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WO2024062094A1 - Titre : dispositif et procede pour la caracterisation de cellules soumises a une contrainte physique - Google Patents

Titre : dispositif et procede pour la caracterisation de cellules soumises a une contrainte physique Download PDF

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Publication number
WO2024062094A1
WO2024062094A1 PCT/EP2023/076210 EP2023076210W WO2024062094A1 WO 2024062094 A1 WO2024062094 A1 WO 2024062094A1 EP 2023076210 W EP2023076210 W EP 2023076210W WO 2024062094 A1 WO2024062094 A1 WO 2024062094A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
application
kpa
cells
constraint
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2023/076210
Other languages
English (en)
Inventor
Edwin-Joffrey Courtial
Emma PETIOT
Mehdi MALEKI
Imen HALIMA
Gabriel FROSSARD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National des Sciences Appliquees de Lyon, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon
Priority to EP23776354.5A priority Critical patent/EP4591044A1/fr
Priority to JP2025517604A priority patent/JP2025536452A/ja
Priority to KR1020257012784A priority patent/KR20250075622A/ko
Priority to CN202380068365.5A priority patent/CN120225856A/zh
Publication of WO2024062094A1 publication Critical patent/WO2024062094A1/fr
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    • G01N2015/1497—Particle shape

Definitions

  • the subject of the present invention is a microfluidic device and a method for the application of at least one physical constraint of intensity and of a determined duration to cells in suspension, and for the characterization of the morphological and physiological state of the cells subjected to the application of this physical constraint.
  • the present invention therefore lies in the field of microfluidic devices and analytical cell biology.
  • Morphology can itself be used as a marker of the physiological state of a cell.
  • these means require, on the one hand, to have appropriate markers specific to a physiological state and, on the other hand, these methods only characterize the physiological state of the cell as observed at the time of marking.
  • bioprocesses using animal cells such as in particular bioprinting processes, bioproduction of cells for cell therapy, and processes implemented from cells, such as the production of therapeutic proteins, viral vaccines or viral vectors, as well as all cell injection or sampling processes, depend on the quality of the cells that are used during said bioprocesses.
  • the quality of cells is generally linked to physiological characteristics such as cell viability, ie the proportion of living cells compared to cells engaged in cell death processes (apoptosis, necrosis, lysis) or cell function (capacity secretion of molecules, capacity to differentiate into cell subtype in the case of stem cells).
  • cell viability ie the proportion of living cells compared to cells engaged in cell death processes (apoptosis, necrosis, lysis) or cell function (capacity secretion of molecules, capacity to differentiate into cell subtype in the case of stem cells).
  • the effectiveness of a bioprocess can therefore be strongly impacted by the alteration it produces on cellular quality and therefore on cellular physiology.
  • One of the mechanisms which very strongly impacts the quality, and in particular cell viability, within a bioprocess is the application of hydrodynamic and mechanical constraints generated by the equipment used, such as a bioreactor, a system using an injection or sampling syringe, or even a separation step.
  • a suspending fluid and a wall creates stress on cells suspended in the fluid. Direct interaction of the cell with the wall produces a mechanical impact on the cell.
  • the intensity and duration of physical stress exerted on a cell vary greatly. For example, a cell therapy process can generate a stress on cells whose intensity can reach 5,000 Pa and a bioprinting process can generate a stress whose duration can reach 30 ms.
  • WO 2015/024690 Apparatus and method for determining the mechanical properties of cells relates to a method and an apparatus for determining the mechanical properties of cells, and discloses the study of the deformation of cells subjected to shear stress.
  • This document discloses a device comprising a simple capillary channel in which suspended cells undergo shear stress and a method for measuring the shape of the cells during their circulation in the device. This process uses binarized images. Measurements are made in real time.
  • EP 3 796 212 “Device for image-based cell classification, method therefor and use thereof” describes a device for sorting cells in real time and without marking.
  • This device includes a microfluidic network leading to the alignment of each of the cells according to its major axis and a classification unit comprising a neural network which sorts the cells based on their images.
  • WO 2019/006188 “Quantitative deformability cytometry: rapid, calibrated measurements of cell mechanical properties” describes a microfluidic device and a quantitative deformability cytometry (q—DC) method intended to quantitatively evaluate the intrinsic mechanical properties of cells.
  • the mechanical parameters determined are: the elastic modulus E, the cell fluidity P, the transit time T T , the migration time Te, the cell size D ce ii and the maximum stretching £ max , at a flow rate of 100 cells/s.
  • Machine learning tools are implemented. The cells are subjected to calibrated shear stresses.
  • a device and a process capable of generating at least one physical constraint such as generated during a bioprocess, the nature, intensity and duration of which are determined and controlled, in order to to characterize the cells likely to undergo said constraints.
  • physical constraint we mean in particular any force exerted on the cells, capable in particular of generating cellular stress; such a physical constraint may in particular be a mechanical impact or a hydrodynamic constraint, such as an elongation, compression or shear stress.
  • the inventors have developed a device for applying at least one physical constraint of determined intensity and duration to cells in suspension, and for characterizing the cells having undergone said at least one physical constraint.
  • a device is configured to:
  • a device is configured for the characterization of said cell during the application of said constraint and optionally for the characterization of said cell after the application of said constraint.
  • a device comprises, on the one hand, a microfluidic circuit for the application of at least one physical constraint and, on the other hand, a means of characterizing cells.
  • said at least one physical constraint is a constraint chosen from mechanical constraints, in particular a mechanical impact, and/or hydrodynamic constraints, such as a hydrodynamic compressive stress, a hydrodynamic shear stress and /or a hydrodynamic extension constraint. More particularly, in a device according to the invention, said at least one physical constraint is a constraint chosen from hydrodynamic constraints.
  • said means for characterizing cells is chosen from all known technical means for observing cells, in particular imaging or cytometry means. More particularly, in a device according to the invention, said means for characterizing cells during application of the stress is chosen from all known technical means for observing cells, in particular imaging or cytometry means.
  • a device comprises a microfluidic circuit comprising at least one segment configured for the application to cells in suspension of at least one physical constraint, more particularly a hydrodynamic constraint, this segment comprising at least: i) a main channel configured for the circulation of a fluid containing said cell in suspension, ii) a fluid inlet and a fluid outlet, iii) means for introducing and establishing a flow of said fluid inside said channel.
  • the invention therefore has as its first object a device for the application of at least one physical constraint, more particularly at least one hydrodynamic constraint, of determined intensity and duration to at least one cell in suspension, and for the characterization of said cell during and/or after said application, more particularly during and optionally after said application.
  • the second object of the invention is a method for the application of at least one physical constraint, more particularly at least one hydrodynamic constraint, of determined intensity and duration to at least one cell in suspension, and for the characterization of said cell during and/or after said application, more particularly during and optionally after said application.
  • the invention also relates to a classification model, previously trained on a set of learning data, to characterize a cell and predict its physiological state during and/or after the application of at least one physical constraint, according to a device and a method according to the invention.
  • a classification model saves time, money and performance (in particular allowing a large number of cell characterizations during a reduced period of time) compared to the tools existing on the market.
  • the subject of the invention is the use of a device, a method or a classification model according to the invention, to characterize a cell and possibly predict his physiological state during and/or after the application of at least one physical constraint.
  • a device and a method according to the invention have the advantage of generating at least one physical constraint, the nature, intensity and duration of which are precisely determined and controlled, in order to characterize the cells having undergone said constraints.
  • a device and a method according to the invention have the advantage of allowing the application of a modular sequence of at least one physical constraint, in particular the repetition of the same constraint and/or the combination of physical constraints of a different nature. , the intensity and duration of each being precisely defined. It is therefore possible, thanks to this simple and precise tool, to reproduce the constraints applied during a bioprocess and to monitor the state of at least one cell at high speed.
  • a device and a method according to the invention also have the advantage of making it possible to predict the physiological state of cells during and/or after they have been subjected to physical constraints. This prediction can be made during and up to several days after the application of these physical constraints.
  • a device and a method according to the invention have the advantage of defining the capacity of a cell to undergo the application of at least one determined physical constraint while maintaining a morphology and a physiological state compatible with the requirements of said bioprocess. It is in fact possible, thanks to a device and a method according to the invention, to define, for given cells, a map of its resistance capacities to at least one physical constraint.
  • capacitor we mean the capacity of a cell to undergo at least one physical constraint of determined intensity and duration, without modification of its physiological state.
  • modification of its physiological state we mean in particular a differentiation, or the transition from a viable state to a state of lysis, necrosis, or apoptosis.
  • a device and a method according to the invention makes it possible in particular to optimize bioprocesses, and in particular the associated physical constraints, in order to define the optimal operating conditions and to adapt said constraints to the cells of interest.
  • These conditions for example, focus on the parameters of the bioprocess (temperature, flow rate, rotation speed), on the suspending fluid (viscosity, osmolarity). It is in fact desirable to optimize the constraints associated with bioprocesses, in order to adapt said constraints to the data obtained during the characterization and prediction of the physiological state of cells subjected to these physical constraints.
  • the invention relates to a device for the application of at least one physical constraint, more particularly at least one hydrodynamic constraint, to at least one cell in suspension and for the characterization of said cell during and/or after said application, the device comprising:
  • microfluidic circuit comprising at least one segment, said segment comprising at least: i) a main channel configured for the circulation of a fluid containing said cell in suspension, ii) a fluid inlet and a fluid outlet, iii) a means for introducing and establishing a flow of said fluid inside said channel, and
  • said device according to the invention being characterized in that said at least one segment is configured for the application to said cell of at least one physical constraint chosen from:
  • the term “for” as in particular in the expression “for the application of a physical constraint” means “configured for the application of a physical constraint”.
  • the limits cited are considered to be part of said range of values.
  • microfluidic circuit we mean a circuit intended to manipulate small volumes of fluids ( 10'18 to 10'3 liters) in channels whose diameter is between 5 pm and 3000 pm.
  • fluid we mean a deformable medium suitable for circulation in a device according to the invention and for cell suspension.
  • said fluid is chosen from Newtonian fluids, that is to say whose viscosity does not vary as a function of the shear stress.
  • Said fluid has at least one of the following properties:
  • nutrient elements assimilable by cells in suspension, such as in particular glucose, glutamine or a nutrient composition such as a culture medium.
  • the fluid for the cell suspension is preferably chosen from Newtonian fluids, and in particular from:
  • physiological buffers usually used for suspending cells, such as in particular PBS, HBSS; these buffers are optionally added with nutritional compounds such as a 0.5 to 6 g/l glucose solution and a 2 to 4 mM glutamine solution,
  • - cell culture media such as in particular DMEM, EMEM, alpha-MEM,
  • the cell concentration is preferably less than 100 million cells per mL, preferably between 0.01 and 10 million cells per mL.
  • the cell volume preferably represents at most 30% of the total volume of the suspension fluid.
  • the circulation of the reference fluid and the fluid in which the cells are suspended is achieved in a stable flow without pulsation.
  • Said device is therefore configured for the application of at least one constraint to at least one cell suspended and moving in said device.
  • the device is preferably designed to drive cells toward a microfluidic chip pursuing a defined current line.
  • the intensity of the stress also designated by the expression “stress level” or “stress” in the figures
  • the residence time under stress also designated by “duration application of the constraint” or “time” in the figures
  • the pump(s) controls the flow rate and flow pattern.
  • the pumps are preferably ultra high pressure pumps, up to 1.37xl0 5 kPa.
  • the circulation of a fluid within a device according to the invention is initiated and maintained by means of any device adapted for this purpose well known to a person skilled in the art, such as a pump.
  • the section of the channels can be constant or variable, this section can also be conical, for example in the form of nozzles.
  • the presence of a conical section, increasing or decreasing, at the end of a channel imposes on the cells an additional constraint of capture and controlled release.
  • the preferred diameter of the main channel is between 10 and 3000 pm.
  • the channels are made of a material suitable for the circulation of a fluid subjected to a pressure of between 10' 3 and 10 6 kPa, and preferably between 1 and 10 4 kPa, and/or of a material suitable for the circulation of a fluid whose viscosity is between 1 and 2000 mPa.s.
  • the capacitance of cells depends on their origin (clone, species, organ), their method of culture (number of doubling in culture, culture medium, environmental condition of the culture, i.e. agitation or not, temperature, pH) and their method of collection (trypsination, mechanical harvest).
  • their method of culture number of doubling in culture, culture medium, environmental condition of the culture, i.e. agitation or not, temperature, pH
  • their method of collection trypsination, mechanical harvest.
  • the method of culturing the cells particularly in 2D or 3D, their culture in adherent or suspended form and the nature of the culture medium used influence the capacitance of the cells.
  • the microfluidic circuit is constituted by a set of channels constituted by an appropriate material, in particular chosen from the following PEEK (PolyEtherEtherCetone), PVC (PolyVinyl Chloride), PTFE ( PolyTetraFluoroEthene), FEP (Fluorinated ethylene polypropylene), PDMS (PolyDimethylSiloxane) or steel.
  • the microfluidic circuit is constituted by a microfluidic chip made of a material chosen from: PDMS, polyacrylate, SEBS (StyreneEthyleneButyleneStyrene), glass, polycarbonate or ceramic.
  • a device according to the invention may comprise, according to particular embodiments, channels arranged in series and/or channels arranged in parallel.
  • a fluid circulation rate in the channel considered for the characterization of the physical stress applied to the cells, between 0 and 5 ml/min, preferably between 0 and 1 ml/min and/or - a fluid circulation speed of between 5 pm/s and 300 m/s, and/or
  • the total duration of presence of the cells in said channel is preferably between 1 ps and 10,000 s, preferably between 1 ps and 100 s, preferably between 1 ps and 1 s, preferably between 10 ps and 100 ms.
  • sustained cell we mean any type of cell, animal or plant, prokaryotic or eukaryotic. Indeed, depending on the diameter of the channels and the magnification of the objective allowing image analysis, a device according to the invention makes it possible to characterize, for example, cells of bacteria, algae or fungi.
  • the nucleic acid content of the cell in particular the quantity of DNA, the quantity of RNA, the nucleotide sequence of one or more nucleic acids, whether DNA or RNA.
  • characterization of the cell we mean the definition of at least one characteristic of said cell. In the case where more than one cellular characteristic is defined, the characterization of said cell includes the definition of the combination of said characteristics.
  • the characterization of the cells leads to the determination of the physiological state of the cells during or after the application of said at least one constraint.
  • Physiology studies the role, functioning and mechanical, physical and biochemical organization of cells and their components, particularly cellular organelles.
  • Physiology also studies the interactions between a cell and its environment.
  • the determination of the physiological state of the cells includes in particular the state of differentiation and/or the determination of the nutritional functions; of proliferation and relationship, such as mobility and sensory functions.
  • This physiological state is preferably chosen from the following: living cell, dead cell, lysed cell, necrotic cell, apoptotic cell, differentiated cell or undifferentiated cell, pathological cell or healthy cell.
  • the physiological state of the cells after the application of at least one physical constraint can also be compared to the physiological state of the cells before the application of said physical constraint.
  • the capacity of cells to undergo at least one physical constraint of determined intensity and duration while maintaining a physiological state compatible with subsequent use is defined as the “capacitance” of the cells.
  • the invention particularly relates to a device configured for the application to said cell of at least one physical compressive stress, said device comprising at least one segment of type (A) comprising, or constituted by, a first channel joined, at the same level, by two channels, each making an angle of between 30 and 150 degrees with said first channel, this angle is also called “flow focusing angle”.
  • A segment of type
  • the intensity of the compressive stress applied to the cells is between 10' 3 and 10 3 kPa, preferably between 10' 3 and 10 2 kPa, preferably between 10' 3 and 10 kPa.
  • Figure 1 schematically represents an example of a type A segment.
  • the invention particularly relates to a device configured for the application to said cell of at least one hydrodynamic shear stress, said device comprising at least one type B segment comprising, or consisting of, a channel with a diameter of between 10 and 2000 pm, preferably between 20 and 200 pm.
  • hydrodynamic shear stress we mean a mechanical stress applied parallel or tangential to the face of a material.
  • the intensity of the shear stress applied to the cells is between 10' 3 and 10 5 kPa, preferably between 10' 3 and 10 4 kPa, preferably between 0.1 and 10 3 kPa.
  • a hydrodynamic shear stress is applied in particular during the circulation of the cells in a capillary channel, the diameter of which is preferably between 10 and 2000 pm, preferably between 20 and 200 pm.
  • Figure 1 schematically represents an example of a type B segment.
  • the invention particularly relates to a device configured for the application to said cell of at least one physical extension constraint, said device comprising at least one type C segment comprising, or constituted by, i) a channel of increasing or decreasing section or ii) a first channel joined by a second in which the circulation of the fluid takes place in a different direction, preferably opposite, to that of the first channel.
  • hydrodynamic extension constraint we mean the application of balanced forces towards the outside of the cells, or an elongation constraint.
  • the intensity of the extension stress applied to the cells is between 10' 3 and 10 3 kPa, preferably between 10' 3 and 10 2 kPa, preferably between 10' 3 and 10 kPa.
  • Figure 1 schematically represents an example of a type C segment.
  • the invention particularly relates to a device configured for the application to said cell of at least one mechanical impact, said device comprising at least one D-type segment comprising, or constituted by, a first channel within which the path line of the cells encounters an obstacle, such as in particular the wall of a second channel.
  • Figure 1 schematically represents an example of a type D segment.
  • mechanical impact we mean any type of mechanical shock, such as for example a shock hitting a wall or an inertial collision on the surface.
  • the intensity of the mechanical impact applied to the cells is between 1 and 300 m/s, preferably between 1 and 100 m/s, preferably between 1 and 10 m/s. s.
  • the duration of the impact time is preferably less than 1 ps.
  • a device for the application of at least one physical constraint and the characterization of at least one cell in suspension, comprises a microfluidic circuit comprising or consisting of:
  • a device for the application of at least one physical constraint and the characterization of at least one cell in suspension, comprises a microfluidic circuit comprising or consisting of:
  • a device according to the invention is in particular designed for the application of a sequence comprising one or more iterations of a physical constraint of the same nature, at a determined frequency and intensity, and/or for the application of a sequence of several physical constraints of different nature, at a determined frequency and intensity.
  • the invention particularly relates to a device configured for the application to said cell of at least one sequence comprising, or consisting of, at least two successive physical constraints of different nature.
  • the sequence can be repeated one, two, three or more times.
  • the invention particularly relates to a device configured for the application to said cell of at least one sequence comprising, or consisting of, at least two successive physical constraints of the same nature.
  • the device is configured for the application to said cell of a physical constraint repeated at least 1 time, at least twice, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 times, or even more.
  • FIG. 2 An example of this embodiment of a device according to the invention is schematized in Figure 2, which represents a device designed for the application to the cells of a large number of compressive stresses, separated by segments designed so that the cells are not subjected to stress. These physical stress sequences can be considered equivalent to the application of dynamic cell deformation. These are repetitions of the same constraint sequence.
  • a device is characterized in that the total intensity of said at least one physical stress applied to the cell is between 10' 3 kPa and 10 5 kPa, preferably between 10' 3 kPa and 10 4 kPa, preferably between 0.1 kPa and 10 3 kPa, preferably between 1 kPa and 10 2 kPa.
  • a device according to the invention is characterized in that the total duration of the application of said at least one physical constraint is between 1 ps and 10,000 s, preferably 1 ps and 100 s, preferably between 1 ps and 1 s, preferably 10 ps and 100 ms.
  • the characterization of said at least one cell in suspension is carried out during the application to said cell of at least one physical constraint and/or after the application to said cell of at least one physical constraint.
  • the characterization of said at least one cell in suspension is carried out during the application to said cell of at least one physical constraint.
  • a device is characterized in that the characterization of said cell takes place after the application of said at least one constraint, this characterization is carried out for a period of between 0 and 120 days, preferably between 0 and 30 days, preferably between 0 and 1 day after the application of said at least one physical constraint.
  • a device is characterized in that the characterization of said cell after the application of said at least one constraint comprises, or consists of, at least one punctual characterization or at least one characterization carried out for a duration comprised between 1 ps and 10000 s, preferably 1 ps and 100 s, preferably between 1 ps and 1 s, preferably 10 ps and 100 ms.
  • a device is characterized in that the means for characterizing said at least one cell is chosen from: a cytometer, a microscope, means for analyzing the protein content of the cell, means for analyzing and sequencing the nucleic acids of said cell, and means for capturing an image and/or electrical signal, combined with means for signal analysis.
  • a device according to the invention may comprise a microelectrode or a photodiode.
  • a device is characterized in that said signal and/or image analysis means comprises, or is constituted by, a central computer unit comprising software means adapted for signal analysis and /or image.
  • a device comprising a signal and/or image analysis means further comprises a first and/or a second classification model.
  • the presence of at least a first and/or a second classification model has the advantage of accelerating the image analysis process and allowing real-time analysis.
  • classification model we mean a machine learning algorithm previously trained, in particular during supervised learning, as well as a set of training data, allowing the training of said algorithm, and a set of data. 'assessment.
  • a classification model may consist of a computer program, said computer program being able to be written in any suitable computer language known to a person skilled in the art. Said computer program can be implemented on a computer to generate a technical result. Examples of these technical results are described below.
  • the training dataset may include a training set and a test set of the model.
  • the model can thus be tested on the test base and the test set can be used to determine whether the training of the model is satisfactory or not.
  • the training game and the test game may be different.
  • the test set may correspond to part of the training set.
  • a device comprising an image analysis means further comprises a first classification model, previously trained with a training data set, and comprising a supervised automatic learning algorithm, not -supervised or semi-supervised.
  • Said first classification model is suitable for predicting the physiological state of a given cell from at least one characteristic of said cell.
  • the input data are images with objects.
  • the output data are objects with a label: a percentage of membership in a specific class.
  • the training algorithm is at least 10 epochs, the loss calculation is cross entropy, and the optimizer is Adam (enhanced gradient descent).
  • the model is transfer learning with YOLO, the nature of the network is a supervised model (1733 cell images / 1733 annotations).
  • the model preferably includes 106 convolutional layers.
  • the functions performed in a neuron are: convolution, addition, softmax, “up sampling”. Neural/layer connections are made.
  • the training data set may comprise a multitude of data pairs, each of the data pairs comprising a first piece of data representing at least one characteristic of said cell and a second piece of data representing a physiological state of said cell.
  • the training data set can be previously constituted from data obtained in the laboratory by analysis of the characteristics of cells whose physiological state has been determined.
  • Said first classification model can in particular be implemented on a computer to generate a technical result consisting, for example, of a classification of a cell according to its characteristics.
  • Said first classification model makes it possible to generate a three-dimensional diagram, representing, for example, for a given cell:
  • the physiological state of the cells that is to say cell viability, necrosis, apoptosis or lysis, expressed as a percentage, or the differentiated or undifferentiated character.
  • a device comprises an image analysis means
  • said image analysis means further comprises a second classification model, previously trained with a set of training data , and comprising a supervised, unsupervised or semi-supervised machine learning algorithm, said second classification model being adapted for the detection and monitoring of the deformation of a given cell, in response to at least one physical constraint.
  • Said first classification model can in particular be implemented on a computer to generate a technical result consisting, for example, of monitoring the morphological evolution of a cell according to different applications of physical constraints.
  • said second classification model uses at least one neural network whose functions are as follows: i) Locate and isolate the cell from said image ii) Validate the presence of a single cell iii) Improve the quality of the image then process the image by applying a mask to the cell and determining its outline, iv) position and measure the major and minor axes of the ellipse describing the outline of the cell. The deformation being defined as the ratio between the major axis and the minor axis.
  • the second classification model comprises: input data 440 images of cells cut out and adjusted to gray level, output data: binary segmentation mask.
  • the training data includes 420 training images.
  • For the training algorithm at least 10 epochs are required, the loss calculation is cross entropy and the optimizer is Adam (improved gradient descent).
  • the nature of the network is U-Net.
  • the number of layers is: 5 contraction layers, 5 expansion layers, or 10 in total.
  • the functions performed in a neuron are: 2D convolution between image and filter, i.e. compress the image, extract the feature vector which contains the object of interest and decompress the image.
  • the neuron/layer connections are characterized in that the layers are composed of two convolutions, both followed by activation functions (ReLU).
  • FIG. 3 An example of locating and isolating a cell is shown in Figure 3.
  • FIG. 4 An example of positioning and measuring the major axis and the minor axis of the ellipse is shown in Figure 4.
  • said second classification model has reached a satisfactory level of learning on all the profiles of the test set if the classification notably achieves a minimum Fl score of 65%, preferably at least 80%.
  • the invention relates to a method for applying at least one physical constraint of determined intensity and duration to at least one cell in suspension, and for the characterization of said cell after said application, the method comprising the following steps: a) depositing and circulating a fluid containing said at least one cell suspended in a microfluidic circuit comprising at least one segment , said segment comprising at least: i) a main channel configured for the circulation of a fluid containing said cell, ii) a fluid inlet and a fluid outlet, iii) means for introducing and establishing a flow of said fluid at the inside said channel, and b) the characterization of said cell after the application of said at least one constraint, a method according to the invention is characterized in that said at least one segment is configured for application to said cell d 'at least one physical constraint chosen from:
  • a method according to the invention particularly concerns the application of a physical constraint and the characterization of at least one cell in suspension, said characterization concerns at least one of the following aspects: the size, shape, appearance of the membrane external, the appearance of the cytoplasm, the presence of at least one marker on the surface of the cell, the protein content of the cell and the nucleic acid content of the cell.
  • the subject of the invention is a method according to the invention comprising the application of at least one physical constraint to at least one cell in suspension, said physical constraint being characterized in that the cell is subjected to:
  • At least one mechanical impact of intensity between 1 and 300 m/s, preferably between 1 and 100 m/s, preferably between 1 and 10 m/s and/or for a duration of less than 1 ps and/or
  • At least one shear stress of intensity between 10' 3 kPa and 10 5 kPa, preferably between 10' 3 kPa and 10 4 kPa, preferably between 0.1 kPa and 10 3 kPa, preferably between 1 kPa and 10 2 kPa and/or for a duration of between 1 ps and 10,000 s, preferably between 1 ps and 100 s, preferably between 10 ps and 1 s, and/or
  • At least one compressive stress of intensity between 10' 3 kPa and 10 5 kPa, preferably between 10' 3 kPa and 10 4 kPa, preferably between 0.1 kPa and 10 3 kPa, preferably between 1 kPa and 10 2 kPa and/or for a duration of between 1 ps and 10 s, preferably between 1 ps and 1 s, preferably between 10 ps and 10 ms and/or
  • At least one extension stress of intensity between 10' 3 kPa and 10 5 kPa, preferably between 10' 3 kPa and 10 4 kPa, preferably between 0.1 kPa and 10 3 kPa, preferably between 1 kPa and 10 2 kPa and/or for a duration of between 1 ps and 10 s, preferably between 1 ps and 1 s, preferably between 10 ps and 10 ms.
  • the parameters i) of fluid flow and ii) of the viscosity of the fluid are chosen in order to reproduce the stress intensities and the residence time reproducing the stresses which are felt by the cells during a particular bioprocess.
  • a current line is generated.
  • the cell follows the streamline developed by the movement of the fluid and its interaction with the channel geometry.
  • the fluid flow rate is between 10' 3 and 10 ml/min, preferably between 10' 3 and 1 ml/min.
  • the residence time of the cells is between 1 ps and 10,000 s, preferably between 1 ps and 1 s, preferably between 10 ps and 100 ms.
  • the subject of the invention is a method according to the invention comprising the application of at least one physical constraint to at least one cell in suspension, then the characterization of said cell, the method further comprising a prediction step of the physiological state of a cell by a first classification model previously trained, based on the characteristics determined during step b).
  • the invention also relates to a method according to the invention comprising the application of at least one physical constraint to at least one cell in suspension, then the characterization of said cell, the method further comprising a step of prediction of the physiological state of a cell by a first classification model previously trained, from the characteristics determined during step b), said first classification model comprising: an automatic learning algorithm, a neural network supervised, semi-supervised or unsupervised learning, previously trained with a training dataset.
  • the invention also relates to a method according to the invention further comprising a step of monitoring the deformation of a cell at different times of its stay in said microfluidic channel, by a second previously trained classification model, from the characteristics determined in step b).
  • the invention also relates to a classification model, previously trained on a set of learning data to predict, in a method according to the invention, a physiological state of a cell after the application of 'at least one physical constraint.
  • the subject of the invention is the use of a device or a method according to the invention, or of a classification model according to the invention for the characterization of cells of the following type: prokaryotic cell , eukaryotic cell, animal cell, plant cell, human cell, stem cell, epithelial cell, fibroblast, blood cell, genetically modified cell or synthetic cell mimic.
  • the subject of the invention is the use of a device or a method according to the invention, or of a classification model according to the invention for determining the "capacitance" of 'a cell.
  • the subject of the invention is the use of a device or a method according to the invention, or of a classification model according to the invention for the definition of at least one parameter of a bioprocess.
  • the subject of the invention is the use of a device or a method according to the invention, or of a classification model according to the invention for the definition of at least one parameter of a bioprocess chosen from: bioprinting, cell therapy and bioproduction.
  • Figure 1 is a schematic representation of example segments A, B, C and D.
  • Figure 2 is a schematic representation of an example of a device in which several types of physical constraints are applied to the cells, here a sequence of shear and elongation stresses.
  • the bottom graph represents a magnification of the top graph.
  • the cell undergoes repeated stress. This type of stress can also be defined as dynamic deformation, or oscillatory deformation.
  • Figure 3 shows the steps for isolating a cell.
  • Figure 4 shows the measurement of the minor axis and the major axis of the ellipse.
  • Figure 5 in Example 2, represents the viability state of human AD-MSC mesenchymal stem cells after application of shear stresses of variable intensity and duration.
  • the percentage of cells in a particular physiological state is given as a function of the application duration (time) expressed in seconds and the intensity (stress) expressed in Pa, of the shear stress.
  • Figure 5 thus represents the percentage of viable cells (frame A), lysed cells (frame B), necrotic cells (frame C) and cells in apoptosis (frame D).
  • Figure 6 in Example 3 represents the state of viability of fibroblast cells after application of a shear stress.
  • the fibroblasts are characterized after the application of shear stresses of varying intensity and duration.
  • the percentage of cells in a particular physiological state is given as a function of the application duration (time), expressed in seconds, and the intensity (stress), expressed in Pa, of the shear stress.
  • Figure 6 thus represents the percentage of cells that are viable (frame A), lysed (frame B), necrotic (frame C) or in apoptosis (frame D).
  • Figure 7 in Example 4 represents the proportion of undifferentiated AD-MSC stem cells (white circle) and differentiated cells (black circle) after application of a shear stress, as a function of the duration of application (time), expressed in seconds, and the intensity (stress), expressed in Pa of the shear stress.
  • Figure 8 in Example 5, represents the viability state of HEK293T cells after application of an elongation stress.
  • HEK293T cells are characterized after the application of elongation stresses of variable intensity and duration.
  • the percentage of cells in a particular physiological state is given as a function of the duration of application (time), expressed in seconds, and the intensity (stress), expressed in Pa, of the elongation stress.
  • Figure 8 thus represents the percentage of cells in apoptosis (frame A), viable (frame B), necrosis (frame C) or lysed (frame D).
  • Figure 9 in Example 6 represents the state of viability of fibroblast cells after application of a shear stress, the viability being measured by cytometry (histogram bars) or by trypan blue staining (black circles) .
  • Figure 10, in Example 7 represents the viability state of HEK293T cells after application of shear stresses of variable intensity and duration. The percentage of viable cells, measured by trypan blue staining, is given as a function of the duration of application (time) expressed in seconds, and the intensity (stress), expressed in Pa, of the shear stress. The percentage of viable cells is expressed after a small number of passages (HEK293T P07, white triangles) or after a higher number of passages (HEK293T P18, black circles).
  • Figure 11 in example 8, represents the state of viability of fibroblast cells after application of shear stresses of variable intensity and duration, according to two series of measurements carried out on the same sample of cells (P06), represented respectively by white triangles and black circles.
  • P06 designates the 6th generation of cell culture passage.
  • Figure 12 in Example 9 represents in three dimensions and on a logarithmic scale the percentage of cell viability as a function of the intensity of a hydrodynamic stress and the residence time.
  • Figure 13 in Example 9 represents in two dimensions the percentage of viability of fibroblasts on the ordinate axis, as a function of the intensity of a hydrodynamic shear stress, on the abscissa axis, and the residence time, represented according to the dot pattern.
  • Figure 14 in Example 9 represents in two dimensions the percentage of cell viability as a function of the intensity of a hydrodynamic stress and the residence time.
  • Figure 15 in Example 10 is a histogram representing cell viability as a function of shear stress intensity, in kPa. For each stress intensity, the viability value was measured after several experiments.
  • Figure 16 in example 10 is a graphical representation of the standard deviation (light bar), the standard error (black bar) and the coefficient of variation (gray bar) of the different measurements, as a function of the intensity of the shear stress, in kPa.
  • Figure 17 in Example 10 is a histogram representing the percentage of cell viability as a function of the intensity of the shear stress, in kPa.
  • Figure 18, in example 11, represents: i) on the left, the percentage of cell viability of different cell types as a function of the intensity of the hydrodynamic stress applied, in kPa, ii) on the right, for each of the cells studied, the percentage of cell viability as a function of the hydrodynamic stress that is applied.
  • Figure 19 in Example 12 represents the percentage of cell viability of the cells as a function of the intensity of the applied shear stress, in kPa.
  • the symbols P07 (round), P08 (square), P09 (triangle) and P10 (star) represent the percentage of cell viability of cells defined according to the number of passages of the cell in culture.
  • Figure 20 in Example 12 represents the percentage of cell viability of the cells as a function of the intensity of the applied shear stress, in kPa.
  • P09, P10 and Pli represent the percentage of cell viability of cells defined according to the number of passages of the cell in culture.
  • Figure 21, in example 13 represents the succession of the same hydrodynamic stress.
  • Figure 22 in Example 13 represents the percentage of cellular viability of the cells as a function of the intensity of the hydrodynamic stress applied, in kPa.
  • Figure 23, in example 13, represents the percentage of cellular viability of the cells as a function of number of cycles of application of the stress, for a stress of 0.2 kPa.
  • Figure 24, in example 14, represents in images the steps of locating and isolating a cell from an original image.
  • Figure 25, in example 15, represents in images the steps of detecting the axes of a cell from an original image.
  • Figure 26, in example 15, represents the deformability of a cell as a function of its initial diameter, under the effect of a shear stress.
  • Figure 27, in example 15, represents the deformability of a cell as a function of its initial diameter, under the effect of mechanical impact stress.
  • Figure 28 in example 16, schematically represents an “autoencoder” type neural network with an example of transformation of an initial image (input) into a final image (output) after processing by this network.
  • Figure 29, in example 16 represents the differences in image processing by the supervised network (U-net) of an initial image preprocessed or not by a non-network.
  • supervised autoencoder
  • line 1 represents the results without application of an autoencoder
  • line 2 represents the results with application of a “variational autoencoder”
  • line 3 represents the results with application of a “denoising autoencoder”.
  • Figures 30 A and 30 B, in example 17, represent the contour results after application of the different neural networks and the associated metrics, then the difference in calculation of deformability compared to a contour made manually (Control at 0 ).
  • Figure 31 in Example 18 represents a classification result of three cells with, from left to right, a necrotic cell, an apoptotic cell and a living cell.
  • Example 1 Materials and methods for the characterization of cells after the application of a physical constraint
  • the AD-MSCs cells are cultured in the culture medium sold under the name MSC-Growth, with a seeding concentration of around 2500 cells per cm 2 .
  • the medium was changed every two days. In order to have a confluence of 70%, the cells spent seven days of incubation in a flask of T175.
  • the fibroblast cells are cultured in the culture medium sold under the name DMEM GLUTAMAX - Gibco, with a seeding concentration of around 5500 cells per cm 2 . In order to have a confluence of 80%, the cells spent seven days of incubation in a flask of T175.
  • the HEK293T cells are cultured in the culture medium sold under the name DMEM GLUTAMAX - Gibco with a seeding concentration of around 12,000 cells per cm 2 .
  • the cells spent four days of incubation in a flask of T175. During the incubation period, the temperature is maintained at 37°C and the CO2 concentration is around 5%.
  • the culture medium was removed.
  • the cells attached to the flask are rinsed with 15 ml of PBS.
  • 5 ml of Trypsin-EDTA 0.5% was added to the flask.
  • the duration of trypsin application was two minutes at 37°C, then 10ml of culture medium containing the serum of fetal calf were added to the flask, in order to stop the reaction.
  • the suspension was placed in a tube and centrifuged at 1200 rpm/210 g for 5 minutes.
  • the fluid was removed and the cells were suspended in a solution of PBS and Ficoll at a concentration of one million per ml.
  • the microfluidic device for shear stress consists of a PDMS microfluidic channel with a diameter of 50 micrometers and a length of 10 cm.
  • the cells were suspended in a fluid (a solution of PBS and Ficoll) whose viscosity was 1.91 mPa.s.
  • the microfluidic device for elongational stress consists of a main microfluidic channel with a diameter of 162 micrometers and a length of 1 cm.
  • the channel section first decreases from 162 to 30 micrometers and then increases from 30 to 162 micrometers. This change in section takes place over a distance of 360 micrometers.
  • the viscosity of the suspending fluid (a solution of PBS and Ficoll with a volumetric consistency of 60% of Ficoll) is 1.91 mPa.s.
  • the cell suspension and the cell-free fluid are injected into the device using syringe pumps and 3 mm diameter PEEK pipes.
  • Cells are injected into the device at a flow rate of between 25 and 800 microliters per minute. Measurements and cell harvesting are performed after hydrodynamic stability within the system has been achieved.
  • the cells After passing through the constraint zone, the cells were harvested.
  • the suspension of the harvested cells is centrifuged to remove the suspending fluid (the Ficoll and PBS solution) and replace it with the marking buffer.
  • the cells are marked with annexin V, a marker for apoptotic cells, or propidium iodide, a marker for necrotic cells.
  • annexin V a marker for apoptotic cells
  • propidium iodide a marker for necrotic cells.
  • a population of 100,000 cells corresponding to each injection rate was suspended in 100 microliters of marking buffer.
  • 2 microliters of annexin V marker and 2 microliters of propidium iodide were added to the buffer.
  • the cell suspension with viability markers was incubated for 15 minutes in a dark place. Then, the cells were centrifuged and rinsed with the labeling buffer.
  • the kit contains the positive hMSC markers: CD90, CD105, CD73 and CD 44 and the negative hMSC markers: CD34, CDllb, CD19, CD45 and HLA-DR.
  • FBS BD Stain Buffer
  • the cells were suspended in 100 microliters of BD Stain Buffer (FBS), then 5 microliters of each positive marker and 20 microliters of each negative marker were added to the buffer. The cell suspension with the markers was incubated for 15 minutes in a dark place. Then, the cells were centrifuged and rinsed with the labeling buffer.
  • the cells are studied by cytometry (FACS Canto II) and characterized according to their state: viable cell, lysis, necrosis, apoptosis or stem character. Each measurement point corresponds to an analysis of at least 50,000 cells.
  • the model is a mathematical expression that makes a relationship between parameters, for example a polynomial expression, a power law, a sum of sines or other 2D or 3D mathematical expressions.
  • a power law of the form y ax k + c which establishes a relationship between x and y.
  • a is a proportionality constant
  • k is the exponent
  • c is the error term.
  • Example 2 Characterization of the viability state of AD-MSCs stem cells after the application of a shear stress
  • AD-MDCs stem cells were cultured then subjected to shear stress of varying intensity and duration. After application of these stresses, the viability state of the cells is characterized as a function of the intensity of the shear stress and the residence time of the cells under stress. The characterization of the physiological state (viable, lysis, necrosis or apoptosis) of the cells was carried out as described in Example 1.
  • AD-MSC mesenchymal stem cells are sensitive to the intensity of the shear stress and the residence time under the stress.
  • AD-MSC cells have a mechanical capacitance against stress of approximately 1000 Pa with a residence time of approximately 0.25 s. Beyond these values, AD-MSC stem cells can no longer withstand the stress and suffer mortality. The mortality pathway by lysis or necrosis is the most present, however the level of apoptosis is negligible in this range of stress and residence times.
  • Example 3 Physiological state of fibroblasts after application of shear stress
  • Fibroblast cells were cultured and then cell samples were subjected to shear stress of varying intensity and duration. After application of these constraints, the character of viability or lysis, necrosis or apoptosis of the cells was determined as described in Example 1.
  • Example 4 State of differentiation of human AD-MSC mesenchymal stem cells after application of shear stress
  • AD-MSC stem cells were cultured as indicated in Example 1.
  • the AD-MSC stem cells were characterized by cytometry to confirm their stem characters before the application of a shear stress of intensity and of varying duration.
  • the cells After passing through the constraint zone, the cells are harvested and resuspended in a DMEM (+) culture medium. The state of differentiation was characterized after their return to culture. Seeding was carried out at 80% of the confluence. After three weeks of incubation, the cells were harvested, labeled using the “BD Human Mesenchymal Stem Cell Analysis Kit (BDB562245)” and analyzed by flow cytometry (FACS Canto II). Each measurement point corresponds to a minimum of 30,000 cells.
  • the characterization was carried out by flow cytometry which here makes it possible to identify the state of the cells after application of the constraint in a binary manner: differentiated or non-differentiated. The cytometer characterization procedure was carried out as indicated in Example 1.
  • Example 5 Viability state of HEK293T cells after application of an elongation stress
  • HEK293T cells were cultured and then cell samples were subjected to elongation stresses of varying intensity and duration. After application of these constraints, the character of viability or lysis, necrosis or apoptosis of the cells was determined as described in Example 1.
  • Example 6 State of viability of fibroblast cells after application of shear stress, as measured by two protocols
  • Cells were harvested after passing through the stress zone. Then they were divided into two batches to be analyzed by cytometry and Trypan Blue. For analysis by cytometry, the batch was marked with the markers Annexin V and propidium iodide. Subsequently, the labeled cells were analyzed by the cytometer. Each measurement point corresponds to a minimum of 50,000 cells. For Trypan Blue analysis, the batch of cells was mixed with Trypan Blue. Three counts on the entire surface of the Malassez slide were carried out. The error bar corresponds to these three counts. The results are presented in Figure 6.
  • Example 7 Viability state of HEK293T cells after application of shear stress
  • HEK293T cells were cultured and then cell samples were subjected to shear stress of varying intensity and duration, as described in Example 1.
  • the HEK293T cells were harvested after passing through the stress zone, then were mixed with Trypan Blue. Three counts on the entire surface of the Malassez slide were carried out. The value corresponds to the average of these three counts.
  • Example 9 Mechanical capacity of cells as a function of stress intensity and residence time under stress
  • Residence time is defined as the period during which cells are exposed to hydrodynamic stress.
  • the stress is maintained at a constant intensity, while the residence time depends on the flow rate and the viscosities in which the cells are suspended. This approach makes it possible to decouple the two parameters and study their effect independently.
  • Fibroblasts were suspended in fluids with a viscosity of 1, 5, 10, 15, or 20 mPa ⁇ s and injected through the microfluidic capillary tube with a flow rate between 117 and 942 ⁇ l/min. This configuration covered the shear stress intensity in a range between 0.16 and 25.59 kPa and a residence time between 12.5 and 100.7 ms.
  • Figure 12 and Figure 13 show a map of the cell viability of fibroblasts as a function of stress intensity and residence time. These two figures represent the same data with a 3D and 2D view and linear and logarithmic scales. The white points are the experimental data and the surface is the mathematical model fit. It is observed that in the indicated ranges, for a given residence time, by increasing the intensity of the stress, cell viability is reduced. However, for a constant stress intensity, cell viability is independent of residence time.
  • Figure 14 depicts fibroblast viability only as a function of stress intensity, while shades of gray identify residence time.
  • the intensity of the stress and the residence time are completely decoupled.
  • MDCK Meth-Darby Canine Kidney
  • AD- MSC Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell
  • WJ-MSC Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells
  • BM-MSC Bone marrow-derived mesenchymal stem cell
  • human dermal fibroblasts Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), Cancer-associated fibroblasts (CAF), Human embryonic kidney 293T cells (HEK293T) and Madin-Darby canine kidney (MDCK).
  • AD- MSC Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell
  • WJ-MSC Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells
  • BM-MSC Bone marrow-derived mesenchymal stem cell
  • human dermal fibroblasts Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), Cancer-associated fibroblasts (CAF), Human embryonic kidney 293T cells (HEK293T) and Madin-Darby canine kidney
  • the cells were suspended in two fluids with a viscosity of 1 and 5 mPa.s and injected through a microfluidic channel of 50 ⁇ m in diameter with a flow rate ranging from 85 to 942 ⁇ l/min and subjected to a stress of shear from 0.11 to 6.4 kPa.
  • the collected cells were labeled with propidium iodide and analyzed by cytometry to quantify the necrotic cell population induced by shear stress.
  • the fibroblast cells were injected without passing through the microfluidic channel and were analyzed by cytometry. .
  • Figure 18 depicts the viability of cell lines after application of shear stress.
  • the points are the experimental data and the lines are the fitting curves.
  • Such a profile of evolution of cell viability can be described as having two phases.
  • cell viability shows a plateau up to a certain shear stress limit, that is, the ability of cells to withstand shear stress.
  • cell viability deteriorates and undergoes a sharp reduction which can reach less than 5% of viable cells.
  • the viability varies by less than 5% compared to the unsheared control cell population.
  • AD-MSC 0.64 kPa
  • WJ-MSC 0, 35 kPa
  • BM-MSC 0.48 kPa
  • fibroblasts 0.64 kPa
  • HUVEC 0.32 kPa
  • HEK293T 0.43 KPa.
  • Example 12 Evolution of mechanical capacity with aging of the cell and incubation time
  • fibroblasts were subcultured (passaged) once a week and subjected to a shear stress. The experiments were continued for four passages, from P07 to P10. Passage is the process of subculture of animal cells, by “P07” we mean the 7th generation of passage of cells in culture. Subcultural practices were strictly identical between the different passages. The viability of fibroblast cells after being subjected to several intensities of shear stress was measured for each passage number by flow cytometry. Cells were suspended in fluids with viscosities of 1 and 5 mPa.s and then exposed to shear stress between 0.159 and 6.14 kPa. The flow rate was in the range of 117 to 942 ul/min for both suspension fluids.
  • Figure 19 shows that sequential subculture practices do not affect the mechanical capacity of fibroblasts to shear stress. In fact, they have a similar mechanical capacity regardless of their number of passages. Up to the shear stress which corresponds to the mechanical capacity of the cell 0.577 kPa, the viability of the fibroblasts is not affected (96%), while the control viability is 97%. In the range from 0.639 kPa to 4.78 kPa, the viability degrades sharply from 92% to 5% and reaches a plateau below 5%.
  • HEK293T cells were subcultured twice per week from passage number P09 to Pli. Therefore, the duration of cell growth alternates between 3 and 4 days between successive subcultures.
  • Cells were suspended in fluids with viscosities of 1 and 5 mPa.s and then exposed to shear stress in the range of 0.11 to 6.4 kPa. The flow rate was in the range of 85 to 942 ul/min for both suspension fluids. Cell viability was analyzed by cytometry.
  • the mechanical capacity of HEK293T cells is affected by varying the incubation period for successive cell subcultures.
  • the incubation period before the application of the constraint and before the measurement is 3 or 4 days.
  • HEK293T having an incubation period of 3 days demonstrates a mechanical capacity of 0.516 kPa, while HEK293T cells having a longer incubation period suffered a weakening of the mechanical capacity which is 0.319 kPa.
  • AD-MSCs cells were suspended in a fluid with a viscosity of 1 mPa.s and exposed to hydrodynamic and repeated stresses.
  • This type of constraint is defined as a succession of the same constraint in a cyclical manner.
  • Figure 21 shows this succession.
  • the cells undergo shear stress, then they enter a no-shear zone and then they are sheared.
  • This cycle was carried out for a batch of cells, with a number of cycles equal to 77, 154, 231, 308, 385 and 462, with a constraint of 0.2 kPa.
  • This stress is lower than the mechanical capacity of the cells, 0.6 kPa, as shown in Figure 22.
  • the cells after being exposed to the different numbers of cycles, were analyzed by a flow cytometer to determine cell viability.
  • Figure 23 represents a cyclic stress below the mechanical capacity of the AD-MSC cell, it does not affect cell viability.
  • the localization and isolation of the cell are carried out using an algorithm from the original images taken by the high-speed camera. They consist firstly of creating a mask to reduce the size of the original image by superposition. Secondly, image processing functions such as erosion and dilation are applied to reduce the background noise of the images and reveal the location of the cell in a more contrasting manner. Then, isolation is carried out by definition of the region of interest (ROI) ( Figure 24).
  • ROI region of interest
  • Example 15 Positioning and measuring the minor and major axes
  • the positioning and measurement of the minor and major axes are carried out using a supervised learning model.
  • the first step consists of applying the supervised model (here U-Net) to the resulting cell photo in Figure 24. This makes it possible to identify the size and shape of the cell.
  • an “edge extraction” type image processing function is carried out in order to position the contour of the cell on the image from Figure 24.
  • the minor and major axes are measured, the major axis being the largest diameter and the minor axis being the smallest diameter.
  • Example 16 Improvement of image quality using an unsupervised model
  • Example 17 Improvement of cell detection and deformability measurements by coupling an unsupervised and supervised model
  • the improvement in the measurement is described by subtracting the deformability measurement compared to a standard manual approach. That is, each image was processed by the user without image processing or application of a learning model.
  • Example 18 Prediction of the physiological state of a cell by a classification model using supervised learning.
  • a supervised learning model can be used to classify the physiological state of the cell by image analysis.
  • the example shows a classification result of 3 cells annotated as necrotic (A), apoptotic (B) and alive (C).

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Abstract

La présente invention a pour objet un dispositif microfluidique et un procédé pour l'application d'au moins une contrainte hydrodynamique d'intensité et du durée déterminée à des cellules en suspension, ladite cellule étant en mouvement dans ledit dispositif, et pour la caractérisation de la morphologie et de l'état physiologique de ces cellules pendant, et optionnellement après, l'application de cette contrainte hydrodynamique.

Description

DESCRIPTION
Titre : DISPOSITIF ET PROCEDE POUR LA CARACTERISATION DE CELLULES SOUMISES A UNE CONTRAINTE PHYSIQUE
Domaine de l'invention
La présente invention a pour objet un dispositif microfluidique et un procédé pour l'application d'au moins une contrainte physique d'intensité et d'une durée déterminée à des cellules en suspension, et pour la caractérisation de l'état morphologique et physiologique des cellules soumises à l'application de cette contrainte physique.
La présente invention se situe donc dans le domaine des dispositifs microfluidiques et de la biologie cellulaire analytique.
Etat de la technique
Les moyens actuellement connus de description et de caractérisation de la morphologie et de la physiologie cellulaire reposent notamment sur l'utilisation de marqueurs cellulaire. La morphologie peut être elle-même utilisée comme un marqueur de l'état physiologique d'une cellule. Ces moyens nécessitent cependant, d'une part, de disposer des marqueurs appropriés et spécifiques d'un état physiologique et, d'autre part, ces méthodes caractérisent uniquement l'état physiologique de la cellule tel qu'observé au moment du marquage.
Par ailleurs, l'efficacité des bioprocédés utilisant des cellules animales, tels que notamment les processus de bioimpression, de bioproduction de cellules pour la thérapie cellulaire, et de procédés mis en œuvre à partir de cellules, tels que la production de protéines thérapeutiques, de vaccins viraux ou de vecteurs viraux, ainsi que tous les processus d'injection ou de prélèvement de cellules, dépendent de la qualité des cellules qui sont utilisées au cours desdits bioprocédés.
La qualité des cellules est en général reliée à des caractéristiques physiologiques telles que la viabilité des cellules, i.e. la proportion de cellules vivantes par rapport aux cellules engagées dans des processus de mort cellulaire (apoptose, nécrose, lyse) ou la fonction des cellules (capacité de sécrétion de molécules, capacité à se différencier en sous-type cellulaire dans le cas de cellules souches). L'efficacité d'un bioprocédé peut donc être fortement impacté par l'altération qu'il produit sur la qualité cellulaire et donc sur la physiologie cellulaire. L'un des mécanismes qui impacte très fortement la qualité, et notamment la viabilité cellulaire, au sein d'un bioprocédé est l'application de contraintes hydrodynamiques et mécaniques générées par les équipements utilisés, tels qu'un bioréacteur, un système mettant en œuvre une seringue d'injection ou de prélèvement, ou encore une étape de séparation. L'interaction entre un fluide suspendant et une paroi crée une contrainte sur les cellules en suspension dans le fluide. Une interaction directe de la cellule avec la paroi produit un impact mécanique sur la cellule. Selon la nature du procédé et des techniques employées, l'intensité et la durée d'une contrainte physique exercée sur une cellule varient très fortement. Par exemple, un procédé de thérapie cellulaire peut générer sur les cellules une contrainte dont l'intensité peut atteindre 5.000 Pa et un procédé de bioimpression peut générer une contrainte dont la durée peut atteindre 30 ms.
Il est donc souhaitable de pouvoir caractériser de façon simple et reproductible l'état physiologique de cellules pendant et/ou après application d'une contrainte physique, notamment via la caractérisation de leur morphologie. En particulier, ce type de caractérisation est souhaitable pour les cellules susceptibles d'être utilisées lors d'un bioprocédé.
Il est en outre souhaitable de caractériser l'état physiologique de cellules au moment où celles-ci sont soumises à des contraintes physiques reproduisant les conditions de contrainte physique appliquées aux cellules au cours d'un bioprocédé particulier.
WO 2015/024690 "Apparatus and method for determining the mechanical properties of cells" a pour objet un procédé et un appareil de détermination des propriétés mécaniques des cellules, et divulgue l'étude de la déformation de cellules soumises à une contrainte de cisaillement. Ce document divulgue un dispositif comprenant un simple canal capillaire dans lequel des cellules en suspension subissent une contrainte de cisaillement et un procédé de mesure de la forme des cellules lors de leur circulation dans le dispositif. Ce procédé met en œuvre des images binarisées. Les mesures se font en temps réel.
EP 3 796 212 "Device for image-based cell classification, method therefor and use thereof' décrit un dispositif de tri des cellules en temps réel et sans marquage. Ce dispositif comprend un réseau microfluidique conduisant à l'alignement de chacune des cellules selon son axe majeur et une unité de classification comprenant un réseau neural qui trie les cellules en fonction des images de celles-ci.
WO 2019/006188 "Quantitative deformability cytometry: rapid, calibrated measurements of cell mechanical properties" décrit un dispositif microfluidique et un procédé de cytométrie de déformabilité quantitative (q— DC) destiné à évaluer quantitativement les propriétés mécaniques intrinsèques de cellules. Les paramètres mécaniques déterminés sont : le module élastique E, la fluidité cellulaire P, le temps de transit TT, le temps de migration Te, la taille des cellules Dceii et l'étirement maximum £max, à un débit de 100 cellules/s. Des outils d'apprentissage automatique sont mis en œuvre. Les cellules sont soumises à des contraintes calibrées de cisaillement.
Il existe donc un besoin de disposer d'un dispositif et d'un procédé permettant de caractériser non seulement les propriétés mécaniques de cellules ayant subi une contrainte physique, mais en outre de caractériser leur morphologie et leur état physiologique.
Il existe donc un besoin de disposer d'un dispositif et d'un procédé capables de générer au moins une contrainte physique telle que générée au cours d'un bioprocédé, dont la nature, l'intensité et la durée sont déterminées et maîtrisées, afin de caractériser les cellules susceptibles de subir lesdites contraintes. Par « contrainte physique » on entend notamment toute force exercée sur les cellules, capables notamment de générer un stress cellulaire ; une telle contrainte physique peut notamment être un impact mécanique ou une contrainte hydrodynamique, telle qu'une contrainte de d'élongation, de compression ou de cisaillement.
Brève description de l'invention
Les inventeurs ont mis au point un dispositif pour l'application d'au moins une contrainte physique d'intensité et de durée déterminées à des cellules en suspension, et pour la caractérisation des cellules ayant subi ladite au moins une contrainte physique.
Plus particulièrement, un dispositif selon l'invention est configuré pour :
- l'application d'au moins une contrainte hydrodynamique d'intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension et en mouvement dans ledit dispositif,
- et pour l'application optionnelle d'au moins un impact mécanique à ladite cellule.
Un dispositif selon l'invention est configuré pour la caractérisation de ladite cellule pendant l'application de ladite contrainte et optionnellement pour la caractérisation de ladite cellule après l'application de ladite contrainte.
Un dispositif selon l'invention comprend, d'une part, un circuit microfluidique pour l'application d'au moins une contrainte physique et, d'autre part, un moyen de caractérisation des cellules.
Dans un dispositif selon l'invention, ladite au moins une contrainte physique est une contrainte choisie parmi les contraintes mécaniques, notamment un impact mécanique, et/ou les contraintes hydrodynamiques, telles qu'une contrainte hydrodynamique de compression, une contrainte hydrodynamique de cisaillement et/ou une contrainte hydrodynamique d'extension. Plus particulièrement, dans un dispositif selon l'invention, ladite au moins une contrainte physique est une contrainte choisie parmi les contraintes hydrodynamiques.
Dans un dispositif selon l'invention, ledit moyen de caractérisation des cellules est choisi parmi tous les moyens techniques connus d'observation des cellules, notamment les moyens d'imagerie ou de cytométrie. Plus particulièrement, dans un dispositif selon l'invention, ledit moyen de caractérisation des cellules pendant l'application de la contrainte est choisi parmi tous les moyens techniques connus d'observation des cellules, notamment les moyens d'imagerie ou de cytométrie.
Un dispositif selon l'invention comprend un circuit microfluidique comprenant au moins un segment configuré pour l'application aux cellules en suspension d'au moins une contrainte physique, plus particulièrement une contrainte hydrodynamique, ce segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d'un fluide contenant ladite cellule en suspension, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l'intérieur dudit canal.
L'invention a donc pour premier objet un dispositif pour l'application d'au moins une contrainte physique, plus particulièrement au moins une contrainte hydrodynamique, d'intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après ladite application, plus particulièrement pendant et optionnellement après ladite application.
L'invention a pour deuxième objet un procédé pour l'application d'au moins une contrainte physique, plus particulièrement au moins une contrainte hydrodynamique, d'intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après ladite application, plus particulièrement pendant et optionnellement après ladite application.
L'invention a également pour objet un modèle de classification, préalablement entraîné sur un jeu de données d'apprentissage, pour caractériser une cellule et prédire son état physiologique pendant et/ou après l'application d'au moins une contrainte physique, selon un dispositif et un procédé selon l'invention. Un tel modèle de classification permet un gain de temps, d'argent et de performance (notamment permet un grand nombre de caractérisation de cellules pendant un laps de temps réduit) au regard des outils existant sur le marché.
L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'un dispositif, d'un procédé ou d'un modèle de classification selon l'invention, pour caractériser une cellule et éventuellement prédire son état physiologique pendant et/ou après l'application d'au moins une contrainte physique.
Un dispositif et un procédé selon l'invention présentent l'avantage de générer au moins une contrainte physique, dont la nature, l'intensité et la durée sont précisément déterminées et maîtrisées, afin de caractériser les cellules ayant subi lesdites contraintes.
Un dispositif et un procédé selon l'invention présentent l'avantage de permettre l'application d'une séquence modulable d'au moins une contrainte physique, notamment la répétition d'une même contrainte et/ou la combinaison de contraintes physiques de nature différente, l'intensité et la durée de chacune étant précisément définies. Il est donc possible grâce à cet outil simple et précis de reproduire les contraintes appliquées lors d'un bioprocédé et de suivre à haute cadence l'état d'au moins une cellule.
Un dispositif et un procédé selon l'invention présentent aussi l'avantage de permettre de prédire l'état physiologique de cellules pendant et/ou après que celles-ci ont été soumises à des contraintes physiques. Cette prédiction peut être réalisée pendant et jusqu'à plusieurs jours après l'application de ces contraintes physiques.
Enfin, un dispositif et un procédé selon l'invention présentent l'avantage de définir la capacité d'une cellule à subir l'application d'au moins une contrainte physique déterminée tout en conservant une morphologie et un état physiologique compatibles avec les exigences dudit bioprocédé. Il est en effet possible grâce à un dispositif et un procédé selon l'invention de définir, pour des cellules données, une cartographie de ses capacités de résistance à au moins une contrainte physique.
Par « capacitance », on entend la capacité d'une cellule à subir au moins une contrainte physique d'intensité et de durée déterminée, sans modification de son état physiologique. Par « modification de son état physiologique » on entend notamment une différentiation, ou le passage d'un état viable à un état de lyse, de nécrose, ou d'apoptose.
L'utilisation d'un dispositif et d'un procédé selon l'invention permet en particulier d'optimiser les bioprocédés, et notamment les contraintes physiques associées, afin de définir les conditions opératoires optimales et d'adapter lesdites contraintes aux cellules d'intérêt. Ces conditions par exemple se focalisent sur les paramètres du bioprocédé (température, débit, vitesse de rotation), sur le fluide suspendant (viscosité, osmolarité). Il est en effet souhaitable d'optimiser les contraintes associées aux bioprocédés, afin d'adapter lesdites contraintes aux données obtenues lors de la caractérisation et de la prédiction de l'état physiologique de cellules soumises à ces contraintes physiques.
Description détaillée de l'invention Selon un premier objet, l'invention concerne un dispositif pour l'application d'au moins une contrainte physique, plus particulièrement au moins une contrainte hydrodynamique, à au moins une cellule en suspension et pour la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après ladite application, le dispositif comprenant :
- un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d'un fluide contenant ladite cellule en suspension, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l'intérieur dudit canal, et
- un moyen de caractérisation de ladite cellule ; ledit dispositif selon l'invention étant caractérisé en ce que ledit au moins un segment est configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte physique choisie parmi :
- un impact mécanique,
- une contrainte hydrodynamique de compression,
- une contrainte hydrodynamique de cisaillement et
- une contrainte hydrodynamique d'extension.
Dans l'exposé de la présente invention, le terme « pour » comme notamment dans l'expression « pour l'application d'une contrainte physique » signifie « configuré pour l'application d'une contrainte physique ». Lorsqu'un intervalle ou une plage de valeurs est indiqué, les bornes citées sont considérées comme faisant partie de ladite plage de valeurs.
Par « circuit microfluidique » on entend un circuit destiné à manipuler de petits volumes de fluides (10‘18 à 10’3 litres) dans des canaux dont le diamètre est compris entre 5 pm et 3000 pm.
Par « fluide » on entend un milieu déformable adapté à la circulation dans un dispositif selon l'invention et à la suspension cellulaire.
De préférence, dans un dispositif selon l'invention, ledit fluide est choisi parmi les fluides newtoniens, c'est-à-dire dont la viscosité ne varie pas en fonction de la contrainte de cisaillement. Ledit fluide possède au moins l'une des propriétés suivantes :
- sa viscosité newtonienne comprise entre 1 et 1000 mPa.s, de préférence entre 1 et 100 mPa.s,
- son indice de pseudo plasticité est compris entre 0 et 1, et est de préférence de 1 mPa.s,
- il est compatible avec la survie des cellules en conditions non contraintes, son osmolarité est comprise entre 250 et 410 mOsmol,
- son pH est physiologique dans des conditions de manipulation à l'air ambiant, ledit pH est donc compris entre 6,5 et 7,8 et
- il comprend des éléments nutritifs assimilables par les cellules en suspension, tels que notamment le glucose, la glutamine ou une composition nutritive telle qu'un milieu de culture.
Plus particulièrement, dans un dispositif et un procédé selon l'invention, le fluide pour la suspension cellulaire est choisi de préférence parmi les fluides newtoniens, et notamment parmi :
- les tampons physiologiques, habituellement utilisés pour la mise en suspension de cellules, tels que notamment PBS, HBSS ; ces tampons sont éventuellement additionnés de composés nutritifs tels qu'une solution de glucose 0,5 à 6 g/l et une solution de glutamine 2 à 4 mM,
- les milieux de culture cellulaire, tels que notamment DMEM, EMEM, alpha-MEM,
- Les solutions de séparation cellulaire, tels que notamment Ficoll et solution de sucrose,
- Les solutions de polymère à faible masse molaire.
Lors de l'application de ladite au moins une contrainte physique, la concentration cellulaire est de préférence inférieure à 100 millions de cellules par mL, de préférence entre 0,01 et 10 millions de cellules par mL. En d'autres termes, le volume cellulaire représente de préférence au plus 30 % du volume total du fluide de suspension.
Dans un dispositif selon l'invention, la circulation du fluide de référence et du fluide dans lequel les cellules sont en suspension est réalisée en un écoulement stable et sans pulsation. Ledit dispositif est donc configuré pour l'application d'au moins une contrainte à au moins une cellule en suspension et en mouvement dans ledit dispositif. Le dispositif est de préférence conçu afin de conduire les cellules vers une puce microfluidique poursuivant une ligne de courant définie.
Dans un dispositif et un procédé selon l'invention, l'intensité de la contrainte, également désigné par l'expression « niveau de contrainte » ou « stress » dans les figures, et le temps de séjour sous contrainte, également désigné par « durée d'application de la contrainte » ou « temps » dans les figures, ont lieu de façon contrôlée. La capture et la libération des cellules en suspension ont également lieu de façon contrôlée.
La ou les pompes contrôlent le débit et la configuration de l'écoulement. Les pompes sont de préférence des pompes à ultra haute pression, jusqu'à 1.37xl05 kPa.
La circulation d'un fluide au sein d'un dispositif selon l'invention est initiée et maintenue au moyen de tout appareil adapté à cet effet bien connu d'une personne du métier, tel qu'une pompe. Dans un dispositif selon l'invention, la section des canaux peut être constante ou variable, cette section peut aussi être conique, par exemple sous la forme de buses. La présence d'une section conique, croissante ou décroissante, à l'extrémité d'un canal impose aux cellules une contrainte supplémentaire de capture et de libération contrôlée.
Lors de la mise en circulation dans le circuit microfluidique d'un fluide comprenant les cellules en suspension, des lignes de courants sont générées et permettent le contrôle de la trajectoire des cellules. Les cellules à caractériser sont positionnées sur l'une des lignes de courant permettant le contrôle de l'intensité de contrainte.
Le diamètre préférentiel du canal principal est compris entre 10 et 3000 pm.
Les canaux sont constitués d'un matériau adapté à la circulation d'un fluide soumis à une pression comprise entre 10‘3 et 106 kPa, et de préférence entre 1 et 104 kPa, et/ou d'un matériau adapté pour la circulation d'un fluide dont la viscosité est comprise entre 1 et 2000 mPa.s.
La capacitance de cellules dépend de leur origine (clone, espèce, organe), de leur mode de culture (nombre de doublement en culture, milieu de culture, condition environnementale de la culture, i.e. agitation ou non, température, pH) et de leur mode de collecte (trypsination, récolte mécanique). Par exemple, le mode de culture des cellules, notamment en 2D ou 3D, leur culture sous forme adhérente ou en suspension et la nature du milieu de culture utilisé influencent la capacitance des cellules
Dans un dispositif selon l'invention, selon un mode de réalisation particulier, le circuit microfluidique est constitué par un ensemble de canaux constitués par un matériau approprié, notamment choisi parmi les suivants PEEK (PolyEtherEtherCetone), PVC (PolyChlorure de Vinyle), PTFE (PolyTetraFluoroEthene), FEP (Fluorinated ethylene polypropylene), PDMS (PolyDimethylSiloxane) ou l'acier. Selon un autre mode de réalisation, le circuit microfluidique est constitué par une puce microfluidique constituée en un matériau choisi parmi : le PDMS, le polyacrylate, le SEBS (StyreneEthyleneButyleneStyrene) le verre, le polycarbonate ou céramique.
Un dispositif selon l'invention peut comprendre, selon des modes de réalisation particuliers, des canaux disposés en série et/ou des canaux disposés en parallèle.
La circulation de fluide dans un dispositif selon l'invention est caractérisée par au moins un des paramètres suivants :
- un débit de circulation du fluide, dans le canal considéré pour la caractérisation de la contrainte physique appliquée aux cellules, compris entre 0 et 5 ml/min, de préférence entre 0 et 1 ml/min et/ou - une vitesse de circulation du fluide comprise entre 5 pm/s et 300 m/s, et/ou
- un débit de cellules analysées qui peut être supérieur à 1000 cellules / minutes lorsque l'analyse est réalisée avec un logiciel.
La durée totale de présence des cellules dans ledit canal est comprise de préférence entre 1 ps et 10000 s, de préférence entre 1 ps et 100 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence entre 10 ps et 100 ms.
Par « cellule en suspension » on entend tout type de cellule, animale ou végétale, procaryote ou eucaryote. En effet, selon le diamètre des canaux et le grossissement de l'objectif permettant l'analyse d'image, un dispositif selon l'invention permet de caractériser par exemple des cellules de bactéries, d'algues ou de champignons.
L'invention a particulièrement pour objet un dispositif pour l'application d'au moins une contrainte physique et la caractérisation d'au moins une cellule en suspension pour au moins un des aspects suivants :
- la taille de la cellule,
- la forme de la cellule, notamment la sphéricité de la cellule
- l'aspect de la membrane externe,
- l'aspect du cytoplasme, notamment sa granulosité
- la présence d'au moins un marqueur à la surface de la cellule,
- le contenu protéique de la cellule et
- le contenu en acides nucléiques de la cellule, notamment la quantité d'ADN, la quantité d'ARN, la séquence nucléotidique d'un ou plusieurs acides nucléiques, qu'il s'agisse d'ADN ou d'ARN.
Par « caractérisation de la cellule » on entend la définition d'au moins une caractéristique de ladite cellule. Dans le cas ou plus d'une caractéristique cellulaire est définie, la caractérisation de ladite cellule comprend la définition de la combinaison desdites caractéristiques.
La caractérisation des cellules conduit à la détermination de l'état physiologique des cellules pendant ou après l'application de ladite au moins une contrainte. La physiologie étudie le rôle, le fonctionnement et l’organisation mécanique, physique et biochimique des cellules et de leurs composants, notamment les organites cellulaires. La physiologie étudie également les interactions entre une cellule et son environnement. La détermination de l'état physiologique des cellules comprend notamment l'état de différenciation et/ou la détermination des fonctions de nutrition ; de prolifération et de relation, telles que la mobilité et les fonctions sensorielles. Cet état physiologique est de préférence choisi parmi les suivants : cellule vivante, cellule morte, cellule lysée, cellule nécrotique, cellule apoptotique, cellule différentiée ou cellule non différentiée, cellule pathologique ou cellule saine.
La relation entre l'état physiologique et les différents aspects de la caractérisation sont connus de l'homme du métier.
L'état physiologique des cellules après l'application d'au moins une contrainte physique peut en outre être comparé à l'état physiologique des cellules avant l'application de ladite contrainte physique.
Au sens de la présente invention, la capacité des cellules à subir au moins une contrainte physique d'intensité et de durée déterminée tout en conservant un état physiologique compatible avec une utilisation ultérieure est définie comme la « capacitance » des cellules.
Selon un aspect particulier, l'invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte physique de compression, ledit dispositif comprenant au moins un segment de type (A) comprenant, ou constitué par, un premier canal rejoint, au même niveau, par deux canaux, chacun faisant un angle compris entre 30 et 150 degrés avec ledit premier canal, cet angle est aussi désigné « angle de flow focusing », ou angle de focalisation de flux.
Par « contrainte hydrodynamique de compression » on entend l'application de forces équilibrées vers l'intérieur des cellules, cette contrainte est aussi désignée par « Flow focusing ». Dans un dispositif et un procédé selon l'invention, l'intensité de la contrainte de compression appliquée aux cellules est comprise entre 10‘3 et 103 kPa, de préférence entre 10‘3 et 102 kPa, de préférence entre 10‘3 et 10 kPa. La Figure 1 représente schématiquement un exemple de segment de type A.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte hydrodynamique de cisaillement, ledit dispositif comprenant au moins un segment de type B comprenant, ou constitué par, un canal de diamètre compris entre 10 et 2000 pm, de préférence entre 20 et 200 pm.
Par « contrainte hydrodynamique de cisaillement » on entend une contrainte mécanique appliquée de manière parallèle ou tangentielle à la face d'un matériau. Dans un dispositif et un procédé selon l'invention, l'intensité de la contrainte de cisaillement appliquée aux cellules est comprise entre 10‘3 et 105 kPa, de préférence entre 10‘3 et 104 kPa, de préférence entre 0,1 et 103 kPa. Une contrainte hydrodynamique de cisaillement est appliquée notamment lors de la circulation des cellules dans un canal capillaire, dont le diamètre est de préférence compris entre 10 et 2000 pm, de préférence entre 20 et 200 pm. La Figure 1 représente schématiquement un exemple de segment de type B.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte physique d'extension, ledit dispositif comprenant au moins un segment de type C comprenant, ou constitué par, i) un canal de section croissante ou décroissante ou ii) un premier canal rejoint par un second dans lequel la circulation du fluide s'effectue dans un sens différent, de préférence opposé, à celui du premier canal.
Par « contrainte hydrodynamique d'extension » on entend l'application de forces équilibrées vers l'extérieur des cellules, ou une contrainte d'élongation. Dans un dispositif et un procédé selon l'invention, l'intensité de la contrainte d'extension appliquée aux cellules est comprise entre 10‘3 et 103 kPa, de préférence entre 10‘3 et 102 kPa, de préférence entre 10‘3 et 10 kPa. La Figure 1 représente schématiquement un exemple de segment de type C.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins un impact mécanique, ledit dispositif comprenant au moins un segment de type D comprenant, ou constitué par, un premier canal au sein duquel la ligne de trajet des cellules rencontre un obstacle, tel que notamment la paroi d'un second canal. La Figure 1 représente schématiquement un exemple de segment de type D.
Par « impact mécanique » on entend tout type de choc mécanique, tel que par exemple un choc à la rencontre d'une paroi ou une collision inertielle à la surface. Dans un dispositif et un procédé selon l'invention, l'intensité de l'impact mécanique appliqué aux cellules est comprise entre 1 et 300 m/s, de préférence entre 1 et 100 m/s, de préférence entre 1 et 10 m/s. La durée du temps d'impact est de préférence inférieure à 1 ps.
Plus particulièrement, un dispositif selon l'invention pour l'application d'au moins une contrainte physique et la caractérisation d'au moins une cellule en suspension, comprend un circuit microfluidique comprenant ou consistant en :
- au moins un segment de type A, et/ou
- au moins un segment de type B, et/ou
- au moins un segment de type C, et/ou - au moins un segment de type D, lesdits segments étant combinés entre eux.
Encore plus particulièrement, un dispositif selon l'invention pour l'application d'au moins une contrainte physique et la caractérisation d'au moins une cellule en suspension, comprend un circuit microfluidique comprenant ou consistant en :
- au moins un segment de type A, et/ou
- au moins un segment de type B, et/ou
- au moins un segment de type C,
- et optionnellement au moins un segment de type D, lesdits segments étant combinés entre eux.
Un dispositif selon l'invention est notamment conçu pour l'application d'une séquence comprenant une ou plusieurs itérations d'une contrainte physique de même nature, à une fréquence et une intensité déterminées, et/ou pour l'application d'une séquence de plusieurs contraintes physiques de nature différente, à une fréquence et une intensité déterminées.
Par « application d'au moins une contrainte physique d'intensité et de durée déterminées » on entend :
- au moins une application d'une contrainte physique particulière d'intensité et de durée déterminées, optionnellement suivie de l'application d'une, deux, trois quatre ou davantage répétitions de l'application de ladite contrainte physique particulière, et/ou
- au moins une application d'une séquence d'au moins deux contraintes physiques particulières d'intensité et de durée déterminées, optionnellement suivie de l'application d'une, deux, trois quatre ou davantage séquences d'au moins deux contraintes physiques, et/ou
- l'application de tout type de séquence de contrainte physique telles que décrites dans la présente demande.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une séquence comprenant, ou consistant en, au moins deux contraintes physiques successives de nature différente. La séquence pouvant être répétée une, deux, trois fois ou plus.
Selon un autre aspect particulier, l'invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une séquence comprenant, ou consistant en, au moins deux contraintes physiques successives de même nature. Selon cet aspect particulier, le dispositif est configuré pour l'application à ladite cellule d'une contrainte physique répétée au moins 1 fois, au moins deux fois, au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 fois, ou même davantage.
Un exemple de ce mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention est schématisé par la Figure 2, qui représente un dispositif conçu pour l'application aux cellules d'un grand nombre de contraintes de compression, séparées par des segments conçus pour que les cellules ne subissent pas de contrainte. Ces séquences de contraintes physiques peuvent être considérées comme équivalentes à l'application d'une déformation dynamique des cellules. Il s'agit de répétitions d'une même séquence de contrainte.
Plus particulièrement, un dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que l'intensité totale de ladite au moins une contrainte physique appliquée à la cellule est comprise entre 10‘3 kPa et 105 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 104 kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103 kPa, de préférence entre 1 kPa et 102 kPa.
Plus particulièrement, par ailleurs, un dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que la durée totale de l'application de ladite au moins une contrainte physique est comprise entre 1 ps et 10000 s, de préférence 1 ps et 100 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence 10 ps et 100 ms.
Dans un dispositif microfluidique selon l'invention, la caractérisation de ladite au moins une cellule en suspension est réalisée pendant l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte physique et/ou après l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte physique. Selon un premier mode de réalisation, la caractérisation de ladite au moins une cellule en suspension est réalisée pendant l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte physique.
Selon un autre mode de réalisation, un dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que la caractérisation de ladite cellule a lieu après l'application de ladite au moins une contrainte, cette caractérisation est réalisée pendant une période comprise entre 0 et 120 jours, de préférence entre 0 et 30 jours, de préférence entre 0 et 1 jour après l'application de ladite au moins une contrainte physique.
Plus particulièrement, un dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que la caractérisation de ladite cellule après l'application de ladite au moins une contrainte comprend, ou consiste en, au moins une caractérisation ponctuelle ou au moins une caractérisation réalisée pendant une durée comprise entre 1 ps et 10000 s, de préférence 1 ps et 100 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence 10 ps et 100 ms.
Plus particulièrement, un dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que le moyen de caractérisation de ladite au moins une cellule est choisi parmi : un cytomètre, un microscope, un moyen d'analyse du contenu protéique de la cellule, un moyen d'analyse et de séquençage des acides nucléiques de ladite cellule, et un moyen de capture d'image et/ou de signal électrique, combiné avec un moyen d'analyse de signal. Par exemple, un dispositif selon l'invention peut comporter une microélectrode ou une photodiode.
Plus particulièrement, un dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que ledit moyen d'analyse de signal et/ou d'image comprend, ou est constitué par, une unité centrale informatique comprenant un moyen logiciel adapté pour l'analyse de signal et/ou d'image.
Encore plus particulièrement, un dispositif selon l'invention comprenant un moyen d'analyse de signal et/ou d'image comprend en outre un premier et/ou un second modèle de classification. La présence d'au moins un premier et/ou un second modèle de classification présente l'avantage d'accélérer le processus d'analyse des images et de permettre une analyse en temps réel.
Par « modèle de classification » on entend un algorithme d'apprentissage automatique préalablement entraîné, en particulier lors d'un apprentissage supervisé, ainsi qu'un jeu de données d'apprentissage, permettant l'entraînement dudit algorithme, et un jeu de données d'évaluation. Un modèle de classification peut consister en un programme d'ordinateur, ledit programme d'ordinateur pouvant être écrit en tout langage informatique adapté, connu d'une personne du métier. Ledit programme d'ordinateur est susceptible d'être mis en œuvre sur un ordinateur pour générer un résultat technique. Des exemples de ces résultats techniques sont décrits ci-après.
Le jeu de données d'apprentissage peut comprendre un jeu d'entraînement et un jeu de test du modèle. Le modèle peut être ainsi testé sur la base de test et le jeu de test peut être utilisé pour déterminer si l'apprentissage du modèle est satisfaisant ou non. Le jeu d'entraînement et le jeu de test peuvent être différents. Alternativement, le jeu de test peut correspondre à une partie du jeu d'entraînement.
Encore plus particulièrement, un dispositif selon l'invention comprenant un moyen d'analyse d'image comprend en outre un premier modèle de classification, préalablement entraîné avec un jeu de données d'apprentissage, et comprenant un algorithme d'apprentissage automatique supervisé, non-supervisé ou semi-supervisé. Ledit premier modèle de classification est adapté pour la prédiction de l'état physiologique d'une cellule donnée à partir d'au moins une caractéristique de ladite cellule. Dans le cas du premier modèle de classification, selon un mode de réalisation particulier, les données d'entrée sont des images avec objets. Les données de sortie sont des objets avec une étiquette : un pourcentage d'appartenance à une classe précise. L'algorithme d'entraînement comprend au moins 10 epochs, le calcul de perte est l'entropie croisée et l'optimiseur est Adam (descente de gradient améliorée). Le modèle est du transfert learning avec YOLO, la nature du réseau est un modèle supervisé (1733 images de cellules / 1733 annotations). Le modèle comprend de préférence 106 couches convolutives. Les fonctions réalisées dans un neurone sont : convolution, addition, softmax, « up sampling ». Des connexions neurones/couches sont réalisées. Le jeu de données d'apprentissage peut comprendre une multitude de couples de données, chacun des couples de données comprenant une première donnée représentant au moins une caractéristique de ladite cellule et une deuxième donnée représentant un état physiologique de ladite cellule.
Le jeu de données d'apprentissage peut être préalablement constitué à partir de données obtenues en laboratoire par analyse de caractéristiques de cellules dont l'état physiologique a été déterminé.
Ledit premier modèle de classification peut notamment être mis en œuvre sur un ordinateur pour générer un résultat technique consistant, par exemple en une classification d'une cellule en fonction de ses caractéristiques.
Ledit premier modèle de classification permet de générer un diagramme en trois dimensions, représentant, par exemple, pour une cellule donnée :
- l'intensité de la contrainte physique appliqué aux cellules, exprimé en Pa,
- la durée d'application de la contrainte physique appliqué aux cellules, ou temps de séjour, ou « temps », exprimé en s,
- l'état physiologique des cellules, c'est-à-dire la viabilité cellulaire, la nécrose, l'apoptose ou la lyse, exprimées en pourcentage, ou bien le caractère différencié ou non différencié.
On estime que le premier modèle de classification a atteint un niveau d'apprentissage satisfaisant sur l'ensemble des profils du jeu de test si la classification atteint notamment un Fl score minimum de 70%.
Encore plus particulièrement, lorsqu'un dispositif selon l'invention comprend un moyen d'analyse d'image, le ledit moyen d'analyse d'image comprend en outre un deuxième modèle de classification, préalablement entraîné avec un jeu de données d'apprentissage, et comprenant un algorithme d'apprentissage automatique supervisé, non-supervisé ou semi-supervisé, ledit deuxième modèle de classification étant adapté pour la détection et le suivi de la déformation d'une cellule donnée, en réponse à au moins une contrainte physique.
Ledit premier modèle de classification peut notamment être mis en œuvre sur un ordinateur pour générer un résultat technique consistant, par exemple en un suivi de l'évolution morphologique d'une cellule selon différentes applications de contraintes physiques.
De préférence, ledit deuxième modèle de classification utilise au moins un réseau neuronal dont les fonctions sont les suivantes : i) Localiser et isoler la cellule de ladite image ii) Valider la présence d'une seule cellule iii) Améliorer la qualité de l'image puis traiter l'image par application d'un masque sur la cellule et en déterminer son contour, iv) positionner et mesurer l'axe majeur et mineur de l'ellipse décrivant le contour de la cellule. La déformation étant définie comme le rapport entre l'axe majeur et l'axe mineur.
Selon un mode de réalisation particulier, le second modèle de classification comprend : données d'entrée 440 images de cellules découpées et ajustées en niveau de gris, données de sortie : masque binaire de segmentation. Les données d'entraînement comprennent 420 images d'entraînement. Pour l'algorithme d'entraînement au moins 10 epochs sont nécessaires, le calcul de perte est l'entropie croisée et l'optimiseur est Adam (descente de gradient améliorée). La nature du réseau est U-Net. Le nombre de couche est : 5 couches de contraction, 5 couches d'expansion, soit 10 au total. Les fonctions réalisées dans un neurone sont : convolution 2D entre image et filtre, c'est-à-dire compresser l'image, extraire le vecteur caractéristique qui contient l'objet d'intérêt et décompresser l'image. Les connections neurones/couches se caractérisent en ce que les couches sont composées de deux convolutions suivies toutes deux de fonctions d'activation (ReLU).
Un exemple de localisation et d'isolement d'une cellule est représenté en Figure 3. Un exemple de positionnement et de mesure de l'axe majeur et de l'axe mineur de l'ellipse est représenté en Figure 4.
On estime que ledit deuxième modèle de classification a atteint un niveau d'apprentissage satisfaisant sur l'ensemble des profils du jeu de test si la classification atteint notamment un Fl score minimum de 65%, de préférence au moins 80 %.
Selon un deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour l'application d'au moins une contrainte physique d'intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule après ladite application, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) le dépôt et la mise en circulation d'un fluide contenant ladite au moins une cellule en suspension dans un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d'un fluide contenant ladite cellule, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l'intérieur dudit canal, et b) la caractérisation de ladite cellule après l'application de ladite au moins une contrainte, un procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit au moins un segment est configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte physique choisie parmi :
- un impact mécanique,
- une contrainte hydrodynamique de compression,
- une contrainte hydrodynamique de cisaillement et
- une contrainte hydrodynamique d'extension.
Un procédé selon l'invention concerne particulièrement l'application d'une contrainte physique et la caractérisation d'au moins une cellule en suspension, ladite caractérisation concerne au moins un des aspects suivants : la taille, la forme, l'aspect de la membrane externe, l'aspect du cytoplasme, la présence d'au moins un marqueur à la surface de la cellule, le contenu protéique de la cellule et le contenu en acides nucléiques de la cellule.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé selon l'invention comprenant l'application d'au moins une contrainte physique à au moins une cellule en suspension, ladite contrainte physique étant caractérisée en ce que la cellule est soumise à :
- au moins un impact mécanique d'intensité comprise entre 1 et 300 m/s de préférence entre 1 et 100 m/s, de préférence entre 1 et 10 m/s et/ou pendant une durée de moins de 1 ps et/ou
- au moins une contrainte de cisaillement d'intensité comprise entre 10‘3 kPa et 105 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 104 kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103 kPa, de préférence entre 1 kPa et 102 kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 ps et 10.000 s, de préférence entre 1 ps et 100 s, de préférence entre 10 ps et 1 s, et/ou
- au moins une contrainte de compression d'intensité comprise entre 10‘3 kPa et 105 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 104 kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103 kPa, de préférence entre 1 kPa et 102 kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 ps et 10 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence entre 10 ps et 10 ms et/ou
- au moins une contrainte d'extension d'intensité comprise entre 10‘3 kPa et 105 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 104 kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103 kPa, de préférence entre 1 kPa et 102 kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 ps et 10 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence entre 10 ps et 10 ms.
Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, les paramètres i) de débit de fluide et ii) de la viscosité du fluide sont choisis afin de reproduire les intensités de contrainte et le temps de séjour reproduisant les contraintes qui sont ressenties par les cellules lors d'un bioprocédé particulier. Lors de la circulation du fluide dans le dispositif, une ligne de courant est générée. Lors de la circulation du fluide dans le dispositif, la cellule suit la ligne de courant développée par le mouvement du fluide et son interaction avec la géométrie du canal. En calculant ou mesurant la contrainte hydrodynamique sur cette ligne et la vitesse de mouvement de la cellule, on peut déduire la contrainte et le temps de séjour pour la cellule.
De préférence, dans un procédé selon l'invention, le débit de fluide est compris entre 10‘3 et 10 ml/min, de préférence entre 10‘3 et 1 ml/min. De préférence, dans un procédé selon l'invention, le temps de séjour des cellules est compris entre 1 ps et 10.000 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence entre 10 ps et 100 ms.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé selon l'invention comprenant l'application d'au moins une contrainte physique à au moins une cellule en suspension, puis la caractérisation de ladite cellule, le procédé comprenant en outre une étape de prédiction de l'état physiologique d'une cellule par un premier modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l'étape b).
Plus particulièrement, l'invention a également pour objet un procédé selon l'invention comprenant l'application d'au moins une contrainte physique à au moins une cellule en suspension, puis la caractérisation de ladite cellule, le procédé comprenant en outre une étape de prédiction de l'état physiologique d'une cellule par un premier modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l'étape b), ledit premier modèle de classification comprenant : un algorithme d'apprentissage automatique, un réseau neuronal à apprentissage supervisé, semi- supervisé ou non-supervisé, préalablement entraîné avec un jeu de données d'apprentissage.
Plus particulièrement, l'invention a également pour objet un procédé selon l'invention comprenant en outre une étape de suivi de la déformation d'une cellule à différents instants de son séjour dans ledit canal microfluidique, par un deuxième modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l'étape b). Selon un troisième aspect, l'invention a également pour objet un modèle de classification, préalablement entraîné sur un jeu de données d'apprentissage pour prédire, dans un procédé selon l'invention, un état physiologique d'une cellule après l'application d'au moins une contrainte physique.
Selon un quatrième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'un dispositif ou d'un procédé selon l'invention, ou d'un modèle de classification selon l'invention pour la caractérisation de cellules de type suivant : cellule procaryote, cellule eucaryote, cellule animale, cellule végétale, cellule humaine, cellule souche, cellule épithéliale, fibroblaste, cellule sanguine, cellule génétiquement modifiée ou mime cellulaire synthétique.
Plus particulièrement selon ce quatrième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'un dispositif ou d'un procédé selon l'invention, ou d'un modèle de classification selon l'invention pour la détermination de la « capacitance » d'une cellule.
Encore plus particulièrement selon ce quatrième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'un dispositif ou d'un procédé selon l'invention, ou d'un modèle de classification selon l'invention pour la définition d'au moins un paramètre d'un bioprocédé.
Encore plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation d'un dispositif ou d'un procédé selon l'invention, ou d'un modèle de classification selon l'invention pour la définition d'au moins un paramètre d'un bioprocédé choisi parmi : la bioimpression, la thérapie cellulaire et la bioproduction.
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l'invention et non pour en limiter la portée. On pourra notamment imaginer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection des caractéristiques décrites par la suite, isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à de l'état de la technique antérieur.
Figures
La Figure 1 est une représentation schématique d'exemples de segments A, B, C et D.
La Figure 2 est une représentation schématique d'un exemple de dispositif dans lequel plusieurs types de contraintes physiques sont appliquées aux cellules, ici un enchainement de contraintes de cisaillement et d'élongation. Le graphe du bas représente un grossissement du graphe du haut. La cellule subit une contrainte répétée. Ce type de contrainte peut également être défini comme une déformation dynamique, ou une déformation oscillatoire.
La Figure 3 représente les étapes d'isolement d'une cellule.
La Figure 4 représente la mesure de l'axe mineur et de l'axe majeur de l'ellipse.
La Figure 5, dans l'exemple 2, représente l'état de viabilité de cellules souches mésenchymateuses humaines AD-MSC après application de contraintes de cisaillement d'intensité et de durée variables. Le pourcentage de cellules dans un état physiologique particulier est donné en fonction de la durée d'application (temps) exprimée en secondes et de l'intensité (contrainte) exprimée en Pa, de la contrainte de cisaillement. La figure 5 représente ainsi le pourcentage de cellules viables (cadre A), cellules lysées (cadre B), cellules nécrosées (cadre C) et cellules en apoptose (cadre D).
La Figure 6, dans l'exemple 3, représente l'état de viabilité de cellules fibroblastes après application d'une contrainte de cisaillement. Les fibroblastes sont caractérisés après l'application de contraintes de cisaillement d'intensité et de durée variables. Le pourcentage de cellules dans un état physiologique particulier est donné en fonction de la durée d'application (temps), exprimée en secondes, et de l'intensité (contrainte), exprimée en Pa, de la contrainte de cisaillement. La figure 6 représente ainsi le pourcentage de cellules viables (cadre A), lysées (cadre B), nécrosées (cadre C) ou en apoptose (cadre D).
La Figure 7, dans l'exemple 4, représente la proportion de cellules souches AD-MSC non- différentiées (cercle blanc) et de cellules différenciées (cercle noir) après application d'une contrainte de cisaillement, en fonction de la durée d'application (temps), exprimée en secondes, et de l'intensité (contrainte), exprimée en Pa de la contrainte de cisaillement.
La Figure 8, dans l'exemple 5, représente l'état de viabilité de cellules HEK293T après application d'une contrainte d'élongation. Les cellules HEK293T sont caractérisés après l'application de contraintes d'élongation d'intensité et de durée variables. Le pourcentage de cellules dans un état physiologique particulier est donné en fonction de la durée d'application (temps), exprimée en secondes, et de l'intensité (contrainte), exprimée en Pa, de la contrainte d'élongation. La figure 8 représente ainsi le pourcentage de cellules en apoptose (cadre A), viables (cadre B), nécrosées (cadre C) ou lysées (cadre D).
La Figure 9, dans l'exemple 6, représente l'état de viabilité de cellules fibroblastes après application d'une contrainte de cisaillement, la viabilité étant mesurée par cytométrie (barres d'histogramme) ou par coloration au bleu trypan (cercles noirs). La Figure 10, dans l'exemple 7, représente l'état de viabilité de cellules HEK293T après application de contraintes de cisaillement d'intensité et de durée variables. Le pourcentage de cellules viables, mesuré par coloration au bleu trypan, est donné en fonction de la durée d'application (temps) exprimée en secondes, et de l'intensité (contrainte), exprimée en Pa, de la contrainte de cisaillement. Le pourcentage de cellules viables est exprimé après un petit nombre de passages (HEK293T P07, triangles blancs) ou après un nombre plus élevé de passages (HEK293T P18, cercles noirs).
La Figure 11, dans l'exemple 8, représente l'état de viabilité de cellules fibroblastes après application de contraintes de cisaillement d'intensité et de durée variables, selon deux séries de mesures réalisées sur le même échantillon de cellules (P06), représentées respectivement par des triangles blancs et des cercles noirs. P06 désigne la 6ème génération de passage de la culture de cellules.
La Figure 12, dans l'exemple 9, représente en trois dimensions et sur une échelle logarithmique le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de l'intensité d'une contrainte hydrodynamique et du temps de résidence.
La Figure 13, dans l'exemple 9, représente en deux dimensions le pourcentage de viabilité de fibroblastes sur l'axe des ordonnées, en fonction de l'intensité d'une contrainte hydrodynamique de cisaillement, sur l'axe des abscisses, et du temps de résidence, représenté selon le motif du point.
La Figure 14, dans l'exemple 9, représente en deux dimensions le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de l'intensité d'une contrainte hydrodynamique et du temps de résidence.
La Figure 15, dans l’exemple 10, est un histogramme représentant la viabilité cellulaire en fonction de l'intensité de la contrainte de cisaillement, en kPa. Pour chaque intensité de contrainte, la valeur de viabilité a été mesurée après plusieurs expérimentations.
La Figure 16, dans l’exemple 10, est une représentation graphique de l'écart type (barre claire), de l'erreur standard (barre noire) et du coefficient de variation (barre grisée) des différentes mesures, en fonction de l'intensité de la contrainte de cisaillement, en kPa.
La Figure 17, dans l’exemple 10, est un histogramme représentant le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de l'intensité de la contrainte de cisaillement, en kPa.
La Figure 18, dans l'exemple 11, représente : i) à gauche, le pourcentage de viabilité cellulaire de différents types de cellules en fonction de l'intensité de la contrainte hydrodynamique appliquée, en kPa, ii) à droite, pour chacune des cellules étudiées, le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de la contrainte hydrodynamique qui est appliquée.
La Figure 19, dans l'exemple 12, représente le pourcentage de viabilité cellulaire des cellules en fonction de l'intensité de la contrainte de cisaillement appliquée, en kPa. Les symboles P07 (rond), P08 (carré), P09 (triangle) et P10 (étoile) représentent le pourcentage de viabilité cellulaire de cellules définies selon le nombre de passage de la cellule en culture.
La Figure 20, dans l'exemple 12, représente le pourcentage de viabilité cellulaire des cellules en fonction de l'intensité de la contrainte de cisaillement appliquée, en kPa. P09, P10 et Pli représentent le pourcentage de viabilité cellulaire de cellules définies selon le nombre de passage de la cellule en culture.
La Figure 21, dans l'exemple 13, représente la succession de la même contrainte hydrodynamique.
La Figure 22, dans l'exemple 13, représente le pourcentage de viabilité cellulaire des cellules en fonction de l'intensité de la contrainte hydrodynamique appliquée, en kPa.
La Figure 23, dans l'exemple 13, représente le pourcentage de viabilité cellulaire des cellules en fonction nombre de cycles d'application de la contrainte, pour une contrainte de 0,2 kPa.
La Figure 24, dans l'exemple 14, représente en images les étapes de localisation et d'isolement d'une cellule à partir d'une image d'origine.
La Figure 25, dans l'exemple 15, représente en image les étapes de détection des axes d'une cellule à partir d'une image d'origine.
La Figure 26, dans l'exemple 15, représente la déformabilité d'une cellule en fonction de son diamètre initial, sous l'effet d'une contrainte de cisaillement.
La Figure 27, dans l'exemple 15, représente la déformabilité d'une cellule en fonction de son diamètre initial, sous l'effet d'une contrainte mécanique d'impact.
La Figure 28, dans l'exemple 16, représente schématiquement un réseau de neurones de type « autoencoder » avec un exemple de transformation d'une image initiale (input) en une image finale (output) après traitement par ce réseau.
La Figure 29, dans l'exemple 16, représente les différences de traitement d'image par le réseau supervisé (U-net) d'une image initiale prétraitée ou non par un réseau non- supervisé (autoencoder), la ligne 1 représente les résultats sans application d'autoencoder, la ligne 2 représente les résultats avec application d'un « variational autoencoder », la ligne 3 représente les résultats avec application d'un « denoising autoencoder ».
Les Figures 30 A et 30 B, dans l'exemple 17, représentent les résultats de contour après application des différents réseaux de neurones et les métriques associées, puis la différence de calcul de la déformabilité par rapport à un contour fait manuellement (Témoin à 0).
La Figure 31, dans l'exemple 18, représente un résultat de classification de trois cellules avec, de gauche à droite, une cellule nécrotique, une cellule apoptotique et une cellule vivante.
EXEMPLES
Exemple 1 : Matériels et méthodes pour la caractérisation de cellules après l'application d'une contrainte physique
Les cellules AD-MSCs sont cultivées dans le milieu de culture commercialisé sous le nom MSC-Growth, avec une concentration d'ensemencement de l'ordre de 2500 cellules par cm2. Le milieu a été changé tous les deux jours. Afin d'avoir une confluence de 70%, les cellules ont passé sept jours d'incubation dans une flasque de T175.
Les cellules fibroblastes sont cultivées dans le milieu de culture commercialisé sous le nom DMEM GLUTAMAX - Gibco, avec une concentration d'ensemencement de l'ordre de 5500 cellules par cm2. Afin d'avoir une confluence de 80%, les cellules ont passé sept jours d'incubation dans une flasque de T175.
Les cellules HEK293T sont cultivées dans le milieu de culture commercialisé sous le nom DMEM GLUTAMAX - Gibco avec une concentration d'ensemencement de l'ordre de 12000 cellules par cm2. Afin d'avoir une confluence de 80%, les cellules ont passé quatre jours d'incubation dans une flasque de T175. Pendant la durée d'incubation, la température est maintenue à 37 °C et la concentration de CO2 de l'ordre de 5%.
Pour décrocher les cellules de la surface de flasque, d'abord le milieu de culture a été enlevé. Les cellules accrochées à la flasque sont rincées avec 15 ml de PBS. Ensuite, 5 ml de Trypsine-EDTA 0.5 % ont été ajoutés dans la flasque. La durée d'application de trypsine était deux minutes à 37°C, puis 10ml de milieu de culture contenant le sérum de veau fœtal ont été ajoutés dans la flasque, afin de stopper la réaction. La suspension a été placée dans un tube et centrifugée à 1200 rpm/210 g pendant 5 minutes. Le liquide a été enlevé et les cellules ont été suspendues dans une solution de PBS et Ficoll à une concentration d'un million par ml.
Le dispositif microfluidique pour la contrainte cisaillement consiste en un canal microfluidique en PDMS de diamètre 50 micromètre et de longueur de 10 cm. Les cellules ont été mises en suspension dans un fluide (une solution de PBS et Ficoll) dont la viscosité était 1,91 mPa.s.
Le dispositif microfluidique pour la contrainte élongationnelle consiste en un canal microfluidique principal de diamètre 162 micromètres et de longueur de 1 cm. La section du canal d'abord diminue de 162 à 30 micromètres et puis augmente de 30 à 162 micromètres. Ce changement de section se fait sur une distance de 360 micromètres. La viscosité de fluide suspendant (une solution de PBS et Ficoll avec une concertation volumique de 60% de Ficoll) est de 1,91 mPa.s.
La suspension des cellules et le fluide sans cellules sont injectés dans le dispositif grâce aux pompe seringues et les tuyaux PEEK de diamètre 3 mm.
Les cellules sont injectées dans le dispositif avec un débit compris entre 25 et 800 microlitres par minute. Les mesures et la récolte des cellules sont effectuées après que la stabilité hydrodynamique au sein de système a été atteinte.
Après passage dans la zone de la contrainte, les cellules ont été récoltées. La suspension des cellules récoltées est centrifugée afin d'enlever le fluide suspendant (la solution de Ficoll et PBS) pour la remplacer par le tampon de marquage.
Pour le test de viabilité, les cellules sont marquées avec l'annexine V, marqueur de cellules apoptotiques ou l'iodure de propidium, marqueur de cellules nécrotiques. Pour cela, Une population de 100000 cellules correspondantes à chaque débit d'injection a été suspendue dans 100 microlitres de tampon de marquage. Ensuite 2 microlitres de marqueur annexine V et 2 microlitres d'iodure de propidium ont été rajoutés dans le tampon. La suspension des cellules avec les marqueurs de viabilité a été incubée pendant 15 minutes dans un endroit sombre. Puis, les cellules ont été centrifugées et rincées par le tampon de marquage.
Pour le test de la caractère souche et l'état de différenciation des cellules souche AD- MSC, les cellules sont marquées grâce au kit «BD Human Mesenchymal Stem Cell Analysis Kit (BDB562245) ». Le kit contient les marqueurs hMSC positive : CD90, CD105, CD73 et CD 44 et les marqueurs hMSC négatives :CD34, CDllb, CD19, CD45 et HLA-DR. Pour la procédure de marquage, 100000 cellules sont suspendues dans 100 microlitres du tampon « BD Stain Buffer (FBS) », ensuite 5 microlitres de chaque marqueur positif et 20 microlitres de chaque marqueur négatif ont été rajouté dans le tampon. La suspension des cellules avec les marqueurs a été incubée pendant 15 minutes dans un endroit sombre. Puis, les cellules ont été centrifugées et rincées par le tampon de marquage.
Les cellules sont étudiées par cytométrie (FACS Canto II) et caractérisées selon leur état : cellule viable, lyse, nécrose, apoptose ou caractère souche. Chaque point de mesure correspond à une analyse d'au minimum 50.000 cellules.
A partir des résultats obtenus, un modèle mathématique de prédiction de l'état physiologique des cellules en fonction de l'intensité et de la durée de la contrainte est établi. Le modèle est une expression mathématique qui fait une relation entre les paramètres par exemple une expression polynomiale, une loi de puissance, une somme de sinus ou les autres expressions mathématique 2D ou 3D. Par exemple, nous pouvons utiliser une loi de puissance sous la forme y = axk + c qui établit une relation entre x et y. Dans ce modèle a est une constante de proportionnalité, k est l'exposant et c est le terme d'erreur. En utilisant cette méthode, nous modélisons l'état physiologique des cellules avant ou/et après passage dans la zone de contrainte en fonction de l'intensité de la contrainte et du temps de séjour sous contrainte. Pour cela, le modèle est établi comme suit : Etat physiologique = A x Contrainte6 + C ; Temps de séjour = D/Contrainte. Les paramètres A, B, C et D diffèrent pour chaque type cellulaire, type de contrainte et le nombre de passage.
Exemple 2 : Caractérisation de l'état de viabilité de cellules souches AD-MSCs après l'application d'une contrainte de cisaillement
Des cellules souches AD-MDCs ont été cultivées puis soumises à une contrainte de cisaillement dont l'intensité et la durée sont variables. Après application de ces contraintes, l'état de viabilité des cellules est caractérisé en fonction de l'intensité de la contrainte de cisaillement et du temps de séjour des cellules sous contrainte. La caractérisation de l'état physiologique (viable, lyse, nécrose ou apoptose) des cellules a été effectuée comme décrit dans l'exemple 1.
Le modèle mathématique défini dans ce cas est le suivant : Etat = A x Contrainte B + C ; Temps = D / Contrainte.
Les valeurs A, B, C et D telles que définies pour chacun des états physiologiques possible sont les suivantes :
Tableau 1
Figure imgf000028_0001
Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 5. Ces résultats montrent que les cellules souches mésenchymateuses humaines AD-MSC sont sensibles à l'intensité de la contrainte de cisaillement et au temps de séjour sous la contrainte. Nous observons que les cellules AD-MSC ont une capacitance mécanique face à la contrainte d'environ 1000 Pa avec un temps de séjour d'environ 0,25 s. Au-delà de ces valeurs, les cellules souches AD-MSC ne supportent plus la contrainte et subissent une mortalité. La voie de mortalité par lyse ou par nécrose est la plus présente, en revanche le niveau d'apoptose est négligeable dans cette gamme de contrainte et temps de séjours.
Exemple 3 : Etat physiologique de fibroblastes après l'application d'une contrainte de cisaillement
Des cellules fibroblastes ont été cultivées puis des échantillons de cellules ont été soumis à des contrainte de cisaillement d'intensité et de durée variables. Après application de ces contraintes, le caractère de viabilité ou de lyse, nécrose ou apoptose des cellules a été déterminé comme décrit dans l'exemple 1.
Le modèle mathématique défini dans ce cas est le suivant : Etat = A x Contrainte B + C ; Temps = D / Contrainte
Les valeurs A, B, C et D telles que définies pour chacun des états physiologiques possibles sont les suivantes :
Tableau 2
Figure imgf000028_0002
Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 6. Ces résultats montrent que les cellules fibroblastes sont fortement sensibles à la contrainte de cisaillement et au temps de séjour sous la contrainte. Nous pouvons constater que les cellules fibroblastes jusqu'à 900 Pa et pendant 0,04 s, sont capable de supporter la contrainte de cisaillement sans être endommagées, c'est-à-dire sans présenter de caractère de lyse, apoptose ou nécrose. Ces valeurs sont la capacitance mécanique des cellules fibroblastes face à la Tl contrainte de cisaillement. En revanche, au-delà de cette capacitance mécanique, la réponse physiologique, c'est-à-dire la perte de viabilité, des fibroblastes est considérable. En effet, les fibroblastes ne résistent pas à la contrainte et le niveau de viabilité de 85% à 900 Pa chute soudainement à 30% à 1000 Pa et atteint un niveau de moins de 5% de viabilité à 2000 Pa. La mortalité des cellules fibroblastes est causée plutôt par la voie de lyse et les autres états physiologiques sont négligeables.
Exemple 4 : Etat de différentiation de cellules souches mésenchymateuses humaines AD-MSC après l'application d'une contrainte de cisaillement
Des cellules souches AD-MSC ont été cultivées comme indiqué dans l'exemple 1. En prérequis, les cellules souches AD-MSC ont été caractérisées par la cytométrie pour confirmer leurs caractères souches avant l'application d'une contrainte de cisaillement d'intensité et de durée variables. Après passage dans la zone de contrainte, les cellules sont récoltées et resuspendues dans un milieu de culture DMEM (+). L'état de différenciation a été caractérisé après leur remise en culture. L'ensemencement a été réalisé à 80% de la confluence. Après trois semaines d'incubation, les cellules ont été récoltées, marquées grâce au kit «BD Human Mesenchymal Stem Cell Analysis Kit (BDB562245) » et analysées en cytométrie en flux (FACS Canto II). Chaque point de mesure correspond à minimum 30.000 cellules. La caractérisation a été faite par la cytométrie en flux qui permet ici d'identifier l'état des cellules après application de la contrainte dans une façon binaire : différenciées ou non-différenciées. La procédure de la caractérisation par la cytomètre a été effectuée comme indiqué dans l'exemple 1.
Le modèle mathématique défini dans ce cas est le suivant : Etat non-différencié : Temps = D / Contrainte où D = 30,6 dans la gamme de 0,147 s < temps < 0.39 s et 78 < contrainte < 2082 Pa
Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 7. Ces résultats montrent l'absence de cellules différenciées. Ceci indique que les cellules souches mésenchymateuses humaines AD-MSC maintiennent leurs caractère souche après avoir subi une contrainte cisaillement dans la gamme représentée dans la figure. L'état physiologique des cellules AD-MSC, ici le maintien du caractère souche, n'a donc pas été affecté par la contrainte et le temps de séjour dans la gamme 0-2100 Pa et 0,015-0,4 s.
Exemple 5 : Etat de viabilité de cellules HEK293T après l'application d'une contrainte d'élongation
Des cellules HEK293T ont été cultivées puis des échantillons de cellules ont été soumis à des contraintes d'élongation d'intensité et de durée variables. Après application de ces contraintes, le caractère de viabilité ou de lyse, nécrose ou apoptose des cellules a été déterminé comme décrit dans l'exemple 1.
Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 8. Ces résultats montrent que les cellules HEK293T ont un taux de survie élevé face à la contrainte élongationnelle dans la gamme de contrainte entre 10 et 110 Pa et le temps de séjour entre 0,1 ms et 0,8 ms. Les états de lyse, nécrose et apoptose sont négligeables par rapport à l'état viable.
Exemple 6 : Etat de viabilité de cellules fibroblastes après l'application d'une contrainte de cisaillement, tel que mesuré par deux protocoles
Des cellules fibroblastes ont été cultivées puis des échantillons de cellules ont été soumis à des contraintes de cisaillement d'intensité et de durée variables. Après application de ces contraintes, le caractère de viabilité des cellules a été déterminé par deux protocoles différents : analyse par cytométrie et numération au bleu trypan. La viabilité est illustrée en fonction de l'intensité de la contrainte de cisaillement. Le temps de séjour sous la contrainte correspond à l'équation suivante : temps (s) = 30,6 / intensité de la contrainte de cisaillement (Pa)
Les cellules ont été récoltées après le passage dans la zone de contrainte. Ensuite elles ont été divisées en deux lots afin d'être analysé par la cytométrie et par le Bleu Trypan. Pour l'analyse par cytométrie, le lot a été marqué par les marqueurs Annexine V et iodure de propidium. Par la suite, les cellules marquées ont été analysées par la cytomètre. Chaque point de mesure correspond à minimum 50.000 cellules. Pour l'analyse par le bleu Trypan, le lot de cellules a été mélangé avec Bleu Trypan. Trois comptages sur la totalité de la surface de la lame Malassez ont été effectués. La barre d'erreur correspond à ces trois comptages. Les résultats sont présentés en Figure 6.
Exemple 7 : Etat de viabilité de cellules HEK293T après l'application d'une contrainte de cisaillement
Des cellules HEK293T ont été cultivées puis des échantillons de cellules ont été soumis à une contrainte de cisaillement d'intensité et de durée variables, comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules HEK293T ont été récoltées après le passage dans la zone de contrainte, ensuite ont été mélangée avec Bleu Trypan. Trois comptages sur la totalité de la surface de la lame Malassez ont été effectués. La valeur correspond à la moyenne de ces trois comptages.
Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 10. Ces résultats montrent que le nombre de passage des cellules dans la culture cellulaire clairement affecte la capacitance mécanique des cellules HEK293T. Ces cellules avec un passage P07 (7 passages) résistent parfaitement à la contrainte avec un taux de viabilité 100% pour les contraintes inférieures à 200 Pa. Mais au-delà de cette capacitance mécanique, les mêmes cellules HEK293T passage P07 rencontrent une chute de viabilité. Cependant, la même lignée cellulaire mais avec un passage P18 (18 passages) perd cette capacitance mécanique et ne résiste pas à la moindre contrainte.
Exemple 8 : Démonstration de la reproductibilité des mesures
La caractérisation de l'état physiologique des cellules fibroblastes après application d'une contrainte de cisaillement ont été effectuées en duplicat. Les deux mesures ont été faites sur le même échantillon de la cellule (P06). La reproductibilité de l'expérience a une erreur moyenne de 3,45% de viabilité. Les analyses réalisées par le système sont donc reproductibles. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 11.
Exemple 9 : Capacité mécanique de cellules en fonction de l'intensité de la contrainte et du temps de résidence sous contrainte
Le temps de résidence est défini comme la période pendant laquelle les cellules sont exposées à une contrainte hydrodynamique. Dans un dispositif microfluidique et procédé selon l'invention, la contrainte est maintenue à une intensité constante, alors que le temps de séjour dépend du débit et des viscosités dans lesquelles les cellules sont en suspension. Cette approche permet de découpler les deux paramètres et d’étudier leur effet indépendamment. Des fibroblastes ont été mis en suspension dans des fluides d’une viscosité de 1, 5, 10, 15 ou 20 mPa.s et injectés à travers le tube capillaire microfluidique avec un débit compris entre 117 et 942 pl/min. Cette configuration couvrait l’intensité de la contrainte de cisaillement dans une gamme comprise entre 0,16 et 25,59 kPa et un temps de résidence compris entre 12,5 et 100,7 ms.
La Figure 12 et la Figure 13 montrent une cartographie de la viabilité cellulaire des fibroblastes en fonction de l’intensité de la contrainte et du temps de séjour. Ces deux figures représentent les mêmes données avec une vue 3D et 2D et des échelles linéaire et logarithmique. Les points blancs sont les données expérimentales et la surface est l’ajustement du modèle mathématique. On observe que dans les plages indiquées, pour un temps de séjour donné, en augmentant l’intensité de la contrainte, on diminue la viabilité cellulaire. Cependant, pour une intensité de contrainte constante, la viabilité cellulaire est indépendante du temps de résidence. La Figure 14 représente la viabilité du fibroblaste uniquement en fonction de l’intensité de la contrainte, tandis que les nuances de gris identifient le temps de résidence. Grâce aux trois représentations des mêmes données, il est possible de conclure que la viabilité et la capacité mécanique des fibroblastes ne dépendent pas du temps de résidence dans la plage de 12,5 à 100,7 ms. Ces résultats indiquent que, dans ce cas, la viabilité des fibroblastes ne peut être caractérisée qu'en fonction de l’intensité de la contrainte.
Dans un procédé selon l'invention, l’intensité de la contrainte et le temps de résidence sont totalement découplés. On peut garder constant l’un de ces paramètres et faire varier l’autre paramètre. Ainsi, nous sommes en mesure d’avoir un aperçu détaillé de l’effet du temps de résidence et de l’intensité de la contrainte de cisaillement en tant que deux paramètres indépendants.
Exemple 10 : Reproductibilité et précision du dispositif
Afin d'obtenir la reproductibilité des expériences et des résultats les inventeurs ont mesuré 6 fois la capacité mécanique des cellules MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Pour écarter la variabilité biologique qui va affecter l'évaluation des erreurs liées à la performance de la machine et la procédure, une population des cellules a été divisée en 6 batch. La mesure de la capacité mécanique a été effectué sur chaque batch de cellule. Les cellules ont été exposées aux contraintes de cisaillement d'une intensité de 0,175, 0,469, 2,716 et 6,397 kPa, puis leur viabilité a été mesurée par cytomètre. L'écart type, l'erreur standard et le coefficient de variation ont été calculés avec les formules suivantes :
Figure imgf000032_0001
Les résultats montrent que l'erreur standard pour les 6 essais est inférieure de 1% dans le pire des cas. Cet exemple montre parfaitement la précision et la performance de la machine et la procédure qui amène aux mesures fiables et très fines. Cette précision permet de faire une analyse poussée avec une fiabilité importante comme montré les Figures 15 à 17.
Exemple 11 : Capacité mécanique de différentes lignées cellulaires
Avec un dispositif selon l'invention, il est possible de mesurer la capacité mécanique face aux contraintes hydrodynamiques de différentes cellules : lignée primaire, lignée cellulaire immortalisée, cellules souches, etc. La capacité mécanique des lignées cellulaires suivantes a été analysée : Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell (AD- MSC), Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSC), Bone marrow-derived mesenchymal stem cell (BM-MSC), human dermal fibroblasts, Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), Cancer-associated fibroblasts (CAF), Human embryonic kidney 293T cells (HEK293T) and Madin-Darby canine kidney (MDCK).
Les cellules ont été mises en suspension dans deux fluides d’une viscosité de 1 et 5 mPa.s et injectées à travers un canal microfluidique de 50 pm de diamètre avec un débit allant de 85 à 942 pl/min et soumises à une contrainte de cisaillement de 0,11 à 6,4 kPa. Les cellules collectées ont été marquées à l’iodure de propidium et analysées par cytométrie pour quantifier la population cellulaire nécrotique induite par le stress de cisaillement. Pour confirmer que les cellules ne sont endommagées que par la contrainte de cisaillement lors de leur injection dans le canal microfluidique et non par la pression statique de la seringue, les cellules fibroblastes ont été injectées sans passer par le canal microfluidique et ont été analysées par cytométrie. Nous avons confirmé que la viabilité cellulaire était inchangée par rapport à la viabilité de la population cellulaire témoin de 97 %. De plus, dans le cas des cellules adhérentes, un soin particulier a été apporté pendant la durée de l’expérience pour limiter leur mort due aux conditions de suspension. De plus, le délai entre la récolte de la cellule et l’exposition au stress de cisaillement était de 5 min seulement, et identique pour toutes les lignées cellulaires.
La Figure 18 représente la viabilité des lignées cellulaires après l'application de la contrainte de cisaillement. Les points sont les données expérimentales et les lignes sont les courbes d’ajustement. Un tel profil d’évolution de la viabilité cellulaire peut être décrit comme ayant deux phases. Premièrement, la viabilité cellulaire montre un plateau jusqu'à une certaine limite de contrainte de cisaillement, c'est-à-dire la capacité des cellules à résister à la contrainte de cisaillement. Puis, après la contrainte de cisaillement qui correspond à la capacité mécanique de la cellule, la viabilité cellulaire se détériore et subit une forte diminution pouvant atteindre moins de 5 % de cellules viables. Avant la contrainte de cisaillement liée à la capacité mécanique de chaque cellule, la viabilité varie de moins de 5% par rapport à la population cellulaire témoin non cisaillée. Il est également à noter que si tous les types cellulaires étudiés présentent des tendances similaires, chaque lignée cellulaire a une sensibilité spécifique à la contrainte de cisaillement en tant que capacité mécanique, AD-MSC : 0,64 kPa, WJ-MSC : 0,35 kPa, BM-MSC : 0,48 kPa, fibroblastes : 0,64 kPa, HUVEC : 0,32 kPa et HEK293T : 0,43 KPa.
Exemple 12 : Evolution de la capacité mécanique avec le vieillissement de la cellule et le temps d'incubation
Pour explorer le lien entre le vieillissement cellulaire et sa capacité mécanique, des fibroblastes ont été sous-cultivés (passage) une fois par semaine et soumis à une contrainte de cisaillement. Les expériences ont été poursuivies pendant quatre passages, de P07 à P10. Le passage est le procédé de sous-culture de cellules animales, par « P07 » on entend la 7ème génération de passage de cellules en culture. Les pratiques de sous-culture étaient strictement identiques entre les différents passages. La viabilité des cellules fibroblastes après avoir été soumises à plusieurs intensités de contrainte de cisaillement a été mesurée pour chaque nombre de passage par cytométrie en flux. Les cellules ont été mises en suspension dans des fluides avec des viscosités de 1 et 5 mPa.s, puis exposées à la contrainte de cisaillement entre 0,159 et 6,14 kPa. Le débit était dans la plage de 117 à 942 ul/min pour les deux fluides de suspension.
La Figure 19 montre que les pratiques séquentielles de sous-culture n'affectent pas la capacité mécanique des fibroblastes face à la contrainte de cisaillement. En effet, ils présentent une capacité mécanique similaire indépendamment de leur nombre de passage. Jusqu'à la contrainte de cisaillement qui correspond à la capacité mécanique de la cellule 0,577 kPa, la viabilité des fibroblastes n'est pas affectée (96 %), alors que la viabilité témoin est de 97 %. Dans la gamme de 0,639 kPa à 4,78 kPa, la viabilité se dégrade fortement de 92 % à 5 % et atteint un plateau sous 5 %.
Une étude similaire a été appliquée aux cellules HEK293T. Contrairement aux fibroblastes, les cellules HEK293T ont été sous-cultivées deux fois par semaine du passage numéro P09 à Pli. Par conséquent, la durée de croissance cellulaire alterne entre 3 et 4 jours entre les sous-cultures successives.
Les cellules ont été mises en suspension dans des fluides avec des viscosités de 1 et 5 mPa.s, puis exposées à la contrainte de cisaillement dans la gamme de 0,11 à 6,4 kPa. Le débit était dans la plage de 85 à 942 ul/min pour les deux fluides de suspension. La viabilité des cellules a été analysée par cytométrie.
Comme le montre la figure 20, la capacité mécanique des cellules HEK293T est affectée par la variation de la période d'incubation pour les sous-cultures cellulaires successives. La période d'incubation avant l'application de la contrainte et avant la mesure est de 3 ou 4 jours. HEK293T ayant une période d’incubation de 3 jours démontre une capacité mécanique de 0,516 kPa, tandis que les cellules HEK293T ayant une période d’incubation plus longue ont subi d'un affaiblissement de la capacité mécanique qui est 0,319 kPa.
Exemple 13 : Répétition d'une série de contraintes
Afin d'explorer l'effet d'une répétition de contraintes identiques sur la capacité mécanique de la cellule, des cellules AD-MSCs ont été suspendues dans un fluide de viscosité de 1 mPa.s et exposées à des contraintes hydrodynamiques et répétées. Ce type de contrainte se définit comme une succession de la même contrainte d'une manière cyclique. La Figure 21 montre cette succession. Les cellules subissent une contrainte de cisaillement, ensuite elles entrent dans une zone sans cisaillement puis elles sont cisaillées. Ce cycle a été effectué pour un batch de cellules, avec un nombre de cycles égal à 77, 154, 231, 308, 385 et 462, avec une contrainte de 0,2 kPa. Cette contrainte est inférieure à la capacité mécanique des cellules, 0,6 kPa, comme montré dans la figure 22. Les cellules, après avoir été exposées aux différents nombres de cycles, ont été analysées par un cytomètre en flux pour déterminer la viabilité cellulaire. La figure 23 représente une contrainte cyclique en dessous de la capacité mécanique de la cellule AD-MSC, elle n'affecte pas la viabilité cellulaire.
Exemple 14 : Localisation et isolement de cellules
La localisation et l'isolement de la cellule sont réalisés à l'aide d'un algorithme à partir des images d'origine prises par la caméra rapide. Elles consistent premièrement en la création d'un masque permettant de réduire la taille de l'image d'origine par superposition. Deuxièmement, des fonctions de traitement d'image de type érosion et dilatation sont appliquées afin de réduire le bruit de fond des images et révéler la localisation de la cellule de façon plus contrastée. Puis, l'isolement est réalisé par définition de la région d'intérêt (ROI) (Figure 24).
Exemple 15 : Positionnement et mesure des axes mineur et majeur
Le positionnement et la mesure des axes mineurs et majeurs sont réalisés à partir d'un modèle d'apprentissage supervisé. La première étape consiste en l'application du modèle supervisé (ici U-Net) sur la photo de cellule résultante de la figure 24. Cela permet d'identifier la taille et la forme de la cellule. Deuxièmement, une fonction de traitement d'image de type « edge extraction » est réalisée afin de positionner le contour de la cellule sur l'image issue de la figure 24. Puis, les axes mineurs et majeurs sont mesurés, l'axe majeur étant le diamètre le plus grand et l'axe mineur étant le diamètre le plus petit. Ces résultats peuvent être affichés dans un graphique représentant le niveau de déformabilité en fonction de la taille de la cellule. Ici, nos résultats démontrent la précision de nos mesures de déformabilité par traitement d'image pour des tests en cisaillement et en crash.
Exemple 16 : Amélioration de la qualité des images par un modèle non-supervisé
Les images résultant des étapes de localisation et d'isolement de la cellule ne sont pas toujours de bonne qualité pour permettre la mesure des axes majeurs et mineurs. Cela provient du fait que ces images sont suffisamment bruitées pour empêcher le modèle supervisé de segmenter la cellule. Afin d'améliorer cette qualité d'image, l'application d'un modèle non-supervisé est nécessaire. Ici, il est montré que l'application d'un réseau de neurones de type « autoencoder » permet de reconstruire l'image issue de l'extraction ROI de meilleure qualité (Figure 28). La Figure 29 démontre la pertinence de cette approche. Sur la Figure 29, la ligne 1 représente les résultats sans d'application d' « autoencoder », la ligne 2 représente les résultats avec application d'un « variational autoencoder », la ligne 3 représente les résultats avec Application d'un « denoising autoencoder »).
Exemple 17 : Amélioration de la détection des cellules et des mesures de déformabilité par couplage d'un modèle non supervisé et supervisé
Le couplage d'un modèle non-supervisé et supervisé peut être utilisé pour améliorer la détection des cellules au sein d'une image ainsi que sa mesure de déformabilité. Dans cet exemple, nous démontrons cette approche par couple des réseaux de neurones autoencoder et U-Net sur des images issues de mesure en cisaillement (Figure 30A).
Les valeurs numériques sont les suivantes (Tableau 3) :
Figure imgf000036_0001
Tableau 3
Nous pouvons observer que l'application du réseau supervisé (U-Net) seule ne permet pas de détecter et suivre toute la cinématique de la cellule tandis que le couplage avec un modèle non supervisé (autocoder VAE ou DAE) améliore la détection et la mesure (Precision, Recall et F& score plus élevé) (Figure 30B).
Aussi, l'amélioration de la mesure est décrite par soustraction de la mesure de déformabilité par rapport à une approche manuelle standard. C'est-à-dire que chaque image a été traitée par l'utilisateur sans traitement d'image ou application d'un modèle d'apprentissage.
Exemple 18 : Prédiction de l'état physiologique d'une cellule par un modèle de classification utilisant un apprentissage supervisé.
Un modèle d'apprentissage supervisé peut être utilisé pour classifier l'état physiologique de la cellule par analyse d'image. Ici l'exemple montre un résultat de classification de 3 cellules annotées comme nécrotique (A), apoptotique (B) et vivante (C).

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 0001] Dispositif pour l'application d'au moins une contrainte hydrodynamique d'intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension et en mouvement dans ledit dispositif, et pour la caractérisation de ladite cellule, pendant l'application de ladite contrainte et optionnellement pour la caractérisation de ladite cellule après l'application de ladite contrainte, le dispositif comprenant :
- un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d'un fluide contenant ladite cellule en suspension, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l'intérieur dudit canal, et
- un moyen de caractérisation de ladite cellule pendant l'application de ladite contrainte, caractérisé en ce que ledit au moins un segment est configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte hydrodynamique choisie parmi : une contrainte hydrodynamique de compression, une contrainte hydrodynamique de cisaillement et une contrainte hydrodynamique d'extension, et pour l'application optionnelle d'au moins un impact mécanique à ladite cellule.
[Revendication 0002] Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel la caractérisation de ladite cellule a pour objet au moins un critère choisi parmi : la taille, la forme, l'aspect de la membrane externe, l'aspect du cytoplasme, la présence d'au moins un marqueur à la surface de la cellule, le contenu protéique de la cellule et le contenu en acides nucléiques de la cellule.
[Revendication 0003] Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit au moins un segment A, configuré pour l'application à ladite cellule d'une contrainte de compression, comprend, ou est constitué par, un premier canal rejoint, au même niveau, par deux canaux, chacun faisant un angle compris entre 30 et 150 degrés avec ledit premier canal.
[Revendication 0004] Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit au moins un segment B, configuré pour l'application à ladite cellule d'une contrainte de cisaillement, comprend, ou est constitué par, un canal de diamètre compris entre 10 et 2000 pm, de préférence entre 20 et 200 pm.
[Revendication 0005] Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit au moins un segment C, configuré pour l'application à ladite cellule d'une contrainte d'extension, comprend, ou est constitué par, i) un canal de section croissante ou décroissante ou ii) un premier canal rejoint par un second canal dans lequel la circulation du fluide s'effectue dans un sens différent, de préférence opposé, à celui du premier canal.
[Revendication 0006] Dispositif selon l'une des revendications précédente, caractérisé en ce que ledit au moins un segment D, configuré pour l'application à ladite cellule d'un impact mécanique, comprend, ou est constitué par, un premier canal au sein duquel la ligne de trajet des cellules rencontre un obstacle, tel que notamment la paroi d'un second canal.
[Revendication 0007] Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit circuit comprend : au moins un segment A et/ou au moins un segment B et/ou au moins un segment C, et optionnellement au moins un segment D, combinés entre eux.
[Revendication 0008] Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit circuit est configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une séquence comprenant, ou consistant en, au moins deux contraintes physiques successives de nature différente.
[Revendication 0009] Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit circuit est configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une séquence comprenant, ou consistant en, au moins deux contraintes hydrodynamiques successives de même nature, et optionnellement au moins deux contraintes mécaniques successives de même nature.
[Revendication 0010] Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'intensité d'au moins une contrainte hydrodynamique appliquée à la cellule est comprise entre 10‘3 kPa et 105 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 104 kPa, de préférence entre 0,1 et 103 kPa, de préférence entre 1 et 102 kPa et/ou en ce que la durée totale de l'application de ladite au moins une contrainte hydrodynamique est comprise entre 1 ps et 10000 s, de préférence entre 1 ps et 100 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence 10 ps et 100 ms.
[Revendication 0011] Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la caractérisation de ladite cellule après l'application de ladite au moins une contrainte est réalisée pendant une période comprise entre 0 et 120 jours, de préférence entre 0 et 30 jours, de préférence entre 0 et 1 jour après l'application de ladite au moins une contrainte physique.
[Revendication 0012] Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la caractérisation de ladite cellule pendant l'application de ladite au moins une contrainte comprend, ou consiste en, au moins une caractérisation ponctuelle ou au moins une caractérisation réalisée pendant une durée comprise entre 1 ps et 10000 s, de préférence 1 ps et 100 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence 10 ps et 100 ms.
[Revendication 0013] Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit moyen de caractérisation de ladite au moins une cellule est choisi parmi : un cytomètre, un microscope, un moyen d'analyse du contenu protéique de la cellule, un moyen d'analyse et de séquençage des acides nucléiques de ladite cellule, et un moyen de capture d'image combiné avec un moyen d'analyse d'image.
[Revendication 0014] Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit moyen d'analyse d'image comprend ou est constitué par : une unité centrale informatique comprenant un moyen logiciel adapté pour l'analyse d'image.
[Revendication 0015] Dispositif selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que ledit moyen d'analyse d'image comprend en outre un premier modèle de classification, préalablement entraîné avec un jeu de données d'apprentissage, et comprenant un algorithme d'apprentissage automatique supervisé, non-supervisé ou semi-supervisé, ledit premier modèle de classification étant adapté pour la prédiction de l'état physiologique d'une cellule donnée à partir de caractéristiques de ladite cellule.
[Revendication 0016] Dispositif selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que ledit moyen d'analyse d'image comprend en outre un deuxième modèle de classification, préalablement entraîné avec un jeu de données d'apprentissage, et comprenant un algorithme d'apprentissage automatique supervisé, non-supervisé ou semi-supervisé, ledit deuxième modèle de classification étant adapté pour la détection et le suivi de la déformation d'une cellule donnée en réponse à au moins une contrainte physique.
[Revendication 0017] Procédé pour l'application d'au moins une contrainte physique d'intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule pendant ladite application, et optionnellement après ladite application, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) le dépôt et la mise en circulation d'un fluide contenant ladite au moins une cellule en suspension dans un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d'un fluide contenant ladite cellule , ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l'intérieur dudit canal, et b) la caractérisation de ladite cellule pendant l'application de ladite au moins une contrainte ; et optionnellement après l'application de ladite au moins une contrainte, caractérisé en ce que ledit au moins un segment est configuré pour l'application à ladite cellule d'au moins une contrainte hydrodynamique choisie parmi : une contrainte hydrodynamique de compression et/ou une contrainte hydrodynamique de cisaillement et/ou une contrainte hydrodynamique d'extension, et optionnellement au moins un impact mécanique.
[Revendication 0018] Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la caractérisation de ladite cellule a pour objet au moins un critère choisi parmi : la taille, la forme, l'aspect de la membrane externe, l'aspect du cytoplasme et la présence d'au moins un marqueur de surface.
[Revendication 0019] Procédé selon l'une des revendications 17 ou 18, dans lequel la cellule est soumise à :
- au moins une contrainte de cisaillement d'intensité comprise entre 10‘3 kPa et 105 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 104 kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103 kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 ps et 10.000 s, de préférence entre 1 ps et 100 s, de préférence entre 10 ps et 1 s, de préférence entre 10 ps et 10 ms, et/ou
- au moins une contrainte de compression d'intensité comprise entre 10‘3 kPa et 103 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 102 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 10 kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 ps et 10 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence entre 10 ps et 10 ms et/ou
- au moins une contrainte d'extension d'intensité comprise entre 10‘3 kPa et 103 kPa, de préférence entre 10‘3 kPa et 102 kPa, de préférence entre 10‘3 et 10 kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 ps et 10 s, de préférence entre 1 ps et 1 s, de préférence entre 10 ps et 10 ms,
- et optionnellement à au moins un impact mécanique d'intensité comprise entre 1 et 300 m/s et/ou pendant une durée de moins de 1 ps.
[Revendication 0020] Procédé selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de prédiction de l'état physiologique d'une cellule par un premier modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l'étape b).
[Revendication 0021] Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de prédiction de l'état physiologique d'une cellule par un premier modèle de classification préalablement entraîné, caractérisé en ce que ledit premier modèle de classification comprend : un algorithme d'apprentissage automatique, un réseau neuronal à apprentissage supervisé ou un algorithme de classification probabiliste multi-classes, préalablement entraîné avec un jeu de données d'apprentissage.
[Revendication 0022] Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de suivi de la déformabilité d'une cellule à différents instants de son séjour dans ledit canal microfluidique, par un deuxième modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l'étape b).
[Revendication 0023] Modèle de classification, préalablement entraîné sur un jeu de données d'apprentissage pour prédire, dans un procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, un état physiologique d'une cellule pendant et/ou après l'application d'au moins une contrainte hydrodynamique.
[Revendication 0024] Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, ou d'un procédé selon l'une des revendications 17 à 22 ou d'un modèle de classification selon la revendication 23 pour la caractérisation de cellules de type suivant : cellule procaryote, cellule eucaryote, cellule animale, cellule végétale, cellule humaine, cellule souche, cellule épithéliale, fibroblaste, cellule sanguine, cellule génétiquement modifiée ou mime cellulaire synthétique.
[Revendication 0025] Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, d'un procédé selon l'une des revendications 17 à 22 ou d'un modèle de classification selon la revendication 23, pour la détermination de la capacitance d'une cellule.
[Revendication 0026] Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, d'un procédé selon l'une des revendications 17 à 22 ou d'un modèle de classification selon la revendication 23 pour la définition d'au moins un paramètre d'un bioprocédé.
[Revendication 0027] Utilisation selon la revendication 26, caractérisée en ce que ledit bioprocédé est choisi parmi : la bioimpression, la thérapie cellulaire et la bioproduction.
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