WO2023282337A1

WO2023282337A1 - 角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物

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Publication number: WO2023282337A1
Application number: PCT/JP2022/027002
Authority: WO
Inventors: 慎二吉崎; 晋羽藤; 雅志塚本
Original assignee: Cellusion Inc
Current assignee: Cellusion Inc
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2022-07-07
Publication date: 2023-01-12
Anticipated expiration: 2024-01-07
Also published as: EP4368190A4; AU2022306214A1; IL309977A; CA3226193A1; US20240350552A1; EP4368190A1; JPWO2023282337A1

Abstract

本発明は、凍結保存可能で、解凍による細胞へのダメージがなく、さらに、解凍後の細胞に対し洗浄や遠心分離等の追加のプロセスを経ることなくそのまま患者に投与可能な治療用組成物、特に移植治療用組成物を提供することを目的とする。ＣＤ２４陽性表現型を有する角膜内皮代替細胞、フェノールフタレイン誘導体及び凍結保護剤を含む、移植用の治療用組成物。かかる治療用組成物は凍結保護剤を含んでいるにもかかわらず、安全に眼房内に移植することができる。ＣＤ２４陽性であることから食作用回避効果が期待できる。

Description

角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物

　本発明は、角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物、特に、移植用の治療用組成物に関する。

　角膜内皮細胞の減少などの角膜内皮の損傷により、角膜内皮細胞の機能が損なわれ、角膜実質部に浮腫が生じる。これは角膜の透明性の低下を招き、視力を低下させる。このような状態は、水疱性角膜症と呼ばれている。一方で、ヒトの角膜内皮細胞は、一度障害を受けると再生する能力をほとんど持たないことが知られている。従って、なんらかの傷害により角膜内皮細胞が減少した場合、その治療は角膜移植が有効な、唯一の手段となる。実際、角膜移植適応例の約半数は角膜内皮機能不全による水疱性角膜症が占める。

　現在、角膜内皮損傷患者は、角膜の上皮、実質及び内皮の３層構造の全てを移植する全層角膜移植により処置されている。全層角膜移植は、確立された技術ではあるが、日本での角膜提供は不足しているのが現状であり、また、拒絶反応が問題となる。かかる問題点を解消するために、損傷を受けた組織のみを移植する「パーツ移植」が普及しつつある。角膜内皮を温存して、ドナーの上皮と実質のみを移植する深層層状角膜移植（Deep Lamellar Keratoplasty：ＤＬＫＰ）や内皮を含む一部の角膜だけを移植する角膜内皮移植等が知られている。しかしながら、例えば角膜内皮移植の場合、その移植材料の供給源となるのは依然として角膜内皮そのものであり、角膜の提供者が限られていることを鑑みれば、全層角膜移植同様、ドナー不足の問題点を克服することができない。さらに角膜内皮細胞は培養が難しく、移植に十分な数の培養細胞を調製することには時間的及び費用的な負担が大きい。

　ドナー不足の問題点を解決する為に、角膜内皮細胞乃至角膜内皮細胞と同等の機能を有する角膜内皮細胞の代替となる細胞の創製が試みられている。
　例えば、ｉＰＳ細胞あるいはＥＳ細胞から角膜内皮細胞の代替となる細胞を誘導する方法が報告されている。ｉＰＳ細胞あるいはＥＳ細胞から角膜内皮細胞（実際は、角膜内皮細胞に特異的な表面マーカー等が今のところ確立されていないため、角膜内皮細胞に近い性質の細胞、いわゆる角膜内皮様細胞（Corneal endothelial like cell））への誘導法・細胞培養法に関しては、非特許文献１に総説されている。また、本発明者らは、これまでに角膜内皮細胞と同等の機能を有する、角膜内皮細胞の代替となる細胞の製造方法を確立し（特許文献１～３）、当該方法によって得られた角膜内皮様細胞を「角膜内皮代替細胞」と命名している。ｉＰＳ細胞由来角膜内皮代替細胞の水疱性角膜症に対する臨床研究も始まっている。

ＷＯ／２０１３／０５１７２２ＷＯ／２０１６／０９３３５９ＷＯ／２０１９／１４２８３３

Hatou S, Shimmura S; Inflamm Regen. 2019;39:19.

　培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞を実際の臨床で治療に用いるには、製造した細胞を安定に治療時まで保存する、かつ製造拠点から病院あるいは診療所へ輸送することなどが出来なければならない。しかし、細胞加工物の剤型や、保存・輸送の温度帯によって、細胞の生存率や品質は変動するため、安定な保存・輸送が可能となる剤型と温度帯の設定が重要である。また、治療にあたってできるだけユーザーフレンドリーな剤型が望ましい。
　移植用の細胞の安定な保存・輸送を可能にする手段として細胞や細胞塊、あるいはその細胞加工物を凍結保存液に懸濁し凍結保存する方法が挙げられる。凍結保存液には、ジメチルスルホキシド（DMSO）等の凍結保護剤が含まれている。一般的に凍結保護剤の存在は細胞やそれを投与する生体に影響を与える。従って、治療のために細胞や細胞塊、あるいは細胞加工物を用いる際には、解凍後、凍結保護剤の洗浄／除去が必要となる。凍結保護剤の洗浄／除去工程の実施は、時間及びコスト的に望ましいものではなく、また、細胞へのダメージが大きい。
　従って、本発明は、凍結保存可能で、解凍による細胞へのダメージがなく、さらに、解凍後の細胞に対し洗浄や遠心分離等の追加のプロセスを経ることなくそのまま患者に投与可能な治療用組成物、特に移植治療用組成物を提供することを目的とする。
　角膜内皮代替細胞は、多能性幹細胞、特に人工多能性幹細胞を分化・誘導することによって調製される。しかしながら、全ての多能性幹細胞に対して目的とする角膜内皮代替細胞へと誘導することは難しく、一部に由来となる幹細胞や、角膜内皮代替細胞への分化・誘導途上にある未分化細胞が残存することがある。このような未分化細胞は、増殖活性を有し、角膜内皮代替細胞以外の細胞に分化し、また、生体内に移植された場合、奇形腫を形成する恐れがある。従って、本発明で用いる角膜内皮代替細胞を含有する細胞集団は、できるだけ未分化細胞の割合が低減されたものであることが好ましい。

　本発明者らは、上記課題に鑑み、細胞、特に培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞の安定な保存・輸送が可能となる剤型と温度帯を鋭意検討した結果、細胞を保存液に懸濁し凍結保存することによって安定に保存・輸送が可能なこと、さらに、得られる細胞含有組成物をフェノールフタレイン誘導体存在下で解凍、希釈することで移植に適した治療用組成物とし得ることを見出した。当該治療用組成物は、凍結保存液に含まれていた凍結保護剤を洗浄等で除去する必要がない。さらに凍結保存された細胞が、解凍後も角膜内皮機能を維持していることを確認して本発明を完成するに至った。
　さらに、本発明者らは、幹細胞由来の角膜内皮代替細胞を含有する治療用医薬組成物において、未分化細胞の割合（以下、未分化細胞残存率とも称する）を調べ、医薬上許容し得る未分化細胞残存率を見出した。

　即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］ＣＤ２４陽性表現型を有する角膜内皮代替細胞、及び所望によりフェノールフタレイン誘導体をさらに含む、治療用組成物。
［２］さらに、凍結保護剤を含む、上記［１］記載の組成物。
［３］凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、上記［２］記載の組成物。
［４］組成物中のＤＭＳＯ濃度が１～１０％である、上記［３］記載の組成物。
［５］フェノールフタレイン誘導体が、フェノールスルホンフタレイン（フェノールレッド）、フェノールフタレイン、ブロモフェノールブルー、イソバレリルフェノールフタレイン、アセチルフェノールフタレイン、フェノールフタレインジブチレート、フェノールフタレインジホスフェート、フェノールフタレインジスルフェート、フェノールフタレイングルクロン酸、フェノールフタレインモノ－β－グルコシドウロン酸、フェノールフタレインモノ－β－グルクロン酸、フェノールフタレインモノ－ホスフェート、およびクレゾールレッドからなる群より選択される、上記［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］フェノールフタレイン誘導体が、フェノールレッドである、上記［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［７］組成物中のフェノールレッド濃度が１～２０ｍｇ／Ｌである、上記［６］記載の組成物。
［８］組成物中の細胞の濃度が０．５～１０×１０^６細胞／ｍＬである、上記［１］～［７］のいずれかに記載の組成物。
［９］細胞のスフェロイド懸濁液の剤形である、上記［１］～［８］のいずれかに記載の組成物。
［１０］組成物中に含まれる細胞集団が、面積相当径が３０μｍ以上のスフェロイドを含み、当該スフェロイドのうち５０％以上が面積相当径３０～９０μｍである、上記［９］記載の組成物。

［１１］角膜内皮代替細胞が幹細胞由来である、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の組成物。
［１２］幹細胞が多能性幹細胞である、上記［１１］記載の組成物。
［１３］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞（遺伝子編集あるいは遺伝子導入により追加機能を付与した細胞を含む）由来である、上記［１２］記載の組成物。
［１４］ヒト角膜内皮細胞または培養内皮細胞よりもＢ２Ｍ発現量が低い上記［１３］記載の組成物。
［１５］移植用である、上記［１］～［１４］のいずれかに記載の組成物。
［１６］前房内への移植用である、上記［１５］記載の組成物。
［１７］角膜内皮の移植が必要な疾患の治療用である、上記［１６］記載の組成物。
［１８］該疾患が、水疱性角膜症、円錐角膜、角膜炎、角膜の化学熱傷、角膜実質ジストロフィー、角膜浮腫及び角膜白斑からなる群より選択される１種である、上記［１７］記載の組成物。
［１９］角膜内皮の移植が必要な疾患の治療用組成物を製造する為の、ＣＤ２４陽性表現型を有する角膜内皮代替細胞の使用。
［２０］該治療用組成物が、所望によりフェノールフタレイン誘導体を含む、上記［１９］記載の使用。

［２１］該治療用組成物が、さらに凍結保護剤を含む、上記［１９］又は［２０］に記載の使用。
［２２］該疾患が、水疱性角膜症、円錐角膜、角膜炎、角膜の化学熱傷、角膜実質ジストロフィー、角膜浮腫及び角膜白斑からなる群より選択される１種である、上記［１９］～［２１］のいずれかに記載の使用。
［２３］角膜内皮の移植が必要な疾患の治療に使用する為の、ＣＤ２４陽性表現型を有する角膜内皮代替細胞を含む治療用組成物。
［２４］所望によりフェノールフタレイン誘導体を含む、上記［２３］記載の組成物。
［２５］さらに凍結保護剤を含む、上記［２３］又は［２４］に記載の組成物。
［２６］該疾患が、水疱性角膜症、円錐角膜、角膜炎、角膜の化学熱傷、角膜実質ジストロフィー、角膜浮腫及び角膜白斑からなる群より選択される１種である、上記［２３］～［２５］のいずれかに記載の組成物。
［２７］ＣＤ２４陽性表現型を有する角膜内皮代替細胞を含む治療用組成物の有効量を、それを必要とする患者の前房内へ移植することを含む、角膜内皮の移植が必要な疾患の治療方法。
［２８］該治療用組成物が、所望によりフェノールフタレイン誘導体を含む、上記［２７］記載の治療方法。
［２９］該治療用組成物が、さらに凍結保護剤を含む、上記［２７］記載の治療方法。
［３０］該疾患が、水疱性角膜症、円錐角膜、角膜炎、角膜の化学熱傷、角膜実質ジストロフィー、角膜浮腫及び角膜白斑からなる群より選択される１種である、上記［２７］～［２９］のいずれかに記載の治療方法。
［３１］凍結保護剤の存在下、－２０℃以下で凍結された角膜内皮代替細胞の細胞懸濁液あるいは細胞スフェロイド懸濁液にフェノールフタレイン誘導体を含む移植用基材を添加することを含む、治療用組成物の製造方法。
［３２］該角膜内皮代替細胞がＣＤ２４陽性表現型を有する、上記［３１］記載の方法。
［３３］幹細胞由来の角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物であって、未分化細胞残存率が１％未満であることを特徴とする組成物。
［３４］該角膜内皮代替細胞がＣＤ２４陽性表現型を有する、上記［３３］記載の組成物。
［３５］未分化細胞残存率が０．１％以下である、上記［３３］又は［３４］に記載の組成物。
［３６］幹細胞が多能性幹細胞である、上記［３３］～［３５］のいずれかに記載の組成物。
［３７］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞（遺伝子編集あるいは遺伝子導入により追加機能を付与した細胞を含む）由来である、上記［３６］記載の組成物。
［３８］ヒト角膜内皮細胞または培養内皮細胞よりもＢ２Ｍ発現量が低い上記［３３］～［３７］のいずれかに記載の組成物。
［３９］未分化細胞残存率が未分化細胞マーカーの発現プロファイルによって評価される、上記［３３］～［３８］のいずれかに記載の組成物。
［４０］移植用である、上記［３３］～［３９］のいずれかに記載の組成物。
［４１］前房内への移植用である、上記［４０］記載の組成物。

　本発明によれば、凍結保存可能で、解凍による細胞へのダメージがなく、さらに、解凍後の細胞に対し洗浄や遠心分離等の追加のプロセスを経ることなくそのまま患者に投与可能な治療用組成物、特に移植治療用組成物の提供が可能になる。本発明の治療用組成物は、全世界に、角膜移植適応症例の約５０％を占めているという水疱性角膜症における角膜内皮代替細胞の移植に有用である。
　本発明によれば、治療用組成物、特に移植用組成物においてその未分化細胞残存率を確認することで副作用のない移植が可能になる。

角膜内皮代替細胞を冷蔵保管した場合と冷凍保管した場合の細胞の状態を比較した結果を示す図である。冷凍保管の方が、細胞塊を長期間維持できることがわかった。本発明の治療用組成物において、解凍後の角膜内皮代替細胞の境界にタイトジャンクションが形成されることを示した図である。細胞境界にZO-1の発現が見られた。未分化細胞残存率について検討した結果を示す図である。未分化細胞スパイク率の奇形腫形成に及ぼす影響を調べた図である。奇形種形成には１％以上のスパイク率を要し、スパイク率０．１％、０．０１％では奇形腫形成は確認されなかった。未分化ｉＰＳ細胞スパイク試験による生存曲線（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線）を表すグラフである。未分化細胞残存率０．１％以下の角膜内皮代替細胞をヌードラット前房内に移植し、経過観察した結果を表す図である。最長２６週まで経過観察したが、造腫瘍性は認めなかった。スフェロイド化した角膜内皮代替細胞のサイズを検証した結果を示すグラフである。凍結保護剤の濃度違いによるＣＥＣＳｉ細胞の顕微鏡観察像である。凍結保護剤の濃度違いによるＣＥＣＳｉ細胞の抗ＺＯ－１抗体の染色像である。ヒト角膜内皮細胞、ｉＰＳ細胞（Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４）及びＣＥＣＳｉ細胞におけるｂｅｔａ－２　ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｂ２Ｍ）の発現量を比較した結果を示すグラフである。ＣＥＣＳｉ細胞スフェロイド懸濁液の顕微鏡写真を示す図である（左；フェノールレッドなし、右；フェノールレッド有り）。

　以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。

１．治療用組成物
　本発明は、培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞、及びフェノールフタレイン誘導体を含有する治療用組成物、特に移植治療用組成物を提供する。好ましくは角膜内皮代替細胞及びフェノールフタレイン誘導体を含有する治療用組成物、好ましくは移植治療用組成物である。本発明は、また、幹細胞由来の角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物であって、未分化細胞残存率が１％未満であることを特徴とする組成物を提供する。本明細書中、これらを総称して本発明の治療用組成物と略記する場合がある。当該治療用組成物は、角膜内皮代替細胞あるいは培養角膜内皮細胞を眼内に移植、特に前房内に移植するのに好適に用いられる。

（細胞）
　本発明の治療用組成物には、培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞、好ましくは角膜内皮代替細胞、より好ましくはｉＰＳ細胞由来の角膜内皮代替細胞が用いられる。

　培養角膜内皮細胞としては、初代培養細胞であっても株化細胞であってもよいが、角膜内皮細胞は初代培養が難しいことから、株化細胞を用いることが好ましい。

　本発明において、角膜内皮代替細胞は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、あるいはそれらに遺伝子編集あるいは遺伝子導入により追加機能を付与した細胞、等の幹細胞から誘導される、角膜内皮機能不全を治療可能な、角膜内皮細胞の代替となり得る細胞である。即ち、角膜内皮代替細胞は角膜内皮細胞と同等の生理機能を有する。
　幹細胞は、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する複数系列の細胞に分化し得る細胞をいい、具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞）、体細胞由来人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）が挙げられる。ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。好ましくはヒトに由来するものが使用できる。

　具体的には、ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、C-Myc遺伝子及びSox2遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子及びSox2遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）等が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Nature. 2008 Jul 31;454(7204):646-50）、低分子化合物を利用した方法（Cell Stem Cell. 2009 Jan 9;4(1):16-9、Cell Stem Cell. 2009 Nov 6;5(5):491-503）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):381-4）など、ｉＰＳ細胞の作成法については技術的な改良が鋭意行なわれているが、作製されたｉＰＳ細胞の基本的な性質、すなわち多分化能を有するという点は作出方法によらず同等であり、いずれも本発明で用いる角膜内皮代替細胞の由来となり得る。

　具体的には、ｉＰＳ細胞としては、201B7、201B7-Ff、253G1、253G4、1201C1、1205D1、1210B2、836B3、FF-I14s03、FF-I01s04、MH09s01、Ff-XT18s02、Ff-WIs03、Ff-WJs513、Ff-CLs14、Ff-KVs09、QHJI14s03、QHJI01s04、RWMH09s01、DRXT18s02、RJWIs03、YZWJs513、ILCLs14、GLKVs09、 Ff-XT28s05-ABo_To、Ff-I01s04-ABII-KO、Ff-I14s04-ABII-KO（いずれもｉＰＳアカデミアジャパン社、又は京都大学ｉＰＳ研究財団）、Tic(JCRB1331株)、Dotcom（JCRB1327株)、Squeaky(JCRB1329株)、及びToe（JCRB1338株)、Lollipop（JCRB1336株)（以上成育医療センター、医薬基盤研究所難病・疾患資源研究部・ＪＣＲＢ細胞バンク）、UTA-1株及びUTA-1-SF-2-2株（いずれも東京大学）、21526、21528、 21530、21531、31536、31538株（いずれもフジフイルム・セルラー・ダイナミクス社）等を用いることができる。

　本発明の治療用組成物に含められる角膜内皮代替細胞は、例えば本発明者らによって開発された角膜内皮様の細胞（特許文献１～３）であり、特許文献１～３に記載の方法によって製造、調製することができる。好ましくは、角膜内皮細胞様の性状及び機能を有し、且つ、NR3C2（nuclear receptor subfamily 3, group C, member 2）の遺伝子発現量が増強されていることを特徴とする、ｉＰＳ細胞（遺伝子編集あるいは遺伝子導入により追加機能を付与した細胞を含む）由来の角膜内皮代替細胞（Corneal Endothelial Cell Substitute from iPS cells；CECSi細胞）である（特許文献３）。

　角膜内皮代替細胞が有する角膜内皮細胞様の性状及び機能としては、具体的には以下の特徴（i）～（iv）が挙げられ、角膜内皮代替細胞はこれらの特徴のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、いっそう好ましくは４つ全ての特徴を有する。
(i)細胞間接着がN-Cadherinで構成されている。
(ii)細胞間にタイトジャンクション（tight junction）が形成されている。
(iii)細胞膜上にNa,K-ATPase α1 subunitを発現する。
(iv)細胞核に転写因子PITX2の発現が観察される。
　細胞間接着がN-Cadherinで構成されているか否かは、N-Cadherinに対する免疫染色で確認することができる。
　細胞間にtight junctionが形成されているか否かは、tight junctionを構成するタンパク質であるZO-1の存在を、ZO-1に対する免疫染色で観察することにより確認することができる。また、電子顕微鏡により直接構造を観察することによって確認することもできる。
　細胞膜上にNa,K-ATPase α1 subunit（ATP1A1）を発現しているか否かは、ZO-1とNa,K-ATPase α1 subunitに対する免疫染色により、両者が共染色されることで確認することができる。
　細胞核に転写因子PITX2が発現しているか否かは、PITX2に対する免疫染色で確認することができる。

　本発明の一実施態様として、本発明の治療用組成物に含められる角膜内皮代替細胞は、ＣＤ２４陽性表現型を有することを特徴とする。ＣＤ２４は、高度にグリコシル化された小さなムチン様グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidyl-inositol、ＧＰＩ）結合細胞表面タンパク質である。ＣＤ２４は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、好酸球、樹状細胞、及びマクロファージなどの造血細胞、並びに神経細胞、神経節細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、筋肉細胞、膵細胞、及び上皮幹細胞などの非造血細胞において高レベルで発現している。近年、ＣＤ２４にマクロファージの食作用を回避する機能があることが報告されている。従って、ＣＤ２４陽性表現型を有する角膜内皮代替細胞を含む本発明の治療用組成物は、移植の際の拒絶反応の低減が期待できる。一方で、ヒト角膜内皮細胞はＣＤ２４陰性であることが報告されている（特表２０１９－５１０５０９号公報、特開２０２０－０７３６０２号公報）。
　ＣＤ２４陽性表現型の有無は、細胞表面上に発現するＣＤ２４抗原に対する免疫染色で確認することができる。

　各免疫染色は当分野で通常実施されており、また、用いる試薬や機器等は商業的に入手可能であるか、既報に従って調製することができる。

　治療用組成物中の培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞はスフェロイドであることが好ましい。本明細書において「スフェロイド」とは、数十個乃至数百個の細胞が凝集した細胞の塊であって、一般的に球状を呈する。ここで「球状」とは、完全に球形である場合に加え、卵形やラグビーボール状といった略球形の形状であることを含む。
　該スフェロイドは、例えば、直径または面積相当径が１０～２００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは３０～１５０μｍの範囲であり、特に好ましくは３０～１００μｍの範囲であり、いっそう好ましくは３０～９０μｍの範囲であり、さらにいっそう好ましくは４０～８０μｍの範囲である。スフェロイドが大きすぎても生着にムラが生じて一様に生着せず、小さすぎても沈着しにくく生着効率が低減するが、スフェロイドの大きさがこの範囲であれば、移植部において細胞が効率的に生着する。「面積相当径」とは、粒子（本願の場合スフェロイド）の投影面積と等しい円の直径を意味し、ヘイウッド径又は円相当径とも称される。すなわち、略球形の形状のスフェロイドの投影面積と等しい面積を有する円の直径である。

　本発明の治療用組成物は、培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞の細胞懸濁液、好ましくはスフェロイド懸濁液の剤形として提供される。
　治療用組成物中の培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞の濃度は、通常、０．５～１０×１０^６細胞／ｍＬ、好ましくは、１．０～５×１０^６細胞／ｍＬである。細胞濃度が高すぎても低すぎでも細胞の移植部における生着効率が低減する。
　細胞濃度の決定は、本発明の治療用組成物の剤形が細胞懸濁液の場合は細胞懸濁液の一部をサンプリングし、当該サンプル中の細胞数を計測し；剤形がスフェロイド懸濁液の場合はスフェロイド懸濁液の一部をサンプリングし、当該サンプル中のスフェロイドを酵素処理して細胞を１個ずつばらばらにして細胞数を計測し、その結果を用いて行う。
　剤形がスフェロイド懸濁液の場合、本発明の治療用組成物中に含まれる細胞集団は、面積相当径が３０μｍ以上のスフェロイドを含む。スフェロイド懸濁液において含まれるスフェロイドのうち５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上が、直径または面積相当径の中央値±３０μｍの範囲に含まれる。一スフェロイドの直径または面積相当径のバラつきが少ない方が、効率的かつ均一に生着面を覆うことができる。実施態様として、スフェロイドの５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上は直径または面積相当径３０～９０μｍの大きさである。

　本発明の角膜内皮代替細胞を含む治療用組成物は、由来となる幹細胞、例えばｉＰＳ細胞や、角膜内皮代替細胞への分化・誘導途上にある細胞等（以下、未分化細胞とも称する）を含み得る。未分化細胞の割合が大きい程、生体に移植した際に奇形腫形成等の副作用が生じやすくなる。本発明の角膜内皮代替細胞を含む治療用組成物は、好ましくは未分化細胞残存率が１％未満、より好ましくは０．１％以下、いっそう好ましくは０．０１％以下である。未分化細胞残存率を１％未満に抑えることで、生体に移植した際の奇形腫形成や腫瘍形成を抑制することができる。

　ここで、「未分化細胞残存率」は、本発明の治療用組成物に含まれる細胞全体における未分化細胞の割合を意味する。未分化細胞率が０％の場合には、本発明の治療用組成物中の細胞の全部が角膜内皮代替細胞であり、未分化細胞率が１００％の場合には、本発明の治療用組成物中の細胞の全部が未分化細胞であることを意味する。未分化細胞残存率が１％未満、０．１％以下、０．０１％以下の場合は、それぞれ本発明の治療用組成物中の全細胞の１％未満、０．１％以下、０．０１％以下が未分化細胞であることを意味する。本発明の治療用組成物中の全細胞数が１×１０^４細胞の場合、未分化細胞残存率が１％未満、０．１％以下、０．０１％以下の場合は、それぞれ１００個未満、１０個以下、１個以下の細胞が未分化細胞であり得ることを意味する。

　未分化細胞残存率の測定は、特に限定されるものではないが、例えば未分化細胞に特異的な細胞マーカー（以下、「未分化細胞マーカー」とも称する）の発現プロファイルを評価することによって行うことができる。本明細書において未分化細胞マーカーとは、由来となった幹細胞に特異的に発現している遺伝子又はタンパク質であり、転写因子のＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２、表面抗原のＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０、及びＴＲＡ－１－８１等が挙げられる。好ましくはＯＣＴ４発現を評価することによって実施される（Stem Cell Research 55 (2021) 102497）。ＯＣＴ４は、多能性を有する細胞のマーカーとして使用される因子で、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞はこの遺伝子を発現しているが、皮膚の細胞や心臓の細胞など、多能性のない細胞はＯＣＴ４を発現していない。具体的には実施例に記載の方法によって評価することができるが、組成物に対しＯＣＴ４の定量的ＰＣＲを実施し、ヒト角膜内皮細胞の樹立株であるＢ４Ｇ１２細胞におけるＯＣＴ４発現量の４．０倍以下である場合が「未分化細胞残存率０．１％以下」に相当する。他の未分化細胞マーカーについても同様にあらかじめ発現量と未分化細胞残存率との相関性を確認することによって、本発明の角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物が移植に適したものであるか否かを知ることができる。

（フェノールフタレイン誘導体）
　本発明の治療用組成物は、上記細胞に加え、フェノールフタレイン誘導体を含むことを特徴とする。フェノールフタレイン誘導体は、下記式で表される基本骨格を有すれば所望の効果が得られる限り特に限定されない。

式中、－Ｘ－は－ＳＯ_２－又は－ＣＯ－であり、環Ａｒ_１及び環Ａｒ_２は同一又は異なって、１～３個の置換基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル等の炭素数１～３の分岐鎖を有してもよいアルキル基；臭素原子、塩素原子等のハロゲン原子；アセチル、イソバレリル等のアシル基）を有していてもよい炭素数６又は１２の芳香環（例、ベンゼン、ナフタレン）である。
　好ましくは－Ｘ－は－ＳＯ_２－である。環Ａｒ_１及び環Ａｒ_２は同一又は異なって、１～３個、好ましくは１又は２個の置換基（例、メチル、イソプロピル、臭素原子）を有していてもよいベンゼンである。
　当該フェノールフタレイン誘導体は、その塩又はそのエステルであってもよい。あるいは酸付加物であってもよい。

　フェノールフタレイン誘導体としては、例えばフェノールスルホンフタレイン（フェノールレッド）、フェノールフタレイン、ブロモフェノールブルー、イソバレリルフェノールフタレイン、アセチルフェノールフタレイン、フェノールフタレインジブチレート、フェノールフタレインジホスフェート、フェノールフタレインジスルフェート、フェノールフタレイングルクロン酸、フェノールフタレインモノ－β－グルコシドウロン酸、フェノールフタレインモノ－β－グルクロン酸、フェノールフタレインモノ－ホスフェート、クレゾールレッドが挙げられる。フェノールフタレイン誘導体は自体既知の方法によって製造することができる。フェノールフタレイン誘導体はフタル酸と該当する各種フェノール類で合成が可能であることは公知であり、使用するフェノール類がフェノールであればフェノールフタレインが合成できる。また、各種フェノールフタレイン誘導体は商業的に入手可能である。簡便性及び品質の安定性の観点から商業的に入手したものを用いることが好ましい。フェノールフタレイン誘導体として好ましくは、下記構造のフェノールレッド（フェノールスルホンフタレインともいう）である。フェノールレッドは通常、ｐＨ指示薬として培地に含められるが、細胞培養という観点からは任意の添加成分であり、フェノールレッドフリーの培地も市販されている。本発明の治療用組成物に含まれるフェノールレッドの濃度は、通常１～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～１５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５～１０ｍｇ／Ｌである。フェノールレッド以外のフェノールフタレイン誘導体の濃度も通常１～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～１５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５～１０ｍｇ／Ｌである。

　フェノールフタレイン誘導体が有する「所望の効果」とは、移植後の細胞の生着を促進する効果である。

　本発明の治療用組成物の投与対象としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒト等の哺乳動物が挙げられるが、好ましくはヒトである。
　本発明の治療用組成物の投与量としては、投与対象の体重や年齢、症状などにより一概に規定されるものではないが、例えば体重２５～３００Kg、年齢１６～１００歳、症状が水疱性角膜症であるヒトであれば一眼あたり５０～２００μＬ、が前房内に注射で投与される。本発明の、凍結保護剤、移植用基材および細胞又は細胞スフェロイドを含む治療用組成物の前房内注射において、眼圧の上昇や著しい炎症などの副作用は生じず、安全である。

　本発明の治療用組成物は角膜内皮の移植が必要な疾患の治療用として好適に用いることができる。該疾患としては、水疱性角膜症、円錐角膜、角膜炎、角膜の化学熱傷、角膜実質ジストロフィー、角膜浮腫、角膜白斑等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　本発明は、また、治療用組成物の有効量を、それを必要とする患者の前房内へ移植することを含む、角膜内皮の移植が必要な疾患の治療方法を提供し得る。ここで、適応疾患、投与量としては、上述のものが挙げられる。

２．治療用組成物の製造方法
　本発明の治療用組成物は、例えば、上記した培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞、好ましくは角膜内皮代替細胞、より好ましくはCECSi細胞を、スフェロイド化した後、凍結保存液に懸濁し凍結し、一定期間保存した後、フェノールフタレイン誘導体存在下で解凍、希釈することで調製することができる。
　細胞をスフェロイド化する方法としては、ハンギングドロップ法、旋回培養法、低付着性培養容器による培養等が知られている。低付着性培養容器による培養法は、操作が簡便な事から好ましく用いられる方法である。通常の培養容器で増殖した付着性の細胞は、低付着性の容器で培養すると、細胞自身が持つ性質により、細胞同士が付着してスフェロイドを形成する。例えば、EZSphere（登録商標、AGCテクノグラス）、ウェルバッグ(東洋製罐）などの容器内で浮遊培養することにより細胞をスフェロイド化することができる。スフェロイド化には好ましくはスフェロイド形成培地を使用する。スフェロイド形成培地としては、例えば実施例に記載される培地が挙げられるが、それに限定されない。スフェロイド形成培地にはフェノールフタレイン誘導体を含まないことにより、より多くのスフェロイドが形成しやすい。
　本発明において、細胞又はスフェロイド化した細胞を凍結する方法及び保存する方法は特に限定されず、細胞の凍結保存で通常実施される方法で行うことができる。好ましくは－７０℃以下、より好ましくは－８０℃以下で凍結し、保存する。保存期間は特に限定されないが、通常、数週間～半年、好ましくは２週間～６か月、より好ましくは４か月の保存期間が挙げられ、解凍後の生存率を損なうことなく保存することができる。

　細胞の凍結保存とは、継代培養することなしに細胞を長期間維持する目的で細胞を凍結保存させることをいう。細胞をそのまま凍結させると細胞内に含まれる水分のために氷晶が発生し、成長した氷晶が細胞膜を破壊する、いわゆる凍害が起こることが知られている。そのため、凍結保存の際に用いられる凍結保存液には、凍害防止の目的で凍結保護剤が含められる。従って、本発明の治療用組成物は、細胞及びフェノールフタレイン誘導体に加え、凍結保護剤を含有し得る。

　凍結保護剤としては、凍害防止の目的が達成される限り特に限定されないが、例えば、細胞浸透性の凍結保護剤や細胞非浸透性の凍結保護剤などが挙げられる。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、カルボキシル化ポリリジン、グリセロール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどが挙げられる。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。好ましくは汎用されているＤＭＳＯである。

　凍結保存液は、凍結保護剤を溶解および／または希釈し、細胞の生存を維持するための媒体を含んでもよい。媒体としては、上記の機能を有するものであれば特に限定されず、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の細胞培養用の基礎培地をベースにしたものなどを使用してもよい。基礎培地としては、例えば、MEM培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地（例、F10、F12）、RPMI 1640培地、Fischer's培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることができる培地であれば特に限定されない。これらの培地は、商業的に入手可能である。さらにこれらの培地は、血清含有培地、無血清培地であり得る。好ましくは無血清培地である。本発明で用いられる培地が血清含有培地である場合には、ウシ血清（Bovine Serum）、ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）などの哺乳動物の血清が使用でき、該血清の培地中の濃度は０．１～２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１～１０％（ｖ／ｖ）である。

　凍結保存液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、凍結・解凍操作により細胞の品質を過度に劣化させない濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、凍結保存液全体に対して、約１％～約６０％（ｖ／ｖ）、約２％～約５０％（ｖ／ｖ）、約５％～約４０％（ｖ／ｖ）、約５％～約２０％（ｖ/ｖ）、約１０％～約２０％（ｖ/ｖ）などとすることができる。凍結保護剤がＤＭＳＯの場合は、例えば凍結保存液においては１０～２０％で含められる。

　あらかじめ凍結保護剤が含まれている、凍結保存液として市販されているもの（例、セルバンカー（登録商標）、バンバンカー（登録商標））も好適に用いることができる。

　かくして凍結された、培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞（好ましくは角膜内皮代替細胞、より好ましくはCECSi細胞）及び凍結保護剤を含む凍結保存液を含む、凍結された組成物を、本発明の「細胞含有組成物」と称する。細胞含有組成物をフェノールフタレイン誘導体存在下で解凍、希釈することで本発明の治療用組成物を調製することができる。

　凍結保存されている細胞含有組成物を、フェノールフタレイン誘導体存在下で解凍、希釈する工程は、具体的には、凍結保存されている細胞含有組成物に移植用基材を添加することによって実施することができる。通常、細胞含有組成物１重量部に対し、１～９重量部（２～１０倍希釈）、より好ましくは４重量部（５倍希釈）の移植用基材を添加する。移植用基材を添加後の組成物中の凍結保護剤の濃度は２％以下が好ましく、より好ましくは１％以下である。
　フェノールフタレイン誘導体は、移植用基材のみ、あるいは凍結保存液及び移植用基材の両方に含めることができるが、好ましくは、移植用基材のみに含まれる。

　凍結保存液及び／又は移植用基材へのフェノールフタレイン誘導体の添加濃度、又は、凍結保存液及び／又は移植用基材中のフェノールフタレイン誘導体の濃度は、凍結保護剤による細胞や生体への影響を排除し得る濃度であれば特に限定されず、最終濃度、即ち、治療用組成物中の濃度で１～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～１５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５～１０ｍｇ／Ｌとなるように調整することができる。例えば、フェノールフタレイン誘導体がフェノールレッドで、移植用基材中の濃度が６～１２ｍｇ/Ｌである場合、該移植用基材で細胞含有組成物を５倍希釈すると、治療用組成物中のフェノールレッドの濃度は５～１０ｍｇ／Ｌとなる。

　細胞含有組成物を移植用基材で２～１０倍希釈、好ましくは５倍希釈して治療用組成物を調製することから、凍結保護剤は凍結保存時の治療用組成物において、０．１～３０％（ｖ／ｖ）、０．２～２５％（ｖ／ｖ）、０．５～２０％（ｖ／ｖ）、０．５～１０％（ｖ/ｖ）、１～１０％（ｖ/ｖ）などとすること、あるいは０．２～１２％（ｖ／ｖ）、０．４～１０％（ｖ／ｖ）、１～８％（ｖ／ｖ）、１～４％（ｖ/ｖ）、２～４％（ｖ/ｖ）などとすることができる。凍結保護剤がＤＭＳＯの場合は、例えば凍結保存液においては１０～２０％（ｖ／ｖ）で、移植時の治療用組成物においては５％（ｖ／ｖ）以下、好ましくは２％（ｖ／ｖ）以下で含められる。

　移植用基材としては、眼内投与、特に前房内投与に適した溶液であれば特に限定されないが、非刺激性の等張化された培養液や生理食塩水、緩衝液等が用いられる。好ましくは培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞を培養していたのと同様の培養液を使用する。移植用基材にはフェノールフタレイン誘導体以外に、必要に応じて各種の成分を含めることができる。該成分は、前房内に投与された（移植された）培養角膜内皮細胞又は角膜内皮代替細胞が脱落することなく角膜内皮細胞層へ分化するのに有用なものであれば特に限定されないが、インスリンあるいはインスリン様成長因子を添加することが好ましい。またレチノイン酸、ＥＧＦ及びｂＦＧＦも添加するのに好ましい成分である。

　以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。本明細書中で用いた略語は特に断りの無い限り、当分野で通常用いられるものと同様である。

実施例１：スフェロイド化した角膜内皮代替細胞の保存条件の検証
　特許文献３の実施例４と同様の方法でｉＰＳ細胞からＣＥＣＳｉ細胞を誘導し、１４日目にＡｃｃｕｔａｓｅ（ナカライテスク　＃１２６７９－５４）を用いて細胞を回収し、凍結保存液バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（日本ジェネティクス　＃ＣＳ－０７－００１；１０％ＤＭＳＯ含有）に１×１０^７細胞／ｍＬの細胞濃度で懸濁し－８０℃のディープフリーザーで凍結保存した。７カ月後に凍結保存した細胞を解凍し、スフェロイド形成バック（東洋製罐、ウェルバッグ）を用いて培養することにより、ＣＥＣＳｉ細胞をスフェロイド化した。
　スフェロイド化したＣＥＣＳｉ細胞を回収し、凍結保存液バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（日本ジェネティクス　＃ＣＳ－０７－００１；１０％ＤＭＳＯ含有）に６×１０^６細胞／ｍＬの細胞濃度で懸濁し－８０℃のディープフリーザーで凍結保存した（冷凍保管）。７日後に凍結保存した細胞は、４倍容量のフェノールレッド含有移植用基材（８．１ｍｇ／Ｌのフェノールレッド含有）を添加して解凍し、スフェロイドの形状を確認した。移植用基材としては、特許文献３の実施例４で用いたＣＥＣＳｉ細胞誘導用（＋Ｔ）培地を用いた。また、同様にｉＰＳ細胞から誘導したＣＥＣＳｉ細胞をスフェロイド化後、４℃で冷蔵保存し（冷蔵保管）、保存後１日目及び２日目にスフェロイドの形状を確認した。結果を図１に示す。
　冷蔵保管では保存後２日目で既にほとんどのスフェロイドは、分散していたが、凍結保存した細胞は、７日間の冷凍保管後も解凍後殆どのスフェロイドにおいて形状の維持が確認された。
　これらの結果より、凍結保存によりスフェロイド化した角膜内皮代替細胞を長期間保存できることが確認された。
　さらに、解凍後のスフェロイド化した角膜内皮代替細胞を培養容器へ播種し、角膜内皮代替細胞の角膜内皮様の機能が維持されているか調べた。
　角膜内皮代替細胞の重要な機能の一つであるバリア機能をタイトジャンクションの形成能を指標に評価した。
　凍結保存前、あるいは７日間の冷凍保管後のスフェロイド化した角膜内皮代替細胞を４８ウェルプレートに播種し、細胞をプレートに接着させた。２４時間後、ウェル上の細胞を、培地を除去し氷冷した４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで２回ウェルを洗ったのち、ブロッキング溶液（Normal Donkey Serumを10%含むPBST（10％NDS/PBST））を添加し３０分間ブロッキングを行った。その後、下記の抗体量で１次抗体反応を室温で１時間行った。
Rabbit anti human ZO-1;Invitrogen, 40-2200, 1:500, 0.4μL/well
ブロッキング溶液（10％NDS/PBST）, 0.20mL/well
　次に、ウェルをＰＢＳで２回洗ったのち、下記の抗体量で２次抗体反応を室温で１時間行った。
Donkey anti-rabbit Cy-3, Jackson, 711-165-152, 1:200, 1.00μL/well
DAPI, 1:1000, 0.20μL/well
ブロッキング溶液（10％NDS/PBST）, 0.20mL/well
　その後、ＰＢＳで２回洗浄後、マウント剤を滴下し、蛍光顕微鏡で観察した。
　結果を図２に示す。凍結保存後のスフェロイドにおいても凍結前と同様に細胞の境界にＺＯ－１の発現が確認された。以上の結果より、凍結保存後の角膜内皮代替細胞が凍結保存後もそのバリア機能を維持していることが確認された。

実施例２：移植用基材での希釈による効果の検証
　実施例１でスフェロイド化した角膜内皮代替細胞の凍結保存が可能であり、解凍後も角膜内皮機能を維持していることが確認された。しかしながら、凍結保存には、凍結保存液を使用している。その凍結保存液には、凍結保護剤としてＤＭＳＯが含まれているため、前房内投与前に洗浄が必要となる。本実施例では、解凍後に洗浄操作等を必要としない方法を検討した。
　洗浄ではなく移植用基材を用いて希釈することにより、凍結保存液の影響を受けず角膜内皮代替細胞の機能を維持するかを検証するため、タイトジャンクションの形成能を指標に実施例１と同様にしてバリア機能を評価した。その結果、移植用基材で５倍以上希釈することにより、角膜内皮機能を維持した状態で角膜内皮代替細胞が得られることがわかった。さらに動物試験を実施し、前房内へ安全に投与可能であることを確認する。

試験例１：スパイク試験（未分化細胞がどの程度残っていてもよいかの予備試験）
（方法）
　本発明の角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物中に残っていても良い未分化細胞の割合（「未分化細胞残存率」とも称する）の許容範囲を定めるため、ｉＰＳ細胞スパイク試験を下記の方法で実施した。
方法：ヒト線維芽細胞に未分化ｉＰＳ細胞株Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４（継代回数Ｐ＝２０）を下記の個数で混合し、ｉＰＳ細胞用培地ＡＫ０３ＮにＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）１０μＭを含んだ培地と混合し、この懸濁液をマトリゲルと１：１混合して、ヌードラット眼前房内に１×１０^６細胞／匹で移植した。なお、栄養細胞としてのヒト線維芽細胞、ｉＰＳ細胞用培地、及びマトリゲルとともに移植することで、混合された未分化ｉＰＳ細胞の造腫瘍性を増幅させた。これにより、より厳しく安全性の高い閾値設定を求めた。
未分化Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４細胞移植数（スパイク率）
１×１０^６　個（１００％）
１×１０^４　個（１％）
１×１０^３　個（０．１％）
１×１０^２　個（０．０１％）
（判定基準）
観察期間中；
　以下の２つの項目を共に満たした場合に「肉眼的造腫瘍性あり」と判定し、その個体について安楽死後、移植眼を摘出、病理組織診断にて確定診断を行った。
ｉ．明らかな左右差をもって、移植眼が腫大化している。
ｉｉ．移植眼の前房内が固形組織で充満している。
観察期間終了後；
　全個体を安楽死後、移植眼を摘出、ＨＥ染色を用いた病理組織診断を行った。
（結果）
　判定基準ｉ、ｉｉに基づき、病理組織診断で前房内の奇形種形成が確認されたものを「死亡」とみなした。スパイク率による代表的な奇形種の組織写真を図４、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を図５に示す。
　Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４未分化ｉＰＳ細胞スパイク率１００％（即ち、未分化ｉＰＳ細胞のみ）群は９週までに生存率０％であった。未分化ｉＰＳ細胞スパイク率１％群は１６週までで生存率１６．７％であった。
　一方、スパイク率０．１％、０．０１％群では最終的な病理診断でも奇形種形成は確認されなかったため、生存率は１００％であった。

実施例３：ｉＰＳ細胞由来角膜内皮代替細胞のヌードラットにおける単回前房内投与造腫瘍性試験
１．未分化細胞残存率の評価方法
　ヌードラットにおける単回前房内投与造腫瘍性試験に用いるｉＰＳ細胞由来角膜内皮代替細胞（ＣＥＣＳｉ細胞）の未分化細胞残存率を既報（Stem Cell Res. 2021 Aug;55:102497.）に従って評価した。要すれば以下の通り。
　未分化ｉＰＳ細胞株（Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４及びＱＨＪＩ０１ｓ０４）をＢ４Ｇ１２細胞にいくつかの濃度で混合（スパイク）し、ＯＣＴ４の発現レベルを解析した。そのデータを尺度とし、各クローンに残存する未分化ｉＰＳＣ集団を定量化した（図３）。ＣＥＣＳｉ細胞におけるＯＣＴ４の発現量をｑＰＣＲにより測定した（ｄａｙ１１）。スパイクテストのスケールを用いて、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４－あるいはＱＨＪＩ０１ｓ０４－由来のＣＥＣＳｉ細胞における残存未分化細胞が０．１％以下であることを確認した（図３）。
２．造腫瘍性試験
　ｉＰＳ細胞由来角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物（未分化細胞残存率０．１％以下）をヌードラット（F344/NJcl-rnu/rnu；４週齢；日本クレア）に単回前房内（右眼）投与（２．５×１０^４細胞／５μＬ／眼）して、造腫瘍性を調べた。
　移植用基材：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＴＳ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１×）、ＩＧＦ１（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｙ２７６３２（１００μＭ）
　試験群構成は下記の通り。

　スリットランプを用いて前眼部及び中間透光体を検査し、前眼部（右眼）の写真撮影を行った。
＜造腫瘍性の判断基準＞
１）明らかな左右差をもって、右眼が腫大化している．
２）右眼の前房内が固形組織で充満している．
　上記治療用組成物（未分化細胞残存率０．１％以下）をヌードラット前房内に移植し、２６匹を最長２６週まで経過観察した。
　移植後１２週以降より、前眼部写真で４週間以上前房内に細胞が観察されない場合は細胞の消失と判定し、移植後１６週以降で細胞が消失したと判定された場合（図６ａ）、消失判定の翌日に剖検を実施した。
　前房内に細胞が残存している動物は２６週まで観察し、観察期間終了の翌日に剖検を実施した。図６ｂ～ｅに示すように、経過中、前房内の細胞塊の大きさに変化はなく造腫瘍性は認められなかった。

実施例４：スフェロイド化した角膜内皮代替細胞のサイズの検証
１．ｉＰＳ細胞拡大培養（解凍）
　ｉＰＳ細胞用培地ＡＫ０３Ｎ（味の素）にＹ－２７６３２（ｗａｋｏ／０３９－２４５９１）を１０μＭの濃度で添加した（以下ＡＫ０３Ｎ＋Ｙ培地とする）。
　Ｔ１２．５フラスコ（コーニング／３５３１０７）をｉＭａｔｒｉｘ５１１（マトリクソーム／８９２００５）、６μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。ｉＰＳ細胞（ＦＦ－Ｉ０１ｓ０４株）を８．０×１０^３細胞／ｃｍ^２の細胞濃度でＡＫ０３Ｎ＋Ｙ培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液をこのＴ１２．５フラスコへ播種した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで培養を開始し、翌日、Ｙ－２７６３２を含まないＡＫ０３Ｎ培地に培地交換した。中２日を空けたあと２日連続で培地交換を行い、培養６日目に継代を行った。
　Ｔ２５フラスコ（住友ベークライト／ＭＳ－２３０５０）をｉＭａｔｒｉｘ５１１（マトリクソーム／８９２００５）、６μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。ｉＰＳ細胞を２．２×１０^３細胞／ｃｍ^２の細胞濃度でＡＫ０３Ｎ＋Ｙ培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液をこのＴ２５フラスコへ播種した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで培養を開始し、翌日、Ｙ－２７６３２を含まないＡＫ０３Ｎ培地に培地交換した。中２日を空けたあと２日連続で培地交換を行い、培養６日目に継代を行った。

２．フェノールレッド不含の角膜内皮代替細胞誘導用培地の調製
　基礎培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２　ｎｏｎ　ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅｄ（サーモフィッシャー／１１０３９－０２１）を用いた。基礎培地５００ｍＬに、添加物として、ＩＴＳ－Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｖｅｎｔｒｉａ／７７７ＩＴＳ０９１）、ＩＧＦ１（オーファンパシフィック；ソマゾン注／858100075、１ｍｇ／ｍＬ）、ＬＩＦ（富士フイルム和光純薬／125-06661）、ＩＬ－６（ミルテニーバイオテク／170-076-161）、ＩＬ－１１（Ｐｅｐｒｏ　ｔｅｃｈ／AF-200-11）、ＴＮＦα（ミルテニーバイオテク／170-076-178）、水溶性ハイドロコートン注射液（日医工／620002208）を添加した。

３．サイズの検証
　表２に記載の角膜内皮代替細胞誘導用培地を用い、特許文献３に記載の方法と同様にしてｉＰＳ細胞からＣＥＣＳｉ細胞を誘導した。誘導後１４日目にＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブ　セル　テクノロジーズ　＃ＡＴ１０４－１００ＭＬ）を用いて細胞を回収し、細胞保存液バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（日本ジェネティクス　＃ＣＳ－０７－００１）に１×１０^７細胞／ｍＬの細胞濃度で懸濁し－８０℃のディープフリーザーで凍結保存した。凍結保存した角膜内皮代替細胞を解凍し、直後に下記に記載のスフェロイド形成用培地で懸濁した後、大型スフェロイド形成バッグ（東洋製罐、ウェルバック）に１．２×１０^８個の細胞数で播種し、最終的に約４００mLになるようにスフェロイド形成用培地を追加した。これを３７℃インキュベーターで一日培養することにより、ＣＥＣＳｉ細胞のスフェロイド（細胞塊）を形成させた。このＣＥＣＳｉ細胞スフェロイドをCTS Rotea Counterflow Centrifugation System（サーモフィッシャー）で洗浄濃縮した。濃縮した一部をサンプリングし、スフェロイドをＡｃｃｕｍａｘ（イノベーティブ　セル　テクノロジーズ　＃AM１０５）で酵素処理して細胞数を計測した。この計測結果を用いて細胞数が７．５×１０^６細胞／ｍＬになるようにスフェロイドを細胞保存液バンバンカー（登録商標）ｈＲＭに懸濁し、４０μLずつ分注して－７０℃以下で凍結保存した。解凍後、移植用基材の基礎培地として使用しているＤＭＥＭ／Ｆ１２　（サーモフィッシャー／１１３３０－０３２）で５倍希釈し（最終的な細胞濃度は１．５×１０^６細胞／ｍＬ）、ｉＳｐｅｃｔ　ＤＩＡ－１０（島津製作所）を用いて面積相当径（粒子の面積と、粒子と同じ面積の円の直径）が３０μｍ以上のスフェロイドの個数を測定した。結果を図７に示す。解析の結果、スフェロイド径（スフェロイドの面積相当径）は約３０～１５０μｍ、そのうち９０％以上は約３０～９０μｍの範囲の細胞集団だった。スフェロイド径がこの範囲内であれば、治療用組成物としての生着効果を維持できる。

実施例５：スフェロイド化した角膜内皮代替細胞のＤＭＳＯ濃度検討
　表２に記載の角膜内皮代替細胞誘導用培地を用い、特許文献３に記載の方法と同様にしてｉＰＳ細胞からＣＥＣＳｉ細胞を誘導した。誘導後１４日目にＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブ　セル　テクノロジーズ　＃ＡＴ１０４－１００ＭＬ）を用いて細胞を回収し、細胞保存液バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（日本ジェネティクス　＃ＣＳ－０７－００１　１０％ＤＭＳＯ含有）に１×１０^７細胞／ｍＬの細胞濃度で懸濁し－８０℃のディープフリーザーで凍結保存した。凍結保存した角膜内皮代替細胞を解凍し、直後に下記に記載のスフェロイド形成用培地で懸濁し、大型スフェロイド形成バッグ（東洋製罐，ウェルバッグ）上に１．２×１０^８細胞／バッグの細胞数で播種した。これを３７℃インキュベーターで一日培養することにより、ＣＥＣＳｉ細胞のスフェロイドを形成させた。スフェロイド形成バッグよりスフェロイド化したＣＥＣＳｉ細胞を回収洗浄後、細胞保存液バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（日本ジェネティクス　＃ＣＳ－０７－００１　１０％ＤＭＳＯ含有）を用いて、７．５×１０^６細胞／ｍＬの細胞濃度に調製する。調製したスフェロイド懸濁液を一次容器に３×１０^５細胞／４０μＬの細胞濃度で分注し、－７０℃以下で凍結保存する。

＜スフェロイド形成培地の調製＞
　基礎培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２　（サーモフィッシャー／１１３３０－０３２）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２　ｎｏ　ｐｈｅｏｌ　ｒｅｄ（サーモフィッシャー／２１０４１－０２５）を用いた。基礎培地４０ｍＬに、添加物として、ＩＴＳ－Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｖｅｎｔｒｉａ／７７７ＩＴＳ０９１）、Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬／０３９－２４５９１）、ＩＧＦ１（オーファンパシフィック；ソマゾン注／858100075、１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。

　凍結保存後のＣＥＣＳｉ細胞のスフェロイドを各ＤＭＳＯ濃度（１００％，５０％，２５％，１０％，５％，２％，１％，０％）の移植用基材を用いて、４８ウェルプレート（ｉＭａｔｒｉｘ５１１ＭＧコート済み）に播種し、細胞をプレートに接着させた。２４時間後、ウェル上のスフェロイドを、培地を除去し氷冷した４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＤＰＢＳで２回ウェルを洗ったのち、ブロッキング溶液（Ｎｏｒｍａｌ　Ｄｏｎｋｅｙ　Ｓｅｒｕｍを１０％含むＰＢＳＴ（１０％ＮＤＳ／ＰＢＳＴ））を添加し３０分間ブロッキングを行った。その後、下記の抗体量で１次抗体反応を室温で１時間行った。
・Rabbit anti human ZO-1;Invitrogen, 40-2200, 1:500, 0.5μL/well
・Mouse anti human Na,K-ATPaseα1; Novus, NB300-146, 1:500, 0.5μL/well
・ブロッキング溶液（10％NDS/PBST）, 0.25mL/well
　次に、ウェルをＤＰＢＳで２回洗ったのち、下記の抗体量で２次抗体反応を室温で１時間行った。
・Donkey anti-rabbit Cy-3, Jackson, 711-165-152, 1:200, 1.25μL/well
・Donkey anti-mouse Alexa flour 488, Invitrogen, A21202, 1.67μL/well
・DAPI, 1:1000, 0.25μL/well
・ブロッキング溶液（10％NDS/PBST）, 0.25 mL/well
　その後、ＰＢＳで２回洗浄後、マウント剤を添加し、蛍光顕微鏡で観察した。移植の際のＤＭＳＯ濃度が５％以下であれば、生着能とタイトジャンクション形成能があることを確認できた。

試験例２：ＦＣＭを用いたＣＥＣＳｉ細胞表面マーカーのスクリーニング
　Human Cell Surface Marker Screening Panel（Lyoplate）を用いて、ＣＥＣＳｉ細胞における細胞表面抗原の発現をフローサイトメーター（BD Biosciences、BD LSRFortessa^TM X-20）で解析し、スクリーニングを実施した。データ解析はＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアｖｅｒ．８．０．１（ベクトンディッキンソン）を使用した。
　ＣＥＣＳｉ細胞は、３ロット用意し（Lot.2020F1, Lot.2020G01, Lot.2020I24）、それぞれ所定の抗体反応を行い、ＦＣＭ測定直前に７－ＡＡＤ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　＃５５９９２５）を適量添加して細胞を染色した。ＡＦ６４７（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７）が８０％以上検出されたものを強陽性）（◎）、１０％以上８０％未満で検出されたものを陽性（○）、５％以上１０％未満で検出されたものを弱陽性とした。
　その結果、ＣＥＣＳｉ細胞に特徴的な細胞表面マーカーとしてＣＤ２４を見出した。

試験例３：Ｂ２Ｍ発現量比較
　ＤＮＡマイクロアレイによる、海外ドナー研究用角膜から採取した本物のヒト角膜内皮細胞、ｉＰＳ細胞（Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４）、ＣＥＣＳｉ細胞を用い、アジレントテクノロジー社製ＤＮＡマイクロアレイ解析（SurePrint G3 Human GE マイクロアレイ 8x60K Ver. 3.0）を行い、遺伝子プロファイルを網羅的に解析し、その結果の中から、Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）を構成する因子の一つであるｂｅｔａ－２　ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｂ２Ｍ）の発現量を比較した。ｉＰＳ細胞およびＣＥＣＳｉ細胞のＢ２Ｍ発現量は、ヒト角膜内皮細胞と比較し、相対的に低いことが示された（図３）。よって、他家移植の際、ＣＥＣＳｉ細胞はヒト角膜内皮細胞よりも拒絶反応を起こしにくい特徴を有する。

実施例６：フェノールレッドのスフェロイド形成への影響の検証
　スフェロイド形成培地を充填した中型スフェロイド形成バッグ（東洋製罐，ウェルバッグ、容量２０ｍL）上に２．５×１０^６細胞／バッグの細胞数で播種した。これを３７℃インキュベーターで一日培養することにより、ＣＥＣＳｉ細胞のスフェロイドを形成させた。このＣＥＣＳｉ細胞スフェロイドを１５ｍＬ遠心管（住友ベークライト　＃ＭＳ－９０１５０）に集め、遠心分離（条件：２００ｇ，５ｍｉｎ，２５℃）による回収後に顕微鏡による観察（図９）と全生細胞数（表５）を測定した。その結果、基礎培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２　ｎｏ　ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅｄを基礎培地としたスフェロイド形成培地により、スフェロイド形成させた方がスフェロイド生成数、全生細胞数ともに多かった。フェノールレッドを含まない培地を使用するか、またはフェノールレッドを取り除く工程を追加することでスフェロイドを形成しやすくすることができる。

　本発明によれば、凍結保存可能で、解凍による細胞へのダメージがなく、さらに、解凍後の細胞に対し洗浄や遠心分離等の追加のプロセスを経ることなくそのまま患者に投与可能な治療用組成物、特に移植治療用組成物の提供が可能になる。本発明の治療用組成物は、全世界に、角膜移植適応症例の約５０％を占めているという水疱性角膜症における角膜内皮代替細胞の移植に有用である。

　本出願は、米国で出願された米国仮特許出願第６３／２１９，０８６（出願日：２０２１年７月７日）及び米国仮特許出願第６３／３２０，８４６（出願日：２０２２年３月１７日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

　ＣＤ２４陽性表現型を有する角膜内皮代替細胞、及び所望によりフェノールフタレイン誘導体をさらに含む、治療用組成物。
　さらに、凍結保護剤を含む、請求項１記載の組成物。
　凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項２記載の組成物。
　組成物中のＤＭＳＯ濃度が１～１０％である、請求項３記載の組成物。
　フェノールフタレイン誘導体が、フェノールスルホンフタレイン（フェノールレッド）、フェノールフタレイン、ブロモフェノールブルー、イソバレリルフェノールフタレイン、アセチルフェノールフタレイン、フェノールフタレインジブチレート、フェノールフタレインジホスフェート、フェノールフタレインジスルフェート、フェノールフタレイングルクロン酸、フェノールフタレインモノ－β－グルコシドウロン酸、フェノールフタレインモノ－β－グルクロン酸、フェノールフタレインモノ－ホスフェート、およびクレゾールレッドからなる群より選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
　フェノールフタレイン誘導体が、フェノールレッドである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
　組成物中のフェノールレッド濃度が１～２０ｍｇ／Ｌである、請求項６記載の組成物。
　組成物中の細胞の濃度が０．５～１０×１０^６細胞／ｍＬである、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
　細胞のスフェロイド懸濁液の剤形である、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
　組成物中に含まれる細胞集団が、面積相当径が３０μｍ以上のスフェロイドを含み、当該スフェロイドのうち５０％以上が面積相当径３０～９０μｍである、請求項９記載の組成物。
　角膜内皮代替細胞が幹細胞由来である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
　幹細胞が多能性幹細胞である、請求項１１記載の組成物。
　多能性幹細胞がｉＰＳ細胞（遺伝子編集あるいは遺伝子導入により追加機能を付与した細胞を含む）由来である、請求項１２記載の組成物。
　ヒト角膜内皮細胞または培養内皮細胞よりもＢ２Ｍ発現量が低い請求項１３記載の組成物。
　移植用である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
　前房内への移植用である、請求項１５記載の組成物。
　凍結保護剤の存在下、－２０℃以下で凍結された角膜内皮代替細胞の細胞懸濁液あるいは細胞スフェロイド懸濁液にフェノールフタレイン誘導体を含む移植用基材を添加することを含む、治療用組成物の製造方法。
　該角膜内皮代替細胞がＣＤ２４陽性表現型を有する、請求項１７記載の方法。
　幹細胞由来の角膜内皮代替細胞を含有する治療用組成物であって、未分化細胞残存率が１％未満であることを特徴とする組成物。
　該角膜内皮代替細胞がＣＤ２４陽性表現型を有する、請求項１９記載の組成物。
　未分化細胞残存率が０．１％以下である、請求項１９又は２０に記載の組成物。
　幹細胞が多能性幹細胞である、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物。
　多能性幹細胞がｉＰＳ細胞（遺伝子編集あるいは遺伝子導入により追加機能を付与した細胞を含む）由来である、請求項２２記載の組成物。
　ヒト角膜内皮細胞または培養内皮細胞よりもＢ２Ｍ発現量が低い請求項１９～２３のいずれか１項に記載の組成物。
　未分化細胞残存率が未分化細胞マーカーの発現プロファイルによって評価される、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の組成物。
　移植用である、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の組成物。
　前房内への移植用である、請求項２６記載の組成物。