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WO2024084030A1 - Manipulation et transfert d'objets par propulsion - Google Patents

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Publication number
WO2024084030A1
WO2024084030A1 PCT/EP2023/079252 EP2023079252W WO2024084030A1 WO 2024084030 A1 WO2024084030 A1 WO 2024084030A1 EP 2023079252 W EP2023079252 W EP 2023079252W WO 2024084030 A1 WO2024084030 A1 WO 2024084030A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
donor substrate
objects
substrate
transferred
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2023/079252
Other languages
English (en)
Inventor
Antonio IAZZOLINO
Bertrand Viellerobe
Fabien Guillemot
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Poietis SAS
Original Assignee
Poietis SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Poietis SAS filed Critical Poietis SAS
Priority to CN202380087372.XA priority Critical patent/CN120435373A/zh
Priority to JP2025522912A priority patent/JP2025536961A/ja
Priority to EP23794288.3A priority patent/EP4605223A1/fr
Publication of WO2024084030A1 publication Critical patent/WO2024084030A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B29C64/10—Processes of additive manufacturing
    • B29C64/106—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material
    • B29C64/112—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material using individual droplets, e.g. from jetting heads
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    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
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    • B33Y50/00—Data acquisition or data processing for additive manufacturing
    • B33Y50/02—Data acquisition or data processing for additive manufacturing for controlling or regulating additive manufacturing processes

Definitions

  • the present invention relates to the field of additive manufacturing of a material by repeated transfers of particles between a donor substrate and a receiver substrate, a film of vector liquid containing the particles to be transferred being deposited on the donor substrate, and in particular the field of bioprinting.
  • the particular field of bioprinting concerns the use of digital manufacturing processes making it possible to organize and assemble in 2D and 3D the constituents of biological tissues with the aim of producing grafts for regenerative medicine or physiological models. for biomedical and pharmaceutical research.
  • the general principle of the invention consists of transferring biological objects (cells for example), organic or mineral from a carrier liquid deposited on a substrate in the form of a film and providing an energy pulse to form a cavitation bubble, directly by vaporization of the liquid part in the focal field of the energy source - generally a laser - or via a thin metallic coating forming a sacrificial layer on the donor substrate.
  • This cavitation bubble drives the particle(s) located in the firing axis towards a receiving substrate, on which the transferred particles accumulate, as the shots are repeated.
  • the equipment comprises a first optical focusing unit placed between said controlled optical deflection means and the film as well as a second optical image conjugation unit placed between said sensor and said separator.
  • the sensor is placed in the focal plane of this second optical unit.
  • Patent application US2022152925 describes a printing process using equipment comprising an exciter delivering orientable energy to produce a point interaction with at least one ink which may contain non-uniformities and deposited on a printing support having a transparent interaction zone, in order to cause a transfer of a targeted part of said ink to a receiver, the method comprising the generation of a wetting film at least partially covering said transparent interaction zone, followed by the deposition of said ink on the surface of said wetting film and transfer steps.
  • Patent application US2020102529 relates to additive manufacturing equipment and method, comprising an orientable energy excitation means to generate an intermittent interaction with a fluid covering a blade in order to trigger a jet oriented in the direction of a target, the fluid being consisting of a liquid vector containing inhomogeneities, in which: the fluid forms a liquid film with a thickness of less than 500 ⁇ m on a blade presenting at least one zone allowing interaction with the laser, into which at least one entrance opens, the interaction zone leading to at least one outlet, the equipment also comprising means for the circulation of the fluid between the inlet and the outlet.
  • Patent application US2017225390 relates to a process for additive manufacturing of a three-dimensional object.
  • the method involves sequentially forming a plurality of layers each of which is structured according to the shape of a cross section of the object.
  • forming at least one of the layers includes performing a raster scan to distribute at least a first building material composition, and a vector scan to distribute at least a second composition of building material.
  • the vector scanning is optionally carried out along a path selected to form at least one structure selected from the group consisting of (i) an elongated structure, (ii) a boundary structure at least partially surrounding an area filled with the first material of construction, and (iii) an inter-layer connection structure.
  • the focus of each shot must be adjusted to take into account the plane in which the particle located in the field of fire is positioned, to bring the appropriate energy into the plane located just under the particle, so that the The energy impulse ensures the cavitation of the liquid under the particle.
  • This step of adjusting the focus before each shot significantly slows down the cadence.
  • the transfer of the particle is accompanied by a transfer of a significant part of carrier liquid, which leads to a material of low volume density.
  • the particles are relatively mobile in the film of vector liquid, and the precision of the shot is disturbed by the movements between the moment of analysis of the image of the firing field, and the triggering of the shot.
  • the present invention relates, in its most general sense, to a process for manufacturing a material having the characteristics set out in claim 1.
  • a method of manufacturing by transferring at least one object, in particular a particle from a donor substrate towards a target substrate, according to the invention in particular provides a donor substrate forming a surface on which a film of vector liquid is deposited 'a thickness e z in a vertical direction Z.
  • a vector liquid contains the objects to be transferred of dimension (D x , D y , D z ). The transfer is ensured by local energetic excitation of said liquid to form a cavitation bubble localized at an object, characterized in that the ratio D z /e z is greater than 1, and preferably greater than 0.5.
  • said objects are spheroids constituted by an aggregation of elementary biological cells.
  • said values D x , D y , D z are greater than 100 ⁇ m and preferably greater than 200 ⁇ m.
  • said energetic excitation is carried out by focusing a laser at the interface between the surface of said substrate and said film of vector liquid.
  • said energetic excitation is carried out by application of an electric field.
  • the energy deposition is carried out by focusing an acoustic wave at the interface between the surface of said substrate and said film of vector liquid.
  • the energy level applied to each shot is a function of the size of the object located in the firing axis.
  • said recipient substrate (40) is elastically deformable along the Z axis.
  • the method comprises steps of displacement in the XOY plane of an object by application of firing with an energy at least 2 times lower than the energy required for transfer of the object to the receiving substrate .
  • the objects to be transferred are spaced by a characteristic distance (d) of value d > 0.5D xy .
  • the objects are of a biological nature including cellular aggregates, spheroids, organoids, explants, explants (islets of Langherans), polymer particles encapsulating the cells (organoid covered with a layer of biomaterial), micro-carriers seeded with cells, biomaterial beads.
  • the volume fraction or volume density of the biological objects transferred by propulsion within the printed tissue or organ is greater than 30%.
  • the transfer is repeated to manufacture a material, tissue or organ and the volume fraction or volume density of the biological objects transferred by propulsion in said printed material, tissue or organ is greater than 30%.
  • the process is combined with other printing technologies such as extrusion, inkjet, LIFT in order to manufacture complex materials or fabrics comprising different components.
  • the process is carried out by the use of several laser beams simultaneously when the object has a non-isotropic shape in order to guarantee its transfer along a homogeneous trajectory.
  • the energy source consists of a laser.
  • the blade of the donor substrate is transparent or weakly absorbing at the wavelength of said laser beam.
  • it comprises an opto-mechanical system making it possible to direct the laser spot relative to the centroid or center of mass of the object.
  • the system can allow the simultaneous use of several laser beams directed at different points of said object in order to make it take off in a homogeneous manner.
  • the energy source consists of a generator of an electric field.
  • the energy source consists of a generator of an acoustic wave.
  • it includes a system for controlling and controlling the value of energy deposited as a function of the size of the particle to be transferred.
  • an intelligent object detection system means of automating the steps of placing the material on the donor substrate and the handling/transfer steps.
  • the donor substrate is covered by a sacrificial layer having high absorption/conduction properties of energy deposition by laser or by electric field.
  • the recipient substrate is not covered by a layer having high absorption properties, this being produced directly in the liquid.
  • it includes an optical visualization/detection system for identifying and targeting the objects to be transferred, compatible with a random distribution of objects on the donor substrate.
  • said donor substrate is placed below said recipient substrate.
  • it comprises at least one other printing means including extrusion, inkjet, LIFT in order to manufacture complex materials or fabrics comprising different components.
  • it includes a means for delivering several laser beams simultaneously at the level of the object when the latter has a non-isotropic shape in order to guarantee its transfer along a homogeneous trajectory.
  • the equipment comprises a system for controlling and controlling the value of energy deposited as a function of the size or shape of the object to be transferred, this energy being deposited in the form of a single pulse, several pulses repeated over time on the same point or several pulses sent simultaneously according to an XY pattern linked to the shape of the object.
  • the recipient substrate is not covered by a layer having strong laser absorption properties to initiate the propulsion process, the absorption then being carried out directly in the liquid layer located between the object and the donor substrate.
  • the donor substrate consists of micro-wells in which the objects to be transferred are arranged.
  • the system can include an extruder for adding a link to the receiving substrate (40), for example a hydrogel type biomaterial between the layers of transferred particles.
  • the equipment can combine several 3D printing, bioprinting and photo-polymerization technologies.
  • the optical part of the device is made up of two parts, a part comprising the camera (20) used to aim at objects, and a part comprising the laser (10) used to “shoot”, i.e. deliver pulses energetics in a plane of the donor substrate (30) where there is a particle to be transferred.
  • the laser (10) is for example an Nd-YAG laser which emits pulses of 1 to 10 ns at 1064 nm with an energy of 15 to 60 microjoules, significantly higher than the energy usually used for LIFT processes.
  • it is constituted by a Ytterbium pulsed fiber laser emitting at 1030nm, with shorter pulses, from 350 femtoseconds to 10 picoseconds, with several tens of microjoules of energy per pulse.
  • the lens (16) is typically an F-Theta lens with a focal length of 100mm suitable for laser scanning.
  • the typical spot size at the focal plane is around 30 to 35 ⁇ m in diameter.
  • the laser beam (14) passes through a shaping optic (13) then is directed via a set of mirrors (11, 12) towards a scanner (15) which will then send the beam vertically towards the donor substrate (30) , via the F-Theta lens (16).
  • the scanner (15) is made up of two automated mirrors which will redirect the beam horizontally at a certain angle towards the objective (16). The objective (16) will then straighten the beam (14) so that it arrives perpendicular to the donor substrate (30) and focuses it.
  • the scanner mirrors (15) make it possible to control the movement of the laser beam (14) along the horizontal axes on the donor substrate (30).
  • the laser beam (14) is therefore focused on the donor substrate (30) and can be directed along the X and Y axes defining the horizontal plane.
  • the beam (14) is focused on the sacrificial layer coating the surface of the substrate, for example a 20 nanometer layer of gold deposited on a transparent optical window.
  • the second optical part including the camera (20) is the part used for aiming.
  • the particles are, in the case of the present invention, relatively large objects, for example spheroids formed by an aggregate of cells, with a diameter of more than 100 ⁇ m, typically 200 ⁇ m to 300 ⁇ m. These objects are distributed randomly on the donor substrate (30); it is therefore necessary to know the position and size of objects to aim them with a laser shot.
  • a visible light source typically an LED (21) is placed above the cartridge, and the light beam (22) passes through the scanner (15) following the opposite path of the laser beam. It then arrives at the level of a semi-reflecting mirror (12) which lets visible light directed towards the camera (20) pass, but reflects infrared towards the laser (10). The beam then passes through a lens (23), an iris (24) and an objective (25) before arriving at the camera (20). Everything is aligned so that the focus of the laser beam (10) is in the center of the image recovered by the camera (20).
  • the installation implemented by the invention is similar to an installation intended for LIFT bioprinting, with the difference that the energy of the pulses is at least 2 or even 5 times higher, and that the placement of the objects to be transferred differs.
  • the objects have a size of more than 100 ⁇ m, typically 200 to 400 ⁇ m or more, and are positioned in a liquid, typically water with added salts to adjust the density, or a solution of BSA (Bovine Serum Albumin) at 2%, forming a film with a thickness less than the size of the particles to be transferred, such that the donor substrate (30) no longer receives a bio-ink, but particles rest partially in an aqueous film not covering them completely.
  • a liquid typically water with added salts to adjust the density, or a solution of BSA (Bovine Serum Albumin) at 2%
  • the invention relates in a non-limiting manner to the transfer of spheroids formed by the aggregation of cells cultured in the laboratory and presenting the appearance of a small pearl made of cells and extracellular matrix.
  • the stem, progenitor or differentiated cells are cultured by conventional methods and seeded in microwells in order to produce aggregates which are then manipulated according to the method of the present invention.
  • the LIFT phenomenon is a process which takes place over very short times, of the order of a hundred microseconds, and can be observed by a TRI device.
  • TRI (English acronym for “Time Resolved Imaging”) consists of taking images of a phenomenon at a specific time by synchronizing a camera with the laser (10) and an LED in order to take a photo at a precise moment of the jet.
  • the three components are synchronized via an electronic card in order to precisely control the activation of the different components over time.
  • the camera In order to obtain an image of the jet at a precise moment, the camera is turned on for several hundred microseconds, while the LED only emits a light flash of 2 ⁇ s at the desired moment.
  • the LED is positioned in front of the camera, so as to illuminate the jet.
  • the images thus obtained show particle behavior very different from that observed in the state of the art with LIFT bioprinting.
  • the large particle is propelled without carrying part of the vector liquid by the formation of a cavity bubble in the liquid film at the interface between the particle and the bottom of the substrate, and not on an enveloping volume of the particle.
  • the particle emerging from the liquid film it pushes aside the liquid surrounding it, to emerge directly from the vector liquid and reach the receiving substrate with very little liquid transport.
  • a donor substrate (30) receiving the film of technical liquid and the ink containing the particles to be transferred, spread on a cartridge which serves as a support for the laser shots. It is composed of an assembly of four stages (31, 32, 33, 34) of glass and PDMS.
  • the purpose of the technical liquid is to clean the central area of the donor substrate and to pre-wet the surface in order to facilitate the spreading of the ink to be transferred containing the particles.
  • the upper blade (31) of the cartridge is made of Polydimethylsiloxane and has a window (35) surrounding the cylindrical volume receiving the technical liquid and the particles. It constitutes a hydrophobic layer forming a barrier to prevent overflow of technical liquid and ink containing the particles. It has a thickness of 10 ⁇ m.
  • a first intermediate blade (32) also has a window (36) and is used for fixing the upper blade (31). It is made of glass, 0.5 mm thick. It also serves to prevent overflows.
  • a second intermediate blade (33) stage comprises a window (37) and two microfluidic channels (38, 39), one for supplying the technical liquid and the other for sucking it up. It is made of Polydimethylsiloxane and has a thickness of 160 ⁇ m.
  • the lower blade (34) is made of glass and measures 0.5 mm thick. It has two holes (48, 49) at the level of the arrival of the micro-fluidic channels of the blade (33). These two holes (48, 49) serve as entry and exit into the cartridge.
  • the lower blade (34) is coated with a layer of 20 nm gold in the perimeter corresponding to the windows (35, 36, 37).
  • the assembly of these four stages (31 to 34) forms the donor substrate (30).
  • the donor substrate (30) is attached to a fluidic connector (50) shown in , having four channels (51 to 54) on its upper part. Lip seals or valves are placed on these four inlets/outlets (51 to 54) to ensure sealing.
  • the holes (51, 53) will coincide with the recesses (48, 49) of the cartridge (50) and allow the entry and exit of the liquid technical.
  • the entrance to these two channels is on the side of the fluid connector (50), and are connected by white pipes to pumps allowing the circulation of the technical liquid.
  • the two pumps are connected to a tank containing the technical liquid.
  • the particles to be transferred are then deposited on the film with a pipette, for example carried by a robotic arm.
  • the other two holes (51, 54) of the fluidic connector (50) are connected to a vacuum pump and serve to press the donor substrate (30) onto the fluidic connector (50) by suction.
  • the fluidic connector (50) is mounted on a set of three micrometric screws along the three axes.
  • the vertical micrometer screw is used to move the donor substrate (30) along the Z axis in order to be placed on the focal plane of the laser.
  • the two horizontal screws are used to move the donor substrate (30) along the X and Y axes, in order to target different locations on the cartridge, alternatively to using the scanner.
  • Both fluidic pumps are computer controlled via software.
  • Several routines are recorded, in particular that allowing the pre-wetting of the cartridge.
  • the preparation of the technical liquid for printing is done in two stages. Firstly, a pre-wetting film is made on the bottom of the donor substrate (30). To do this, a volume of technical liquid is sent through the first channel, while the suction channel pump is not engaged. Thus the technical liquid will accumulate on the surface of the donor substrate (30), and cover the entire surface, then the suction channel comes into play while the supply of technical liquid is stopped. Thus the thick film will become thinner but the technical liquid will remain spread over the entire surface of the donor substrate (30), the bottom is well pre-wet. Once this film is ready, a precise volume of ink containing particles to be transferred is deposited with a pipette, which will spread over the donor substrate (30).
  • the particle is ejected from the first cavitation bubble, which is much larger than in known LIFT solutions, due to the higher power and the small volume of liquid between the underside of the particle and the bottom of the donor substrate.
  • the particle is ejected alone, out of the liquid with a ballistic propulsion phenomenon.
  • the cavitation bubble explodes and expels the particle upwards at a high speed.
  • a polyethylene particle is approximately 3 mm high, or a speed of 20 m/s. It reaches the receiving substrate (40) almost dry and surrounded by residual splashes of liquid.
  • the ejection of 250 ⁇ m collagen spheres is slower than for polyethylene beads.
  • the particle reaches 3mm in height in 800 ⁇ s, compared to 100 ⁇ s for polyethylene.
  • the transfer of cell spheroids has a behavior similar to that described for collagen because their shape and density are very similar.
  • the transfer of an IPSC (stem cell) spheroid also reaches 3 mm in height in 700 to 800 ⁇ s.
  • the base of the jet takes 100 ⁇ s to form with a sphere of collagen or made of IPSC. Furthermore, we can see that there is a single jet. In fact, the characteristic crown of the second jet is not present. Between 200 ⁇ s and 600 ⁇ s, the jet is formed from the IPSC spheroid at the top of the jet, and the carrier liquid forms the rest of the jet, still attached to the base. However, after 700 ⁇ s, the IPSC spheroid detaches from the jet, and the liquid falls. The spheroid then continues its flight without or with little liquid, as with polyethylene. The jet breaks up at a similar time as for the bio-ink jet, i.e. around 700 ⁇ s.
  • the transfer takes place from the donor substrate (30), the cartridge containing the particles to be transferred, to a recipient substrate (40) consisting of a cell culture plate or a glass slide.
  • the distance between the donor substrate (30) and the donor substrate (30) is critical. It must be greater than the duration necessary for the separation of the liquid filament connecting the particle during the initial journey. Indeed, the particles can, due to their porosity and/or their hydrophilic nature, result in liquid which forms a sort of link (capillary bridge) as long as the particle remains close to the surface of the liquid film, and which breaks. from a certain distance depending on the characteristics of the liquid on the one hand and the particle on the other hand. Typically, this distance is a few millimeters, generally between 3 and 5 mm. The distance must also be limited so that the kinetic energy is sufficient to ensure that most of the particles reach the receiving substrate.
  • a distance of between 3 and 10 mm is usually appropriate, but those skilled in the art will be able to determine the optimal distance by observing, for example with the aforementioned TRI process, the formation and rupture of the liquid filament forming during the trajectory of the particles. This distance can also be chosen to minimize the speed of impact of the object on the recipient.
  • one solution consists of depositing an elastic coating on its receiving surface, for example a 4 mg/ml collagen film.
  • Collagen like any other hydrogel, is more elastic than glass and will deform upon the impact of a particle, which makes the shock less violent for the transferred particle which retains its original shape.
  • the precision of the laser shot constitutes an important parameter.
  • the center of the shot is shifted in the horizontal of 80 ⁇ m offset of the shot relative to the center of the particle, for particles with an average diameter of 200 ⁇ m, the transfer fails.
  • the positioning of the laser beam can be ensured by the scanner (15) or by the positioning of the donor substrate (30), for example by action on the micrometric screws ensuring the positioning of the fluidic connector (50) or by laser shots of low powers, for example a power less than half the power required for the transfer, near a particle to be moved in the horizontal XOY plane.
  • the sacrificial layer ensures constant and reproducible absorption over the entire surface of the donor substrate. It also makes it possible to check the correct functioning of the laser thanks to the ablated spots visible on the sacrificial layer.
  • the use of a sacrificial layer is expensive and time-consuming but above all involves having to change the donor substrate as soon as the ablation rate becomes too high.
  • the number of donor substrate required can very quickly become very large, thereby extending the time and cost of producing said tissues.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé et un équipement de transfert d'au moins un objet depuis un substrat donneur (30) en direction d'un substrat cible (40), ledit substrat donneur (30) formant une surface sur laquelle est déposée un film de liquide vecteur d'une épaisseur ez selon une direction verticale Z, ledit liquide vecteur contenant les objets à transférer de dimension (Dx, Dy, Dz), ledit transfert étant assuré par excitation énergétique locale dudit liquide pour former une bulle de cavitation localisée au niveau d'un objet, caractérisé en ce que le ratio Dz/ez est supérieur à 1, et de préférence supérieur à 0,5.

Description

MANIPULATION ET TRANSFERT D’OBJETS PAR PROPULSION Domaine de l’invention
La présente invention concerne le domaine de la fabrication additive d’un matériau par transferts répétés de particules entre un substrat donneur et un substrat récepteur, un film de liquide vecteur contenant les particules à transférer étant déposé sur le substrat donneur, et notamment le domaine de la bio-impression. Le domaine particulier de la bio-impression concerne l’utilisation de procédés de fabrication numérique permettant d’organiser et d’assembler en 2D et en 3D les constituants des tissus biologiques dans le but de produire des greffons pour la médecine régénératrice ou des modèles physiologiques pour la recherche biomédicale et pharmaceutique.
Le principe général de l’invention consiste à transférer des objets biologiques (des cellules par exemple), organiques ou minérales à partir d’un liquide vecteur déposé sur un substrat sous forme d’un film et d’apporter une impulsion énergétique pour former une bulle de cavitation, directement par vaporisation de la partie de liquide dans le champ focal de la source d’énergie- généralement un laser – ou par l’intermédiaire d’un fin revêtement métallique formant sur le substrat donneur une couche sacrificielle. Cette bulle de cavitation entraîne la ou les particules se trouvant dans l’axe de tir vers un substrat récepteur, sur lequel viennent s’accumuler les particules transférées, au fur et à mesure de la répétition des tirs.
 Etat de la technique
On connait dans l’état de la technique la demande de brevet US2020/009877 décrivant un équipement pour le dépôt de particules sur une cible à partir d'une lame transparente portant un film formé par un fluide contenant des particules en suspension, par excitation locale du film par un faisceau laser orienté par un moyen de déviation optique piloté, l'équipement comportant des moyens d'observation de ladite zone d'activation locale par un système d'imagerie optique comportant un capteur et une source d'éclairage dont les axes optiques sont sensiblement communs dans la partie comprise entre un séparateur optique et le film. Le faisceau optique du système d'imagerie et le faisceau optique du laser sont coaxiaux dans la partie comprise entre ledit moyen de déviation optique piloté et le film.
L'équipement comporte un premier bloc optique de focalisation disposé entre ledit moyen de déviation optique piloté et le film ainsi qu’un deuxième bloc optique de conjugaison d'image placé entre ledit capteur et ledit séparateur. Le capteur est placé dans le plan focal de ce deuxième bloc optique.
Le brevet CN113021874 décrit un procédé d'impression unicellulaire basé sur le transfert induit par un point laser annulaire est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
  • étape 1, après que des faisceaux laser pulsés qui sont uniformément répartis sont incidents sur un élément du système de formation de point lumineux annulaire, la lumière émergente est focalisée pour former un point lumineux annulaire sur une couche sacrificielle à travers une couche de contrainte transparente ;
  • étape 2, la couche sacrificielle génère une ablation sous l'action de la lumière et de la chaleur du laser et forme une bulle de cavitation annulaire plasmatique ;
  • étape 3, expansion rapide des bulles de cavitation annulaires et éloignement de la solution cellulaire à l'extérieur des anneaux, et parallèlement, poussée vers le bas des cellules de transfert cibles au centre des anneaux sous l'expansion des bulles de cavitation ;
  • étape 4, effondrement des bulles de cavitation annulaire et expulsion complète des cellules de transfert cibles par effondrement des ondes de choc générées dans la direction verticale par rapport à la position centrale de l'anneau ;
  • étape 5, sous l'action de la gravité et de l'impulsion propre, imprimer les cellules de transfert cibles et la solution transportée sur une plaque réceptrice.
La demande de brevet US2022152925 décrit un procédé d'impression mettant en œuvre un équipement comprenant un excitateur délivrant de l'énergie orientable pour produire une interaction ponctuelle avec au moins une encre pouvant contenir des non-uniformités et déposée sur un support d'impression présentant une zone d'interaction transparente, afin de provoquer une transfert d'une partie ciblée de ladite encre vers un récepteur, le procédé comprenant la génération d'un film mouillant recouvrant au moins partiellement ladite zone d'interaction transparente, suivi du dépôt de ladite encre sur la surface dudit film mouillant et des étapes de transfert.
La demande de brevet US2020102529 concerne un équipement et un procédé de fabrication additive, comprenant un moyen d'excitation énergétique orientable pour générer une interaction intermittente avec un fluide recouvrant une pale afin de déclencher un jet orienté en direction d'une cible, le fluide étant constitué d'un vecteur liquide contenant des inhomogénéités, dans lequel : le fluide forme un film liquide d'épaisseur inférieure à 500 µm sur une lame présentant au moins une zone permettant l'interaction avec le laser, dans laquelle débouche au moins une entrée, la zone d'interaction débouchant sur au moins une sortie, l'équipement comprenant également des moyens pour la circulation du fluide entre l'entrée et la sortie.
La demande de brevet US2017225390 concerne un procédé de fabrication additive d'un objet tridimensionnel. Le procédé consiste à former séquentiellement une pluralité de couches dont chacune est structurée selon la forme d'une section transversale de l'objet. Dans certains modes de réalisation, la formation d'au moins l'une des couches comprend l'exécution d'un balayage raster pour distribuer au moins une première composition de matériau de construction, et d'un balayage vectoriel pour distribuer au moins une seconde composition de matériau de construction. Le balayage vectoriel s'effectue éventuellement le long d'un trajet sélectionné pour former au moins une structure sélectionnée dans le groupe constitué de (i) une structure allongée, (ii) une structure limite entourant au moins partiellement une zone remplie du premier matériau de construction, et (iii ) une structure de connexion inter-couches.
Inconvénients de l’art antérieur
Les solutions de l’art antérieur sont adaptées pour le transfert de petites particules, de dimensions significativement inférieures à l’épaisseur du film de liquide vecteur lorsqu’elles sont basées sur le LIFT, ou adaptées pour la manipulation / transfert de grosses particules par contact lorsqu’il s’agit de technos non LIFT comme le Kenzan ou l’aspiration Elles présentent toutefois plusieurs inconvénients.
En premier lieu, la focalisation de chaque tir doit être ajustée pour prendre en compte le plan dans lequel est positionnée la particule se trouvant dans le champ de tir, pour apporter l’énergie approprié dans le plan situé juste sous la particule, afin que l’impulsion énergétique assure la cavitation du liquide sous la particule. Cette étape d’ajustement de la focalisation avant chaque tir ralentit fortement la cadence.
En second lieu, le transfert de la particule s’accompagne d’un transfert d’une partie non négligeable de liquide vecteur, ce qui conduit à un matériau de faible densité volumique.
En troisième lieu, les particules sont relativement mobiles dans le film de liquide vecteur, et la précision du tir est perturbée par les déplacements entre le moment de l’analyse de l’image du champ de tir, et le déclenchement du tir.
Solution apportée par l’invention
Afin de remédier à ces inconvénients, la présente invention concerne selon son acception la plus générale un procédé de fabrication d'un matériau présentant les caractéristiques énoncées par la revendication 1.
Un procédé de fabrication par transfert d’au moins un objet, notamment une particule depuis un substrat donneur en direction d’un substrat cible, selon l’invention prévoit notamment un substrat donneur formant une surface sur laquelle est déposée un film de liquide vecteur d’une épaisseur ez selon une direction verticale Z. Un liquide vecteur contient les objets à transférer de dimension (Dx, Dy, Dz). Le transfert est assuré par excitation énergétique locale dudit liquide pour former une bulle de cavitation localisée au niveau d’un objet, caractérisé en ce que le ratio Dz/ez est supérieur à 1, et de préférence supérieur à 0,5.
Selon une variante, lesdits objets sont des sphéroïdes constitués par une agrégation de cellules biologiques élémentaires.
Avantageusement, lesdites valeurs Dx, Dy, Dz sont supérieures à 100 µm et de préférence supérieures à 200 µm.
Selon une seconde variante, ladite excitation énergétique est réalisée par la focalisation d’un laser à l’interface entre la surface dudit substrat et ledit film de liquide vecteur.
Selon une deuxième variante, ladite excitation énergétique est réalisée par application d’un champ électrique.
Selon une troisième variante, le dépôt d’énergie est réalisé par la focalisation d’une onde acoustique à l’interface entre la surface dudit substrat et ledit film de liquide vecteur.
Avantageusement, le niveau d’énergie appliqué à chaque tir est fonction de la taille de l’objet située dans l’axe de tir.
Selon une variante, ledit substrat receveur (40) est déformable élastiquement selon l’axe Z.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé comporte des étapes de déplacement dans le plan XOY d’un objet par application de tir avec une énergie au moins 2 fois inférieure à l’énergie requise pour un transfert de l’objet vers le substrat récepteur.
Avantageusement, les objets à transférer sont espacées d’une distance (d) caractéristique de valeur d > 0.5Dxy.
Selon une variante, les objets sont de nature biologique comprenant des agrégats cellulaires, des sphéroïdes, des organoïdes, des explants, des explants (îlots de Langherans), des particules de polymères encapsulant les cellules (organoïde recouvert d’une couche de biomatériau), des micro-carriers ensemencés de cellules, des billes de biomatériaux.
De préférence, la fraction volumique ou la densité volumique des objets biologiques transférés par propulsion au sein du tissu ou organe imprimé est supérieure à 30 %.
Selon une variante, le transfert est répété pour fabriquer un matériau, tissu ou organe et que la fraction volumique ou la densité volumique des objets biologiques transférés par propulsion dans ledit matériau, tissu ou organe imprimé est supérieure à 30 %.
Selon une autre variante, le procédé est combiné avec d’autres technologies d’impression comme l’extrusion, le jet d’encre, LIFT afin de fabriquer des matériaux ou tissus complexes comportant différents composants.
Selon une autre variante, le procédé est réalisé par l’utilisation de plusieurs faisceaux lasers simultanée lorsque l’objet a une forme non isotrope afin de garantir son transfert selon une trajectoire homogène.
L’invention concerne aussi un équipement de manipulation et de transfert par dépôt d’énergie impulsionnelle comportant :
  • une source d’énergie orientée vers le matériel à transférer,
  • un substrat donneur à partir duquel ledit matériel est manipulé et transféré par des impulsions énergétiques et,
  • un substrat receveur cible qui recueille le matériel transféré
Ledit substrat donneur comprend une lame recouverte par le matériel à transférer, constitué par un film liquide vecteur destiné à contenir des objets transférables de taille DxDyDz, caractérisé en ce que
  • lesdits objets transférables ont une orientation Dx,Dy dans le plan du film et Dz perpendiculaire au film
  • le ratio entre la dimension (Dz) de l’objet et l’épaisseur (e) du film liquide est supérieur à 1 et de préférence supérieur à 0,5.
De préférence, la source d’énergie est constituée par un laser.
Selon une variante, la lame du substrat donneur est transparente ou faiblement absorbante à la longueur d’onde dudit faisceau laser.
Selon un mode de réalisation particulier, il comporte un système opto-mécanique permettant de diriger le spot laser par rapport au centroïde ou centre de masse de l’objet.
Si l’objet a une forme particulière non isotrope, le système peut permettre l’utilisation simultanée de plusieurs faisceaux lasers dirigés en différents points dudit objet afin de le faire décoller de façon homogène.
Selon une première variante, la source d’énergie est constituée par générateur d’un champ électrique.
Selon une deuxième variante, la source d’énergie est constituée par générateur d’une onde acoustique.
Selon une variante, il comporte un système de contrôle et d’asservissement de la valeur d’énergie déposée en fonction de la taille de la particule à transférer.
Avantageusement, il intègre un système de détection des objets intelligent, des moyens d’automatisation des étapes de placement du matériel sur le substrat donneur et des étapes de manipulation / transfert.
Selon une variante, le substrat donneur est recouvert par une couche sacrificielle ayant des propriétés de forte absorption / conduction du dépôt d’énergie par laser ou par champ électrique.
Selon une variante, le substrat receveur n’est pas recouvert par une couche ayant des propriétés de forte absorption, celle-ci étant réalisée directement dans le liquide.
Selon une variante, il comporte un système optique de visualisation / détection pour repérer et cibler les objets à transférer, compatible avec une répartition aléatoire des objets sur le substrat donneur.
De préférence, ledit substrat donneur est disposé en-dessous dudit substrat receveur.
Selon une autre variante, il comporte au moins un autre moyen d’impression comprenant l’extrusion, le jet d’encre, le LIFT afin de fabriquer des matériaux ou tissus complexes comportant différents composants.
Selon une autre variante, il comporte un moyen pour délivrer plusieurs faisceaux lasers simultanément au niveau de l’objet lorsque celui-ci a une forme non isotrope afin de garantir son transfert selon une trajectoire homogène.
Selon une variante, l’équipement comporte un système de contrôle et d’asservissement de la valeur d’énergie déposée en fonction de la taille ou de la forme de l’objet à transférer, cette énergie étant déposée sous la forme d’un seul pulse, de plusieurs pulses répétés dans le temps sur un même point ou encore de plusieurs pulses envoyés simultanément selon un pattern XY lié à la forme de l’objet.
Selon une variante, le substrat receveur n’est pas recouvert par une couche ayant des propriétés de forte absorption laser pour initier le processus de propulsion, l’absorption étant alors réalisée directement la couche liquide se trouvant entre l’objet et le substrat donneur.
Selon une autre variante, le substrat donneur est constitué de micro-puits dans lesquels les objets à transférer sont disposés.
Description détaillée d’un exemple non limitatif de réalisation
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, concernant un exemple non limitatif de réalisation illustré par les dessins annexés où :
La représente une vue schématique du système de transfert
La représente un exemple de chronologie des différents composants du TRI pour la prise d’une image du jet à un instant T
La représente une vue éclatée d’un exemple de substrat donneur
La représente une vue en perspective d’un exemple de connecteur fluidique.
Présentation générale du système de transfert
Le système de transfert comporte plusieurs parties :
  • une partie optique comprenant un laser impulsionnel (10) pour produire l’énergie de cavitation du liquide vecteur et une caméra (20) pour l’observation du substrat donneur (30) et du substrat récepteur (40)
  • Une partie automate, avec un bras robot (50) utilisé pour l’automatisation de la manipulation du receveur (40)
  • un dispositif microfluidique (31) assurant l’alimentation du substrat donneur (30) avec le liquide vecteur et les particules à transférer
et optionnellement, le système peut comporter un extrudeur pour ajouter sur le substrat récepteur (40) un lien, par exemple un biomatériau de type hydrogel entre les couches de particules transférées.
Plus généralement, l’équipement peut combiner plusieurs technologies d’impression 3D, de bio-impression, de photo-polymérisation.
La partie optique du dispositif est constituée de deux parties, une partie comprenant la caméra (20) servant à viser les objets, et une partie comprenant le laser (10) servant à « tirer », c’est-à-dire délivrer des impulsions énergétiques dans un plan du substrat donneur (30) où se trouve une particule à transférer.
Le laser (10) est par exemple un laser Nd-YAG qui émet des impulsions de 1 à 10 ns à 1064 nm avec une énergie de 15 à 60 microjoules, sensiblement supérieure à l’énergie utilisée habituellement pour des procédés LIFT.
Selon un autre exemple, il est constitué par un laser à fibre pulsée Ytterbium émettant à 1030nm, avec impulsions plus courtes, de 350 femtosecondes à 10 picosecondes, avec plusieurs dizaines de microjoules d'énergie par impulsion.
La lentille (16) est typiquement une lentille F-Théta avec une distance focale de 100mm adaptée au balayage laser. La taille typique du spot au plan focal est de l'ordre de 30 à 35µm de diamètre.
Le faisceau laser (14) traverse une optique de mise en forme (13) puis est dirigé via un jeu de miroirs (11, 12) vers un scanner (15) qui enverra ensuite le faisceau à la verticale vers le substrat donneur (30), via la lentille F-Théta (16).
Le scanner (15) est composé de deux miroirs automatisés qui vont rediriger le faisceau à l’horizontale avec un certain angle en direction de l’objectif (16). L’objectif (16) va ensuite redresser le faisceau (14) pour qu’il arrive perpendiculaire au substrat donneur (30) et le focaliser. Les miroirs du scanner (15) permettent de commander le déplacement du faisceau laser (14) selon les axes horizontaux sur le substrat donneur (30). Le faisceau laser (14) est donc focalisé sur le substrat donneur (30) et dirigeable selon les axes X et Y définissant le plan horizontal.
Pour un substrat donneur (30), le faisceau (14) est focalisé sur la couche sacrificielle revêtant la surface du substrat, par exemple une couche d’or de 20 nanomètres déposée sur une fenêtre optique transparente.
La deuxième partie optique comprenant la caméra (20) est la partie servant à viser. En effet, les particules sont, dans le cas de la présente invention, des objets relativement gros, par exemple des sphéroïdes formés par un agrégat de cellules, avec un diamètre de plus de 100µm, typique de 200 µm à 300 µm. Ces objets sont répartis de façon aléatoire sur le substrat donneur (30) ; il est donc nécessaire de connaître la position et la taille des objets pour les viser avec un tir laser. Pour cela une source lumineuse dans le visible, typiquement une LED (21) est placée au-dessus de la cartouche, et le faisceau lumineux (22) passe par le scanner (15) en suivant le chemin inverse du faisceau laser. Il arrive ensuite au niveau d’un miroir semi-réfléchissant (12) qui laisse passer la lumière visible dirigée vers la caméra (20), mais réfléchit l’infrarouge vers le laser (10). Le faisceau passe ensuite par une lentille (23), un iris (24) et un objectif (25) avant d’arriver sur la caméra (20). Le tout est aligné de telle sorte à ce que le focus du faisceau laser (10) se fasse au centre de l’image récupérée par la caméra (20).
Nature des objets transférés
L’installation mise en œuvre par l’invention est similaire à une installation destinée à la bio-impression LIFT, à la différence que l’énergie des impulsions est au moins 2 voire 5 fois supérieure, et que le placement des objets à transférer diffère fondamentalement des solutions utilisées pour la bio-impression LIFT, où les particules à transférer forment une bio-encre où les particules sont de tailles très inférieures à l’épaisseur du film déposé sur le substrat donneur (30).
Dans le cadre de la présente invention, les objets présentent une taille de plus de 100µm, typiquement 200 à 400 µm voir plus, et sont positionnés dans un liquide, typiquement de l’eau additionnée de sels pour ajuster la densité, ou une solution de BSA (Bovine Serum Albumine) à 2%, formant un film d’une épaisseur inférieure à la taille des particules à transférer, de telle sorte que le substrat donneur (30) ne reçoit plus une bio-encre, mais des particules reposent partiellement dans un film aqueux ne les recouvrant pas totalement.
L’invention porte de façon non limitative au transfert de sphéroïdes formés par l’agrégation de cellules cultivées en laboratoire et présentant l’aspect d’une petite perle faite de cellules et de matrice extra-cellulaire.
Afin de produire les sphéroïdes, les cellules souches, progénitrices ou différenciées sont cultivées par des méthodes conventionnelles et ensemencées dans des micro-puits afin de produire des agrégats qui sont ensuite manipulés selon le procédé de la présente invention.
Séquences de tir
Le phénomène de LIFT est un processus qui se déroule sur des temps très courts, de l’ordre de la centaine de microsecondes, et peut être observé par un dispositif de TRI.
Le TRI (acronyme anglais de « Time Resolved Imaging » Imagerie résolue en fonction du temps) consiste à prendre des images d’un phénomène à un temps précis en synchronisant une caméra avec le laser (10) et une LED afin de prendre une photo à un moment précis du jet. Les trois composants sont synchronisés via une carte électronique afin de contrôler précisément l’activation des différents composants dans le temps. Afin d’obtenir une image du jet à un instant précis, la caméra est allumée durant plusieurs centaines de microsecondes, alors que la LED émet uniquement un flash lumineux de 2 µs à l’instant désiré. La LED est positionnée en face de la caméra, de sorte à éclairer le jet.
La présente la chronologie du TRI avec une échelle du temps en microsecondes. Dans un premier temps (100) on allume la caméra de l’analyseur, qui met 60 µs à s’allumer. Le laser (10) met 4 µs à s’allumer (105), et 5 µs de plus pour effectuer le tir laser. Si la caméra est allumée lors du tir laser, le faisceau est visible sur l’image et rend celle-ci moins lisible, il faut donc tirer avant que la caméra de l’analyseur soit allumée.
On commence donc à allumer (101) le laser (10) 50 µs après la caméra de l’analyseur, pour que le tir (102) ait lieu à 59 µs, soit 1 µs avant que la caméra de l’analyseur soit allumée (103). La caméra reste ensuite allumée pendant 500 µs. Enfin la LED va émettre une séquence de flash lumineux (110, 111) de 2 µs à partir du temps voulu (106), T µs après le tir laser, soit 59+T µs après l’allumage de la caméra, pour créer une image stroboscopique avec des intervalles de temps de 2µs entre deux flashs.
Les images ainsi obtenues montrent un comportement des particules très différent de celui observé dans l’état de la technique avec la bio-impression LIFT. La particule de grande taille est propulsée sans emporter une partie du liquide vecteur par la formation d’une bulle de cavité dans le film de liquide à l’interface entre la particule et le fond du substrat, et non pas sur un volume enveloppant de la particule. La particule émergeant du film liquide, elle écarte le liquide l’entourant, pour émerger directement du liquide vecteur et atteindre le substrat récepteur avec un emport très faible de liquide.
Substrat donneur
La représente une vue éclatée d’un substrat donneur (30) recevant le film de liquide technique et l’encre contenant les particules à transférer, étalées sur une cartouche qui sert de support pour les tirs laser. Elle est composée par un assemblage de quatre étages (31, 32, 33, 34) de verre et de PDMS. Le liquide technique a pour but de nettoyer la zone centrale du substrat donneur et à prémouiller la surface afin de faciliter l’étalement de l’encre à transférer contenant les particules.
La lame supérieure (31) de la cartouche est composée de Polydiméthylsiloxane et présente une fenêtre (35) entourant le volume cylindrique recevant le liquide technique et les particules. Elle constitue une couche hydrophobe formant un barrage afin d’éviter les débordements de liquide technique et de l’encre contenant les particules. Elle présente une épaisseur de 10 µm.
Une première lame intermédiaire (32) présente également une fenêtre (36) et sert à la fixation de la lame supérieure (31). Elle est réalisée en verre, d’épaisseur 0.5 mm. Elle sert également à faire barrage aux débordements.
Une deuxième lame intermédiaire (33) étage comporte une fenêtre (37) et deux canaux microfluidiques (38, 39), l’un permettant d’amener le liquide technique et l’autre de l’aspirer. Il est en Polydiméthylsiloxane et avec une épaisseur de 160 µm.
La lame inférieure (34) est en verre et mesure 0.5 mm d’épaisseur. Elle comporte deux trous (48, 49) au niveau de l’arrivée des canaux micro-fluidiques de la lame (33). Ces deux trous (48, 49) servent d’entrée et sortie dans la cartouche. La lame inférieure (34) est revêtue d’une couche d’or de 20 nm dans le périmètre correspondant aux fenêtres (35, 36, 37).
L’assemblage de ces quatre étages (31 à 34) forme le substrat donneur (30).
Connecteur fluidique
Le substrat donneur (30) est accroché sur un connecteur fluidique (50) représenté en , présentant quatre canaux (51 à 54) sur sa partie supérieure. Sur ces quatre entrées / sorties (51 à 54) sont posées des joints ou valves à lèvres afin d’assurer l’étanchéité. Lorsque le substrat donneur (30) est posé sur le connecteur fluidique (50), les trous (51, 53) vont coïncider avec les évidoirs (48, 49) de la cartouche (50) et permettre l’entrée et la sortie du liquide technique. L’entrée de ces deux canaux se fait sur le côté du connecteur fluidique (50), et sont reliés, par des tuyaux blancs à des pompes permettant la circulation du liquide technique. Les deux pompes sont reliées à un réservoir contenant le liquide technique. Les particules à transférer sont ensuite déposées sur le film avec une pipette par exemple portée par un bras robotisé. Les deux autres trous (51, 54) du connecteur fluidique (50) sont reliés à une pompe à vide et servent à plaquer le substrat donneur (30) sur le connecteur fluidique (50) par aspiration.
Le connecteur fluidique (50) est monté sur un ensemble de trois vis micrométriques selon les trois axes. La vis micrométrique verticale sert à déplacer le substrat donneur (30) selon l’axe Z afin de se placer sur le plan focal du laser. Les deux vis horizontales servent à déplacer le substrat donneur (30) selon les axes X et Y, afin de viser différents endroits de la cartouche, alternativement à l’utilisation du scanner.
Les deux pompes fluidiques sont contrôlées par ordinateur via un logiciel. Plusieurs routines sont enregistrées, notamment celle permettant le prémouillage de la cartouche. En effet, la préparation du liquide technique pour l’impression se fait en deux étapes. Dans un premier temps un film de prémouillage est effectué sur le fond du substrat donneur (30). Pour cela un volume de liquide technique est envoyé par le premier canal, alors que la pompe du canal d’aspiration n’est pas enclenchée. Ainsi le liquide technique va s’accumuler sur la surface du substrat donneur (30), et recouvrir toute la surface, puis le canal d’aspiration entre en jeu alors que l’apport de liquide technique est stoppé. Ainsi le film épais va s’affiner mais le liquide technique restera étalé sur l’ensemble de la surface du substrat donneur (30), le fond est bien prémouillé. Une fois ce film prêt, on vient déposer à la pipette un volume précis d’encre contenant des particules à transférer, qui s’étalera sur le substrat donneur (30).
Transfert d’une particule
La particule est éjectée dès la première bulle de cavitation, qui est beaucoup plus grande que dans les solutions LIFT connue, en raison de la puissance supérieure et du faible volume de liquide compris entre la face inférieure de la particule et le fond du substrat donneur. La particule est éjectée seule, hors du liquide avec un phénomène de propulsion balistique. La bulle de cavitation explose et expulse par cette occasion la particule vers le haut à une vitesse importante. Au bout de 150 µs une particule de Polyéthylène se trouve à environ 3 mm de hauteur, soit une vitesse de 20 m/s. Elle atteint le substrat récepteur (40) quasi-sèche et entourée d’éclaboussures résiduelles de liquide.
L’éjection de sphères de collagène de 250 µm est plus lente que pour les billes de Polyéthylène. La particule atteint 3mm de hauteur en 800 µs, contre 100 µs pour le polyéthylène. Le transfert de sphéroïdes de cellules a un comportement similaire à celui décrit pour le collagène car leur forme et leur densité sont très proches. Par exemple, le transfert d’un sphéroïde d’IPSC (cellules souches) atteint également 3 mm de hauteur en 700 à 800 µs.
La base du jet met 100 µs à se former avec une sphère de collagène ou faite d’IPSC. De plus, on peut voir qu’il y a un seul et unique jet. En effet la couronne caractéristique du second jet n’est pas présente. Entre 200 µs et 600 µs, le jet est formé du sphéroïde d’IPSC au sommet du jet, et que le liquide vecteur forme le reste du jet, toujours attaché à la base. Cependant après 700 µs, le sphéroïde d’IPSC se détache du jet, et le liquide retombe. Le sphéroïde continue alors son vol sans ou avec peu de liquide, comme pour le polyéthylène. La brisure du jet se fait à un temps similaire que pour le jet de bio-encre, c’est à dire autour de 700 µs.
A la différence des solutions LIFT connues, toute l’énergie de cavitation propulse la particule, sans perte pour lui faire traverser et quitter la couche de liquide qui se trouve autour d’elle et qui peut représenter une masse supérieure à celle de la particule elle-même. La particule ne subit par ailleurs, avec le procédé selon l’invention, que peu de frottements fluides lors de son éjection du liquide vecteur du fait de la viscosité de ce dernier.
Transfert sur le substrat récepteur
Le transfert se fait du substrat donneur (30), la cartouche contenant les particules à transfert, vers un substrat receveur (40) constitué par une plaque de culture cellulaire ou une lame de verre.
La distance entre le substrat donneur (30) et le substrat donneur (30) est critique. Elle doit être supérieure à la durée nécessaire à la séparation du filament de liquide reliant la particule lors de parcours initial. En effet, les particules peuvent du fait de leur porosité et/ou de leur caractère hydrophile, entraîner du liquide qui forme une sorte de lien (pont capillaire) tant que la particule reste proche de la surface du film de liquide, et qui se rompt à partir d’une certaine distance dépendant des caractéristiques du liquide d’une part et de la particule d’autre part. Typiquement, cette distance est de quelques millimètres, généralement entre 3 et 5 mm. La distance doit par ailleurs être limitée pour que l’énergie cinétique soit suffisante pour garantir que la plupart des particules atteignent le substrat récepteur. Une distance comprise entre 3 et 10 mm est habituellement appropriée, mais l’homme du métier saura déterminer la distance optimale en observant, par exemple avec le procédé TRI susvisé, la formation et la rupture du filament de liquide se formant lors de la trajectoire des particules. Cette distance pourra aussi être choisie pour minimiser la vitesse d’impact de l’objet sur le receveur.
Pour amortir l’impact des particules sur la surface du substrat récepteur (40), une solution consiste à déposer sur sa surface réceptrice un revêtement élastique, par exemple un film de collagène à 4 mg/ml. Le collagène, comme tout autre hydrogel, est plus élastique que le verre et va se déformer lors de l’impact d’une particule, ce qui rend le choc moins violent pour la particule transférée qui conserve sa forme originelle.
Déplacement d’une particule
La précision du tir laser constitue un paramètre important. Lorsque le centre du tir est décalé dans le plan XOY horizontal de plus de 50 µm par rapport au centroïde (ou centre de masse) de la particule, le pourcentage de particules transférées décroît rapidement, et la précision de la localisation décroît et au-delà de 80 µm de décalage du tir par rapport au centre de la particule, pour des particules de 200 µm de diamètre moyen, le transfert échoue.
Le positionnement du faisceau laser peut-être assuré par le scanner (15) ou par le positionnement du substrat donneur (30) par exemple par une action sur les vis micrométriques assurant le positionnement du connecteur fluidique (50) ou encore par des tirs laser de faibles puissances, par exemple d’une puissance inférieure à la moitié de la puissance requise pour le transfert, à proximité d’une particule à déplacer dans le plan XOY horizontal.
Avantages et inconvénients d’une couche sacrificielle
La couche sacrificielle permet d’assurer une absorption constante et reproductible sur l’ensemble de la surface du substrat donneur. Elle permet en outre de vérifier le bon fonctionnement du laser grâce aux spots ablatés visibles sur la couche sacrificielle.
Pour autant, le recours à une couche sacrificielle est coûteux et prend du temps mais surtout implique de devoir changer le substrat donneur dès que le taux d’ablation devient trop important. Or pour la fabrication de tissus en grand nombre et / ou en grande taille le nombre de substrat donneur nécessaire peut très vite devenir très important, allongeant de fait le temps et le coût de production desdits tissus.
L’intérêt d’utiliser une approche sans couche sacrificielle est donc très important pour des applications de production à grande échelle, en particulier pour les domaines cliniques et industriels. L’impression d’objets de grande taille comme les sphéroïdes par un système travaillant sans couche sacrificielle est donc particulièrement intéressant pour réduire le temps et le coût de fabrication.
Les solutions de types laser à impulsions ultra-courtes (régime femtoseconde / picoseconde) ou laser travaillant dans le domaine de longueur d’onde du Mid-IR (2.6 à 3.2 µm) sont tout à fait utilisables dans ce contexte.

Claims (23)

  1. - Procédé de transfert d’au moins un objet depuis un substrat donneur (30) en direction d’un substrat cible (40), ledit substrat donneur (30) formant une surface sur laquelle est déposée un film de liquide vecteur d’une épaisseur ez selon une direction verticale Z, ledit liquide vecteur contenant les objets à transférer de dimension (Dx, Dy, Dz), ledit transfert étant assuré par excitation énergétique locale dudit liquide pour former une bulle de cavitation localisée au niveau d’un objet, caractérisé en ce que le ratio Dz/ez est supérieur à 0,5.
  2. - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdits objets sont des sphéroïdes constitués par l’agrégation de cellules biologiques élémentaires.
  3. - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdites valeurs Dx, Dy, Dz sont supérieures à 100 µm et de préférence supérieures à 200 µm.
  4. - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite excitation énergétique est réalisée par la focalisation d’un laser (10) à l’interface entre la surface dudit substrat et ledit film de liquide vecteur.
  5. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le niveau d’énergie appliqué à chaque tir est fonction de la taille de l’objet situé dans l’axe de tir.
  6. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit substrat receveur (40) est déformable élastiquement selon l’axe Z.
  7. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comporte des étapes de déplacement dans le plan XOY d’un objet par application de tir avec une énergie au moins 2 fois inférieure à l’énergie requise pour un transfert de l’objet vers le substrat récepteur.
  8. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les objets à transférer sont espacés d’une distance (d) caractéristique de valeur d > 0.5Dxy.
  9. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les objets sont de nature biologique comprenant des agrégats cellulaires, des sphéroïdes, des organoïdes, des explants, des explants (îlots de Langherans), des particules de polymères encapsulant les cellules (organoïde recouvert d’une couche de biomatériau), des micro-carriers ensemencés de cellules, des billes de biomatériaux.
  10. - Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que le transfert est répété pour fabriquer un matériau, tissu ou organe et que la fraction volumique ou la densité volumique des objets biologiques transférés par propulsion dans ledit matériau, tissu ou organe imprimé est supérieure à 30 %.
  11. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le transfert est réalisé par l’utilisation de plusieurs faisceaux lasers simultanée lorsque l’objet a une forme non isotrope afin de garantir son transfert selon une trajectoire homogène.
  12. - Équipement de manipulation et de transfert par dépôt d’énergie impulsionnelle comportant :
    une source d’énergie (10) orientée vers le matériel à transférer,
    un substrat donneur (30) à partir duquel ledit matériel est manipulé et transféré par des impulsions énergétiques et,
    un substrat receveur cible (40) qui recueille le matériel transféré
    Ledit substrat donneur (30) comprend une lame (34) recouverte par le matériel à transférer, constitué par un film liquide vecteur destiné à contenir des objets transférables de taille DxDyDz, caractérisé en ce que ladite lame (34) dudit substrat donneur (30) est recouverte un film liquide vecteur dont l’épaisseur est (e) est inférieur à 2xDz, où Dz est la dimension des objets transférables selon la direction perpendiculaire audit film, Dx,Dy étant l’orientation desdits objets transférables dans le plan dudit film.
  13. - Équipement selon la revendication 12 caractérisé en ce que la source d’énergie (10) est constituée par un laser.
  14. - Équipement selon la revendication 12 caractérisé en ce que la lame (34) du substrat donneur (30) est transparente ou faiblement absorbante à la longueur d’onde dudit faisceau laser (10).
  15. - Équipement selon la revendication 12 caractérisé en ce qu’il comporte un système opto-mécanique (15) permettant de diriger le spot laser par rapport au centroïde ou centre de masse de l’objet.
  16. - Équipement selon la revendication 12, caractérisé en ce qu’il intègre un système de détection des objets intelligent, des moyens d’automatisation des étapes de placement du matériel sur le substrat donneur et des étapes de manipulation / transfert.
  17. - Équipement selon la revendication 12, caractérisé en ce que le substrat donneur (30) est recouvert par une couche sacrificielle ayant des propriétés de forte absorption / conduction du dépôt d’énergie par laser ou par champ électrique.
  18. - Équipement selon la revendication 12, caractérisé en ce que le substrat receveur (40) n’est pas recouvert par une couche ayant des propriétés de forte absorption laser pour initier le processus de propulsion, l’absorption étant alors réalisée directement la couche liquide se trouvant entre l’objet et le substrat donneur.
  19. - Équipement selon la revendication 12, caractérisé en ce qu’il comporte un système optique de visualisation / détection pour repérer et cibler les objets à transférer, compatible avec une répartition aléatoire des objets sur le substrat donneur.
  20. - Équipement selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit substrat donneur (30) est disposé en-dessous dudit substrat receveur (40).
  21. - Équipement selon la revendication 12, caractérisé en ce qu’il comporte au moins un autre moyen d’impression comprenant l’extrusion, le jet d’encre, le LIFT afin de fabriquer des matériaux ou tissus complexes comportant différents composants.
  22. - Équipement selon la revendication 12, caractérisé en ce qu’il comporte un moyen pour délivrer plusieurs faisceaux lasers simultanément au niveau de l’objet lorsque celui-ci a une forme non isotrope afin de garantir son transfert selon une trajectoire homogène.
  23. - Équipement selon la revendication 12, caractérisé en ce que le substrat donneur est constitué de micro-puits dans lesquels les objets à transférer sont disposés.
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