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WO2023276129A1 - ナノポア形成方法 - Google Patents

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WO2023276129A1
WO2023276129A1 PCT/JP2021/025047 JP2021025047W WO2023276129A1 WO 2023276129 A1 WO2023276129 A1 WO 2023276129A1 JP 2021025047 W JP2021025047 W JP 2021025047W WO 2023276129 A1 WO2023276129 A1 WO 2023276129A1
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WO
WIPO (PCT)
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membrane
solution
aqueous solution
forming
nanopore
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2021/025047
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English (en)
French (fr)
Inventor
ハイ フィ グェンファム
善光 柳川
玲奈 赤堀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi High Tech Corp
Original Assignee
Hitachi High Tech Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi High Tech Corp filed Critical Hitachi High Tech Corp
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Priority to CN202180098457.9A priority patent/CN117355744A/zh
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    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the present disclosure relates to nanopore formation technology for forming nanopores in a membrane.
  • Nanopore sensors have been developed, for example, as biological sample analyzers that analyze molecules, particles, DNA, and proteins.
  • a nanopore sensor pores larger than or equivalent to the size of a biological sample (sample), for example, pores with a diameter of 1 nm to 100 nm, are formed on a thin film (membrane), and an aqueous solution is insulated by the membrane. It is introduced into the first solution bath and the second solution bath.
  • a biological sample (sample) is introduced into one of the first solution bath or the second solution bath.
  • a voltage is applied between the electrodes immersed in each solution bath, and the ion current flowing between the electrodes is measured. Physical and structural properties of biological samples can be sensed by measuring the sequestered ion current that flows as the biological sample passes through pores.
  • nanopore sensors There are two types of nanopore sensors, one based on biological membranes and the other based on solid membranes.
  • nanopore sensors using biological membranes pores are formed by suspended proteins with nanometer-sized pores on a lipid bilayer membrane.
  • the membrane is made of a high mechanical strength material such as silicon nitride (SiN), and the nanometer-sized pores are formed by electron beam irradiation of the membrane, chemical etching techniques, or Manufactured by a dielectric breakdown technique in which a voltage is applied to form pores.
  • SiN silicon nitride
  • the dielectric breakdown technique stress is applied to the membrane by generating a potential difference with an external power supply or the like, and nanopores are formed by dielectric breakdown.
  • This dielectric breakdown technology allows nanopores to be formed on the membrane just before measuring the target sample, so it has low nanopore manufacturing cost, user-friendliness, and on-site processing (processing at the user's place of use). ) and the ability to form fresh nanopores.
  • Patent Document 1 or Non-Patent Document 1 discloses the use of a neutral pH aqueous solution (pH 7-7.5) to form nanopores on a SiN film.
  • a neutral pH aqueous solution pH 7-7.5
  • the introduced aqueous solution may not come into contact with the surface of the dried membrane, which may deteriorate the yield of nanopore formation.
  • solid films become hydrophobic in the ambient environment due to oxidation of the surface and/or attachment of unwanted organic substances to the surface. Therefore, in laboratories, it is usually necessary to treat the membrane to make it hydrophilic before use. Hydrophilic treatments are commonly performed in laboratories by piranha or plasma treatments. However, when commercializing nanopore sensors, it is not realistic to have end users perform these dangerous processes, and other alternative techniques are required.
  • Patent Document 2 discloses introducing a method of storing a membrane in an aqueous solution under specific conditions such as water volume, temperature, and salinity.
  • US Pat. No. 6,300,003 discloses introducing a method of storing membranes by attaching a hydrophilic surface and a protective layer containing a soluble substance.
  • Patent Document 4 introduces the EWOD (Electorowetting On Dielectric) method, and discloses that the droplet of the aqueous solution is moved to the position of the membrane by controlling the hydrophobic and hydrophilic properties by applying a high voltage.
  • this method also requires plasma treatment of the membrane surface.
  • Patent document 5 also introduces a nanopore fabrication method based on a pulsed laser and discloses performing piranha treatment before sample measurement to achieve hydrophilicity.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 dielectric breakdown is performed using a neutral pH aqueous solution without piranha treatment or plasma treatment. Yield is low.
  • piranha processing and plasma processing must be operated at the user's place of use (on-site), there are problems such as imposing a processing burden on the user and unfavorable safety issues, which is not realistic.
  • the alternative storage techniques according to Patent Documents 2 and 3 the storage process itself may impose a burden on the user.
  • Non-Patent Document 2 utilizes such a high pH aqueous solution to form nanopores on a membrane of about 20 nm.
  • the use of high pH aqueous solutions can lead to membrane degradation due to the uncontrolled size of the nanopores formed due to the chemical etching process. Precise control of nanopore size in the sub-nanometer order is considered important in performing practical bioanalyses such as DNA sequencing.
  • the present disclosure proposes a technique for forming nanopores with a high yield and an appropriate size.
  • the present disclosure is a nanopore forming method for forming nanopores in a membrane, comprising introducing an aqueous solution having a first pH into a first solution tank and a second solution tank insulated by the membrane; After ensuring the hydrophilicity of the surface of the membrane, and after the hydrophilicity of the surface of the membrane is ensured, the aqueous solution of the first pH in the first solution tank and the second solution tank is set higher than the first pH. substituting with an aqueous solution of a second low pH, and immersing the electrode in each of the first solution bath and the second solution bath containing the aqueous solution of the second pH to generate dielectric breakdown and form nanopores in the membrane.
  • a method for forming nanopores including:
  • nanopores with a high yield and an appropriate size.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration example of a nanopore sensing system before forming nanopores in the membrane;
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the outline of processing from confirmation of hydrophilicity of the membrane surface to formation of nanopores. 4 is a diagram for explaining an overview of sample measurement processing in the nanopore sensing system 100.
  • FIG. 4 is a flow chart for explaining the flow of processing from formation of nanopores in the membrane to sample measurement according to the present embodiment. 4 is a flowchart showing detailed contents (example) of a nanopore forming process using a dielectric breakdown technique (pulse voltage).
  • 2 is a flow chart showing detailed contents (example) of a nanopore forming process using a dielectric breakdown technique (constant voltage).
  • FIG. 4 is a flow chart showing detailed contents (example) of nanopore formation processing using a dielectric breakdown technique (pulse current). 4 is a flow chart showing detailed contents (example) of nanopore formation processing using dielectric breakdown technology (constant current).
  • FIG. 4 shows the IV (current-voltage) characteristics before nanopores are formed in the membrane 101 by dielectric breakdown technique.
  • the pulse voltage V p was increased stepwise from 4 V to 4.8 V, and the pulse period (pulse voltage application period) was increased to 200 ms for each voltage.
  • FIG. 4 is a diagram showing current values (current values before and after inserting electrodes 104 and 109 into the flow cell) measured when the applied DC voltage Vc is 0V. Experimental results (accumulated voltage application time-ion current characteristic).
  • the material, thickness, size and number of membranes are not limited.
  • the composition of the aqueous solution of the high pH aqueous solution, the composition of the aqueous solution of the neutral pH aqueous solution used for nanopore formation, and the composition of the aqueous solution used for sample measurement are not limited.
  • the dielectric breakdown technology used for nanopore formation is merely an example, and various forms of dielectric breakdown technology can be applied.
  • the capacitance noise measurement method is used when measuring the RMS noise, but the method is not limited to this.
  • a dry membrane is attached to the flow cell (part of the nanopore sensing system) before the nanopore is formed, separating the first and second solution reservoirs of the flow cell. Insulate.
  • a high pH aqueous solution (first pH aqueous solution) is introduced (filled) into each solution tank. Electrodes are submerged in the solution of each bath and connected to an electrical unit capable of supplying voltage or current.
  • capacitance noise is first measured (measured) in an unloaded state and a loaded state (capacitance noise measurement process). It is determined whether the membrane surface becomes hydrophilic and the aqueous solution is in contact with the membrane surface.
  • the DC voltage can be less than the dielectric breakdown voltage of the membrane. For example, if a 5 nm thick membrane is used, it exhibits a breakdown voltage of 5 V, so the DC voltage for checking the capacitance noise is from -2.5 V to 2.5 V. In this way, by setting the applied voltage to be less than the dielectric breakdown inducing voltage in the capacitance noise measurement process, unnecessary dielectric breakdown can be prevented from occurring during the process.
  • the membrane surface becomes hydrophilic when the capacitance noise with load (RMS noise with load) is several times (at least 2 times or more) higher than the capacitance noise without load (RMS noise with load).
  • RMS noise with load capacitance noise with load
  • a high pH aqueous solution (first pH aqueous solution) is taken out from each solution tank and introduced (filled) again.
  • the pH of the first pH aqueous solution may be further increased.
  • contact between the first pH aqueous solution and the membrane surface may be ensured by moving the first pH aqueous solution back and forth over the membrane surface (eg, by pipetting).
  • a first pH aqueous solution (high pH aqueous solution) is taken out from each solution tank, and a second pH aqueous solution (eg, neutral pH aqueous solution) lower than the first pH is introduced into each solution tank.
  • This process may be repeated several times to ensure that the aqueous solution in each bath is neutral.
  • the aqueous solution replacement process is performed, for example, it may be confirmed that the pH of the aqueous solution in each solution tank is neutral.
  • Nanopores of desired size can be formed on the membrane by causing dielectric breakdown.
  • a sample can be introduced into one of the two baths.
  • a voltage is applied between the electrodes of each solution bath, or a current is passed between the electrodes, an ion current is measured.
  • a molecule or particle of interest (a target molecule or particle) can be detected by measuring the ionic current (blockage current) as the molecule or particle of interest passes through the nanopore.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration example of a nanopore sensing system before forming nanopores in the membrane.
  • the nanopore sensing system 100 includes a first solution bath 103 containing an aqueous solution (eg, 1 M KCl pH 12.7), a second solution bath 110 containing an aqueous solution (eg, 1 M KCl pH 12.7), and a liquid sealing gasket 102. and 111, electrodes immersed in an aqueous solution (eg, Ag/AgCl electrodes) 104 and 109, electrical equipment unit 107 for supplying power and current, and electrical leads connecting electrode 104 and electrical equipment unit 107.
  • an aqueous solution eg, Ag/AgCl electrodes
  • Membrane 101 is placed in nanopore sensing system 100 by sandwiching it with liquid-tight gaskets 102 and 111 . Also, after placing the membrane 101, the aqueous solutions 106 and 112 are injected into the first solution bath 103 and the second solution bath 110, respectively.
  • a dry SiN film or a multi-component film can be used for the membrane 101.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the outline of processing from confirmation of the hydrophilicity of the membrane surface to formation of nanopores.
  • 1 M KCl pH 12.7 aqueous solutions 106 and 112 are placed in the first solution tank 103 and the second solution tank 110, respectively, and the capacitance noise (RMS noise) is measured. Whether or not the aqueous solutions 106 and 112 are in contact with the surface of the membrane 101 (whether or not the surface of the membrane 101 has become hydrophilic) is confirmed (details will be described later). After that, the 1M KCl pH 12.7 aqueous solutions 106 and 112 are discharged from the first solution bath 103 and the second solution bath 110, and the 1M KCl pH 7.5 aqueous solutions 130 and 131 are discharged into the first solution bath 103 and the second solution bath 110. be filled. That is, 1M KCl pH 12.7 aqueous solutions 106 and 112 are replaced by 1M KCl pH 7.5 aqueous solutions 130 and 131 .
  • RMS noise capacitance noise
  • nanopores 113 of a desired size can be formed in the membrane 101 by applying voltage or current from the electric equipment unit 107 based on dielectric breakdown technology (the pore size can be controlled).
  • FIG. 3 is a diagram for explaining an overview of sample measurement processing in the nanopore sensing system 100.
  • a sample 120 is introduced into either first solution bath 103 or second solution bath 110 .
  • a low voltage of 20 V or less for example, 2 V or less
  • the ion current (blockage current) when the sample 120 passes through the nanopore 113 is measured.
  • Each of the aqueous solutions 140 and 141 filled in the first solution tank 103 and the second solution tank 110 during sample measurement depends on the type of sample to be measured (target sample).
  • FIG. 4 is a flow chart for explaining the flow of processing from nanopore formation in the membrane to sample measurement according to this embodiment.
  • the processing from nanopore formation to sample measurement according to this embodiment includes hydrophilicity processing S201, hydrophilicity confirmation processing S211, nanopore formation processing S221, and sample measurement processing S231. That is, the membrane 101 is immersed in an aqueous solution with a high pH (aqueous solution with a first pH) in order to ensure the hydrophilicity of the surface of the membrane 101 (step 201), and it is confirmed whether the surface of the membrane 101 is actually hydrophilic.
  • step 211 forming nanopores by a dielectric breakdown method in an aqueous solution with a low pH (aqueous solution with a second pH lower than the first pH) (step 221), and measuring a sample (step 231), resulting in a high yield, And it becomes possible to measure a specimen (sample) using a nanopore whose size is controllable.
  • Step 201 (i-1) Step 202 First, the operator prepares the dry membrane 101 .
  • Step 203 The operator then attaches the dry membrane 101 to the flow cell.
  • the flow cell corresponds to the components of the nanopore sensing system 100 (see FIGS. 1-3), including the first solution reservoir 103, the second solution reservoir 110, and the liquid-tight gaskets 102 and 111.
  • FIG. 1 the components of the nanopore sensing system 100 (see FIGS. 1-3), including the first solution reservoir 103, the second solution reservoir 110, and the liquid-tight gaskets 102 and 111.
  • Step 204 The operator introduces (fills) a high pH (greater than pH 8) aqueous solution (first pH aqueous solution), eg, 1 M KCl pH 12.7 aqueous solution, into the first solution reservoir 103 and the second solution reservoir 110 of the flow cell.
  • first pH aqueous solution eg, 1 M KCl pH 12.7 aqueous solution
  • Step 211 In the hydrophilicity confirmation process (step 211), a DC voltage Vc is applied between the electrodes (step 212), and the RMS noise is measured without inserting the electrodes into the flow cell (first solution tank 103 and second solution tank 110). , (RMS noise measurement without load: step 213), and inserting electrodes into the flow cell (step 216) and measuring RMS noise (RMS noise measurement with load: step 214).
  • Step 212 The operator applies a DC voltage (Vc) across Ag/AgCl electrodes 104 and 109 via electrical equipment unit 107 . At this stage, Ag/AgCl electrodes 104 and 109 are not immersed in the aqueous solutions of first solution bath 103 and second solution bath 110, respectively.
  • the voltage applied here is, for example, a low voltage of 10 V or less. This is to prevent unwanted dielectric breakdown from occurring in step 214 .
  • Step 213 The operator measures the RMS (Root Mean Square) noise of the current (unloaded RMS noise ⁇ no ) while the Ag/AgCl electrodes 104 and 109 are not immersed in an aqueous solution (aqueous solution of the first pH).
  • RMS Root Mean Square
  • Step 216 The operator immerses the Ag/AgCl electrodes 104 and 109 in an aqueous solution (an aqueous solution with a first pH).
  • Step 214 Subsequently, the operator immerses the Ag/AgCl electrodes 104 and 109 in an aqueous solution (aqueous solution of the first pH) (with the electrodes 104 and 109 inserted into the first solution bath 103 and the second solution bath 110), and the current RMS (Root Mean Square) noise (loaded RMS noise ⁇ w ) is measured.
  • aqueous solution of the first pH aqueous solution of the first pH
  • RMS Root Mean Square
  • Step 215 The operator compares the unloaded RMS noise ⁇ no with the loaded RMS noise ⁇ w . Specifically, it is determined whether the RMS noise ⁇ w is several times (for example, twice) as large as the unloaded RMS noise ⁇ no . If the loaded RMS noise ⁇ w is greater than the unloaded RMS noise ⁇ no (Yes in step 215), the surface of the membrane 101 is hydrophilic (hydrophilic property: the surface of the membrane 101 is completely aqueous ) is confirmed, the hydrophilicity confirmation process (step 211) ends, and the process shifts to the nanopore formation process S221.
  • step 204 the aqueous solution in the first solution bath 103 and the second solution bath 110 (aqueous solution of first pH: for example, aqueous solution of 1M KCl pH 12.7) is discharged, and the new aqueous solution of first pH becomes the first solution.
  • the tank 103 and the second solution tank 110 are filled, and the hydrophilicity confirmation process (step 211) is performed again.
  • the hydrophilicity confirmation process is executed again, if the hydrophilicity of the surface of the membrane 101 cannot be confirmed even if the hydrophilicity confirmation process is executed a plurality of times (for example, 5 times), the pH of the aqueous solution is increased ( However, the pH may be set lower than 14).
  • the operator compares the unloaded RMS noise ⁇ no with the loaded RMS noise ⁇ w , but a computer (not shown) may be connected to the nanopore sensing system 100 and the computer may perform the comparison process. .
  • the computer displays an instruction on the screen (not shown) of the display device to move the process to step 221. Then, the operator can be prompted to perform the next nanopore formation process.
  • the computer displays an instruction to move the process to step 204 on the screen (not shown) of the display device, The operator can be urged to perform the hydrophilicity confirmation process again.
  • the unloaded RMS noise ⁇ no is measured in advance and stored in a memory (not shown), and when the hydrophilicity confirmation process is executed, the unloaded RMS noise ⁇ no is read from the memory, and the loaded RMS noise You may make it compare with (sigma) w .
  • Step 221 (iii) Step 221 (iii-1) Step 222
  • the operator discharges the aqueous solution of the first pH filled in the first solution tank 103 and the second solution tank 110, and the aqueous solution of the second pH lower than the first pH (for example, the neutral aqueous solution, more specifically, 1M KCl pH 7.5 in water) is charged instead (water solution replacement).
  • the neutral aqueous solution for example, the neutral aqueous solution, more specifically, 1M KCl pH 7.5 in water
  • Step 223 The operator applies a voltage or a current between the electrodes 104 and 109 in the electrical equipment unit 107 to cause dielectric breakdown, thereby forming nanopores 113 of a desired size in the membrane 101 as shown in FIG.
  • the aqueous solution is an aqueous solution with a second pH (e.g., a neutral aqueous solution, more specifically, an aqueous solution of 1 M KCl pH 7.5:
  • the first solution tank 103 and the second solution tank 110 are filled with the type of aqueous solution (KCl, etc., instead of the pH, which varies depending on the type of sample to be measured).
  • Step 232 The operator introduces a sample (target sample) 120 to be measured into either the first solution tank 103 or the second solution tank 110, as shown in FIG.
  • Step 233 By applying a low voltage (which can be, for example, less than 20 V, or more specifically less than 2 V) across electrodes 104 and 109 with electronics unit 107, an operator can draw a sample.
  • the ionic current (blockage current) is measured as 120 passes through the nanopore.
  • step 223 of nanopore formation processing> 5 to 8 are flowcharts showing detailed contents (examples) of the nanopore forming process using dielectric breakdown technology. Four forms will be described here.
  • Example of pulse voltage application Fig. 5
  • the operator uses the electrical equipment unit 107 to apply a pulse voltage V p1 between the Ag/AgCl electrodes 104 and 109 immersed in the first solution bath 103 and the second solution bath 110 for a period of at least one cycle.
  • the magnitude of the pulse voltage Vp1 varies depending on the thickness and material of the membrane 101. For example, in the case of a 5 nm SiN membrane, a pulse voltage of 4V to 5V is applied.
  • the pulse voltage V p1 is a voltage for applying stress to the membrane 101 .
  • the operator operates the electrical equipment unit 107 to change the applied voltage from the pulse voltage Vp1 to a predetermined low voltage Vm1 , and measures the current Im1 flowing at the low voltage Vm1 (step 242).
  • the low voltage V m1 is set lower than the value of the pulse voltage V p1 to the extent that dielectric breakdown does not occur during the process of step 242 or the already formed nanopores do not expand. For example, when a SiN membrane with a thickness of 5 nm is used as the membrane 101, it is set to less than 1V.
  • the operator compares the measured current I m1 with the threshold current I th1 (step 253). If the measured current I m1 is greater than the threshold current I th1 (Yes in step 243), it is determined that the desired nanopore 113 (see FIG. 2) has been formed, and the process proceeds to step 231 (sample measurement process). . On the other hand, if the measured current I m1 is less than or equal to the threshold current I th1 (No in step 243), the process returns to step 241, and the membrane 101 is again stressed by the pulse voltage V p1 . When applying the pulse voltage Vp1 again in step 241, the application time may be lengthened, or the polarity (positive/negative) of the applied voltage may be reversed.
  • the threshold current I th1 used in step 243 can be estimated from the conductivity of the aqueous solution, the thickness of the membrane 101, and the desired size of the nanopores, and can also be estimated from experiments and observations by TEM (Transmission Electron Microscopy). can also be determined (estimated) based on
  • Example of constant voltage application Fig. 6
  • the operator uses the electrical equipment unit 107 to apply a constant voltage Vdc for a predetermined time between the Ag/AgCl electrodes 104 and 109 immersed in the first solution bath 103 and the second solution bath 110 (step 251).
  • the magnitude of the constant voltage Vdc varies depending on the thickness and material of the membrane 101. For example, in the case of a 20 nm SiN membrane, the constant voltage can be from 16V to 20V.
  • the application time of the constant voltage is, for example, less than 10 minutes including the application time in the next step 252 .
  • the operator measures the current Im2 flowing at that time while applying the constant voltage Vdc (step 252).
  • the operator compares the measured current I m2 and the threshold current I th2 to confirm whether the desired nanopores 113 are formed in the membrane 101 (step 253). If the measured current I m2 is greater than the threshold current I th2 (Yes in step 253), it is determined that the desired nanopores 113 (see FIG. 2) have been formed, and the process proceeds to step 231 (sample measurement process). . On the other hand, if the measured current Im2 is less than or equal to the threshold current Ith2 ( No in step 253), the process returns to step 251 and the constant voltage Vdc is applied again.
  • the applied voltage value may be increased, or the polarity (positive/negative) of the applied voltage may be reversed.
  • the threshold current I th2 used in step 253 can be estimated from the conductivity of the aqueous solution, the thickness of the membrane 101, and the desired nanopore size, and can also be estimated from experiments and TEM (Transmission Electron Microscopy) observations. can also be determined (estimated) based on
  • the operator operates the electrical equipment unit 107 to apply a predetermined low voltage Vm2 between the Ag/AgCl electrodes 104 and 109 immersed in the first solution bath 103 and the second solution bath 110,
  • the current Im3 flowing at voltage Vm2 is measured (step 262).
  • the low voltage Vm2 is set so low that dielectric breakdown does not occur during the processing of step 262, or that already formed nanopores do not expand. For example, when a SiN membrane with a thickness of 5 nm is used as the membrane 101, it is set to less than 1V.
  • the operator compares the measured current I m3 with the threshold current I th3 (step 263). If the measured current I m3 is greater than the threshold current I th3 (Yes in step 263), it is determined that the desired nanopore 113 (see FIG. 2) has been formed, and the process proceeds to step 231 (sample measurement process). . On the other hand, if the measured current I m3 is equal to or less than the threshold current I th3 (No in step 263), the process returns to step 261, and the pulse current I p1 will flow between the Ag/AgCl electrodes 104 and 109 again. .
  • the current value may be increased, or the polarity (positive/negative) of the applied current may be reversed.
  • the threshold current I th3 used in step 263 can be estimated from the conductivity of the aqueous solution, the thickness of the membrane 101, and the desired nanopore size, and can also be estimated from experiments and observations by TEM (Transmission Electron Microscopy). can also be determined (estimated) based on
  • Example of constant current flow Fig. 8
  • the operator uses the electric equipment unit 107 to apply a constant current Vdc for a predetermined time between the Ag/AgCl electrodes 104 and 109 immersed in the first solution bath 103 and the second solution bath 110 (step 271).
  • the magnitude of constant current Idc varies depending on the thickness and material of membrane 101 .
  • the operator measures the voltage Vm3 at that time while applying the constant current Idc (step 272).
  • the operator compares the measured voltage Vm3 and the threshold voltage Vth to confirm whether the desired nanopores 113 are formed in the membrane 101 (step 273). If the measured voltage V m3 is greater than the threshold voltage V th (Yes in step 273), it is determined that the desired nanopores 113 (see FIG. 2) have been formed, and the process proceeds to step 231 (sample measurement process). . On the other hand, if the measured voltage Vm3 is less than or equal to the threshold voltage Vth (No in step 273), the process returns to step 271 and the constant current Idc is applied between the electrodes 104 and 109 again.
  • the threshold voltage V th used in step 273 can be estimated from the conductivity of the aqueous solution, the thickness of the membrane 101, and the desired size of nanopores, and can also be estimated from experiments and observations by TEM (Transmission Electron Microscopy). can also be determined (estimated) based on
  • FIG. 9A shows IV (current-voltage) characteristics before nanopores are formed in membrane 101 by dielectric breakdown technique. Leakage currents of less than 6 ⁇ 10 ⁇ 11 A are observed for all membranes, as shown in FIG. 9A. Therefore, it can be seen that all membranes were under the same conditions before the nanopore formation treatment and were not damaged.
  • FIG. 9B corresponds to the form of applying the pulse voltage described above (FIG. 5), the pulse voltage Vp is increased stepwise from 4 V to 4.8 V, and the pulse period (application period of the pulse voltage) is changed for each voltage.
  • FIG. 10 is a diagram showing characteristics ( ) of current I m (ion current) measured by applying a specific low voltage V m (0.4 V as an example) after increasing to 200 ms.
  • the dotted line graphs ( ⁇ plot and ⁇ plot) show the results of nanopore formation of the two membranes when dielectric breakdown occurs in an aqueous solution of a first pH (e.g., 1 M KCl pH 12.7). .
  • the solid line graphs ( ⁇ plot and ⁇ plot) show the nanopore formation results of the two membranes when dielectric breakdown occurs in an aqueous solution of the second pH (eg, 1 M KCl pH 7.5).
  • the second pH aqueous solution (1 M KCl pH 7.5 ) the current Im measured when nanopores are formed remains at a value slightly exceeding the threshold current Ith .
  • nanopores could be formed, but their sizes were larger than desired.
  • this embodiment hydrophilic treatment is performed in a first pH aqueous solution, but nanopore formation treatment is performed in a second pH aqueous solution (second pH ⁇ first pH)), the desired nanopore size can be accurately obtained. It's under control.
  • FIG. 10A and 10B are diagrams showing examples (experimental results) of RMS noise measurement results in the hydrophilicity confirmation process (S211).
  • FIG. 10A is a diagram showing current values (current values before and after inserting the electrodes 104 and 109 into the flow cell) measured when the applied DC voltage Vc is 0V. That is, FIG. 10A shows the current values measured in steps 212 ⁇ 213 of FIG. is shown the RMS noise (RMS noise with load) after inserting electrodes 104 and 109 into the flow cell.
  • FIG. 10A is a diagram showing current values (current values before and after inserting the electrodes 104 and 109 into the flow cell) measured when the applied DC voltage Vc is 0V. That is, FIG. 10A shows the current values measured in steps 212 ⁇ 213 of FIG. is shown the RMS noise (RMS noise with load) after inserting electrodes 104 and 109 into the flow cell.
  • FIG. 10A is a diagram showing current values (current values before and after inserting the electrodes
  • 10A shows that, for example, 1 pA was measured as the unloaded RMS noise ⁇ no and 5 pA was measured as the loaded RMS noise ⁇ w .
  • the loaded RMS noise ⁇ w is five times the unloaded RMS noise ⁇ no . Therefore, it is considered that the hydrophilicity of the surface of the membrane 101 is confirmed, and the subsequent nanopore forming treatment is performed.
  • FIG. 10B shows experimental results (accumulated voltage application FIG. 2 is a diagram showing time-ion current characteristics). From FIG. 10B, when the voltage application cumulative time exceeds a predetermined period (about 1.4 s in FIG. 10B), a large change is observed in the ion current value, indicating that nanopores 113 were formed in the membrane 101. Formation of the nanopores 113 on the membrane 101 means that the surface of the membrane 101 has been successfully made hydrophilic, or that the aqueous solution has come into normal contact with the surface of the membrane 101 . In other words, it can be seen that comparing the RMS noise (FIG. 10A) is synonymous with confirming the hydrophilic property of the surface of the membrane 101 .

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Abstract

歩留まりが高く、適切なサイズのナノポアを形成する。このため、本開示は、メンブレンにナノポアを形成するナノポア形成方法であって、メンブレンによって絶縁した第１溶液槽と第２溶液槽に第１ｐＨの水溶液を導入することと、前記メンブレンの表面の親水性を確保することと、メンブレンの表面の親水性が確保された後、第１溶液槽および第２溶液槽の第１ｐＨの水溶液を、第１ｐＨよりも低い第２ｐＨの水溶液で置換することと、第２ｐＨの水溶液を収容する第１溶液槽および第２溶液槽のそれぞれに電極を浸し、絶縁破壊を発生させて前記メンブレンにナノポアを形成することと、を含む、ナノポア形成方法について提案する（図４参照）。

Description

ナノポア形成方法
　本開示は、メンブレンにナノポアを形成するナノポア形成技術に関するものである。
　ナノポアセンサは、例えば、分子、粒子、ＤＮＡ、タンパク質などの解析する生体試料分析装置として開発されている。ナノポアセンサでは、生体試料（サンプル）のサイズよりも大きいか同等の大きさの細孔、例えば径が１ｎｍ～１００ｎｍの孔が、薄膜（メンブレン）上に形成され、水溶液がメンブレンによって絶縁される第１溶液槽および第２溶液槽に導入される。生体試料（サンプル）は、第１溶液槽あるいは第２溶液槽の１つの溶液槽に導入される。各溶液槽に浸入する電極間には電圧が印加され、電極間を流れるイオン電流が測定される。生体試料の物体特性および構造特性は、生体試料が細孔を通過する際に流れる封鎖イオン電流を測定することによって検知することができる。
　ナノポアセンサには２種類あり、１つは生体膜（生体メンブレン）に基づくもので、もう１つは固体膜（固体メンブレン）に基づくものである。生体メンブレンを用いるナノポアセンサでは、孔（ポア）は、脂質二重膜（lipid bilayer membrane）上にナノメートルサイズの細孔を有する浮遊タンパク質によって形成される。一方、固体ナノポアでは、膜（メンブレン）は窒化シリコン（ＳｉＮ）などの高力学的強度材料製であり、ナノメートルサイズの細孔は、当該メンブレンへの電子線照射、化学エッチング技術、またはメンブレンに電圧を印加してポアを形成する絶縁破壊技術（dielectric breakdown technique）によって製造される。絶縁破壊技術では、外部電源等によってメンブレンに電位差を生じさせることでストレスを印加し，絶縁破壊によりナノポアを形成する。この絶縁破壊技術には、対象試料（ターゲットサンプル）を計測する直前にナノポアをメンブレン上に形成することができるため、廉価なナノポア製造コスト、ユーザーフレンドリー、オンサイト加工（ユーザの使用場所での加工）、新鮮なナノポアを形成可能などの利点がある。
　例えば、特許文献１あるいは非特許文献１は、中性ｐＨ水溶液（ｐＨ７－７．５）を用いて、ＳｉＮ膜上にナノポアを形成することについて開示する。しかし、乾燥メンブレンの表面が疎水性となるため、導入された水溶液が乾燥メンブレンの表面に接触しないことがあり，ナノポア形成の歩留まりが悪化する恐れがある。固体膜が周囲環境で疎水性になる理由は、表面が酸化したり、または／かつ、不要な有機物質が表面に付着するためと考えられる。そのため、研究室では、通常、使用する前にメンブレンを親水化する処理が必要となる。通常、研究室では、ピラニア処理またはプラズマ処理によって親水性処理を行っている。しかし、ナノポアセンサを製品化する場合、エンドユーザにこれらの危険な処理を行わせることは現実的ではなく、他の代替技術が必要となる。
　例えば、特許文献２は、水の量、温度、および塩分濃度などの特定条件において水溶液中でメンブレンを保管する方法を導入することを開示する。また、特許文献３は、親水性表面と可溶性物質を含む保護層とを付着させることにより、メンブレンを保管する方法を導入することを開示する。さらに、特許文献４は、ＥＷＯＤ（Electorowetting On Dielectric）法を導入し、高電圧を印加することで疎水性および親水性特性を制御することにより水溶液の液滴をメンブレンの位置に移動させることを開示するが、この方法でもメンブレン表面のプラズマ処理が必要となる。また、特許文献５は、パルスレーザに基づくナノポア製造方法を導入し、試料（サンプル）測定前にピラニア処理を実施して親水性を実現することを開示する。
ＷＯ２０１５／０９７７６５号 ＷＯ２０１９／００８７３６号 特開２０１９－７４４９５号公報 ＷＯ２０２０／２１７３３０号 ＷＯ２０２０／１９４３０３号
Harold Kwok, Kyle Briggs, and Vicent Tabard-Cossa, "Nanopore fabrication by controlled dielectric breakdown", PLos ONE 9 (3), e92880 (2014), DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092880 Itaru Yanagi, Rena Akahori, and Ken-ichi Takeda, "Stable fabrication of a large nanopore by controlled dielectric breakdown in a high-pH solution for the detection of various-sized molecules", Scientific Reports 9, 13143 (2019), DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-019-49622-y
　しかしながら、特許文献１および非特許文献１では、ピラニア処理やプラズマ処理を伴わずに中性ｐＨ水溶液を用いて絶縁破壊を行っているものの、乾燥メンブレン表面が疎水性特性を有するため、ナノポア形成の歩留まりは低い。また、ユーザの使用場所（オンサイト）でピラニア処理やプラズマ処理を操作しなければならないとすると、ユーザに加工の負担を掛けたり、安全上の好ましくないという課題があり、現実的ではない。また、特許文献２および３による代替保存技術を用いたとしても、保存プロセス自体がユーザに負担を生じさせる可能性がある。
　一方、アルカリ水溶液または高ｐＨ水溶液は、低表面張力特性を有しており、メンブレン位置に入り込んでメンブレン表面に付着した不要物質を洗い流すことができる。非特許文献２では、このような高ｐＨ水溶液を利用して、約２０ｎｍのメンブレン上にナノポアを形成している。しかし、高ｐＨ水溶液の利用は、化学エッチングプロセスのため、形成されるナノポアのサイズが制御不能であり、メンブレンの劣化を引き起こす可能性がある。サブナノメートルのオーダにおいてナノポアサイズを精密に制御することは、ＤＮＡシーケンシングなどの実用的な生体分析を実行する上では重要であると考えられる。
　本開示は、このような状況に鑑み、歩留まりが高く、適切なサイズのナノポアの形成技術を提案する。
問題を解決するための手段
　上記課題を解決するために、本開示は、メンブレンにナノポアを形成するナノポア形成方法であって、前記メンブレンによって絶縁した第１溶液槽と第２溶液槽に第１ｐＨの水溶液を導入することと、前記メンブレンの表面の親水性を確保することと、前記メンブレンの表面の親水性が確保された後、前記第１溶液槽および前記第２溶液槽の前記第１ｐＨの水溶液を、前記第１ｐＨよりも低い第２ｐＨの水溶液で置換することと、前記第２ｐＨの水溶液を収容する前記第１溶液槽および前記第２溶液槽のそれぞれに電極を浸し、絶縁破壊を発生させて前記メンブレンにナノポアを形成することを含む、ナノポア形成方法について提案する。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせおよび以降の詳細な記述と添付される請求の範囲の様態により達成され実現される。
　本開示の技術によれば、歩留まりが高く、適切なサイズのナノポアを形成することが可能となる。
メンブレンにナノポア形成する前のナノポアセンシングシステムの構成例を示す図である。 メンブレン表面の親水性確認からナノポア形成までの処理概要を説明するための図である。 ナノポアセンシングシステム１００における試料計測の処理概要を説明するための図である。 本実施形態による、メンブレンに対するナノポア形成から試料計測までの処理の流れを説明するためのフローチャートである。 絶縁破壊技術を用いたナノポア形成処理の詳細内容（例）を示すフローチャートである（パルス電圧）。 絶縁破壊技術を用いたナノポア形成処理の詳細内容（例）を示すフローチャートである（定電圧）。 絶縁破壊技術を用いたナノポア形成処理の詳細内容（例）を示すフローチャートである（パルス電流）。 絶縁破壊技術を用いたナノポア形成処理の詳細内容（例）を示すフローチャートである（定電流）。 絶縁破壊技術によってナノポアがメンブレン１０１に形成される前のＩＶ（電流‐電圧）特性を示す図である。 パルス電圧を印加する形態（図５）に対応し、パルス電圧Ｖｐを４Ｖから４．８Ｖまで段階的に増加させ、各電圧についてパルス期間（パルス電圧の印加期間）を２００ｍｓまで増加させた後に、特定の低電圧Ｖｍ（一例として０．４Ｖ）を印加して計測した電流Ｉｍ（イオン電流）の特性を示す図である。 印加直流電圧Ｖｃが０Ｖのときに計測される電流値（フローセルに電極１０４および１０９を挿入する前と後の電流値）を示す図である。 負荷ありＲＭＳノイズが負荷なしＲＭＳノイズの数倍（図１０Ａでは５倍）大きくなった状態でメンブレン１０１に対してナノポア形成処理（Ｓ２２１）を実行したときの実験結果（電圧印加累積時間‐イオン電流特性）を示す図である。
　本実施形態では、メンブレンの材料、厚さ、サイズ、および数は制限されない。また、本実施形態では、高ｐＨ水溶液の水溶液の組成、ナノポア形成に用いる中性ｐＨ水溶液の水溶液の組成、および試料測定に用いる水溶液の組成についても制限されない。ナノポア形成に用いられる絶縁破壊技術は、単なる一例に過ぎず、様々な形態の絶縁破壊技術を適用することができる。さらに、本実施形態では、ＲＭＳノイズを測定する際に静電容量ノイズ測定方法を用いているが、これに限定されるものでもない。
　＜概要＞
（i）本実施形態では、ナノポアセンシングシステムにおいて、乾燥メンブレンが、ナノポアが形成される前、フローセル（ナノポアセンシングシステムの一部）に取り付けられ、フローセルの第１溶液槽と第２溶液槽とを絶縁する。各溶液槽には、高ｐＨ水溶液（第１ｐＨ水溶液）が導入（充填）される。電極が各溶液槽の溶液中に沈入され、電圧あるいは電流を供給することができる電気機器ユニットに接続される。ナノポア形成を行う前には、まず、無負荷状態と負荷状態における静電容量ノイズが計測（測定）される（静電容量ノイズ測定プロセス）。メンブレン表面が親水性になり、水溶液がメンブレン表面に接触しているか否か確認される。メンブレン表面の親水性が確認された場合、各溶液槽内の高ｐＨ水溶液はそれより低いｐＨの水溶液（第２ｐＨ水溶液：中性ｐＨ水溶液）によって迅速に置換される（水溶液置換プロセス）。これは、メンブレンが高ｐＨ水溶液による化学エッチングプロセスにより分解されやすいためである。続いて、電極が各溶液槽にそれぞれ浸され、電気機器ユニットによって電圧あるいは電流が供給される。これにより、絶縁破壊が起こり、ナノポアがメンブレン上に形成される。
（ii）上記静電容量ノイズ測定プロセスでは、２つの電極間に直流電圧が印加される。そして、二乗平均平方根（ＲＭＳ：Root Mean Square）ノイズまたは電気機器ユニットのノイズが、負荷のない状態（メンブレンによって絶縁された両溶液槽に各電極を差し込まない状態）と負荷がある状態（メンブレンによって絶縁された両溶液槽に各電極を差し込んだ状態）で監視される。ここで、直流電圧は、メンブレンの絶縁破壊惹起電圧未満にすることができる。例えば、５ｎｍ厚のメンブレンを用いる場合、５Ｖの絶縁破壊電圧を呈するため、静電容量ノイズをチェックする直流電圧は－２．５Ｖから２．５Ｖまでである。このように、静電容量ノイズ測定プロセスで印加電圧を絶縁破壊惹起電圧未満とすることにより、当該プロセス中に不要な絶縁破壊の発生を防止することができる。
　本実施形態では、負荷あり静電容量ノイズ（負荷ありＲＭＳノイズ）が負荷なし静電容量ノイズ（負荷ありＲＭＳノイズ）よりも数倍（少なくとも２倍以上）高い場合、メンブレン表面は親水性になった、あるいは水溶液がメンブレン表面に接触している状態になったと判断される。一方、負荷ありＲＭＳノイズが負荷なしＲＭＳノイズと同等以下である場合、水溶液がメンブレン表面に接触しないことがある。このため、高ｐＨ水溶液（第１ｐＨ水溶液）が各溶液槽から取り出され、再び導入（充填）される。再導入する場合には、第１ｐＨ水溶液のｐＨをさらに高くしてもよい。また、第１ｐＨ水溶液をメンブレン表面上で前後に移動させる（例えば、ピペッティング処理）ことにより、第１ｐＨ水溶液とメンブレン表面との接触を確かなものにするようにしてもよい。
（iii）水溶液置換プロセスでは、各溶液槽から第１ｐＨ水溶液（高ｐＨ水溶液）を取り出し、第１ｐＨより低い第２ｐＨ水溶液（例えば、中性ｐＨ水溶液）を各溶液槽に導入する。このプロセスは、各溶液槽の水溶液が確実に中性となるように数回行うようにしてもよい。なお、当該水溶液置換プロセスを行った場合、例えば、各溶液槽内の水溶液のｐＨが中性であることを確認するようにしてもよい。
（iv）所望のサイズのナノポアは、絶縁破壊を起こさせることによってメンブレン上に形成することができる。試料（サンプル）は、２つのうち１つの溶液槽に導入することができる。各溶液槽の電極間に電圧が印加されると、あるいは当該電極間に電流が流されると、イオン電流が計測される。対象の分子または粒子（ターゲットの分子または粒子）は、対象の分子または粒子がナノポアを通過する際のイオン電流(封鎖電流)を測定することによって検出することができる。
（v）乾燥メンブレンの疎水性特性による固体ナノポアセンサの利用率の低さは、上述のように、高ｐＨ水溶液を導入することにより克服される。また、静電容量ノイズを測定することによってメンブレン表面に水溶液が接触することを確認した後は、絶縁破壊技術によるナノポア製造のための中性ｐＨ水溶液へ迅速に置換することによって、ナノポアのサイズは効果的に制御される。また、メンブレンの高度な保存処理を用いる負担も回避される。
　＜ナノポアセンシングシステムの構成例＞
　図１は、メンブレンにナノポアを形成する前のナノポアセンシングシステムの構成例を示す図である。ナノポアセンシングシステム１００は、水溶液（例えば、１ＭＫＣｌ　ｐＨ１２．７）を収容する第１溶液槽１０３と、水溶液（例えば、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ１２．７）を収容する第２溶液槽１１０と、液体密閉用ガスケット１０２および１１１と、水溶液に浸された電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）１０４および１０９と、電源や電流を供給するための電気機器ユニット１０７と、電極１０４と電気機器ユニット１０７とを接続する電気導線１０５と、電極１０９と電気機器ユニット１０７とを接続する電気導線１０８と、を備える。メンブレン１０１は、液体密閉用ガスケット１０２および１１１によって挟むことによりナノポアセンシングシステム１００に配置される。また、メンブレン１０１を配置した後に、水溶液１０６および１１２が第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０にそれぞれ注入される。なお、メンブレン１０１には、例えば、乾燥ＳｉＮ膜または多元膜を用いることができる。
　＜メンブレン表面の親水性確認およびナノポア形成：概要＞
　図２は、メンブレン表面の親水性確認からナノポア形成までの処理概要を説明するための図である。
　まず、図１に示されるように１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ１２．７水溶液１０６および１１２を第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０のそれぞれに収容した状態で静電容量ノイズ（ＲＭＳノイズ）を測定して当該水溶液１０６および１１２がメンブレン１０１の表面に接触しているか否か（メンブレン１０１の表面の親水性となったか否か）が確認される（詳細については後述）。その後、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ １２．７水溶液１０６および１１２を第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０から排出し、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ７．５水溶液１３０および１３１が充填される。つまり、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ １２．７水溶液１０６および１１２が１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ７．５水溶液１３０および１３１によって置換される。
　水溶液置換後、絶縁破壊技術に基づいて、電気機器ユニット１０７から電圧または電流を印加することにより、メンブレン１０１に所望のサイズのナノポア１１３を形成することができる（ポアサイズが制御可能）。
　＜試料（サンプル）測定＞
　図３は、ナノポアセンシングシステム１００における試料計測の処理概要を説明するための図である。図３に示されるように、試料（サンプル）１２０は、第1溶液槽１０３あるいは第２溶液槽１１０の一方に導入される。そして、電気機器ユニット１０７により、２０Ｖ以下の低電圧（例えば、２Ｖ以下）を電極１０４および１０９間に印加することにより、試料１２０がナノポア１１３を通過する際のイオン電流(封鎖電流)を計測する。なお、試料（サンプル）測定時に第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に充填される水溶液１４０および１４１のそれぞれは、計測対象の試料（ターゲットサンプル）の種類に依存する。
　＜ナノポア形成から試料計測までの処理の詳細＞
　図４は、本実施形態による、メンブレンに対するナノポア形成から試料計測までの処理の流れを説明するためのフローチャートである。本実施形態によるナノポア形成から試料計測までの処理は、親水性処理Ｓ２０１、親水性確認処理Ｓ２１１、ナノポア形成処理Ｓ２２１、および試料（サンプル）計測処理Ｓ２３１によって構成される。つまり、メンブレン１０１の表面の親水性を確保するためにｐＨが高い水溶液（第１ｐＨの水溶液）にメンブレン１０１を浸すこと（ステップ２０１）、メンブレン１０１の表面が実際に親水性となっているか確認すること（ステップ２１１）、ｐＨが低い水溶液（第１ｐＨよりも低い第２ｐＨの水溶液）で絶縁破壊法によりナノポアを形成すること（ステップ２２１）、および試料計測すること（ステップ２３１）により、高歩留まり、およびサイズ制御可能なナノポアを用いて試料（サンプル）を測定することが可能となる。
（i）ステップ２０１
　(i-1)ステップ２０２
　まず、オペレータは、乾燥メンブレン１０１を準備する。
　(i-2)ステップ２０３
　次に、オペレータは、乾燥メンブレン１０１をフローセルに取り付ける。ここで、フローセルは、ナノポアセンシングシステム１００（図１から３参照）における、第１溶液槽１０３と、第２溶液槽１１０と、液体密閉用ガスケット１０２および１１１と、を含む構成部分に対応する。
　(i-3)ステップ２０４
　オペレータは、高ｐＨ（ｐＨ８より高い）の水溶液（第１ｐＨの水溶液）、例えば、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ１２．７の水溶液をフローセルの第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に導入（充填）する。
（ii）ステップ２１１
　親水性確認処理（ステップ２１１）は、電極間に直流電圧Vcを印加し（ステップ212），フローセル（第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０）に電極を挿入せずにＲＭＳノイズを計測し，（負荷なしＲＭＳノイズ計測：ステップ２１３）、およびフローセルに電極を挿入し（ステップ216）、ＲＭＳノイズを計測する（負荷ありＲＭＳノイズ計測：ステップ２１４）各ステップから構成される。
　(ii-1)ステップ２１２
　オペレータは、電気機器ユニット１０７を介して、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９間にＤＣ電圧（Ｖｃ）を印加する。この段階では、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９は、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０の水溶液のそれぞれには浸されていない状態である。ここで印加される電圧は、例えば、１０Ｖ以下の低電圧である。これは、ステップ２１４において、所望されない絶縁破壊の発生を防止するためである。
　(ii-2)ステップ２１３
　オペレータは、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９が水溶液（第１ｐＨの水溶液）に浸されていない状態で、電流のＲＭＳ（Root Mean Square）ノイズ（負荷なしＲＭＳノイズσｎｏ）を計測する。
　(ii-３)ステップ２１６
　オペレータは、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９を水溶液（第１ｐＨの水溶液）に浸す。
　(ii-４)ステップ２１４
　続いて、オペレータは、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９を水溶液（第１ｐＨの水溶液）に浸した状態（第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に電極１０４および１０９を挿入した状態）で、電流のＲＭＳ（Root Mean Square）ノイズ（負荷ありＲＭＳノイズσｗ）を計測する。
　(ii-５)ステップ２１５
　オペレータは、負荷なしＲＭＳノイズσｎｏと負荷ありＲＭＳノイズσｗを比較する。具体的には、ＲＭＳノイズσｗが負荷なしＲＭＳノイズσｎｏの数倍（例えば、２倍）大きいか判断される。負荷ありＲＭＳノイズσｗが負荷なしのＲＭＳノイズσｎｏよりも大きい場合（ステップ２１５でＹｅｓの場合）、メンブレン１０１の表面が親水性を有すること（親水性特性：メンブレン１０１の表面が完全に水溶液と接している状態）が確認され、親水性確認処理（ステップ２１１）は終了し、処理はナノポア形成処理Ｓ２２１に移行する。負荷ありＲＭＳノイズσｗが負荷なしＲＭＳノイズσｎｏ以下である場合（ステップ２１５でＮｏの場合）、メンブレン１０１の表面の親水性は担保されず、処理はステップ２０４に戻る。この場合、ステップ２０４では、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０内の水溶液（第１ｐＨの水溶液：例えば、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ１２．７の水溶液）を排出し、新しい第１ｐＨの水溶液が第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に充填され、再度親水性確認処理（ステップ２１１）が実行される。なお、再度親水性確認処理を実行するとき、親水性確認処理を複数回（例えば５回）実行してもメンブレン１０１の表面の親水性が確認できなかった場合には、水溶液のｐＨを上げる（ただし、ｐＨ１４より低く設定する）ようにしてもよい。
　なお、上述では、オペレータが負荷なしＲＭＳノイズσｎｏと負荷ありＲＭＳノイズσｗを比較するが、ナノポアセンシングシステム１００にコンピュータ（図示せず）を接続し、コンピュータが当該比較処理を行ってもよい。このとき、コンピュータは、負荷ありＲＭＳノイズσｗが負荷なしのＲＭＳノイズσｎｏよりも大きい場合には、表示装置の画面（図示せず）上にステップ２２１に処理を移行させるように指示を表示し、オペレータに次のナノポア形成処理の実行を促すことができる。また、コンピュータは、負荷ありＲＭＳノイズσｗが負荷なしのＲＭＳノイズσｎｏ以下の場合には、表示装置の画面（図示せず）上にステップ２０４に処理を移行させるように指示を表示し、オペレータに再度親水性確認処理の実行を促すことができる。また、負荷なしＲＭＳノイズσｎｏを予め計測してメモリ（図示せず）に格納しておき、親水性確認処理を実行する際に当該メモリから負荷なしＲＭＳノイズσｎｏを読み出し、負荷ありＲＭＳノイズσｗと比較するようにしてもよい。
（iii）ステップ２２１
　(iii-1)ステップ２２２
　オペレータは、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に充填されている第１ｐＨの水溶液を排出し、第１ｐＨよりも低い第２ｐＨの水溶液（例えば、中性の水溶液、さらに具体的には、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ７．５の水溶液）を代わりに充填する（水溶液の置換）。
　(iii-2)ステップ２２３
　オペレータは、電気機器ユニット１０７で電極１０４および１０９間に電圧を印加あるいは電流を流すことにより絶縁破壊を起こさせ、図２に示すように、メンブレン１０１に所望サイズのナノポア１１３を形成する。
（iv）ステップ２３１
　試料（サンプル）計測処理では、ナノポア形成処理（ステップ２２１）と同様に、水溶液は、第２ｐＨの水溶液（例えば、中性の水溶液、さらに具体的には、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ７．５の水溶液：ただし、ｐＨではなく水溶液の種類（ＫＣｌなど）は導入される計測対象の試料（サンプル）の種類によって変わる）が第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に充填される。
　(iv-1) ステップ２３２
　オペレータは、図３に示されるように、計測対象とすべき試料（ターゲットサンプル）１２０を第１溶液槽１０３あるいは第２溶液槽１１０のいずれかに導入する。
　(iv-2)ステップ２３３
　オペレータは、電気機器ユニット１０７で電極１０４および１０９間に低電圧（例えば、２０Ｖより低電圧、さらに具体的には２Ｖよりも低電圧とすることができる）を印加することにより、試料（サンプル）１２０がナノポアを通過する際のイオン電流(封鎖電流)を計測する。
　＜ナノポア形成処理のステップ２２３の詳細内容＞
　図５から図８は、絶縁破壊技術を利用したナノポア形成処理の詳細内容（例）を示すフローチャートである。ここでは、４つの形態を挙げて説明する。
（i）パルス電圧印加の例：図５
　オペレータは、電気機器ユニット１０７を用いて、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に浸されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９間に、少なくとも一周期分の期間、パルス電圧Ｖｐ１を印加する（ステップ２４１）。パルス電圧Ｖｐ１の大きさはメンブレン１０１の厚さと材質によって変わるが、例えば、５ｎｍのＳｉＮメンブレンの場合、４Ｖから５Ｖのパルス電圧が印加される。パルス電圧Ｖｐ１は、メンブレン１０１にストレスを与えるための電圧である。
　続いて、オペレータは、電気機器ユニット１０７を操作して、印加電圧をパルス電圧Ｖｐ１から所定の低電圧Ｖｍ１に変更し、低電圧Ｖｍ１において流れる電流Ｉｍ１を計測する（ステップ２４２）。ここで、低電圧Ｖｍ１は、ステップ２４２の処理中に絶縁破壊を起こさない程度に、あるいは既に形成されたナノポアが拡張しない程度に、パルス電圧Ｖｐ１の値よりも低く設定される。例えば、メンブレン１０１として厚さ５ｎｍのＳｉＮメンブレンを用いる場合には、１Ｖ未満に設定される。
　オペレータは、計測電流Ｉｍ１と閾値電流Ｉｔｈ１を比較する（ステップ２５３）。計測電流Ｉｍ１が閾値電流Ｉｔｈ１よりも大きい場合（ステップ２４３でＹｅｓの場合）、所望のナノポア１１３（図２参照）が形成されたと判断され、処理はステップ２３１（試料計測処理）に移行する。一方、計測電流Ｉｍ１が閾値電流Ｉｔｈ１以下の場合（ステップ２４３でＮｏの場合）、処理はステップ２４１に戻り、再度パルス電圧Ｖｐ１によってメンブレン１０１にストレスが掛けられることになる。なお、ステップ２４１で再度パルス電圧Ｖｐ１を印加する場合、印加時間を長くしてもよいし、印加電圧の極性（正負）を反転させてもよい。また、ステップ２４３において用いられる閾値電流Ｉｔｈ１は、水溶液の導電率、メンブレン１０１の厚さ、および所望のナノポアのサイズから推定することができるし、また、実験およびＴＥＭ（Transmission Electron Microscopy）による観察に基づいて決定（推定）することもできる。
（ii）定電圧印加の例：図６
　オペレータは、電気機器ユニット１０７を用いて、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に浸されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９間に、定電圧Ｖｄｃを所定時間印加する（ステップ２５１）。定電圧Ｖｄｃの大きさはメンブレン１０１の厚さと材質によって変わるが、例えば、２０ｎｍのＳｉＮメンブレンの場合、１６Ｖから２０Ｖの定電圧とすることができる。また、定電圧の印加時間は、次のステップ２５２での印加時間を含め、例えば、１０分未満である。
　続いて、オペレータは、定電圧Ｖｄｃを印加しながら、そのときに流れる電流Ｉｍ２を計測する（ステップ２５２）。
　そして、オペレータは、計測電流Ｉｍ２と閾値電流Ｉｔｈ２を比較し、所望のナノポア１１３がメンブレン１０１に形成されたか確認する（ステップ２５３）。計測電流Ｉｍ２が閾値電流Ｉｔｈ２よりも大きい場合（ステップ２５３でＹｅｓの場合）、所望のナノポア１１３（図２参照）が形成されたと判断され、処理はステップ２３１（試料計測処理）に移行する。一方、計測電流Ｉｍ２が閾値電流Ｉｔｈ２以下の場合（ステップ２５３でＮｏの場合）、処理はステップ２５１に戻り、定電圧Ｖｄｃが再度印加される。なお、ステップ２５１で再度定電圧Ｖｄｃを印加する場合、印加電圧値を大きくしてもよいし、印加電圧の極性（正負）を反転させてもよい。また、ステップ２５３において用いられる閾値電流Ｉｔｈ２は、水溶液の導電率、メンブレン１０１の厚さ、および所望のナノポアのサイズから推定することができるし、また、実験およびＴＥＭ（Transmission Electron Microscopy）による観察に基づいて決定（推定）することもできる。
（iii）パルス電流を流す例：図７
　オペレータは、電気機器ユニット１０７を用いて、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に浸されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９間に、少なくとも一周期分の期間、パルス電流Ｉｐ１を流す（ステップ２６１）。パルス電流Ｉｐ１の大きさはメンブレン１０１の厚さと材質によって変わる。
　続いて、オペレータは、電気機器ユニット１０７を操作して、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に浸されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９間に所定の低電圧Ｖｍ２を印加し、低電圧Ｖｍ２において流れる電流Ｉｍ３を計測する（ステップ２６２）。ここで、低電圧Ｖｍ２は、ステップ２６２の処理中に絶縁破壊を起こさない程度に、あるいは既に形成されたナノポアが拡張しない程度に、低く設定される。例えば、メンブレン１０１として厚さ５ｎｍのＳｉＮメンブレンを用いる場合には、１Ｖ未満に設定される。
　オペレータは、計測電流Ｉｍ３と閾値電流Ｉｔｈ３を比較する（ステップ２６３）。計測電流Ｉｍ３が閾値電流Ｉｔｈ３よりも大きい場合（ステップ２６３でＹｅｓの場合）、所望のナノポア１１３（図２参照）が形成されたと判断され、処理はステップ２３１（試料計測処理）に移行する。一方、計測電流Ｉｍ３が閾値電流Ｉｔｈ３以下の場合（ステップ２６３でＮｏの場合）、処理はステップ２６１に戻り、再度パルス電流Ｉｐ１がＡｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９間に流されることになる。なお、ステップ２６１で再度パルス電流Ｉｐ１を流す場合、電流値を大きくしてもよいし、流す電流の極性（正負）を反転させてもよい。また、ステップ２６３において用いられる閾値電流Ｉｔｈ３は、水溶液の導電率、メンブレン１０１の厚さ、および所望のナノポアのサイズから推定することができるし、また、実験およびＴＥＭ（Transmission Electron Microscopy）による観察に基づいて決定（推定）することもできる。
（iv）定電流を流す例：図８
　オペレータは、電気機器ユニット１０７を用いて、第１溶液槽１０３および第２溶液槽１１０に浸されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極１０４および１０９間に、定電流Ｖｄｃを所定時間流す（ステップ２７１）。定電流Ｉｄｃの大きさはメンブレン１０１の厚さと材質によって変わる。
　オペレータは、定電流Ｉｄｃを流しながら、そのときの電圧Ｖｍ３を計測する（ステップ２７２）。
　そして、オペレータは、計測電圧Ｖｍ３と閾値電圧Ｖｔｈを比較し、所望のナノポア１１３がメンブレン１０１に形成されたか確認する（ステップ２７３）。計測電圧Ｖｍ３が閾値電圧Ｖｔｈよりも大きい場合（ステップ２７３でＹｅｓの場合）、所望のナノポア１１３（図２参照）が形成されたと判断され、処理はステップ２３１（試料計測処理）に移行する。一方、計測電圧Ｖｍ３が閾値電圧Ｖｔｈ以下の場合（ステップ２７３でＮｏの場合）、処理はステップ２７１に戻り、定電流Ｉｄｃが電極１０４および１０９間に再度流される。なお、ステップ２７１で再度定電流Ｉｄｃを流す場合、電流値を大きくしてもよいし、流す電流の極性（正負）を反転させてもよい。また、ステップ２７３において用いられる閾値電圧Ｖｔｈは、水溶液の導電率、メンブレン１０１の厚さ、および所望のナノポアのサイズから推定することができるし、また、実験およびＴＥＭ（Transmission Electron Microscopy）による観察に基づいて決定（推定）することもできる。
　＜実験結果＞
　図９Ａおよび図９Ｂは共に、本開示の技術を用いた実験の結果を示す図である。当該実験結果は、（i）２つのメンブレンについて、親水性処理（Ｓ２０１）および絶縁破壊技術によるナノポア形成処理（Ｓ２２１）で同じ高ｐＨ水溶液（第１ｐＨの水溶液：例えば、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ１２．７）を用いて行う場合（点線）と、（ii）他の２つのメンブレンについて、親水性処理（Ｓ２０１）で高ｐＨ水溶液（第１ｐＨの水溶液：例えば１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ１２．７）を用い、絶縁破壊技術によるナノポア形成処理（Ｓ２２１）で中性ｐＨ水溶液（第２ｐＨの水溶液：例えば１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ７．５）を用いて行う場合（実線）を含んでいる。
　図９Ａは、絶縁破壊技術によってナノポアがメンブレン１０１に形成される前のＩＶ（電流‐電圧）特性を示す図である。図９Ａに示されるように、６×１０－１１Ａ未満の漏れ電流が全てのメンブレンについて観測されている。このため、全てのメンブレンは、ナノポア形成処理前には同一条件下にあり、破損していないことが分かる。
　図９Ｂは、上述のパルス電圧を印加する形態（図５）に対応し、パルス電圧Ｖｐを４Ｖから４．８Ｖまで段階的に増加させ、各電圧についてパルス期間（パルス電圧の印加期間）を２００ｍｓまで増加させた後に、特定の低電圧Ｖｍ（一例として０．４Ｖ）を印加して計測した電流Ｉｍ（イオン電流）の特性（）を示す図である。図９Ｂにおいて、点線のグラフ（□プロットと△プロット）は、第１ｐＨの水溶液（例えば、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ１２．７）中で絶縁破壊を発生させた場合の２つのメンブレンのナノポア形成結果を示している。一方、実線のグラフ（○プロットと×プロット）は、第２ｐＨの水溶液（例えば、１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ７．５）中で絶縁破壊を発生させた場合の２つのメンブレンのナノポア形成結果を示している。図９Ｂからは、第１ｐＨ水溶液（１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ１２．７）中でナノポアが形成されときに計測される電流Ｉｍは、大幅に閾値電流Ｉｔｈを超える一方、第２ｐＨ水溶液（１Ｍ ＫＣｌ ｐＨ７．５）中でナノポアが形成されときに計測される電流Ｉｍは、閾値電流Ｉｔｈを少し上回わった値に止まっていることが分かる。つまり、前者の場合（親水性処理およびナノポア形成処理を共に第１ｐＨ水溶液中で行う場合）によれば、ナノポアを形成することはできたが、そのサイズは所望のサイズよりも大きくなっている。一方、後者（本実施形態：親水性処理は第１ｐＨ水溶液中で行うが、ナノポア形成処理は第２ｐＨ水溶液（第２ｐＨ＜第１ｐＨ）中で行う場合）によれば、所望のナノポアサイズが正確に制御できている。
　＜親水性確認処理におけるＲＭＳノイズの計測定結果の例＞
　図１０Ａおよび図１０Ｂは、親水性確認処理（Ｓ２１１）におけるＲＭＳノイズの計測定結果の例（実験結果）を示す図である。図１０Ａは、印加直流電圧Ｖｃが０Ｖのときに計測される電流値（フローセルに電極１０４および１０９を挿入する前と後の電流値）を示す図である。つまり、図１０Ａには、図４のステップ２１２→ステップ２１３で計測される電流値がフローセルに電極１０４および１０９を挿入する前のＲＭＳノイズ（負荷なしＲＭＳノイズ）とステップ２１４で計測される電流値がフローセルに電極１０４および１０９を挿入した後のＲＭＳノイズ（負荷ありＲＭＳノイズ）が示されている。図１０Ａには、例えば、負荷なしＲＭＳノイズσｎｏとして１ｐＡが計測され、負荷ありＲＭＳノイズσｗとして５ｐＡが計測されたことが示されている。この場合、負荷ありＲＭＳノイズσｗは、負荷なしＲＭＳノイズσｎｏの５倍となっている。よって、メンブレン１０１の表面の親水性が確認されたと考えられ、後続のナノポア形成処理が実行される。
　図１０Ｂは、負荷ありＲＭＳノイズが負荷なしＲＭＳノイズの数倍（図１０Ａでは５倍）大きくなった状態でメンブレン１０１に対してナノポア形成処理（Ｓ２２１）を実行したときの実験結果（電圧印加累積時間‐イオン電流特性）を示す図である。図１０Ｂからは、電圧印加累積時間が所定期間（図１０Ｂでは、約１．４ｓ）を超えると、イオン電流値に大きな変化が見られるので、メンブレン１０１にナノポア１１３が形成されたことが分かる。メンブレン１０１にナノポア１１３が形成されたということは、メンブレン１０１の表面が成功裏に親水性となった、あるいは水溶液がメンブレン１０１の表面に正常に接触するようになったと言える。つまり、ＲＭＳノイズの比較すること（図１０Ａ）は、メンブレン１０１の表面の親水性特性を確認することと同義であることが分かる。
１０１　乾燥メンブレン（ＳｉＮ）
１０２、１１１　ガスケット
１０３　第１溶液槽
１０４　電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）
１０５　電気導線
１０６、１１２　高ｐＨ水溶液（第１ｐＨ水溶液）
１０７　電気機器ユニット
１０８　電気導線
１０９　電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）
１１０　第２溶液槽
１１３　ナノポア
１２０　試料（サンプル）
１３０、１３１　中性ｐＨ水溶液（第２ｐＨ水溶液）
１４０、１４１　水溶液

Claims (14)

  1. 　メンブレンにナノポアを形成するナノポア形成方法であって、
    　前記メンブレンによって絶縁した第１溶液槽と第２溶液槽に第１ｐＨの水溶液を導入することと、
    　　前記メンブレンの表面の親水性を確保することと、
    　前記メンブレンの表面の親水性が確保された後、前記第１溶液槽および前記第２溶液槽の前記第１ｐＨの水溶液を、前記第１ｐＨよりも低い第２ｐＨの水溶液で置換することと、
    　前記第２ｐＨの水溶液を収容する前記第１溶液槽および前記第２溶液槽のそれぞれに電極を浸し、絶縁破壊を発生させて前記メンブレンにナノポアを形成することと、
    を含む、ナノポア形成方法。
  2. 　請求項１において、
    　前記メンブレンの表面の親水性を確保することは、
    　　前記第１ｐＨの水溶液を収容する前記第１溶液槽および前記第２溶液槽に前記電極を浸さずに前記電極に電圧を印加し、第１静電容量ノイズを測定することと、
    　　前記第１ｐＨの水溶液を収容する前記第１溶液槽および前記第２溶液槽に前記電極を浸した状態で前記電極に電圧を印加し、第２静電容量ノイズを測定することと、
    　　前記第１静電容量ノイズと前記第２静電容量ノイズを比較することにより、前記メンブレンの表面の親水性を確認することと、
    を含む、ナノポア形成方法。
  3. 　請求項２において、
    　前記第１静電容量ノイズを測定することでは、１０Ｖ未満の直流電圧での二乗平均平方根ノイズが測定される、ナノポア形成方法。
  4. 　請求項２において、
    　前記第２静電容量ノイズが前記第２静電容量ノイズよりも２倍以上高い場合に前記メンブレンの表面の親水性が確保されたと判断する、ナノポア形成方法。
  5. 　請求項１において、
    　前記メンブレンは窒化シリコン層を含む、ナノポア形成方法。
  6. 　請求項５において、
    　前記窒化シリコン層の厚さは１００ｎｍ未満である、ナノポア形成方法。
  7. 　請求項１において、
    　前記第１ｐＨは８以上である、ナノポア形成方法。
  8. 　請求項１において、
    　前記第１ｐＨは１０以上である、ナノポア形成方法。
  9. 　請求項１において、
    　前記メンブレンにナノポアを形成することは、
    　　前記電極にパルス電圧を印加することと、
    　　前記パルス電圧よりも低い電圧を前記電極に印加したときに流れる電流を計測することと、
    　　前記電流が閾値電流よりも大きいときに前記絶縁破壊が発生したと判断することと、
    を含む、ナノポア形成方法。
  10. 　請求項１において、
    　前記メンブレンにナノポアを形成することは、
    　　前記電極に定電圧を印加することと、
    　　前記定電圧を印加した状態で流れる電流を計測することと、
    　　前記電流が閾値電流よりも大きいときに前記絶縁破壊が発生したと判断することと、
    を含む、ナノポア形成方法。
  11. 　請求項１において、
    　前記メンブレンにナノポアを形成することは、
    　　前記電極にパルス電流を流すことと、
    　　前記電極に所定の電圧を印加した状態で流れる電流を計測することと、
    　　前記電流が閾値電流よりも大きいときに前記絶縁破壊が発生したと判断することと、
    を含む、ナノポア形成方法。
  12. 　請求項１において、
    　前記メンブレンにナノポアを形成することは、
    　　前記電極に定電流を流すことと、
    　　前記定電流を流した状態で前記電極の電位を計測することと、
    　　前記電位が閾値電位よりも小さいときに前記絶縁破壊が発生したと判断することと、
    を含む、ナノポア形成方法。
  13. 　メンブレンにナノポアを形成するナノポア形成方法であって、
    　前記メンブレンによって絶縁した第１溶液槽と第２溶液槽に第１ｐＨの水溶液を導入することと、
    　電極間に電圧を印加、あるいは電流を流す、電気機器を準備することと、
    　無負荷状態で前記電気機器により前記電極間に１０Ｖ未満の直流電圧を印加して第１二乗平方根ノイズを測定することと、
    　負荷状態で前記電気機器により前記電極間に前記１０Ｖ未満の直流電圧を印加して第２二乗平方根ノイズを計測することと、
    　前記メンブレンの表面の親水性が確保された後、前記第１溶液槽および前記第２溶液槽の前記第１ｐＨの水溶液を、前記第１ｐＨよりも低い第２ｐＨの水溶液で置換することと、
    　前記第２ｐＨの水溶液を収容する前記第１溶液槽および前記第２溶液槽のそれぞれに電極を浸し、絶縁破壊を発生させて前記メンブレンにナノポアを形成することと、
    を含む、ナノポア形成方法。
  14. 　請求項１３において、
    　前記無負荷状態は、前記第１ｐＨの水溶液を収容する前記第１溶液槽および前記第２溶液槽に前記電極を浸さない状態であり、
    　前記負荷状態は、前記第１ｐＨの水溶液を収容する前記第１溶液槽および前記第２溶液槽に前記電極を浸した状態である、ナノポア形成方法。
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