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WO2024075732A1 - タイムラプス撮影機能付き培養装置および培養方法 - Google Patents

タイムラプス撮影機能付き培養装置および培養方法 Download PDF

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WO2024075732A1
WO2024075732A1 PCT/JP2023/036069 JP2023036069W WO2024075732A1 WO 2024075732 A1 WO2024075732 A1 WO 2024075732A1 JP 2023036069 W JP2023036069 W JP 2023036069W WO 2024075732 A1 WO2024075732 A1 WO 2024075732A1
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culture
well
cells
time
images
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広夢 井上
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Astec Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G06T7/00—Image analysis
    • G—PHYSICS
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    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
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    • G06T2207/10—Image acquisition modality
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    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • the present invention relates to a culture device and culture method with a time-lapse photography function that cultures cells such as embryos and performs time-lapse photography.
  • Culture devices with a time-lapse photography function are known that culture cells such as embryos while also taking time-lapse photographs (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
  • a culture device with a time-lapse photography function multiple fertilized eggs (embryos) collected and processed from a single patient are placed in multiple separate wells in a single culture vessel to begin culturing, and time-lapse photography is performed at regular intervals until the embryos become transplantable (3 to 7 days), and the captured image data is saved on a recording medium.
  • the time-lapse images of the development of multiple embryos are morphologically evaluated to determine whether the embryos are good or bad, and procedures such as transplantation, cryopreservation, or removal are carried out.
  • the evaluation of embryo images is generally carried out using image display software that assists in embryo evaluation, and the images of the embryos over time are displayed in a chronological order on the image display software, allowing the user to check and make a judgment.
  • some embryos may be terminated for cryopreservation or transplantation, or may be temporarily removed from the device for observation under a microscope or for changing the medium.
  • time-lapse photography a well in the culture vessel containing an embryo is designated in advance at the dish-in time when culturing begins, and periodic photography is performed on this designated well. Therefore, even when an embryo is removed, images of wells without an embryo are taken and recorded on the recording medium. This increases the amount of recording medium used, and there is a possibility that a recording medium shortage may occur.
  • the present invention aims to provide a culture device and culture method with a time-lapse photography function that can automatically record only the wells in a culture vessel in which cells exist.
  • the culture device with time lapse photography function of the present invention is a culture device with time lapse photography function that places cells in each well of a culture vessel having at least one well, cultures the cells, and performs time lapse photography.
  • the culture device includes a photography means that takes pictures of each well of the culture vessel at a predetermined time lapse photography cycle, a detection means that detects the presence or absence of cells in each well of the culture vessel, and an image recording means that records images of wells that are detected by the detection means as having cells among the images taken for each well by the photography means.
  • the culture device with time-lapse photography function of the present invention takes pictures of each well of the culture vessel at a predetermined time-lapse period, detects the presence or absence of cells, and records only the images of the wells that are detected as having cells in the image recording means.
  • the detection means preferably detects the presence or absence of cells by analyzing the image captured by the imaging means for each well. In this way, when the presence of cells is detected as a result of analyzing the image captured for each well, only the image of the well in which the presence of cells has been detected is recorded in the image recording means.
  • the detection means preferably detects the presence or absence of cells at each time lapse photography cycle. This allows the presence or absence of cells to be detected each time photography is performed at a predetermined time lapse cycle, and only images of wells where cells are detected to be present are recorded in the image recording means.
  • the culture device with time-lapse photography function of the present invention preferably has a notification means for notifying when the detection result by the detection means differs from the previous detection result.
  • the notification means notifies the user, allowing the user to check the detection result.
  • the culture device with time lapse photography function of the present invention preferably has a history recording means for recording the history of the presence or absence of cells in all wells of the culture vessel for each time lapse photography cycle.
  • a history recording means for recording the history of the presence or absence of cells in all wells of the culture vessel for each time lapse photography cycle.
  • the culture method of the present invention is a culture method in which cells are placed in each well of a culture vessel having at least one well, cultured, and time-lapse photography is performed, and is characterized by including the steps of photographing each well of the culture vessel at a predetermined time-lapse photography cycle, detecting the presence or absence of cells in each well of the culture vessel, and recording images of wells that are detected as having cells among the images photographed for each well.
  • images are taken of each well in the culture vessel at a predetermined time lapse period, the presence or absence of cells is detected, and only images of wells where cells are detected to be present are recorded.
  • the present invention it is possible to automatically record only images of wells in which cells are present for each well of a culture vessel, eliminating the need to pre-register wells that contain cells and need to be photographed when the dish is inserted, thus reducing the amount of work required. It also makes it possible to reduce the amount of recording media used to record images. Furthermore, because images of unnecessary wells that do not contain cells are not recorded, there is more freedom in setting the photographing cycle and schedule, enabling cultivation through more accurate image observation. Furthermore, when the recorded images are displayed, there are no images of unnecessary wells that do not contain cells, making it possible to perform efficient evaluations.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a culture device with a time lapse photography function according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an enlarged view of the culture vessel of FIG. 1.
  • FIG. 2 is a functional block diagram of the culture device with a time lapse photography function of FIG. 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a procedure for detecting the presence or absence of cells.
  • FIG. 13 is a flow diagram showing a time lapse photography process using the culture device.
  • 1A and 1B are diagrams showing examples of live image display of all wells, in which (A) shows a conventional display example, and (B) shows a display example of the present invention.
  • FIG. 1A and 1B are diagrams showing examples of a timeline display of multiple wells, in which (A) shows a conventional display example, and (B) shows a display example of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing a comparative example in which a moving image is displayed by frame-by-frame advancement of a plurality of time-lapse images.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of an abnormality notification display.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a culture device with a time-lapse photography function according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is an enlarged view of the culture vessel in FIG. 1
  • FIG. 3 is a functional block diagram of the culture device with a time-lapse photography function in FIG. 1.
  • a culture device with a time lapse photography function (hereinafter sometimes simply referred to as a "culture device") 1 in an embodiment of the present invention is a culture device that arranges cells in each well 11 of a culture vessel 10 having at least one well 11 (see Figure 2) in a chamber section 2, cultures the cells in each well 11, and performs time lapse photography using a photography section 3.
  • Time lapse photography is a photography method in which multiple still images are taken at regular time intervals (time lapse period) and these multiple still images are stitched together to create a video.
  • the culture device 1 also has a culture control unit 4 that controls the chamber unit 2, an imaging control unit 5 that controls the imaging unit 3, a recording unit 6 that stores images captured by the imaging unit 3, an input/display unit 7 that inputs instructions for the operation of the device and displays images, and an overall control unit 8 that controls the entire device.
  • a culture control unit 4 that controls the chamber unit 2
  • an imaging control unit 5 that controls the imaging unit 3
  • a recording unit 6 that stores images captured by the imaging unit 3
  • an input/display unit 7 that inputs instructions for the operation of the device and displays images
  • an overall control unit 8 that controls the entire device.
  • the chamber section 2 maintains the environment, such as the temperature and CO2 / O2 gas concentration, required for cell culture.
  • One or more culture vessels 10 can be stored in the chamber section 2.
  • a heater, a CO2 gas flow path, and an O2 gas flow path (not shown) are connected to the chamber section 2.
  • the culture control unit 4 controls the heater and the CO2 / O2 gas flow rate so that the temperature and the CO2 / O2 gas concentration are constant.
  • the chamber section 2 may be configured with a plurality of chambers divided into one or more culture vessels.
  • the photographing unit 3 is composed of a camera 30, an illumination 31, an objective lens 32, a movable part 33, etc.
  • the illumination 31 shines light on the cells in the culture vessel 10
  • the transmitted light and diffracted light are received by the objective lens 32
  • the image enlarged by the objective lens 32 is input to the camera 30.
  • the movable part 33 moves the camera 30 and the illumination 31 together in the arrangement direction of the wells of the culture vessel 10 (X and Y directions in FIG. 2).
  • the movable part 33 also moves the objective lens 32 in the Z-axis (optical axis) direction to photograph the cells in the multiple culture vessels 10. Note that a configuration in which multiple cameras 30 and illuminations 31 are arranged for each culture vessel 10 and chamber part 2 can also be used.
  • the camera 30 and illumination 31 can be fixed, and the chamber part 2 can be integrated with a separately provided movable part (not shown), and the culture vessel 10 can be moved in the X, Y, and Z directions. Furthermore, the camera 30 and the lighting 31 can be fixed, while both the chamber section 2 and the culture vessel 10 can be made movable.
  • the imaging control unit 5 controls the optical settings of the imaging unit 3 when capturing images, position control, time lapse imaging conditions, and image storage.
  • the imaging control unit 5 has an imaging means 40 that captures images for each well 11 of the culture vessel 10 at a predetermined time lapse imaging period, a detection means 41 that detects the presence or absence of cells in each well 11 of the culture vessel 10, and an image recording means 42 that records images of wells 11 that are detected as having cells by the detection means 41 from among the images captured for each well 11 by the imaging means 40.
  • the imaging means 40 images each well 11 of the culture vessel 10 using the imaging unit 3 at a predetermined time lapse period that has been set in advance.
  • the time lapse period can be set arbitrarily between several minutes and several hours.
  • the imaging unit 3 is a microscope camera that is composed of, for example, an objective lens with a magnification of about 10x, a CCD or CMOS image sensor, etc.
  • the detection means 41 detects the presence or absence of cells by analyzing the images captured by the imaging means 40 for each well. Detection of the presence or absence of cells is performed on a well-by-well basis.
  • Figure 4 shows an example of a procedure for detecting the presence or absence of cells.
  • the detection means 41 detects wells from the images of the wells captured by the imaging means 40, produces an image of only embryos as cells, and detects the presence or absence of an embryo from this image of only the embryo. Detection of the presence or absence of an embryo from an image of only the embryo can be performed by methods using image processing, artificial intelligence (machine learning, deep learning, etc.).
  • Embryo images have the following characteristics, and the presence or absence of an embryo can be detected by focusing on one of these characteristics or a combination of multiple characteristics from the object.
  • - It is circular.
  • - Its size is between 100 and 200 ⁇ m.
  • - There is a ring-shaped transparent body at the edge (almost uniform brightness area in the image).
  • a method may be used in which detection is performed using deep learning or other methods that use various image characteristics, such as the brightness and darkness characteristics of the entire image, extraction of feature points, or model comparison.
  • the image recording means 42 records in the recording unit 6 only the images of wells that are detected as having cells by the detection means 41, among the images captured for each well by the imaging means 40.
  • the recording unit 6 is, for example, a recording medium such as a magnetic disk such as a hard disk drive (HDD) or a floppy disk (FD), an optical disk such as a compact disk (CD) or a DVD, a magneto-optical disk such as an MO, a solid state drive (SSD), a flash memory such as a memory card or a USB memory, or a magnetic tape. It is also possible to use a recording medium such as a network attached storage (NAS) or cloud storage as the recording unit 6.
  • NAS network attached storage
  • the timing for detecting the presence or absence of cells by the detection means 41 can be when time lapse photography starts, during time lapse photography, or both, but it is preferable to detect the presence or absence of cells for each time lapse cycle. This allows the presence or absence of cells to be detected each time photography is performed at a predetermined time lapse cycle, and only images of wells that are detected as having cells are recorded in the image recording means 42, so that only images of a minimum number of wells are recorded in the image recording means 42.
  • the input/display unit 7 is composed of a display device with a touch panel, etc.
  • the input/display unit 7 provides input instructions from the user to the culture control unit 4 and the photography control unit 5, and also displays images captured by the camera 30 and images read from the recording unit 6.
  • the overall control unit 8 controls the various blocks within the device and the entire device.
  • the overall control unit 8 also has an interface with the outside of the device.
  • the overall control unit 8 may also be equipped with software for observing and evaluating embryos. This allows the overall control unit 8 to assist the user in their culture evaluation work by clearly arranging images on the input/display unit 7 and analyzing and displaying them.
  • Figure 5 is a flow diagram showing the time-lapse photography process using the culture device 1.
  • step (S106) If an embryo is present in the well 11, the imaging means 40 moves back and forth from the Z-axis focal position to capture multiple slice images of the well 11. However, if slice images are not required, it is sufficient to only capture images at the center of the focal point.
  • the image recording means 42 stores the image of the well 11 in the recording unit 6.
  • step (S108) It is determined whether or not photography has been completed for all wells 11. If photography has not been completed, the process proceeds to step (S103) to photograph the next well 11.
  • step (S109) When photography of all wells 11 is completed, the process ends.
  • step (S110) In time lapse photography from the second cycle onwards of the time lapse period, processing is carried out from step (S102).
  • the wells 11 are detected first, and then the cells are detected.
  • the regularity of the well arrangement is used to directly search for cells and detect the presence or absence of cells.
  • step (S101) involves detecting the X, Y, and Z coordinates of all wells 11, it is also possible to take multiple divided images of multiple wells 11 across the entire culture vessel 10 and tile these images, or to use a high-resolution camera to take a wide-area image of all wells 11 in a single image, and then divide the image to extract the individual well images to detect the presence or absence of cells.
  • the culture device 1 in this embodiment can be configured such that the imaging control unit 5 has a history recording means 43 that records the history of the presence or absence of cells in all wells 11 of the culture container 10 for each time lapse imaging period, and a notification means 44 that notifies when the detection result by the detection means 41 differs from the previous detection result.
  • the imaging control unit 5 has a history recording means 43 that records the history of the presence or absence of cells in all wells 11 of the culture container 10 for each time lapse imaging period, and a notification means 44 that notifies when the detection result by the detection means 41 differs from the previous detection result.
  • the history recording means 43 records the history of the presence or absence of cells in all wells 11 of the culture vessel 10 in the recording unit 6 for each time lapse photography cycle based on the detection results by the detection means 41. As a result, the history of the presence or absence of cells in all wells 11 of the culture vessel 10 is recorded by the history recording means 43 for each time lapse photography cycle, and it becomes possible to utilize the history of the presence or absence of cells in all wells 11 of the culture vessel 10 for each time lapse photography cycle for image arrangement in a timeline display and history management.
  • FIG. 6 shows an example of live image display of all wells
  • (A) shows a conventional display example
  • (B) shows a display example of the present invention.
  • FIG. 6(A) conventionally, images of all wells 11 of the culture vessel 10 are recorded, and images of all wells 11 are displayed regardless of the presence or absence of an embryo in each well 11.
  • the present invention only images of wells 11 with embryos among all wells 11 of the culture vessel 10 are recorded in the recording unit 6, and the history of the presence or absence of embryos in all wells 11 is also recorded by the history recording means 43. Based on this history of the presence or absence of embryos, it is possible to display only images of wells 11 with embryos and not display wells 11 without embryos, as shown in FIG.
  • FIG. 7 shows an example of a timeline display of multiple wells, (A) showing a conventional display example, and (B) showing a display example of the present invention.
  • multiple wells are arranged horizontally, and images of the wells for each time lapse period are arranged vertically.
  • embryos may be removed from wells 11 during the culture process for cryopreservation or transplantation.
  • the culture vessel (dish) 10 may be taken out for external microscopic observation or culture medium change.
  • FIG. 7(A) wells 11 from which embryos were removed are all displayed.
  • FIG. 8 is a diagram showing a comparative example in which a video is displayed by frame-by-frame advancement of multiple time-lapse images.
  • time-lapse image data of a specific embryo was read from a storage device and displayed continuously, resulting in the presence of images 81 of wells without cells.
  • images 81 of wells without cells As a result, when the video is displayed, an image without an embryo appears for a moment, resulting in a discontinuous and difficult-to-view video display.
  • this image 81 of only wells without an embryo is eliminated, resulting in a video that is easy to view and free of discontinuities.
  • the growth state of cells can be visualized continuously by continuously displaying time-lapse images, and the process of change and growth can be easily understood.
  • the notification means 44 notifies the user when the detection result by the detection means 41 is different from the previous detection result.
  • the notification means 44 may, for example, sound a notification buzzer, turn on a notification lamp, or display an abnormality notification on the display.
  • FIG. 9 shows an example of an abnormality notification display.
  • the notification means 44 may, for example, display an abnormality notification dialog on the display as shown in FIG. 9 to alert the user of the culture device 1 and ask the user to confirm whether or not imaging is required.
  • the imaging operation of the corresponding well 11 is put into a standby state, and if the operator has confirmed the presence or absence of an embryo through cryopreservation or transplantation, the operator may select "OK", or if there is a possibility of an error in the judgment, the operator may select "CANCEL" and instruct the user to take another image.
  • the detection result of the presence or absence of cells may be notified to the user, and the user may be notified of the need to confirm the need to take an image or of an abnormality in the dish installation.
  • the culture device 1 of this embodiment it is possible to automatically record only images of wells 11 in which cells are present for each well 11 of the culture container 10, thereby reducing the amount of usage of the recording unit 6 that records images.
  • images of unnecessary wells 11 in which no cells are present are not recorded, there is more freedom in setting the shooting cycle and schedule, making it possible to culture with more accurate image observation.
  • efficient evaluation can be performed.
  • the present invention is useful as a culture device and culture method with a time-lapse photography function that cultures cells such as embryos and performs time-lapse photography.

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Abstract

培養容器内の細胞が存在するウェルのみを自動的に記録することが可能なタイムラプス撮影機能付き培養装置および培養方法の提供。　少なくとも１個以上のウェルを有する培養容器のウェル毎に細胞を配して培養するとともにタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影機能付き培養装置であって、培養容器のウェル毎に所定のタイムラプス撮影周期で撮影する撮影手段４０と、培養容器のウェル毎に細胞の有無を検出する検出手段４１と、撮影手段４０によりウェル毎に撮影した画像のうち検出手段４１により細胞有りと検出されたウェルの画像を記録する画像記録手段４２とを含む。

Description

タイムラプス撮影機能付き培養装置および培養方法
　本発明は、胚などの細胞を培養するとともにタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影機能付き培養装置および培養方法に関する。
　胚などの細胞を培養するとともにタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影機能付き培養装置が知られている（例えば、特許文献１～３参照。）。例えば、タイムラプス撮影機能付き培養装置では、一人の患者から採取処理した複数の受精卵（胚）を一つの培養容器内で区分された複数のウェルに配して培養を開始し、移植可能な胚（３～７日）になるまで一定周期でタイムラプス撮影を行い、撮影した画像データを記録媒体に保存する。
　そして、このタイムラプス撮影した複数の胚の成長過程の画像を形態学的に評価して、胚の良否を判定し、胚の移植、凍結保存や排除などを行う。胚画像の評価は、一般的には、胚の評価をアシストする画像表示用ソフトを用いて行われ、画像表示用ソフトで時系列に一覧表示して胚の経過画像を確認し、判定を行っている。
特表２００９－５３９３８７号公報 特表２０１７－５２９８４４号公報 特開２０１６－１２３３６６号公報
　ところで、培養の早期段階で一部の胚を凍結保存や移植などを行うために培養を終了したり、装置から一時的に取り出して顕微鏡観察や培地交換などを行ったりする場合がある。タイムラプス撮影では、培養を開始するディッシュイン時に予め培養容器内で胚を入れたウェルを指定し、この指定したウェルに対して周期撮影を行うため、胚を取り出した場合にも、胚のないウェルの画像が撮影され、記録媒体に記録される。そのため、記録媒体の使用量が増え、記録媒体不足を起こしてしまう可能性がある。
　また、画像表示用ソフトで時系列表示したり、コマ送りで動画表示したりしたときに、胚のない不要な画像も表示されることになるため、見にくい表示となり、評価作業の効率が下がるという問題がある。
　そこで、本発明においては、培養容器内の細胞が存在するウェルのみを自動的に記録することが可能なタイムラプス撮影機能付き培養装置および培養方法を提供することを目的とする。
　本発明のタイムラプス撮影機能付き培養装置は、少なくとも１個以上のウェルを有する培養容器のウェル毎に細胞を配して培養するとともにタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影機能付き培養装置であって、培養容器のウェル毎に所定のタイムラプス撮影周期で撮影する撮影手段と、培養容器のウェル毎に細胞の有無を検出する検出手段と、撮影手段によりウェル毎に撮影した画像のうち検出手段により細胞有りと検出されたウェルの画像を記録する画像記録手段とを含むものである。
　本発明のタイムラプス撮影機能付き培養装置によれば、培養容器のウェル毎に所定のタイムラプス周期で撮影され、細胞の有無が検出されて、細胞有りと検出されたウェルの画像のみが画像記録手段に記録される。
　検出手段は、撮影手段によりウェル毎に撮影した画像を解析することにより細胞の有無を検出するものであることが望ましい。これにより、ウェル毎に撮影した画像を解析した結果、細胞有りと検出された場合に、その細胞有りと検出されたウェルの画像のみが画像記録手段に記録される。
　検出手段は、タイムラプス撮影周期毎に細胞の有無を検出するものであることが望ましい。これにより、所定のタイムラプス周期で撮影される度に細胞の有無が検出されて、細胞有りと検出されたウェルの画像のみが画像記録手段に記録される。
　本発明のタイムラプス撮影機能付き培養装置は、検出手段による検出結果が前回の検出結果と異なる場合に通知する通知手段を有するものであることが望ましい。これにより、検出手段による検出結果が前回の検出結果と異なる場合に通知手段による通知がなされるので、ユーザは検出結果を確認することが可能となる。
　本発明のタイムラプス撮影機能付き培養装置は、タイムラプス撮影周期毎に培養容器の全ウェルの細胞の有無経歴を記録する経歴記録手段を有するものであることが望ましい。これにより、タイムラプス撮影周期毎に培養容器の全ウェルの細胞の有無経歴が経歴記録手段によって記録されるので、このタイムラプス撮影周期毎の培養容器の全ウェルの細胞の有無経歴に基づいてタイムライン表示での画像配列や履歴管理に活用することが可能となる。
　本発明の培養方法は、少なくとも１個以上のウェルを有する培養容器のウェル毎に細胞を配して培養するとともにタイムラプス撮影を行う培養方法であって、培養容器のウェル毎に所定のタイムラプス撮影周期で撮影すること、培養容器のウェル毎に細胞の有無を検出すること、ウェル毎に撮影した画像のうち細胞有りと検出されたウェルの画像を記録することを含むことを特徴とする。
　本発明の培養方法によれば、培養容器のウェル毎に所定のタイムラプス周期で撮影され、細胞の有無が検出されて、細胞有りと検出されたウェルの画像のみが記録される。
　本発明によれば、培養容器のウェル毎に細胞が存在するウェルの画像のみを自動的に記録することが可能となり、ディッシュイン時に細胞があり撮影の必要なウェルを予め登録する手間が不要となり、作業の削減が図れる。また、画像を記録する記録媒体の使用量を削減することが可能となる。さらに、細胞が存在しない不要なウェルの画像が記録されないので、撮影の周期やスケジュール設定の自由度が増し、より高精度な画像観察による培養が可能となる。さらに、記録された画像を表示する際に、細胞が存在しない不要なウェルの画像がないため、効率の良い評価を行うことが可能となる。
本発明の実施の形態におけるタイムラプス撮影機能付き培養装置の概略構成図である。 図１の培養容器の拡大図である。 図１のタイムラプス撮影機能付き培養装置の機能ブロック図である。 細胞の有無の検出手順の一例を示す図である。 培養装置によるタイムラプス撮影処理を示すフロー図である。 全ウェルのライブ画像表示例を示す図であって、（Ａ）は従来の表示例を示す図、（Ｂ）は本発明の表示例を示す図である。 複数ウェルのタイムライン表示例を示す図であって、（Ａ）は従来の表示例を示す図、（Ｂ）は本発明の表示例を示す図である。 複数のタイムラプス撮影のコマ送りにより動画表示を行う比較例を示す図である。 異常通知表示の例を示す図である。
　図１は本発明の実施の形態におけるタイムラプス撮影機能付き培養装置の概略構成図、図２は図１の培養容器の拡大図、図３は図１のタイムラプス撮影機能付き培養装置の機能ブロック図である。
　図１に示すように、本発明の実施の形態におけるタイムラプス撮影機能付き培養装置（以下、単に「培養装置」と称することもある。）１は、チャンバ部２内において、少なくとも１個以上のウェル１１（図２参照。）を有する培養容器１０のウェル１１毎に細胞を配して培養するとともに、撮影部３によりタイムラプス撮影を行う培養装置である。タイムラプス撮影とは、一定の時間間隔（タイムラプス周期）で複数枚の静止画を撮影したり、これらの撮影した複数枚の静止画を繋ぎ合わせて動画としたりする撮影方法である。
　また、培養装置１は、チャンバ部２の制御を行う培養制御部４、撮影部３の制御等を行う撮影制御部５、撮影部３により撮影した画像等を記憶する記録部６、装置の動作を入力指示したりや画像表示などを行う入力／表示部７や、装置全体の制御を行う全体制御部８等を有する。
　チャンバ部２は、細胞培養を行うために培養に必要な温度やＣＯ2／Ｏ2ガス濃度などの環境を維持するものである。チャンバ部２内には、１個または複数の培養容器１０を収納可能となっている。チャンバ部２には、図示しないヒーター、ＣＯ2ガス流路やＯ2ガス流路が接続されている。培養制御部４は、温度やＣＯ2／Ｏ2ガス濃度が一定となるようにヒーターやＣＯ2／Ｏ2ガス流量を制御する。なお、図１においては、チャンバ部２内に２個の培養容器１０を図示ししているが、１個または複数の培養容器ごとに分割された複数のチャンバにより構成されたものとすることもできる。
　撮影部３は、カメラ３０、照明３１、対物レンズ３２や可動部３３などにより構成される。撮影部３では、培養容器１０内の細胞に照明３１により光を当て、その透過光や回折光を対物レンズ３２により受け、この対物レンズ３２により拡大した画像がカメラ３０に入力される。可動部３３は、カメラ３０および照明３１を培養容器１０のウェルの配置方向（図２のＸ、Ｙ方向）に対して一体に可動にする。また、可動部３３は、対物レンズ３２をＺ軸（光軸）方向に可動にすることにより、複数の培養容器１０内の細胞を撮影する。なお、培養容器１０やチャンバ部２ごとにカメラ３０や照明３１を複数配置する構成とすることもできる。また、別の形態として、カメラ３０および照明３１を固定して、チャンバ部２を別に設けた可動部（図示せず。）と一体化し、Ｘ、Ｙ方向やＺ方向に培養容器１０を可動にする構成とすることもできる。さらに、カメラ３０および照明３１を固定して、チャンバ部２および培養容器１０の双方を可動にすることもできる。
　撮影制御部５は、画像撮影時の撮影部３の光学設定、位置制御やタイムラプス撮影条件、および画像の保存などを制御する。撮影制御部５は、図３に示すように、培養容器１０のウェル１１毎に所定のタイムラプス撮影周期で撮影する撮影手段４０と、培養容器１０のウェル１１毎に細胞の有無を検出する検出手段４１と、撮影手段４０によりウェル１１毎に撮影した画像のうち検出手段４１により細胞有りと検出されたウェル１１の画像を記録する画像記録手段４２とを有する。
　撮影手段４０は、培養容器１０の各ウェル１１を予め設定された所定のタイムラプス周期で撮影部３により撮影する。タイムラプス周期は、数分～数時間の間で任意に設定可能である。撮影部３は、例えば１０倍程度の倍率の対物レンズやＣＣＤまたはＣＭＯＳイメージセンサ等から構成される顕微鏡カメラである。
　検出手段４１は、撮影手段４０によりウェル毎に撮影した画像を解析することにより細胞の有無を検出する。細胞の有無の検出はウェル単位で行う。図４は細胞の有無の検出手順の一例を示している。図４に示す例では、検出手段４１は撮影手段４０により撮影したウェルの画像からウェルを検出して細胞としての胚のみの画像とし、この胚のみの画像から胚の有無を検出する。胚のみの画像からの胚の有無の検出は、画像処理、人工知能（機械学習やディープラーニング）などを用いた方法により行うことが可能である。
　例えば、画像のラベリングによりオブジェクトを抽出し、このオブジェクトから胚の有無を検出する方法がある。胚画像には以下の特徴があり、オブジェクトの中からこれらのいずれか、またはこれらの複数を組み合わせた特徴量に着目することで、胚の有無を検出することができる。
　・円形状である
　・サイズが１００～２００μｍである
　・輪郭に環状の透明体がある（画像でほぼ均一の輝度域）
　・内部に構造体（テクスチャー）を有する
　あるいは、オブジェクト抽出による検出ではなく、画像全体での明暗特性や特徴点の抽出あるいはモデル比較など、画像の諸特性を用いてディープラーニングなどにて検出を行う方法を採用しても良い。
　画像記録手段４２は、撮影手段４０によりウェル毎に撮影した画像のうち検出手段４１により細胞有りと検出されたウェルの画像のみを記録部６に記録する。記録部６は、例えば、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）やフロッピーディスク（ＦＤ）等の磁気ディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）やＤＶＤ等の光ディスク、ＭＯ等の光磁気ディスク、ソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、メモリーカードやＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリや、磁気テープなどの記録媒体である。また、記録部６として、ネットワークアタッチドストレージ（ＮＡＳ）やクラウドストレージ等の記録媒体を使用することも可能である。
　なお、検出手段４１による細胞の有無の検出のタイミングとしては、タイムラプス撮影開始時、タイムラプス撮影途中、またはその両方とすることができるが、タイムラプス周期毎に細胞の有無を検出することが望ましい。これにより、所定のタイムラプス周期で撮影される度に細胞の有無が検出され、細胞有りと検出されたウェルの画像のみが画像記録手段４２に記録されるため、最小限のウェルの画像のみが画像記録手段４２に記録されることになる。
　入力／表示部７は、タッチパネル付き表示装置などからなる。入力／表示部７は、培養制御部４や撮影制御部５へのユーザからの入力指示を与えるとともに、カメラ３０で撮影した画像の表示や、記録部６から読み出した画像の表示などを行う。
　全体制御部８は、装置内の各ブロック間や装置全体の制御を行う。また、全体制御部８は、装置外部とのインターフェースを有する。なお、胚の観察や評価を行うためのソフトウェアは全体制御部８に備えても良い。これにより、全体制御部８は、入力／表示部７に画像を分かりやすく配置し、解析表示して、ユーザの培養評価業務をアシストすることができる。
　次に、上記構成の培養装置１によるタイムラプス撮影方法について説明する。図５は培養装置１によるタイムラプス撮影処理を示すフロー図である。
（Ｓ１００）培養装置１内に培養容器（ディッシュ）１０が入る（ディッシュイン）と処理が開始される。
（Ｓ１０１）培養容器１０内に設けられたマークなどにより全ウェル１１のＸＹ座標およびＺ軸焦点中心の自動検出（オートフォーカス）がなされる。
（Ｓ１０２）撮影手段４０は撮影部３を最初のウェル１１へ移動する。
（Ｓ１０３）撮影手段４０は撮影部３によりウェル１１を撮影する。検出手段４１は撮影手段４０により撮影した画像からウェル１１を検出する。
（Ｓ１０４）検出手段４１はウェル１１内の胚の有無を自動検出する。
（Ｓ１０５）検出手段４１は胚の有無を判断する。ウェル１１内に胚が無い場合、ステップ（Ｓ１０８）へ移行する。
（Ｓ１０６）ウェル１１内に胚が有る場合、撮影手段４０はＺ軸焦点位置から前後にずらしてウェル１１の複数のスライス画像を撮影する。但し、スライス画像が不要な場合は、焦点中心の撮影だけでも良い。
（Ｓ１０７）画像記録手段４２はウェル１１の画像を記録部６に保存する。
（Ｓ１０８）全ウェル１１について撮影が完了したか否か判断する。撮影が完了していない場合、次のウェル１１を撮影するため、ステップ（Ｓ１０３）へ移行する。
（Ｓ１０９）全ウェル１１について撮影が完了すると処理を終了する。
（Ｓ１１０）タイムラプス周期の２周期目以降のタイムラプス撮影では、ステップ（Ｓ１０２）から処理を行う。
　なお、本例では、まずウェル１１の検出を行い、その後で細胞の検出を行う方法としているが、ウェル１１自体の検出は行わず、ウェル配列の規則性などを利用して細胞を直接サーチし、細胞の有無を検出する方法を採用することもできる。
　また、ステップ（Ｓ１０１）で全ウェル１１のＸ、ＹおよびＺ座標を検出する方法としたが、複数のウェル１１からなる分割画像を培養容器１０全体で複数枚撮影してこれらをタイリングしたり、あるいは高解像度のカメラを用いて全ウェル１１を１枚の画像で広範囲撮影し、その後で画像を分割して個々のウェル画像を抽出して細胞の有無を検出したりする方法を採用することもできる。
　また、本実施形態における培養装置１は、図３に示すように、撮影制御部５が、タイムラプス撮影周期毎に培養容器１０の全ウェル１１の細胞の有無経歴を記録する経歴記録手段４３と、検出手段４１による検出結果が前回の検出結果と異なる場合に通知する通知手段４４とを有する構成とすることができる。
　経歴記録手段４３は、検出手段４１による検出結果に基づき、タイムラプス撮影周期毎に培養容器１０の全ウェル１１の細胞の有無経歴を記録部６に記録する。これにより、タイムラプス撮影周期毎に培養容器１０の全ウェル１１の細胞の有無経歴が経歴記録手段４３によって記録されるので、このタイムラプス撮影周期毎の培養容器１０の全ウェル１１の細胞の有無経歴に基づいてタイムライン表示での画像配列や履歴管理に活用することが可能となる。
　図６は全ウェルのライブ画像表示例を示す図であって、（Ａ）は従来の表示例を示す図、（Ｂ）は本発明の表示例を示す図である。図６（Ａ）に示すように、従来は培養容器１０の全ウェル１１の画像が記録されており、各ウェル１１の胚の有無に関わらず全ウェル１１の画像が表示されている。一方、本発明では、培養容器１０の全ウェル１１のうち胚が有るウェル１１の画像のみ記録部６に記録されており、経歴記録手段４３によってその全ウェル１１の胚の有無履歴も記録されているため、この胚の有無履歴に基づき、図６（Ｂ）に示すように、胚が有るウェル１１の画像のみ表示し、胚が無いウェル１１については表示しないようにすることが可能である。したがって、記録部６に記録されている画像について観察ソフトウェアや評価ソフトウェアで胚を比較観察または評価するとき、一目で見やすく、状態や経過が把握しやすくなり、培養観察や評価を効率良く行うことが可能となる。
　図７は複数ウェルのタイムライン表示例を示す図であって、（Ａ）は従来の表示例を示す図、（Ｂ）は本発明の表示例を示す図である。図７は、横方向に複数ウェルを並べ、縦方向にタイムラプス周期ごとのウェルの画像を並べて表示している。細胞培養では、培養途上において凍結保存や移植のためにウェル１１から胚が抜き取られることがある。また、外部顕微観察や培養液交換のため、培養容器（ディッシュ）１０ごと外部に取り出されることもある。この場合、従来においては、図７（Ａ）に示すように、抜き取られた胚があったウェル１１についても全て表示される。一方、本発明では、経歴記録手段４３によって記録された胚の有無履歴に基づき、図７（Ｂ）に示すように、培養途上において凍結保存や移植用として抜き取られた胚があったウェル１１については表示されない。また、外部顕微観察や培養液交換のため、培養容器１０ごと外部に取り出された場合も表示されない。そして、培養容器１０が再配置された場合には、再び胚が有るウェル１１について表示される。
　図８は複数のタイムラプス撮影のコマ送りにより動画表示を行う比較例を示す図である。図８に示すように、従来、記憶装置から所定の胚のタイムラプス画像データを読み取り連続して表示していたため、細胞のないウェルのみの画像８１が混在する。そのため、動画表示時に一瞬胚のない画像が出現し、不連続で見にくい動画表示となっている。しかし、本実施形態におけるタイムラプス撮影機能付き培養装置１では、この胚のないウェルのみの画像８１が排除されることになるため、不連続性のない見やすい動画像を得ることができる。すなわち、本実施形態におけるタイムラプス撮影機能付き培養装置１では、タイムラプス画像を連続して表示することにより細胞の成長状態を連続的に視覚化でき、変化や成長の過程を分かりやすく把握することができる。
　通知手段４４は、検出手段４１による検出結果が前回の検出結果と異なる場合に通知する。通知手段４４は、例えば、通知ブザーの鳴動、通知ランプの点灯やディスプレイへの異常通知表示などである。図９は異常通知表示の例を示している。通知手段４４は、検出手段４１による検出結果が前回の検出結果と異なる場合、例えば、図９に示すようにディスプレイへ異常の通知をダイアログにより表示することで、培養装置１の使用者に注意を促し、撮影要否の確認を行う。このとき、該当するウェル１１の撮影動作を待機状態とし、操作者は凍結保存や移植済で胚の有無を確認できている場合には「ＯＫ」とし、判定に誤りがありそうな場合には「ＣＡＮＣＥＬ」として、別途撮影するように指示することも可能となる。なお、別の実施形態として、細胞の有無の検出結果を使用者に通知し、撮影要否の確認やディッシュ設置の異常などを情報通知することもできる。
　以上のように、本実施形態における培養装置１では、培養容器１０のウェル１１毎に細胞が存在するウェル１１の画像のみを自動的に記録することが可能となり、画像を記録する記録部６の使用量を削減することができる。また、細胞が存在しない不要なウェル１１の画像が記録されないので、撮影の周期やスケジュール設定の自由度が増し、より高精度な画像観察による培養が可能である。さらに、記録された画像を表示する際に細胞が存在しない不要なウェルの画像がないため、効率の良い評価を行うことが可能である。
　本発明は、胚などの細胞を培養するとともにタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影機能付き培養装置および培養方法として有用である。
　１　タイムラプス撮影機能付き培養装置
　２　チャンバ部
　３　撮影部
　４　培養制御部
　５　撮影制御部
　６　記録部
　７　入力／表示部
　８　全体制御部
　１０　培養容器
　１１　ウェル
　３０　カメラ
　３１　照明
　３２　対物レンズ
　３３　可動部
　４０　撮影手段
　４１　検出手段
　４２　画像記録手段
　４３　経歴記録手段
　４４　通知手段

Claims (6)

  1. 　少なくとも１個以上のウェルを有する培養容器のウェル毎に細胞を配して培養するとともにタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影機能付き培養装置であって、
    　前記培養容器のウェル毎に所定のタイムラプス撮影周期で撮影する撮影手段と、
    　前記培養容器のウェル毎に細胞の有無を検出する検出手段と、
    　前記撮影手段によりウェル毎に撮影した画像のうち前記検出手段により細胞有りと検出されたウェルの画像を記録する画像記録手段と
    を含むタイムラプス撮影機能付き培養装置。
  2. 　前記検出手段は、前記撮影手段によりウェル毎に撮影した画像を解析することにより前記細胞の有無を検出するものである請求項１記載のタイムラプス撮影機能付き培養装置。
  3. 　前記検出手段は、前記タイムラプス撮影周期毎に細胞の有無を検出するものである請求項１または２に記載のタイムラプス撮影機能付き培養装置。
  4. 　前記検出手段による検出結果が前回の検出結果と異なる場合に通知する通知手段を有する請求項１または２に記載のタイムラプス撮影機能付き培養装置。
  5. 　前記タイムラプス撮影周期毎に前記培養容器の全ウェルの細胞の有無経歴を記録する経歴記録手段を有する請求項１または２に記載のタイムラプス撮影機能付き培養装置。
  6. 　少なくとも１個以上のウェルを有する培養容器のウェル毎に細胞を配して培養するとともにタイムラプス撮影を行う培養方法であって、
    　前記培養容器のウェル毎に所定のタイムラプス撮影周期で撮影すること、
    　前記培養容器のウェル毎に細胞の有無を検出すること、
    　前記ウェル毎に撮影した画像のうち細胞有りと検出されたウェルの画像を記録すること
    を含む培養方法。
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