especially other than the second tagment sequence (for example, 7 bp or more, preferably 10 bp or more, more preferably 12 bp or more, still more preferably 15 bp or more, and the upper limit is particularly limited)
  • the additional oligo is not linked to the end of the first adapter in step (ii), but It becomes easier to bind complementary to the first adapter.
  • the additional oligo is aligned in close proximity to the second adapter that is complementary to the first adapter, and as a result, the additional oligo is easily linked to the end of the second adapter.
  • the 5' end of the adapter that is not the transferred strand also referred to as the non-transferred strand adapter
  • step (iii) for example, DNA ligase, etc.
  • DNA ligase for example, DNA ligase, etc.
  • the first adapter includes a first tagment sequence on the 5' end side of the first transposon terminal sequence, and becomes a transferred strand that is linked to the 5' end of the double-stranded DNA by transposase.
  • the second adapter preferably has its 5' end modified by phosphorylation or the like, and becomes a non-transferred strand that can be ligated to the 3' end of the double-stranded DNA using DNA ligase or the like.
  • the oligo DNA (referred to as additional oligo) for ligation to the second adapter includes a second tagment sequence.
  • the additional oligo is complementary to the base sequence of the first adapter (particularly a region other than the first tagment sequence, preferably an arbitrary sequence region of the first adapter and/or a partial region of the first transposon terminal sequence). It is preferable to have a continuous base sequence of several bases (for example, 7 bp or more, preferably 10 bp or more, more preferably 12 bp or more, even more preferably 15 bp or more, and the upper limit is not particularly limited, but for example, 30 bp or less).
  • the region of the second tagment sequence and the nucleotide sequence of the first adapter (in particular, a region other than the first tagment sequence, preferably an arbitrary sequence region of the first adapter and/or a part of the first transposon terminal sequence)
  • the region of the base sequence complementary to the nucleotide sequence does not necessarily have to be clearly distinguished, and some of the sequences may overlap.
  • the additional oligo thus contains the nucleotide sequence of the first adapter (particularly a region other than the first tagment sequence, preferably an arbitrary sequence region of the first adapter and/or a partial region of the first transposon terminal sequence).
  • the additional oligo By containing a complementary base sequence to the first adapter, in step (ii), the additional oligo tends to be complementary to the first adapter rather than being linked to the end of the first adapter, and as a result, the first adapter It is arranged in close proximity to the second adapter which is complementary to the oligo, and the additional oligo is easily ligated to the end of the second adapter.
  • the additional oligo may include a nucleic acid analog such as a Locked Nucleic Acid (LNA) or a Bridged Nucleic Acid (BNA).
  • the bases constituting the additional oligo contain such nucleic acid analogs such as LNA and BNA, it is possible to improve the annealing temperature between the first adapter and the additional oligo, thereby making it possible to improve the annealing temperature of the first adapter and the additional oligo.
  • This has the advantage that oligos are more likely to bind in a complementary manner.
  • the additional oligo used in the present invention further has one or more arbitrary lengths (for example, a length of about 5 to 30 bp, preferably about 5 to 30 bp, in addition to the base sequences complementary to the second tagment sequence and the first adapter base sequence).
  • This optional sequence of the additional oligo may be present at either the 5' end or the 3' end of the second tagment sequence.
  • the 5' end be adjacent to the second tagment sequence and opposite to the end to which the second adapter is ligated (for example, the 5' end with the first adapter as a transferred strand).
  • it is preferably present at the 3' end of the second tagment sequence.
  • transposase and transposon terminal sequence The transposase used in the present invention is not particularly limited, and any transposase or variant thereof known in the art can be used.
  • Tn5 transposase a variant having an amino acid sequence in which 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, inserted, or added.
  • hyperactive mutants of Tn5 transposase, MuA transposase, Sleeping Beauty transposase, piggyBac transposase, Himar1 transposase, Mos1 transposase, or mutants thereof for example, Picelli et al., Genome Res .24(12):2033-40, 2014, M. Zhou, and WS Reznikoff, J. Mol. Biol., 271, 362-373, 1997, TW Wiegand, and WS Reznikoff, J.
  • Tn5 transposase or its mutant Tn5-type transposase is more preferred, and Tn5 transposase mutant (highly active Tn5 transposase) is particularly preferred.
  • the transposon end sequence (a unique double-stranded sequence recognized by the transposase) used in combination with the transposase will be used. Usually, one strand will be the transferred strand and the other strand will be the non-transferred strand. ) are different.
  • the transposon terminal sequence used in the present invention does not need to be a full-length sequence, and may be a part of a base sequence known as a transposon terminal sequence as long as the effect of the present invention is achieved.
  • a transposon terminal sequence serving as a non-transferred strand can be used in the present invention if it has a length of at least 10 bp (preferably at least 11 bp, more preferably at least 12 bp).
  • a transposon end sequence with a base length of at least 10 bp is obtained by deleting the 3' end of the base sequence of the transposon end sequence that is known to be a non-transferred strand.
  • transposon terminal sequences that become non-transferred strands.
  • transposon terminal sequence used when the transposase exhibits transposition activity on double-stranded DNA is not the same as shown here; Any terminal sequence can be used in the present invention.
  • a sequence complementary to the first tagment sequence and the additional oligo is added to the 5' end of the first transposon terminal sequence.
  • 5'- TCGTCGGCAGCGTCCTCGTGTGCTACTTGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 3) is used as the first adapter which becomes the transferred strand
  • 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' (SEQ ID NO: 4) was used as a second adapter for the non-transferred strand
  • 5'-TCAAGTAGCACACGAGCCGAGCCCACGAGAC-3' can be used as an additional oligo.
  • the 5' ends of the second adapter and additional oligo may be phosphorylated.
  • the 3' terminal side of the additional oligo may be modified with an OH group (for example, modified with a phosphate group or inverted dT).
  • the non-transferred strand can also be shorter.
  • the total length of the non-transferred strand (or the second adapter that can become the non-transferred strand) can be shortened to about 10 bp to 19 bp, preferably about 11 bp to 19 bp, more preferably about 12 bp to 19 bp, even more preferably 14 bp to 19 bp.
  • a non-transferred strand of about 19 bp can be used.
  • 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGCTAGCTAGCAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 6) is used as the first adapter which becomes the transferred strand
  • 5'-CTGTCTCTTATACAC-3' (SEQ ID NO: 7) was used as a second adapter for the non-transferred strand
  • 5'-ATCTGCTAGCTAGCTCCGAGCCCACGAGAC-3' (SEQ ID NO: 8) can be used as an additional oligo.
  • the 5' ends of the second adapter and additional oligo may be phosphorylated.
  • the 3' terminal side of the additional oligo may be modified with an OH group (for example, modified with a phosphate group or inverted dT).
  • an OH group for example, modified with a phosphate group or inverted dT.
  • the first tagment sequence may be incorporated into a sequence complementary to the additional oligo in the first adapter.
  • sequences complementary to the additional oligo may be present at the 5' end and 3' end of the first tagment sequence.
  • 5'-CTCGTGTGCTACTTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 9) is used as the first adapter which becomes the transferred strand
  • 5'-CTGTCTCTTATA-3' (SEQ ID NO: 10) was used as a second adapter for the non-transferred strand
  • 5'-CACATCTCCGAGCCCACGAGACTCAAGTAGCACACGAG-3' (SEQ ID NO: 11) can be used as an additional oligo.
  • the 5' ends of the second adapter and additional oligo may be phosphorylated.
  • the 3' terminal side of the additional oligo may be modified with an OH group (for example, modified with a phosphate group or inverted dT).
  • the first tagment sequence and the second tagment sequence form a circular structure sandwiched between double-stranded regions, but in the present invention, Such a tagment sequence may be added to double-stranded DNA.
  • the first and second tagment sequences are present at positions closer to the ends of the double-stranded DNA. There is an advantage that the reaction can proceed more efficiently when performing PCR or the like using primers.
  • transposome used in the present invention is characterized by containing at least the above-mentioned (a) first adapter, (b) second adapter, and (c) transposase.
  • the method of adding the first and second adapters to transposase is not particularly limited, but for example, in addition to Non-Patent Document 1, methods described in Picelli et al., Genome Res.24(12):2033-40, 2014, etc. There are several methods that can be used.
  • the reaction temperature and time of the transposase treatment ((i) step of reacting the transposome with the double-stranded DNA)
  • the temperature at which the transposome and the double-stranded DNA are reacted depends on the transposase used, the sequence and length of the first adapter, and the It can be set as appropriate depending on the sequences and lengths of the two adapters, their combinations, etc.
  • the reaction temperature is preferably 30°C or higher and 65°C or lower, more preferably 37°C or higher and 60°C or lower, and even more preferably 50°C or higher and 60°C or lower.
  • the reaction time is preferably 1 minute or more, more preferably 3 minutes or more, even more preferably 5 minutes or more.
  • the upper limit of the reaction time is not particularly limited, but may be, for example, 24 hours or less, preferably 12 hours or less, more preferably 6 hours or less, even more preferably 3 hours or less.
  • the concentration of transposase in the reaction solution for reacting transposomes with double-stranded DNA is not particularly limited as long as it exhibits transposase activity, but it is preferably 10 pg/ ⁇ L or more.
  • the reaction solution used for the transposase treatment is not particularly limited as long as it exhibits transposase activity, and may contain other additives.
  • N,N-dimethylformamide or polyethylene glycol increases the efficiency of NGS library preparation using transposon reactions, and can be preferably used (Picelli et al., Genome Res. 24 (12):2033-40, 2014).
  • buffers, salts, organic solvents, polymers, surfactants, chelating agents, proteins, combinations of two or more of these, and the like may be used as additives.
  • buffers examples include Tris, Bis-Tris, Tricine, Bis-Tricine, Hepes, Mops, Tes, and Taps. (Taps), Pipes, Caps, phosphoric acid, acetic acid, and combinations of two or more of these. Buffers are usually dissolved in water (preferably nuclease-free water) and used in the form of an aqueous solution.
  • salts include chlorides (e.g., lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, manganese chloride, ammonium chloride), acetates (e.g., lithium acetate, sodium acetate, potassium acetate, magnesium acetate, manganese acetate, (ammonium acetate), sulfates (eg, potassium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate, ammonium sulfate), and combinations of two or more of these.
  • chlorides e.g., lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, manganese chloride, ammonium chloride
  • acetates e.g., lithium acetate, sodium acetate, potassium acetate, magnesium acetate, manganese acetate, (ammonium acetate)
  • sulfates eg, potassium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate, ammoni
  • organic solvent examples include alcohols (eg, ethanol, methanol, polyethylene glycol), aprotic solvents such as N,N-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide, and combinations of two or more of these.
  • alcohols eg, ethanol, methanol, polyethylene glycol
  • aprotic solvents such as N,N-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide
  • Surfactants include anionic surfactants (e.g., sodium dodecyl sulfate, sodium cholate, sodium deoxycholate), cationic surfactants (e.g., cetyltrimethylammonium bromide), nonionic surfactants (e.g., cetyltrimethylammonium bromide), For example, octylphenol ethoxylate, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate), and amphoteric surfactants (such as 3-[(3-col (amidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid) and the like, but are not limited to these.
  • anionic surfactants e.g., sodium dodecyl sulfate, sodium cholate, sodium deoxycholate
  • cationic surfactants e.g., cetyltrimethylammonium bro
  • Chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA), nitrilotriacetic acid (NTA), phenanthroline, maleic acid, citric acid, tricine, trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N , N',N'-tetraacetic acid (CDTA), tartaric acid, nicotinamide, hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), phytic acid, and the like, but are not limited to these.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGTA glycol etherdiaminetetraacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • CDTA trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N , N',N'-tetraacetic acid
  • HIDA hydroxyethyliminodiacetic acid
  • proteins include, but are not limited to, fetal bovine serum albumin (BSA).
  • BSA fetal bovine serum albumin
  • the method for linking the additional oligo to the second adapter is not particularly limited, but it is preferably carried out by an enzymatic reaction, more preferably by using polynucleotide ligase, and by DNA ligase. It is particularly preferable that there be.
  • polynucleotide ligase the origin of the enzyme is not particularly limited, but DNA ligase derived from T4 phage, DNA ligase derived from T3 phage, DNA ligase derived from T7 phage, DNA ligase derived from Escherichia coli or its mutant, or Lucigen.
  • a DNA ligase is used, such as Ampligase® Thermostable DNA ligase, sold by Ampligase®.
  • the gap can be filled by an enzyme reaction such as DNA polymerase (gap repair). This gap repair may be performed simultaneously with the ligation using polynucleotide ligase, or may be performed separately.
  • the enzyme used for gap repair and ligation is not particularly limited, but it is preferable to use DNA polymerase and polynucleotide ligase.
  • DNA polymerase is not particularly limited, it is preferable to use DNA polymerase derived from T4 phage, DNA polymerase I derived from Escherichia coli, or Klenow fragment, which is a fragment of DNA polymerase I derived from Escherichia coli. It is more preferable to use an enzyme that hardly exhibits DNA strand displacement activity.
  • the origin of the enzyme for polynucleotide ligase is not particularly limited, but heat-stable DNA ligase such as Ampligase (registered trademark) Thermostable DNA ligase sold by Lucigen, DNA ligase derived from T4 phage, and DNA ligase derived from Escherichia coli may be used. Preferably, DNA ligase is used.
  • the concentration of these enzymes is not particularly limited as long as they exhibit activity, but the concentration of polynucleotide ligase is 0.01 U/ ⁇ L. As mentioned above, it is preferable that the concentration of DNA polymerase is 0.005 U/ ⁇ L or more. Further, the reaction solution used for the linking process in this enzyme reaction is not particularly limited as long as it exhibits enzyme activity, and may contain other additives.
  • polynucleotide ligases such as DNA ligase derived from T4 phage require adenosine triphosphate (ATP) to exert their activity; It is known that polynucleotide ligases such as DNA ligase derived from E. coli require nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to exert their activity. Furthermore, DNA polymerases usually require deoxyribonucleotides to exert their activity. In addition, for example, buffers, salts, organic solvents, polymers, surfactants, chelating agents, proteins, combinations of two or more of these, and the like may be used as additives.
  • ATP adenosine triphosphate
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • DNA polymerases usually require deoxyribonucleotides to exert their activity.
  • buffers examples include Tris, Bis-Tris, Tricine, Bis-Tricine, Hepes, Mops, Tes, and Taps. (Taps), Pipes, Caps, phosphoric acid, acetic acid, and combinations of two or more of these. Buffers are usually dissolved in water (preferably nuclease-free water) and used in the form of an aqueous solution.
  • salts include chlorides (e.g., lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, manganese chloride, ammonium chloride), acetates (e.g., lithium acetate, sodium acetate, potassium acetate, magnesium acetate, manganese acetate, (ammonium acetate), sulfates (eg, potassium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate, ammonium sulfate), and combinations of two or more of these.
  • chlorides e.g., lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, manganese chloride, ammonium chloride
  • acetates e.g., lithium acetate, sodium acetate, potassium acetate, magnesium acetate, manganese acetate, (ammonium acetate)
  • sulfates eg, potassium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate, ammoni
  • organic solvent examples include alcohols (eg, ethanol, methanol, polyethylene glycol), aprotic solvents such as N,N-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide, and combinations of two or more of these.
  • alcohols eg, ethanol, methanol, polyethylene glycol
  • aprotic solvents such as N,N-dimethylformamide and dimethyl sulfoxide
  • Surfactants include anionic surfactants (e.g., sodium dodecyl sulfate, sodium cholate, sodium deoxycholate), cationic surfactants (e.g., cetyltrimethylammonium bromide), nonionic surfactants (e.g., cetyltrimethylammonium bromide), For example, octylphenol ethoxylate, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate), and amphoteric surfactants (e.g., 3-[(3-col) (amidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid) and the like, but are not limited to these.
  • anionic surfactants e.g., sodium dodecyl sulfate, sodium cholate, sodium deoxycholate
  • cationic surfactants e.g., cetyltrimethyl
  • Chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA), nitrilotriacetic acid (NTA), phenanthroline, maleic acid, citric acid, tricine, trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N , N',N'-tetraacetic acid (CDTA), tartaric acid, nicotinamide, hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), phytic acid, and the like, but are not limited to these.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGTA glycol etherdiaminetetraacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • CDTA trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N , N',N'-tetraacetic acid
  • HIDA hydroxyethyliminodiacetic acid
  • proteins include, but are not limited to, fetal bovine serum albumin (BSA).
  • BSA fetal bovine serum albumin
  • reaction solution used in step (i) can be used as it is, and the enzyme described above can be added thereto to perform step (ii) (linking of the additional oligo to the second adapter). Good too.
  • the method for linking the non-transferred strand (for example, second adapter) to double-stranded DNA is not particularly limited, but it is preferably carried out by an enzymatic reaction.
  • an enzymatic reaction When linking a non-transferred strand to an adapter double-stranded DNA by an enzymatic reaction, it is preferable to phosphorylate the 5' end of the non-transferred strand. In some embodiments, it is preferable to perform gap repair because there may be a distance of several bases between the non-transferred strand by transposase and the double-stranded DNA.
  • Gap repair between the adapter of the non-transferred strand and the double-stranded DNA may be performed simultaneously with the ligation of the additional oligo to the second adapter in (ii) above, or may be performed separately.
  • the same enzyme is commonly used as (ii) the enzyme that connects the additional oligo to the second adapter and (iii) the enzyme that connects the non-transferred strand adapter to the double-stranded DNA.
  • separate enzymes may be used.
  • the enzyme used for gap repair and ligation is not particularly limited, but it is preferable to use DNA polymerase and polynucleotide ligase.
  • DNA polymerase is not particularly limited, it is more preferable to use DNA polymerase derived from T4 phage, DNA polymerase I derived from Escherichia coli, or Klenow fragment, which is a fragment of DNA polymerase I derived from Escherichia coli, and DNA polymerase derived from T4 phage. It is more preferable to use an enzyme that hardly exhibits DNA strand displacement activity such as.
  • the origin of the enzyme for polynucleotide ligase is not particularly limited, but heat-stable DNA ligase such as Ampligase (registered trademark) Thermostable DNA ligase sold by Lucigen, DNA ligase derived from T4 phage, or Escherichia coli-derived DNA ligase may be used. Preferably, DNA ligase is used.
  • the concentration of these enzymes is not particularly limited as long as they exhibit activity, but the concentration of polynucleotide ligase is 0.
  • the concentration of DNA polymerase is preferably 0.005 U/ ⁇ L or more.
  • the reaction solution used for the linking process in this enzyme reaction is not particularly limited as long as it exhibits enzyme activity, and may contain other additives. As other additives, for example, those similar to those described as other additives that can be suitably used in the enzyme reaction in (ii) above for linking the additional oligo to the second adapter can be used.
  • reaction temperature and time for the ligation of (ii) and (iii) Reactions during the above (ii) ligation of the additional oligo to the second adapter and the above (iii) ligation of the non-transferred strand adapter to the double-stranded DNA The conditions are not particularly limited, and the reaction conditions in both steps may be the same or different. For example, when both steps are performed under the same reaction conditions, the upper limit of the reaction temperature is not particularly limited.
  • the Tm value of the complementary sequence portion of the second transposon terminal sequence is +15°C or less, and the complementary sequence portion of the first adapter and the additional oligo (particularly the region other than the first tagment sequence (preferably the The Tm value of the complementary sequence region between the arbitrary sequence region of one adapter and/or a partial region of the first transposon terminal sequence) and the additional oligo (region other than the second tagment sequence) +15°C or less
  • the Tm value of the complementary sequence portion of the first adapter and the second adapter is preferably +10°C or less, and the Tm value of the complementary sequence portion of the first adapter and the additional oligo is +10°C or less. is more preferable.
  • the temperature is preferably 45°C or lower, more preferably 37°C or lower.
  • the lower limit of the reaction temperature in this case is not particularly limited, but in order to reduce non-specific linkage while maintaining enzyme activity, it is preferably 4°C or higher, more preferably 10°C or higher. , more preferably 15°C or higher.
  • the temperature range is preferably such that the polynucleotide ligase activity can be maintained at 10% or more and the DNA polymerase activity can be maintained at 10% or more, in order to avoid a decrease in enzyme activity due to low temperature or heat.
  • the reaction time is not particularly limited, but is preferably 5 minutes or longer, more preferably 10 minutes or longer.
  • the upper limit of the reaction time is not particularly limited, it can be, for example, 1 hour or less.
  • DNA purification is performed after any one or more of steps (i), (ii), and (iii), or after all of these steps. may or may not be performed. Furthermore, when performing the PCR reaction described below, the DNA may or may not be purified before the PCR. Furthermore, when performing NGS analysis using the double-stranded DNA library generated according to the present invention, DNA purification may or may not be performed before the NGS analysis. Purification of DNA can be performed by any method known in the art, such as a method using AMPure XP (Beckman Coulter) or similar adsorption beads, or a method using insolubilization using ethanol or polyethylene glycol. However, there are no particular limitations.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • Tagment sequences added in nucleic acid amplification methods such as PCR include, for example, index sequences used in NGS instruments such as Illumina (e.g., NextSeq TM , MiSeq TM series, etc.), sequences for hybridization on flow cells (e.g., Illumina).
  • NGS instruments such as Illumina (e.g., NextSeq TM , MiSeq TM series, etc.)
  • sequences for hybridization on flow cells e.g., Illumina
  • P5 sequence, P7 sequence manufactured by Oxford Nanopore Technologies, and sequences required for recognition of target DNA using long read sequencers (eg, MinION, GridION, PromethION) manufactured by Oxford Nanopore Technologies, etc., but are not particularly limited.
  • the method of nucleic acid amplification such as PCR is not particularly limited.
  • strand information may or may not be stored in the prepared library.
  • the target double-stranded DNA for storing strand information is not particularly limited.
  • double-stranded DNA containing uracil only on one strand is prepared by synthesizing DNA complementary to the cDNA in a reaction solution containing dUTP,
  • the DNA strand containing uracil is amplified by treatment with UNG (uracil DNA glycosylase) and/or by performing PCR using a DNA polymerase that cannot use uracil as a template (e.g., family B DNA polymerase). You can make it impossible.
  • UNG uracil DNA glycosylase
  • each DNA strand can be analyzed while preserving strand information.
  • bisulfite sequence analysis can be easily performed. For example, after methylating cytosine bases in the first tagment sequence region of the first adapter and cytosine bases in the second tagment sequence region of the additional oligo, a library is generated from double-stranded DNA, and bisulfite (sulfite The methylation state of cytosine in double-stranded DNA can be detected by treatment with hydrogen salts) or the like.
  • T-WGBS Tagmentation-based whole-genome bisulfite sequence
  • the present invention uses the first adapter in which the cytosine base in the first tagment sequence is methylated and the additional oligo in which the cytosine base in the second tagment sequence is methylated.
  • it may also be a method of generating a double-stranded DNA library used for bisulfite analysis, and by this method, it is possible to perform methylation analysis of double-stranded DNA in which at least one strand is methylated. can.
  • the target double-stranded DNA (also referred to as target double-stranded DNA) is not particularly limited, but may include genomic DNA extracted from cells, double-stranded DNA amplified by a method such as PCR, or RNA. Examples include synthesized double-stranded DNA.
  • double-stranded DNA is not only double-stranded DNA derived from one cell, tissue, organ, or organism (e.g., animals, plants, fungi, bacteria, viruses, etc.), but also double-stranded DNA derived from multiple cells, tissues, organs, or organisms. It may be double-stranded DNA derived from The amount of double-stranded DNA used in the present invention is not particularly limited.
  • Double-stranded DNA library generation kit The present invention may also be an embodiment of a kit for generating a double-stranded DNA library having different tagment sequences at the 5' end and 3' end.
  • the kit includes (a) a first adapter comprising a first tagment sequence and a first transposon terminal sequence; and (b) a second adapter having a base sequence complementary to at least a portion of the first transposon terminal sequence.
  • a transposome comprising a second adapter comprising a transposon terminal sequence; and (c) a transposase.
  • the kit preferably also contains enzymes such as polynucleotide ligase and DNA polymerase.
  • This purified Hyperactive Tn5 was dialyzed in 50 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), and 50% glycerol, the buffer was replaced, and the protein concentration was adjusted to 100 ⁇ g/mL in the dialysis buffer.
  • the diluted solution was prepared as a "purified Tn5 solution".
  • three sets of adapters shown in Table 1 below were first prepared.
  • a solution was prepared such that the concentration of the first adapter and the second adapter was 5 ⁇ M in a solution of 50 mM HEPES-KOH (pH 7.5) and 100 mM NaCl, and the solution was heated to 100°C.
  • the adapter was then annealed by cooling to 25°C at a rate of ⁇ -1°C/min. After annealing, equal amounts of 100% glycerol were mixed to prepare each "adapter solution (1, 2, 3)" which was adjusted to 50% glycerol.
  • each adapter solution (1, 2, 3) was added to 24 ⁇ L of the purified Tn5 solution and left to stand at 25°C for 60 minutes to provide each adapter, followed by dialysis buffer.
  • the mixture was diluted 100 times to prepare "Tn5 (Adapter 1),”"Tn5 (Adapter 2),” and "Tn5 (Adapter 3).”
  • Tn5 Adapter 1
  • Tn5 Adapter 2
  • Tn5 Adapter 3
  • the 5' side of the second adapter (non-transferred strand) shown in Table 2 below is not phosphorylated, and three adapter sets that cannot bind to the target double-stranded DNA in an additional reaction using DNA ligase, etc.
  • the underline indicates the first tagment sequence
  • the underline indicates the first transposon terminal sequence
  • reaction buffer Preparation of reaction buffer
  • Tn5 reaction buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15% dimethylformamide, 10 mM MgCl 2
  • additional reaction buffer 300 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM MgCl 2 , 100 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 12 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM NAD, 0.05% BSA
  • Example 1 Preparation of library for NGS using the present invention
  • a target double-stranded DNA was fragmented according to the present invention, and a tagment that added different sequences to the 5' end and 3' end was prepared.
  • the following experiment was conducted to examine whether the conversion could be performed efficiently and the library for NGS could be prepared.
  • Tn5 adapter
  • genomic DNA (1 ng) purified from HeLa S3 cells as the target double-stranded DNA
  • a Tn5 reaction solution was first prepared with the composition shown in Table 4.
  • the prepared reaction solution was reacted at 55°C for 5 minutes (Adapters 1, 2, 1NC, and 2NC) or at 50°C for 20 minutes (Adapters 3 and 3NC) to perform fragmentation and addition of the first tagment sequence. . After stopping the reaction by adding 2.5 ⁇ L of 0.15% sodium dotecyl sulfate solution, the entire amount of the additional reaction solution prepared with the composition shown in Table 5 was added.
  • a PCR reaction was performed as follows. A PCR reaction solution was prepared with the composition shown in Table 6, PCR was carried out according to the reaction cycle shown in Table 7, and an index sequence and P5 and P7 sequences for Illumina's NGS were added.
  • the nucleic acid of the PCR product after the reaction was purified using 24 ⁇ L of AMPure XP beads (Beckman Coulter) according to the manual, and eluted into 30 ⁇ L of TE buffer (Nacalai Tesque) (purified PCR nucleic acid solution). Then, using 3 ⁇ L of the purified PCR nucleic acid solution, electrophoresis was performed using MultiNA, a microchip electrophoresis device for DNA/RNA analysis manufactured by SHIMADZU, according to the manual, and the pattern of the library product was confirmed (FIG. 5).
  • Example 2 Preparation of NGS library retaining strand information using the present invention
  • fragmentation and tagmentation targeting RNA-derived double-stranded cDNA were efficiently performed using the present invention.
  • cDNA was synthesized from 1 ng of RNA purified from HeLa S3 cells using the RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN), and the 2nd strand synthesis solution shown in Table 8 was added to 9 ⁇ L of this cDNA solution. The reaction was carried out in different cycles to obtain RNA-derived double-stranded DNA.
  • RNA-derived double-stranded DNA was purified using 27 ⁇ L of AMPure XP beads (Beckman Coulter) according to the manual, and the DNA was purified with a mixture of 2.5 ⁇ L of Tn5 reaction buffer and 1.25 ⁇ L of sterile water. Eluted (purified double-stranded DNA (derived from RNA)). Thereafter, in the same manner as in Example 1, a Tn5 reaction solution was prepared with the composition shown in Table 10 using the obtained (RNA-derived) purified double-stranded DNA as the target double-stranded DNA.
  • the prepared reaction solution was reacted at 55°C for 5 minutes (Adapters 1 and 2) or at 50°C for 20 minutes (Adapter 3) to perform fragmentation and addition of the first tagment sequence. After stopping the reaction by adding 2.5 ⁇ L of 0.15% sodium dotecyl sulfate solution, the entire amount of the additional reaction solution prepared with the composition shown in Table 5 was added.
  • PCR reaction was performed as follows.
  • a PCR reaction solution was prepared with the composition shown in Table 6, PCR was carried out according to the reaction cycle shown in Table 7, and an index sequence and P5 and P7 sequences for Illumina's NGS were added.
  • DNA polymerase derived from KOD Thermococcus kodakarensis
  • the PCR product was purified using 24 ⁇ L of AMPure XP beads (Beckman Coulter) according to the manual, and eluted into 30 ⁇ L of TE buffer (Nacalai Tesque) (purified PCR nucleic acid solution). Then, using 3 ⁇ L of the purified PCR nucleic acid solution, electrophoresis was performed using MultiNA, a microchip electrophoresis device for DNA/RNA analysis manufactured by SHIMADZU, according to the manual, and the pattern of the library product was confirmed (Figure 6).
  • Tn5 adapter 1
  • Tn5 adapter 2
  • Tn5 Adapter 3
  • the present invention allows efficient fragmentation and tagmentation even from RNA-derived cDNA, making it possible to prepare a library for Illumina NGS. Furthermore, under conditions containing dUTP, about half the yield was obtained, suggesting that amplification from the 2nd strand was not possible due to the use of a polymerase that cannot amplify using uracil as a template. From this result, it can be seen that the double-stranded DNA library obtained by the method of this example is composed of the one amplified from the 1st strand and is able to retain strand information.
  • Example 3 NGS analysis of libraries prepared using the present invention Among the double-stranded DNA libraries obtained in Examples 1 and 2, genomic DNA or RNA-derived double-stranded DNA (without dUTP or NGS analysis was performed using Miseq Reagent Kit v3 and Miseq using a library prepared by treating Tn5 (adapter 1), Tn5 (adapter 2), and Tn5 (adapter 3).
  • Tn5 adapter 1
  • Tn5 adapter 2
  • Tn5 adapter 3
  • the following custom primers were added to the predetermined sequence primer solution as sequence primers.
  • the Read1 primer, Read2 primer, and Index1 Read primer attached to Miseq Reagent Kit v3 were used.
  • Read1 primer for adapter 1 5'-GCGTCCTCGTGTGCTACTTGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 12)
  • Read2 primer for adapter 1 5'-CTCGGCTCGTGTGCTACTTGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 13)
  • Index1 Read primer for adapter 1 5'-TCAAGTAGCACACGAGCCGAGCCCAGAGAC-3' (SEQ ID NO: 14)
  • Read1 primer for adapter 2 5'-GGCAGCGTCAGCTAGCTAGCAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 15)
  • Read2 primer for adapter 2 5'-GTGGGCTCGGAGCTAGCTAGCAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 16)
  • Index1 Read primer for adapter 2 5'-ACATCTGCTAGCTAGCTCCGAGCCCACGAGAC-3' (SEQ ID NO: 17)
  • the double-stranded DNA library generation method of the present invention can efficiently generate a double-stranded DNA library that can be used for sequence analysis such as NGS with a simple procedure.
  • the present invention makes it possible to easily and quickly prepare a library for genetic analysis such as next-generation sequencer (NGS) analysis.
  • NGS next-generation sequencer

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Abstract

簡単な手順で効率的に、５'末端側と３'末端側とに異なるタグメント配列を有する二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する方法が提供される。当該方法は、以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む：　（ｉ）（ａ）第一のタグメント配列及び第一のトランスポゾン末端配列を含む第一アダプターと、　（ｂ）前記第一のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有する第二のトランスポゾン末端配列を含む第二アダプターと、　（ｃ）トランスポゼースと　を含むトランスポソームによって二本鎖ＤＮＡを断片化し、該二本鎖ＤＮＡの５'末端又は３'末端に、前記第一アダプター及び前記第二アダプターのいずれか一方のアダプターを転移鎖として連結させる工程、　（ｉｉ）第二のタグメント配列を含むアディショナルオリゴを第二アダプターに連結させる工程、及び　（ｉｉｉ）前記第一アダプター及び前記第二アダプターのうち、二本鎖ＤＮＡに連結していない非転移鎖のアダプターを、該二本鎖ＤＮＡの５'末端及び３'末端のうち前記工程（ｉ）において転移鎖のアダプターを連結させていない末端に連結させる工程。

Description

次世代シーケンサー解析等のための断片化及びタグメント化方法
　本発明は、二本鎖ＤＮＡライブラリーの生成方法等に関する。
　近年、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いた解析が広く用いられるようになり、この解析のための二本鎖ＤＮＡの断片化及びタグメント付加などの前処理技術が種々開発されている。例えば、トランスポゼースなどの組換え酵素に第一のタグメント配列又は第二のタグメント配列をそれぞれ付与して二種類のトランスポソームを形成させ、これら二種類のトランスポソームによって標的二本鎖ＤＮＡをランダムに断片化及びタグメント化する方法などが知られている。しかし、この方法では、二種類のトランスポソームが標的二本鎖ＤＮＡの末端にランダムに結合することになるため、理論収量が二分の一となるほか、ストランド情報を保持できない、バイサルファイトシーケンス解析に利用できないなどの問題がある。
　近年、ＲＮＡシーケンス解析などにおいて、二本鎖を形成するゲノムＤＮＡのどちらの鎖からＲＮＡが転写されているか、すなわちストランド情報を保持したＲＮＡシーケンス解析法が近年重視されている。ストランド情報を用いることで、アンチセンスＲＮＡなどのノンコーディング遺伝子の解析が可能になるだけでなく、オーバーラップ遺伝子のより正確な発現定量ができるようになる。そのため、ストランド情報を保持するための断片化及びタグメント付加の方法の開発も進められている。例えば、断片化後、Ｙ字アダプターを付加する方法（特許文献１）や、トランスポゼースによって断片化、５’末端側のみ第一のタグメント配列でタグメント化した後、３’末端側のアダプターを熱処理等によって除去し、第二のタグメント配列を入れ替える方法（特許文献２及び非特許文献１）などがこれまでに報告されている。
米国特許第8563478号公報 米国特許第10287574号公報
Wang et al., Nature Protocols Vol.8,No.10, 2022-2032, 2013
　ストランド情報を保持しつつ、二本鎖ＤＮＡの断片化及びタグメント付加を行う従来の方法では、手順が煩雑である、収集効率が低い、又はその両方であることが多い。例えば、特許文献１では、Ｙ字アダプターを付加する前に通常断片化反応及びアデニン付加反応が必要となり、更にＹ字アダプターを付加した後にアダプターダイマーを除去することも必要となって、手順が煩雑であり手間を要する上に、収集効率が低い。また、特許文献２及び非特許文献１では、実施例などからも明らかであるように、トランスポゼースによる断片化と５’末端側のみのタグメント化の後に、３’末端側のアダプターを除去し、別のタグメント配列を含む新たなアダプターを付与するという手順が必要であり、当該手順を完遂するために多段階での温度変化が必要となる。このような多段階の工程を行うことは、手順が煩雑であることに加え、手順の各段階でロスを生じさせ、最終的に生成される二本鎖ＤＮＡライブラリーの収量を低減させるという問題がある。本発明は、簡単な手順で効率的に二本鎖ＤＮＡを断片化及びタグメント化する方法を提供することを１つの課題とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、従来の方法よりも簡単な手順で効率的に二本鎖ＤＮＡを断片化し、５’末端側と３’末端側に異なる配列のタグメントを付加できる方法を見出した。具体的には、第一のタグメント配列を付与したトランスポゼースによって二本鎖ＤＮＡを断片化した後、３’末端側のアダプターを除去することなく、このアダプターに第二のタグメント配列をリガーゼなどによって連結することで、単純かつ効率的に断片化並びに第一及び第二のタグメント配列の付加を行うことができることを見出した。当該知見に基づいて更に鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、代表的な本発明は以下の態様を包含する。
　［項１］　５’末端側と３’末端側とに異なるタグメント配列を有する二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）：
　（ｉ）（ａ）第一のタグメント配列及び第一のトランスポゾン末端配列を含む第一アダプターと、
　　　　（ｂ）前記第一のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有する第二のトランスポゾン末端配列を含む第二アダプターと、
　　　　（ｃ）トランスポゼースと
　　を含むトランスポソームによって二本鎖ＤＮＡを断片化し、該二本鎖ＤＮＡの５’末端又は３’末端に、前記第一アダプター及び前記第二アダプターのいずれか一方のアダプターを転移鎖として連結させる工程、
　（ｉｉ）第二のタグメント配列を含むアディショナルオリゴを前記第二アダプターに連結させる工程、及び
　（ｉｉｉ）前記第一アダプター及び前記第二アダプターのうち、前記二本鎖ＤＮＡに連結していない非転移鎖のアダプターを、該二本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端のうち前記工程（ｉ）において転移鎖のアダプターを連結させていない末端に連結させる工程、
を含み、ここで前記工程（ｉｉ）は、前記工程（ｉｉｉ）の前、後、又は同時に実施される、方法。
　［項２］　前記第一アダプターが、前記第一のトランスポゾン末端配列よりも５’末端側に第一のタグメント配列を含み、トランスポゼースによって前記二本鎖ＤＮＡの５’末端に連結する転移鎖となる、項１に記載の方法。
　［項３］　前記アディショナルオリゴが、前記第一アダプターの塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む、項１又は２に記載の方法。
　［項４］　前記トランスポゼースが、高活性Ｔｎ５トランスポゼースであり、前記第一及び第二のトランスポゾン末端配列がＴｎ５型のトランスポゾン末端配列である、項１～３のいずれかに記載の方法。
　［項５］　前記工程（ｉｉ）において、ＤＮＡリガーゼにより、アディショナルオリゴを第二アダプターに連結させる、項１～４のいずれかに記載の方法。
　［項６］　前記工程（ｉｉｉ）において、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼにより、前記二本鎖ＤＮＡに連結していない非転移鎖のアダプターを前記二本鎖ＤＮＡに連結させる、項１～５のいずれかに記載の方法。
　［項７］　前記工程（ｉｉｉ）において、二本鎖ＤＮＡに連結していない非転移鎖のアダプターが５’末端側がリン酸化修飾されている第二アダプターであり、前記第二アダプターを前記二本鎖ＤＮＡの３’末端に連結させる、項１～６のいずれかに記載の方法。
　［項８］　前記工程（ｉ）において、前記二本鎖ＤＮＡの５’末端に第一アダプターを転移鎖として連結させ、前記工程（ｉｉ）において、５’末端側がリン酸化修飾されているアディショナルオリゴを第二アダプターの３’末端に連結させる、項１～７のいずれかに記載の方法。
　［項９］　前記工程（ｉ）において、前記二本鎖ＤＮＡの５’末端に第一アダプターを転移鎖として連結させ、前記工程（ｉｉ）において、３’末端側のＯＨ基が修飾されているアディショナルオリゴを第二アダプターの３’末端に連結させる、項１～８のいずれかに記載の方法。
　［項１０］　前記ＯＨ基の修飾が、リン酸基又はinverted dTによる修飾である、項９に記載の方法。
　［項１１］　ストランド情報を保持している二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する、項１～１０のいずれかに記載の方法。
　［項１２］　前記二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖が修飾されている、項１～１１のいずれかに記載の方法。
　［項１３］　前記修飾がメチル化修飾である、項１２に記載の方法。
　［項１４］　前記第一のタグメント配列におけるシトシン塩基がメチル化されている前記第一アダプター及び前記第二タグメント配列におけるシトシン塩基がメチル化されている前記アディショナルオリゴを使用し、バイサルファイト解析に用いられる二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する、項１２に記載の方法。
　本発明により、従来の方法よりも単純な手順で効率的に二本鎖ＤＮＡを断片化し、５’末端側と３’末端側に異なる配列のタグメントを付加することができる。本発明の方法では、二種類の異なるトランスポソームを用意する必要がない。本発明の方法によれば、簡単にストランド情報を保持することも可能となり得る。これによってＮＧＳをはじめとするシーケンス解析を微量のサンプルから効率的に且つ高度に行うことができるようになり、遺伝子解析、診断技術の進展に大いに役立つ。
図１は、本発明の一つの実施態様の概要図である。トランスポゼースなどのタグメンターゼによって、二本鎖ＤＮＡに第一のタグメント配列及び第一のトランスポゾン末端配列を有する第一アダプターと、第二のトランスポゾン末端配列を有する第二アダプターとを付加した後、第二のタグメント配列を有するアディショナルオリゴを第二アダプターに連結させ、二本鎖ＤＮＡに連結（共有結合）していないアダプター（非転移鎖、この図では第二アダプター）を、二本鎖ＤＮＡに連結させることで、５’末端側と３’末端側に異なるタグメント配列を有する二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成できる。 図２は、本発明の一つの実施態様であり、配列番号３で示される塩基配列からなる第一アダプター、配列番号４で示される塩基配列からなる第二アダプター、及び配列番号５で示される塩基配列からなるアディショナルオリゴで行う場合の模式図である。第二アダプター及びアディショナルオリゴの５’末端をリン酸化修飾することで隣り合うＤＮＡとの連結が可能になる。また、アディショナルオリゴの３’末端をinverted dT修飾することでオリゴの分解を防ぐと共に、ＰＣＲ反応等におけるプライマーとして機能しないようにしている。 図３は、本発明の一つの実施態様であり、配列番号６で示される塩基配列からなる第一アダプター、配列番号７で示される塩基配列からなる第二アダプター、及び配列番号８で示される塩基配列からなるアディショナルオリゴで行う場合の模式図である（第一アダプター及び第二アダプターの各塩基配列長が、図２の例よりも短い例である）。第二アダプター及びアディショナルオリゴの５’末端をリン酸化修飾することで隣り合うＤＮＡとの連結が可能になる。また、アディショナルオリゴの３’末端をinverted dT修飾することでオリゴの分解を防ぐと共に、ＰＣＲ反応等におけるプライマーとして機能しないようにしている。 図４は、本発明の一つの実施態様であり、配列番号９で示される塩基配列からなる第一アダプター、配列番号１０で示される塩基配列からなる第二アダプター、及び配列番号１１で示される塩基配列からなるアディショナルオリゴで行う場合の模式図である（第一アダプターにおける第一のタグメント配列、及びアディショナルオリゴにおける第二のタグメント配列が末端に配置されておらず、第一及び第二のタグメント配列が環状構造を形成する例である）。第二アダプター及びアディショナルオリゴの５’末端をリン酸化修飾することで隣り合うＤＮＡとの連結が可能になる。また、アディショナルオリゴの３’末端をinverted dT修飾することで分解を防ぐと共に、ＰＣＲ反応等におけるプライマーとして機能しないようにしている。 図５は、実施例１におけるライブラリー産物（アダプター２）の電気泳動の結果を示す図である。SHIMADZU社のＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置MultiNAを用いてライブラリー産物のパターンを確認した。 図６は、実施例２におけるライブラリー産物（アダプター３）の電気泳動の結果を示す図である。SHIMADZU社のＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置MultiNAを用いてライブラリー産物のパターンを確認した。
［発明の開示］
　以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明について更に詳説する。
＜二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する方法＞
　本発明では、従来の方法よりも単純な手順で、５’末端側と３’末端側とに異なるタグメント配列を有する二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する方法を提供する。本発明では、第一のタグメント配列を含む第一のアダプター、第二のアダプター、及びトランスポゼースを含むトランスポソームによって二本鎖ＤＮＡを断片化した後、第二のアダプターに第二のタグメント配列を含むアディショナルオリゴをリガーゼなどによって連結することで、単純かつ効率的に二本鎖ＤＮＡの断片化と、第一のタグメント配列及び第二のタグメント配列の付加を行うことができる。本発明の方法により、ＮＧＳをはじめとするシーケンス解析において必要となる、断片化及びタグメント配列の付加が可能となる。さらに、本発明のタグメント化においては、５’末端側と３’末端側とに異なるタグメント配列が付加されるため、例えば、ストランド情報を保存した状態で二本鎖ＤＮＡライブラリーを調製することができる。
１．第一のタグメント配列と第二のタグメント配列の付加
　本発明では、少なくとも以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む方法によって、５’末端側と３’末端側とに異なるタグメント配列を有する二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する：
　（ｉ）（ａ）第一のタグメント配列及び第一のトランスポゾン末端配列を含む第一アダプターと、
　　　　（ｂ）前記第一のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有する第二のトランスポゾン末端配列を含む第二アダプターと、
　　　　（ｃ）トランスポゼースと
を含むトランスポソームによって二本鎖ＤＮＡを断片化し、該二本鎖ＤＮＡの５’末端又は３’末端に、第一アダプター及び第二アダプターのいずれか一方のアダプターを転移鎖として連結させる工程
　（ｉｉ）第二のタグメント配列を含むアディショナルオリゴを第二アダプターに連結させる工程、及び
　（ｉｉｉ）第一アダプター及び第二アダプターのうち、前記二本鎖ＤＮＡに連結していない非転移鎖のアダプターを、該二本鎖ＤＮＡの５’末端又は３’末端のうち前記工程（ｉ）において転移鎖のアダプターを連結させていない末端に連結させる工程。
　尚、これらの工程のうち工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）は順序を制限されず、工程（ｉｉｉ）の前に工程（ｉｉ）を行ってもよいし、工程（ｉｉ）の前に工程（ｉｉｉ）を行ってもよいし、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）を同時に行うこともできる。
　本発明では、前記工程（ｉ）において、前記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含むトランスポソームによって、二本鎖ＤＮＡを断片化し、該二本鎖ＤＮＡの５’末端又は３’末端に、第一アダプター又は第二アダプターを転移鎖として連結させる。この工程において転移鎖を連結させる末端は５’末端又は３’末端のいずれであってもよいが、一つの実施形態では、第一アダプター又は第二アダプターを転移鎖として５’末端に連結させることが好ましく、第一アダプターを転移鎖として５’末端に連結させることが好ましい。
２．（ａ）第一アダプター及び（ｂ）第二アダプター
　本発明では、（ｃ）トランスポゼースと共に、（ａ）第一アダプター及び（ｂ）第二アダプターを含むトランスポソームを用いる。本発明のトランスポソームを構成する（ａ）第一アダプターは、第一のタグメント配列及び第一のトランスポゾン末端配列を少なくとも含むポリヌクレオチドである。第一アダプターは、第一のタグメント配列及び第一のトランスポゾン末端配列以外に１又は複数の任意の長さ（例えば、５～３０ｂｐ程度の長さ、好ましくは７～２５ｂｐ程度の長さ、より好ましくは１５～２０ｂｐ程度の長さ）の塩基配列（本明細書では、「第一アダプターの任意配列」等ともいう）を含んでいてもよい。この第一アダプターの任意配列は、第一のタグメント配列と第一のトランスポゾン末端配列との間に存在してもよく、及び／又は第一のタグメント配列に隣接し第一のトランスポゾン末端配列とは反対側（例えば、第一アダプターを転移鎖として５’末端に連結させる場合、第一のタグメント配列の５’末端側）に存在してもよい。特定の実施形態において、第一アダプターの任意配列は、後述するアディショナルオリゴの一部（第二のタグメント配列以外）と相補的に結合するように設計され（好ましくは、第一アダプターの任意配列は第一のトランスポゾン末端配列の一部と一緒になって、後述するアディショナルオリゴの一部（第二のタグメント配列以外）と相補的に結合するように設計され）、当該アディショナルオリゴと第二アダプターとを連結させ易くするように機能する。この場合、第一アダプターの任意配列は、「アディショナルオリゴと相補的な配列」ともいう。なお、第一のタグメント配列領域と第一のトランスポゾン末端配列領域（及び、必要に応じて含まれる第一アダプターの任意配列の領域）は、必ずしもその領域が明確に区別されている必要はなく、それらの一部の配列が重複するものであってもよい。
　本発明のトランスポソームを構成する（ｂ）第二アダプターは、第二のトランスポゾン末端配列を少なくとも含み、好ましくは第二のトランスポゾン末端配列からなる、ポリヌクレオチドである。前記第二のトランスポゾン末端配列は、前記第一のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有することが好ましい。このように第一アダプターに含まれる第一のトランスポゾン末端配列と、第二アダプターに含まれる第二のトランスポゾン末端配列とが互いに相補的な塩基配列を含むことにより、第一アダプター及び第二アダプターは相補的な塩基配列を介して少なくとも一部の領域（好ましくは、断片化二本鎖ＤＮＡに最終的に転移させる方の末端側の領域）で二本鎖を形成し、断片化した二本鎖ＤＮＡの末端に付加され易くすることができる。
　第一アダプターに含まれる第一のタグメント配列及び第二アダプターに連結させる第二のタグメント配列は、特に制限されないが、第一及び第二の二つのタグメント配列は相補的でないことが好ましい。例えば、第一のタグメント配列の逆相補鎖となる塩基配列と、第二のタグメント配列の塩基配列との間の同一性が７０％以下であることが好ましく、６０％以下であることがより好ましく、５０％以下であることがさらに好ましい。また、第一のタグメント配列の逆相補鎖となる塩基配列と、第二のタグメント配列の塩基配列との間の同一性の下限は特に限定されないが、０％を超えることが好ましく、１％以上であることが好ましい。配列同一性は、Blast、Clustal W等のプログラムを用いて決定することができる。このように第一のタグメント配列の逆相補鎖となる塩基配列と第二のタグメント配列の塩基配列との間の塩基配列同一性が低くなるように設計することで、二本鎖ＤＮＡの両端にそれぞれ付与される第一及び第二のタグメント配列をより明確に識別でき、第一又は第二のタグメント配列が付加された二本鎖ＤＮＡの５’末端側と３’末端側の判別が容易になる。
　好ましい実施形態において、（ａ）第一アダプター（特に、第一のタグメント配列以外の領域、好ましくは第一アダプターの任意配列の領域及び／又は第一のトランスポゾン末端配列の一部の領域）は、アディショナルオリゴ（特に、第二のタグメント配列以外）の塩基配列と相補的な数塩基（例えば、７ｂｐ以上、好ましくは１０ｂｐ以上、より好ましくは１２ｂｐ以上、さらに好ましくは１５ｂｐ以上であり、上限は特に限定されないが、例えば３０ｂｐ以下）の連続する塩基配列を有することが好ましい。このように第一アダプターの塩基配列とアディショナルオリゴの塩基配列とが互いに相補的な塩基配列を含むことにより、工程（ｉｉ）においてアディショナルオリゴは、第一アダプターの末端に連結されるのではなく、第一アダプターに相補的に結合し易くなる。それにより、アディショナルオリゴは、第一アダプターに相補的に結合している第二アダプターと近接して並び、結果として第二アダプターの末端にアディショナルオリゴが連結し易くなる。
　更に特定の実施形態において、第一アダプター及び第二アダプターのうち、工程（ｉ）の転移鎖ではないアダプターの５’末端はリン酸化などで修飾しておくことが好ましい。このように、工程（ｉ）の転移鎖ではないアダプター（非転移鎖のアダプターともいう）の５’末端をリン酸化等で修飾しておくことによって、工程（ｉｉｉ）において、例えば、ＤＮＡリガーゼ等により、非転移鎖のアダプターを二本鎖ＤＮＡに容易に連結することができる。
　更に好ましい実施形態において、第一アダプターは、第一のトランスポゾン末端配列よりも５’末端側に第一のタグメント配列を含み、トランスポゼースによって二本鎖ＤＮＡの５’末端に連結する転移鎖となることが好ましい。かかる実施態様において、第二アダプターは、５’末端がリン酸化等で修飾されており、ＤＮＡリガーゼ等によって二本鎖ＤＮＡの３’末端に連結可能な非転移鎖となることが好ましい。
３．アディショナルオリゴ
　本発明において、第二アダプターに連結させるためのオリゴＤＮＡ（アディショナルオリゴと称する）は第二のタグメント配列を含む。アディショナルオリゴは、第一アダプターの塩基配列（特に、第一のタグメント配列以外の領域、好ましくは第一アダプターの任意配列の領域及び／又は第一のトランスポゾン末端配列の一部の領域）と相補的な数塩基（例えば、７ｂｐ以上、好ましくは１０ｂｐ以上、より好ましくは１２ｂｐ以上、さらに好ましくは１５ｂｐ以上であり、上限は特に限定されないが、例えば３０ｂｐ以下）の連続する塩基配列を有することが好ましい。なお、第二のタグメント配列の領域と、第一アダプターの塩基配列（特に、第一のタグメント配列以外の領域、好ましくは第一アダプターの任意配列の領域及び／又は第一のトランスポゾン末端配列の一部の領域）と相補的な塩基配列の領域は、必ずしもその領域が明確に区別されている必要はなく、それらの一部の配列が重複するものであってもよい。アディショナルオリゴが、このように第一アダプターの塩基配列（特に、第一のタグメント配列以外の領域、好ましくは第一アダプターの任意配列の領域及び／又は第一のトランスポゾン末端配列の一部の領域）と相補的な塩基配列を含むことにより、工程（ｉｉ）においてアディショナルオリゴは、第一アダプターの末端に連結されるのではなく第一アダプターに相補的に結合し易くなり、結果として、第一アダプターに相補的に結合している第二アダプターと近接して並び、第二アダプターの末端にアディショナルオリゴが連結し易くなる。
　一つの実施形態において、アディショナルオリゴは、ロック核酸（ＬＮＡ、Locked Nucleic Acid）又は架橋型核酸（ＢＮＡ、Bridged Nucleic Acid）等の核酸アナログを含んでいてもよい。アディショナルオリゴを構成する塩基がこのようなＬＮＡ、ＢＮＡ等の核酸アナログを含むことにより、第一アダプターとアディショナルオリゴのアニーリング温度を向上させることができ、それにより第一アダプターの塩基配列に対してアディショナルオリゴが相補的に結合し易くなるという利点がある。
　本発明に用いるアディショナルオリゴは更に、第二のタグメント配列及び第一アダプターの塩基配列と相補的な塩基配列以外に、１又は複数の任意の長さ（例えば、５～３０ｂｐ程度の長さ、好ましくは１０～２５ｂｐ程度の長さ、より好ましくは１５～２０ｂｐ程度の長さ）の塩基配列（本明細書では、「アディショナルオリゴの任意配列」等ともいう）を含んでいてもよい。このアディショナルオリゴの任意配列は、第二のタグメント配列の５’末端側と３’末端側のどちらに存在してもよい。第二アダプターへのアディショナルオリゴの連結の妨げになり難いという観点から、第二のタグメント配列に隣接し第二アダプターが連結する末端とは反対側（例えば、第一アダプターを転移鎖として５’末端に連結させる場合、第二のタグメント配列の３’末端側）に存在することが好ましい。
４．（ｃ）トランスポゼース、及びトランスポゾン末端配列
　本発明において使用されるトランスポゼースは特に制限されず、当該分野で公知の任意のトランスポゼース又はその変異体を使用することができる。例えば、Ｔｎ３トランスポゼース、Ｔｎ５トランスポゼース、Ｔｎ７トランスポゼース、Ｔｎ１０トランスポゼース、ＭｕＡトランスポゼース、Sleeping Beautyトランスポゼース、piggyBacトランスポゼース、Himar1トランスポゼース、Ｍｏｓ１トランスポゼース、又はこれらの変異体（例えば、これらの野生型のアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個程度）のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列を有する変異体）等が挙げられるがこれらに限定されない。なかでも、過剰活性型（hyperactive）変異体が知られているＴｎ５トランスポゼース、ＭｕＡトランスポゼース、Sleeping Beautyトランスポゼース、piggyBacトランスポゼース、Himar1トランスポゼース、Ｍｏｓ１トランスポゼース、又はこれらの変異体（例えば、Picelli et al., Genome Res.24(12):2033-40, 2014、M. Zhou, and W.S. Reznikoff, J. Mol. Biol., 271, 362-373, 1997、T.W. Wiegand, and W.S. Reznikoff, J. Bacteriol., 174, 1229-1239, 1992、M.D. Weinreich, A. Gasch, and W.S. Reznikoff, Genes Dev., 8, 2363-2374, 1994、T.A. Naumann, and W.S. Reznikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 8944-8949, 2000、I.Y. Goryshin, and W.S. Reznikoff, J. Biol. Chem. 273, 7367-7374, 1998に記載されているＴｎ５トランスポゼース変異体、F. Voigt et al., Nat. Commun., Vol.7, No.11126, 2016に記載されているSleeping Beautyトランスポゼース変異体、K. Yusa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol.108 No.4 1531-1536, 2010に記載されているPiggyBacトランスポゼース変異体、D.J. Lampe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol.96, No.20, 11428-11433, 1999に記載されているHimar1トランスポゼース変異体、S. Germon et al., Genetica, Vol.137, No.265, 265-276, 2009に記載されているＭｏｓ１トランスポゼース変異体、T.S. Rasila et al., Nucleic Acids Res. Vol.46, Issue 9, 4649-4661, 2018に記載されているＭｕＡトランスポゼース変異体等）が好ましく、Ｔｎ５トランスポゼース又はこの変異体であるＴｎ５型トランスポゼースがより好ましく、Ｔｎ５トランスポゼース変異体（高活性Ｔｎ５トランスポゼース）が特に好ましい。
　使用するトランスポゼースによって、そのトランスポゼースと組み合わせて使用するトランスポゾン末端配列（トランスポゼースによって認識される特有の二本鎖配列のことをいう。通常、一方の鎖が転移鎖となり、他方の鎖が非転移鎖となる。）が異なる。当業者は技術常識に従って、使用するトランスポゼースの種類に応じて適切なトランスポゾン末端配列を適宜選択することができる。
　また、本発明に用いるトランスポゾン末端配列は全長配列でなくてもよく、本発明の効果を奏する限り、トランスポゾン末端配列として公知の塩基配列の一部であってもよい。例えば、非転移鎖となるトランスポゾン末端配列は、少なくとも１０ｂｐ（好ましくは少なくとも１１ｂｐ、より好ましくは少なくとも１２ｂｐ）の長さがあれば、本発明に使用できることが確認されている。例えば、非転移鎖となることが公知のトランスポゾン末端配列の塩基配列において３’末端側を欠失させた、少なくとも１０ｂｐ（好ましくは少なくとも１１ｂｐ、より好ましくは少なくとも１２ｂｐ）の塩基長のトランスポゾン末端配列の一部を、本発明において好適に使用することができる。
　例えば、Ｔｎ５型のトランスポゼースであれば、
5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号１）
などの配列が転移鎖となるトランスポゾン末端配列として使用され、またその相補鎖である
5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’（配列番号２）
などの配列が非転移鎖となるトランスポゾン末端配列として使用される。
　尚、特許文献２に示されるように、トランスポゼースが二本鎖ＤＮＡに対して転移活性を示す際に使用するトランスポゾン末端配列はここに示した１通りではなく、使用するトランスポゼースが転移活性を示すトランスポゾン末端配列であれば、本発明において使用できる。
　一つの実施形態では、第一アダプターにおいて、第一のタグメント配列及びアディショナルオリゴと相補的な配列は、第一のトランスポゾン末端配列の５’末端に付加される。　例えば、図２に示すように、
5’- TCGTCGGCAGCGTCCTCGTGTGCTACTTGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号３）
を転移鎖となる第一アダプターとして使用し、
5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’（配列番号４）
を非転移鎖の第二アダプターとして使用した上で、
5’-TCAAGTAGCACACGAGCCGAGCCCACGAGAC-3’（配列番号５）をアディショナルオリゴとして使用することができる。尚、第二アダプター及びアディショナルオリゴの５’末端側はリン酸化修飾してもよい。また、アディショナルオリゴの３’末端側はＯＨ基を修飾（例えば、リン酸基又はinverted dTで修飾）してもよい。
　また他の実施形態では、非転移鎖をより短いものとすることもできる。例えば、非転移鎖（又は非転移鎖となり得る第二アダプター）の全長を１０ｂｐ～１９ｂｐ程度まで短くすることができ、好ましくは１１ｂｐ～１９ｂｐ程度、より好ましくは１２ｂｐ～１９ｂｐ程度、さらに好ましくは１４ｂｐ～１９ｂｐ程度の非転移鎖を使用できる。
　例えば、図３に示すように、
5’-TCGTCGGCAGCGTCAGCTAGCTAGCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号６）
を転移鎖となる第一アダプターとして使用し、
5’-CTGTCTCTTATACAC-3’（配列番号７）
を非転移鎖の第二アダプターとして使用した上で、
5’-ATCTGCTAGCTAGCTCCGAGCCCACGAGAC-3’（配列番号８）
をアディショナルオリゴとして使用することができる。尚、第二アダプター及びアディショナルオリゴの５’末端側はリン酸化修飾してもよい。また、アディショナルオリゴの３’末端側はＯＨ基を修飾（例えば、リン酸基又はinverted dTで修飾）してもよい。
　このように非転移鎖のアダプターが短い場合であっても、アディショナルオリゴと一緒になって安定したタグメント配列を形成し、転移鎖のアダプターと共に二本鎖ＤＮＡに付加することができる。
　また別の実施形態では、第一アダプターにおいて、アディショナルオリゴと相補的な配列中に、第一のタグメント配列を組み込んでもよい。換言すれば、アディショナルオリゴと相補的な配列を第一のタグメント配列の５’末端側及び３’末端側に存在させてもよい。
　例えば、図４に示すように、
5’-CTCGTGTGCTACTTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号９）
を転移鎖となる第一アダプターとして使用し、
5’-CTGTCTCTTATA-3’（配列番号１０）
を非転移鎖の第二アダプターとして使用した上で、
5’-CACATCTCCGAGCCCACGAGACTCAAGTAGCACACGAG-3’（配列番号１１）
をアディショナルオリゴとして使用することができる。尚、第二アダプター及びアディショナルオリゴの５’末端側はリン酸化修飾してもよい。また、アディショナルオリゴの３’末端側はＯＨ基を修飾（例えば、リン酸基又はinverted dTで修飾）してもよい。
　このような第一アダプター、第二アダプター、及びアディショナルオリゴを使用すると第一のタグメント配列と第二のタグメント配列が二本鎖領域に挟まれた環状構造を形成することになるが、本発明ではこのようなタグメント配列を二本鎖ＤＮＡに付加する態様であってもよい。このような環状構造とすることによって、二本鎖ＤＮＡの末端により近い位置に第一及び第二のタグメント配列が存在することになり、例えば、第一及び第二のタグメント配列からそれぞれに対応するプライマーを用いてＰＣＲ等を行う際により効率よく反応を進めることができるという利点がある。
５．トランスポソームの調製
　本発明に用いるトランスポソームは、前記の（ａ）第一アダプター、（ｂ）第二アダプター、及び（ｃ）トランスポゼースを少なくとも含むことを特徴としている。トランスポゼースに第一及び第二のアダプターを付与する方法としては特に制限されないが、例えば非特許文献１の他、Picelli et al., Genome Res.24(12):2033-40, 2014などに記載されているような方法が挙げられる。
６．トランスポゼース処理（（ｉ）トランスポソームと二本鎖ＤＮＡを反応させる工程）の反応温度、時間
　トランスポソームと二本鎖ＤＮＡを反応させる温度は、使用するトランスポゼース、第一アダプターの配列及び長さ、第二アダプターの配列及び長さ、並びにこれらの組み合わせ等に応じて適宜設定され得る。例えば、反応温度としては、３０℃以上、６５℃以下であることが好ましく、３７℃以上、６０℃以下であることがより好ましく、５０℃以上、６０℃以下であることがさらに好ましい。反応時間としては１分以上であることが好ましく、より好ましくは３分以上であることがより好ましく、５分以上であることがさらに好ましい。反応時間の上限は、特に限定されないが、例えば２４時間以下、好ましくは１２時間以下、より好ましくは６時間以下、更に好ましくは３時間以下であり得る。
　トランスポソームと二本鎖ＤＮＡを反応させる反応液中のトランスポゼースの濃度は、トランスポゼース活性を示す限り特に制限されないが、１０ｐｇ／μＬ以上であることが好ましい。またトランスポゼース処理に用いる反応液としては、トランスポゼース活性が発揮される反応液であれば特に制限されず、他の添加剤を含んでいてもよい。例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドやポリエチレングリコールの添加によってトランスポゾン反応を利用したＮＧＳ用ライブラリー調製の効率が高まることが知られており、好適に使用され得る（Picelli et al., Genome Res.24(12):2033-40, 2014）。この他にも、例えば緩衝剤、塩、有機溶媒、ポリマー、界面活性剤、キレート剤、タンパク質、これら２種以上の組合せなどを添加剤として使用してもよい。
　緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、ビス－トリス（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、キャプス（Ｃａｐｓ）、リン酸、酢酸、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
　塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化アンモニウム）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン、酢酸アンモニウム）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸アンモニウム）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
　有機溶媒としては、例えばアルコール類（例えばエタノール、メタノール、ポリエチレングリコール）や、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒、これら２種以上の組合せが挙げられる。
　界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及び両イオン性界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、フェナントロリン、マレイン酸、クエン酸、トリシン、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＣＤＴＡ）、酒石酸、ニコチンアミド、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、フィチン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
　タンパク質としては、ウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）等が挙げられるが、これに限定されない。ＢＳＡ等のタンパク質を添加することにより、酵素を安定化したり、容器への反応成分の吸着を抑制することができる。
７．（ｉｉ）アディショナルオリゴの第二アダプターへの連結
　アディショナルオリゴの第二アダプターへの連結方法は特に制限されないが、酵素反応によって行われることが好ましく、ポリヌクレオチドリガーゼを用いることがより好ましく、ＤＮＡリガーゼであることが特に好ましい。ポリヌクレオチドリガーゼを用いる場合、酵素の由来は特に制限されないが、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ファージ由来のＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ファージ由来のＤＮＡリガーゼ、大腸菌由来のＤＮＡリガーゼ又はその変異体、又はLucigen社が販売しているAmpligase（登録商標）Thermostable DNA ligaseのようなＤＮＡリガーゼを使用することが好ましい。
　またアディショナルオリゴと第二アダプターの間が１塩基以上離れている場合、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素反応によって間を埋めることができる（ギャップリペアー）。このギャップリペアーはポリヌクレオチドリガーゼによる連結と同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。ギャップリペアーして連結させる場合に用いられる酵素としては特に制限されないが、ＤＮＡポリメラーゼ及びポリヌクレオチドリガーゼを用いることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼとしては特に制限されないが、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、又は大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩの断片であるクレノウ断片を用いることが好ましく、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ鎖置換活性をほとんど示すことのない酵素を用いることがより好ましい。ポリヌクレオチドリガーゼとしては、酵素の由来は特に制限されないが、Lucigen社が販売しているAmpligase（登録商標）Thermostable DNA ligaseのような耐熱性のＤＮＡリガーゼや、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ、大腸菌由来のＤＮＡリガーゼを使用することが好ましい。
　アディショナルオリゴの第二アダプターへの連結を上記のような酵素を用いて酵素反応により行う場合、これらの酵素の濃度は活性を示す限り特に制限されないが、ポリヌクレオチドリガーゼの濃度は０．０１Ｕ／μＬ以上、ＤＮＡポリメラーゼの濃度は０．００５Ｕ／μＬ以上であることが好ましい。また、この酵素反応での連結処理に用いる反応液は、酵素活性が発揮される反応液であれば特に制限されず、他の添加剤を含んでいてもよい。例えばＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼなどのポリヌクレオチドリガーゼは活性の発揮にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を必要とし、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡリガーゼなどのポリヌクレオチドリガーゼは活性の発揮にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を必要とすることが知られている。またＤＮＡポリメラーゼは活性の発揮にデオキシリボヌクレオチドが通常必要とされる。この他にも、例えば緩衝剤、塩、有機溶媒、ポリマー、界面活性剤、キレート剤、タンパク質、これら２種以上の組合せなどを添加剤として使用してもよい。
　緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、ビス－トリス（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、キャプス（Ｃａｐｓ）、リン酸、酢酸、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
　塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化アンモニウム）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン、酢酸アンモニウム）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸アンモニウム）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
　有機溶媒としては、例えばアルコール類（例えばエタノール、メタノール、ポリエチレングリコール）や、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒、これら２種以上の組合せが挙げられる。
　界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及び両イオン性界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、フェナントロリン、マレイン酸、クエン酸、トリシン、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＣＤＴＡ）、酒石酸、ニコチンアミド、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、フィチン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
　タンパク質としては、ウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）等が挙げられるが、これに限定されない。ＢＳＡ等のタンパク質を添加することにより、酵素を安定化したり、容器への反応成分の吸着を抑制することができる。
　また工程（ｉ）（トランスポゼース処理）に用いた反応液をそのまま用いて、これに前記のような酵素を添加することにより、工程（ｉｉ）（アディショナルオリゴの第二アダプターへの連結）を行ってもよい。
８．（ｉｉｉ）非転移鎖のアダプターの二本鎖ＤＮＡへの連結
　非転移鎖（例えば、第二アダプター）の二本鎖ＤＮＡへの連結方法は特に制限されないが、酵素反応によって行われることが好ましい。酵素反応によって非転移鎖のアダプターの二本鎖ＤＮＡへの連結を行う場合には、非転移鎖の５’末端をリン酸化することが好ましい。いくつかの実施形態では、トランスポゼースによる非転移鎖と二本鎖ＤＮＡの間は数塩基離れている場合があるため、ギャップリペアーを行うことが好ましい。
　非転移鎖のアダプターと二本鎖ＤＮＡの間のギャップリペアーは、上記（ｉｉ）のアディショナルオリゴの第二アダプターへの連結と同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。また、上記（ｉｉ）アディショナルオリゴの第二アダプターへの連結を行う酵素と、（ｉｉｉ）非転移鎖のアダプターの二本鎖ＤＮＡへの連結を行う酵素は、同じ酵素を共通して使用してもよいし、別々の酵素を用いてもよい。ギャップリペアーして連結させる場合に用いられる酵素としては特に制限されないが、ＤＮＡポリメラーゼ及びポリヌクレオチドリガーゼを用いることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼとしては特に制限されないが、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、又は大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩの断片であるクレノウ断片を用いることがさらに好ましく、またＴ４ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ鎖置換活性をほとんど示すことのない酵素を用いることがより好ましい。ポリヌクレオチドリガーゼとしては、酵素の由来は特に制限されないが、Lucigen社が販売しているAmpligase（登録商標）Thermostable DNA ligaseのような耐熱性のＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ、又は大腸菌由来のＤＮＡリガーゼを使用することが好ましい。
　非転移鎖のアダプターの二本鎖ＤＮＡへの連結を上記のような酵素を用いて酵素反応により行う場合、これらの酵素の濃度は活性を示す限り特に制限されないが、ポリヌクレオチドリガーゼの濃度は０．０１Ｕ／μＬ以上、ＤＮＡポリメラーゼの濃度は０．００５Ｕ／μＬ以上であることが好ましい。また、この酵素反応での連結処理に用いる反応液は、酵素活性が発揮される反応液であれば特に制限されず、他の添加剤を含んでいてもよい。この他の添加剤としては、例えば、上記（ｉｉ）アディショナルオリゴの第二アダプターへの連結において、酵素反応で好適に用いられ得る他の添加剤として説明したものと同様のものが用いられ得る。
９．（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の連結の反応温度、時間
　上記（ｉｉ）アディショナルオリゴの第二アダプターへの連結及び上記（ｉｉｉ）非転移鎖のアダプターの二本鎖ＤＮＡへの連結を行う際の反応条件は特に限定されず、両工程の反応条件は同じであっても、異なっていてもよい。例えば、両工程を同じ反応条件で行う場合、反応温度の上限は特に制限されないが、一例として、第一アダプターと第二アダプターとの相補的な配列部分（特に、第一のトランスポゾン末端配列と第二のトランスポゾン末端配列との相補的な配列部分）のＴｍ値＋１５℃以下であり、かつ第一アダプターとアディショナルオリゴの相補的な配列部分（特に、第一のタグメント配列以外の領域（好ましくは第一アダプターの任意配列の領域及び／又は第一のトランスポゾン末端配列の一部の領域））とアディショナルオリゴ（第二のタグメント配列以外の領域）との相補的な配列部分）のＴｍ値＋１５℃以下であることが好ましく、第一アダプターと第二アダプターの相補的な配列部分のＴｍ値＋１０℃以下であり、かつ第一アダプターとアディショナルオリゴの相補的な配列部分のＴｍ値＋１０℃以下であることがより好ましい。一実施形態では、４５℃以下であることが好ましく、３７℃以下であることがより好ましい。また、この場合の反応温度の下限は特に制限されないが、酵素の活性を保持しつつ、非特異的な連結を減らすため、４℃以上であることが好ましく、１０℃以上であることがより好ましく、１５℃以上であることがさらに好ましい。また酵素反応によって連結を行う場合、低温や熱による酵素活性の低下を免れるため、ポリヌクレオチドリガーゼ活性を１０％以上、ＤＮＡポリメラーゼ活性を１０％以上に保持できる温度範囲であることが好ましい。
　反応時間は特に制限されないが、例えば、５分以上が好ましく、１０分以上がより好ましい。反応時間の上限は特に限定されないが、例えば、１時間以下とすることができる。
　本発明の二本鎖ＤＮＡライブラリー生成方法では、前記工程（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のいずれか１つ以上の工程の後、又はこれらの全ての工程の後に、ＤＮＡの精製を行ってもよいし、行わなくてもよい。また、後述するＰＣＲ反応を行う場合は、当該ＰＣＲの前にＤＮＡの精製を行ってもよいし、行わなくてもよい。更に、本発明によって生成された二本鎖ＤＮＡライブラリーを用いてＮＧＳ解析を行う場合は、当該ＮＧＳ解析の前に、ＤＮＡの精製を行ってもよいし、行わなくてもよい。ＤＮＡの精製は、当該分野で公知の任意の方法で行うことができ、例えば、ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）やこれに類似した吸着ビーズによる方法や、エタノールやポリエチレングリコールを利用した不溶化による方法が挙げられるが、特に限定されない。
１０．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
　本発明によってタグメント配列を付加した後（工程（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の終了後）、各種用途に利用することができる。本発明では、Ｙ字アダプターを付加する場合のように、アダプターダイマー等の不純物も生成しないため、精製することなく、そのまま各種用途に利用することができる。例えば、５’末端側と３’末端側にそれぞれ付加された異なるタグメント配列にそれぞれ結合するように設計されたプライマー対を利用して、ＰＣＲ等の任意の核酸増幅法によってタグメント化された二本鎖ＤＮＡを増幅してもよい。またＰＣＲ等の核酸増幅法によって新たなタグメント配列を付加してもよい。ＰＣＲ等の核酸増幅法で付加するタグメント配列としては、例えばillumina社などのＮＧＳ機器（例えばNextSeqTM、MiSeqTMシリーズなど）において使用するインデックス配列や、フローセル上にハイブリダイズさせるための配列（例えばillumina社のＰ５配列、Ｐ７配列）や、Oxford Nanopore Technologies社のロングリードシーケンサー（例えばMinION、GridION、PromethION）などで標的ＤＮＡの認識に必要となる配列などが挙げられるが、特に制限されない。ＰＣＲ等の核酸増幅の方法は特に制限されない。
１１．ストランド情報の保存
　本発明では、調製されるライブラリーにストランド情報を保存してもよいし、保存しなくてもよい。ストランド情報を保存する場合の標的二本鎖ＤＮＡとしては、特に制限されない。例えばＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、当該ｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成する際にｄＵＴＰを含む反応液中で合成することで、片側の鎖にのみウラシルを含んだ二本鎖ＤＮＡを調製し、後の工程において、ＵＮＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）によって処理する、及び／又はウラシルを鋳型にできないＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ）を用いてＰＣＲを行う、などによってウラシルを含むＤＮＡ鎖を増幅できないようにすることができる。これによって、例えば、後に続くシーケンシング解析において、ストランド情報を保存しつつ、それぞれのＤＮＡ鎖を解析することができる。
１２．バイサルファイトシーケンス解析
　本発明によれば、簡便にバイサルファイトシーケンス解析、特にT-WGBS（Tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencin）解析を実施することもできる。例えば、第一アダプターの第一のタグメント配列領域におけるシトシン塩基と、アディショナルオリゴの第二のタグメント配列領域のシトシンをメチル化した上で、二本鎖ＤＮＡからライブラリーを生成し、バイサルファイト（亜硫酸水素塩）などで処理することで、二本鎖ＤＮＡにおけるシトシンのメチル化状態を検出することができる。このようなバイサルファイトシーケンス解析としては、例えば、Adey A. et al., Genome Res. 22,1139-1143,2012に記載の方法等を参照することにより実施できる。
　従って、一つの実施形態において、本発明は、前記第一タグメント配列におけるシトシン塩基がメチル化されている前記第一アダプター及び前記第二タグメント配列におけるシトシン塩基がメチル化されている前記アディショナルオリゴを使用し、バイサルファイト解析に用いられる二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する方法であってもよく、この方法により少なくとも一方の鎖がメチル化修飾されている二本鎖ＤＮＡのメチル化解析を行うことができる。
１３．二本鎖ＤＮＡ
　本発明において、対象となる二本鎖ＤＮＡ（標的二本鎖ＤＮＡなどとも呼ばれる）は特に制限されないが、細胞より抽出されたゲノムＤＮＡ、ＰＣＲなどの方法によって増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡより合成された二本鎖ＤＮＡなどが挙げられる。また、二本鎖ＤＮＡは、一つの細胞、組織、器官、生物（例えば、動植物、真菌、細菌、ウイルス等）に由来する二本鎖ＤＮＡだけでなく、複数の細胞、組織、器官、生物に由来する二本鎖ＤＮＡであってもよい。本発明に使用される二本鎖ＤＮＡの量としては特に制限されない。
１４．二本鎖ＤＮＡライブラリー生成キット
　本発明は、５’末端側と３’末端側とに異なるタグメント配列を有する二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成するためのキットの態様でもあり得る。当該キットは、（ａ）第一のタグメント配列及び第一のトランスポゾン末端配列を含む第一アダプターと、（ｂ）前記第一のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有する第二のトランスポゾン末端配列を含む第二アダプターと、（ｃ）トランスポゼースとを含むトランスポソームを少なくとも含む。また、当該キットは、ポリヌクレオチドリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素も含んでいることが好ましい。これらの（ａ）～（ｃ）成分、酵素、及び任意に含み得る他の添加剤は、各成分が任意に混合された混合物の形態であってもよく、各成分を別々に備えたキットの形態であってもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（トランスポソームの調製）
　まず実施例に先立って、トランスポゼースの準備として、Hyperactive Tn5（Picelli et al., Genome Res.24(12):2033-40, 2014に記載されているＴｎ５トランスポゼース変異体（E54K/L372P変異体））のC末端をヒスチジンタグにより修飾したタンパク質をコードする遺伝子を発現プラスミド中に挿入し、大腸菌DH5α株に形質転換した。この大腸菌株を30℃にて培養後、50 mM HEPES-KOH（pH 8.0）、100 mM NaCl中に懸濁し、超音波処理を行い破砕した。そしてこの破砕液をTALON(商標) Affinity Resin（ClonTech社）用いてアフィニティークロマトグラフィーに供し、結合させた後、50 mM HEPES-KOH（pH 8.0）、100 mM NaCl、10 mM imidazoleで洗浄し、50 mM HEPES-KOH（pH 8.0）、100 mM NaCl、150 mM imidazoleで溶出することで精製したHyperactive Tn5を得た。　この精製したHyperactive Tn5を50 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、100 mM NaCl、1 mM ジチオトレイトール（DTT）、50%グリセロール中で透析し、バッファー置換し、タンパク濃度を100μg/mLに透析バッファーで希釈したものを「精製Tn5溶液」として調製した。　またトランスポゼースに供与するアダプターを調製するため、まず以下の表１に示す３組のアダプターを用意した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらのアダプターセットにおいて、50 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、100 mM NaClの溶液中に第一アダプター及び第二アダプターの濃度が5μMとなるように溶液を調製し、100℃まで加熱した。そしてΔ-1℃/minずつ25℃まで冷却することでアダプターのアニーリングを行った。アニーリング後、100%グリセロールを等量混合し、50%グリセロールに調製した各「アダプター溶液（１、２、３）」を用意した。
　そして精製Tn5溶液24μLに対し、各アダプター溶液（１、２、３）のいずれか１種を6μL添加し、25℃で60分間静置することで、それぞれのアダプターを供与した後、透析バッファーで100倍希釈し、「Tn5（アダプター１）」、「Tn5（アダプター２）」、「Tn5（アダプター３）」を調製した。
　またネガティブコントロールとして、下記表２に示す第二アダプター（非転移鎖）の５’側がリン酸化されておらず、ＤＮＡリガーゼなどによるアディショナル反応において標的二本鎖DNAに結合できない３組のアダプターセットにおいても同様の作業を行い、「Tn5（アダプター１NC）」、「Tn5（アダプター２NC）」、「Tn5（アダプター３NC）」を調製した。
　尚、調製した「Tn5（アダプター１）」、「Tn5（アダプター２）」、「Tn5（アダプター３）」、「Tn5（アダプター１NC）」、「Tn5（アダプター２NC）」、「Tn5（アダプター３NC）」を用いてヒトゲノムDNAの分解を評価することによる活性測定を行い、いずれも活性を示すことを確認した。またアダプターの５’側リン酸化の有無は、トランスポソームの転移活性に影響を及ぼさなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２中、下線（実線）は、第一のタグメント配列を示し、下線（破線）は、第一のトランスポゾン末端配列を示す。
（アディショナルオリゴの調製）
　さらに、これらのアダプターセットとともに使用する表３に示したアディショナルオリゴを10μMとなるように調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３中、下線は、第二のタグメント配列を示す。
（反応用バッファーの調製）
　また反応用バッファーとして、Tn5反応用バッファー（20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、15% ジメチルホルムアミド、10 mM MgCl2）、アディショナル反応用バッファー（300 mM Tris-HCl(pH8.0)、40 mM MgCl2、100 mM (NH4)2SO4、12 mM EDTA（pH8.0）、1 mM NAD、0.05% BSA）を調製した。
実施例１：本発明を用いたNGS用ライブラリーの調製
　本実施例では、本発明によって標的二本鎖DNAの断片化、及び５’末端側と３’末端側とに異なる配列を付加するタグメント化が効率的に行われ、NGS用ライブラリーの調製が可能であるか検討するため、以下の実験を行った。
　上記の調製法で得られたTn5（アダプター）を用い、HeLa S3細胞より精製したゲノムDNA（1 ng）を標的二本鎖DNAとして、まず表４の組成でTn5反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　調製した反応液を55℃で5分間反応（アダプター１、２、１NC、及び２NC）又は50℃で20分間反応（アダプター３及び３NC）し、断片化及び第一のタグメント配列の付加を行った。0.15% ドテシル硫酸ナトリウム溶液を2.5μL添加することで反応を停止した後、表５の組成で調製したアディショナル反応液を全量添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　アディショナル反応液を添加後、37℃で15分間反応（アダプター１、２、１NC、及び２NC）又は20℃で20分間反応（アダプター３及び３NC）し、アディショナル反応を行い、第二のタグメント配列を付加した。このようにして得られた二本鎖ＤＮＡライブラリーを核酸精製せずに使用して、以下のようにPCR反応を行った。
　表６の組成でPCR反応液を調製し、表７の反応サイクルでPCRを行い、インデックス配列及びillumina社NGS用のP5、P7配列の付加を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　反応後のPCR産物をAMPure XPビーズ（Beckman Coulter社）24 μLを用いてマニュアル通りに核酸を精製し、30 μLのTEバッファー（ナカライテスク社）中に溶出した（精製したPCR核酸溶液）。そして精製したPCR核酸溶液 3μLを用いて、SHIMADZU社のDNA/RNA分析用マイクロチップ電気泳動装置MultiNAを用いてマニュアル通りに電気泳動し、ライブラリー産物のパターンを確認した（図５）。またGenNext（登録商標）NGS Library Quantification Kit（東洋紡製）を用いてマニュアル通りにライブラリーの定量を行ったところ、Tn5（アダプター１）では120 nM、Tn5（アダプター１NC）では0.4 nMのライブラリー収量であると算出された。Tn5（アダプター２）及びTn5（アダプター２NC）、Tn5（アダプター３）及びTn5（アダプター３NC）においても同様の結果が得られた。
　これらの結果から、本発明によって効率的に断片化、タグメント化が行われており、イルミナ社NGS用のライブラリーの調製が可能となったことがわかる。またネガティブコントロールではほとんど収量が得られていないことから、アディショナルオリゴは非転移鎖である第二アダプターに連結され、第二アダプターは標的二本鎖DNAに連結されることで反応が起こることが示された。
実施例２：本発明を用いたストランド情報を保持したNGS用ライブラリーの調製
　本実施例では、本発明によってRNA由来の二本鎖cDNAを標的とした断片化、タグメント化が効率的に行われ、NGS用ライブラリーの調製が可能であるか検討し、さらにストランド情報の保持が可能となるか検討するため、以下の実験を行った。
　まずHeLa S3細胞よりRNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN社）を用いて精製したRNA 1 ngからcDNAを合成し、このcDNA溶液9 μLに表８に示した2ndストランド合成液を添加し、表９に示したサイクルで反応させ、RNA由来二本鎖DNAを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　反応後のRNA由来二本鎖ＤＮＡをAMPure XPビーズ（Beckman Coulter社）27 μLを用いてマニュアル通りに核酸を精製し、2.5 μLのTn5反応用バッファーと1.25 μLの滅菌水の混合液でDNAを溶出した（（RNA由来）精製二本鎖DNA）。その後、実施例１と同様に、得られた（RNA由来）精製二本鎖DNAを標的二本鎖DNAとして、表１０の組成でTn5反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　調製した反応液を55℃で5分間反応（アダプター１及び２）又は50℃で20分間反応（アダプター３）し、断片化及び第一のタグメント配列の付加を行った。0.15% ドテシル硫酸ナトリウム溶液を2.5 μL添加することで反応を停止した後、表５の組成で調製したアディショナル反応液を全量添加した。
　アディショナル反応液を添加後、37℃で15分間反応（アダプター１及び２）又は20℃で20分間反応（アダプター３）し、アディショナル反応を行い、第二のタグメント配列を付加した。このようにして得られた二本鎖ＤＮＡライブラリーを核酸精製せずに使用して、以下のようにPCR反応を行った。
　表６の組成でPCR反応液を調製し、表７の反応サイクルでPCRを行い、インデックス配列及びillumina社NGS用のP5、P7配列の付加を行った。なお、このPCR反応液では、ウラシルを含む塩基配列を増幅できないファミリーＢに属するKOD（Thermococcus kodakarensis）由来のDNAポリメラーゼを使用した。
　反応後のPCR産物をAMPure XPビーズ（Beckman Coulter社）24 μLを用いてマニュアル通りに核酸を精製し、30 μLのTEバッファー（ナカライテスク社）中に溶出した（精製したPCR核酸溶液）。そして精製したPCR核酸溶液 3μLを用いて、SHIMADZU社のDNA/RNA分析用マイクロチップ電気泳動装置MultiNAを用いてマニュアル通りに電気泳動し、ライブラリー産物のパターンを確認した（図６）。また、GenNext（登録商標）NGS Library Quantification Kit（東洋紡社）を用いてマニュアル通りにライブラリーの定量を行ったところ、Tn5（アダプター１）では、dUTPを添加していない条件で83 nM、dUTPを添加した条件で37 nMであると算出された。Tn5（アダプター２）及びTn5（アダプター３）においても同様の結果が得られた。
　これらの結果から、本発明によってRNA由来のcDNAからでも効率的に断片化、タグメント化が行われており、イルミナ社NGS用のライブラリーの調製が可能となったことがわかる。さらにdUTPを含んだ条件では半量程度の収量が得られており、ウラシルを鋳型に増幅できないポリメラーゼを用いることで、2ndストランドからの増幅ができていないと考えられた。この結果から、本実施例の方法により得られた二本鎖DNAライブラリーが、1stストランドから増幅されたもので構成されており、ストランド情報を保持できていることが分かる。
実施例３：本発明を用いて調製したライブラリーのNGS解析
　実施例１、実施例２において得られた二本鎖DNAライブラリーのうち、ゲノムDNA又はRNA由来二本鎖DNA（dUTPなし、又はあり）をTn5（アダプター１）、Tn5（アダプター２）、Tn5（アダプター３）で処理して調製したライブラリーを使用して、Miseq Reagent Kit v3及びMiseqを用いてNGS解析を行った。尚、アダプター１及びアダプター２を解析する場合には、シーケンスプライマーとして以下のカスタムプライマーを既定のシーケンスプライマー液に添加した。アダプター３の解析は、Miseq Reagent Kit v3に添付されているRead1プライマー、Read2プライマー、Index1 Readプライマーを使用した。
アダプター１のためのRead1プライマー：
5’-GCGTCCTCGTGTGCTACTTGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号１２）
アダプター１のためのRead2プライマー：
5’-CTCGGCTCGTGTGCTACTTGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号１３）
アダプター１のためのIndex1 Readプライマー：
5’-TCAAGTAGCACACGAGCCGAGCCCACGAGAC-3’（配列番号１４）
アダプター２のためのRead1プライマー：
5’-GGCAGCGTCAGCTAGCTAGCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号１５）
アダプター２のためのRead2プライマー：
5’-GTGGGCTCGGAGCTAGCTAGCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’（配列番号１６）
アダプター２のためのIndex1 Readプライマー：
5’-ACATCTGCTAGCTAGCTCCGAGCCCACGAGAC-3’（配列番号１７）
CLC Genomics workbenchを用いて、解析されたNGSデータについてヒトゲノムへのマッピング率及びストランド率を解析した。その結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　この結果から、本発明の二本鎖DNAライブラリー生成方法により、NGSを始めとするシーケンス解析等に利用できる二本鎖DNAライブラリーを簡単な手順で効率的に生成できることが明らかとなった。
　本発明により、簡便且つ迅速に次世代シーケンサー（NGS）解析などの遺伝子解析のためのライブラリー調製が可能となる。

Claims (14)

  1. 　５’末端側と３’末端側とに異なるタグメント配列を有する二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する方法であって、以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）：
    　（ｉ）（ａ）第一のタグメント配列及び第一のトランスポゾン末端配列を含む第一アダプターと、
    　　　　（ｂ）前記第一のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有する第二のトランスポゾン末端配列を含む第二アダプターと、
    　　　　（ｃ）トランスポゼースと
    　　を含むトランスポソームによって二本鎖ＤＮＡを断片化し、該二本鎖ＤＮＡの５’末端又は３’末端に、前記第一アダプター及び前記第二アダプターのいずれか一方のアダプターを転移鎖として連結させる工程、
    　（ｉｉ）第二のタグメント配列を含むアディショナルオリゴを前記第二アダプターに連結させる工程、及び
    　（ｉｉｉ）前記第一アダプター及び前記第二アダプターのうち、二本鎖ＤＮＡに連結していない非転移鎖のアダプターを、該二本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端のうち前記工程（ｉ）において転移鎖のアダプターを連結させていない末端に連結させる工程、
    を含み、前記工程（ｉｉ）は、前記工程（ｉｉｉ）の前、後、又は同時に実施される、方法。
  2. 　前記第一アダプターが、前記第一のトランスポゾン末端配列よりも５’末端側に第一のタグメント配列を含み、トランスポゼースによって前記二本鎖ＤＮＡの５’末端に連結する転移鎖となる、請求項１記載の方法。
  3. 　前記アディショナルオリゴが、前記第一アダプターの塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記トランスポゼースが、高活性Ｔｎ５トランスポゼースであり、前記第一及び第二のトランスポゾン末端配列がＴｎ５型のトランスポゾン末端配列である、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記工程（ｉｉ）において、ＤＮＡリガーゼにより、アディショナルオリゴを第二アダプターに連結させる、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記工程（ｉｉｉ）において、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼにより、前記二本鎖ＤＮＡに連結していない非転移鎖のアダプターを前記二本鎖ＤＮＡに連結させる、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記工程（ｉｉｉ）において、二本鎖ＤＮＡに連結していない非転移鎖のアダプターが５’末端側がリン酸化修飾されている第二アダプターであり、前記第二アダプターを前記二本鎖ＤＮＡの３’末端に連結させる、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記工程（ｉ）において、前記二本鎖ＤＮＡの５’末端に第一アダプターを転移鎖として連結させ、前記工程（ｉｉ）において、５’末端側がリン酸化修飾されているアディショナルオリゴを第二アダプターの３’末端に連結させる、請求項１に記載の方法。
  9. 　前記工程（ｉ）において、前記二本鎖ＤＮＡの５’末端に第一アダプターを転移鎖として連結させ、前記工程（ｉｉ）において、３’末端側のＯＨ基が修飾されているアディショナルオリゴを第二アダプターの３’末端に連結させる、請求項１に記載の方法。
  10. 　前記ＯＨ基の修飾が、リン酸基又はinverted dTによる修飾である、請求項９に記載の方法。
  11. 　ストランド情報を保持している二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する、請求項１に記載の方法。
  12. 　前記二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖が修飾されている、請求項１に記載の方法。
  13. 　前記修飾がメチル化修飾である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記第一タグメント配列におけるシトシン塩基がメチル化されている前記第一アダプター及び前記第二タグメント配列におけるシトシン塩基がメチル化されている前記アディショナルオリゴを使用し、バイサルファイト解析に用いられる二本鎖ＤＮＡライブラリーを生成する、請求項１２に記載の方法。
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