WO2024096505A1

WO2024096505A1 - 친화성 크로마토그래피를 통해 불순물을 제거하는 방법

Info

Publication number: WO2024096505A1
Application number: PCT/KR2023/017083
Authority: WO
Inventors: 정세천; 김송영; 서정걸; 오은서; 김상욱; 이태수; 박연진
Original assignee: Samsung Bioepis Co Ltd
Current assignee: Samsung Bioepis Co Ltd
Priority date: 2022-10-31
Filing date: 2023-10-31
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2025-04-30
Also published as: KR20250095668A; AU2023374003A1; EP4613757A1

Abstract

본 발명은 비이온성 계면활성제를 포함하는, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 목적 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 조성물 또는 방법을 이용하여 목적 단백질을 정제할 경우 목적 단백질의 수득율을 향상시키면서 HCP를 효과적으로 제거할 수 있는 바, 항체 의약품 등의 재조합 단백질 의약품을 제조하는 공정에서 응용될 수 있다.

Description

친화성 크로마토그래피를 통해 불순물을 제거하는 방법

본 발명은 비이온성 계면활성제를 포함하는, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 목적 단백질 정제 방법에 관한 것이다.

숙주 세포 단백질(Host cell protein, HCP)는 바이오의약품 제조에 사용되는 숙주 세포(host cell)의 대사 과정에서 생성되는 모든 공정-관련 불순물(process-related impurity)을 지칭한다. 상기 HCP는 매우 적은 양으로도 면역 반응(immune response), 항-약물 항체(anti-drug antibody) 형성 등의 이상반응을 초래할 가능성 있다고 알려져 있는 바, 정제 공정 중에 HCP를 제거하는 기술은 중요한 의미를 가진다.

친화성 크로마토그래피로서 단백질 A 크로마토그래피 (Protein A chromatography)는 항체의 Fc 단편에 특이적 결합력을 가지는 단백질 A를 리간드로 사용한다. 이 때문에 항체 정제 공정 중 첫번째 공정으로 주로 사용되며, 불순물이 많은 HCCF 내에 존재하는 항체를 높은 순도로 정제할 수 있게 한다.

HCCF(Harvest cell culture fluid)를 단백질 A 레진에 로딩할 때, 항체의 Fc 단편과 단백질 A 리간드도 결합하지만, HCP 또한 항체 또는 단백질 A 레진과 비특이적인 결합 (non-specific binding)을 한다. 이러한 비특이적 결합 때문에 단백질 A 리간드로부터 항체를 회수할 시 (용출 단계), 항체에 비특이적으로 결합한 HCP가 같이 회수될 수 있다.

따라서, 항체 회수 전에, 비특이적으로 결합한 HCP를 제거할 수 있는 첨가물을 흘려주어 (세척 단계), 비특이적으로 결합한 HCP를 제거해줄 수 있으나, 이때 첨가물의 종류에 따라 HCP만 제거하는 것이 아니라 단백질 A 리간드에 붙은 항체 또한 같이 제거하여 공정 수율을 낮추는 역효과를 불러오기도 한다.

이에, 정제 공정 수율은 유지하면서, 단백질 A 크로마토그래피 공정의 정제물 내에 HCP를 감소시킬 수 있는 기술의 개발이 요구된다.

일 양상은 A) 목적 단백질을 포함하는 시료와 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 B) 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 상기 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 A) 목적 단백질을 포함하는 시료와 비이온성 계면활성제를포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 B) 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 상기 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계를 포함하는, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법을 제공한다.

또 다른 양상은 비이온성 계면활성제를 포함하는, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 조성물을 제공한다.

일 양상은 A) 목적 단백질을 포함하는 시료와 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 B) 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 상기 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 하기에서 설명할 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.

상기 방법은 목적 단백질 정제하는 과정에서 불순물을 제거하는 방법일 수 있으며, 구체적으로 불순물 제거를 개선시키는 방법일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "비이온성 계면활성제(non-ionic surfactant)"는 물에 이온화되지 않고 용해되는 계면활성제로서, 다른 종류의 계면활성제와 달리 이온성을 띄지 않아 다른 물질들과의 상용성이 좋다는 점에서 응용의 폭이 넓어 여러분야에서 폭넓게 사용되고 있다.

상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100), 터지톨 15-S (TERGITOL 15-S) 시리즈, 터지톨 NP (TERGITOL NP) 시리즈, 터지톨 MIN-FOAM (TERGITOL MIN-FOAM) 시리즈 및 EcoSurf 시리즈로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 터지톨 15-S (TERGITOL 15-S) 시리즈일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "터지톨 (Tergitol)"은 다우 케미칼 캄파니(The Dow Chemical Company)에서 상업적으로 판매하고 있는 화합물에 대한 상품명이다.

상기 비이온성 계면활성제는 2차 알코올 에톡실레이트 형태의 화합물일 수 있으며, 구체적으로 상기 비이온성 계면활성제는 (a) 쇄내에 명시된 수의 탄소를 함유하는 지방족 쇄와 (b) 명시된 수의 에톡실레이트화 단위를 함유하는 것일 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 하기 화학식 1의 일반식으로 표현될 수 있다.

[화학식 1]

(상기 m, n 및 x는 각각 0이 아닌 정수임)

상기 비이온성 계면활성제는 터지톨 15-S 계열의 터지톨을 포함하는 것일 수 있다. 상기 터지톨 15-S는 2차 알코올 에톡실레이트로서 Alcohols, C12-14-secondary, ethoxylated의 화학식명을 갖는 화합물이고, 알킬 탄소 사슬 길이가 11 내지 15이고, 3 내지 40개의 에톡실레이트 단위를 갖는 것이다. 상기 터지톨 15-S는 84133-50-6의 Cas No로 나타낼 수 있으며, 하기 화학식 2의 일반식으로 표현될 수 있다.

[화학식 2]

(상기 m 및 n은 각각 0이 아닌 정수이고, m+n=2 내지 6의 정수이며, x는 3 내지 40의 정수임)

상기 15-S 계열의 터지톨은 '터지톨 15-S-x'으로 표현될 수 있으며, 상기 x은 에톡실레이트 단위의 개수를 나타낸다. 상기 x는 3 내지 40일 수 있으며, 구체적으로 3 내지 40, 3 내지 35, 3 내지 30, 3 내지 25, 3 내지 20, 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 10, 3 내지 9, 5 내지 40, 5 내지 35, 5 내지 30, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 12, 5 내지 10, 5 내지 9, 7 내지 40, 7 내지 35, 7 내지 30, 7 내지 25, 7 내지 20, 7 내지 15, 7 내지 12, 7 내지 10, 또는 7 내지 9의 정수일 수 있다.

따라서, 예를 들어, 터지톨 15-S-9는 9개의 에톡실레이트 단위를 포함하는 화합물을 의미하며, 하기 화학식 3으로 표현될 수 있다.

[화학식 3]

(상기 m 및 n은 0이 아닌 정수이고, m+n=2 내지 6의 정수이며, x는 9임)

상기 15-S 계열의 터지톨(터지톨 15-S 시리즈)은 터지톨 15-S-3, 터지톨 15-S-5, 터지톨 15-S-7, 터지톨 15-S-9, 터지톨 15-S-12, 터지톨 15-S-15, 터지톨 15-S-30 및 터지톨 15-S-40로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 터지톨 15-S-9를 포함하는 것일 수 있다.

상기 NP 계열의 터지톨(터지톨 NP 시리즈)는 노닐페놀 에톡시레이트 계열의 비이온성 계면활성제로서, 터지톨 NP-4, 터지톨 NP-6, 터지톨 NP-7, 터지톨 NP-8, 터지톨 NP-9, 터지톨 NP-9.5, 터지톨 NP-10, 터지톨 NP-11, 터지톨 NP-12, 터지톨 NP-13, 터지톨 NP-15, 터지톨 NP-30, 터지톨 NP-40, 터지톨 NP-50, 터지톨 NP-55, 및 터지톨 NP-70으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 비이온성 계면활성제는 알코올 에톡실레이트 및 알킬페놀 에톡실레이트 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 1차 알코올 에톡실레이트, 2차 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트 및 옥틸페놀 에톡실레이트로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 2차 알코올 에톡실레이트를 포함하는 것일 수 있다.

상기 비이온성 계면활성제는 화학식 1로 표현되는 화합물을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 화학식 2로 표현되는 화합물을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 화학식 3으로 표현되는 화합물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 비이온성 계면활성제(구체적으로, 터지톨)는 상기 혼합물 총 중량에 대하여 0.003%(w/w) 내지 2.0%(w/w)의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 혼합물 내 비이온성 계면활성제(구체적으로, 터지톨)의 농도는 0.003%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.01%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.008%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.006%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.005%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.01%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.008%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.006%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.005%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.01%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.008%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.006%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.01%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.008%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 또는 0.5%(w/w) 내지 0.6%(w/w) 일 수 있다.

상기 비이온성 계면활성제는 상기 시료 내 불순물의 비특이적인 결합을 억제 또는 저해하는 것일 수 있으며, 구체적으로 1) 상기 시료 내 불순물과 목적 단백질간의 비특이적인 결합 및 2) 상기 시료 내 불순물과 친화성 크로마토그래피의 친화성 리간드간의 비특이적인 결합 중 하나 이상을 억제 또는 저해하는 것일 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 불순물의 비특이적인 결합을 억제함으로서 친화성 크로마토그래피를 이용한 목적 단백질 정제 과정에서 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "목적 단백질"은 당업자가 발현 또는 수득하고자 하는 단백질을 의미하는 것으로서, 숙주세포 또는 목적하는 생체 내에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 상기 목적 단백질은 "표적 단백질" 또는 "관심 단백질"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.

상기 목적 단백질은 재조합 단백질일 수 있으며, 예를 들어 항체 치료제, 항암면역치료제, 암치료 백신, 감염질환 백신, 단백질 대체 치료제, 알레르기 치료제, 또는 면역질환 치료제로 사용될 수 있는 것을 포함할 수 있다.

상기 목적 단백질은 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편,　면역접합체 (immunoadhesin), 형질전환 성장 인자 (Transforming Growth Factor: TGF)-베타 수퍼패밀리 신호전달 분자, 혈액 응고 인자, 항-종양 괴사 인자 수용체 (tumor necrosis factor receptor: TNFR) 항체, 항-인간 표피 성장 인자 수용체 2 (human epidermal growth factor receptor 2: HER2) 항체 및 TNFR:Fc로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin: Ig)"과 상호교환적으로 사용된다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond: SS-bond)으로 결합한다. 항체는 예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM일 수 있다. 상기 항체는 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 동물 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 용어 "항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"은　면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 말한다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fv, Fab, Fab', Fv F(ab')₂, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기　면역접합체는 항체 유사 단백질로서,　면역글로불린의 Fc 영역과, 결합 단백질의 기능성 도메인 (예, 수용체, 리간드 세포-부착 (cell-adhesion) 분자)의 융합 단백질을 의미한다.

상기 TGF-베타 수퍼패밀리 신호전달 분자는 예를 들어 TGF-베타 1, TGF-베타 2, 또는 TGF-베타 3일 수 있다. 상기 혈액 응고 인자는 혈액 응고에 관여하는 인자를 말한다. 상기 혈액 응고 인자는 예를 들어, 피브리노겐, 프로트롬빈, 조직 트롬보플라스틴, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor), 프리칼리크레인 (prekallikrein), 고분자량 키니노겐,　피브로넥틴, 안티트롬빈 III, 헤파린 공인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-연관 프로테아제 저해제, 플라스미노겐, 알파 2-안티플라스민, 조직 플라스미노겐 활정세, 우로키나제 (urokinase), 플라스미노겐 활성제 저해제-1, 플라스미노겐 활성제 저해제-2, 또는 암 프로코아굴란트 (cancer procoagulant)이다.

상기 항-TNFR 항체는 TNFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 또한, 상기 항-HER2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있으며, TNFR:Fc는 TNFR과 Fc 영역의 융합 단백질을 말한다.

상기 목적 단백질은 아바고보맙 (abagovomab), 압시비맙 (abciximab), 아달리무맙 (adalimumab), 아데카투무맙 (adecatumumab), 알렘투주맙 (alemtuzumab), 알투모맙 (altumomab), 알투모맙 펜테테이트 (altumomab pentetate), 아나투모맙 (anatumomab), 아나투모맙 마페나톡스 (anatumomab mafenatox), 아르시투모맙 (arcitumomab), 아틀리주맙 (atlizumab), 바실리지맙 (basiliximab), 벡투모맙 (bectumomab), 엑투모맙 (ectumomab), 벨리무맙 (belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙 (bevacizumab), 브렌툭시맙 (brentuximab), 카나키누맙 (canakinumab), 카프로맙 (capromab), 카프로맙 펜데티드 (capromab pendetide), 카투마조맙 (catumaxomab), 세르톨리주맙 (certolizumab), 클리바투주맙 테트라제탄 (clivatuzumab tetraxetan), 다클리주맙 (daclizumab), 데노수맙 (denosumab), 에쿨리주맙 (eculizumab), 에드레콜로맙 (edrecolomab), 에팔리주맙 (efalizumab), 에타라시주맙 (etaracizumab), 에르투마조맙 (ertumaxomab), 파놀레소맙 (fanolesomab), 폰톨리주맙 (fontolizumab), 겜투주맙 (gemtuzumab), 기렌툭시맙 (girentuximab), 골리무맙 (golimumab), 이브리투모맙 (ibritumomab), 이고보맙 (igovomab), 인플릭시맙 (infliximab), 이플리무맙 (ipilimumab), 라베투주맙 (labetuzumab), 메폴리주맙 (mepolizumab), 무로모납 (muromonab), 무로모납(muromonab)-CD3, 나탈리주맙 (natalizumab), 네시투무맙 (necitumumab), 니모투주맙 (nimotuzumab), 오파투무맙 (ofatumumab), 오말리주맙 (omalizumab), 오레고보맙 (oregovomab), 팔리비주맙 (palivizumab), 파니투무맙 (panitumumab), 라니비주맙 (ranibizumab), 리툭시맙 (rituximab), 사투모맙 (satumomab), 술레소맙 (sulesomab), 이브리투모맙 (ibritumomab), 이브리투모맙 티욱제탄 (ibritumomab tiuxetan), 토실리주맙 (tocilizumab), 토시투모맙 (tositumomab), 트라스투주맙 (trastuzumab), 우스케티누맙 (ustekinumab), 비실리주맙 (visilizumab), 보투무맙 (votumumab), 잘루투무맙 (zalutumumab), 브로달루맙 (brodalumab), 안루킨주맙 (anrukinzumab), 바피네우주맙 (bapineuzumab), 달로투주맙 (dalotuzumab), 뎀시주맙 (demcizumab), 가니투맙 (ganitumab), 이노투주맙 (inotuzumab), 마브릴리무맙 (mavrilimumab), 모제투모맙 파수도톡스 (moxetumomab pasudotox), 릴로투무맙 (rilotumumab), 시팔리무맙 (sifalimumab), 타네주맙 (tanezumab), 트랄로키누맙 (tralokinumab), 트레멜리무맙 (tremelimumab), 우렐루맙 (urelumab), 아도르나제 알파 (adornase alfa), 레비프 (Rebif), 베카플레르민 (becaplermin), 알테플라제 (alteplase), 라로니다제 (laronidase), 알레파셉트 (alefacept), 애플리버셉트 (aflibercept), 락시바쿠맙 (Raxibacumab), 다르베포에틴 알파 (darbepoetin alfa), 베카플레르민 농축물 (Becaplermin Concentrate), 인터페론 베타 (interferon beta)-1b, 보툴리늄 독소 유형 (Botulinum Toxin Type) A, 라스부리카제 (rasburicase), 아스파라기나제 (asparaginase), 에포에틴 알파 (epoetin alfa), 에타네르셉트(etanercept), 아갈시다제 베타 (agalsidase beta), 인터페론 알파콘 (interferon alfacon)-1, 인터페론 알파 (interferon alfa)-2a, 아나킨라 (anakinra), 보툴리늄 독소 유형 (Botulinum Toxin Type) B, 페그필그라스팀 (pegfilgrastim), 오프렐베킨 (oprelvekin), 필그라스팀 (filgrastim), 데닐레우킨 디프티톡스 (denileukin diftitox), 페긴테르페론 알파 (peginterferon alfa)-2a, 알데스레우킨 (aldesleukin), 도르나제 알파 (dornase alfa), 인터페론 베타 (interferon beta)-1a, 베타플레르민 (becaplermin), 레테플라제 (reteplase), 인터페론 알파 (interferon alfa)-2, 테넥테플라제 (tenecteplase), 드로트레코긴 알파 (drotrecogin alfa), 릴로나셉트 (rilonacept), 로미플로스팀 (romiplostim), 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (methoxypolyethylene glycol)-에포에틴 베타(epoetin beta), C1 에스테라제 (esterase) 저해제, 이두르술파제 (idursulfase), 알글루코시다제 알파 (alglucosidase alfa), 아바타셉트 (abatacept), 갈술파제 (galsulfase), 팔리페르민 (palifermin) 및 인터페론 감마 (interferon gamma)-1b로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 목적 단백질은 면역글로불린 또는 Fc-융합 단백질과 같이 Fc 단편을 포함하는 단백질(Fc 함유-단백질)일 수 있다. 용어 "Fc 단편"은 항체의 결정화가능한 꼬리 영역으로서, Fc 수용체라 불리는 세포 표면 수용체와 상호작용하는 영역을 의미하며, 단백질 A와 상호작용할 수 있는　면역글로불린 분자의 아미노산 잔기를 의미하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 "Fc 단편"은 "Fc 영역", "Fc 도메인" 또는 "Fc"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

상기 목적 단백질을 포함하는 시료는 세포 배양액일 수 있으며, 구체적으로 목적 단백질을 발현/생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 수득한 배양액일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "세포 배양액(cell culture fluid)"은 수확된 세포 배양액 (harvest cell culture fluid, HCCF), 세포 배양 상청액 또는 사전 처리된(pretreated) 세포 배양액/배양 상청액을 의미한다. 상기 세포 배양액은 목적 단백질을 발현/생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다. 세포 배양액은 원심분리 및/또는 여과, 예를 들어, 정밀 여과, 정용여과, 한외여과 및 심층 여과에 의해 부분적으로 정화되거나 정제되었을 수 있다.

본 명세서에서의 용어, "사전 처리된(pretreated)"은 원하는 크로마토그래피 성능을 달성하고 목적 단백질을 안정화시키도록 pH 및/또는 전도도 범위 및/또는 완충 용량을 조정하여 위하여, 예를 들어, 샘플에 대하여, 버퍼 교환, 희석, 염, 세제, 카오트로픽(chaotropic) 물질, 또는 유기 화합물의 첨가, pH 적정(titration) 또는 여과로 이루어진 일 이상의 조정을 수행함으로써, 예를 들어, 본 발명의 방법에 이용되는 크로마토그래피 단계를 위하여 제조되는 세포 배양액이다. 포유류 세포로부터 발현된 목적 단백질은 배양 과정 중에 일반적으로 세포 배양액으로 분비되기 때문에, 배양 과정 마지막에서의 생성물 수확은 세포로부터 세포 배양액을 분리함으로써 이루어진다. 세포 분리 방법은 세포 잔해의 증가, 및 프로테아제 및 목적 단백질 생성물의 품질에 영향을 미칠 수 있는 다른 분자의 방출을 피하기 위하여 세포 파괴를 최소화하도록 부드럽게 이루어져야 한다. 일반적으로, 포유류 세포 배양물로부터의 수확물은 원심분리에 이어서 여과를 거친다. 확장층 흡착 크로마토그래피(Expanded bed adsorption chromatography)는 원심분리/여과 방법을 피하기 위한 대안적인 방법이다. 크로마토그래피 단계를 통한 정제 전 샘플의 다른 처리는 특정 목적 단백질 농도, pH 범위, 전도도 및 버퍼종(buffer species) 농도로 세포 배양액을 농축 및/또는 정용여과하는 것일 수 있다.

상기 목적 단백질을 생산하는 숙주 세포 또는 유기체는 목적 단백질을 인코딩하는 유전자로 형질전환될 수 있고, 목적 단백질을 발현할 수 있는 임의의 적합한 숙주 세포 또는 유기체일 수 있다. 상기 숙주 세포는 진핵 또는 원핵일 수 있고, 비제한적으로, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포를 포함할 수 있으며, 포유류 세포가 바람직하다. 적합한 포유류 세포의 비-제한 예는 항체-발현 하이브리도마 세포, 뿐만 아니라 발현 숙주, 예컨대 원숭이 신장 세포 7(COS7: monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HeLa 세포, HuT 78 세포 또는 HEK293 세포 등을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 A) 단계는 목적 단백질을 포함하는 시료, 구체적으로 세포 배양액에 비이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 첨가하여 혼합하는 것을 포함하는 것으로서, 상기 시료에 일정 농도의 비이온성 계면활성제를 첨가한 후 여과하거나 및/또는 인큐베이션을 수행하는 것을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 방법에 있어서, 목적 단백질을 고효율로 수득하거나, 불순물을 효과적으로 제거하는 등의 친화성 크로마토그래피를 효과적으로 수행하기 위해, 비이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 첨가하기 전 또는 후에 상기 시료에 추가 성분을 처리하거나 추가 공정을 도입하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, B) 단계는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 상기 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계로서, 구체적으로 불순물을 제거하여 목적 단백질을 정제하는 단계이다.

본 명세서에서의 용어 "친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)" 또는 "친화성 정제"는 고형 지지체에 고정된 또는 커플링된 리간드와 이의 결합 파트너 사이의 특이적 결합 상호작용에 기반한 분리 방법을 의미한다. 복합 혼합물이 컬럼에 통과되는 경우, 친화성 리간드에 특이적 결합 친화성을 갖는 분자들은 결합된다. 다른 샘플 성분이 세정 제거된 후, 결합된 분자는 박리된 형태 지지체로, 최초 혼합물로부터 이의 정제를 초래한다. 각각의 특이적 친화성 시스템은 당해 분야의 숙련가에 공지된 조건의 이의 자체 세트를 요구한다.

상기 친화성 리간드는 금속 (예를 들면, Cd⁺², Co⁺², Cu⁺², Ga⁺³, Fe⁺³, Ni⁺², 및 Zn⁺²), 염료 [예를 들면, 시바크론 블루(Cibacron Blue) 및 이의 변이체], 글루타티온, 서브틸리신, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 보로네이트, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 항-c-Myc, 항-HA, 뉴클레오타이드, 조효소, 항체, 헤파린, (공지된 특이성을 가진 항체에 대한) 항원, 및 다른 공지된 친화성 리간드 중 선택될 수 있다.

일 예로서, 상기 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피, Capto Blue(High Sub) 크로마토그래피，단백질 G 크로마토그래피， 단백질 A/G 크로마토그래피，단백질 L 크로마토그래피，Lambda Fab Select 크로마토그래피, Kappa Select 크로마토그래피, lg Select 크로마토그래피, Blue Sepharose 크로마토그래피, Capto Heparin 크로마토그래피, VII Select 크로마토그래피, VIII Select 크로마토그래피, XSelect 크로마토그래피 및 Capto L 크로마토그래피로부터 선택되는 것일 수 있으며, 구체적으로 단백질 A 크로마토그래피일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "단백질 A 크로마토그래피" 는 단백질 A를 사용하여 물질 및/또는 입자를 분리 또는 정제하는 기술 또는 방법을 의미한다. 상기 단백질 A 는 원래 스타필로코쿠스 아우레우스에서 발견된 40-60 kD 세포벽 단백질로서, 그의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성 또는 생합성으로 제조된 단백질 A(예를 들어, 펩타이드 합성에 의해, 또는 재조합 기술에 의해), 및 CH2/CH3 및/또는 Fc 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 보유한 그의 변이체를 포함할 수 있다. 단백질 A는 일반적으로 고체 상에 고정화되어 있는 바, 용어 "단백질 A"는 단백질 A가 공유결합되는 크로마토그래피 고형물 지지 매트릭스(chromatographic solid support matrix)를 함유하는 친화성 크로마토그래피 수지 또는 컬럼을 나타낸다. 일 예로, 단백질 A　크로마토그래피에서 사용하기 위한 크로마토그래피　칼럼은 폴리비닐에테르 고체 상에 고정화된 단백질 A, 예를 들어 Eshmuno® 칼럼 (Merck, Darmstadt, Germany), 공극 유리 매트릭스에 고정화된 단백질 A, 예를 들어 ProSep® 칼럼 (Merck, Darmstadt, Germany), 아가로스 고체 상에 고정화된 단백질 A, 예를 들어 MABSELECT^TM SuRe^TM 칼럼 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서의 용어 "불순물(impurity)"은 상기 방법에서 정제, 회수 또는 수득해야 할 목적 단백질과 상이한 임의의 물질을 의미한다. 상기 불순물은 세포 배지 성분, 세포 잔해, 숙주 세포 단백질(Host cell protein, HCP), 내독소, 바이러스, 지질, DNA, RNA, 공정 물질로부터의 침출수, 및 그의 응집체 또는 단편일 수 있으며, 응집체, 전하 변이체, 잘못 접힌(misfolded) 분자, 또는 정제될 목적 단백질의 단편과 같은 생성물-관련 물질도 불순물로 간주될 수 있다. 본 명세서에서 상기 불순물은 "오염물(contaminant)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 목적 단백질을 포함하는 시료에 포함되는 불순물로서, 본 발명에서 제거하고자 하는 대상이 되는 불순물은 숙주 세포 단백질을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "숙주 세포 단백질(Host cell protein, HCP)"은 목적 단백질을 발현/생산하는 숙주 세포의 대사 과정 중 생성되는 모든 공정 관련 불순물(process-related impurity)을 의미한다. 본 명세서에서 상기 숙주 세포 단백질은 "숙주 세포 단백질 오염물질", 및 "숙주 세포 단백질 불순물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 B) 단계는 B-1) 상기 혼합물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하는 단계; 및 B-2) 상기 칼럼을 제1 세척 버퍼로 세척하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 평형 버퍼(equilibration buffer)로 평형된 칼럼일 수 있으며, 구체적으로, 상기 혼합물을 로딩하기 전에 평형 버퍼를 이용하여 평형화시킨 컬럼일 수 있다. 따라서, 상기 B-1) 단계는 혼합물 로딩 전에 평형 버퍼로 상기 친화성 크로마토그래피 칼럼을 평형화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 상기 혼합물이 로딩된 후 평형 버퍼를 이용하여 평형화될 수 있다. 따라서, 상기 B-1) 단계는 혼합물 로딩 후에 평형 버퍼로 상기 친화성 크로마토그래피 칼럼을 평형화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 평형 버퍼는 인산나트륨, 염화나트륨, 트리스(Tris), 트리스-염화수소(Tris-HCl), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, 인산칼륨, 염화칼륨, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 평형 버퍼는 pH 7 내지 8, 50 내지 100 mM의 인산나트륨, 및 70 내지 130 mM의 염화나트륨을 포함하는 것일 수 있다.

상기 평형 버퍼의 pH는 7 내지 8, 7 내지 7.8, 7 내지 7.6, 7 내지 7.4, 7 내지 7.3, 7.2 내지 8, 7.2 내지 7.8, 7.2 내지 7.6, 7.2 내지 7.4, 7.2 내지 7.3, 7.3 내지 8, 7.3 내지 7.8, 7.3 내지 7.6 또는 7.3 내지 7.4일 수 있다.

상기 평형 버퍼는 50 내지 100 mM, 50 내지 90 mM, 50 내지 80 mM, 50 내지 75 mM, 60 내지 100 mM, 60 내지 90 mM, 60 내지 80 mM, 60 내지 75 mM, 70 내지 100 mM, 70 내지 90 mM, 70 내지 80 mM, 70 내지 75 mM, 75 내지 100 mM, 75 내지 90 mM 또는 75 내지 80 mM 농도의 인산나트륨을 포함하는 것일 수 있다.

상기 평형 버퍼는 70 내지 130 mM, 70 내지 120 mM, 70 내지 110 mM, 70 내지 105 mM, 70 내지 100 mM, 80 내지 130 mM, 80 내지 120 mM, 80 내지 110 mM, 80 내지 105 mM, 80 내지 100 mM, 90 내지 130 mM, 90 내지 120 mM, 90 내지 110 mM, 90 내지 105 mM, 90 내지 100 mM, 95 내지 130 mM, 95 내지 120 mM, 95 내지 110 mM, 95 내지 105 mM, 95 내지 100 mM, 100 내지 130 mM, 100 내지 120 mM, 100 내지 110 mM 또는 100 내지 105 mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 것일 수 있다.

상기 B-2) 단계는 컬럼 내 존재하는 숙주 세포 단백질 등의 불순물을 제거하기 위한 단계로서, 제1 세척 버퍼로 칼럼을 세척하는 것일 수 있다. 상기 B-2) 단계는 1회 이상 수행될 수 있다.

상기 세척은 고정상으로부터 불순물을 용출시키지만 표적 생성물(목적 단백질)을 용출시키지 않는 이동상의 적용을 의미하는 것일 수 있다.

상기 제1 세척 버퍼는 목적 단백질과 친화성 리간드 간의 결합은 유지하면서 칼럼 내 숙주 세포 단백질 등을 포함하는 불순물만을 제거하기에 적합한 성분 또는 성분들의 조합을 포함하는 버퍼를 사용할 수 있으며, 구체적으로 인산나트륨, 염화나트륨, 트리스(Tris), 트리스-염화수소(Tris-HCl), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, 인산칼륨, 염화칼륨, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), 트리톤 X-100 (Triton X-100), 요소 (Urea), 트윈 80 (Tween 80), LDAO (Lauryldimethylamine oxide), 염화칼슘 (CaCl₂), 아르기닌(Arginine), EDTA (ethylene-diamine-tetraacetic acid), 구아니딘(Guanidine), 이소프로판올(isopropanol) 및 이들의 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 제1 세척 버퍼는 구아니딘, 구아니딘 염(예를 들어, 구아니딘-HCl) 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하지 않는 것일 수 있으며, 구체적으로 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올을 모두 포함하지 않는 것일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 제1 세척 버퍼는 pH 6.5 내지 8, 20 내지 80 mM의 트리스, 및/또는 0.5 내지 1.5 M의 염화나트륨을 포함하는 것일 수 있다.

상기 제1 세척 버퍼의 pH는 6.5 내지 8, 6.5 내지 7.8, 6.5 내지 7.6, 6.5 내지 7.4, 6.5 내지 7.2, 6.5 내지 7.0, 6.7 내지 8, 6.7 내지 7.8, 6.7 내지 7.6, 6.7 내지 7.4, 6.7 내지 7.2, 6.7 내지 7.0, 7.0 내지 8, 7.0 내지 7.8, 7.0 내지 7.6, 7.0 내지 7.4 또는 7.0 내지 7.2 일 수 있다.

상기 제1 세척 버퍼는 20 내지 80 mM, 20 내지 70 mM, 20 내지 60 mM, 20 내지 55 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 80 mM, 30 내지 70 mM, 30 내지 60 mM, 30 내지 55 mM, 30 내지 50 mM, 40 내지 80 mM, 40 내지 70 mM, 40 내지 60 mM, 40 내지 55 mM, 40 내지 50 mM, 45 내지 80 mM, 45 내지 70 mM, 45 내지 60 mM, 45 내지 55 mM, 45 내지 50 mM, 50 내지 80 mM, 50 내지 70 mM, 50 내지 60 mM 또는 50 내지 55 mM 농도의 트리스를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제1 세척 버퍼는 0.5 내지 1.5 M, 0.5 내지 1.3 M, 0.5 내지 1.1 M, 0.5 내지 1.0 M, 0.7 내지 1.5 M, 0.7 내지 1.3 M, 0.7 내지 1.1 M, 0.7 내지 1.0 M, 0.9 내지 1.5 M, 0.9 내지 1.3 M, 0.9 내지 1.1 M, 0.9 내지 1.0 M, 1.0 내지 1.5 M, 1.0 내지 1.3 M 또는 1.0 내지 1.1 M 농도의 염화나트륨을 포함하는 것일 수 있다.

상기 B) 단계는 B-3) 상기 칼럼을 제2 세척 버퍼로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 B-3) 단계는 컬럼 내 존재하는 제1 세척 버퍼 및 이의 잔류물 등의 불순물을 제거하기 위한 단계로서, 제1 세척 버퍼로 세척한 칼럼을 제2 세척 버퍼를 이용하여 세척하는 것일 수 있다. 상기 B-3) 단계는 1회 이상 수행될 수 있다.

상기 제2 세척 버퍼는 목적 단백질과 친화성 리간드 간의 결합은 유지하면서 칼럼 내 제1 세척 버퍼 및 이의 잔류물 등의 불순물만을 제거하기에 적합한 성분 또는 성분들의 조합을 포함하는 버퍼를 사용할 수 있으며, 구체적으로 인산나트륨, 염화나트륨, 트리스(Tris), 트리스-염화수소(Tris-HCl), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, 인산칼륨, 염화칼륨, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid) 및 이들의 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 제2 세척 버퍼는 pH 6.5 내지 8 이고, 20 내지 80 mM의 트리스를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제2 세척 버퍼의 pH는 6.5 내지 8, 6.5 내지 7.8, 6.5 내지 7.6, 6.5 내지 7.4, 6.5 내지 7.2, 6.7 내지 8, 6.7 내지 7.8, 6.7 내지 7.6, 6.7 내지 7.4, 6.7 내지 7.2, 7.0 내지 8, 7.0 내지 7.8, 7.0 내지 7.6, 7.0 내지 7.4, 7.0 내지 7.2, 7.2 내지 8, 7.2 내지 7.8, 7.2 내지 7.6 또는 7.2 내지 7.4일 수 있다.

상기 제2 세척 버퍼는 20 내지 80 mM, 20 내지 70 mM, 20 내지 60 mM, 20 내지 55 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 80 mM, 30 내지 70 mM, 30 내지 60 mM, 30 내지 55 mM, 30 내지 50 mM, 40 내지 80 mM, 40 내지 70 mM, 40 내지 60 mM, 40 내지 55 mM, 40 내지 50 mM, 45 내지 80 mM, 45 내지 70 mM, 45 내지 60 mM, 45 내지 55 mM, 45 내지 50 mM, 50 내지 80 mM, 50 내지 70 mM, 50 내지 60 mM 또는 50 내지 55 mM 농도의 트리스를 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법은 C) 용출 버퍼를 이용하여 상기 칼럼으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 C) 단계는 컬럼 내 존재하는 목적 단백질을 회수하기 위한 단계로서, 구체적으로 용출 버퍼(elution buffer)를 이용하여 목적 단백질 또는 목적 단백질을 포함하는 정제물을 회수하는 단계일 수 있다.

상기 용출 버퍼는 크로마토그래피 칼럼으로부터 단백질을 용리하는데 사용되는 완충제로서, 목적 단백질과 친화성 리간드 간의 결합을 감소시키면서 상기 목적 단백질을 효과적으로 회수하기에 적합한 성분 또는 성분들의 조합을 포함하는 버퍼를 사용할 수 있으며, 구체적으로 시트레이트 아세테이트, 포스페이트, 암모늄 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 용출 버퍼는 pH 2 내지 5이고, 100 내지 500 mM의 글라이신을 포함하는 것일 수 있다.

상기 용출 버퍼의 pH는 1 내지 5, 1 내지 4.5, 1 내지 4, 1 내지 3.5, 1.5 내지 5, 1.5 내지 4.5, 1.5 내지 4, 1.5 내지 3.5, 2 내지 5, 2 내지 4.5, 2 내지 4, 2 내지 3.5, 2.5 내지 5, 2.5 내지 4.5, 2.5 내지 4, 2.5 내지 3.5, 3 내지 5, 3 내지 4.5, 3 내지 4 또는 3 내지 3.5일 수 있다.

상기 용출 버퍼는 100 내지 500 mM, 100 내지 450 mM, 100 내지 400 mM, 100 내지 350 mM, 100 내지 300 mM, 150 내지 500 mM, 150 내지 450 mM, 150 내지 400 mM, 150 내지 350 mM, 150 내지 300 mM, 200 내지 500 mM, 200 내지 450 mM, 200 내지 400 mM, 200 내지 350 mM, 200 내지 300 mM, 250 내지 500 mM, 250 내지 450 mM, 250 내지 400 mM, 250 내지 350 mM, 250 내지 300 mM, 300 내지 500 mM, 300 내지 450 mM, 300 내지 400 mM 또는 300 내지 350 mM 농도의 글라이신을 포함하는 것일 수 있다.

상기 C) 단계에 있어서, 상기 용출물은 이후 공정에서, 예를 들어 보다 낮은 pH에서의 항온 처리 또는 중화 공정에서 후처리될 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은 1400 ppm 이하, 1300 ppm 이하, 1200 ppm 이하, 1100 ppm 이하, 1000 ppm 이하, 900 ppm 이하, 800 ppm 이하, 700 ppm 이하 또는 600 ppm 이하의 불순물(구체적으로, 숙주 세포 단백질)을 함유하는 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은 500 내지 1300 ppm, 500 내지 1200 ppm, 500 내지 1100 ppm, 500 내지 1000 ppm, 500 내지 950 ppm, 500 내지 900 ppm, 500 내지 850 ppm, 500 내지 800 ppm, 500 내지 750 ppm, 500 내지 700 ppm, 500 내지 650 ppm, 500 내지 600 ppm, 550 내지 1300 ppm, 550 내지 1200 ppm, 550 내지 1100 ppm, 550 내지 1000 ppm, 550 내지 950 ppm, 550 내지 900 ppm, 550 내지 850 ppm, 550 내지 800 ppm, 550 내지 750 ppm, 550 내지 700 ppm, 550 내지 650 ppm, 550 내지 600 ppm, 600 내지 1200 ppm, 600 내지 1100 ppm, 600 내지 1000 ppm, 600 내지 950 ppm, 600 내지 900 ppm, 600 내지 850 ppm, 600 내지 800 ppm, 600 내지 750 ppm, 600 내지 700 ppm, 600 내지 650 ppm, 650 내지 1200 ppm, 650 내지 1100 ppm, 650 내지 1000 ppm, 650 내지 950 ppm, 650 내지 900 ppm, 650 내지 850 ppm, 650 내지 800 ppm, 650 내지 750 ppm 또는 650 내지 700 ppm의 불순물(구체적으로, 숙주 세포 단백질)을 함유하는 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은 95 내지 105%, 95 내지 104%, 95 내지 103%, 95 내지 102%, 95 내지 101%, 95 내지 100%, 97 내지 105%, 97 내지 104%, 97 내지 103%, 97 내지 102%, 97 내지 101%, 97 내지 100%, 99 내지 105%, 99 내지 104%, 99 내지 103%, 99 내지 102%, 99 내지 101%, 또는 99 내지 100%의 목적 단백질 수율을 나타내는 것일 수 있다. 상기 목적 단백질 수율은 친화성 크로마토그래피를 적용하기 전의 목적 단백질을 포함하는 시료에 포함된 목적 단백질 양 대비 친화성 크로마토그래피를 적용한 후 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함된 목적 단백질 양의 비율로 계산된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다 효과적으로 불순물이 제거된 것일 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 방법을 이용하는 경우 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않는 대조군보다 불순물 함량은 낮으면서 목적 단백질 수율은 유지되거나 또는 증가된 용출물, 회수물 또는 정제물을 수득할 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은, 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다, 불순물(구체적으로, 숙주 세포 단백질)이 감소된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 불순물의 양은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 불순물의 양 보다 약 5% 이상 감소된 것일 수 있으며, 구체적으로 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은, 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다, 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)이 증가되거나 유지된 것일 수 있으며, 구체적으로 일정 수준 이상으로 증가되거나 일정 수준 이하로 증가/감소된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)보다 약 5% 이상 증가된 것일 수 있다. 구체적으로 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 증가된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)보다 약 10% 이하로 증가/감소된 것일 수 있으며, 구체적으로 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 5% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.01% 이하, 약 0.01% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 8%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.01% 내지 약 3%, 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 8%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 8%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 8%, 약 1% 내지 약 5%, 또는 약 1% 내지 약 3% 증가/감소된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 세척 버퍼를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다 효과적으로 불순물이 제거된 것일 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 방법을 이용하는 경우 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 세척 버퍼를 이용한 대조군보다 불순물 함량은 낮거나 유사하면서, 목적 단백질 수율은 증가된 용출물, 회수물 또는 정제물을 수득할 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은, 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 세척 버퍼를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다, 불순물(구체적으로, 숙주 세포 단백질)이 감소된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 불순물의 양은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 세척 버퍼를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 불순물의 양 보다 약 5% 이상 감소된 것일 수 있으며, 구체적으로 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은, 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 세척 버퍼를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다, 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)이 증가된 것일 수 있다.

상기 방법을 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 세척 버퍼를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)보다 약 5% 이상 증가된 것일 수 있다. 구체적으로 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 증가된 것일 수 있다.

다른 양상은 A) 목적 단백질을 포함하는 시료와 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 B) 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 상기 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계를 포함하는, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.

상기 방법은 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시킴으로서 목적 단백질을 정제하기 위한 방법일 수 있다.

또 다른 양상은 A) 목적 단백질을 포함하는 시료와 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 B) 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 상기 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계를 포함하는, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의한 정제된 목적 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.

또 다른 양상은 비이온성 계면활성제를 포함하는, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.

상기 조성물은 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시킴으로서 목적 단백질을 정제 및/또는 정제된 목적 단백질을 제조하기 위한 조성물일 수 있다.

상기 조성물은 목적 단백질을 포함하는 시료가 친화성 크로마토그래피에 적용하기 전에 사용되는 것일 수 있다.

상기 조성물은 목적 단백질을 포함하는 시료에 혼합되는 것일 수 있으며, 상기 조성물 또는 상기 조성물에 포함되는 비이온성 계면활성제가 상기 혼합물 총 중량에 대하여 0.003%(w/w) 내지 2.0%(w/w)의 농도로 포함되도록 혼합되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 혼합물 내 포함되는 비이온성 계면활성제(구체적으로, 터지톨)의 농도는 0.003%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.01%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.008%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.006%(w/w), 0.003%(w/w) 내지 0.005%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.01%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.008%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.006%(w/w), 0.004%(w/w) 내지 0.005%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.01%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.008%(w/w), 0.005%(w/w) 내지 0.006%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.01%(w/w), 0.006%(w/w) 내지 0.008%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.03%(w/w), 0.01%(w/w) 내지 0.02%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.03%(w/w) 내지 0.04%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.04%(w/w) 내지 0.05%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.4%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.3%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.2%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.1%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.08%(w/w), 0.05%(w/w) 내지 0.06%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.3%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.6%(w/w), 0.4%(w/w) 내지 0.5%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.8%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.6%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.4%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.2%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 1.0%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 0.9%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 0.8%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 0.7%(w/w), 또는 0.5%(w/w) 내지 0.6%(w/w) 일 수 있다.

상기 조성물은 목적 단백질을 포함하는 시료와 적절히 혼합함으로서 상기 시료 내 불순물의 비특이적인 결합을 억제 또는 저해하는 것일 수 있으며, 구체적으로 1) 상기 시료 내 불순물과 목적 단백질간의 비특이적인 결합 및 2) 상기 시료 내 불순물과 친화성 크로마토그래피의 친화성 리간드간의 비특이적인 결합 중 하나 이상을 억제 또는 저해하는 것일 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는불순물의 비 특이적인 결합을 억제함으로서 친화성 크로마토그래피를 이용한 목적 단백질 정제 과정에서 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은, 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다, 불순물(구체적으로, 숙주 세포 단백질)이 감소된 것일 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 불순물의 양은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 불순물의 양 보다 약 5% 이상 감소된 것일 수 있으며, 구체적으로 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은, 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다, 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)이 증가되거나 유지된 것일 수 있으며, 구체적으로 일정 수준 이상으로 증가되거나 일정 수준 이하로 증가/감소된 것일 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)보다 약 5% 이상 증가된 것일 수 있다. 구체적으로 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 증가된 것일 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)보다 약 10% 이하로 증가/감소된 것일 수 있으며, 구체적으로 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 5% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.01% 이하, 약 0.01% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 8%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.01% 내지 약 3%, 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 8%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 8%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 8%, 약 1% 내지 약 5%, 또는 약 1% 내지 약 3% 증가/감소된 것일 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은, 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물(세척 버퍼)를 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다, 불순물(구체적으로, 숙주 세포 단백질)이 감소된 것일 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 불순물의 양은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물(세척 버퍼)를 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 불순물의 양 보다 약 5% 이상 감소된 것일 수 있으며, 구체적으로 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물은, 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물(세척 버퍼)를 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물보다, 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)이 증가된 것일 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)은 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하지 않고 및/또는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물(세척 버퍼)를 이용하여 수득한 용출물, 회수물 또는 정제물에 포함되는 목적 단백질의 수득율(목적 단백질의 양)보다 약 5% 이상 증가된 것일 수 있다. 구체적으로 약 5% 이상, 약 8% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 증가된 것일 수 있다.

일 양상에 따른 조성물 또는 방법을 이용하여 목적 단백질을 정제할 경우 목적 단백질의 수득율을 향상시키면서 HCP를 효과적으로 제거할 수 있는 바, 항체 의약품 등의 재조합 단백질 의약품을 제조하는 공정에서 응용될 수 있다.

도 1은 터지톨 첨가 농도 (0-0.5%(w/w))에 따른 단백질 A 크로마토그래피 정제물의 HCP 잔류량 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 터지톨의 농도가 CMC 농도인 0.005% 이상일 경우, 터지톨 농도 증가에 따라 HCP 제거능이 증가하는 경향을 확인하였다.

도 2는 터지톨 첨가 농도 (0-0.5%(w/w))에 따른 단백질 A 크로마토그래피 정제물의 단백질 수득율(공정 수율)과 HCP 잔류량 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 터지톨 첨가 농도가 증가함에도 단백질 수득율은 유사한 수준으로 확인되었고, HCP 잔류량은 감소하는 경향을 확인하였다.

도 3은 첨가되는 비이온성 계면활성제(0.5%(w/w)) 종류에 따른 HCP 제거능을 비교분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: HCCF에 비이온성 계면활성제를 처리하는 공정

본 발명의 목적인, HCCF(harvest cell culture fluid) 내의 불순물로서 HCP(Host cell protein)를 효과적으로 제거하기 위한 기술에 있어서, 비이온성 계면활성제 처리에 따른 HCP 제거능을 비교분석하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 한편, 상기 비이온성 계면활성제의 일 예로서 터지톨(Tergitol)을 사용하였다.

구체적으로, 재조합 단백질 생산 공정으로부터 수득한 HCCF에 터지톨 15-S-9를 0 내지 0.5 %(w/w)의 농도 범위(0.002, 0.006, 0.05, 0.5 w/w%)로 첨가한 후, 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용하여, 30분간 믹싱을 수행하였다. 믹싱이 완료된 후에, 0.22 μm 필터를 이용하여 여과를 수행하였다. 여과 후, 최소 0.5시간동안 상온에서 인큐베이션을 수행하였다.

실험예 2: 단백질 A 크로마토그래피(Protein A chromatography) 수행

HCCF에서 HCP 등의 불순물을 제거하고 목적 단백질을 수득하기 위한 공정으로서, 친화성 크로마토그래피로서 하기와 같이 단백질 A 크로마토그래피를 수행하였다.

먼저, 단백질 A 컬럼을 평형 버퍼(equilibration buffer) (75 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨, pH 7.3)로 5 CV(column volumes) 워싱을 수행하여 평형(equilibration) 과정을 수행하였다. 그 후, 단백질 A 컬럼에 실험예 1에서 비이온성 계면활성제가 처리된 HCCF를 항체의 load ratio가 25 g/L resin이 되도록 로딩한 후, 평형 버퍼로 3 CV 워싱을 수행하였다. 그 후, 단백질 A 컬럼 내 존재하는 불순물(impurity)을 제거하기 위해 wash 1 버퍼 (구체적인 조성은 하기 표 1에 기재함)로 3 CV 워싱을 수행하였다.

다음으로, 항체를 회수하기 전 단백질 A 컬럼 내 존재하는 wash 1 버퍼를 제거해주기 위해, wash 2 버퍼 (50 mM Tris, pH 7.2)를 이용하여 3 CV 컬럼 워싱을 수행하였으며, 완료 후 용출 버퍼(elution buffer) (300 mM glycine, pH 3.4)를 이용하여 단백질 A 컬럼으로부터 항체를 회수하였다. 회수된 항체는 pH 5.5로 중화된 후에 CHO ELISA 분석 (Cygnus CHO HCP ELISA kit, F550-1)을 수행하여 그 결과를 비교하였다.

실험예 3: 터지톨 첨가 및 농도에 따른 HCP 제거능 평가

상기 실험예 1 및 2에서 수행한 단백질 A 크로마토그래피에서의 터지톨 첨가 농도 및 Wash 1 버퍼 조성에 따른 목적 단백질 수율 (yield) 및 HCP 농도(HCP 제거능)를 하기 표 1에 구체적으로 기재하였다.

한편, 상기 목적 단백질 수율은 각 실험별로 배양액(HCCF)내에 존재하는 목적 단백질의 총 양과 친화성 크로마토그래피 수행 후 용출물 내에 존재하는 목적 단백질 총 양의 비율로 계산되었다.

구체적으로, HCCF 내에 존재하는 목적 단백질의 총량은 HCCF 부피와 HCCF 역가(titer)의 곱으로 계산이 되며, 이때 HCCF 역가는 단백질 G-HPLC를 이용하여 측정한다. 또한, 용출물 내에 존재하는 목적 단백질의 총량은 용출액 부피와 용출물 내에 존재하는 목적 단백질의 농도로 계산이 되며, 상기 용출물 내 목적 단백질의 농도는 UV/Vis　분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 280 nm의 흡광도를 측정해 계산한다 (HCCF 내에는 항체 외에 다른 불순물들이 많이 존재하여 단백질 G-HPLC를 통하여 항체만 정제 후에 역가를 측정하고, 용출물 내에는 단백질 A 정제가 완료된 후 높은 순도를 보이는 항체 정제물이기 때문에 280 nm를 측정하여 농도 계산). 이때 측정 방법에 따라 variation이 존재하여 단백질 수율이 100%가 초과되어 측정될 수 있다.

No.	HCCF내 Tergitol 첨가 농도(w/w%)	Wash 1 버퍼 조성	Yield (%)		HCP (ppm)		p-value^a
대조군 1	N/A	50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.0	101.4	101.0 [SD: 0.3]	1527.5	1483 [SD: 39]	N/A
			101.0		1465.6
			100.8		1456.4
실시예 1	0.002%	50 mM Tris,1 M NaCl, pH 7.0	101.7	101.5 [SD: 0.2]	1426.1	1370 [SD 118]	0.189
			101.5		1448.9
			101.2		1233.7
실시예 2	0.006%	50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.0	101.3	101.0 [SD: 0.6]	1214.3	1170 [SD: 49]	0.001
			101.5		1117.6
			100.3		1178.7
실시예 3	0.050%	50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.0	100.8	100.7 [SD: 0.2]	829.3	850 [SD: 20]	0.000
			100.8		852.6
			100.4		868.6
실시예 4	0.500%	50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.0	99.9	99.8 [SD: 0.2]	748.2	669 [SD: 71]	0.000
			99.9		610.4
			99.6		647.5
대조군 2	N/A	50 mM Tris, 0.8 M Guanidine-HCl, 12% isopropanol, pH 7.0	93.7	93.1 [SD: 1.7]	771.4	773 [SD: 11]	0.000
			91.2		785.3
			94.5		763.1

^a대조군 1 조건 대비 2-sample T-test 결과

구체적으로, HCCF에 첨가한 터지톨의 농도가 CMC(Critical micelle concentration) 농도인 0.005% 이하인 경우에는 터지톨을 첨가하지 않은 대조군 (대조군 1)보다 통계적으로 유의한 효과를 나타내지 않았으나, 0.005% 이상인 경우에는 터지톨 첨가 농도 증가에 따라 단백질 A 크로마토그래피 정제물 내의 HCP 농도가 현저히 감소하는 것을 확인하였습니다 (표 1 및 도 1).

다음으로, HCCF에 첨가한 터지톨의 농도에 따른 단백질 A 크로마토그래피 공정 수율 및 HCP 농도 변화를 확인한 결과, 터지톨 첨가 농도 증가에 따라 목적 단백질 수율(yield)는 유사한 수준으로 확인되었으며, 정제물 내 HCP 농도는 감소하는 경향을 확인하였다 (표 1 및 도 2).

다음으로, HCCF에 터지톨을 첨가하지 않고 wash 1 버퍼에 구아니딘을 포함하는 대조군 2의 경우, HCP 제거 효능을 어느정도 나타냈으나, 목적 단백질 수율이 실시예 1 내지 4와 비교하여 현저히 저하되는 것을 확인하였다 (표 1).

따라서, HCCF에서 목적 단백질을 정제/수득하는 공정에서, 일정 농도의 터지톨을 HCCF에 첨가한 후 정제 공정을 수행할 경우 목적 단백질의 수득율을 유지하거나 향상시키면서 HCP를 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 4: 계면활성제 종류에 따른 HCP 제거능 평가

상기 실험예 1 및 2에서 수행한 단백질 A 크로마토그래피에서, HCCF에 첨가된 비이온성 계면활성제의 종류에 따른 목적 단백질 수율 (yield) 및 HCP 농도(HCP 제거능)를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, HCCF에 첨가되는 비이온성 계면활성제로서 터지톨 15-S-9, 터지톨 NP-9(Cas no. 127087-87-0), 터지톨 min foam 1X(Cas no. 68439-51-0), 또는 EcoSurf SA-9(Cas no. 68937-66-6)를 사용하였으며, HCCF에 첨가되는 비이온성 계면활성제의 종류를 제외하고는 상기 표 1의 실시예 4와 동일한 조건으로 단백질 A 크로마토그래피를 수행하였다.

그 결과, 다양한 비이온성 계면활성제 중 Tergitol 15-S-9가 현저히 우수한 HCP 제거능을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3).

따라서, HCCF에서 목적 단백질을 정제/수득하는 공정에서, 다양한 종류의 비이온성 계면활성제 중 2차 알코올 에톡시레이트(보다 구체적으로, 터지톨 15-S-9)를 HCCF에 첨가한 후 정제 공정을 수행할 경우, 보다 효과적으로 목적 단백질의 수득율을 유지하거나 향상시키면서 HCP를 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

A) 목적 단백질을 포함하는 시료와 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및

B) 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 상기 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계

를 포함하는, 목적 단백질을 정제하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100), 터지톨 15-S (TERGITOL 15-S) 시리즈 및 터지톨 NP (TERGITOL NP) 시리즈로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 터지톨 15-S-3, 터지톨 15-S-5, 터지톨 15-S-7, 터지톨 15-S-9, 터지톨 15-S-12, 터지톨 15-S-15, 터지톨 15-S-20, 터지톨 15-S-30 및 터지톨 15-S-40로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 알코올 에톡시레이트를 포함하는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 하기 화학식 2로 표현되는 화합물을 포함하는 것인, 방법:

[화학식 2]

상기 m 및 n은 각각 0이 아닌 정수이고,

상기 m 및 n의 합은 2 내지 6의 정수이고,

상기 x는 3 내지 40의 정수임.
청구항 1에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 상기 혼합물 총 중량에 대하여 0.003%(w/w) 내지 2.0%(w/w)의 농도로 포함되는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 상기 시료 내 불순물의 비특이적인 결합을 억제하는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 목적 단백질을 포함하는 시료는 세포 배양액(cell culture fluid)인 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피인 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 목적 단백질은 Fc 단편을 포함하는 단백질인 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 불순물은 숙주 세포 단백질(Host cell protein, HCP)을 포함하는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 B) 단계는

B-1) 상기 혼합물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하는 단계; 및

B-2) 상기 칼럼을 제1 세척 버퍼로 세척하는 단계

를 포함하는 것인, 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 B) 단계는

B-3) 상기 칼럼을 제2 세척 버퍼로 세척하는 단계

를 추가로 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은

C) 용출 버퍼를 이용하여 상기 칼럼으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계

를 추가로 포함하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 제1 세척 버퍼는 구아니딘, 구아니딘 염 및 이소프로판올로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하지 않는 것인, 방법.
A) 목적 단백질을 포함하는 시료와 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및

B) 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 이용하여 상기 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계

를 포함하는, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법.
비이온성 계면활성제를 포함하는, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 조성물.