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WO2023228728A1 - 幹細胞の製造方法及びγδＴ細胞の製造方法 - Google Patents

幹細胞の製造方法及びγδＴ細胞の製造方法 Download PDF

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WO2023228728A1
WO2023228728A1 PCT/JP2023/017460 JP2023017460W WO2023228728A1 WO 2023228728 A1 WO2023228728 A1 WO 2023228728A1 JP 2023017460 W JP2023017460 W JP 2023017460W WO 2023228728 A1 WO2023228728 A1 WO 2023228728A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
producing
stem cells
stem
blood
Prior art date
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PCT/JP2023/017460
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French (fr)
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剛士 田邊
健太 須藤
裕 安井
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I Peace Inc
Original Assignee
I Peace Inc
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Publication date
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Priority to US18/868,650 priority patent/US20250354115A1/en
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    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to cell technology, and relates to a method for producing stem cells and a method for producing ⁇ T cells.
  • T cells derived from hematopoietic stem cells play an important role in immunity (for example, see Non-Patent Document 1).
  • T cells express a wide variety of T cell receptors (TCRs) on their surface.
  • TCR diversity is brought about by V(D)J gene rearrangement.
  • VJ gene rearrangement is shown in Figure 1.
  • DN1 double negative 1 cells, which are T cell precursor cells, proliferate in response to interleukin-7 (IL-7) and c-kit ligand (KL), which are strongly expressed in the subcortical region within the thymus. At the same time, they express CD25 (interleukin-2 receptor ⁇ chain) and become DN2 cells. DN2 cells gradually decrease CD44 expression and become DN3 cells.
  • IL-7 interleukin-7
  • KL c-kit ligand
  • TCR includes a variable (V) region and a constant (C) region.
  • V variable
  • C constant
  • the amino acid sequence of the V region is highly diverse and forms a binding site for antigens.
  • the V region gene is divided into the V gene, D (diversity) gene, and J (joining) gene in germline DNA, and in the process of differentiation into T cells, these are divided into V-(D)-J and V-(D)-J. They are rearranged into a single link on the chromosome and become expressed genes.
  • the J gene includes JP1 gene, JP gene, J1 gene, JP2 gene, and J2 gene.
  • TCR ⁇ type T cells TCR consists of an ⁇ chain and a ⁇ chain.
  • TCR ⁇ type T cells TCR consists of a ⁇ chain and a ⁇ chain. The decision to branch out into TCR ⁇ type T cells or TCR ⁇ type T cells is determined by control in the silencer regions present at the TCR ⁇ gene locus and the TCR ⁇ gene locus.
  • TCR ⁇ type T cells are smaller in number than TCR ⁇ type T cells, they account for the majority of the interepithelial lymphocyte population in the intestinal mucosa. TCR ⁇ type T cells sense various stresses that cause damage to cells and induce immune responses. TCR ⁇ type T cells are said to sense not only stress from outside the body such as bacterial infection or viral infection, but also changes in properties associated with cell canceration.
  • TCR ⁇ type T cells proliferate and become activated after recognizing intermediate products in the mevalonate metabolism of the cholesterol synthesis pathway of antigen presenting cells (APC) and isopentenyl pyrophosphate (IPP) as antigens. Therefore, cancer immunotherapy is being carried out in which TCR ⁇ type T cells of a patient are activated outside the body and returned to the body.
  • APC antigen presenting cells
  • IPP isopentenyl pyrophosphate
  • One of the objects of the present invention is to provide a method for efficiently inducing stem cells having a rearranged ⁇ -TCR gene and a method for efficiently producing ⁇ T cells.
  • a method for producing stem cells according to an aspect of the present invention includes applying tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazol-2-ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate (PTA) to blood cells or immune cells; inducing stem cells from blood cells or immune cells.
  • PTA tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazol-2-ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate
  • the above method for producing stem cells may further include applying interleukin to blood cells or immune cells.
  • the interleukin may be at least one selected from the group consisting of IL-2, IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33.
  • the blood cells or immune cells may be mononuclear cells.
  • the stem cells may be iPS cells.
  • inducing factor RNA may be introduced into the blood cells or immune cells.
  • an RNA virus vector may be used to induce stem cells from blood cells or immune cells.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded plus RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded negative RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a chromosomally non-integrating RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a Mononegavirales viral vector.
  • the RNA virus vector may be a Paramyxoviridae virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Respirovirus virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Sendai virus vector.
  • a virus-derived genomic RNA carrying an inducer RNA and a virus-derived envelope that covers the genomic RNA and is different from the genomic RNA are used.
  • a chimeric virus comprising the following may also be used.
  • the stem cells may include a rearranged ⁇ -TCR gene.
  • a method for producing blood cells or immune cells according to an aspect of the present invention includes providing stem cells produced by the above-described method for producing stem cells, and inducing blood cells or immune cells from the stem cells.
  • the blood cells or immune cells may be ⁇ type T cells.
  • a cell mass of stem cells may be seeded onto feeder cells.
  • the feeder cells may be stromal cells.
  • a method for producing stem cells according to an aspect of the present invention includes adding a bisphosphonate or (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate (HMBPP) and an interleukin to blood cells or immune cells. and inducing stem cells from blood cells or immune cells, wherein the interleukin is at least one selected from the group consisting of IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33. It is one.
  • the interleukin may not include IL-2.
  • the interleukin may include IL-18 and IL-33.
  • the interleukin may include IL-4 and IL-18.
  • the interleukin may include IL-9 and IL-18.
  • the interleukins may include IL-4, IL-9, and IL-18.
  • the interleukins may include IL-4, IL-18, and IL-33.
  • IL-4 may be applied to blood cells or immune cells after IL-18 and IL-33.
  • the interleukins may include IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33.
  • IL-4 may be applied to blood cells or immune cells after IL-9, IL-18 and IL-33.
  • bisphosphonates include zoledronic acid, pamidronic acid, alendronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid, minodronic acid, tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazole-2- ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate (PTA), salts thereof and hydrates thereof.
  • the bisphosphonate may be zoledronic acid.
  • the blood cells or immune cells may be mononuclear cells.
  • the stem cells may be iPS cells.
  • inducing factor RNA may be introduced into the blood cells or immune cells.
  • an RNA virus vector may be used to induce stem cells from blood cells or immune cells.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded plus RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded negative RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a chromosomally non-integrating RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a Mononegavirales viral vector.
  • the RNA virus vector may be a Paramyxoviridae virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Respirovirus virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Sendai virus vector.
  • a virus-derived genomic RNA carrying an inducer RNA and a virus-derived envelope that covers the genomic RNA and is different from the genomic RNA are used.
  • a chimeric virus comprising the following may also be used.
  • the stem cells may include a rearranged ⁇ -TCR gene.
  • a method for producing blood cells or immune cells according to an aspect of the present invention includes providing stem cells produced by the above-described method for producing stem cells, and inducing blood cells or immune cells from the stem cells.
  • the blood cells or immune cells may be ⁇ type T cells.
  • a cell mass of stem cells may be seeded onto feeder cells.
  • the feeder cells may be stromal cells.
  • a method for producing stem cells according to an aspect of the present invention includes applying bisphosphonate or (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate (HMBPP) to blood cells or immune cells; inducing stem cells from cells or immune cells, without applying IL-2 to blood cells or immune cells.
  • HMBPP bisphosphonate or (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate
  • any interleukins, including IL-2 are not applied to blood cells or immune cells.
  • bisphosphonates include zoledronic acid, pamidronic acid, alendronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid, minodronic acid, tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazole-2- ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate (PTA), salts thereof and hydrates thereof.
  • the bisphosphonate may be zoledronic acid.
  • the blood cells or immune cells may be mononuclear cells.
  • the stem cells may be iPS cells.
  • inducing factor RNA may be introduced into the blood cells or immune cells.
  • an RNA virus vector may be used to induce stem cells from blood cells or immune cells.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded plus RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded negative RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a chromosomally non-integrating RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a Mononegavirales viral vector.
  • the RNA virus vector may be a Paramyxoviridae virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Respirovirus virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Sendai virus vector.
  • a virus-derived genomic RNA carrying an inducer RNA and a virus-derived envelope that covers the genomic RNA and is different from the genomic RNA are used.
  • a chimeric virus comprising the following may also be used.
  • the stem cells may include a rearranged ⁇ -TCR gene.
  • a method for producing blood cells or immune cells according to an aspect of the present invention includes providing stem cells produced by the above-described method for producing stem cells, and inducing blood cells or immune cells from the stem cells.
  • the blood cells or immune cells may be ⁇ type T cells.
  • a cell mass of stem cells may be seeded onto feeder cells.
  • the feeder cells may be stromal cells.
  • a method for producing stem cells according to an aspect of the present invention includes applying tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazol-2-ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate (PTA) to blood cells or immune cells; inducing stem cells from blood cells or immune cells, without applying IL-2 to blood cells or immune cells.
  • PTA tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazol-2-ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate
  • the above method for producing stem cells may further include applying an interleukin other than IL-2 to blood cells or immune cells.
  • the interleukin may be at least one selected from the group consisting of IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33.
  • the blood cells or immune cells may be mononuclear cells.
  • the stem cells may be iPS cells.
  • inducing factor RNA may be introduced into the blood cells or immune cells.
  • an RNA virus vector may be used to induce stem cells from blood cells or immune cells.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded plus RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded negative RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a chromosomally non-integrating RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a Mononegavirales viral vector.
  • the RNA virus vector may be a Paramyxoviridae virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Respirovirus virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Sendai virus vector.
  • a virus-derived genomic RNA carrying an inducer RNA and a virus-derived envelope that covers the genomic RNA and is different from the genomic RNA are used.
  • a chimeric virus comprising the following may also be used.
  • the stem cells may include a rearranged ⁇ -TCR gene.
  • a method for producing blood cells or immune cells according to an aspect of the present invention includes providing stem cells produced by the above-described method for producing stem cells, and inducing blood cells or immune cells from the stem cells.
  • the blood cells or immune cells may be ⁇ type T cells.
  • a cell mass of stem cells may be seeded onto feeder cells.
  • the feeder cells may be stromal cells.
  • a method for producing stem cells according to an aspect of the present invention includes applying (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate and interleukin to blood cells or immune cells; inducing stem cells from blood cells or immune cells, and the interleukin does not include IL-2.
  • the interleukin may be at least one selected from the group consisting of IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33.
  • the interleukin may include IL-18 and IL-33.
  • interleukins include IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33, and IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33 are added to blood cells or immune cells after IL-9, IL-18, and IL-33. -4 may be applied.
  • the blood cells or immune cells may be mononuclear cells.
  • the stem cells may be iPS cells.
  • inducing factor RNA may be introduced into the blood cells or immune cells.
  • an RNA virus vector may be used to induce stem cells from blood cells or immune cells.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded plus RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a single-stranded negative RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a chromosomally non-integrating RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a Mononegavirales viral vector.
  • the RNA virus vector may be a Paramyxoviridae virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Respirovirus virus vector.
  • the RNA virus vector may be a Sendai virus vector.
  • a virus-derived genomic RNA carrying an inducer RNA and a virus-derived envelope that covers the genomic RNA and is different from the genomic RNA are used.
  • a chimeric virus comprising the following may also be used.
  • the stem cells may include a rearranged ⁇ -TCR gene.
  • a method for producing blood cells or immune cells according to an aspect of the present invention includes providing stem cells produced by the above-described method for producing stem cells, and inducing blood cells or immune cells from the stem cells.
  • the blood cells or immune cells may be ⁇ type T cells.
  • a cell mass of stem cells may be seeded onto feeder cells.
  • the feeder cells may be stromal cells.
  • the method for producing ⁇ T cells according to an aspect of the present invention includes inducing differentiation of ⁇ T cells from pluripotent stem cells derived from T cells.
  • pluripotent stem cells may be derived from ⁇ T cells.
  • the ⁇ T cells induced by pluripotent stem cells may express a ⁇ T cell receptor.
  • the pluripotent stem cells may have a rearranged gene for the ⁇ T cell receptor.
  • the differentiated ⁇ T cells may express a ⁇ T cell receptor.
  • inducing differentiation of ⁇ T cells from pluripotent stem cells is the same as inducing hematopoietic stem progenitor cells from pluripotent stem cells and inducing ⁇ T cells from hematopoietic stem progenitor cells. , may also be included.
  • cells may be cultured in a feeder-free manner while inducing hematopoietic stem progenitor cells from pluripotent stem cells.
  • cells may be cultured in suspension while hematopoietic stem progenitor cells are induced from pluripotent stem cells.
  • hematopoietic stem progenitor cells may be induced from pluripotent stem cells in a medium containing at least one of bone morphogenetic protein 4 (BMP-4), VEGF, and bFGF.
  • BMP-4 bone morphogenetic protein 4
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF vascular endothelial growth factor
  • hematopoietic stem progenitor cells may be induced from pluripotent stem cells using a medium containing an activin receptor-like kinase inhibitor.
  • the cells are cultured in a medium containing at least one of bone morphogenetic protein 4 (BMP-4), VEGF, and bFGF,
  • BMP-4 bone morphogenetic protein 4
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF vascular endothelial growth factor
  • hematopoietic stem progenitor cells may be cultured on feeder cells.
  • the feeder cells may be OP9 cells.
  • ⁇ T cells are ⁇ T cells induced to differentiate from pluripotent stem cells derived from ⁇ T cells.
  • a pharmaceutical composition for cancer treatment according to an aspect of the present invention contains ⁇ T cells induced to differentiate from pluripotent stem cells derived from ⁇ T cells.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing VJ gene rearrangement.
  • 1 is a photograph of induced stem cells according to Example 1.
  • 1 is a photograph showing the results of PCR analysis of the genome of induced stem cells according to Example 1.
  • 3 is a graph showing the percentage of ⁇ T cells according to Example 2.
  • 2 is a graph showing the number of ⁇ T cells induced from 2 ⁇ 10 4 mononuclear cells according to Example 2.
  • 3 is a photograph of induced stem cells according to Example 2.
  • 3 is a photograph of induced stem cells according to Example 2.
  • 3 is a graph showing the number of induced stem cell colonies according to Example 4.
  • 3 is a flow cytometer dot plot showing the results of Example 5.
  • 3 is a flow cytometer dot plot showing the results of Example 5.
  • 3 is a flow cytometer dot plot showing the results of Example 5.
  • 3 is a photograph showing the results of PCR analysis of the genome of induced stem cells according to Example 6.
  • 7 is a graph showing the number of induced stem cell colonies according to Example 7.
  • 3 is a photograph showing the results of PCR analysis of the genome of induced stem cells according to Example 7.
  • 3 is a photograph showing the results of PCR analysis of the genome of induced stem cells according to Example 7.
  • 3 is a flow cytometer dot plot showing the results of Example 8.
  • 2 is a dot plot using a flow cytometer showing the results of Example 8, Comparative Example 1, and Comparative Example 2.
  • 3 is a flow cytometer dot plot showing the results of Example 9.
  • 3 is a photograph of cells showing the results of Example 9.
  • a method for producing stem cells includes applying tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazol-2-ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate (PTA) to blood cells or immune cells, and or inducing stem cells from immune cells.
  • PTA tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazol-2-ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate
  • interleukin may be further applied to blood cells or immune cells.
  • Examples of interleukins in combination with PTA include, but are not limited to, IL-2, IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33. Interleukins may not include IL-2.
  • the method for producing stem cells applies bisphosphonate or (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate (HMBPP) and interleukin to blood cells or immune cells. and inducing stem cells from blood cells or immune cells, wherein the interleukin in combination with the bisphosphonate or HMBPP is selected from the group consisting of IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33. At least one is selected. Interleukins may not include IL-2.
  • HMBPP bisphosphonate or (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate
  • Interleukins in combination with bisphosphonates or HMBPP include, for example, IL-18 and IL-33.
  • Interleukins in combination with bisphosphonates or HMBPP include, for example, IL-4 and IL-18.
  • Interleukins in combination with bisphosphonates or HMBPP include, for example, IL-9 and IL-18.
  • Interleukins in combination with bisphosphonates or HMBPP include, for example, IL-4, IL-9, and IL-18.
  • Interleukins in combination with bisphosphonates or HMBP include, for example, IL-4, IL-18 and IL-33.
  • IL-4 may be applied to blood cells or immune cells after IL-18 and IL-33.
  • Interleukins in combination with bisphosphonates or HMBP include, for example, IL-4, IL-9, IL-18, and IL-33.
  • IL-4 may be applied to blood cells or immune cells after IL-9, IL-18 and IL-33.
  • Interleukins that are combined with bisphosphonates include, for example, IL-4.
  • Interleukins in combination with bisphosphonates include, for example, IL-4 and IL-18.
  • Interleukins in combination with bisphosphonates include, for example, IL-4, IL-9, and IL-18.
  • Interleukins that are combined with bisphosphonates include, for example, IL-9.
  • Interleukins in combination with bisphosphonates include, for example, IL-9 and IL-18.
  • Interleukins that are combined with bisphosphonates include, for example, IL-18.
  • the method for producing stem cells includes applying bisphosphonate or (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate (HMBPP) to blood cells or immune cells, and inducing stem cells from cells or immune cells, without applying IL-2 to blood cells or immune cells.
  • HMBPP bisphosphonate or (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphate
  • any interleukins, including IL-2 are not applied to blood cells or immune cells.
  • bisphosphonates include zoledronic acid, pamidronic acid, alendronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid, minodronic acid, PTA, salts thereof, and hydrates thereof.
  • the stem cells are, for example, induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Blood cells or immune cells may be derived from humans or non-human animals. Blood cells are separated from the blood. Blood includes, but is not limited to, peripheral blood and umbilical cord blood. Blood may be collected from an adult or a minor. When blood is collected, anticoagulants such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), heparin, and Biological Products Standard Blood Preservation Solution A (ACD-A) may be used.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • ACD-A Biological Products Standard Blood Preservation Solution A
  • Immune cells are isolated from blood, bone marrow, thymus, lymph, cavity fluid, and tissue. Examples of cavity fluids include ascites, pleural effusions, and pericardial effusions. Examples of tissues include tumor tissue.
  • Blood cells are, for example, nucleated cells such as mononuclear cells, neutrophils, eosinophils, basophils, and lymphocytes, and do not include red blood cells, granulocytes, and platelets.
  • the blood cells may be, for example, vascular endothelial progenitor cells, blood stem/progenitor cells, T cells, or B cells.
  • T cells may be, for example, ⁇ T cells or ⁇ T cells.
  • the blood cells do not have to be ⁇ T cells.
  • immune cells include lymphocytes. Examples of lymphocytes include T cells, NK cells, or B cells.
  • PTA or bisphosphonate When applying PTA or bisphosphonate to blood cells or immune cells, PTA or bisphosphonate may be added to the medium in which the blood cells or immune cells are cultured.
  • concentration of PTA or bisphosphonate in the medium is, for example, 0.5 ⁇ mol/L or more and 50 ⁇ mol/L or less, 1 ⁇ mol/L or more and 50 ⁇ mol/L or less, 3 ⁇ mol/L or more and 20 ⁇ mol/L or less, or 5 ⁇ mol/L or more and 12 ⁇ mol/L or less. It is.
  • Blood cells or immune cells may be cultured in a medium supplemented with PTA or bisphosphonates for one or more days, two or more days, or three or more days.
  • Blood cells or immune cells may be cultured in a medium supplemented with PTA or bisphosphonates for up to 14 days, up to 10 days, or up to 7 days.
  • interleukin When applying interleukin to blood cells or immune cells, interleukin may be added to the medium in which the blood cells or immune cells are cultured.
  • concentration of interleukin in the medium is, for example, 5 ng/mL or more and 100 ng/mL or less, 10 ng/mL or more and 90 ng/mL or less, or 15 ng/mL or more and 80 ng/mL or less.
  • Blood cells or immune cells may be cultured in a medium supplemented with interleukin for one or more days, two or more days, or three or more days.
  • Blood cells or immune cells may be cultured in a medium supplemented with interleukin for up to 14 days, up to 10 days, or up to 7 days.
  • Interleukin may be added to the medium every day, once every two days, or once every three days.
  • Interleukins may be applied to blood cells or immune cells after applying PTA or bisphosphonates to blood cells or immune cells.
  • PTA or bisphosphonates and interleukins may be applied simultaneously to blood cells or immune cells.
  • the PTA or bisphosphonate may be applied to the blood cells or immune cells after the interleukin is applied to the blood cells or immune cells.
  • Examples of media for culturing blood cells or immune cells include, but are not limited to, RPMI 1640 medium, minimal essential medium ( ⁇ -MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), and F12 medium.
  • the blood cells or immune cells may be expanded for 1, 2, or 3 days before introducing the inducer into the blood cells or immune cells.
  • an inducing factor is introduced into the blood cells or immune cells to which at least PTA or bisphosphonate has been applied to induce stem cells from the blood cells or immune cells.
  • inducing stem cells induction refers to reprogramming, reprogramming, transformation, cell fate reprogramming, and the like.
  • the inducer introduced into blood cells or immune cells may be RNA.
  • RNA may be mRNA.
  • Inducers include, for example, OCT3/4, SOX2, KLF4, and c-MYC.
  • M 3 O which is a modified version of OCT3/4, may be used as an inducing factor.
  • the inducers are LIN28A, FOXH1, LIN28B, GLIS1, p53-dominant negative, p53-P275S, L-MYC, NANOG, DPPA2, DPPA4, DPPA5, ZIC3, BCL-2, E-RAS, TPT1, SALL 2.NAC1 , DAX1, TERT, ZNF206, FOXD3, REX1, UTF1, KLF2, KLF5, ESRRB, miR-291-3p, miR-294, miR-295, NR5A1, NR5A2, TBX3, MBD3sh, TH2A, TH2B, and P53DD group It may be at least one selected from. RNA for these inducers is available from TriLink.
  • gene symbols are written here in humans, it is not intended to limit the species by uppercase or lowercase letters. For example, all capital letters do not exclude the inclusion of mouse or rat genes. However, in the examples, gene symbols are written according to the biological species actually used.
  • vectors may be used to introduce inducers into blood cells or immune cells.
  • the inducer may be introduced into blood cells or immune cells by lipofection.
  • RNA virus can be used as a vector.
  • the RNA virus may be a single-stranded RNA virus.
  • the RNA virus may be a single-stranded positive RNA virus.
  • the RNA virus may be a single-stranded negative RNA virus.
  • the RNA virus may be a chromosomally non-integrating RNA virus.
  • the RNA virus may be a Mononegavirales virus.
  • the RNA virus may be a Paramyxoviridae virus.
  • the RNA virus may be a virus belonging to the genus Respirovirus.
  • the RNA virus may be Sendai virus (Sev).
  • Sendai virus is a virus whose genome is RNA and belongs to the order Mononegavirales and the family Paramyxoviridae.
  • Sendai virus has an RNA genome and an envelope made of a lipid bilayer membrane that encloses the RNA.
  • CytoTune (registered trademark, Invitrogen) can be used as the Sendai virus loaded with inducer RNA.
  • the Sendai virus vector may be a Sendai virus vector with improved persistence of infection.
  • a stealth RNA vector may be used as the RNA virus vector.
  • As the stealth RNA vector SRV iPSC-1 Vector, SRV iPSC-2 Vector, SRV iPSC-3 Vector, and SRV iPSC-4 Vector (registered trademark, Tokiwa Bio Co., Ltd.) can be used. Details of stealth RNA vectors are described in Japanese Patent No. 4478788, Japanese Patent No. 4936482, Japanese Patent No. 5633075, and Japanese Patent No. 5963309.
  • Multiplicity of infection is an indicator of Sendai virus titer.
  • the MOI of Sendai virus is, for example, 0.1 to 100.0, or 1.0 to 50.0.
  • the inducer is introduced into blood cells or immune cells using a chimeric virus comprising a virus-derived genomic RNA carrying the inducer RNA and a virus-derived envelope that covers the genomic RNA and is different from the genomic RNA. Good too.
  • the genomic RNA of the chimeric virus may be derived from a paramyxovirus.
  • the chimeric virus genomic RNA may be a stealth RNA vector.
  • the genomic RNA of the chimeric virus contains the nucleocapsid protein (NP) gene, phosphorylated protein (P) gene/C protein (C) gene, matrix protein (M) gene, membrane fusion protein (F) gene, hemagglutinin-neuraminidase (
  • NP nucleocapsid protein
  • P phosphorylated protein
  • C C protein
  • M matrix protein
  • F membrane fusion protein
  • HN hemagglutinin-neuraminidase
  • the NP gene, P gene/C gene, and L gene are involved in transcription and replication of viral vectors.
  • the F gene, M gene, and NH gene are involved in virus particle formation. Therefore, a viral vector in which the functions of the F gene, M gene, and NH gene are all deleted cannot form new virus particles after infecting cells.
  • the F gene, M gene, and NH gene may be deleted in the genomic RNA.
  • the L gene which has a mutation that enables sustained gene expression, encodes a large protein whose amino acid sequence is valine at position 1618.
  • a virus vector having the mutant L gene has a reduced interferon-inducing ability, has no cytotoxicity, and has the ability to sustain infection. Therefore, the expression of the loaded inducer RNA is sustained within the cell.
  • siRNA targeting at least one of the NP gene, P gene, and mutant L gene may be introduced into the cells in order to remove the viral vector from the cells.
  • siRNA targeting a region containing the 527th or 1913rd nucleotide of the mutant L gene may be introduced into cells.
  • an undifferentiated cell-specific microRNA target sequence may be added to the non-coding region of at least one of the NP gene, P gene, and mutant L gene.
  • An example of an undifferentiated cell-specific microRNA is miR-302a.
  • the expression of undifferentiated cell-specific miRNAs such as miR-302a is induced in the cells.
  • the undifferentiated cell-specific miRNA binds to the target sequence, the expression of at least one of the NP gene, P gene, and mutant L gene is suppressed, and the viral vector is removed from the cell.
  • a miR-302a target sequence is added to the mutant L gene.
  • the genomic RNA of the chimeric virus may have, from the 3' end, the viral NP gene, P gene, C gene, and a mutant L gene that enables continuous gene expression.
  • the genomic RNA may have an inducer RNA between the C gene and the mutant L gene.
  • the genomic RNA may have fluorescent protein RNA between the C gene and the mutant L gene.
  • An example of a fluorescent protein is EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein).
  • the genome may have the RNA of a drug resistance gene between the C gene and the mutant L gene.
  • the envelope of the chimeric virus is, for example, derived from measles virus.
  • the genome RNA has the NP gene, P gene, C gene, and mutant L gene of the virus, and has EGFP RNA and inducer RNA between the C gene and the mutant L gene, and the genome Tokiwa Bio was commissioned to produce a chimeric virus called MSRV-1, which has a measles virus-derived envelope that covers RNA. Tokiwa Bio was commissioned to produce a chimeric virus called MSRV-2 in which a target sequence for miR-302a was added to the mutated L gene of MSRV-1.
  • the multiplicity of infection can be cited as an index of the titer of the chimeric virus.
  • the MOI of the chimeric virus is, for example, 0.1 to 100.0, or 1.0 to 50.0.
  • An inducing factor may be introduced into blood cells or immune cells that are adherently cultured, or may be introduced into blood cells or immunocytes that are cultured in suspension in a gel medium.
  • the blood cells or immune cells into which the inducer is introduced are cultured feeder-free using a basement membrane matrix such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), or Laminin 511 (iMatrix-511, Nippi). Good too.
  • a basement membrane matrix such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), or Laminin 511 (iMatrix-511, Nippi). Good too.
  • a stem cell medium such as a human ES/iPS medium such as Stemfit (Ajinomoto) can be used.
  • the stem cell culture medium is not limited to this, and various stem cell culture media can be used.
  • Primate ES Cell Medium, mTeSR1, TeSR2 (STEMCELL Technologies), etc. may be used.
  • the stem cell medium is placed, for example, in a dish, well, or tube.
  • the gel medium does not need to be stirred. Moreover, the gel medium does not need to contain feeder cells.
  • the gel medium may contain at least one substance selected from the group consisting of cadherin, laminin, fibronectin, and vitronectin.
  • the cells After introducing an inducing factor into blood cells or immune cells, the cells may be initialized in a liquid medium other than a gel medium, or the cells may be initialized in a gel medium.
  • the cells into which the inducer has been introduced are collected, and at least a portion of the collected and mixed cells is plated in a culture medium for at least one passage. It may be executed once. During passage, clones of cells into which the inducer has been introduced may be mixed. During passage, different clones of cells into which the inducer has been introduced may be mixed. Thereafter, the cells into which the inducer has been introduced may be collected, and at least a portion of the collected and mixed cells may be seeded in a medium and passaged multiple times.
  • the cells into which the inducing factor has been introduced may be collected, and at least a portion of the collected mixed cells may be seeded in a culture medium and subcultured until stem cells are established. Note that all of the collected mixed cells may be seeded into the culture medium.
  • collecting the cells into which the inducing factor has been introduced, and inoculating at least a portion of the collected and mixed cells into a culture medium means, for example, that the cells into which the inducing factor has been introduced are It means to passage without distinguishing between the two.
  • cells into which an inducing factor has been introduced may be seeded in the same culture vessel without being differentiated by gene expression status.
  • collecting the cells into which the inducing factor has been introduced, and inoculating at least a portion of the collected and mixed cells into a culture medium means, for example, that the cells into which the inducing factor has been introduced are It means to passage without distinguishing between the two.
  • cells into which an induction factor has been introduced may be seeded in the same culture vessel without being differentiated by the degree of reprogramming.
  • collecting the cells into which the inducing factor has been introduced, and inoculating at least a portion of the collected and mixed cells into a culture medium means, for example, distinguishing the cells into which the inducing factor has been introduced by morphology. It means to pass generations without any trouble.
  • cells into which an inducing factor has been introduced may be seeded in the same culture vessel without being differentiated by morphology.
  • collecting the cells into which the inducing factor has been introduced, and inoculating at least a portion of the collected and mixed cells into a culture medium means, for example, that the cells into which the inducing factor has been introduced are differentiated by size. It means to pass generations without any trouble.
  • cells into which an inducing factor has been introduced may be seeded in the same culture vessel without distinguishing their sizes.
  • collecting the cells into which the inducing factor has been introduced, and inoculating at least a portion of the collected and mixed cells into a medium for passage means that the cells into which the inducing factor has been introduced are passaged without cloning. It means to do something. For example, in the case of passage without cloning, it is not necessary to pick up colonies formed by cells into which an inducing factor has been introduced. For example, when subculturing without cloning, it is not necessary to separate multiple colonies formed by cells into which an inducing factor has been introduced. For example, during subculture, cells that have formed a plurality of different colonies may be mixed and seeded in the same culture vessel.
  • the cells cultured adherently may be collected, and at least a portion of the collected and mixed cells may be seeded in a medium for subculture.
  • cells may be detached from the culture vessel, and at least a portion of the detached and mixed cells may be seeded in the same culture vessel.
  • the cells may be peeled from the culture vessel using a peeling solution, and the entire mixed cells may be subcultured.
  • cells that do not form colonies may be passaged.
  • the whole cells cultured in suspension may be passaged.
  • the cells into which the inducing factor has been introduced may be cultured in a closed culture vessel and passaged.
  • a closed incubator for example, does not exchange gases, viruses, microorganisms, impurities, etc. with the outside world.
  • the cells into which the inducer has been introduced may be expanded by two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the entire adherent cultured cells may be cryopreserved as stem cells.
  • whole cells detached from the culture vessel with a detachment solution may be cryopreserved as stem cells.
  • the whole cells that are being cultured in suspension may be cryopreserved as stem cells.
  • the induced stem cells can express undifferentiated cell markers such as Nanog, OCT4, and SOX2.
  • the induced stem cells can express TERT.
  • the induced stem cells may exhibit teostomerase activity.
  • stem cells have been derived from blood cells or immune cells can be confirmed, for example, from the morphology of the cells.
  • induced stem cells may form flat-shouldered colonies similar to ES cells and express alkaline phosphatase.
  • whether or not stem cells are derived from blood cells or immune cells can be determined using a flow cytometer using cell surface markers that indicate undifferentiated cells such as TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-3, This may be carried out by analyzing whether at least one surface marker selected from SSEA-4 and SSEA5 is positive.
  • TRA-1-60 is an antigen specific to iPS/ES cells and is not detected in somatic cells. Since iPS cells are generated only from the TRA-1-60 positive fraction, TRA-1-60 positive cells are considered to be iPS cells.
  • the induced stem cells are equipped with, for example, a rearranged ⁇ -TCR gene.
  • a rearranged ⁇ -TCR gene is a gene encoding TCR in which the TCR ⁇ region and TCR ⁇ region have been rearranged.
  • the TCR ⁇ region includes V ⁇ -J ⁇ .
  • the TCR ⁇ region includes V ⁇ -D ⁇ -J ⁇ .
  • the induced stem cells are equipped with rearranged ⁇ -TCR genes with, for example, J1/J2 genes.
  • a method for producing blood cells or immune cells includes preparing stem cells produced by the above-described method for producing stem cells, and inducing blood cells or immune cells from the stem cells.
  • the method for inducing blood cells or immune cells from stem cells is not particularly limited, and includes, for example, glycogen synthase kinase-3 (GSK3) inhibitors such as CHIR99021, bone morphogenetic proteins such as bone morphogenetic protein-4 (BMP-4),
  • GSK3 glycogen synthase kinase-3
  • BMP-4 bone morphogenetic proteins
  • the prepared cells are cultured for 4 days in a medium containing growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SB431542 growth factor
  • growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF)
  • SCF stem cell factor
  • cells are cultured for 2 days in a medium containing growth factors such as VEGF, SCF, interleukins such as IL-3 and IL-6, cytokines such as Flt3L, and erythropoietin (EPO). Furthermore, cells are cultured in a medium containing SCF, interleukins such as IL-6, and EPO. This induces blood cells or immune cells.
  • growth factors such as VEGF, SCF, interleukins such as IL-3 and IL-6, cytokines such as Flt3L, and erythropoietin (EPO).
  • EPO erythropoietin
  • stem cells may be seeded on stromal cells to induce blood cells or immune cells from the stem cells.
  • the stromal cells may be derived from bone marrow.
  • the stromal cells may be OP9 cells.
  • OP9 cells do not produce macrophage stimulating factor (M-CSF) and have the function of supporting differentiation of stem cells into blood cells or immune cells.
  • M-CSF macrophage stimulating factor
  • a colony of stem cells is divided into a plurality of cell clusters, and the stem cell clusters are seeded onto OP9 cells as feeder cells.
  • Blood cells or immune cells are thereby induced from the stem cells.
  • the induced blood cells or immune cells are, for example, positive for CD34 and CD43.
  • the induced blood cells or immune cells may be ⁇ type T cells.
  • the method for producing ⁇ T cells includes inducing differentiation of ⁇ T cells from pluripotent stem cells derived from T cells.
  • Pluripotent stem cells are, for example, iPS cells.
  • Pluripotent stem cells are, for example, pluripotent stem cells derived from ⁇ T cells.
  • Pluripotent stem cells are, for example, pluripotent stem cells derived from ⁇ T cells expressing the ⁇ T cell receptor.
  • pluripotent stem cells may be induced from T cells by a method similar to the method for producing stem cells described above.
  • pluripotent stem cells may be derived from T cells stimulated with IL-2 and zoledronic acid.
  • the induced pluripotent stem cells may have a rearranged gene for the ⁇ T cell receptor.
  • Inducing differentiation of ⁇ T cells from pluripotent stem cells may include inducing hematopoietic stem progenitor cells from pluripotent stem cells and inducing ⁇ T cells from hematopoietic stem progenitor cells.
  • cells may be cultured feeder-free.
  • cells may be cultured in suspension.
  • Hematopoietic stem progenitor cells may be induced from pluripotent stem cells using a medium containing at least one of bone morphogenetic protein 4 (BMP-4), VEGF, and bFGF. Hematopoietic stem progenitor cells may be induced from pluripotent stem cells with a medium containing BMP-4, VEGF, and bFGF.
  • BMP-4 bone morphogenetic protein 4
  • VEGF vascular endothelial growth factor 4
  • bFGF bone morphogenetic protein 4
  • Hematopoietic stem progenitor cells may be induced from pluripotent stem cells using a medium containing an activin receptor-like kinase inhibitor.
  • An activin receptor-like kinase inhibitor may be added to the medium containing BMP-4, VEGF, and bFGF.
  • cells are cultured in a medium containing at least one of BMP-4, VEGF, and bFGF, and then, at least one of VEGF, bFGF, SCF, TPO, and FLT3L is cultured.
  • Cells may be cultured in a medium containing
  • cells While deriving hematopoietic stem progenitor cells from pluripotent stem cells, cells may be cultured in a medium containing BMP-4, VEGF, and bFGF, and then cells may be cultured in a medium containing VEGF, bFGF, and SCF. .
  • cells are cultured in a medium containing BMP-4, VEGF, and bFGF; Cells may be cultured in a medium containing VEGF, bFGF, SCF, TPO, and FLT3L.
  • Hematopoietic stem progenitor cells may be cultured on feeder cells.
  • the feeder cells may be OP9 cells.
  • ⁇ T cells induced to differentiate from pluripotent stem cells may express a ⁇ T cell receptor.
  • ⁇ T cells can be used as pharmaceutical compositions for cancer treatment.
  • Example 1 1 ⁇ mol/L to ⁇ mol/L tetrakis-pivaloyloxymethyl 2-(thiazol-2-ylamino)ethylidene-1,1-bisphosphonate (PTA, Techno Suzuta), 10% fetal bovine serum (Life Technologies), 1 RPMI1640 medium (Gibco) containing .0 ⁇ 10 ⁇ 5 mol/L 2-mercaptoethanol (Nacalai Tesque), 100 U/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin (Life Technologies) containing PTA according to Example 1. Prepared as a culture medium.
  • Human peripheral blood mononuclear cells were placed in the PTA-containing medium according to Example 1, and the medium containing approximately 1 ⁇ 10 6 mononuclear cells was placed in a 24-well plate (day 1). The medium was supplemented with 1 ⁇ L of 20 ⁇ g/mL IL-2 daily. On the third day, the medium containing the cells was collected from the plate, the medium was centrifuged, and the supernatant was removed. Thereafter, 2 mL of a new PTA-containing medium according to Example 1 was added to the cells, and 1 mL each was placed in two wells of a 24-well plate.
  • the medium containing the cells was collected from the plate, the medium was centrifuged, and the supernatant was removed. Thereafter, the PTA-containing medium according to Example 1 was added to the cells, and the medium containing 2 ⁇ 10 4 mononuclear cells was placed in a 96-well plate. KLF4, OCT3/4, SOX2, and c-MYC were introduced into the cells using MSRV (Tokiwa Bio). Multiplicity of infection (MOI) was adjusted to 5.
  • Fresh PTA-containing medium according to Example 1 was added to the medium containing the cells collected from the 96-well plate on day 7 and placed in a 6-well plate coated with laminin (iMatrix-511, Nippi). On the 8th, 10th, and 12th days, a stem cell medium (Stem Fit, Ajinomoto) was added, and thereafter, the medium was replaced with the stem cell medium.
  • laminin iMatrix-511, Nippi
  • FIG. 3 A photograph of the established iPS cells is shown in Figure 2.
  • genomic DNA was extracted from iPS cells and analyzed by PCR and electrophoresis to determine whether it contained the rearranged V ⁇ 9 gene.
  • the genomic DNA of mononuclear cells (PBMC) was used as a positive control, and the genome of iPS cells that do not have the rearranged V ⁇ 9 gene was analyzed in the same manner as a negative control.
  • PBMC mononuclear cells
  • FIG. 3 it was confirmed that the iPS cells established in Example 1 had a rearranged V ⁇ 9 gene containing the JP gene and a rearranged V ⁇ 2 gene containing the J ⁇ 1 gene. It was done.
  • Example 2 5 ⁇ mol/L zoledronic acid (Zol, Sigma-Aldrich), 10% fetal bovine serum (Life Technologies), 1.0 ⁇ 10 ⁇ 5 mol/L 2-mercaptoethanol (Nacalai Tesque), 100 U/mL penicillin. 1640 medium (Gibco) containing 100 ⁇ g/mL of streptomycin (Life Technologies) was prepared as the zoledronic acid-containing medium according to Example 2.
  • Human peripheral blood mononuclear cells were placed in the zoledronic acid-containing medium according to Example 2, and the medium containing approximately 1 ⁇ 10 6 mononuclear cells was placed in a 24-well plate (day 1). 1 ⁇ L of 20 ⁇ g/mL IL-2 was added daily to the culture medium of the first mononuclear cell group. The culture medium of the second mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L of 20 ⁇ g/mL IL-9 daily. The medium of the third mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L of 20 ⁇ g/mL IL-33 daily.
  • the culture medium of the fourth mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L each of 50 ⁇ g/mL IL-18 and 500 ⁇ g/mL IL-33 every day.
  • the culture medium of the fifth mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L each of 5 ⁇ g/mL IL-4, 50 ⁇ g/mL IL-18, and 500 ⁇ g/mL IL-33 every day.
  • the culture medium of the sixth mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L each of 5 ⁇ g/mL IL-4, 2 ⁇ g/mL IL-9, 50 ⁇ g/mL IL-18, and 500 ⁇ g/mL IL-33 every day. .
  • the medium containing cells was collected from the plate, the medium was centrifuged, and the supernatant was removed. Thereafter, 2 mL of a new zoledronic acid-containing medium according to Example 2 was added to the cells, and 1 mL each was placed in two wells of a 24-well plate.
  • Figure 4 shows the percentage of ⁇ T cells examined on day 6 using an anti- ⁇ 9 antibody and an anti- ⁇ 2 antibody using a flow cytometer. The number of ⁇ T cells derived from 2 ⁇ 10 4 mononuclear cells is shown in FIG. 5.
  • the medium containing the cells was collected from the plate, the medium was centrifuged, and the supernatant was removed. Thereafter, the zoledronic acid-containing medium according to Example 2 was added to the cells, and the medium containing 2 ⁇ 10 4 mononuclear cells was placed in a 96-well plate. KLF4, OCT3/4, SOX2, and c-MYC were introduced into the cells using MSRV (Tokiwa Bio). Multiplicity of infection (MOI) was adjusted to 5.
  • Fresh zoledronic acid-containing medium according to Example 2 was added to the medium containing the cells collected from the 96-well plate on the 7th day and placed in a 6-well plate. On the 8th, 10th, and 12th days, a stem cell medium (Stem Fit, Ajinomoto) was added, and thereafter, the medium was replaced with the stem cell medium.
  • a stem cell medium Ste Fit, Ajinomoto
  • Example 3 iPS cells were induced from mononuclear cells in the same manner as in Example 2, except that zoledronic acid in the zoledronic acid-containing medium according to Example 2 was changed to HMBPP. Note that only IL-2 was used as the interleukin.
  • Example 4 Human peripheral blood mononuclear cells were placed in the zoledronic acid-containing medium according to Example 2, and the medium containing approximately 1 ⁇ 10 6 mononuclear cells was placed in a 24-well plate (day 1). No interleukin was added to the culture medium of the first mononuclear cell group.
  • the culture medium of the second mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L of 20 ⁇ g/mL IL-2 daily.
  • the medium of the third mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L of 20 ⁇ g/mL IL-9 daily.
  • the culture medium of the fourth mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L of 20 ⁇ g/mL IL-18 daily.
  • the culture medium of the fifth mononuclear cell group was supplemented with 1 ⁇ L of 20 ⁇ g/mL IL-4 every day.
  • 1 ⁇ L each of 20 ⁇ g/mL IL-9 and 20 ⁇ g/mL IL-18 was added to the culture medium of the sixth mononuclear cell group every day.
  • 1 ⁇ L each of 20 ⁇ g/mL IL-4 and 20 ⁇ g/mL IL-18 was added to the culture medium of the seventh mononuclear cell group every day.
  • To the culture medium of the eighth mononuclear cell group, 1 ⁇ L each of 20 ⁇ g/mL IL-4, 20 ⁇ g/mL IL-9, and 20 ⁇ g/mL IL-18 were added daily.
  • a zoledronic acid-free medium which is the same as the zoledronic acid-containing medium according to Example 2 except that it does not contain zoledronic acid, was prepared, and the zoledronic acid-free medium for the ninth mononuclear cell group contained 20 ⁇ g/mL daily. 1 ⁇ L of IL-2 was added.
  • the medium containing cells was collected from the plate, the medium was centrifuged, and the supernatant was removed. Thereafter, 2 mL of a new zoledronic acid-containing medium according to Example 2 was added to the first to eighth cell groups, and 1 mL each was placed in two wells of a 24-well plate. In addition, 2 mL of fresh zoledronic acid-free medium was added to the ninth cell group, and 1 mL each was added to two wells of a 24-well plate.
  • the medium containing the cells was collected from the plate, the medium was centrifuged, and the supernatant was removed. Thereafter, the zoledronic acid-containing medium according to Example 2 was added to the first to eighth cell groups, and the zoledronic acid-free medium was added to the ninth cell group, containing 2 ⁇ 10 4 mononuclear cells.
  • the medium was placed in a 96-well plate. KLF4, OCT3/4, SOX2, and c-MYC were introduced into the cells using MSRV (Tokiwa Bio). Multiplicity of infection (MOI) was adjusted to 5.
  • Fresh zoledronic acid-containing medium according to Example 2 was added to the medium containing the first to eighth cell groups collected from the 96-well plate on the seventh day, and fresh zoledronic acid was added to the medium containing the ninth cell group. Acid-free medium was added and placed in a 6-well plate. On the 8th, 10th, and 12th days, a stem cell medium (Stem Fit, Ajinomoto) was added, and thereafter, the medium was replaced with the stem cell medium.
  • Ste cell medium Ste Fit, Ajinomoto
  • Example 5 ⁇ MEM medium supplemented with FBS at a final concentration of 20% and penicillin/streptomycin at a final concentration of 1% was prepared as a medium for OP9 cells.
  • Vitamin C at a final concentration of 100 mmol/L
  • interleukin-7 IL-7
  • FLT3 ligand at a final concentration of 10 ⁇ g/mL
  • SCF stem cell factor
  • Each colony of iPS cells induced using only IL-2 as the interleukin in Examples 2 and 3 was detached from the dish using a cell scraper and divided into multiple cell clusters by pipetting.
  • a dish in which OP9 cells were cultured as feeder cells was prepared.
  • OP9 cells were cultured in OP9 cell medium.
  • a plurality of cell clusters consisting of iPS cells were seeded on the feeder cells, and cultured for 2 days using a stem cell medium supplemented with Y27632 at a final concentration of 10 ⁇ mol/L.
  • the medium was replaced with a medium for OP9 cells supplemented with vitamin C, and the cells were cultured for an additional 12 days.
  • half of the medium was removed from the dish and replaced with a fresh OP9 medium supplemented with vitamin C.
  • Figure 10 shows the results of flow cytometry analysis of cells cultured on OP9/DLL1 for 28 days.
  • the cells were positive for both lymphoid progenitor cell markers CD5-PE and CD7-FITC.
  • a cell population positive for ⁇ TCR-APC, a ⁇ T cell marker was confirmed among the CD3-PE positive population, a Pan-T cell marker.
  • a CD3-PE monopositive ⁇ T cell population was also confirmed.
  • T progenitor cells In order to induce cells that had been induced to become T progenitor cells to become ⁇ T cells, strong stimulation was applied to the cells via ⁇ T cell receptor (TCR).
  • HMBPP (0.01 ⁇ g/mL to 1 ⁇ g/mL) or zoledronic acid (5 ⁇ mol/L) was added to the medium as a stimulant, and the cells were cultured until day 35.
  • the feeder cells were changed from OP9/DLL1 cells that express Notch ligands to OP9 cells that do not express Notch ligands to inhibit induction into ⁇ T cells.
  • Figure 11 shows the results of flow cytometry analysis of cells on day 35. It was confirmed that CD3 and ⁇ TCR (V ⁇ 9) were expressed on the cell surface. The marker expression was higher when the feeder cells were OP9-DLL1 cells than when the feeder cells were OP9 cells. In the negative control, in which no stimulant was added, there was no marker expression.
  • Genomic DNA was extracted from the iPS cells established in Example 2, and analyzed by PCR and electrophoresis to determine whether they contained the rearranged V ⁇ 9 gene.
  • the genomic DNA of mononuclear cells (PBMC) was used as a positive control, and the genome of iPS cells that do not have the rearranged V ⁇ 9 gene was analyzed in the same manner as a negative control.
  • PBMC mononuclear cells
  • FIG. 12 it was confirmed that the iPS cells established in Example 1 had a rearranged V ⁇ 9 gene containing the JP gene and a rearranged V ⁇ 2 gene containing the J ⁇ 1 gene. It was done.
  • Example 7 In the same manner as in Example 4, iPS cells were established by adding only IL-2 to a zoledronic acid-containing medium. In addition, by the same method as in Example 4, iPS cells were established by adding IL-4, IL-9, and IL-18 to the zoledronic acid-containing medium. As shown in Figure 13, the number of iPS cell colonies established was higher when IL-4, IL-9, and IL-18 were added to the medium than when only IL-2 was added to the medium. There were many.
  • iPS cells induced from ⁇ T cells were prepared in a medium supplemented with IL-2 and zoledronic acid, and the iPS cells were adherently cultured. iPS cells were collected using TrypLe Select and suspended in iPS cell medium (Puel, I Peace, Inc.). iPS cells were placed in a low adhesion well plate, 10 ⁇ mol/L ROCK inhibitor and 10 ⁇ mol/L GSK-3 inhibitor were added to the medium, and the cells were cultured at 37° C. in a 5% CO 2 environment. Thereafter, the cell suspension was collected, and the cell suspension was centrifuged to remove the supernatant.
  • L-glutamine replacement (Gibco GlutaMAX supplement), 50 ⁇ g/mL ascorbic acid 2-phosphate, 40 mmol/L monothioglycerol (MTG), insulin-transferrin-selenium solution (ITS), and penicillin/streptomycin.
  • the added serum-free medium (Gibco StemPro-34 SFM) was prepared as a differentiation medium.
  • BMP-4 bone morphogenetic protein 4
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF vascular endothelial growth factor
  • the cell suspension was collected, centrifuged, and the supernatant was removed.
  • the cells were suspended in a differentiation medium supplemented with 50 ng/mL VEGF, 50 ng/mL bFGF, and 50 ng/mL SCF, and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 environment.
  • the cell suspension was collected, centrifuged, and the supernatant was removed.
  • Cells were suspended in differentiation medium supplemented with 50 ng/mL VEGF, 50 ng/mL bFGF, 50 ng/mL SCF, 30 ng/mL TPO, and 10 ng/mL FLT3L, and incubated at 37°C in a 5% CO 2 environment. Cells were cultured under Thereafter, cells were collected every 2 to 3 days and cultured in a differentiation medium containing the same additives until the 14th day to form embryoid bodies.
  • the cell suspension was collected and the embryoid bodies were disrupted by pipetting. Furthermore, the cells obtained by disrupting the embryoid bodies were passed through a 40 ⁇ m filter to collect only hematopoietic stem progenitor cells.
  • OP9/DLL1 cells were prepared as feeder cells. Additionally, ⁇ -MEM supplemented with FBS, GlutaMAX supplement, and penicillin/streptomycin was prepared as OP9 medium. OP9/DLL1 cells were seeded in a 6 cm dish and cultured overnight in OP9 medium.
  • Hematopoietic stem progenitor cells were suspended in OP9 medium supplemented with SCF, IL-7, FLT3L, and ascorbic acid 2-phosphate, and seeded onto OP9/DLL1 cells. Thereafter, the medium was replaced with fresh OP9 medium every 2 to 3 days, and the cells were passaged onto new OP9/DLL1 cells every week to culture the cells for 3 weeks.
  • stem cells become positive for CD45, a blood cell marker, and then become positive for CD3, a T cell marker, and positive for TCR ⁇ 9 and TCR ⁇ 2, which are ⁇ T cell markers. It is thought that it will become. Therefore, cells exhibiting a combination of CD3-positive and CD8-positive, a combination of CD7-positive and CD5-negative, a combination of CD7-positive and CD5-positive, a combination of CD45-positive, TCR ⁇ 9-positive, and TCR ⁇ 2-negative are in the process of being induced into ⁇ T cells. It can be a cell.
  • IL-2 and a serum-free lymphocyte medium (X-VIVO10, registered trademark) supplemented with beads (Dynabeads, registered trademark, Human T-Activator CD3/CD28, ThermoFisher) with anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies bound to the surface.
  • iPS cells induced from ⁇ T cells ( ⁇ T-iPS cells) using KLF4, OCT3/4, SOX2, and c-MYC were prepared in the same manner as in Example 8.
  • Hematopoietic stem progenitor cells were induced.
  • hematopoietic stem progenitor cells were cultured for 3 weeks in the same manner as in Example 8. When the cells cultured for 3 weeks were analyzed using a flow cytometer, they were positive for CD45, but as shown in FIG. 17, they were negative for TCR ⁇ 9 and TCR ⁇ 2, and ⁇ T cells were not induced.
  • Example 9 The ⁇ T cells produced in Example 8 were collected, centrifuged, and the supernatant was removed. Next, IL-7, IL-2, dexamethasone, and anti-CD3 (OKT3) antibody were added to the differentiation medium, the cells were suspended in the differentiation medium, and the cells were cultured at 37°C in a 5% CO 2 environment. did. After 3 days, the cells were harvested and washed with PBS, the cells were centrifuged, and the supernatant was removed. Next, IL-7, IL-2, and dexamethasone were added to the differentiation medium, the cells were suspended in the differentiation medium, and the cells were cultured at 37° C. in a 5% CO 2 environment. After 4 days, mature ⁇ T cells were obtained. When mature ⁇ T cells were analyzed using a flow cytometer, as shown in FIG. 18, more than 98% of the cells were positive for the combination of CD3 and CD45 and the combination of V ⁇ 9 and CD3.
  • Mature ⁇ T cells were collected, centrifuged, and the supernatant was removed.
  • IL-2, IL-4, IL-9, and IL-18 were added to the differentiation medium, the cells were suspended in the differentiation medium, and the cells were placed in wells coated with anti-CD3 (OKT3) antibody and retronectin. were seeded, and the cells were cultured at 37° C. in a 5% CO 2 environment.
  • the cells were harvested and washed with PBS, the cells were centrifuged, and the supernatant was removed.
  • the cells were suspended in a differentiation medium supplemented with IL-2, IL-4, IL-9, and IL-18, and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 environment.
  • the cells were repeatedly subcultured to a wider well, thereby expanding mature ⁇ T cells.
  • the cell morphology indicates that proliferating ⁇ T cells are activated by IL-2, IL-4, IL-9, and IL-18, and anti-CD3 (OKT3) antibody. confirmed.

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Abstract

本開示によれば、血液細胞又は免疫細胞にテトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート（ＰＴＡ）を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含む幹細胞の製造方法が提供される。

Description

幹細胞の製造方法及びγδＴ細胞の製造方法
　本発明は、細胞技術に関し、幹細胞の製造方法及びγδＴ細胞の製造方法に関する。
　造血幹細胞に由来するＴ細胞は、免疫で重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献１参照）。Ｔ細胞は、表面に多様性に富むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＴＣＲの多様性は、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成によりもたらされる。ＶＪ遺伝子再構成を図１に示す。
　Ｔ細胞の前駆細胞であるＤＮ１（ｄｏｕｂｌｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　１）細胞は、胸腺内の皮質被膜下領域に強く発現されるインターロイキン－７（ＩＬ－７）とｃ－ｋｉｔリガンド（ＫＬ）に反応して増殖するとともに、ＣＤ２５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２　ｒｅｃｅｐｔｏｒα鎖）を発現し、ＤＮ２細胞になる。ＤＮ２細胞は、しだいにＣＤ４４発現を減少させて、ＤＮ３細胞になる。
　ＴＣＲは、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域とを備える。Ｖ領域のアミノ酸配列は多様性に富み、抗原との結合部位を形成する。Ｖ領域遺伝子は、ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ＤＮＡにおいてはＶ遺伝子、Ｄ（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）遺伝子、及びＪ（ｊｏｉｎｉｎｇ）遺伝子に分断されて存在し，Ｔ細胞へ分化する過程で、これらが、Ｖ－（Ｄ）－Ｊと染色体上でひとつながりに再構成され、発現型の遺伝子となる。なお、Ｊ遺伝子には、ＪＰ１遺伝子、ＪＰ遺伝子、Ｊ１遺伝子、ＪＰ２遺伝子、Ｊ２遺伝子がある。
　ＴＣＲβ及びＴＣＲγ遺伝子座のＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成が起こったＤＮ３細胞は、ＴＣＲαβ型Ｔ細胞か、ＴＣＲγδ型Ｔ細胞になる。ＴＣＲαβ型Ｔ細胞においては、ＴＣＲがα鎖とβ鎖からなる。ＴＣＲγδ型Ｔ細胞においては、ＴＣＲがγ鎖とδ鎖からなる。ＴＣＲαβ型Ｔ細胞となるか、ＴＣＲγδ型Ｔ細胞となるかの分岐決定は、ＴＣＲγ遺伝子座とＴＣＲα遺伝子座に存在するサイレンサー領域における制御による。
　ＴＣＲγδ型Ｔ細胞は、ＴＣＲαβ型Ｔ細胞より少数であるが、腸粘膜における上皮細胞間リンパ球集団の中では、多数を占める。ＴＣＲγδ型Ｔ細胞は、細胞に傷害を与える様々なストレスを感知し、免疫反応を誘導する。ＴＣＲγδ型Ｔ細胞は、細菌感染やウイルス感染などの体外からのストレスの他に、細胞のガン化に伴う性質の変化を感知するといわれている。
　ＴＣＲγδ型Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のコレステロール合成経路のメバロン酸代謝における中間生成物や、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を抗原として認識した後、増殖や活性化する。そのため、患者のＴＣＲγδ型Ｔ細胞を体外で活性化させ、体内に戻す癌免疫療法が実施されている。しかし、ＴＣＲγδ型Ｔ細胞は、末梢血中に１から５％しか存在しないため、採血しても十分なＴＣＲγδ型Ｔ細胞が得られないという問題がある。
　そのため、ゾレドロン酸で刺激した末梢血単核球を初期化して、再構成されたγδ―ＴＣＲ遺伝子を有するｉＰＳ細胞を誘導することが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。しかし、当該方法で誘導されたｉＰＳ細胞は、Ｊ１／Ｊ２遺伝子を有するγδ―ＴＣＲ遺伝子が再構成されないことが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。
国際公開第２０１８／１４３２４３号
　本発明は、再構成されたγδ―ＴＣＲ遺伝子を有する幹細胞を効率的に誘導する方法、及びγδＴ細胞を効率的に製造する方法を提供することを目的の一つとする。
　本発明の態様に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞にテトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート（ＰＴＡ）を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含む。
　上記の幹細胞の製造方法が、血液細胞又は免疫細胞にインターロイキンを適用することをさらに含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、単核球であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、ｉＰＳ細胞であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを血液細胞又は免疫細胞に導入してもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、ＲＮＡウイルスベクターを用いてもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖プラスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖マイナスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、染色体非組み込み型ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、モノネガウイルス目ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、パラミクソウイルス科ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、レスピロウイルス属ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、センダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、当該ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用いてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備えていてもよい。
　本発明の態様に係る血液細胞又は免疫細胞の製造方法は、上記の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、を含む。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、γδ型Ｔ細胞であってもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することにおいて、幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞上に播種してもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、フィーダー細胞が間質細胞であってもよい。
　本発明の態様に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞に、ビスホスホネート又は（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）と、インターロイキンと、を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含み、インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３からなる群から選択される少なくとも一つである。インターロイキンが、ＩＬ－２を含まなくともよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３を含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－４及びＩＬ－１８を含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－９及びＩＬ－１８を含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３を含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－１８及びＩＬ－３３より後にＩＬ－４を適用してもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３を含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－９、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３より後にＩＬ－４を適用してもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、ミノドロン酸、テトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート（ＰＴＡ）、それらの塩及びそれらの水和物から選択される１つであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、ビスホスホネートが、ゾレドロン酸であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、単核球であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、ｉＰＳ細胞であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを血液細胞又は免疫細胞に導入してもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、ＲＮＡウイルスベクターを用いてもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖プラスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖マイナスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、染色体非組み込み型ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、モノネガウイルス目ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、パラミクソウイルス科ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、レスピロウイルス属ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、センダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、当該ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用いてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備えていてもよい。
　本発明の態様に係る血液細胞又は免疫細胞の製造方法は、上記の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、を含む。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、γδ型Ｔ細胞であってもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することにおいて、幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞上に播種してもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、フィーダー細胞が間質細胞であってもよい。
　本発明の態様に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞に、ビスホスホネート又は（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含み、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－２を適用しない。好ましくは、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－２を含むあらゆるインターロイキンを適用しない。
　上記の幹細胞の製造方法において、ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、ミノドロン酸、テトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート（ＰＴＡ）、それらの塩及びそれらの水和物から選択される１つであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、ビスホスホネートが、ゾレドロン酸であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、単核球であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、ｉＰＳ細胞であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを血液細胞又は免疫細胞に導入してもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、ＲＮＡウイルスベクターを用いてもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖プラスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖マイナスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、染色体非組み込み型ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、モノネガウイルス目ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、パラミクソウイルス科ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、レスピロウイルス属ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、センダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、当該ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用いてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備えていてもよい。
　本発明の態様に係る血液細胞又は免疫細胞の製造方法は、上記の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、を含む。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、γδ型Ｔ細胞であってもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することにおいて、幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞上に播種してもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、フィーダー細胞が間質細胞であってもよい。
　本発明の態様に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞にテトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート（ＰＴＡ）を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含み、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－２を適用しない。
　上記の幹細胞の製造方法が、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－２以外のインターロイキンを適用することをさらに含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、単核球であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、ｉＰＳ細胞であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを血液細胞又は免疫細胞に導入してもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、ＲＮＡウイルスベクターを用いてもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖プラスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖マイナスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、染色体非組み込み型ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、モノネガウイルス目ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、パラミクソウイルス科ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、レスピロウイルス属ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、センダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、当該ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用いてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備えていてもよい。
　本発明の態様に係る血液細胞又は免疫細胞の製造方法は、上記の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、を含む。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、γδ型Ｔ細胞であってもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することにおいて、幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞上に播種してもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、フィーダー細胞が間質細胞であってもよい。
　本発明の態様に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞に、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸と、インターロイキンと、を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含み、インターロイキンがＩＬ－２を含まない。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３を含んでいてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３を含み、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－９、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３より後にＩＬ－４を適用してもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、単核球であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、ｉＰＳ細胞であってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを血液細胞又は免疫細胞に導入してもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、ＲＮＡウイルスベクターを用いてもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖プラスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、一本鎖マイナスＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、染色体非組み込み型ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、モノネガウイルス目ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、パラミクソウイルス科ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、レスピロウイルス属ウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターが、センダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することにおいて、誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、当該ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用いてもよい。
　上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備えていてもよい。
　本発明の態様に係る血液細胞又は免疫細胞の製造方法は、上記の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、を含む。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、血液細胞又は免疫細胞が、γδ型Ｔ細胞であってもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することにおいて、幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞上に播種してもよい。
　上記の血液細胞又は免疫細胞の製造方法において、フィーダー細胞が間質細胞であってもよい。
　本発明の態様に係るγδＴ細胞の製造方法は、Ｔ細胞から誘導された多能性幹細胞からγδＴ細胞を分化誘導することを含む。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、多能性幹細胞がγδＴ細胞から誘導されていてもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、多能性幹細胞に誘導されたγδＴ細胞が、γδＴ細胞受容体を発現していてもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、多能性幹細胞が、γδＴ細胞受容体の再構成遺伝子を有していてもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、分化誘導されたγδＴ細胞が、γδＴ細胞受容体を発現していてもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、多能性幹細胞からγδＴ細胞を分化誘導することが、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導することと、造血幹前駆細胞からγδＴ細胞を誘導することと、を含んでいてもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導する間、フィーダーフリーで細胞を培養してもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導する間、細胞を浮遊培養してもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦの少なくともいずれかを含む培地で、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導してもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、アクチビン受容体様キナーゼ阻害剤を含む培地で、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導してもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導する間、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦの少なくともいずれかを含む培地で細胞を培養し、次いで、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌの少なくともいずれかを含む培地で細胞を培養してもよい。
　上記のγδＴ細胞の製造方法において、造血幹前駆細胞をフィーダー細胞上で培養してもよい。フィーダー細胞が、ＯＰ９細胞であってもよい。
　本発明の態様に係るγδＴ細胞は、γδＴ細胞から誘導された多能性幹細胞から分化誘導されたγδＴ細胞である。
　本発明の態様に係るがん治療のための医薬品組成物は、γδＴ細胞から誘導された多能性幹細胞から分化誘導されたγδＴ細胞を含む。
　本発明によれば、γδＴ細胞を効率的に製造する方法、及びγδＴ細胞を効率的に製造する方法を提供可能である。
ＶＪ遺伝子再構成を示す模式図である。 実施例１に係る誘導された幹細胞の写真である。 実施例１に係る誘導された幹細胞のゲノムをＰＣＲで解析した結果を示す写真である。 実施例２に係るγδＴ細胞の割合を示すグラフである。 実施例２に係る２×１０４個の単核球から誘導されたγδＴ細胞の数を示すグラフである。 実施例２に係る誘導された幹細胞の写真である。 実施例２に係る誘導された幹細胞の写真である。 実施例４に係る誘導された幹細胞のコロニー数を示すグラフである。 実施例５の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例５の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例５の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例６に係る誘導された幹細胞のゲノムをＰＣＲで解析した結果を示す写真である。 実施例７に係る誘導された幹細胞のコロニー数を示すグラフである。 実施例７に係る誘導された幹細胞のゲノムをＰＣＲで解析した結果を示す写真である。 実施例７に係る誘導された幹細胞のゲノムをＰＣＲで解析した結果を示す写真である。 実施例８の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例８、比較例１、及び比較例２の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例９の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例９の結果を示す細胞の写真である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための例示をするものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　実施形態に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞にテトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート（ＰＴＡ）を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含む。実施形態に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞にインターロイキンをさらに適用してもよい。ＰＴＡと組み合わされるインターロイキンの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３が挙げられるが、特に限定されない。インターロイキンはＩＬ－２を含まなくてもよい。
　また、実施形態に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞にビスホスホネート又は（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）と、インターロイキンと、を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含み、ビスホスホネート又はＨＭＢＰＰと組み合わされるインターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３からなる群から選択される少なくとも一つである。インターロイキンはＩＬ－２を含まなくてもよい。
　ビスホスホネート又はＨＭＢＰＰと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３を含む。ビスホスホネート又はＨＭＢＰＰと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－４及びＩＬ－１８を含む。ビスホスホネート又はＨＭＢＰＰと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－９及びＩＬ－１８を含む。ビスホスホネート又はＨＭＢＰＰと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を含む。ビスホスホネート又はＨＭＢＰと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３を含む。この場合、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－１８及びＩＬ－３３より後にＩＬ－４を適用してもよい。ビスホスホネート又はＨＭＢＰと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３を含む。この場合、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－９、ＩＬ－１８及びＩＬ－３３より後にＩＬ－４を適用してもよい。
　ビスホスホネートと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－４を含む。ビスホスホネートと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－４及びＩＬ－１８を含む。ビスホスホネートと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を含む。
　ビスホスホネートと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－９を含む。ビスホスホネートと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－９及びＩＬ－１８を含む。
　ビスホスホネートと組み合わされるインターロイキンは、例えば、ＩＬ－１８を含む。
　また、実施形態に係る幹細胞の製造方法は、血液細胞又は免疫細胞に、ビスホスホネート又は（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）を適用することと、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、を含み、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－２を適用しない。好ましくは、血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－２を含むあらゆるインターロイキンを適用しない。
　ビスホスホネートの例としては、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、ミノドロン酸、ＰＴＡ、それらの塩及びそれらの水和物が挙げられる。
　幹細胞は、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。
　血液細胞又は免疫細胞はヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ）液等の抗凝固剤を用いてもよい。免疫細胞は、血液、骨髄、胸腺、リンパ液、腔水、及び組織から分離される。腔水の例としては、腹水、胸水、及び心嚢水が挙げられる。組織の例としては、腫瘍組織が挙げられる。
　血液細胞は、例えば、単核球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞であってもよいし、γδＴ細胞であってもよい。血液細胞は、γδＴ細胞でなくてもよい。免疫細胞の例としては、リンパ球が挙げられる。リンパ球の例としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＢ細胞が挙げられる。
　血液細胞又は免疫細胞にＰＴＡ又はビスホスホネートを適用する際には、血液細胞又は免疫細胞を培養する培地にＰＴＡ又はビスホスホネートを添加してもよい。培地中におけるＰＴＡ又はビスホスホネートの濃度は、例えば、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５０μｍｏｌ／Ｌ以下、１μｍｏｌ／Ｌ以上５０μｍｏｌ／Ｌ以下、３μｍｏｌ／Ｌ以上２０μｍｏｌ／Ｌ以下、あるいは５μｍｏｌ／Ｌ以上１２μｍｏｌ／Ｌ以下である。ＰＴＡ又はビスホスホネートを添加した培地で血液細胞又は免疫細胞を１日以上、２日以上、あるいは３日以上培養してもよい。ＰＴＡ又はビスホスホネートを添加した培地で血液細胞又は免疫細胞を１４日以下、１０日以下、あるいは７日以下培養してもよい。
　血液細胞又は免疫細胞にインターロイキンを適用する際には、血液細胞又は免疫細胞を培養する培地にインターロイキンを添加してもよい。培地中におけるインターロイキンの濃度は、例えば、５ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以上９０ｎｇ／ｍＬ以下、あるいは１５ｎｇ／ｍＬ以上８０ｎｇ／ｍＬ以下である。インターロイキンを添加した培地で血液細胞又は免疫細胞を１日以上、２日以上、あるいは３日以上培養してもよい。インターロイキンを添加した培地で血液細胞又は免疫細胞を１４日以下、１０日以下、あるいは７日以下培養してもよい。インターロイキンは培地に毎日添加してもよいし、２日に１回添加してもよいし、３日に１回添加してもよい。
　血液細胞又は免疫細胞にＰＴＡ又はビスホスホネートを適用した後に血液細胞又は免疫細胞にインターロイキンを適用してもよい。血液細胞又は免疫細胞にＰＴＡ又はビスホスホネートとインターロイキンを同時に適用してもよい。血液細胞又は免疫細胞にインターロイキンを適用した後に血液細胞又は免疫細胞にＰＴＡ又はビスホスホネートを適用してもよい。
　血液細胞又は免疫細胞を培養する培地の例としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、最小必須培地（α－ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及びＦ１２培地が挙げられるが、これらに限定されない。血液細胞又は免疫細胞に誘導因子を導入する前に、１日間、２日間、又は３日間、血液細胞又は免疫細胞を増殖してもよい。
　次に、少なくともＰＴＡ又はビスホスホネートを適用された血液細胞又は免疫細胞に誘導因子を導入して、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導する。幹細胞を誘導することにおいて、誘導とは、リプログラミング、初期化、形質転換、及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)等を指す。
　血液細胞又は免疫細胞に導入される誘導因子は、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、ｍＲＮＡであってもよい。誘導因子は、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ－ＭＹＣを含む。誘導因子として、ＯＣＴ３／４を改良したＭ３Ｏを使用してもよい。また、誘導因子は、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。これらの誘導因子のＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
　血液細胞又は免疫細胞に誘導因子を導入する方法は任意である。例えば、ベクターを用いて誘導因子を血液細胞又は免疫細胞に導入してもよい。リポフェクションにより誘導因子を血液細胞又は免疫細胞に導入してもよい。
　ベクターとして、ＲＮＡウイルスを用いることができる。ＲＮＡウイルスが、一本鎖ＲＮＡウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスが、一本鎖プラスＲＮＡウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスが、一本鎖マイナスＲＮＡウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスが、染色体非組み込み型ＲＮＡウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスが、モノネガウイルス目ウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルス科ウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスが、レスピロウイルス属ウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスが、センダイウイル（Ｓｅｖ）であってもよい。センダイウイルスは、モノネガウイルス目パラミクソウイルス科に属する、ＲＮＡをゲノムとするウイルスである。センダイウイルスは、ＲＮＡのゲノムと、ＲＮＡを内包する脂質二重膜からなるエンベロープと、を備える。
　誘導因子のＲＮＡを搭載したセンダイウイルスとしては、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用可能である。センダイウイルスベクターは、感染持続性を改善したセンダイウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターとして、ステルス型ＲＮＡベクターを用いてもよい。ステルス型ＲＮＡベクターとしては、ＳＲＶ　ｉＰＳＣ－１　Ｖｅｃｔｏｒ、ＳＲＶ　ｉＰＳＣ－２　Ｖｅｃｔｏｒ、ＳＲＶ　ｉＰＳＣ－３　Ｖｅｃｔｏｒ、ＳＲＶ　ｉＰＳＣ－４　Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標、ときわバイオ株式会社）が使用可能である。ステルス型ＲＮＡベクターの詳細は、特許第４４７８７８８号公報、特許第４９３６４８２号公報、特許第５６３３０７５号公報、及び特許第５９６３３０９号公報に記載されている。
　センダイウイルスの力価（タイター）の指標としては、感染多重度（ＭＯＩ）が挙げられる。センダイウイルスのＭＯＩは、例えば、０．１から１００．０、あるいは１．０から５０．０である
　誘導因子は、誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用いて血液細胞又は免疫細胞に導入されてもよい。
　キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、パラミクソウイルス由来であってもよい。キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、ステルス型ＲＮＡベクターであってもよい。
　キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子、リン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子／Ｃタンパク質（Ｃ）遺伝子、マトリクスタンパク質（Ｍ）遺伝子、膜融合タンパク質（Ｆ）遺伝子、赤血球凝集素－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子、及び巨大タンパク質（Ｌ）遺伝子を含むウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能を全て欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するウイルス遺伝子と、誘導因子ＲＮＡと、を有していてもよい。
　ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子／Ｃ遺伝子、及びＬ遺伝子は、ウイルスベクターの転写、複製に関与する。Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮＨ遺伝子は、ウイルスの粒子形成に関与する。そのため、Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮＨ遺伝子の機能を全て欠損させたウイルスベクターは、細胞に感染した後に、新規のウイルス粒子を形成できない。Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮＨ遺伝子の機能を全て欠損させるために、ゲノムＲＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮＨ遺伝子が欠失していてもよい。
　持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するＬ遺伝子は、アミノ酸配列の１６１８番目がバリンである巨大タンパク質をコードする。当該変異Ｌ遺伝子を有するウイルスベクターは、インターフェロン誘導能が低下するため、細胞傷害性がなく、持続感染能を有する。そのため、細胞内において、搭載された誘導因子ＲＮＡの発現が持続される。
　血液細胞又は免疫細胞から幹細胞が誘導された後、細胞からウイルスベクターを除去するために、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子の少なくともいずれかを標的とするｓｉＲＮＡを細胞に導入してもよい。例えば、変異Ｌ遺伝子の５２７番目又は１９１３番目のヌクレオチドを含む領域を標的とするｓｉＲＮＡを細胞に導入してもよい。
　あるいは、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子の少なくともいずれかの非コード領域に、未分化細胞特異的マイクロＲＮＡの標的配列を付加してもよい。未分化細胞特異的マイクロＲＮＡの例としては、ｍｉＲ－３０２ａが挙げられる。幹細胞が血液細胞又は免疫細胞から誘導されると、細胞において、ｍｉＲ－３０２ａ等の未分化細胞特異的ｍｉＲＮＡの発現が誘導される。未分化細胞特異的ｍｉＲＮＡが標的配列に結合すると、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子の少なくともいずれかの発現が抑制され、細胞からウイルスベクターが除去される。例えば、変異Ｌ遺伝子に、ｍｉＲ－３０２ａの標的配列が付加される。
　キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、３’末端側から、ウイルスのＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｃ遺伝子、及び持続的遺伝子発現を可能とする変異Ｌ遺伝子を有していてもよい。ゲノムＲＮＡは、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、誘導因子ＲＮＡを有していてもよい。ゲノムＲＮＡは、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、蛍光タンパク質のＲＮＡを有していてもよい。蛍光タンパク質の例としては、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）が挙げられる。ゲノムは、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、薬剤耐性遺伝子のＲＮＡを有していてもよい。
　キメラウイルスのエンベロープは、例えば、麻しんウイルス由来である。
　３’末端側から、ウイルスのＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｃ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子を有し、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、ＥＧＦＰのＲＮＡと誘導因子ＲＮＡを有するゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆う麻しんウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスは、ＭＳＲＶ－１として、ときわバイオに作製を依頼した。ＭＳＲＶ－１の変異Ｌ遺伝子にｍｉＲ－３０２ａの標的配列を付加したキメラウイルスは、ＭＳＲＶ－２として、ときわバイオに作製を依頼した。
　キメラウイルスの力価（タイター）の指標としては、感染多重度（ＭＯＩ）が挙げられる。キメラウイルスのＭＯＩは、例えば、０．１から１００．０、あるいは１．０から５０．０である
　接着培養されている血液細胞又は免疫細胞に、誘導因子を導入してもよいし、ゲル培地で浮遊培養されている血液細胞又は免疫細胞に、誘導因子を導入してもよい。
　誘導因子を導入される血液細胞又は免疫細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養してもよい。
　誘導因子を導入される血液細胞又は免疫細胞が培養される培地としては、例えば、Ｓｔｅｍｆｉｔ　（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
　ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、ｍＴｅＳＲ１、及びＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等に入れられる。
　ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
　ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
　血液細胞又は免疫細胞へ誘導因子の導入を行った後、ゲル培地ではない液体培地中で細胞を初期化させてもよいし、ゲル培地中で細胞を初期化させてもよい。
　血液細胞又は免疫細胞に誘導因子を導入し、細胞を培養した後、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種する継代を少なくとも１回実行してもよい。継代することにおいて、誘導因子を導入された細胞のクローンどうしを混合してもよい。継代することにおいて、誘導因子を導入された細胞の異なるクローンどうしを混合してもよい。その後、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することを、複数回実施してもよい。幹細胞が樹立するまで、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収した混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。なお、回収した混じり合った細胞の全てを培地に播種してもよい。
　ここで、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、誘導因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、誘導因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、誘導因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、誘導因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。
　あるいは、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、誘導因子を導入された細胞を、形態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、誘導因子を導入された細胞を、形態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、誘導因子を導入された細胞を、大きさ区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、誘導因子を導入された細胞を、大きさ区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。
　またあるいは、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、誘導因子を導入された細胞をクローニングすることなく継代することをいう。例えば、クローニングすることなく継代する場合、誘導因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップしなくともよい。例えば、クローニングすることなく継代する場合、誘導因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離しなくともよい。例えば、継代時に、複数の異なるコロニーを形成した細胞同士を混合して、同じ培養器に播種してもよい。また、例えば、クローニングすることなく継代する場合、誘導因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングしなくともよい。例えば、継代時に、コロニーどうしを混合して、同じ培養器に播種してもよい。
　例えば、誘導因子を導入された細胞が接着培養されている場合、接着培養されている細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。例えば、継代時に、培養器から細胞を剥離し、剥離して混じり合った細胞の少なくとも一部を同じ培養器に播種してもよい。例えば、剥離液で培養器から細胞を剥がし、剥がして混じり合った細胞全体を継代してもよい。例えば、コロニーを形成していない細胞を継代してもよい。誘導因子を導入された細胞が浮遊培養されている場合、浮遊培養されている細胞全体を継代してもよい。
　誘導因子を導入された細胞は、閉鎖された培養器内で培養され、継代されてもよい。閉鎖された培養器は、例えば、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしない。また、誘導因子を導入された細胞を二次元培養で拡大培養してもよいし、三次元培養で拡大培養してもよい。
　誘導因子を導入された細胞が幹細胞に誘導され、幹細胞が樹立された後、接着培養されている細胞全体を、幹細胞として凍結保存してもよい。例えば、剥離液で培養器から剥がれた細胞全体を幹細胞として凍結保存してもよい。また、誘導因子を導入された細胞が幹細胞に誘導された後、浮遊培養されている細胞全体を、幹細胞として凍結保存してもよい。
　誘導された幹細胞は、未分化細胞マー力一であるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２等を発現し得る。誘導された幹細胞は、ＴＥＲＴを発現し得る。誘導された幹細胞は、テ口メラーゼ活性を示し得る。
　また、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞が誘導されたか否かは、例えば、細胞の形態から確認することができる。例えば、誘導された幹細胞は、ＥＳ細胞に類似する肩平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現し得る。あるいは、血液細胞又は免疫細胞から幹細胞が誘導されたか否かは、フローサイトメーターで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行ってもよい。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原であり、体細胞では検出されない。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞と考えられる。
　誘導された幹細胞は、例えば、再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備えている。再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子とは、ＴＣＲγ領域及びＴＣＲδ領域の再構成が生じた、ＴＣＲをコードする遺伝子である。ＴＣＲγ領域はＶγ－Ｊγを含む。ＴＣＲδ領域は、Ｖδ―Ｄδ―Ｊδを含む。誘導された幹細胞は、例えば、Ｊ１／Ｊ２遺伝子を有する再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備えている。
　実施形態に係る血液細胞又は免疫細胞の製造方法は、上記の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、を含む。
　幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導する方法は、特に限定されない、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１等のグリコーゲン合成酵素キナーゼ－３（ＧＳＫ３）阻害剤、骨形成タンパク質―４（ＢＭＰ－４）等の骨形成タンパク質、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の成長因子を含む培地で、用意した細胞を４日間培養する。さらに、ＳＢ４３１５４２等のＡＬＫ５阻害剤、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の成長因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む培地で、細胞を２日間培養する。さらに、ＶＥＧＦ等の成長因子、ＳＣＦ、ＩＬ－３及びＩＬ－６等のインターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ等のサイトカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む培地で細胞を２日間培養する。さらに、ＳＣＦ、ＩＬ－６等のインターロイキン、ＥＰＯを含む培地で細胞を培養する。これにより、血液細胞又は免疫細胞が誘導される。
　あるいは、間質細胞（ストロマ細胞）上に幹細胞を播種して、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導してもよい。間質細胞が骨髄由来であってもよい。間質細胞がＯＰ９細胞であってもよい。ＯＰ９細胞は、マクロファージ刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を産生せず、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞への分化を支持する機能を有する。例えば、幹細胞のコロニーを複数の細胞塊に分割し、幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞としてのＯＰ９細胞上に播種する。これにより、幹細胞から血液細胞又は免疫細胞が誘導される。誘導される血液細胞又は免疫細胞は、例えば、ＣＤ３４とＣＤ４３が陽性である。
　誘導される血液細胞又は免疫細胞は、γδ型Ｔ細胞であってもよい。
　また、実施形態に係るγδＴ細胞の製造方法は、Ｔ細胞から誘導された多能性幹細胞からγδＴ細胞を分化誘導することを含む。多能性幹細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞である。多能性幹細胞は、例えば、γδＴ細胞から誘導された多能性幹細胞である。多能性幹細胞は、例えば、γδＴ細胞受容体を発現しているγδＴ細胞から誘導された多能性幹細胞である。
　Ｔ細胞から多能性幹細胞を誘導する方法は、特に限定されない。例えば、上述した幹細胞の製造方法と同様の方法により、Ｔ細胞から多能性幹細胞を誘導してもよい。あるいは、ＩＬ－２及びゾレドロン酸で刺激されたＴ細胞から、多能性幹細胞を誘導してもよい。誘導された多能性幹細胞は、γδＴ細胞受容体の再構成遺伝子を有していてもよい。
　多能性幹細胞からγδＴ細胞を分化誘導することは、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導することと、造血幹前駆細胞からγδＴ細胞を誘導することと、を含んでいてもよい。多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導する間、フィーダーフリーで細胞を培養してもよい。多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導する間、細胞を浮遊培養してもよい。
　骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦの少なくともいずれかを含む培地で、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導してもよい。ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦを含む培地で、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導してもよい。
　アクチビン受容体様キナーゼ阻害剤を含む培地で、多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導してもよい。ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦを含む培地に、アクチビン受容体様キナーゼ阻害剤を添加してもよい。
　多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導する間、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦの少なくともいずれかを含む培地で細胞を培養し、次いで、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌの少なくともいずれかを含む培地で細胞を培養してもよい。
　多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導する間、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦを含む培地で細胞を培養し、次いで、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＳＣＦを含む培地で細胞を培養してもよい。
　多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導する間、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦを含む培地で細胞を培養し、次いで、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＳＣＦを含む培地で細胞を培養し、次いで、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＦＬＴ３Ｌを含む培地で細胞を培養してもよい。
　造血幹前駆細胞をフィーダー細胞上で培養してもよい。フィーダー細胞が、ＯＰ９細胞であってもよい。
　多能性幹細胞から分化誘導されたγδＴ細胞は、γδＴ細胞受容体を発現していてもよい。γδＴ細胞は、がん治療のための医薬品組成物として使用可能である。
　（実施例１）
　１μｍｏｌ／Ｌからμｍｏｌ／Ｌのテトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート（ＰＴＡ、テクノ鈴田）、１０％のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．０×１０－５ｍｏｌ／Ｌの２－メルカプトエタノール（ナカライテスク）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を実施例１に係るＰＴＡ含有培地として用意した。
　実施例１に係るＰＴＡ含有培地にヒト末梢血単核球を入れ、約１×１０6個の単核球を含む培地を２４ウェルプレートに入れた（１日目）。培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－２を１μＬ添加した。３日目に細胞を含む培地をプレートから回収し、培地を遠心分離し、上清を除いた。その後、細胞に新しい実施例１に係るＰＴＡ含有培地を２ｍＬ添加し、２４ウェルプレートの２ウェルに１ｍＬずつ入れた。
　６日目に細胞を含む培地をプレートから回収し、培地を遠心分離し、上清を除いた。その後、細胞に実施例１に係るＰＴＡ含有培地を添加し、２×１０４個の単核球を含む培地を９６ウェルプレートに入れた。ＭＳＲＶ（ときわバイオ）を用いて、細胞にＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを導入した。感染多重度（ＭＯＩ）は、５になるよう調整した。
　７日目に９６ウェルプレートから回収した細胞を含む培地に、新鮮な実施例１に係るＰＴＡ含有培地を加え、ラミニン（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ニッピ）でコーティングされた６ウェルプレートに入れた。８日目、１０日目、１２日目に、幹細胞培地（Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ、味の素）を添加し、その後は、幹細胞培地を用いて培地交換を行った。
　１４日目、ｉＰＳ細胞の複数のコロニーが形成されたことを確認した。樹立したｉＰＳ細胞の写真を図２に示す。また、ｉＰＳ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、再構成されたＶγ９遺伝子を有するかを、ＰＣＲと電気泳動により解析した。陽性コントロールとして単核球（ＰＢＭＣ）のゲノムＤＮＡ、陰性コントロールとして再構成されたＶγ９遺伝子を有しないｉＰＳ細胞のゲノムを同様に解析した。その結果、図３に示すように、実施例１で樹立されたｉＰＳ細胞は、ＪＰ遺伝子を有する再構成されたＶγ９遺伝子と、Ｊδ１遺伝子を有する再構成されたＶδ２遺伝子をと、有することが確認された。
　（実施例２）
　５μｍｏｌ／Ｌのゾレドロン酸（Ｚｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．０×１０－５ｍｏｌ／Ｌの２－メルカプトエタノール（ナカライテスク）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む）１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を実施例２に係るゾレドロン酸含有培地として用意した。
　実施例２に係るゾレドロン酸含有培地にヒト末梢血単核球を入れ、約１×１０６個の単核球を含む培地を２４ウェルプレートに入れた（１日目）。第１の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－２を１μＬ添加した。第２の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－９を１μＬ添加した。第３の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－３３を１μＬ添加した。第４の単核球群の培地には、毎日５０μｇ／ｍＬのＩＬ－１８と５００μｇ／ｍＬのＩＬ－３３をそれぞれ１μＬ添加した。第５の単核球群の培地には、毎日５μｇ／ｍＬのＩＬ－４、５０μｇ／ｍＬのＩＬ－１８、及び５００μｇ／ｍＬのＩＬ－３３をそれぞれ１μＬ添加した。第６の単核球群の培地には、毎日５μｇ／ｍＬのＩＬ－４、２μｇ／ｍＬのＩＬ－９、５０μｇ／ｍＬのＩＬ－１８、及び５００μｇ／ｍＬのＩＬ－３３をそれぞれ１μＬ添加した。
　３日目に細胞を含む培地をプレートから回収し、培地を遠心分離し、上清を除いた。その後、細胞に新しい実施例２に係るゾレドロン酸含有培地を２ｍＬ添加し、２４ウェルプレートの２ウェルに１ｍＬずつ入れた。
　６日目に抗γ９抗体及び抗δ２抗体を用いてフローサイトメーターで調べたγδＴ細胞の割合を図４に示す。２×１０４個の単核球から誘導されたγδＴ細胞の数を図５に示す。
　６日目に細胞を含む培地をプレートから回収し、培地を遠心分離し、上清を除いた。その後、細胞に実施例２に係るゾレドロン酸含有培地を添加し、２×１０４個の単核球を含む培地を９６ウェルプレートに入れた。ＭＳＲＶ（ときわバイオ）を用いて、細胞にＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを導入した。感染多重度（ＭＯＩ）は、５になるよう調整した。
　７日目に９６ウェルプレートから回収した細胞を含む培地に、新鮮な実施例２に係るゾレドロン酸含有培地を加え、６ウェルプレートに入れた。８日目、１０日目、１２日目に、幹細胞培地（Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ、味の素）を添加し、その後は、幹細胞培地を用いて培地交換を行った。
　１４日目、ｉＰＳ細胞の複数のコロニーが形成されたことを確認した。樹立したｉＰＳ細胞の写真を図６及び図７に示す。
　（実施例３）
　実施例２に係るゾレドロン酸含有培地のゾレドロン酸をＨＭＢＰＰに変えた以外は、実施例２と同様に、単核球からｉＰＳ細胞を誘導した。なお、インターロイキンはＩＬ－２のみを用いた。
　（実施例４）
　実施例２に係るゾレドロン酸含有培地にヒト末梢血単核球を入れ、約１×１０６個の単核球を含む培地を２４ウェルプレートに入れた（１日目）。第１の単核球群の培地には、インターロイキンを添加しなかった。第２の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－２を１μＬ添加した。第３の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－９を１μＬ添加した。第４の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－１８を１μＬ添加した。第５の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－４を１μＬ添加した。第６の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－９と２０μｇ／ｍＬのＩＬ－１８をそれぞれ１μＬ添加した。第７の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－４と２０μｇ／ｍＬのＩＬ－１８をそれぞれ１μＬ添加した。第８の単核球群の培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－４と、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－９と、２０μｇ／ｍＬのＩＬ－１８をそれぞれ１μＬ添加した。また、実施例２に係るゾレドロン酸含有培地とはゾレドロン酸を含有しない以外は同じゾレドロン酸非含有培地を用意し、第９の単核球群のゾレドロン酸非含有培地には、毎日２０μｇ／ｍＬのＩＬ－２を１μＬ添加した。
　３日目に細胞を含む培地をプレートから回収し、培地を遠心分離し、上清を除いた。その後、第１から第８の細胞群に新しい実施例２に係るゾレドロン酸含有培地を２ｍＬ添加し、２４ウェルプレートの２ウェルに１ｍＬずつ入れた。また、第９の細胞群に新しいゾレドロン酸非含有培地を２ｍＬ添加し、２４ウェルプレートの２ウェルに１ｍＬずつ入れた。
　６日目に細胞を含む培地をプレートから回収し、培地を遠心分離し、上清を除いた。その後、第１から第８の細胞群に実施例２に係るゾレドロン酸含有培地を添加し、第９の細胞群にゾレドロン酸非含有培地を添加し、２×１０４個の単核球を含む培地を９６ウェルプレートに入れた。ＭＳＲＶ（ときわバイオ）を用いて、細胞にＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを導入した。感染多重度（ＭＯＩ）は、５になるよう調整した。
　７日目に９６ウェルプレートから回収した第１から第８の細胞群を含む培地に、新鮮な実施例２に係るゾレドロン酸含有培地を加え、第９の細胞群を含む培地に、新鮮なゾレドロン酸非含有培地を加え、６ウェルプレートに入れた。８日目、１０日目、１２日目に、幹細胞培地（Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ、味の素）を添加し、その後は、幹細胞培地を用いて培地交換を行った。
　１４日目、ｉＰＳ細胞の複数のコロニーが形成されたことを確認した。形成されたコロニーの数を図８に示す。
　（実施例５）
　終濃度が２０％のＦＢＳ、及び終濃度が１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加されたαＭＥＭ培地をＯＰ９細胞用培地として用意した。
　終濃度が１００ｍｍｏｌ／ＬのビタミンＣ、終濃度が１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－７（ＩＬ－７）、終濃度が１０μｇ／ｍＬのＦＬＴ３リガンド、終濃度が１０μｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）を添加されたＯＰ９細胞用培地を分化誘導用培地として用意した。
　実施例２及び実施例３でインターロイキンとしてはＩＬ－２のみを用いて誘導されたｉＰＳ細胞のそれぞれのコロニーをセルスクレイパーによりディッシュから剥離し、ピペッティングにより複数の細胞塊に分割した。フィーダー細胞としてＯＰ９細胞が培養されているディッシュを用意した。ＯＰ９細胞は、ＯＰ９細胞用培地で培養されていた。フィーダー細胞上に、ｉＰＳ細胞からなる複数の細胞塊を播種し、終濃度が１０μｍоｌ／ＬのＹ２７６３２を添加した幹細胞用培地を用いて２日間培養した。２日目には、培地をビタミンＣを添加したＯＰ９細胞用培地に交換し、さらに１２日間培養した。培養５、９、１３日目にはディッシュから半量の培地を除き、新しくビタミンＣを添加したＯＰ９用培地と交換した。
　１４日間の培養により、ｉＰＳ細胞が血液前駆細胞に分化していく経過が観察された。また、１４日目の細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を図９に示す。細胞は、血液細胞のマーカーであるＣＤ３４とＣＤ４３が陽性であることが確認された。１４日目に得られた血液前駆細胞をＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種し、さらに２５日間培養した。その間、４あるいは５日ごとに分化細胞を新しいＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に載せ替えた。
　ＯＰ９／ＤＬＬ１上で２８日間培養した細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を図１０に示す。図１０の右側グラフに示すように、細胞は、リンパ球系前駆細胞マーカーであるＣＤ５－ＰＥとＣＤ７－ＦＩＴＣの両方に対して陽性であった。また、図１０の左側グラフに示すように、γδＴ細胞マーカーであるγδＴＣＲ－ＡＰＣ陽性である細胞集団が、Ｐａｎ－Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３－ＰＥ陽性集団の中に確認された。また、同時に、ＣＤ３－ＰＥ単陽性のαβＴ細胞集団も確認された。
　Ｔ前駆細胞へと誘導された細胞をγδＴ細胞へと誘導するため、γδＴ細胞受容（ＴＣＲ）を介して強い刺激を細胞へ加えた。刺激物質としてＨＭＢＰＰ（０．０１μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬ）又はゾレドロン酸（５μｍｏｌ／Ｌ）を培地中に添加し、３５日目まで細胞を培養した。また、一部の培養サンプルにおいて、フィーダー細胞をＮｏｔｃｈリガンドを発現するＯＰ９／ＤＬＬ１細胞からＮｏｔｃｈリガンドを発現しないＯＰ９細胞に変え、αβＴ細胞への誘導を阻害した。
　３５日目の細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を図１１に示す。ＣＤ３及びγδＴＣＲ（Ｖγ９）が細胞表面に発現していることを確認した。フィーダー細胞がＯＰ９－ＤＬＬ１細胞であるほうが、フィーダー細胞がＯＰ９細胞であるより、マーカーの発現は多かった。刺激物質を添加しなかったネガティブコントロールでは、マーカーの発現はなかった。
　（実施例６）
　実施例２で樹立したｉＰＳ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、再構成されたＶγ９遺伝子を有するかを、ＰＣＲと電気泳動により解析した。陽性コントロールとして単核球（ＰＢＭＣ）のゲノムＤＮＡ、陰性コントロールとして再構成されたＶγ９遺伝子を有しないｉＰＳ細胞のゲノムを同様に解析した。その結果、図１２に示すように、実施例１で樹立されたｉＰＳ細胞は、ＪＰ遺伝子を有する再構成されたＶγ９遺伝子と、Ｊδ１遺伝子を有する再構成されたＶδ２遺伝子をと、有することが確認された。
　（実施例７）
　実施例４と同様の方法により、ゾレドロン酸含有培地にＩＬ－２のみを添加してｉＰＳ細胞を樹立した。また、実施例４と同様の方法により、ゾレドロン酸含有培地にＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を添加してｉＰＳ細胞を樹立した。図１３に示すように、培地にＩＬ－２のみを添加した場合と比較して、培地にＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を添加したほうが、樹立されたｉＰＳ細胞のコロニー数は多かった。
　培地にＩＬ－２のみを添加して樹立したｉＰＳ細胞株においては、図１４に示すように、２７のｉＰＳ細胞株中、７のｉＰＳ細胞株が、ＪＰ遺伝子を有する再構成されたＶγ９遺伝子を有していた。したがって、培地にＩＬ－２のみを添加して樹立したｉＰＳ細胞株において、ＪＰ遺伝子を有する再構成されたＶγ９遺伝子を有しているｉＰＳ細胞株の割合は、２８％であった。
　培地にＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を添加して樹立したｉＰＳ細胞株においては、図１５に示すように、１３のｉＰＳ細胞株中、１２のｉＰＳ細胞株が、ＪＰ遺伝子を有する再構成されたＶγ９遺伝子を有していた。したがって、培地にＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を添加して樹立したｉＰＳ細胞株において、ＪＰ遺伝子を有する再構成されたＶγ９遺伝子を有しているｉＰＳ細胞株の割合は、９２％であった。
　（実施例８）
　ＩＬ－２及びゾレドロン酸を添加した培地中でγδＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞（γδＴ－ｉＰＳ細胞）を用意し、ｉＰＳ細胞を接着培養した。ＴｒｙｐＬｅ　Ｓｅｌｅｃｔを用いてｉＰＳ細胞を回収し、ｉＰＳ細胞をｉＰＳ細胞用培地（Ｐｕｅｌ、Ｉ　Ｐｅａｃｅ，Ｉｎｃ．）に懸濁した。ｉＰＳ細胞を低接着ウェルプレートに入れ、培地に１０μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤と１０μｍｏｌ／ＬのＧＳＫ－３阻害剤を添加し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で細胞を培養した。その後、細胞浮遊液を回収し、細胞浮遊液を遠心して上清を除いた。
　Ｌ－グルタミンの代替品（Ｇｉｂｃｏ　ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント）、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸２－リン酸塩、４０ｍｍｏｌ／Ｌのモノチオグリセロール（ＭＴＧ）、インスリン－トランスフェリン－セレニウム溶液（ＩＴＳ）、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加した無血清培地（Ｇｉｂｃｏ　ＳｔｅｍＰｒｏ－３４　ＳＦＭ）を、分化用培地として用意した。
　分化用培地に５０ｎｇ／ｍＬの骨形成タンパク質４（ＢＭＰ－４）、５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、及び５０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加し、分化用培地に上記の細胞浮遊液から回収した細胞を懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で細胞を培養した。２４時間後、６μｍｏｌ／Ｌのアクチビン受容体様キナーゼ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）を培地に添加した。
　分化用培地で細胞を培養して４日目、細胞浮遊液を回収し、細胞浮遊液を遠心し上清を除いた。５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを添加した分化用培地に細胞を懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で細胞を培養した。
　分化用培地で細胞を培養して７日目、細胞浮遊液を回収し、細胞浮遊液を遠心し上清を除いた。５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、及び１０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３Ｌを添加した分化用培地に細胞を懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で細胞を培養した。以後、２、３日ごとに細胞を回収し、同じ添加物を添加した分化用培地で培養することを、１４日目まで続け、胚葉体を形成させた。
　分化用培地で細胞を培養して１４日目、細胞浮遊液を回収し、ピペッティングにより胚葉体を崩した。さらに、胚葉体を崩して得られた細胞を４０μｍのフィルターに通して、造血幹前駆細胞のみを回収した。
　フィーダー細胞としてＯＰ９／ＤＬＬ１細胞を用意した。また、ＦＢＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したα－ＭＥＭをＯＰ９培地として用意した。ＯＰ９／ＤＬＬ１細胞を６ｃｍディッシュに播種し、ＯＰ９培地中で一晩培養した。
　造血幹前駆細胞を、ＳＣＦ、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、及びアスコルビン酸２－リン酸塩を添加したＯＰ９培地に懸濁し、ＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。以後、２、３日ごとに培地を新鮮なＯＰ９培地に交換し、１週間ごとに新しいＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に細胞を継代して、３週間細胞を培養した。
　３週間培養された細胞をフローサイトメーターで分析したところ、図１６に示すように、ＣＤ４５陽性、ＣＤ３陽性、及びＴＣＲγ９陽性の組みあわせ、ＣＤ４５陽性及びＴＣＲγ９陽性の組み合わせ、ＴＣＲγ９陽性及びＴＣＲδ２陽性の組み合わせが検出され、γδＴ細胞が誘導されたことが示された。また、ＣＤ４５陽性及びＴＣＲγ９陰性の組み合わせ、ＣＤ３陽性及びＣＤ８陰性の組み合わせ、ＣＤ３陽性及びＣＤ８陽性の組み合わせ、ＣＤ７陽性及びＣＤ５陰性の組み合わせ、ＣＤ７陽性及びＣＤ５陽性の組み合わせ、ＣＤ４５陽性、ＴＣＲγ９陽性、及びＴＣＲδ２陰性の組み合わせも検出された。幹細胞は、γδＴ細胞に誘導される過程において、血液細胞のマーカーであるＣＤ４５が陽性になり、その後、さらにＴ細胞のマーカーであるＣＤ３が陽性になり、γδＴ細胞のマーカーであるＴＣＲγ９とＴＣＲδ２が陽性になると考えられている。そのため、ＣＤ３陽性及びＣＤ８陽性の組み合わせ、ＣＤ７陽性及びＣＤ５陰性の組み合わせ、ＣＤ７陽性及びＣＤ５陽性の組み合わせ、ＣＤ４５陽性、ＴＣＲγ９陽性、及びＴＣＲδ２陰性の組み合わせを示す細胞は、γδＴ細胞に誘導される途中の細胞であり得る。
　（比較例１）
　ＩＬ－２と、表面に抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を結合したビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、登録商標、Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加した無血清リンパ球培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１０、登録商標、Ｌｏｎｚａ）中で、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを用いてαβＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞（αβＴ－ｉＰＳ細胞）を用意し、実施例８と同じ方法で、αβＴ－ｉＰＳ細胞から造血幹前駆細胞を誘導した。さらに、実施例８と同じ方法で、造血幹前駆細胞を３週間培養した。３週間培養された細胞をフローサイトメーターで分析したところ、ＣＤ４５陽性であったものの、図１７に示すように、ＴＣＲγ９及びＴＣＲδ２が陰性であり、γδＴ細胞が誘導されなかった。
　（比較例２）
　ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３リガンド、及びＩＬ－３を添加した血球培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを用いて、再構成されたＴＣＲ遺伝子を有しないｎｏｎＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞（ｎｏｎＴ－ｉＰＳ細胞）を用意し、実施例８と同じ方法で、αβＴ－ｉＰＳ細胞から造血幹前駆細胞を誘導した。さらに、実施例８と同じ方法で、造血幹前駆細胞を３週間培養した。３週間培養された細胞をフローサイトメーターで分析したところ、ＣＤ４５陽性であったものの、図１７に示すように、ＴＣＲγ９及びＴＣＲδ２が陰性であり、γδＴ細胞が誘導されなかった。
　（実施例９）
　実施例８で作製したγδＴ細胞を回収し、遠心して上清を除去した。次に、分化用培地にＩＬ－７、ＩＬ－２、デキサメタゾン、及び抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体を添加し、分化用培地に細胞を懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で細胞を培養した。３日後、細胞を回収してＰＢＳで洗浄し、細胞を遠心して、上清を除去した。次に、分化用培地にＩＬ－７、ＩＬ－２、及びデキサメタゾンを添加し、分化用培地に細胞を懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で細胞を培養した。４日後、成熟したγδＴ細胞が得られた。成熟したγδＴ細胞フローサイトメーターで分析したところ、図１８に示すように、９８％以上の細胞において、ＣＤ３及びＣＤ４５の組み合わせ、Ｖγ９及びＣＤ３の組み合わせが陽性であった。
　成熟したγδＴ細胞を回収し、遠心して上清を除去した。次に、分化用培地にＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を添加し、分化用培地に細胞を懸濁し、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体及びレトロネクチンをコートしたウェルに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で細胞を培養した。３日後、細胞を回収してＰＢＳで洗浄し、細胞を遠心して、上清を除去した。次に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８を添加した分化用培地に細胞を懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で細胞を培養した。その後、培地の色が変わったときに培地を交換し、ウェルの底面を細胞が埋め尽くしたときに、より広いウェルへ細胞を継代することを繰り返し、成熟したγδＴ細胞を増幅した。図１９に示すように、増殖しているγδＴ細胞が、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９、及びＩＬ－１８と抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体により活性化されていることが細胞の形態から確認された。
 

Claims (28)

  1. 　血液細胞又は免疫細胞にテトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートを適用することと、
    　前記血液細胞又は前記免疫細胞から幹細胞を誘導することと、
    　を含む、幹細胞の製造方法。
  2. 　前記血液細胞又は前記免疫細胞にインターロイキンを適用することをさらに含む、請求項１に記載の幹細胞の製造方法。
  3. 　前記インターロイキンが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項２に記載の幹細胞の製造方法。
  4. 　前記幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の幹細胞の製造方法。
  5. 　請求項１に記載の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、
    　前記幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、
    　を含む、血液細胞又は免疫細胞の製造方法。
  6. 　血液細胞又は免疫細胞に、ビスホスホネート又は（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸と、インターロイキンと、を適用することと、
    　前記血液細胞又は前記免疫細胞から幹細胞を誘導することと、
    　を含み、
    　前記インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３からなる群から選択される少なくとも一つである、
    　幹細胞の製造方法。
  7. 　前記幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項６に記載の幹細胞の製造方法。
  8. 　請求項６に記載の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、
    　前記幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、
    　を含む、血液細胞又は免疫細胞の製造方法。
  9. 　血液細胞又は免疫細胞に、ビスホスホネート又は（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸を適用することと、
    　前記血液細胞又は免疫細胞から幹細胞を誘導することと、
    　を含み、
    　前記血液細胞又は免疫細胞にＩＬ－２を適用しない、
    　幹細胞の製造方法。
  10. 　前記血液細胞又は前記免疫細胞にあらゆるインターロイキンを適用しない、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
  11. 　前記幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
  12. 　前記幹細胞が、再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備える、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
  13. 　請求項９に記載の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、
    　前記幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、
    　を含む、血液細胞又は免疫細胞の製造方法。
  14. 　血液細胞又は免疫細胞にテトラキス－ピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートを適用することと、
    　前記血液細胞又は前記免疫細胞から幹細胞を誘導することと、
    　を含み、
    　前記血液細胞又は前記免疫細胞にＩＬ－２を適用しない、
    　幹細胞の製造方法。
  15. 　前記血液細胞又は前記免疫細胞にＩＬ－２以外のインターロイキンを適用することをさらに含む、請求項１４に記載の幹細胞の製造方法。
  16. 　前記幹細胞が、再構成されたγδ－ＴＣＲ遺伝子を備える、請求項１４に記載の幹細胞の製造方法。
  17. 　請求項１４に記載の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、
    　前記幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、
    　を含む、血液細胞又は免疫細胞の製造方法。
  18. 　血液細胞又は免疫細胞に、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸と、インターロイキンと、を適用することと、
    　前記血液細胞又は前記免疫細胞から幹細胞を誘導することと、
    　を含み、
    　前記インターロイキンがＩＬ－２を含まない、
    　幹細胞の製造方法。
  19. 　前記インターロイキンが、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－１８、及びＩＬ－３３からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１８に記載の幹細胞の製造方法。
  20. 　請求項１８に記載の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、
    　前記幹細胞から血液細胞又は免疫細胞を誘導することと、
    　を含む、血液細胞又は免疫細胞の製造方法。
  21. 　Ｔ細胞から誘導された多能性幹細胞からγδＴ細胞を分化誘導することを含む、γδＴ細胞の製造方法。
  22. 　前記多能性幹細胞がγδＴ細胞から誘導されている、請求項２１に記載のδＴ細胞の製造方法。
  23. 　前記多能性幹細胞に誘導されたγδＴ細胞が、γδＴ細胞受容体を発現している、請求項２１に記載のδＴ細胞の製造方法。
  24. 　前記多能性幹細胞が、γδＴ細胞受容体の再構成遺伝子を有する、請求項２１に記載のδＴ細胞の製造方法。
  25. 　前記分化誘導されたγδＴ細胞が、γδＴ細胞受容体を発現している、請求項２１に記載のδＴ細胞の製造方法。
  26. 　前記多能性幹細胞から前記γδＴ細胞を分化誘導することが、
    　前記多能性幹細胞から造血幹前駆細胞を誘導することと、
    　前記造血幹前駆細胞から前記γδＴ細胞を誘導することと、
    　を含む、請求項２１に記載のδＴ細胞の製造方法。
  27. 　γδＴ細胞から誘導された多能性幹細胞から分化誘導されたγδＴ細胞。
  28. 　γδＴ細胞から誘導された多能性幹細胞から分化誘導されたγδＴ細胞を含む、がん治療のための医薬品組成物。
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