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WO2023282293A1 - ペプチド、及び組成物 - Google Patents

ペプチド、及び組成物 Download PDF

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WO2023282293A1
WO2023282293A1 PCT/JP2022/026856 JP2022026856W WO2023282293A1 WO 2023282293 A1 WO2023282293 A1 WO 2023282293A1 JP 2022026856 W JP2022026856 W JP 2022026856W WO 2023282293 A1 WO2023282293 A1 WO 2023282293A1
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WO
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amino acid
seq
peptide
acid sequence
leu
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PCT/JP2022/026856
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French (fr)
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雄介 高橋
昌克 渡邉
基岐 岡本
美加子 林
慧 蟹江
竜司 加藤
裕司 成田
藍歌 緒方
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Tokai National Higher Education and Research System NUC
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Tokai National Higher Education and Research System NUC
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to peptides and compositions that promote dentin formation.
  • DMCs Dentin Matrix Components
  • DMCs degradation products produced by degradation by Matrix Metalloproteinase (MMP) 20 activate migration, differentiation, and mineralization of pulp cells in vitro. has been reported.
  • MMP Matrix Metalloproteinase
  • Non-Patent Document 1 S100-A7 and S100-A8 are believed to promote wound healing of the dentin-pulp complex.
  • An object of the present invention is to provide a peptide or composition capable of promoting wound healing of the dentin-pulp complex.
  • amino acid sequence consisting of Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln SEQ ID NO: 28
  • amino acid sequence consisting of Asn-Thr-Asp-Gly-Ala-Val-Asn-Phe-Gln SEQ ID NO: 32
  • amino acid sequence consisting of Glu-Leu-Val-Arg-Lys-Asp-Leu-Gln-Asn SEQ ID NO: 47
  • amino acid sequence consisting of Asn-Ala-Asp-Lys-Gln-Leu-Ser-Phe-Glu SEQ ID NO: 51
  • An amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are substituted or deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 47 or SEQ ID NO: 51; or SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 32 , an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues are inserted into the amino acid
  • the peptide is Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln (SEQ ID NO: 28), Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr (SEQ ID NO: 100) or Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr-Ile (SEQ ID NO: 100) 101), the peptide according to Item 1, having an amino acid sequence consisting of Item 3.
  • Item 3. A composition comprising the peptide of Item 1 or Item 2. Section 4. 4. The composition of paragraph 3, wherein the composition is used to promote dentin formation.
  • the composition according to Item 3 or 4 which is used for filling dental cavities or promoting dental pulp wound healing.
  • A is a 3D constructed image obtained by micro-CT image analysis of a rat molar sample subjected to a direct pulp capping experiment using S100-A7 and a sample subjected to a direct pulp capping experiment using S100-A7 reacted with MMP20. Planar images of partial (a, e) and sagittal (b, f), frontal (C, g), and horizontal (d, h) slices are shown. The third dentine is indicated by a dashed line. B shows the results of volume quantification of the third dentin (Student's t-test, p > 0.05).
  • A shows an H-E staining image of a rat molar sample subjected to a direct pulp capping experiment using S100-A7.
  • B shows a magnified image of the boxed area in A.
  • C shows an H-E stained image of a sample subjected to a direct pulp capping experiment using S100-A7 reacted with MMP20.
  • D shows a magnified image of the boxed area in C.
  • the dotted line indicates the boundary between the tertiary dentin and the primary dentin.
  • Symbol P indicates dental pulp
  • symbol D indicates dentin
  • symbol TD indicates tertiary dentin.
  • B shows the volume of tertiary dentin formed after pulp capping.
  • 4 shows H-E staining images of representative samples 4 weeks after straight encapsulation experiments using peptides derived from the Protein S100 family.
  • A is an H-E staining image when No. 28 peptide was used.
  • B is an H-E staining image when No. 47 peptide was used.
  • C is an H-E staining image when No. 32 peptide was used.
  • D is an H-E staining image when No. 51 peptide was used.
  • E is an H-E stained image using S100-A8.
  • F is an H-E stained image using S100-A9.
  • G is an H-E stained image using PBS.
  • the dotted line indicates the boundary between the tertiary dentin and the strict dentin.
  • the symbol P indicates the dental pulp
  • the symbol D the dentin
  • the symbol TD the tertiary dentin
  • the symbol C the experimentally formed cavity.
  • characteristic Indicates protein As a result of LC-MS/MS analysis of protein S100-A8 family-derived peptide (No.28 peptide) or protein expressed when S100-A8 was allowed to act on hDPSCs, characteristic Indicates protein.
  • A indicates a cell membrane-derived protein.
  • B indicates cytoplasmic proteins. Quantitative value indicates the numerical value (a.u.) measured for each sample.
  • Peptides Certain embodiments of the present invention relate to peptides. Peptides are derived from Protein S100-A8 [UniProtKB - P05109 (S10A8_HUMAN)] or Protein S100-A9 [UniProtKB - P06702 (S10A9_HUMAN)].
  • the Protein S100 family to which Propteins S100-A7, S100-A8 and S100-A9 belong, is a group of low-molecular-weight proteins with a molecular weight of about 8-14 kDa that are expressed only in vertebrates.
  • the Protein S100 family exists in cells and functions by binding to nucleic acids and transcription factors. It may be released.
  • amino acid sequences that make up the peptide are written from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • description and physical properties of the amino acid sequence are in accordance with Table 1 below.
  • Amino acids include both natural amino acids and artificial amino acids.
  • residue of various amino acids refers to a constituent unit of an amino acid that constitutes a peptide. represents a group from which —OH is removed. Also, in this specification, “having” can include both concepts of "including” and “consisting of”.
  • peptides are known. For example, it can be synthesized by a tert-butoxycarbonyl group (Boc) solid-phase synthesis method, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc) solid-phase synthesis method, or the like.
  • Boc tert-butoxycarbonyl group
  • Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group
  • Peptides may also include those having a carboxyl group (--COOH), carboxylate ( --COO- ), or ester (--COOR) at the C-terminus.
  • the peptide has an amino acid sequence consisting of Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln (SEQ ID NO: 28), Asn-Thr-Asp-Gly-Ala-Val-Asn-Phe-Gln (SEQ ID NO: 32), an amino acid sequence consisting of Glu-Leu-Val-Arg-Lys-Asp-Leu-Gln-Asn (SEQ ID NO: 47), Asn-Ala-Asp-Lys-Gln-Leu-Ser-Phe- It contains an amino acid sequence consisting of Glu (SEQ ID NO: 51).
  • the length of the peptide is about 9 to 15 amino acid residues, preferably about 9 to 13 amino acid residues, more preferably about 9 to 10 amino acid residues.
  • a peptide includes an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues, 1 amino acid residue, or 2 amino acid residues are substituted or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1. Substitution of residues is preferably carried out, for example, between amino acid residues having the same degree of hydrophilicity.
  • the peptide may contain an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acid residues, 1 amino acid residue, or 2 amino acid residues are inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • a substitution, deletion, or insertion of two or three amino acid residues may occur as a continuous amino acid sequence or as a discontinuous amino acid sequence.
  • the peptides are preferably Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln (SEQ ID NO: 28), Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr (sequence No. 100), or a peptide having an amino acid sequence consisting of Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr-Ile (SEQ ID NO: 101).
  • the peptide may have modifications in its main chain or side chain. Modifications here are not limited as long as they do not interfere with the dentinogenic function of the peptide.
  • the modification may be present at at least one site selected from the N-terminus, C-terminus of the main chain, and at least one side chain of the amino acid residues constituting the main chain.
  • Peptides may also adopt a cyclic structure.
  • N-terminal modifications include azide modification, C 1-6 acylation modification such as C 1-6 alkanoyl (acetylation modification, formylation modification, etc.), succinylation modification, Boc modification, Fmoc modification, and biotinylation modification. , myristic modification, palmitoylation modification, stearoylation modification, fluorescent dye modification (TAMRA labeling, FITC labeling, rhodamine labeling, FAM labeling, etc.), pyroglutamylation modification, dansylation modification, methylation modification, and the like.
  • C-terminal modifications include modifications that are generally used as C-terminal modifications of peptides.
  • C-terminal modification includes amidation modification, biotinylation modification, methyl esterification modification, aldehyde modification, N-hydroxyesterification modification, pNA labeling, MCA labeling, ⁇ -naphthylamidation modification and the like.
  • Modification of side chains of amino acid residues constituting the main chain includes polyethylene glycol modification, phosphorylation modification, acetylation modification, methylation modification, fluorescence modification, biotinylation modification, sugar or sugar chain modification, lipid modification, and the like. can be mentioned.
  • the peptide preferably exhibits the function of promoting dentin formation in vivo. Also, the peptide preferably forms a denser dentin than when using the S100-A8 recombinant protein.
  • dentin is preferably tertiary dentin.
  • Whether or not the formation of dentin is promoted, or the quality of the formed dentin can be determined, for example, by microscopic examination using H-E stained specimens of teeth subjected to direct pulp capping experiments shown in Examples described later. It can be evaluated by observation and image interpretation using micro-CT.
  • the formed third dentin can be scored and quantified.
  • the third dentin formed only in the area of 1/3 or less of the exposed pulp was graded 0, the 1/3 to 2/3 of the exposed pulp was graded 1, and the exposed pulp was graded 1. More than 2/3 can be scored as Grade 2, and grade 3 can be scored if tertiary dentine formation that completely covers the pulpal area is observed.
  • composition is the same as in 1. above. and a pharmaceutically acceptable carrier and support.
  • the support include Mineral Trioxide Aggregate (MTA), polymer compound and hydroxyapatite-containing paste, gelatin, and collagen.
  • MTA Mineral Trioxide Aggregate
  • the amount of peptide added to the support is about 10 mg to 100 mg per 1 g of the support.
  • the composition can contain the peptide in an amount of about 0.1 to 100 mg/mm 3 as the amount of peptide used per unit volume.
  • the composition can be used to promote dentin formation.
  • the composition can be used as a composition for promoting dental pulp wound healing.
  • the composition can also be used as a dental cavity filling composition.
  • Example 1 Investigation of the effect of MMP-20 on S100-A7 in the third dentin formation process Whether the full length of S100-A7 is necessary in the pulpal wound healing process, and whether S100-A7 degraded by MMP-20 In order to evaluate whether the decomposition products of A7 are necessary, the following experiments were performed.
  • a round bur (#1, Dentsply Maillefer, Switzerland) attached to an electric engine (VIVAMATE G5 (trademark), NSK, Tochigi) was used for the left and right maxillary first molars to expose the mesial pulp angle from the occlusal surface.
  • An experimental cavity was formed.
  • the exposed pulp surface was washed with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical, Tokyo), and after confirming hemostasis, Dulbecco-phosphate-buffered saline (PBS) containing S100-A7 (PROSPEC, Israel) at a concentration of 1 ⁇ g/ml was applied.
  • Example 2 Search for Functional Peptides Derived from the Protein S100 Family Although human-derived Protein S100 was used for direct pulp capping experiments on rats, it promoted healing of dental pulp wounds. It is considered highly likely that the conserved protein S100-derived amino acid sequence will exert its function. Therefore, the following experiments were carried out for the purpose of searching for functional sequences that are conserved among the Protein S100 family.
  • S100-A7, S100-A8, and S100-A9 which are known proteins, are used, and for S100-A7, Polar bear, Brandt's bat, Chinese tree shrew, Black flying fox, David's myotis, Human, Bovine, Eight species of Horse, S100-A8 of four species of Human, Bovine, Mouse and Rat, and S100-A9 of five mammalian species of Human, Bovine, Rabbit, Mouse and Rat.
  • a sequence alignment was performed to search for The amino acid sequences used in the comparative study were those registered in Uniprot (https://www.uniprot.org/), a database that comprehensively collects information on protein amino acid sequences, and multiple sequence alignments were used. It was performed using the alignment program CLUSTAL-W (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  • a peptide array method was performed based on the report by Kanie et al. [Materials 2016, 9(9):17]. Using a peptide synthesizer (ASP222, Intavis, Germany), peptides were synthesized on a cellulose membrane by the Fmoc solid-phase synthesis method, and placed in a 96-well plate.
  • ASP222 peptide synthesizer
  • hDPSCs Human dental pulp stem cells
  • mineralization induction medium 50 ⁇ g/ml ascorbic acid (Sigma Aldrich, USA), 10 mM ⁇ -glycerophosphate ( Sigma Aldrich), 10% FBS-containing Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification ( ⁇ -MEM)
  • ⁇ -MEM FBS-containing Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification
  • Bone morphogenetic protein (BMP)-derived peptide (amino acid sequence TLVNSVNSK: SEQ ID NO: 60, also referred to as "No. 60 peptide"), which also promotes dental pulp wound healing, was used.
  • FIG. 6 shows the results of quantifying the calcification ability of hDPSCs in the presence of 58 types of candidate peptides.
  • the top 10 peptides that induce mineralization of hDPSCs are indicated by "*”, and the results of collating these 10 peptides with the results of the peptide-selected regions of sequence alignment are shown in FIG.
  • FIG. 7 it was found that many of the peptides that promoted calcification of hDPSCs overlapped.
  • a peptide derived from S100-A8 (amino acid sequence KLLETECPQ: SEQ ID NO: 28, also referred to as “No.28 peptide") and a peptide derived from S100-A9 (amino acid sequence ELVRKDLQN: SEQ ID NO: 47, "No. 47 peptide")
  • a peptide derived from S100-A8 (amino acid sequence NTDGAVNFQ: SEQ ID NO: 32, also referred to as "No. 32 peptide”
  • a peptide derived from S100-A9 from the region in Fig. 7-c (Amino acid sequence NADKQLSFE: SEQ ID NO: 51, also referred to as "No. 51 peptide”) were considered to be highly likely to be functional sequences, and were verified in subsequent experiments.
  • the same cells were continuously cultured for one day, and then WST-1-assay was performed using the Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara Bio).
  • a WST-1 reagent was added to the culture medium, and the mixture was allowed to stand at 37°C under a 5% CO 2 gas phase for 30 minutes. Subsequently, after shaking for 1 minute at room temperature, the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (ARVO MX).
  • ARVO MX microplate reader
  • PBS was added to the culture solution, and the number of samples was 6 for each condition.
  • the same micro-CT images were analyzed in the same manner as in 2) of Materials and Methods, and the volume of the formed third dentin was evaluated. Also, the above I. 1. HE staining was performed in the same manner as in 3) of Materials and Methods, and histopathological evaluation was performed for formation of the third dentin. The number of samples was 8 for each condition.
  • Fig. 10 shows representative results of H-E staining of samples used for microCT analysis.
  • the specimens of No. 28 peptide, No. 32 peptide, and No. 51 peptide in which complete tertiary dentin formation was observed, there was a slight defect in the tertiary dentin, but the pulp side and the coronal side communicated. No significant defects were observed, and complete closure of the exposed pulp surface by the formed third dentin was confirmed.
  • the samples of S100-A8 and S100-A9 no defects such as communication between the coronal side and the pulpal side were observed, and complete closure of the exposed pulp surface by the formed third dentin was confirmed.
  • the tertiary dentine showed a sparse structure compared to the sample with sparse (Fig. 10).
  • Example 4 Analysis of the wound healing mechanism of protein S100 family-derived peptides
  • LC-MS/MS Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
  • hDPSCs were cultured for 7 days, collected with a scraper, added with Buffer A of the same kit, and allowed to stand on ice for 10 minutes. Then, it was transferred to a microtube with a filter cartridge attached to the kit, and centrifuged at 14,000 rpm for 30 seconds. After discarding the cartridge and stirring for 10 seconds, centrifugation was performed at 3000 rpm for 1 minute to collect the supernatant. Next, the collected supernatant was centrifuged at 14,000 rpm for 30 minutes to extract cytoplasmic proteins in the supernatant and cell membrane proteins in the pellet. As a control, hDPSCs cultured in mineralization induction medium supplemented with PBS were used.
  • GO Gene Ontology
  • GO Term consists of a hierarchical structure, with general functional representations at the top level and more detailed functional representations at the bottom level. For example, there are three categories at the top: "Molecular function”, “Biological process”, and "Cellular component”.
  • Flotillin-1 FLOT1
  • Very-long-chain (3R)-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase 3KCR1
  • Protein LYRIC LYRIC
  • Gap junction alpha-1 protein GJA1
  • Protein S100-A13 S100-A13
  • NOL3 Nucleolar protein 3
  • mitogen-activated protein kinase 1 MAP2K1
  • CDH2 cadherin-2
  • NRAS GTPase Nras
  • MAP1 mitogen-activated protein kinase 1
  • CRK cytoplasmic proteins Adapter molecule crk
  • PSMB7 proteasome subunit beta type-7
  • No.28 peptide may promote calcification of DPSCs by suppressing the expression of proteins related to the MAPK signaling pathway and promoting the expression of proteins related to the NF ⁇ B signaling pathway.
  • NF ⁇ B signaling pathway generally regulates immunity, inflammation, cell proliferation, and cell differentiation.
  • NF ⁇ B signaling pathway was activated by the action of H 2 O 2 on dental pulp cells overexpressing Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR ⁇ ).
  • PPAR ⁇ Peroxisome proliferator-activated receptor gamma

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Abstract

象牙質－歯髄複合体の創傷の治癒を促進することができるペプチド、又は組成物を提供することを課題とする。　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln（配列番号２８）からなるアミノ酸配列；Asn-Thr-Asp-Gly-Ala-Val-Asn-Phe-Gln（配列番号３２）からなるアミノ酸配列；Glu-Leu-Val-Arg-Lys-Asp-Leu-Gln-Asn（配列番号４７）からなるアミノ酸配列；Asn-Ala-Asp-Lys-Gln-Leu-Ser-Phe-Glu（配列番号５１）からなるアミノ酸配列；前記配列番号２８、配列番号３２、配列番号４７又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列において１アミノ酸残基から３アミノ酸残基が置換又は欠失したアミノ酸配列；又は前記配列番号２８、配列番号３２、配列番号４７又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列に１アミノ酸残基から３アミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、を含む、ペプチドであって、前記ペプチドの長さが９アミノ酸残基から１５アミノ酸残基である、ペプチド、により課題を解決する。

Description

ペプチド、及び組成物
　本発明は、象牙質の形成を促進するペプチド、及び組成物に関する。
　象牙質の約20%を占める有機成分である象牙質基質成分 (Dentin Matrix Components: DMCs) は、原生象牙質の発生過程において象牙芽細胞から分泌されたタンパク質である。
　これまでの歯髄創傷治癒メカニズムを検討した一連の先行研究において、Matrix Metalloproteinase (MMP) 20で分解を受けて生じたDMCs分解産物がin vitroにおいて歯髄細胞の遊走・分化・石灰化能を活性化することが報告されている。また、DMCs分解産物がin vivoにおけるラットを用いた直接覆髄実験にて露髄面を完全に覆う第三象牙質を誘導し、その第三象牙質は細管構造も有していたことからMMP20によって生じるDMCs分解産物が象牙質－歯髄複合体の創傷治癒を促進すると考えられている。さらに、MMP20の作用により生じたDMCs分解産物をプロテオーム解析することで同定されたProtein S100-A7 (S100-A7) 、Protein S100-A8 (S100-A8) が、in vitroにおいて歯髄細胞の増殖・分化・石灰化能を活性化すること、in vivoにおけるラットを用いた直接覆髄実験にて露髄面を完全に覆う第三象牙質を誘導することが報告され（非特許文献１）、S100-A7、S100-A8が象牙質－歯髄複合体の創傷治癒を促進すると考えられている。
Komichi S, Takahashi Y, Okamoto M, Ali M, Watanabe M, Huang HL, Nakai T, Cooper P, Hayashi M: Protein S100-A7 derived from digested dentin is a critical molecule for dentin pulp regeneration. Cells 2019, 8(9):19.
　本発明は、象牙質－歯髄複合体の創傷の治癒を促進することができるペプチド、又は組成物を提供することを課題とする。
　本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、Protein S100ファミリーの S100-A8及びA9由来のペプチドに、象牙質の形成を促進する作用があることを見出した。
　本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
項１．
　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln（配列番号２８）からなるアミノ酸配列；
　Asn-Thr-Asp-Gly-Ala-Val-Asn-Phe-Gln（配列番号３２）からなるアミノ酸配列；
　Glu-Leu-Val-Arg-Lys-Asp-Leu-Gln-Asn（配列番号４７）からなるアミノ酸配列；
　Asn-Ala-Asp-Lys-Gln-Leu-Ser-Phe-Glu（配列番号５１）からなるアミノ酸配列；
　前記配列番号２８、配列番号３２、配列番号４７又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列において１アミノ酸残基から３アミノ酸残基が置換又は欠失したアミノ酸配列；又は　前記配列番号２８、配列番号３２、配列番号４７又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列に１アミノ酸残基から３アミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
を含む、ペプチドであって、前記ペプチドの長さが９アミノ酸残基から１５アミノ酸残基である、ペプチド。
項２．
　前記ペプチドが、
　　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln（配列番号２８）、
　　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr（配列番号１００）、又は
　　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr-Ile（配列番号１０１）、からなるアミノ酸配列を有する、項１に記載のペプチド。
項３．
　項１又は項２に記載のペプチドを含む、組成物。
項４．
　前記組成物が、象牙質形成を促進するために使用される、項３に記載の組成物。
項５．
　前記組成物が、歯窩洞充填用又は歯髄創傷治癒促進用である、項３又は４に記載の組成物。
　本発明によれば、象牙質－歯髄複合体の創傷の治癒を促進することができるペプチド、又は組成物を提供することができる。
Aは、S100-A7を用いて直接覆髄実験をおこなったラット臼歯試料とMMP20と反応させたS100-A7を用いた直接覆髄実験おこなった試料のマイクロCT画像解析による三次元構築画像の一部(a、e)と矢状断(b、f)、前頭断(C、g)、水平断(d、h)の平面画像を示す。第三象牙質を破線で示す。Bは、第三象牙質の体積定量結果を示す(Student’s t-test, p > 0.05)。 Aは、S100-A7を用いて直接覆髄実験をおこなったラット臼歯試料のH-E染色像を示す。Bは、Aにおいて四角で囲んだ部位の拡大像を示す。Cは、MMP20と反応させたS100-A7を用いて直接覆髄実験をおこなった試料のH-E染色像を示す。Dは、Cにおいて四角で囲んだ部位の拡大像を示す。点線は第三象牙質と原生象牙質の境界を示す。符号Pは歯髄、符号Dは象牙質、符号TDは第三象牙質を示す。 Protein S100ファミリーのアミノ酸配列を対象に実施した配列アライメントの結果を示す。一致しているアミノ酸を「＊」、CLUSTAL-Wにおける相同性スコアが0.5より高い部位（高い相同性を示す部位）は「：」、0.5以下の部位（低い相同性を示す部位）は「．」を、アミノ酸配列下に示す。相同性の高い部位は網掛けで示す。 図３に示すA領域のS100-A7 HUMANを例とした、候補ペプチドのデザインの例を示す。 候補ペプチドの一覧を示す。 58種類の候補ペプチドについて、各ペプチドの存在下におけるhDPSCsの石灰化能を示す。＊は石灰可能が強かった上位10種のペプチドを示す。 図6において＊を付した10種類の配列アライメントをペプチド選出領域の結果と照らし合わせて示す。黒枠は、hDPSCsの石灰化を促進したペプチドの重複領域を示す。S100-A8由来のペプチドを白バーで、S100-A9由来の候補ペプチドを黒バーで配列下部に示す。 Aは、Protein A100ファミリー由来ペプチド (No.28、No.32、No.47、No.51)のhDPSCsに対する細胞毒性を示す。コントロールと比較し有意差がある試料を* で示す（One way ANOVA, Tukey’s test, p<0.05）。Bは、各ペプチドが細胞増殖能に与える影響を示す。 Aは、覆髄後に形成された第三象牙質をスコア化した結果を示す。Bは、覆髄後に形成された第三象牙質の体積を示す。 Protein S100ファミリー由来ペプチドを用いた直性覆随実験後4週における代表的な試料のH-E染色像を示す。Aは、No. 28ペプチドを使用した時のH-E染色像である。Bは、No. 47ペプチドを使用した時のH-E染色像である。Cは、No. 32ペプチドを使用した時のH-E染色像である。Dは、No. 51ペプチドを使用した時のH-E染色像である。Eは、S100-A8を使用した時のH-E染色像である。Fは、S100-A9を使用した時のH-E染色像である。Gは、PBSを使用した時のH-E染色像である。点線は、第三象牙質と厳正象牙質の境界を示す。符号Pは歯髄を示し、符号Dは象牙質を示し、符号TDは第三象牙質を示し、符号Cは実験的に形成した窩洞を示す。 Protein S100-A8ファミリー由来ペプチド (No.28ペプチド)若しくは、 S100-A8をhDPSCsに作用させた際に発現したタンパク質に対して、LC-MS/MS解析をおこなった結果、同定された特徴的なタンパク質を示す。Aは細胞膜由来タンパク質を示す。Bは細胞質タンパク質を示す。quantitative valueは各試料で計測された数値 (a.u.)を示す。
１．ペプチド
　本発明のある実施形態はペプチドに関する。
　ペプチドは、Protein S100-A8［UniProtKB - P05109 (S10A8_HUMAN)］又はProtein S100-A9［UniProtKB - P06702 (S10A9_HUMAN)］に由来する。Proptein S100-A7、S100-A8及びS100-A9が属するProtein S100 ファミリーは、脊椎動物でのみ発現する、分子量が8～14kDa程度の低分子量タンパク質群である。Protein S100ファミリーは細胞内に存在し、核酸や転写因子に結合することで機能するが、Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs、ダメージ関連分子パターン)の一つとして細胞の損傷や細胞死により細胞外に放出される場合もある。
　本明細書において、ペプチドを構成するアミノ酸配列はＮ末端側からＣ末端側に向かって記載するものとする。また、アミノ酸配列の記載及び物性は、下記表１に従うものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　アミノ酸には、天然アミノ酸及び人工アミノ酸のいずれも包含される。
　本明細書において、各種アミノ酸の「残基」とは、ペプチドを構成するアミノ酸の構成単位であり、アミノ酸から、主鎖のアミノ基については水素原子が除かれ、及び／又は主鎖のカルボキシル基については－OHが除かれてなる基を表す。
　また、本明細書において「有する」は、「含む」、及び「からなる」の両方の概念を含み得る。
　ペプチドの合成方法は、公知である。例えば、tert-ブトキシカルボニル基（Boc）固相合成法、または９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）固相合成法等により合成することができる。ペプチドの主鎖の全長が、１００アミノ酸残基を超える場合には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、酵母、又はカイコ等を使用して、リコンビナントペプチドとして合成してもよい。
　ペプチドには、Ｃ末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、又はエステル（－COOR）であるもの、等も包含し得る。
　ペプチドは、Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln（配列番号２８）からなるアミノ酸配列、Asn-Thr-Asp-Gly-Ala-Val-Asn-Phe-Gln（配列番号３２）からなるアミノ酸配列、Glu-Leu-Val-Arg-Lys-Asp-Leu-Gln-Asn（配列番号４７）からなるアミノ酸配列、Asn-Ala-Asp-Lys-Gln-Leu-Ser-Phe-Glu（配列番号５１）からなるアミノ酸配列を含む。
　前記ペプチドの長さは、９アミノ酸残基から１５アミノ酸残基程度、好ましくは９アミノ酸残基から１３アミノ酸残基程度、より好ましくは９アミノ酸残基から１０アミノ酸残基程度である。
　ペプチドは、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列において１アミノ酸残基から３アミノ酸残基、又は、１アミノ酸残基、若しくは２アミノ酸残基が置換又は欠失したアミノ酸配列を含む。残基の置換は、例えば同程度の親水性を有するアミノ酸残基間で行われることが好ましい。
　ペプチドは、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列に１アミノ酸残基から３アミノ酸残基、又は、１アミノ酸残基、若しくは２アミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。
　２アミノ酸残基、又は３アミノ酸残基の置換、欠失、挿入は、連続するアミノ酸配列として起こってもよく、不連続なアミノ酸配列として起こってもよい。
　前記ペプチドとして、好ましくはLys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln（配列番号２８）、Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr（配列番号１００）、又はLys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr-Ile（配列番号１０１）からなるアミノ酸配列を有するペプチドである。
　ペプチドは、主鎖又は側鎖に修飾を有していてもよい。ここで修飾は、ペプチドの象牙質形成機能を阻害しない限り制限されない。修飾は、主鎖のＮ末端、Ｃ末端及び主鎖を構成するアミノ酸残基の少なくとも一つの側鎖から選択される少なくとも一カ所に存在し得る。また、ペプチドは、環状構造をとってもよい。
　Ｎ末端の修飾としては、一般的にペプチドのＮ末端修飾として使用される修飾を挙げることができる。例えば、Ｎ末端の修飾として、アジド化修飾、Ｃ１－６アルカノイルなどのＣ１－６アシル化修飾（アセチル化修飾、ホルミル化修飾等）、スクシニル化修飾、Boc修飾、Fmoc修飾、ビオチン化修飾、ミリスチン化修飾、パルミトイル化修飾、ステアロイル化修飾、蛍光色素修飾（TAMRA標識、FITC標識、ローダミン標識、FAM標識等）、ピログルタミル化修飾、ダンシル化修飾、メチル化修飾等を挙げることができる。
　Ｃ末端の修飾として、一般的にペプチドのＣ末端修飾として使用される修飾を上げることができる。例えば、Ｃ末端の修飾として、アミド化修飾、ビオチン化修飾、メチルエステル化修飾、アルデヒド化修飾、Ｎ－ヒドロキシエステル化修飾、pNA標識、MCA標識、βナフチルアミド化修飾等を挙げることができる。
　主鎖を構成するアミノ酸残基の側鎖の修飾は、ポリエチレングリコール化修飾、リン酸化修飾、アセチル化修飾、メチル化修飾、蛍光修飾、ビオチン化修飾、糖又は糖鎖による修飾、脂質修飾等を挙げることができる。
　ペプチドは、in vivoにおいて、象牙質の形成を促進する機能を示すことが好ましい。また、ペプチドは、S100-A8組換えタンパク質を使用した時よりも密な象牙質を形成することが好ましい。ここで、象牙質とは、好ましくは第三象牙質である。
　象牙質の形成を促進するか否か、又は形成された象牙質の質については、例えば、後述する実施例において示す直接覆髄実験を施行した歯に対し、H-E染色標本を使った鏡検による観察、マイクロCTを使用した画像読影により評価できる。
　H-E染色、又はマイクロCTを使用した象牙質の形成を促進するか否かの評価では、例えば、Clinical Oral Investigations 2018, 22(8):2879-2887.；Journal of Dentistry 2010, 38(10):828-837に記載の方法を利用し、形成された第三象牙質に対してスコアリングを行い数値化することができる。この方法において、露髄部の1/3以下のエリアにのみ第三象牙質が形成されたものをGrade 0、露髄部の1/3~2/3のものをGrade 1、露髄部の2/3以上のものをGrade 2、露髄部を完全に覆う第三象牙質形成を認めるものをGrade 3としてスコアリングすることができる。
２．組成物
　組成物は、上記１．において述べたペプチドと、薬学的に許容される担体、支持体を含む。
　支持体としては、Mineral Trioxide Aggregate (MTA)、高分子化合物とハイドロキシアパタイト含有ペーストやゼラチン、コラーゲン等を挙げることができる。支持体へのペプチドの添加量は、支持体１ｇに対して10 mgから100 mg程度である。
　組成物には、単位体積あたりのペプチドの使用量として、0.1から100 mg／mm3程度となるようにペプチドを含ませることができる。
　組成物は、象牙質形成を促進するために使用され得る。組成物は、歯髄創傷治癒促進用組成物として使用されうる。また、組成物は、歯窩洞充填用組成物として使用することができる。
　以下に実施例を示して本発明についてより詳細に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定して解釈されるものではない。
I．実施例１：第三象牙質形成過程のS100-A7に対してMMP-20が与える影響の検討　歯髄創傷治癒過程においてS100-A7の全長が必要であるのか、MMP-20によって分解されたS100-A7の分解産物が必要であるのかを評価するため、以下の実験を行った。
１．材料及び方法
１）S100-A7及びMMP20と反応させたS100-A7を用いた直接覆髄実験　本研究は大阪大学大学院歯学研究科動物実験委員会の承認下で実施した(承認番号：28-013-0)。
　8週齢雄性Wistar系ラットに全身麻酔としてペントバルビタールナトリウム(ソムノペンチル（商標）, 共立製薬, 東京) (30 mg/kg) の腹腔内注射をおこない、疼痛緩和のためカルプロフェン(Rimadyl（商標），Pfizer, 米国) (3 mg/kg) の投与をおこなった。処置歯にラバーダム防湿をおこない、歯面及び周囲組織をアルコール綿球にて清拭後、窩洞形成をKomichiらの報告[非特許文献１]をもとに以下の方法でおこなった。左右上顎第一臼歯に対して電気エンジン(VIVAMATE G5（商標）, NSK, 栃木) に装着したラウンドバー(#1, Dentsply Maillefer, スイス) を用い、咬合面より近心髄角に露髄するような実験的窩洞を形成した。露髄面を生理食塩水(大塚製薬, 東京) で洗浄し、止血を確認後、S100-A7 (PROSPEC, Israel) を1 μg/mlの濃度で含有したダルベッコ-リン酸緩衝生理食塩水(PBS, ナカライテスク, 京都) 若しくは、同溶液をMMP-20 (フナコシ, 東京) で処理(0.01 μg/mlのMMP-20を添加後37℃にて24時間静置) した溶液を、それぞれ20 μl浸漬させたゼラチンスポンジ(Spongel（商標）, アステラス製薬, 東京) を用いて直接覆髄をおこなった。その後、グラスアイオノマーセメント(Fuji IX（商標）, GC, 東京) にて充填をおこなった。覆髄から4週間経過後に、実験動物をペントバルビタールナトリウムの腹腔内過剰投与により屠殺した後、4 %パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液(ナカライテスク, 京都) にて灌流固定をおこなった。続いて被験歯を含む上顎骨を摘出し軟組織の除去後、以下の方法で評価をおこなった。試料数は各条件につき3とした。
２）マイクロCTによる画像解析
　直接覆髄後の試料について、形成された第三象牙質の定量評価を目的にマイクロCT (R-mCT2（商標）, RIGAKU, 東京) を用いた画像解析をおこなった。被験歯の断層撮影は管電圧90 kV、管電流160 μA、スライス幅5 μmの条件でおこない、撮影により得られたデータに対し、上顎第一臼歯の水平断面をXY平面、矢状断面をYZ平面、前頭断面をZX平面とし、YZ平面にて露髄部直下に認められる不透過像を新生第三象牙質とした。原生象牙質と同等のCT値を第三象牙質抽出の閾値に設定し、2値化画像から新生第三象牙質の面積を計算した。各断面の新生第三象牙質面積を計測し、全てを合計することで新生第三象牙質の体積を算出した。画像解析ソフトウェアはTRI 3D-BON (RATOK, 東京) を使用した。
３）病理組織学的評価
　マイクロCT解析に用いた試料を、4 %パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液にて12時間、4℃にて浸漬固定後、カルキトックス(富士フイルム和光純薬, 大阪) 中にて2日間の低温脱灰をおこなった。脱灰終了後、上昇アルコール系列で脱水、パラフィン包埋をおこない、回転式ミクロトーム(RM 2155, Leica, ドイツ) にて厚さ5 μmの連続切片を作成後、ヘマトキシリン-エオジン(H-E) 染色を行った。第三象牙質の病理組織学的評価は光学顕微鏡(BZ-X700, KEYENCE, 大阪) 下にておこなった。
４）統計学的解析
　マイクロCT撮影後、画像解析にて計測した第三象牙質の体積の比較について、統計学的有意差検定にStudent’s t-testを用いて危険率5 %で評価した。
２．結果
　マイクロCT解析の結果、S100-A7単体若しくはMMP20と反応させたS100-A7を覆髄材として用いた場合の双方において、露髄部を完全に覆う第三象牙質形成が観察された(図1A)。
　形成された第三象牙質の体積を定量・比較した結果、それぞれの試料間で有意差は認められなかった(p>0.05)(図1B) 。
　マイクロCT解析にて露髄面の閉鎖が認められた試料についておこなったH-E染色像から、双方の試料において第三象牙質内に微小な欠損は認めるものの、歯髄側と歯冠側が交通するような大きい欠損は認めず、形成された第三象牙質による露髄面の完全閉鎖が確認された(図2)。
II．実施例２：Protein S100ファミリー由来機能ペプチドの探索
　ヒト由来のProtein S100を用いてラットを対象に直接覆髄実験をおこなったにも関わらず、歯髄創傷治癒を促進したことから、異なる動物種においても保存されているProtein S100由来のアミノ酸配列が機能を発揮する可能性が高いと考えられる。そのため、Protein S100ファミリー間で保存されている機能配列の探索を目的として、以下の実験をおこなった。
１．材料及び方法
１）配列アライメントを用いたProtein S100 ファミリーのアミノ酸配列の相同性の探索　象牙質基質成分 (Dentin Matrix Components: DMCs)においてその存在が報告されており、かつ歯髄創傷治癒への関与が示唆されているタンパク質であるS100-A7、S100-A8、S100-A9の3種類を用い、さらにS100-A7についてはPolar bear、Brandt's bat、Chinese tree shrew、Black flying fox、David's myotis、Human、Bovine、Horseの8種、S100-A8はHuman、Bovine、Mouse、Ratの4種、またS100-A9はHuman、Bovine、Rabbit、Mouse、Ratの5種の哺乳類のアミノ酸配列を対象として相同性の高い領域を検索するため、配列アライメントを実施した。比較検討を実施したアミノ酸配列は、タンパク質のアミノ酸配列に関する情報を網羅的に収集したデータベースであるUniprot (https://www.uniprot.org/) に登録されているものを用い、配列アライメントはマルチプルアライメントプログラムであるCLUSTAL-W (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) を用いて実施した。
２）ペプチドアレイ法を用いた機能ペプチドのスクリーニング
　配列アライメントにて得られたS100-A7、S100-A8及びS100-A9のアミノ酸配列の相同性が高い領域の中から、機能ペプチドのスクリーニング法であるペプチドアレイ法にて用いる候補ペプチドをヒトProtein S100のアミノ酸配列から選出した。ペプチドのアミノ酸残基数の決定にあたり、現在約100種類以上存在するペプチド医薬品の約80％は10残基以内のペプチド医薬品であること、また骨芽細胞上のReceptor Activator of Nuclear factor-Kappa B Ligand (RANKL) に結合して骨形成シグナルを促進することが報告されているW9ペプチドが9残基から構成されていること等の情報から、本研究においても9残基を用いることとした。
　上述の条件にて選出された候補ペプチドの機能についてスクリーニングすることを目的に、Kanieらの報告に基づいてペプチドアレイ法をおこなった[Materials 2016, 9(9):17]。ペプチド合成器(ASP222, Intavis, ドイツ) を用いて、セルロース膜上にFmoc固相合成法にてペプチドを合成し、96 wellプレート内に静置した。同プレートにヒト歯髄幹細胞(hDPSCs, Lonza, スイス) を5,000 cells/well となるように播種し、石灰化誘導培地(50 μg/mlアスコルビン酸(Sigma Aldrich, 米国), 10 mM β-グリセロリン酸(Sigma Aldrich), 10 %FBS含有Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification (α-MEM) ) を用いて37℃、5 %CO2気相下で14日間培養をおこなった。培地の交換は3日毎におこなった。培養開始14日後に培溶液を除去、PBSにて洗浄し、10 %中性緩衝ホルマリン液(富士フイルム和光純薬, 大阪) にて30分間固定した後、石灰化評価セット(PG Research, 東京)を用いてアリザリンレッド溶液で30分間染色をおこない、精製水にて洗浄後、同キットの石灰化結節溶解液を加え10分間撹拌し、色素が溶出した上清を用いて細胞の石灰化能について定量評価をおこなった。評価にはマイクロプレートリーダー(ARVO MX, PerkinElmer, 米国) を用い450 nmにおける吸光度を測定し評価した。試料数は各条件につき9とした。ネガティブコントロールとして石灰化誘導能を持たないことがわかっているランダムペプチド(アミノ酸配列KHHAKVGSA：配列番号59、「No.59 ペプチド」とも称する) 、ポジティブコントロールとして骨形成能を持つことが報告されており、歯髄創傷治癒も促進するBone morphogenetic protein (BMP) 由来ペプチド(アミノ酸配列TLVNSVNSK：配列番号60、「No.60 ペプチド」とも称する)を用いた。
２．結果
１）配列アライメントを用いたProtein S100 ファミリーのアミノ酸配列の相同性の探索　S100-A7、S100-A8、S100-A9の3種類のタンパク質について、複数の哺乳類のアミノ酸配列を対象として、相同性の高い領域を検索するため配列アライメントを実施した。その結果、網掛けで示す領域に相同性の高い部分が3箇所認められ(図3のA、B、C)、これらの領域から、次におこなうペプチドアレイ法に用いる候補ペプチドを選出した。候補ペプチドの選出は、図4に示すように、配列アライメント(図3)において、相同性が高かった部位におけるヒトProtein S100のアミノ酸配列のN末から9残基を選び、候補ペプチドとした。その候補ペプチドから3残基ずつずらしたものも同様に候補ペプチドとし、S100-A7、S100-A8、及びS100-A9について相同性が高かったA、B、Cの領域から計58種類の候補ペプチドを選出した(図５)。
２）ペプチドアレイ法を用いた機能ペプチドのスクリーニング
　58種類の候補ペプチド存在下におけるhDPSCsの石灰化能の定量結果を図6に示す。図6の中で、hDPSCsの石灰化を誘導する上位10種のペプチドを「＊」で示し、これら10種のペプチドを配列アライメントのペプチド選出領域の結果と照合した結果を図７に示す。図7中の2箇所の黒枠で囲んだ領域において、hDPSCsの石灰化促進を示したペプチドが多く重複しているのが認められた。その重複した領域から、図7b中の領域からS100-A8由来のペプチド(アミノ酸配列KLLETECPQ：配列番号28、「No.28ペプチド」とも称する) とS100-A9由来のペプチド(アミノ酸配列ELVRKDLQN：配列番号47、「No.47ペプチド」) を、図7-c中の領域からS100-A8由来のペプチド (アミノ酸配列NTDGAVNFQ：配列番号32、「No. 32ペプチド」とも称する) とS100-A9由来のペプチド(アミノ酸配列NADKQLSFE：配列番号51、「No. 51ペプチド」とも称する) の4種類のペプチドが機能的な配列となる可能性が高いと考え、以降の実験にて検証をおこなった。
III．実施例３：Protein S100ファミリー由来ペプチドが歯髄創傷治癒に与える影響の検討
　Protein S100ファミリー由来機能ペプチドであるNo. 28ペプチド、No. 47ペプチド、No. 32ペプチド、及びNo. 51ペプチドが歯髄創傷治癒に与える影響を調べるために、以下の実験をおこなった。
１．材料及び方法
１）Protein S100ファミリー由来ペプチドがhDPSCsへの毒性及び増殖能に与える影響の評価
　4種類のペプチドを、0.1、1、10、100 μg/mlの濃度で添加した10 %FBS含有α-MEM培地にhDPSCsを5,000 cells/well となるように96 wellプレートに播種し、37℃、5 %CO2気相下で2日間培養した。毒性試験は、培養液上清を採取し、LDH Cytotoxicity Detection Kit (タカラバイオ, 滋賀) を用いてLDH-assay をおこなった。採取した培養液上清に試薬を添加し、37℃、5 %CO2気相下で30分静置した。その後、マイクロプレートリーダー(ARVO MX) を用いて405 nmにおける吸光度を測定した。さらに、増殖能を評価するため、継続して同細胞を1日培養後、Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (タカラバイオ) を用いてWST-1-assayをおこなった。WST-1試薬を培養液中に添加し、37℃、5%CO2気相下で30分静置した。続いて室温で1分間振盪の後、マイクロプレートリーダー(ARVO MX) を用いて450 nmにおける吸光度を測定した。コントロールとして、PBSを培養液中に添加したものを用い、試料数は各条件につき6とした。
２）Protein S100ファミリー由来ペプチドを用いた直接覆髄実験
　Protein S100ファミリー由来ペプチドが第三象牙質形成能に与える影響を評価するために上記Ｉ．の１．材料及び方法の１）と同様の手法で、100 μg/mlの濃度でNo. 28、No. 47、No. 32、及びNo. 51の各ペプチドを含有したPBS溶液をそれぞれ20 μl浸漬させたゼラチンスポンジ(Spongel(商標)) を用いてラット臼歯を対象とした直接覆髄実験をおこなった。コントロールとしてペプチドの由来タンパク質の組換え体であるS100-A8(PROSPEC, イスラエル)、S100-A9 (PROSPEC) を1 μg/mlの濃度で含有したPBS溶液及びPBS溶液のみを用いた。覆髄処置から4週間経過後、露髄部直下に形成された第三象牙質についてマイクロCT撮影ならびに画像解析を実施し、Okamotoらが過去に実施した直接覆髄実験で、病理組織像より観察された第三象牙質の形成量をスコアリングしていた評価方法を、本研究ではマイクロCTの画像に応用し、形成された第三象牙質のスコアリングにて評価をおこなった[Clinical Oral Investigations 2018, 22(8):2879-2887.；Journal of Dentistry 2010, 38(10):828-837]。スコアは、露髄部の1/3以下のエリアにのみ第三象牙質が形成されたものをGrade 0、露髄部の1/3~2/3のものをGrade 1、露髄部の2/3以上のものをGrade 2、露髄部を完全に覆う第三象牙質形成を認めるものをGrade 3として一人の術者が評価をおこなった。これに加えて、上記Ｉ．の１．材料及び方法の２）と同様の手法で同じマイクロCT画像の解析をおこない、形成された第三象牙質の体積の評価をおこなった。また上記Ｉ．の１．材料及び方法の３）と同様の手法でH-E染色を実施し、第三象牙質形成について病理組織学的評価をおこなった。試料数は各条件につき8とした。
３）統計学的解析
　上記の実験における統計学的有意差検定は、細胞毒性試験にOne-way ANOVA, Tukey’s test 、細胞増殖試験及び直接覆髄実験における第三象牙質形成量の比較にはKruskal-Wallis-test を用い、危険率5 %で評価した。
２．結果
１）Protein S100ファミリー由来ペプチドがhDPSCsへの毒性及び増殖能に与える影響の評価
　各ペプチドの細胞毒性についてLDH-assayにより検討した結果、No. 28及びNo. 47ペプチドでは全濃度の試料で、No. 32ペプチドでは1 μg/ml、No. 51ペプチドでは100 μg/ml 及び10 μg/mlを用いた試料において、コントロールと比較し有意に低い細胞毒性を示した(p< 0.05)(図8A)。その他の試料ではコントロールとの間に有意差は認めなかった(p>0.05)。
　一方、各ペプチドが細胞増殖能に与える影響については、全ての試料でコントロールとの間に有意差は認めなかった(p>0.05)(図8B) 。
　これらの結果から、No. 28ペプチド、No. 47ペプチド、No. 32ペプチド、及びNo. 51ペプチドの全てのペプチドがPBSと同等の細胞毒性を呈し、また細胞増殖にも影響を与えないことが明らかになった。本結果を踏まえて、100 μg/mlのペプチドを用いてラットを用いた直接覆髄実験をおこない、各ペプチドの機能をin vivoで検討した。
２）Protein S100ファミリー由来ペプチドを用いた直接覆髄実験
　覆髄後に形成された第三象牙質をスコア化した結果を図9Aに示す。No. 28ペプチドを用いて覆髄を行った結果、5つの試料において露髄部を完全に封鎖するような第三象牙質形成を認めたのに対し、他のペプチドを用いた場合は露髄部を完全に封鎖するのは0もしくは1試料のみであった。コントロールとしてS100-A8組換えタンパク質を用いた場合は露髄部の完全封鎖は1試料で、S100-A9では2試料、PBSでは0試料であった。
　また、第三象牙質の体積を定量した結果、No. 28ペプチドを用いて覆髄を行った試料はNo. 47ペプチド若しくは、PBSを用いて覆髄を行った試料と比較し、有意に多くの第三象牙質の形成を認めた(p<0.05)が、その他の試料とは有意差を認めなかった(p>0.05) (図9B)。
　マイクロCT解析に用いた試料についてH-E染色をおこなった代表的な結果を図10に示す。完全な第三象牙質形成を認めたNo. 28ペプチド、No. 32ペプチド、及びNo. 51ペプチドの試料において第三象牙質内に微小な欠損は認めるものの、歯髄側と歯冠側が交通するような欠損は認めず、形成された第三象牙質による露髄面の完全閉鎖が確認された。S100-A8、S100-A9の試料においても、歯冠側と歯髄側が交通するような欠損は認めず、形成された第三象牙質による露髄面の完全閉鎖が確認されたが、ペプチドを用いた試料と比較して第三象牙質は疎な構造を示した(図10)。
　本研究により、象牙質基質タンパク質中に存在するProtein S100-A8由来の機能ペプチド (KLLETECPQ：配列番号28)が最も歯髄の創傷治癒を促進することが明らかとなった。
IV．実施例４：Protein S100ファミリー由来ペプチドの歯髄創傷治癒メカニズムの解析　直接覆髄実験で良好な結果を示したProtein S100ファミリー由来ペプチドが、歯髄創傷治癒を促進したメカニズムについて検討するために、No. 28ペプチドと歯髄細胞の相互作用を惹起させ、歯髄細胞が発現するタンパク質の変化について液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry : LC-MS/MS)で解析を行った。
１．材料及び方法
　Protein S100ファミリー由来ペプチドにより生じる歯髄創傷治癒過程におけるプロテオーム解析
　No. 28ペプチド若しくはNo. 28ペプチドの由来タンパク質である組換えS100-A8をhDPSCsと作用させることで、hDPSCsが発現するタンパク質の比較ならびに定量をLC-MS/MSにて実施した。No. 28ペプチドとS100-A8の濃度を0.1 mMとした試料を用いて、それぞれの試料を含有した石灰化誘導培地にhDPSCを3,000,000 cells/plateとなるよう100 mm細胞培養皿に播種し37℃、5 %CO2気相下で7日間培養した。その後、細胞膜タンパク抽出キット(コスモバイオ, 東京) を用いて、細胞膜タンパク質と細胞質タンパク質を抽出した。実際の手順としては、hDPSCsを7日間培養後、スクレイパーにて回収し、同キットのBuffer Aを添加し氷上にて10分静置した。その後、キット付属のフィルターカートリッジ付きマイクロチューブに移し、14,000 rpmで30秒間遠心分離をおこなった。カートリッジを破棄し10秒間撹拌後、3000 rpmで1分間遠心分離をおこない、上清を採取した。次に採取した上清を14,000 rpmで30分間遠心分離をおこなうことで上清が細胞質タンパク質、ペレットが細胞膜タンパクと分離されたものを抽出した。コントロールとしてPBSを添加した石灰化誘導培地で培養したhDPSCsを用いた。
　液体クロマトグラフィーはUltiMate 3000 Nano LC systems (Thermo Fisher Scientific, 米国) 、ESI-column (0.075 x 150 mm) (Thermo Fisher Scientific) を用いて、各試料の分析をおこなった。移動相はアセトニトリル含有0.1 %ギ酸水溶液を用い、流速は300nL/minとし、最初の5分は5%のアセトニトリル含有0.1%ギ酸水溶液の濃度で流し、続いて95分間で40％まで上昇させ、その後2分間一定の割合でアセトニトリルの濃度を増加、90 %まで上昇させ、5分間維持した。ペプチドの分析はQ-Exactive (Thermo Fisher Scientific) を用いた。得られたMS/MSスペクトルに対しMascot Distiller v2.5, Mascot Server v2.5 (Matrix Science, 米国) 及びUniProtを用いたペプチドマスフィンガープリンティングによってタンパク質の同定、及び定量解析をおこなった。
　さらに、タンパク質の発現量の変化を評価するために、同定された細胞膜由来タンパク質、細胞質由来タンパク質の各試料間で以下の条件で絞り込みをおこなった。
〈コントロール群と比較してペプチド群、S100-A8群で発現量が増加したタンパク質の絞り込み条件〉
　・S100-A8群での計測値がコントロール群と比較して高かったタンパク質
　・ペプチド群／コントロール群の比率が2倍以上のタンパク質
　・ペプチド群、S100-A8群の両群の計測値が1 (a.u. ; arbitrary unit) 以上のタンパク質
〈コントロール群と比較してペプチド群、S100-A8群で発現量が減少したタンパク質の絞り込み条件〉
・S100-A8群での計測値がコントロール群と比較して低下していたタンパク質
・コントロール群／ペプチド群の比率が2倍以上のタンパク質
・コントロール群の計測値が1 (a.u.) 以上のタンパク質
上記の条件により絞り込んだ各群をGene Ontology (GO) 分類を用いて解析をおこなった。GOには国際的に標準化されたGO Termが存在し、これは生物学的機能を表現することを目的としている。GO Termは階層構造によって成り立っており、上位の階層は一般的な機能表現、下位はより詳細な機能表現である。例えば、最上位には”Molecular function”、“Biological process”、”Cellular component”の三つのカテゴリーが存在する。
　本実験により得られたタンパク質群について、上記のカテゴリーからそれぞれの機能を表現する”Molecular function”と”Biological process”に属するGO Termを検索し、各タンパク質群に特徴的な機能について検討をおこなった。
２．結果
　Protein S100ファミリー由来ペプチドにより生じる歯髄創傷治癒過程におけるプロテオーム解析
　LC-MS/MSによる分析をおこなった結果、細胞膜由来タンパク質は1833、細胞質由来タンパク質は1557同定された。
　各絞り込み条件に従い、発現量に変化のあったタンパク質について検討した結果、細胞膜由来タンパク質においてコントロールよりもNo. 28ペプチド及びS100-A8で発現量が上昇したタンパク質が158抽出され、逆に発現量がコントロールよりも低下したタンパク質は97あった。同様に、細胞質由来タンパク質でコントロールよりも上昇したタンパク質は250、減少したタンパク質は67検出された。
　次に絞り込んだタンパク質群から、それぞれのタンパク質がもつGO Termを検索、特徴的な機能の検討をおこない、以下の結果が得られた(図11) 。まずコントロールと比較してNo. 28ペプチドとS100-A8を用いた試料で発現が上昇したタンパク質について、特徴的に見出されたものとしてNuclear Factor-kappa B (NFκB) シグナル経路を促進する機能に関連するGO Term持つタンパク質が認められた。具体的には、細胞膜由来タンパク質において、Flotillin-1 (FLOT1) 、Very-long-chain (3R)-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase (3KCR1) 、Protein LYRIC (LYRIC) 、Gap junction alpha-1 protein (GJA1) が、細胞質由来タンパク質からは、Protein S100-A13 (S100-A13) 、Nucleolar protein 3 (NOL3) が得られた。一方、No. 28ペプチドとS100-A8を用いた試料で発現が減少したタンパク質のうち、特徴的に見出されたものとしてMitogen-activated Protein Kinase (MAPK) シグナル経路を促進する機能に関連するGO Termを持つタンパク質が認められた。具体的には、細胞膜由来タンパク質からDual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MAP2K1)、Cadherin-2 (CDH2)、GTPase Nras (NRAS)、Mitogen-activated protein kinase 1 (MAP1)、一方、細胞質由来タンパク質からはAdapter molecule crk (CRK)、Proteasome subunit beta type-7 (PSMB7)が得られた。
　これらの結果からNo.28ペプチドは、MAPKシグナル経路に関連するタンパク質の発現を抑制し、NFκBシグナル経路に関連するタンパク質の発現を促進することでDPSCsの石灰化を促進している可能性が示唆された。NFκBシグナル経路は一般的に免疫や炎症、細胞増殖、細胞分化の調節をおこなうことが報告されているが、一方でNeurotrophin receptor-interacting MAGE homologue (Nrage)をノックダウンしたマウスの象牙芽細胞様細胞で同シグナル経路が活性化され、ALPの活性が上昇したという報告や、Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ)を過剰発現させた歯髄細胞にH2O2を作用させることでNFκBシグナル経路が活性化され、その結果石灰化が促進されたという報告もある。また、MAPKシグナル経路は一般的に細胞増殖、細胞分化、細胞遊走、アポトーシスの調節をおこなうことが報告されているが、脊髄損傷後の神経組織において5-Methoxytryptophan(5MTP)をマウスに投与するとMAPK経路を抑制し抗炎症に作用するという報告があり、本実験においてもNo. 28ペプチドを用いた試料でMAPK経路を活性化するタンパク質の発現が減少したことから、炎症を抑制することで治癒が促進する方向へ作用した可能性も考えられる。

Claims (5)

  1. 　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln（配列番号２８）からなるアミノ酸配列；
    　Asn-Thr-Asp-Gly-Ala-Val-Asn-Phe-Gln（配列番号３２）からなるアミノ酸配列；
    　Glu-Leu-Val-Arg-Lys-Asp-Leu-Gln-Asn（配列番号４７）からなるアミノ酸配列；
    　Asn-Ala-Asp-Lys-Gln-Leu-Ser-Phe-Glu（配列番号５１）からなるアミノ酸配列；
    　前記配列番号２８、配列番号３２、配列番号４７又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列において１アミノ酸残基から３アミノ酸残基が置換又は欠失したアミノ酸配列；又は　前記配列番号２８、配列番号３２、配列番号４７又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列に１アミノ酸残基から３アミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
    を含む、ペプチドであって、前記ペプチドの長さが９アミノ酸残基から１５アミノ酸残基である、ペプチド。
  2. 　前記ペプチドが、
    　　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln（配列番号２８）、
    　　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr（配列番号１００）、又は
    　　Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr-Ile（配列番号１０１）、からなるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　請求項１又は請求項２に記載のペプチドを含む、組成物。
  4. 　前記組成物が、象牙質形成を促進するために使用される、請求項３に記載の組成物。
  5. 　前記組成物が、歯窩洞充填用又は歯髄創傷治癒促進用である、請求項３に記載の組成物。
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