WO2023234412A1

WO2023234412A1 - 遺伝子改変動物由来の動物繊維

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Publication number: WO2023234412A1
Application number: PCT/JP2023/020690
Authority: WO
Inventors: 俊沢津橋; 結花稲谷; 忠由渡邉; 勇佑長尾; 尚大上利; 梨沙貝沼; 朋子長尾; 耕一西村; 俊矢穂積; 晃寛小野
Original assignee: Setsurotech Inc; Optage Inc
Current assignee: Setsurotech Inc; Optage Inc
Priority date: 2022-06-03
Filing date: 2023-06-02
Publication date: 2023-12-07
Anticipated expiration: 2024-12-03
Also published as: EP4533942A1; JP7201190B1; CN119677408A; JP2023177792A

Abstract

本発明は、新規繊維を有する非ヒト動物および当該非ヒト動物を作製する方法を提供する。具体的には、本発明は、ＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子の発現または機能を低下させた非ヒト動物および当該非ヒト動物を作製する方法を提供する。

Description

遺伝子改変動物由来の動物繊維

　本発明は、動物の作製方法、当該方法によって得られた動物および動物繊維、ならびに当該動物繊維を含む繊維製品に関する。

　ウールやカシミヤなどの動物繊維は、繊維径、繊維長、色あいなどの要素により品質が決定する。なかでも、繊維径の細さは織物、編物など製品の手触り、着心地、光沢、保温性、伸縮性などに直接関連するため、最終製品の品質に影響を与える極めて重要な要素である。これまで、細い動物繊維は、特定の優良品種を使用して生産が行われてきたが、優良品種であっても細い動物繊維は体毛全体のごく一部であり、細さに伴い希少性が高くなるため僅かな産毛量の増減によって価格が変動し易く、供給が不安定であった。

　また、動物繊維は、繊維表面に凹凸を生じるスケール構造を持っており、このスケール同士の摩擦によって繊維間の絡み合いが生じ、これがピリング（毛玉）形成のほか、光沢、柔軟性、平滑性等を損なう品質劣化をもたらす原因になっていた。このような劣化を避けるべく、従来から化学的方法によってスケールを剥離したり、コーティング樹脂によってスケールの凹凸を被覆して、繊維表面を滑らかにする処理が開発されてきた。しかしながら、かかる方法は、繊維間の絡み合いを防ぐことができるものの、動物繊維本来の品質を損なうため、動物繊維への適用は避けられており、特に希少な繊維径の細い動物繊維への適用は敬遠される傾向にあった。
　これらのことから、繊維径の細い動物繊維を安定に供給でき、および／または、その品質維持を可能にする技術が望まれていた。

特開２００６－２８３２５４特開２００６－１３２０５９

　本発明はヒト動物の作製方法、当該方法によって得られた動物および動物繊維、ならびに当該動物繊維を含む繊維製品を提供する。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、ＫｒｔまたはＫａｐファミリーを構成する遺伝子の発現または機能を低下させることによって、動物繊維の径が細くなること、および当該低下を有する非ヒト動物から繊維径の細い動物繊維が得られることを見出した。本発明者らはまた、さらに研究進めるなかで、当該動物から滑らかな繊維表面を有する動物繊維が得られ得ること見出し、発明を完成させた。

　すなわち、本発明は以下に関する
［１］遺伝子改変を有する動物（好ましくは哺乳類、より好ましくは偶蹄類）、またはその動物繊維であって、
　前記動物は動物繊維を有し、
　前記遺伝子改変は、ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、前記１つ以上の遺伝子の破壊である、
遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［２］上記［１］に記載の遺伝子改変を有する動物、またはその動物繊維であって、
　（ｉ）上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維はより小さな長径（例えば、５～５０％、または５～２５％小さな長径）を有する、および／または
　（ｉｉ－１）上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は、前記１つ以上の遺伝子がコードするタンパク質の含有量が少ないか、もしくは、（ｉｉ－２）前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は、前記１つ以上の遺伝子がコードするタンパク質を含まない、
遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［３］上記［１］または「２」に記載の遺伝子改変を有する動物、またはその動物繊維であって、
　上記遺伝子改変を有しない動物の動物繊維と比較して、前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は５％以上、１０％以上、または１５％以上小さな長径を有する、
遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［４］上記［１］～［３］のいずれかに記載の遺伝子改変を有する動物、またはその動物繊維であって、
　ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、Ｋａｐ８－１およびＫａｐ８－２のいずれかまたは両方を含む、遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［５］上記［１］～［３］のいずれかに記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維であって、
　ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４から選択される１つ以上の遺伝子を少なくとも含む、遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［６］前記遺伝子改変は、ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、上記［１］～［５］のいずれかに記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［７］上記［１］～［６］のいずれかに記載の動物繊維。
［８］上記［７］に記載の動物繊維を含む、布、織物、または繊維製品。

［９］非ヒト動物が、哺乳類または鳥類である、上記のいずれかに記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［１０］哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、アルパカ、リャマ、ラクダ、ヤク、アイベックス、グァナコ、キヴィアック、チルー、タヌキ、ラクーン、ミンク、セーブル、フォックス、ポッサム、オポッサム、ビーバー、アザラシ、ヌートリア、フェレットもしくはビクーニャ、または、これらのいずれか一つの哺乳類の交雑によって得られた哺乳類であり、鳥類が、カモ、ガチョウ、アヒルもしくはダチョウ、または、これらのいずれか一つの鳥類の交雑によって得られた鳥類である、上記［９］に記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［１１］ヤギが、カシミヤ、モヘヤ、アンゴラおよびカシゴラから選択されるヤギ（好ましくはカシミヤ）である、上記［１０］に記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維（好ましくは動物繊維はアンダーファーまたはアンダーコートである）。
［１２］上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、動物繊維のスケールの間隔において大きい（例えば、５％～１０％大きい）動物繊維を有する、上記のいずれかに記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［１３］上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、動物繊維のスケールの厚みにおいて薄い（例えば、５～２０％薄い）動物繊維を有する、上記のいずれかに記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［１４］上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、動物繊維のスケールの厚みにおいて薄い（例えば、５～２０％薄い）動物繊維を有する、上記［１２］に記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［１５］上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、光沢を有する、上記のいずれかに記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［１６］上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、動物繊維のスケールの間隔において大きい（例えば、５％～１０％大きい）動物繊維を有する、上記［２］に記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［１７］上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、動物繊維のスケールの厚みにおいて薄い（例えば、５～２０％薄い）動物繊維を有する、上記［２］に記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
［１８］上記遺伝子改変を有しない同種同系または同種異系の対照動物の動物繊維と比較して、動物繊維のスケールの厚みにおいて薄い（例えば、５～２０％薄い）動物繊維を有する、上記［１６］に記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。

［１９］上記いずれかの遺伝子改変動物を得ることに用いるための材料であって、遺伝子改変を有する遺伝子改変動物またはその生殖細胞（例えば、精子または卵子）を含み、前記遺伝子改変は、ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、前記１つ以上の遺伝子の破壊である、材料。
［２０］上記［１９］に記載の材料であって、
　ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、Ｋａｐ８－１およびＫａｐ８－２のいずれかまたは両方を含む、材料。
［２１］上記［１９］に記載の材料であって、
　ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４から選択される１つ以上の遺伝子を少なくとも含む、材料。
［２２］上記［２０］に記載の材料であって、
　ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４から選択される１つ以上の遺伝子を少なくとも含む、材料。
［２３］前記遺伝子改変は、ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、上記［１９］に記載の材料。
［２４］ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、上記［２０］に記載の材料。
［２５］ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、上記［２１］に記載の材料。
［２６］ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、上記［２２］に記載の材料。

［２７］遺伝子改変動物が雄である、上記いずれかに記載の遺伝子改変動物またはその動物繊維。
［２８］遺伝子改変動物が雌である、上記いずれかに記載の遺伝子改変動物またはその動物繊維。
［２９］遺伝子改変動物が雄である、上記いずれかに記載の材料。
［３０］遺伝子改変動物が雌である、上記いずれかに記載の材料。
［３１］上記いずれかに記載の動物繊維の原毛であって、刺し毛とうぶ毛を含む、原毛。［３２］上記［３１］に記載の原毛から得られる製毛。
［３３］上記［３２］に記載の製毛を含む、紡毛糸または撚糸。
［３４］上記［３３］に記載の紡毛糸または撚糸を含む、織物。
［３５］上記［３４］に記載の織物を含む、被服。
［３６］上記［３４］に記載の織物を含む、動物繊維製品。

（１）　非ヒト動物のＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子の発現または機能を低下させることを含む、非ヒト動物の作製方法。
（２）　非ヒト動物のＫｒｔファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、非ヒト動物の内毛根鞘、毛表皮、毛皮質または毛髄質で発現するＫｒｔタンパク質をコードする遺伝子である、（１）に記載の方法。
（３）　内毛根鞘で発現するＫｒｔタンパク質をコードする遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４から選択される１以上の遺伝子である、（２）に記載の方法。
（４）　Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４から選択される1つ以上の遺伝子である、（３）に記載の方法。
（５）　非ヒト動物のＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、ＫＡＰ８－１を含む、（１）～（４）のいずれか一項に記載の方法。

（６）　非ヒト動物のＦｇｆ５および／またはＴｙｒ遺伝子の遺伝子の発現または機能を低下させることをさらに含む（１）～（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）　遺伝子の発現または機能を低下させることが、非ヒト動物の遺伝子のノックアウトである、（１）～（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）　非ヒト動物が、齧歯目または偶蹄目に属する、（７）に記載の方法。
（９）　（１）～（８）のいずれか一項に記載された方法によって作製された非ヒト動物またはその子孫。
（１０）　（９）に記載の非ヒト動物またはその子孫から得られた動物繊維。
（１１）　（１０）に記載の動物繊維を含む動物繊維製品。

＜１＞　ＫｒｔファミリーまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子の発現または機能の低下をもたらす改変を含む、非ヒト動物またはその子孫。
＜２＞　Ｋｒｔファミリーを構成する遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４からなる群から選択され、ＫＡＰファミリーを構成する遺伝子が、ＫＡＰ８サブファミリーからなる群から選択される、＜１＞に記載の非ヒト動物またはその子孫。
＜３＞　さらにＦｇｆ５および／またはＴｙｒ遺伝子の発現または機能の低下をもたらす改変を含む、＜１＞または＜２＞に記載の非ヒト動物またはその子孫。
＜４＞　遺伝子の発現または機能の低下をもたらす改変が、ノックアウトである、＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載の非ヒト動物またはその子孫。

＜５＞　動物繊維の平均繊維径が野生型よりも有意に細い非ヒト動物を作製する方法であって、非ヒト動物のＫｒｔファミリーを構成する遺伝子、ＫＡＰファミリーを構成する遺伝子、非ヒト動物のＫｒｔファミリーを構成する遺伝子、ＫＡＰファミリーを構成する遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現もしくは機能の低下させることを含む、前記方法。
＜６＞　動物繊維の平均スケール厚が野生型よりも有意に小さい非ヒト動物を作製する方法であって、非ヒト動物のＫｒｔファミリーまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子の発現もしくは機能を低下させることを含む、前記方法。
＜７＞　動物繊維のスケール間隔が、野生型よりも有意に長い非ヒト動物を作製する方法であって、非ヒト動物のＫｒｔファミリーを構成する遺伝子、ＫＡＰファミリーを構成する遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現もしくは機能の低下させることを含む、前記方法。
＜８＞　Ｋｒｔファミリーを構成する遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４からなる群から選択され、ＫＡＰファミリーを構成する遺伝子が、ＫＡＰ８－１サブファミリーからなる群から選択される、＜５＞～＜７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９＞　さらに非ヒト動物のＦｇｆ５および／またはＴｙｒ遺伝子の発現もしくは機能を低下させることを含む、＜５＞～＜８＞のいずれか一項に記載の方法。

＜１０＞　遺伝子の発現もしくは機能を低下または喪失させることが、遺伝子のノックアウトである、＜５＞～＜９＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１＞　＜５＞～＜１０＞のいずれか一項に記載の方法により作製された非ヒト動物またはその子孫。
＜１２＞　非ヒト動物またはその子孫が、哺乳類または鳥類である、＜５＞～＜１１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１３＞　哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、アルパカ、リャマ、ラクダ、ヤク、アイベックス、グァナコ、キヴィアック、チルー、タヌキ、ラクーン、ミンク、セーブル、フォックス、ポッサム、オポッサム、ビーバー、アザラシ、ヌートリア、フェレットもしくはビクーニャ、または、これらのいずれか一つの哺乳類の交雑によって得られた哺乳類であり、鳥類が、カモ、ガチョウ、アヒルもしくはダチョウ、または、これらのいずれか一つの鳥類の交雑によって得られた鳥類である、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞　ヤギが、カシミヤ、モヘヤ、アンゴラおよびカシゴラから選択される＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞　＜５＞～＜１４＞に記載された方法によって作製された非ヒト動物またはその子孫。
＜１６＞　＜１＞～＜４＞または＜１５＞に記載の非ヒト動物またはその子孫から得られた動物繊維。
＜１７＞　＜１６＞に記載の動物繊維を含む動物繊維製品。

（Ｐ１）遺伝子改変を有する非ヒト動物の動物繊維であって、
　前記非ヒト動物は動物繊維を有し、
　前記遺伝子改変は、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７４、およびＫＡＰ８－１からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、前記１つ以上の遺伝子の破壊である、
動物繊維｛但し、非ヒト動物は、イヌでもウシでもなくてよい｝。
（Ｐ２）上記（Ｐ１）に記載の動物繊維であって、
　（１）上記遺伝子改変を有しない動物の動物繊維と比較して、前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は、前記１つ以上の遺伝子がコードするタンパク質の含有量が少ないか、もしくは、（２）前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は、前記１つ以上の遺伝子がコードするタンパク質を含まない、
動物繊維。
（Ｐ３）上記（Ｐ１）または（Ｐ２）に記載の動物繊維であって、
　上記遺伝子改変を有しない動物の動物繊維と比較して、前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は５％以上、１０％以上、または１５％以上小さな長径を有する、
動物繊維。
（Ｐ４）上記（Ｐ１）または（Ｐ２）に記載の動物繊維であって、
前記１つ以上の遺伝子が、Ｋａｐ８－１を少なくとも含む、動物繊維。
（Ｐ５）上記（Ｐ３）に記載の動物繊維であって、
　前記１つ以上の遺伝子が、Ｋａｐ８－１を少なくとも含む、動物繊維。
（Ｐ６）上記（Ｐ１）または（Ｐ２）に記載の動物繊維であって、
前記１つ以上の遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２およびＫｒｔ７４から選択される１つ以上の遺伝子を少なくとも含む、動物繊維。
（Ｐ７）上記（Ｐ３）に記載の動物繊維であって、
　前記１つ以上の遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２およびＫｒｔ７４から選択される１つ以上の遺伝子を少なくとも含む、動物繊維。
（Ｐ８）前記遺伝子改変は、ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、上記（Ｐ１）または（Ｐ２）に記載の動物繊維。
（Ｐ９）前記遺伝子改変は、ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、上記（Ｐ４）に記載の動物繊維。
（Ｐ１０）前記遺伝子改変は、ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、上記（Ｐ６）に記載の動物繊維。
（Ｐ１１）上記（Ｐ８）に記載の動物繊維を含む、布、織物、または繊維製品。
（Ｐ１２）上記（Ｐ９）に記載の動物繊維を含む、布、織物、または繊維製品。
（Ｐ１３）上記（Ｐ１０）に記載の動物繊維を含む、布、織物、または繊維製品。
（Ｐ１４）上記（Ｐ１）または（Ｐ２）に記載の動物繊維を含む、布、織物、または繊維製品。

　本発明の方法により、繊維径が細い動物繊維を持つ動物品種を作製することができる。さらに、このような動物から得られた繊維径が細い動物繊維は個体間でのばらつきも少なく、体毛全体が細い。そのため、手触り、柔軟性、伸縮性、保温性、速乾性などに優れた高品質な動物繊維の供給を実現できると考えられる。そして、かかる動物繊維は、繊維径が細いことに加えて、滑らかな繊維表面を持つ。したがって、かかる動物繊維は、従来の同等の繊維径を持つ動物繊維よりも手触り、着心地、光沢等の品質が優れている。かかる動物繊維はまた、ピリングやフェルト形成も生じにくいため、かかる品質を長期にわたって維持することができる。また、繊維径を細くし、滑らかな表面を持つ動物繊維を生産する過程で用いられてきた種々の化学的な方法を用いる必要がないことから、従来にない安全性の高い天然繊維を生産し得る。このように、本発明者らは、動物繊維を産毛する動物の遺伝子改変により、動物繊維としての好ましい特性を有する天然繊維が製造可能であることを実証し、環境負荷の低さおよび安全性に優れ、従来の化学的アプローチによる繊維製造と異なった新たな繊維生産のアプローチを見出した。

図１－１は、Ｋｒｔ７１の野生型（ＷＴ）および改変された各個体におけるＫｒｔ７１の配列を示す。図１－２は、改変された各個体におけるＫｒｔ７１の配列を示す。図１－３は、改変された各個体におけるＫｒｔ７１の配列を示す。図１－４は、改変された各個体におけるＫｒｔ７１の配列を示す。図２－１は、Ｋｒｔ７２の野生型（ＷＴ）および改変された各個体におけるＫｒｔ７２の配列を示す。図２－２は、改変された各個体におけるＫｒｔ７２の配列を示す。図２－３は、改変された各個体におけるＫｒｔ７２の配列を示す。図３－１は、Ｋｒｔ７３の野生型（ＷＴ）および改変された各個体におけるＫｒｔ７３の配列を示す。図３－２は、改変された各個体におけるＫｒｔ７３の配列を示す。図４－１は、Ｋｒｔ７４の野生型（ＷＴ）および改変された各個体におけるＫｒｔ７４の配列を示す。図４－２は、改変された各個体におけるＫｒｔ７４の配列を示す。図５は、ＫＡＰ８－１の野生型（ＷＴ）および改変された各個体におけるＫＡＰ８－１の配列を示す。図６は、ＫＡＰ８－２の野生型（ＷＴ）および改変された各個体におけるＫＡＰ８－２の配列を示す。図７は、Ｔｙｒの野生型（ＷＴ）および改変された個体におけるＴｙｒの配列を示す。図８は、Ｆｇｆ５の野生型（ＷＴ）および改変された個体におけるＦｇｆ５の配列を示す。図９は、ヤギのＫＡＰ８－１の野生型（ＷＴ）および改変された個体におけるＫＡＰ８－１の配列を示す。図１０は、野生型の個体および遺伝子改変された個体から得られた動物繊維の長径を示す。図１１は、野生型の毛、Ｋｒｔ７２変異体の毛、およびＫＡＰ８－１変異体の毛の電子顕微鏡写真を示す。図１２は、黒色毛を有する野生型マウスとそのＴｙｒ変異体の外観を示す。図１３は、野生型ヤギとＫＡＰ８－１破壊ヤギの毛の断面の長径を示す。図１４は、野生型の各種動物の毛に含まれるＫｒｔ７２とＫＡＰ８－１タンパク質の存在を示す、ウェスタンブロッティングの結果である。図１５は、様々な生物種のＫＡＰ８－１の配列のＫＡＰ８－１との同一性を示す。ヤギとハツカネズミのＫＡＰ８－１タンパク質内のドメイン（ＮＣＢＩ－ＣＤＤ　ＩＤ：２３９１６２；２３アミノ酸）を元にアミノ酸比較を行った。図１６は、様々な生物種のＫｒｔ７１の配列の同一性を示す。ヤギとハツカネズミのＫＲＴ７１タンパク質内のドメイン（ＮＣＢＩ－ＣＤＤ　ＩＤ：３６５８２７；３１４アミノ酸）を元にアミノ酸比較を行った。偶蹄目、肉食目はヤギＫＲＴ７１、げっ歯目、ウサギ目はハツカネズミＫＲＴ７１と比較した。図１７は、様々な生物種のＫｒｔ７２の配列の同一性を示す。ヤギとハツカネズミのＫＲＴ７２タンパク質内のドメイン（ＮＣＢＩ－ＣＤＤ　ＩＤ：３６５８２７；３１４アミノ酸）を元にアミノ酸比較を行った。偶蹄目、肉食目および双前歯目はヤギＫＲＴ７２、げっ歯目、ウサギ目はハツカネズミＫＲＴ７２と比較した。図１８は、様々な生物種のＫｒｔ７４の配列の同一性を示す。ヤギのＫＲＴ７２タンパク質内のドメイン（ＮＣＢＩ－ＣＤＤ　ＩＤ：３６５８２７；３１４アミノ酸）を元にアミノ酸比較を行った。

　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願及び他の出版物（オンライン情報を含む）は、その全内容を参照により本明細書に援用する。

　本明細書では、単数形の単語は、複数であることを除外しない。本明細書では、「含む」は、記載の無い構成を含んでいてもよいことを意味し、「からなる」を包含する。「からなる」は、記載の無い構成を実質的に含まない。

　本発明は、一態様において、非ヒト動物を作製する方法であって、ＫｒｔまたはＫａｐファミリーを構成する１つ以上の遺伝子の発現または機能を低下させることを含む前記方法が包含される。

　本明細書において「動物」は、動物繊維を発毛する動物であり、ヒトまたは非ヒト動物であり得、非ヒト動物は例えば、非ヒト哺乳類、および鳥類などであり得る。哺乳類としては、限定されずに、ネズミ科、チンチラ科、ヌートリア科、ビーバー科などの齧歯目、ウサギ科などのウサギ目、ヤギ亜科、ラクダ科、ウシ科などの偶蹄目（偶蹄類ともいう）、イヌ科、アライグマ科、イタチ科などの食肉目、ポッサム科などのクスクス亜目、オポッサム科などのオポッサム目などが包含される。本発明の一態様において、ネズミ科にはマウス（ハツカネズミなど）、ラット（クマネズミなど）など、チンチラ科にはチンチラなど、ヌートリア科にはヌートリアなど、ビーバー科にはビーバーなど、ウサギ科には家兎、野兎、アンゴラウサギなど、ヤギ亜科には、ヤギまたはヒツジなど、ラクダ科には、ラクダ（ヒトコブラクダ、フタコブラクダなど）、リャマ、ビクーニャ、アルパカ、グァナコなど、ウシ科にはヤク、キヴィアック（ジャコウウシ）、チルーなど、イヌ科にはオオカミ、タヌキ、フォックス（キツネ）など、アライグマにはラクーン（アライグマ）など、イタチ科にはフェレット、ミンク、セーブルなど、アザラシ科にはゴマフアザラシ、ワモンアザラシ、ゼニガタアザラシ、クラカケアザラシ、アゴヒゲアザラシなどが包含される。ヤギには、限定されずに、カシミヤヤギ、アイベックス、チャングラヤギ、アンゴラヤギ、シバヤギ、日本ザーネン、アルパイン、トカラヤギなどが包含される。ヒツジには、限定されずに、メリノ、ポロワス、コリデール、チェビオット、ペレンデール、ロムニー、サフォーク、マンクスロフタン、ジャコブ、フライスランドなどが含まれる。

　鳥類には、限定されずに、カモ科などのカモ目、ダチョウ科などのダチョウ目などが包含される。カモ科には限定されずに、マガモ、イエガモ、アヒル、ハクチョウ、ガン、ガチョウ、カリガネ、ヒシクイなど、ダチョウ科にはダチョウなどがそれぞれ包含される。
　非ヒト動物は、上で列挙したいずれか一つの非ヒト動物の交雑によって得られた非ヒト動物であってもよい。さらに非ヒト動物は、上記の野生型のほかに、本発明の対象遺伝子とは別の遺伝子が改変された非ヒト動物であってもよい。本発明の遺伝子改変により平均繊維径の減少の有用性の観点からマウス、ウサギ、ラクダ、ヤギまたはヒツジが好ましく、ヤギとしてはカシミヤヤギが特に好ましい。
　動物繊維は、ヒトの頭髪であってもよい。

　非ヒト動物の形態は、胚の形態であっても個体の形態であってもよい。胚は、個体発生能を持つ任意の細胞または細胞集団を指す。胚としては、例えば受精卵、初期胚、桑実胚、胚盤胞もしくはこれらに含まれる内部細胞塊のほか、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などが含まれる。個体は、飼育することで体表から動物繊維が発育（発毛）する。胚は、非ヒト動物の子宮に移植することにより個体に成長させることができる。胚または個体は、モザイクあるいはキメラであってもよい。遺伝子の発現または機能の低下が、対象遺伝子の遺伝子改変によってもたらされる場合、モザイクあるいはキメラの胚または個体であっても、少なくとも毛包を構成する細胞または生殖細胞系列の細胞に改変を含んでいればよい。毛包を構成する細胞が改変を有していれば、繊維径が細い動物繊維の発育が可能となり、生殖細胞系列の細胞が前記改変を有していれば、繊維径が細い動物繊維を発育する子孫を得ることが可能となる。ホモの遺伝子改変動物同士の掛け合わせでは、理論上１００％の確率でホモの遺伝子改変動物が得られ、ヘテロの遺伝子改変動物とホモの遺伝子改変動物との掛け合わせでは、理論上５０％の確率でホモの遺伝子改変動物が得られ、ヘテロの遺伝子改変動物同士の掛け合わせでは、理論上２５％の確率でホモの遺伝子改変動物が得られる。遺伝子改変は、好ましくは、ホモの遺伝子改変であり、すなわち、父方および母方の染色体の両方で行われている。

　毛包を構成する細胞は、限定されずに、毛母体に含まれる毛母細胞（上皮細胞）、色素産生細胞（メラノサイト）、毛根鞘に含まれる立方上皮細胞、毛隆起に含まれる毛包幹細胞または色素幹細胞、毛乳頭細胞および毛球部毛根鞘細胞などが挙げられる。毛包は、単一毛包であっても複合毛包であってもよい。単一毛包の場合、一次毛包であっても二次毛包であってもよい。生殖細胞系列は、限定されずに、卵子、精子などの配偶子、またはそれらの基となる始原生殖細胞、卵祖細胞、卵母細胞、卵原細胞、精原細胞、精細胞などを指す。

　本明細書において「動物繊維」とは、上述のヒトまたは非ヒト動物の動物繊維を指し、例えば、非ヒト動物が哺乳類であれば獣毛繊維を、非ヒト動物が鳥類であれば羽毛繊維を指す。本明細書では「動物繊維」を「毛」または「体毛」とも称することがある。獣毛繊維は、典型的には上で詳述した哺乳類に由来する動物繊維である。具体的には、例えばマウスの毛、ラットの毛、チンチラの毛である「チンチラ」、家兎または野兎の毛である「ラビット」、アンゴラウサギの毛である「アンゴラ」、カシミヤヤギの毛である「カシミヤ」、アンゴラヤギの毛である「モヘヤ」、ヒツジの毛である「羊毛」または「ウール」、アルパカの毛である「アルパカ」、リャマの毛である「リャマ」、フタコブラクダの毛である「キャメル」、ヤクの毛である「ヤク」、アイベックスの毛である「アイベックス」、グァナコの毛である「グァナコ」、キヴィアックの毛である「キヴィアック」、チルーの毛である「チルー」、タヌキの毛、ラクーンの毛である「ラクーン」、ミンクの毛である「ミンク」、セーブルの毛である「セーブル」、ポッサムの毛である「ポッサム」、キツネの毛である「フォックス」、オポッサムの毛である「オポッサム」、ビーバーの毛である「ビーバー」、アザラシの毛である「アザラシ」、ヌートリアの毛である「ヌートリア」、フェレットの毛である「フェレット」またはビクーニャの毛である「ビキューナ」が挙げられる。これらの例から分かるように、本発明においては、動物の名前と獣毛の名前に同じ呼び名を使用することがある。本発明において、獣毛繊維は、刺し毛（ガードヘアー）であっても綿毛（アンダーヘアー、アンダーコート、アンダーファー、またはうぶ毛ともいう）であってよい。カシミヤは、カシミヤヤギから得られた体毛から刺し毛を除去して得られる、綿毛を主に含む、または綿毛からなる体毛である。

　羽毛繊維には、鳥類由来の繊維であれば限定されない。典型的には上で詳述した鳥類に由来する動物繊維である。具体的には、例えばカモ、ガチョウ、アヒル、ウズラ、ニワトリ、シチメンチョウ、オナガドリ、チャボ、ハト、ダチョウ、キジ、ホロホロチョウまたはダチョウの羽毛などが包含される。羽毛繊維は、限定されずに、正羽、綿羽、半綿羽などが含まれる。本発明の動物繊維は、非ヒト動物から刈り取られた原毛のほか、原毛を選別、洗浄または切断等したもの、および／またはこれらをスケール剥離処理、酵素処理またはパルス処理などの処理任意の加工処理を加えたものも包含される。

　本明細書において「Ｋｒｔファミリー」は、ケラチン（Keratin）タンパク質をコードする遺伝子ファミリーを指す。「Ｋｒｔファミリーを構成する１つ以上の遺伝子」を、本明細書ではＫｒｔ遺伝子とも呼ぶ。また、Ｋｒｔ遺伝子がコードするタンパク質をＫｒｔタンパク質とも呼ぶ。一般的に、Ｋｒｔ遺伝子またはＫｒｔタンパク質は、Ｋｒｔの他に、限定されずに、例えばＣｋ、ＣＫ、ＫＲＴ、Ｋなどのシンボルで表されることもあるが、本明細書ではこれらのシンボルで表される遺伝子またはタンパク質のシンボルを「Ｋｒｔ」で表す。

　本発明においてＫｒｔ遺伝子は、非ヒト動物のゲノム中に保持されるＫｒｔ遺伝子のメンバーであってよく、好ましくは、ＩＩ型（中性～塩基性）のケラチンタンパク質をコードする遺伝子であってよい。本発明においてＫｒｔ遺伝子は、好ましくは、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４からなる群から選択される１以上の遺伝子であり、より好ましくは、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、およびＫｒｔ７４からなる群から選択される１以上の遺伝子であり、さらに好ましくはＫｒｔ７２である。

　本発明の一態様において、Ｋｒｔ遺伝子は、非ヒト動物の個体が成長する間に、毛包を構成する細胞で発現するＫｒｔ遺伝子であってよい。個体が成長する間とは、特に非ヒト動物から動物繊維が発育（発毛）する間を指し、特定の時間または季節など特定の期間にのみ発現するものであってよい。特に発毛量が高い期間に発現しているＫｒｔ遺伝子が好ましい。毛包は、非ヒト動物を構成する毛包であれば特に限定されない。

　このような発現は、毛包のトランスクリプトーム解析において通常に用いられているＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット、発現アレイ、ＲＮＡシーケンスなどの方法によって測定することができる。また、当業者はQiao et al., Genet Mol Res. 2016 Sep 2; 15(3)、Din et al., BMC Genomics. 2019 Feb 15; 20(1):140、Fan et al., Genet Mol Res. 2015 Dec 22; 14(4):17904-15、Zhu PLoS One. 2013 Sep 19; 8(9):e76282などで用いられている方法を参考に測定してもよいし、これらの文献に記載の遺伝子を参考にしてもよい。

　このような毛包での発現は、動物繊維中の構成タンパク質として反映されるため、毛包の直接的なトランスクリプトーム解析の代わりに、動物繊維のプロテオーム解析をすることで、毛包で発現したタンパク質を推定することができる。動物繊維のプロテオーム解析としては、通常に用いられている手法を採用すればよく、例えば動物繊維中のタンパク質を溶解等して、電気泳動、質量分析またはイムノアッセイなどの方法によって解析すればよい。当業者は、Plowman et al., Electrophoresis. 2000 May; 21(9): 1899-906、Plowman et al., J Proteomics. 2012 Jul 19;75(14):4315-24、Li et al., PLoS One. 2016 Jan 20; 11(1): e0147044などを参考にすることができる。

　動物繊維は、表皮から外部に出ている毛幹部と、毛包中に存在する毛根部からなる。毛包中の動物繊維の構造は、毛表皮（キューティクル）、毛皮質（コルテックス）および毛髄質（メデュラ）からなる毛幹が毛包の中心にあり、その外側を内毛根鞘が囲み、コンパニオン層を介して一番外側を外毛根鞘が囲んでいる。動物繊維の成長において、毛根部の下部に位置する毛球部（毛母体）に存在する毛母細胞の増殖、分化および角化が、中心的なプロセスの一部を占める。
　具体的には、毛根部で増殖した毛母細胞は、内毛根鞘を構成する細胞と、毛表皮、毛皮質および毛髄質を構成する３種類の毛幹細胞へ分化し、各部位で特異的な発現をしながら増殖し、角化する。

　このような動物繊維の成長プロセスにおいて、内毛根鞘で発現するＫｒｔタンパク質としてＫｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４のタンパク質が、知られている（Jeffrey E Plowman; Duane P Harland, Singapore Springer Singapore 2018, Hair Fibre: Proteins, Structure and Development参照）。Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４からなる群から選択される１以上の遺伝子は、少なくとも内毛根鞘を含む組織において改変されている。このとき改変は、内毛根鞘を含む組織に特異的であってもよい。

　本発明者らは、非ヒト動物のＫｒｔファミリーを構成する１つ以上の遺伝子、そのなかでも特に非ヒト動物の内毛根鞘、毛表皮、毛皮質または毛髄質で発現するＫｒｔタンパク質をコードする遺伝子の発現または機能を低下させることで、動物繊維の繊維径の減少、あるいは滑らかな繊維表面を付与できることを見出した。得られた動物繊維は、健全な層構造および靱性などを維持していた。
　したがって、一態様において、本発明は、非ヒト動物の内毛根鞘、毛表皮、毛皮質または毛髄質を含む組織で発現するＫｒｔタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現または機能を低下させることを含む、非ヒト動物の作製方法を含む。

　本発明の別態様において、Ｋｒｔファミリーを構成する１つ以上の遺伝子は、内毛根鞘で発現する遺伝子、すなわちＫｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４からなる群から選択される１以上をコードする遺伝子であってよい。

　サブファミリー分類を含むケラチンの系統解析は、当該技術分野で公知であり、Eckhart and Ehrlich, Adv Exp Med Biol. 2018;1054:33-45に記載されている。

　これらの各サブファミリーを構成するタンパクをコードする遺伝子は、発現時期、発現部位の共通性に加えて、配列の相同性が認められることから、同一の機能を持つと考えられる。したがって、各サブファミリー内のタンパク質をコードする遺伝子の発現または機能を低下させることで、サブファミリー単位で同じ形質が得られる。

　本発明の発現または機能を低下させるＫｒｔ遺伝子は、一態様において、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４からなる群から選択される１以上の遺伝子が好ましく、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、またはＫｒｔ７４が好ましく、Ｋｒｔ７２が特に好ましい。Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、およびＫｒｔ７４からなる群から選択される１以上の遺伝子（特にＫｒｔ７１）が改変される場合には、改変動物は、
　ネズミ科（但し、マウス以外）、チンチラ科、ヌートリア科、ビーバー科などの齧歯目、ウサギ科などのウサギ目；ヤギ亜科、ラクダ科、ウシ科などの偶蹄目（偶蹄類ともいう；但しウシ以外）；イヌ科、アライグマ科、イタチ科などの食肉目；ポッサム科などのクスクス亜目；およびオポッサム科などのオポッサム目であり得、
　チンチラ科、ヌートリア科、ビーバー科、ウサギ科などのウサギ目；ヤギ亜科、ラクダ科；イヌ科、アライグマ科、イタチ科などの食肉目；ポッサム科などのクスクス亜目；およびオポッサム科などのオポッサム目であり得る。したがって、動物繊維も、上記改変動物の動物繊維であり得る。一態様において、改変される遺伝子は、Ｋｒｔ７１を含まない。

　本発明の一態様において、Ｋｒｔ遺伝子は、ヒトまたは非ヒト動物の動物繊維を構成するタンパク質成分のうち、非主要成分をコードする遺伝子であってもよい。動物繊維は、約５０～６０％がケラチンであり、約２０～３０％がケラチン関連タンパク質（Keratin associated protein：ＫＡＰ）を含むマトリックスタンパク質で構成されている。非主要成分をコードする遺伝子とは、これらＫｒｔおよびＫＡＰタンパク質のうち、動物繊維を質量分析に供した場合、例えば上位１０以下、２０位以下、３０位以下に位置づけられるＫｒｔタンパク質をコードする遺伝子である。典型的には、例えばＫｒｔ８６、Ｋｒｔ８７、Ｋｒｔ８３、Ｋｒｔ８５、Ｋｒｔ８４、Ｋｒｔ３３ａ、Ｋｒｔ３１、Ｋｒｔ３４、Ｋｒｔ３３ｂ、Ｋｒｔ３５、Ｋｒｔ３２が主要成分をコードする遺伝子であり、これら主要成分以外の成分をコードする遺伝子が非主要成分をコードする遺伝子であり、例えば、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、またはＫｒｔ７４をコードする遺伝子である。

　本明細書において、「ＫＡＰファミリー」は、ケラチン関連タンパク質（Keratin associated protein）をコードする遺伝子ファミリーを指し、「ＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子」を、本明細書ではＫＡＰ遺伝子と呼ぶ。また、ＫＡＰ遺伝子がコードするタンパク質をＫＡＰタンパク質とも呼ぶ。一般的に、ＫＡＰ遺伝子またはＫＡＰタンパク質は、ＫＡＰの他に、例えばＫａｐ、Ｋｒｔａｐ、ＫＲＴＡＰなどのシンボルで表されることもあるが、本明細書ではこれらのシンボルで表される遺伝子またはタンパク質のシンボルを「ＫＡＰ」で表す。
　ＫＡＰ遺伝子は、本発明の非ヒト動物のゲノム中に保持されるＫＡＰファミリーのメンバーであれば、例えば、高グリシン／チロシンＫＡＰタンパク質をコードする遺伝子であり得る。

　本発明の一態様において、高グリシン／チロシンＫＡＰタンパク質をコードする遺伝子としては、ＫＡＰ８サブファミリーの遺伝子が挙げられ、ＫＡＰ８サブファミリーとしてはＫＡＰ８－１、およびＫＡＰ８－２が挙げられる。

　本発明の一態様においてＫＡＰ遺伝子は、高グリシン／チロシンＫＡＰタンパク質をコードするＫＡＰ遺伝子が好ましい。高グリシン／チロシンＫＡＰタンパク質をコードするＫＡＰとしてはＫＡＰ８サブファミリーが好ましい。ＫＡＰ８としてはＫＡＰ８－１が特に好ましい。ＫＡＰ８－１の改変としては、特に限定されないが、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、欠失、挿入などが上げられる。ある好ましい態様では、フレームシフト変異およびナンセンス変異は、破壊される遺伝子の５’末端側において、例えば、第１エクソン、または第２エクソン（好ましくは第１エクソン）において生じさせ得る。欠失は、例えば、１アミノ酸長以上、２アミノ酸長以上、好ましくは３アミノ酸長以上、より好ましくは４アミノ酸長以上、５アミノ酸長以上、６アミノ酸長以上、７アミノ酸長以上、８アミノ酸長以上、９アミノ酸長以上、１０アミノ酸長以上、２０アミノ酸長以上、３０アミノ酸長以上、４０アミノ酸長以上、５０アミノ酸長以上、または６０アミノ酸長以上の欠失であり得る。欠失はまた、例えば、GenBank: AAS00529.1として登録されたアミノ酸配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２のいずれか１以上のアミノ酸に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸において生じ得る。欠失は、ＫＡＰ８－１のタンパク質の機能の低下または消失を誘発するものであり得る。フレームシフト変異には、ＫＡＰ８－１をコードする核酸のエクソン領域におけるｎ塩基長の挿入又は欠失｛但し、ｎは３の倍数ではない自然数である。｝が挙げられる。ｎは例えば、１以上、２以上、４以上、５以上、７以上、８以上、１０以上、１１以上、１３以上、１４以上、１６以上、１７以上、１９以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、または１５０以上の自然数であり得る。フレームシフトは、ＫＡＰ８－１のタンパク質の機能の低下または消失を誘発するものであり得る。ナンセンス変異は、例えば、GenBank: AAS00529.1として登録されたアミノ酸配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２のいずれか１以上のアミノ酸に対応するＫＡＰ８－１の領域内において生じ得る。また、ミスセンス変異は、例えば、GenBank: AAS00529.1として登録されたアミノ酸配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２のいずれか１以上のアミノ酸に対応するＫＡＰ８－１の領域内において生じ得る。但し、ナンセンス変異およびミスセンス変異は、ＫＡＰ８－１の機能の低下または消失を誘発するものであり得る。ＫＡＰ８－１の欠失変異としては、例えば、GenBank: AAS00529.1として登録されたアミノ酸配列の位置３０および３１に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸の欠失であり得る。アミノ酸配列の特定位置に対応するアミノ酸とは、２つ以上のアミノ酸配列をアラインメントしたときに同じ位置に整列されるアミノ酸である。例えば、GenBank: AAS00529.1として登録されたアミノ酸配列の位置３０および３１に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸とは、GenBank: AAS00529.1として登録されたアミノ酸配列とＫＡＰ８－１のアミノ酸配列をアラインメントし、位置３０および３１のアミノ酸と同じ位置に整列されるＫＡＰ８－１のアミノ酸を意味する。

　本発明の一態様において、遺伝子改変動物は、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、およびＫｒｔ７４からなる群から選択される１以上の遺伝子と、ＫＡＰ８－１遺伝子の発現もしくは機能の低下、または、前記遺伝子の破壊を有する。本発明の一態様において、遺伝子改変動物は、Ｋｒｔ７１とＫＡＰ８－１の発現もしくは機能の低下、または、前記遺伝子の破壊を有する。遺伝子改変動物は、Ｋｒｔ７４とＫＡＰ８－１の発現もしくは機能の低下、または、前記遺伝子の破壊を有する。
本発明の好ましい態様では、遺伝子改変動物は、Ｋｒｔ７２とＫＡＰ８－１の発現もしくは機能の低下、または、前記遺伝子の破壊を有する。

　本発明のさらに好ましい態様では、遺伝子改変動物は、
Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、およびＫＡＰ８－１；
Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７４、およびＫＡＰ８－１；または
Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７４、およびＫＡＰ８－１
の発現もしくは機能の低下、または、前記遺伝子の破壊を有する。

　本発明のさらに好ましい態様では、遺伝子改変動物は、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７４、およびＫＡＰ８－１の発現もしくは機能の低下、または、前記遺伝子の破壊を有する。

　本発明の一態様では、遺伝子改変動物は、雄または雌である。求める動物繊維の特性によって、動物繊維毎に雄の動物繊維がよいか雌の動物繊維がよいかが決まっている場合には、求める動物繊維の特性に応じて雄または雌を選別し、その動物繊維を得ることができる。本発明の一態様では、遺伝子改変動物は、一定の年齢を有し得る。

　本発明の一態様では、前記遺伝子改変動物から、動物繊維（特に体毛）の平均繊維径（長径）が、前記遺伝子の改変を有しない同一動物の動物繊維（特に体毛）の平均繊維径（長径）の９５％以下、９０％以下、８５％以下、または８０％以下である、遺伝子改変動物を選択することができる。このようにすることで、遺伝子の改変を有する遺伝子改変動物であって、その動物繊維（特に体毛）の平均繊維径（長径）が、前記遺伝子の改変を有しない同種同系または同種異系の動物の動物繊維（特に体毛）の平均繊維径（長径）の９５％以下、９０％以下、８５％以下、または８０％以下である、遺伝子改変動物であって、前記遺伝子の改変が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７４、およびＫＡＰ８－１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現もしくは機能の低下、または、前記遺伝子の破壊を有する、遺伝子改変動物が提供される。対照動物は、同種同系であることが好ましいが、同種同系の対照動物を入手できない場合には、同種異系の動物とすることができる。同種異系の動物は、好ましくは、同種異系の野生型の動物であり、より好ましくは、改変前の動物である。改変前と改変後とで比較することで、遺伝子改変の効果を最も適切に評価し得る。

　本発明は、一態様において、ＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現または機能を低下させることを含む前記方法が包含される。

　本発明は、一態様において、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、およびＫｒｔ７４からなる群から選択される１以上の遺伝子と、ＫＡＰ８－１遺伝子の発現もしくは機能を低下させること、または前記遺伝子を破壊する（ノックアウト）することを含む。

　本明細書におけるＦｇｆ５遺伝子は、ＦＧＦ５（Fibroblast growth factor 5）をコードする遺伝子を指す。一般的にＦｇｆ５の他に、限定されずに、例えばＦＧＦ－５、ＨＢＧＦ－５などのシンボルで表されることもあるが、本明細書ではこれらのシンボルで表される遺伝子を「Ｆｇｆ５」で表す。

　本明細書におけるＴｙｒ遺伝子は、Tyrosinaseをコードする遺伝子を指す。一般的にＴｙｒの他に、限定されずに、例えば、ＴＹＲ、ＬＢ２４－ＡＢ、ＳＫ２９－ＡＢなどのシンボルで表されることもあるが、本明細書ではこれらのシンボルで表される遺伝子を「Ｔｙｒ」で表す。

　本明細書において、Ｋｒｔ遺伝子、Ｋａｐ遺伝子Ｆｇｆ５遺伝子、Ｔｙｒ遺伝子を総称して「対象遺伝子」と呼ぶこともある。また対象遺伝子がコードするタンパク質を「対象タンパク質」と呼ぶこともある。

　本明細書において、「ホモログ」とは、進化的な起源を同じくする類似性の高い遺伝子の一群を指す。ホモログは「オーソログ」と「パラログ」の２種類に分類される。オーソログは、種分岐の際に同じ遺伝子だったホモログを指す。パラログは、同種内において遺伝子重複によって生じたホモログを指す。

　Ｋｒｔ７１は、種々の生物種においてその核酸配列およびアミノ酸配列が知られている。マウスＫｒｔ７１は、例えば、GenBank: AAI25349.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７１のアミノ酸配列を有する。ヤギＫｒｔ７１は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_017903206.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７１のアミノ酸配列を有する。ヒツジＫｒｔ７１は、例えば、GenBank: AFV46425.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７１のアミノ酸配列を有する。ウサギＫｒｔ７１は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_002711049.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７１のアミノ酸配列を有する。ミンクＫｒｔ７１は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_044084420.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７１のアミノ酸配列を有する。ヒトＫｒｔ７１は、例えば、GenBank: AAI03919.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７１のアミノ酸配列を有する。当業者であれば、各生物種についてＫｒｔ７１の遺伝子およびタンパク質のアミノ酸配列を決定することができるであろう。

　Ｋｒｔ７２は、種々の生物種においてその核酸配列およびアミノ酸配列が知られている。マウスＫｒｔ７２は、例えば、GenBank: EDL04025.1登録としてされたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７２のアミノ酸配列を有する。ヤギＫｒｔ７２は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_013832621.2として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７２のアミノ酸配列を有する。ヒツジＫｒｔ７２は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_004006372.2またはNCBI Reference Sequence: XP_042102628.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７２のアミノ酸配列を有する。ウサギＫｒｔ７２は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_008254713.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７２のアミノ酸配列を有する。ミンクＫｒｔ７２は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_044085134.1またはNCBI Reference Sequence: XP_044085135.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７２のアミノ酸配列を有する。ヒトＫｒｔ７２は、例えば、GenBank: AAI13687.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７２のアミノ酸配列を有する。当業者であれば、各生物種についてＫｒｔ７２の遺伝子およびタンパク質のアミノ酸配列を決定することができるであろう。

　Ｋｒｔ７４は、種々の生物種においてその核酸配列およびアミノ酸配列が知られている。マウスＫｒｔ７４は、例えば、GenBank: EDL04026.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７４のアミノ酸配列を有する。ヤギＫｒｔ７４は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_005701908.2として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７４のアミノ酸配列を有する。ヒツジＫｒｔ７４は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_004006373.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７４のアミノ酸配列を有する。ミンクＫｒｔ７４は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_044085217.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７４のアミノ酸配列を有する。ヒトＫｒｔ７４は、例えば、GenBank: KAI2565848.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫｒｔ７４のアミノ酸配列を有する。当業者であれば、各生物種についてＫｒｔ７４の遺伝子およびタンパク質のアミノ酸配列を決定することができるであろう。

　keratin associated protein 8-1（ＫＡＰ８－１）は、種々の生物種においてその核酸配列およびアミノ酸配列が知られている。マウスＫＡＰ８－１は、例えば、NCBI Reference Sequence: NP_034805.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸配列を有する。ヤギＫＡＰ８－１は、例えば、GenBank: AAS00529.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸配列を有する。ヒツジＫＡＰ８－１は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_027834241.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸配列を有する。ウサギＫＡＰ８－１は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_017202204.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸配列を有する。ミンクＫＡＰ８－１は、例えば、NCBI ReferenceSequence: XP_044110896.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸配列を有する。ヒトＫＡＰ８－１は、例えば、NCBI Reference Sequence: NP_787053.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＫＡＰ８－１のアミノ酸配列を有する。当業者であれば、各生物種についてＫＡＰ８－１の遺伝子およびタンパク質のアミノ酸配列を決定することができるであろう。

　線維芽細胞増殖因子５（Ｆｇｆ５）は、種々の生物種においてその核酸配列およびアミノ酸配列が知られている。マウスＦｇｆ５は、例えば、GenBank: AAH71227.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＦｇｆ５のアミノ酸配列を有する。ヤギＦｇｆ５は、例えば、GenBank: AIZ78004.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＦｇｆ５のアミノ酸配列を有する。ヒツジＦｇｆ５は、例えば、GenBank: AID52934.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＦｇｆ５のアミノ酸配列を有する。ウサギＦｇｆ５は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_008265908.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＦｇｆ５のアミノ酸配列を有する。ミンクＦｇｆ５は、例えば、NCBI Reference Sequence: XP_044080065.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＦｇｆ５のアミノ酸配列を有する。ヒトＦｇｆ５は、例えば、GenBank: AAB06463.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するＦｇｆ５のアミノ酸配列を有する。当業者であれば、各生物種についてＦｇｆ５の遺伝子およびタンパク質のアミノ酸配列を決定することができるであろう。Ｆｇｆ５は、外毛根鞘において発現し、したがって、外毛根鞘を含む組織において改変することができる。改変は組織特異的であってもよい。

　チロシナーゼ（ｔｙｒ）は、種々の生物種においてその核酸配列およびアミノ酸配列が知られている。マウスＴｙｒは、例えば、GenBank: BAA00341.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するｔｙｒのアミノ酸配列を有する。ヤギＴｙｒは、例えば、GenBank: AEV91332.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するｔｙｒのアミノ酸配列を有する。ヒツジｔｙｒは、例えば、GenBank: ACF21682.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するｔｙｒのアミノ酸配列を有する。ウサギｔｙｒは、例えば、NCBI Reference Sequence: NP_001075546.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するｔｙｒのアミノ酸配列を有する。ミンクｔｙｒは、例えば、GenBank: AJO15925.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するｔｙｒのアミノ酸配列を有する。ヒトｔｙｒは、例えば、GenBank: AAB60319.1として登録されたアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対応するｔｙｒのアミノ酸配列を有する。

　上記アミノ酸配列を有するタンパク質のオーソログまたはホモログは、これらのアミノ酸配列のいずれかと高い相同性を有する。高い相同性とは、５０％以上、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、さらには９６％、９７％、９８％又は９９％以上)の相同性を意味する。この相同性は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するprotein BLASTアルゴリズムのデフォルトパラメータで決定することができる。

　上述のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列は、ＮＣＢＩの国立医学図書館の核酸配列検索により決定することができる。また、アミノ酸配列に基づいてコドン対応表から核酸配列を決定することもできるであろう。核酸配列は、当該核酸配列を発現する細胞に対してコドン最適化がなされていてもよいであろう。また、上記タンパク質のいずれかをコードする塩基配列を持つＤＮＡは、天然の核酸配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを利用して単離することができる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ，４２℃」、「１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、３７℃」であり、よりストリンジェントな条件として「２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ，４２℃」および「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」などの条件を挙げることができる。当業者は、他の生物における上述の配列番号１～２６に記載の塩基配列またはシンボルをもとにホモログの塩基配列を適宜取得することが可能である。

　上記の具体的アミノ酸配列を有するタンパク質以外の対象タンパク質であっても、高い相同性（通常６５％以上、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有し、かつ、対象タンパク質が有する機能を持つタンパク質も、それぞれ本発明の対象タンパク質に含まれる。

　本明細書において「遺伝子の発現または機能を低下させること」とは、対象遺伝子または対象タンパク質の発現を低下または消失させること、または、対象タンパク質の機能を低下または消失させること、を意味する。対象遺伝子の発現または機能を低下させる方法としては、例えば、対象遺伝子を破壊等すること、対象遺伝子の転写を抑制すること、対象遺伝子の転写物を分解すること、対象遺伝子の翻訳を阻害すること、対象タンパク質と他の分子との相互作用を阻害すること、対象タンパク質の正常な折り畳みを阻害することなどが挙げられる。

　これらの方法を実現する具体的な手段として、ヒトまたは非ヒト動物におけるゲノムの改変を伴う手段と、改変を伴わない手段とが挙げられる。ゲノムの改変を伴わない手段としては、対象遺伝子の発現または機能を低下させるエピジェネティック制御因子、阻害性核酸因子（ｍｉＲＮＡなど）、ＲＮＡ編集因子などの発現コンストラクト、あるいは対象タンパク質に結合する任意の低分子などの投与が挙げられる。本発明の好ましい例は、ヒトまたは非ヒト動物の子孫からも所望の形質を持つ動物繊維が得られる観点から、対象遺伝子の改変を伴う手段が好ましい。

　本明細書の「改変」は、人為的にヌクレオチドを欠失、置換および/または挿入し、所定の塩基配列を他の塩基配列へ変更することを意味する。ヌクレオチドは、１塩基のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、長鎖ヌクレオチドなどであってもよい。改変としては、例えば、ミスセンス変異、フレームシフト変異、ナンセンス変異、および１以上のアミノ酸の欠失が挙げられる。遺伝子改変動物は、改変により、当該改変を受けた遺伝子もしくはタンパク質の発現または機能を低下させ、または当該改変を受けた遺伝子もしくはタンパク質が破壊される。
　本明細書において「ノックアウト」は、対象遺伝子の発現または機能の低下をもたらす改変、好ましくは対象遺伝子の破壊を意味する。ノックアウトは、このような改変であれば限定されず、対象領域の改変であっても、対象領域以外のゲノム上の任意の領域の改変であってもよい。本明細書において「対象領域」とは、対象遺伝子のコード領域、およびコード領域外で対象遺伝子の発現を制御する任意のシスまたはトランスエレメントをコードする領域を呼ぶ。ゲノム上の任意の領域の改変には、対象遺伝子の発現もしくは機能の低下または破壊をもたらす外部遺伝子の挿入、例えば、ゲノム編集因子、阻害核酸因子、ＲＮＡ編集因子、エピジェネティック制御因子など発現する発現カセットを挿入する改変も包含される。このような発現カセットは、挿入後、直ちに対象遺伝子の発現もしくは機能の低下または破壊を引き起こさなくても、所定の期間経過後に低下または破壊をもたらすものであればよい。

　本発明において、ノックアウトは、対象領域の一部又は全部の改変であってよい。「一部」とは、対象領域の一部であって、遺伝子の発現もしくは機能の低下または破壊をもたらすのに必要な長さの領域である。ヌクレオチドを対象領域へ欠失、挿入する場合、フレームシフトにより遺伝子の発現もしくは機能の低下または破壊、特に消失させることができ、フレームシフトが起こらない場合でも欠失、置換、挿入によって終止コドンが生じるナンセンス変異によって対象タンパク質の発現もしくは機能の低下または破壊、特に消失させることができる。複数のエクソンを持つ遺伝子については、限定されずに第１、第２、第３、第４、第５、第６など任意のエクソンの改変であってよいが、好ましくは第１エクソンや第２エクソンの改変（フレームシフト変異またはナンセンス変異）であり得る。

　本発明において、ノックアウトは、遺伝子の発現もしくは機能の低下または破壊をもたらすことができれば、ホモであってもヘテロであってもよい。本明細書において「ホモ」とは、父方および母方の染色体の両方（両アレル）に改変を有することを意味し、本明細書において[-/-]と示すこともある。本明細書において「ヘテロ」とは、遺伝子改変に対して用いられる場合、父方または母方のいずれか一方のみ（片アレル）に改変を有することを意味し、本明細書において[-/+]または[+/-]と示すこともある。ヘテロのノックアウトであっても、ドミナントネガティブ変異であれば遺伝子の機能が消失し、その他の変異であっても片アレルで発現または機能低下すれば、全体として発現または機能低下をもたらし得ることが理解できる。ホモ、ヘテロいずれであっても当該改変は、子孫の一部または全てに遺伝するため、その子孫も遺伝子の発現または機能の低下をもたらす改変を有し、有益である。本発明において、ノックアウトは、表現型をもたらす観点および効率よくホモのノックアウト動物を得る観点で、好ましくはホモのノックアウトである。

　改変の方法は限定されずに、ゲノム編集および相同組換えなど任意の方法により行うことができる。簡便性と改変効率の高さから、ゲノム編集が好ましい。ゲノム編集は、例えば、標的の２本鎖ＤＮＡを切断するヌクレアーゼと、当該ヌクレアーゼと結合するＤＮＡ認識成分とを含むゲノム編集因子を利用した方法が挙げられる。ゲノム編集としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが挙げられる。例えば、ＺＦＮでは、ＦｏｋＩ（ヌクレアーゼ）とジンクフィンガーモチーフ（ＤＮＡ認識成分）が用いられ、ＴＡＬＥＮでは、ＦｏｋＩ（ヌクレアーゼ）とＴＡＬエフェクター（ＤＮＡ認識成分）が用いられ、ＣＲＩＳＰＲでは、Ｃａｓ（ヌクレアーゼ）とｇｕｉｄｅＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ＤＮＡ認識成分）が用いられる。ゲノム編集に用いられるヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有していればよく、ヌクレアーゼ以外にＤＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼなどを用いることもできる。

　ヌクレアーゼとしては、限定されずに、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ（ＴｙｐｅＩＡ～Ｃ、ＴｙｐｅＩ－Ｄ（Ｃａｓ３’、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ）、ＴｙｐｅＩ－Ｅ（Ｃａｓ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６））、タイプＩＩ（Ｃａｓ９など）タイプＩＩＩおよびタイプＶ（Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１、ＭＡＤ２、ＭＡＤ７など）を用いることができる。一態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓでは、ＤＮＡ認識成分としてｇＲＮＡが用いられるが、ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡであってもｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡによるデュアルｇＲＮＡであってもよい。また、ゲノム編集は必ずしもヌクレアーゼ活性を伴う必要はなく、Prime editingやTarget-AIDなどを任意の編集手段を用いることができる。(Anzalone et al., 2019 Nature vol 576, pages 149-157、Nishimasu et al., Science 21 Sep 2018: Vol. 361, Issue 6408, pp. 1259-1262)。

　対象遺伝子を標的とするｇＲＮＡの標的配列の設計方法は、通常の方法を用いて設計してよい。例えば、Naito et al., Bioinformatics. 2015 Apr 1; 31(7): 1120-1123、Park et al., Bioinformatics. 2016 Jul 1; 32(13): 2017-2023に記載されている。これらの文献および対象遺伝子等の配列情報に基づいてｇＲＮＡを作製することができる。
　マウスＫｒｔ７１を標的とするｇＲＮＡの標的配列としては限定されず、配列番号１～３の配列を使用することができる。その他の動物種では、上記ｇＲＮＡの標的配列に対応する塩基配列を有するｇＲＮＡを用いて、Ｋｒｔ７１遺伝子を破壊することができる。
　マウスＫｒｔ７２を標的とするｇＲＮＡの標的配列としては限定されず、配列番号４～６の配列を使用することができる。その他の動物種では、上記ｇＲＮＡの標的配列に対応する塩基配列を有するｇＲＮＡを用いて、Ｋｒｔ７２遺伝子を破壊することができる。
　マウスＫｒｔ７４を標的とするｇＲＮＡの標的配列としては限定されず、配列番号１０～１２の配列を使用することができる。その他の動物種では、上記ｇＲＮＡの標的配列に対応する塩基配列を有するｇＲＮＡを用いて、Ｋｒｔ７４遺伝子を破壊することができる。
　マウスＫＡＰ８－１を標的とするｇＲＮＡの標的配列としては限定されず、配列番号１３～１５の配列を使用することができる。その他の動物種では、上記ｇＲＮＡの標的配列に対応する塩基配列を有するｇＲＮＡを用いて、ＫＡＰ８－１遺伝子を破壊することができる。
　マウスＴｙｒ配列を標的とするｇＲＮＡの標的配列としては限定されず、配列番号１９～２１の配列を使用することができる。その他の動物種では、上記ｇＲＮＡの標的配列に対応する塩基配列を有するｇＲＮＡを用いて、ＫＡＰ８－１遺伝子を破壊することができる。
　マウスＦｇｆ５配列を標的とするｇＲＮＡの標的配列としては限定されず、配列番号２２～２４の配列を使用することができる。その他の動物種では、上記ｇＲＮＡの標的配列に対応する塩基配列を有するｇＲＮＡを用いて、ＫＡＰ８－１遺伝子を破壊することができる。

　改変対象としては、例えば胚、体細胞、生殖細胞、個体などが挙げられる。ゲノム編集因子を胚へ導入する場合、導入によって改変された胚を個体の子宮内へ移植して非ヒト動物個体を得ることができる。体細胞へ導入する場合、導入によって改変された体細胞の核を除核卵細胞に導入する核移植を経て得られた胚を個体の子宮内へ移植すればよい。その他に、改変された胚由来の細胞を他の胚へ混入させて作製したキメラ胚を個体の子宮内へ移植することもできる。生殖細胞へ導入する場合、導入して改変された生殖細胞をそのまま利用して、または個体へ移植して受精（自然交配、人工授精または体外受精など）を経て非ヒト動物個体を得ることができる。

　個体へ導入する場合、ウイルスベクターなどの形でゲノム編集因子を含む組成物を個体へ直接投与して改変細胞を持つ非ヒト動物を得ることもできる。この場合、少なくとも毛包を構成する細胞に改変が生じれば動物繊維の繊維径が細くなる等の形質が現れ、生殖系列に改変が生じれば、その子孫に対象遺伝子の発現または機能の低下がもたらされ得る。改変対象が、改変されたかどうかは、例えばＰＣＲ、サザンブロット、ゲノムシークエンスなど通常の方法を用いて判定すればよい。

　導入方法としては、限定されずエレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、デキストラン法、マイクロインジェクション法、ｉＴＯＰ（D'Astolfo et al., Cell. 2015; 161(3): 674-690）、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを用いることができる。胚への導入には、導入効率の高さからエレクトロポレーション法が好ましい。個体への導入には、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを用いた送達手法が好ましい。ウイルスベクターとしては、限定されずに、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスなどをベースとするベクターが挙げられる。

　本発明の一態様において、非ヒト動物の遺伝子を改変する他に、非ヒト動物へ阻害性核酸を投与してもよい。阻害性核酸は、標的分子の発現を阻害する核酸を意味し、ＲＮＡｉ分子、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ模倣物、ｐｉＲＮＡ（Piwi-interacting RNA）、リボザイム、アンチセンス核酸、ボナック核酸（WO 2012/005368）等を含む。核酸は、修飾核酸を含んでいてもよく、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド分子（ギャップマー、ミクスマー等）であってもよい。

　ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）分子は、ＲＮＡｉ活性を有する任意の分子を意味し、例えば、限定されずに、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）などを包含する。ＲＮＡｉ干渉は、典型的には、二本鎖核酸分子が誘導する、標的ＲＮＡが配列特異的に分解される現象を指す。二本鎖核酸分子は細胞内に入ると、その長さに応じてダイサーにより切断された後、Argonaute（ＡＧＯ）タンパク質を含むＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。ＲＩＳＣは、標的ＲＮＡと相補的な配列を有するアンチセンス鎖（ガイド鎖）をガイド役に標的ＲＮＡを認識し、これを切断する。ｓｉＲＮＡは、典型的には、約２０～２５ｍｅｒの長さを有する二本鎖ＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、典型的には、ｓｉＲＮＡの二本鎖をＲＮＡからなるヘアピンを介して連結させて得られるＲＮＡである。

　ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構は、典型的には、ｍｉＲＮＡが誘導する配列特異的なＲＮＡの分解または翻訳抑制を指す。成熟ｍｉＲＮＡはArgonaute（ＡＧＯ）タンパク質を含むｍｉＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）に取り込まれ、主にシード配列（５'末端から２～８位の配列）と相補的なｍＲＮＡにｍｉＲＩＳＣを誘導し、ｍＲＮＡからの翻訳を抑制するとともに、ｍＲＮＡの３'末端に存在するポリＡテールを分解して短縮し、ｍＲＮＡの分解を促進する。ｐｉＲＮＡによる遺伝子発現制御機構は、典型的には、ｐｉＲＮＡが誘導する配列特異的なＲＮＡの分解を指す。ｐｉＲＮＡは、ＰＩＷＩサブファミリータンパク質であるＰｉｗｉタンパク質を含むｐｉＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｐｉＲＩＳＣ）に取り込まれると核内に移行し、標的遺伝子の転写を配列特異的に抑制する。ｒａｓｉＲＮＡ（repeat associated siRNA）もＰｉｗｉタンパク質を介した遺伝子サイレンシングを生じる。

　ｍｉｃｒｏＲＮＡ模倣物は、内因性ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能を模倣する核酸分子であり、当該技術分野において周知である（例えば、van Rooij and Kauppinen, EMBO Mol Med. 2014; 6(7): 851-64、Chorn et al., RNA. 2012; 18(10): 1796-804）。ｍｉｃｒｏＲＮＡ模倣物は化学修飾を含んでもよく、内因性ｍｉｃｒｏＲＮＡに対してヌクレオチド配列が変更されていてもよい。
　ｓｈＲＮＡは、互いに相補性を有するアンチセンス領域及びセンス領域と、その間に介在するループ領域とを含む１本鎖ＲＮＡ分子であり、アンチセンス領域とセンス領域との対合により二重鎖領域が形成され、ヘアピン状の３次元構造を呈する。ｓｈＲＮＡは細胞内でｄｉｃｅｒにより切断され、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成し、これがＲＩＳＣに取り込まれ、ＲＮＡ干渉を引き起こす。

　ｓｈＲＮＡは典型的には、これをコードする核酸構築物や、これを含むプラスミド等により細胞内で発現され、その作用を発揮するが、ｓｈＲＮＡ分子を直接細胞に送達することも可能である。これらの阻害核酸は、本明細書に含まれる標的遺伝子の情報に基づいて公知の方法で適宜作製できる（Disney et al., Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018 Nov 1;10(11)、 Naito and Ui-Tei, Front Genet. 2012; 3: 102、 Mickiewicz et al., Acta Biochim Pol. 2016; 63(1): 71-77等）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３はＲＮＡを編集することができるため当該ゲノム編集因子は阻害性核酸と同様に遺伝子サイレンシングに用いることができる。

　本発明の方法において遺伝子の発現または機能の低下をもたらす種々の組成物を非ヒト動物へ投与する場合、経口及び非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、経皮、皮下、皮内、経粘膜、静脈内、筋肉内、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、心筋内、関節内、鼻腔内、腹腔内、気道内、気管支内、肺胞内、肺内及び子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形及び製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる。

　本発明において、ＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子（対象遺伝子）の発現もしくは機能の低下させ、または破壊していれば、それ以外に、他の任意の遺伝子の発現または機能を低下または向上させてよい。他の遺伝子としては、動物繊維に関する形質、またはそれ以外の任意の形質を非ヒト動物へ付与または向上させる遺伝子であってよい。遺伝子の発現または機能を低下もしくは機能の低下させ、または破壊する好ましい遺伝子としては、限定されずに、Ｆｇｆ－５、Ｔｙｒ、ＭＳＴＮ、ＡＳＩＰ、ＢＣＯ２、ＣＦＴＲなどであってよく、これらのノックアウトであってよい。遺伝子の発現または機能を向上させる好ましい遺伝子としては、限定されずに、Ｔβ４、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ－Ａ）、ＡＡＮＡＴ、ＡＳＭＴなどであってよく、例えば、これらの遺伝子を含む発現カセットのノックインであってよい。本発明の非ヒト動物の所望の形質を阻害しない限り、複数の遺伝子の発現または機能を同時に向上または低下させてよい。

　例示的な態様において、本発明の非ヒト動物は、対象遺伝子の発現または機能を低下させることに加えて、Ｆｇｆ５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の発現もしくは機能を低下させ、または破壊することをさらに含む。
　Ｆｇｆ５遺伝子の発現もしくは機能を低下させ、または破壊することで、非ヒト動物の動物繊維長が長くなる。また、Ｔｙｒ遺伝子の発現または機能を低下させることで、非ヒト動物の動物繊維の色が白くなる。このため、一態様において、本発明のＫｒｔまたはＫＡＰから選択される1以上の遺伝子の発現または機能の低下と、Ｆｇｆ５およびＴｙｒのいずれかまたは両方の発現または機能の低下を併せることで、繊維径が細く、繊維長の長い動物繊維を持つ非ヒト動物（ＫｒｔまたはＫＡＰから選択される1以上の遺伝子と、Ｆｇｆ５遺伝子の発現または機能低下）、繊維径が細く、白い動物繊維を持つ非ヒト動物（ＫｒｔまたはＫＡＰから選択される1以上の遺伝子と、Ｔｙｒ遺伝子の発現または機能低下）、繊維径が細く、繊維長が長く、白い動物繊維を持つ非ヒト動物（ＫｒｔまたはＫＡＰから選択される1以上の遺伝子と、Ｆｇｆ５と、Ｔｙｒ遺伝子の発現または機能低下）、あるいは、繊維長が長く、白い動物繊維を持つ非ヒト動物（Ｔｙｒと、Ｆｇｆ５遺伝子の発現または機能低下）をそれぞれ得ることができる。Ｆｇｆ５およびＴｙｒ遺伝子の発現もしくは機能を低下させ、または破壊する方法としては、上で詳述した対象遺伝子の発現もしくは機能を低下させ、または破壊する方法を使えばよい。

　これまでＦｇｆ５遺伝子のノックアウトを持つマウス、イヌ、ネコおよびヤギなどの動物で繊維長が長くなることが知られている（Cell. 1994 Sep 23; 78(6): 1017-25、Anim Genet. 2006 Aug; 37(4): 309-15、Anim Genet. 2007 Jun; 38(3): 218-21、PLoS One. 2016 Oct 18; 11(10): e0164640、）。また、Ｔｙｒ遺伝子のノックアウトを持つマウス、ウサギ、ウシおよびミンクなどの動物で動物繊維が白くなることが知られている（Mamm Genome. 2004 Oct; 15(10): 749-58、Mamm Genome. 2000 Aug; 11(8): 700-2、Mamm Genome. 2004 Jan; 15(1): 62-7、Anim Genet. 2008 Dec; 39(6): 645-8）。これらのことから、特定の非ヒト動物種における特定遺伝子の改変に基づく形質は、その形質が動物繊維に関連するものであれば、他の動物種のオルソログの改変においても同じ形質として現れることが分かる。これは、ＫｒｔまたはＫＡＰなどの遺伝子についても同様であると考えられる。

　本発明の方法によって作製された非ヒト動物は、ＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現もしくは機能の低下または破壊などの遺伝子改変を有する非ヒト動物の動物繊維の径（繊維径）は、上記遺伝子改変を有しない（例えば、遺伝子改変前の）同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の動物繊維と比較して繊維径が細い。遺伝子改変前の配列は本明細書に登録番号を伴って例示した通りの配列であり得る。繊維径は、典型的には平均繊維径（特に繊維の長径の平均）を指し、対照非ヒト動物は、典型的には野生型を指す。本発明の一態様において、ＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の改変を有する非ヒト動物の平均繊維径は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の平均繊維径よりも５％以上、６％％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、１６％以上、１７％以上、１８％以上、１９％以上、または２０％以上細い。上記改変を有する非ヒト動物の平均繊維径は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の平均繊維径よりも、例えば、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、または１０％以下細い。上記改変を有する非ヒト動物の平均繊維径は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の平均繊維径よりも５～４０％、５～３０％、５～２０％、１０～２０％、１５～２０％、５～１５％、１０～１５％、または５～１０％細い。同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の平均繊維径よりも５～２０％、１０～２０％、１５～２０％、５～１５％、１０～１５％、または５～１０％細い遺伝子改変動物は、上記改変を有する動物から選択して得ることができる。

　繊維径の減少は商業的価値を生じ得る。例えば、カシミヤは、平均繊維径を含む動物繊維の特性により等級分けがなされている（表１参照）。これによれば５％の繊維径の減少は、０．７５μｍ～０．９５μｍの平均径繊維径の減少に想到し、等級が１から２つ上昇することを意味する。また、２０％の繊維径の減少は、３等級の最大径１９μｍから１５．２μｍへの減少を意味し、３級から最高級への等級の上昇を意味する。この等級の上昇をもたらす改変技術の価値は破壊的であると考えられる。

　平均繊維径は、例えば、同じ齢の非ヒト動物の同じ体表の箇所から採取された、複数の動物繊維の同じ部分の直径（例えば、非ヒト動物の同じ箇所から採取された動物繊維の毛根部分から所定の長さ、または同じ方法で刈った動物繊維の根元から所定の長さの直径）を光学または電子顕微鏡などで観察し測定することができる。別の測定方法として、羊毛繊維試験方法として用いられている方法、例えば同じ齢の非ヒト動物から得られた複数の動物繊維を利用したプロジェクションミクロスコープ（IWTO1-8、JIS L 1081 Aの規格参照）、エアーフロー（IWTO-28、JIS L 1081 Bの規格参照）、レーザースキャン（JIS L 1081 Cの規格参照）、オプティカルアナライザ（IWTO-47、JIS L 1081 Dの規格参照）など任意の方法によって動物繊維の平均繊維径を測定することができる。動物繊維の直径は、好ましくは長径である。

　したがって一態様において、本発明は、平均繊維径が細い動物繊維の作製方法でもある。本態様において、非ヒト動物のＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現または機能を低下させることに加えて、非ヒト動物を飼育すること、非ヒト動物の動物繊維を刈ることなど、任意の１つまたは２つ以上のステップを含めてよい。
平均繊維径は、繊維製品の手触り、肌触り、着心地、光沢、伸縮性、保温性、速乾性などの性質の向上に寄与することが知られている。したがって、本発明によって作製された繊維製品は、手触り、肌触り、着心地、柔軟性、伸縮性、保温性、速乾性、光沢から選択される１以上の性質を向上した繊維製品を得ることが出来る。

　一態様において、本発明の方法によって作製された非ヒト動物は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物に比べて滑らかな繊維表面を持つ。「滑らかな繊維表面」とは、具体的には、例えば、動物繊維の表面に存在するスケールのスケール厚が小さい、および／またはスケール間隔が長いことを意味する。「スケール」とは、動物繊維の表面に松笠状に配置されている鱗片状の構造であり、動物繊維の毛根側で他のスケールと重なっており、かかる重なりによって動物繊維の表面の凹凸を生んでいる。羽毛繊維では、このスケールに類似する「ノード」または「節」と呼ばれる構造を持つが、本発明の「スケール」には羽毛繊維におけるノードまたは節も包含される。

　本明細書において、スケール厚とは、あるスケールが他のスケールと重なった凸部分の厚さである。スケール厚が小さくなると、凸の厚さが減少するため、例えば、平均スケール厚が小さくなると「滑らかな表面を持つ」動物繊維が得られることが理解できる。本発明の一態様において、ＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子をノックアウトした非ヒト動物の動物繊維のスケール厚は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物、特に野生型の平均スケール厚よりも有意に小さい。

　平均スケール厚は、同じ齢の非ヒト動物の同じ体表部分から採取された複数の動物繊維上の同じ位置に存在するスケールのスケール厚（例えば、非ヒト動物の同じ体表部分から採取された動物繊維の毛根部分から所定の長さ部分、または同じ方法で刈った動物繊維の根元から所定の長さ部分、に存在するスケールのスケール厚）を光学または電子顕微鏡などで観察して測定することができる。平均スケール厚の違いは、目視で評価し得るため、測定は必ずしも数値として現れなくてもよい。例えば、発明の方法によって作製された非ヒト動物の動物繊維と、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の動物繊維との電子顕微鏡像を比較してスケールが作り出す影、スケールの輪郭などを指標に、平均スケール厚の減少を評価できる。「スケール厚が小さい」とは、例えば、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の動物繊維と比較してスケールが作り出す影が薄い、スケールの輪郭が不鮮明であることを指す。平均スケール厚を数値で測定できる場合は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の動物繊維と比較して、例えば９８％以下、９６％以下、９５％以下、９３％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、好ましくは７０％以下、より好ましくは６５％以下、さらに好ましくは３０％以下、より好ましく２０％以下スケール厚が小さいことを指す。

　光沢は、同じ齢の非ヒト動物および対照の同じ体表部分から採取された複数の動物繊維上の同じ位置に存在する部分（例えば、非ヒト動物の同じ体表部分から採取された動物繊維の毛根部分から所定の長さ部分、または同じ方法で刈った動物繊維の根元から所定の長さ部分）を目視で観察して評価することができる。評価は、複数人により構成される評価パネルにより行うことができる。評価パネルは、光沢の優劣に関する所定の評点に基づいて動物繊維の光沢を評価することができる。評点においては、例えば、光沢に優れたものを５点、平均的なものまたは対照と同等を３点、光沢で劣ったものを１点、最高点と平均の間を４点、平均と最低点との間を２点等とすることができる。

　本発明の一態様において、ＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子をノックアウトした非ヒト動物の動物繊維のスケール間隔は、対照非ヒト動物、特に野生型のスケール間隔よりも有意に長い。

　スケール間隔とは、各スケールの長径である。動物繊維の表面に存在する各スケールの長径が長くなると、所定の繊維長に存在するスケールの数が減少することになる。例えば、スケール間隔が２５μｍのスケールを持つ動物繊維では１００μｍにつき４枚のスケールが存在するのに対して、平均スケール間隔５０μｍのスケールでは１００μｍにつき２枚のスケールしか存在しないため、スケールによって生じる凹凸の頻度が減ることになる。したがって、スケール間隔、特に平均スケール間隔が長くなると「滑らかな繊維表面」がもたらされることが理解できる。

　平均スケール間隔は、同じ齢の非ヒト動物の同じ体表部分から採取された、複数の動物繊維の同じ部分のスケール間隔（例えば、非ヒト動物の同じ体表部分から採取された動物繊維の毛根部分から所定の長さ部分に存在する、または同じ方法で刈った動物繊維の根元から所定の長さ部分に存在するスケールのスケール間隔）を光学または電子顕微鏡などで観察して測定することができる。

　「スケール間隔が長い」とは、例えば、このようにして測定した平均スケール間隔が対照非ヒト動物と比較して、１０２％以上、１０５％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％、１６０％以上、好ましくは１７０％以上、より好ましくは１８０％以上長いことを指し、例えば、１０５％～１８０％長いことを指す。

　従来から動物繊維上のスケールは、織物や編物の繊維製品のピリング（毛玉）やフェルト形成をもたらす絡み合い、縮みの原因として知られている。また、スケールは繊維製品を着た時のチクチクとした刺激の原因となるだけでなく、製品自体の光沢や柔軟性、平滑性等を損なう原因にもなっており、このような問題に対処するため酸化剤、酵素、プラズマ放電などの化学的、物理的な方法によりスケールの剥離処理をしたり、コーティング樹脂によってスケールの凹凸を被覆処理する方法が取られている。

　したがって、本発明は、一態様において、ピリングおよび／またはフェルト形成が生じにくい、柔軟性が高い、滑らさかさが強い、刺激が少ない、光沢性の強い、および、縮みのない、から選択される１以上の性質を持つ動物繊維を含む繊維製品を作製するための方法でもある。本態様は、非ヒト動物のＫｒｔまたはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現または機能を低下させること、非ヒト動物の動物繊維を刈り取ること、刈り取られた動物繊維から繊維製品を製造することのほか、任意の１つまたは２つ以上のステップを含めてよい。

　この態様は、好ましくはスケールを剥離処理またはスケール被覆処理するステップを含まない。一態様において、本発明の方法によって作製された非ヒト動物から得られる動物繊維製品は、ピリングおよび／またはフェルト形成が生じにくい、柔軟性、非刺激性（手触り、肌触り、着心地）、防縮などの性質の向上に寄与することが知られているため、かかる性質を向上させた繊維製品の製造用に好ましく用いることができる。特に、平均繊維径が小さくなるにつれてピリングおよび／またはフェルト形成が生じやすくなることから、平均繊維径が細いカシミヤ、モヘヤ、アンゴラ、カシゴラ、ヤク、アイベックス、グァナコ、キヴィアック、チルー、タヌキ、ラクーン、ミンク、セーブル、フォックス、ポッサム、オポッサム、ビーバー、アザラシ、ヌートリア、フェレット、ビクーニャ、カモ、ガチョウ、アヒル、ダチョウなどの動物繊維の作製において用いられることが好ましい。

　本発明の一態様では、動物繊維は、動物の原毛であり得る。原毛（特に獣毛）は、一般的に刺し毛とうぶ毛を含み得る。

　本発明の一態様では、動物繊維は、不要毛を好ましくは６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２５重量％以下、２０重量％以下、または１５重量％以下の割合でしか含まない。不要毛は、例えば、獣毛（例えば、ヤギ（例えば、カシミヤ、モヘヤ、アンゴラおよびカシゴラ）の場合、刺し毛等を意味する。動物繊維は、好ましくは、アンダーコートを４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、または８５重量％以上含む。不要毛は、ヤギ（例えば、カシミヤ、モヘヤ、アンゴラおよびカシゴラ）では、刺し毛である。ヤギ（例えば、カシミヤ、モヘヤ、アンゴラおよびカシゴラ）は、刺し毛の他にうぶ毛（アンダーコートまたはアンダーファーともいう）を有する。

　動物繊維は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の動物繊維と比較して、平均繊維径において、５％以上、６％％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、１６％以上、１７％以上、１８％以上、１９％以上、または２０％以上細い。動物繊維は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の動物繊維と比較して、平均繊維径において、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、または１０％以下細い。動物繊維は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物の動物繊維と比較して、平均繊維径において、５～４０％、５～３０％、５～２０％、１０～２０％、１５～２０％、５～１５％、１０～１５％、または５～１０％細い。このような繊維には、本発明の遺伝子改変動物から刈り取られた動物繊維から、そのような動物繊維を選別して得てもよいし、そのような繊維系を有する本発明の遺伝子改変動物から刈り取ることで（選別なしで、または選別を経て）得てもよい。

　上記遺伝子改変動物から得られた動物繊維は、同種同系または同種異系の対照非ヒト動物と比較して、上記遺伝子改変動物において改変されたＫｒｔ遺伝子およびＫＡＰ遺伝子によりコードされるタンパク質の産物が少ない。ある好ましい態様では、上記遺伝子改変動物から得られた動物繊維は、上記遺伝子改変動物において改変されたＫｒｔ遺伝子およびＫＡＰ遺伝子によりコードされるタンパク質を実質的に含まない。

　一態様において、本発明の方法によって作製された非ヒト動物は、対照非ヒト動物に比べて、平均繊維径が小さく、かつ滑らかな繊維表面を持つ。したがって、平均繊維径が細いにもかかわらずピリングおよび／またはフェルト形成が生じにくく長期にわたって品質が維持でき、着用可能な繊維製品を提供できる。
　本発明の方法によって作製された動物は、体毛全体の平均繊維径が細いため、かかる動物から得られた動物繊維は、細い毛のみを選別する選別工程を省略して生産することができる。したがって、経済的に合理的である。
　もし、作製された非ヒト動物の動物繊維の平均繊維径に個体差がある場合には、平均繊維径の小さな個体を選別してから、当該選別された個体から動物繊維を回収してもよい。これにより、平均繊維径の小さな動物繊維を主に回収することができる。

　一態様において、本発明の方法によって作製された非ヒト動物から、動物繊維の原毛を得ることができる。本発明によれば、動物繊維の原毛から製毛を得る方法が提供される。動物繊維の原毛から製毛を得る方法は、原毛を解毛すること、土砂およびふけを除去すること、得られた原毛を洗浄すること（例えば、中性洗剤による洗浄、湯洗い、および水洗いを含む）、および、原毛中に混在するうぶ毛と刺し毛を分離して、うぶ毛を取り出すこと（製毛加工）を含み得る。製毛加工の工程では、刺し毛含有率をできるだけ下げつつ、歩留まりを上げることが重要であるとされている。製毛加工は、カシミヤの加工の重要工程である。製毛は、必要に応じて染色（例えば、低温染色法による）に供することができる。未染色の製毛もしくは原毛または染色された製毛または原毛は、紡績されて紡毛糸に加工され、また、紡毛糸は合糸されて撚糸または梳毛糸に加工され得る。典型的には、紡毛糸、撚糸、または梳毛糸は梱包されて出荷される。紡毛糸、撚糸、または梳毛糸は、用途によって異なる織物に加工される。本発明では、動物繊維から得られる製毛、紡毛糸、撚糸、梳毛糸、および織物もまた、提供され得る。本発明で得られる、製毛、紡毛糸、撚糸、梳毛糸、および織物は、上記で説明した動物繊維に由来するから、上記で記載した動物繊維の平均繊維径、および／または、スケール間隔もしくはスケール厚を有する。なお、製毛工程は、一般的な毛皮（例えば、ミンクやセーブルの毛皮）の作製においては実施されないことが多いが、カシミヤなどの高品質な製品（特に高級品）の作製においては行われ得る。

　一態様において、製毛加工後の動物繊維（例えば、「トップス」または“ｔｏｐｓ”）は、不要毛（例えば、刺し毛）の含有率において原毛よりも低い。製毛加工後の動物繊維は、不要毛を６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、または５重量％以下しか含まない。原毛における不要毛の含有率をＡとすると、製毛加工後の動物繊維における不要毛の含有率（Ｂ）は、Ａの９５重量％以下、９０重量％以下、８０重量％以下、７０重量％以下、６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、または５重量％以下であり得る。原毛における不要毛の含有率をＡとすると、製毛における不要毛の含有率（Ｂ）は、例えば、５重量％～９０重量％、５重量％～６０重量％、５重量％～３０重量％、または５重量％～２０重量％であり得る。したがって、紡毛糸、撚糸、および梳毛糸における不要毛（例えば、刺し毛）の含有率も６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、または５重量％以下しか含まない。また、原毛における不要毛の含有率をＡとすると、紡毛糸、撚糸、および梳毛糸における不要毛の含有率（Ｃ）は、Ａの９５重量％以下、９０重量％以下、８０重量％以下、７０重量％以下、６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、または５重量％以下であり得る。当然にこのようにして得られる動物繊維、紡毛糸、撚糸、および梳毛糸は、上記遺伝子変異に基づく成分を含むものである。すなわち、このようにして得られる動物繊維、紡毛糸、撚糸、および梳毛糸は、改変した遺伝子産物を野生型よりも少なくしか含まないか（例えば、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、５重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、または１重量％以下しか含まないか）、上記で破壊した遺伝子の産物（例えば、タンパク質）を含まないか、破壊された遺伝子がコードするペプチド分子（その機能が低下または喪失したペプチド分子）を含む。したがって、得られる動物繊維、紡毛糸、撚糸、および梳毛糸は、同種同系または同種異系の非ヒト対照動物のそれとは、異なる成分含量（特に、含有タンパク質比率）を有する。また、このようにして得られる動物繊維、紡毛糸、撚糸、および梳毛糸は、上記遺伝子破壊を有しない同種同系または同種異系の非ヒト対照動物と比較して、上記で規定する細い直径（長径）を有し得る。これらの特性は、少なくとも獣毛および獣毛に由来する上記糸に共通する特性であり得る。

　本明細書における「繊維製品」とは、本発明の方法によって作製された動物から得られた動物繊維を含んでいれば限定されず、スライバー、糸（紡毛糸及び梳毛糸を含む）、繊維シート、織物、編物、生地、布地、不織布、多軸繊維シート、毛皮などいかなる形態のもの、およびこれらから得られたコート、セーター、ストール、ショール、マフラー、シャツ、ズボン、スーツ、ブレザー、スカート、毛布、ひざ掛け、肌着、靴下、手袋などの被服（最終製品）を含む。繊維製品も、上記製毛加工後の動物繊維、紡毛糸、撚糸、または梳毛糸の特徴（例えば、太さ、スケール間隔、スケール厚、不要毛含有率、成分含有量）を有する。

　繊維製品には、上記動物繊維以外の繊維は含まれていなくてもよいし、上記動物繊維以外の繊維を含んでいてもよい。例えば、繊維製品には、異種動物の繊維、植物由来の繊維、または合成繊維を混合してもよく、異種動物の繊維、植物由来の繊維、または合成繊維が含まれていてもよい。繊維製品に含まれる上記動物繊維以外の繊維としては、繭繊維、クモ繊維、絹、綿、麻、亜麻等の天然繊維、ポリエステル、ポリアミド、アクリル、ポリエチレン、ポリプロピレン等の合成繊維、ビスコース法レーヨン、銅アンモニア法レーヨン等の半合成繊維を挙げることができる。

　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。

実施例１：マウス、カシミヤヤギ、ヒツジの動物繊維の質量分析
（１）試料の作製
　野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統；日本エスエルシー社から購入、以下同様）、カシミヤヤギ、ヒツジの動物繊維をそれぞれ８Ｍ尿素溶液へ添加し、これを超音波処理し溶解した。ここに０．２６ＭのＤＴＴを添加し３７℃で１時間インキュベートし、試料中のタンパク質を還元した。その後、試料に０．２２Ｍのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を添加し、３０分間、３７℃でインキュベートしてタンパク質をアルキル化した。試料からタンパク質を沈殿し、精製するためにアセトン沈殿を行った。アセトン沈殿は、まず、試料量に対して１０倍量のＴＣＡ／アセトン（10% TCA in Acetone）を添加し、攪拌した。試料を－２０℃で一晩静置した後、１５０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離を行った。上清を除去した後、少量の冷アセトンでペレットを洗浄し、遠心分離後に上清を除去した。アセトンを揮発させた後、０．５Ｍ尿素溶液を添加して試料を再溶解した。

　試料に０．２ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｙｐｓｉｎ酢酸溶液を添加して３７℃で一晩インキュベーションしペプチド化した。インキュベーション終了後、ギ酸（１０％）を加えて反応を停止させた。ペプチド化した試料をＧＬ－Ｔｉｐ（登録商標）ＳＤＢのチップ（ジーエルサイエンス株式会、Cat No.7820-11200）を使用して脱塩及び濃縮した後、ペプチド濃度を測定した（Pierce Quantitative Colorimetric AssayThermo Fisher、Cat No.233275）。
（２）質量分析およびデータ解析
　このようにして得られたペプチド試料を、それぞれ、質量分析法（ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ）を用いて分析した。ＬＣとして超高分解能フーリエ変換型質量分析装置 (Orbitrap Fusion)（Thermo Fisher、Cat NO. IQLAAEGAAPFADBMBHQ）を測定に使用した。

　その結果、マウス、カシミヤヤギ、ヒツジの動物繊維を構成する主要タンパク質の殆どが、共通していることが分かった。動物繊維は、毛包中に存在する毛母細胞等が分化、増殖を経て角化することにより形成されるため、動物繊維の構成成分の共通性は、各動物における毛母細胞等の分化、増殖および角化プロセス、すなわち発毛メカニズムの共通性を反映している。よって、動物全体として共通の発毛メカニズム持つことが推測される。なお、動物繊維（体毛）の形成は、広く様々な動物種において共通することと考えられている。例えば、Ｆｇｆ５の働きは、イヌ、ネコ、マウス、およびヒトを含む様々な種において共通しており、カシミヤヤギにおいても共通している（X. Wang et al., Plos One, 11(10): e0164640, 2016）。Ｆｇｆ５は、毛の伸長に対する阻害因子であり、外毛根鞘で発現し、毛成長周期におけるカタジェンの開始を制御している（J. M. Heabert et al., CELL, 78: 1017-1025, 1994）。

　実施例２：ノックアウトマウスの作製
　以下では、動物種によらず、共通の発毛メカニズムに関与していると考えられる多数の遺伝子から、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、Ｋｒｔ７４、ＫＡＰ８－１、ＫＡＰ８－２、Ｔｙｒ、およびＦｇｆ－５を選択し、これらの遺伝子の破壊を個別に試みた。
（１）ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＣａｓ９タンパク質の調整
　マウスのＫｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、Ｋｒｔ７４、ＫＡＰ８－１、ＫＡＰ８－２、Ｔｙｒ、Ｆｇｆ－５に対するｃｒＲＮＡ（Alt-R（商標）、CRISPR-Cas9 crRNA）、ｔｒａｃｒＲＮＡ(Alt-R（商標）CRISPR-Cas9 tracrRNA, 5 nmol、Cat# 1072532)およびＣａｓ９タンパク質(Alt R（商標）S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg Cat# 1081058）はIntegrated DNA Technologies, Inc（（以下、IDTと称する）、米国)より購入した。それぞれの標的遺伝子に対して３種類のｃｒＲＮＡ配列を設計し、得られたｃｒＲＮＡそれぞれを１μｇ／μｌとなるように、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩ（ Thermo Fisher Scientific、Cat#31985062）に添加して溶解した。ｃｒＲＮＡの配列中のＤＮＡ標的化部位の核酸配列は以下の通りである。３種類のｃｒＲＮＡ配列が異なる３箇所を標的化することができ、各遺伝子について最大で３箇所の変異を導入することができると期待される。

Krt71 KO用crRNAの標的部位の配列(RNA上ではTはUに変わる)
　Krt71 crRNA1; CCTACCGGGCAGGAGGCAAA（配列番号１）
　Krt71 crRNA2; AGCGGGAAGAACGGAGGTTT（配列番号２）
　Krt71 crRNA3; ACCTGATGGATACCGCCAGG（配列番号３）
Krt72 KO用crRNAの標的部位の配列(RNA上ではTはUに変わる)
　Krt72 crRNA2; GTCATCTCAGGCAGGCTCAG（配列番号４）
　Krt72 crRNA3; AGAAGCCTGTTCTGTGTGGG（配列番号５）
　Krt72 crRNA4; CGGGATAGAGGGTCAACTGG（配列番号６）
Krt73 KO用crRNAの標的部位の配列(RNA上ではTはUに変わる)
　Krt73 crRNA1; TCTTACCGGGCAGCCGGCAA（配列番号７）
　Krt73 crRNA2; AGCGGGCGCACAGGGGGATA（配列番号８）
　Krt73 crRNA3; AATCCATCCTTGTGCCTGCC（配列番号９）
Krt74 KO用crRNAの標的部位の配列(RNA上ではTはUに変わる)
　Krt74 crRNA1; GATTCCCTCCAAGACTGTAG（配列番号１０）
　Krt74 crRNA2; AGCTTTGGATATGGGTATGG（配列番号１１）
　Krt74 crRNA3; TCTGTCTGGGGGCATCTACC（配列番号１２）
KAP8-1 KO用crRNAの標的部位の配列(RNA上ではTはUに変わる)
　KAP8-1 cRNA1; GTCTTCCCAGGATGCTACTG（配列番号１３）
　KAP8-1 cRNA2; CAGCCAACACTGTACCCCAG（配列番号１４）
　KAP8-1 cRNA3; GGTAGCACCTACTCTCCAGT（配列番号１５）
KAP8-2 KO用crRNAの標的部位の配列(RNA上ではTはUに変わる)
　KAP8-2 cRNA1; GTAGCTGCCGTAGTAGCTCA（配列番号１６）
　KAP8-2 cRNA2; GGCTCTGGCATCCGAGGCTT（配列番号１７）
　KAP8-2 cRNA3; GGAGGTTACGGATATGGATC（配列番号１８）
Tyr KO用crRNAの標的部位の配列(RNA上ではTはUに変わる)
　Tyr crRNA1; TGCCAACAAGTTCTTAGAGG（配列番号１９）
　Tyr crRNA2; GGTCATCCACCCCTTTGAAG（配列番号２０）
　Tyr crRNA3; CAGTGCTCAGGCAACTTCAT（配列番号２１）
Fgf5 KO用crRNAの標的部位の配列(RNA上ではTはUに変わる)
　Fgf5 crRNA1; CCCAAGCGCTGTGGATCAGG（配列番号２２）
　Fgf5 crRNA2; ACGTCGCGCTACTTCTGCCC（配列番号２３）
　Fgf5 crRNA3; GTTTCCAGTGGAGCCCTTCG（配列番号２４）

（２）エレクトロポレーション
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎは、日本エスエルシーから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎのオスの精巣上体より精子塊を回収した。ＦＥＲＴＩＵＰ（商標）－精子前培養培地（九動株式会社（以下、九動と称する）、日本）でインキュベートした。ＣＡＲＤ　ＨｙｐｅｒＯｖａ（商標）（九動）により超過剰排卵誘発を行ったＣ５７ＢＬ／６Ｎのメスより卵子塊をＣＡＲＤ　ｍＨＴＦ培地（九動）に回収した。精子懸濁液を卵子含む培地に添加することにより体外受精を行った。３時間の媒精後、卵子をＣＡＲＤ　ＫＳＯＭ培地（九動）に３回移すことにより、卵子の洗浄を行った。

　ＧｅｎｏｍｅＥｄｉｔｏｒ（株式会社ベックス（以下、BEXと称する）、日本、Cat# GEB15）に接続した電極（BEX、Cat# LF501PT1-10）を実体顕微鏡上にセットした。ＣＡＲＤ　ＫＳＯＭ培地中で培養されている受精卵をＯｐｔｉ－ＭＥＭＩで２回洗浄し、血清有培地含を除去した。次いで、上記遺伝子のそれぞれを標的とする３種類のｃｒＲＮＡ(６６ng/μl)、ｔｒａｃｒＲＮＡ（１００ng/μl）およびＣａｓ９タンパク質（１００ng/μl）を含有するＤｕｐｌｅｘ　Ｂｕｆｆｅｒ(IDT)溶液（５μｌ）で満たした電極のギャップに受精卵を並べ、エレクトロポレーションを行った。電気的条件は、２５Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）で一方の極性および逆の極性の両方を各３回であった。

　エレクトロポレーションの後、すぐに受精卵を電極から回収し、Ｍ２培地で１回、ＣＡＲＤ　ＫＳＯＭ培地で２回洗浄した。次いで、受精卵を、ＣＡＲＤ　ＫＳＯＭ培地中、３７℃で、５％ＣＯ₂インキュベーター内で、２細胞期まで培養した。

実施例３：ノックアウトマウスの遺伝子変異の確認
　２細胞期の胚を、交配後０．５日の偽妊娠マウスの卵管に移植した。出産から３週後に耳の一部を採取し５０ｍＭＮａＯＨ９０μｌ中で９８℃、１０分間処理した後１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０μｌで中和しゲノムＤＮＡ溶液を採取した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による各遺伝子の変異を調べるために、各標的配列に隣接するゲノム領域を、以下の特異的プライマーを使用するＰＣＲにより増幅させた。

Krt71のKO確認用プライマーセット
　mKrt71_Miseq_Fw;
　　TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATCTACCTTCCTCCTGCACCT（配列番号２５）
　mKrt71_Miseq_Rv;
　　GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACATTGTTCAGAGCCTTGATCTGCT（配列番号２６）
Krt72のKO確認用プライマーセット
　Krt72 N-Fw; AATTAGCTGACTCCATCCTGCC（配列番号２７）
　Krt72 N-Rv; CCTTGATCTGCTCCCTCTCTTG（配列番号２８）
　Krt72-Miseq_Fw;
　　TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCAGGAGTGCAGCTGTATCC（配列番号１０７）
　Krt72-Miseq_Rv;
　　GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGACATTGAGTGGGGCCAGAAG（配列番号１０８）
Krt73のKO確認用プライマーセット
　mKrt73_Miseq_Fw;
　　TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCTGTCTGTGGCTTCTTCAGGAT（配列番号２０）
　mKrt73_Miseq_Rv;
　　GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGAATTTGTTGTTCAGAGCCT（配列番号３０）
Krt74のKO確認用プライマーセット
　mKrt74_Miseq_Fw;
　　TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTTGGCAACTGAACTTCAGGTC（配列番号３１）
　mKrt74_Miseq_Rv;
　　GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAACTTGTCGTTCAGAGCCTTGAT（配列番号３２）
KAP8-1のKO確認用プライマーセット
　Krtap8-1 Fw; AAGACCAAGCGCTTTTGAAGTC（配列番号３３）
　Krtap8-1 Rv; AGGTGTCACAAAGCCTTCATGA（配列番号３４）
　KAP8-1-Miseq_Fw;
　　TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAAGAATGAAAATGAGGGCCTTGTG（配列番号３５）
　KAP8-1-Miseq_Rv;
　　GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGGTGTCACAAAGCCTTCATGA（配列番号３６）
KAP8-2のKO確認用プライマーセット
　KAP8-2_Miseq_Fw;
　　TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGACAACGGAAGGGTATGTTCATGA（配列番号３７）
　KAP8-2_Miseq_Rv;
　　GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACATTTCTTCTTGACTTGATTCACAGTCAG（配列番号３８）TyrのKO確認用プライマーセット
　Tyr Fw; CCAGGGGTTGCTGGAAAAGA（配列番号３９）
　Tyr Rv; TCTTTTCGGAGACACTCAAATCA（配列番号４０）
Fgf5のKO確認用プライマーセット
　Fgf5 Fw; GAGGCTATGTCCACCCTGTG（配列番号４１）
　Fgf5 Rv; GTCCCTCCCAGAACAGGTTT（配列番号４２）

　各遺伝子のＰＣＲ増幅産物を精製し、次世代シーケンサーMiseq（イルミナ）、および、ユーロフィンジェネティクス株式会社（日本）により提供される受託シークエンスサービスを利用して標的部位のＤＮＡ配列を解析した。

　その結果、図１－１～図８の変異配列を持つノックアウトマウスが各遺伝子について１～３匹ずつ得られた。図１－１～図８は、野生型の配列（第１エクソン）と、ノックアウトマウスの変異が生じた配列（第１エクソン）を比較したものであり、ノックアウトマウスで欠失した配列をハイライトで、挿入を下線で、置換を太字でそれぞれ示す。

　得られた変異はいずれも、各遺伝子のフレームシフトによる遺伝子破壊であることが確認された。

実施例５：走査型電子顕微鏡によるノックアウト動物繊維の繊度確認
　３週齢の野生型およびＫｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７３、もしくはＫｒｔ７４、またはＫＡＰ８－１もしくはＫＡＰ８－２ノックアウトマウスのＡｗｌ毛を観察した。マウスのＡｗ１毛の先端から２ｍｍの断面を走査型電子顕微鏡３０００倍で観察し、長径を測定した。具体的には、以下の手順で包埋、切断および固定し、走査型電子顕微鏡で観察した。
［撮影条件］
　加速電圧：５ｋＶ（高倍率観察モード）ＷＤ：２０ｍｍ
　観察角度：０°（毛と平行）観察倍率：３０００倍

［固定条件］
　各Ａｗｌ毛（以下、試料ともいう）を１ｍｍ溝のシリコンモールドに入れ、紫外線硬化樹脂を滴下し、モールドに流し込んだ。モールドの壁面に接触しないように試料の位置を調節した後、１０Ｗブラックライト下で3時間以上照射する。硬化を確認後、余分な樹脂を削り取った。
［断面の作製］
　樹脂に包埋した試料を実態顕微鏡で観察しながら、毛先２ｍｍの箇所を片刃カミソリで切断した。毛先から２ｍｍの位置はＪＩＳ規格１級の金属直尺を用いて測定・決定した。切断に使用したカミソリは×印を入れ、以後の断面作製には使用を禁止した。

　観察試料は、毛根側とし、毛先側は予備観察試料として別に保管する。本試料・予備試料ともに番号を付け、必要時以外は密閉されたプラスチックケースに入れて保管した。
［スパッタリング手順］
　電子顕微鏡にて直角に観察できる試料台に観察試料を固定した。Ａｕスパッタリング装置（JFC-1200FINE COATER（日本電子(株)製））にてＡｕ微粒子を１２０秒間塗布した（Ａｕ膜厚の理論値は約２０ｎｍ）。
［電子顕微鏡観察手順］
　電子顕微鏡（VHX-D510（(株)キーエンス製）にて試料を観察した。観察方向は包埋した樹脂と平行になる位置で固定し、撮影後は試料の長径を測定した。撮影条件は下記とした。
［撮影条件］
　加速電圧：５ｋＶ（高倍率観察モード）ＷＤ：８ｍｍ
　観察角度：０°（包埋樹脂と平行）観察倍率：３０００倍

　結果を図１０に示す。なお、毛は野生型およびそれぞれのノックアウト（ＫＯ）マウスの１個体から少なくとも１０本を採取して観察に供した。毛の繊維径（長径）は、同時期に取得された同週齢の野生型の毛の平均繊維径で標準化した。

　上記図１０に示されるように、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２、Ｋｒｔ７４、およびＫＡＰ８－１のノックアウトマウスそれぞれの毛の繊維径の減少が再現性をもって確認された。特に、破壊の具体的様式の異なる複数の変異体において繊維径の減少が認められたことから、これらの遺伝子の破壊は、繊維径の減少に寄与することが示唆された。なおこの繊維径減少の傾向は、光学顕微鏡による観察、電子顕微鏡における固定の有無によっては変わらなかった。また、Ｋｒｔ７２およびＫＡＰ８－１がいずれのノックアウトのなかで繊維径をもっとも強く減少させることが明らかとなった。特にＫｒｔ７２　ＫＯでは、１０％を超える繊維径の減少が観察され、ＫＡＰ８－１　ＫＯでは、約２０％の繊維径の減少が観察された。

実施例６：走査型電子顕微鏡によるノックアウト動物繊維のスケール構造観察
　作製した全てのノックアウトマウス（３週齢）のＡｗｌ毛の先端から２ｍｍ部分の側面を走査型電子顕微鏡で１２００倍で撮影した。Ａｕスパッタリング装置（DII-29010SCTR Smart Coater、日本電子株式会社製）にてＡｕ微粒子を60秒間塗布した(Ａｕ膜厚の理論値は約５ｎｍ)。固定は特に行わなかった。
［撮影条件］
　加速電圧：１０ｋＶ　ＷＤ：２０ｍｍ
　観察倍率：１２００倍
　毛のスケール間隔を測定するために撮影した毛の像を基に、スケールの幅を各ノックアウトマウスで測定した。

　　その結果は図１１に示される通りであった。図１１のとおり、野生型と比較してＫｒｔ７２のノックアウトマウスの毛およびＫＡＰ８－１ノックアウトマウスの毛ではスケール間隔が増加し、一定の長さの毛に含まれるスケール枚数が減少した。また、これらのノックアウトの毛では、スケール厚が減少し、スケールの輪郭が不明確であり毛全体が滑らかになっていることが分かる。またＫｒｔ７２のノックアウトマウスの毛では野生型と比較して束にした際の手触りが大幅に滑らかになることが確認された。これは繊維径の減少のほか、スケール間隔の増加およびスケール厚の減少に起因するものと考えられる。

実施例７：Ｆｇｆ－５ノックアウト動物繊維の観察
　３週齢の野生型マウスおよびＦｇｆ－５ノックアウトマウスのＡｗｌ毛をそれぞれ採取し、長さを測定した。結果を表１０に示す。マウスは各１頭であり、ｎは計測した毛の本数であり、毛の長さｍｍはそれらの平均の長さを示す。「ＷＴ」は野生型を示す。

　Ｆｇｆ－５ノックアウトマウスでは毛の長さが野生型と比較して５５％増加した。

　Ｆｇｆ－５と上記ＫｒｐファミリーまたはＫＡＰファミリーからなる群から選択される１以上の遺伝子破壊を組み合わせる。これにより、細い繊維径を有し、長い動物繊維を産生する動物が得られる。

実施例８：　Ｔｙｒノックアウト動物繊維の観察
　３週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統；黒色）およびそのＴｙｒノックアウトマウスの写真を図１２に示す。野生型では体毛は黒色を呈するのに対して、Ｔｙｒノックアウトマウスでは毛が白色になることが確認できた（図１２参照）。

　Ｔｙｒと上記ＫｒｐファミリーまたはＫＡＰファミリーからなる群から選択される１以上の遺伝子破壊を組み合わせる。これにより、細い繊維径を有し、白い動物繊維を産生する動物が得られる。

　Ｆｇｆ－５とＴｙｒと上記ＫｒｐファミリーまたはＫＡＰファミリーからなる群から選択される１以上の遺伝子破壊を組み合わせる。これにより、細い繊維径を有し、長く、白い動物繊維を産生する動物が得られる。

実施例９：　Ｋｒｔファミリー遺伝子破壊を有するヤギの動物繊維の分析
　本実施例では、Ｋｒｔ７２の遺伝子破壊を有するヤギを作製し、その動物繊維の径を分析した。動物繊維としてはアンダーコートを用いた。

（１）ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＣａｓ９タンパク質の調整
　ヤギのＫＡＰ８－１に対するｃｒＲＮＡ（Alt-R（商標）、CRISPR-Cas9 crRNA）、ｔｒａｃｒＲＮＡ(Alt-R（商標） CRISPR-Cas9 tracrRNA, 5 nmol、Cat# 1072532)、Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサーおよびＣａｓ９タンパク質(Alt R（商標） S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg Cat# 1081058）はIntegrated DNA Technologies, Inc（（以下、IDTと称する）、米国)より購入した。３種類のｃｒＲＮＡそれぞれを１μｇ／μｌとなるように、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＩ（Thermo Fisher Scientific、Cat#31985062）に添加し、溶解した。ｃｒＲＮＡ、エレポエンハンサーの配列は以下の通りである。

（２）エレクトロポレーション
　雌雄ヤギは井上商店から購入した。PG（動物用プロナルゴンF注射薬（商標）　Zoetis）投与により同期化を開始し、P4（ルティナス膣錠100mg（商標）フェリング・ファーマ）同期化実施し、E2（動物用オバホルモン注（商標）あすかアニマルヘルス）により卵胞誘起開始。FSH（アントリンR10 （商標）共立製薬）漸減法により過剰排卵誘発を行った雌ヤギにPGとｈCG（ゲストロン1500（商標）共立製薬）を投与後、雄ヤギと交配させた。排卵後、吸入麻酔にて開腹手術を実施し、子宮角・卵巣を切除回収した。子宮角側より留置針（サーフロー（商標）テルモ）を留置し、PBS（エンブリオテック（商標）日本全薬工業株式会社）にて卵管内還流し、体内受精卵を回収した。培養液（BO-HEPES-IVM（商標）ivf Bioscience)受精卵を回収し、さらに培養液（BO-IVC（商標）ivf Bioscience)にて3回移すことにより受精卵の洗浄を行った。

　ＧｅｎｏｍｅＥｄｉｔｏｒ（株式会社ベックス（以下、BEXと称する）、日本、Cat# GEB15）に接続した電極（BEX、Cat# LF501PT1-10）を実体顕微鏡上にセットした。BO-IVC培地中で培養されている受精卵をＯｐｔｉ－ＭＥＭＩで２回洗浄し、血清有培地含を除去した。次いで、ＫＡＰ８－１を標的とする３種類のｃｒＲＮＡ（１２０ｎｇ／μｌ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（１２０ｎｇ／μｌ）およびＣａｓ９タンパク質（１００ｎｇ／μｌ）、エレクトロポレーションエンハンサー（１５０ｎｇ／μｌ）を含有するＯｐｔｉ－ｍｅｍ溶液（５μｌ）で満たした電極のギャップに受精卵を並べ、エレクトロポレーションを行った。電気的条件は、２０Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）で一方の極性および逆の極性の両方を各３回であった。

エレクトロポレーションの後、すぐに受精卵を電極から回収し、Ｍ２培地で１回、BO-IVC培地で２回洗浄した。次いで、受精卵を、BO-IVC培地中、３９℃で、５％ＣＯ₂、５％Ｏ₂インキュベーター内で、7日間、胚盤胞まで培養した。

（３）ノックアウトヤギの変異確認
　培養7日目の胚盤胞の胚を、同期化を行い培養7日目同日の移植用ヤギの子宮角に、吸入麻酔下の開腹手術にて移植した。出産から１週間以内に耳の一部を採取し５０ｍＭＮａＯＨ９０μｌ中で９８℃、１０分間処理した後１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０μｌで中和しゲノムＤＮＡ溶液を採取した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による各遺伝子の変異を調べるために、各標的配列に隣接するゲノム領域を、以下の特異的プライマーを使用するＰＣＲにより増幅させた。

　各遺伝子のＰＣＲ増幅産物を精製し、ユーロフィンジェネティクス株式会社（日本）により提供される受託シークエンスサービスを利用して標的部位のＤＮＡ配列を解析した。

　その結果、図９の変異配列を持つノックアウトヤギが得られた。図９は、野生型の配列と、ノックアウヤギの変異が生じた配列を比較したものであり、ノックアウトヤギで欠失した配列をハイライトで、また、コード領域の配列を大文字で示す。

　ＫＡＰ８－１（ヘテロ）は、種を超えて高く保存された重要な領域の２アミノ酸（Ｙ３０およびＧ３１）の欠損を惹き起こす変異配列を有し、これによりＫＡＰ８－１遺伝子が破壊されていた。

　上記実施例にしたがって、生後５ヶ月のヤギの綿毛（アンダーコート）を採取し、得られた綿毛の中心部１０ｍｍの領域をレジン包埋し、その領域内の３カ所にて毛の長径を測定した。その結果、図１３に示されるように、遺伝子改変前の同種ヤギの毛の平均長径は１４．５５μｍであったのに対して、ＫＡＰ８－１破壊ヤギの毛の平均長径は１１．４６μｍであり、２０％を超える長径の減少を認めた。また、上記平均長径の差は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１）。また、野生型ヤギおよびＫＡＰ８－１破壊ヤギの綿毛の表面を電子顕微鏡により観察し、スケールの幅および枚数を計測した。スケールの幅については、綿毛の表面の電子顕微鏡像における毛の上辺と下辺上でのスケールの幅をそれぞれ計測し、平均値を算出して、スケール幅とした。スケール枚数は、電子顕微鏡における一定の長さの綿毛に含まれるスケール枚数とした。その結果、野生型ヤギの綿毛は、スケール幅が１３．２μｍであったのに対して、ＫＡＰ８－１破壊ヤギでは、スケール幅は１４．０μｍであり、スケール幅が大きかった。また、スケール枚数は、野生ヤギの綿毛において平均で１３．２枚含まれる長さに、ＫＡＰ８－１破壊ヤギの綿毛では平均１０．２枚のスケールが含まれるに過ぎなかった。このことから、ＫＡＰ８－１破壊により、ヤギにおいても、一定の長さの綿毛に含まれるスケールが少なくなること、すなわち、滑らかな手触りを示し、高い光沢を有する毛が得られることが示唆された。

実施例１０：各動物種由来の動物繊維のウェスタンブロッティング
　各種動物毛からタンパク質試料を調製し、ウェスタンブロット法を用いてＫｒｔ７２もしくはＫＡＰ８－１タンパク質を検出した。具体的には以下のようにして行った。
（１）タンパク試料の調整
　各種動物毛を２～３ｍｍ長に切断し、エタノールで洗浄後、８Ｍ　尿素、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０、２％　ＳＤＳ、１００ｍＭ　ＤＴＴ中で３７℃で１日間インキュベートさせた。さらに６０℃で３０分間インキュベートし、１０，００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を回収し、４×ＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｗａｋｏ）を等量添加した。
（２）ウェスタンブロット法
　個々のタンパク質試料（１００μｇ）をＳＤＳゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）に電気泳動的に転写した。転写したＰＶＤＦ膜をＢｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ　（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）に浸漬し、室温で１時間振盪、ブロッキング処理を行った。一次抗体は以下の表に示したものを使用し、ＰＢＳＴで２０倍希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅを用いて希釈し、４℃で１日間振盪させた。二次抗体はＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ　Ｄｏｎｋｅｙ　Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、１：１００００になるように希釈し、室温で１時間振盪した。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ＥＣＬブロッティング基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出した。

　結果は、図１４に示される通りであった。いずれの動物種から得られた動物繊維は、Ｋｒｔ７２およびＫＡＰ８－１を含有した。このようにこれら毛髪の構成成分は、種を超えて共通していることが示唆された。

実施例１１：各構成成分のアミノ酸配列の同一性
　データベースから様々な生物種のＫＡＰ８－１（図１５）、Ｋｒｔ７１（図１６）、Ｋｒｔ７２（図１７）、Ｋｒｔ７４（図１８）を取得し、アミノ酸配列の同一性を求めた。欠くタンパク質について動物種間で保存されている領域をMotif Searchにより特定し、当該領域が機能ドメインであることをNCBIデータベースに基づいて確認した上で、当該ドメインについてのアミノ酸配列の同一性を算出した。その結果、いずれの動物種も高い配列同一性を示した。このように、破壊した遺伝子は、種を超えて高い配列同一性を有していたことから、これらのタンパク質機能も種を超えて保存されていると考えられる。

Claims

　遺伝子改変を有する動物、またはその動物繊維であって、
　前記動物は動物繊維を有し、
　前記遺伝子改変は、ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、前記１つ以上の遺伝子の破壊である、
遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
　請求項１に記載の遺伝子改変を有する動物、またはその動物繊維であって、
　（ｉ）上記遺伝子改変を有しない動物の動物繊維と比較して、前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維はより小さな長径を有する、および／または
　（ｉｉ－１）上記遺伝子改変を有しない動物の動物繊維と比較して、前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は、前記１つ以上の遺伝子がコードするタンパク質の含有量が少ないか、もしくは、（ｉｉ－２）前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は、前記１つ以上の遺伝子がコードするタンパク質を含まない、
遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
　請求項１または２に記載の遺伝子改変を有する動物、またはその動物繊維であって、
　上記遺伝子改変を有しない動物の動物繊維と比較して、前記遺伝子改変を有する動物の動物繊維は５％以上、１０％以上、または１５％以上小さな長径を有する、
遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
　請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変を有する動物、またはその動物繊維であって、
　ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、Ｋａｐ８－１を少なくとも含む、遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
　請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維であって、
　ＫｒｔもしくはＫＡＰファミリーを構成する１つ以上の遺伝子が、Ｋｒｔ７１、Ｋｒｔ７２およびＫｒｔ７４から選択される１つ以上の遺伝子を少なくとも含む、遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
　前記遺伝子改変は、ＦＧＦ－５遺伝子およびＴｙｒ遺伝子のいずれかまたは両方の遺伝子の発現もしくは機能の低下もしくは欠損、または、遺伝子の破壊をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変動物、またはその動物繊維。
　請求項１～６のいずれか一項に記載の動物繊維。
　請求項７に記載の動物繊維を含む、布、織物、または繊維製品。